CN1871344A - 在洗涤剂中具有改善稳定性的蛋白酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在洗涤剂组合物稳定性改善的蛋白酶。此外，本发明涉及包含本发明蛋白酶的清洁组合物或洗涤剂组合物以及此蛋白酶在洗涤剂组合物中的用途。

Description

在洗涤剂中具有改善稳定性的蛋白酶

技术领域

本发明涉及具有在洗涤剂组合物中改善稳定性的蛋白酶。本发明还涉及编码所述蛋白酶的分离多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、包含所述核酸构建体的宿主细胞和用于生产和使用本发明蛋白酶的方法。此外，本发明涉及包含本发明蛋白酶的清洁组合物和洗涤剂组合物以及涉及所述蛋白酶在洗涤剂组合物中的用途。

发明背景

在洗涤剂工业中，向洗涤配方中添加酶的应用已超过30年。用于此类配方的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶以及其它酶或其混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。

在本领域内，例如在EP 130756(GENENTECH)(对应于美国再公告专利号34,606(GENENCOR))；EP 214435(HENKEL)；WO87/04461(AMGEN)；WO 87/05050(GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas、Russell和Fersht(1985)Nature 318 375-376；Thomas、Russell和Fersht(1987)J.Mol. Biol.193 803-813；Russel和Fersht Nature 328496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(Amgen)；WO95/27049(SOLVAY S.A.)；WO 95/30011(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/30010(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/29979(PROCTER &GAMBLE公司)；US 5.543.302(SOLVAY S.A.)；EP 251 446(GENENCOR)；WO 89/06279(NOVOZYMES A/S)；WO 91/00345(NOVOZYMES A/S)；EP 525 610 A1(SOLVAY)；WO 94/02618(GIST-BROCADES N.V.)公开了为数众多的此类蛋白酶变体。

WO 89/06270(Novozymes A/S)公开了包含有限底物特异性蛋白酶的洗涤剂组合物，其中所述蛋白酶是能够断裂赖氨酸或精氨酸的C-末端侧肽键的胰蛋白酶样蛋白酶。

而WO 94/25583公开了编码镰孢霉属(Fusarium)胰蛋白酶样蛋白酶DNA序列的克隆并且从所述DNA序列中获得了活性胰蛋白酶样蛋白酶的表达。

然而，即便已经描述了众多有用的蛋白酶和蛋白酶变体，但是为了众多的工业用途仍需要进一步改善蛋白酶或蛋白酶变体。

具体而言，由于洗涤剂中存在的物质往往会降低蛋白酶的稳定性，所以蛋白酶在洗涤剂中的稳定性问题已经变得尤其明显。

因此，本发明的目标是提供改良的蛋白酶，所述蛋白酶适用于例如洗衣房和/或硬质表面清洁的洗涤剂中。

发明简述

本发明在第一个方面涉及具有在洗涤剂中稳定性改善的蛋白酶，所述蛋白酶选自

a.具有与如SEQ NO：2的第1-266位氨基酸所示氨基酸序列至少73％同一性的氨基酸序列的蛋白酶；

b.由在低严格条件下与下列序列杂交的核酸序列所编码的蛋白酶：

(i)如SEQ ID NO：1的第127-804位核苷酸所示的核酸序列的互补链，或

(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列；以及

c.与如SEQ NO：2的第1-266位氨基酸所示氨基酸序列相比具有1-50、优选1-40或1-30、更优选1-20、最优选1-10个氨基酸替代的蛋白酶。

本发明在第二个方面涉及包含编码本发明蛋白酶的核酸序列的分离多核苷酸。

本发明在第三个方面涉及编码蛋白酶的分离多核苷酸，所述多核苷酸选自：

a.具有与如SEQ ID NO：1的第52-804位核苷酸所示核酸序列至少80％同一性的核酸序列；和

b.在低严格条件下与下列序列杂交的核酸序列：

(i)如SEQ ID NO：1的第52-804位核苷酸所示核酸序列的互补链；或

(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列。

本发明在第四个方面涉及包含本发明核酸序列的核酸构建体，其中所述核酸序列与能够指导蛋白酶在适宜宿主中表达的一种或多种控制序列有效连接。

本发明在第五个方面涉及包含本发明核酸构建体、启动子和转录终止信号及翻译终止信号的重组表达载体。

本发明在第六个方面涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞。

本发明在第七个方面涉及生产本发明蛋白酶的方法，所述方法包括：

(a)在诱导产生所述蛋白酶的条件下培养本发明重组宿主细胞；和

(b)回收蛋白酶。

本发明在第八个方面涉及包含本发明蛋白酶的清洁组合物或洗涤剂组合物、优选衣物洗涤组合物或洗碟组合物。

本发明的另一些方面涉及本发明蛋白酶在清洁组合物或洗涤剂组合物中的用途；用于清洁或洗涤硬质表面或衣物的方法，所述方法包括将硬质表面或衣物与本发明组合物接触。

定义

在更详细讨论本发明之前，首先定义如下术语和惯例。

氨基酸的命名

A＝Ala＝丙氨酸

V＝Val＝缬氨酸

L＝Leu＝亮氨酸

I＝Ile＝异亮氨酸

P＝Pro＝脯氨酸

F＝Phe＝苯丙氨酸

W＝Trp＝色氨酸

M＝Met＝甲硫氨酸

G＝Gly＝甘氨酸

S＝Ser＝丝氨酸

T＝Thr＝苏氨酸

C＝Cys＝半胱氨酸

Y＝Tyr＝酪氨酸

N＝Asn＝天冬酰胺

Q＝Gln＝谷氨酰胺

D＝Asp＝天冬氨酸

E＝Glu＝谷氨酸

K＝Lys＝赖氨酸

R＝Arg＝精氨酸

H＝His＝组氨酸

X＝Xaa＝任意氨基酸

核酸的命名

A＝腺嘌呤

G＝鸟嘌呤

C＝胞嘧啶

T＝胸腺嘧啶(仅在DNA中)

U＝尿嘧啶(仅在RNA中)

蛋白酶

将断裂蛋白质底物中酰胺键的酶归类为蛋白酶或(可互换地为)肽酶(见Walsh，1979，Enzymatic Reaction Mechanisms.W.H.Freeman andCompany，San Francisco，第3章)。

丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶是催化肽键水解并且在酶的活性位点内存在一个必需丝氨酸残基的酶(White，Handler和Smith，1973，“Principles ofBiochemistry”，第五版，McGraw-Hill Book Company，NY，第271-272页)。

细菌丝氨酸蛋白酶的分子量范围为20,000-45,000道尔顿。它们可被二异丙基氟磷酸抑制。细菌丝氨酸蛋白酶水解单纯末端酯并且其活性类似于同样为丝氨酸蛋白酶的真核胰凝乳蛋白酶。更狭义的术语碱性蛋白酶则含盖一个亚类，其反映某些丝氨酸蛋白酶具有高的最佳pH(9.0-11.0)(综述见Priest(1977)Bacteriological Rev.41 711-753)。

胰蛋白酶样蛋白酶

术语“胰蛋白酶样蛋白酶”在本上下文中旨在指具有类似于胰蛋白酶活性的蛋白酶，即能够断裂位于赖氨酸或精氨酸的C末端侧肽键的酶。如在以下材料和方法部分中实施例IV所述，基于胰蛋白酶底物断裂的测定法测定胰蛋白酶样蛋白酶活性。

母体蛋白酶

母体蛋白酶可以是从自然来源分离的蛋白酶，其中可以在保留蛋白酶特征的同时对此蛋白酶进行后续修饰。而且，母体蛋白酶还可以是通过如J.E.Ness等，Nature Biotechnology，17，893-896(1999)所描述的DNA改组技术制备的蛋白酶。备选地，术语“母体蛋白酶”可称作“野生型蛋白酶”。

蛋白酶的修饰

将此处所用的术语“修饰”定义为包括蛋白酶的化学性修饰以及编码蛋白酶的DNA的遗传操作。所述修饰可以是氨基酸侧链替换、在目的氨基酸处的替代、缺失和/或插入。

蛋白酶变体

在本发明的上下文中，术语蛋白酶变体或已突变的蛋白酶意指一种由表达突变基因的生物产生的蛋白酶，其中所述突变基因源自拥有原始基因或母体基因并且产生相应母体酶的母体微生物，为了能够在宿主中表达时产生该突变蛋白酶已经将母体基因突变成为突变基因。类似地，突变基因还可源自经DNA改组技术产生的母体基因。

同源蛋白酶序列

在本上下文中，两种氨基酸序列之间的同源性由参数“同一性”描述。

为了确定两种蛋白酶之间的同一性程度，可应用默认设置的VectorNTI程序包v8的AlignX应用的GAP程序。来自程序的结果除了氨基酸比对之外还计算两种序列间“同一性百分数”。

基于此描述，本领域熟练技术人员可以常规鉴定根据本发明可修饰的适宜同源蛋白酶和相应的同源活性位点环区域。

分离多核苷酸

如此处所用，术语“分离多核苷酸”指已经分离和纯化并且因此处于适用于遗传工程蛋白质生产系统形式的多核苷酸。此类分离分子可以是从其天然环境中分离的那些分子，并且包括cDNA克隆和基因组克隆以及源自DNA改组实验或源自位点定向自然发生实验的多核苷酸。本发明的分离多核苷酸不含通常与之结合的其它基因，但可包含5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。鉴定所结合的区域对于本领域的普通技术人员而言是轻而易举的(见例如Dynan和Tijan，Nature 316：774-78，1985)。术语“分离核酸序列”可备选地称作“分离DNA序列”、“克隆核酸序列”或“克隆DNA序列”。

分离蛋白质

当术语“分离的”应用于蛋白质时表明该蛋白质已经脱离了其天然环境。

在一个优选的方式中，分离蛋白质基本不含其它蛋白质，尤其是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(见下))。

如通过SDS-PAGE所确定，分离蛋白质纯度大于10％、优选大于20％、更优选大于30％。此外，优选提供如通过SDS-PAGE所确定的高度纯化形式的蛋白质，即纯度大于40％、大于60％、大于80％，更优选大于95％并且最优选大于99％。

术语“分离蛋白质”可备选地称作“纯化蛋白质”。

同源杂质

术语“同源杂质”意指源自最初获得本发明蛋白酶的同源细胞中的任何杂质(例如除本发明蛋白酶之外的另外的多肽)。

获得自

如此处所使用的与特定微生物来源有关的术语“获得自”意指由特定来源产生的或由所来源基因已经插入的细胞产生的多核苷酸和/或蛋白酶。

底物

如此处所使用的与蛋白酶的底物有关的术语“底物”应当解释为该术语的最广义形式，如包括包含至少一种对蛋白酶水解敏感的肽键的化合物。

产物

如所使用的与源自蛋白酶的酶反应产物有关的术语“产物”在本发明的上下文中应当解释为包括涉及蛋白酶的水解反应的产物。产物可以为后续水解反应中的底物。

洗涤性能

在本上下文中，术语“洗涤性能”用作表示酶在例如洗涤或硬质表面清洁过程中去除污迹、特别是所清除物体上的蛋迹的能力。还可参见实施例VII中的“模式洗涤剂洗涤性能测试”。

