JPH06319534A - サブチリシン突然変異体の製造に有用な桿菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 サブチリシン突然変異体の製造に有用な桿菌
を提供する。 【構成】 酵素的に活性なサブチリシンまたは中性プロ
テアーゼを分泌することができない様な突然変異サブチ
リシンおよ中性プロテアーゼの遺伝子を含有している実
質的に正常な胞子形成を行う桿菌。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、サブチリシン突然変異体の製造
に有用な桿菌および該変異体の製造方法に関する。本発
明は更に、適当な宿主中での組換え技術を用いた蛋白質
の生産およびその処置に関するものである。さらに詳し
くは、本発明はサブチリシンおよび中性プロテアーゼの
ような原核生物の(原核生)プロテアーゼを組換え微生物
宿主を用いて生産する方法、微生物宿主により外来性蛋
白質を合成させる方法、および酵素類の特性を改良する
ための、該酵素の方向づけられた変異誘発法に関連する
ものである。

【発明の背景】

【０００２】多くの細菌類は、そのライフサイクルのあ
る時期においてプロテアーゼを分泌することは知られて
いる。桿菌類(Ｂacillus)は２つの主要な細胞外プロテ
アーゼ、中性プロテアーゼ(ＥＤＴＡにより阻止される
メタロ(金属)プロテアーゼ)およびアルカリ性プロテア
ーゼ(即ちサブチリシン、セリン・エンドプロテアーゼ)
を生産する。この両者は、その培養物が指数増殖期を過
ぎ、定常期に入って胞子形成を開始すると、最も多量に
生産される。これらの２つのプロテアーゼの生理学的役
割は明らかでない。それらは、胞子形成において役割を
果たしている(Ｊ．Ｈoch, １９７６, “Ａdv．Ｇene
t．" １８: ６９−９８; Ｐ．Ｐiggotら１９７６、“Ｂ
act．Ｒev．" ４０: ９０８−９６２; およびＦ．Ｐrie
st、１９７７、“Ｂact．Ｒev．"４１: ７１１−７５
３)、細胞壁の改変に関与している(Ｌ．Ｊolliffeら１
９８０、“Ｊ．Ｂact．" １４１: １１９９−１２０
８)、および捕捉酵素である(Ｐriest、同上)などと推測
されてきた。プロテアーゼ遺伝子の発現の調製は複雑で
ある。胞子形成の初期の段階でブロックされたミュータ
ントはアルカリ性および中性プロテアーゼ両者の生産量
が少ないので、それらは胞子形成と関連して協調的に調
整されていると思われる。さらに、プロテアーゼおよび
その他の分泌される遺伝子生産物、例えばアミラーゼお
よびレバンサッカラーゼ(priest、前記)の発現レベルに
影響を与える多数の多形質発現ミューテーションが存在
している。

【０００３】サブチリシンは工業および商業的な応用範
囲が非常に広い(米国特許第３６２３９５７およびＪ．
Ｍillet, １９７０、“Ｊ．Ａppl．Ｂact．" ３３: ２
０７)。例えばサブチリシンおよびその他プロテアーゼ
は通常洗剤として使用され、蛋白質に基づくしみを除去
することができる。これらはまた、食品加工にも使用さ
れ、食品材料中に存在する蛋白質用物質を組成物中、所
望の形にすることができる。

【従来の技術】

【０００４】照射および化学物質などの試剤および手段
によって細菌を変異誘発させる典型的な方法により、プ
ロテアーゼの分泌が起こる増殖期、そのタイミングおよ
び分泌されたプロテアーゼの活性レベルについて異なっ
た性質を示す多血症のミュータント株が生産される。し
かし、その変異誘発過程が基本的に不規則であり、所望
の性質に近付いた微生物を同定するのに必要な選択およ
びスクリーニング法が冗長であるため、これらの株はそ
の究極的な潜在能力に近付いていない。さらにこれらの
ミュータントはその親株、即ち、野性型株に復帰するこ
とができる。このような場合には所望の性質は失われて
しまう。不規則な変異誘発によって処理した場合、ミュ
ーテーションのタイプや部位は解らないか、あるいはほ
とんど特性化できないので、復帰の可能性も解らない。
このことは酵素合成細菌に基づく工業的生産に著しい不
安定を付与することになる。最後に、古典的な変異誘発
法は、過度の未熟溶菌のような望ましくない性質を、例
えばプロテアーゼレベルの低下のような望ましい表現形
質と共に表わすことが多い。

【０００５】桿菌類によって分泌されるプロテアーゼに
関しては特別の問題が存在している。その１つは、その
ようなプロテアーゼは少なくとも２種存在しているので
一方のみの欠落をスクリーニングすることが難しいこと
である。さらに、胞子形成およびプロテアーゼ生産の両
者に影響を与える多数の多形質発現ミューテーション
は、真のプロテアーゼミューテーションの分離を困難に
する。

【０００６】中性プロテアーゼ遺伝子の温度感受性ミュ
ータントが通常の変異誘発技術により得られており、Ｂ
acillus subtillisのクロモゾーム(染色体)中の調節お
よび構造遺伝子の位置を決めるのに使用されている
(Ｈ．Ｕeharaら１９７９，“Ｊ．Ｂact．" １３９: ５
８３−５９０)。さらにアルカリ性プロテアーゼ遺伝子
の推定のナンセンスミューテーションが報告されている
(Ｃ．Ｒoitschら１９８３，“Ｊ．Ｂact．" １５５: １
４５−１５２)。

【０００７】不活性なセリンプロテアーゼまたは非常に
減少した濃度のセリンプロテアーゼを生産する桿菌の温
度感受性ミュータントが単離されている。しかしこれら
のミュータントは無胞子性であり、約１０^-7〜１０^-8の
野性型への復帰頻度を示す(Ｆ．Ｐriest同上７１９
頁)。これらのミュータントは外来性蛋白質の組換体に
よる生産には不適当である。と言うのは、無胞子性ミュ
ータントは胞子形成ミュータントより最少培地中でのそ
の増殖サイクルの初期の段階において溶菌する傾向があ
り、そのため細胞内容物(細胞内プロテアーゼを含む)が
培養上清中に未成熟で放出されるからである。野性型復
帰体は培養上清を、それが分泌したプロテアーゼで汚染
するので、復帰の可能性を有することも望ましくない。

【０００８】桿菌類(Ｂacillus sp．)は外来性蛋白質の
発現用として提案されたが、分泌されたプロテアーゼが
存在し、所望の生産物がそれによって強力に加水分解さ
れるため、外来性蛋白質発現のための宿主として桿菌類
を商業的に受入れることが遅れてきた。胞子形成をする
ことができ、増殖期に胞子形成に関連してプロテアーゼ
を発現しないＢacillus megateriumミュータントが報告
されている。しかし、採用された分析法は他のプロテア
ーゼ類の存在を除外しなかったし、問題のプロテアーゼ
は胞子形成期には発現される(Ｃ．Ｌoshonら１９８２、
“Ｊ．Ｂact．"１５０: ３０３−３１１)。勿論これ
は、外来性蛋白質が培養中に蓄積し、傷つきやすい時期
である。

【発明の目的】

【０００９】本発明の目的は、増殖サイクルのあらゆる
時点において細胞外中性およびアルカリ性プロテアーゼ
を実質的に含んでおらず、実質的に正常な胞子形成特性
を示す桿菌株を組立てることである。外来性(ヘテロロ
ーガス)または内性(ホモローガス)の蛋白質を発現する
ためのコピー数の高いプラスミドで形質転換し得る復帰
不能の微生物、さもなくば正常なプロテアーゼを含んで
いない微生物が要求されている。

【００１０】入手し得るストックのものとは異なる性質
を持った酵素類が要求されている。特に、強力な酸化安
定性を有する酵素類は、洗濯物に使用されるプロテアー
ゼの漂白適合性および貯蔵寿命を延ばすのに有用であろ
う。同様に、酸化安定性の低いものは、酵素活性の迅速
なかつ効率的な消滅を必要とする工業的生産において有
用であろう。

【００１１】酵素のpＨ活性プロフィルを改良すること
は、その酵素を各種のプロセスにおいてより有効にする
のに役立つであろう。例えばプロテアーゼのpＨ活性プ
ロフィルを拡げれば、アルカリ性および中性の洗濯物の
両者に適した酵素が得られるであろう。このプロフィル
を狭くすると、特に修正した基質特異性と一緒にする
と、酵素は混合物中でより適合性のあるものとなるであ
ろう(後述)。

【００１２】原核生物のカルボニル水解酵素(原核生カ
ルボニル水解酵素)(基本的にはプロテアーゼであるがリ
パーゼも含む)を突然変異させると、多種多様の水解酵
素、特にＫm、Ｋcat、Ｋm／Ｋcat比および基質特異性に
おいて改良された特性を持ったものが得られる。これら
の酵素は、例えばペプチド製造あるいは洗濯に使用する
などの加水分解工程において存在すると予測される特定
の基質用に修正することができる。

【００１３】酵素の科学的な改変は知られている。例え
ばＩ．Ｓcindsen、１９７６、“Ｃarlsberg Ｒes．Ｃo
mmun．" ４１(５): ２３７−２９１参照。しかしこれら
の方法は、都合のよいアミノ酸残基が存在していること
に依存しており、共通の側鎖を持った全ての感受性の残
渣を改良するという点において非特異的であることが多
く、さらに、加工、例えば変性させることなく(これは
一般に活性を再設立する上において完全に復帰不能であ
る)、非感受性のアミノ酸残基に達することができない
という欠点を有している。このような方法は１つのアミ
ノ酸残基側鎖を他の側鎖または等価の機能体で置換える
ことを目的としているので、その限りにおいては変異誘
発法がこのような方法にとって代わることができる。

【００１４】cys残基をセリンに変換することからな
る、tＲＮＡ合成酵素の予定された、部位指定性の変異
誘発法が報告されている(Ｇ．Ｗinterら１９８２、“Ｎ
ature"２９９: ７５６−７５８; Ａ．Ｗilkinsonら１９
８４、“Ｎature" ３０７: １８７−１８８)。この方法
は大規模な変異誘発には実際的ではない。本発明は飽和
変異誘発(saturation mutagenesis)によりＤＮＡを変異
させるための簡便、迅速な方法を提供するものである。

【発明の要約】

【００１５】本明細書には、組換え宿主細胞中でサブチ
リシンおよび中性プロテアーゼのような原核生物のカル
ボニル水解酵素(カルボニルヒドロラーゼ)を生産する方
法が記載されており、この方法はプロ、プレ、またはプ
レプロ型のこれらの酵素を含む所望のサブチリシンまた
は中性プロテアーゼを暗号化している配列を含んだ発現
ベクターを使って宿主を形質転換し、その宿主を培養
し、所望の酵素を回収するものである。この暗号配列は
後に詳述するように、天然のものと正確に対応している
場合もあり、生産される蛋白質に望ましい性質を付与す
る改良部分を含んでいる場合もある。

【００１６】次いでこの新規な株を、このような操作を
しなければその宿主株中で発現されないポリペプチドを
暗号化している少なくとも１つのＤＮＡ部分で形質転換
し、その形質転換された株を培養し、ポリペプチドをそ
の培養物から回収する。このＤＮＡ部分は、真核生物
(酵母または哺乳動物)の蛋白質を暗号化しているＤＮＡ
であってもよいが、通常は宿主桿菌遺伝子の方向づけら
れたミュータントである。この新規な株はまた、その宿
主ゲノム以外の起源由来の細菌性遺伝子から発現される
蛋白質、あるいはこれらの外来性遺伝子またはその宿主
ゲノムからのホモローガス遺伝子を発現するベクターの
ための宿主としても役立つ。後者の場合、中性プロテア
ーゼまたはサブチリシンを含んでいないアミラーゼのよ
うな酵素が得られる。酵素的に活性なサブチリシンを含
んでいない中性プロテアーゼを培養で得ることができ、
またその逆も可能である。

【００１７】原核生物のカルボニル水解酵素のためのク
ローンした遺伝子をコピー数の高いプラスミドに結合さ
せ、親細胞に比べてはるかに高い収率でこの酵素を合成
することができる。本明細書においてはまた、水解酵素
の改変型を開示しており、これにはプロおよびプレプロ
チモーゲン型の酵素、そのプレ型、および方向づけられ
たそのミューテーションが含まれている。

【００１８】蛋白質の暗号領域内のあらゆる部位におい
て多数のミューテーションを迅速かつ効率的に生成させ
得る飽和変異誘発のための好適な方法は以下の工程から
なる: (a)前駆体(プレカーサー)蛋白質の少なくとも一部を暗
号化しているＤＮＡ部分を得、(b)その部分内の領域を
同定し、(c)その領域内にすでに存在しているヌクレオ
チドをヌクレオチドで置換えてその部分に特殊な少なく
とも１種の制限酵素部位を作り、これにより、発現され
たときにその領域によって暗号化されているアミノ酸を
変えることなく、その同定された領域に対する特殊な制
限部位を５'および３'に利用できるようにし、(d)５'お
よび３'末端に工程(c)で導入された制限酵素部位とアニ
ーリングすることができる配列を含んでおり、該ＤＮＡ
部分に結合させた場合、該前駆体蛋白質が、その内部に
おける少なくとも１個のアミノ酸が置換、欠落(切除)お
よび／または挿入された形で発現されるような複数のオ
リゴヌクレオチドを合成し、(e)その特異な部位を開裂
し得る制限酵素で工程(Ｃ)のＤＮＡ部分を消化し、そし
て、(f)工程(d)のオリゴヌクレオチドのそれぞれを工程
(e)の消化した部分に結合させ、複数のミュータントＤ
ＮＡ部分を得る。

【００１９】上記の方法またはその他の既知の方法によ
り、原核生物のカルボニル水解酵素を暗号化している分
離したＤＮＡにミューテーションを導入すると、そのＤ
ＮＡを発現した場合、水解酵素の予定された部位に少な
くとも１個のアミノ酸の置換、欠落(切除)または挿入が
起こる。この方法は野性型蛋白質のミュータントを作成
するのに(この場合、「前駆体」蛋白質は野性型である)ま
たはミュータントを野性型に返すのに(この場合「前駆
体」はミュータントである)有用である。

【００２０】前駆体酵素と異なる酸化安定性および／ま
たはpＨ活性プロフィルを示すミュータント酵素を回収
する。このようにして種々のＫm、Ｋcat、Ｋcat／Ｋm比
を持ち、基質特異性を有する原核生物カルボニル水解酵
素が得られる。

【００２１】本発明方法によって得られるミュータント
酵素を、常法により界面活性剤や洗浄剤と混合し、洗剤
工業あるいはその他の洗浄技術分野において有用な新規
な組成物を得ることができる。

【図面の説明】

【００２２】図１、図２および図３は機能的Ｂ．amylol
iquefaciensサブチリシン遺伝子の配列を示す模式図で
ある。図１においてはＢ．amyloliquefaciensゲノムの
１．５kbフラグメント上に、プロモーターおよびリボソ
ーム結合部位を含んだＢ．amyloliquefaciensのための
全機能配列が存在している。図２および図３はその暗号
鎖のヌクレオチド配列を、蛋白質のアミノ酸配列と関連
させて示している。そのＤＮＡ配列のプロモーター
(p)、リボソーム結合部位(rbs)および終止(term)領域も
示されている。

