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CN113754778A - 靶向cldn18.2的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

靶向cldn18.2的嵌合抗原受体及其用途 Download PDF

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CN113754778A
CN113754778A CN202010507858.2A CN202010507858A CN113754778A CN 113754778 A CN113754778 A CN 113754778A CN 202010507858 A CN202010507858 A CN 202010507858A CN 113754778 A CN113754778 A CN 113754778A
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杨选明
张会会
张晓卿
李范林
梁洁
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Shanghai Longyao Biotechnology Co ltd
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Shanghai Jiaotong University
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Abstract

本申请涉及一种融合蛋白，其包含靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)和增效结构域，具有提高CAR‑T的活化能力，增殖能力和/或对肿瘤细胞杀伤能力的效果。

Description

靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体及其用途
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体及其用途。
背景技术
过继性细胞疗法中如嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是一种经人工修饰的肿瘤杀伤细胞，其结合了抗体的靶向识别功能和T细胞的肿瘤杀伤功能，是肿瘤免疫治疗领域的一大突破。然而，CAR-T对胃癌、胰腺癌等实体瘤的疗效尚不理想，新型CAR-T结构，新的靶点的发掘是CAR-T治疗实体瘤的关键。
CLDN18属于Claudins蛋白家族成员，CLDN18.1和CLDN18.2是CLDN18的可变剪切体。在正常组织中，CLDN18.1主要表达在肺部，CLDN18.2只表达于胃粘膜上皮细胞。但是CLDN18.2在多种肿瘤组织表达，譬如胃癌，胰腺癌，食管癌，卵巢癌，肺癌等，是理想的肿瘤CAR-T治疗靶点。现有CAR结构虽然在治疗血液来源的肿瘤取得了巨大的成功，但是由于实体肿瘤的免疫抑制微环境，同样的CAR结构在实体肿瘤中疗效甚微，因此亟需开发新的靶点，新的CAR结构用于胰腺癌，胃癌等的治疗。
发明内容
为了解决目前的靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体结构对于CLDN18.2阳性肿瘤细胞杀伤能力不强的问题，本申请提供了一种靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体及其用途，包括针对Claudin18.2特异性活性高的融合蛋白、核酸分子、载体、细胞，及其制备方法、药物组合物和用途，同时提供了增强靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体对肿瘤细胞的杀伤能力的方法和增强靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体的T细胞扩增能力的方法。
本申请提供一种融合蛋白，其包含a)靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)；b)
增效结构域，所述增效结构域能够增强所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体对肿瘤细胞的杀伤能力。
在某些实施方式中，所述增效结构域包括共刺激增效结构域，所述共刺激增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：OX40和OX40L。
在某些实施方式中，所述共刺激增效结构域包含SEQ ID NO:23-24中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述增效结构域包括趋化增效结构域，所述趋化增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：CCR7和CXCR5。
在某些实施方式中，所述趋化增效结构域包含SEQ ID NO:25-26中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体的C端与所述增效结构域的N端直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述连接包括通过连接子连接。
在某些实施方式中，所述连接子包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中一种所述融合蛋白，其为单链结构。
在某些实施方式中一种所述融合蛋白，其以自N端至C端的顺序依次包括所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体、所述连接子和所述增效结构域。
在某些实施方式中，所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体包括CLDN18.2结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，其中所述CLDN18.2结合结构域包含特异性结合CLDN18.2的抗体或其片段。
在某些实施方式中，所述抗体为单链抗体。
在某些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO:28-29中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述跨膜结构域包含源自选自下述蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α，β或ζ链、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8a、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
在某些实施方式中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述共刺激结构域包含源自选自下述蛋白的共刺激结构域：CD28、4-1BB、OX40和ICOS。
在某些实施方式中，所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述胞内信号传导结构域包含源自CD3ζ的信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:23-33中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码所述的融合蛋白或其片段。
另一方面，本申请提供了载体，其包含所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了细胞，其包含所述的载体和/或所述的融合蛋白。
另一方面，本申请提供了制备所述融合蛋白方法，其包括以下的步骤：合成所述的融合蛋白，和/或，在表达所述的融合蛋白的条件下培养所述的细胞。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含所述的融合蛋白和任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了所述的融合蛋白和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤。
另一方面，本申请提供了所述的融合蛋和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述肿瘤包括淋巴瘤和/或胰腺癌。
另一方面，本申请提供了治疗肿瘤的方法，其包括以有效治疗癌症的量向需要其的对象施用所述的融合蛋白和/或所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了施用所述的融合蛋白和/或所述的药物组合物用于治疗肿瘤的方法，所述肿瘤包括淋巴瘤和/或胰腺癌。
另一方面，本申请提供了所述的融合蛋白和/或所述的药物组合物，其用于治疗肿瘤。
另一方面，本申请提供了所述的融合蛋白和/或所述的药物组合物，其用于治疗肿瘤，所述肿瘤包括淋巴瘤和/或胰腺癌。
另一方面，本申请提供了一种增强靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体对肿瘤细胞的杀伤能力的方法，其中所述方法包括以下的步骤：使所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体与增效结构域连接，其中所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：OX40、OX40L、CCR7和CXCR5。
在某些实施方式中，所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体的C端与所述增效结构域的N端直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述连接包括通过连接子连接。
在某些实施方式中，所述连接子包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体为所述融合蛋白的所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述增效结构域包含SEQ ID NO:23-26中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了一种增强包含靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体的T细胞扩增能力的方法，其中所述方法包括以下的步骤：使所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体与增效结构域连接，其中所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：OX40、OX40L、CCR7和CXCR5。
在某些实施方式中，所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体的C端与所述增效结构域的N端直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述连接包括通过连接子连接。
在某些实施方式中，所述连接子包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体为所述融合蛋白的靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述增效结构域包含SEQ ID NO:23-26中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述T细胞来源于PBMC。
本申请提供的靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体，通过引入独立于CAR的新共刺激增效结构域或趋化增效结构域，具有提高CAR-T的活化能力，增殖能力和/或对肿瘤细胞杀伤能力的有益效果。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本申请所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)结构示意图。
图2a显示的本申请所述无增效抗CLDN18.2的CAR-T病毒(A为Ab10BBZ病毒，B为Ab362BBZ病毒)的滴度测定结果。
图2b显示的是本申请所述共刺激增效型抗CLDN18.2的CAR-T病毒(A为Ab10BBZ-OX40病毒、B为Ab10BBZ-OX40L病毒、C为Ab362BBZ-OX40病毒和D为Ab362BBZ-OX40L病毒)的滴度测定结果。
图2c显示的本申请所述趋化增效型抗CLDN18.2的CAR-T病毒(A为Ab10BBZ-CXCR5病毒和B为Ab10BBZ-CCR7病毒)的滴度测定结果。
图3显示的是本申请所述抗CLDN18.2的CAR-T细胞(A为Ab10BBZ CAR-T细胞、B为Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞、C为Ab362BBZ CAR-T细胞、D为Ab362BBZ-OX40 CAR-T细胞、E为Ab10BBZ-OX40L CAR-T细胞、F为Ab362BBZ-OX40L CAR-T细胞、G为Ab10BBZ-CCR7 CAR-T细胞和H为Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞)表达分析检测结果。
图4显示的是本申请所述抗CLDN18.2的CAR-T细胞(Ab362BBZ CAR-T细胞、Ab362BBZ-OX40 CAR-T细胞、Ab10BBZ CAR-T细胞、Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞、Ab10BBZ-CCR7CAR-T细胞、Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞、Ab10BBZ-OX40L CAR-T细胞和Ab362BBZ-OX40LCAR-T细胞)的体外增殖对比实验结果。统计显著性(P)用星号表示：**表示P<0.01，*表示P<0.05。
图5a显示的是本申请所述抗CLDN18.2的CAR-T细胞(Ab10BBZ CAR-T细胞和Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞和Ab10BBZ-OX40L CAR-T细胞)对CLDN18.2阳性肿瘤细胞的杀伤的检测结果。统计显著性(P)用星号表示：***表示P<0.001。
图5b显示的是本申请所述抗CLDN18.2的CAR-T细胞(Ab10BBZ CAR-T细胞、Ab10BBZ-CCR7 CAR-T细胞和Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞)对CLDN18.2阳性肿瘤细胞的杀伤的检测结果。统计显著性(P)用星号表示：***表示P<0.001，*表示P<0.05。
图6a显示的是本申请所述抗CLDN18.2的CAR-T细胞(Ab10BBZ CAR-T细胞和Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞)的体内抗肿瘤实验结果。统计显著性(P)用星号表示：**表示P<0.01。
图6b显示的是本申请所述抗CLDN18.2的CAR-T细胞(Ab10BBZ CAR-T细胞和Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞)的体内抗肿瘤实验结果。统计显著性(P)用星号表示：***表示P<0.001，*表示P<0.05。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号结构域转导效应子功能信号并指导细胞进行特化功能。虽然可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，此类截短部分可用于代替完整链，只要其转导效应子功能信号即可。术语“胞内信号传导结构域”因此意在包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任一截短部分。例如，CD3ζ。
在本申请中，术语“单链”是指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。
在本申请中，术语“共刺激结构域”是指共刺激分子的胞内部分或其截短形式，所述胞内部分或其截短形式能够传导共刺激信号(也称作第二信号)。例如，CD28、4-1BB、OX-40和ICOS。
在本申请中，术语“抗体或其片段”包括的免疫学上的结合试剂延伸至来自所有物种的所有抗体，包括二聚体、三聚体和多聚体抗体；双特异性抗体；嵌合抗体；人和人源化抗体；重组和改造的抗体以及它们的片段。术语“抗体或其片段”可以指具有抗原结合区的任意抗体样分子，该术语包括小分子物质片段如Fab′、Fab、F(ab′)2、单结构域抗体(DABs)、Fv、scFv(单链Fv)、线性抗体、双抗体等等。制备和使用各种基于抗体的构建物和片段的技术在本领域中是公知的。
在本申请中，术语“跨膜结构域”是指跨越细胞膜延伸并使CAR锚定于细胞膜的CAR的一部分。例如，T细胞受体的α，β或ζ链、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8a、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
在本申请中，术语“连接子”是指具有氨基酸序列的肽，可以是合成来源的。在根据本发明的融合蛋白内，连接子用于将增效结构域融合至嵌合抗原受体的C-或N-末端。
在本申请中，术语“杀伤能力”是指通过使所述细胞接触有效量的抗体、免疫缀合物、双特异性/多特异性分子或组合物从而杀伤细胞来实现。所述方法可以包括杀伤表达CLDN18.2的细胞，任选地在效应细胞存在下进行杀伤，例如通过CDC、凋亡、ADCC、吞噬作用或通过两种或更多种这些机制的组合。可以使用本发明融合蛋白杀伤的CLDN18.2表达细胞包括癌细胞，如致瘤性的胃、胰腺、食管、肺、卵巢、结肠、肝、头颈和胆囊细胞。
在本申请中，术语“特异性结合”、“特异性结合亲和力”或“特异性靶向”描述了一种分子以高于背景结合的结合亲和力与另一种分子结合。如果结合结构域(或者包含结合结构域的CAR或含有结合结构域的融合蛋白)与靶分子的结合或联合具有例如大于或等于约105M-1的亲和力或Ka(即，具体的结合相互作用的平衡缔合常数，单位为1/M)，则所述结合结构域与靶分子“特异性结合”。
在本申请中，术语“直接或间接连接”是指通过肽键直接的连接，或者通过连接子或者通过非肽连接实现间接连接。
在本申请中，术语“CLDN18.2结合结构域”、“胞外抗原结合结构域”、“胞外结构域”或“胞外配体结合结构域”是指位于细胞膜外侧并且能够结合抗原、靶标或配体的CAR的一部分。
在本申请中，术语“PBMC”或“人外周血单核细胞”通常是指外周血中具有单个核的细胞。例如具有圆形核的任何血细胞(即，淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞)。这些血细胞是免疫系统抵抗感染并适应入侵者的关键组分。淋巴细胞群由CD4+和CD8+T细胞、B细胞和自然杀伤细胞、CD14+单核细胞和嗜碱性粒细胞/嗜中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/树突细胞组成。通常，使用FICOLLTM(使血液分层的亲水多糖)，从全血分离这些细胞，其中单核细胞和淋巴细胞在血浆层下形成血沉棕黄层。例如，“PBMC”指至少包含T细胞，以及任选地包含NK细胞和抗原递呈细胞的细胞群。