附图简述

图1描述了本发明蛋白酶的抑制谱图。

图2描述了本发明蛋白酶的底物特异性。

图3描述了本发明蛋白酶的温度谱图。

图4描述了如DMC测定法所测定的本发明蛋白酶的pH谱图。

图5描述了如ACZL-酪蛋白-测定法所测定的本发明蛋白酶的pH谱图。

图6描述了本发明蛋白酶的pH-稳定性谱图。

发明详述

在本发明第一个引起关注的方面，具有改善稳定性的胰蛋白酶样蛋白酶是与如SEQ NO：2(即成熟蛋白酶)的第1-266位氨基酸所示的氨基酸序列具有至少73％同一性的分离蛋白酶。

在一个引起关注的实施方案中，本发明的蛋白酶与如SEQ NO：2的第1-266位氨基酸所示氨基酸序列具有大于75％、或大于80％、或大于85％、或大于90％、或大于92％、或大于94％、或大于96％、或大于97％、或大于98％、或大于99％的同一性。

在另一个引起关注的方面，所述蛋白酶是具有如SEQ NO：2的第-25-266位氨基酸所示氨基酸序列的蛋白酶变体，所述蛋白酶变体包含一个或多个氨基酸残基的替代、缺失和/或插入。

序列比对和同一性值的计算可以使用对蛋白质和DNA比对均有用的完全Smith-Waterman比对进行。氨基酸序列可以使用默认设置的VectorNTI程序包v8的AlignX应用程序比对，该应用程序使用改进ClustalW算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson T.J.，1994)、blosum62mt2得分矩阵、开口罚分10和缺口延伸罚分0.1。

通过对具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白酶的氨基酸序列与认为是现有技术最接近蛋白酶的氨基酸序列之间进行此种比对，发现了同一性为73％的成熟蛋白质。

在本发明另一个引起关注的实施方案中，分离蛋白酶由这样的核酸序列编码，其中所述核酸序列在低严格条件下、优选在中等严格条件下、更优选在高严格条件下与(i)如SEQ ID NO：1的第127-804位核苷酸所示核酸序列的互补链，或(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor，New York)。

如SEQ ID NO：1的第127-804位核苷酸所示核酸序列互补链的亚序列可以为至少100个核苷酸或优选至少200个核苷酸、或至少300个核苷酸，或至少400个核苷酸。而且，亚序列应当编码具有蛋白水解活性的蛋白酶片段。蛋白酶还可以是具有蛋白水解活性的蛋白酶等位基因变体或片段。

SEQ ID NO：1的核酸序列或其亚序列以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段可用于设计核酸探针，以便根据本领域众所周知的方法从不同属或种的株系中鉴定和克隆编码具有蛋白水解活性的subtilase的DNA。具体而言，此类探针可用于在标准DNA印迹方法中与目的属或种的基因组DNA或cDNA杂交以便鉴定和分离其相应基因。此类探针比完整序列明显较短，但长度应该至少15个、优选25个并且更优选35个核苷酸。还可使用更长的探针。DNA探针和RNA探针均可使用。探针一般是标记的以便用于检测相应基因(例如用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白标记)。此类探针包括于本发明中。

因此，从其它此类生物中制备的基因组DNA文库或cDNA文库可筛选与上述探针杂交并且编码本发明subtilase的DNA。来自其它此类生物的基因组DNA或其它DNA可以通过熟练技术人员所知的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或者其它分离技术分离。来自文库的DNA或分离DNA可以转移并固定在硝酸纤维素或其它适宜载体材料上。为了鉴定与SEQ IDNO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料用于DNA印迹。为了本发明的目的，杂交作用指核酸序列与对应于SEQ ID NO：1中所示核酸序列、其互补链或其亚序列的标记核酸探针在低严格条件至高严格条件下杂交。使用X射线胶片检测在此类条件下与核酸探针杂交的分子。

对于至少100个核苷酸长度的长探针，将低严格条件至高严格条件定义为在标准DNA印迹方法之后于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200□g/ml已剪切和变性鲑精DNA和25％甲酰胺(对于低严格条件)、35％甲酰胺(对于中等严格条件)或50％甲酰胺(对于高严格条件)中预杂交和杂交。

对于至少100个核苷酸长度的长探针，载体材料用2×SSC、0.2％SDS于优选至少50℃(低严格条件)、更优选至少55℃(中等严格条件)、甚至更加优选65℃(高严格条件)下最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在标准DNA印迹方法之后于低于根据Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48：1390)的计算方法所计算Tm值5-10℃的温度下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1×Denhardt溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg/ml酵母RNA中进行预杂交、杂交和杂交后洗涤。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，载体材料于低于所计算Tm值5-10℃的温度下，在添加0.1％SDS的6×SCC中洗涤一次(15分钟)并且用6×SCC洗涤两次(每次15分钟)。

本领域众所周知，一种氨基酸残基替换成相似氨基酸残基的所谓保守替换预期在酶的特征上仅产生轻微改变。

下表1列出了保守氨基酸替换的组别。

表1

                保守氨基酸置换

共同特征        氨基酸

碱性(正电荷)    R＝精氨酸

                K＝赖氨酸

                H＝组氨酸

酸性(负电荷)    E＝谷氨酸

                D＝天冬氨酸

极性            Q＝谷氨酰胺

                N＝天冬酰胺

疏水性          L＝亮氨酸

                I＝异亮氨酸

                V＝缬氨酸

                M＝甲硫氨酸

芳香族          F＝苯丙氨酸

                W＝色氨酸

                Y＝酪氨酸

小的            G＝甘氨酸

                A＝丙氨酸

                S＝丝氨酸

                T＝苏氨酸

因此，在本发明又一个令人关注的实施方案中，具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白酶同时具有一个或多个氨基酸残基的替代、缺失和/或插入。

而且，与具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白酶具有免疫化学同一性或部分免疫化学同一性的所分离蛋白酶(优选纯化形式)也处于本发明范围内。免疫化学特性可以通过众所周知的Ouchterlony双向免疫扩散方法由免疫交叉反应同一性检测确定。具体而言，根据Harboe和Ingild在N.H.Axelsen，J.Krll和B.Weeks编辑的A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications，1973，第23章或Johnstone和Thorpe的Immuno-chemistry in Practice，BlackwellScientific Publications，1982(更具体在第27-31页)所描述的方法免疫兔(或其它啮齿类动物)制备抗血清，其中所述抗血清包含与具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白酶表位发生免疫反应或结合的多克隆抗体。具有免疫化学同一性的蛋白酶是与抗血清以相同方式反应的蛋白酶，所述的相同方式例如在使用特异免疫化学技术时沉淀完全融合、相同的沉淀形态学和/或相同的电泳迁移率。Axelsen，Bock和Krll在N.H.Axelsen，J.Krll和B.Weeks编辑的A Manual of Quantitative immunoelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications，1973，第10章中深入解释了免疫化学同一性。具有部分免疫化学同一性的蛋白酶是与抗血清以部分相同方式反应的蛋白酶，所述的部分相同方式例如在使用特异免疫化学技术时沉淀的部分融合、部分相同的沉淀形态学和/或部分相同的电泳迁移率。Bock和Axelsen在N.H.Axelsen，J.Krll和B.Weeks编辑的A Manual ofQuantitative immunoelectrophoresis，Blackwell Scientific Publications，1973，第11章中描述了部分免疫化学同一性。

抗体还可以是单克隆抗体。单克隆抗体可根据如E.Harlow和D.Lane，编者，1988，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York的方法制备和使用。

本发明人分离了编码具有如SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的subtilase的基因并且将其插入至大肠杆菌(Escherichia coli)NN049696中。根据国际承认用于专利程序的微生物菌种保藏布达佩斯条约，将携带所述基因的大肠杆菌NN049696株于2000年2月8日保藏于德意志微生物保藏中心(Mascheroder Weg 1B，D-38124 Braunschweig，德国)并且指定保藏号为DSM 15940。

在本发明一个令人关注的实施方案中，所述蛋白酶与由多核苷酸的蛋白酶编码部分所编码蛋白酶具有大于73.0％、或大于75.0％、或大于80.0％、或大于85.0％、或大于90.0％、或大于92.0％、或大于94.0％、或大于96.0％、或大于97.0％、或大于98.0％、或大于99.0％的同一性，其中所述的多核苷酸的蛋白酶编码部分已经被克隆进入保藏号DSM 15940大肠杆菌NN049696中质粒片段。

如上所述，本发明的蛋白酶在洗涤剂中表现出改善的稳定性。因此，为了使熟练技术人员能选择有效的和优选的蛋白酶，为此目的本发明人提供了能够由熟练技术人员容易实施以便评估所讨论蛋白酶性能的适宜测试法。

因此，可使用此处实施例V中公开的稳定性测试以评估所选择蛋白酶的稳定性。也就是说，当蛋白酶混合到标准洗涤剂组合物中时，可以使用此实施例评估与参考系统(混合到相同模式洗涤剂系统中并在相同条件下测试)相比较的蛋白酶的稳定性。

在本发明一个令人关注的方面中，当在“实施例V洗涤剂中的稳定性”中测试时所述蛋白酶在30℃时具有至少40％的残余活性，在30℃时具有至少50％的残余活性，例如在30℃时具有至少60％的残余活性，更优选地在30℃时具有至少70％的残余活性。

在本发明另一个令人关注的方面中，当在“实施例V洗涤剂中的稳定性”中测试时所述蛋白酶在35℃时具有至少40％的残余活性，在35℃时具有至少50％的残余活性，例如在35℃时具有至少60％的残余活性，更优选地在35℃时具有至少70％的残余活性。

因此，对于衣物洗涤目的特别令人关注的蛋白酶是这样的蛋白酶，当该蛋白酶在如此处“稳定测试”所述的包含下列成分的模式洗涤剂组合物中测试时表现出与相同条件下测试的参照酶相比改善的稳定性：

磺酸盐                                20-30％

非离子表面活性剂                      0-4％

Na₂SO₄                             2-8％

Na₂CO₃                         20-40％

Na₂O*2SiO₂                     1-3％

沸石4A                            5-15％

非极性的烃                        0-0.5％

柠檬酸钠                          2-8％

PCA共聚物                         0-2％

本发明的蛋白酶可通过用于人工产生多样性的标准技术构建，例如通过不同蛋白酶基因的DNA改组(见WO 95/22625和J.E.Ness等，NatureBiotechnology，17，893-896(1999))。