【００２３】図４はプール１(パネルＡ)およびプール２
(パネルＢ)でそれぞれプローブした鈍化陽性クローンの
レプリカ・ニトロセルロース・フィルターの結果を示す
グラフである。

【００２４】図５はサブチリシン発現プラスミド(pＳ
４)の制限分析を示している。pＢＳ４２ベクター配列
(４．５kb)は実線で、挿入配列(４．４kb)は点線で示し
てある。

【００２５】図６はpＢＳ４２およびpＳ４で形質転換し
た培養物からの上清について行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の結果を示すグラフである。

【００２６】図７はシャトルベクターpＢＳ４２の構成
を示している。

【００２７】図８はＢ．stbtilisサブチリシン遺伝子を
含む配列の制限地図を示す模式図である。

【００２８】図９および図１０は機能的なＢ．stbtilis
サブチリシン遺伝子の配列を示す模式図である。

【００２９】図１１はＢ．stbtilisサブチリシン遺伝子
の欠失ミュータントを得るための組立法を示す模式図で
ある。

【００３０】図１２はＢ．stbtilis中性プロテアーゼ遺
伝子の制限地図を示す模式図である。

【００３１】図１３および図１４はＢ．stbtilis中性プ
ロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図であ
る。

【００３２】図１５はＢ．stbtilis中性プロテアーゼ遺
伝子を含んでいるベクターの組立を示す模式図である。

【００３３】図１６、図１７および図２０は本発明方法
による変異誘発技術の具体例を示す模式図である。図１
６中、１は野性型のＤＮＡ配列、２はΔp２２２ＤＮＡ
配列、３はＫpnＩおよびＰstＩで切断されたΔp２２
２、４はオリゴヌクレオチドプールと結合した切断Δp
２２２を示す。図１７中、１は野性型ＤＮＡ配列、２は
Δp１６６、３はＳacＩおよびＸmaＩＩＩで切断したΔp
１６６、４はオリゴヌクレオチドプールに結合させた切
断Δp１６６を示す。図２０はＧ−１６９飽和変異誘発
を示しており、１は野性型ＤＮＡ配列、２はΔp１６９
ＤＮＡ配列、３はＫpnＩおよびＥcoＲＶで切断したΔp
１６９、４はオリゴヌクレオチドプールに結合させた切
断Δp１６９を示す。

【００３４】図１８はサブチリシンミュータントの強化
された酸化安定性を示すグラフである。図中、ＡはＡla
−２２２ミュータント、ＣはＣys−２２２ミュータン
ト、●はＭet−２２２(ＷＴ)を示す。

【００３５】図１９は野性型酵素と比較した場合のサブ
チリシンミュータントのpＨ活性プロフィルの変化を示
すグラフである。○はＣ−２２２、●はＷＴである。

【００３６】原核生物のカルボニル水解酵素は、Ｏ＝Ｃ
−Ｘ結合(Ｘは酸素または窒素)を含んでいる化合物を加
水分解する酵素である。これらには、基本的に加水分解
酵素、例えばリパーゼおよびペプチド加水分解酵素、例
えばサブチリシンまたはメタロプロテアーゼなどが含ま
れる。ペプチド加水分解酵素には、α−アミノアシルペ
プチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラー
ゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプ
チダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプ
ロテイナーゼ、カルボキシルプロテイナーゼおよびメタ
ロプロテイナーゼなどが含まれる。セリン、メタロ、チ
オールおよび酸プロテアーゼも、エンドおよびエキソプ
ロテアーゼと同様に含まれる。

【００３７】サブチリシンは通常、蛋白質またはペプチ
ドの内部ペプチド結合を開裂されるセリンプロテイナー
ゼである。メタロプロテアーゼは活性を現わすのに金属
イオンのコファクター(副因子)が必要なエキソまたはエ
ンドプロテアーゼである。

【００３８】サブチリシンや中性プロテアーゼには多数
の天然のミュータントが存在しており、これらは全て出
発遺伝子材料のソースとして同等の効果で使用すること
ができる。

【００３９】これらの酵素およびその遺伝子は多くの原
核生物から入手できる。好適な例はグラフ陰性の微生
物、例えばＥ．coliまたはシュードモナスおよびグラフ
陽性菌、例えばマイクロコッカスまたは桿菌(バチルス)
である。

【００４０】カルボニル水解酵素を暗号化している遺伝
子は本明細書の一般的な方法に従って得ることができ
る。実施例から明らかなように、この方法は、問題の水
解酵素領域を暗号化している推定配列を持った標識した
プローブを合成し、この水解酵素を発現する微生物から
ゲノムライブラリーを調製し、そしてプローブに対する
ハイブリダイゼーションにより、問題の遺伝子について
このライブラリーをスクリーニングすることからなる。
次いで陽性のハイブリダイズしたクローンを位置づけ、
配列を決定する。クローンした遺伝子を、宿主中での複
製に必要な領域を持った発現ベクター(これもクローニ
ングベクターであってよい)に結合させ、そのプラスミ
ドを宿主にトランスフェクトして酵素を合成させ、その
組換え宿主細胞を酵素合成に有利に条件下で、通常抗生
物質の存在により与えられる選択圧の下で(これに対す
る耐性はベクターにより暗号化されている)で培養す
る。このような条件下で培養すると、形質転換されるの
が親の微生物であっても、その野性型の親の微生物の酵
素合成よりも遥かに高い効率で酵素が生産される。

【００４１】「発現ベクター」とは、適当な宿主中でＤＮ
Ａを発現させ得る適当なコントロール(調節)配列に機能
的に結合している(operably linked)ＤＮＡ配列を含有
しているＤＮＡ構成物を意味する。このようなコントロ
ール配列には転写を司るプロモーター、このような転写
を調節する、場合により存在するオペレータ配列、適当
な mＲＮＡリボソーム結合サイトを暗号化している配列
および転写および翻訳の終了を支配する配列などが含ま
れる。ベクターはプラスミド、ファージ粒子または単に
洗剤的なゲノム挿入物であってよい。ベクターを適当な
宿主に導入すると、このベクターは複製することがで
き、宿主ゲノムとは独立に機能し、またある場合にはそ
のゲノム自体に組み込まれることもある。本明細書にお
いて「プラスミド」と「ベクター」とは交換可能に使用する
ことがある。それはプラスミドは現在において最も普通
に使用されるベクターの形態であるからである。しか
し、本発明は同等の機能を営む現在知られている、ある
いは将来知られるであろう発現ベクターのあらゆる形を
も包含するものである。

【００４２】「組換え宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技術
を使って組立てられたベクターで形質転換またはトラン
スフェクトされた細胞を意味する。本発明においては、
組換え宿主細胞は、原核生物のカルボニル水解酵素を暗
号化している発現ベクターによって形質転換されたもの
であるので、その水解酵素を種々の形で生産するものを
意味する。この組換え宿主細胞は形質転換前に１つの形
のカルボニル水解酵素を生産したものであってもよく、
また生産しなかったものであってもよい。

【００４３】「機能的に結合」という用語を２つのＤＮＡ
領域の関係について用いる場合、それらが互いに機能的
に関連し合っていることを意味する。例えば１つのプレ
配列を、もしそれが信号配列として機能するならば、ペ
プチドと機能的に結合させると、これは蛋白質の成熟型
の分泌に関与しほとんどの場合信号配列の開裂に関係す
る。プロモーターを暗号配列に機能的に結合させると、
それはその暗号配列の転写を支配する。リボソーム結合
サイトは、それを翻訳可能なように位置づけると、それ
は暗号配列と機能的に結合されたことになる。

【００４４】「プロヒドロラーゼ」とは、酵素を不活性化
する追加のＮ末端アミノ酸残基を含んでいる水解酵素で
あって、その残基が除去されたとき酵素となる水解酵素
を意味する。多くの蛋白質分解酵素は変換性プロ酵素産
物として天然に存在し、ポストー翻訳産物が存在しない
とこの形で発現される。

【００４５】「プレ配列」とは、水解酵素の分泌に関与す
る、水解酵素のＮ末端部分に結合したアミノ酸の信号配
列を意味する。プレ配列も、本明細書に記載した同じ方
法で改変してもよく、これには予定したミューテーショ
ンを導入することが含まれる。水解酵素と結合すると、
目的とする蛋白質「プレヒドロラーゼ」になる。従って、
本発明の目的に叶うプレヒドロラーゼはプレサブチリシ
ンおよびプレプロサブチリシンである。プレヒドロラー
ゼは、プレプロ暗号領域から、「プロ」配列(あるいは酵
素を不活性な状態に維持する、そのプロ配列の少なくと
もその部分)を削除し、次いでそのプレヒドロラーゼを
発現させることにより生産される。このようにすると生
物はプロ酵素ではなく活性酵素を分泌する。

【００４６】このクローンしたカルボニルヒドロラーゼ
を使って、その水解酵素を発現させるために宿主細胞を
形質転換する。記述したように、洗濯物におけるサブチ
リシンのように、水解酵素がその改変されない形で工業
的に使用し得る場合には、このことは興味ある事実であ
る。好ましい実施態様では、ヒドロラーゼ遺伝子はコピ
ー数の高いプラスミドに結合させる。このプラスミドは
宿主中で、それが以下に述べるようなプラスミドの複製
に必要なよく知られた要素を含んでいるという意味にお
いて複製される: 問題の遺伝子に機能的に結合したプロ
モーター(これは、もしそれが認識されるならば、すな
わち宿主細胞によって転写されるならば、その遺伝子自
身のホモローガスプロモーターとして供給されてもよ
い)、転写終了およびポリアデニル化領域(宿主細胞によ
って転写された mＲＮＡの、そのヒドロラーゼ遺伝子に
対する安定性のために必要である)(これは外来性である
かまたはそのヒドロラーゼ遺伝子の内性終止領域によっ
て供給される)および望ましくは抗生物質含有培地中
で、プラスミドで感染された宿主細胞の増殖を連続的に
維持し得る抗生物質耐性遺伝子のような選択遺伝子。コ
ピー数の多いプラスミドは、また宿主のための複製起源
を含んでおり、これにより染色体の制限を受けることな
く細胞質内で多数のプラスミドが生成する。しかしヒド
ロラーゼ遺伝子の複数のコピーを宿主ゲノムに組込むこ
とも本発明の範囲に含まれる。これはホモローガスな組
換えに特に感受性のある細菌株によって促進される。得
られた宿主細胞は組換え宿主細胞と呼ばれる。

【００４７】カルボニルヒドロラーゼ遺伝子をクローン
したら、その遺伝子の用途を野性型または前駆体酵素の
合成を凌駕して強化するために種々の改変を行なう。前
駆体酵素は、本明細書に記載した方法で改変する前の酵
素である。通常この前駆体は、この方法に従って改変さ
れたＤＮＡを付与した微生物によって発現される酵素で
ある。本発明でいう「前駆体」とは、前駆体酵素それ自体
を操作することにより生成酵素を作る時の前駆体を意味
するものではないと解すべきである。

【００４８】この改変の最初のステップとして、ホモロ
ーガス遺伝子を含んでいる組換え陽性(rec⁺)微生物から
その遺伝子を削除してもよい。これはクローンした遺伝
子のインビトロ欠失ミューテーションを微生物のゲノム
と組換えることにより達成することができる。Ｅ．coli
や桿菌のように多くの微生物株が組換え可能であること
が知られている。必要なのは、候補宿主のホモローガス
領域と組換えられる欠失ミュータントからの残りのＤＮ
Ａの領域である。この欠失は暗号領域内であってもよく
(酵素的に不活性なポリペプチドを残す)あるいはまたホ
モローガスな境界領域(例えばプロモーターまたは終止
領域)が宿主に存在する限りは全暗号領域を含んでいて
もよい。宿主が欠失ミュータントとの組換えを受け入れ
たかどうかは、形質転換された表現形質の欠失について
スクリーニングすることにより決定される。これは、カ
ルボニルヒドロラーゼの場合には、本来、水解酵素によ
って加水分解される染色体性の基質を開裂する能力を失
っているかどうかを宿主培養物について分析することに
より容易に達成することができる。

【００４９】プロテアーゼ欠失ミュータントを含んだ形
質転換宿主は、蛋白質分解酵素と適合しない生産物を合
成するのに有用である。このような宿主は、ここに記載
した欠失プロテアーゼを分泌することはできないが、事
実上正常に胞子形成を行なう。さらに、この形質転換体
のその他の増殖特性は親の微生物と実質的に同じであ
る。このような微生物は、その親細胞よりも外来性蛋白
質の不活性化において活性が低く、そしてこれらの宿主
は、既知のプロテアーゼ欠失微生物よりも優れた増殖特
性を持っているという点で有用である。しかし、本発明
方法に従って中性プロテアーゼおよびサブチリシンを欠
失させるということは、桿菌のすべての蛋白質分解活性
を除去するということではない。通常、細胞外には分泌
されない細胞内プロテアーゼは培養の後期には「漏れ」た
りまたはその細胞から拡散すると考えられている。これ
らの分子内プロテアーゼは、それらの酵素がここで定義
されているように、サブチリシンまたは中性プロテアー
ゼであってもよく、そうでないかもしれない。従って、
本発明の新規な桿菌株は、通常その親株において細胞外
に分泌されるサブチリシンおよび／または中性プロテア
ーゼ酵素を分泌することができない。「できない」とは野
性型に復帰しないことを意味する。復帰は従来知られて
いるプロテアーゼを欠落した天然株に関して存在してい
る有限の可能性である。というのは、このような株の表
現形質は容易に復帰し得るミューテーション、例えば点
変異の関数ではないとう保証はないからである。これを
本発明で提供する極めて大きな欠失と比較すべきであ
る。

【００５０】本発明に係る欠失ミュータント−形質転換
宿主細胞は、図１、図２、図３および図９、図１０また
は図１３、図１４に示した遺伝子と実質的に相同である
と定義される遺伝子であって、酵素的に活性な中性プロ
テアーゼまたはサブチリシンを暗号化している遺伝子を
含んでいない。「相同」な遺伝子は、図１、図２、図３お
よび図９、図１０または図１３、図１４に示した遺伝子
と、極めて厳密な条件下でハイブリダイズし得る暗号領
域を含んでいる。

【００５１】カルボニルヒドロラーゼ欠失ミュータント
を含んでいる微生物株は２つの基本的なプロセスにおい
て有用である。１つの態様では、通常宿主によって発現
される、その欠失遺伝子によって暗号化された蛋白質で
汚染されていないことが望ましい生産物を発酵生産する
のに好都合である。１つの例はアミラーゼの発酵合成で
あり、この場合、不純物としてのプロテアーゼがアミラ
ーゼの工業的使用において各種の妨害をする。本発明に
係る新規な株は、このような生産物から夾雑カルボニル
ヒドロラーゼを除去するという負担を軽減させるもので
ある。

