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JP7468903B2 - Ｃｌｄｎ１８．２を標的とする抗体、二重特異性抗体、ａｄｃ及びｃａｒならびにその使用 - Google Patents

Ｃｌｄｎ１８．２を標的とする抗体、二重特異性抗体、ａｄｃ及びｃａｒならびにその使用 Download PDF

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JP7468903B2 JP2020571669A JP2020571669A JP7468903B2 JP 7468903 B2 JP7468903 B2 JP 7468903B2 JP 2020571669 A JP2020571669 A JP 2020571669A JP 2020571669 A JP2020571669 A JP 2020571669A JP 7468903 B2 JP7468903 B2 JP 7468903B2
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Description

発明の詳細な説明
本願は出願日が２０１８年６月１７日の中国特許出願ＣＮ２０１８１０６１０７９０．３、２０１８年１１月０１日の中国特許出願ＣＮ２０１８１１２９５８４５．２、２０１９年０２月０３日の中国特許出願ＣＮ２０１９１０１０８９５１．３、２０１９年０４月０８日の中国特許出願ＣＮ２０１９１０２７６４７３．７の優先権を要求する。本願は上記中国特許出願の全文を引用する。
［技術分野］
本発明は、生物医薬の分野に関し、特にＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、二重特異性抗体、ＡＤＣ及びＣＡＲならびにその使用に関する。
［背景技術］
癌は、人類の健康への巨大な脅威で、疾患の分野で死亡につながる要因の一つでもある。癌の治療は手術、化学療法、標的薬物、腫瘍免疫治療、併用治療などの各段階の発展を経た後、近年、すでに大きな成功が得られた。数多くの癌患者のうち、肺癌、胃癌、膵臓腺癌、食道癌や卵巣癌などの癌患者の治療手段はまだとても満足できるものとは言えない。これらの腫瘍に対する手段は、大分子標的薬物、例えば、新規なモノクローナル抗体、及びこれらのモノクローナル抗体と既存の腫瘍免疫治療手段、例えば免疫チェックポイント阻害剤ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１抗体の併用治療を含め、満足されていない巨大な臨床治療の需要に新たな可能性及び選択を提供している。
密着結合タンパク質（クローディン、Ｃｌａｕｄｉｎ又はＣＬＤＮ）は、ヒト、ネズミなどの種において発現され、細胞間密着結合に関連するタンパク質で、細胞間のイオン流の制御、細胞極性の維持及び細胞間のシグナル伝達に重要な作用がある。ＣＬＤＮファミリーのタンパク質は、すでに２９種類も発見され、ＣＬＤＮ１８がその一つである。ＣＬＤＮ１８は、２つの相同分子があり、それぞれクローディン１８．１（ＣＬＤＮ１８．１）及びクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）と呼ばれる。ヒトクローディン１８．１（ｈＣＬＤＮ１８．１）及びヒトクローディン１８．２（ｈＣＬＤＮ１８．２）は高度に相同で、アミノ酸の相同性が９２％と高い。ｈＣＬＤＮ１８．２は、正常組織における発現が非常に限られ、胃粘膜分化上皮細胞のみで見られるが、転移を含む胃癌の組織で特に高発現されている（Ｓａｈｉｎ Ｕ．ら Ｃｌａｕｄｉｎ－１８ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ２ ｉｓ ａ ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｌｖｅｏｐｍｅｎｔ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００８； １４ （２３）：７６４２－３４）。さらに、ＣＬＤＮ１８．２は、約７０％胃癌、５０％の膵臓腺癌、３０％の食道癌、２５％の肺癌及び卵巣癌などを含む、異なる癌の患者の組織で発現されている。そのため、ＣＬＤＮ１８．２はすでに理想的な腫瘍患者のマーカー及び抗腫瘍薬の開発の標的となっており、特にＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体は腫瘍治療のために開発されているが、標的の特殊性のため、ＣＬＤＮ１８．２に対する治療抗体の開発が非常に困難である。ヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質は、全長が２６１のアミノ酸で、ＮＣＢＩ公開配列ＮＰ＿００１００２０２６．１のクローディン－１８のアイソフォーム２を参照し、そのうちの１－２３がシグナルペプチドである。ＣＬＤＮ１８．２タンパク質は膜貫通タンパク質で、２つの膜外領域がそれぞれシグナルペプチドの後ろの約５５のアミノ酸の細胞外領域１（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ１、ＥＣＬ１）及び２３個のアミノ酸のＥＣＬ２である。この構造はヒトＣＬＤＮ１８．１と非常に類似しており、そしてヒトＣＬＤＮ１８．２とヒトＣＬＤＮ１８．１のＥＣＬ２領域が完全に同様である。そのため、ヒトＣＬＤＮ
１８．２タンパク質を標的とする抗体の開発では、ヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質のＥＣＬ１領域又は空間構造に対する抗体を見つけることが必要である。これによって、その辺の仕事がより困難になっている。
また、ヒトＣＬＤＮ１８．２膜タンパク質に対する抗体が発揮する効果は、少なくとも腫瘍細胞のアポトーシスの誘導、腫瘍細胞成長の抑制、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）のエフェクター細胞が仲介する腫瘍細胞の殺傷作用を含む患者の免疫細胞との作用を含む。しかし、このような機能の抗体の探索はより困難である。現在、ヒトＣＬＤＮ１８．２に対する研究では、ＩＭＡＢ３６２抗体（ＷＯ２０１４／１４６６７２を参照する）のみが臨床試験の段階に入っている。ＩＭＡＢ３６２はヒトＣＬＤＮ１８．２に対する抗体で、ヒト－マウスキメラ抗体で、免疫原性のリスクがあり、親和性が高くない。細胞学の実験では、取り込みの活性がなく、ＡＤＣの開発に適せず、且つ治療効果が限られ、これは本発明の腫瘍モデルの薬効評価においても検証された。また、ＣＬＤＮ１８．２標的に対して臨床又は前期研究・開発に入った二重特異性抗体はまだない。現在、ＣＬＤＮ１８．２標的に対して臨床で開発された抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）薬物はまだない。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞（ＣＡＲＴ又はＣＡＲ－Ｔと略する）は、患者の体内から分離されたＴ細胞で、体外でＣＡＲを利用してＴ細胞を、特異的に癌細胞を認識できるように改変・修飾し、改変後のＣＡＲＴ細胞を増幅させ、患者の体内へ戻し、腫瘍を治療する効果を図る。ＣＮ２０１４１０３４１５０４．Ｘでは、ＣＬＤ１８Ａ２（即ち、クローディン１８．２）を標的とするＴ細胞及びその製造方法と使用が開示され、臨床データも報告されているが、ＣＡＲＴの薬効及び安全性には向上の余地がまだまだある。
そのため、本分野では、有効的なヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質を標的とする抗体、特にヒト化抗体、ならびに細胞活性、ＰＫ活性や動物における薬効などがより良い抗体、二重特異性抗体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）薬物、ならびにより有効的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれを含む細胞が欠けている。
［発明の概要］
本分野でＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、二重特異性抗体、抗体薬物複合体及びＣＡＲ分子が欠けているという技術的課題を克服するために、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体及びその抗体薬物複合体、ＣＡＲ分子ならびにその製造方法と使用を提供する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第一の側面の解決策は、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体であって、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び／又は重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記ＶＬは、
配列番号１１又は配列番号１２で示されるＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３で示されるＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号１４で示されるＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列といった相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含み、
前記ＶＨは、
配列番号１５で示されるＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１６で示されるＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号１７で示されるＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列といったＣＤＲ配列を含む。
前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体は、ヒト、マウスＣＬＤＮ１８．２との特異的結合活性がより良く、Ｅｍａｘがより高く、親和性（ＫｉｎＥｘＡ）が高く（好ましくは１０ｐＭオーダーに達する）、ヒト血細胞におけるＣＤＣ活性がより良く、ＣＬＤＮ１８．２＋細胞のアポトーシスの誘導活性がより良く、腫瘍細胞成長の抑制活性がより良く、動物における薬効がより優れ、且つ体内における薬物代謝（ＰＫ）が良く、特にＴ１／２
がより長い。マウスＣＬＤＮ１８．２とより良い結合活性を有する。
一つの好適な実施例において、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体では、前記ＶＬは配列番号１１で示されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１３で示されるＶＬ ＣＤＲ２及び配列番号１４で示されるＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨは配列番号１５で示されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１６で示されるＶＨ ＣＤＲ２及び配列番号１７で示されるＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか、或いは、
前記ＶＬは配列番号１２で示されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１３で示されるＶＬ ＣＤＲ２及び配列番号１４で示されるＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨは配列番号１５で示されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１６で示されるＶＨ ＣＤＲ２及び配列番号１７で示されるＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体のＣＤＲ領域は脱アミノ化感受性部位が最適化されたＣＤＲ配列であり、好ましくは、前記ＣＤＲ領域の脱アミノ化感受性部位が最適化されたＣＤＲ配列は軽鎖ＣＤＲ配列であり、より好ましくは、前記ＣＤＲ領域の脱アミノ化感受性部位が最適化されたＣＤＲ配列は軽鎖ＣＤＲ１のＬ３０Ａ及び／又はＬ３０Ｂ位が最適化されたＣＤＲ１配列である、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の軽鎖ＣＤＲ１のＬ３０Ａ及び／又はＬ３０Ｂ位のＮＳがＮＴに突然変異し、且つ前提はＬ３０Ｅ位がＱではなく、且つＬ３４位がＴではないことである、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の軽鎖ＣＤＲ１のＬ３０Ａ及び／又はＬ３０Ｂ位のＮＳがＮＴに突然変異し、且つ前提は突然変異前の前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１２で示される配列である、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体のＣＤＲ領域は脱アミノ化感受性部位が最適化されたＣＤＲ配列であり、好ましくは、前記ＣＤＲ領域の脱アミノ化感受性部位が最適化されたＣＤＲ配列は重鎖ＣＤＲ配列であり、より好ましくは、前記ＣＤＲ領域の脱アミノ化感受性部位が最適化されたＣＤＲ配列は重鎖ＣＤＲ３のＨ９９及び／又はＨ１００位が最適化されたＣＤＲ配列である、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の重鎖ＣＤＲ３のＨ９９及び／又はＨ１００位のＮＳがＮＴに突然変異し、且つ前提は軽鎖ＣＤＲ１のＬ３０Ｅ位がＱではなく、且つＬ３４位がＴではないことである、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の重鎖ＣＤＲ３のＨ９９及び／又はＨ１００位のＮＳがＮＴに突然変異し、且つ前提は突然変異前の前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１２で示される配列である、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
ここで、上記のような軽鎖ＣＤＲ１のＬ３０Ａ、Ｌ３０Ｂ、Ｌ３０Ｅ及びＬ３４位、重鎖ＣＤＲ３のＨ９９及びＨ１００位はＫａｂａｔ番号付けに準じて定義されている。
一つの好適な実施形態において、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体はマウス由来抗体であり、前記マウス由来ＣＬＤＮ１８．２抗体は親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）成熟を
経た後、親和性が３～１０倍又はそれ以上、好ましくは１０倍又はそれ以上向上した、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
好ましくは、前記マウス由来抗体のＶＬは配列番号７で示されるアミノ酸配列又はその突然変異、及び／又は、前記マウス由来抗体のＶＨは配列番号８で示されるアミノ酸配列又はその突然変異である。
前記突然変異は、前記ＶＬ及び／又はＶＨのアミノ酸配列に一つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加が生じたもので、且つ前記突然変異した配列は前記ＶＬ及び／又はＶＨのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有し、そして前記抗体とＣＬＤＮ１８．２の結合が維持又は改善され、前記少なくとも８５％の配列相同性は好ましくは少なくとも９０％の配列相同性であり、より好ましくは少なくとも９５％の配列相同性であり、最も好ましくは少なくとも９９％の配列相同性である。
一つの好適な実施例において、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体はマウス由来抗体の可変領域及びマウス又はヒト抗体の定常領域を含み、前記マウス抗体の定常領域はマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ３又はＩｇＧ３の重鎖定常領域及びκ又はλ型軽鎖定常領域を含み、前記ヒト抗体の定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の重鎖定常領域及びκ又はλ型軽鎖定常領域を含む、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
好ましくは、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体はマウス由来抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域からなるキメラ抗体である。前記キメラ抗体は親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）成熟を経た後、親和性が３～１０倍又はそれ以上、好ましくは１０倍又はそれ以上向上した。
より好ましくは、前記キメラ抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列番号９で示されるアミノ酸配列又はその突然変異、及び／又は、前記キメラ抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列番号１０で示されるアミノ酸配列又はその突然変異である。
一つの好適な実施例において、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体はヒト化抗体である、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域のフレームワーク（ＦＲ）配列はヒト軽鎖配列から選ばれ、ＦＲ配列は好ましくは１～１０個のアミノ酸の復帰突然変異を含む、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ配列はそれぞれＣＣＧ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ又はＣｏｎｔａｃｔなどの番号付けに準じて定義されてもよく、前記ＣＤＲ配列は表４～表８で示される軽鎖ＣＤＲ配列又はその突然変異を含む、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
好ましくは、前記ヒト化抗体のＶＬは配列番号２９～３３のうちのいずれかで示されるアミノ酸配列又はその突然変異を含み、前記突然変異は、前記ＶＬ及び／又はＶＨのアミノ酸配列に一つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加が生じたもので、且つ前記突然変異した配列は前記ＶＬ及び／又はＶＨのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有し、そして前記抗体とＣＬＤＮ１８．２の結合が維持又は改善され、前記少なくとも８５％の配列相同性は好ましくは少なくとも９０％の配列相同性であり、より好ましくは少なくとも９５％の配列相同性であり、最も好ましくは少なくとも９９％の配列相同性である。
より好ましくは、軽鎖ＣＤＲ１の第Ｌ３０Ｅ及びＬ３４位がヒトＣＤＲ１の相応する部位におけるアミノ酸に最適化（突然変異）された。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記ヒト化抗体の重鎖可変領域のフレームワーク（ＦＲ）配列はヒト重鎖配列から選ばれ、ＦＲ配列は好ましくは０～１０個のアミノ酸の復帰突然変異を含む、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
本発明の一つの好適な実施例において、前記ヒト化抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ配列はそれぞれＣＣＧ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ又はＣｏｎｔａｃｔなどの番号付けに準じて定義されてもよく、前記ＣＤＲ配列は表４～表８で示される重鎖ＣＤＲ配列又はその突然変異配列を含む、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記ヒト化抗体の重鎖可変領域の配列は配列番号３４～３７のうちのいずれかで示されるアミノ酸配列又はその突然変異を含む、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記ヒト化抗体は、配列が配列番号２９～３３のうちのいずれかで示されるアミノ酸配列又はその突然変異である軽鎖可変領域と配列が配列番号３４～３７のうちのいずれかで示されるアミノ酸配列又はその突然変異である重鎖可変領域の組み合わせを含む、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
一つの好適な実施例において、前記抗体の軽鎖はヒト抗体κ又はλ型軽鎖定常領域又はその突然変異から選ばれるものを含み、及び／又は、前記抗体の重鎖はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の重鎖定常領域又はその突然変異から選ばれるものを含み、
好ましくは、前記重鎖定常領域又はその突然変異は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の２３４位、２３５位及び２４３位、又は２３９、３３０及び３３２位の突然変異を含み、
より好ましくは、前記重鎖定常領域又はその突然変異は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３５６～３５８位がＥＥＭ又はＤＥＬである突然変異を含む、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
一つの好適な実施例において、前記軽鎖は配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２又は配列番号４５で示されるアミノ酸配列又はその突然変異を含み、及び／又は、
前記重鎖可変領域は配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４又は配列番号４６で示されるアミノ酸配列又はその突然変異を含む、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
一つの好適な実施例において、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体では、以下の軽鎖及び重鎖を含む：
前記重鎖は配列番号３９のアミノ酸配列で示され、前記軽鎖は配列番号３８のアミノ酸配列で示され、或いは、前記重鎖は配列番号３９のアミノ酸配列で示され、前記軽鎖は配列番号４０のアミノ酸配列で示され、或いは、前記重鎖は配列番号４１のアミノ酸配列で示され、前記軽鎖は配列番号３８のアミノ酸配列で示され、或いは、前記重鎖は配列番号４１のアミノ酸配列で示され、前記軽鎖は配列番号４０のアミノ酸配列で示され、或いは、前記重鎖は配列番号３９のアミノ酸配列で示され、前記軽鎖は配列番号４２のアミノ酸配列で示され、或いは、前記重鎖は配列番号４３のアミノ酸配列で示され、前記軽鎖は配列番号４２のアミノ酸配列で示され、或いは、前記重鎖は配列番号４４のアミノ酸配列で示され、前記軽鎖は配列番号４２のアミノ酸配列で示され、或いは、前記重鎖は配列番号４３のアミノ酸配列で示され、前記軽鎖は配列番号４５のアミノ酸配列で示され、或いは
、前記重鎖は配列番号４４のアミノ酸配列で示され、前記軽鎖は配列番号４５のアミノ酸配列で示され、或いは、前記重鎖は配列番号３９のアミノ酸配列で示され、前記軽鎖は配列番号４５のアミノ酸配列で示され、或いは、前記重鎖は配列番号４６のアミノ酸配列で示され、前記軽鎖は配列番号３８のアミノ酸配列で示される。
一つの好適な実施例において、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体は免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を提供する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第二の側面の解決策は、第一タンパク質機能領域及び第二タンパク質機能領域を含み、前記第一タンパク質機能領域は第一の側面の解決策に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体でり、前記第二タンパク質機能領域は非ＣＬＤＮ１８．２抗原を標的とする抗体である、二重特異性抗体を提供する。前記の二重特異性抗体は、単独のＣＬＤＮ１８．２抗体が有する結合活性、機能活性を残しながら、もう一つのタンパク質機能領域の結合及び機能活性を維持することができる。且つ、前記二重特異性抗体の構造は正常ＩｇＧ抗体に類似し、通常の抗体発現・精製方法によって、発現及び精製を行い、且つ安定している。
本発明の二重特異性抗体は、配列特異的で、ＩｇＧ構造と類似する二重特異性抗体（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ＩｇＧ ｌｉｋｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＳＢｏｄｙ）である。
一つの具体的な実施例において、上記のような二重特異性抗体では、前記非ＣＬＤＮ１８．２抗原は免疫チェックポイント抗原又は腫瘍治療標的であり、前記免疫チェックポイント抗原はＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｔｉｍ３、ＬＡＧ３、ＣＤ４７を含み、前記腫瘍治療標的はＳＩＲＰα（ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α、シグナル調節タンパク質α）などを含み、ＳＩＲＰαは膜タンパク質で、主にマクロファージ、樹状細胞などを含む髄系細胞で発現される。より好ましくは、前記第二タンパク質機能領域は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗Ｔｉｍ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体を含む。最も好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体はニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｎｉｖｏと略す）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｐｅｍと略す）又はＢａ０８（即ち、特許出願ＣＮ２０１４１０３６９３００に記載のＢａ０８－１）である。前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｔｅｚｏと略す）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ、Ａｖｅｌと略す）又はデュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、Ｄｕｒｖと略す）であり、前記抗ＣＤ３抗体はビーリンサイト（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）又はＡＭＧ４２０におけるＣＤ３と結合する軽・重鎖可変領域の配列で構築される抗体である。
或いは、前記第二タンパク質機能領域はサイトカイン及びサイトカイン受容体又はこれらの断片であり、好ましくはサイトカイン又はその断片はＴＧＦβ、ＩＬ１０及びＣＳＦ－１を含み、前記サイトカイン受容体又はその断片はＴＧＦβＲＩＩ、ＩＬ１０受容体及びマクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ－１Ｒ）を含む。
一つの具体的な実施例において、上記のような二重特異性抗体で、前記抗体は免疫グロブリン、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ、一本鎖可変断片とも呼ばれる）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２である。好ましくは、前記免疫グロブリンの定常領域はヒト抗体の定常領域であり、前記ヒト抗体の定常領域はヒト抗体の軽鎖定常領域及びヒト抗体の重鎖定常領域を含み、前記ヒト抗体の軽鎖定常領域は好ましくはκ鎖又はλ鎖であり、前記ヒト抗体の重鎖定常領域は好ましくはｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２又はｈＩｇＧ４である。
生産プロセスが簡単で有効な活性が残った二重特異性抗体を設計するために、本発明の二重特異性抗体の形態は正常ＩｇＧの構造に類似し、具体的に、その構造は２つの標的をターゲッティングできる軽鎖及び／又は重鎖可変領域のタンパク質機能領域で、２つのタンパク質機能領域は同一の重鎖Ｆｃ領域を共有するように設計されている。好ましくは、１つの標的の抗体分子を１つ又は複数のｓｃＦｖの形態、或いは完全なサイトカイン又はその断片、或いは完全なサイトカイン受容体又はその断片で、もう１つの標的の完全な抗体の軽鎖又は重鎖の一方の端末に連結している。これによって、異なる重鎖Ｖｃ及び／又は軽鎖の発現による発現産物の不均一を避け、例えばノブ（Ｋｎｏｂ）形態のＦｃ及びホール（Ｈｏｌｅ）形態のＦｃの共発現において、その発現過程で不均一なＦｃ－Ｆｃのマッチング形態が現れ、精製プロセスに不便さをもたらす。また、軽・重鎖部分の領域のクロス（ｃｒｏｓｓ）デザインの構造活性に対する影響、及びプロセスで現れるＦｃミスマッチ現象を避けることができる。また、１つ又は複数のｓｃＦｖの設計により、特定の標的に対する活性を調整することもできる。
一部の具体的な実施例において、上記のような二重特異性抗体で、前記第一タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第二タンパク質機能領域は１つ又は複数のｓｃＦｖ、サイトカイン又はその断片であり、或いはサイトカイン受容体又はその断片であり、或いは、前記第二タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記の第一タンパク質機能領域は１つ又は複数のｓｃＦｖであり、ここで、前記ｓｃＦｖは重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域はリンカーを介して連結し、前記リンカーは好ましくは（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｗ ［以下、（Ｇ４Ｓ）ｗと略する］であり、前記ｓｃＦｖ、サイトカイン又はその断片、或いはサイトカイン受容体又はその断片はリンカーを介して前記免疫グロブリンと連結し、前記リンカーは本分野でよく見られるペプチド断片又は （Ｇ４Ｓ）ｗから選ばれることができ、前記ｗは好ましくは０～１０の整数であり、より好ましくは１、２、３又は４である。
前記二重特異性の設計の概要（一般式１）は下記表の通りである。
表０１において、軽鎖を含む配列とは当該配列が軽鎖の配列以外、軽鎖の配列と連結したｓｃＦｖを含んでもよいことであり、重鎖を含む配列とは当該配列が重鎖の配列以外、重鎖の配列と連結したｓｃＦｖを含んでもよいことである。記述の便宜上、表におけるｓｃＦｖは、本明細書において、特別に明示しない限り、当業者に理解される意味のほか、
サイトカイン及びサイトカイン受容体又はこれらの断片の配列でもよい。ここで、Ｔ１は標的１に対する第一タンパク質機能領域を、Ｔ２は標的２に対する第二タンパク質機能領域を表す。Ｔ１（ｓｃＦｖ）は標的１抗体に対するｓｃＦｖ配列を、Ｔ２（ｓｃＦｖ）は標的２抗体に対するｓｃＦｖ配列を表す。
（ｓｃＦｖ）ｎ１、（ｓｃＦｖ）ｎ２、（ｓｃＦｖ）ｎ３、（ｓｃＦｖ）ｎ４におけるｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４はそれぞれ自然数であり、０、１、２、３などでもよいが、本発明の具体的な実施例において、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４のうち、少なくとも１つの数値が１であり、残りが０である。ＶＬとは、標的１又は２に対する抗体の軽鎖可変領域の配列を表し、ＶＨとは、標的１又は２に対する抗体の重鎖可変領域の配列を表す。Ｌｃとは、軽鎖（κ又はλ）の定常領域の配列を表し、ヒト軽鎖の定常領域の配列が好ましい。Ｈｃは重鎖を表し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などの定常領域の配列を含み、好ましくは、ヒトの重鎖定常領域の配列である。重鎖定常領域のＣ末端にｓｃＦｖ又は他のタンパク質配列が連結している場合、そのＣ末端の末端アミノ酸Ｋは突然変異してもよく、好ましくはＡに突然変異される。これによって、プラン１において、Ｔ１は免疫グロブリンであり、Ｔ２はｓｃＦｖであり、プラン２において、Ｔ２は免疫グロブリンであり、Ｔ１はｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖは同一の標的に対するものであり、プラン３、４において、両末端のｓｃＦｖは２つの異なる標的に対するものである。
表０１におけるｓｃＦｖが通常のｓｃＦｖであり、即ち、サイトカイン及びサイトカイン受容体又はこれらの断片の配列ではない場合、前記ｓｃＦｖは軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域であり、その軽鎖可変領域のＮ末端又は重鎖可変領域のＣ末端がリンカーを介して相応的に前記の免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に連結しており、或いは前記ｓｃＦｖは重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域であり、その重鎖可変領域のＮ末端又は軽鎖可変領域のＣ末端がリンカーを介して相応的に前記免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に連結している。
なお、上記ｓｃＦｖが軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域である場合、その連結形態は軽鎖可変領域のＣ末端がリンカーと連結し、前記リンカーがさらに重鎖可変領域のＮ末端に連結することで、リンカーを介して免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖と連結できるように、ｓｃＦｖの軽鎖可変領域のＮ末端及び重鎖可変領域のＣ末端が露出される。本発明において、免疫グロブリンの軽鎖と連結する場合、一部の具体的な実施例において、好ましくはｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端を利用してリンカーを介して免疫グロブリンの軽鎖のＮ末端と連結する。免疫グロブリンの重鎖と連結する場合、一部の具体的な実施例において、好ましくはｓｃＦｖの軽鎖可変領域のＮ末端を利用して免疫グロブリンの重鎖のＣ末端と連結する。
前記ｓｃＦｖが重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域である場合、その連結形態は軽鎖可変領域のＮ末端がリンカーと連結し、前記リンカーがさらに重鎖可変領域のＣ末端に連結することで、リンカーを介して免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖と連結できるように、ｓｃＦｖの軽鎖可変領域のＣ末端及び重鎖可変領域のＮ末端が露出される。この場合、免疫グロブリンの軽鎖と連結する場合、一部の具体的な実施例において、好ましくはｓｃＦｖの軽鎖可変領域のＣ末端を利用して免疫グロブリンの軽鎖のＮ末端と連結する。免疫グロブリンの重鎖と連結する場合、一部の具体的な実施例において、好ましくはｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端を利用して免疫グロブリンの重鎖のＣ末端と連結する。好ましくは、前記リンカーは（Ｇ４Ｓ）３であり、及び／又は、前記ｓｃＦｖの数は２つで、対称的に前記の免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖と連結する。
より好ましくは、前記二重特異性抗体は、以下のいずれかから選ばれる。
（１）前記第一タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記免疫グロブリンは、
例えば配列番号３８で示されるアミノ酸配列である軽鎖、例えば配列番号３９で示されるアミノ酸配列である重鎖を含み、前記第二タンパク質機能領域はｓｃＦｖである。ここで、
２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端がリンカーを介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖のＮ末端と連結しており、且つ、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域はＡｔｅｚｏの軽鎖可変領域であり、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域はＡｔｅｚｏの重鎖可変領域であり、或いは、
２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端がリンカーを介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖可変領域のＮ末端と連結しており、且つ、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域はＨｕ５Ｆ９の軽鎖可変領域であり、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域はＨｕ５Ｆ９の軽鎖可変領域であり、或いは、
２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端がリンカーを介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖のＣ末端と連結しており、且つ、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域はＡＭＧ４２０の軽鎖可変領域であり、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域はＡＭＧ４２０の重鎖可変領域である。
また、前記二重特異性抗体は、以下の構造を含んでもよい：前記第一タンパク質機能領域は免疫グロブリンで、前記免疫グロブリンは、例えば配列番号３８又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列である軽鎖、例えば配列番号３９で示されるアミノ酸配列である重鎖を含み、前記第二タンパク質機能領域はｓｃＦｖである。
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域はｉＭａｂの軽鎖可変領域（即ち、ＷＯ２０１８０７５８５７＿４配列）であり、重鎖可変領域はｉＭａｂの重鎖可変領域（即ち、ＷＯ２０１８０７５８５７＿３配列）であり、或いは、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域の配列はＴｉｍ３の軽鎖可変領域（特許出願ＣＮ２０１７１０３４８６９９．４における配列番号２７で示される）であり、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域はＴｉｍ３の重鎖可変領域（特許出願ＣＮ２０１７１０３４８６９９．４における配列番号３６で示される）であり、或いは、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域の配列はＢｌｉｎｃｙｔｏＣＤ３の軽鎖可変領域であり、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域はＢｌｉｎｃｙｔｏＣＤ３の重鎖可変領域であり、或いは、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域の配列はＰｅｍの軽鎖可変領域であり、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域はＰｅｍの重鎖可変領域である。或いは、
（２）前記第一タンパク質機能領域はｓｃＦｖであり、前記第二タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端がリンカーを介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖のＮ末端と連結しており、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域の配列は配列番号２９で示され、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域の配列は配列番号３４で示される。ここで、
前記免疫グロブリンはＮｉｖｏの軽鎖可変領域、κ鎖である軽鎖定常領域、Ｎｉｖｏの重鎖可変領域及び重鎖定常領域がｈＩｇＧ４であるアミノ酸配列を含み、或いは、
前記免疫グロブリンはＰｅｍの軽鎖可変領域、κ鎖である軽鎖定常領域、Ｐｅｍの重鎖可変領域及び重鎖定常領域がｈＩｇＧ４であるアミノ酸配列を含み、或いは、
前記免疫グロブリンはＡｔｅｚｏの軽鎖可変領域、κ鎖である軽鎖定常領域、Ａｔｅｚｏの重鎖可変領域及び重鎖定常領域がｈＩｇＧ４であるアミノ酸配列を含む。
同様に、前記の二重特異性抗体は以下の免疫グロブリンを含んでもよい：前記第一タンパク質機能領域はｓｃＦｖであり、前記第二タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、軽鎖定常領域はκ鎖であり、重鎖定常領域はｈＩｇＧ１であるアミノ酸配列である。ここで、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域はｉＭａｂの軽鎖可変領域（即ち、ＷＯ２０１８０７５８５７＿４配列）であり、重鎖可変領域はｉＭａｂの重鎖可変領域（即ち、ＷＯ２０１８０７５８５７＿３配列）であり、或いは、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域はＴｉｍ３の軽鎖可変領域（特許出願ＣＮ２０１７１０３４８６９９．４における配列番号
２７で示される）であり、前記免疫グロブリンの重鎖可変領域はＴｉｍ３の重鎖可変領域（特許出願ＣＮ２０１７１０３４８６９９．４における配列番号３６で示される）であり、或いは、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域はＨｕ５Ｆ９の軽鎖可変領域であり、重鎖可変領域はＨｕ５Ｆ９の軽鎖可変領域であり、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域の配列はＡｖｅｌの軽鎖可変領域であり、前記免疫グロブリンの重鎖可変領域はＡｖｅｌの重鎖可変領域であり、或いは、前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域の配列はＢｌｉｎｃｙｔｏＣＤ３の軽鎖可変領域であり、前記免疫グロブリンの重鎖可変領域はＢｌｉｎｃｙｔｏＣＤ３の重鎖可変領域である。