显而易见，本发明的蛋白酶还可从天然来源分离，即本发明的蛋白酶可以是例如真菌多肽，并且更优选是丝状真菌蛋白酶，如镰孢霉属、顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Filibasidium、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)的蛋白酶；或酵母蛋白酶例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或亚罗酵母属(Yarrowia)蛋白酶。

在另一个令人关注的实施方案中，蛋白酶是杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusarium sulphureum)、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、孤独腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicolalanuginose)、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliphthora thermophila、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium pur-purogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)、李氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)蛋白酶。

在一个令人关注的实施方案中，蛋白酶是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis蛋白酶。

应当理解，对于前面提到的物种本发明包括完整状态和不完整状态以及其它分类学上的同等物如无性型，而无论其种名是否已知。本领域的技术人员会容易识别适当同等物的同一性。

本发明的蛋白酶还可以是细菌蛋白酶，如革兰氏阳性细菌的蛋白酶如芽孢杆菌属(Bacillus)多肽，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、Bacillus lautus、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白酶；或链霉菌属(Streptomyces)蛋白酶如变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)蛋白酶；或者革兰氏阴性细菌蛋白酶如大肠杆菌或假单胞菌属(Pseudomonas)蛋白酶。

公众轻易地从众多的菌种保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)、荷兰真菌菌种保藏中心(CBS)和美国北方农业研究所培养物保藏中心(NRRL)获得这些物种的株系。

而且，可使用上述探针从其它来源，包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等等)中分离的微生物中鉴定和获得此类蛋白酶。用于从天然环境中分离微生物的技术为本领域众所周知。类似地，筛选另一种微生物的基因组文库或cDNA文库还可得到多核苷酸。一旦使用探针检测到编码蛋白酶的多核苷酸，则可用本领域普通技术人员所知的技术分离或克隆该序列(见例如Sambrook等，1989，见上)。

通常，可以使用用于克隆基因和向所述基因导入(随机和/或位点定向)插入的标准方法以便获得本发明的蛋白酶。对适宜技术的进一步描述，可参考此处实施例(见下页)和Sambrook等，(1989)Molecular cloning：Alaboratory manual，Cold Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.等(编者)“Current protocols in Molecular Biology”JohnWiley and Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编者)“MolecularBiological Methods for Bacillus”，John Wiley and Sons，1990；以及WO96/34946。

此外，本发明的蛋白酶可通过用于人工创造多样性的标准技术构建，例如通过不同蛋白酶基因的DNA改组(WO 95/22625；Stemmer WPC，Nature 370：389-91(1994))。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明蛋白酶的分离多核苷酸。

在一个令人关注的实施方案中，多核苷酸与如SEQ ID NO：1的第52-804位核苷酸所示的多核苷酸的同一性为至少86％，诸如至少87％，例如至少88％，优选至少89％，诸如至少90％，例如至少91％，更优选至少92％，诸如至少93％，例如至少94％，最优选至少95％，诸如至少96％，例如至少97％，具体而言至少98％，优选至少99％。在本发明另一个令人关注的实施方案中，多核苷酸包含如SEQ ID NO：1的第127-804位核苷酸所示多核苷酸、其等位基因变体或其能够编码本发明蛋白酶的片段。显而易见，多核苷酸可由如SEQ ID NO：1的第127-804位核苷酸所示的多核苷酸组成。

本发明还包含编码具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸因为密码子简并性而不同于SEQ ID NO：2。本发明还涉及编码具有蛋白水解活性的SEQ ID NO：2片段的SEQ ID NO：1的亚序列。

SEQ ID NO：1的亚序列是包含SEQ ID NO：1的第52-804位核苷酸的多核苷酸，只是去除了5’末端和/或3’末端的一个或多个核苷酸。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术为本领域众知并且包括从基因组DNA中分离、从cDNA中制备或其组合。可使用例如众所周知的聚合酶链式反应(PCR)或旨在检测具有共同结构特征的所克隆DNA片段的表达文库抗体筛选法实现从该基因组中克隆本发明多核苷酸。见例如Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，AcademicPress，New York。可使用其它的核酸扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录法(LAT)和酸序列依赖性扩增法(NASBA)。

所分离多核苷酸可通过例如基因工程中使用的旨在将多核苷酸从其天然位置迁移至其可以再生的不同位点的标准克隆方法获得。所述克隆方法包括剪切和分离含有编码蛋白酶的多核苷酸的目的核酸片段、将片段插入载体分子以及将重组载体整合进入宿主细胞，在所述宿主细胞中将复制出多核苷酸的多个拷贝或克隆。所述的多核苷酸可以为基因组来源、cDNA来源、RNA来源、半合成来源、合成来源或其组合。

为了本发明的目的，如上述测定两种多核苷酸之间的同一性程度。

对编码本发明蛋白酶的多核苷酸进行修饰对于与蛋白酶基本类似的蛋白酶的合成可能是必需的。术语与蛋白酶“基本类似”指蛋白酶的非天然存在形式。这些蛋白酶在某些工程化方式上不同于从其天然来源分离的蛋白酶，例如特异活性、热稳定性、最佳pH等不同的变体。变体序列可以基于作为SEQ ID NO：1的多肽编码部分存在的多核苷酸(例如其亚序列)而构建，和/或通过导入不会产生核酸序列所编码蛋白酶的另一种氨基酸序列但符合宿主生物密码子选择(为了酶的生产)的核苷酸替代或者通过导入可产生不同氨基酸序列的核苷酸替代而构建。对于核苷酸替代的概述见例如Ford等，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。

本领域技术人员熟知，此类替代可在分子的功能关键区域以外进行并且仍产生活性蛋白酶。可根据本领域已知方法，如位点定向突变或丙氨酸扫描突变(见例如Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)鉴定对于本发明所分离多核苷酸编码的多肽的活性必需的并且因此优选不进行替代的氨基酸残基。在丙氨酸扫描突变技术中，在分子中每个正电荷残基处引入突变，并且测试所得突变分子的蛋白水解活性以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点还可通过三维结构分析确定，所述三维结构分析可通过诸如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记技术测定(见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，Journal of Molecular Biology 224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLetters 309：59-64)。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明多核苷酸的核酸构建体，其中所述多核苷酸与能够指导多肽在适宜宿主细胞中表达的一种或多种控制序列有效连接。

为了使蛋白酶表达，可以以多种方式操作编码本发明蛋白酶的分离多核苷酸。在插入载体之前对多核苷酸进行操作可能是期望的或必需的，这取决于表达载体。利用重组DNA方法来修饰多核苷酸的技术是本领域众所周知的。

控制序列包括对表达本发明蛋白酶所必需或有利的所有成分。相对于编码蛋白酶的多核苷酸而言，每一控制序列可以是天然的或外来的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子以及转录终止信号和翻译终止信号。可提供含接头的控制序列，其中所述接头用于引入便于控制序列与编码蛋白酶的多核苷酸的编码区连接的特异限制性酶切位点。

控制序列可以是适当启动子序列，即在核酸序列表达时可被宿主细胞识别的序列。启动子序列包含介导蛋白酶表达的转录控制序列。启动子可以是在所选择宿主细胞中表现转录活性的任何多核苷酸，其包括突变体启动子、截断启动子和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外蛋白酶或细胞内蛋白酶的基因获得。

用于指导本发明核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的适宜启动子的例子是从米曲霉TAKA淀粉酶基因、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶基因、黑曲霉中性α淀粉酶基因、黑曲霉酸稳定性α淀粉酶基因、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)基因、米黑根毛霉脂肪酶基因、米曲霉碱性蛋白酶基因、米曲霉丙糖磷酸异构酶基因、构巢曲霉乙酰胺酶基因和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶基因获得的启动子(WO 96/00787)以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)以及其突变启动子、截断启动子和杂合启动子。

在酵母宿主中有用的启动子是从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)基因、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)基因和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因获得的启动子。用于酵母宿主细胞的其它启动子描述于Romanos等，1992，Yeast 8：423-488。

用于指导本发明核酸构建体转录，尤其是在细菌宿主细胞中转录的适宜启动子的例子是从大肠杆菌lac操纵基因、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核的β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75：3727-3731)获得的启动子以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria”(ScientificAmerican，1980，242：74-94)和Sambrook等，1989，同上。

控制序列还可以是适宜转录终止序列，即宿主细胞识别以终止转录的序列。终止序列与编码蛋白酶的多核苷酸的3’末端有效连接。在所选择宿主细胞中具有功能的任何终止子可用于本发明。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶基因、黑曲霉α葡糖苷酶基因和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶基因获得的终止子。

用于酵母宿主细胞的优选终止子是从酿酒酵母烯醇化酶基因、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)基因和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因获得的终止子。用于酵母宿主细胞的其它终止子描述于Romanos等，1992，同前。

控制序列还可以是适宜前导序列，即对宿主细胞翻译而言重要的mRNA非翻译区域。前导序列有效连接于编码多肽的多核苷酸5’末端。在所选择宿主细胞中具有功能的任何前导序列可用于本发明。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶基因和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶基因获得的。

用于酵母宿主细胞的适宜前导序列是从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、酿酒酵母α因子基因和酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)基因获得的。

控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，即有效连接于多核苷酸3’末端并且在转录时被宿主细胞识别作为向所转录mRNA添加聚腺苷酸残基的信号的序列。在所选择宿主细胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列可用于本发明。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶基因、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶基因和黑曲霉α葡糖苷酶基因获得的。

用于酵母宿主细胞的聚腺苷酸化序列描述于Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990。

控制序列还可以是信号肽编码区，其中所述信号肽编码区编码连接于蛋白酶氨基末端的氨基酸序列并且指导所编码蛋白酶进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可内在地包含与编码分泌性蛋白酶的编码区片段以翻译阅读框天然连接的信号肽编码区。备选地，编码序列的5’端可包含对编码序列而言为外来的信号肽编码区。当编码序列在天然情况下不包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，可以将外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区以便增强蛋白酶的分泌。然而，能够指导所表达蛋白酶进入所选择宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可用于本发明。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、孤独腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶基因和柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶基因获得的。

用于酵母宿主细的信号肽编码区是从酿酒酵母α因子基因和酿酒酵母转化酶基因获得的。其它有用信号肽编码区描述于Romanos等，1992，同前。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从芽孢杆菌NCIB 11837麦芽糖淀粉基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA基因获得的信号肽编码序列。另一些信号肽描述于Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137。

控制序列还可以是编码位于蛋白酶氨基端的前肽编码区。得到的多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常为非活性的并且可通过将前肽从前多肽中催化性切下或自催化性切下而转换为成熟的活性多肽。前肽编码区可从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)基因、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)基因、酿酒酵母α因子基因、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因和Myceliphthora thermophila虫漆酶基因(WO 95/33836)获得的。