【００５２】２番目の重要な実施態様では、サブチリシ
ンおよび中性プロテアーゼ欠失−ミュータント株は、本
来その株によって暗号化されていない蛋白質を合成する
のに有用である。これらの蛋白質は２つのクラスの何れ
かである。最初のクラスは宿主のそれと実質的な形質転
換前の相同性を示さない遺伝子によって暗号化されてい
る蛋白質からなる。これらはその他の原核生物からの蛋
白質であってもよいが、しかし通常は、酵母または高等
な真核生物、特に哺乳類からの真核性蛋白質である。発
現されたホモローガスでない蛋白質を原核生物が分解す
る可能性が減少するので、本発明に係る新規な株は、そ
のような蛋白質を暗号化している遺伝子を含有している
発現可能なベクターのための有用な宿主として役立つの
である。

【００５３】第２のグループは、宿主のそれと実質的に
形質転換前相同性を示すミュータント宿主遺伝子からな
る。これには微生物のもの(レンニン、例えばムコール
属からのレンニン)と同様、サブチリシンおよび中性プ
ロテアーゼのような原核生物のカルボニルヒドロラーゼ
のミューテーションが含まれる。これらのミュータント
は、工業的に使用するための前駆体酵素の性質を改善す
るために選択される。

【００５４】本発明方法はこのようなミュータントの組
立ておよび同定を行なう新規な方法を提供するものであ
る。まずヒドロラーゼを暗号化している遺伝子を得、そ
の全部あるいは一部の配列決定を行なう。次いでその配
列を精査して、発現される酵素の１もしくはそれ以上の
アミノ酸のミューテーション(削除、挿入または置換)を
作成するのに望ましい場所を決定する。この点に接して
いる配列に、発現されたときに各種のミュータントをコ
ードすることになるオリゴヌクレオチドプールでその遺
伝子の短いセグメント(断片)を置換するための制限サイ
トが存在しているかどうかを評価する。選択された点か
ら好適な距離(１０〜１５ヌクレオチド)内の場所に特異
な制限部位は通常存在しないので、その遺伝子のヌクレ
オチドを、最終的な組立物において解読枠も暗号化され
ているアミノ酸も変化しないように、置換することによ
ってそのような部位を生成させる。好適な隣接領域の位
置づけ、および必要な変化を評価して２つの特異な制限
部位配列に到達するための仕事は、遺伝暗号の重剰性、
その遺伝子の制限酵素地図および多数の異なった制限酵
素によって常法通り行なう。もし偶然に１つの隣接する
特異な制限部位が利用できるような場合には、上の方法
はその部位を含有してない隣接領域に関してのみ使用す
る。

【００５５】その配列を変化させ所望の配列にするため
の遺伝子のミューテーションは、常套の方法に従ってＭ
１３プライマーエクステンション(延長)によって行な
う。この遺伝子をクローンしたら、それを特異な制限酵
素で消化し、多数の最終的な末端相補性オリゴヌクレオ
チドカセットをその特異な部位に結合させる。オリゴヌ
クレオチドは全て同じ制限部位を持つように合成するこ
とができ、かつ、制限部位を作成するのに合成リンカー
が必要でないので、この方法によって変異誘発が極めて
単純化される。

【００５６】問題の遺伝子中に存在していない部位を持
った市販の制限酵素の数は非常に多い。適当なＤＮＡ配
列コンピューターサーチ・プログラムを使用すれば潜在
的な５'および３'特異隣接部位を見出すのが簡単にな
る。基本的な制約は、制限部位の作成で導入されるミュ
ーテーションは全て最終的に組立てられたアミノ酸暗号
配列に対してサイレントでなければならないということ
である。標的コドンに対して５'の候補制限部位につい
ては、配列は、その候補酵素の切断に対して５'の認識
配列中に少なくとも、１つを除く全てのヌクレオチドを
含んでいる遺伝子内に存在していなければならない。例
えば、もし近くの５'配列がＮＣＣ、ＣＮＣまたはＣＣ
Ｎを含んでいるならば、平滑切断酵素ＳmaＩ(ＣＣＣ／
ＧＧＧ)が５'候補となるだろう。さらに、もしＮをＣに
変えなければならない場合、この変換はアミノ酸暗号配
列を無傷にしておかなければならない。制限部位を導入
するのに永久的なサイレントミューテーションが必要な
場合、滅多に使用しないコドンの導入を避けたいと考え
るであろう。ＳmaＩについての同様の状況が、配列ＮＧ
Ｇ、ＧＮＧ、またはＧＧＮが存在しなければならないこ
とを除いて３'隣接部位に適用される。候補酵素を位置
づけるためのこの制限は、平滑切断酵素については最も
緩和であり、４塩基突き出し酵素については最も厳格で
ある。一般に多くの候補部位を利用することができる。
ここに述べたコドン−２２２標的については、ＫpnＩ部
位から１塩基対５'にＢalＩ部位(ＴＧＧ／ＣＣＡ)を手
術することができた。３'ＥcoＲＶ部位(ＧＡＴ／ＡＴ
Ｃ)はＰstＩ部位に向かって１１塩基対５'を使用するこ
とができた。平滑末端から４塩基突き出しに渡る末端を
持ったカセットは容易に機能するであろう。回顧する
と、この仮定のＥcoＲＶ部位は使用したオリゴヌクレオ
チドカセットを極めて短くし(９および１３塩基対)、か
くして純度を上げプールバイアスの問題を低くしたこと
であろう。オリゴヌクレオチドカセットの結合が一方向
に保証され得るように隣接部位はそれ自体が結合できな
いものを選択すべきである。

【００５７】ミューテーション自体は予め決定する必要
はない。例えばオリゴヌクレオチドカセットまたはフラ
グメントはニトロソグアニジンあるいはその他の突然変
異誘発物質で無秩序に変異誘発させ、それを予め決めら
れた場所でヒドロラーゼ遺伝子に結合させる。

【００５８】適当な宿主に形質転換することによって発
現されたミュータントカルボニルヒドロラーゼは、所望
の特性、例えば基質特異性、酸化安定性、pＨ活性プロ
フィルなどを示す酵素についてスクリーニング(選択)す
る。

【００５９】基質特異性の変化は、前駆体酵素のＫcat
／Ｋm比とそのミュータントのそれとの違いによって決
められる。Ｋcat／Ｋm比は触媒効率の大きさを現わして
いる。Ｋcat／Ｋm比が増加または減少した真核生物のカ
ルボニルヒドロラーゼについては実施例に記載してあ
る。一般に目的とするところは、与えられた基質に対し
て大きなＫcat／Ｋm比(数字で言えば大きな比)を持った
ミュータントを確保することであり、これによって標的
基質に対して酵素をより効率よく使用することができる
のである。ある基質に対してＫcat／Ｋm比が増加すると
別の基質に対するＫcat／Ｋm比が減少するということが
ある。これは基質特異性のシフトであり、このようなシ
フトを示すミュータントは、前駆体が望ましくない場合
に利用価値があり、例えば基質混合物中の特定の基質の
望ましくない加水分解を防止することができる。Ｋcat
およびＫmは既知の方法あるいは実施例１８に記載の方
法に従って測定する。

【００６０】酸化安定性は、実施例に記載したミュータ
ントによって達成されるもう１つの目標である。この安
定性は各種の使用目的に応じて強化したり減少したりす
ることができる。安定性は１もしくはそれ以上のメチオ
ニン、トリプトファン、システインまたはリジン残基を
削除し、場合によりメチオニン、トリプトファン、シス
テインまたはリジンの１つではない他のアミノ酸残基で
置換えることにより強化される。その反対の置換を行な
うと酸化安定性が減少する。置換された残基は好ましく
はアラニルであるが中性残基も好適である。

【００６１】改変されたpＨ活性プロフィルを示すミュ
ータントも得られる。pＨ活性プロフィルは酵素活性に
対するpＨのプロットであり、実施例１９に例示したよ
うに、あるいは既知の方法で作成することができる。よ
り広いプロフィルを持ったミュータント、すなわちある
pＨにおいてその前駆体よりも強い活性を有するが、如
何なるpＨにおいても顕著に強い活性を示さないミュー
タントあるいはより鋭いプロフィルを持ったミュータン
ト、すなわち、ある一定のpＨではその前駆体と比べて
強い活性を有するが、その他のpＨではより低い活性を
持ったミュータントを得るのが好ましい。

【００６２】上記のミュータントは好ましくはその酵素
の活性部位内で調製する。と言うのはこれらのミューテ
ーションは活性に最も影響を与えそうであるからであ
る。しかし酵素の安定性または形態にとって重要なその
他の部位でのミュータントも有用でる。桿菌のサブチリ
シンまたはそのプレ、プレプロおよびプロ型の場合、チ
ロシン−１、アスパルテート＋３２、アスパラギン＋１
５５、チロシン＋１０４、メチオニン＋２２２、グリシ
ン＋１６６、ヒスチジン＋６４、グリシン＋１６９、フ
ェニルアラニン＋１８９、セリン＋３３、セリン＋２２
１、チロシン＋２１７、クルタメート＋１５６および／
またはアラニン＋１５２におけるミューテーションによ
って上記の特性またはその酵素のプロセシングにおいて
変化したミュータントが得られる。これらのアミノ酸の
位置番号は図９および図１０から明らかなように、Ｂ．
amyloliquefaciensのサブチリシンに対して決められた
ものである。削除または挿入を行なうと与えられた位置
からＮ末端方向において対応するアミノ酸の位置がシフ
トし、残部はその元の位置すなわち野性型の位置番号を
取らなくなることは理解されるであろう。また、対立遺
伝子の違いおよび各種の原核生物種の中での変動によっ
て位置のシフトが起こり、従って、そのようなサブチリ
シンの位置１６９はグリシンでは占められなくなるであ
ろう。このような場合、グリシンの新しい位置は、グリ
シン＋１６９という定義で表わされ、その範囲に包含さ
れる。グリシン＋１６９に対する新しい位置は図９およ
び図１０のグリシン＋１６９に相同な領域について問題
のサブチリシンを精査することにより容易に同定され
る。

【００６３】１もしくはそれ以上のアミノ酸残基、通常
約１０個までのアミノ酸残基を変異させ得る。しかし、
商業的な実際性を除けばミューテーションの数に制限は
ない。

【００６４】本発明の酵素は塩の形で得ることもでき
る。蛋白質のイオン化状態は、もし、それが溶液中にあ
る場合は、その周囲の媒質のpＨに依存し、もしそれが
固状の形である場合はそれが調製された溶液のpＨに依
存することは明らかである。酸性の蛋白質は通常、例え
ばアンモニウム塩、ナトリウム塩またはカリウム塩とし
て調製され、塩基性蛋白質は塩酸塩、硫酸塩または燐酸
塩として調製される。従って、本発明は、カルボニルヒ
ドロラーゼの電気的に中性のもの、および塩の形のもの
の両者を含み、カルボニルヒドロラーゼという用語はイ
オン化状態に関係なく有機化学の基本的な構造を指すも
のとする。

【００６５】本発明のミュータントは特に食品加工およ
び洗浄技術において有用である。ミュータントを包含す
るこのカルボニルヒドロラーゼは本明細書に記載した発
酵法により製造され適当な技術で回収される(例えば、
Ｋ．Ａnstrup、１９７４、Ｉndustrial Ａspects of
Ｂiochemistry, ed．Ｂ．Ｓpencer２３−４６頁参
照)。これらは自体既知の方法で洗剤または他の界面活
性剤とともに製剤化され、工業的過程、特に洗剤技術に
おいて使用される。後者の場合、この酵素は蛋白質分解
酵素の分野でよく知られているように洗剤、ビルダー、
漂白剤および／または蛍光漂白剤と混合する。好適な洗
剤には直鎖状アルキルベンゼンスルホネート、アルキル
エトキシ化サルフェート、硫酸化直鎖状アルコールまた
はエトキシ化直鎖状アルコールなどが含まれる。この組
成物は粒状または液状に製剤化することができる(例え
ば、米国特許３６２３９５７号、４４０４１２８号、４
３８１２４７号、４４０４１１５号、４３１８８１８
号、４２６１８６８号、４２４２２１９号、４１４２９
９９号、４１１１８５５号、４０１１１６９号、４０９
０９７３号、３９８５６８６号、３７９０４８２号、３
７４９６７１号、３５６０３９２号、３５５８４９８号
および３５５７００２号参照)。

【００６６】以下に本発明の実施態様を記載するが、本
発明はこれによって限定されるものと解釈してはならな
い。実験操作における用語の解説

【００６７】実施例を簡単にするために、度々使用する
方法は簡単な用語によって表わす。プラスミドは大文字
および／または数値を前および／または後に付けた小文
字のpで表わす。本発明で使用する出発プラスミドは市
販されているか、無制限に利用可能であるか、あるいは
そのような入手可能なプラスミドから既知の方法に従っ
て組立てることができる。

【００６８】「Ｋlenow処置」とは、２本鎖ＤＮＡの凹ん
だ３'末端を、ヌクレオチドに相補的なデオキシリボヌ
クレオチドで満たして、そのＤＮＡ鎖の突出した５'末
端を作成する過程を言う。この方法は通常ＤＮＡの制限
酵素開裂によって生成した凹んだ末端を満たすのに使わ
れる。これによってその後の結合に必要な平滑末端が作
られる。Ｋlenow処置は、触媒的に活性な量の(通常１０
単位)Ｅ．coli ＤＮＡポリメラーゼＩのＫlenowフラグ
メント(「Ｋlenow」)の存在下、満たすべきＤＮＡと適当
な相補的デオキシリボヌクレオチドと反応させることに
より(通常１５℃で１５分間)達成される。Ｋlenowおよ
びその他の必要な試薬は市販されている。この方法につ
いては多数の報告がある(例えば、Ｔ．Ｍaniatisら１９
８２、Ｍolecular Ｃloning、１０７−１０８頁参
照)。

【００６９】ＤＮＡの「消化」とは、そのＤＮＡのある部
位だけに作用する酵素によってそのＤＮＡを触媒的に開
裂することを言う。このような酵素は制限酵素と呼ば
れ、それぞれの酵素に特異な部位を制限部位と呼ぶ。
「部分的」消化とは制限酵素による不完全な消化を意味
し、ＤＮＡ基質中の、与えられた制限エンドヌクレアー
ゼの開裂部位の幾つかが開裂されるが全てが開裂されな
いような条件を選んで行なわれる。本発明で使用した各
種の制限酵素は市販されており、その反応条件、コファ
クターおよびその他の必要な事項は、その酵素の供給者
によって確立されたものを使用した。制限酵素は通常、
大文字およびそれに続くその他の文字および通常その制
限酵素が初めて得られた微生物を表わす番号で構成され
る略号によって表わされる。通常約１μgのプラスミド
またはＤＮＡフラグメントは、約２０μlの緩衝液中約
１単位の酵素とともに使用される。個々の制限酵素に対
する適当な緩衝液および基質の量は製造業者によって指
示されている。通常、インキュベーション時間は３７℃
で約１時間であるが、製造業者の指示には従い、それを
変えることもできる。インキュベーションの後、蛋白質
をフェノールおよびクロロホルムによる抽出で除き、消
化した核酸をエタノールを用いた沈澱によって水性フラ
クションから回収する。制限酵素で消化した場合、ＤＮ
Ａフラグメントの２つ制限開裂末端が「環化」、すなわ
ち、閉じた環を形成するのを防ぐために、細菌性アルカ
リホスファターゼで末端の５'燐酸を加水分解する操作
を行う。環化が起こるとその制限部位に別のＤＮＡフラ
グメントが挿入するのが妨げられる。特に、指摘しない
限り、プラスミドの消化は５'末端の脱燐酸化を伴って
いないと解釈すべきである。脱燐酸化の方法および試薬
は通常のものである(Ｔ．Ｍniatisら前記１３３−１３
４頁参照)。