表０１におけるＴ１（ｓｃＦｖ）、Ｔ２（ｓｃＦｖ）におけるｓｃＦｖがサイトカイン又はその断片、或いはサイトカイン受容体又はその断片である場合、その構造はリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）－サイトカイン受容体又はその突然変異配列、或いはサイトカイン又はその突然変異配列－リンカーである。リンカーのもう一方の末端に免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖のＮ及び／又はＣ末端が連結しており、好ましくは（Ｇ４Ｓ）ｗであり、ｗは０、１、２、３、４であり、好ましくはｗ＝３又はｗ＝４である。
１つの具体的な実施例において、上記のような二重特異性抗体で、前記第一タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第二タンパク質機能領域はサイトカイン又はその断片、或いはサイトカイン受容体又はその断片であり、前記サイトカイン又はその断片、或いはサイトカイン受容体又はその断片の数は好ましくは２つ又は４つで、リンカーを介して対称的に前記免疫クロブリンの２本の軽鎖及び／又は２本の重鎖のＣ末端及び／又はＮ末端と連結しており、前記リンカーは（Ｇ４Ｓ）３が好ましい。
好ましくは、前記免疫グロブリンは、例えば配列番号３８で示されるアミノ酸配列である軽鎖、例えば配列番号３９で示されるアミノ酸配列である重鎖を含む。ここで、
前記サイトカイン又はその断片、或いはサイトカイン受容体又はその断片はＴＧＦβＲＩＩで、その配列は配列番号１で示され、且つ数が２つで、前記ＴＧＦβＲＩＩは対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖のＣ末端と連結しており、そのＣ末端のアミノ酸がＫからＡに突然変異した。或いは、
前記サイトカイン又はその断片、或いはサイトカイン受容体又はその断片はＩＬ１０であり、、その配列は配列番号２で示され、且つ数が２つであり、前記ＩＬ１０は対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖のＣ末端と連結しており、そのＣ末端のアミノ酸がＫからＡに突然変異した。
一部の好適な具体的な実施例において、上記のような二重特異性抗体で、前記の二重特異性抗体は以下の軽鎖のアミノ酸配列及び重鎖のアミノ酸配列を含む：
配列番号５３で示される軽鎖のアミノ酸配列、配列番号５４で示される重鎖のアミノ酸配列、又は、配列番号５５で示される軽鎖のアミノ酸配列、配列番号５６で示される重鎖のアミノ酸配列、又は、配列番号３８で示される軽鎖のアミノ酸配列、配列番号５７で示される重鎖のアミノ酸配列、又は、配列番号３８で示される軽鎖のアミノ酸配列、配列番号５８で示される重鎖のアミノ酸配列、又は、配列番号３８で示される軽鎖のアミノ酸配列、配列番号５９で示される重鎖のアミノ酸配列、又は、配列番号３８で示される軽鎖のアミノ酸配列、配列番号６０で示される重鎖のアミノ酸配列、又は、配列番号３８で示される軽鎖のアミノ酸配列、配列番号６１で示される重鎖のアミノ酸配列、又は、配列番号３８で示される軽鎖のアミノ酸配列、配列番号４で示される重鎖のアミノ酸配列。
或いは、本発明に記載の二重特異性抗体はＤＶＤ－Ｉｇ（Ｄｕａｌ－ｖａｒｉａｂｌｅ
ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ、二重可変領域型免疫グロブリン）の二重特異性抗体であり、その構造は正常の抗体の軽・重鎖のＮ末端にそれぞれさらにもう１つの抗体のＶＬ及びＶＨが連結しており、２つの抗体の可変領域が２つの標的に結合することで二重機能が実現する
。
前記二重特異性抗体の設計の概要（一般式２）は下記表の通りである。
Ｔ１、Ｔ２はそれぞれ標的１と標的２に対するものを表す。表０２において、軽鎖を含む配列とは、当該配列が正常の完全な軽鎖の配列以外、もう１つの軽鎖可変領域の配列を含む。重鎖を含む配列とは、当該配列が正常の完全な重鎖の配列以外、もう１つの重鎖可変領域の配列を含む。軽鎖可変領域と完全な軽鎖の間、重鎖可変領域と完全な重鎖の間はリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）を介して連結している。
一つの具体的な実施例において、前記二重特異性抗体はＤＶＤ－Ｉｇの二重特異性抗体である。好ましくは、前記第二タンパク質機能領域は、正常の抗体の完全な軽鎖及び重鎖を含み、前記第一タンパク質機能領域は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、或いは、前記第一タンパク質機能領域は、正常の抗体の完全な軽鎖及び重鎖を含み、前記第二タンパク質機能領域は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。より好ましくは、前記軽鎖と前記軽鎖可変領域の間、前記の重鎖と前記の重鎖可変領域の間はいずれもリンカーを介して連結しており、前記のリンカーは好ましくは（Ｇ４Ｓ）ｗであり、前記のｗは好ましくは０～１０の整数であり、より好ましくは１、２、３又は４である。
一つの好適な具体的な実施例において、前記二重特異性抗体は軽鎖を含む配列及び重鎖を含む配列からなる。前記二重特異性抗体は以下の組み合わせから選ばれる：軽鎖を含む配列はＡｂ１０ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＮｉｖｏＶＬ－Ｌｃ（κ鎖）であり、重鎖を含む配列はＡｂ１０ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）３－ＮｉｖｏＶＨ－Ｈｃ（ｈＩｇＧ４）であり、或いは、軽鎖を含む配列はＡｔｅｚｏＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－Ａｂ１０ＶＬ－Ｌｃ（κ鎖）であり、重鎖を含む配列はＡｔｅｚｏＶＨ－（Ｇ４Ｓ）３－Ａｂ１０ＶＨ－Ｈｃ（ｈＩｇＧ１）であり、或いは、軽鎖を含む配列はＨｕ５Ｆ９ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－Ａｂ１０ＶＬ－Ｌｃ（κ鎖）であり、重鎖を含む配列はＨｕ５Ｆ９ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）３－Ａｂ１０ＶＨ－Ｈｃ（ｈＩｇＧ１）である。
或いは、本発明に記載の二重特異性抗体は第一タンパク質機能領域及び第二タンパク質機能領域を含み、その一方のタンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、もう一方のタンパク質機能領域はＦａｂ’又はＦ（ａｂ’）２である。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第三の側面の解決策は、構造が下記式Ｉで表される、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を提供する。
Ａｂ－［（Ｌ２）ｎ－Ｌ１-Ｄ］ｙ 式Ｉ
ここで、Ｄは細胞毒性を有する小分子薬物であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ前記薬物及び前記抗体と連結するリンカーであり、ｎは０又は１であり、ｙはＡｂと複合したＤの平均数を表し、且つ０＜ｙ≦１０、好ましくは２≦ｙ≦７、より好ましくは３≦ｙ≦６、最
も好ましくは４．４又は４．８である。
前記Ａｂは本発明の第一の側面に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、又は本発明の第二の側面に記載の二重特異性抗体である。
抗体の薬物複合体の製造過程において、複合の方法により、特定部位のカップリングの場合、抗体が持つ薬物の数が決まっており、抗体薬物複合体は単一の産物（非混合物）である。ランダム部位のカップリングの場合、異なる抗体が持つ薬物複合体分子の数は実際に異なるため、本発明に記載の抗体の薬物複合体は実質的に混合物であり、且つ一般式におけるｙは混合物における抗体が持つ薬物複合体の平均値を反映する。数値の計算後、通常、非整数の正数であり、例えば４．４又は４．８である。カップリング反応のＡＤＣ製剤における各抗体の薬物部分の平均数は通常の方法、例えば質量分析法、ＥＬＩＳＡ測定及びＨＰＬＣによって特徴付けされる。また、ＡＤＣの定量的分布を測定することができ、一部の場合、ｙがある値の均一なＡＤＣの他の薬物担持量のＡＤＣからの分離、精製及び特徴付けは逆相ＨＰＬＣ又は電気泳動のような方法によって実現できる。
本発明の一般式において、リンカーＬ２が存在する（即ち、ｎが１である）場合、Ｌ２、Ｌ１及びＤの数は同様で、この時、抗体の薬物複合体はＡｂ－［Ｌ２－Ｌ１-Ｄ］ｙである。Ｌ２が存在しない（即ち、ｎが０である）場合、即ち、１種類のみのリンカーを含む場合、Ｌ１及びＤの数は同様であり、この時、抗体の薬物複合体は実際にＡｂ－［Ｌ１-Ｄ］ｙである。また、本発明の一般式で表される抗体の薬物複合体は、実は理想の状態における抗体の薬物複合体であり、即ち、一般式はリンカーＬ１が連結したＬ２（存在すれば）の数、Ｄが連結したＬ１の数のみが考慮されている。当業者に周知のように、実際に合成される抗体の薬物複合体には、Ｄが連結していないリンカーが存在するため、抗体が実際にカップリングした薬物分子の平均数は≦ｙであり、即ち、抗体にカップリングした薬物の理論最大値である。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記小分子薬物は毒素、化学治療剤、抗生物質、放射性同位元素及び核溶解酵素から選ばれる細胞毒剤である、抗体薬物複合体を提供する。
好ましくは、前記小分子薬物は、モノメチルオーリスタチン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、マイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）系アルカロイド、カンプトテシン系アルカロイド、カリケアミシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。より好ましくは、前記モノメチルオーリスタチンはモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）又はモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）であり、前記マイタンシン系はＮ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）マイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（４－メルカプト－１－オキソプロピル）マイタンシン（ＤＭ３）及びＮ２’－デアセチル－Ｎ２’－（４－メルカプト－４－メチル－１－オキソペンチル）マイタンシン（ＤＭ４）である。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記Ｌ１は切断可能なリンカー、切断不可なリンカー、親水性リンカー、事前に電荷を持たせたリンカー及びジカルボン酸に基づいたリンカーから選ばれる、抗体薬物複合体を提供する。好ましくは、前記リンカーはＮ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）バレラート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボナート（ＳＭＣＣ）、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロピオニル（ＭＰ）、バリン－シトルリン（ＶＣ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｌａ－ｐｈｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）及びＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢから選ばれる。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記Ｌ２は以下の式ＩＩで表される化合物である、抗体薬物複合体を提供する。
ここで、Ｘ１は水素原子、ハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる。
Ｘ２はアルキル基、シクロアルキル基及び複素環基から選ばれる。ｍは０～５である。Ｓは硫黄原子である。
好ましくは、Ｘ１が水素原子であり、Ｘ２がアルキル基であり、ｍが１である場合、式ＩＩで表される化合物はチオ酢酸Ｓ－（３－カルボニルプロピル）エステルである。
本発明の一つの好適な実施形態において、抗体薬物複合体を提供するが、前記小分子薬物はＤＭ１であり、前記リンカーＬ１はＳＭＣＣであり、ｎは０であり、これによって下記式ＩＩＩで表される抗体薬物複合体を形成するか、
或いは、前記小分子薬物はＭＭＡＦであり、前記リンカーＬ１はＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢであり、Ｌ２はチオ酢酸Ｓ－（３－カルボニルプロピル）エステルであり、ｎは１であり、これによって下記式ＩＶで表される抗体薬物複合体を形成する：
本発明の一つの好適な実施形態において、上記のような抗体の薬物複合体を提供するが、一部の実施形態において、リンカーが連結された単一の抗体分子に複合する細胞毒剤又は小分子薬物の数ｙ（又は薬物担持量、又はＤＡＲ）は１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であるが、連結反応の特殊性のため、リンカーが連結された抗体に複合する小分子薬物のＤＡＲは実際に０～１０、１～８、２～７、３～６又は４～５の平均値である。即ち、本発明の抗体複合体は、実際的に抗体に異なる数のリンカー－薬物又はリンカーのみが連結した混合物であるため、ｙ値は薬物複合数の平均値で、且つ数値は整数又は非整数である。一部の実施形態において、本発明のＡＤＣの薬物担持量の範囲は１～約８、約２～約７、約３～約６、約４～約５、約４．１～約４．９、約４．２～約４．８、約４．３～約４．７、約４．４～約４．６、約４．４、４．６又は約４．８である。
本発明の一つの好適な実施形態において、抗体薬物複合体を提供するが、下記式Ｖで表される抗体薬物複合体であり、
或いは、下記式ＶＩで表される抗体薬物複合体であり、
或いは、下記式ＶＩＩで表される抗体薬物複合体であり、
或いは、下記式ＶＩＩＩで表される抗体薬物複合体であり、
ここで、前記Ａｂ１０は配列番号３８で示される軽鎖及び配列番号３９で示される重鎖を含み、前記Ａｂ６は配列番号４２で示される軽鎖及び配列番号３９で示される重鎖を含む。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第四の側面の解決策は、前記の抗体薬物複合体の製造方法を提供する。
ｎが１である場合、前記製造方法は、
（１）中間体１の製造：前記抗体を前記リンカーＬ２と溶液で混合し、反応させた後、精製し、中間体１を含む溶液を得るが、前記中間体１は下記式ＩＸで表され、
ここで、Ｘ１は水素原子、ハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれ、
Ｘ２はアルキル基、シクロアルキル基及び複素環基から選ばれ、ｍは０～５であり、Ｓは硫黄原子であり、
好ましくは、Ｘ１は水素原子であり、Ｘ２はアルキル基であり、ｍは１であり、即ち、Ｌ２はチオ酢酸Ｓ－（３－カルボニルプロピル）エステルである工程、
（２）中間体２の製造：前記リンカーＬ１と前記薬物から中間体２：Ｌ１－Ｄを製造する工程、
（３）工程（１）で得られた中間体１を含む溶液を、工程（２）で得られた中間体２を含む溶液と混合し、反応させた後、精製し、抗体薬物複合体を含む溶液を得る工程を含む。
ｎが０である場合、前記製造方法は、
（１）中間体３の製造：前記抗体を前記リンカーＬ１と溶液で混合し、反応させた後、精製し、中間体３を含む溶液を得る工程、
（２）工程（１）で得られた中間体３を含む溶液を、前記薬物を含む溶液と混合し、反応させた後、精製し、抗体薬物複合体を含む溶液を得る工程を含み、
好ましくは、前記工程（１）及び／又は（２）において、前記反応温度は２５℃であり、前記反応時間は２～４時間であり、及び／又は、前記精製はゲルろ過による精製、好ましくはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムを使用する脱塩による精製である。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第五の側面の解決策は、クローディン１８．２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
ＣＡＲを設計する場合、特定の抗原に対する抗体遺伝子は重要な選択であり、体内の遺伝子発現の複雑性及び様々な制御不可能な要素を考えると、ＣＡＲに適する遺伝子の選択が非常に困難である。そして、多くの腫瘍特異的抗原はそれに対するＣＡＲ細胞の構築に適する特異性分子がなかなか見つからず、ＣＡＲを構築しても、活性のある細胞外結合領域が得られないことが多く、これもＣＡＲ技術の発展の難点である。また、ＣＡＲ細胞は腫瘍免疫治療において魅了的な将来性があるが、その高いリスクも考える必要がある。例えば、ある正常組織においてＣＡＲに識別される特異的抗原が低く発現されると、ＣＡＲ
Ｔ細胞は相応の抗原を発現する正常組織を損傷する。既存技術では、クローディン１８．２を標的とする抗体は特異的にクローディン１８．２に結合する効果が良くなく、クローディン１８．２を標的とするＣＡＲ細胞も効果が十分ではなく、周知のように、有効性と安全性を兼ねるクローディン１８．２を標的とするＣＡＲ細胞の開発は非常に困難である。発明者らは、実験により、意外的に、本発明のＣＡＲにおける抗体結合活性／親和性が高いことを見出し、これは、同じプロセス（同じウイルス力価、形質移入効率）において、本発明のＣＡＲはより良く標的細胞に結合し、特異性がより優れ、非標的細胞の結合による副作用が減少することを意味する。本発明のＣＡＲを使用すると、少ない投与量でも作用を発揮し、非常に高い応用価値がある。本発明において、ＣＬＤＮ１８．２に対するＣＡＲ細胞の抗原結合部分（抗体）はヒト化配列であり、ＣＡＲ治療による免疫原性のリスクを減少することができる。新世代のＣＡＲ設計により、具体的に、ＣＡＲのＣ末端に有効に腫瘍を殺傷するサイトカイン、サイトカイン及びその受容体結合複合体などを導入し、そしてこれらの因子及び／又は複合体が細胞外、腫瘍細胞の領域に分泌されるようにすることにより、より優れた腫瘍抑制効果が実現できる。
前記ＣＡＲは、（ａ）特異的にＣＬＤＮ１８．２を認識する細胞外結合ドメインｓｃＦｖ、（ｂ）ヒンジドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）共刺激細胞内ドメイン、（ｅ）シグナル伝達ドメインを含む。
ここで、前記細胞外結合ドメインは本発明の第一の側面に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。
一つの好適な具体的な実施例において、上記のようなＣＡＲでは、
（１）前記ヒンジドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１５２、ＰＤ１及びＩｇＧ１重鎖のうちの一つ又は複数の分子から選ばれるヒンジ領域であり、
（２）前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲのα、β、ζ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ
３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４及びＰＤ１のうちの一つ又は複数の分子から選ばれる膜貫通領域であり、
（３）前記共刺激細胞内ドメインは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＯＸ４０、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３、ＣＤ２７０、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２７８、ＤＡＰ１０、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＦｃεＲＩγ及びＭｙＤ８８のうちの一つ又は複数の分子から選ばれる細胞内領域であり、好ましくはＣＤ２８細胞内領域及び／又は４－１ＢＢ細胞内領域であり、及び／又は、
（４）前記シグナル伝達ドメインは、Ｉｇα、Ｉｇβ，ＴＣＲξ，ＦｃＲ１γ、ＦｃＲ１β，ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε，ＣＤ２，ＣＤ５，ＣＤ２２，ＣＤ２８，ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ，ＣＤ２７８，ＣＤ６６ｄ及びＣＤ３ζのうちの一つ又は複数の分子から選ばれる細胞内領域であり、好ましくはＣＤ３ζ細胞内領域である。
一つの好適な実施例において、前記ＣＡＲで、前記ヒンジドメインはＣＤ８αヒンジ領域であり、前記膜貫通ドメインはＣＤ８α膜貫通領域であり、前記共刺激細胞内ドメインはＣＤ２８細胞内領域及び／又は４－１ＢＢ細胞内領域であり、前記シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζ細胞内領域（実施例のＣＡＲの一般式においてＣＤ３ζと略する）であり、
好ましくは、前記ＣＤ８αヒンジ領域はヒトＣＤ８αヒンジ領域であり、前記ＣＤ８α膜貫通領域はヒトＣＤ８α膜貫通領域であり、前記ＣＤ２８細胞内領域はヒトＣＤ２８細胞内領域であり、前記４－１ＢＢ細胞内領域はヒト４－１ＢＢ細胞内領域であり、及び／又は、前記ＣＤ３ζ細胞内領域はヒトＣＤ３ζ細胞内領域である。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第六の側面の解決策は、クローディン１８．２を標的とするＣＡＲを含有する核酸構築体であって、式ｃａｒ－［（ＩＲＥＳ）－ｆ］ｑで表される構造を有し、ここで、ＩＲＥＳは配列番号５５のヌクレオチド配列で表される内部リボソーム進入部位配列であり、ｆは機能性タンパク質Ｆをコードし、ｑは０又は非０自然数であり、ｃａｒは上記第五の側面のＣＡＲをコードする、核酸構築体を提供する。
一つの好適な実施例において、上記のような核酸構築体で、ｑが０ではない自然数であり、好ましくは１である場合、前記機能性タンパク質Ｆは、以下のものを含む：
（１）サイトカイン又はその活性断片、好ましくはＩＬ１０又はＩＬ１５又はその活性断片、より好ましくは前記ＩＬ１０のアミノ酸配列は配列番号５４で表される；
（２）サイトカイン受容体又はその活性断片、好ましくはＩＬ１５ Ｒα又はその断片又はＩＬ１５ Ｒα断片（ｓｕｓｈｉ）又はＩＬ１５ Ｒα断片（ｓｕｓｈｉ＋）；或いは、
（３）サイトカイン受容体又はその活性断片とサイトカインの融合タンパク質、好ましくはＩＬ１５ Ｒα又はその断片又はＩＬ１５ Ｒα断片（ｓｕｓｈｉ）又はＩＬ１５ Ｒα断片（ｓｕｓｈｉ＋）とＩＬ１５の融合断片。
一つの好適な実施例において、前記核酸構築体の構造は、以下のものである：
（１）ｓｃＦｖ－ヒトＣＤ８αヒンジ領域－ヒトＣＤ８α膜貫通領域－ヒト４－１ＢＢ細胞内領域－ヒトＣＤ３ζ細胞内領域であり、好ましくは、それがコードするアミノ酸配列は配列番号３で示され、ここで、一つの好適なヌクレオチド構築体は下記でＣＡＲ１ａと呼ばれる；或いは、
（２）ｓｃＦｖ－ヒトＣＤ８αヒンジ領域－ヒトＣＤ８α膜貫通領域－ヒト４－１ＢＢ細胞内領域－ヒトＣＤ３ζ細胞内領域－（ＩＲＥＳ）－ＩＬ１５であり、ここで、一つの好適なヌクレオチド構築体は下記でＣＡＲ３ａｂと呼ばれる；或いは、
（３）ｓｃＦｖ－ヒトＣＤ８αヒンジ領域－ヒトＣＤ８α膜貫通領域－ヒト４－１ＢＢ細胞内領域－ヒトＣＤ３ζ細胞内領域－（ＩＲＥＳ）－ＩＬ１０であり、ここで、一つの
好適なヌクレオチド構築体は下記でＣＡＲ３ａｂ１０と呼ばれる；或いは、
（４）ｓｃＦｖ－ヒトＣＤ８αヒンジ領域－ヒトＣＤ８α膜貫通領域－ヒト４－１ＢＢ細胞内領域－ヒトＣＤ３ζ細胞内領域－（ＩＲＥＳ）－ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ＋）－ＩＬ１５であり、ここで、一つの好適なヌクレオチド構築体は下記でＣＡＲ４ａと呼ばれる。
なお、当業者には、上記の構築体は核酸であり、便宜上、当該構築体の４種類の構造は「…をコードするヌクレオチド配列」という記述が略されることがことが分かる。例えば、上記構築体の構造におけるｓｃＦｖは、実際的に「ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列」であり、ヒトＣＤ８αヒンジ領域は、実際的に「ヒトＣＤ８αヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列」であり、ほかも同様である。また、上記構造におけるＩＬ１０及びＩＬ１５は、野生型のＩＬ１０及びＩＬ１５以外、ＩＬ１０及びＩＬ１５の突然変異体又はその活性断片でもよい。
上記の核酸構築体において、さらにＣＤ２７のＴ細胞記憶・生存シグナル伝達ドメイン、及び／又は、自己破壊可能なドメイン、例えば誘導型カスパーゼ（ｉＣａｓｐ）をコードするヌクレオチド配列又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。自己破壊可能なドメインは抗原認識シグナル経路を調節し、最大限にＣＡＲ細胞の正常組織に対する傷害を低減させ、オフターゲット効果を減少させることができる。不良反応が生じた場合、無毒性プロドラッグによる刺激で、自殺遺伝子が活性化され、ＣＡＲ細胞のアポトーシスが誘導され、治療が終了する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第七の側面の解決策は、分離された核酸であって、上記のようなＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又は上記のような二重特異性抗体をコードする核酸を提供する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第八の側面の解決策は、上記のような分離された核酸、又は上記のような核酸構築体を含む発現ベクターを提供する。
好ましくは、前記発現ベクターは、レトロウイルス発現ベクター、レンチウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター及びアデノ随伴ウイルス発現ベクターから選ばれる。より好ましくは、レンチウイルス発現ベクターであり、その骨格プラスミドはｐＢＡＢＥｐｕｒｏでもよい。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第九の側面の解決策は、遺伝子修飾された細胞であって、上記のような核酸構築体、前記発現ベクターが形質移入された細胞を提供する。好ましくは、前記遺伝子修飾された細胞は真核細胞であり、より好ましくは分離されたヒト細胞であり、さらに好ましくは免疫細胞、例えばＴ細胞、又はＮＫ細胞、例えばＮＫ９２細胞系である。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第十の側面の解決策は、遺伝子修飾された細胞を製造する方法であって、前記の核酸構築体、前記発現ベクター又は前記ウイルスを修飾しようとする細胞内へ導入する工程を含む方法を提供する。
好ましくは、前記遺伝子修飾された細胞は真核細胞であり、好ましくは分離されたヒト細胞であり、より好ましくは免疫細胞、例えばＴ細胞、又はＮＫ細胞あり、さらに好ましくはＮＫ９２細胞系である。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第十一の側面の解決策は、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、前記二重特異性抗体、前記遺伝子修飾された細胞又は前記抗体
薬物複合体と、薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物を提供する。好ましくは、前記薬物組成物は、さらに、免疫チェックポイント抗体を含む。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第十二の側面の解決策は、腫瘍を治療する薬物の製造における、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、前記二重特異性抗体、前記抗体薬物複合体、前記核酸構築体、前記発現ベクター、前記ウイルス、前記遺伝子修飾された細胞又は前記の薬物組成物の使用を提供する。好ましくは、前記腫瘍はＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍であり、好ましくは、胃癌、食道癌、肺癌、メラノーマ、腎臓癌、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓腺癌、膀胱癌、膠細胞腫又は白血病である。
本分野の常識に合うことを前提に、上記各好適な条件を任意に組み合わせれば、本発明の各好適な実例が得られる。本発明で用いられる試薬及び原料はいずれも市販品として得られる。
本発明の積極的な進歩効果は以下の通りである。
本発明は、新規な免疫及び選別方法により、多くの新規なデザインを行い、新規なＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、好ましくはヒト化抗体を提供するが、当該抗体はヒト、マウスＣＬＤＮ１８．２との特異的結合活性がより良く、Ｅｍａｘがより高く、親和性（ＫｉｎＥｘＡ）が高く（好ましくは１０ｐＭオーダーに達する）、ヒト血細胞におけるＣＤＣ活性がより良く、ＣＬＤＮ１８．２＋細胞のアポトーシスの誘導活性がより良く、腫瘍細胞成長の抑制活性がより良く、動物における薬効がより優れ、且つ体内における薬物代謝（ＰＫ）が良く、特にＴ１／２がより長い。マウスＣＬＤＮ１８．２ともより良い結合活性を有する。
本発明は、二重特異性抗体を提供するが、一方の標的はＣＬＤＮ１８．２に対するものであり、もう一方はＣＬＤＮ１８．２以外に対する標的である。新規なデザインでは、意外に、得られた二重特異性抗体（ＳＢｏｄｙ）は好適に２つの標的の結合活性、機能活性を残した分子であることが見出され、そして二重特異性のデザインはＩｇＧ構造に類似し、プロセス・精製が簡単で、且つ安定している。これは後期の開発で抗体の製造に便利をもたらす。同時に、デザインされた標的はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１などの免疫チェックポイント抗原を含む場合、ＣＬＤＮ１８．２と結合し、一つの分子で腫瘍免疫及び標的抗体の併用を実現させることができ、２つの分子の併用効果と同等又はそれ以上の相乗効果が生じ、腫瘍免疫治療及び標的治療により便利な薬物開発の選択をもたらす。
本発明は、初めて、ＣＬＤＮ１８．２に対する抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を創造した。ここで、抗体分子の効果は上記の通りである。当該抗体と細胞毒素のカップリングで得られるＡＤＣ分子は、その抗ヒト、マウスＣＬＤＮ１８．２の優れた特異的結合活性、取り込み活性及び効率的に腫瘍細胞を殺傷する特徴を残したと同時に、細胞毒性の毒素を持ち、より特異的に腫瘍細胞をターゲティングして殺傷し、ターゲティングして特異的に腫瘍細胞の増殖を抑制し、予想外なより優れた腫瘍を治療する薬効が生じる。これらの特徴により、本発明のＡＤＣ薬物及びその薬用塩、溶媒化合物又は他の薬物と併用する組み合わせは、腫瘍患者、特にＣＬＤＮ１８．２陽性癌患者により特異的に有効であり、より良い治療の選択、手段及び方法になる。また、本発明によって提供される抗体薬物複合体／抗体はより良い薬物動態学的性能を有し、安全域が大きく、且つ毒性・副作用がより低い。
本発明は、新たなクローディン１８．２を標的とするＣＡＲ分子を提供するが、その活性及び親和性が高く、より良く腫瘍細胞をターゲティングすることができる。クローディン１８．１と結合せず、優れた特異性を有し、非標的細胞との結合による副作用が減少される。ＣＡＲ分子の抗原結合配列は好適にヒト化され、免疫原性のリスクが減少し、安全性がより良い。ＣＡＲ分子はサイトカイン又はサイトカイン受容体に結合して併用すると
、治療効果がより良くなる。本発明のＣＡＲ分子を含む免疫細胞は治療効果が良く、特に好適な実施例において、本発明のＣＡＲ分子は１００％に近い癌抑制効果がある。
図１は、本発明のマウス由来抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体ｍａｂ５ｂとヒトＣＬＤＮ１８．２（図１ａ）及びマウスＣＬＤＮ１８．２（図１ｂ）の結合活性である（ＥＬＩＳＡ）。 図２は、本発明の抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体ｍａｂ５ｂのヒト化抗体（図２ａ）及びヒト化最適化抗体（図２ｂ）とヒトＣＬＤＮ１８．２の結合活性である（ＥＬＩＳＡ）。 図３は、本発明のヒト化抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体、ヒト化最適化抗体ＣＤＣの活性評価である。 図４は、本発明のヒト化抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体、ヒト化最適化抗体の腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する活性である（図４ａ、図４ｂ）。 図５は、本発明のヒト化抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体、ヒト化最適化抗体の動物モデルにおける薬効評価である（図５ａ、図５ｂ）。 図６は、本発明のヒト化抗体Ａｂ１０及びＡｂ６の取り込み活性の分析である。 図７Ａは、ＬＢ３０２の構造及び関連検出データの図であり、構造概略図（ｃ）、及びヒトＣＬＤＮ１８．２との結合活性の検出結果（ａ）、及びヒトＰＤ－１との結合活性の検出結果（ｂ）を含む。 図７Ｂは、ＬＢ３０１の構造及び関連検出データの図であり、構造概略図（ｃ）、及びヒトＣＬＤＮ１８．２との結合活性の検出結果（ａ）、及びヒトＰＤ－１との結合活性の検出結果（ｂ）を含む。 図７Ｃは、ＬＢ３０９の構造及び関連検出データの図であり、構造概略図（ｃ）、及びヒトＣＬＤＮ１８．２との結合活性の検出結果（ａ）、及びヒトＰＤ－１との結合活性の検出結果（ｂ）を含む。 図７Ｄは、ＬＢ３０８の構造及び関連検出データの図であり、構造概略図（ｃ）、及びヒトＣＬＤＮ１８．２との結合活性の検出結果（ａ）、及びヒトＰＤ－１との結合活性の検出結果（ｂ）を含む。 図８は、ＬＢ４０１の構造及び関連検出データの図であり、中では、ａは－８０℃で６０日（６０ｄ）、４℃で３０日、３７℃で７日及び１４日保存したサンプルのヒトＣＬＤＮ１８．２との結合活性の検出結果であり、ｂはＬＢ４０１の構造概略図である。 図９は、ＣＬＤＮ１８．２に対して設計されたＣＡＲＴ細胞の動物体内における薬効であり、ＣＡＲＴ（ブランクベクター）、ＣＡＲＴ１ａ、ＣＡＲＴ３ａｂ、ＣＡＲＴ３ａｂ１０及びＣＡＲＴ４ａ細胞を注射したマウスの腫瘍体積の変化を示す。
［具体的な実施形態］
用語の解釈：
本発明において、別途に説明しない限り、本明細書で使用される科学及び技術用語は当業者に通常理解される意味を有する。そして、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝
学、核酸化学、免疫学の実験室の操作手順はいずれも相応する分野で幅広く使用される通常の手順である。同時に、より良く本発明を理解できるように、以下、関連用語の定義及び解釈を提供する。
本発明で使用されるアミノ酸の３文字の略号及び１文字の略号は当業者に既知のもの、或いはＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２４３， ｐ３５５８（１９６８）に記載のものである。
本明細書で用いられるように、用語「含む」又は「含有する」とは、組成物及び方法が前記の要素を含むことであるが、他の要素を除くものではない。「基本的に……からなる」は、組成物及び方法を定義するために使用される場合、予想される使用の組み合わせに何らの実質的な作用がある他の要素を除くことを表す。例えば、本明細書で定義される、基本的に当該要素からなる組成物は、分離・精製方法及び薬学的に許容される担体（例えばリン酸塩緩衝液、防腐剤など）から微量の汚染物を除くことがない。「……からなる」は、微量元素よりも多い他の成分及び本明細書で公開された組成物を施用するための実質的な方法・工程を除くことを表す。これらの接続語（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｔｅｒｍ）で定義されるいずれの側面も本発明の範囲に含まれる。
用語「ＣＬＤＮ１８．２」はアイソタイプ、哺乳動物（例えばヒト）のＣＬＤＮ１８．２、ヒトＣＬＤＮ１８．２のホモログ及び少なくとも一つのＣＬＤＮ１８．２との共有エピトープを含む類似体を含む。ＣＬＤＮ１８．２（例えばヒトＣＬＤＮ１８．２）のアミノ酸配列は本分野で既知のものであり、例えば、ＮＣＢＩデータベースで示される通りである。
用語「ＣＬＤＮ１８．１」はアイソタイプ、哺乳動物（例えばヒト）のＣＬＤＮ１８．１、ヒトＣＬＤＮ１８．１のホモログ及び少なくとも一つのＣＬＤＮ１８．１との共有エピトープを含む類似体を含む。ＣＬＤＮ１８．１（例えばヒトＣＬＤＮ１８．１）のアミノ酸配列は本分野で既知のものであり、ＮＣＢＩデータベースで示される通りである。
本発明に記載の「ＣＬＤＮ１８．２抗体」、「抗ＣＬＤＮ１８．２抗体」、「ＣＬＤＮ１８．２抗体分子」及び「抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子」は入れ替えて使用することができる。用語「エピトープ」とは抗原（例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２）における抗体分子と特異的に相互作用する部分を言う。本発明において、用語「競争」とは抗体分子が抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子と標的（例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２）との結合能力に干渉することを言う。結合作用に対する干渉は直接又は間接的なものである（例えば、抗体分子又は標的を介するアロステリック調節作用）。競争的結合測定法（例えば、ＦＡＣＳ測定法、ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡＣＯＲＥ測定法）によって抗体分子が別の抗体分子のその標的と結合する程度に干渉できるか確認することができる。
本発明に記載の用語「抗体」は免疫グロブリンを含み、２本の同じ重鎖及び２本の同じ軽鎖がジスルフィド結合を介して連結してなる４本ペプチド鎖の構造である。免疫グロブリンの重鎖定常領域のアミノ酸の構成及び配列順序により、その抗原性が異なる。これによって、免疫グロブリンは５種類に分かれ、或いは免疫グロブリンのアイソタイプと呼ばれ、即ち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥであり、その相応する重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同一のＩｇはそのヒンジ領域のアミノ酸の組成及び重鎖ジスルフィド結合の数と位置の違いにより、異なるサブタイプに分かれ、例えばＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に分かれる。軽鎖は定常領域によってκ鎖又はλ鎖に分かれる。５種類のＩｇのうち、いずれのＩｇもκ鎖又はλ鎖を有してもよい。
本発明において、本発明に記載の抗体の軽鎖可変領域はさらに軽鎖定常領域を含んでもよく、前記の軽鎖定常領域はヒト由来又はマウス由来のκ鎖、λ鎖又はその突然変異を含む。本発明において、本発明に記載の抗体の重鎖可変領域はさらに重鎖定常領域を含んでもよく、前記の重鎖定常領域はヒト由来又はマウス由来のＩｇＧ１、２、３、４又はその突然変異を含む。
抗体の重鎖及び軽鎖のＮ末端に近い約１１０のアミノ酸の配列は大きく異なり、可変領域（Ｖ領域）であり、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列は相対的に安定であり、定常領域（Ｃ領域）である。可変領域は３つの超可変領域（ＨＶＲ）及び４つの配列が相対的に保存的な骨格領域（ＦＲ）を含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。各軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）は３つのＣＤＲ領域及び４つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で並ぶ。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指す。
軽鎖及び重鎖のうち、可変領域及び定常領域は約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して連結し、重鎖はさらに約３又はそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とからなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とからなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。抗体の定常領域はグロブリンと宿主の組織又は因子の結合を仲介し、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）と古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）の結合を含む。ＶＨとＶＬ領域はさらに超可変性を有する領域［相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる］に細分してもよく、その間により保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在している。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端まで並ぶ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。各重鎖／軽鎖に相応する可変領域（ＶＨ及びＶＬ）はそれぞれ抗体結合部位を形成する。特に、重鎖は、さらに、３つ以上、例えば６、９又は１２個のＣＤＲを含んでもよい。例えば、本発明の二重特異性抗体において、重鎖はＩｇＧ抗体の重鎖のＮ末端にもう一つの抗体のＳｃＦｖが連結したものでもよく、このような場合、重鎖は９つのＣＤＲを含有する。
本発明に記載の抗体又は抗原結合断片のＶＬ領域及びＶＨ領域のＣＤＲのアミノ酸残基は数及び位置において既知のＫａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ、ＣＣＧ、ＡｂＭ及びＣｈｏｔｈｉａの番号付けに準ずる。例えば、Ｋａｂａｔ番号付けはＫａｂａｔ ＥＡ．ら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９８７ ａｎｄ １９９１）］の定義に準じ、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ １９８７） Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７、Ｃｈｏｔｈｉａら （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３の定義に準ずる。与えられるＣＤＲの境界は認識のための方案にもよるが、本発明に記載の定義規則及び前記抗体の定義のＣＤＲ配列は表３－８を参照する。例えば、Ｋａｂａｔ方案は構造比較に基づく、Ｃｈｏｔｈｉａ方案は構造情報に基づく。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ方案に用いられる番号は最も使用される抗体領域の配列の長さに基づき、そしてアルファベットを挿入して挿入物を（例えば、「３０ａ」）、一部の抗体において欠失部分を示す。２つの方案では、異なる位置に何らかの挿入物及び欠失部分（インデル「（ｉｎｄｅｌ）」）異なる番号になる。Ｃｏｎｔａｃｔ方案は複合体の結晶構造に対する分析に基づき、且つ多くの面においてＣｈｏｔｈｉａ番号付け方案に類似する。そのため、別途に規定しない限り、用語で定義される抗体又はその領域（例えば可変領域