当信号肽和前肽区均出现于subtilase的氨基末端时，则前肽区紧邻蛋白酶氨基端而信号肽区位于前肽区的氨基端。

添加使多肽表达相对于宿主细胞生长而受到调节的调节序列也是适当的。调节系统的实例是那些对化学刺激或物理刺激(包括调节性化合物的存在)做出反应从而引起基因表达开启或关闭的系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAα淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的调节序列。在真核系统中，这些调节序列包括能够在氨甲蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和在重金属存在下扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸与调节序列有效连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明核酸构建体、启动子和转录终止信号和翻译终止信号的重组表达载体。

包含编码本发明酶的核酸构建体的重组表达载可以是方便进行重组DNA操作的任何载体。

载体的选择常常取决于该载体将要导入的宿主细胞。因此，载体可为自主复制载体，即作为载体复制不依赖于染色体复制的染色体外实体存在的载体，例如质粒。备选地，载体可以是在导入宿主细胞后部分或全部整合至宿主细胞基因组并且与载体所导入染色体一同复制的一种载体。

载体优选为表达载体，在此载体中编码本发明酶的DNA序列与DNA转录所需的额外片段有效连接。通常表达载体源自质粒或病毒DNA，或者包含二者的成分。术语“有效连接”表示片段如此排列以便这类片段协调发挥它们的预期功能，例如转录从启动子起始并且前进通过编码酶的DNA序列。

启动子可以为在所选择宿主细胞内表现转录活性的任何DNA序列，并且可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。

用于细菌宿主细胞的适宜启动子实例包括嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因、淀粉液化芽孢杆菌α淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因的启动子，或者噬菌体λPR或PL启动子或者大肠杆菌lac、trp或tac启动子。

如果需要，还可以将编码本发明酶的DNA序列与适宜终止子有效连接。

本发明的重组载体还可进一步包含能使载体在所讨论宿主细胞内复制的DNA序列。

载体还可以包含选择标记，例如其产物补偿宿主细胞缺陷的基因或者编码对抗生素如卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等或对重金属或除草剂具有抗性的基因。

为了指导本发明的酶进入所述宿主细胞的分泌途径，可在重组载体中提供分泌信号序列(也称作前导序列、前序列原(prepro sequence)或前序列)。分泌信号序列可以以正确的读码框与编码酶的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码酶的DNA序列的5′端。分泌信号序列可以是与酶正常连接的分泌信号序列或者来自编码另一种分泌性蛋白质的基因。

用于将编码本发明酶的DNA序列分别与启动子和任选终止子和/或分泌信号序列连接的方法、或者用于通过合适的PCR扩增方案组装这些序列的方法和用于将它们插入包含复制或整合所必需信息的合适载体内的方法是本领域技术人员众所周知的(参考例如Sambrook等，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞。

导入宿主细胞的编码本发明酶的DNA序列对所讨论宿主而言为同源的或异源的。如果所述DNA序列与宿主细胞同源，即由该宿主细胞天然产生，则所述DNA序列一般与另一个启动子序列有效连接或者(如果可行的话)与不同于该序列天然环境中的另一种分泌信号序列和/或终止子序列连接。术语“同源”旨在包括编码对所讨论宿主生物而言为天然的酶的DNA序列。术语“异源”旨在包括宿主细胞天然不表达的DNA序列。因此，DNA序列可来自另一种生物，或者其为人工合成序列。

本发明DNA构建体或重组载体所导入的宿主细胞可以是能够产生本发明酶的任何细胞，其包括细菌、酵母、真菌和包括植物在内的高等真核细胞。

能够在培养时产生本发明酶的细菌宿主细胞的实例是革兰氏阳性细菌，例如芽孢杆菌菌株诸如枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus lautus、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌菌株，尤其是迟缓芽孢杆菌菌株，或者链霉菌菌株诸如变铅青链霉菌或鼠灰链霉菌菌株，或者革兰氏阴性菌如大肠杆菌。

细菌的转化可通过原生质体转化、电穿孔、结合或通过感受态细胞以本身已知的方式实现(参考Sambrook等，同前)。

当酶在细菌如大肠杆菌中表达时，此酶一般可作为不溶性颗粒(称作包涵体)留在细胞质中或者由细菌分泌序列指导分泌至壁膜间隙。在前一种情况下，将细胞裂解并且回收颗粒并变性，此后通过稀释变性剂使酶再折叠。在后一种情况下，可以通过破碎细胞(如通过超声处理或渗透休克以便释放壁膜间隙内容物)从壁膜间隙获得酶，并且回收酶。

当酶在革兰氏阳性细菌诸如芽孢杆菌或链霉菌菌株中表达时，酶可以滞留在细胞质中或者由细菌分泌序列指导分泌至细胞外培养基。在后一种情况下，如下所述可以从培养基中获得酶。

在本发明的另一个实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。如此处所用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担孢子目(basidiosporogenous)和属于半知菌类的酵母(芽酵母属(Blastomycetes))。由于酵母的分类将来可能变化，为了本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.，编者，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所描述进行定义。

在优选实施方案中，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或亚罗酵母属细胞。

在更优选实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母、诺地酵母或Saccharomycesoviformis细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最选的实施方案中，酵母宿主细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚门的所有真菌(如Hawksworth等，1995，见上，所定义)。丝状真菌的特征为具有由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝壁。营养生长通过菌丝延长进行并且碳代谢是专性需氧。与此不同，酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽进行并且碳代谢可以是发酵。

在甚至更加优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是如镰孢霉属、顶孢霉属、曲霉属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、弯颈霉属或木霉属各种的细胞，但不限于此。

在最优选实施方案中，所述的丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢菌、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum细胞。在甚至最优选的实施方案中，所述的丝状真菌母细胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)细胞。在另一个最优选的实施方案中，所述的丝状真菌宿主细胞是孤独腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、Myceliphthora thermophila、粗糙脉孢菌、产紫青霉、Thielaviaterrestris、哈茨木霉、康宁木霉、长柄木霉、李氏木霉或绿色木霉细胞。

真菌细胞可通过包括原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。适用于转化曲霉属宿主细胞的方法描述于EP238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81：1470-1474。适用于转化镰孢霉属各种的方法描述于Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787。对酵母的转化可使用Becker和Guarente(在Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编者，Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，第194卷，第182-187页，Academic Press，Inc.，New York中)；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163以及Hinnen等，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：1920中描述的方法进行。

产生本发明蛋白酶的方法

本发明还涉及产生本发明蛋白酶的方法，所述方法包括：

a)在诱导产生蛋白酶的条件下培养本发明的重组宿主细胞，和

b)回收蛋白酶。

当将包含编码酶的DNA序列的表达载体转化进入异源宿主细胞中时，有可能实现本发明酶的异源重组生产。

因此可以制造出高度纯化的蛋白酶组合物，其特征在于不含同源杂质。

在本发明上下文中，同源杂质意指来自同源细胞的任何杂质(例如除了本发明酶以外的其它多肽)，其中所述同源细胞是最始获得本发明酶的细胞。

用于培养所转化宿主细胞的培养基可以是适于所讨论宿主细胞生长的任何常规培养基。所表达的蛋白酶可以方便地分泌到培养基中并且可通过众所周知的方法从其中回收，其中所述方法包括经离心或过滤从培养基中分离细胞、通过盐例如硫酸铵沉淀方式沉淀培养基中的蛋白质成分、随后为层析方法例如离子交换层析、亲和层析等等。

本发明蛋白酶的用途

本发明蛋白酶可用于众多工业应用中，尤其用于洗涤剂工业。因此，本发明还涉及包含本发明蛋白酶的清洁组合物或洗涤剂组合物，优选衣物洗涤组合物或洗碟组合物。

包含本发明蛋白酶的洗涤剂组合物

通常，清洁组合物和洗涤剂组合物在本领域内经充分描述，并且对适宜清洁组合物和洗涤剂组合物的进一步描述可参考WO 96/34946；WO97/07202；WO 95/30011。

而且，此处的实施例证明本发明蛋白酶在洗涤剂中的稳定性得到改善。

洗涤剂组合物

本发明的酶可添加至清洁组合物或洗涤剂组合物中并且因此成为它们的一种成分。

本发明的洗涤剂组合物可以配制成例如手洗或机洗衣物洗涤剂组合物(其包含适用于预处理脏织物的衣物添加剂组合物和漂洗加入的织物柔软剂组合物)，或者配制成用于一般家居硬质表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制成用于手工用或机器用洗碟操作的洗涤剂组合物。

在一个特定方面，本发明提供了包含本发明蛋白酶的洗涤剂添加剂。洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包含一种或多种其它酶，如另一种蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、arabinase、galactanase、木聚糖酶、氧化酶如虫漆酶和/或过氧化物酶。

通常，所选则酶的特征应当与所选择洗涤剂相容(例如最佳pH、与其它酶或非酶成份的相容性等等)，并且酶应当以有效量存在。

蛋白酶：适宜蛋白酶包括那些动物来源、植物来源或微生物来源的蛋白酶。优选微生物来源的蛋白酶。化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体包括在内。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草蛋白酶，尤其是那些源自芽孢杆菌属的枯草蛋白酶，如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(如猪或牛来源)和在WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢霉属蛋白酶。

有用蛋白酶的实例是在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体，尤其在如下位置存在一个或多个替代的变体：第27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274位(BPN’编号)。

优选的可商业获得的蛋白酶包括Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Esperase^TM、Kannase^TM(Novozymes A/S)、Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、FN2^TM和FN3^TM(Genencor International Inc.)。

脂肪酶：适宜脂肪酶包括那些细菌来源或真菌来源的脂肪酶。化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体包括在内。有用脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(同义词嗜热真菌属)如在EP 258 068和EP 305 216中描述的柔毛腐质霉或者在WO 96/13580中描述的孤独腐质霉的脂肪酶；假单胞菌脂肪酶如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌种SD 705菌株(Pseudomonas sp.strain SD 705)(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌脂肪酶如来自枯草芽胞杆菌(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO91/16422)的脂肪酶。

另一些实例是如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些脂肪酶变体。

优选的可商业获得的脂肪酶包括Lipolase^TM和LipolaseUltra^TM(Novozymes A/S)。

淀粉酶：适宜(α和/或β)淀粉酶包括那些细菌来源或真菌来源的淀粉酶。化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体包括在内。淀粉酶包括例如自芽孢杆菌如更加详细描述于GB 1,296,839中的地衣芽孢杆菌特定株获得的α-淀粉酶。

有用淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体，尤其在如下位置存在一个或多个替代的变体：第15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444位。

可商业获得的淀粉酶是Duramyl^TM、termamyl^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)、Rapidase^TM和Purastar^TM(来自GenencorInternational Inc.)。

纤维素酶：适宜纤维素酶包括那些细菌来源或真菌来源的纤维素酶。化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体包括在内。适宜纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳属、顶孢霉属的纤维素酶，例如公开于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US5,776,757和WO 89/09259中的由孤独腐质霉、Myceliphthora thermophila和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。