【００７０】制限消化物から、ＤＮＡのある特定のフラ
グメントを「回収」または「分離」するとは、消化物を６％
のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、分
子量によって所望のフラグメントを同定し(マーカーと
して分子量の解っているＤＮＡフラグメントを使用す
る)、所望のフラグメントを含んでいるゲル断片を切り
取り、ＤＮＡからゲルを分離することを言う。この方法
は一般に知られている(例えば、Ｒ．Ｌawnら１９８１，
“Ｎucleic Ａcids Ｒes．“９: ６１０３−６１１４
およびＤ．Ｇoeddelら(１９８０)“Ｎucleic Ａcids
Ｒes．" ８: ４０５７参照)。

【００７１】「サザーン分析」とは、消化物またはＤＮＡ
含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の標識化(ラ
ベル)したオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメン
トとハイブリダイズさせることにより確認する方法を言
う。本発明においてはサザーン分析とはＧ．Ｗahlら１
９７９、“Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．Ｕ．Ｓ．Ａ．"
７６: ３６８３−３６８７に記載された方法により１％
アガロース上で消化物を分離して脱プリン化(depurinat
ion)し、Ｅ．Ｓouthern, １９７５，“Ｊ．Ｍol．Ｂio
l．“９８: ５０３−５１７の方法でニトロセルロース
に転移させ、そしてＴ．Ｍaniatisら１９７８，“Ｃel
l" １５: ６８７−７０１に記載の方法でハイブリダイ
ゼーションを行うことを意味する。

【００７２】「形質転換」とは、ＤＮＡが染色体外要素ま
たは染色体組込体として複製可能なように、ＤＮＡを生
物に導入することを意味する。特に指摘しない限り、本
発明で使用した方法は、Ｅ．coliの形質転換については
Ｍandelら１９７０、“Ｊ．Ｍol．Ｂiol．" ５３: １５
４のＣaＣl₂法であり、桿菌については、Ａnagnostoplo
usら１９６１、“Ｊ．Ｂact．" ８１: ７９１−７４６
の方法による。

【００７３】「結合(ライゲーション)」とは、２本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成させる
ことを言う(Ｔ．Ｍaniatisら前記１４６頁)。特に指摘
しない限り、結合は既知の緩衝液および条件を使って、
ほぼ当モル量の結合すべきＤＮＡフラグメント０．５μ
g当たり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)
を用いて行なう。形質転換体からプラスミドを調製し、
制限地図を作成して分析し、そして／またはＭessingら
１９８１、“Ｎucleic Ａcids Ｒes．“, ９: ３０９
の方法により配列決定する。

【００７４】形質転換体からＤＮＡの「調製」とは、微生
物培養液からプラスミドＤＮＡを分離することを言う。
特に指摘しない限りＭaniatisら(前記、９０頁)のアル
カリ／ＳＤＳ法を使用した。

【００７５】「オリゴヌクレオチド」とは、Ｃreaらの方
法(１９８０，“Ｎucleic ＡcidsＲes．" ８: ２３３
１−２３４８)によって化学的に合成し(但し縮合剤とし
てメシチレンニトロトリアゾールを使用した)、次い
で、ポリアクリルアミドゲルで精製した短い１本鎖また
は２本鎖ポリデオキシヌクレオチドを言う。

【００７６】全ての文献を参考として明細書に記載し
た。

【００７７】実施例１ Ｂ．amyloliquifaciensからゲ
ノムＤＮＡライブラリーの調製およびサブチリシン遺伝
子の分離 細胞外Ｂ．amyloliquefaciensの既知のアミノ酸配列に
より適当なプローブ混合物の組立が可能である。成熟サ
ブチリシンの配列が図１、図２および図３に記載されて
おり、これには本発明者らにより見出されたその他の情
報も含まれている。１１７位から１２１位までのアミノ
酸の配列に対する全てのコドンの多義性は以下の配列の
８つのオリゴヌクレオチドのプールでカバーされる:

【化１】 Ｊ．Ｍarmur,“Ｊ．Ｍol,Ｂiol．"３:２０８により記載
されているＢ．amyloliquefaciens(ＡＴＣＣ Ｎo．２
３８４４)から分離した染色体ＤＮＡをＳau３Ａで部分
消化し、フラグメントを大きさで選択し、脱燐酸化した
pＢＳ４２のＢamＨ１部位に結合させた(pＢＳ４２は、
Ｅ．coliおよび桿菌の両者で機能的な複製起源を含んで
いるシャトルベクターである。これは実施例４に記載の
方法で調製する)。コンピテント細胞２５０μl当り８０
〜４００ng(ナノグラム)のライブラリーＤＮＡを用い、
Ｍ．Ｍandelら１９７０,“Ｊ．Ｍol,Ｂio．"５３:１５
４の方法に従って、ベクターを含有するこのＳau３Ａフ
ラグメントをＥ．coli Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣ Ｎ
o．３１４４６)に導入した。

【００７８】形質転換混合物からの細胞を、ＬＢ培地＋
１２．５μg／mlのクロラムフェニコールを含有するプ
レート１５０mm当り１〜５×１０³形質転換体の密度に
なるように置き、肉眼で観察できるコロニーが現われる
まで３７℃で一夜増殖させた。次いでこのプレートを、
ＬＢ／クロラムフェニコールプレート上に積層したＢＡ
８５ニトロセルロースフィルター平板反復法でプリント
した。この平板反復プレートを３７℃で１０〜１２時間
増殖させ、フィルターをＬＢおよび１５０μg／mlのス
ペクチノマイシンを含有している新しいプレートに移
し、プラスミドプールを増幅させた。

【００７９】３７℃で一夜インキュベートした後、Ｇru
nsteinおよびＨognessの方法(１９７５,“Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)"７２:３９６１)によりフィ
ルターを処理した。成功した形質転換体約２０,０００
の内、陽性コロニーは２５個であった。これらの陽性コ
ロニーの内８個を画線し、個々のクローンを純化した。
各画線から２４のコロニーをマイクロタイターウエル中
で増殖させ２枚の反復フィルター上にスタンプし、１個
のヌクレオチドだけが異なっている以下のもの:

【化２】 の何れかを用いて上記した方法でプローブした。図４に
示したように、プール１はプール２よりも遥かに高い割
合で全ての陽性クローンとハイブリダイズし、特異なハ
イブリダイゼイションを暗示した。

【００８０】陽性クローンからのミニプラスミド標品
(Ｍaniatisら、前記)５個の内４個は、Ｓau３Ａまたは
ＨincＩＩで消化すると同一の制限消化物パターンを示
した。Ｍaniatisら(前記)の方法により、これらの４つ
の同一のコロニーの１つから分離したプラスミドは全て
正しい遺伝子配列を持っており、これをpＳ４と命名し
た。制限分析により決定したこのプラスミドの特徴を図
５に示す。

【００８１】実施例２ サブチリシン遺伝子の発現 Ｂacillus subtilis Ｉ−１６８(カタログＮo．１−
Ａ １,Ｂacillus Ｇenetic Ｓtock Ｃenter)をpＳ
４で形質転換し、１個のクロラムフェニコール耐性形質
転換体を最少培地で増殖させた。２４時間後培養物を遠
沈し、上清(１０〜２００μl)およびペレットを、０．
１Ｍ燐酸ナトリウム(pＨ８．０)中２５℃で染色体基質
サクシニル−Ｌ−ala−ala−pro−phe−p−ニトロアニ
リド(０．２μＭ)１mlを使って４１２nmにおける１分当
りの吸収の変化を測定することにより、蛋白質分解活性
を分析した。対照(コントロール)として使用したpＢＳ
４２で形質転換したＢ．subtilis Ｉ−１６８培養物
は、pＳ４で形質転換した培養物の活性の１／２００以
下の活性を示した。pＳ４培養物のプロテアーゼ活性の
９５％以上が上清に存在しており、これはフェニルメチ
ルスルホニルフルオライド(ＰＭＳＦ)で処理すると完全
に阻害されたがＥＤＴＡでは阻害を受けなかった。

【００８２】上清の一部をＰＭＳＦおよびＥＤＴＡで処
理し、全てのプロテアーゼ活性を阻害し、Ｌaemmli,
Ｕ．Ｋ．,１９７０“Ｎature",２２７:６８０の方法に
従って、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。この
上清を調製するために、１６μlの上清を１mＭＰＭＳ
Ｆ、１０mＭＥＤＴＡで１０分間処理し、４μlの５×濃
ＳＤＳ試料緩衝液マイナスβ−メルカプトエタノールと
ともに煮沸した。pＳ４、pＢＳ４２で形質転換した細胞
および形質転換しなかったＢ．amyloliquefaciensの上
清を使った泳動上のＣoomassie染色の結果を図６に示
す。レーン３はＢ．amyloliquefaciensからの標準品と
してのサブチリシンを示している。pＢＳ４２で形質転
換したＢ．subtilisからの上清である２レーンには、p
Ｓ４形質転換宿主からのレーン１によって示されるサブ
チリシンに伴っている３１,０００ＭＷ(分子量)帯(バン
ド)がなかった。サブチリシンについての約３１,０００
ＭＷのバンドは、一般に既知の分子量２７,５００のサ
ブチリシン標準品によって示される遅い移動率の特徴で
ある。

【００８３】実施例３ Ｂ．amyloliquefaciensサブチ
リシン遺伝子の配列決定 pＳ４のＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメント(ここでＥcoＲ
Ｉ部位はＨincＩＩ部位の変換により組立てられた)の全
配列を、Ｆ．Ｓangerの方法(１９７７,“Ｐroc．Ｂat
l．Ａcad．Ｓci(ＵＳＡ)",７４:５４６３)により決定し
た。図５の制限地図を参照すると、ＢamＨＩ−ＰvuＩＩ
フラグメントはサザーン分析によりプール１のオリゴヌ
クレオチドとハイブリダイズすることが解った。このフ
ラグメントの配列決定により得られたデータから残りの
フラグメントの配列が決定された(例えばＰvuＩＩ−Ｈi
ncＩＩおよびＡvaＩ−ＡvaＩ)。この結果を図１、図２
および図３に示す。

【００８４】この配列を調べることにより、Ｂ．amylol
iquefaciensによって分泌されたものに相当する成熟サ
ブチリシンのためのコドンが存在することが確認され
た。

【００８５】この配列のすぐ上流に−１０７位のＧＴＧ
開始コドンから始まる一連の１０７個のコドンが存在す
る。−１０７のコドンから約−７５のコドンまでが既知
の信号配列のそれに相当する特徴を持ったアミノ酸配列
を暗号化している(大部分のこのような信号配列は長さ
１８〜３０のアミノ酸であり、疎水性中心部を持ってお
り、僅かな疎水性アミノ酸で終わっている)。従って配
列決定のデータの結果は−１０７から約−７５のコドン
が信号配列を暗号化しており、−７５から−１までの残
りの介在コドンはたぶんプロ配列を暗号化していると思
われる。

【００８６】実施例４ pＢＳ４２の組立 pＢＳ４２は、pＵＢ１１０、pＣ１９４およびpＢＲ３２
２から導かれたフラグメントの三方向ライゲーションに
より調製する(図７)。pＵＢ１１０からのフラグメント
は、１９００位のＨpaＩＩ部位と４５００位のＢamＨＩ
部位との間の約２６００塩基対フラグメントであり、Ｂ
acillus(桿菌)中で機能する複製起源を含んでいる(Ｔ．
Ｇrycztanら１９７８“Ｊ．Ｂacteriol．",１３４:３１
８(１９７８):Ａ．Ｊalankoら１９８１“Ｇene",１４:
３２５)。このＢamＨＩ部位はＫlenowで試験した。pＢ
Ｒ３２２部分は、２０６７位のＰvuＩＩ部位と３２２３
位のＳau３Ａ部位との間の１１００塩基対のフラグメン
トであり、Ｅ．coli複製起源を含んでいる(Ｆ．Ｂoliva
rら１９７７,“Ｇene",２:９５:Ｊ．Ｓutcliffe,１９７
８Ｃold Ｓpring Ｇarbor Ｓymposium４３:Ｉ,７
７)。pＣ１９４フラグメントは９７３位のＨpaＩＩ部位
と２００６位のＳau３Ａ部位との間の１２００塩基対フ
ラグメントでありＥ．coliおよびＢ．subtilisの両方で
発現し得るクロラムフェニコール耐性のための遺伝子を
含んでいる(Ｓ．Ｅhrlich,“Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i．(ＵＳＡ)",７４:１６８０;Ｓ．Ｈorynuchiら１９８
２,“Ｊ．Ｂacteriol．"１５０:８１５)。

【００８７】このようにpＢＳ４２はＥ．coliおよび桿
菌の両者で機能する複製起源およびクロラムフェニコー
ル耐性のための発現し得る遺伝子を含んでいる。

【００８８】実施例５ Ｂ．subtilisサブチリシン遺伝
子の分離および配列決定 Ｂ．subtilis Ｉ１６８染色体ＤＮＡをＥcoＲＩで消化
し、そのフラグメントをゲル電気泳動にかけた。１個の
６kbフラグメントが「α−³²p」ＣＴＰニック・トランス
レーション−上記のpＳ４のサブチリシン構造遺伝子の
Ｃ末端から得られた標識フラグメント−にハイブリダイ
ズした。この６kbフラグメントを電気溶出し、ＥcoＲＩ
で消化し細菌性アルカリホスファターゼで処理したpＢ
Ｓ４２に結合させた。この結合混合物でＥ．coli ＡＴ
ＣＣ ３１４４６を形質転換し、形質転換体を、１２．
５μgのクロラムフェニコール／mlを含有しているＬＢ
寒天上で増殖させて選択した。５０００個の形質転換コ
ロニーのプールした懸濁液からプラスミドＤＮＡを調製
した。このＤＮＡを、プロテアーゼ欠落株であるＢ．su
btilis ＢＧ８４(この調製法は実施例８に記載してあ
る)に導入した。プロテアーゼを生産するコロニーを、
ＬＢ寒天プラス１．５％(w／w)カーネーション粉末脱脂
スキムミルクおよび５μgクロラムフェニコール／ml(以
降スキムミルク選択プレートと言う)上に置き、蛋白分
解活性を示す澄明な部分を観察することによりスクリー
ニングした。