）の「ＣＤＲ」及び「相補性決定領域」ならびに当該抗体及びその領域の単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２）は本明細書に記載の上記既知の方案における任意の一つの定義される相補性決定領域を含むことが理解される。一部の場合、規定は一つ又は複数の特定のＣＤＲを認識する方案に使用され、例えばＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＣｏｎｔａｃｔ方法によって定義されるＣＤＲが挙げられる。他の場合、ＣＤＲの特定のアミノ酸配列が与えられる。
本発明において、用語「マウス由来抗体」は本分野の知識及び技能によって製造されるヒトＣＬＤＮ１８．２に対するモノクローナル抗体である。製造時、ＣＬＤＮ１８．２抗原で試験対象に注射した後、必要な配列又は機能の特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離する。本発明の一つの好適な実施形態において、前記マウス由来ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合断片は、さらにマウス由来κ鎖、λ鎖又はその突然変異の軽鎖定常領域を、或いはさらにマウス由来ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４又はその突然変異の重鎖定常領域を含んでもよい。
用語「ヒト抗体」はヒト免疫グロブリン配列の可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンの配列によってコードされるアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、体外におけるランダム又は部位特異性の誘発突然変異或いは体内における体細胞の突然変異によって導入される突然変異）。しかし、用語「ヒト抗体」はこのような抗体、即ち、既に別の哺乳動物種（例えばマウス）からのＣＤＲ配列がヒト骨格配列に移植されたもの（即ち、「ヒト化抗体」）を含まない。
用語「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、マウス由来抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域を融合させてなる抗体で、マウス由来抗体による免疫応答反応を減少することができる。キメラ抗体を構築するには、マウス由来モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを構築・選択し、さらにマウスハイブリドーマ細胞から可変領域の遺伝子をクローニングし、また必要によって得られたヒト抗体の定常領域の遺伝子をクローニングし、マウス可変領域の遺伝子とヒト定常領域の遺伝子をキメラ遺伝子に連結してベクターに挿入し、最後に真核細胞、産業化システム又は原核産業化システムにおいてキメラ抗体分子を発現させる。本発明の一つの好適な実施形態において、前記ＣＬＤＮ１８．２キメラ抗体の抗体軽鎖可変領域は、さらにマウス由来κ型、λ型又はその突然変異の軽鎖ＦＲ領域を含む。前記ＣＬＤＮ１８．２キメラ抗体の抗体重鎖可変領域は、さらにマウス由来ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はその突然変異の重鎖ＦＲ領域を含む。ヒト抗体の定常領域はヒト由来ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４又はその突然変異の重鎖定常領域から選ばれ、好ましくはヒト由来ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の重鎖定常領域を含むか、或いはアミノ酸が突然変異してＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性細胞傷害作用）、ＣＤＣ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ、補体依存性細胞傷害作用）活性が変わったＩｇＧ１を使用する。ＩｇＧにおけるＦｃ領域に対する修飾により、抗体のＡＤＣＣ、ＣＤＣ効果機能を低下又は消失、或いは増強させることができる。前記修飾とは抗体の重鎖定常領域における突然変異であり、例えばＩｇＧ１のＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２／４キメラ、ＩｇＧ４のＦ２３５Ｅ、又はＬ２３４Ａ／Ｅ２３５Ａ，Ｆ２４３Ｌ、又はＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅの突然変異から選ばれる。
用語「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域のフレームワークに移植してなる抗体である。特に、本発明に記載のＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＣＤＲがＣＣＧ、Ｋａｂａｔ、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＣｏｎｔａｃｔなどの番号付けで定義される各ＣＤＲ配列であり、ヒトの抗体可変領域のフレー
ムワークに移植してなる抗体である。好ましくは、本発明に記載のＣＬＤＮ１８．２抗体のＣＤＲは、好適に軽鎖ＣＤＲ１における０～５箇所がヒト抗体ＣＤＲの相応する部位のアミノ酸に突然変異した。これらによって、キメラ抗体が大量のマウスタンパク質成分を持つことで、強烈な抗体可変抗体反応が誘導されることを克服することができる。ヒトＦＲ配列はＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のサイトｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ及びｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇから得られる。
本明細書で用いられるように、抗体に関する用語「特異的結合」とは特異性抗原を認識するが、基本的にサンプルにおける他の分子を認識又は結合しない抗体のことである。例えば、特異的な結合は一つの種の抗原の抗体でも、一つ又は複数の種の当該抗原でもよい。しかし、このような種間クロス反応性自体は抗体の特異性による分類を変えることがない。もう一つの実例において、特異的に抗原に結合する抗体は当該抗原の異なる対立遺伝子形態に結合することもできる。しかし、このようなクロス反応性自体は抗体の特異性による分類を変えることがない。一部の場合、用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、抗体、タンパク質又はペプチドと第二化学物質の相互作用に使用することができ、当該相互作用が化学物質における特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在によることを意味する。例えば、抗体は、通常、タンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体はエピトープ「Ａ」に特異性がある場合、標識された「Ａ」及び抗体を含む反応において、エピトープＡを含有する分子（又は遊離の未標識のＡ）の存在によって抗体に結合する標識されたＡの量が減少する。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記のＣＬＤＮ１８．２ヒト化抗体のマウスＣＤＲ配列は配列番号１１～２８から選ばれる。ヒトの抗体の可変領域のフレームワークは設計・選択されたもので、ここで、前記抗体の軽鎖可変領域における軽鎖ＦＲ領域配列は、ヒト軽鎖のＩＧＫＶ４－１＊０１（Ｆ）とｈＪＫ２．１の組み合わせ配列の配列番号２９～３３からのものであり、ヒト軽鎖ＩＧＫＶ４－１＊０１（Ｆ）のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域及びｈＪＫ２．１のＦＲ４領域を含む。ここで、前記抗体の重鎖可変領域における重鎖ＦＲ領域配列は、ヒト重鎖のＩＧＨＶ１－６９＊０１（Ｆ）とｈＪＨ４．１の組み合わせ配列の配列番号３４～３７からのもので、ヒト重鎖ＩＧＨＶ１－６９＊０１（Ｆ）のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域及びｈＪＨ４．１のＦＲ４領域を含む。免疫原性の低下及びそれによる活性の低下を防止するには、前記ヒト抗体の可変領域に最低限の復帰突然変異をさせることによって活性を維持することができる。本発明の一つの好適な実施形態において、前記のヒト化抗体は、可変領域の復帰突然変異が０であり、即ち、全ヒト化抗体である。
用語「脱アミノ化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）」とは部位又は分子のある部位におけるアミノ基を脱離させることである。「脱アミノ化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）感受性部位」とは、脱アミノ化作用が生じやすい傾向がある分子及び分子のある部位である。
用語「抗原結合断片」とは、抗体の抗原結合断片及び抗体類似体であり、通常、少なくとも一部の親抗体（ｐａｒｅｎｔａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の抗原結合領域又は可変領域（例えば一つ又は複数のＣＤＲ）を含む。抗体断片には親抗体の少なくとも一部の結合特異性が残っている。通常、モルで活性を表示する場合、抗体断片には少なくとも１０％の親の結合活性が残っている。好ましくは、抗体断片には少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％又はそれ以上の親抗体の標的に対する結合親和性が残っている。抗原結合断片の実例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、一本鎖抗体、ナノ抗体、ドメイン抗体及び多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。遺伝子改変の抗体突然変異の詳細はＨｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３： １１２６－１１３６に記載されている。
「Ｆａｂ断片」は１本の軽鎖と１本の重鎖のＣＨ１及び可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖はもう一つの重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆｃ」領域は抗体のＣＨ１およいＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含有する。２つの重鎖断片は２つ又は複数のジスルフィド結合及びＣＨ３ドメインの疎水作用によって一緒になっている。「Ｆａｂ’断片」は１本の軽鎖とＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインならびにＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の領域を含む１本の重鎖の部分を含有するため、２つのＦａｂ’断片の２本の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合を形成してＦ（ａｂ’）２分子になることが可能である。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は２本の軽鎖と２本のＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の定常領域の部分を含む重鎖を含有するため、２本の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合を形成している。そのため、Ｆ（ａｂ’）２断片は２本の重鎖の間のジスルフィド結合によって一緒になった２つのＦａｂ’断片からなる。用語「Ｆｖ」とは抗体の一方のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなる抗体断片であるが、定常領域が欠けている。
一部の場合、抗体の抗原結合断片は一本鎖結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）であり、ここで、ＶＬ及びＶＨドメインが単一のポリペプチド鎖になるようなリンカーを介して１価の分子を形成している［例えば、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６ （１９８８） 及びＨｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３（１９８８）を参照する］。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨという一般的な構造を有する。適切な既存技術のリンカーは重複のＧ４Ｓアミノ酸配列又はその突然変異からなる。例えば、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４又は（Ｇ４Ｓ）３リンカーを使用してもよいが、その突然変異を使用してもよい。
用語「多重特異性抗体」は、その最も広い意味で使用され、ポリエピトープ特異性を有する抗体を含む。これらの多重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体であって、当該ＶＨ－ＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有し、２つ又は複数のＶＬ及びＶＨ領域を有する抗体であって、各ＶＨ－ＶＬ単位が異なる標的又は同一の標的の異なるエピトープに結合する抗体、２つ又は複数の単一可変領域を含む抗体であって、各単一可変領域が異なる標的又は同一の標的の異なるエピトープと結合する抗体、全長抗体、抗体断片、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、及び三価抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、共役又は非共役的に連結した抗体断片などを含むが、これらに限定されない。
抗体分子は二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）及び一本鎖分子ならびに抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ及びＦｖ）を含む。抗体分子は１本の重鎖及び１本の軽鎖（本発明において半抗体と呼ばれる）を含むか、又はこれらからなる。Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、二重特異性抗体（Ｄａｂ）（二価及び二重特異性）及びキメラ（例えば、ヒト化）抗体は、完全な抗体を修飾することによって生成してもよく、又は組み換えＤＮＡ技術によって一から合成された抗体分子でもよい。これらの機能性抗体断片には選択的にそれに相応する抗原又は受容体と結合する能力が残っている。抗体及び抗体断片はいずれの抗体の種類からのものでもよく、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含むが、これらに限定されず、そしていずれの抗体のサブタイプからのものでもよい（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）。抗体分子の製造はモノクローニングでもポリクローニングでもよい。抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体又は体外で生成した抗体でもよい。抗体は例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から選ばれる重鎖定常領域を有してもよい。また、抗体は例えばκ型又はλ型の軽鎖を有してもよい。
本発明で開示された抗体は単一ドメイン抗体でもよい。単一ドメイン抗体は相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの構成部分である抗体を含んでもよい。例は重鎖抗体、天然に軽鎖が欠けた抗体、通常の４本鎖抗体から誘導された単一ドメイン抗体、遺伝子改変抗体及び抗体から誘導される骨格以外の単一ドメイン骨格を含むが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は既存技術の任意の抗体、又は将来の任意の単一ドメイン抗体でもよい。単一ドメイン抗体は任意の種からのものでもよく、マウス、ヒト、ラクダ、アルパカ、ヤギ、ウサギ及びウシを含むが、これらに限定されない。一部の側面では、単一ドメイン抗体は天然に存在する単一ドメイン抗体であり、軽鎖が欠けた重鎖抗体と呼ばれる。明確な理由により、本発明において、４本鎖免疫グロブリンの通常のＶＨと区別するように、天然に軽鎖が欠けた重鎖抗体から誘導されるこのような可変ドメインはＶＨＨ又はナノ体と呼ばれる。このようなＶＨＨ分子はラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）の種（例えばラクダ、アルパカ、ヒトコブラクダ、ラマやグアナコ）で生じた抗体から誘導されるものでもよい。ラクダ以外の他の種は天然に軽鎖が欠けた重鎖抗体が発生できれば、このようなＶＨＨも考えられる。ＶＨ領域及びＶＬ領域はさらに超可変領域に分画され、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれ、その間により保存的な領域が挿入されており、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は既に多くの方法によって定義されている。
本発明の抗体はモノクローナル抗体を含む。本発明に係るモノクローナル抗体又はｍＡｂまはＡｂとは、単一クローンの細胞株から得られる抗体であり、前記の細胞は、真核のもの、原核のもの又はファージのクローン細胞株でもよいが、これらに限定されない。本発明に係るベクターの宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞又はヒト細胞でもよいが、これらに限定されない。適切な真核細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｔ、２９３Ｅ、ＢＨＫ細胞を含むが、これらに限定されず、適切な昆虫細胞Ｓｆ９細胞を含むが、これらに限定されない。
モノクローナル抗体又は抗原結合断片は、例えばハイブリドーマ技術、組み換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（例えばＣＤＲ移植（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｉｎｇ））、又は他の既存技術によって組み換えて得ることができる。抗体及び抗原結合断片を生産及び精製する方法は既存技術、例えばコールド・スプリング・ハーバーの抗体技術研究所マニュアルにおいて熟知のものか見つかるものである。抗原結合断片は同様に通常の方法で製造することができる。
本明細書で用いられた用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」とは、抗原と結合できる細胞外領域（細胞外結合ドメイン）、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン（膜貫通領域）及び細胞質シグナルをドメインに伝達するポリペプチド（即ち、細胞内シグナル領域）を含む。ヒンジドメインは、細胞外抗原結合領域に柔軟性を与えるための一部と考えられる。細胞内シグナル領域とは、決まったシグナル伝達経路を通してセカンドメッセンジャーが生じることによって情報を細胞内に伝達することで細胞活性を調節するタンパク質、或いはこのようなメッセンジャーに応答することによってエフェクターとして作用を発揮するタンパク質で、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）の免疫エフェクター機能を促進できるシグナルを生じさせるものである。細胞内シグナル領域はシグナル伝達ドメインを含み、さらに共刺激分子からの共刺激細胞内ドメインを含んでもよい。
用語「シグナル伝達ドメイン」とはＣＡＲのエフェクター機能シグナルを伝達して細胞にその専門的な機能を実行するようにさせる部分である。シグナル伝達ドメインの実例は、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖又はその任意のホモログを含むが、これらに限定されない。
本明細書において、用語「ＣＤ３ζ」はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＧ３６６６４．１によって提供されるタンパク質、又はヒト以外の種、例えばマウス、げっ歯類動物、サル
、ルイジンエンなど由来の等価残基と定義されている。「ＣＤ３ζ細胞内領域」は、機能的にＴ細胞の活性化に必要な初期シグナルを伝達することができる、ζ鎖由来の細胞質ドメインのアミノ酸残基と定義されている。一方、ＣＤ３ζ細胞内領域はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２から１６４を含む、その機能的ホモログである、ヒト以外の種、例えばマウス、げっ歯類動物、サル、ルイジンエンなど由来の等価残基である。本明細書で用いられるように、用語「ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン」又は「ＣＤ３ζ細胞内領域」とはその名称に関連する特定のタンパク質断片、及び本明細書で示されるＣＤ３ζ細胞内領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％、又は代わりに少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９７％、さらに好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する、類似する生物的機能を有する任意の他の分子をいう。
用語「共刺激細胞内ドメイン」とは、共刺激分子の細胞内領域で、Ｔ細胞における関連する結合性パートナーで、特異的に共刺激リガンドと結合することによって、免疫細胞の共刺激反応を仲介するが、例えば、増殖が挙げられるが、これに限定されない。共刺激分子は、有効な免疫反応に必要で、非抗原受容体の細胞表面の分子又はそのリガンドである。共刺激分子は、例えばＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１ （ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）及び４－１ＢＢ （ＣＤ１３７）といった分子の細胞内領域を含むが、これらに限定されない。
本明細書において、用語「４－１ＢＢ」とはＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーで、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸配列、又はヒト以外の種、例えばマウス、げっ歯類動物、サル、ルイジンエンなど由来の等価残基を有し、「４－１ＢＢ」共刺激細胞内ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸配列２１４－２５５、又はヒト以外の種、例えばマウス、げっ歯類動物、サル、ルイジンエンなどからの等価残基、又は本願で示される４－１ＢＢ共刺激ドメイン配列と少なくとも８０％、又は代わりに少なくとも９０％のアミノ酸配列の同一性、好ましくは９５％の配列の同一性、より好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％の配列の同一性を有する、類似する生物的機能を有する任意の他の分子と定義されている。
本明細書で用いられるように、用語「ＣＤ２８共刺激ドメイン」はヒトＣＤ２８共刺激ドメイン、或いはその名称に関連する特定のタンパク質断片、及びヒトＣＤ２８共刺激ドメインの配列と少なくとも８０％、又は代わりに少なくとも９０％のアミノ酸配列の同一性、好ましくは９５％の配列の同一性、より好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％の配列の同一性を有する、類似する生物的機能を有する任意の他の分子をいう。
本発明において、一つの側面では、ＣＡＲはキメラ融合タンパク質を含み、前記タンパク質は細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含む。一つの側面では、ＣＡＲはキメラ融合タンパク質を含み、前記タンパク質は細胞外抗原を認識する細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含む。一つの側面では、ＣＡＲはキメラ融合タンパク質を含み、前記タンパク質は細胞外結合ドメイン、共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含み、前記共刺激ドメインは一つ又は複数の共刺激分子からの少なくとも二つの機能性シグナル伝達ドメインを含む。一つの側面では、ＣＡＲはＣＡＲ融合タンパク質のＮ末端に任意選択のリーダー配列（又はシグナルペプチド）を含む。一つの側面では、ＣＡＲは細胞外抗原認識ドメインのＮ末端にさらにリーダー配列を含み、ここで、リーダー配列は任意にＣＡＲの細胞で加工されて細胞膜に局在化する過程で抗原識別ドメイン（例えばｓｃＦｖ）のＮ末端から切り取られる。
「相同性」、「変異配列」、「突然変異」とは２つのポリヌクレオチド配列の間又は２つのポリペプチドの間の配列の類似性をいう。比較する２つの配列における位置がいずれも同じ塩基又はアミノ酸の単独の２価の基に占められている場合、例えば２つのＤＮＡ分子のいずれの位置もアデノシンに占められている場合、前記分子は当該位置において相同である。２つの配列の間の相同性の百分率は２つの配列が共有するマッチ又は相同の位置数を比較の位置数で割って１００を掛ける関数である。例えば、配列のアラインメントの場合、２つの配列における１０の位置のうち、６つのマッチ又は相同があると、２つの配列は相同性が６０％である。一般的に、２つの配列のアライメントで最大の相同性百分率が得られる場合、比較する。「最適化」とは、前記抗体と抗原の結合を維持又は改善した突然変異で、本発明において、ＣＬＤＮ１８．２との結合を維持又は改善した突然変異である。
本発明において、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」（一本鎖の場合）は入れ替えて使用することができる。用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」又は「ポリヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」は入れ替えて使用することができる。
用語「アミノ酸修飾」は、アミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を含み、「アミノ酸の置換」及び「アミノ酸の保存的置換」はそれぞれそのうちのアミノ酸残基がもう一つのアミノ酸残基で置換されること及び類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることである。
用語「ＩＬ１０」、「インターロイキン１０」及び「ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０」は入れ替えて使用することができ、同じ意味を有する。同様に、用語「ＩＬ１５」、「インターロイキン１５」及び「ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５」は入れ替えて使用することができ、同じ意味を有する。適切なアミノ酸修飾は、得られる分子の生物活性が変わらないままで容易に実施することができる。これらの技術により、当業者は、一般的に、ポリペプチドの非必要領域において単一のアミノ酸を変えても基本的に生物活性が変わらないことが分かる。前記ＩＬ１０又はＩＬ１５の活性断片はいずれも本発明に使用することができる。ここで、前記生物活性断片とは、全長ポリペプチドの一部として、全長のポリペプチドの全部又は一部の機能が残っているポリペプチドをいう。通常の場合、前記生物活性断片には少なくとも５０％の全長ポリペプチドの活性が残っている。より好ましい条件において、前記活性断片には全長ポリペプチドの８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の活性が残っている。前記ＩＬ１０又はＩＬ１０ポリペプチド配列に基づき、修飾又は改良されたポリペプチドも本発明に使用することができ、例えば、その半減期、有効性、代謝、及び／又はポリペプチドの効果を促進するために修飾又は改良されたポリペプチドを使用することができる。つまり、ポリペプチドの生物活性に影響しない変更形態のいずれも本発明に使用することができる。
当業者に周知のように、ＩＬ１５とＩＬ１５受容体の結合によって生物学的機能が発揮される。ＩＬ１５受容体は３つのサブユニットを有し、それぞれＩＬ１５受容体α、ＩＬ１５Ｒβ（ＣＤ１２２）及びγ（ＣＤ１３２とも呼ばれる）である。ＩＬ１５Ｒα細胞外領域はＩＬ１５に結合する部分であり、そのうちのｓｕｓｈｉドメインがＩＬ１５に結合してＩＬ１５の生物学的機能が発揮される。本発明において、「ｓｕｓｈｉ＋」とは、ｓｕｓｈｉ断片以外、さらに他のポリペプチド断片を含む。上記ＩＬ１５Ｒα、ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）及びＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ＋）のアミノ酸配列はＣＮ１０６７５５１０７Ａを参照する。ＩＬ１５がＩＬ１５Ｒαに結合すると、細胞自身が活性化される以外、ＩＬ１５Ｒαを介し、さらにシグナルがもう一つの細胞に伝達して細胞活性が活性化される。これらの活性は選択的なＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞などの増幅を含み、且つＩＬ２のようにＴ細胞を活性化させて調節するものではないため、抗腫瘍免疫反応において異
なる機能を発揮する可能性がある。
本明細書で用いられる「レンチウイルス」とはレトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）の属である。レンチウイルスはレトロウイルスの中で独特なもので、非分裂細胞に感染することができ、顕著な量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達するため、遺伝子送達ベクターの最も有効な方法である。ＨＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶはいずれもレンチウイルスの実例である。レンチウイルスからのベクターは体内において顕著なレベルの遺伝子の移行を実現させる手段を提供する。
本明細書で用いられる用語「ベクター」は分離された核酸を含み、且つ分離された核酸を細胞内部へ送達する組成物である。本分野では、多くのベクターが知られており、線状ポリヌクレオチド、イオン又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含むが、これらに限定されない。そのため、用語「ベクター」は自己複製のプラスミド又はウイルスを含む。なお、当該用語は核酸の細胞内への移行を促進するプラスミド及びウイルス以外の化合物、例えばポリリジン化合物、リポソームなどとも理解できる。ウイルスベクターの実例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
本発明で使用される表現「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」は入れ替えて使用することができ、且つこのような名称はいずれも子孫を含む。用語「宿主細胞」とは、ベクター導入に使用可能な細胞で、例えば大腸菌などの原核細胞、例えば酵母細胞などの真菌細胞、或いは例えば線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はヒト細胞などの動物細胞を含むが、これらに限定されない。
用語「形質移入」とは外来核酸を真核細胞へ導入することである。形質移入は本分野で既知の様々な手段によって実現することができ、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、ＤＥＡＥ－デキストランを介する形質移入、ポリブレンを介する形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染及びバイオリステック技術（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）を含む。
用語「免疫細胞」とは免疫応答を引き起こす細胞であり、「免疫細胞」及びその文法的な他の形態は任意由来の免疫細胞を指す。「免疫細胞」は、例えば骨髄で生じる造血幹細胞（ＨＳＣ）から誘導される白血球、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）及び骨髄由来の細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単核球、マクロファージ、樹状細胞）を含む。用語「免疫細胞」はヒトのものでも非ヒトのものでもよい。
本明細書で用いられるように、用語「Ｔ細胞」とは胸腺で成熟するリンパ球である。Ｔ細胞は細胞を介する免疫において重要な作用を果たし、且つ他のリンパ球（例えばＢ細胞）との相違点は細胞の表面に存在するＴ細胞受容体にある。「Ｔ細胞」はＣＤ３を発現するすべての種類の免疫細胞を含み、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及びγ－δＴ細胞を含む。「細胞傷害性Ｔ細胞」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び好中球を含み、これらの細胞は細胞傷害性反応を仲介する。本明細書で用いられるように、用語「ＮＫ細胞」とは骨髄由来で自然免疫系において重要な作用を果たすリンパ球である。ＮＫ細胞は、細胞の表面に抗体及び主要組織適合遺伝子複合体分子が存在しなくても、ウイルス感染に対する細胞、腫瘍細胞又は他のストレス細胞の快速免疫反応を提供する。
例えば、免疫細胞は血液由来のもの、例えば自己Ｔ細胞、異種Ｔ細胞、自己ＮＫ細胞、
異種ＮＫ細胞でもよく、細胞系由来のもの、例えばＥＢＶウイルスで感染させることによってＮＫ細胞系を製造し、胚性幹細胞及びｉＰＳＣから誘導・分化したＮＫ細胞及びＮＫ９２細胞系などでもよい。
「任意に」、「いずれ」、「任意の」又は「いずれか」とは後記の事項又は環境によって可能であるが必ずしも発生するわけではないという意味であり、当該記述は当該事項又は環境が発生する場合又は発生しない場合を含む。例えば、「任意に１つの抗体の重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体の重鎖可変領域でもよいが、必ずしも存在しなくてもよい。本発明で用いられるように、「１つ」及び「１種類」とは本発明において１つ又は１つよりも多いという文法的対象である。内容によって明確に示されない限り、用語「又は」は本発明において用語「及び／又は」という意味で、且つ入れ替えて使用することができる。「約」及び「およそ」とは、通常、測定の性質又は精度により、測定される量の許容できる誤差の程度である。例示的な誤差の程度は、一般的に、その１０％以内の範囲であり、より一般的に、その５％以内の範囲である。本発明で開示される方法及び組成物は、指定の配列、変異配列又はそれと基本的に同様又は類似の配列、例えば、指定の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％又はこれ以上同じ配列を有するポリペプチド及び核酸を含む。アミノ酸配列の場合、本発明において、用語「基本的に同様」とは第一のアミノ酸配列である。
本明細書で用いられるように、用語「ＫＤ」とは特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数（ＫＤ）であり、抗体と抗原の間の結合親和性を示すために使用される。解離平衡定数が小さいほご、抗体－抗原結合が緊密であり、抗体と抗原の間の親和性が高い。通常、抗体は約１０－５Ｍ未満、例えば約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ又は１０－１０Ｍ未満又はそれ以上小さい解離平衡定数で抗原と結合し、例えば、表面プラスモン共鳴技術（ＳＰＲ）によってＢＩＡＣＯＲＥ装置で測定される。例えば、ＫＩＮＥＸＡ方法によってＫＩＮＥＸＡ ４００装置で測定される抗体と細胞が結合する親和性を使用する。本明細書で用いられるように、用語ＥＣ５０とは半数最大効果濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５０％ ｏｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ）、即ち、５０％の最大効果をもたらす濃度である。
本発明の薬物組成物は、必要により各種の剤形に調製することができ、且つ医者が患者の種類、年齢、体重及び基本病状、投与の様態などの要素によって患者に有益な投与量を決めて使用することができる。投与形態は、例えば注射又は他の治療形態を使用してもよい。
本明細書で用いられるように、用語「抗体の薬物複合体」、「複合物」、「複合体」又は「ＡＤＣ」は入れ替えて使用することができ、式Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩなどの構造で示される抗体の薬物複合体を指す。
オーリスタチンは全合成薬物であり、物理性質及び薬らしさの特徴を最適化するには、化学構造式が比較的に改造しやすい。抗体と複合するオーリスタチンの誘導体は主にモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含むが、前者は天然微小管重合阻害剤であるドラスタチン１０（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ－１０）から誘導される合成ペンタペプチドであり、Ｃ末端に１つの２－アミノ－１－フェニルプロパン－１－オールを加えて合成された。ＭＭＡＥは多くのヒト腫瘍細胞株に対する抑制活性が１ ｎｍｏｌ未満である。ＭＭＡＥ自身の細胞毒活性を低下させるために、ＭＭＡＦはドラスタチン１０のＣ末端に１つのフェニルアラニンを加えたもので、構造上１つのカルボキシ基が導入され、ＭＭＡＦの細胞膜透過性が劣るため、細胞に対する生物活性が顕著に低下するが、抗体と複合した後、細胞に対する抑制活性が大幅に向上する（ＵＳ７７５０１１６）。
一部の実施形態において、抗体の細胞傷害性薬物複合体又はその薬用可能な塩又は溶媒化合物は１つ又は複数のメイタンシノイド分子が複合した本発明の抗体を含む。メイタンシノイドは微小管重合を抑制することによって作用を発揮する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、初めはメイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓｓｅｒｒａｔａ）から分離された（米国特許番号３，８９６，１１１）。その後、他の微生物もメイタンシノイド、例えばマイタンシノールやＣ－３メイタンシノールエステル（米国特許番号４，１５１，０４２）を生成することが見出された。メイタンシノイド薬物モジュールは抗体－薬物複合体において注目の薬物モジュールであり、それは、（ｉ）発酵又は発酵産物の化学修飾又は誘導によって製造することが比較的に容易で、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを介する抗体への複合に適する官能基で誘導しやすく、（ｉｉｉ）血漿において安定で、且つ（ｉｖ）多くの腫瘍細胞系に有効であるからである。メイタンシノイド薬物モジュールとして適するメイタンシン化合物は本分野で公知で、そして既知の方法によって天然源から分離するか、遺伝工学技術によって生産することができる（Ｙｕら（２００２）ＰＮＡＳ９９：７９６８－７９７３を参照する）。マイタンシノール及びマイタンシノール類似体も既知の方法によって合成・製造することができる。メイタンシノイド薬物モジュールの例示的な実施形態は、本明細書で開示されるように、ＤＭ１、ＤＭ３及びＤＭ４を含む。
本発明で用いられる用語「連結ユニット」、「連結基」及び「リンカー」とは、本発明に適する、本発明の抗体と小分子薬物を連結するための基である。例示的なリンカーは、ＭＣ、ＭＰ、ｖａｌ－ｃｉｔ、ａｌａ－ｐｈｅ、ＰＡＢ、ＳＰＰ、ＳＭＣＣ、ＳＩＡＢを含む。一つの実施形態において、前記リンカーはＭｃ－ｖｃ－ＰＡＢである。
薬物担持量（Ｌｏａｄｉｎｇ）はｙで表され、即ち、一般式Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩの分子における各抗体の平均薬物モジュール数であり、薬物抗体比（ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）とも呼ばれる。カップリング反応のＡＤＣ製品における各抗体の平均薬物モジュール数は通常の方法、例えば質量分析、ＥＬＩＳＡ測定法及びＨＰＬＣによって特徴付けされる。また、ＡＤＣのｙにおける定量分布を測定することができる。一部の場合、ｙがある値の同質なＡＤＣの他の薬物担持量のＡＤＣからの分離、精製及び特徴付けは、逆相ＨＰＬＣ又は電気泳動のような手段によって実現できる。薬物担持量の範囲は０．８～１０個の薬物モジュール（Ｄ）／抗体でもよい。
ＡＤＣの担持量（薬物抗体比ＤＡＲ）は様々な手段、例えば、（ｉ）薬物－リンカー中間体又はリンカー試薬が抗体に対して過剰なモル量になるように制限すること、（ｉｉ）カップリング反応の時間又は温度を制限すること、（ｉｉｉ）システインのチオール修飾の部分又は還元性条件を制限すること、（ｉｖ）組み換え技術で抗体のアミノ酸配列に対して遺伝子改変を行うことで、リンカー－薬物複合の数及び／又は位置を制御するためにシステイン残基の数及び位置を変えること（例えば本明細書及びＷ０２００６／０３４４８８（全体として本明細書に参考として取り入れる）に記載のように製造されるｔｈｉｏＭａｂ又はｔｈｉｏＦａｂ）によって制御することができる。
本発明に記載の方法、組成物、併用治療は、他の活性剤又は治療手段と併用してもよいが、前記方法は対象に有効に疾患（例えば、癌）を治療又は予防する量で、本発明に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子、任意に、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、Ｔｉｍ－３抗体（免疫治療）又は他の腫瘍治療抗体、Ｈｅｒ－２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ抗体など、及びＡＤＣ（抗体薬物複合体、例えばＴ－ＤＭ１）、二重特異性抗体、化学治療薬などの１つ又は複数の阻害剤の組み合わせを投与することを含み、さらに、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子、別の活性剤又は全部をこのような量又は投与量で施用することを含み、前記量又は投与量は単独で（例えば、単一の療法として）使用される各活性剤の量又は投与量と同様又はそれよりも高いか、低い量又は投与量