尤其适合的纤维素酶是助于护色的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。另一些实例是在WO 94/07998、EP 0 531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些纤维素酶变体。

可商业获得的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(NovozymesA/S)、Clazinase^TM、和Puradax HA^TM(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：适宜过氧化物酶/氧化酶包括那些植物、细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体包括在内。有用过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)如灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶以及在WO 93/24618、WO 95/10602和WO98/15257中描述的它们的变体。

通过添加包含一种或多种酶的单独添加剂或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂，使洗涤剂组合物中包含洗涤剂酶。本发明的洗涤剂添加剂(即单独添加剂或组合添加剂)可配制成颗粒、液体、浆夜等。优选的洗涤剂添加剂制剂是颗粒(尤其为非尘状颗粒)、液体(尤其是稳定液体)或浆液。

非尘状的颗粒可例如按照US 4,106,991和4,661,452中所公开那样产生并且可任选地通过本领域已知的方法包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1000-20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；在醇中包含12-20个碳原子并且存在15-18个环氧乙烷单元的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸以及脂肪酸的单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。适用于通过流化床技术形成膜的包衣材料的实例在GB 143591中给出。液体酶制剂可以根据已建立方法通过加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸进行稳定处理。经保护的酶可根据在EP238,216中公开的方法制备。

本发明的洗涤剂组合物可为任何方便形式，如棒状、片状、粉末、颗粒状、糊状或液体。液体洗涤剂可以是含水液体，一般含有高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或者是非水液体。

洗涤剂组合物一般包含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是包括半极性在内的非离子表面活性剂和/或阴离子表面活性剂和/或阳离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂水平一般为重量的0.1％-60％。

当在洗涤组合物中包含阴离子表面活性剂时，所述洗涤剂一般包含大约1％至大约4％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸钠、α烯烃磺酸酯、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α硫代脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。

当在洗涤组合物中包含非离子表面活性剂时，所述洗涤剂一般包含大约0.2％至大约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides)”)。

洗涤剂可以包含0-65％的助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。聚合物的实例是羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡啶N-氧化物、聚乙烯咪唑、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以包含含有过氧化氢源如过硼酸盐或过碳酸盐的漂白系统，其中所述过氧化氢源可与形成过酸的漂白激活物如四乙酰基乙二胺或壬酰羟苯磺酸盐混合。备选地，漂白系统可包含例如酰胺型、二酰亚胺型或砜型的过氧酸。

本发明洗涤剂组合物中的酶(类)可使用常规稳定剂进行稳定，稳定剂如多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物如芳香硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸，并且组合物可以按照如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。

洗涤剂还可以包含其它常规洗涤剂成份例如织物调节剂，包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐剂、污垢悬浮剂、防尘污再沾着剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂或香料。

目前考虑按照相当于每升洗涤液体0.01-100毫克酶蛋白、优选每升洗涤液体0.05-5毫克酶蛋白、尤其每升洗涤液体0.1-1毫克酶蛋白的量向洗涤剂组合物中加入任何酶，尤其是本发明的酶。

本发明的酶可以额外加入到WO 97/07202中所公开的洗涤剂配方。

本发明进一步在如下实施例中详细描述，所述实施例无论如何不限制本发明所要求的范围。

在洗涤剂组合物中，缩写的组分标识具有如下含义：

LAS：直链C₁₂烷基苯磺酸钠

TAS：动物脂烷基硫酸钠

XYAS：C_1X-C_1Y烷基硫酸钠

SS：分子式为2-丁基辛酸的二级皂表面活性剂

25EY：与平均Y摩尔的环氧乙烷缩合的主要为C₁₂-C₁₅的直链伯醇

45EY：与平均Y摩尔的环氧乙烷缩合的主要为C₁₄-C₁₅的直链伯醇

XYEZS：每摩尔与平均Z摩尔的环氧乙烷缩合的C_1X-C_1Y烷基硫酸钠

非离子表面活性剂：由BASF GmbH以商品名Plurafax LF404销售的C₁₃-C₁₅混合乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，其具有平均程度为3.8的乙氧基化作用和平均程度为4.5的丙氧基化作用

CFAA：C₁₂-C₁₄烷基N-甲基葡糖酰胺

TFAA：C₁₆-C₁₈烷基N-甲基葡糖酰胺

硅酸盐：无定形硅酸钠(SiO₂∶Na₂O比率＝2.0)

NaSKS-6：分子式为δ-Na₂Si₂O₅的晶态层状硅酸盐

碳酸盐：无水碳酸钠

磷酸盐：三聚磷酸钠

MA/AA：马来酸/丙烯酸为1∶4的共聚物，其平均分子量大约为80,000

聚丙烯酸盐：由BASF GmbH以商品名PA30销售的聚丙烯酸盐同聚物，其平均分子量为8,000

沸石A：具有1-10微米的原始粒度大小的分子式为Na₁₂(AlO₂SiO₂)₁₂.27H₂O的水合硅酸铝钠

柠檬酸盐：柠檬酸三钠二水合物

柠檬酸：柠檬酸

过硼酸盐：无水过硼酸钠单水合物漂白剂，实验式为NaBO₂.H₂O₂

PB4：无水过硼酸钠四水合物

过碳酸盐：实验式为2Na₂CO₃.3H₂O₂的无水过碳酸钠漂白剂

TAED：四乙酰基乙二胺

CMC：羧甲基纤维素钠

DETPMP：二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)，由Monsanto以商品名Dequest 2060销售

PVP：聚乙烯吡咯烷酮聚合物

EDDS：钠盐形式的乙二胺-N，N’-二琥珀酸，[S，S]异构体

抑泡剂：25％石蜡(熔点为50℃)，17％疏水二氧化硅，58％石蜡油

颗粒抑泡剂：12％硅氧烷/二氧化硅，18％十八烷醇，70％颗粒形式淀粉

硫酸盐：无水硫酸钠

HMWPEO：高分子量聚环氧乙烷

TAE25：动物脂醇乙氧基化物(25)

洗涤剂实例I

本发明的颗粒状织物清洁组合物可如下制备：

组分

％

直链C12烷基苯磺酸钠	6.5
		硫酸钠	15.0
沸石A	26.0
		次氮基三乙酸钠	5.0
酶	0.1
		PVP	0.5
TAED	3.0
		硼酸	4.0
过硼酸盐	18.0
		苯酚磺酸盐	0.1
次要物质(Minors)	至100

洗涤剂实例II

本发明的紧密颗粒状织物清洁组合物(密度800g/l)可如下制备：

组分	％
		45AS	8.0
25E3S	2.0
		25E5	3.0
25E3	3.0
		TFAA	2.5
沸石A	17.0
		NaSKS-6	12.0
柠檬酸	3.0
		碳酸盐	7.0
MA/AA	5.0
		CMC	0.4

酶	0.1
		TAED	6.0
过碳酸盐	22.0
		EDDS	0.3
颗粒状抑泡剂	3.5
		水/次要物质	至100

洗涤剂实例III

本发明的尤其用于洗涤染色织物的颗粒状织物清洁组合物可以如下制备：

组分	％	％
			LAS	10.7	-
TAS	2.4	-
			TFAA	-	4.0
45AS	3.1	10.0
			45E7	4.0	-
25E3S	-	3.0
			68E11	1.8	-
25E5	-	8.0
			柠檬酸盐	15.0	7.0
碳酸盐	-	10.0
			柠檬酸	2.5	3.0
沸石A	32.1	25.0
			Na-SKS-6	-	9.0
MA/AA	5.0	5.0
			DETPMP	0.2	0.8
酶	0.10	0.05

硅酸盐	2.5	-
			硫酸盐	5.2	3.0
PVP	0.5	-
			聚(4-乙烯吡啶)-N-氧化物/乙烯咪唑和乙烯吡咯烷酮的共聚物	-	0.2
过硼酸盐	1.0	-
			苯酚磺酸盐	0.2	-
水/次要物质	至100	至100

洗涤剂实例IV

本发明的能够提供“洗涤过程中柔化”能力的颗粒状织物清洁组合物可如下制备：

组分	％	％
			45AS	-	10.0
LAS	7.6	-
			68AS	1.3	-
45E7	4.0	-
			25E3	-	5.0
椰油烷基-二甲基-羟基-乙基氯化铵	1.4	1.0
			柠檬酸盐	5.0	3.0
Na-SKS-6	-	11.0
			沸石A	15.0	15.0
MA/AA	4.0	4.0
			DETPMP	0.4	0.4

过硼酸盐	15.0	-
			过碳酸盐	-	15.0
TAED	5.0	5.0
			绿土	10.0	10.0
HMWPEO	-	0.1
			酶	0.10	0.05
硅酸盐	3.0	5.0
			碳酸盐	10.0	10.0
颗粒状抑泡剂	1.0	4.0
			CMC	0.2	0.1
水/次要物质	至100％	至100％

洗涤剂实例V

本发明过脏液体织物清洁组合物可如下制备：

组分	％	％
			LAS酸形式	-	25.0
柠檬酸	5.0	2.0
			25AS酸形式	8.0	-
25AE2S酸形式	3.0	-
			25AE7	8.0	-
CFAA	5.0	-
			DETPMP	1.0	1.0
脂肪酸	8	-
			油酸	-	1.0
乙醇	4.0	6.0
			丙二醇	2.0	6.0

酶	0.10	0.05
			椰油烷基二甲基羟基乙基氯化铵	-	3.0
绿土	-	5.0
			PVP	2.0	-
水/次要物质	至100	至100

粉末状自动洗碟组合物I

非离子表面活性剂	0.4-2.5％
		偏硅酸钠	0-20％
二硅酸钠	3-20％
		三磷酸钠	20-40％
碳酸钠	0-20％
		过硼酸钠	2-9％
四乙酰基乙二胺(TAED)	1-4％
		硫酸钠	5-33％
酶	0.0001-0.1％

粉末状自动洗碟组合物II

非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)	1-2％
		二硅酸钠	2-30％
碳酸钠	10-50％
		膦酸钠	0-5％
无水柠檬酸三钠	9-30％

乙酸次氮基三钠(NTA)	0-20％
		过硼酸钠一水合物	5-10％
四乙酰基乙二胺(TAED)	1-2％
		聚丙烯酸聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物)	6-25％
酶	0.0001-0.1％
		香料	0.1-0.5％
水	5-10

粉末状自动洗碟组合物III

非离子表面活性剂	0.5-2.0％
		二硅酸钠	25-40％
柠檬酸钠	30-55％
		碳酸钠	0-29％
碳酸氢钠	0-20％
		过硼酸钠一水合物	0-15％
四乙酰基乙二胺(TAED)	0-6％
		马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％
粘土	1-3％
		聚氨基酸	0-20％
聚丙烯酸钠	0-8％
		酶	0.0001-0.1％