在本申请中，术语“T细胞”是指胸腺衍生的细胞，其参与各种细胞介导的免疫反应。包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、不成熟的T淋巴细胞、成熟的T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。示例性T细胞群可以包括但不限于辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或者T细胞的任何其它亚群。其它示例性T细胞群可以包括但不限于表达下述标志物中的一种或多种的T细胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197和HLA-DR，并且若需要，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。
在本申请中，术语“增殖”指细胞分裂(细胞的对称或不对称分裂)的增加。“增殖”可以指T细胞的对称或不对称分裂。当与未处理的样本中的细胞相比，处理的样本中的细胞数存在增加时，发生“增殖增加”。
在本申请中，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，可以是哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
在本申请中，术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状的本申请抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。
在本申请中，术语“药物”通常是指当将其正确给予患者时，能够诱导期望的治疗效果的化学化合物或组合物。
在本申请中，术语“药物组合物”表示含有一种或多种本申请所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。治疗性组合物一般应当是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。可以将组合物配制为溶液、微乳液、分散剂、脂质体或适合高抗体浓度的其他有序结构。可以通过将活性化合物(即抗体或抗体部分)以要求的量连同上文所列举的一种成分或成分组合在适宜的溶剂中并入，根据需要，随后过滤消毒，制备无菌可注射溶液剂。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够转运与它连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其指其他DNA区段可以连接入其中的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中其他DNA区段可以连接入病毒基因组。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组，从而与宿主基因组一起复制，如不能自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一链中由DNA和RNA构成的多核苷酸、聚-赖氨酸-偶联的DNA或RNA、肽-偶联的DNA或RNA、脂质体-偶联的DNA等。此外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因的表达。这类载体在本申请中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
在本申请中，术语“佐剂”通常是指辅助或调节药物作用的任何物质，包括但不仅限于免疫学佐剂，它使对抗原的免疫反应增强或免疫反应多样化。
在本申请中，术语“肿瘤”或“肿瘤细胞”通常是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。肿瘤的例子包括但不限于，癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(schwannoma)(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌和黑素瘤。“肿瘤细胞”进一步包括“实体瘤”，其指的是选自下组的肿瘤：胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、以及头和颈癌，可以是淋巴瘤和/或胰腺癌。
在本申请中，术语“CLDN18.2”、“CLD18.2”、“Claudin18.2”、“claudin18.2”或“密蛋白18.2”包括指2型Claudin18。该术语包括变体、同源物、直向同源物和平行同源物。
在本申请中，术语“CLDN18.2阳性肿瘤”是指在其表面上表达CLDN18.2蛋白的肿瘤细胞。为了确定细胞是否在表面上表达CLDN18.2蛋白的目的，认为CLDN18.2 mRNA表达与细胞表面上的CLDN18.2蛋白表达有关，可以通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法来测定CLDN18.2 mRNA的表达。或者，例如可以使用针对CLDN18.2蛋白的抗体在诸如免疫组织化学，FACS，等方法中测定细胞表面上的CLDN18.2蛋白表达。例如，CLDN18.2阳性肿瘤可以是哺乳动物种植肿瘤，也可以是通过将CFPAC-1肿瘤细胞皮下接种到B-NDG小鼠的肿瘤。
在本申请中，术语“CLDN18.2阳性肿瘤细胞”是指在其表面上表达CLDN18.2蛋白的细胞。为了确定细胞是否在表面上表达CLDN18.2蛋白的目的，认为CLDN18.2 mRNA表达与细胞表面上的CLDN18.2蛋白表达有关，可以通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法来测定CLDN18.2 mRNA的表达。或者，例如可以使用针对CLDN18.2蛋白的抗体在诸如免疫组织化学，FACS，等方法中测定细胞表面上的CLDN18.2蛋白表达。例如，CLDN18.2阳性肿瘤细胞可以是Raji-CLDN18.2肿瘤细胞和/或CFPAC-1肿瘤细胞。
发明详述
嵌合抗原受体
一方面，本申请提供一种嵌合抗原受体(CAR)，其将基于抗体的对靶抗原(例如，肿瘤抗原)的特异性与T细胞受体活化胞内结构域组合以产生呈现特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白。本申请使用的术语“嵌合”描述了其由来自不同来源的不同蛋白或DNA的部分组成。本申请所考虑的CAR包含胞外结构域(也被称作结合结构域或抗原特异性结合结构域，例如CLDN18.2结合结构域)、跨膜结构域、共刺激结构域以及胞内信号转导结构域，所述胞外结构域与特定的靶抗原结合。CAR的主要特性是它们使免疫效应细胞特异性重定向的能力，从而引发增殖、细胞因子的产生、吞噬作用或者能够以独立于主要组织相容性(MHC)的方式介导表达靶抗原的细胞的细胞死亡的分子的产生，利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向的能力。
在另一方面，本申请提供的CAR包含特异性结合靶抗原的胞外结合结构域，所述胞外结合结构域包括但不限于单链抗体、抗体或其抗原结合片段、束缚配体或者共受体的胞外结构域，所述靶抗原是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。TAA或TSA可以在血癌细胞上表达。TAA或TSA可以在实体瘤细胞上表达。实体瘤可以是胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、除非小细胞肺癌之外的肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、脾脏癌、皮肤癌、除胶质母细胞瘤之外的脑癌、肾癌、甲状腺癌等。TAA或TSA可以选自：α叶酸受体、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NYESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM和VEGFR2。
在另一方面，本申请提供的CAR包含跨膜结构域，其使胞外结合部分和胞内信号转导结构域融合，并且使CAR锚定至免疫效应细胞的质膜上。跨膜结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组来源。示例性的跨膜结构域可以源自(即，至少包括以下的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
在另一方面，本申请提供的CAR包含共刺激信号转导结构域，其以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号。CAR可以包含一个或多个“共刺激信号转导结构域”。例如，共刺激信号转导结构域包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、CTLA4、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、TRIM、LCK3、SLAM、DAP10、LAG3、HVEM和NKD2C以及CD83的共刺激信号转导结构域。
在另一方面，本申请提供的CAR包含胞内信号转导结构域。胞内信号转导结构域参与将有效的CAR结合靶抗原的信息转导进免疫效应细胞的内部，以引发效应细胞的功能，例如活化、细胞因子的产生、增殖和细胞毒性活性，包括将细胞毒性因子释放至CAR结合的靶细胞或者用与胞外CAR结构域结合的抗原引发的其它细胞应答。例如，胞内信号转导结构域TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的胞内信号转导结构域。
在另一方面，本申请提供的CAR包含一个或多个特异性结合靶抗原的胞外结合结构域与一个或多个跨膜结构域，所述特异性结合靶抗原的胞外结合结构域的C端与所述跨膜结构域的N端直接或间接连接，所述连接可以是通过肽键直接连接，所述连接也可以是通过连接子连接。
在另一方面，本申请提供的CAR包含一个或多个跨膜结构域与一个或多个共刺激结构域，所述跨膜结构域的C端与所述共刺激结构域的N端直接或间接连接，所述连接可以是通过肽键直接连接，所述连接也可以是通过连接子连接。
在另一方面，本申请提供的CAR包含一个或多个共刺激结构域与一个或多个胞内信号传导结构域，所述共刺激结构域的C端与所述胞内信号传导结构域的N端直接或间接连接，所述连接可以是通过肽键直接连接，所述连接也可以是通过连接子连接。
在另一方面，本申请提供的CAR包含特异性结合靶抗原的一个或多个胞外结合结构域、一个或多个跨膜结构域与一个或多个共刺激结构域，所述特异性结合靶抗原的胞外结合结构域的C端与所述跨膜结构域的N端独立的为直接或间接连接，所述跨膜结构域的C端与所述共刺激结构域的N端独立的为直接或间接连接，所述连接可以是通过肽键直接连接，所述连接也可以是通过连接子连接。
在另一方面，本申请提供的CAR包含一个或多个跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域与一个或多个胞内信号传导结构域，所述跨膜结构域的C端与所述共刺激结构域的N端独立的为直接或间接连接，所述共刺激结构域的C端与所述胞内信号传导结构域的N端独立的为直接或间接连接，所述连接可以是通过肽键直接连接，所述连接也可以是通过连接子连接。
在另一方面，本申请提供的CAR包含一个或多个特异性结合靶抗原的胞外结合结构域、一个或多个跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域与一个或多个胞内信号传导结构域，所述特异性结合靶抗原的胞外结合结构域的C端与所述跨膜结构域的N端独立的为直接或间接连接，所述跨膜结构域的C端与所述共刺激结构域的N端独立的为直接或间接连接，所述共刺激结构域的C端与所述胞内信号传导结构域的N端独立的为直接或间接连接，所述连接可以是通过肽键直接连接，所述连接也可以是通过连接子连接。
在另一方面，本申请提供的CAR包含特异性结合靶抗原的胞外结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域与胞内信号传导结构域，所述特异性结合靶抗原的胞外结合结构域的C端与所述跨膜结构域的N端独立的为直接或间接连接，所述跨膜结构域的C端与所述共刺激结构域的N端独立的为直接或间接连接，所述共刺激结构域的C端与所述胞内信号传导结构域的N端独立的为直接或间接连接，所述连接可以是通过肽键直接连接。
融合蛋白或其片段
一方面，本申请提供一种融合蛋白或其片段，包括融合多肽及其片段。融合蛋白指包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个多肽区段的多肽。融合蛋白通常是C-末端连接至N-末端，但是它们也可以是C-末端连接至C-末端、N-末端连接至N-末端、或者N-末端连接至C-末端。融合蛋白的多肽可以是任意顺序或指定的顺序。融合多肽或融合蛋白还可以包括保守修饰的变体、多态变体、等位基因、突变体、子序列以及种间同系物，只要保留融合多肽的期望转录活性。可以通过化学合成方法或者通过两个部分之间化学键合来产生融合多肽，或者通常可以使用其它标准技术来制备融合多肽。将包含融合多肽的连接的DNA序列与合适的转录或翻译控制元件可操作地连接。另一方面，融合伴侣包含有助于以比天然重组蛋白更高的产率表达蛋白的序列(表达增强子)。可以选择其它融合伴侣，以增加蛋白的溶解性或者使蛋白能够靶向期望的胞内区室或者促进融合蛋白通过细胞膜的转运。
融合蛋白还可以在本申请所描述的各多肽结构域之间包含多肽切割信号。此外，多肽位点可以位于任何接头肽序列。示例性的多肽切割信号包括多肽切割识别位点，如蛋白酶切割位点、核酸酶切割位点(例如，罕见限制性酶识别位点、自切割核酶识别位点)和自切割病毒寡肽(参见deFelipe和Ryan,2004.Traffic,5(8)；616-26)。合适的蛋白酶切割位点和自切割肽是对技术人员来说是已知的(参见，例如，Ryan等人,1997.J.Gener.Virol.78,699-722；Scymczak等人(2004)Nature Biotech.5,589-594)。示例性蛋白酶切割位点包括但不限于以下的切割位点：马铃薯Y病毒NIa蛋白酶(例如、烟草蚀纹病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、byovirusNIa蛋白酶、byovirus RNA-2-编码的蛋白酶、口蹄疫病毒L蛋白酶、肠病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、小RNA病毒(picorna)3C蛋白酶、豇豆花叶病毒24K蛋白酶、线虫传多面体病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球状病毒)3C-样蛋白酶、PYVF(欧防风黄点病毒)3C-样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa和肠激酶。另一方面，自切割肽包括获自以下的那些多肽序列：马铃薯Y病毒和心病毒2A肽、FMDV(口蹄疫疾病病毒)、马鼻炎病毒A、明脉扁刺蛾β四体病毒和猪捷申病毒。另一方面，自切割多肽位点包含2A或2A-样位点、序列或结构域(Donnelly等人,2001.J.Gen.Virol.82:1027-1041)。
核酸分子、载体、细胞
一方面，本申请提供了一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的融合蛋白或其片段。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述融合蛋白，也可以编码其中的一部分。本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。所述分离的核酸可以是通过重组DNA技术制备的核酸分子。在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述抗体、其抗原结合片段的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993。
在另一方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。所述表达控制序列可以为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中，适当的启动子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。
一方面，本申请提供一种细胞，所述细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或表达本申请所述的融合蛋白。每种或每个细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或表达一个或一种本申请所述的融合蛋白。每种或每个细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或表达多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的融合蛋白。例如，可将本申请所述的核酸分子引入所述细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的核酸分子引入所述细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
药物组合物
一方面，本申请提供一种药物组合物，其可包含本申请所述的融合蛋白或其片段，所述的核酸分子，所述的载体，所述的宿主细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。本申请所述的药物组合物可以包含预防和/或治疗有效量的所述抗体、其抗原结合片段。所述预防和/或治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的疾病或病症和/或其任何并发症而所需的剂量。所述药学上可接受的佐剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性，并且可包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵(hexamethonium chloride)、氯化苯二甲羟铵(benzalkonium chloride)、氯化苄甲乙氧铵(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苄醇；对羟苯甲酸烷酯，诸如对羟苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间-甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷酰氨酸、天冬酰氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，诸如钠离子；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本申请中的药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。
治疗肿瘤
一方面，本申请提供抑制肿瘤生长和/或杀伤肿瘤的方法。例如，本申请的药物组合物可以抑制或延缓疾病的发展或进展，可以减小肿瘤大小(甚至基本消除肿瘤)，和/或可以减轻和/或稳定疾病状态。肿瘤的例子包括但不限于，淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌和黑素瘤。“肿瘤”进一步包括“实体瘤”，其指的是选自下组的肿瘤：胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、以及头和颈癌。“肿瘤”可以是胃癌、肾癌、胰腺癌和/或淋巴癌。
铰链区、增效结构域、共刺激增效结构域、趋化增效结构域
