JP6584986B2 - 核酸検出方法 - Google Patents

Description

本発明の実施形態は、核酸検出方法に関する。

現在、遺伝子検査技術の進展に伴い、臨床現場や犯罪捜査などの様々な場面で核酸検査が実施されている。対象遺伝子は、リアルタイムＰＣＲ法やマイクロアレイ法により検出または定量されている。例えば、リアルタイムＰＣＲ法は、核酸の増幅を伴うことから感度が高く、定量範囲が広い。一方、マイクロアレイ法は、同時に数万種類以上の対象遺伝子を検出することが可能である。また、これらの方法を組み合わせた検出方法が提供されている。

上記のような状況において、現在、核酸を簡便かつ高感度に検出する方法の更なる開発が望まれている。

特開２０１３−６６４６３号公報

本発明が解決しようとする課題は、核酸を簡便かつ高感度に検出できる核酸検出方法を提供することである。

実施形態に従う核酸検出方法は、試料中の標的核酸を検出する方法である。標的核酸は第１の配列を含む。当該方法は、基体と、前記基体の少なくとも一つの面に一方の端が固定されており、前記第１の配列に相補的な配列または前記第１の配列と同じ配列を含む核酸プローブとを備えるプローブ固定基体を用いて行われる。当該方法は、当該少なくとも一つの面に接して前記核酸プローブを含むように反応場を形成し、当該反応場で、前記試料、検出可能な信号を生ずる標識物質、前記第１の配列またはその相補配列を含む増幅産物核酸を生成するポリメラーゼ、プライマーセット、および予め定められた濃度の塩を含んでいる反応液を増幅条件下に維持することと；増幅条件下で前記増幅産物核酸と前記核酸プローブとの結合および／または近接により生ずる標識物質からの信号を検出することと；当該検出結果から前記標的核酸の有無および／または量を決定することとを含む。標識物質は、前記核酸プローブに結合および／または近接している核酸の存在または存在量の増加により、前記検出可能な信号が変化する物質である。当該予め定められた濃度は、以下の第１の塩濃度および第２の塩濃度のうち、より高い方の濃度よりも高く、第３の塩濃度以下である。前記第１の塩濃度は、前記ポリメラーゼおよび前記プライマーセットを含む評価用反応液中で標準配列を含む評価用核酸から評価用増幅産物核酸が形成されるときの増幅反応速度がピークとなるときの濃度である。前記標準配列は前記第１の配列である。前記第２の塩濃度は、前記核酸プローブと、前記評価増幅反応により形成された評価用増幅産物核酸とのハイブリダイズ速度が０ａｕよりも高くなるときの濃度である。前記第３の塩濃度は、前記評価用増幅産物核酸の検出量が予め定められた閾値以上となる塩濃度のうちの最も高い濃度である。

実施形態のプローブと増幅産物核酸との関係の一例を示す模式図である。 実施形態のプローブ固定基体の一例を示す模式図である。 実施形態のプローブ固定基体の一例を示す模式図である。 実施形態の方法に用いるプライマーの一例を示す図である。 反応液の塩濃度に対する核酸の増幅速度の例を表すグラフである。 実施形態の第２の塩濃度を決定する方法の一例を示すフローチャートである。 反応液の塩濃度に対するハイブリダイゼーション速度の一例を示すグラフである。 反応液の塩濃度に対する増幅産物核酸の検出量を表すグラフである。 実施形態のプローブ固定基体の一例を示す模式図である。 実施形態のプローブと増幅産物核酸との関係の一例を示す模式図である。 実施形態のプローブ固定基体の一例におけるプローブの使用時の様子を示す模式図である。 例における実験結果を示す図である。 例における実験結果を示す図である。 例における実験結果を示す図である。 例における実験結果を示す図である。

１．核酸検出方法の概要
実施形態に従う核酸検出方法は、試料中の標的核酸を検出する方法である。標的核酸は第１の配列を含む。当該方法は、基体と、前記基体の少なくとも一つの面に一方の端が固定されており、前記第１の配列に相補的な配列または前記第１の配列と同じ配列を含む核酸プローブとを備えるプローブ固定基体を用いて行われる。当該方法は、当該少なくとも一つの面に接して前記核酸プローブを含むように反応場を形成し、当該反応場で、前記試料、検出可能な信号を生ずる標識物質、前記第１の配列またはその相補配列を含む増幅産物核酸を生成するポリメラーゼ、プライマーセット、および予め定められた濃度の塩を含んでいる反応液を増幅条件下に維持することと；増幅条件下で前記増幅産物核酸と前記核酸プローブとの結合および／または近接により生ずる標識物質からの信号を検出することと；当該検出結果から前記標的核酸の有無および／または量を決定することとを含む。標識物質は、前記核酸プローブに結合および／または近接している核酸の存在または存在量の増加により、前記検出可能な信号が変化する物質である。当該予め定められた濃度は、以下の第１の塩濃度および第２の塩濃度のうち、より高い方の濃度よりも高く、第３の塩濃度以下である。前記第１の塩濃度は、前記ポリメラーゼおよび前記プライマーセットを含む評価用反応液中で標準配列を含む評価用核酸から評価用増幅産物核酸が形成されるときの増幅反応速度がピークとなるときの濃度である。前記標準配列は前記第１の配列である。前記第２の塩濃度は、前記核酸プローブと、前記評価増幅反応により形成された評価用増幅産物核酸とのハイブリダイズ速度が０ａｕよりも高くなるときの濃度である。前記第３の塩濃度は、前記評価用増幅産物核酸の検出量が予め定められた閾値以上となる塩濃度のうちの最も高い濃度である。