粉末状自动洗碟组合物IV

非离子表面活性剂

1-2％

沸石MAP	15-42％
		二硅酸钠	30-34％
柠檬酸钠	0-12％
		碳酸钠	0-20％
过硼酸钠一水合物	7-15％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	0-3％
聚合物	0-4％
		马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％
有机膦酸盐	0-4％
		粘土	1-2％
酶	0.0001-0.1％
		硫酸钠	平衡

粉末状自动洗碟组合物V

非离子表面活性剂	1-7％
		二硅酸钠	18-30％
柠檬酸三钠	10-24％
		碳酸钠	12-20％
单过硫酸盐(2KHSO5.KHS04.K2SO4)	15-21％
		漂白稳定剂	0.1-2％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-6％
		二乙三胺五乙酸，五钠盐	0-2.5％
酶	0.0001-0.1％
		硫酸钠、水	平衡

具有清洁表面活性剂系统的粉末状和液体洗碟组合物VI

非离子表面活性剂	0-1.5％
		十八烷基二甲胺N-氧化物脱水物	0-5％
十八烷基二甲胺N-氧化物二水合物和十六烷基二甲胺N-氧化物脱水物的C18/C16混合物，重量比为80∶20	0-4％
		无水十八烷基二(羟乙基)胺N-氧化物和无水十六烷基二(羟乙基)胺N-氧化物的C18/C16混合物，重量比为70∶30	0-5％
平均乙氧基化程度为3的C13-C15烷基乙氧基硫酸盐	0-10％
		平均乙氧基化程度为3的C12-C15烷基乙氧基硫酸盐	0-5％
平均乙氧基化程度为12的C13-C15乙氧基化醇	0-5％
		平均乙氧基化程度为9的C12-C15乙氧基化醇的混合物	0-6.5％
平均乙氧基化程度为30的C13-C15乙氧基化醇的混合物	0-4％
		二硅酸钠	0-33％
三聚磷酸钠	0-46％
		柠檬酸钠	0-28％
柠檬酸	0-29％
		碳酸钠	0-20％
过硼酸钠一水合物	0-11.5％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	0-4％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-7.5％

硫酸钠	0-12.5％
		酶	0.0001-0.1％

非水液体自动洗碟组合物VII

液体的非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)	2.0-10.0％
		碱金属硅酸盐	3.0-15.0％
碱金属磷酸盐	20.0-40.0％
		选自高级二元醇、聚乙二醇、多氧化物、乙二醇醚的液体载体	25.0-45.0％
稳定剂(例如磷酸和C16-C18链烷醇的偏酯)	0.5-7.0％
		抑泡剂(例如硅酮)	0-1.5％
酶	0.0001-0.1％

非水液体的洗碟组合物VIII

液体非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)	2.0-10.0％
		硅酸钠	3.0-15.0％
碱金属碳酸盐	7.0-20.0％
		柠檬酸钠	0.0-1.5％
稳定系统(例如精细粉碎的硅酮和低分子量的二烷基聚乙二醇醚的混合物)	0.5-7.0％
		低分子量聚丙烯酸聚合物	5.0-15.0％
粘土凝胶增稠剂(例如膨润土)	0.0-10.0％
		羟丙基纤维素聚合物	0.0-0.6％

酶	0.0001-0.1％
		选自高级二元醇、聚乙二醇、多氧化物、乙二醇醚的液体载体	平衡

摇溶的液体自动洗碟组合物IX

C12-C14脂肪酸	0-0.5％
		嵌段共聚物表面活性剂	1.5-15.0％
柠檬酸钠	0-12％
		三聚磷酸钠	0-15％
碳酸钠	0-8％
		三硬脂酸铝	0-0.1％
异丙基苯磺酸钠	0-1.7％
		聚丙烯酸增稠剂	1.32-2.5％
聚丙烯酸钠	2.4-6.0％
		硼酸	0-4.0％
甲酸钠	0-0.45％
		甲酸钙	0-0.2％
正癸基二苯基氧化物二磺酸钠	0-4.0％
		单乙醇胺(MEA)	0-1.86％
氢氧化钠(50％)	1.9-9.3％
		1，2-丙二醇	0-9.4％
酶	0.0001-0.1％
		抑泡剂、染料、香料、水	平衡

液体自动洗碟组合物X

醇乙氧基化物	0-20％
		脂肪酸酯磺酸盐	0-30％
十二烷基硫酸钠	0-20％
		烷基多糖苷	0-21％
油酸	0-10％
		一水合二硅酸钠	18-33％
脱水柠檬酸钠	18-33％
		硬脂酸钠	0-2.5％
一水合过硼酸钠	0-13％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	0-8％
马来酸/丙烯酸共聚物	4-8％
		酶	0.0001-0.1％

含有受保护的漂白粒子的液体自动洗碟组合物XI

硅酸钠	5-10％
		焦磷酸四钾	15-25％
三磷酸钠	0-2％
		碳酸钾	4-8％
受保护的漂白粒子，例如氯	5-10％
		聚合的增稠剂	0.7-1.5％
氢氧化钾	0-2％
		酶	0.0001-0.1％
水	平衡

XII：如I、II、III、IV、VI和X中所描述的自动洗碟组合物，其中以过碳酸盐替换过硼酸盐。

XII I：如I-VI中所描述的自动洗碟组合物，其还含有锰催化剂。锰催化剂可以是例如“Effcient manganese catalysts for low-temperaturebleaching”，Nature，(1994)，369，637-639中所描述的化合物之一。

材料和方法

真菌菌株腐皮镰孢(Fusarium solani)

米曲霉菌株BECh2(WO 00/39322)

表达载体pCaHj483(WO 98/00529)

曲霉表达构建体pMStr59(实施例VI)

蛋白活性酶测定法

AZCL-酪蛋白测定法：

底物：AZCL-酪蛋白(来自Megazyme的已交联并且染色的酪蛋白，货号I-AZCAS)

温度：可控

测定缓冲液：

·对于pH谱图：

о100mM琥珀酸，

о100mM HEPES，

о100mM CHES，

о100mM CABS，1mM CaCl₂，

о150mM KCl，

о0.01％Triton X-100

用HCl或NaOH调节至pH值3.0；4.0；5.0；6.0；7.0；8.0；9.0；10.0和11.0。

о对于其它：0.1M硼砂，pH 9.0。

用于AZCL-酪蛋白测定法的步骤：

1)轻轻搅拌将0.02g AZCL-酪蛋白悬浮于10.0ml测定缓冲液。

2)将200微升该悬浮液转移至管中并且置于冰浴，然后将40微升蛋白酶样品(在测试缓冲液中稀释)加至底物管中。

3)通过将含有底物样品和酶样品的管转移至温度混合器中开始测试，其中温度混合器在测定温度下预热至少5分钟。

4)将管在温度混合器上以1200转/分孵育20分钟。

5)将管转移至冰浴中终止孵育。

6)然后将管在冷冻离心机内离心数分钟。

7)测量OD₅₉₅，作为相对蛋白酶活性的量度标准。

用于DMC/TNBS测定法的步骤：

底物和试剂的制备：

оDMC底物溶液：

将0.075g DMC(二甲基酪蛋白，自Novo Nordisk A/S获得)溶解于10ml测定缓冲液(与AZCL-酪蛋白测定法中相同)，用HCl或NaOH调节pH，用0.45微米的滤膜过滤并且此滤液用作DMC底物溶液。

оTNBS溶液：

用5ml pH 9.0的200mM CHES(从Sigma获得)缓冲液稀释17微升1M TNBS(从Fluka获得)溶液，在冰上避光保存。

步骤：

1)将40微升DMC底物溶液转移至96孔微量滴定板，随后加入20微升蛋白酶样品，然后充分混合并且保持冰浴。

2)通过将微量滴定板转移至温度混合器中开始测定，其中温度混合器在测定温度下预热至少5分钟。

3)将管在温度混合器上以600转/分孵育20分钟。

4)将微量滴定板移至冰浴终止孵育，随后加入60微升TNBS溶液，在暗处于冰上保持15分钟。

5)测量OD₄₀₅作为相对蛋白酶活性的量度标准。

抑制物

由Novozymes A/S制备的链霉菌属枯草蛋白酶抑制物(SSI)

由Novozymes A/S制备的胰凝乳蛋白酶抑制物-2(CI-2)

来自USB life science的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)

对硝基苯胺生色底物

Suc-AAPF-pNA(Sigma S-7388)

Suc-AAPE-pNA(BACHEM L-1710)

Suc-GGF-pNA(Sigma S-1899)

BA-pNA(苯甲酰基-DL-精氨酸，Sigma B-4875)

Suc-FGL-pNA(Sigma S-6768)

实施例I：用于酶纯化和基因克隆的真菌菌株的培养

包含编码本发明蛋白酶基因片段的腐皮镰孢真菌菌株在WB培养集中生长。

每个500ml振摇培养瓶：

·30g麦麸，和

·45ml的如下溶液：

о0.18g酵母提取物，

о0.045g KH2PO4，

о0.0225g MgSO4.7H2O，

о0.675g葡萄糖，45ml自来水，

121℃高压灭菌30分钟，在25℃保持7天。

通过加入大约150ml灭菌水并且使用灭菌的玻璃棒搅拌，然后4℃放置过夜进行酶的提取。收集过滤和离心后的最终上清液并且用作进一步纯化的粗蛋白酶样品。

然后直接将10g发酵WB培养基转至清洁塑料袋内，随后立即在液氮中冷冻以收获菌丝体。冰冻的菌丝体保存于-80℃冰箱直至用于RNA提取。

实施例II：从培养液中纯化蛋白酶

将4000ml的实施例I中所述菌株上清液用于蛋白酶纯化。总蛋白用硫酸铵沉淀(80％饱和度)。

离心后，将沉淀重溶于100ml 25mM磷酸盐缓冲液中(pH6.0)，然后用相同缓冲液透析。

将已透析样品用0.45微米滤器过滤，然后加到纯化柱上。样品终体积是140ml。

将过滤的样品加载至经25mM pH6.0的磷酸盐缓冲液平衡的38ml SP琼脂糖FF柱(来自Phamacia)上，并且用线性NaCl梯度(0-0.3M)洗脱蛋白质。在pH 9.0，在预先用SSI抑制或不抑制的情况下，分析柱级分对AZCL-酪蛋白的蛋白酶活性。

将具有不被SSI抑制的蛋白酶活性级分混合。然后将混合溶液用3k膜(来自Amicon)超滤，将浓缩溶液加到经25mM Tris-HCl，pH7.4平衡的180ml Sephacryl 100柱上(来自Phamacia)。用相同缓冲液洗脱蛋白质。

在蛋白酶活性测试(用SSI预先抑制或未用SSI预先抑制)之后，通过SDS-PAGE分析具有蛋白酶活性级分，并将含有纯化蛋白酶的级分混合并且用做样品特征描述(见实施例IV)。