である。抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、別の活性剤又は全部の使用量又は投与量は単独で（例えば、単一の療法として）使用される各活性剤の量又は投与量よりも（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％）低い。
また、本発明の実施例に記載のように、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及びＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物複合体はＣＬＤＮ１８．２に結合して標的細胞（腫瘍細胞）のアポトーシスを誘導し、腫瘍細胞の成長を抑制し、体内におけるエフェクター細胞の腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ、ＣＤＣ殺傷作用を増加させることによって癌患者を治療する目的を実現することができる。そのため、一部の実施形態において、本発明に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及びＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物複合体はこれらの機序によって本発明の抗体の抗腫瘍効果を示し、そして腫瘍細胞の成長を抑制する方法は、治療有効量の本発明に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及びＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物複合体を被験者に施用することを含む。当該方法は癌の体内治療に適する。標的特異的な治療効果が得られるように、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子は他の抗体とともに施用することができる。ＣＬＤＮ１８．２抗体及びＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物複合体を一つ又は複数の活性剤と組み合わせて施用する場合、当該組み合わせは任意の順番で又は同時に癌の種類、特にＣＬＤＮ１８．２高発現の腫瘍患者に施用することができる。一部の側面では、対象の体内において対象の過剰増殖性障害又は疾患（例えば癌）を治療（例えば減少又は緩和）する。当該方法は、対象に単独で又は他の活性剤か治療手段と組み合わせて本発明に係る一つ又は複数の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物複合体を施用することを含む。
組み合わせは、さらに、免疫チェックポイント調節因子の阻害剤又は作動剤、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体分子、抗ＰＤ－１抗体分子、又はＣＴＬＡ－４阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）、又は非免疫チェックポイント調節因子の阻害剤又は作動剤（例えば化学薬物、小分子標的薬物、抗体標的薬物を含む大分子、例えば抗Ｈｅｒ２、抗ＶＥＧ、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＥＧＦＲなどの抗体、抗体複合薬物、二重特異性抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞の組み合わせなど）、又は任意の組み合わせを含む。ＣＬＤＮ１８．２抗体による治療は、標準の癌治療と組み合わせることもできる。
用語「免疫チェックポイント」とは、免疫細胞の表面における一連の分子であり、「閘門」として免疫応答、例えば腫瘍免疫応答を下方調節又は抑制することで、本発明の抗体と併用して腫瘍を治療することができる。免疫チェックポイント分子はＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、細胞傷害性のＴ細胞抗原４（ＣＴＬＡ－４）、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ３、ＯＸ－４０，４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ４０、及びリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）などを含むが、これらに限定されない。
単独で又はもう一つの免疫調節剤（例えば抗ＬＡＧ－３、抗Ｔｉｍ－３、抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子）と組み合わせて抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子によって胃癌、膵臓腺癌、肺癌、食道癌、卵巣癌などを治療する。抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子は、免疫に基づいた対策、標的薬物（例えば、ＶＥＧＦ阻害剤、例えばＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体）、ＶＥＧＦチロシンキナーゼ阻害剤、例えばスニチニブ、ソラフェニブ、アパチニブ、ＲＮＡｉ阻害剤又はＶＥＧＦシグナル伝達の下流媒介物の阻害剤、例えば、ラパマイシン、哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）の阻害剤のうちの一つ又は複数と組み合わせて施用することができる。
本発明で用いられるように、用語「癌」、「癌症」、「癌患者」とは組織病理学的分類や侵入段階にかかわらず、すべての種類の癌性増殖物又は発癌過程、転移性組織又は悪性転化の細胞、組織又は器官を含む。例は、固形腫瘍、血液癌、軟部組織腫瘍や転移性病巣を含むが、これらに限定されない。
本発明で開示されるＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、二重特異性抗体、ＡＤＣ及びＣＡＲ細胞又はその組み合わせで治療することができる癌の実例は、肺癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、頭頚部癌、メラノーマ、腎臓癌、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓腺癌、膀胱癌及び白血病など、又はその転移性病巣を含むが、これらに限定されない。
実施例１：クローディン１８．１、１８．２（ＣＬＤＮ１８．１、ＣＬＤＮ１８．２）高発現細胞株の構築
本発明で使用されたヒトＣＬＤＮ１８．１、ヒトＣＬＤＮ１８．２、マウスＣＬＤＮ１８．１、マウスＣＬＤＮ１８．２高発現細胞株は会社の安定的な細胞株構築プラットフォームによって完成された。具体的な手順は以下の通りである。
実験開始から１日目に、２９３Ｔ細胞（中国科学院典型培養物寄託委員会細胞ライブラリーＣａｔ＃ＧＮＨｕ１７）を２つの６ｃｍシャーレに、各シャーレにおける細胞数が７．５×１０５個になるように接種した。２日目に、パッケージングプラスミド（ｐＧａｇ－ｐｏｌ、ｐＶＳＶ－Ｇ、ｐＢａｂｅなどのＢｉｏＶｅｃｔｏｒ、プラスミドベクター菌種細胞遺伝子寄託センター）及びヒト又はマウスＣＬＤＮ１８．２又はＣＬＤＮ１８．１遺伝子がクローニングされたプラスミドｐＢａｂｅ－ＣＬＤＮ１８．２又はｐＢａｂｅ－ＣＬＤＮ１８．１を４μｇずつＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ ＃ ３１９８５０７０）に入れ、最終体積が２００μｌになるようにし、別途に２００μｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭを用意して３６μｌの形質移入試薬ｆｅｃｔｉｎ（上海源培生物科技股フン有限公司Ｃａｔ ＃ Ｆ２１０）を入れ、両者を均一に混合し、室温で５ｍｉｎ置いた後、混合物（２００μｌ／シャーレ）を培養された２９３Ｔ細胞に滴下した。３日目に、２９３Ｔ細胞培養液を４ｍｌのＤＭＥＭ高糖培地（上海源培生物科技股フン有限公司／源培生物：Ｃａｔ＃ ３１０ＫＪ）に変えた。４日目に、ＣＨＯ－Ｋ１（中国科学院典型培養物寄託委員会細胞ライブラリーＣａｔ＃ ＳＣＳＰ－５０７）を１０ｃｍシャーレに、細胞数が５×１０５個になるように接種した。５日目に、２９３Ｔ細胞上清（ウイルス）を収集し、０．４５μｍろ膜でろ過して培養されたＣＨＯ－Ｋ１細胞に入れ、同時に１０ μｇ／ｍｌのポリブレン（上海翊聖生物科技有限公司Ｃａｔ ＃ ４０８０４ＥＳ７６）を入れ、均一に混合した後、インキュベーターに置き、３～４ｈ後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １０％ＦＢＳ培地（源培生物、Ｃａｔ ＃ Ｌ３１０ＫＪ）に変えた。７日目に、ＣＨＯ－Ｋ１細胞を継代し、８日目に、継代された細胞に１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を入れてスクリーニングした（源培生物、Ｃａｔ ＃ Ｓ２５０Ｊ０）。２～３日で細胞が大量に死亡し、培地を変えて続いて細胞が死亡しなくなるまで培養し、細胞が大量に増幅し、モノクローナル細胞株をスクリーニングし、増幅培養して凍結保存した。
本発明で構築された安定的な発現ＣＬＤＮ１８細胞株はそれぞれ、ヒトＣＬＤＮ１８．１＋細胞（ｈＣＬＤＮ１８．１＋ｃｅｌｌ）、ヒトＣＬＤＮ１８．２＋細胞（ｈＣＬＤＮ１８．２＋ｃｅｌｌ）、マウスＣＬＤＮ１８．１＋細胞（ｍＣＬＤＮ１８．１＋ ｃｅｌｌ）、マウスＣＬＤＮ１８．２＋細胞（ｍＣＬＤＮ１８．２＋ ｃｅｌｌ）と記載した。使用されたタンパク質配列は公開発表されているデータベースからのもので、各タンパク質のアミノ酸配列は以下の通りである。
ヒトＣＬＤＮ１８．１（ｈＣＬＤＮ１８．１）はＮＣＢＩデータベースにおける＞ＮＰ＿０５７４５３．１，ｃｌａｕｄｉｎ－１８ ｉｓｏｆｏｒｍ １ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］からのものである。ヒトＣＬＤＮ１８．２（ｈＣＬＤＮ１８．２））はＮＣＢＩデータベースにおける＞ＮＰ＿００１００２０２６．１ ｃｌａｕｄｉｎ－１８ ｉｓｏｆｏｒｍ ２ ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］からのものである。マウスＣＬＤＮ１８．１（ｍＣＬＤＮ１８．１））はＮＣＢＩデータベースにおける＞ＮＰ＿０６２７８９．１ ｃｌａｕｄｉｎ－１８ ｉｓｏｆｏｒｍ Ａ１．１ ｐｒｅｃ
ｕｒｓｏｒからのものである。マウスＣＬＤＮ１８．２（ｍＣＬＤＮ１８．２））はＮＣＢＩデータベースにおけるＮＰ＿００１１８１８５０．１ ｃｌａｕｄｉｎ－１８ ｉｓｏｆｏｒｍ Ａ２．１ ［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］からのものである。
実施例２：抗ＣＬＤＮ１８．２抗体とＣＬＤＮ１８．２＋及びＣＬＤＮ１８．１ ＋細胞株の結合（ＥＬＩＳＡ）実験
実施例１で得られた細胞であるヒトＣＬＤＮ１８．１、ヒトＣＬＤＮ１８．２、マウスＣＬＤＮ１８．１又はマウスＣＬＤＮ１８．２高発現のモノクローナル細胞株を増幅培養した後、５×１０４個／ウェルで９６ウェルプレートに敷き、３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートした後、上清を除去し、免疫染色固定液（上海碧雲天生物技術有限公司Ｃａｔ＃Ｐ００９８）を使用して１００μｌ／ウェルで室温で半時間固定させた。ＰＢＳ（源培生物，Ｃａｔ＃Ｂ３２０）で一回洗浄した後、５％牛乳で３７℃で２時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。被験サンプル（ヒト又はマウス由来抗体、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を入れた。３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。抗ヒト又はマウスＨＲＰを１：２５００、５０μｌ／ウェルで３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃ Ｃａｔ＃ＴＴＭＢ－１０００－０１）で呈色させ、５０μｌ／ウェルで１Ｍ
Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させた。マイクロプレートリーダー（ＭｕｌｔｉｓｋａｎＧＯ Ｔｈｅｒｍｏ 型番５１１１９２００）によって読み取り、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５によってデータの分析を行った。
実施例３：組み換えタンパク質、抗体のクローニング、発現及び精製、活性検出（ＥＬＩＳＡ、ブロッキングアッセイ）
本発明で使用された組み換えタンパク質／抗体のクローニング、発現及び精製はいずれも当業者に熟知の分子クローニング方法で行われた。
具体的に、本発明で使用された発現ベクターは長沙優宝生物科技有限公司から購入され、その後、二重酵素切断又は相同組み換え方法によって外来遺伝子を導入しやすいように、上海健信生物医薬科技有限公司（健信生物）によってＥｃｏＲＩ酵素切断部位（ＧＡＡＴＴＣ）が導入された。遺伝子合成は、生工生物工程（上海）股フン有限公司（生工生物）などによって完成された。２９３細胞、ＣＨＯ－Ｋは中国科学院典型培養物寄託委員会細胞ライブラリーから購入された。
本発明において、組み換えタンパク質及び抗体は２９３Ｆ細胞に一過性形質移入して発現させて精製することによって得られた。具体的な手順は、２９３細胞をＧｉｂｃｏ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃ １２３３８０１８）培地で増幅培養した。一過性形質移入の前、細胞濃度を６～８×１０５ 細胞／ｍｌ、１％ＦＢＳ（Ａｕｓ Ｇｅｎｅ Ｘ ＦＢＳ Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔプロバイダー：ＡｕｓＧｅｎｅＸ，Ｃｈｉｎａ，Ｃａｔ＃ ＦＢＳＳＡ５００－Ｓ）に調整し、３７℃、８％ＣＯ２のシェーカーで２４ｈ培養し、再度顕微鏡で検出したところ、生存率が＞９５％であり、細胞濃度が１． × １０６細胞／ｍｌであった。
３００ｍｌの培養系細胞、１５ｍｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃３１９８５０７０）を用意し、重鎖、軽鎖を１５０μｇずつ溶解させ、０．２２μｍでろ過して除菌した。さらに１５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭを取って６００μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃａｔ＃ ２３９６６－２）に溶解させた後、５ｍｉｎ静置した。５００ｍｌの培養系において、２５ｍｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃３１９８５０７０）に重鎖、軽鎖を２５０μｇずつ溶解させ、０．２２μｍでろ過して除菌した。さらに２５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭを取って１０００μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＰＥＩに溶解させた後、５ｍｉｎ静置した。ＰＥＩをゆっくりプラスミドに入
れ、室温で１０ｍｉｎインキュベートし、培養瓶を振とうしながらゆっくりプラスミドＰＥＩ混合溶液を滴下し、３７℃、８％ＣＯ２のシェーカーで５日培養してサンプルを回収し、３３００Ｇ １０ ｍｉｎで上清を取って精製した。
精製：サンプルを高速遠心して不純物を除去し、ＰＢＳ ｐＨ ７．４でプロテインＡ（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ＃ ７１－５０２０－９１ ＡＥ）を含有する重力カラム（生工生物、Ｃａｔ＃ Ｆ５０６６０６－０００１）を平衡化し、２～５倍のカラム体積で洗浄した。サンプルにカラムを通させた。５～１０倍のカラム体積のＰＢＳ（生工生物、Ｃａｔ＃Ｂ５４８１１７－０５００）でカラムを洗浄した。さらにｐＨ ３．５の０．１Ｍ酢酸で標的のタンパク質を溶離させた後、ｐＨ ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌで中性に調整し、マイクロプレートリーダーによって濃度を測定し、分注して使用に備えて保存した。
本発明における組み換えヒトＣＬＤＮ１８．２（クローディン１８．２）細胞外領域（２０位Ｄ－７０はＡ断片である）及びＦｃ融合タンパク質は２９３系によって一過性形質移入して精製されたものである。当該タンパク質は免疫マウスの血清力価の検出に使用することができる。
本発明の一部の実験において、ヒトＣＬＤＮ１８．２（ａｎｔｉ－ｈＣＬＤＮ１８．２）抗体（対照分子又は陽性分子と呼ばれる）が対照として使用された。本発明において、当該抗体はＲｅｆ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）と略され、配列はＷＯ２０１４１４６６７２からのものである。
抗原被覆プレートＥＬＩＳＡ：ｐＨ ７．４のＰＢＳ緩衝液で本発明で発現させたヒトＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、又はＰｅｐｒｏｔｅｃｈから購入されたＴＧＦβ１（Ｃａｔ＃ １００－２１－１０）、ＴＧＦβ２（Ｃａｔ＃ １００－３５Ｂ）、ＴＧＦβ３（Ｃａｔ＃ １００－３６Ｅ）を懸濁させた。Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入されたＩＬ１０（カタログ番号ＳＥＫＡ１０９４７）、ＦｃγＲ
Ｉ／ＣＤ６４（Ｃａｔ．＃１２５７－ＦＣ－０５０，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）などの抗原をアッセイによって、１～２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に入れ、３７℃インキュベーターで２時間置いた。液を捨てた後、ＰＢＳで希釈された５％脱脂牛乳（上海生工生物工程有限公司，Ａ６００６６９－０２５０）ブロッキング液を２００μｌ／ウェル入れ、３７℃インキュベーターで３時間又は４℃で一晩（１６～１８時間）置いてブロッキングした。ブロッキング液を捨て、そしてＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４、０．０５％ ｔｗｅｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ）でプレートを５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルで１％ ＢＳＡで５倍連続希釈された被験抗体を入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１：２５００で希釈されたＨＲＰで標識された二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１５－０３５－００３）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ呈色基質（ＫＰＬ，５２－００－０３）を入れ、室温で５～１０ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ／孔の１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させ、ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５１１１９２００）によって４５０ｎｍにおいて吸収値を読み取り、ＯＤ値からＥＣ５０を計算した。
抗体による抗原とそのリガンドの結合に対する阻害の実験（ブロッキングアッセイ）
ｐＨが７．４のＰＢＳ緩衝液で本発明で発現させた抗原ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７を２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に入れ、３７℃で２時間インキュベ
ートした。液を捨てた後、ＰＢＳで希釈された５％脱脂牛乳（上海生工生物工程有限公司，Ａ６００６６９－０２５０）ブロッキング液を２００μｌ／ウェル入れ、３７℃で３時間インキュベートしてブロッキングした。ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４、０．０５％ ｔｗｅｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ）でプレートを５回洗浄した後、２５μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡで５倍に連続希釈された被験サンプル及び２５μｌ／ウェルの最終濃度が１０μｇ／ｍｌのビオチンで標識されたリガンド（ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＳＩＲＰαなど、本発明で発現・精製されたもの）を入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１：１０００で希釈されたＨＲＰで標識された二次抗体（金斯瑞生物科技有限公司、Ｍ０００９１）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ呈色基質（ＫＰＬ，５２－００－０３）を入れ、室温で５～１０ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ／孔の１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させ、ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５１１１９２００）によって４５０ｎｍにおいて吸収値を読み取り、ＯＤ値からＩＣ５０を計算した。
ビオチンで標識されたキットはＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２で、東仁化学科技（上海）有限公司から購入され、カタログ番号はＬＫ０３である。操作方法は説明書に従って行われ、標識された抗体はＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）マイクロプレートリーダーによって濃度を検出して使用された。
実施例４：抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体の発見
本発明の抗ヒトＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は、実施例１で得られたヒトＣＬＤＮ１８．２高発現細胞株（ｈＣＬＤＮ１８．２＋ ｃｅｌｌ）でマウスを免疫させ、免疫マウスの脾臓を採取してハイブリドーマ融合を行い、数百万株のハイブリドーマクローンからスクリーニングして最適化して得られた。
実験用マウスは雌で、４週齢である（ＳＪＬは北京ＶＩＴＡＬ ＲＩＶＥＲ実験動物技術有限公司から購入され、動物生産許可証番号：ＳＣＸＫ（京）２０１６－００１１で、Ｂａｌｂ／ｃは上海ＳＩＰＰＲ－ＢＫ実験動物有限公司から購入された）。マウスは購入された後、実験室の環境において１週間飼育し、昼夜で明暗の周期を調節し、温度は２０～２５℃で、湿度は４０～６０％であった。マウスを３匹／群／籠で分けた。
実施例１で構築されたヒトＣＬＤＮ１８．２高発現細胞株（ｈＣＬＤＮ１８．２＋ｃｅｌｌ、ヒトＣＬＤＮ１８．２＋細胞）を培養し、トリプシンで消化した後、ＤＭＥＭ培地（源培生物、Ｃａｔ＃Ｌ３１０ＫＪ）で洗浄した後、ＤＭＥＭ培地に再懸濁させた。１００μｌ／１×１０７細胞／匹で、免疫マウスに腹腔内注射した。１回目の免疫の時、Ｔｉｔｅｒｍａｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ２６８４）で１：１で細胞と均一に混合して免疫させた。その後、週に１回で、１０回免疫させた後、実施例２のＥＬＩＳＡ方法によって、ヒトＣＬＤＮ１８．１＋細胞及びヒトＣＬＤＮ１８．２＋細胞を同時にプレートに敷き、又は上記実施例３における組み換えて発現されたヒトＣＬＤＮ１８．２細胞外（ＥＣＬ１）タンパク質をプレートに敷き、免疫マウスの血清力価を検出し、ヒトＣＬＤＮ１８．１＋細胞をプレートに敷いた場合のＥＬＩＳＡ値を背景とし、マウス血清の免疫力価（ｔｉｔｅｒ）を計算した。１２～１５回免疫させた後、血清力価が高くて且つ力価がプラトー期にあるマウスを選んで脾臓細胞の融合を行い、融合前に２００μｌ／２×１０７細胞／匹でマウスを刺激免疫し、３日後、マウス脾臓のリンパ球を取って骨髄腫細胞Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－８２８７（商標））と融合して得られたハイブリドーマ細胞を９６ウェルプレートに敷いた。
９６ウェルプレートにおけるハイブリドーマ細胞の上清を取ってヒトＣＬＤＮ１８．１＋細胞及びヒトＣＬＤＮ１８．２＋細胞をプレートに敷き、ハイブリドーマから生じた抗
体の結合の様子を検出した。表１ａは一部のハイブリドーマ上清の検出結果である。
ヒトのＣＬＤＮ１８．２及びＣＬＤＮ１８．１は９２％と高い相同性があり（２４０／２６１）、且つ当該タンパク質は膜貫通タンパク質であり、少数のペプチド断片が細胞外で（例えば５１アミノ酸のＥＣＬ１）、免疫原性が非常に低く、特異性抗体が生成する可能性が非常に低い。そのため、上記スクリーニングにおいて、ＣＬＤＮ１８を分泌・認識できるハイブリドーマは少なく、そしてごく一部のハイブリドーマにおいて、大多数のハイブリドーマ上清における抗体が同時にヒトＣＬＤＮ１８．２及びＣＬＤＮ１８．１に結合できる抗体である。
意外なことに、本発明では、分泌される上清がヒトＣＬＤＮ１８．２＋細胞のみに結合し、ヒトＣＬＤＮ１８．１＋細胞に結合しないハイブリドーマが見出され、表１ａにおけるｍａｂ５を参照し、クローン番号はＣ１３Ｃ１である。表１ａのデータから分かるように、同じスクリーニング条件において、当該クローンの上清はヒトＣＬＤＮ１８．２＋細胞のみに結合し、検出値は１．４１であり、一方、ヒトＣＬＤＮ１８．１＋細胞にほとんど結合せず、結合活性の読み取り値はわずか０．０９であった。
さらに、本発明で意外に見出された当該ハイブリドーマ細胞株Ｃ１３Ｃ１が独特な抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体を分泌することに対して確認した。Ｃ１３Ｃ１ハイブリドーマ細胞に対して有限な希釈を数回行い、鋭意に精密に最適化して毎回の希釈後の単一クローンをスクリーニングし、最終的に独特な抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体を分泌できるモノクローナル細胞株を見つけたが、結果は表１ｂに示す。
表１ｂの結果から分かるように、本発明で得られた初期ハイブリドーマクローンＣ１３Ｃ１から精密に最適化・スクリーニングによって得られたモノクローナル細胞株Ｃ１３Ｃ１Ｆ１Ｄ３Ｇ６及びＣ１３Ｃ１Ｆ１Ｄ３Ｈ５によって分泌される抗体はいずれもヒトＣＬＤＮ１８．２細胞と結合する特徴が残り、読み取り値はそれぞれ０．８８９５及び０．８７７８であった。一方、ヒトＣＬＤＮ１８．１細胞と結合せず、読み取り値はそれぞれ０．０８５９及び０．０７５６であった。当該読み取り値は今回のＥＬＩＳＡのバックグラウンドの０．０８１に近かった。初期ハイブリドーマクローンＦ２Ａ４も同時にスクリーニングしてモノクローナル細胞株Ｆ２Ａ４Ｆ６Ｆ３Ｅ４及びＦ２Ａ４Ｆ６Ｆ３Ｈ７を得た。これらのモノクローナル細胞株は予想通りに、ヒトＣＬＤＮ１８．２細胞、ヒトＣＬＤＮ１８．１細胞に同じ結合活性があったが、データは表１ｂに示す。これらの結果から、本発明で発見されたモノクローナル細胞株、例えばＣ１３Ｃ１Ｆ１Ｄ３Ｇ６は、独特な抗体を分泌し、意外に、分泌される抗体はヒトＣＬＤＮ１８．２のみに結合し、ヒトＣＬＤＮ１８．１に結合しないことが分かる。
これは、本発明で意外に発見された抗体が有効にヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質のみを認識し、モノクローナル抗体として腫瘍、特にヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質が過剰発現される、膵臓腺癌、胃癌、食道癌、肺癌などを含むが、これらに限定されない癌患者を治療する潜在的な能力を有する。ヒトＣＬＤＮ１８．１に全然結合しないことから、治療性抗体がヒトＣＬＤＮ１８．１などのタンパク質に非特異的に結合して毒性・副作用につながることが避けられると予想される。
実施例５：本発明のマウス由来抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体のスクリーニング・同定
上記実施例で得られたハイブリドーマのモノクローナル細胞株Ｃ１３Ｃ１Ｆ１Ｄ３Ｇ６（表１ｂ）から当該細胞株によって分泌される抗体配列を抽出し、本発明のマウス由来抗体ｍａｂ５ｂ配列を得た。ハイブリドーマの好適なモノクローナル細胞株から抗体配列を抽出する過程は当業者に熟知でよく使用される方法である。
具体的に、本発明は上記実施例で発見されたハイブリドーマのモノクローナル細胞Ｃ１３Ｃ１Ｆ１Ｄ３Ｇ６を増幅培養し、１×１０６個の細胞を収集し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１５５９６－０１８）でＲＮＡを抽出し（キットの説明書の手順に従う）、抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、逆転写キットは生工生物技術（上海）股フン有限公司から購入され、Ｃａｔ＃Ｂ５３２４３５であった。逆転写で得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ増幅を行った後、増幅産物をシークエンシングしてｍａｂ５ｂの抗体の軽・重鎖可変領域の配列を得た。使用されたプライマーはＮｏｖａｇｅｎによって発表されたマニュアルを参照する（ＴＢ３２６ Ｒｅｖ．Ｃ０３０８）。
本発明の好適なハイブリドーマモノクローナル細胞株Ｃ１３Ｃ１Ｆ１Ｄ３Ｇ６から抗ヒトＣＬＤＮ１８．２（ａｎｔｉ－ｈＣＬＤＮ１８．２）モノクローナル抗体の軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号５）及び重鎖のヌクレオチド配列（配列番号６）を得た。
上記軽鎖の塩基配列から翻訳して得られた本発明で発見されたハイブリドーマモノクローナル細胞株から抽出されたマウス由来抗ヒトＣＬＤＮ１８．２（ａｎｔｉ－ｈＣＬＤＮ１８．２）モノクローナル抗体ｍａｂ５ｂの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＫＫ（配列番号７）
上記重鎖の塩基配列から得られた本発明で発見されたハイブリドーマモノクローナル細胞株から抽出されたマウス由来抗ヒトＣＬＤＮ１８．２（ａｎｔｉ－ｈＣＬＤＮ１８．２）モノクローナル抗体ｍａｂ５ｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである。
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＩＧＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＮＹＬＩＥＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＬＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＤＤＳＡＶＹＦＣＡＲＶＹＹＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号８）
本発明で発見されたハイブリドーマモノクローナル細胞株から抽出された上記抗体ｍａｂ５ｂは、実施例３に記載の方法によって抗体の軽・重鎖の可変領域及び定常領域をそれぞれクローニングして（配列は以下の通りである）組み換えて発現させ、精製した後、対照抗体Ｒｅｆとともに、ヒトｈＣＬＤＮ１８．１、ｈＣＬＤＮ１８．２、マウスｍＣＬＤＮ１８．１及びｍＣＬＤＮ１８．２との結合活性を検出し、結果は下記表２ａ、表２ｂ及び図１に示す。
本発明の抗ｈＣＬＤＮ１８．２抗体ｍａｂ５ｂ軽鎖（Ｌ Ｃｈａｉｎ）は配列番号９で示され、重鎖（Ｈ Ｃｈａｉｎ）は配列番号１０で示される。
表２ａ、図１ａの結果から、本発明で発見された抗ｈＣＬＤＮ１８．２マウス由来抗体ｍａｂ５ｂ及び対照抗体（Ｒｅｆ）はいずれもｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞に結合せず、ＥＣ５０が検出されず（ＮＤ）、２００ｎＭという高濃度の場合でも結合活性が検出されず、結合値Ｅｍａｘ（サンプルの濃度が上がって結合がプラトーに達した時の結合値、即ち、最大特異的結合数値）がまだバックグラウンド、即ち、背景値であったことが分かる。一方、２つの抗体はいずれもｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞に良い結合活性があった。意外なことに、本発明の抗体ｍａｂ５ｂの結合活性はＲｅｆよりも１倍以上優れた（ＥＣ５０：０．１１５ ｎＭ ｖｓ ０．２４９ ｎＭ）。より意外なことに、ｍａｂ５ｂで得られる最大結合数値ＥｍａｘがＲｅｆよりも３６％以上高かった［（１．９２－１．４１）／１．４１］。
表２ｂ、図１ｂの結果から、本発明で発見された抗ｈＣＬＤＮ１８．２マウス由来抗体ｍａｂ５ｂ及び対照抗体（Ｒｅｆ）はいずれもマウスＣＬＤＮ１８．１＋細胞に結合せず、ＥＣ５０が検出されず（ＮＤ）、２００ｎＭという高濃度の場合でも結合活性が検出されず、結合値Ｅｍａｘがまだバックグラウンド、即ち、背景値であったことが分かる。一方、２つの抗体はいずれもマウスＣＬＤＮ１８．２＋細胞に良い結合活性があった。意外なことに、本発明の抗体ｍａｂ５ｂの結合活性はＲｅｆよりも４倍以上優れた（ＥＣ５０
：０．１８２ｎＭ ｖｓ １．０４ｎＭ）。より意外なことに、ｍａｂ５ｂで得られる最大結合数値ＥｍａｘがＲｅｆよりも１倍以上高かった［２．２１ ｖｓ １．０］。
上記結果から、本発明で発見された新規な分子ｍａｂ５ｂは結合活性（ＥＣ５０及びＥｍａｘ）が対照分子よりも良かったことが分かる。そして、ｈＣＬＤＮ１８．１及びｍＣＬＤＮ１８．１のいずれにも結合活性がなかったことから、ｍａｂ５ｂは結合活性がより良いのみならず、特異性も非常に優れたことが示された。これはｍａｂ５ｂを腫瘍治療製品の開発に使用するとより良い治療効果及び安全性という優勢を提供することを示す。そして、マウスＣＬＤＮ１８．２にもより良く結合し、マウスにおいて臨床前研究を行うのにより便利な非霊長類動物の選択を提供する。
実施例６： 本発明の抗体ｍａｂ５ｂのヒト化
本発明で発見された抗体ｍａｂ５ｂは活性がＲｅｆよりも良いことから、当該抗体は腫瘍治療薬の開発に有用であることが示された。薬物開発の過程における免疫原性などの面のリスクを減少するために、例えばマウス由来抗体からヒト化し、そしてヒト化を最適化した後、分子の特性が薬物開発に有利で、本発明では、ｍａｂ５ｂに対してヒト化の選別、及び配列の最適化が行われた。具体的な過程は下記の通りである。
抗体のＣＤＲの定義は本分野で多くの様々な方法があり、これらのＣＤＲを表示する方法は下記表３にまとめた。
上記実施例５で得られたマウス由来抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体ｍａｂ５ｂは表３の様々な定義方法により、そのＣＤＲ配列は以下のように表示／注釈される。
本発明の抗ｈＣＬＤＮ１８．２抗体（ｍａｂ５ｂ）の上記ＣＤＲ分析は、抗体表示システムにより、抗体の軽・重鎖のＣＤＲ領域（上記のように）を表示・認識した上で、マウス由来抗体ｍａｂ５ｂの軽・重鎖可変領域の配列をそれぞれヒト抗体のデータベース（ｖ－ｂａｓｅ）と比較し、相同性の高いヒト抗体の軽・重鎖の株を見つけ、それに基づき、コンピューターでモデルを構築し、抗体の構造における抗原との結合に影響しうる部位をシミュレートし、重要な部位及び組み合わせを復帰突然変異させ、活性が好適なヒト化抗体分子をスクリーニングした。
具体的に、配列の相同性の比較分析により、ｍａｂ５ｂ軽鎖との相同性が良いヒト抗体株は、ＩＧＫＶ４－１＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ２－２８＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ２Ｄ－２８＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ１－２７＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ１－３９＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ１Ｄ－３９＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ２－４０＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ２Ｄ－２９＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ２Ｄ－４０＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ３－１５＊０１（Ｆ）を含む。さらに比較、分析したところ、ヒト抗体株の軽鎖ＩＧＫＶ４－１＊０１（Ｆ）が好ましい。特に、選ばれたヒト抗体株の軽鎖ＩＧＫＶ４－１＊０１（Ｆ）のＣＤＲ２配列はＷＡＳＴＲＥＳであり、本発明で発見されたマウス由来抗体ｍａｂ５ｂの軽鎖ＣＤＲ２配列と完全に一致している。配列アラインメントによってｍａｂ５ｂの軽鎖Ｊ遺伝子領域はヒト抗体株ｈＪＫ１、ｈＪＫ２．１、ｈＪＫ２．２、ｈＪＫ２．３、ｈＪＫ２．４と相同性が高いことが分かり、さらに比較、分析したところ、好適にｈＪＫ２．１をｍａｂ５ｂ軽鎖のヒト化ヒト抗体株のＪ領域に使用し、ヒト化の設計、スクリーニング及び配列の最適化を行った。
配列の相同性の比較分析により、ｍａｂ５ｂ重鎖との相同性が良いヒト抗体株は、ＩＧＨＶ１－６９＊０２（Ｆ）、ＩＧＨＶ１－６９＊０６（Ｆ）、ＩＧＨＶ１－６９＊０８（Ｆ）、ＩＧＨＶ１－６９＊０９（Ｆ）、ＩＧＨＶ１－６９＊１０（Ｆ）、ＩＧＨＶ１－６９＊０４（Ｆ）、ＩＧＨＶ１－６９＊１４（Ｆ）、ＩＧＨＶ１／ＯＲ１５－２＊０２（Ｐ）、ＩＧＨＶ１－６９＊０１（Ｆ）、ＩＧＨＶ１－６９＊１１（Ｆ）を含み、さらに比較し、分析したところ、好適にヒト抗体株の重鎖ＩＧＫＶ１－６９＊０１（Ｆ）配列を本発明の抗体のヒト化に使用した。配列アラインメントによってｍａｂ５ｂの重鎖Ｊ遺伝子領域はヒト抗体株の重鎖Ｊ遺伝子ｈＪｈ４．１、ｈＪｈ４．２、ｈＪｈ４．３、ｈＪｈ１、ｈＪｈ２、ｈＪｈ３．１、ｈＪｈ３．２と相同性が高いことが分かり、さらに比較し、分析したところ、好適にｈＪｈ４．１を本発明のｍａｂ５ｂ重鎖のヒト化ヒト抗体株のＪ領域に使用し、ヒト化の設計、スクリーニング及び配列の最適化を行った。
本発明の抗体ｍａｂ５ｂのＣＤＲ領域（上記ＣＤＲの定義を参照する）を、選ばれたヒト化軽・重鎖のヒト抗体株の鋳型に移植し、さらにＩｇＧ軽・重鎖定常領域と組み換えた。その後、マウス由来抗体の３次元構造を元に、残基を包埋し、ＣＤＲ領域と直接に相互作用がある残基、及びＶＬとＶＨの配座に大きく影響する残基に対して復帰突然変異を行い、これらの突然変異及び突然変異の組み合わせをスクリーニングし、抗体活性に対する影響を考慮し、そしてＣＤＲ領域の化学的不安定なアミノ酸残基を最適化し、構造、活性などが最適化された抗体分子配列、即ち、本発明の抗ヒトＣＬＤＮ１８．２マウス由来抗体ｍａｂ５ｂのヒト化系列の最適化抗体分子を得た。
具体的に、本発明の抗体ｍａｂ５ｂの軽鎖を分析したところ、ＣＤＲ１（Ｌ２４－Ｌ３４位）及びＣＤＲ２（Ｌ５０－Ｌ５６位）の配列は本発明のヒト化の好適なヒト軽鎖ＩＧＫＶ４－１＊０１（Ｆ）の配列と相同性が高いことが分かった。中では、Ｌ２４～Ｌ３４のＣＤＲ１は５つのアミノ酸しか異ならず、それぞれＬ２９、Ｌ３０Ａ、Ｌ３０Ｃ、Ｌ３０Ｅ及びＬ３４位であり、下記表９ａに示された。一方、Ｌ５０～Ｌ５６位のＣＤＲ２は
完全に一致している（下記表９ｂに示された）。本発明では、まず、ｍａｂ５ｂのＣＤＲ１の５つの部位（Ｌ２９、Ｌ３０Ａ、Ｌ３０Ｃ、Ｌ３０Ｅ及びＬ３４位）に対して復帰突然変異を行って、ヒトＩＧＫＶ４－１＊０１（Ｆ）の相応する部位のアミノ酸にし、組み合わせの設計は下記表９ａに示された。
上記ヒト化設計分子Ｖａｒ１、Ｖａｒ２、Ｖａｒ３、Ｖａｒ４、Ｖａｒ５、Ｖａｒ６、Ｖａｒ７、Ｖａｒ８及びｍａｂ５ｂを前記実施例３のようにクローニングし、発現し、精製して、実施例２のようにヒトＣＬＤＮ１８．２＋細胞との結合活性を検出し、結果は下記表１０に示された。
上記結果から、本発明の抗体ｍａｂ５ｂの軽鎖ＣＤＲ１のヒト化最適化配列はいずれもｍａｂ５ｂと同じ（近い）結合活性が残ったことが分かる。
さらに、上記ヒト化方法を利用し、ｍａｂ５ｂに対してヒト化設計を行い、好適に本発明のｍａｂ５ｂ抗体のヒト化軽鎖可変領域の好適な配列は以下の通りである。
Ｌ１４：ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫ ＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２９）
Ｌ１１：配列番号３０；
Ｌ１２：ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫ ＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３１）
Ｌ１３：配列番号３２；
Ｌ１５：ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫ ＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３３）
上記方法によって得られた本発明のヒト化重鎖可変領域の好適な配列は以下の通りである。
Ｈ５１：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＮＹＬＩＥＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧ ＬＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＹＹＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３４）
Ｈ５２：配列番号３５；Ｈ５３：配列番号３６；
Ｈ５４：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＮＹＬＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭ ＧＬＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＹＹＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３７）
挙げられたＬ１４、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１５及び挙げられていない前記任意の配列を含む上記軽鎖可変領域の配列をヒト抗体軽鎖のκ型又はλ型の軽鎖定常領域と組み合わせて本発明のヒト化抗体の軽鎖の配列を得た。挙げられたＨ５１、Ｈ５２、Ｈ５３、Ｌ５４及び挙げられていない前記重鎖可変領域の配列を含む上記重鎖可変領域の配列をｈＩｇＧ１、２、３、４などの異なるサブタイプの定常領域と組み合わせて本発明のヒト化抗体の重鎖の配列を得た。前記軽鎖、重鎖を任意に組み合わせて本発明のヒト化抗体を得たが、一部のヒト化抗体の配列を下記表１１に示された。