一方面，本申请提供“铰链区”或“铰链结构域”是指连接CAR蛋白质的两个相邻结构域。例如胞外结构域和跨膜结构域的CAR的一部分。所述铰链区可以在所述CAR的各个结构域之间，添加所述铰链区是为了所述分子的适当的间距和构象。本申请所考虑的CAR可以包含1、2、3、4或5个或者更多个铰链区。铰链区的长度可以是约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸或约10至约20个氨基酸或者任意介于中间长度的氨基酸。铰链区可以源自天然的、合成的、半合成的或重组来源。铰链区可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
另一方面，本申请的一个或多个铰链区可以位于CAR的特异性结合靶抗原的胞外结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域之间任意一个或多个位置。例如，一个或多个铰链区可以位于特异性结合靶抗原的胞外结合结构域与跨膜结构域之间、位于跨膜结构域与共刺激结构域之间和/或位于共刺激结构域与胞内信号传导结构域之间。例如，一个铰链区可以位于特异性结合靶抗原的胞外结合结构域与跨膜结构域之间。
另一方面，铰链区与CAR的各个结构域的连接可以是CAR的各个结构域的的C端与铰链区的N端直接或间接连接，所述连接可以是通过肽键直接连接，所述连接也可以是通过连接子连接。例如，特异性结合靶抗原的胞外结合结构域的C端与铰链区的N端通过肽键连接。
一方面，本申请提供一种增效结构域，所述增效结构域是指能够增强嵌合抗原受体对肿瘤细胞的杀伤能力的结构域。所述增效结构域可以与所述CAR的各个结构域直接或间接的连接，例如所述胞内信号传导结构域的C端与所述增效结构域的N端直接或间接连接。另一方面增效结构域包括共刺激增效结构域和/或趋化增效结构域。其中所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：4-1BB、CD28、CD27、OX40、OX40L、GITR、ICOS、CCR2、CCR5、CCR7、CCR15、CXCR2、CXCR4和/或CXCR5。
另一方面，本申请的一个或多个增效结构域的N端可以与一个或多个CAR的特异性结合靶抗原的胞外结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域的C端直接或间接连接。例如，一个或多个增效结构域可以与胞内信号传导结构域直接或间接连接。例如，一个增效结构域可以与胞内信号传导结构域直接或间接连接。所述连接可以是通过肽键直接连接，所述连接也可以是通过连接子连接。例如，胞内信号传导结构域的C端与增效结构域的N端通过连接子连接。
在另一方面，本申请提供一种共刺激增效结构域，所述共刺激增效结构域是指能够增强淋巴细胞对抗原的有效应答和/或增强淋巴细胞增殖能力的结构域。所述共刺激增效结构域可以与所述CAR的各个结构域直接或间接的连接，例如所述胞内信号传导结构域的C端与所述共刺激增效结构域的N端直接或间接连接。所述可任选的淋巴细胞共刺激增效结构域选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、OX40L、GITR和/或ICOS的共刺激增效结构域。
另一方面，本申请的一个或多个共刺激增效结构域的N端可以与一个或多个CAR的特异性结合靶抗原的胞外结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域的C端直接或间接连接。例如，一个或多个共刺激增效结构域可以与胞内信号传导结构域直接或间接连接。例如，一个共刺激增效结构域可以与胞内信号传导结构域直接或间接连接。所述连接可以是通过肽键直接连接，所述连接也可以是通过连接子连接。例如，胞内信号传导结构域的C端与共刺激增效结构域的N端通过连接子连接。
在另一方面，本申请提供一种趋化增效结构域，所述趋化增效结构域是指能够增强淋巴细胞对肿瘤的杀伤能力和/或增强淋巴细胞调控肿瘤凋亡的能力的结构域。所述趋化增效结构域可以与所述CAR的各个结构域直接或间接的连接，例如所述胞内信号传导结构域的C端与所述趋化增效结构域的N端直接或间接连接。所述可任选的淋巴细胞趋化增效结构域选自CCR2、CCR5、CCR7、CCR15、CXCR2、CXCR4和/或CXCR5的趋化增效结构域。
另一方面，本申请的一个或多个趋化增效结构域的N端可以与一个或多个CAR的特异性结合靶抗原的胞外结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域的C端直接或间接连接。例如，一个或多个趋化增效结构域可以与胞内信号传导结构域直接或间接连接。例如，一个趋化增效结构域可以与胞内信号传导结构域直接或间接连接。所述连接可以是通过肽键直接连接，所述连接也可以是通过连接子连接。例如，胞内信号传导结构域的C端与趋化增效结构域的N端通过连接子连接。
例如，本申请的靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体包含特异性结合靶抗原的胞外结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域、胞内信号传导结构域与增效结构域，所述特异性结合靶抗原的胞外结合结构域的C端与铰链区的N端通过肽键直接连接，所述铰链区的C端与跨膜结构域的N端通过肽键直接连接，所述跨膜结构域的C端与共刺激结构域的N端通过肽键直接连接，所述共刺激结构域的C端与胞内信号传导结构域的N端通过肽键直接连接，所述胞内信号传导结构域的C端与增效结构域的N端通过连接子连接。
例如，本申请的靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体包含特异性结合靶抗原的胞外结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域、胞内信号传导结构域与共刺激增效结构域，所述特异性结合靶抗原的胞外结合结构域的C端与铰链区的N端通过肽键直接连接，所述铰链区的C端与跨膜结构域的N端通过肽键直接连接，所述跨膜结构域的C端与共刺激结构域的N端通过肽键直接连接，所述共刺激结构域的C端与胞内信号传导结构域的N端通过肽键直接连接，所述胞内信号传导结构域的C端与共刺激增效结构域的N端通过连接子连接。
例如，本申请的靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体包含特异性结合靶抗原的胞外结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域、胞内信号传导结构域与趋化增效结构域，所述特异性结合靶抗原的胞外结合结构域的C端与铰链区的N端通过肽键直接连接，所述铰链区的C端与跨膜结构域的N端通过肽键直接连接，所述跨膜结构域的C端与共刺激结构域的N端通过肽键直接连接，所述共刺激结构域的C端与胞内信号传导结构域的N端通过肽键直接连接，所述胞内信号传导结构域的C端与趋化增效结构域的N端通过连接子连接。
制备、方法、用途
一方面，本申请提供一种制备的融合蛋白或其片段的方法。所述方法可包括，在使得所述的融合蛋白或其片段表达的条件下，培养所述本申请所述的细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。在某些情形中，所述方法还可包括分离和/或纯化所述融合蛋白或其片段的步骤。例如，可以采用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖进行亲和层析，还可通过凝胶电泳和/或高效液相色谱等来纯化和分离本申请所述的融合蛋白或其片段。
另一方面，本申请提供了治疗受试者中的癌症、抑制受试者中肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括向有需要的受试者或所述肿瘤细胞施用本申请所述的融合蛋白或其片段和/或所述的药物组合物。可通过任何合适的方法来施用，所述合适的方法包括例如：以静脉内方式、以肌内方式、以皮下方式、以皮内方式、以经皮方式、以动脉内方式、以腹膜内方式、以损伤内方式、以颅内方式、以关节内方式、以前列腺内方式、以胸膜内方式、以气管内方式、以鞘内方式、以鼻内方式、以阴道内方式、以直肠内方式、以局部方式、以肿瘤内方式、以腹膜方式、以结膜下方式、以囊内方式、以粘膜方式、以心包内方式、以脐内方式、以眼内方式、以眶内方式、以口服方式、以局部方式、以透皮方式、以玻璃体内方式(例如，通过玻璃体内注射)、通过滴眼剂、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接沐浴靶细胞的局部灌注、通过导管、通过灌洗、以乳膏形式或以脂质组合物形式。用于本申请描述的方法中的组合物还可以全身方式或以局部方式施用。施用方法可以根据各种因素(例如，所施用的化合物或组合物以及所治疗的病状、疾病或病症的严重性)而变化。例如，以静脉内方式、以肌内方式、以皮下方式、以局部方式、以口服方式、以透皮方式、以腹膜内方式、以眶内方式、通过植入、通过吸入、以鞘内方式、以心室内方式或以鼻内方式施用抗癌疗法(例如，抗CLDN18.2抗体)。部分地根据施用是否为短暂的或长期的，给药可通过任何适合的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射。本申请涵盖各种给药排程，包括但不限于单次施用或各种时间点内的多次施用、推注施用和脉冲输注。
另一方面，本申请提供了所述融合蛋白或其片段和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途。所述药物用于治疗癌症，抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖。所述肿瘤或癌症可以包含淋巴瘤和/或胰腺癌。所述肿瘤或癌症可以为CLDN18.2表达异常的肿瘤或癌症。
本申请所述的融合蛋白或其片段和/或所述的药物组合物可以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、单个患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法、施用排程和医学从业者已知的其他因素。治疗剂(例如，抗CLDN18.2抗体)无需但任选地与一种或多种当前用来预防或治疗所考虑的病症的药剂一起配制和/或同时施用。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的治疗剂(例如，抗CLDN18.2抗体)的量、病症或治疗的类型以及以上论述的其他因素。这些药剂通常可以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量且通过凭经验/临床上确定为适当的任何途径加以使用。与单个治疗相比，可减少组合治疗中施用的抗体的剂量。通过常规技术易于监测此疗法的进展。
增强肿瘤细胞的杀伤能力
一方面，本申请提供一种增强嵌合抗原受体和/或表达所述嵌合抗原受体的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤能力的方法，包括以下的步骤：使所述嵌合抗原受体与增效结构域连接，其中所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：4-1BB、CD28、CD27、OX40、OX40L、GITR、ICOS、CCR2、CCR5、CCR7、CCR15、CXCR2、CXCR4和/或CXCR5。
在另一方面，本申请提供一种增强嵌合抗原受体和/或表达所述嵌合抗原受体的淋巴细胞扩增能力的方法，包括以下的步骤：使所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体与增效结构域连接，其中所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：4-1BB、CD28、CD27、OX40、OX40L、GITR和/或ICOS。
在另一方面，本申请提供一种增强嵌合抗原受体和/或表达所述嵌合抗原受体的淋巴细胞调控肿瘤凋亡的方法，包括以下的步骤：使所述嵌合抗原受体与增效结构域连接，其中所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：CCR2、CCR5、CCR7、CCR15、CXCR2、CXCR4和/或CXCR5。
实施方式
1.融合蛋白，其包含：
a)靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)；
b)增效结构域，所述增效结构域能够增强所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体对肿瘤细胞的杀伤能力。
2.根据实施方式1所述的融合蛋白，其中所述增效结构域包括共刺激增效结构域，所述共刺激增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：OX40和OX40L。
3.根据实施方式2所述的融合蛋白，其中所述共刺激增效结构域包含SEQ ID NO:23-24中任一项所示的氨基酸序列。
4.根据实施方式1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述增效结构域包括趋化增效结构域，所述趋化增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：CCR7和CXCR5。
5.根据实施方式4所述的融合蛋白，其中所述趋化增效结构域包含SEQ ID NO:25-26中任一项所示的氨基酸序列。
6.根据实施方式1-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体的C端与所述增效结构域的N端直接或间接连接。
7.根据实施方式6所述的融合蛋白，其中所述连接包括通过连接子连接。
8.根据实施方式7所述的融合蛋白，其中所述连接子包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
9.根据实施方式1-8中任一项所述的融合蛋白，其为单链结构。
10.根据实施方式7-9中任一项所述的融合蛋白，其以自N端至C端的顺序依次包括所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体、所述连接子和所述增效结构域。
11.根据实施方式1-10中任一项所述的融合蛋白，其中所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体包括CLDN18.2结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，其中所述CLDN18.2结合结构域包含特异性结合CLDN18.2的抗体或其片段。
12.根据实施方式11所述的融合蛋白，其中所述抗体为单链抗体。
13.根据实施方式11或12中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体包含SEQ IDNO:28-29中任一项所示的氨基酸序列。
14.根据实施方式11-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述跨膜结构域包含源自选自下述蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α，β或ζ链、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8a、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
15.根据实施方式11-14中任一项所述的融合蛋白，其中所述跨膜结构域包含SEQID NO:31的氨基酸序列。
16.根据实施方式11-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述共刺激结构域包含源自选自下述蛋白的共刺激结构域：CD28、4-1BB、OX40和ICOS。
17.根据实施方式11-16中任一项所述的融合蛋白，其中所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
18.根据实施方式11-17中任一项所述的融合蛋白，其中所述胞内信号传导结构域包含源自CD3ζ的信号传导结构域。
19.根据实施方式11-18中任一项所述的融合蛋白，其中所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
20.根据实施方式1-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:23-33中任一项所示的氨基酸序列。
21.一种或多种分离的核酸分子，其编码实施方式1-20中任一项所述的融合蛋白或其片段。
22.载体，其包含实施方式21所述的核酸分子。
23.细胞，其包含实施方式22所述的载体，或者表达实施方式1-20中任一项所述的融合蛋白。
24.制备实施方式1-20中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括以下的步骤：合成实施方式1-20中任一项所述的融合蛋白，和/或，在表达实施方式1-20中任一项所述的融合蛋白的条件下培养实施方式23所述的细胞。
25.药物组合物，其包括实施方式1-20中任一项所述的融合蛋白和任选地药学上可接受的佐剂。
26.实施方式1-20中任一项所述的融合蛋白和/或实施方式25所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤。
27.根据实施方式26所述的用途，其中所述肿瘤包括淋巴瘤和/或胰腺癌。
28.一种增强靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体对肿瘤细胞的杀伤能力的方法，其中所述方法包括以下的步骤：使所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体与增效结构域连接，其中所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：OX40、OX40L、CCR7和CXCR5。
29.根据实施方式28所述的方法，其中，所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体的C端与所述增效结构域的N端直接或间接连接。
30.根据实施方式28或29中任一项所述的方法，其中所述连接包括通过连接子连接。
31.根据实施方式30所述的方法，其中所述连接子包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
32.根据实施方式28-31中任一项所述的方法，其中所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体为实施方式1-20中任一项所述融合蛋白的靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体。
33.根据实施方式28-32中任一项所述的方法，其中所述增效结构域包含SEQ IDNO:23-26中任一项所示的氨基酸序列。
34.一种增强包含靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体的T细胞扩增能力的方法，其中所述方法包括以下的步骤：使所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体与增效结构域连接，其中所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：OX40、OX40L、CCR7和CXCR5。
35.根据实施方式34所述的方法，其中，所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体的C端与所述增效结构域的N端直接或间接连接。
36.根据实施方式34或35中任一项所述的方法，其中所述连接包括通过连接子连接。