实施例III：蛋白酶的基因克隆

使用RT-PCR技术克隆编码本发明蛋白酶的基因片段。

总RNA的提取：

使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN，目录号74904)从冰冻菌丝体中提取总RNA。总RNA从实施例I所述菌株的100mg菌丝体中提取。

用于克隆的特异性引物的设计：

基于已知真菌胰蛋白酶DNA序列的保守区域设计用于从镰孢霉属和相关真菌中通过PCR扩增胰蛋白酶的特异性引物。引物序列(CDS引物)示于SEQ ID NO.：5。

通过使用3’RACE试剂盒克隆本发明蛋白酶全长：

3’RACE系统(GIBCO，目录号18373-019)用于合成本发明蛋白酶的cDNA。将大约5毫克总RNA用作模板并且将Adapter Primer(由3’RACE系统提供)用于合成cDNA的第一链。然后使用特异性CDS-引物扩增本发明蛋白酶的cDNA。

使用CDS引物扩增的PCR产物经凝胶分析得到大约～1kb片段的特异性条带，从1％LMP琼脂糖凝胶回收该产物，然后通过在70℃孵育并且随后使用PCR Preps DNA纯化系统(Promega，目录号A7170)纯化。纯化片段与pGEM-T载体(Promega，目录号A3600)连接，然后将2-4微升连接产物通过“热休克”法转化50微升JM109高效感受态细胞。

将转化培养液涂布于含有氨苄青霉素/IPTG/X-Gal的LB平板上，并将这些平板于37℃培养过夜。

通过指示平板上的颜色筛选和菌落PCR筛选鉴定重组克隆。将阳性克隆接种于3ml LB液体培养基并且于37℃振荡(大约250转/分)培养过夜。在10,000g离心5分钟沉淀细胞后，使用小量制备DNA纯化系统(Promega，目录号A7100)从细胞沉淀中制备质粒样品。最后，使用BigDye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(PE)通过ABI377测序仪对质粒测序，并且成功获得该基因的全长序列。

实施例IV：本发明蛋白酶的特征描述

抑制测试：

通过使用包括SSI、CI2和EDTA的不同抑制物在AZCL-酪蛋白测定法中测试已纯化的本发明蛋白酶(见实施例II)，以在WO 94/25583中公开的胰蛋白酶样蛋白酶和Savinase^作为对照。结果示于图1。

本发明蛋白酶的活性不受SSI、CI-2和EDTA抑制，这意味着该蛋白酶可能是丝氨酸蛋白酶家族中的非枯草蛋白酶。

底物特异性：

本发明蛋白酶的底物特异性通过使用包括AAPF、AAPE、GGF、BA和FGL的不同pNA底物测试，以Savinase^和在WO 94/25583中公开的胰蛋白酶样蛋白酶作为参照。结果示于图2。

所述蛋白酶与在WO 94/25583中公开的胰蛋白酶样蛋白酶具有相同的底物特异性并且它不同于枯草蛋白酶Savinase^。

温度谱图：

本发明蛋白酶的温度谱图使用如上所述的AZCL-酪蛋白测定法获得。结果示于图3，可以看出所述酶在15℃至70℃具有活性并且最佳温度在40℃至50℃附近。

pH谱图：

本发明蛋白酶的pH谱图使用在“蛋白酶活性测定法”部分所述的AZCL-酪蛋白测定法和DMC测定法获得。

结果示于图5(AZCL酪蛋白测定法)和图4(DMC测定法)。

所述蛋白酶在pH3至pH11表现活性并且在pH9附近具有最佳活性。在两种测定法中，直至pH11蛋白酶均表现出高活性。

pH-稳定性：

对于pH稳定性测试，将15微升酶样品与200微升pH3、4、5、6、7、8、9、10、11的缓冲液混合并且在37℃孵育2小时。随后，使用如上“蛋白酶活性测定法”部分所述的AZCL-酪蛋白测定法测定酶活性。结果示于图6。可以看出本发明的蛋白酶在pH4至pH10的宽pH范围内稳定。

实施例V：在洗涤剂中的稳定性

蛋白酶用去离子水稀释并且与来自KAO的Attack洗涤剂溶液(溶于去离子水中的1.4g/l，6°dH(CaCl2∶MgCl2 2∶1)，未加热灭活)混合以产生0.7g/l(3°dH)的洗涤剂终浓度和相关的蛋白酶含量。对应于混合物中OD280为25-50mA/ml的蛋白酶剂量为正常的。重复进行三次。

将混合物于20℃、25℃、30℃和35℃孵育30分钟然后在DMC/TNBS测定法中测定活性，或者将混合物立即测定作为参考。

将下表所示的残余活性计算为与参考样品活性相比所贮存样品的活性。

作为温度函数的残余活性(％)
					温度(℃)	20	25	30	35
WO 9425583	82	60	8	4
					本发明的酶	69	72	72	71

如以上数据可以看出，本发明的蛋白酶与在WO 9425583中公开的蛋白酶相比在稳定性方面显示出明显地改善。

实施例VI在米曲霉中表达来自腐皮镰孢的胰蛋白酶

编码腐皮镰孢胰蛋白酶的核苷酸序列(SEQ ID No：1)用于设计PCR扩增所述基因的引物，在所述引物的末端加入了利于克隆进入表达载体的适当限制性位点(见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；引物序列)。

使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，California，美国)并按照制造商说明书并且使用实施例III中所述cDNA作为模板开展PCR扩增，退火温度为58℃且延伸时间1分钟，30个循环。得到单一PCR产物，将产物用XhoI限制性切割并且克隆到曲霉表达载体pCa Hj483(WO98/00529)中，该载体已经使用标准技术用NruI和XhoI限制性切割。表达载体pCaHj483含有在大肠杆菌中选择和增殖的序列以及在曲霉中选择和表达的序列。

具体而言，在曲霉中的选择通过构巢曲霉的amdS基因的帮助，此amdS基因允许使用乙酰胺作为唯一氮源。在曲霉中的表达通过来自黑曲霉的中性淀粉酶II(NA2)启动子介导，该启动子与来自构巢曲霉的丙糖磷酸异构酶(tpi)编码基因的5’前导序列和来自黑曲霉的淀粉葡糖苷酶的编码基因终止子融合。将所得到的曲霉表达构建体pMStr59的胰蛋白酶编码基因测序并且将序列与先前测定序列比较以证实PCR扩增期间没有引入错误。

使用标准技术(Christensen，T.等，(1988)，Biotechnology 6，1419-1422)将pMStr59转化米曲霉菌株BECh2(WO 00/39322)。通过WO 94/26925中描述的方法使用100ml含5.0AU/l Neutrase 1.5 MG(Novozymes A/S，Bagsvaerd，丹麦)的改进FG4P培养基在250ml瓶中培养转化体。将Neutrase溶解于pH6.5的通用缓冲液中并且在添加前过滤除菌。培养物于26℃、270转/分振荡培养4天。

如WO 94/26925中所描述测定镰孢霉胰蛋白酶的表达，使用N-苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸(L-BA-pNA)作为底物，并且pH8.0的tris缓冲液包含成分如下：25mM tris，1mM CaCl₂和150mM KCl。

通用缓冲液：

100mM琥珀酸

100mM HEPES

100mM CHES

100mM CABS

1mM CaCl₂

150mM KCl

0.01％Triton X-100

实施例VI-“模式洗涤剂洗涤性能测试”

为了评估subtilase在标准洗涤剂组合物中的洗涤性能，可以使用如下试验条件进行标准洗涤实验：

洗涤剂：        模式洗涤剂

洗涤剂剂量：    4.0g/l

pH：            10.1

洗涤时间：      20分钟

温度：          30℃

水硬度：        15°dH

酶浓度：        10nm(在洗涤剂溶液中)

测试系统：      带搅拌棒的10ml烧杯

纺织物/体积：   5片纺织物(2.5cm)/50ml洗涤剂溶液

测试材料：      EMPA 117

模式洗涤剂的组分如下：

6.2％          LAS(Nansa 80S)

2％            C₁₆-C₁₈脂肪酸钠盐

4％            非离子表面活性剂(Plurafax LF404)

22％           沸石P

10.5％        Na₂CO₃

4％           Na₂Si₂O₅

2％            羧甲基纤维素(CMC)

6.8％          丙烯酸盐液体CP5 40％

20％           过硼酸钠(实验式NaBO₂.H₂O₂)

0.2％          EDTA

21％          Na₂SO₄

               水(平衡)

通过加入HCl或NaOH将洗涤剂溶液的pH调节至10.1。通过向测试系统中加入CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺∶Mg²⁺＝4∶1)将水硬度调节至15°dH。在洗涤后，将织物片用自来水冲洗并空气干燥。

使用Macbeth ColorEye 7000光度计(Macbeth，Division ofKollmorgen Instruments Corporation，德国)在460nm测定测试材料的反射系数(R_subtilase)。按照制造商的方法开展测量。

为测定空白值，开展未添加酶的相似洗涤实验。如上面刚刚描述测定反射系数(R_空白)。

如上所述开展参照实验，其中测试了相关蛋白酶的洗涤性能。如上面刚刚描述测定反射系数(R_savinase)。

生物材料的保藏

以下生物材料已经按照布达佩斯条约的条款保藏于德意志微生物保藏中心(Mascheroder Weg 1B，D-38124 Braunschweig，德国)并且给定下列保藏号：

保藏物                 保藏号             贮藏日期

大肠杆菌NN049696       DSM 15940          2003-09-22

序列表

<110>诺和酶股份有限公司

<120>在洗涤剂中具有改善稳定性的蛋白酶

<130>10178

<160>2

<170>PatentIn 版本3.2

<210>1

<211>1004

<212>DNA

<213>腐皮镰孢(Fusarium solani)

<220>

<221>CDS

<222>(52)..(804)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(127)..(804)