ヒト化Ａｂ１０抗体のアミノ酸配列：
軽鎖：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号３８）
重鎖：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＮＹＬＩＥＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＹＹＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹ
ＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３９）
ヒト化Ａｂ７抗体のアミノ酸配列の軽鎖：配列番号４０；重鎖：配列番号３９；
ヒト化Ａｂ８抗体のアミノ酸配列の軽鎖：配列番号３８；重鎖：配列番号４１；
ヒト化Ａｂ９抗体のアミノ酸配列の軽鎖：配列番号４０；重鎖：配列番号４１；
ヒト化Ａｂ６抗体のアミノ酸配列の軽鎖：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４２）
重鎖：配列番号３９；
ヒト化Ａｂ１１抗体のアミノ酸配列の軽鎖：配列番号４２；重鎖：配列番号４３；
ヒト化Ａｂ１２抗体のアミノ酸配列の軽鎖：配列番号４２；重鎖：配列番号４４；
ヒト化Ａｂ１３抗体のアミノ酸配列の軽鎖：配列番号４５；重鎖：配列番号４３；
ヒト化Ａｂ１４抗体のアミノ酸配列の軽鎖：配列番号４５；重鎖：配列番号４４；
ヒト化Ａｂ１５抗体のアミノ酸配列の軽鎖：配列番号４５；重鎖：配列番号３９；
本発明の前記実施例３の方法によってクローニングし、組み換え抗体を発現させて精製し、実施例２の前記ＥＬＩＳＡ方法によって上記ヒト化抗体及びｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞、ｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞との結合活性を検出してスクリーニングしたが、結果は下記表１２及び図２ａに示された。
表１２の結果から、本発明で発見された抗体ｍａｂ５ｂがヒト化した後、マウス由来抗体は結合活性が対照抗体Ｒｅｆよりも高いという利点が残り、ヒト化抗体Ａｂ１０のＥＣ５０がＲｅｆより２倍も良かった（０．１１７ ｖｓ ０．３４５）ことが分かる。そして、これらの最適化されたヒト化分子は結合最高値Ｅｍａｘが対照抗体Ｒｅｆよりも３９．８％～５４．１％高かった。マウス由来抗体ｍａｂ５ｂと比べ、より対照抗体よりも優れた。
さらに本発明のヒト化分子を最適化するために、好ましくは最終の配列がヒト抗体株の軽・重鎖となるべく一致するようにし、マウス由来抗体における少量の配列によってなりうる免疫原性を減少し、好適にヒト化最適化軽鎖ＣＤＲ１配列Ｖａｒ３（表９を参照）で一連のヒト化抗体を設計し、そして特異的結合活性のスクリーニングを行った。結果は下記表１３及び図２ｂに示された。
上記結果から、本発明のさらに最適化されたヒト化抗体（表１３及び図２ｂ）のうち、これらのヒト化抗体の復帰突然変異のアミノ酸の数が異なり、Ａｂ１～Ａｂ２０を含む（表１１を参照）ことが分かる。その中で、６個の復帰突然変異のもの、例えばＡｂ１０（軽鎖１個、重鎖５個）、６個の復帰突然変異で、且つ軽鎖ＣＤＲ１のヒト化最適化されたもの、例えばＡｂ６（軽鎖１個、重鎖５個）、２個の復帰突然変異のもの、例えばＡｂ１４（軽鎖０個、重鎖２個）、１個のみの復帰突然変異のもの、例えばＡｂ１１（軽鎖１個、重鎖０個）、及び完全に復帰突然変異のないもの、例えばＡｂ１３がある。これらの最適化されたヒト化分子の活性は、ＥＣ５０及びＥｍａｘ活性を含め、いずれもＡｂ１０（表１２における既に最適化されたｍａｂ５ｂヒト化分子）と同等のレベルが残り、且ついずれもｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞に結合しない。
特に意外に発見されたＡｂ１３抗体分子は何らの復帰突然変異がなく、全ヒト化の抗体分子で、且つＣＤＲ１配列がヒト化最適化され、その結合活性（ＥＣ５０及びＥｍａｘ）がＡｂ６、Ａｂ１０と同様であった。
上記結果から、本発明のマウス由来抗体ｍａｂ５ｂ配列がヒト化を経て最適化スクリーニングされた抗体分子、ヒト化のはＦＲ領域のみで、軽鎖ＣＤＲ１が野生型のままで（突然変異がない）、例えばＡｂ１０、又はＦＲ領域以外、軽鎖ＣＤＲ１もヒト化最適化された配列Ｖａｒ３であり、得られたＡｂ６、Ａｂ１１－１５などは、いずれもその結合活性
を維持し、且ついずれも対照分子よりも優れ、ＥＣ５０が対照分子よりも１倍強く、Ｅｍａｘが対照分子よりも３０％～５０％高く、そしていずれもｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞に結合しないことが分かる。
実施例７：本発明の抗体配列の脱アミド（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）感受性部位の配列最適化
本発明のｍａｂ５ｂ配列及びヒト化後の最適化配列（上記表９ａ、９ｂ、１１）に対してコンピューターによる構造のシミュレーション解析を行い、可能な、特に抗体の集合、アスパラギン脱アミド（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）の感受性部位（ＮＧ、ＮＳ、ＮＨなど）、アスパラギン酸異性化（ＤＧ、ＤＰ）の感受性部位、Ｎグリコシル化（Ｎ－｛Ｐ｝Ｓ／Ｔ）の感受性部位及び酸化の感受性部位を含むＣＤＲ領域の翻訳後修飾（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＰＴＭ）の部位を分析したところ、本発明の抗体は軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ１，Ｌ Ｃｈａｉｎ）の第Ｌ３０Ａ、Ｌ３０Ｂ位がＮＳであり、重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ３，Ｈ Ｃｈａｉｎ）の第Ｈ９９、Ｈ１００がＮＳであり、そのＬ３０Ａ位、Ｈ９９位のアスパラギン（Ｎ）が脱アミドに敏感な可能性があることが分かった。本発明の抗体を薬物製剤に使用する場合の抗体分子の薬らしさの関連リスクを低下させるために、この２つの可能な感受性部位に対して配列最適化を行った。具体的に、本発明の抗体の軽鎖ＣＤＲ１のＬ３０Ａ、Ｌ３０Ｂ位（ＮＳ）、重鎖ＣＤＲ３のＨ９９、Ｈ１００位（ＮＳ）の部位に対して突然変異させ、好適な方案は以下の通りである。
上記最適化された脱アミド感受性部位の最適化設計後の配列を異なる軽・重鎖の組み合わせで抗体を発現させた後、さらに結合活性でスクリーニングした。前記抗体の組み合わせの一部を下記表に示す。
上記好適な抗体を実施例３の方法によって発現させ、精製した後、実施例２の方法によってヒトＣＬＤＮ１８．２＋細胞との結合活性を検出したが、結果を表１６ａ、１６ｂ及び表１６ｃに示された。
表１６ａの結果から、Ａｂ２１（軽鎖 ＣＤＲ１ ＮＳ－＞ＴＳ及び重鎖 ＣＤＲ３ ＮＳ－＞ ＴＳ）は結合活性が「ほとんどない」ことが分かった（＞１６ｎＭ）。Ａｂ２３（軽鎖 ＣＤＲ１ ＮＳ－＞ＮＴ、重鎖 ＣＤＲ３ ＮＳ－＞ ＴＳ）も結合活性が「ほとんどない」ことが分かった（＞４０ｎＭ）。Ａｂ２２（軽鎖ＣＤＲ１ ＮＳ－＞ ＴＳ、重鎖ＣＤＲ３ ＮＳ－＞ ＮＴ）は結合活性がやや低下するが、完全になくならないことが分かった（ＥＣ５０＝１．３７ｎＭ ｖｓ Ａｂ１４ ＥＣ５０ ＝０．３５）。つまり、軽鎖ＣＤＲ１のＬ３０Ａ位はＮ－＞Ｔであるが、重鎖ＣＤＲ３のＨ９９位Ｎが突然変異しておらず、抗体の結合活性が「ほとんどない」から１．３７ｎＭに回復し、正常Ａｂ１４よりも３倍近く減少した。一方、Ａｂ５６（軽鎖ＣＤＲ１ ＮＳ－＞ＮＴ、重鎖ＣＤＲ３ ＮＳ－＞ＮＴ）は結合活性が正常分子Ａｂ１４と同様で、そのＥＣ５０＝０．２９５ｎＭであった。
表１６ａを合わせると、本発明の抗体の軽鎖ＣＤＲ１のＬ３０Ａ位Ｎ及び重鎖ＣＤＲ３のＨ９９位Ｎは本発明の抗体の結合に非常に重要であり、これらの部位の突然変異（例えばＴへの変異）が直接に活性の消失又は完全な無活性につながることが分かった。しかし、軽鎖のＬ３０Ｂ位Ｓ及び重鎖ＣＤＲ３のＨ１００位ＳのＴへの突然変異は結合活性に影響がない。
表１６ｂのデータから、単独の軽鎖のＬ３０Ｂ位ＳのＴへの突然変異、又は単独の重鎖ＣＤＲ３のＨ１００位ＳのＴへの突然変異は結合活性に影響がないことがさらに証明された。
非常に意外なことに、表１６ｂのデータから、Ａｂ３０（重鎖ＣＤＲ３、ＮＳ－＞ＮＴ）は、完全に結合活性を失った（ＥＣ５０＞１１ｎＭ、即ち、実際に結合曲線が既に陰性対照と同様になり、抗原との特異的結合作用がなくなった）が、Ａｂ３４は同じ重鎖（ＣＤＲ３、ＮＳ－＞ＮＴ）を含むが、活性を失っていなかったことが分かった。これは、Ａｂ３０の活性消失はＣＤＲ３ではなく、ＮＳ－＞ＮＴの変化によるものであることが示された。この２つの分子の唯一の違いは軽鎖ＣＤＲ１の違い、即ち、Ａｂ３０は軽鎖がＬ１４であり、そのＣＤＲ１がＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号１１）であり、Ａｂ３４は軽鎖がＬ１２であり、そのＣＤＲ１がＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＮＫＮＹＬＡ（配列番号１２）であるため、下線部分が２つのＣＤＲ１配列の違いである。この意外な発見から、重鎖ＣＤＲ３のＨ１００位ＳがＴへ突然変異した（脱アミドの可能性を避けるために）場合、軽鎖のＣＤＲ１配列はＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＮＫＮＹＬＡでなければならない（配列番号１２、即ち、ＣＤＲ１配列が最適化されたＶａｒ３、表９ａを参照）ことが示された。軽鎖ＣＤＲ１がＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴである（配列番号１１、下線部分が２つのＣＤＲ１配列の違いである）場合、抗体分子全体が完全に結合活性を失った（Ａｂ３０）。この発見から、本発明の抗体のＣＤＲ１はＬ３０Ｅ位がＱで且つＬ３４位がＴである場合（下線で示された）、重鎖Ｈ１００位ＳがＴへの脱アミドの可能性を避けるために、重鎖のＨ１００位Ｓは突然変異してはならず、そうでなければ、抗体分子全体が結合活性を失うことが示された。
さらに本発明の抗体の軽鎖ＣＤＲ１配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号１１、Ｌ３０Ｅ位Ｑ及びＬ３４位Ｔ）及びヒト化最適化されたＣＤＲ１配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＮＫＮＹＬＡ（配列番号１２、Ｌ３０Ｅ位Ｎ和Ｌ３４位Ａ）の違いによる本発明の抗体の軽鎖ＣＤＲ１及び重鎖ＣＤＲ３におけるＮＳ突然変異（脱アミドの可能性を避けるため）への影響を確認するために、Ａｂ１０（ＣＤＲ１：ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ、配列番号１１）とＡｂ６（ＣＤＲ１：ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＮＫＮＹＬＡ、配列番号１２）を比較したところ、この２つの分子の唯一の違いはその軽鎖ＣＤＲ１にある（下線のアミノ酸は両者の違いである）。そして、この２つの分子の軽鎖ＣＤＲ１及び重鎖ＣＤＲ３に同時にＮＴ－＞ＮＳの突然変異を行ったところ、Ａｂ３５、Ａｂ３６の２つの抗体を得た。表１６ｃの結果から、Ａｂ３５は完全に結合活性を失った（ＥＣ５０＞６２ｎＭ）ことが分かる。
このデータから、本発明で発見された軽鎖ＣＤＲ１配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＮＫＮＹＬＡ（配列番号１２）のＬ３０Ｅ位がＮで且つＬ３４位がＡで（下線で示された）あり、即ち、ＣＤＲ１のヒト化最適化された配列が軽鎖ＣＤＲ１のＬ３０Ｂ位Ｓ（斜体）に影響がないこと、及び／又は重鎖のＨ１００位Ｓに脱アミドの可能性を避けるために、突然変異（例えば、Ｌ３０Ｂ位ＳのＴへの突然変異及び／又はＨ１００位ＳのＴへの突然変異）を行ったことが確認された。
ＣＤＲ１配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号１１）のＬ３０Ｅ位がＱで且つＬ３４位がＴである（下線で示された）場合、ＣＤＲ１のＬ３０Ｂ位Ｓ（斜体）又
は重鎖のＨ１００位Ｓのいずれも突然変異してはならず（例えば、Ｌ３０Ｂ位ＳのＴへの突然変異又はＨ１００位ＳのＴへの突然変異）、何らのこのような突然変異でも抗体の結合活性がなくなる。
上記結果をまとめると、本発明の抗体の軽鎖ＣＤＲ１のＬ３０Ａ、Ｌ３０Ｂ位ＮＳ、重鎖ＣＤＲ３のＨ９９、Ｈ１００位ＮＳはＮＳ－＞ＮＴという最適化突然変異によって脱アミノ化のリスクを低下させることができるが、ＣＤＲ１のＬ３０Ｅ位がＮで、Ｌ３４位がＡである（即ち、配列はヒト化最適化された配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＮＫＮＹＬＡ、配列番号１２）場合しかできず、当該領域の配列がＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号１１）である場合、抗体は完全に活性を失う（下線部分は両者の配列の違いである）ことが分かる。
実施例８： 本発明の抗体のＦｃ配列（バリアント）の活性分析
本発明の抗体の可変領域と実施例３で挙げられたヒト抗体の異なる軽鎖（κ、λ型軽鎖など）、重鎖定常領域（ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ４、ｈＩｇＧ１）を含むが、これらに限定されない、ヒト抗体の異なる軽・重鎖定常領域の組み合わせ、特にヒトのＩｇＧ１Ｆｃ配列のバリアント、例えば３５６－３５８位がＤＥＬ又はＥＥＭである異なる形態から、異なる抗体のバリアント形態が得られる。表１７に一部の本発明の抗体及びＦｃ配列のバリアント形態を示すが、Ｆｃ領域配列の３５６－３５８位がＤＥＬ又はＥＥＭであるものを含む。
前記Ａｂ４２抗体のアミノ酸配列は以下のとおりである。
軽鎖：配列番号３８；重鎖：配列番号４６。
上記好適な抗体を実施例３の方法によって発現させ、精製した後、実施例２の方法によってヒトＣＬＤＮ１８．２＋細胞との結合活性を検出したが、代表的なデータを下記表１
８に示す。結果から、軽・重鎖定常領域の上記変化は、ｈＩｇＧ１の３５６～３５８位がそれぞれＤＥＬ又はＥＥＭであるものを含み、本発明の抗体の活性に影響しないことが分かる。
実施例９： 本発明の抗体のＦｃ領域（ヒトＩｇＧ１）のＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性に対する配列の最適化
本発明の抗体の特異的にヒトＣＬＤＮ１８．２に結合して腫瘍治療に使用する作用機序の一つは、抗体Ｆｃによって腫瘍細胞に対するエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）の殺傷を仲介することで、腫瘍を治療する目的を果たす。本発明の抗体におけるヒトＦｃ領域（ｈＩｇＧ１ Ｆｃ）はエフェクター細胞のＡＤＣＣ及びＣＤＣ作用を仲介し、特異的に腫瘍細胞を標的とする作用を増強することができるが、非特異的標的では、標的以外の副作用につながる。ヒト抗体Ｆｃ領域（ｈＩｇＧ１ Ｆｃ）が仲介するＡＤＣＣ及びＣＤＣ作用について、多くの研究がある。本発明では、発見された抗体分子のＦｃ領域のヒト血細胞に対するエフェクター作用（ＡＤＣＣ及びＣＤＣ）が確認された。具体的に、本発明の抗体におけるヒト抗体Ｆｃ領域（ｈＩｇＧ１ Ｆｃ）に異なる突然変異をさせ、これらの突然変異体のＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を評価したが、突然変異の設計は表１９に示され、活性のデータは表２０ａ、２０ｂに示された。
上記好適な抗体は実施例３の方法によって発現させ、精製して抗体を得た後、それぞれＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）実験及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）実験を行って抗体Ｆｃ配列の最適化後の活性を検出した。具体的に、以下の通りである。
ＡＤＣＣ：
実施例１で構築されたｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞に対し、正常の培養を行った。培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ（上海源培生物科技股フン有限公司Ｃａｔ＃Ｌ３１０ＫＪ）で、本実験のＡＤＣＣ用標的細胞とした。
実験の前日に、培養されたｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を取り、５０００個／ウェルで計数して９６ウェルプレートに敷いた。実験の当日に、ＰＢＭＣ細胞（本発明では、ヒト末梢血から分離されたものであり、ヒト末梢血は当社のボランティアから提供された。）を用意し、１５００００細胞／５０μｌの濃度でＰＢＭＣを無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（培源生物、Ｃａｔ＃Ｌ２１０ＫＪ）に懸濁させた。被験薬物は無血清ＲＰＭＩ１６４０で調製され、初期濃度４０μｇ／ｍｌから３倍の比率で希釈された。
培養された標的細胞（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞）を取り出し、注意して上清を吸い取って捨て、調製されたＰＢＭＣを５０μｌ／ウェル入れた。同時に５０μｌ／ウェルで調製された異なる濃度の被験サンプルを入れ、標的細胞を３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで４時間インキュベートし、ＬＤＨを検出した。
ＬＤＨキットはＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ＬＤＨ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ－ＷＳＴで、東仁化学科技（上海）有限公司から購入され、カタログ番号はＣＫ１２である。操作方法は説明書に従って行われ、マイクロプレートを取り出し、各ウェルに１００μｌの使用液（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れ、光を避けるようにアルミホイルで包み、室温で１０～４０ｍｉｎ反応させ、ＭｕｌｔｉｓｋａｎＧＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）マイクロプレートリーダーによって４９０ｎＭにおいて数値を読み取り、１０ｍｉｎおきに１回検出し、適切な反応時間のデータを取り、Ｇｒａｐｈｐａｄｐｒｉｓｍ５によってデータを分析処理した。
ＣＤＣ：
実施例１で構築されたｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を、本実験のＣＤＣ用標的細胞とした。ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞に対して正常培養を行い、培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ（ＡＤＣＣと同様）であった。実験の前日に、標的細胞を収集し、計数し、１×１０５細胞／ｍｌで調製し、１００μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに入れた。３７℃、５％ ＣＯ２で一晩培養して使用に備えた。
実験の当日に、９６ウェルプレートの細胞から培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄して使用に備えた。被験抗体は無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０）で希釈され、抗体の初期濃度は２０μｇ／ｍｌであり、５倍で希釈された。５０μｌ／ウェルで希釈された抗体をＰＢＳで洗浄された標的細胞の培養プレートに入れ（０μｇ／ｍｌ抗体ウェル用新鮮培地を１００μｌ／ウェルで、対照ウェルとした）、各濃度に６つの重複ウェルを設けた。３７℃、５％ ＣＯ２で１５ ｍｉｎインキュベートした。
補体の用意：新鮮な血清を滅菌された遠心管に取った。半分の血清を取って５６℃の水浴鍋で３０分間インキュベートして補体を不活性化させ、陰性対照とした。不活性化させた血清及び不活性化させなかった血清を、それぞれＲＰＭＩ１６４０培地で血清を調製したが、ＲＰＭＩ１６４０培地＝４０％：６０％で、即ち、４０％は血清であり、６０％はＲＰＭＩ１６４０であった。
異なる濃度の被験抗体を含有する標的細胞培養プレートに５０μｌ／ウェルの希釈された血清を入れ、血清の最終濃度を２０％とし、サンプル（抗体）の初期濃度は１０μｇ／ｍｌであった。前の３つの重複ウェルに補体を含有する血清を、後ろの３つの重複ウェルに不活性化させた補体の血清を入れた。３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２時間インキュベートした後、取り出してＬＤＨキットによって検出した。
ＬＤＨキットはＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ＬＤＨ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ－ＷＳＴで、東仁化学科技（上海）有限公司から購入され、カタログ番号はＣＫ１２である。操作方法は説明書に従って行われ、マイクロプレートを取り出し、各ウェルに１００μｌの使用液（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れ、光を避けるようにアルミホイルで包み、室温で反応させ、１０ｍｉｎおきに１回検出し、適切な反応時間のデータを取り、ＭｕｌｔｉｓｋａｎＧＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）マイクロプレートリーダーによって４９０ｎＭにおいて数値を読み取り、Ｇｒａｐｈｐａｄｐｒｉｓｍ５によってデータを分析処理した。
結果から、本発明の抗体は、ｈＩｇＧ１の形態で、そのＦｃ領域の２４３位Ｆの単一部位の突然変異、例えばＦ２４３Ｌ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａでは、本発明の抗体のＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性が完全に失われたが、Ｆｃ領域の２３９、３３０、３３２位の３つの部位の組み合わせの突然変異、例えばＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅでは、本発明の抗体のＣＤＣ活性がやや弱くなったことが分かる。
実施例１０：本発明の抗体の異なるヒト化分子のＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性の評価
本発明のヒト化抗体分子のＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を評価するために、上記実施例と同じ方法によって、対照分子（Ｒｅｆ）とともに、本発明のヒト化分子のＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を検出したが、結果は下記表２１ａ、２１ｂ及び図３に示された。
上記結果から、本発明のヒト化抗体はＡＤＣＣ活性が対照抗体（Ｒｅｆ）に相当することが分かる（表２１ａ）。意外なことに、本発明のヒト化分子の中では、異なる復帰突然変異を含有するヒト化分子を含み、Ａｂ６、Ａｂ１３、Ａｂ１４などのＣＤＣ活性が近く（ＥＣ５０はそれぞれ０．２９３μｇ／ｍｌ、０．３７４μｇ／ｍｌ、０．２６５μｇ／ｍｌ）、且つＡｂ１０（０．６４８μｇ／ｍｌ）よりも１倍以上優れ、特に意外なことに、Ａｂ６、Ａｂ１３及びＡｂ１４などのＣＤＣ活性が対照抗体（ＥＣ５０ ＝２．３１μｇ／ｍｌ）よりも１０倍近く優れた（表２１ｂ、図３を参照する）。Ａｂ３６、Ａｂ２４もいずれもＣＤＣ活性が対照抗体Ｒｅｆよりも優れた。
Ａｂ３５（ＣＤＲ１、ＣＤＲ３ ＮＳ突然変異体、実施例７、表１６ｃを参照する）は結合活性を失ったため、ＣＤＣ活性は検出されなかった。
実施例１１：本発明の抗体による腫瘍細胞（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞）のアポトーシスの誘導活性の評価
本発明の抗体、特に好適なヒト化抗体によるｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞（腫瘍細胞）のアポトーシスの誘導作用を検出するために、本発明の実施例１で構築されたｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を利用し、本発明の抗体による腫瘍細胞のアポトーシスの誘導活性を検出した。ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞に対して正常培養を行い（培地は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥ
Ｍ／Ｆ１２で、プロバイダーは上海源培生物科技股フン有限公司で、カタログ番号はＬ３１０である）、本実験用細胞とした。実験の初めは、ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を９６ウェルプレートに２×１０４／ウェルの密度で敷いた。３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養して壁に付着させた。抗体サンプルの用意：無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの抗体サンプルを調製した。一晩付着培養されたｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を取り出し、培地を捨て、そしてＰＢＳで細胞を２回洗浄した。それぞれ用意された異なる濃度の抗体サンプルを１００μｌ／ウェル入れた。続いて２４ｈ培養した後、ＬＤＨを検出した。
ＬＤＨキットはＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ＬＤＨ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ－ＷＳＴで、東仁化学科技（上海）有限公司から購入され、カタログ番号はＣＫ１２である。操作方法は説明書に従って行われ、マイクロプレートを取り出し、各ウェルに１００μｌの使用液（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れ、光を避けるようにアルミホイルで包むなどの方法を使用し、室温で反応させ、異なる時点（１０ ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４０ｍｉｎ、５０ｍｉｎ）で、ＭｕｌｔｉｓｋａｎＧＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）マイクロプレートリーダーによって４９０ｎＭにおいて数値を読み取り、適切な反応時間を見つけ、数値を読み取ってＧｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５によってデータを分析処理した。
結果は図４ａ、図４ｂに示された。図４ａ、４ｂの結果から、本発明のヒト化抗体Ａｂ１０、Ａｂ６、Ａｂ１４、Ａｂ２４、Ａｂ３６などは、いずれも腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する活性が対照分子（Ｒｅｆ）よりも良く、活性が３～１０倍良く／強く、これらの分子は濃度１０μｇ／ｍｌでは、既に対照分子の３０μｇ／ｍｌにおける活性に相当するか、陽性分子の３０μｇ／ｍｌにおける活性よりも強いことが分かる。
具体的に、Ａｂ６は１０μｇ／ｍｌにおける腫瘍細胞のアポトーシスを増加する活性（４６．７％）が同濃度の陽性対照（１５．３％）よりも２倍以上良かった。さらに、３０μｇ／ｍｌの陽性対照（１９．６％）よりも１倍以上良かった。一方、濃度３０μｇ／ｍｌでは、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する活性（８５．１％）が同濃度における対照抗体（１９．６％）よりも３倍以上良かった。
意外なことに、Ａｂ６は１０μｇ／ｍｌにおける腫瘍細胞のアポトーシスを増加する活性（４６．７％）が同濃度のＡｂ１０（３３．２％）よりも４１％良かった。濃度３０μｇ／ｍｌでは、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する活性（８５．１％）が同濃度におけるＡｂ１０（３４．７％）よりも１倍以上強かった。
実施例１２：本発明の抗体による腫瘍細胞（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞）の増殖の抑制作用
腫瘍細胞の増殖に対する本発明の抗体の抑制作用を検出するために、実施例１で構築されたｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞に対して活性を検出した。具体的に、ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞に対して正常培養を行った（培地は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２で、プロバイダーは上海源培生物科技股フン有限公司で、カタログ番号はＬ３１０である）。実験の初めは、対数期のｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を取って９６ウェルプレートに３×１０３／ウェルの密度で敷いた。３７℃、５％ＣＯ２で一晩付着培養した。抗体サンプルの用意：１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（源培生物）で１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌの抗体サンプルを調製した。一晩付着培養されたｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を取り出し、培地を捨て、そしてＰＢＳで細胞を１回洗浄した後、それぞれ用意された異なる抗体サンプルを１００μｌ／ウェル入れた。続いて７２ｈ培養した後、ＣＣＫ８キットで検出した。
ＣＣＫ－８キットはＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８で、東仁化学科技（上海）有限公司から購入され、カタログ番号はＣＫ０４である。操作方法は説明書に従って行われ、９６ウェルプレートを取り出し、各ウェルに１０μｌのＣＣＫ－８溶液（読み取り値に影響するため、ウェルに泡が生じないように注意した）を入れ、培養プレートをインキュベーターで１～４ｈインキュベートし、最適な検出時点を見つけ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）マイクロプレートリーダーによって４５０ｎＭにおいて数値を読み取り、数値をＧｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５によって分析してデータを処理した。結果を下記表２２に示す。
表２２の結果から、陰性抗体は１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌの濃度において腫瘍細胞を抑制する活性（抑制率）が１％以下で、即ち、ブックグラウンドレベルであることが分かる。１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌにおけるＡｂ１０の腫瘍細胞を抑制する活性（抑制率）が２．１７％～３．１６％であり、これはＲｅｆの抑制率の２．３４％～３．９％に近い。一方、Ａｂ６は腫瘍細胞を抑制する活性がＲｅｆよりもずっと強く、例えば１０μｇ／ｍｌにおける抑制率が６．１２％で、Ｒｅｆ（２．９４％）の２倍以上である。
実施例１３：本発明のヒト化抗体のマウスＣＬＤＮ１８との結合活性の検出
前記実施例２の方法に従い、本発明の好適なヒト化抗体のマウスＣＬＤＮ１８．１＋細胞及びマウスＣＬＤＮ１８．２＋細胞との結合活性を検出した。スクリーニングの過程において、１つのクローン克隆（抗体Ｌ１８０）が得られ、当該抗体はヒト及びマウスのＣＬＤＮ１８．１のいずれにも結合した。本アッセイの対照として、Ｌ１８０はｍＣＬＤＮ１８．１＋細胞との結合活性がＥＣ５０＝０．４８ｎＭであることから、本発明で構築されたマウスＣＬＤＮ１８．１＋細胞は抗ＣＬＤＮ１８．１抗体と特異的に結合することが示された。一方、本発明の好適なヒト化抗体はいずれもｍＣＬＤＮ１８．１＋細胞に結合せず、且つ同マウス由来抗体ｍａｂ５ｂと同じｍＣＬＤＮ１８．２＋細胞との結合活性が残り、下記表２３を参照する。
上記結果から、本発明の好適なヒト化抗体はいずれもｍＣＬＤＮ１８．２＋細胞との結合活性が残っていることが分かる。ＥＣ５０はヒト化前のｍａｂ５ｂ（同アッセイにおけるＥＣ５０＝０．３７５ｎＭ）と同じ結合活性を有する。Ｅｍａｘは１．９１（Ａｂ５１）～２．４７（Ａｂ６）の間で、ｍａｂ５ｂ（２．１７）に近い。
実施例１４：本発明の抗体の体内における薬効活性の評価
本発明の抗体の抗腫瘍活性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにｈＣＬＮＤ１８．２＋細胞（実施例１で構築された）又は胃癌細胞ＮＵＧＣ４（上海素爾生物科技有限公司）を皮下移植して構築された動物薬効モデルを利用し、本発明の抗体の体内における薬効を評価した。
具体的に、ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞の培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２（源培生物）に１０％ウシ胎児血清（上海博昇生物科技有限公司、カタログ番号ＢＳ－０００２－５００）を入れたものである。ＮＵＧＣ４細胞の培地はＲＰＭＩ１６４０（源培生物）に１０％ウシ胎児血清を入れたものである。培養条件は３７℃、５％ ＣＯ２である。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは雌で、４週齢で、体重が１８～２０ｇであり、上海ＳＩＰＰＲ－ＢＫ実験動物有限公司（生産許可証番号：ＳＣＸＫ（京）２０１２－０００１）から購入され、室温２０～２５℃、湿度４０～６０％で、自由に餌・水を摂取させ、３～４日適応性飼育した。適当に敷材を交換し、籠を掃除した。対数期の細胞を選び、収集して計数した。
ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞異系移植モデルでは、ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、再懸濁させて１×１０８細胞／ｍｌにした。マウスの左側に０．１ｍｌ皮下接種し、計１×１０７細胞／匹であった。腫瘍体積が約１２０～１８０ ｍｍ３になるように成長したマウスを選び、各群に５～６匹、ランダムに群分けした。
胃癌ＮＵＧＣ４細胞異系移植モデルでは、ＮＵＧＣ４細胞をＲＰＭＩ１６４０で２回洗
浄した後、Ｍａｔｒｉｇｅｌを入れ、ＲＰＭＩ６４０との比率が１：１になるようにし、混合液で再懸濁させて１×１０８細胞／ｍｌにした。マウスの左側に０．１ｍｌ皮下接種し、計１×１０７細胞／匹であった。腫瘍体積が約１５０～２００ｍｍ３になるように成長したマウスを選び、各群に５～６匹、ランダムに群分けした。
無菌で被験サンプルをＰＢＳで調製した。ブランクは無サンプルのＰＢＳ対照であり、標的に関係のない抗体であり、即ち、陰性抗体（Ｎｅｇ ＩｇＧ）対照である。２００μｇ／１００μｌ／匹で腹腔内注射した。２回／週で、数週連続で注射した。サンプルを注射した日を０日目とした。毎回の投与前に、体重、腫瘍体積を測定し、データを記録した。
腫瘍の大きさの計算式：腫瘍体積ＴＶ（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径２）。相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％） ＝ １００％×（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）。腫瘍抑制率（ＴＧＩ）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％。ここで、Ｔ０、Ｔはそれぞれサンプル群の実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積であり、Ｃ０、Ｃはそれぞれ対照群の実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積である。
動物体内における薬効の結果は図５ａ、５ｂ（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞異系移植モデル）及び下記表２４（ＮＵＧＣ４腫瘍細胞異系移植モデル）に示す。
ヒトＣＬＤＮ１８．２高発現細胞（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞）で構築された腫瘍異系移植モデルにおいて、図５ａの結果から、本発明の抗体Ａｂ１０、Ａｂ６は陽性抗体分子（Ｒｅｆ）と同様に非常に良い体内における薬効活性を示し、腫瘍細胞成長の抑制及び／又は腫瘍細胞の殺滅（抑制率）が９０％以上に達した。意外なことに、軽鎖ＣＤＲ１及び重鎖ＣＤＲ３が脱アミノ感受性部位最適化され、軽鎖ＣＤＲ１がヒト化最適化された好適な抗体Ａｂ３６は完全に腫瘍の成長を抑制、その体内における薬効が顕著にＡｂ６、Ａｂ１０及び対照陽性抗体（Ｒｅｆ）よりも良かったことが示された。図５ｂの結果から、本発明の完全ヒト化抗体（復帰突然変異がない）Ａｂ１３、及びその軽鎖ＣＤＲ１及び重鎖ＣＤＲ３が脱アミノ感受性部位最適化された完全ヒト化抗体Ａｂ５１、ならびに軽鎖ＣＤＲ１及び重鎖ＣＤＲ３が脱アミノ感受性部位最適化され、重鎖に復帰突然変異が２個のみあるヒト化抗体Ａｂ２４はいずれも対照抗体と同じ体内における薬効を示したことが示された。
ヒト胃癌細胞系ＮＵＧＣ４で構築された腫瘍モデルにおいて、上記結果（表２４）から、本発明の好適なヒト化抗体Ａｂ１０、Ａｂ６はいずれもある程度の薬効を示し、腫瘍抑制率が１０％～２０％であり、且つ投与量依存性を示したことが分かる。一方、同じモデルにおいて、対照抗体（Ｒｅｆ）はＰＢＳ対照、陰性抗体（Ｎｅｇ ＩｇＧ）と同様で、腫瘍抑制効果がなかった。この結果から、本発明の抗体は陽性対照抗体よりも優れた体内における薬効を有することが分かる。
実施例１５：本発明の抗体のマウスにおける薬物動態学（ＰＫ）の評価
上記実施例１３に記載のように、本発明の抗体はマウスＣＬＤＮ１８．２と優れた結合活性を有し、これは本発明の抗体に臨床前研究の非霊長類の種の選択を提供した。本発明では、マウス体内における薬物動態学（ＰＫ）の本発明の抗体の特性を評価した。
具体的に、実験は６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスが使用され、上海ＳＩＰＰＲ－ＢＫ実験動物有限公司から購入された。マウスは購入された後、６匹／籠であり、自由に餌及び水を摂らせた。実験室の環境において３日飼育し、温度は２０～２５℃であり、湿度は４０～６０％であり、１２／１２時間で明暗の周期を調節した。実験開始の前日に、マウスに対して体重を測定し、２０～２５ｇのマウスを選び、３匹／群で群分け及び番号付けを
行った。実験の当日に、各マウスにそれぞれ被験薬物Ａｂ１０及び対照抗体（Ｒｅｆ）を皮下注射し、薬物の投与量は１０ｍｇ／ｋｇであり、皮下注射は１００ μｌ／匹／回であった。
マウスに注射した後０、１、６、２４、２６、３０、５０、５５、７１、７９、９８、１４３、１６７、１９１、２１５、２４０時間でそれぞれ目縁から採血した。採取された血液サンプルを遠心し、上清を取り、－２０度で保存し、測定に備えた。血液サンプルを収集した後、前記実施例２のＥＬＩＳＡ方法によって血清における薬物濃度を検出した。正式に検出する前に、１匹のマウスの血清を採取し、勾配希釈を行い、血清の最適な希釈比率を決めた。すべてのサンプルは最適な希釈比率でＥＬＩＳＡによる検出を行い、検出結果に対してＴ１／２計算式及びＥＸＣＥＬソフトによってデータを分析したが、結果を下記表２５に示した。
上記表２５の結果から、本発明の抗体Ａｂ１０はＣｍａｘが対照抗体（Ｒｅｆ）よりも５７％高かった（［４０７．７～２５９．３］／２５９．３）ことが分かる。より意外なことに、本発明の抗体Ａｂ１０は半減期Ｔ１／２が対照抗体（Ｒｅｆ）よりも３０．７時間以上長く（１７０．１～１３９．４）、マウス体内において３０時間と長いＴ１／２の優勢は、ヒト体内においてさらに拡大すると予想される。これらの結果から、本発明のヒト化抗体は対照抗体よりも優れたＰＫ性能を有し、特に半減期Ｔ１／２の顕著な優勢が臨床に少なくとも薬効（長時間）及びコスト（低い投与頻度）などの優勢をもたらすと予想されることが分かる。
実施例１６：本発明の抗体の親和性の分析（ＫｉｎＥｘＡ）
ＣＬＤ１８．２は細胞の膜貫通タンパク質であり、４回膜貫通で、２つの細胞外領域ＥＣＬ１及び２がいずれもわずか２０～５０アミノ酸の長さである。本発明の抗体は特異的にＣＬＤＮ１８．２細胞外領域に結合する。通常の抗原（２０－５０アミノ酸）を発現させて抗体と結合させるＢｉａｃｏｒｅ検出法は、好適に本発明の抗体の標的タンパク質の
細胞外領域との特異的な親和性を評価することができる。そのため、本発明では、ＫｉｎＥｘＡ方法によって抗体のｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞との親和性を検出した。方法はＫｉｎＥｘＡ ４０００装置の説明書を参照して行われ、即ち、被験抗体Ｒｅｆ、Ａｂ１０をそれぞれ固定結合相手（Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐａｒｔｎｅｒ、ＣＢＰ）とし、ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を滴定剤（Ｔｉｔｒａｎｔ）とした。固定濃度の抗体（ＣＢＰ）で細胞（Ｔｉｔｒａｎｔ）を勾配希釈し、インキュベートした後、抗ヒトＩｇＧ
Ｆｃのカラムで細胞に結合しなかった遊離抗体（ｆｒｅｅ ＣＢＰ）を捕獲し、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７で信号値を獲得し、ＫｉｎＥｘＡの付属ソフトによって抗体の親和性を算出した。
具体的に、適切な抗体希釈液の濃度を決めるために、まず、予想された親和性から合理的な濃度を推算して信号テストを行い、それぞれ５００μｌの１２０ｐＭ Ｒｅｆ抗体及び１００ｐＭ Ａｂ１０抗体を信号１００％とし、当該濃度において満足できる純粋な検出信号値を得、ＰＢＳブランクを陰性信号値（ＮＳＢ）とした。１２０ｐＭ Ｒｅｆ 抗体及び１００ｐＭ Ａｂ１０抗体の濃度をＣＢＰ濃度とした。次の平衡実験において、３００ｇで１０分間遠心してそれぞれ２本の遠心管のｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を収集し、各管の細胞数は５×１０８個であった（ＦＡＣＳ検出による陽性率は１００％であった）。ＰＢＳで細胞を１回洗浄し、３００ｇで１０分間遠心し、細胞をそれぞれ１５ｍｌ遠心管に収集した。それぞれ１５ｍｌの１２０ｐＭ Ｒｅｆ及び１００ｐＭ Ａｂ１０の抗体溶液を用意した。５×１０８個の細胞に１２０ｐＭ Ｒｅｆ 抗体溶液を２ｍｌまで入れ、そして１２０ｐＭ Ｒｅｆ 抗体溶液を緩衝液として細胞を２倍勾配で希釈し、初期濃度２．５×１０８細胞／ｍｌから、１８個の勾配で、各勾配の濃度は０．６ｍｌずつであった。５×１０８個の細胞に１００ｐＭ Ａｂ１０抗体溶液を２ｍｌまで入れ、そして１００ｐＭ Ａｂ１０抗体溶液を緩衝液として細胞を２倍勾配で希釈し、初期濃度２．５×１０８細胞／ｍｌから、１８の勾配で、各勾配の濃度は０．６ｍｌずつであった。細胞と抗体の懸濁液を室温で振とうしながら２ｈインキュベートした。インキュベート終了後、４５０ｇで１０分間遠心し、上清を取った。１μｇ／ｍｌのａｎｔｉ ｈｕｍａｎ Ｆｃ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７溶液を用意した。サンプルをホルダーにおける相応する位置にセットした。ＫｉｎＥｘＡ３２００装置によって信号値を検出して親和性のデータを得た。結果は下記表に示された。結果から、Ａｂ１０は親和性（１３．３ ｐＭ）がＲｅｆ抗体よりも１０倍以上高かったことが分かる。