37.根据实施方式36所述的方法，其中所述连接子包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
38.根据实施方式34-37中任一项所述的方法，其中所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体为实施方式1-20中任一项所述融合蛋白的靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体。
39.根据实施方式34-38中任一项所述的方法，其中所述增效结构域包含SEQ IDNO:23-26中任一项所示的氨基酸序列。
40.根据实施方式34-39中任一项所述的方法，其中所述T细胞来源于PBMC。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
在本申请中，所述结合靶点、单链抗体(scFv，single chain fragmentvariable)、嵌合抗原受体(CAR)、载体和细胞的名称的对应关系如表1所示。
表1本申请所述结合靶点、单链抗体(scFv，single chain fragment variable)、嵌合抗原受体(CAR)、载体和细胞的名称的对应关系
Figure BDA0002527190920000221
实施例1抗CLDN18.2 CAR-T细胞的制备
制备无增效靶向CLDN18.2的CAR(Ab10BBZ和Ab362BBZ，结构如图1所示)，和对照CAR(20BBZ)。人工合成以下序列：scFv Ab10(氨基酸序列SEQ ID NO:28，核苷酸序列SEQ IDNO:1)，scFv Ab362(氨基酸序列SEQ ID NO:29，核苷酸序列SEQ ID NO:2)，铰链区(氨基酸序列SEQ ID NO:30，核苷酸序列SEQ ID NO:3)，跨膜区(氨基酸序列SEQ ID NO:31，核苷酸序列SEQ ID NO:4)，4-1BB共刺激因子(氨基酸序列SEQ ID NO:32，核苷酸序列SEQ ID NO:5)，CD3ζ胞内信号传导结构域(氨基酸序列SEQ ID NO:33，核苷酸序列SEQ ID NO:6)。其中，将铰链区，跨膜区，4-1BB共刺激因子和CD3ζ胞内信号传导结构域首尾相连可获得BBZ，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。同时，构建scFv 20作为对照，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。将可特异性结合CLDN18.2的scFv Ab10(氨基酸序列SEQ ID NO:28，核苷酸序列SEQID NO:1)和BBZ(核苷酸序列SEQ ID NO:7)通过overlap PCR，两端加入XbaI和BamHI酶切位点克隆pCDH-MSCVEF载体。进行PCR扩增，并用延伸PCR在5’端依次带上XbaI酶切位点(含保护碱基)、scFvAb10、铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激因子、CD3ζ胞内信号传导结构域、BamHI酶切位点，PCR扩增得到所述CAR：Ab10BBZ(氨基酸序列SEQ ID NO:14)。
制备无增效抗CLDN18.2的CAR-T病毒(Ab10BBZ病毒和Ab362BBZ病毒)，和对照CAR-T病毒(20BBZ病毒)。测序正确的克隆用NucleoBond Xtra Midi Plus EF试剂盒无内毒素大提，和慢病毒包装质粒(VSV-g，pMD Gag/Pol或RSV-REV)共同转染293细胞，37℃、5％CO2培养48小时后收取上清，0.45μM过滤后，使用贝克曼超速离心机和SW28转头，以25000RPM的速度离心2小时以浓缩病毒，即为pCDH-MSCVEF-Ab10BBZ病毒(简称为Ab10BBZ病毒)，用于后续CAR-T细胞生产。同时用与制备Ab10BBZ病毒相同的方法生产对照pCDH-MSCVEF-20BBZ病毒和pCDH-MSCVEF-Ab362BBZ病毒(简称20BBZ病毒和Ab362BBZ病毒)，将所得病毒感染293细胞，使用anti-mouse Fab抗体(Jackson ImmunoResearch#115-605-006)用流式检测的方法测病毒滴度。图2a中显示的是在添加1μL、3μL、9μL的所述病毒的时候的流式检测结果，以不添加病毒作为空白对照。结果显示，随着所加病毒剂量的增加，所述CAR：20BBZ(氨基酸序列SEQ ID NO:15)和Ab362BBZ(氨基酸序列SEQ ID NO:16)的CAR表达量也随之增加。
类似地，制备共刺激增效型靶向CLDN18.2的CAR(Ab10BBZ-OX40、Ab10BBZ-OX40L、Ab362BBZ-OX40和Ab362BBZ-OX40L，结构如图1所示)，和共刺激增效型抗CLDN18.2的CAR-T病毒(Ab10BBZ-OX40病毒、Ab10BBZ-OX40L病毒、Ab362BBZ-OX40病毒和Ab362BBZ-OX40L病毒)。将Ab10BBZ，Ab362BBZ去除终止密码子，连接片段2A(氨基酸序列SEQ ID NO:27，核苷酸序列SEQ ID NO:9)、OX40(氨基酸序列SEQ ID NO:23，核苷酸序列SEQ ID NO:10)或OX40L(氨基酸序列SEQ ID NO:24，核苷酸序列SEQ ID NO:11)通过overlap PCR，分子克隆，及病毒生产获得pCDH-MSCVEF-Ab10BBZ-OX40病毒，pCDH-MSCVEF-Ab10BBZ-OX40L病毒，pCDH-MSCVEF-Ab362BBZ-OX40病毒和pCDH-MSCVEF-Ab362BBZ-OX40L病毒(简称Ab10BBZ-OX40病毒、Ab10BBZ-OX40L病毒、Ab362BBZ-OX40病毒和Ab362BBZ-OX40L病毒)。类似地，用流式检测的方法测病毒滴度。图2b中显示的是在添加1μL、3μL、9μL的所述病毒的时候的流式检测结果，以不添加病毒作为空白对照。结果显示，随着所加病毒剂量的增加，所述CAR：Ab10BBZ-OX40(氨基酸序列SEQ ID NO:17)，Ab10BBZ-OX40L(氨基酸序列SEQ ID NO:18)，Ab362BBZ-OX40(氨基酸序列SEQ ID NO:19)和Ab362BBZ-OX40L(氨基酸序列SEQ ID NO:20)的CAR表达量也随之增加。
类似地，制备趋化增效型靶向CLDN18.2的CAR(Ab10BBZ-CCR7和Ab10BBZ-CXCR5，结构如图1所示)，和趋化增效型抗CLDN18.2的CAR-T病毒(Ab10BBZ-CCR7病毒和Ab10BBZ-CXCR5病毒)。将Ab10BBZ，Ab362BBZ去除终止密码子，连接片段2A(氨基酸序列SEQ ID NO:27，核苷酸序列SEQ ID NO:9)、CCR7(氨基酸序列SEQ ID NO:25，核苷酸序列SEQ ID NO:12)或CXCR5(氨基酸序列SEQ ID NO:26，核苷酸序列SEQ ID NO:13)通过overlap PCR，分子克隆，及病毒生产获得pCDH-MSCVEF-Ab10BBZ-CCR7病毒和pCDH-MSCVEF-Ab10BBZ-CXCR5病毒(简称Ab10BBZ-CCR7病毒和Ab10BBZ-CXCR5病毒)。类似地，用流式检测的方法测病毒滴度。如图2c所示，在添加1μL、3μL、9μL的所述病毒的时候的流式检测结果，以不添加病毒作为空白对照。结果显示，随着所加病毒剂量的增加，所述CAR：Ab10BBZ-CCR7(氨基酸序列SEQ IDNO:22)和Ab10BBZ-CXCR5(氨基酸序列SEQ ID NO:21)的CAR表达量也随之增加。
制备无增效抗CLDN18.2的CAR-T细胞(Ab10BBZ CAR-T细胞和Ab362BBZ CAR-T细胞)，和对照CAR-T细胞(20BBZ CAR-T细胞)。将人PBMC经过Stemcell T细胞分离试剂盒(购自stem cell Catlog#19671)纯化后，接种到anti-hCD3(购自Bioxcell#BE0001-2)和anti-hCD28(购自Bioxcell#BE0248)包被的96孔培养板，2天后，按照MOI(感染复数，即病毒量与细胞数的比值)＝10-20感染本实施例制备的Ab10BBZ病毒，20BBZ病毒和Ab362BBZ病毒，1天后换液继续细胞培养，培养基为含10％FBS的RPMI完全培养基，IL2(50IU/ml)，IL21(4ng/ml)，按照每6天使用人工抗原呈递细胞(X射线100Gray辐照后的Raji-CLDN18.2细胞)或anti-hCD3(0.1μg/ml)或anti-hCD28(0.25μg/ml)刺激，经过2轮刺激后，所得细胞即为Ab10BBZ CAR-T细胞，20BBZ CAR-T细胞和Ab362BBZ CAR-T细胞，使用Alexa
Figure BDA0002527190920000251
647AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Mouse IgG,Fab fragment specific抗体染色和流式分析，其结果如图3所示，结果显示，所得细胞均为CAR阳性。
类似地，制备共刺激增效型抗CLDN18.2的CAR-T细胞(Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞，Ab10BBZ-OX40L CAR-T细胞，Ab362BBZ-OX40 CAR-T细胞和Ab362BBZ-OX40L CAR-T细胞)。将人PBMC来源的T细胞经过纯化，活化，Ab10BBZ-OX40病毒、Ab10BBZ-OX40L病毒、Ab362BBZ-OX40病毒和Ab362BBZ-OX40L病毒感染和扩增后，分别获得Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞，Ab10BBZ-OX40L CAR-T细胞，Ab362BBZ-OX40 CAR-T细胞和Ab362BBZ-OX40L CAR-T细胞，通过流式染色，用Alexa
Figure BDA0002527190920000252
647AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Mouse IgG,Fab fragment specific抗体染色，其结果如图3所示。结果显示，所得细胞均为CAR阳性。
类似地，制备趋化增效型抗CLDN18.2的CAR-T细胞(Ab10BBZ-CCR7 CAR-T细胞和Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞)。将人PBMC来源的T细胞经过纯化，活化，Ab10BBZ-CCR7病毒和Ab10BBZ-CXCR5病毒感染和扩增后，分别获得Ab10BBZ-CCR7 CAR-T细胞和Ab10BBZ-CXCR5CAR-T细胞，通过流式染色，用Alexa
Figure BDA0002527190920000253
647AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Mouse IgG,Fab fragment specific抗体染色，其结果如图3所示。结果显示，所得细胞均为CAR阳性。
实施例2抗CLDN18.2 CAR-T细胞的扩增能力
将实施例1制备所得的Ab10BBZ CAR-T细胞，Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞和Ab10BBZ-OX40L CAR-T细胞，Ab362BBZ CAR-T细胞，Ab362BBZ-OX40 CAR-T细胞和Ab362BBZ-OX40LCAR-T细胞，连续培养，每隔6天用人工抗原呈递细胞刺激一次，细胞计数，其结果如图4所示。由图4可知，Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞和Ab10BBZ-OX40L CAR-T细胞相比Ab10BBZ CAR-T细胞，Ab362BBZ-OX40 CAR-T细胞和Ab362BBZ-OX40L CAR-T细胞相比Ab362BBZ CAR-T细胞有更强的扩增能力。
将实施例1制备所得的Ab10BBZ CAR-T细胞，Ab10BBZ-CCR7 CAR-T细胞和Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞，连续培养14天，每隔6天用人工抗原呈递细胞刺激一次，细胞计数，其结果如图4所示。由图4可知，Ab10BBZ-CCR7 CAR-T细胞和Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞相比Ab10BBZ CAR-T细胞有着相似的体外扩增能力。
实施例3抗CLDN18.2 CAR-T细胞的体外肿瘤杀伤能力
将实施例1制备所得的Ab10BBZ CAR-T细胞，Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞，Ab10BBZ-OX40L CAR-T细胞，接种到96孔板，按照CAR-T：肿瘤细胞比例1:1加入CLDN18.2阳性肿瘤细胞(Raji-CLDN18.2肿瘤细胞)，24小时后流式细胞仪检测Raji-CLDN18.2的存活。对体外肿瘤杀伤的效果检测如图5a所示，Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞比Ab10BBZ CAR-T细胞有更强的体外肿瘤杀伤能力。
将实施例1制备所得的Ab10BBZ CAR-T细胞，Ab10BBZ-CCR7 CAR-T细胞，Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞，接种到96孔板，按照CAR-T：肿瘤细胞比例1:1加入CLDN18.2阳性肿瘤细胞(Raji-CLDN18.2肿瘤细胞)，24小时后流式细胞仪检测Raji-CLDN18.2的存活。对体外肿瘤杀伤的效果检测如图5b所示，相比Ab10BBZ CAR-T细胞，Ab10BBZ-CCR7 CAR-T细胞和Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞能选择性杀伤更多CLDN18.2阳性肿瘤细胞，体外杀伤能力分别提高13.1％和44.7％。
实施例4抗CLDN18.2 CAR-T细胞的体内抗肿瘤能力
将3x106 CFPAC-1肿瘤细胞皮下接种到B-NDG小鼠，6天后给予107Ab10BBZ CAR-T细胞或Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞治疗，给予PBS作为空白对照，测量小鼠的肿瘤负荷，其结果分别如图6a所示，Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞相对Ab10BBZ CAR-T细胞能够更好的控制肿瘤负荷。结果显示，与对照Ab10BBZ CAR-T细胞相比，Ab10BBZ-OX40 CAR-T细胞使得小鼠肿瘤减少了82.9％(3.798mm3到0.646mm3)。
将3x106 CFPAC-1肿瘤细胞皮下接种到B-NDG小鼠，6天后给予107Ab10BBZ CAR-T细胞或Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞治疗，给予PBS作为空白对照，测量小鼠的肿瘤负荷，和小鼠体内CAR-T的持续增殖能力。其结果分别如图6b所示。由图6b可知，Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞相对Ab10BBZ CAR-T细胞能够更好的控制肿瘤负荷。结果显示，与对照Ab10BBZ CAR-T细胞相比，Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞使得小鼠肿瘤减少了67.7％(30.98mm3到10.24mm3)；与对照Ab10BBZ CAR-T细胞相比，Ab10BBZ-CXCR5 CAR-T细胞有着更好的体内持续增殖能力，增殖提高2.76倍(0.133％到0.367％)。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体及其用途
<130> 0104-PA-004
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab10
<400> 1
atggagaccg acaccctctt attatgggtg ctgttattat gggtccccgg aagcaccgga 60
accggtgaca tcgtcatgac ccagagcccc gactctctgg ctgtgtctct gggcgagaga 120
gccacaatca gctgcaagag cagccagtct ctgctcaact ccggaaacca gaagaactac 180
ctcacatggt atcagcagaa gcccggccaa cctcccaagc tgctgatcta ttgggcttcc 240
acaagggaat ccggcgtgcc cgataggttc agcggaagcg gcagcggcac agatttcaca 300
ctgaccatct cctctctgca agccgaggac gtggccgtgt actactgcca gaacgactac 360
ttctacccct tcaccttcgg ccaaggcacc aagctggaga ttaagaggac cgtgggcgga 420
ggaggaagcg gaggaggagg cagcggaggc ggaggcagcc aagtccagct cgtgcagagc 480
ggagccgaag tgaaaaaacc cggctcctcc gtgaaagtga gctgcaaggc ctccggctat 540
gccttctcca actatctgat cgagtgggtg aaacaagccc ccggccaagg actggaatgg 600
atcggactga ttaatcccgg ctccggcggc accaactaca acgagaaatt caagggcaag 660
gccaccatca ccgccgacaa gagcacctcc acagcctaca tggagctcag ctctctgaga 720
agcgaggaca cagccgtgta ttactgcgct agagtgtact acggcaactc cttcgcctat 780
tggggccaag gcacactggt cacagtgagc agc 813
<210> 2
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab362
<400> 2
atggagaccg acaccctctt attatgggtg ctgttattat gggtccccgg aagcaccgga 60
accggtgaca tcgtgatgac ccagtcccct agctctctga ccgtgacagc cggagagaaa 120
gtgaccatga gctgcaagag cagccaatct ctgctgaaca gcggcaacca gaagaactat 180
ctgacatggt atcagcagaa gcccggccaa ccccccaagc tgctgattta ctgggccagc 240
acaagagaga gcggagtgcc cgataggttc accggcagcg gcagcggcac cgatttcaca 300
ctgaccatct ccagcgtgca agccgaagac ctcgccgtct actactgcca gaacgactac 360
agctaccctt tcaccttcgg ctccggcacc aaactggaga tcaagggagg aggaggcagc 420
ggaggcggcg gctccggcgg aggcggcagc caagtgcagc tgcagcagcc cggcgccgag 480
ctggtgagac ccggcgcctc cgtgaagctg agctgcaaag ctagcggcta caccttcacc 540