<223>52-102：信号肽  并且53-126：前肽

<400>1

ctcttcactc ttcaactctc tactcttgga atcccctgtc tgctcttcac c atg gtc      57

                                                         Met Val

                                                         -25

aag ttt gct gcc atc ctc gca ctt gtt gcg cct ctt gtc gcc gct cgg      105

Lys Phe Ala Ala Ile Leu Ala Leu Val Ala Pro Leu Val Ala Ala Arg

            -20                 -15                 -10

cct cag gac tca tca ccc atg atc gtt ggt gga act gct gcc agc gct      153

Pro Gln Asp Ser Ser Pro Met Ile Val Gly Gly Thr Ala Ala Ser Ala

        -5              -1  1               5

ggt gac ttc ccc ttc atc gtc agc atc gcc tac aat ggt ggc cct tgg      201

Gly Asp Phe Pro Phe Ile Val Ser Ile Ala Tyr Asn Gly Gly Pro Trp

10                  15                  20                  25

tgc gga ggt acc ctc ctc aac gcc aac acc gtc atg act gct gcc cac      249

Cys Gly Gly Thr Leu Leu Asn Ala Asn Thr Val Met Thr Ala Ala His

                30                  35                  40

tgc acc caa ggt cgc tct gct agc gcc ttc cag gtc cgc gcc gga agt      297

Cys Thr Gln Gly Arg Ser Ala Ser Ala Phe Gln Val Arg Ala Gly Ser

            45                  50                  55

ctg aac cgc aac tcg ggt ggt gtt acc tct tcc gtt tct tcc atc agg      345

Leu Asn Arg Asn Ser Gly Gly Val Thr Ser Ser Val Ser Ser Ile Arg

        60                  65                  70

atc cat cct agc ttc agt agc tcg acc ctg aac aac gat gtt tcc atc      393

Ile His Pro Ser Phe Ser Ser Ser Thr Leu Asn Asn Asp Val Ser Ile

    75                  80                   85

ctg aag ctg tcc acc ccc atc tcg act agc tcc act att tct tat ggt      441

Leu Lys Leu Ser Thr Pro Ile Ser Thr Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Gly

90                  95                  100                 105

cgc ctg gct gcg tcg ggc tct gac cct gtt gcc ggc tct gat gcc aca      489

Arg Leu Ala Ala Ser Gly Ser Asp Pro Val Ala Gly Ser Asp Ala Thr

                110                 115                 120

gtt gct ggc tgg ggt gtc act tct cag ggc tct tcc agc tct ccc gtg      537

Val Ala Gly Trp Gly Val Thr Ser Gln Gly Ser Ser Ser Ser Pro Val

            125                 130                 135

gct ttg agg aag gtt acc att ccc atc gtc tcc cgc acc act tgc cga      585

Ala Leu Arg Lys Val Thr Ile Pro Ile Val Ser Arg Thr Thr Cys Arg

        140                 145                 150

tcc cag tat ggc act tct gcc atc acc acc aac atg ttc tgc gct ggt      633

Ser Gln Tyr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Thr Asn Met Phe Cys Ala Gly

    155                 160                 165

ctt gct gag ggt ggt aag gac tct tgc cag ggc gac agc ggc ggt ccc      681

Leu Ala Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

170                 175                 180                 185

att gtc gat acc tcc aac act gtc att ggc att gtt tct tgg ggt gag      729

Ile Val Asp Thr Ser Asn Thr Val Ile Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu

                190                 195                 200

ggt tgt gct cag ccc aac tta tct ggt gtc tat gcc cga gtt gga tct      777

Gly Cys Ala Gln Pro Asn Leu Ser Gly Val Tyr Ala Arg Val Gly Ser

            205                 210                 215

ctc cgc act tac atc gac ggc cag ctg taaattgctc ggtcggttgg            824

Leu Arg Thr Tyr Ile Asp Gly Gln Leu

        220                 225

tttacatttc tgttctaggc agtttgcttg tcagagactt ttgttgagat ggggacggaa    884

gatggagtag gaatgctgag agtgtttgtt tgagagttta gttgatagtc aagatccaag    944

tcccggttgg ccatgcactg gcaactcgag cgactagatt ctcaataaaa ttgttcgtgg   1004

<210>2

<211>251

<212>PRT

<213>腐皮镰孢

<400>2

Met Val Lys Phe Ala Ala Ile Leu Ala Leu Val Ala Pro Leu Val Ala

-25                 -20                 -15                 -10

Ala Arg Pro Gln Asp Ser Ser Pro Met Ile Val Gly Gly Thr Ala Ala

                 -5             -1  1               5

Ser Ala Gly Asp Phe Pro Phe Ile Val Ser Ile Ala Tyr Asn Gly Gly

        10                  15                  20

Pro Trp Cys Gly Gly Thr Leu Leu Asn Ala Asn Thr Val Met Thr Ala

    25                  30                  35

Ala His Cys Thr Gln Gly Arg Ser Ala Ser Ala Phe Gln Val Arg Ala

40                  45                  50                  55

Gly Ser Leu Asn Arg Asn Ser Gly Gly Val Thr Ser Ser Val Ser Ser

                60                  65                  70

Ile Arg Ile His Pro Ser Phe Ser Ser Ser Thr Leu Asn Asn Asp Val

            75                  80                  85

Ser Ile Leu Lys Leu Ser Thr Pro Ile Ser Thr Ser Ser Thr Ile Ser

        90                  95                  100

Tyr Gly Arg Leu Ala Ala Ser Gly Ser Asp Pro Val Ala Gly Ser Asp

    105                 110                 115

Ala Thr Val Ala Gly Trp Gly Val Thr Ser Gln Gly Ser Ser Ser Ser

120                 125                 130                 135

Pro Val Ala Leu Arg Lys Val Thr Ile Pro Ile Val Ser Arg Thr Thr

                140                 145                 150

Cys Arg Ser Gln Tyr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Thr Asn Met Phe Cys

            155                 160                 165

Ala Gly Leu Ala Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly

        170                 175                 180

Gly Pro Ile Val Asp Thr Ser Asn Thr Val Ile Gly Ile Val Ser Trp

    185                 190                 195

Gly Glu Gly Cys Ala Gln Pro Asn Leu Ser Gly Val Tyr Ala Arg Val

200                 205                 210                 215

Gly Ser Leu Arg Thr Tyr Ile Asp Gly Gln Leu

                220                 225

Claims (27)

1.选自下列的蛋白酶：

a.包含与如SEQ NO：2的第1-226位氨基酸所示氨基酸序列具有至少73％同一性的氨基酸序列的蛋白酶；和

b.由在低严格条件下与下列序列杂交的核酸序列所编码的蛋白酶：

(i)如SEQ ID NO：1的第127-804位核苷酸所示核酸序列的互补链，或

(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列；和

c.与如SEQ NO：2的第1-266位氨基酸所示氨基酸序列相比具有1-50、优选1-40或1-30、更优选1-20、最优选1-10个氨基酸替代的蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶具有与如SEQ NO：2的第1-226位氨基酸所示氨基酸序列具有大于75.0％、或大于80.0％、或大于85.0％、或大于90.0％、或大于92.0％、或大于94.0％、或大于96.0％、或大于97.0％、或大于98.0％、或大于99.0％同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的蛋白酶，其包含如SEQ NO：2的第1-226位氨基酸所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的蛋白酶，其由如SEQ NO：2的第1-226位氨基酸所示的氨基酸序列组成。

5.根据前述权利要求中任意一项所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶是具有如SEQ NO：2的第-25-226位氨基酸所示氨基酸序列的蛋白酶的变体，所述变体包含一个或多个氨基酸残基的替代、缺失和/或插入。

6.蛋白酶或其变体，其中所述蛋白酶由克隆入在大肠杆菌(Escherichiacoli)DSM 15940中存在的质粒片段内的多核苷酸的蛋白酶编码部分所编码，所述变体与所述蛋白酶的成熟部分具有大于73％的同一性。

7.根据权利要求6所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶与多核苷酸的蛋白酶编码部分编码的蛋白酶成熟部分具有大于75.0％、或大于80.0％、或大于85.0％、或大于90.0％、或大于92.0％、或大于94.0％、或大于96.0％、或大于97.0％、或大于98.0％、或大于99.0％的同一性，其中所述多核苷酸被克隆入在保藏号DSM 15940的大肠杆菌中存在的质粒片段内。

8.根据权利要求6所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶包含由克隆入在大肠杆菌DSM 15940中存在的质粒片段内的多核苷酸的蛋白酶编码部分编码的蛋白酶。

9.根据权利要求6所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶由克隆入在大肠杆菌DSM 15940中存在的质粒片段内的多核苷酸的蛋白酶编码部分所编码的蛋白酶组成。

10.根据权利要求1所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶由在中等严格条件下、优选在高严格条件下与下列序列杂交的核酸序列编码：

(i)如SEQ ID NO：1的第127-804位核苷酸所示核酸序列的互补链，或

(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列。

11.根据前述权利要求中任意一项所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶样蛋白酶。

12.根据前述权利要求中任意一项所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶在35℃贮藏后具有至少50％的残余活性，其中活性测定是按照“实施例V洗涤剂中的稳定性”所述测试的。

13.根据权利要求11所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶在35℃贮藏后具有至少55％的残余活性，例如在35℃贮藏后具有至少60％的残余活性，更优选地在35℃贮藏后具有至少65％的残余活性。

14.所分离的核酸序列，其中所述核酸序列包含编码前述权利要求中任意一项所定义蛋白酶的核酸序列。

15.编码蛋白酶的所分离核酸序列，其中所述核酸序列选自：

d.与如SEQ NO：1的第52-804位核苷酸所示核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列；和

e.在低严格条件下与下列序列杂交的核酸序列：

(i)如SEQ ID NO：1的第52-804位核苷酸所示核酸序列的互补链；或

(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列。

16.根据权利要求14所述的核酸序列，其中所述核酸序列具有与如SEQ ID NO：1的第52-804位核苷酸所示核酸序列具有至少86％，诸如至少87％，例如至少88％，优选至少89％，诸如至少90％，例如至少91％，更优选至少92％，诸如至少93％，例如至少94％，最优选至少95％，诸如至少96％，例如至少97％，具体而言至少98％，优选至少99％同一性的核酸序列。

17.包含权利要求14-16中任意一项所述的核酸序列的核酸构建体，其中所述核酸构建体与能够指导蛋白酶在适宜宿主中表达的一种或多种控制序列有效连接。

18.重组表达载体，其中所述重组表达载体包含权利要求17的核酸构建体、启动子和转录终止信号以及翻译终止信号。

19.重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含权利要求17的核酸构建体。

20.根据权利要求19所述的宿主细胞，其为真菌或酵母，优选为丝状真菌，尤其为曲霉属(Aspergillus)。

21.根据权利要求20所述的宿主细胞，其为米曲霉(Aspergillusoryzae)。

22.根据权利要求19所述的宿主细胞，其为细菌，优选为芽孢杆菌属(Bacillus)，尤其为迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)。

23.用于生产根据权利要求1-13中任意一项所述蛋白酶的方法，所述方法包括：

f.在可诱导蛋白酶产生的条件下培养如权利要求19-22中任意一项所定义的重组宿主细胞；和

g.回收蛋白酶。

24.清洁组合物或洗涤剂组合物，优选衣物洗涤组合物或洗碟组合物，其包含根据权利要求1-13中任意一项所述的蛋白酶。

25.根据权利要求24所述的组合物，其额外包含纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、另外的蛋白酶、淀粉酶或其混合物。

26.如权利要求1-13中任意一项所定义蛋白酶在清洁组合物或洗涤剂组合物中的用途。

27.用于清洁或洗涤硬质表面或衣物的方法，所述方法包括将硬质表面或衣物与权利要求25-26中所定义的组合物接触。

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