【００８９】プラスミドＤＮＡをプロテアーゼ生産コロ
ニーから調製し、ＥcoＲＩで消化し、Ｂ．amyloliquefa
ciensからのサブチリシン構造遺伝子の³²p−標識Ｃ末端
フラグメントにハイブリダイズさせることにより、サザ
ーン分析によって６kbＥcoＲＩ挿入体の存在についてし
らべた。陽性クローンを同定し、このプラスミドをpＳ
１６８．１と命名した。pＳ１６８．１で形質転換した
Ｂ．subtilis ＢＧ８４は、Ｂ．subtilis Ｉ１６８に
よって生産されるものよりも５倍の濃度でセリンプロテ
アーゼを分泌した。ＥＤＴＡを上清に加えても分析の結
果は変らなかったがＰＭＳＦ(フェニルメチルスルホニ
ルフルオライド)を上清に加えると、ＢＧ８４株につい
て実施例８で述べた分析において検出できない濃度ま
で、プロテアーゼ活性が減少した。

【００９０】６．５kb ＥcoＲＩ挿入体の制限地図を図
８に示した。種々の制限酵素消化物をサブクローンし、
そしてＢ．subtilis ＢＧ８４中でサブチリシンの発現
を試験することにより、サブチリシン遺伝子を２．５kb
ＫpnＩ−ＥcoＲＩフラグメントの内部に位置せしめ
た。Ｂ．amyloliquefaciensサブチリシン遺伝子のＣ末
端からの標識フラグメントをプローブとして用いたサザ
ーン分析により、Ｂ．subtilis遺伝子のＣ末端をこのサ
ブクローンの中央の６３１bp ＨincＩＩフラグメント
Ｂの内部またはその一部に位置づけた。縦列のＨincＩ
ＩフラグメントＢ、Ｃ、およびＤ並びにＨincＩＩ−Ｅc
oＲＩフラグメントＥ(図８)をＭ１３ベクターmp８また
はmp９に結合させ、ジデオキシ読み終り法(Ｆ．sanger
ら１９７７,“Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．Ｕ．Ｓ．
Ａ．"７４:５４６３−５４６７)を用いて既知の方法で
(Ｊ．Ｍessingら１９８２“Ｇene"１９:２０９−２７
６)で配列化した。この領域の配列を図９および図１０
に示した。最初の２３アミノ酸は信号ペプチドであると
考えられる。信号配列と成熟暗号配列の間の残りの８３
アミノ酸は、推定上の「プロ」配列を構成している。この
遺伝子の３'末端のオーバーラインドヌクレオチドは転
写終了領域であると思われる。成熟開始コドンから上流
の２つのＳhine−Ｄalgarno配列としての可能性のある
配列には下線を付した。

【００９１】実施例６ Ｂ．subtilisサブチリシン遺伝
子の不活性化ミューテーションの製造 桿菌の染色体に組込まれる欠落遺伝子を持ったプラスミ
ドを組立てるには、二段階の結合が必要であった(図１
１参照)。最初の工程で、実施例５で述べたＢ．subtili
sゲノムライブラリーから回収した６．５kb挿入体を含
んでいるpＳ１６８．１をＥcoＲＩで消化し、この反応
生成物をＫlenowで処理し、そのＤＮＡをＨincＩＩで消
化し、その一部にＢ．subtilisサブチリシン遺伝子の
５'末端を含んでいる８００bp ＥcoＲＩ−ＨincＩＩフ
ラグメントＥ(図８参照)を回収した。このフラグメント
を、ＨincＩＩで消化し細菌性アルカリホスファターゼ
で処理したpＪＨ１０１に結合させた(pＪＨ１０１は
Ｊ．Ｈoch(Ｓcripps)から入手でき、Ｆ．Ａ．Ｆerrari
ら１９８３,“Ｊ．Ｂact．"１３４:３１８−３２９に記
載されている)。得られたプラスミド、pＩＤＶ１は、図
１１に示した方向にフラグメントＥを含有していた。第
２の工程ではpＳ１６８．１をＨincＩＩで消化し、サブ
チリシン遺伝子の３'末端を含んでいる７００bpＨincＩ
ＩフラグメントＢを回収した。pＩＤＶ１をその特異な
ＨincＩＩ部位で消化し、フラグメントＢをこの線状化
したプラスミドに結合させ、Ｅ．coli ＡＴＣＣ ３１
４４６に形質転換し、そして１２．５μgのクロラムフ
ェニコール／mlまたは２０μgのアンピシリン／mlを含
有しているＬＢプレート上で選択した。pＩＤＶ１．４
と命名された１つの得られたプラスミドはフラグメント
Ｅに関して正しい方向にフラグメントＢを含有してい
た。図１１に示したこのプラスミドpＩＤＶ１．４は、
５'および３'隣接配列の部分をも含んでいるサブチリシ
ン遺伝子の欠失誘導体である。

【００９２】後記実施例８で調製した部分的プロテアー
ゼ欠落(欠失)ミュータント(Ｐrt^+/-)、Ｂ．subtilis
ＢＧ７７をpＩＤＶ１．４で形質転換した。２つのクラ
スのクロラムフェニコール耐性(Ｃm^r)形質転換体が得ら
れた。ＬＢ寒天プラススキムミルクを含有しているプレ
ート上の相当する位置の澄明さを観察することにより、
７５％がＢＧ７７(Ｐrt^+/-)と同じレベルのプロテアー
ゼ活性を示したが２５％はほとんど完全にプロテアーゼ
を欠失していた(Ｐrt^-)。Ｃm^rＰrt^-形質転換体は、その
プラスミドのフラグメントＥまたはＢのための相同領域
における１回の交叉組込みによるものとは考えられな
い。というのは、このような場合その遺伝子は中断され
ずそして発現形質はＰrt^+/-となるであろうから。事
実、フラグメントＥまたはＢのいずれかを独立してpＪ
Ｈ１０１に結合させ、次いでＢ．subtilis ＢＧ７７に
導入するとプロテアーゼ欠落表現形質は観察されなかっ
た。Ｃm^rＰrt^-pＩＤＶ１．４形質転換体のＣm^rの表現形
質は、Ｃm^sＰrt^-誘導体がＣm^rＰrt^-培養物から、抗生物
質選択の非存在下に最少培地で１０世代増殖させた後、
約０．１％の頻度でＣm^rＰrt^-培養物から分離すること
ができたという点で不安定であった。このような誘導体
の１つを、ＢＧ２０１８と命名した。この欠失を、ＰＢ
Ｓ１形質導入によりＩＡ８４(サブチリシン遺伝子に隣
接する(両端に位置する)２個の栄養要求ミューテーショ
ンを持ったＢＧＳＣ株)に導入した。この誘導体微生物
をＢＧ２０１９と命名した。

【００９３】実施例７ Ｂ．subtilisからゲノムＤＮＡ
ライブラリーの調製および中性プロテアーゼ遺伝子の分
離 Ｂ．subtilisの中性プロテアーゼの部分的なアミノ酸配
列はＰ．Ｌevyら１９７５,“Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓc
i．ＵＳＡ"７２:４３４１−４３４５に記載されてい
る。発表されているこの配列から、その領域内のアミノ
酸に対する潜在的なコドンの重剰性が最も少ない酵素の
領域(Ａsp Ｇln Ｍet Ｉle Ｔyr Ｇly)を選択し
た。下に示すように、この潜在的な全ての暗号配列をカ
バーするのに２４の組み合せが必要である。

【化３】

【００９４】それぞれ６通りの組み合せを含む４つのプ
ールを実施例１に記載したようにして調製した。このプ
ールを「γ−³²p」ＡＴＰを用いて燐酸化により標識し
た。

【００９５】Ｂ．subtilis(１Ａ７２、Ｂacillus Ｇin
etic Ｓtock Ｃenter)ＤＮＡを各種の制限酵素で消化
し、消化物を電気泳動ゲルで分離し、その４つのプロー
ブプールのそれぞれを、プロットした消化物のそれぞれ
に、条件を徐々に厳格にしながら１個のバンドがハイブ
リダイズするのが確認されるまで、ハイブリダイゼイシ
ョンを行なうことによりＢ．subtilisゲノム中の特異な
配列に最も合致する配列を含んだ標識プールを選択し
た。徐々に条件を厳格にするということは、ハイブリダ
イゼイションを起しにくい条件にすることを言い、例え
ばホルムアミド濃度を増大させること、塩濃度を減少さ
せることおよび温度を上げることである。５×Ｄenhard
t's、５×ＳＳＣ、５０mＭ ＮaＰＯ₄(pＨ６．８)およ
び２０％ホルムアミドの溶液中、３７℃でプール４だけ
がプロットした消化物とハイブリダイズした。これらを
中性プロテアーゼ遺伝子のために使用する適当なハイブ
リダイゼイション条件として選択し、プール４をプロー
ブとして使用した。

【００９６】桿菌のゲノムＤＮＡをＳau３Ａで部分消化
し、その部分消化物を電気泳動ゲル上で分子量により分
離し、１５〜２０kbフラグメントを溶出し(Ｒ．Ｌawnら
１９８１,“Ｎucleic Ａcids Ｒes．"９:６１０３−
６１１４)、Ｐromega Ｂiptec．提供のＰackageneキッ
トを使って、そのフラグメントを、ＢamＨＩで消化した
チャロン３０ファージに結合させることにより、常法に
従ってＢ．subtilis株ＢＧＳＣ１−Ａ７２のラムダーラ
イブラリーを調製した。

【００９７】チャロンラムダーファージのための全ての
既知の宿主を使用することができるが、このファージラ
イブラリーの宿主としてはＥ．coli ＤＰ５０supＦを
使用した。このＥ．coli宿主をライブラリーファージと
ともにプレートして培養し、その後プラークを、ニトロ
セルロースに転移させ、プローブプール４でスクリーニ
ングする(ＢentonおよびＤavis１９７７,“Ｓcience"１
９６:１８０−１８２)ことにより中性プロテアーゼ遺伝
子の存在について分析した。陽性プラークを、プラーク
純化を２回行なって精製し、さらに調査するために２つ
のプラークを選んだ。これらをλＮＰＲＧ１およびλＮ
ＧＲＧ２と命名した。各ファージから制限酵素加水分解
および電気泳動ゲル上の分離によりＤＮＡを調製した。
分離したフラグメントをプロットし、標識したプール４
オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。これによ
り、λＮＰＲＧ１は２４００bpＨindＩＩＩハイブリダ
イジングフラグメントを含んでいたが、４３００bpＥco
ＲＩフラグメントは含んでおらず、一方λＮＰＲＧ２は
４３００bpＥcoＲＩフラグメントを含んでいるが、２４
００bpＨindＩＩＩフラグメントは含んでいないことが
解った。

【００９８】この２４００bpλＮＰＲＧ１フラグメント
をpＪＨ１０１のＨindＩＩＩ部位に、以下の方法でサブ
クローンした。λＮＰＲＧ１をＨindＩＩＩで消化し、
消化物を電気泳動により分画し、そして２４００bpフラ
グメントをゲルから回収した。このフラグメントをアル
カリホスファターゼで処理したＨindＩＩＩ消化pＪＨ１
０１に結合させ、この結合混合物を使い、Ｖ．Ｈershfi
eldら１９７４,“Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．(Ｕ．
Ｓ．Ａ．)"７９:３４５５−３４５９の塩化カルシウム
ショック法によりＥ．coliＡＴＣＣ ３１４４６を形質
転換した。形質転換体を、ＬＢ培地プラス１２．５μg
のクロラムフェニコール／mlを含有しているプレート上
での増殖可能なコロニーを選択することにより同定し
た。

【００９９】形質転換コロニーから数個のプラスミドを
得た。各プラスミド中の２４００ｂｐフラグメントの方
向性は通常の制限分析により決定した（方向性とは、結
合させた発現ベクターの読み取り方向に関して遺伝子フ
ラグメントの読み取り方向または転写方向を意味す
る)。向い合った２つのプラスミドが得られ、これらをp
ＮＰＲsubＨ６およびpＮＰＲsubＨ１と命名した。

【０１００】λＮＰＲＧ２をＥcoＲＩで消化することお
よびプラスミドがアルカリホスファターゼで処理したＥ
coＲＩ消化pＢＲ３２５であることを除いて、２４００b
pフラグメントについて上記した方法と同様にしてλＮ
ＰＲＧ２の４３００bpＥcoＲＩフラグメントをpＢＲ３
２５にサブクローンした。pＢＲ３２５はＦ．Ｂolivar,
１９７８,“Ｇene"４:１２１−１３６に記載されてい
る。４３００bp挿入体が異なった方法で存在している２
つのプラスミドを同定した。これら２つのプラスミドを
pＮＰＲsubＲＩおよびpＮＰＲsubＲＩbと命名した。

【０１０１】実施例８ Ｂ．subtilis中性プロテアーゼ
遺伝子の特性化 pＮＰＲsubＨ１挿入体を種々の制限エンドヌクレアーゼ
で順次消化し、標識化したプール４とプロットハイブリ
ダイズさせ、その挿入体の制限地図を作成した(一般的
な制限地図の作成法についてはＴ．Ｍaniatisら前記３
７７頁参照)。プローブプール４とハイブリダイズした
最も小さなフラグメントは４３０bp ＲsaＩフラグメン
トであった。このＲsaＩフラグメントをＭ１３mp８
(Ｍ．Ｍessingら１９８２,“Ｇene"１９:２６９−２７
６およびＭ．Ｍessing in Ｍethodsin Ｅnzymology,
１９８３,Ｒ．ＷuらＥds．,１０１:２０−７８)のＳma
Ｉ部位に結合させ、その配列を読み取り終りジデオキシ
法(Ｆ．Ｓangerら１９７７,“Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓc
i．Ｕ．Ｓ．Ａ．"７４:５４６３−５４６７)により決定
した。pＮＰＲsubＨ１挿入体からの他の制限フラグメン
トをＭ１３mp８またはＭ１３mp９ベクターの適当な部位
に挿入し、その配列を決定した。必要に応じ、圧縮人造
構造(compression artifact)(Ｄ．Ｍillsら１９７９,
“Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．(Ｕ．Ｓ．Ａ．)"７６:２
２３２−２２３５)を減少させるためにdＩＴＰを使用し
た。pＮＰＲsubＨ１フラグメントの制限地図を図１２に
示す。制限酵素消化物からの種々のフラグメントの配列
を比較し、プロテアーゼのアミノ末端およびカルボキシ
末端に翻訳されるコドン配列を含んでいるオープンリー
ディングフレーム(Ｐ．Ｌevyら前記)を決定した。オー
プンリーディングフレームは、既知の１から始まる、リ
ーデイングフレーム(全ての３つのヌクレオチド)中に如
何なる終止コドンをも内部に含んでいないＤＮＡ配列で
ある。このオープンリーディングフレームは、アミノ末
端から２４００bp ＨindＩＩＩフラグメントの末端に
まで拡がっていた。１３００bp ＢglＩＩ−ＨindＩＩ
ＩフラグメントをpＮＰＲsubＲＩ部位(これはλＮＰＲ
Ｇ２の４３００bp ＥcoＲＩフラグメントを含んでい
た)から調製し、Ｍ１３mp８にクローンした。pＮＰＲsu
bＨ１の２４００bpフラグメントによって暗号化されて
いない中性プロテアーゼリーダー領域の部分を含んでい
るこのフラグメントの配列を、ＨindＩＩＩ部位から上
流へ４００ヌクレオチドについて決定した。