tcctactgga tcaactgggt gaagcagaga cccggccaag gactggagtg gatcggcaac 600
atctacccct ccgactccta caccaactac aaccagaagt ttaaggacaa ggccacactg 660
accgtggaca agtcctccag caccgcctac atgcagctgt cctcccctac ctccgaggac 720
agcgccgtgt actactgcac aagaagctgg aggggcaaca gctttgacta ctggggccaa 780
ggcaccacac tgaccgtgag cagc 804
<210> 3
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链
<400> 3
acaaccaccc ccgctcccag acctcctaca cccgctccca ccattgccag ccagcctctc 60
tctttaagac ccgaggcttg taggcccgct gctggaggag ccgtgcacac aaggggactg 120
gactttgctt gtgat 135
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 跨膜
<400> 4
atctatatct gggcccctct ggctggaact tgtggagtcc tcttattatc tttagtgatc 60
actttatact gt 72
<210> 5
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 共刺激
<400> 5
aagaggggtc gtaagaagtt attatacatc ttcaagcagc ccttcatgag gcccgtccaa 60
accacccaag aagaggacgg atgtagctgt aggtttcccg aggaggagga gggaggctgc 120
gaatta 126
<210> 6
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 胞内信号传导
<400> 6
cgtgtcaagt tctccagaag cgccgatgcc cccgcttacc aacaaggtca gaaccagctg 60
tacaatgagc tgaatctggg cagaagagaa gagtacgacg tgctggataa gaggaggggt 120
cgtgaccccg aaatgggagg caagcccaga agaaaaaacc cccaagaagg actctacaac 180
gagctgcaaa aggataagat ggctgaggcc tattccgaga ttggcatgaa gggcgagaga 240
aggagaggca agggccacga cggtttatat caaggtctct ccaccgccac caaggacaca 300
tacgatgctc tgcacatgca agctctgccc cccaga 336
<210> 7
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BBZ
<400> 7
gcggccgcta caaccacccc cgctcccaga cctcctacac ccgctcccac cattgccagc 60
cagcctctct ctttaagacc cgaggcttgt aggcccgctg ctggaggagc cgtgcacaca 120
aggggactgg actttgcttg tgatatctat atctgggccc ctctggctgg aacttgtgga 180
gtcctcttat tatctttagt gatcacttta tactgtaaga ggggtcgtaa gaagttatta 240
tacatcttca agcagccctt catgaggccc gtccaaacca cccaagaaga ggacggatgt 300
agctgtaggt ttcccgagga ggaggaggga ggctgcgaat tacgtgtcaa gttctccaga 360
agcgccgatg cccccgctta ccaacaaggt cagaaccagc tgtacaatga gctgaatctg 420
ggcagaagag aagagtacga cgtgctggat aagaggaggg gtcgtgaccc cgaaatggga 480
ggcaagccca gaagaaaaaa cccccaagaa ggactctaca acgagctgca aaaggataag 540
atggctgagg cctattccga gattggcatg aagggcgaga gaaggagagg caagggccac 600
gacggtttat atcaaggtct ctccaccgcc accaaggaca catacgatgc tctgcacatg 660
caagctctgc cccccaga 678
<210> 8
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 20
<400> 8
gaattcgccg ccaccatgga gaccgacacc ctcttattat gggtgctgtt attatgggtc 60
cccggaagca ccggaaccgg tcagatcgtg ctgagccaga gccccgccat tctgtccgcc 120
agccccggcg agaaggtgac catgacatgc agagcctcct cctccgtgag ctacatccac 180
tggttccagc agaagcccgg ctcctcccct aagccttgga tctacgccac cagcaatctg 240
gctagcggag tgcccgtgag attcagcggc agcggaagcg gaaccagcta ctctctgacc 300
atcagcagag tggaggccga ggacgccgct acctactact gtcagcagtg gaccagcaac 360
cctcctacct tcggcggcgg caccaagctg gagatcaagg gcggaggagg ctccggaggt 420
ggaggttctg gcggtggagg ttcccaagtg cagctgcagc agcccggcgc tgagctggtg 480
aaacccggcg cttccgtgaa gatgagctgc aaggccagcg gctacacctt caccagctac 540
aacatgcact gggtgaagca gacccccggc agaggactgg aatggatcgg cgccatttac 600
cccggcaacg gcgatacctc ctacaaccag aagttcaagg gcaaggctac actgaccgcc 660
gacaagagca gcagcaccgc ctacatgcag ctgagctctc tgaccagcga ggacagcgcc 720
gtgtactact gcgctagaag cacctactac ggcggcgact ggtacttcaa cgtgtgggga 780
gccggcacaa ccgtgacagt gtccgcc 807
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 2A
<400> 9
ggctccggcg ccacaaactt ctctttactg aagcaagctg gagacgtgga ggagaacccc 60
ggtcct 66
<210> 10
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40
<400> 10
atgtgtgtgg gagccagaag actgggaaga ggaccttgcg ctgctctgct gctgctggga 60
ctgggactgt ccacagtgac cggactgcac tgcgtgggcg acacataccc cagcaacgat 120
agatgctgcc acgagtgtag acccggcaat ggcatggtgt ccagatgctc tagaagccag 180
aatacagtgt gcagaccttg cggccccggc ttttacaacg atgtggtgtc cagcaagcct 240
tgcaagcctt gcacatggtg taatctgagg tccggcagcg agaggaaaca actgtgcacc 300
gccacccaag acacagtctg cagatgtaga gctggcaccc agcctctgga cagctataaa 360
cccggcgtgg actgtgctcc ttgccctccc ggccatttca gccccggaga caaccaagct 420
tgcaagcctt ggacaaactg cacactggcc ggaaagcaca cactgcaacc cgccagcaac 480
agctccgacg ccatttgcga agatagagac cctcccgcta cacagcctca agagacacaa 540
ggcccccccg ctagacctat caccgtccag cccacagagg cttggcctag aaccagccaa 600
ggccctagca caagacccgt ggaggtcccc ggcggaagag ctgtggccgc cattctgggc 660
ctcggactgg tgctcggact gctcggacct ctggctattc tgctggctct gtatctgctg 720
aggagagacc agaggctgcc tcccgacgcc cataaacctc ccggcggcgg cagctttaga 780
acccctattc aagaggagca agccgacgcc catagcacac tggccaagat ctga 834
<210> 11
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40L
<400> 11
atggaaaggg tccaacccct ggaagagaat gtgggaaatg cagccaggcc aagattcgag 60
aggaacaagc tattgctggt ggcctctgta attcagggac tggggctgct cctgtgcttc 120
acctacatct gcctgcactt ctctgctctt caggtatcac atcggtatcc tcgaattcaa 180
agtatcaaag tacaatttac cgaatataag aaggagaaag gtttcatcct cacttcccaa 240
aaggaggatg aaatcatgaa ggtgcagaac aactcagtca tcatcaactg tgatgggttt 300
tatctcatct ccctgaaggg ctacttctcc caggaagtca acattagcct tcattaccag 360
aaggatgagg agcccctctt ccaactgaag aaggtcaggt ctgtcaactc cttgatggtg 420
gcctctctga cttacaaaga caaagtctac ttgaatgtga ccactgacaa tacctccctg 480
gatgacttcc atgtgaatgg cggagaactg attcttatcc atcaaaatcc tggtgaattc 540
tgtgtccttt ga 552
<210> 12
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CCR7
<400> 12
atggacctgg ggaaaccaat gaaaagcgtg ctggtggtgg ctctccttgt cattttccag 60
gtatgcctgt gtcaagatga ggtcacggac gattacatcg gagacaacac cacagtggac 120
tacactttgt tcgagtcttt gtgctccaag aaggacgtgc ggaactttaa agcctggttc 180
ctccctatca tgtactccat catttgtttc gtgggcctac tgggcaatgg gctggtcgtg 240
ttgacctata tctatttcaa gaggctcaag accatgaccg atacctacct gctcaacctg 300
gcggtggcag acatcctctt cctcctgacc cttcccttct gggcctacag cgcggccaag 360
tcctgggtct tcggtgtcca cttttgcaag ctcatctttg ccatctacaa gatgagcttc 420
ttcagtggca tgctcctact tctttgcatc agcattgacc gctacgtggc catcgtccag 480
gctgtctcag ctcaccgcca ccgtgcccgc gtccttctca tcagcaagct gtcctgtgtg 540
ggcatctgga tactagccac agtgctctcc atcccagagc tcctgtacag tgacctccag 600
aggagcagca gtgagcaagc gatgcgatgc tctctcatca cagagcatgt ggaggccttt 660
atcaccatcc aggtggccca gatggtgatc ggctttctgg tccccctgct ggccatgagc 720
ttctgttacc ttgtcatcat ccgcaccctg ctccaggcac gcaactttga gcgcaacaag 780
gccatcaagg tgatcatcgc tgtggtcgtg gtcttcatag tcttccagct gccctacaat 840
ggggtggtcc tggcccagac ggtggccaac ttcaacatca ccagtagcac ctgtgagctc 900
agtaagcaac tcaacatcgc ctacgacgtc acctacagcc tggcctgcgt ccgctgctgc 960
gtcaaccctt tcttgtacgc cttcatcggc gtcaagttcc gcaacgatct cttcaagctc 1020
ttcaaggacc tgggctgcct cagccaggag cagctccggc agtggtcttc ctgtcggcac 1080
atccggcgct cctccatgag tgtggaggcc gagaccacca ccaccttctc ccca 1134
<210> 13
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CXCR5
<400> 13
cgtacgatga actaccctct gacactggag atggatctgg agaacctcga agacctcttt 60
tgggagctcg acagactgga caactacaac gacacctccc tcgtggaaaa ccatctgtgt 120
cccgctaccg agggacctct catggccagc tttaaggccg tgtttgtgcc cgtggcttat 180
tctctgatct ttctgctggg cgtgatcggc aacgtgctgg tgctggtcat tctggagagg 240
cacagacaga caaggagctc caccgaaacc ttcctcttcc atctcgccgt ggccgatctg 300
ctgctggtct tcattctgcc cttcgccgtg gctgaaggca gcgtgggctg ggtgctgggc 360
acatttctgt gtaagaccgt gatcgctctg cacaaggtca acttctactg ctcctctctg 420
ctgctggctt gcatcgccgt ggacagatat ctggctattg tgcacgctgt ccacgcctat 480
agacatagaa gactgctgtc catccacatt acatgcggca ccatctggct cgtgggattt 540
ctgctggctc tgcccgaaat tctgtttgct aaggtgagcc aaggccacca caacaactct 600
ctgcctaggt gcacctttag ccaagagaac caagccgaga cccacgcttg gttcacatct 660
aggttcctct atcacgtggc cggctttctg ctgcccatgc tcgtgatggg ctggtgctac 720
gtgggcgtcg tgcacagact gagacaagcc cagaggagac ctcagaggca gaaggccgtg 780
agggtggcca ttctggtgac cagcatcttc tttctgtgct ggtcccccta ccacatcgtc 840
atctttctgg acacactggc tagactgaaa gccgtggaca acacatgcaa gctcaatgga 900
tctctgcccg tggctatcac catgtgcgag tttctgggac tggctcattg ctgtctgaac 960
cccatgctgt acaccttcgc tggagtcaag tttaggagcg atctgtctag gctgctgacc 1020
aaactgggct gtaccggccc cgcctctctg tgccagctgt ttcctagctg gaggaggtcc 1080
tctctgtccg agagcgaaaa cgccacctct ctgaccacct tctgaggatc c 1131
<210> 14
<211> 521
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab10
<400> 14
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1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
20 25 30
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
165 170 175
Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr
210 215 220
Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn
245 250 255
Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265 270
Ala Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
290 295 300
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
325 330 335
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
340 345 350
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
355 360 365
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
370 375 380
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