以下、実施形態に従う核酸検出方法について、詳細に説明する。

実施形態に従う核酸検出方法は、試料中の標的核酸を検出する方法である。

試料は、検出対象を含み得る分析されるべき対象であればよく、標的核酸を含む可能性のあるものであればよい。例えば、試料は液体であり得る。例えば、試料は、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰、リンパ液、汗、髄液、涙液、母乳、羊水などの生体物質、または環境から採取された環境物質、人工核酸或いはそれらの混合物などであってもよい。例えば、これらの何れかを本実施形態に従う試料として使用するために、細切、ホモジナイズおよび抽出などそれ自身公知の何れかの手段により前処理を行ってもよい。例えば、これらの何れかを生体または環境などから採取し、何れかの手段によって核酸を抽出し、得られた核酸成分を含む液体を試料としてもよい。

標的核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾若しくは合成核酸などであり得る。標的核酸は、第１の配列をターゲットとして含む。第１の配列は、実施形態の核酸検出方法において増幅され、核酸プローブまたはその一部とハイブリダイズするべき配列である。標的核酸は、後述する第１の配列を増幅するためのプライマーセットが結合するための増幅用領域を含む。増幅工程においては、第１の配列を増幅して得られる増幅産物核酸が、更に当該プライマーセットにより増幅され得る。

第１の配列の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、６０塩基〜７０塩基、７０塩基〜８０塩基、８０塩基〜９０塩基、９０塩基〜１００塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であり得る。

増幅とは、第１の配列をまたはその相補配列を含む核酸を鋳型として連続して複製し、増幅産物核酸を生成することをいう。実施形態において使用される増幅法は、後述するプライマーセットを用いて第１の配列を等温増幅する方法であれはよい。増幅法は、これらに限定するものではないが、例えば、等温増幅方法または変温増幅方法であり得る。それらは例えば、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＴ−ＬＡＭＰ増幅、ＳＤＡ増幅、ＮＡＳＢＡ増幅、ＲＣＡ増幅、ＳＭＡＰ増幅およびＩＣＡＮ増幅などを含み得る。また、所望に応じて逆転写反応を増幅反応と同時に行ってもよい。

検出とは、標的核酸の有無を検出することであってもよく、標的核酸の量を定量することであってもよい。

２．プローブ固定基体
当該第１の配列を含む標的核酸の検出は、プローブ固定基体を用いて行われ得る。

図１に当該プローブ固定基体の一例の模式図を示す。プローブ固定基体１は、基体２と核酸プローブ３とを備える。核酸プローブは、以下、「プローブ」と記す。

基体２は、少なくとも１つの面を有する固相である。基体２は、例えば、樹脂、ガラス、またはシリコン、或いはこれらの何れかの表面に金属膜が形成されたものなどであり得る。金属膜は、例えば、金などで構成され得る。基体２は、例えば、核酸に関する情報を得るための電極またはその他のセンサを含み得る。基体２の全体的な形状は、容器形状、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であり得る。基体２の大きさおよび形状は実施者が任意に選択すればよい。また、基体２として、流路を有する基板を用いてもよい。

プローブ３は、基体２の少なくとも１面に固定されている核酸鎖である。プローブ３は、基体２のプローブ固定領域２ａに固定され得る。プローブ３は、一本鎖核酸であってもよく、或いは後述するような二本鎖核酸であってもよい。

例えば、一本鎖核酸である場合、プローブ３は、第１の配列４に相補的な配列、即ち、第１の配列結合領域４’を含み得る。この第１の配列結合領域４’には、増幅産物核酸５中の第１の配列４がハイブリダイズし得る。或いはプローブ３は、第１の配列４と同じ配列を含み得る。それにより、反応場に存在する標的核酸に由来する第１の配列に相補的な配列にハイブリダイズし、それにより標的核酸が検出されてもよい。