【０１０２】この中性プロテアーゼ遺伝子のために決定
された、推定上の分泌リーダーおよびプレプロ配列を含
む全ヌクレオチド配列を図１３および図１４に示す。列
の上の数値はアミノ酸番号を示している。図１３および
図１４において下線を引いたヌクレオチドはリボソーム
結合部位(Ｓhine−Ｄalgarno)を構成していると考えら
れ、一方上に線を引いたヌクレオチドはターミネーター
であると推定される潜在的なヘアピン構造を構成してい
る。最初の２７〜２８の推定アミノ酸は中性プロテアー
ゼのための信号であると考えられ、開裂点はala−２７
またはala−２８にある。プロ酵素構造の「プロ」配列は
成熟、活性酵素のアミノ末端アミノ酸(ala−２２２)に
至っている。

【０１０３】１９００bpを含んでいるpＮＰＲsubＲ１の
ＢglＩＩフラグメント(図１２)を１４００bpを含んでい
るpＮＰＲsubＨ１のＰvuＩＩ−ＨindＩＩＩフラグメン
トと結合させることにより、全ての中性プロテアーゼ遺
伝子を持ったコピー数の高いプラスミドを組立てた(図
１５)。実施例４からのpＢＳ４２をＢamＨＩで消化し、
細菌性アルカリホスファターゼで処理してプラスミドの
再環化を防止した。pＮＰＲsubＲ１をＢglＩＩで消化
し、１９００bpフラグメントをゲル電気泳動法で分離
し、pＢＳ４２の開いたＢamＨＩ部位に結合させた。こ
の結合させたプラスミドを使ってＥ．coli ＡＴＣＣ
３１４４６を、塩化カルシウムショック法(Ｖ．Ｈershf
ieldら前記)により形質転換し、形質転換された細胞
を、１２．５μg／mlのクロラムフェニコールを含有す
るＬＢ培地を含んだプレート上で増殖させることにより
選択した。図１５に示した方向にＢglＩＩフラグメント
を持ったプラスミドを形質転換体から分離し、pＮＰＲs
ubＢ１と命名した。pＮＰＲsubＢ１をＥcoＲＩで消化
(線状化)し、Ｋlenow処理により修復して平滑末端と
し、次いでＨindＩＩＩで消化した。ＨindＩＩＩ消化に
より得られる大きい方のフラグメント(アミノ末端およ
び上流領域を暗号化している配列を含んでいる)を回収
した。

【０１０４】この遺伝子のカルボキシ末端領域は、pＮ
ＰＲsubＨ１をＰvuＩＩおよびＨindＩＩＩで消化し１４
００bpフラグメントを回収することによって得たpＮＰ
ＲsubＨ１からのフラグメントで供給した。この１４０
０bpフラグメントの平滑末端ＰvuＩＩおよびＨindＩＩ
Ｉ部位をそれぞれ、pＮＰＲsubＢ１の平滑なＥcoＲＩお
よびＨindＩＩＩ部位と結合させた(図１５参照)。この
組立物を、後記の分析法で、本来蛋白分解活性物を分泌
しないＢ．subtilis株ＢＧ８４に導入した。この形質転
換体を、ＬＢ培地プラス１．５％カーネーション粉末脱
脂ミルクおよび５μg／mlのクロラムフェニコールを含
有しているプレート上で選択した。大きなかさ(halo)を
清澄にしたコロニーからのプラスミドを分析した。構造
遺伝子および中性プロテアーゼ遺伝子の隣接領域を挿入
しているプラスミド−pＮＰＲ１０を制限分析によって
調べたところ図１５に示す構造を持っていた。

【０１０５】Ａdelbergらの一般的な方法(１９６５,
“Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun．"１８:７８８
−７９５)に従い、Ｂ．subtilis I１６８のＮ−メチル
−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(ＮＴＧ)によ
る変異誘発によってＢ．subtilis株ＢＧ８４を作った。
変異誘発させた株I１６８をスキムミルクプレート(抗生
物質を含まず)においた。小さいかさを形成するコロニ
ーを拾い上げさらに分析した。各コロニーにつきスキム
ミルクプレート上でプロテアーゼ生産を、デンプンプレ
ート上でアミラーゼ生産を調べた。部分的にプロテアー
ゼ欠失であり、アミラーゼ陽性であり、そして胞子形成
し得る１つの単離物をＢＧ７７と命名した。プロテアー
ゼ欠失ミューテーションはprt−７７と命名した。このp
rt−７７対立遺伝子を下に述べる会合によってspoＯＡ
バックグラウンドに移動させて、胞子形成欠落株である
ＢＧ８４株を作った。

【０１０６】

【表１】 表１ 株 遺伝子型 起源 Ｉ１６８ trpＣ２ ＪＨ７０３ trpＣ２ , pheＡ１２ Ｔrousdaliら＊ spoＯＡ△６７７ ＢＧ１６ purＢ６ , metＢ５ Ｐb１６６５ leuＡ８ , lvs−２１ hisＡ , thr−５ sacＡ３２１ ＢＧ７７ trpＣ２ , prt−７７ ＮＴＧ×Ｉ１６８ ＢＧ８１ metＢ５ , prt−７７ ＢＧ１６ＤＮＡ×ＢＧ７７ ＢＧ８４ spoＯ△６７７,prt−７７ ＪＨ７０３ＤＮＡ×ＢＧ８１ ＊“Ｍol．Ｇan．Ｇenetics"１７３:６１(１９７９) ＢＧ８４はスキムミルクプレート上でプロテアーゼ活性
を完全に失っており、０．１Ｍの燐酸ナトリウム(pＨ
８)中、２５℃で０．２μg／mlのサクシニル(−Ｌ−ala
−Ｌ−ala−Ｌ−pro−Ｌ−phe)p−ニトロアニリド(Ｖeg
a)とインキュベーションし、１分当りの４１２mnにおけ
る吸収の変化を測定して分析した結果、検出可能な濃度
のサブチリシンも中性プロテアーゼも生産しなかった。
ＢＧ８４は１９８３年７月２１日にＡＴＣＣに寄託され
た(寄託番号３９３８２)。サブチリシン分析のための試
料は、改良Ｓchaefferの培地(Ｔ．Ｌeightonら１９７
１,“Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．"２４６:３１８９−３１９５)
で増殖させた培養の後期対数増殖期の上清から採取し
た。

【０１０７】実施例９ 中性プロテアーゼ遺伝子の発現 pＮＰＲ１０で形質転換したＢＧ８４を、０．１％のカ
ゼイン加水分解物および１０μgのクロラムフェニコー
ルを添加した最少培地に接種し、１６時間培養した。培
養上清０．１mlを採取し、１０mＭトリス−ＨＣl、１０
０mＭ ＮaＣl(pＨ６．８)中に１．４mg／mlのＡzocoll
蛋白分解基質(Ｓigma)を入れた懸濁液に加え、撹拌下に
インキュベートした。消化されなかった基質を遠心分離
により除き、５０５nmにおける光学密度を測定した。Ａ
zocoll基質懸濁液のバックグラウンド値を減じた。標準
的なプロテアーゼ発現株であるＢＧ１６によって分泌さ
れるプロテアーゼの量を任意に１００と定めた。ＢＧ１
６、および対照並びに中性プロテアーゼ遺伝子含有プラ
スミドで形質転換したＢＧ８４についての結果を後記実
施例１２の表２に示す。分泌されるプロテアーゼ−欠落
Ｂ．Ｓubtilis株ＢＧ８４を形質転換したものは、野生
株であるＢＧ１６よりも遥かに高い濃度でプロテアーゼ
活性体を分泌することが解る。

【０１０８】実施例１０ 中性プロテアーゼ遺伝子の不
活性化ミューテーションの製造

【０１０９】pＮＰＲsubＨ１の２４００bp挿入体の２つ
のＲsaＩに囲まれた領域、全５２７bp、を削除し、不完
全な構造遺伝子を作ることができる。この遺伝子の翻訳
産物は酵素的に不活性である。この欠失のあるプラスミ
ドを以下の如くして組立てた。pＪＨ１０１をＨindＩＩ
Ｉで消化して開裂させ、細菌性アルカリホスファターゼ
で処理した。線状化したpＪＨ１０１に挿入すべき中性
プロテアーゼ遺伝子のフラグメントは、pＮＰＲsubＨ１
をＨindＩＩＩおよびＲsaＩで消化しゲル電気泳動によ
って１２００bpのＨindＩＩＩ−ＲsaＩおよび６８０bp
のＲsaＩ−ＨindＩＩＩフラグメントを回収することに
より得た。これらのフラグメントを線状化したpＪＨ１
０１に結合させ、Ｅ．coli ＡＴＣＣ３１４４６の形質
転換に使用した。形質転換体をＬＢ培地および２０μg
のアンピシリン／ml含有プレート上で選択した。この形
質転換体からプラスミドを回収し、制限酵素分析によっ
て分析し、pＮＰＲsubＨ１出発プラスミドと同じ方向性
に２つのフラグメントを持ったプラスミドを同定した。
内部のＲsaＩフラグメントを失ったこのプラスミドをp
ＮＰＲsubＨ１△と命名した。

【０１１０】実施例１１ 中性プロテアーゼ遺伝子の欠
失ミュータントによる置換 プラスミドpＮＰＲsubＨ１△をＢ．Ｓubtilis株ＢＧ２
０１９(実施例６のサブチリシン欠除ミュータント)に導
入し、染色体組込み体をスキムミルクプレート上で選択
した。コロニーの周囲に親株と同レベルの蛋白分解を示
すものと、蛋白分解ゾーンのほとんどないものとの２つ
のタイプのＣm^r形質転換体が観察された。蛋白分解ゾー
ンのないものを選択し、再画線して個々のコロニーを純
化し、それらのプロテアーゼ欠失特性をスキムミルクプ
レート上で確認した。Ｃm^rである蛋白分解欠失コロニー
の１つを選んでこれをさらに研究した(このコロニーを
ＢＧ２０３４と命名した)。ＢＧ２０３４の偶発Ｃm^s復
帰突然変異体を、Ｃm含有ＬＢ培地で一夜増殖させて分
離し、個々のコロニーをプレートし、Ｃmを含んだ、お
よび含まない培地上に反復プレートした。３個のＣm^s復
帰突然変異体を分離したところ、その内の２つはプロテ
アーゼ能があり、残りの１はプロテアーゼ能がなかった
(これをＢＧ２０３６と命名した)。ＢＧ２０３６のハイ
ブリダイゼーション分析の結果、このプラスミドは、た
ぶん組換えによって、この株から欠落し、サブチリシン
および中性プロテアーゼの欠失フラグメントだけが残っ
たことを確認した。

【０１１１】実施例１２ 機能的なサブチリシンおよび
中性プロテアーゼを欠く株の表現形質 中性またはアルカリ性のプロテアーゼあるいはその両者
の機能的遺伝子を欠く株についてその増殖、胞子形成お
よびプロテアーゼの発現について試験した。プロテアー
ゼの発現はスキムミルクプレート上のコロニーの周りの
澄明化バンドおよび液体培養上清中のプロテアーゼ濃度
の測定によって調べた(表２)。サブチリシン遺伝子欠失
株(ＢＧ２０３５)はプロテアーゼ活性の３０％の減少お
よびミルクプレート上の正常なかさ(halo)を示した。削
除された中性プロテアーゼ遺伝子および活性サブチリシ
ン遺伝子を持ち、ＢＧ２０３６(実施例１１)のＤＮＡで
ＢＧ１６(実施例８)を形質転換することにより組立てら
れたＢＧ２０４３株は、プロテアーゼ活性の８０％の減
少およびミルクプレート上の小さいかさを示した。上記
の両遺伝子における削除を有する点でＢＧ２０３６(実
施例１１)と等価であると考えられるＢＧ２０５４株
は、検出可能なプロテアーゼ活性を示さず、ミルクプレ
ート上の検出し得るかさも示さなかった。

【０１１２】プロテアーゼ遺伝子群の片方または両方を
削除しても増殖または胞子形成に明らかな影響を与えな
かった。これらの削除(欠失)を有する株は最少グルコー
ス培地およびＬＢ培地の両者において正常な増殖速度を
示した。これらの株は親株ＢＧ１６に匹敵する頻度の胞
子形成を示した。これらの株を形態学的に調べたところ
欠失を含まない株と明らかな違いを示さなかった。

【０１１３】

【表２】 表２ プロテアーゼ発現および胞子形成に及ぼすプロテアーゼ欠失の影響 遺伝子型¹ プロテアーゼ 胞子形成 活性² (％) ＢＧ１６ 野生型 １００ ４０ ＢＧ２０３５ apr△６８４ ７０ ２０ ＢＧ２０４３ nprＥ△５２２ ２０ ２０ ＢＧ２０５４ apr△６８４, ＮＤ ４５ nprＥ△５２２ ＢＧ８４ spoＯＡ△ ＮＤ … (pＢＳ４２) ６７７,prt−７７ ＢＧ８４ spoＯＡ△ ３０００ …(pＮＰＲ１０) ６７７,prt−７７ ¹ プロテアーゼ表現形質に関連する座だけを示した。² プロテアーゼ活性はＢＧ１６を１００とする任意の単
位で表わしてある。ＮＤはプロテアーゼ活性が検出され
なかったことを示す。

【０１１４】実施例１３ ２２２位におけるＢ．Ａmylo
liquefaciensサブチリシン遺伝子の部位特異性飽和変異
誘発、カセット挿入のための遺伝子の調製 Ｗellらの方法(Ｎucleic Ａcids Ｒes．１９８３,１
１:７９１１−７９２４)に従って調製したpＳ４の誘導
体であるpＳ４−５をＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化
し、１．５kbＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメントを回収し
た。このフラグメントをＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化
した複製型のＭ−１３mp９に結合させた(Ｓangerら,１
９８０“Ｊ．Ｍol．Ｂiol．"１４３,１６１−１７８;Ｍ
essingら,１９８１,“Ｎucleic Ａcids Ｒesearch"
９,３０４−３２１;Ｍessing,Ｊ．およびＶieira,Ｊ．
(１９８２)Ｇene１９,２６９−２７６)。Ｍ−１３mp９
ＳＵＢＴと命名したこのＭ−１３mp９ファージ結合体を
つかってＥ．coli株ＪＭ１０１を形質転換し、２mlの終
夜培養物から１本鎖ファージＤＮＡを調製した。以下の
配列を持ったオリゴヌクレオチドプライマーを合成し
た: ５'−ＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＧＣＡＣＧ
ＣＴＧＣＡＧＧＡＧ−ＣＧＧＣＴＧＣ−３' このプライマーは２２２−２２５位のアミノ酸に対する
１０bpのコドンが削除されており、met−２２２コドン
にＫpnＩ部位(５')を、met＋２２２コドンにＰstＩ部位
(３')を導入するためにアミノ酸２２０、２２７および
２２８に対するコドンが変異されていることを除けば、
アミノ酸２１６−２３２を暗号化しているサブチリス遺
伝子フラグメントの配列に符号している(図１６参照)。
置換したヌクレオチドは星印で示してあり、ライン２の
下線を引いたコドンは新しい制限部位を示しており、ラ
イン４の線を引いた部分は挿入されたオリゴヌクレオチ
ドを表わしている。このプライマー(約１５μＭ)を以下
の如くして「³²p」でラベルした:「r³²p」−ＡＴＰ(２０μl
の反応液中１０μl)(Ａmersham５０００Ｃi／mmol,１０
２１８)およびＴ₄ポリヌクレオチドキナーゼ(１０単
位)、次いで非放射性ＡＴＰ(１００μＭ)とともにイン
キュベートしこの変異誘発プライマーを完全に燐酸化し
た。この燐酸化混合物を６８℃で１５分間加熱してキナ
ーゼを不活性化した。