実施例１７： 本発明の抗体の取り込み活性の検出
ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞が９０％まで増殖した時点で、トリプシンで消化し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）で細胞を最終濃度が１ｘ１０６細胞／ｍｌになるように再懸濁させた。５００μｌの細胞懸濁液を１．５ｍｌ遠心管に入れ、蛍光標識を持つ抗体対照抗体（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞に結合しない抗体）、対照抗体Ｒｅｆ、被験サンプル（本発明の好適なヒト化抗体）Ａｂ１０、Ａｂ６（抗体の標識には、ｍｉｘ－ｎ－ｓｔａｉｎ ＣＦ４８８ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ＃ ＭＸ４８８Ｓ１００－１ｋｉｔ、又はｍｉｘ－ｎ－ｓｔａｉｎ ＣＦ６３３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃ
ｈ，Ｃａｔ＃ ＭＸ６３３Ｓ１００－１ｋｉｔが使用され、標識の手順はいずれもキットにおける説明書に従って行われた）を入れ、最終濃度が１μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌであり、氷の上で１時間インキュベートし、冷やしておいたＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。１／５を取り出して氷の上に置き、結合値のサンプルとしてそのままフローサイトメトリーに使用した。残った４／５の細胞は、３７℃で加熱しておいた１６４０＋１０％ＦＢＳで細胞を再懸濁させ、１／４を分注してそのまま氷の上に置き、取り込みの０時間の散布売るとし、残りは３７℃インキュベーターでインキュベートし、それぞれ１ｈｒ、２ｈｒ、３ｈｒで取り出し、氷の上で予備冷却し、取り込みを中止させ、４℃、１３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨てた。０ｈｒ、１ｈｒ、２ｈｒ、３ｈｒでストリッピング緩衝液（ｓｔｒｉｐ ｂｕｆｆｅｒ）（０．０５ Ｍ グリシン，ｐＨ ２．４５ ＋ ０．１ Ｍ ＮａＣｌ）を２５０μｌ入れ、室温で７ｍｉｎ、４℃、１３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。サンプルはすべて１５０μｌの４％パラホルムアルデヒド（生工生物工程 Ｃａｔ＃Ｅ６７２００２）を入れ、４℃で半時間固定した後、装置にセットして検出した（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター）。結果を下記表に示す。
上記結果（ＣＦ４８８で標識された被験抗体）から、抗体濃度が１μｇ／ｍｌの場合（上記表の左半分）、対照抗体（Ｒｅｆ）の結合蛍光強度（１９３９）は陰性抗体（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞に結合しない抗体）の蛍光強度値（１７４７）、即ち、バックグラウンド値に近かったことが分かる。そして、０ｈ、１ｈ、２ｈ、３ｈにおける蛍光強度値（下線の数値）もすべてバックグラウンド（１７４７）に近かった。一方、本発明の抗体Ａｂ１０、Ａｂ６は、結合値（蛍光強度）がそれぞれ２７２００、１６３００であり、バックグラウンドの１５倍及び９倍であり、それぞれ対照抗体の１４倍（２７２００／１９３９）及び８．４倍（１６３００／１９３９）であった。これによって、さらに、本発明の抗体は結合Ｅｍａｘが対照抗体（Ｒｅｆ）よりも強かったことが証明された。
抗体濃度が１０ μｇ／ｍｌに増加した場合（上記表の右半分）、陰性抗体（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞に結合しない抗体）の蛍光強度値、即ち、バックグラウンド値が１２８４～３４８５（下線の数字）であった。対照抗体（Ｒｅｆ）の蛍光強度（結合値）は１７９００であり、バックグラウンド（３４８５）よりも４倍高かったことから、Ｒｅｆが１０μｇ／ｍｌと高くなって初めて蛍光標識抗体の特異的結合が検出されたことが示された。同じ濃度において、本発明の抗体Ａｂ１０、Ａｂ６の結合強度（蛍光値）がそれぞれ１３８０００、８６０００であり、バックグラウンド（３４８５）の３９倍及び２４倍であり、それぞれＲｅｆの７．７倍（１３８０００／１７９００）及び４．８倍（８６０００／１７９００）であった。これによって、さらに、本発明の抗体の結合Ｅｍａｘが対照抗体（Ｒｅｆ）よりもずっと強かったことが証明された。これは上記ＫｉｎＥｘＡ検出の結果とも一致する。
上記表におけるデータから、公式：取り込み百分率（％）＝（被験時点における蛍光強度－０ｈにおける蛍光強度）／結合値により、下記表のデータが得られた。
上記結果から、本発明の好適な抗体Ａｂ１０、Ａｂ６は、濃度１μｇ／ｍｌの場合（上記表の左半分）、１ｈ、２ｈ、３ｈのいずれでも比較的に良い取り込み作用が示され、３ｈにおける取り込みはそれぞれ２８％及び２５％であったことが分かる。一方、同等の条件において、Ｒｅｆ抗体は陰性対照抗体と同様に、取り込みが見られなかった。
抗体の量が１０μｇ／ｍｌまで上がった（上記表の右半分）場合、対照抗体は非常に小さい取り込みしかなく（７％ ～８％）、ほとんどバックグラウンドに近づく、即ち、取り込みがなかった。一方、本発明の抗体Ａｂ１０、Ａｂ６は、取り込みがまだ時間の経過につれて増加し、３ｈで、それぞれ２３％及び１８％であった。これは抗体濃度１μｇ／ｍｌにおける２８％及び２５％に及ばないことから、本発明の抗体は結合活性がＲｅｆよりもずっと良く、１０μｇ／ｍｌは本発明の抗体に過飽和であり、最適な抗体取り込み濃
度ではないことが示された。
上記結果から、本発明の好適なヒト化抗体は取り込み抗体であることが分かる。一方、対照抗体（Ｒｅｆ）は取り込み抗体ではないか、取り込みが非常に弱い。さらに本発明の好適な抗体の取り込み活性を証明するために、ＣＦ４８８と異なる蛍光染料ＣＦ６３３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃ ＭＸ６３３Ｓ１００－１ｋｉｔ）で抗体の標識及び取り込み活性の分析を行ったが、検出装置はＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターであった。結果は下記表に示す。
上記結果（ＣＦ６３３で標識された被験抗体）から、抗体濃度が１μｇ／ｍｌの場合（上記表の左半分）、陰性抗体（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞に結合しない抗体）の蛍光強度値、即ち、バックグラウンド値が２３であったことが分かる。０ｈ、１ｈ、２ｈ、３ｈにおける蛍光強度値（下線の数値）もすべてバックグラウンド（１２．７～１３．７、即ち、２倍以内で１００未満のはいずれもバックグラウンド値である）に近かった。対照抗体（Ｒｅｆ）の結合蛍光強度（６２．５）がバックグラウンド（陰性抗体、２３）に近く、２倍の範囲内であった（６２．５／２３＝２．７）。そして、０、１、２、３ｈで結合蛍光強度値がいずれも弱く（１５．５～３３．４）、特に１、２、３ｈで読み取り値が変化せず（３３．９、３３．７、３３．４）、これらの数値が基本的にバックグラウンドレベルに近いことが示された。
一方、本発明の抗体Ａｂ１０、Ａｂ６は、結合値（蛍光強度）がそれぞれ８５４、６９０であり、バックグラウンドの３７倍（８５４／２３）及び３０倍（６９０／２３）であり、それぞれ対照抗体の１４倍（８５４／６２．５）及び１１倍（６９０／６２．５）であった。これによって、さらに、本発明の抗体の結合Ｅｍａｘが対照抗体（Ｒｅｆ）よりもずっと強かったことが証明された。これは上記ＫｉｎＥｘＡの結果とも一致した。
抗体濃度が１０μｇ／ｍｌに増加した場合（上記表の右半分）、陰性抗体（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞に結合しない抗体）の蛍光強度値、即ち、バックグラウンド値が２３．２～１４．９（下線の数字）であった。対照抗体（Ｒｅｆ）の蛍光強度（結合値）は１９８であり、バックグラウンド（２３．２）の８．５倍であったことから、Ｒｅｆが１０μｇ／ｍｌと高い場合、蛍光標識抗体の特異的結合が検出できることが示された。同じ濃度において、本発明の抗体Ａｂ１０、Ａｂ６の結合強度（蛍光値）がそれぞれ３２２９及び２２３７であり、それぞれバックグラウンド（２３．２）の１３９倍及び９６倍であり、それぞれＲｅｆの１６倍（３２２９／１９８）及び１１倍（２２３７／１９８）であった。これによって、さらに、本発明の抗体の結合Ｅｍａｘが対照抗体（Ｒｅｆ）よりもずっと強かった（蛍光読み取り値が１０倍以上強かった）ことが証明された。
上記表におけるデータから、公式：取り込み百分率（％）＝（被験時点における蛍光強度－０ｈにおける蛍光強度）／結合値により、下記表のデータが得られた。
上記結果から、本発明の好適な抗体Ａｂ１０、Ａｂ６は、濃度１μｇ／ｍｌの場合、１ｈ、２ｈ、３ｈのいずれでも比較的に良い取り込み作用が示され、３ｈにおける取り込みはそれぞれ３５．１％及び３０．４％であったことが分かる。一方、同等の条件において、Ｒｅｆ抗体（結合強度がバックグラウンドの２～３倍以内）は陰性対照抗体と同様に、取り込み作用がなかった。
抗体の量が１０μｇ／ｍｌまで上がった（上記表の右半分）場合、対照抗体は非常に小さい取り込みしかなく（５％～８％）、ほとんどバックグラウンドに近づく、即ち、取り込みがなかった。一方、本発明の抗体Ａｂ１０、Ａｂ６は、取り込みが時間の経過につれて増加し、３ｈで、それぞれ２７．３％及び２８．９％であった（図６を参照する）。こ
れは抗体濃度１μｇ／ｍｌにおける３５．１％及び３０．４％に及ばないことから、本発明の抗体は結合活性がＲｅｆよりもずっと良く、１０μｇ／ｍｌは本発明の抗体に既に過飽和である、最適な取り込み作用の濃度ではないことが示された。
上記２つの異なる蛍光染料（ＣＦ４８８及びＣＦ６３３）の実験結果をまとめると、本発明の好適なヒト化抗体Ａｂ１０、Ａｂ６は取り込み抗体であることが分かる。これらは対照抗体（Ｒｅｆ）と全く違う。対照抗体は取り込み作用がないか、取り込みが非常に弱く、バックグラウンドレベルに近かった。
実施例１８：抗ＣＬＤＮ１８．２抗体Ａｂ１０毒素ＳＭＣＣ－ＤＭ１複合体（ＡＤＣ１）の製造
本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体Ａｂ１０毒素ＳＭＣＣ－ＤＭ１複合体（ＡＤＣ１）の製造方法は特許ＣＮ１０６１８８２９３Ａ及びＵＳ２００９２０２５３６Ａ１で開示された方法を参照し、具体的な手順は以下の通りである。
工程１では、中間体を製造した。１ｍｇのＳＭＣＣ（４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミドエステル、上海瀚鴻化工科技有限公司、ロット番号ＢＨ－４８５７－１１１２０３）を０．５５ｍＬのアセトニトリル溶液に溶解させ、使用に備えた。Ａｂ１０抗体（ｐＨ＝６．５、ＰＢＳ緩衝液）５０ｍｇ（５ｍｌ）を上記使用に備えた４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミドエステルのアセトニトリル溶液に入れ、２５℃で振とうしながら２時間反応させた。反応終了後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムによって脱塩・精製して（溶離相：ｐＨが６．５の０．０５ＭのＰＢＳ溶液）中間体溶液、即ち、上記合成スキームにおける工程１と工程２の間の分子を得、そして約８ｍｇ／ｍｌに濃縮した後、次の反応を行った。
工程２では、抗体－毒素のカップリングを行った。工程１で得られた中間体溶液５ｍｇを、Ｌ－ＤＭ１のエタノール溶液（３．０ｍｇ Ｌ－ＤＭ１／ｍｌエタノール）に入れた。Ｌ－ＤＭ１は「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００６，４９，４３９２－４４０８」の公知の方法によって製造することができ、Ｌ－ＤＭ１の量はＬ－ＤＭ１：中間体＝３：８ｍｇの比率で入れた。２５℃で振とうしながら約４．０時間反応させた後、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムによって脱塩
・精製し（溶離相：ｐＨが６．５の０．０５ＭのＰＢＳ溶液）、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体Ａｂ１０に毒素ＳＭＣＣ－ＤＭ１をカップリングさせた産物ＡＤＣ１の溶液を得た。得られたＡＤＣ１の最終濃度は１．３ｍｇ／ｍｌで、分注して４℃で保存して使用に備えた。
得られたＡＤＣ１のサンプルをＬＣ－ＭＳ方法によって検出して分析したところ、得られたサンプルに遊離の毒素小分子がないことが証明された。分光光度計（ＵＶ方法）によってＡ２５２、Ａ２８０における吸収ピークを検出したところ、得られたＡＤＣ１毒素と抗体の比率ＤＡＲ＝４．４であった。
実施例１９：抗ＣＬＤＮ１８．２抗体Ａｂ１０毒素ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ複合体（ＡＤＣ２）の製造
本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体Ａｂ１０毒素ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ複合体（ＡＤＣ２）の製造方法は特許ＣＮ１０６１８８２９３Ａ及びＵＳ２０１４０１２７２１１Ａ１で開示された方法を参照し、具体的な手順は以下の通りである。
工程１では、中間体を製造した。０．７ｍｇのチオ酢酸Ｓ－（３－カルボニルプロピル）エステルを０．９ｍＬのアセトニトリル溶液に溶解させ、使用に備えた。Ａｂ１０抗体（ｐＨ＝４．３の酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液）５０ｍｇ（５ｍｌ）を上記使用に備えたチオ酢酸Ｓ－（３－カルボニルプロピル）エステルのアセトニトリル溶液に入れた後、１．０ｍｌのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１４．１ ｍｇ）水溶液を滴下し、２５℃で振とうしながら２時間反応させた。反応終了後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムによって脱塩・精製（溶離相：ｐＨが６．５の０．０５ＭのＰＢＳ溶液）した後、産物１ａの溶液（上記スキームに示されるように）を得、１ａを約１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、中間体１ｂの製造を行った。ここで、前記ｘ≦ｙであった。
５ｍｌの上記１ａ溶液に０．１５ｍｌの２．０Ｍ塩酸ヒドロキシアミン溶液を入れ、２５℃で振とうしながら３０分間反応させた後、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムによって脱塩・精製（溶離相：ｐＨが６．５の０．０５ＭのＰＢＳ溶液）した後、上記スキームにおける中間体１ｂ、即ち、Ａｂ１０－プロパンチオール溶液を得た。
工程２では、抗体－毒素のカップリングを行った。１．６ｍｇの化合物ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ（ＰＣＴ特許ＷＯ２００５０８１７１１で開示された方法によって製造することができる）を０．３ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、上記で製造された中間体Ａｂ１０－プロパンチオール溶液５ｍｇを入れ、２５℃で振とうしながら４時間反応させた後、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムによって脱塩・精製し（溶離相：ｐＨが６．５の０．０５ＭのＰＢＳ溶液）、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体Ａｂ１０毒素ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ複合体ＡＤＣ２（構造は下記式で表される）を得た。
得られたＡＤＣ２の最終濃度は１．２１ｍｇ／ｍｌであり、分注して４℃で保存して使用に備えた。得られたＡＤＣ２のサンプルをＬＣ－ＭＳ方法によって検出して分析したところ、得られたサンプルに遊離の毒素小分子がないことが証明された。分光光度計（ＵＶ
方法）によってＡ２５２、Ａ２８０における吸収ピークを検出したところ、得られたＡＤＣ２毒素と抗体の比率ＤＡＲ＝４．８であった。
実施例２０：抗ＣＬＤＮ１８．２抗体Ａｂ１０細胞毒性複合体ＡＤＣ１、ＡＤＣ２の結合活性の検出
実施例２に記載のＥＬＩＳＡ方法によって本発明の抗体Ａｂ１０、及びＡｂ１０抗体細胞毒素複合体ＡＤＣ１、ＡＤＣ２のｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞との結合活性を検出したが、結果を下記表に示す。
上記結果から、Ａｂ１０抗体細胞毒素複合体ＡＤＣ１、ＡＤＣ２は、標的細胞（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞）との結合活性（ＥＣ５０）が抗体Ａｂ１０よりもやや弱くなったが、２倍（誤差）の範囲内にあったことが分かる。
実施例２１：抗ＣＬＤＮ１８．２抗体Ａｂ１０細胞毒性複合体ＡＤＣ１、ＡＤＣ２の取り込み活性の検出
上記「本発明の抗体の取り込み活性の検出」（実施例１７）と同じ方法によって本発明の抗体Ａｂ１０、及びＡｂ１０抗体細胞毒素複合体ＡＤＣ１、ＡＤＣ２の取り込み活性を検出した。上記実施例に基づき、標識方法を最適化し（ＣＦ６３３染料を使用した）、抗体濃度（２．５μｇ／ｍｌ）及び時間（１時間）などの取り込みの検出条件で、結果を下記表に示した。
上記結果から、本発明のＡｂ１０抗体細胞毒素複合体ＡＤＣ１、ＡＤＣ２には抗体Ａｂ１０の取り込み活性が残ったことが分かる。つまり、毒素が連結した抗体Ａｂ１０は抗体の取り込み活性が影響されなかった。
実施例２２：抗ＣＬＤＮ１８．２抗体Ａｂ１０細胞毒性複合体ＡＤＣ１、ＡＤＣ２の標的細胞の増殖を抑制する活性
Ａｂ１０抗体細胞毒性複合体ＡＤＣ１、ＡＤＣ２の標的細胞の増殖を抑制する活性を検出するために、ＣＣＫ８法（キットは東仁化学科技（上海）有限公司から購入され、カタログ番号はＣＫ０４である。説明書に従って行われた。）によって細胞の増殖作用を検出した。具体的に、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地でｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞（標的細胞）及びｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞（非ＣＬＤＮ１８．２標的細胞で、対照細胞とした）を培養し、７２時間の培養の終了の２時間前に、各ウェルに１０μｌのＣＣＫ８を入れ、インキュベーターで続いて２時間培養し、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯマイクロプレートリーダーでＯＤ４５０ｎＭの読み取り値を得、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５によって分析してデータを処理した。細胞増殖抑制百分率（％）＝１００×（１－（ＯＤ４５０サンプル／ＯＤ４５０対照ウェル））で、結果を下記表に示す。
上記結果から、本発明のＡｂ１０抗体細胞毒素複合体ＡＤＣ１及びＡＤＣ２分子は、標的特異性細胞（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞）の増殖を顕著に抑制することができ、ＩＣ５０はそれぞれ１１．２ｎＭ及び０．７１ｎＭであったことが分かる。ＡＤＣ１は非標的細胞（本実験に使用されたのはＡｂ１０抗体に結合しないｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞である）に対して抑制作用がなく、安全域が３０００と高かった。ＡＤＣ２は非常に高い濃度（ＩＣ５０：１８．５ｎＭ）で非標的特異性細胞に対する抑制が見られたが、このような抑制は高投与量（１０～１００ｎＭと高い）による非標的毒性のためである。これはＡＤＣ２に連結したＭＭＡＦの高毒性という特徴と一致している。ＡＤＣ２は安全域が２６に達した。
実施例２３：抗ＣＬＤＮ１８．２抗体Ａｂ１０細胞毒性複合体の標的細胞傷害活性の検出
本発明のＡｂ１０抗体細胞毒素複合体の特異的にＣＬＤＮ１８．２＋を標的とする細胞毒性を検出するために、本実施例ではＡＤＣ１を例として、細胞上清におけるＬＤＨの放出を検出することによって本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体Ａｂ１０細胞毒性複合体の標的細胞傷害活性を評価した。
具体的に、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地でｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞（標的細胞）及びｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞（非ＣＬＤＮ１８．２標的細胞で、対照細胞とした）を対数期まで培養した。実験の前日に、培養されたｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞及びｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞を、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で再懸濁させ、細胞濃度が４×１０４細胞／ｍｌになるように調整し、１００μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに入れた。３７℃、５％ ＣＯ２で一晩インキュベートした。実験の当日に、９６ウェルプレートにおける細胞から培地を除き、各ウェルに２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を入れて使用に備えた。２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で勾配希釈された被験薬物ＡＤＣ１を調製し、０μｇ／ｍｌの抗体ウェルに新鮮な培地を使用し、対照ウェルとした。細胞に用意された異なる濃度の抗体サンプルを５０μｌ／ウェル入れ、各濃度に３つの重複ウェルを設けた。３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターで７２時間インキュベートした後、上清を取り出してＬＤＨキット（東仁化学科技（上海）有限公司から購入され、カタログ番号はＣＫ１２である）によってＬＤＨの放出を検出した。検出方法は説明書に従って行われた。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯマイクロプレートリーダーによって４９０ｎＭにおいて数値を読み取り、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５によって分析してデータを処理した。細胞殺傷百分率（％）＝１００×（ＯＤ４９０被験サンプル－ＯＤ４９０対照ウェル）／（ＯＤ４９０細胞全分解－ＯＤ４９０対照ウェル）。実験結果は下記表に示す。
上記結果から、本発明のＡｂ１０抗体細胞毒性複合体の特異的にｈＣＬＤＮ１８．２＋陽性細胞を標的とする細胞毒性が強く、ＥＣ５０が１ｎＭ以下であったことが分かる。一方、非標的細胞（本実験に使用されたのはＡｂ１０抗体に結合しないｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞である）に対する細胞傷害作用が弱かった（細胞毒性がなかった）。特に、ＡＤＣ１は特異的細胞と非特異的細胞を標的とする毒性（ＥＣ５０）の比率が１５６と高かった。この特異性域（安全域）は当該分子の非標的毒性が弱く、安全性が高いことを示す。
実施例２４：抗ＣＬＤＮ１８．２抗体Ａｂ１０細胞毒性複合体の体内における薬効
実施例１４と同じ方法におけるＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにｈＣＬＮＤ１８．２＋細胞を皮下移植した動物モデル及び試験方法を使用し、ＡＤＣ１と例として、本発明の抗体Ａｂ１０抗体細胞毒性複合体の体内における薬効を評価した。 結果を表３５に示した。
表３５の結果から、本発明の抗体毒素薬物複合体ＡＤＣ１は、低濃度（２ｍｇ／ｋｇ）では、４回のみの投与であり、２週間（１４日）で非常に優れた腫瘍抑制効果が見られ、抑制率が４６％であり、対照群と有意差があった（Ｐ値＜０．００１）。
実施例１４と同じ方法において、その中の腫瘍細胞を、胃癌細胞系ＮＵＧＣ－４のｈＣＬＤＮ１８．２過剰発現の細胞系をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに接種し、本発明のＡＤＣ２の動物における薬効を評価した。具体的に、胃癌細胞系ＮＵＧＣ－４の細胞は中国科学院細胞生物学研究所から購入された。実施例１の方法によってｈＣＤＬＮ１８．２過剰発現細胞系ＮＵＧＣ－４－８０２を構築した。ＮＵＧＣ－４－８０２を１０％ウシ胎児血清（上海博昇生物科技有限公司、カタログ番号ＢＳ－０００２－５００）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（上海源培生物科技股フン有限公司、カタログ番号：Ｌ２１０ＫＪ）において培養し、５％ＣＯ２を含有する３７℃の細胞インキュベーターにおいて培養し続けた。ＮＵＧＣ－４－８０２細胞が対数期（コンフルエント８０％～９０％）まで増殖した時点で、０．２５％トリプシンで消化し、細胞を収集し、そして無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、再懸濁させて計数し、細胞濃度が５×１０７細胞／ｍｌになるように調整した。５×１０６個／１００μｌでＢＡＬＢ／ｃ－ヌードマウスの右脇部の皮下に接種し、体積が約１２０～１５０ｍｍ３まで成長した腫瘍細胞を選んでランダムに６匹ずつ群分けした。
無菌で被験サンプルＡＤＣ２、Ａｂ１０をＰＢＳで調製した。ブランク群はＰＢＳである。投与量５ｍｇ／ｋｇで、静脈注射した。２回／週で、２週連続で注射した。各注射サンプルの投与の当日を０日目とした。毎回の投与前に、体重、腫瘍体積を測定し、データを記録した。データの統計分析方法は前記実施例１４と同様である。本実験の実際の投与周期は２週間であった。結果を表３５ｂに示した。
表３５ｂの結果から、本発明の抗体毒素薬物複合体ＡＤＣ２は、５ｍｇ／ｋｇでは、４回のみの投与で、２週間（１４日）でＮＵＧＣ－４－８０２腫瘍モデルにおいて非常に優れた腫瘍抑制効果が見られ、抑制率が６２％に達し、対照群ＰＢＳと有意差があった（Ｐ
値＜０．０５）。特に意外なことに、当該モデルにおいて、同濃度の抗体Ａｂ１０は腫瘍抑制効果が弱かった（わずか１０％）。この意外な結果から、本発明の抗体毒素薬物複合体ＡＤＣ２が単独の抗体よりも顕著に優れた腫瘍抑制効果を有することが分かる。
実施例２５ 二重特異性抗体における抗原、抗体のクローニング、発現及び精製
本発明で使用されるヒトＣＬＤＮ１８．２の設計は上記実施例を参照する。ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質、Ｈｉｓタグタンパク質、モノクローナル抗体及び設計された異なる構造の二重特異性抗体などは、本発明によってクローニングされ、発現・精製して得られたか、北京ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社及び北京Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入された。
抗原の配列はＮＣＢＩデータベースから検索して得られた。本発明で使用される抗体は、組み換え抗体、二重特異性抗体を含む。本発明で発見された抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体の配列以外、他の配列はいずれも開示された文献から得られ、抗ＰＤ－１抗体Ｎｉｖｏ、Ｐｅｍ、Ｂａ０８（配列は特許ＷＯ２０１６０１５６８５Ａ１からのものである）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏ（アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）／Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、Ａｖｅｌ（アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）／Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、Ｄｕｒｖ（デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）／ ｉｍｆｉｎｚｉ）、抗ＣＤ４７抗体ｈｕ５Ｆ９、ｉＭａｂ、Ｂｌｉｎｃｙｔｏ、ＡＭＧ４２０における抗ＣＤ３抗体の軽・重鎖可変領域の配列を含む。例えば、ＰＤ－１抗体Ｎｉｖｏ（ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）／Ｏｐｉｄｉｖｏ）の配列は公開文献、例えばｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ、又はＷＯ２０１３０１９９０６からのものである。ＰＤ－１抗体Ｐｅｍ（ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）／Ｋｅｙｔｒｕｄａ）の配列はｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａからのものである。ＰＤ－１抗体Ｂａ０８の配列は特許ＷＯ２０１６０１５６８５Ａ１からのものである。Ａｔｅｚｏ配列、Ａｖｅｌ配列、Ｄｕｒｖ配列（登録番号，ＤＢ１１７１４）はいずれもｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａから直接調べて得られる。ＣＤ４７抗体ｈｕ５Ｆ９の軽鎖の配列はＵＳ９３８２３２０Ｂ２＿４２であり、重鎖の配列はＵＳ９３８２３２０Ｂ２＿３７である。ｉＭａｂの軽鎖はＷＯ２０１８０７５８５７＿４，１Ｆ８であり、重鎖はＷＯ２０１８０７５８５７＿３，１Ｆ８である。ＣＤ３抗体はｂｌｉｎｃｙｔｏの抗ＣＤ３抗体の軽鎖・重鎖可変領域からのものである。Ｂｌｉｎｃｙｔｏの配列はｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａで開示された配列である。もう一つのＣＤ３抗体の配列はＡＭＧ４２０における抗ＣＤ３抗体配列の軽・重鎖可変領域からのものである。ＡＭＧ４２０の配列はＷＯ２０１４１４０２４８＿３４０からのものである。Ｔｉｍ３の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれＣＮ２０１７１０３４８６９９．４における配列番号２７及び配列番号３６で示され、当該特許は既に公開され、ＬＡＧ３の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれＣＮ２０１８１０９１７６８４Ｘにおける配列番号３３及び配列番号４４で示される。ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）の配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ： Ｐ３７１７３．２の細胞外領域（本発明の配列表における配列番号１）からもので、ＩＬ１０配列はＮＣＢＩ番号ＮＰ＿０００５６３．１（本発明の配列表における配列番号２）からものである。ＣＤ４７リガンドＳＩＲＰαの配列はＮＣＢＩ番号ＮＰ＿００１０３５１１１．１からのものである。
すべての抗原、抗体は、単独の抗体、二重特異性抗体、抗体－受容体（Ｔｒａｐ）、抗体－サイトカインなどの遺伝子合成で得られる合成断片を含み、設計、クローニング・発現、精製がいずれも本発明によって完成された。具体的に、前記実施例３と同様である。
Ｈｉｓタグタンパク質の精製：細胞を高速遠心して不純物を除去した。ニッケルカラム（Ｎｉ ｓｍａｒｔ ｂｅａｄｓ ６ＦＦ、常州天地人和生物科技有限公司、Ｃａｔ＃ ＳＡ０３６０１０）の平衡化：１０ ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する
ＰＢＳのｐＨ７．４溶液でニッケルカラムを平衡化し、２～５倍カラム体積で流した。サンプル上清にカラムを通させた。不純物タンパク質の溶離：１０ ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳのｐＨ７．４溶液でクロマトグラフィーカラムを洗い、非特異的に結合した不純物タンパク質を除去し、そして流出液を収集した。２５０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）で目的のタンパク質を溶離させた。緩衝液の置換：溶離させた目的のタンパク質に限外ろ過チューブを通させて１２０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し（限外ろ過チューブＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ＃ＵＦＣ５００３０８）、さらに１ｍｌのＰＢＳを追加し、濃度を測定し、分注して保存して使用に備えた。ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３及びＩＬ１０はいずれもＰｅｐｒｏｔｅｃｈから購入された。
ヒト抗体の軽鎖定常領域の配列Ｌｃ（κ鎖）、Ｌｃ（λ鎖）は既存技術である。ヒト抗体の重鎖定常領域の配列ｈＩｇＧ４又はＨｃ（ｈＩｇＧ４）；ｈＩｇＧ１又はＨｃ（ｈＩｇＧ１）；ｈＩｇＧ１ｐ又はＨｃ（ｈＩｇＧ１ｐ）、即ち、第３５６～３５８位がＥＥＭのｈＩｇＧ１のもう一つの形態は、いずれも既存技術である。上記で示された配列以外、重鎖定常領域はｈＩｇＧ２又はｈＩｇＧ３でもよい。
実施例２６ Ｔ細胞（ＣＤ３）との抗体の結合実験（ＦＡＣＳ）
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって本発明で設計されたＣＤ３を標的とする二重特異性抗体のＣＤ３結合活性を検出した。具体的に、健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ，１１１３１Ｄ）で３日活性化させた。活性化細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ，０．５％ ＦＢＳ）で１回洗浄した（８００ｇ，遠心分離３分間）後、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、細胞密度が４×１０６／ｍｌであり、各サンプルに２５μｌずつで使用に備えた。被験サンプルをＦＡＣＳ緩衝液で勾配希釈し、最高濃度が２５０ｎＭであり、５倍希釈で、８つの濃度であり、体積が２５μｌであった。希釈されたサンプル２５μｌを２５μｌの細胞懸濁液に入れ、軽く均一に混合した後、室温で２０分間インキュベートした。染色体積５倍超のＦＡＣＳ緩衝液で細胞を洗浄した後、二次抗体（ａｎｔｉ－ｈＦｃ－
ＰＥ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，４０９３０４）を入れ、室温で２０分間染色した後、洗浄し、再懸濁させ、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター）によって検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトによって被験サンプルの平均蛍光信号ＭＦＩを分析した。ＭＦＩ及び濃度で曲線を作成し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトによってＥＣ５０を計算した。
実施例２７ 活性化ＰＢＭＣ標的細胞殺傷実験
本発明のＣＤ３を標的とする二重特異性抗体に対して、本実験でその機能を評価した。上記実施例１で構築されたｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を標的細胞とし、ｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞を陰性対照細胞とした（ｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞を構築する方法は実施例１と同様で、即ち、同じ構築手順であり、ｈＣＬＤＮ１８．２をｈＣＬＤＮ１８．１プラスミドに取り替えた）。健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞とした。具体的に、それぞれｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞及びｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞を収集し、１６４０完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ）において細胞密度が２×１０５／ｍｌになるように調整し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに入れて使用に備えた。１６４０完全培地においてＰＢＭＣを細胞密度が４×１０６／ｍｌになるように調整し、５０μｌ／ウェルでそれぞれｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞又はｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞に入れた。１６４０完全培地で勾配希釈された被験サンプルを調製し、濃度が４、０．４、０．０４、０．００４μｇ／ｍｌであり、５０μｌ／ウェルで細胞に入れ、その最終濃度が１、０．１、０．０１、０．００１μｇ／ｍｌであった。重複ウェルは３つである。３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで４８時間インキュベートした後、上清をＬＤＨキット（上海同仁生物科技有限公司、カタログ番号：ＣＫ１２）によってＬＤＨの放出を検出し、標的細胞の殺傷を反映させた。操作方法は説明書に準じ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯマイクロプレートリーダーによって４９０ｎＭにおいて数値を読み取り、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５によって分析してデータを処理した。
細胞殺傷百分率（％）＝１００×（ＯＤ４９０ある薬物濃度－ＯＤ４９０対照ウェル）／（ＯＤ４９０細胞全分解－ＯＤ４９０対照ウェル）
実施例２８ 本発明の二重特異性抗体の安定性の評価
本発明で設計された二重特異性抗体は、いずれもプロテインＡ重力カラムによって精製された。サンプルを精製してｐＨ ７．４のＰＢＳ緩衝液に置換し、１ｍｇ／ｍｌであった。異なる条件において保存したが、－８０℃で６０日以上、４℃で１４又は３０日、３７℃で７日、３７℃で１４日などを含む。異なる条件において保存されたサンプルは、電気泳動（ＰＡＧＥ）によってサンプルの分解程度を評価した。結合活性を検出することによって異なる保存条件がサンプルの活性に影響があるかどうか評価した。同じ検出条件において、検出された活性値（ＥＣ５０）及び－８０℃で保存されたサンプルで検出された活性値を比較し、比の変化が２倍の範囲を超えると、保存条件がサンプルの安定性／活性に影響があったと考えられる。
実施例２９ ＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－１の２つの標的に対する二重特異性抗体の設計及び活性評価
本発明では、ＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－１の２つの標的に対して異なる配列構造の二重特異性抗体を設計したが、下記表に示す。

本発明の実施例２５の方法によってそれぞれ上記二重特異性抗体をクローニング・発現し、精製し、前記実施例の方法によってそれぞれこれらの設計された二重特異性分子とヒトＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－１との結合活性を検出したが、結果を下記表に示した。

比の値が大きいほど、設計された二重特異性抗体の単一標的に対する結合力が低下されることが示され、例えば、比の値が２の場合、設計された二重特異性抗体の標的に対する結合活性が相応するモノクローナル抗体と比べて１倍低下したことが示された。比の値が２以内の場合、結合活性が影響されていないことが示され、比の値が２～５の間の場合、結合活性がやや影響されたことが示され、この時はもう一つの標的の比が考慮され、もう一つの標的の比の値が例えば１以内の場合、当該二重特異性抗体はまだある程度の利用価値がある。
上記結果はそれぞれＬＢ３０２、ＬＢ３０１、ＬＢ３０８及びＬＢ３０９のヒトＣＬＤＮ１８．２の結合活性の検出結果（図７Ａ～７Ｄ、ａ）、ヒトＰＤ－１の結合活性の検出結果（図７Ａ～７Ｄ、ｂ）及び二重特異性抗体の構造概略図（図７Ａ～７Ｄ、ｃ）を示す。ＬＢ３０２（Ａｂ１０ ｓｃＦｖがＮｉｖｏＶＨ ＨｃのＮ末端に位置する）、ＬＢ３０１（Ａｂ１０ ｓｃＦｖがＰｅｍＶＨ ＨｃのＮ末端に位置する）、ＬＢ３０７（Ａｂ１０ ｓｃＦｖがＢａ０８ＶＨ ＨｃのＮ末端に位置する）は、ＰＤ－１の結合活性に対する影響がそれぞれ０．６８、２．１、１．５倍の変化であり、ＣＬＤＮ１８．２の結合活性に対する影響がそれぞれ１．１８、３．２、６．１であった。ＬＢ３０２はヒトＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－１との結合活性を維持したが、ＬＢ３０７はヒトＣＬＤＮ１８．２の結合活性に対する影響が最も大きく、５．１倍低下した（６．１－１＝５．１）。つまり、同じ類似するＩｇＧ構造の二重特異性設計分子のうち、ＬＢ３０２、ＬＢ３０１、ＬＢ３０７は同時に抗ＰＤ－１であるが、ＰＤ－１抗体Ｎｉｖｏ、Ｐｅｍ、Ｂａ０８の配列が異なるため、その抗ＣＬＤＮ１８．２の効果も異なる。意外に、本発明の抗体Ａｂ１０のｓｃＦｖ及びニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｎｉｖｏ）で設計された二重特異性抗体ＬＢ３０２は２つの標的のＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－１に対する結合活性に影響がなかったことが見出された。
これらのデータから、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の配列及び異なるＰＤ－１抗体の配列で設計された配列特異的で構造がＩｇＧと類似する二重特異性抗体（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ＩｇＧ ｌｉｋｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ、本発明ではＳＢｏｄｙと略される）は、活性が配列及びｓｃＦｖが存在する位置に関連する。ＳＢｏｄｙは配列の組み合わせ、ｓｃＦｖが存在する位置によって予想外の２つの標的に対する活性が生じる。