385 390 395 400
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
405 410 415
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
420 425 430
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
435 440 445
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
450 455 460
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
465 470 475 480
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
485 490 495
Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
500 505 510
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Thr
515 520
<210> 15
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 20
<400> 15
Ala Ala Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Thr Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser
20 25 30
Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
35 40 45
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro
145 150 155 160
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
165 170 175
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln
195 200 205
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
210 215 220
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val
245 250 255
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ala Ala Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
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<211> 518
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab362
<400> 16
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
100 105 110
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115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly
180 185 190
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr
195 200 205
Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
210 215 220
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp
225 230 235 240
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr
260 265 270
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
275 280 285
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
290 295 300
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
305 310 315 320
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
325 330 335
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
340 345 350
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
355 360 365
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
370 375 380
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
385 390 395 400
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
405 410 415
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
420 425 430
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
435 440 445
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
450 455 460
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
465 470 475 480
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser
485 490 495
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
500 505 510
Asn Pro Gly Pro Arg Thr
515
<210> 17
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab10-OX40
<400> 17
Ile Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys
1 5 10 15
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala
20 25 30
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
35 40 45
Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
50 55 60
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro
65 70 75 80
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
85 90 95
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
100 105 110
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
115 120 125
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
130 135 140
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
145 150 155 160
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
165 170 175
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
180 185 190
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
195 200 205
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
210 215 220
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
225 230 235 240
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
245 250 255
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
260 265 270
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
275 280 285
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
290 295 300
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
305 310 315 320
Thr Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala
325 330 335
Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys
340 345 350
Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg
355 360 365
Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val
370 375 380
Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys
385 390 395 400
Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg
405 410 415
Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala
420 425 430
Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro
435 440 445
Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro
450 455 460
Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser
465 470 475 480
Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln
485 490 495
Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro
500 505 510
Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val
515 520 525
Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu
530 535 540
Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu
545 550 555 560
Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly
565 570 575
Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His
580 585 590
Ser Thr Leu Ala Lys Ile
595
<210> 18
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab10-OX40L
<400> 18
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
20 25 30
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
165 170 175
Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr
210 215 220
Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn
245 250 255
Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265 270
Ala Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
290 295 300
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
325 330 335
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
340 345 350
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
355 360 365
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
370 375 380
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
385 390 395 400
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
405 410 415
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
420 425 430
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
435 440 445
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
450 455 460
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
465 470 475 480
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
485 490 495
Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
500 505 510
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Thr Met Glu Arg Val Gln Pro Leu
515 520 525
Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys
530 535 540
Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys
545 550 555 560
Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser Ala Leu Gln Val Ser His Arg
565 570 575
Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys
580 585 590
Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys
595 600 605
Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile
610 615 620
Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr
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Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val
645 650 655
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Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly
675 680 685
Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
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<210> 19
<211> 771
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab362-OX40
<400> 19
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
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Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser
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Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly
180 185 190
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr
195 200 205
Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
210 215 220
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp
225 230 235 240
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr
260 265 270
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
275 280 285
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
290 295 300
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
305 310 315 320
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
325 330 335
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
340 345 350
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
355 360 365