【０１１５】Ｎorrisらの改良法(１９８３,“Ｎucleic
Ａcids Ｒes．"１１,５１０３−５１１２)に従い、
５μlのラベルした変異誘発プライマー(〜３μＭ)、約
１μgＭ−１３mp９ＳＵＢＴ鋳型、１μlの１μＭ Ｍ−
１３塩基配列プライマー(１７−mer)および２．５μlの
緩衝液(０．３Ｍトリス(pＨ８)、４０mＭ ＭgＣl₂,１
２mＭＥＤＴＡ,１０mＭ ＤＴＴ,０．５mg／mlＢＳＡ)
を混合することにより、このプライマーをＭ−１３mp９
ＳＵＢＴにハイブリダイズした。この混合物を６８℃で
１０分間加熱し、室温で１０分間冷却した。このアニリ
ング混合物に３．６μlの０．２５mＭ dＧＴＰ,dＣＴ
Ｐ,dＡＴＰおよびdＴＴＰ、１．２５μlの１０mＭ Ａ
ＴＰ、１μlのリガーゼ(４単位)および１μlのＫlenow
(５単位)を添加した。このプライマーの延長およびライ
ゲーション反応(全量２５μl)は１４℃で２時間行なっ
た。６８℃で２０分間加熱してＫlenowおよびリガーゼ
を不活性化した。この加熱した反応混合物をＢamＨＩお
よびＥcoＲＩで消化し、その消化物の一部を６％ポリア
クリルアミドゲルに適用し、放射活性フラグメントをオ
ートラジオグラフィーにより検出した。その結果「³²p」
変異誘発プライマーが、今や変異したサブチリシン遺伝
子を含んでいるＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメントに挿入
されたことが解った。

【０１１６】消化した反応混合物の残りを、１mＭ Ｅ
ＤＴＡを含有する１０mＭトリス(pＨ８)で２００μlに
希釈し、フェノール／クロロホルム混合物(１:１(v：
v))で１回、次いでクロロホルムで１回抽出し、水相を
回収した。５Ｍ酢酸アンモニウム(pＨ８)１５μlを２倍
容量のエタノールとともに加え、水相からＤＮＡを沈澱
させた。マイクロフュージ中、５分間遠心分離してＤＮ
Ａをペレット化し、上清を捨てた。７０％エタノール３
００μlを加えてＤＮＡペレットを洗浄し、洗液を捨て
ペレットを凍結乾燥した。

【０１１７】実施例４のpＢＳ４２をＢamＨＩおよびＥc
oＲＩで消化し、アクリルアミドゲル上で精製してベク
ターを回収した。この消化したベクター０．５μg、５
０μＭ ＡＴＰおよび６単位のリガーゼをライゲーショ
ン緩衝液２０μlに溶解した。ライゲーション(結合)を
１４℃で終夜行なった。このＤＮＡをＥ．coli２９４re
c⁺に導入し、形質転換体を１２．５μg／mlのクロラム
フェニコール含有ＬＢ培地４ml中で増殖させた。この培
養物からプラスミドＤＮＡを調製し、ＫpnＩ、ＥcoＲＩ
およびＢamＨＩで消化した。この制限フラグメントを分
析した結果、分子の３０〜５０％が変異誘発プライマー
によってプログラムされた所望のＫpnＩ部位を含んでい
ることが解った。ＫpnＩ部位を含んでいないプラスミド
は、変異誘発部位の細菌による修復前にＭ−１３複製に
より生成したと思われ、このようにして、ある形質転換
体において、ＫpnＩ⁺およびＫpnＩ^-プラスミドのヘテロ
ジーナス体が生成したと考えられる。ＫpnＩ⁺プラスミ
ドの純粋な培養を得るために、このＤＮＡをもう１度
Ｅ．coliに導入し、新しいＫpnＩ部位を含有するプラス
ミドをクローンした。このような形質転換体１６個から
ＤＮＡを調製し、その内６個が予想したＫpnＩ部位を含
んでいることが解った。

【０１１８】これらの６個の形質転換体の内の１つ(p△
２２２と命名)からプレパラティブな量のＤＮＡを作
り、制限分析により予想されたＫpnＩおよびＰstＩ部位
が存在すること、およびその位置を確認した。４０μg
のp△２２２を３００μlのＫpnＩ緩衝液プラス３０μl
のＫpnＩ(３００単位)中３７℃で１．５時間消化した。
ＤＮＡをエタノール沈澱させ、７０％エタノールで洗浄
し凍結乾燥した。ＤＮＡペレットを２００μlのＨindＩ
ＩＩ緩衝液により、２０μl(５００単位)のＰstＩで３
７℃で１．５時間消化した。水相をフェノール／ＣＨＣ
l₃で抽出し、ＤＮＡをエタノール沈澱させた。このＤＮ
Ａを水に溶解し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より精製した。ベクターバンド(帯)を電気溶出(１２０
v、２時間、０℃、０．１倍のＴＢＥ(Ｍaniatisら、前
記)中)した後、ＤＮＡをフェノール／ＣＨＣl₃抽出によ
り精製し、エタノール沈澱し、エタノールで洗浄した。

【０１１９】p△２２２はＫnpＩまたはＰstＩによりそ
れぞれ別々に完全に消化することができたが(＞９８
％)、徹底的な二重消化は不完全であった(＜＜５０
％)。これらの部位が非常に近くにあるため(１０bp)、
ＫnpＩによる消化によってそのＰstＩ部位の近くのＤＮ
Ａが「ブリージング」、すなわち鎖の分離、すなわちほつ
れを起したために、このような結果になったものと考え
られる。ＰstＩは２本鎖ＤＮＡだけを開裂させるので鎖
の分離によってその後のＰstＩの消化が阻害されるので
あろう。

【０１２０】実施例１４ オリゴヌクレオチドカセット
のサブチリシン遺伝子への結合 ５'が燐酸化されていない４つの相補性オリゴヌクレオ
チドプール(Ａ−Ｄ、表１参照)１０μＭを、２０μlの
リガーゼ緩衝液中で５分間６８℃で加熱し、次いで室温
で１５分間冷却することによりアニーリングした。各ア
ニーリングしたオリゴヌクレオチドプール１μＭ、〜
０．２μgのＫpnＩおよびＰstＩで消化した実施例１３
で得たp△２２２、０．５mＭ ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液
および６単位のＴ₄ＤＮＡリガーゼ、の全量２０μlを１
４℃で終夜反応させ、プールしたカセットをベクターに
結合させた。大過剰のカセット(p△２２２末端を越える
こと〜３００×)をこの結合に使用して分子内ＫpnＩ−
ＫpnＩ結合を防止した。１mＭＥＤＴＡを含有している
１０mＭトリス(pＨ８)２５μlを加えて反応物を希釈し
た。この混合物を６８℃で５分間加熱し、室温で１５分
間冷却することにより再びアニーリングしてカセットの
コンカテマー(concatemer)形成を防止した。各プールか
らのこの結合混合物を別々にＥ．coli２９４rec⁺細胞に
形質転換した。各形質転換混合物の一部をプレートし、
それぞれの形質転換体の数を測定した。多数の形質転換
体が多変異誘発性の高い可能性を示した。形質転換体の
残り(〜２００−４００形質転換体)をＬＢ培地プラス１
２．５μgのクロラムフェニコール／mlの４ml中で培養
した。各形質転換プール(Ａ−Ｄ)からＤＮＡを分離し
た。このＤＮＡをＫpnＩで消化し、その〜０．１μgを
使って再びＥ．coli rec⁺を形質転換し、その混合物を
プレートして各プールから個々のコロニーを分離した。
遺伝子へのカセットの結合および形質転換時の細菌性修
復によりＫpnＩおよびＰstＩ部位が破壊された。このよ
うにして形質転換体ＤＮＡをＫpnＩで消化したときp△
２２２だけが切断された。この切断プラスミドはＥ．co
liを形質転換しないであろう。個々の形質転換体を培養
して増殖させ、直接的なプラスミドの塩基配列決定のた
めにプール当り２４〜２６の形質転換体からＤＮＡを調
製した。５'−ＧＡＧＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＴＧＧＣ−
３'の配列を持った合成オリゴヌクレオチドプライマー
を使ってジデオキシ配列決定反応をプライムした。得ら
れたミュータントを以下の表３に示す。

【０１２１】記載したスクリーニングの後２個のコドン
＋２２２ミュータント(すなわちglnおよびile)は見出さ
れなかった。これらを得る目的で、図１６の上のオリゴ
ヌクレオチド鎖に相当する各ミュータントのための１本
鎖２５mer(２５量体)オリゴヌクレオチドを構成した。
それぞれを燐酸化し、そのそれぞれの非燐酸化オリゴヌ
クレオチドプール(すなわちglnに対してはプールＡ、il
eに対してはプールＤ)の下の鎖にアニーリングした。こ
れをＫpnＩおよびＰstＩ消化p△２２２に結合させ、も
とのオリゴヌクレオチドプールについて記載したように
プロセッシングした。このようにして得られたシングル
ミュータントの出現率はglnに対して２／８、ileに対し
ては０／７であった。この明らかなかたよりを避けるた
め、上の鎖を燐酸化し、その非燐酸化相補性プールにア
ニーリングした。ヘテロ燐酸化カセットを切断p△２２
２に結合させ、前と同様にしてプロセシングした。gln
およびileミュータントの出現率はそれぞれ７／７およ
び７／７となった。

【０１２２】表３のデータはこのプールから得られたミ
ュータントの出現におけるかたよりを表わしている。こ
れは、プールにおいてオリゴヌクレオチドを等価に表わ
していないことから起こったものと考えられる。これは
特定のポリマーがプールの変異誘発コドンを越えて非等
価にカップリングすることにより惹起されたものかもし
れない。このようなかたよりの問題は、合成中にトリマ
ーレベルの適当な調節により(同じ反応を行なう)なおす
ことができた。いずれの場合も、第１次スクリーニング
で単離されなかったミュータントは所望のミューテーシ
ョンを表わしている１本鎖オリゴヌクレオチドを合成
し、両末端を燐酸化し、非燐酸化相補鎖のプールにアニ
ーリングし、カセット部位に結合させることにより得る
ことができた。完全に非燐酸化したカセットについて観
察されたかたよったヘテロデュプレックス修復は、２２
２位は下の鎖の５'末端よりも上の鎖５'末端により近い
という事実から起ったものと思われる(図１６参照)。非
燐酸化５'末端にはギャップが存在し、２本鎖ＤＮＡに
はミスマッチバブル(bubble)が２２２位にあるので、上
の鎖のギャップの切除修復はより容易に複製可能な環状
にハイブリダイズしたデュプレックスを維持することに
なる。上の鎖は選択的５'燐酸化により完全に保持し得
るという事実はこの仮説に合致している。この場合、下
の鎖だけが切除修復を促進し得る５'ギャップを含んで
いる。この方法は、変異誘発オリゴヌクレオチドカセッ
トを使った場合、合成オリゴヌクレオチド鎖のかたよっ
た挿入を方向づけるのに有用である。

【０１２３】実施例１５ １６６位におけるサブチリシ
ン遺伝子の部位特異性変異誘発 変異誘発プライマーが異なっていること(図１７の３７m
erを使用した)、２つの制限酵素がＰstＩおよびＫpnＩ
ではなくてＳacＩおよびＸmaＩＩＩであること、および
得られた組立て物が異なっていることを除けば実施例１
３〜１４に示した操作を忠実に繰返した(図１７参照)。

【０１２４】１６６位のミュータントサブチリシンを分
泌する桿菌株を後記実施例１６に記載した方法で得た。
野生型残基のala、asp、gln、phe、his、lys、asn、ar
g、およびvalが置換されているミュータントサブチリシ
ンを回収した。

【０１２５】実施例１６ ミュータントサブチリシン酵素の調製 実施例１１の方法で得たＢ．subtilis株ＢＧ２０３６を
実施例１４,１５または２０のプラスミドおよび対照と
してpＳ４−５により形質転換した。形質転換体をプレ
ートまたは振盪フラスコ中１６〜４８時間３７℃でＬＢ
培地プラス１２．５μg／mlのクロラムフェニコール中
で培養した。酵素的に活性なミュータントサブチリシン
を、細胞ブロスをpＨ６．２の０．０１Ｍ燐酸ナトリウ
ムに対して透析することにより回収した。透析したブロ
スを１Ｎ ＨＣlでpＨ６．２に調節し、ＣＭセルロース
(ＣＭ−５２ワットマン)の２．５×２cmのカラムに充填
した。０．０１Ｍ燐酸ナトリウム(pＨ６．２)で洗浄し
た後、サブチリシン(＋２２２におけるミュータントを
除く)をＮaＣlについて０．０８Ｎとして同じ緩衝液で
溶出した。＋２２２のミュータントサブチリシンは０．
１Ｍ燐酸ナトリウム(pＨ７．０)で溶出した。この精製
したミュータントおよび野生型酵素を使って酸化安定
性、Ｋm、Ｋcat、Ｋcat／Ｋm比、至適pＨおよび基質特
異性における変化を調べた。

【０１２６】

【表３】 表３ オリゴヌクレオチドプール編成および得られたミュータントの頻度プール アミノ酸 コドン−２２２¹ 頻度² Ａ asp ＧＡＴ ２／２５ met ＡＴＧ ３／２５ cys ＴＧＴ １３／２５ arg ＡＧＡ ２／２５ gln ＧＡＡ ０／２５ 予想外 ５／２５ ミュータント³ Ｂ leu ＣＴＴ １／２５ pro ＣＣＴ ３／２５ phe ＴＴＣ ６／２５ tyr ＴＡＣ ５／２５ his ＣＡＣ １／２５ 予想外 ９／２５ ミュータント Ｃ glu ＧＡＡ ３／１７ ala ＧＣＴ ３／１７ thr ＡＣＡ １／１７ lys ＡＡＡ １／１７ asn ＡＡＣ １／１７ 予想外 ８／１７ ミュータント Ｄ gly ＧＧＣ １／２３ trp ＴＧＧ ８／２３ ile ＡＴＣ ０／２３ ser ＡＧＣ １／２３ val ＧＴＴ ４／２３ 予想外 ９／２３ ミュータント ¹ コドンは、クローンしたサブチリシン塩基配列の多使
用性に基づいて選んだ(Ｗellsら１９８３、前記)² 頻度は、直接プラスミド塩基配列決定によりシングル
トラック分析から決定した。³ 予想外ミュータントは、一般に２２２の隣りのコドン
または結合点、において変化しているダブルミュータン
トからなっていた。これらは、オリゴヌクレオチドプー
ルにおける不純物／またはギャップ末端の誤った修復の
結果得られたものと考えられる。