例えば、ＬＢ３０９（Ａｂ１０ ｓｃＦｖがＮｉｖｏＶＨ－ＨｃのＣ末端に位置する）、ＬＢ３０８（Ａｂ１０ ｓｃＦｖがＰｅｍＶＨ－ＨｃのＣ末端に位置する）、ＬＢ３１０（Ａｂ１０ ｓｃＦｖがＢａ０８ＶＨ－ＨｃのＣ末端に位置する）は、ＰＤ－１の結合活性に対する影響がそれぞれ１．３３、０．９３、０．５６倍の変化で、ＣＬＤＮ１８．２の結合活性に対する影響がそれぞれ４．２、６．５、７．３倍であった。つまり、同じ設計形態では、３つのＰＤ－１抗体の配列が異なる二重特異性抗体分子は、ＰＤ－１との結合活性にとほんど影響がない。しかし、ＣＬＤＮ１８．２との結合活性に影響が大きく、Ａｂ１０ ｓｃＦｖがＮｉｖｏＶＨ－ＨｃのＣ末端に位置する設計（ＬＢ３０９）では、活性がより良い。
ＬＢ３０２／ＬＢ３０１／ＬＢ３０７及びＬＢ３０９／ＬＢ３０８／ＬＢ３１０の活性のデータを比較したところ、同じ配列では、ｓｃＦｖがＨｃのＮ末端に位置するほうがＣ末端よりも活性に対する影響が小さく、本発明のＣＬＤＮ１８．２抗体の配列及びＰＤ－１抗体の配列の二重特異性抗体の設計には、ｓｃＦｖがＨｃのＮ末端に位置するのがより最適化の二重特異性抗体の設計である。
ＬＢ３０１及びＬＢ１５６を比較したところ、本発明で設計された二重特異性抗体は、ｓｃＦｖが異なるが、位置が同様で（いずれも重鎖のＮ末端）あり、ｓｃＦｖがＰＤ－１に対するもので、ＰＤ－１に対するその（ＬＢ１５６）結合活性が低下されなかった（活性変化が０．３４倍で、即ち、活性が増強された）が、ＣＬＤＮ１８．２に対する活性変化が４．８倍で、即ち、３．８倍低下したことが見出された。Ｎ末端のｓｃＦｖがＣＬＤＮ１８．２に対するものである場合、ＰＤ－１に対するその（ＬＢ３０１）結合変化が３．２倍で、即ち、２．２倍低下したが、ＣＬＤＮ１８．２に対する結合活性変化が２．１倍で、即ち、１．１倍低下したことが見出された。このような構造は活性に対する影響がＬＢ１５６と大いに異なる。
ＬＢ３０２及びＬＢ３０９を比較したところ、同じ標的のｓｃＦｖでは、例えば、いずれもＣＬＤＮ１８．２に対するｓｃＦｖであり、その位置が異なる場合も、活性に対する影響が意外と大いに異なることが見出された。ＰＤ－１に対するＬＢ３０２の結合活性変化が０．６８倍で（１に近く、即ち、影響がない）、ＣＬＤＮ１８．２に対する結合活性変化が１．１８倍であった（影響がない）。ＰＤ－１に対するＬＢ３０９の結合活性変化が４．２倍で、即ち、活性が３．２倍低下したが、ＣＬＤＮ１８．２に対する結合活性にほとんど影響がなかった（活性変化１．３３倍）。つまり、ｓｃＦｖが重鎖Ｎ末端に位置するほうがＣ末端よりも優れている。
ＬＢ３１２及びＬＢ３１３を比較したところ、同じ標的に対するｓｃＦｖでは、例えば、いずれもＡｂ１０ ｓｃＦｖ及びＰＤ－１抗体（Ｐｅｍ）で設計された二重特異性抗体で、Ａｂ１０ ｓｃＦｖがいずれもＰＤ－１抗体の軽鎖に連結しているが、位置が異なる場合、活性に対する影響が意外と大いに異なることが見出された。ＬＢ３１２のＡｂ１０
ｓｃＦｖはＰｅｍ ＬｃのＮ末端に、ＬＢ３１３のＡｂ１０ ｓｃＦｖはＰｅｍ ＬｃのＣ末端に位置する。ＬＢ３１３はＣＬＤＮ１８．２との結合活が１０倍以上低下し、ＬＢ３１２は１．６倍低下した。両者はＰＤ－１結合活性に対する影響が近い。つまり、Ａｂ１０ ｓｃＦｖが軽鎖Ｎ末端に位置するほうがＣ末端よりも良い。
ＰＤ－１抗体の重鎖Ｃ末端に１コピーのＡｂ１０ ｓｃＦｖが付加された場合（ＬＢ３１４）、意外に、これによってＣＬＤＮ１８．２との結合活性を向上させることができず（ＬＢ３０２と比較する）、しかもＰＤ－１の結合活性を低下させ、変化倍数が５．２倍であったことが見出された。つまり、Ｎｉｖｏの重鎖Ｃ末端に１コピーのＡｂ１０ ｓｃＦｖが付加された場合、２つの標的のいずれにも結合活性を低下させるか阻害する作用が
ある。
また、より正確に本発明の二重特異性抗体の結合力を評価するために、ＢｉａｃｏｒｅでＰＤ－１に対するＬＢ３０２、ＬＢ３０１の親和性を検出した。具体的に、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ装置によってＬＢ３０２対Ｎｉｖｏ（Ｌ１０１）、ＬＢ３０１対Ｐｅｍ（Ｌ１０５）のヒトＰＤ－１－ｈｉｓ（本発明の実施例１の方法によって発現された）との親和性を測定した。ｐＨ ７．４の稼働緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％のＰ２０）で、まず、プロテインＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ＃ ２１１８１）をバイオセンサーチップＣＭ５（Ｃａｔ． ＃ ＢＲ－１００５ －３０，ＧＥ）にカップリングし、チップを新しく調製された５０ｍＭ ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）及び２００ｍＭ ＥＤＣ塩酸塩（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ ｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ
ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）で活性化させた後、ｐＨ４．０の１０ ｍＭ ＮａＡＣで調製された１０μｇ／ｍｌのプロテインＡを注いだ。稼働緩衝液で濃度が１μｇ／ｍｌになるように被験サンプルを希釈し、捕獲信号が５０ＲＵ程度であり、抗原ＰＤ－１－ｈｉｓの濃度勾配は１００ ｎＭから、３倍希釈であり、流速が３０μｌ／分で、結合時間が１８０秒で、溶離時間が３００秒であった。実験後、１０ｍＭ グリシン塩酸（Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ）、ｐＨ １．５、３０ μｌ／ｍｉｎでチップを３０ｓ洗浄した。実施データをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０
（ＧＥ）ソフトによって１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでフィッティングし、親和性の数値ＫＤを得た。結果：ＬＢ３０２，１０．４ ｎＭ ｖｓ Ｌ１０１，８．６ ｎＭ；ＬＢ３０１，６．５ ｎＭ ｖｓ Ｌ１０５，４．４ ｎＭ。当該Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性（ＫＤ）は前記ＥＬＩＳＡの結果と一致し、即ち、本発明のＳＢｏｄｙ分子ＬＢ３０２、ＬＢ３０１は相応する抗体に近いＰＤ－１との結合活性を維持している。
Ａｂ６配列設計に基づいたＬＢ３０２２、ＬＢ３０１２は活性（上記表を参照する）がＬＢ３０２、ＬＢ３０１に近かった。
これらのデータから、本発明の抗体Ａｂ１０、Ａｂ６などの設計に基づいた構造がＩｇＧに類似する二重特異性抗体（抗ＣＬＤＮ１８．２及びヒトＰＤ－１）ＳＢｏｄｙは配列依存性及び配列位置依存性のものであることが分かる。例えば、Ａｂ１０配列に基づいて特定的に設計された二重特異性抗体は予想外の効果、即ち、好適な設計が得られ、例えばＬＢ３０２には２つの標的の結合活性が好適に残っている。
前記実施例の方法によって、本発明で設計された好適な分子のアポトーシス誘導活性（％）を評価することによって抗ＣＬＤＮ１８．２機能活性を比較した。アポトーシス活性はＡｂ１０抗体を同じ条件、同等の濃度（本実験では１５０ｎＭとした）において対照とした。ＰＤ－１抗原とリガンドＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する活性（ＩＣ５０）を検出することによって、抗ＰＤ－１の機能活性を評価したが、結果を下記表に示した。
Figure 0007468903000064
上記結果から、ＬＢ３０２、ＬＢ３０８、ＬＢ３１０はいずれも抗ＰＤ－１抗体の機能活性が残って低下せず、逆に増強したものもあった（ＬＢ３１０）。活性の増強は配列設計関連による相乗効果を反映する可能性がある。
抗ＣＬＤＮ１８．２の機能活性のデータから、Ａｂ１０ ｓｃＦｖが重鎖Ｎ末端にあるもの（ＬＢ３０２、ＬＢ３０１、ＬＢ３０７）は抗ＣＬＤＮ１８．２細胞活性に増強／相乗（Ａｂ１０抗体と比べ）効果があり、且つ異なるＰＤ－１抗体（Ｐｅｍ、Ｎｉｖｏ、Ｂａ０８）のいずれもそうであったことが分かる。一方、Ａｂ１０ ｓｃＦｖが重鎖Ｃ末端（ＬＢ３０９、ＬＢ３０８、ＬＢ３１０）に抗ＣＬＤＮ１８．２細胞活性を維持した。これらのデータから、本発明のＡｂ１０抗体に基づいて設計された二重特異性抗体（ＳＢｏｄｙ）は設計によって、予想外の活性効果が生じることが分かる。
安定性の評価（方法は前記実施例を参照する）から、二重特異性抗体（ＳＢｏｄｙ）ＬＢ３０２、ＬＢ３０９、ＬＢ１５６、ＬＢ３０１、ＬＢ３０８、ＬＢ３０７、ＬＢ３１０、ＬＢ３１２、ＬＢ３１３、ＬＢ３１４、ＬＢ３０２２、ＬＢ３０１２は、３７℃で１４日で保存した後、いずれも異なる程度の分解が生じ、ＰＤ－１及びＣＬＤＮ１８．２に対する結合活性がある程度低下され、部分的に１０倍以上低下したことが分かる。－８０℃で６０日、４℃で１４日保存した場合、活性が変化せず、これらの二重特異性分子は－８０℃、４℃で安定して保存できることが示された。
Figure 0007468903000065
上記結果から、本発明で設計された二重特異性抗体は、同じＡｂ１０抗体ｓｃＦｖ配列でＰＤ－１抗体の位置異なるもの（ＬＢ３０２ ｖｓ ＬＢ３０９、ＬＢ３０１ ｖｓ ＬＢ３０８、ＬＢ３０７ ｖｓ ＬＢ３１０）、同じＡｂ１０配列ｓｃＦｖ配列の位置で異なるＰＤ－１抗体のもの（ＬＢ３０２ ｖｓ ＬＢ３０１ ｖｓ ＬＢ３０７、ＬＢ３０９ ｖｓ ＬＢ３０８ ｖｓ ＬＢ３１０）、同じＡｂ１０及びＰＤ－１抗体ｓｃＦｖ又はＡｂ１０ ｓｃＦｖ配列及びＰＤ－１抗体のもの（ＬＢ１５６ ｖｓ ＬＢ３０１）で、意外に、異なる設計、発現量が配列に関連し、大いに異なることが見出された。収量が最も高いＬＢ３０９が収量が最も低いＬＢ１５６よりも６７倍高かった（２８．７／０．４２）。同じＡｂ１０ ｓｃＦｖが同じＰＤ－１抗体（Ｐｅｍ）の軽鎖のＮ末端にあるもの（ＬＢ３１２）とＣ末端にあるもの（ＬＢ３１３）でも発現量が異なる。１コピーのＡｂ１０ ｓｃＦｖが付加されたもの（ＬＢ３１４）は、発現量が単コピーのＡｂ１０ ｓｃＦｖのもの（ＬＢ３０２）よりも１２倍低下した（２．５７／０．２＝１２．９）。これらのデータから、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体に基づいて設計された二重特異性抗体（ＳＢｏｄｙ）は発現量が配列特異的なものであることが分かる。Ａｂ１０抗体の二重特異性抗体の設計における配列の位置、構造などはいずれも発現量に関連する。
ＬＢ３０２の軽鎖の配列：配列番号５３；重鎖を含む配列：配列番号５４。
実施例３０ ＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－Ｌ１の２つの標的に対する二重特異性抗体の設計及び活性評価
本発明では、ＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－Ｌ１の２つの標的に対して異なる配列構造の
二重特異性抗体を設計し、下記表に示した。
Figure 0007468903000066
Figure 0007468903000067
本発明の実施例２５の方法によってそれぞれ上記二重特異性抗体をクローニング・発現し、精製し、前記実施例の方法によってそれぞれこれらの二重特異性分子とヒトＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－Ｌ１との結合活性を検出したが、結果を下記表に示す。
Figure 0007468903000068
Figure 0007468903000069
ＬＢ１５７とＬＢ３０５を比較したところ、本発明の抗体Ａｂ１０及びＰＤ－Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏで構造がＩｇＧに類似する二重特異性抗体を設計すると、意外に、重鎖のＮ末端はＡｂ１０ ｓｃＦｖでもＡｔｅｚｏ ｓｃＦｖでも、ＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－Ｌ１に対する得られた二重特異性抗体の結合活性に影響がなかったことが見出された。また、安定性実験の結果から、ＬＢ１５７及びＬＢ３０５は３７℃で１４日保存しても、活性に変化がなく、そして電気泳動（ＰＡＧＥ）分析では、抗体に顕著な分解が見られなかったことが示された。本発明の抗体Ａｂ１０とＡｔｅｚｏ配列の組み合わせで設計された構造がＩｇＧに類似する二重特異性抗体は、２つの標的に対する結合活性が残り、通常の抗体精製方法によりプロテインＡを精製して得られ、プロセスが簡単で、且つ安定性が良いことが示された。
ＬＢ３１１のデータから、Ａｂ１０ ｓｃＦｖがＰＤ－Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏの重鎖Ｃ末端に連結して得られたＳＢｏｄｙは、ｈＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－Ｌ１に対する結合活性に影響がなかったことが分かる。
ＬＢ３１６、ＬＢ３１７のデータから、Ａｂ１０ ｓｃＦｖ及びＰＤ－Ｌ１抗体Ａｖｅｌで設計されたＳＢｏｄｙにおいて、Ａｂ１０ ｓｃＦｖがＡｖｅｌ重鎖のＮ末端にある時の効果がより良かったが、Ａｂ１０ ｓｃＦｖがＡｔｅｚｏ重鎖の両末端にある時の効果がいずれも良かったことが分かる。
ＬＢ３１９、ＬＢ３２０のデータから、Ａｂ１０ ｓｃＦｖ及びＰＤ－Ｌ１抗体Ｄｕｒｖで設計されたＳＢｏｄｙにおいて、Ａｂ１０ ｓｃＦｖがＤｕｒｖ重鎖のＮ末端にある時、ＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－Ｌ１に対する結合活性のいずれにも影響がなかったことが分かる。Ａｂ１０ ｓｃＦｖがＤｕｒｖ重鎖のＣ末端にある時、ＣＬＤＮ１８．２の結合活性にやや影響があり、ＰＤ－Ｌ１の結合活性に影響がなかった。
これらのデータから、３つのＰＤ－Ｌ１抗体及びＡｂ１０ ｓｃＦｖで設計されたＳＢｏｄｙにおいて、２つの標的に対する結合活性は配列の間に差異が存在する。即ち、ＳＢｏｄｙの活性は配列依存性である。Ａｂ１０ ｓｃＦｖ及びＡｔｅｚｏで設計されたＳＢｏｄｙは、意外に、パフォーマンスが最も良かった。
また、より正確に本発明の二重特異性抗体の結合力を評価するために、ＢｉａｃｏｒｅでＰＤ－Ｌ１に対するＬＢ１５７、ＬＢ３０５ ｖｓ ＬＢ１８５（Ａｔｅｚｏ）の親和性を検出した。Ｂｉａｃｏｒｅ方法は前記ＬＢ３０２に記載の方法と同様である。ＰＤ－１－ｈｉｓの代わりに、ＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入され、Ｃａｔ ＃： １００８４－Ｈ０８Ｈである）を使用した。得られた親和性（ＫＤ）の結果：ＬＢ１５７は５．２２ｎＭであり、ＬＢ３０５は３．０８ ｎＭであり、ＬＢ１８５は１．９７ ｎＭであった。当該結果から、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－Ｌ１（ａｔｅｚｏ）で設計されたＳＢｏｄｙでは、Ａｂ１０ ｓｃＦｖはａｔｅｚｏ結合活性にほとんど影響がなかった（ＬＢ３０５ ｖｓ ＬＢ１８５）が、ａｔｅｚｏ ｓｃＦｖがＡｂ１０の重鎖Ｎ末端にある場合、ＰＤ－Ｌ１に対する結合力が少々低下した（ＬＢ１５７ ｖｓ ＬＢ１８５）ことが示された。これは上記ＥＬＩＳＡ検出の結果と基本的に一致し、即ち、本発明で最適化して設計されたＳＢｏｄｙのＬＢ１５７、ＬＢ３０５は２つの標的に対する結合活性が残っている。
また、Ａｂ６配列に基づいて設計されたＬＢ１５７２、ＬＢ３０５２は、ＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－Ｌ１に対する活性にほとんど影響がなかった。
上記二重特異性抗体に対する機能的評価は、ＣＬＤＮ１８．２に対するＣＤＣ細胞活性、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合を遮断する活性を含むが、その結果は下記表を参照する。
Figure 0007468903000070
Ｃ５７ＢＬ／６ ｃｎｃ系マウス（浙江ＶＩＴＡＬ ＲＩＶＥＲ実験動物技術有限公司から購入され、生産許可証番号：ＳＣＸＫ（浙）２０１８－０００１である）で動物薬効モデルを構築し、本発明の二重特異性抗体ＬＢ１５７、ＬＢ３０５に対して体内薬効の評価を行った。
ＭＣ３８細胞（中国科学院細胞生物学研究所から購入された）で本実験に必要な安定的な発現細胞系ＭＣ３８－８０４（構築方法は前記実施例１と同様であり、ＭＣ３８の代わりにＣＨＯ－Ｋ１を使用した）を構築した。ＭＣ３８－８０４を１０％ウシ胎児血清（上海博昇生物科技有限公司、カタログ番号ＢＳ－０００２－５００）、１％Ｈｅｐｅｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（中国）有限公司、カタログ番号：１５６３００８０）を含有するＤＭＥＭ／高糖培地（上海源培生物科技股フン有限公司、カタログ番号：Ｌ１１０ＫＪ）で培養し、５％ＣＯ２を含有する３７℃の細胞インキュベーターにおいて培養し続けた。６週齢のＣ５７ＢＬ／６ ｃｎｃ雌マウスを５匹／籠でＳＰＦ級環境において飼育し、温度２０～２５℃、湿度４０％～６０％で、自由に摂取、飲水をさせ、定期的に敷材を交換した。
ＭＣ３８－８０４細胞が対数期（コンフルエント８０％～９０％）まで増殖した時点で、０．２５％トリプシンで消化し、細胞を収集し、そして無血清のＤＭＥＭ／高糖培地で細胞を２回洗浄し、最後に無血清のＤＭＥＭ／高糖培地で再懸濁させ、細胞を計数し、マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン医療機器上海有限公司から購入され、カタログ番号：３５４２３４である）で１：１の比率で細胞濃度が１×１０７細胞／ｍｌになるように調整し、接種に使用した。ＭＣ３８－８０４細胞懸濁液（１×１０６個）１００μｌをマウスの右脇部の皮下に接種し、体積が約１２０～１５０ｍｍ３まで成長した腫瘍細胞を選んでランダムに６匹ずつ群分けした。
無菌で被験サンプル及び陽性対照をＰＢＳで調製した。ブランク群はＰＢＳである。ＰＤ－Ｌ１抗体ＬＢ１８５＋Ａｂ１０は併用対照群である。ＬＢ１５７、ＬＢ３０５はそれぞれ二重特異性抗体薬物の被験群である。投与形態は腹腔内注射であり、ＬＢ１８５＋Ａｂ１０併用対照群では、マウスの投与量は抗体ごとに２０μｇずつ、２００μｌ／匹であった。ＬＢ１５７マウスの投与量は２６μｇ／２００μｌ／匹であり、ＬＢ３０５マウスの投与量は２６μｇ／２００μｌ／匹であった（併用群のＬＢ１８５、Ａｂ１０と等モル量である）。各群では、投与頻度は２回／週で、１．５週連続であった。
各注射サンプルの投与の当日を０日目とした。毎回の投与前に、体重、腫瘍体積を測定し、データを記録した。本実験の実際の投与周期は１．５週間であり、測定周期は２１日であった。
腫瘍の大きさの計算式：腫瘍体積ＴＶ（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径２）；腫瘍相対体積（ＲＴＶ）＝Ｔ／Ｔ０又はＣ／Ｃ０である。相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）＝１００％×（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）；腫瘍抑制率（ＴＧＩ）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％；ここで、Ｔ０、Ｔはそれぞれサンプル群の実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積であり、Ｃ０、Ｃはそれぞれ対照群の実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積である。
結果を下記表に示した。
Figure 0007468903000071
上記結果から、本発明のＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－Ｌ１に対する二重特異性抗体ＬＢ１５７は、薬効が同モル量の２つのモノクローナル抗体の併用によるものと同様であり、２１日目の腫瘍抑制率がそれぞれ５４％と５２％であったことが分かる。非常に意外なことに、ＬＢ３０５の腫瘍抑制率は２１日目で８０％に達し、モノクローナル抗体の併用による腫瘍抑制率５２％よりも顕著に優れた。
ＬＢ３０５の軽鎖の配列：配列番号５５；重鎖を含む配列：配列番号５６。
実施例３１ ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ４７の２つの標的に対する二重特異性抗体の設計及び活性評価
本発明では、ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ４７の２つの標的に対して異なる配列構造の二重特異性抗体を設計し、下記表に示した。
Figure 0007468903000072
本発明の実施例２５の方法によってそれぞれ上記二重特異性抗体をクローニング・発現し、精製し、前記実施例の方法によってそれぞれこれらの二重特異性分子とヒトＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ４７との結合活性を検出したが、結果を下記表に示した。
Figure 0007468903000073
上記結果（ＬＢ１５８及びＬＢ３０４）から、本発明の抗体Ａｂ１０及びＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９で構造がＩｇＧに類似する形態に設計され、設計された二重特異性抗体のＡｂ１０ ｓｃＦｖがＮ末端にある時（ＬＢ３０４）、Ａｂ１０の結合活性に影響が大きく、ＥＣ５０が７．５倍低下した（８．５－１＝７．５、上記表を参照する）ことが分かる。同じ配列の組み合わせで、異なる位置の場合、例えばＨｕ５Ｆ９ ｓｃＦｖが前記二重特異性抗体のＮ末端にある時（ＬＢ１５８）、ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ４７に対する結合活性に影響が小さく、ＥＣ５０が１倍程度低下した（上記表を参照する）。
ＬＢ１５８の機能活性の検出結果から、ＣＤ４７とリガンドＳＩＲＰαを阻害する活性ＩＣ５０が１．１３ｎＭであり、ＣＤ４７モノクローナル抗体Ｈｕ５Ｆ９ ＬＢ１５７のＩＣ５０が２．３７ ｎＭで１．１倍増強し、即ち、機能活性が低下されなかったことが分かる。ＣＬＤＮ１８．２機能活性を腫瘍細胞のアポトーシスの誘導で評価したところ、ＬＢ１５８の腫瘍細胞のアポトーシスの誘導は１１％であり、同じ条件、同じ濃度のＡｂ１０は腫瘍細胞のアポトーシスの誘導は１０．３％であった。即ち、ＬＢ１５８は抗ＣＬＤＮ１８．２の機能活性が低下しなかった。
安定性の検出結果から、ＬＢ１５８は－８０℃で６０日、４℃で１４日、３７℃で７日、１４日保存し、電気泳動（ＰＡＧＥ）分析では分解が見られなかったことが分かる。活性の検出結果から、ＣＬＤＮ１８．２に対するこの４つのサンプルの結合活性がそれぞれ０．６８ｎＭ、０．９８ｎＭ、０．６７ｎＭ、０．７３ｎＭであったことが分かる。ＣＤ４７に対する結合活性がそれぞれ０．０８ｎＭ、０．１２ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．１０ｎＭであったことが分かる。ＬＢ１５８は、これらの保存条件において、分子が安定して
おり（電気泳動の結果）、そして活性も安定していることが示された。
ＬＢ３２１の結果から、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及びもう一つのＣＤ４７抗体（ｉＭａｂ）で設計された二重特異性抗体（ｉＭａｂ ｓｃＦｖがＡｂ１０の重鎖Ｎ末端にある）は、抗ＣＬＤＮ１８．２の結合活性が維持されながら、ＣＤ４７の結合活性が１．５倍増加した（ＥＣ５０が０．４８４ｎＭ ｖｓ １．３８ｎＭである）ことが分かる。機能活性の検出結果から、ＬＢ３２１はＣＤ４７とリガンドＳＩＲＰαを阻害する活性ＩＣ５０及びＬＳ９５６（ｉＭａｂ）が１．６４倍変化したことが分かる。ＬＢ３２１は抗ＣＤ４７抗体の機能活性に影響がなかったことが示された。
安定性の検出結果から、ＬＢ３２１は、－８０℃で６０日、４℃で１４日で保存した場合、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤ４７との結合活性がいずれも変化せず、３７℃で１４日保存した場合、ＣＬＤＮ１８．２との結合活性ＥＣ５０が０．９９ｎＭから１０．１ｎＭに変わり、活性が１０倍近く低下され、ＣＤ４７との結合活性が０．７７ｎＭから１２．３ｎＭに変わり、活性が１５倍低下したことが分かる。ＬＢ３２１は４℃又は４℃以下で保存しても安定していることが示された。同時に、同様に設計されたＳＢｏｄｙは、ＣＤ４７抗体配列の違いにより、例えば安定性の方面では、ＬＢ１５８は安定性がＬＢ３２１よりも良いことが示された。
本発明で設計された二重特異性抗体の発現量を比較した結果は下記表に示された。
Figure 0007468903000074
上記結果から、本発明で設計された二重特異性抗体は、同じ配列で、位置が異なる場合（ＬＢ１５８ ｖｓ ＬＢ３０４）、同じ条件において発現量が大いに異なることが分かる。ＬＢ１５８はＬＢ３０４よりも収量が１倍以上高かった。ＬＢ１５８ ｖｓ ＬＢ３２１で、異なる配列（同一の標的に対するもの）が同じ手段でＡｂ１０と設計された二重特異性抗体も、同じ条件において発現量が大いに異なる（３７．９ ｖｓ １３．６）ことが示された。
これらの結果から、本発明の抗体Ａｂ１０及びＣＤ４７抗体で最適化設計（配列の構成やｓｃＦｖ位置など）で得られた最適化二重特異性分子は２つの標的に対する結合活性を維持しながら、安定性が良いことが示された。構造がＩｇＧに類似し、通常のＩｇＧと同じプロセスで精製することができ、後続の開発がより簡単で、実施しやすくなる。
実施例３２ ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３の２つの標的に対する二重特異性抗体の設計及び活性評価
本発明では、ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３の２つの標的に対して異なる配列構造の二重特異性抗体を設計し、下記表に示した。
Figure 0007468903000075
Figure 0007468903000076
本発明の実施例２５の方法によってそれぞれ上記二重特異性抗体をクローニング・発現し、精製し、前記実施例の方法によって、それぞれこれらの二重特異性分子のヒトＣＬＤＮ１８．２＋細胞との結合（ＥＬＩＳＡ）及びＣＤ３（Ｔ細胞）とのＦＡＣＳによる結合活性を検出したが、結果を下記表に示した。
Figure 0007468903000077
Figure 0007468903000078
上記結果（ＬＢ１５５，ＬＢ１９５；ＬＢ１９４，ＬＢ１９３）から、本発明の抗体Ａ
ｂ１０及びＣＤ３抗体で設計された構造がＩｇＧに類似する二重特異性抗体は、ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ又はＡＭＧ４２０由来のもの）がＮ末端にあることはＡｂ１０及びＣＬＤＮ１８．２に対する結合活性のいずれにも大きい影響があり、中でも、ＡＭＧ４２０ ｓｃＦｖ及びＡｂ１０で設計された二重特異性抗体ＬＢ１９４は、ＣＬＤＮ１８．２に対する影響が最も大きく、ＥＣ５０が６．２倍低下した（７．２－１＝６．２）ことが分かる。ＬＢ１９５対ＬＢ１５５、ＬＢ１９４対ＬＢ１９５の結果から、ＣＤ３抗体及び本発明のＡｂ１０で設計された二重特異性抗体では、ＣＤ３ ｓｃＦｖがＮ末端にある場合、ＶＨ－リンカー－ＶＬはＶＬ－リンカー－ＶＨよりも２つの標的の結合活性がより良く残っていることが示された。
また、ＬＢ１５５、ＬＢ１９５、ＬＢ１９４、ＬＢ１９３及びＬＢ３０３を比較した結果から、Ａｂ１０ ｓｃＦｖ及びＣＤ３抗体で設計された構造がＩｇＧに類似する二重特異性抗体は、ＣＤ３ ｓｃＦｖ及びＡｂ１０抗体から構成された二重特異性抗体よりも二重特異性抗体の結合活性がより良く残っていることが示された。
ＬＢ１９６の結果から、ＣＤ３ ｓｃＦｖがＣ末端にある場合、ＣＤ３の結合活性に影響がなく、活性変化倍数が０．７７であった（１未満）が、ＣＬＤＮ１８．２の結合活性に対する影響が大きかったことが示された。同じ条件において、ＣＬＤＮ１８．２に対するＬＢ１９６の結合活性がＡｂ１０のＣＬＤＮ１８．２との結合活性よりも２．５倍低下した（３．５－１＝２．５）。同様にＣＤ３ ｓｃＦｖ及びＡｂ１０抗体で設計された二重特異性抗体でも、ＣＤ３ ｓｃＦｖがＮ末端にある場合、２つの標的の結合活性がより良く残っていることが示された。
Ａｂ６及びＣＤ３抗体に基づいて設計された二重特異性抗体において、好適な分子ＬＢ１９５２は基本的にＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３との結合活性が残っていた。
機能活性の分析から、ＬＢ１９５、ＬＢ１９３はＣＤＣを活性化させる活性（前記実施例の方法によって抗ＣＬＤＮ１８．２機能を評価した）が、Ａｂ１０活性（ＥＣ５０）に対して変化倍数がそれぞれ１．７、２．２倍であったことが分かる。これらの変化倍数が実験誤差範囲内にあると、ＬＢ１９５、ＬＢ１９３はＣＬＤＮ１８．２に対する機能活性が残っていることが示される。ＰＢＭＣを活性化させて標的細胞を殺傷する活性（方法は前記実施例を参照する）の検出では、ＬＢ１９５、ＬＢ１９３の活性が相当し、標的細胞に対する特異的殺傷作用に投与量と効果の関係が示され、０．１μｇ／ｍｌの濃度において３０％～４０％の標的細胞が分解したことが見出された。
安定性分析の結果から、ＬＢ１９５及びＬＢ１９３は－８０℃で６０日、４℃で１４日、３７℃で７日、３７℃で１４日保存するなどの条件において、３７℃で１４天のみは、電気泳動（ＰＡＧＥ）ですこし分解が見られ、ほかはいずれも安定して分解がみられず、且つ活性がいずれも顕著な変化がなかったことが分かる。
これらから、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ及びＡｂ１０に基づいて二重特異的に設計された好適な分子ＬＢ１９５、ＬＢ１９３は２つの標的に対する結合活性及び機能活性が残っていることが示された。通常のＩｇＧ精製方法によって得られ、且つ安定して保存することができる。
Figure 0007468903000079
上記結果から、本発明のＡｂ１０及びＣＤ３抗体に基づいて設計された二重特異性抗体の発現量が最も良かったのはＬＢ１９６であることが分かる。
代表的な配列ＬＢ１９３の軽鎖配列：配列番号３８、それはＡｂ１０軽鎖であり、実施例６を参照する；重鎖を含む配列：配列番号４。
実施例３３ ＣＬＤＮ１８．２及びＴＧＦβの２つの標的に対する二重特異性抗体の設計及び活性評価
本発明では、ＣＬＤＮ１８．２及びＴＧＦβの２つの標的に対して異なる配列の構造がＩｇＧに類似する二重特異性抗体を設計したが、具体的に、本発明の抗体Ａｂ１０、Ａｂ６の軽鎖、重鎖のＮ又はＣ末端、好ましくは重鎖のＣ末端にＴＧＦβ受体ＩＩが融合され、得られた分子（ＴＲＡＰ）はＣＬＤＮ１８．２に結合しながら、ＴＧＦβ１、２、３に結合することができ、設計は下記表に示した。
Figure 0007468903000080
本発明の実施例２５の方法によって、それぞれ上記二重特異性抗体をクローニング・発現し、精製し、前記実施例の方法によって、それぞれこれらの二重特異性分子のヒトＣＬＤＮ１８．２及びＴＧＦβとの結合活性を検出したが、結果を下記表に示した。
Figure 0007468903000081
上記ＬＢ４０１の結合活性の結果から、本発明の抗体Ａｂ１０は重鎖のＣ末端にＴＧＦβＲＩＩが結合しており、ヒトＣＬＤＮ１８．２に対する結合活性が残りながら、ＴＧＦβＩに対する結合活性、ならびにＴＧＦβＩＩ及びＴＧＦβＩＩＩに対する高度の選択性が残っていることが分かる。また、ＴＧＦβに対するＬＢ４０１とＬＢ８２４の結合活性を比較したところ、ＴＧＦβ１、２、３に対する本発明の抗体Ａｂ１０にＴＧＦβＲＩＩが融合して得られたＬＢ４０１の結合活性は、ＰＤ－Ｌ１抗体にＴＧＦβＲＩＩが融合したＴｒａｐ（ＬＢ８２４）の結合特性（Ｐｒｏｆｉｌｅ）と一致していることが見出された。
Ａｂ１０の代わりにＡｂ６で得られたＬＢ４０１２は、同様に２つの標的に対する結合活性が残っている。
安定性分析の結果から、ＬＢ４０１は－８０℃で６０日、４℃で３０日、３７℃で７日、３７℃で１４日保存するなどの条件において安定で、電気泳動（ＰＡＧＥ）分析では、３７℃で１４日保存すると、分解が見られ、ＴＧＦβＩ、ＩＩ、ＩＩＩの結合活性が低下し、ＣＬＤＮ１８．２の結合活性に影響がなかったことが分かり、図８を参照する。そのため、ＬＢ４０１は－８０℃又は４℃で安定して保存することができる。
また、ＬＢ４０１及びＬＢ８２４に対して平行に血清安定性の評価を行った。具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢、雌、上海ＳＩＰＰＲ－ＢＫ実験動物有限公司から購入された。）から血液を取り、１２０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血清を取って使用に備えた。３μｌのサンプル（１μｇ／μｌ， ｐＨ７．４ ＰＢＳ）を取って上記血清２７μｌで希釈し、最終濃度が０．１μｇ／ｍｌであった。それぞれ３７℃で０ｈ、２４ｈ及び７２ｈ処理した後、そのヒトＣＬＤＮ１８．２＋細胞及びＴＧＦβＩとの結合活
性を検出した。結果は以下の通りであった。
Figure 0007468903000082
上記結果から、ＬＢ４０１を血清で２４時間インキュベートしても、ＣＬＤＮ１８．２及びＴＧＦβＩに対する結合活性にいずれも影響がなかったことが分かる。７２時間では、ＣＬＤＮ１８．２に対する結合活性が２倍以上低下し（０．４２４ ｖｓ ０．１１）、ＴＧＦβＩに対する結合活性も低下し、これは現在の臨床試験の同種類の分子ＬＢ８２４の安定性に類似する。
前記実施例３０と同じ動物モデル（ＭＣ３８－８０４）及び方法によって、本発明のＣＬＤＮ１８．２及びＴＧＦβに対して設計された二重特異性抗体（ＴＲＡＰ）に対して体内薬効の評価を行った。無菌で被験サンプル及び陽性対照をＰＢＳで調製した。ブランク群はＰＢＳであった。Ａｂ１０は単独投与対照群であり、ＬＢ８２４は二重特異性抗体薬物対照群である。ＬＢ４０１は本発明の好適な二重特異性抗体薬物の被験群である。投与形態は腹腔内注射であり、Ａｂ１０の投与量が１２０μｇ／２００μｌ／匹であり、ＬＢ８２４、ＬＢ４０１の投与量は１６０μｇ／２００μｌ／匹であった。各群では、投与頻度は２回／週であり、３週連続であった。結果を下記表に示した。
Figure 0007468903000083
上記結果から、この動物モデルにおいて、Ａｂ１０単独では、薬効が弱く、２４日目にわずか１２％の腫瘍抑制率が示されたことが分かる。ＰＤ－Ｌ１及びＴＧＦβに対する分子ＬＢ８２４（薬効モデルの対照分子として）は、２４日目に５６％の腫瘍抑制率が示された。非常に意外なことに、本発明で設計されたＣＬＤＮ１８．２及びＴＧＦβに対する二重特異性抗体（ＴＲＡＰ）ＬＢ４０１はＡｂ１０と同じモル量で、２４日目の腫瘍抑制率が６１％に達し、ＬＢ８２４（５６％）よりも良く、単独Ａｂ１０（１２％）よりも顕著に優れた。
上記結果から、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及びＴＧＦβＲＩＩで最適化して設計された二重特異性分子は、２つの標的に対する優れた活性が残り、動物における薬効が顕著で、しかも分子が安定で、精製プロセス（プロテインＡ結合）が簡単で実行しやすいことが分かる。
ＬＢ４０１の軽鎖配列（配列番号３８）は、Ａｂ１０軽鎖であり、実施例６を参照する。
ＬＢ４０１の重鎖を含む配列（配列番号５７）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＮＹＬＩＥＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＹＹＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳ
ＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ
実施例３４ ＣＬＤＮ１８．２及びＩＬ１０の２つの標的に対する二重特異性抗体の設計及び活性評価
本発明では、ＣＬＤＮ１８．２及びＩＬ１０の２つの標的に対してＡｂ１０抗体及びサイトカインの融合分子が設計された。具体的に、本発明の抗体Ａｂ１０、Ａｂ６の軽鎖、重鎖のＮ及び／又はＣ末端、好ましくは重鎖のＣ末端和Ｎ末端にＩＬ１０分子が融合され、設計は下記表に示した。
Figure 0007468903000084
Figure 0007468903000085
本発明の実施例２５の方法によって、それぞれ上記二重特異性抗体をクローニング・発現し、精製し、前記実施例の方法によってそれぞれこれらの二重特異性分子のヒトＣＬＤＮ１８．２及びＩＬ１０との結合活性を検出したが、結果を下記表に示した。
Figure 0007468903000086
上記結合活性の結果から、本発明の抗体Ａｂ１０及びサイトカインＩＬ１０で設計された二重特異性分子ＬＢ４３２及びＬＢ４３３、ＬＢ４３３２は、ＣＬＤＮ１８．２との結合活性がＡｂ１０、Ａｂ６と同様であった（活性変化が２倍程度であった）ことが分かる。ＩＬ１０との結合活性は抗原被覆ＥＬＩＳＡ及びサンドイッチ方ＥＬＩＳＡによって評価した。具体的に、抗原被覆ＥＬＩＳＡの検出方法は前記実施例３を参照する。その結果、ＬＢ４３２、ＬＢ４３３及びＬＢ４３３２のＥＣ５０はそれぞれ０．３４、０．１４及び０．２ｎＭであった。活性の差は２倍程度で、実験誤差範囲に近かった。
同じ条件において、ＥＬＩＳＡによって検出されたＩＬ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ＃：２００－１０）の結合活性ＥＣ５０は４．５３ｎＭであった。つまり、本発明の二重特異性分子ＬＢ４３２、ＬＢ４３３及びＬＢ４３３２は、ＩＬ１０結合活性が組み換えＩＬ１０結合活性よりも強かった。
サンドイッチ法ＥＬＩＳＡ方法：実施例２で構築されたヒトＣＬＤＮ１８．２＋を、１０×１０４／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ＃ＣＬＳ３５９９－１００ＥＡ）に敷き、３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートした後、上清を除去し、免疫染色固定液（上海碧雲天生物技術有限公司Ｃａｔ ＃ Ｐ００９８）を使用して１００μｌ／ウェルで室温で半時間固定させた。ＰＢＳで一回洗浄した後、２３０μｌ
の５％牛乳で３７℃で２時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。５０μｌ／ウェルで１％ ＢＳＡで５倍連続希釈された被験抗体を入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０ μｌ／ウェルで１：４００で希釈されたＨＲＰで標識されたウサギ抗ヒトＩＬ１０（ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｔ＃ＳＥＫＡ１０９４７）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ呈色基質（ＫＰＬ，５２－００－０３）を入れ、室温で５～１０ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ／孔の１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させ、ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５１１１９２００）によって、４５０ｎｍにおいて吸収値を読み取り、ＯＤ値からＥＣ５０を計算した。サンドイッチ法ＥＬＩＳＡの結果から、ＬＢ４３２の結合活性（１１．３ ｎＭ）が顕著にＬＢ４３３（０．７７ ｎＭ）よりも弱かった。同じＩＬ１０配列がＡｂ１０のＮ末端かＣ末端にあるかで、それぞれＣＬＤＮ１８．２及びＩＬ１０と結合する活性に影響が大きくなかったが、ＬＢ４３２はＣＬＤＮ１８．２に結合した後、さらにＩＬ１０に結合する活性がＬＢ４３３よりも１０倍以上低下した（１１．３ｎＭ ｖｓ ０．７７ ｎＭ）。
つまり、ＬＢ４３２のＮ末端へのＩＬ１０の連結は「立体障害」が存在し、即ち、得られた二重特異性分子が単独で２つの標的に結合する活性に影響がないが、その一方に結合していると、当該分子のもう一方の標的への結合が阻害／影響される。本発明の他の二重特異性分子ＳＢｏｄｙにおいて、ＬＢ３０２、ＬＢ３０１、ＬＢ１５７、ＬＢ３０５、ＬＢ１５８、ＬＢ１９５、ＬＢ１９６、ＬＢ４０１などを含み、サンドイッチ法ＥＬＩＳＡによる検出では、いずれもその一方の標的の結合がもう一方の標的の結合に影響すること（立体障害）が見出されなかった。
上記データから、本発明では、意外に、抗体Ａｂ１０及びＩＬ１０で設計された二重特異性抗体の最適化配列はＬＢ４３３であり、即ち、ＩＬ１０がＡｂ１０の重鎖のＣ末端に融合するのが最も好ましいことが見出された。
安定性の検出結果から、ＬＢ４３２及びＬＢ４３３は－８０℃で６０日、４℃で３０日、３７℃で７日、３７℃で１４日保存するなどの条件下で安定で、電気泳動（ＰＡＧＥ）分析では顕著な分解が見られず、ＬＢ４３２及びＬＢ４３３は安定性が良いことが分かる。
また、ＬＢ４３２及びＬＢ４３３に対して血清安定性の評価を行った。具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢、雌、上海ＳＩＰＰＲ－ＢＫ実験動物有限公司から購入された。）から血液を取り、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血清を取って使用に備えた。３μｌのサンプル（１μｇ／μｌ，ｐＨ７．４ ＰＢＳ）を取って上記血清２７μｌで希釈し、最終濃度が０．１μｇ／ｍｌであった。それぞれ３７℃で０ｈ、２４ｈ及び７２ｈ処理した後、そのヒトＣＬＤＮ１８．２＋細胞及びＩＬ１０抗体との結合活性を検出した。結果は以下の通りであった。
Figure 0007468903000087
上記血清安定性の結果から、ＬＢ４３３は血清で７２ｈインキュベートした後、ＣＬＤＮ１８．２との結合活性改変が１．６４倍（０．２６４／０．１６１）であり、同じ条件下でＬＢ４３２は３．４（１．２／０．３５７）であり、ＩＬ１０との結合活性において、ＬＢ４３３は変化が０．６７倍（０．１１３／０．１６８）であり、同じ条件下で、ＬＢ４３２は１．４（０．１１５／０．０８３）であった。ＬＢ４３３の血清安定性がＬＢ４３２よりも良かったことが示された。
Figure 0007468903000088
上記結果から、ＬＢ４３３１、ＬＢ４３３３、ＬＢ４３３４、ＬＢ４３３５の結合活性（ＣＬＤＮ１８．２， ＩＬ１０）は、ＬＢ４３３に近かったことが分かる。これらの分子は、ＬＢ４３３との相違点が、ＣＤ６４ （ＦｃγＲ Ｉ）に対するその結合活性が顕
著に低下したことにある。
前記実施例３０と同じ動物モデル（ＭＣ３８－８０４）及び方法によって本発明のＣＬＤＮ１８．２及びＩＬ１０に対して設計された二重特異性抗体に対して体内薬効の評価を行った。無菌で被験サンプル及び陽性対照をＰＢＳで調製した。ブランク群はＰＢＳである。Ａｂ１０は単独投与対照群である。ＬＢ４３３は二重特異性抗体薬物の被験群である。投与形態は腹腔内注射であり、Ａｂ１０の投与量が６０μｇ／２００μｌ／匹であり、ＬＢ４３３の投与量は８０μｇ／２００μｌ／匹であった。各群では、投与頻度は２回／週であり、１．５週連続であった。結果を下記表に示す。
Figure 0007468903000089
上記結果から、この動物モデルにおいて、Ａｂ１０単独では、薬効が弱く、２１日目にわずか４％の腫瘍抑制率が示され、即ち、動物における薬効が見られなかったことが分かる。非常に意外なことに、本発明のＣＬＤＮ１８．２及びＩＬ１０に対して設計された二重特異性抗体ＬＢ４３３は、Ａｂ１０と同じモル量で、２１日目の腫瘍抑制率が８１％に達し、単独のＡｂ１０（４％）よりも顕著に優れており、Ｔ検定分析のＰ値が＜０．０５であった。