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
370 375 380
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
385 390 395 400
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
405 410 415
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
420 425 430
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
435 440 445
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450 455 460
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val Gly Asp
515 520 525
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530 535 540
Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys Arg Pro
545 550 555 560
Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys
565 570 575
Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu
580 585 590
Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln
595 600 605
Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro
610 615 620
Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
625 630 635 640
Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser
645 650 655
Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu
660 665 670
Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala
675 680 685
Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro
690 695 700
Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly
705 710 715 720
Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg
725 730 735
Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser
740 745 750
Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu
755 760 765
Ala Lys Ile
770
<210> 20
<211> 677
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab362-OX40L
<400> 20
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly
180 185 190
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr
195 200 205
Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
210 215 220
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp
225 230 235 240
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr
260 265 270
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
275 280 285
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
290 295 300
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
305 310 315 320
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
325 330 335
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
340 345 350
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
355 360 365
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
370 375 380
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
385 390 395 400
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
405 410 415
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
420 425 430
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
435 440 445
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
450 455 460
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
465 470 475 480
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Met Glu
485 490 495
Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg Pro Arg
500 505 510
Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln Gly Leu
515 520 525
Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser Ala Leu
530 535 540
Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
545 550 555 560
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
565 570 575
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
580 585 590
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn
595 600 605
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
610 615 620
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
625 630 635 640
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
645 650 655
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
660 665 670
Glu Phe Cys Val Leu
675
<210> 21
<211> 893
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab10-CXCR5
<400> 21
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
20 25 30
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
165 170 175
Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr
210 215 220
Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn
245 250 255
Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265 270
Ala Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
290 295 300
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
325 330 335
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
340 345 350
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
355 360 365
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
370 375 380
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
385 390 395 400
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
405 410 415
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
420 425 430
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
435 440 445
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
450 455 460
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
465 470 475 480
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
485 490 495
Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
500 505 510
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Thr Met Asn Tyr Pro Leu Thr Leu
515 520 525
Glu Met Asp Leu Glu Asn Leu Glu Asp Leu Phe Trp Glu Leu Asp Arg
530 535 540
Leu Asp Asn Tyr Asn Asp Thr Ser Leu Val Glu Asn His Leu Cys Pro
545 550 555 560
Ala Thr Glu Gly Pro Leu Met Ala Ser Phe Lys Ala Val Phe Val Pro
565 570 575
Val Ala Tyr Ser Leu Ile Phe Leu Leu Gly Val Ile Gly Asn Val Leu
580 585 590
Val Leu Val Ile Leu Glu Arg His Arg Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu
595 600 605
Thr Phe Leu Phe His Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile
610 615 620
Leu Pro Phe Ala Val Ala Glu Gly Ser Val Gly Trp Val Leu Gly Thr
625 630 635 640
Phe Leu Cys Lys Thr Val Ile Ala Leu His Lys Val Asn Phe Tyr Cys
645 650 655
Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile
660 665 670
Val His Ala Val His Ala Tyr Arg His Arg Arg Leu Leu Ser Ile His
675 680 685
Ile Thr Cys Gly Thr Ile Trp Leu Val Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro
690 695 700
Glu Ile Leu Phe Ala Lys Val Ser Gln Gly His His Asn Asn Ser Leu
705 710 715 720
Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gln Glu Asn Gln Ala Glu Thr His Ala Trp
725 730 735
Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr His Val Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met
740 745 750
Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr Val Gly Val Val His Arg Leu Arg Gln
755 760 765
Ala Gln Arg Arg Pro Gln Arg Gln Lys Ala Val Arg Val Ala Ile Leu
770 775 780
Val Thr Ser Ile Phe Phe Leu Cys Trp Ser Pro Tyr His Ile Val Ile
785 790 795 800
Phe Leu Asp Thr Leu Ala Arg Leu Lys Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys
805 810 815
Leu Asn Gly Ser Leu Pro Val Ala Ile Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly
820 825 830
Leu Ala His Cys Cys Leu Asn Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val
835 840 845
Lys Phe Arg Ser Asp Leu Ser Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr
850 855 860
Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln Leu Phe Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser
865 870 875 880
Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe
885 890
<210> 22
<211> 899
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab10-CCR7
<400> 22
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
20 25 30
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
165 170 175
Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr
210 215 220
Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn
245 250 255
Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265 270
Ala Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
290 295 300
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
325 330 335
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
340 345 350
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
355 360 365
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
370 375 380
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
385 390 395 400
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
405 410 415
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
420 425 430
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
435 440 445
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
450 455 460
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
465 470 475 480
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
485 490 495
Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
500 505 510
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Thr Met Asp Leu Gly Lys Pro Met
515 520 525
Lys Ser Val Leu Val Val Ala Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Cys Leu
530 535 540
Cys Gln Asp Glu Val Thr Asp Asp Tyr Ile Gly Asp Asn Thr Thr Val
545 550 555 560
Asp Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Leu Cys Ser Lys Lys Asp Val Arg Asn
565 570 575