【０１２７】実施例１７ 改良された酸化安定性を示す
ミュータントサブチリシン 野生型のメチオニンの代りに、２２２において置換した
システインおよびアラニンを有するサブチリシン(実施
例１６)を各種の濃度の次亜鉛素酸ナトリウム(Ｃlorox
Ｂleach)とともにインキュベートすることにより酸化
に対する抵抗性を分析した。

【０１２８】全量４００μlの０．１Ｍ ＮaＰＯ₄緩衝
液(pＨ７、図１８に示した濃度の上記の漂白剤含有)４
００μlに、終濃度が０．０１６mg／ml(酵素)となるよ
うに充分な酵素を加えた。この溶液を２５℃で１０分間
インキュベートし、以下の如くし酵素活性を分析した:
１２０μlのala＋２２２または野生型、あるいは１００
μlのcys＋２２２インキュベーション混合物を８９０μ
lの０．１Ｍトリス緩衝液(pＨ８．６)および１０μlのs
ＡＡＰＦpＮ(実施例１８)基質溶液(２０mg／ml、ＤＭＳ
Ｏ中)と混合した。p−ニトロアニリンの遊離に基づく４
１０nmにおける吸光度の増加率をモニターした(Ｄel
Ｍar,Ｅ．Ｇ．ら１９７９“Ａnal．Ｂiochem．"９９,３
１６−３２０)。この結果を図１８に示す。メチオニン
の代りに不安定なシステイン残基が置換したミュータン
トあるいは野生型酵素の何れと比較しても、より安定な
酵素をアラニン置換体が生産した。驚くべきことに、こ
のアラニン置換は、アッセイ基質に対する酵素活性を実
質的に阻害することなく、かつ、この酵素にかなりの酸
化安定性を付与した。セリン＋２２２ミュータントも改
良された酸化安定性を示した。

【０１２９】実施例１８ 改良された動力学および基質
特異性を示すミュータントサブチリシン グリシン＋１６６の各種のミュータントを、改良された
Ｋcat、ＫmおよびＫcat／Ｋm比についてスクリーニング
した。速度的パラメータは反応の進行カーブを分析する
ことにより得た。反応速度は基質濃度の関数として計算
した。データはＭarquardtの非線形回帰アルゴリズム
(Ｍarquardt,Ｄ．Ｗ．１９６３“Ｊ．Ｓoc．Ｉnd．Ａpp
l．Ｍath．１１,４３１−４１)を使って、Ｍichaelis−
Ｍentonの方程式に合わせて分析した。すべての反応
は、初期濃度０．００２５Ｍ〜０．０００２６Ｍ(問題
の酵素のＫm比に依存する。濃度は各測定毎にＫm比を越
えるように調節した。)のベンゾイル−Ｌ−バリル(Ｖal
yl)−グリシル(Ｇlycyl)−Ｌ−アルギニル(Ａrginyl)−
p−ニトロアニリド(ＢＶＧＲpＮ;ＶegaＢiochemicals)
を含有しているか、または初期濃度０．００１０Ｍ〜
０．０００２８Ｍ(ＢＶＧＲpＮにいての場合と同様に変
化する)のサクシニル−Ｌ−アラニル(Ａlanyl)−Ｌ−ア
ラニル(Ａlanyl)−Ｌ−プロリル(Ｐrolyl)−Ｌ−フェニ
ルアラニル(Ｐhenylalanyl)−p−ニトロアニリド(sＡＡ
ＰＦpＮ;Ｖega Ｂiochemicals)を含有させ０．１Ｍト
リス緩衝液(pＨ８．６)中、２５℃で行なった。これら
の実験の結果を以下に示す。

【０１３０】

【表４】 表４ 基質 酵 素 Ｋcat Ｋm Ｋcat／ (s^-1) (Ｍ) Ｋm sＡＡＰ− gly −１６６ ３７ １．４×１０^-4 ３×１０⁵ Ｆ pＮ (野生型) ala ＋１６６ １９ ２．７×１０^-5 ７×１０⁵ asp ＋１６６ ３ ５．８×１０^-4 ５×１０³ glu ＋１６６ １１ ３．４×１０^-4 ３×１０⁴ phe ＋１６６ ３ １．４×１０^-5 ２×１０⁵ hys ＋１６６ １５ １．１×１０^-4 １×１０⁵ lys ＋１６６ １５ ３．４×１０^-5 ４×１０⁵ asn ＋１６６ ２６ １．４×１０^-4 ２×１０⁵ arg ＋１６６ １９ ６．２×１０^-5 ３×１０⁵ val ＋１６６ １ １．４×１０^-4 １×１０⁵ ＢＶＧ− 野生型 ２ １．１×１０^-3 ２×１０³ Ｒ pＮ asp ＋１６６ ２ ４．１×１０^-5 ５×１０⁴ glu ＋１６６ ２ ２．７×１０^-5 ７×１０⁴ asn ＋１６６ １ １．２×１０^-4 ８×１０³ 各ミュータントのＫcat／Ｋm比は野生型酵素のものと異
なっていた。触媒効率の測定の結果、これらの比率は、
本発明方法に従って、与えられた基質に対して遥かに高
い活性を有する酵素を容易に設計することができ、かつ
スクリーニングによって選択することができるというこ
とを示している。例えばＡ１６６は、sＡＡＰＦpＮにお
ける野生型の活性の２倍以上の活性を示す。

【０１３１】このデータはまた、野生型酵素のミューテ
ーションによる基質特異性の変化をも示している。例え
ばＤ１６６およびＥ１６６ミュータントのＫcat／Ｋm比
は、ＢＶＧpＮ基質に対しては野生型より高いが、sＡＡ
ＰＦpＮについては質的に逆の結果が得られている。従
ってＤ１６６およびＥ１６６ミュータントは、sＡＡＰ
ＦpＮよりもＢＶＧＲpＮに対してより特異性がある。

【０１３２】実施例１９ 改良されたpＨ活性プロフィ
ルを示すミュータントサブチリシン 実施例１６で得られたＣys＋２２２ミュータントのpＨ
プロフィルを野生型酵素のそれと比較した。ＤＭＳＯ中
の１０μlの６０mg／ml sＡＡＰＦpＮ、１０μlのＣys
＋２２２(０．１８mg／ml)か野生型(０．５mg／ml)およ
び９８０μlの緩衝液(pＨ６．６、７．０および７．６
の場合の測定については０．１Ｍ ＮaＰＯ₄緩衝液;pＨ
８．２、８．６および９．２の場合は０．１Ｍトリス緩
衝液;およびpＨ９．６および１０．０の場合は０．１Ｍ
グリシン緩衝液)を混合した後、１分当りの４１０nmに
おける吸光度の初期変化率を各pＨについて測定し、そ
のデータを図１９に示した。Ｃys＋２２２ミュータント
は野生型酵素よりも狭い至適pＨを示した。

【０１３３】実施例２０ １６９位におけるサブチリシ
ン遺伝子の部位特異性変位誘発 変位誘発プライマーが異なっていること(図２０に示し
たプライマーを使用)、２つの制限酵素がＰstＩおよび
ＫpnＩの代りにＫpnＩとＥcoＲＶであること、および得
られた組立物が異なっていること(図２０に示した)を除
けば実施例１３〜１４と同じ操作を行なった。

【０１３４】１６９位におけるミュータントサブチリシ
ンを分泌する桿菌株は実施例１６に記載したようにして
得た。野生型の残基の代りにalaおよびserの置換を示す
ミュータントサブチリシンを回収し、速度論的特徴の変
化を調べるために分析した。この分析にはpＨ８．６で
ＳＡＡＰＦ pＮを実施例１８に示したものと同様にし
て使用した。結果を以下に示す。

【０１３５】

【表５】 表５ 酵素 Ｋcat(s^-1) Ｋm(Ｍ) Ｋcat／Ｋm ala ＋１６９ ５８ ７．５×１０^-5 ８×１０⁵ ser ＋１６９ ３８ ８．５×１０^-5 ４×１０⁵

【０１３６】実施例２１ 蛋白質基質に対する特異活性の変化 実施例１５および１６で得た１６６位のミュータント
を、天然の蛋白質基質に対する特異活性の変化について
分析した。これらのミュータントプロテアーゼは、変化
した比活性とともに変化した特異性をも示すことがある
ので、１つのタイプの特異性を持ったプロテアーゼの方
向に分析がかたよらないために、基質は十分な量の種々
の開裂部位、すなわち酸性、塩基性、中性および疎水性
の部位を含んでいなければならない。基質はある配列部
位をマスキングすることになるデリビタイズド残基を含
んでいてはならない。ヘモグロビン、アゾコローゲン(a
zocollogen)、アゾカゼイン、ジメチルカゼインなどの
広く用いられている基質は、この理由で使用できない。
牛カゼイン、αおよびα₂カゼインが好適な基質として
選ばれた。

【０１３７】１００mＭトリス緩衝液(pＨ８．０)、１０
mＭ ＥＤＴＡ中で１％カゼイン溶液(w／v)を調製し
た。分析のプロトコールは次の通りである: ７９０μlの５０mＭトリス(pＨ８．２) １００μlの１％カゼイン(Ｓigma)溶液 １０μlの試験酵素(１０−２００μg)。 このアッセイ混合物を混合し、室温で２０分間インキュ
ベートした。１００μlの１００％トリクロロ酢酸を添
加し、次いで室温で１５分間インキュベートすることに
より反応を終結させた。沈澱した蛋白質を遠心分離によ
りペレット化し、上清の２８０nmにおける光学密度を分
光光度計を用いて測定した。光学密度は、反応混合物中
の沈澱しなかった、すなわち加水分解されたカゼインの
量を表わしている。それぞれのミュータントプロテアー
ゼによって加水分解されたカゼインの量を、種々の量の
野生型プロテアーゼを含んでいる一連の標準物と比較
し、その活性を野生型の活性に対するパーセンテージで
表わした。酵素活性を、分析に使用した酵素溶液の２８
０nmにおける吸光度でカゼイン加水分解活性を割ること
により比活性に変換した。

【０１３８】Ａsn＋１６６を除き、分析した全てのミュ
ータントは野生型のものよりカゼインに対する比活性が
低かった。Ａsn＋１６６は野生型よりカゼインに対する
活性が２６％高かった。最も低い比活性を示したミュー
タントはile＋１６６であり、野生型の活性の０．１８
４であった。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は機能的Ｂ．amyloliquefaciensサブチ
リシン遺伝子の配列を示す模式図であって、Ｂ．amylol
iquefaciensの全機能配列を示している。

【図２】 図２は機能的Ｂ．amyloliquefaciensサブチ
リシン遺伝子の配列を示す模式図であって、その暗号鎖
のヌクレオチド配列を、蛋白質のアミノ酸配列と関連さ
せて示している模式図である。

【図３】 図３は機能的Ｂ．amyloliquefaciensサブチ
リシン遺伝子の配列を示す模式図であって、その暗号鎖
のヌクレオチド配列を、蛋白質のアミノ酸配列と関連さ
せて示している模式図である。

【図４】 図４はプール１(パネルＡ)およびプール２
(パネルＢ)でそれぞれプローブした純化陽性クローンの
レプリカ・ニトロセルロース・フィルターの結果を示す
グラフである。

【図５】 図５はサブチリシン発現プラスミド(pＳ４)
の制限分析を示す模式図である。

【図６】 図６はpＢＳ４２およびpＳ４で形質転換した
培養物からの上清について行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥの
結果を示すグラフである。

【図７】 図７はシャトルベクターpＢＳ４２の構成を
示す模式図である。

【図８】 図８はＢ．stbtilisサブチリシン遺伝子を含
む配列の制限地図を示す模式図である。

【図９】 図９は機能的なＢ．subtilisサブチリシン遺
伝子の配列を示す模式図である。

【図１０】 図１０は機能的なＢ．subtilisサブチリシ
ン遺伝子の配列を示す模式図である。

【図１１】 図１１はＢ．subtilisサブチリシン遺伝子
の欠失ミュータントを得るための組立法を示す模式図で
ある。

【図１２】 図１２はＢ．subtilis中性プロテアーゼ遺
伝子の制限地図を示す模式図である。

【図１３】 図１３はＢ．subtilis中性プロテアーゼ遺
伝子のヌクレオチド配列を示す模式図である。

【図１４】 図１４はＢ．subtilis中性プロテアーゼ遺
伝子のヌクレオチド配列を示す模式図である。

【図１５】 図１５はＢ．subtilis中性プロテアーゼ遺
伝子を含んでいるベクターの組立を示す模式図である。

【図１６】 図１６は本発明方法による変異誘発技術の
具体例を示す模式図である。

【図１７】 図１７は本発明方法による変異誘発技術の
具体例を示す模式図である。

【図１８】 図１８はサブチリシンミュータントの強化
された酸化安定性を示すグラフである。

【図１９】 図１９は野生型酵素と比較した場合のサブ
チリシンミュータントのpＨ活性プロフィルの変化を示
すグラフである。

【図２０】 図２０は本発明方法による変異誘発技術の
具体例を示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/57 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） 7804−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:125） 7804−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/56 Ｃ１２Ｒ 1:125） 7804−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/57 Ｃ１２Ｒ 1:125） 7804−4Ｂ (31)優先権主張番号 ６１４６１５ (32)優先日 1984年５月29日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６１４６１６ (32)優先日 1984年５月29日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６１４６１７ (32)優先日 1984年５月29日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 デビッド・アロン・エステル アメリカ合衆国カリフォルニア94043、マ ウンテン・ビュー、ディアブロ・アヴェニ ュー250番 (72)発明者 ユーゲニオ・フェラーリ アメリカ合衆国カリフォルニア94015、デ イリー・シティー、モーニングサイド・ド ライブ75番 (72)発明者 デニス・ジェイムス・ヘナー アメリカ合衆国カリフォルニア94404、パ シフィカ、エンジェリタ・アヴェニュー 297番 (72)発明者 ジェイムス・アレン・ウエルズ アメリカ合衆国カリフォルニア94403、サ ン・マテオ、オータイ・アヴェニュー65番

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素的に活性なサブチリシンまたは中性
   プロテアーゼを分泌することができない様な突然変異サ
   ブチリシンおよ中性プロテアーゼの遺伝子を含有してい
   る実質的に正常な胞子形成を行う桿菌。
2. 【請求項２】 突然変異が不可逆的である請求項１の桿
   菌。
3. 【請求項３】 突然変異が、発現されないかあるいは発
   現されても酵素的に非活性なポリペプチドを生じること
   となる削除である請求項１または２に記載の桿菌。
4. 【請求項４】 桿菌によって発現されないポリペプチド
   をコードしている少なくとも１個のＤＮＡ部分によって
   形質転換を受けた請求項１〜３のいずれかに記載の桿
   菌。
5. 【請求項５】 形質転換のためのＤＮＡがサブチリシン
   突然変異体または真核性蛋白をコードするものである請
   求項５に記載の桿菌。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の桿菌を、蛋白が培養物
   中に蓄積するまで培養し、そして該蛋白を回収すること
   からなるサブチリシン突然変異体の製造方法。