ＬＢ４３３の軽鎖配列（配列番号３８）は、Ａｂ１０軽鎖であり、実施例６を参照する。
ＬＢ４３３の重鎖を含む配列（配列番号５８）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＮＹＬＩＥＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＹＹＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ
ＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ
ＬＢ４３３３の軽鎖の配列（配列番号３８）；ＬＢ４３３３の重鎖を含む配列（配列番号５９）；
ＬＢ４３３１の軽鎖の配列（配列番号３８）；ＬＢ４３３１の重鎖を含む配列（配列番号６０）；
ＬＢ４３３５の軽鎖の配列（配列番号３８）；ＬＢ４３３５の重鎖を含む配列（配列番号６１）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＮＹＬＩＥＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＹＹＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ
実施例３５ ＣＬＤＮ１８．２及びＬＡＧ３、ＣＬＤＮ１８．２及びＴｉｍ３の２つの標的に対する二重特異性抗体の設計及び活性評価
本発明では、ＣＬＤＮ１８．２及びＬＡＧ３の２つの標的、ならびにＣＬＤＮ１８．２及びＴｉｍ３の２つの標的に対してそれぞれ二重特異性抗体を設計し、下記表に示した。
Figure 0007468903000090
本発明の実施例２５の方法によってそれぞれ上記二重特異性抗体をクローニング・発現し、精製し、前記ＥＬＩＳＡ方法によってそれぞれこれらの二重特異性分子のヒトＣＬＤＮ１８．２及びＬＡＧ３、Ｔｉｍ３との結合活性を検出したが、結果を下記表に示した。
Figure 0007468903000091
上記結果から、本発明の抗体Ａｂ１０及びＬＡＧ３、Ｔｉｍ３抗体で設計された構造がＩｇＧに類似する二重特異性抗体分子（ｓｃＦｖがＡｂ１０の重鎖のＮ末端にある）は、ＣＬＤＮ１８．２及びＬＡＧ３、Ｔｉｍ３に対する結合活性を維持しながら、安定して発現し、精製することができる。
実施例３６ ＣＬＤＮ１８．２それぞれ及びＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７の２つの標的の抗体のＤＶＤ構造の設計及び評価
本発明では、ＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７に対してそれぞれＤＶＤ形態で二重特異性抗体を設計し、下記表に示した。
Figure 0007468903000092
本発明の実施例２５の方法によって、それぞれ上記二重特異性抗体をクローニング・発現し、精製し、ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行った結果から、これらの抗体の軽鎖、重鎖はいずれもリンカー間の断裂現象が生じやすいことが示された。一方、ｓｃＦｖの形態で１つの標的の抗体をもう１つの標的の抗体の軽鎖又は重鎖のＮ又はＣ末端に連結し、スクリーニングによって設計が最適化された二重特異性抗体を得ると、リンカー間の断裂を防止／減少し（前記実施例を参照する）、そして２つの標的の結合活性、機能活性を維持できる。好適な二重特異性抗体（本発明では、ＳＢｏｄｙと呼ばれる）は、安定しながら、構造が通常のＩｇＧに類似し、精製プロセスが簡単で、これは後続の開発過程におけるプロセス、精製に大いに便利を提供する。
実施例３７ ＣＬＤＮ１８．２に対するＣＡＲ分子の設計
本発明のＣＬＤＮ１８．２に対する新たなＣＡＲ分子の設計は先に公開された特許ＣＮ１０６７５５１０７Ａを参照する。
具体的に、本発明で設計されたＣＡＲ分子の核酸構築体の一般式はＣＡＲ－［（ＩＲＥＳ）－ｆ］ｑである。当該一般式において、ＣＡＲはキメラ抗原受体を表し、ｓｃＦｖ－Ｈ－ＴＭ－Ｓ－ＣＤ３ζを含み、ここで、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ、ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は特異的にＣＬＤＮ１８．２抗原を標的とする一本鎖可変断片であり、一本鎖抗体、一本鎖可変領域とも呼ばれる。その配列は本発明で発見された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（前記実施例を参照する）の可変領域の配列から構成される。その構造はＶＬ－リンカー－ＶＨ又はＶＨ－リンカー－ＶＬであり、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｗが好ましく、ｗは０、１、２、３、４であり、好ましくはｗ＝３又はｗ＝４である。Ｈはヒンジドメインであり、ＴＭは膜貫通ドメインであり、Ｓは共刺激シグナル伝達領域である。前記共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８由来の共刺激分子、及び／又は４－１ＢＢ由来の共激分子を含む。一般式において、ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列（細胞内領域）である。
ＩＲＥＳは内部リボソーム進入部位配列（Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ、ＩＲＥＳ）を表し、ｆは機能性タンパク質Ｆをコードし、ｑは０又は非０自然数である。前記機能性タンパク質はサイトカインＩＬ１０、ＩＬ１５又はその活性断片、及び／又は前記サイトカインの受容体、例えばＩＬ１５受容体又はその活性断片、及び／又はサイトカイン、例えばＩＬ１０、ＩＬ１５又はその活性断片とＩＬ１５受容
体ｓｕｓｈｉ＋断片の融合断片を含む。
設計されたＣＡＲ分子は構造にｆ部分がない場合、当該ＣＡＲ分子もＩＲＥＳ配列がない。また、ＩＲＥＳ及び（ＩＲＥＳ）は同じ意味を表し、ＩＲＥＳの外に括弧「（）」が含まれる場合、ＩＲＥＳ配列が核酸構築体のみに存在し、ＩＲＥＳ配列を含むヌクレオチドがタンパク質のコーディングに使用される場合、当該ＩＲＥＳ配列は相応するタンパク質をコードするのではなく、ＩＲＥＳ配列の前又は後ろのヌクレオチド配列がそれぞれ異なるタンパク質断片（即ち、ＣＡＲ及びｆ）をコードし、且つ異なるタンパク質断片同士はそれぞれ離れている。
上記ＣＡＲ又はＣＡＲ－（ＩＲＥＳ）－ｆ分子において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の配列の可変領域に基づいて設計されたｓｃＦｖの配列は本発明の新たな抗体配列であり、上記実施例を参照する。ｓｃＦＶ部位はＦａｂ又は単一ドメイン抗体（ｓｄＦｖ）の構造でもよい。他の配列（ｓｃＦｖ以外の配列）は米国国立医学図書館サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂ ｍｅｄ．ｃｏｍ、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから検索して得られ、ヒトＣＤ８αシグナルペプチド、ヒトＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通領域、ヒトＣＤ２８細胞内領域、ヒト４－１ＢＢ細胞内領域、ヒトＣＤ３ζ細胞内領域、内部リボソーム進入エレメント（ＩＲＥＳ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）、ヒトＩＬ１５（特許ＣＮ１０６７５５１０７Ａにおける配列番号２２と同じ）、ヒトＩＬ１５受容体α（ＩＬ１５Ｒα）野生型及び突然変異／ｓｕｓｈｉ部分（ＵＳ２０１４／０１３１４； ＷＯ２００７／０４６００６）、ヒトＩＬ１０（配列番号２）タンパク質配列などを含む。すべてのクローンに構築された塩基配列はいずれもタンパク質配列からコドンの最適化を行うことで、コードアミノ酸配列が変わらないままでヒト細胞による発現により適するようにした。
ＩＬ１０のヌクレオチド配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００５７２で示される配列である。
具体的に、本発明の代表的なＣＡＲ分子の構築は、公開番号がＣＮ１０６７５５１０７Ａの特許出願に記載の方法を参照する。当該特許の実施例３のＪＸ００５プラスミド（ｐＢＡＢＥｐｕｒｏ由来のもの）におけるコードｃ－Ｍｅｔ抗体のｓｃＦｖを本発明のＡｂ１０のｓｃＦｖに変えると、本発明のＣＡＲの新たな分子ＣＡＲ１ａのプラスミドＪＸ１ａが得られる。プラスミドＪＸ１ａでコードされるＣＡＲ１ａのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＦＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＮＹＬＩＥＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＹＹＧＮＳＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号３）
ここで、１～２４６位はＡｂ１０に結合したｓｃＦｖコード配列であり、２４７～２９３位はヒトＣＤ８αヒンジ領域のコード配列（下線部分）であり、２９４～３１５位はヒトＣＤ８α膜貫通領域のコード配列であり、３１６～３５７位は４－１ＢＢ細胞内領域のコード配列であり、３５８～４６９位はＣＤ３ζ 細胞内シグナル領域のコード配列である。
ここで、１～６３位のヌクレオチド（下線部分）はシグナルペプチドのコード領域である。６４～８０１位はＣＬＤＮ１８．２が結合したＡｂ１０抗体のＳＣＦＶのコード配列であり、８０２～９４２位はヒトＣＤ８Αヒンジ領域のコード配列であり、９４３～１００８位はヒトＣＤ８α膜貫通領域のコード配列であり、１００９～１１３４位は４－１ＢＢ細胞内領域のコード配列であり、１１３５～１４７０位はＣＤ３Ζ 細胞内シグナル領域のコード配列である。
公開番号がＣＮ１０６７５５１０７Ａの特許出願における実施例５で構築されたＪＸ００７プラスミドにおけるコードｃ－Ｍｅｔ抗体のｓｃＦｖを、本発明のＡｂ１０のｓｃＦｖに取り替えて（方法は本発明のＪＸ１ａの構築方法と同じである）、本発明のＣＡＲの新たな分子ＣＡＲ３ａｂに使用されるプラスミドＪＸ３ａｂを得た。プラスミドＪＸ３ａｂでコードされるアミノ酸配列は上記ＪＸ１ａがコードする配列と同様であり、また、サイトカインＩＬ１５の活性断片（野生型）をコードする。ＩＬ１５活性断片のヌクレオチド配列は、任意の既存技術においてそれをコードする配列、例えばＣＮ１０６７５５１０７Ａの配列番号３１の６９９～１０４０位のヌクレオチド配列でもよい。
上記で構築されたプラスミドＪＸ３ａｂにおけるＩＬ１５をコードする配列（例えばＣＮ１０６７５５１０７Ａの配列番号３１の６９９～１０４０位のヌクレオチド配列）の代わりに、ＩＬ１０をコードする配列（例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００５７２で示される配列）を使用して、本発明の新たなＣＡＲ分子ＣＡＲ３ａｂ１０のプラスミドＪＸ３ａｂ１０を得た。
上記プラスミドＪＸ３ａｂ１０は、以下のようなＩＬ１０タンパク質配列をコードする。
ＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ（配列番号２）
特許ＣＮ１０６７５５１０７Ａの実施例６で構築されたＪＸ００８プラスミドにおけるコードｃ－Ｍｅｔ抗体のｓｃＦｖを、本発明のＡｂ１０のｓｃＦｖに取り替えて（方法は本発明のＪＸ１ａの構築方法と同じである）、本発明のＣＡＲの新たな分子ＣＡＲ４ａに使用されるプラスミドＪＸ４ａを得た。ＪＸ４ａがコードするアミノ酸配列は、上記ＣＡＲ１ａのコード配列以外、サイトカインＩＬ１５の活性断片（突然変異型）とＩＬ１５Ｒα （ｓｕｓｈｉ＋）の融合タンパク質をコードし、ｓｕｓｈｉ＋とはｓｕｓｈｉ断片以外、さらに他のポリペプチド断片を含む。
上記同じ方法により、Ａｂ１０抗体のｓｃＦｖの代わりにＡｂ６抗体配列のｓｃＦｖを使用して、ＣＡＲの新たな分子ＣＡＲ１ａ．２、ＣＡＲ３ａｂ．２、ＣＡＲ３ａｂ１０．２及びＣＡＲ４ａ．２に相応するプラスミドＪＸ１ａ．２、ＪＸ３ａｂ．２、ＪＸ３ａｂ１０．２及びＪＸ４ａ．２を構築した。
実施例３８ ＣＬＤＮ１８．２に対して設計されたＣＡＲ分子の同定
ウイルスのパッケージング、製造及び濃縮：ウイルスの製造方法は特許ＣＮ１０６７５５１０７Ａで使用される方法を参照し、三プラスミドウイルスパッケージングシステムｐＧａｇ－Ｐｏｌ、ｐＶＳＶＧ及び本発明の新たな各ＣＡＲ分子の発現プラスミドｐＢＡＢＥｐｕｒｏ（いずれも優宝生物から購入された）を使用し、例えばＪＸ１ａ、ＪＸ３ａｂ、ＪＸ３ａｂ１０又はＪＸ４ａで２９３細胞に共形質移入させてウイルス上清を得、超遠心分離によって濃縮して濃縮されたウイルスを得た。
具体的に、パッケージングプラスミドｐＧａｇ－Ｐｏｌ、ｐＶＳＶＧ及び発現プラスミドＪＸ１ａ、ＪＸ３ａｂ、ＪＸ３ａｂ１０又はＪＸ４ａを、６μｇずつ、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃａｔ＃： ２３９６６－２）３６μｇと均一に混合し、室温で５ｍｉｎ静置し、２９３細胞（中国科学院典型培養物寄託委員会細胞ライブラリー）に入れた。４８ｈ培養し、１次上清を回収し、次の日に、７２ｈ培養し、２次上清を回収した。２回の上清を合併し、３ｍＬの２０％ショ糖溶液を入れ、ウイルス上清を注意してショ糖溶液の上に敷き、１２５０００ｇで１．５時間遠心分離し、ＰＢＳで低温で沈殿を再懸濁させ、分注して－８０℃で凍結保存した。ウイルスはそれぞれ１ａ、３ａｂ、３ａｂ１０、４ａと表示する。超遠心機の型番はＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ ＸＰＮ－１００であり、ローターの型番はＳＷ３２ｉであり、超遠心管はＢｅｃｋｍａｎ ３４４０５８であった。
ウイルス力価の検出：勾配希釈されたウイルスで２９３細胞に感染させ、４８時間後、プロテインＬで染色してｓｃＦｖを発現する細胞の陽性率を確認する方法によって、ウイルスの力価を確認した。具体的に、それぞれ２０μｌのウイルス（１ａ、３ａｂ、３ａｂ１０、４ａ）を１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃： １００９９１４１）、０．８μｇ ポリブレン（上海翊盛生物科技有限公司、Ｃａｔ＃： ４０８０４ＥＳ７６）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（培源生物，Ｃａｔ＃Ｌ２１０ＫＪ）で５倍勾配で希釈し、最終の系は２５０μｌであった。予めプラートに敷いた２９３細胞に入れ、全培養系は５００μｌ／ウェルであり、２９３細胞は５×１０４個／ウェルであった。４８ｈ後、細胞を収集し、ビオチン－プロテインＬ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、カトログ番号Ｍ０００９７）で２９３細胞を１μｌ／サンプルで標識した。室温で２０ｍｉｎインキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液を１ｍｌ入れ、遠心分離して細胞を洗浄した。ＦＡＣＳ緩衝液１００μｌで再懸濁させ、ＰＥで標識されたストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カトログ番号１２－４３１７－８７）を０．４μｌ／サンプルで入れ、室温で２０ｍｉｎインキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液を１ｍｌ入れ、遠心分離して細胞を洗浄した。ＦＡＣＳによって陽性細胞の比率を検出し、陽性の比率が１０％になった時のサンプルを取ってウイルスの力価を計算し、力価（ＩＵ／ｍｌ）＝陽性率×２９３細胞数×希釈倍数／ウイルス液体積であった。結果から、今回で得られた１ａ、３ａｂ、３ａｂ１０及び４ａウイルスの力価はそれぞれ９．２、１．３、３．２及び１．５×１０６ＩＵ／ｍｌであったことが分かる。
ＣＡＲＴ細胞の調製：健常なボランティアから新鮮な末梢血を採取し、特許ＣＮ１０６７５５１０７Ａにおける同じ方法によって末梢血の単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）を分離した。ＰＢＭＣを抗ヒトＣＤ３、ＣＤ２８抗体がカップリングされた磁気ビーズ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１３１Ｄ）で４０～４８ｈ活性化させた後、それぞれウイルス１ａ、３ａ、３ａｂ１０、４ａ（ＭＯＩが０．０５～５の範囲にある）、ポリブレン（最終濃度８μｇ／ｍｌ）を入れた。３ｈ感染させ、１ｍｌまで液を追加し、一晩で液を交換し、培地が１０％ＦＢＳ、５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ２（北京四環生物製薬有限公司，Ｃａｔ＃：Ｓ２００４０００７）を含有するＲＰＭＩ １６４０であった。１日おきに液を交換して１：２で培養体積を、体内外実験に十分な細胞が得られるまで拡大した。感染後、各ＣＡＲ分子のＴ細胞（ＣＡＲＴ細胞）をそれぞれＣＡＲＴ１ａ、ＣＡＲＴ３ａｂ、ＣＡＲＴ３ａｂ１０及びＣＡＲＴ４ａ細胞と表示し、未感染のＴ細胞（ブランクベクター）を陰性細胞（対照）とした。
本発明のＣＡＲＴ分子Ａｂ１０抗体ｓｃＦｖの発現・同定：上記各ＣＡＲＴ細胞はプロテインＬで染色することによってＣＡＲＴ分子ｓｃＦｖの発現及び感染細胞の陽性率を確認した。具体的に、感染後のＴ細胞（ＣＡＲＴ細胞）を２×１０５個収集し、ビオチン－プロテインＬ（南京ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社、カタログ番号Ｍ０００９７）で細胞を標識した（標識方法は前記ウイルス力価の検出と同様である）。ＦＡＣＳによってＣＡＲＴ陽性
細胞の比率を検出し、陰性細胞を対照とした。陽性率＝ＣＡＲＴ細胞ＦＡＣＳ（％）－陰性細胞（対照） ＦＡＣＳ（％）であり、結果を下記表５７ａに示した。
上記と同じ方法によってＣＡＲＴ１ａ．２、ＣＡＲＴ３ａｂ．２、ＣＡＲＴ３ａｂ１０．２及びＣＡＲＴ４ａ．２を製造した。検出されたＡｂ６抗体ｓｃＦｖの陽性率がＣＡＲＴ１ａ、ＣＡＲＴ３ａｂ、ＣＡＲＴ３ａｂ１０及びＣＡＲＴ４ａに近く、表５７ｂを参照する。
Figure 0007468903000093
Figure 0007468903000094
上記結果から、本回の実験の４種類のＣＡＲＴ細胞（Ａｂ１０及びＡｂ６のｓｃＦｖを含む）の陽性率が２０％～４７％であり、得られたＣＡＲＴ細胞のいずれも正常にＡｂ１０又はＡｂ６抗体のｓｃＦｖを発現したことが確認された。以下、ＣＡＲＴ１ａ、ＣＡＲＴ３ａｂ、ＣＡＲＴ３ａｂ１０及びＣＡＲＴ４ａを例として本発明のＣＡＲ細胞の活性及び機能を評価した。
本発明で設計されたＣＡＲＴ細胞によって発現・分泌されるサイトカインの同定：本発明で設計された新たなＣＡＲＴ細胞ＣＡＲＴ３ａｂ、ＣＡＲＴ４ａがサイトカインＩＬ１５、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒを発現・分泌し、ＣＡＲＴ３ａｂ１０はサイトカインＩＬ１０を発現・分泌する。前記ＣＡＲＴ細胞が前記因子を発現・分泌することを同定するために、ＣＡＲＴ細胞の培養上清を取り、ＥＬＩＳＡキット（北京義翹神州生物技術有限公司、カタログ番号ＳＥＫＡ１０９４７、ＳＥＫ１０３６０）によってそれぞれＩＬ１０、ＩＬ１５の発現を検出した。その結果、ＣＡＲＴ３ａｂ１０上清のみから２２５６ｐｇ／ｍｌ及び８４４ｐｇ／ｍｌ検出され（繰り返して異なるドナーＰＢＭＣ由来のＴ細胞に感染させて得られたＣＡＲＴ細胞を調製した）、同時に調製されたＣＡＲＴ１ａ上清から背景値として１３．７ｐｇ／ｍｌ及び５．３ｐｇ／ｍｌのみ検出された（繰り返して異なるドナーＰＢＭＣ由来のＴ細胞に感染させて得られたＣＡＲＴ細胞を調製した）。当該データから、本発明で設計されたＣＡＲＴ３ａｂ１０が特異的にサイトカインＩＬ１０を発現して分泌したことが分かる。ＥＬＩＳＡ方法では、ＣＡＲＴ３ａｂ、ＣＡＲＴ４ａ上清におい
てＩＬ１５、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαの発現及び分泌が検出されず、培養されたＣＡＲＴ３ａｂ、ＣＡＲＴ４ａによって分泌されるサイトカインＩＬ１５及びＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαの量が低かったことが示された。
細胞の培養上清からＩＬ１５及びＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαの発現が検出されず、生じた４つのＣＡＲＴ細胞をそれぞれマウス体内に注射した。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを取り、静脈内注射で１×１０６のＣＡＲＴ細胞を投与した。注射後の７日目及び１４日目にそれぞれ血清を採取し、ＥＬＩＳＡによって血清におけるＩＬ１０及びＩＬ１５のレベルを検出した。結果を下記表に示した。
Figure 0007468903000095
上記結果から、ＣＡＲＴ３ａｂ１０はマウス体内において、７日目の時点で、ＩＬ１０の発現量が５１５４．７ｐｇ／ｍｌに達したことが分かる。１４日目に、ＩＬ１０の発現量が３５０．７ｐｇ／ｍｌに低下した。ＣＡＲＴ１ａ、ＣＡＲＴ（ブランク）は対照サンプルとしていずれもＩＬ１０の発現が検出されず、検出値１４、１５２．７及び１２８．７ｐｇ／ｍｌはいずれも背景値であった。ＣＡＲＴ３ａｂは１４日目にＩＬ１５活性断片の発現が検出され、発現量が１１８．８ｐｇ／ｍｌであった。ＣＡＲＴ４ａは７日目にＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαの発現が検出され、発現量が２０６．４ｐｇ／ｍｌであった。ＣＡＲＴ１ａ、ＣＡＲＴ（ブランク）は対照サンプルとしていずれもＩＬ１５の発現が検出されず、読み取り値が０（背景）であった。
上記結果から、本発明で設計されたＣＡＲで形質移入されたＴ細胞であるＣＡＲＴ３ａｂ、ＣＡＲＴ４ａ細胞によってＩＬ１５活性断片が発現・分泌されたことが分かる。ＣＡＲＴ３ａｂ１０細胞によってＩＬ１０が発現・分泌された。
実施例３９ ＣＬＤＮ１８．２に対して設計されたＣＡＲ細胞の活性
本発明のＣＡＲＴ細胞の体外活性を評価するために、ヒトＣＬＤＮ１８．２高発現細胞（ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞）を標的細胞とし、ヒトＣＬＤＮ１８．１高発現細胞（ｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞）を対照陰性標的細胞とし、ＣＡＲＴ細胞の２種類の細胞に対する殺傷を比較した後、標的細胞の生存比率でＣＡＲＴ細胞の特異性体外殺傷活性を評価した。具体的に、ＣＦＳＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３８０１）でｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を標識した。標的細胞の懸濁液を調製し、ｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞をＣＦＳＥで標識されたｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞と等比率で混合し、それぞれ１．５×１０
５個／ｍｌであった。２４ウェルプレートにおいて標的細胞殺傷実験を行い、標的細胞の懸濁液は１００μｌ／ウェルであった。ＣＡＲＴ１ａ、ＣＡＲＴ３ａｂ、ＣＡＲＴ３ａｂ１０、ＣＡＲＴ４ａ細胞及び陰性細胞（ブランクベクター）をそれぞれ同じ培地で希釈し、異なるＣＡＲＴ細胞と標的細胞の比率にし、それぞれ２０：１，１０：１，３：１及び１：１であった。別に未殺傷群を設け、即ち、ＣＡＲＴ細胞なしで、上記標的細胞のみの群であった。ＣＡＲＴ細胞を標的細胞と１６時間共培養した後、上清を捨て、ＰＢＳで慎重に洗浄して残ったＣＡＲＴ細胞及び殺滅された標的細胞を除去し、トリプシンで消化して付着した標的細胞を収集し、７ＡＡＤ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：４２０４０４）で染色した後、ＦＡＣＳによって７ＡＡＤ陰性ＣＦＳＥ標識ｈＣＬＤＮ１８．２＋／ｈＣＬＤＮ１８．１＋細胞の比率を検出した。
標的細胞の特異的分解（殺傷）率＝１－［ＣＡＲＴ細胞７ＡＡＤ陰性ｈＣＬＤＮ１８．２＋／ｈＣＬＮ１８．１＋］／［陰性対照（ブランクベクター）細胞７ＡＡＤ陰性ｈＣＬＤＮ１８．２＋／ｈＣＬＮ１８．１＋］。標的細胞の特異的分解（殺傷）率が高いほど、ＣＡＲＴ細胞の特異的殺傷効果が強く、以下はＣＡＲＴ細胞と標的細胞が１０：１の場合におけるＣＡＲＴ１ａ殺傷率の計算結果である。陰性対照ＣＡＲＴ細胞の結果のデータから、生存細胞ＣＬＤＮ１８．１：ＣＬＤＮ１８．２は５０．５％対４８．６％であり、１：１に近く、これは陰性対照ＣＡＲＴ細胞が非標的細胞及び標的細胞のいずれに対しても殺傷効果がないことを示した。ＣＡＲ１ａ細胞の結果のデータから、生存細胞ＣＬＤＮ１８．１：ＣＬＤＮ１８．２は５７．５％対３７．５％であり、ＣＡＲＴ１ａ細胞は非標的細胞に殺傷効果がなかった（５０％に近かった）が、標的細胞（ＣＬＤＮ１８．２）に殺傷効果があった（５０％から３７．５％に低下した）ことを示した。殺傷率（％）の計算方法：１－［（３７．５％／５７．５％）／（４８．６％／５０．５％）］＝３２．２％。各結果を下記表に示した。
Figure 0007468903000096
上記結果（３回以上の重複実験で、且つ毎回の実験で陰性対照ＣＡＲＴ細胞は非標的細胞及び標的細胞のいずれにも殺傷効果がなかった）から、本発明の４種類のＣＡＲＴ細胞と標的細胞が２０：１の場合、いずれも殺傷効果を示し、殺傷率が１９．８％～３４．８％であった。ＣＡＲＴ細胞：標的細胞の比率の低下につれ、標的細胞に対する殺傷効果が低下し、最も速く低下したのはＣＡＲＴ４ａ、ＣＡＲＴ３ａｂ１０及びＣＡＲＴ３ａであった。この３つのＣＡＲＴ細胞が３：１、１：１の比率の場合、基本的に標的細胞に対する殺傷作用が見られなかった。これは、本発明のＣＡＲＴの設計は細胞機能に関連し、生じる効果は異なる設計によって予想外の効果が現れることを示す。
実施例４０ ＣＬＤＮ１８．２に対して設計されたＣＡＲ細胞の動物体内における薬効
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを取り、ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を皮下接種して腫瘍モデ
ルを構築し、ＣＡＲＴ細胞を静脈内注射し、腫瘍体積（ＴＶ）、体重（ＢＷ）を測定することによってＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍効果及びその安全性を評価した。具体的に、ｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において培養し、５％
ＣＯ２を含有する３７℃の細胞インキュベーターにおいて対数期（コンフルエント８０％～９０％）まで連続培養した後、トリプシンで消化し、細胞を収集し、そして無血清のＤＭＥＭ／Ｆ１２で細胞を２回洗浄し、ＰＢＳで再懸濁させ、計数し、細胞濃度が１×１０８／ｍｌになるように調整した。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにｈＣＬＤＮ１８．２＋細胞懸濁液を１００μｌ／匹で、右脇部の皮下に接種した。３週間後、腫瘍体積が８０～１３０ｍｍ３のマウスを選択し、群分けし（２匹／群）ＣＡＲＴ細胞を２×１０６／匹で静脈内注射した。投与当日を０日目とした。その後、週に２回腫瘍体積を測定し、体重を量り、データを記録した。
腫瘍の大きさの計算式：腫瘍体積ＴＶ（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径２）；相対腫瘍体積（ＲＴＶ）＝ ＴＶ／ＴＶ０であり、ここで、ＴＶ０は開始時（０日目）の腫瘍体積であり、１とした。ＴＶは検出時の腫瘍体積である。相対腫瘍体積（ＲＴＶ）は、各検出時点における腫瘍体積の増長倍数である。相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）＝１００％×（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）；腫瘍抑制率（ＴＧＩ）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％。ここで、Ｔ０、Ｔはそれぞれサンプル群の実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積であり、Ｃ０、Ｃはそれぞれ対照群の実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積である。
結果から、ＣＡＲＴを注射して２週間後、各マウスの体重に顕著な変化がなく、ＣＡＲＴ細胞に顕著な安全性問題がないことが示された。薬効の面において、ＣＡＲＴ（ブランクベクター）をマウスに注射して１３日目～１９日目に、腫瘍体積が増大し続け、増加倍数（相対腫瘍体積）が１４から３９倍になった（図９）。一方、ＣＡＲＴ１ａ、ＣＡＲＴ３ａｂ、ＣＡＲＴ３ａｂ１０及びＣＡＲＴ４ａ細胞を注射したマウスは、腫瘍体積の増加がいずれも１０倍以下であった（腫瘍抑制率：４０％～９０％）。特に、ＣＡＲＴ３ａｂ１０及びＣＡＲＴ４ａ細胞を注射したマウスは、腫瘍体積が１３日目から１７日目の間で維持してほとんど増長せず、持続的に抑制する（１００％に近い抑制）効果を達成した。この結果から、本発明の抗ＣＬＮＤ１８．２抗体で設計された異なるＣＡＲ分子によるＣＡＲＴ細胞が予想外の動物薬効の効果を示すことが分かる。
実施例４０ ＣＬＤＮ１８．２に対して設計されたＣＡＲをＮＫ細胞に形質移入して得られたＣＡＲＮＫ細胞の活性
対数期にある状態が良好なＮＫ９２（商城北納創聯生物科技有限公司から購入された）細胞にそれぞれウイルス１ａ、３ａ、３ａｂ１０、４ａ（ＭＯＩが０．５～５の範囲にある）、ポリブレン（最終濃度８μｇ／ｍＬ）を入れた。３ｈ感染させ、１ｍＬまで液を追加し、一晩で液を交換し、培地がＮＫ９２専用培地（商城北納創聯生物科技有限公司）であった。１日おきに液を交換して１：２で培養体積を、体内外実験に十分な細胞が得られるまで拡大した。感染後のＮＫ９２細胞をそれぞれＣＡＲＮＫ１ａ、ＣＡＲＮＫ３ａ、ＣＡＲＮＫ３ａｂ１０、ＣＡＲＮＫ４ａ細胞と表示し、未感染のＮＫ９２細胞をＣＡＲＮＫ（ブランクベクター）と表示し、陰性対照とした。７日感染させた後、上記実施例３８と同じ方法によってＣＡＲＮＫ細胞表面の発現を検出し、結果を下記表に示す。
Figure 0007468903000097
上記結果から、本発明で新たに設計されたＣＡＲはＮＫ細胞においても好適に抗体Ａｂ１０のｓｃＦｖを発現してヒトｈＣＬＤＮ１８．２を認識することができることが分かる。
実施例４１ ＣＬＤＮ１８．２に対して設計されたＣＡＲＮＫ細胞の動物体内における薬効
上記実施例７と同じ動物モデルで本発明のＣＡＲＮＫ細胞の動物薬効を評価した。調製されたＣＡＲＮＫ（ブランクベクター）対照、ＣＡＲＮＫ１ａ、ＣＡＲＮＫ３ａｂ、ＣＡＲＮＫ３ａｂ１０、ＣＡＲＮＫ４ａ細胞を２×１０５／匹取り、２匹／群で、０日目及び３日目に１回ずつ注射した。その後、週に２回腫瘍の大きさを検出し、結果を下記表６１に示した。
Figure 0007468903000098
表６１の結果から、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体で構築されたＣＡＲＮＫ細胞は体内において１１、１３日目に持続的に腫瘍を抑制する効果が示されたことが分かる。腫瘍抑制率は１６．５％～６０．７％の範囲にあった。ここで、ＣＡＲＮＫ３ａｂ１０が示した動物体内における薬効が最も優れた。
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正を行うことができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。

Claims (17)

  1. 軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、
    前記ＶＬは配列番号１１で示されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１３で示されるＶＬ ＣＤＲ２及び配列番号１４で示されるＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨは配列番号１５で示されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１６で示されるＶＨ ＣＤＲ２及び配列番号１７で示されるＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、或いは、
    前記ＶＬは配列番号１２で示されるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１３で示されるＶＬ ＣＤＲ２及び配列番号１４で示されるＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨは配列番号１５で示されるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１６で示されるＶＨ ＣＤＲ２及び配列番号１７で示されるＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むことを特徴とするＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体。
  2. 前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体はマウス由来抗体であり、
    前記マウス由来抗体のＶＬは配列番号７で示されるアミノ酸配列であり、及び、前記マウス由来抗体のＶＨは配列番号８で示されるアミノ酸配列であり、或いは、
    前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体はヒト化抗体であり、前記ヒト化抗体のＶＬは配列番号２９～３３のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み、及び、前記ヒト化抗体のＶＨ配列は配列番号３４～３７のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体。
  3. 前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体がマウス由来抗体であるとき、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体は、マウス由来抗体の可変領域、及びマウス又はヒト抗体の定常領域を含み、前記マウス抗体の定常領域はマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３の重鎖定常領域及びκ又はλ型軽鎖定常領域を含み、前記ヒト抗体の定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の重鎖定常領域及びκ又はλ型軽鎖定常領域を含み、或いは、
    前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体がヒト化抗体であるとき、前記抗体の軽鎖はヒト抗体κ又はλ型軽鎖定常領域又はその突然変異を含み、及び／又は、前記抗体の重鎖はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４又はそれらの突然変異から選ばれる重鎖定常領域を含むことを特徴とする請求項２に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体。
  4. 前記ＶＬは配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨは配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含み、或いは、前記ＶＬは配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨは配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体。
  5. 前記重鎖定常領域又はその突然変異は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の３５６～３５８位がＥＥＭ又はＤＥＬである突然変異を含む、ことを特徴とし、或いは、
    前記抗体の軽鎖は配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２又は配列番号４５で示されるアミノ酸配列を含み、及び、前記抗体の重鎖は配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４又は配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体。
  6. 前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体が免疫グロブリンであるとき、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体は配列番号３９のアミノ酸配列で示される重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列で示される軽鎖を含み、或いは、配列番号３９のアミノ酸配列で示される重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列で示される軽鎖を含み、或いは、配列番号９の軽鎖アミノ酸配列、及び配列番号１０の重鎖アミノ酸配列を含み、或いは、
    前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）である請求項１～５のいずれかに記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体。
  7. 前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体は免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１～５のいずれかに記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体。
  8. 第一タンパク質機能領域及び第二タンパク質機能領域を含む二重特異性抗体であって、前記第一タンパク質機能領域は請求項１～７のいずれかに記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体であり、前記第二タンパク質機能領域は非ＣＬＤＮ１８．２抗原を標的とする抗体。
  9. 前記二重特異性抗体は、
    配列番号５３で示される軽鎖のアミノ酸配列及び配列番号５４で示される重鎖を含むアミノ酸配列、又は、配列番号５５で示される軽鎖のアミノ酸配列及び配列番号５６で示される重鎖を含むアミノ酸配列、又は、配列番号３８で示される軽鎖のアミノ酸配列及び配列番号５７で示される重鎖を含むアミノ酸配列、又は、配列番号３８で示される軽鎖のアミノ酸配列及び配列番号５８で示される重鎖を含むアミノ酸配列、又は、配列番号３８で示される軽鎖のアミノ酸配列及び配列番号５９で示される重鎖を含むアミノ酸配列、又は、配列番号３８で示される軽鎖のアミノ酸配列及び配列番号６０で示される重鎖を含むアミノ酸配列、又は、配列番号３８で示される軽鎖のアミノ酸配列及び配列番号６１で示される重鎖を含むアミノ酸配列、又は、配列番号３８で示される軽鎖のアミノ酸配列及び配列番号４で示される重鎖を含むアミノ酸配列である軽鎖のアミノ酸配列及び重鎖を含むアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の二重特異性抗体。
  10. 分離された核酸であって、請求項１～７のいずれかに記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又は請求項８又は９に記載の二重特異性抗体をコードする核酸。
  11. 構造が下記式Ｉで表される、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）。
    Ａｂ－［（Ｌ２）ｎ－Ｌ１－Ｄ］ｙ 式Ｉ
    （ここで、Ｄは細胞毒性を有する小分子薬物であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ前記薬物及び前記抗体と連結するリンカーであり、ｎは０又は１であり、ｙはＡｂと複合したＤの平均数を表し、且つ０＜ｙ≦１０であり、
    前記Ａｂは請求項１～７のいずれかに記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、又は請求項８又は９に記載の二重特異性抗体である。）
  12. 下記式Ｖで表される抗体薬物複合体であり、
    或いは、下記式ＶＩで表される抗体薬物複合体であり、
    或いは、下記式ＶＩＩで表される抗体薬物複合体であり、
    或いは、下記式ＶＩＩＩで表される抗体薬物複合体であり、
    ここで、前記Ａｂ１０は配列番号３８で示される軽鎖及び配列番号３９で示される重鎖を含み、前記Ａｂ６は配列番号４２で示される軽鎖及び配列番号３９で示される重鎖を含む、ことを特徴とする請求項１１に記載の抗体薬物複合体。
  13. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、（ａ）特異的にＣＬＤＮ１８．２を認識する細胞外結合ドメインｓｃＦｖ、（ｂ）ヒンジドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）共刺激細胞内ドメイン、（ｅ）シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞外結合ドメインは請求項１～７のいずれかに記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むことを特徴とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  14. 核酸構築体であって、式ｃａｒ－［（ＩＲＥＳ）－ｆ］ｑで表される構造を有し、ここで、ＩＲＥＳは内部リボソーム進入部位配列であり、ｆは機能性タンパク質Ｆをコードし、ｑは０又は非０の自然数であり、ｃａｒは請求項１３に記載のＣＡＲをコードすることを特徴とする核酸構築体。
  15. 遺伝子修飾された細胞であって、発現ベクターが形質移入されており、前記発現ベクターは、請求項１０に記載の分離された核酸、又は請求項１４に記載の核酸構築体を含むことを特徴とする遺伝子修飾された細胞。
  16. 請求項１～７のいずれかに記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、請求項８又は９に記載の二重特異性抗体、請求項１１又は１２に記載の抗体薬物複合体、請求項１５に記載の遺伝子修飾された細胞と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする薬物組成物。
  17. 腫瘍を治療する医薬として使用するための、請求項１～７のいずれかに記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、請求項８又は９に記載の二重特異性抗体、請求項１１又は１２に記載の抗体薬物複合体、請求項１３に記載のＣＡＲ、請求項１４に記載の核酸構築体、請求項１５に記載の遺伝子修飾された細胞又は請求項１６に記載の薬物組成物。
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