Phe Lys Ala Trp Phe Leu Pro Ile Met Tyr Ser Ile Ile Cys Phe Val
580 585 590
Gly Leu Leu Gly Asn Gly Leu Val Val Leu Thr Tyr Ile Tyr Phe Lys
595 600 605
Arg Leu Lys Thr Met Thr Asp Thr Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Val Ala
610 615 620
Asp Ile Leu Phe Leu Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Tyr Ser Ala Ala
625 630 635 640
Lys Ser Trp Val Phe Gly Val His Phe Cys Lys Leu Ile Phe Ala Ile
645 650 655
Tyr Lys Met Ser Phe Phe Ser Gly Met Leu Leu Leu Leu Cys Ile Ser
660 665 670
Ile Asp Arg Tyr Val Ala Ile Val Gln Ala Val Ser Ala His Arg His
675 680 685
Arg Ala Arg Val Leu Leu Ile Ser Lys Leu Ser Cys Val Gly Ile Trp
690 695 700
Ile Leu Ala Thr Val Leu Ser Ile Pro Glu Leu Leu Tyr Ser Asp Leu
705 710 715 720
Gln Arg Ser Ser Ser Glu Gln Ala Met Arg Cys Ser Leu Ile Thr Glu
725 730 735
His Val Glu Ala Phe Ile Thr Ile Gln Val Ala Gln Met Val Ile Gly
740 745 750
Phe Leu Val Pro Leu Leu Ala Met Ser Phe Cys Tyr Leu Val Ile Ile
755 760 765
Arg Thr Leu Leu Gln Ala Arg Asn Phe Glu Arg Asn Lys Ala Ile Lys
770 775 780
Val Ile Ile Ala Val Val Val Val Phe Ile Val Phe Gln Leu Pro Tyr
785 790 795 800
Asn Gly Val Val Leu Ala Gln Thr Val Ala Asn Phe Asn Ile Thr Ser
805 810 815
Ser Thr Cys Glu Leu Ser Lys Gln Leu Asn Ile Ala Tyr Asp Val Thr
820 825 830
Tyr Ser Leu Ala Cys Val Arg Cys Cys Val Asn Pro Phe Leu Tyr Ala
835 840 845
Phe Ile Gly Val Lys Phe Arg Asn Asp Leu Phe Lys Leu Phe Lys Asp
850 855 860
Leu Gly Cys Leu Ser Gln Glu Gln Leu Arg Gln Trp Ser Ser Cys Arg
865 870 875 880
His Ile Arg Arg Ser Ser Met Ser Val Glu Ala Glu Thr Thr Thr Thr
885 890 895
Phe Ser Pro
<210> 23
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40
<400> 23
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Trp Thr
130 135 140
Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser
145 150 155 160
Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln
165 170 175
Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu
180 185 190
Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val
195 200 205
Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu
210 215 220
Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg
225 230 235 240
Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr
260 265 270
Leu Ala Lys Ile
275
<210> 24
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40L
<400> 24
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 25
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CCR7
<400> 25
Met Asp Leu Gly Lys Pro Met Lys Ser Val Leu Val Val Ala Leu Leu
1 5 10 15
Val Ile Phe Gln Val Cys Leu Cys Gln Asp Glu Val Thr Asp Asp Tyr
20 25 30
Ile Gly Asp Asn Thr Thr Val Asp Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Leu Cys
35 40 45
Ser Lys Lys Asp Val Arg Asn Phe Lys Ala Trp Phe Leu Pro Ile Met
50 55 60
Tyr Ser Ile Ile Cys Phe Val Gly Leu Leu Gly Asn Gly Leu Val Val
65 70 75 80
Leu Thr Tyr Ile Tyr Phe Lys Arg Leu Lys Thr Met Thr Asp Thr Tyr
85 90 95
Leu Leu Asn Leu Ala Val Ala Asp Ile Leu Phe Leu Leu Thr Leu Pro
100 105 110
Phe Trp Ala Tyr Ser Ala Ala Lys Ser Trp Val Phe Gly Val His Phe
115 120 125
Cys Lys Leu Ile Phe Ala Ile Tyr Lys Met Ser Phe Phe Ser Gly Met
130 135 140
Leu Leu Leu Leu Cys Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Val Ala Ile Val Gln
145 150 155 160
Ala Val Ser Ala His Arg His Arg Ala Arg Val Leu Leu Ile Ser Lys
165 170 175
Leu Ser Cys Val Gly Ile Trp Ile Leu Ala Thr Val Leu Ser Ile Pro
180 185 190
Glu Leu Leu Tyr Ser Asp Leu Gln Arg Ser Ser Ser Glu Gln Ala Met
195 200 205
Arg Cys Ser Leu Ile Thr Glu His Val Glu Ala Phe Ile Thr Ile Gln
210 215 220
Val Ala Gln Met Val Ile Gly Phe Leu Val Pro Leu Leu Ala Met Ser
225 230 235 240
Phe Cys Tyr Leu Val Ile Ile Arg Thr Leu Leu Gln Ala Arg Asn Phe
245 250 255
Glu Arg Asn Lys Ala Ile Lys Val Ile Ile Ala Val Val Val Val Phe
260 265 270
Ile Val Phe Gln Leu Pro Tyr Asn Gly Val Val Leu Ala Gln Thr Val
275 280 285
Ala Asn Phe Asn Ile Thr Ser Ser Thr Cys Glu Leu Ser Lys Gln Leu
290 295 300
Asn Ile Ala Tyr Asp Val Thr Tyr Ser Leu Ala Cys Val Arg Cys Cys
305 310 315 320
Val Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Ile Gly Val Lys Phe Arg Asn Asp
325 330 335
Leu Phe Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Cys Leu Ser Gln Glu Gln Leu
340 345 350
Arg Gln Trp Ser Ser Cys Arg His Ile Arg Arg Ser Ser Met Ser Val
355 360 365
Glu Ala Glu Thr Thr Thr Thr Phe Ser Pro
370 375
<210> 26
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CXCR5
<400> 26
Arg Thr Met Asn Tyr Pro Leu Thr Leu Glu Met Asp Leu Glu Asn Leu
1 5 10 15
Glu Asp Leu Phe Trp Glu Leu Asp Arg Leu Asp Asn Tyr Asn Asp Thr
20 25 30
Ser Leu Val Glu Asn His Leu Cys Pro Ala Thr Glu Gly Pro Leu Met
35 40 45
Ala Ser Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val Ala Tyr Ser Leu Ile Phe
50 55 60
Leu Leu Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val Leu Val Ile Leu Glu Arg
65 70 75 80
His Arg Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr Phe Leu Phe His Leu Ala
85 90 95
Val Ala Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile Leu Pro Phe Ala Val Ala Glu
100 105 110
Gly Ser Val Gly Trp Val Leu Gly Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val Ile
115 120 125
Ala Leu His Lys Val Asn Phe Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys
130 135 140
Ile Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala Tyr
145 150 155 160
Arg His Arg Arg Leu Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile Trp
165 170 175
Leu Val Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys Val
180 185 190
Ser Gln Gly His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gln
195 200 205
Glu Asn Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr
210 215 220
His Val Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr
225 230 235 240
Val Gly Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln Arg
245 250 255
Gln Lys Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe Leu
260 265 270
Cys Trp Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala Arg
275 280 285
Leu Lys Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly Ser Leu Pro Val
290 295 300
Ala Ile Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys Leu Asn
305 310 315 320
Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg Ser Asp Leu Ser
325 330 335
Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln
340 345 350
Leu Phe Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala
355 360 365
Thr Ser Leu Thr Thr Phe
370
<210> 27
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 2A
<400> 27
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 28
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab10
<400> 28
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
20 25 30
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
165 170 175
Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr
210 215 220
Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn
245 250 255
Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 29
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ab362
<400> 29
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly
180 185 190
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr
195 200 205
Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
210 215 220
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp
225 230 235 240
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 30
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链
<400> 30
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 31
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 跨膜
<400> 31
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 32
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 共刺激
<400> 32
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 33
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 胞内信号传导
<400> 33
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110

Claims (10)

1.融合蛋白，其包含：
a)靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)；
b)增效结构域，所述增效结构域能够增强所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体对肿瘤细胞的杀伤能力。
2.一种或多种分离的核酸分子，其编码权利要求1所述的融合蛋白或其片段。
3.载体，其包含权利要求2所述的核酸分子。
4.细胞，其包含权利要求3所述的载体，或者表达权利要求1所述的融合蛋白。
5.制备权利要求1所述的融合蛋白的方法，其包括以下的步骤：合成权利要求1所述的融合蛋白，和/或，在表达权利要求1所述的融合蛋白的条件下培养权利要求4所述的细胞。
6.药物组合物，其包括权利要求1所述的融合蛋白和任选地药学上可接受的佐剂。
7.权利要求1所述的融合蛋白和/或权利要求6所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述肿瘤包括淋巴瘤和/或胰腺癌。
9.一种增强靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体对肿瘤细胞的杀伤能力的方法，其中所述方法包括以下的步骤：使所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体与增效结构域连接，其中所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：OX40、OX40L、CCR7和CXCR5。
10.一种增强包含靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体的T细胞扩增能力的方法，其中所述方法包括以下的步骤：使所述靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体与增效结构域连接，其中所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：OX40、OX40L、CCR7和CXCR5。
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