プローブ３は、第１の配列４またはその相補配列に加えて、更なる核酸部分を含み得る。この核酸部分は、例えば、リンカーなどであり得る。

プローブ３の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、６０塩基〜７０塩基、７０塩基〜８０塩基、８０塩基〜９０塩基、９０塩基〜１００塩基、例えば、１０塩基〜５０塩基であり得る。第１の配列結合領域の塩基長は、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、６０塩基〜７０塩基、７０塩基〜８０塩基、８０塩基〜９０塩基、９０塩基〜１００塩基であり得る。例えば、１０塩基〜５０塩基であり得る。

プローブ３の基体２への固定は、これらに限定されるものではないが、例えば、メルカプト基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基およびビオチンなど末端修飾基を介して行ってもよい。これらの官能基の選択およびプローブ３の固定は、それ自身公知の手段により達成することが可能である。

プローブ固定基体は、１つの基体に固定された複数種類のプローブを備えてもよい。そのようなプローブ固定基体の一例を図２に示す。図２に示されるように、プローブ固定基体１００は、一つの基体２００の一つの面上にアレイ状に互いに独立して配置されたプローブ固定領域２００ａを備え、更にこれらのそれぞれに、種類ごとに固定されている複数種類のプローブ３００を備える。互いに独立して配置するために、それらに固定されているプローブが互いに影響を与えない間隔でプローブ固定領域が配置されている。複数種類のプローブは、互いに異なる配列を有し得る。互いに異なる配列は、プローブの配列のうち任意の複数の配列領域が互いに異なった配列であってもよく、全長に亘り互いに異なった配列であってもよい。複数種類のプローブのそれぞれの塩基長は、互いに同じであってもよいし、異なっていてもよい。プローブ固定基体１００は、複数種類のプローブの他に、更に、陽性信号および／または陰性信号を確認するためのポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールとなるプローブを含んでいてもよい。

このようなプローブ固定基体は、試料に含まれる、それぞれ第１_１〜１_ｎの配列またはそれらの相補配列を含む第１〜第ｎの複数の標的核酸を検出するのに用いられ得る。その場合、プローブ固定基体は、第１〜第ｎの複数の核酸プローブを備える。これらの第１〜第ｎの核酸プローブは、それぞれ前記第１_１〜１_ｎの配列と相補的な配列を含み得る。ｎは、２以上の整数である。

図３に示すプローブ固定基体１０１は、基体２０１と、基体２０１の一つの面上にアレイ状に独立して配置されているプローブ固定領域としての複数の電極２０１ａに種類ごとに固定されている複数種類のプローブ３０１ａと、電極２０１ａに電気的に接続されたパット２０１ｂとを備える。このようなプローブ固定基体１０１は、後述する電気的に活性な標識物質からの信号を検出するために使用され得る。電気信号として伝えられる情報はパット２０１ｂから取り出し得る。このプローブ固定基体１０１は、参照電極および対極を更に具備し得る。

基体は、反応場を支持し得る。反応場において、増幅反応と検出反応とが行われる。反応場は、基体２のプローブ３が固定されている面に接して存在していてもよく、基体２全体を含むように容器に収容されていてもよい。反応場には反応液が存在する。反応液は、当該検出方法を行う前に反応場に持ち込まれ得る。

反応液は、第１の配列を含む増幅産物核酸を生成するための増幅反応および前記プローブ固定基体による増幅産物核酸の検出反応を両方行うための反応液である。

そのような反応液は、ポリメラーゼと、前記第１の配列を増幅するためのプライマーセットと、特定の濃度の塩とを含む。ポリメラーゼは、核酸増幅酵素であり、これにより標的核酸またはその増幅産物核酸を鋳型として、第１の配列に相補的な配列を有する核酸配列を合成する。ポリメラーゼは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡポリメラーゼなどであり得る。ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ、Ｂｓｔ２．０、Ｂｓｔ３．０、ＧｓｐＳＳＤ、ＧｓｐＭ、Ｔａｑまたはこれらの何れかの組み合わせなどであり得る。ポリメラーゼの種類は、所望に応じて選択され得る。反応液は何れかの逆転写酵素を含んでいてもよい。

プライマーセットは、核酸の所望の配列を増幅するために必要なプライマーの集合体である。例えば、ＰＣＲ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、１つの第１の配列を増幅するための１種類のフォワードプライマーと１種類のリバースプライマーとを含めばよい。また例えば、ＬＡＭＰ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、少なくとも１つの標的核酸を増幅するためのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーを含めばよく、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＰプライマー、即ち、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーを含んでもよい。

本実施形態で使用するプライマーセットは、第１の配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであればよい。例えば、二つのプライマーにより増幅を行う場合、標的核酸上で第１の配列を挟み込むようにそれらが結合するための増幅用配列が配置される。また、プライマーセットは、反応場において得られる増幅産物核酸の一本鎖部分に第１の配列を含むように設計されることが好ましい。例えば、ＬＡＰＭ法を利用する場合、ＬＡＭＰ増幅産物核酸は、一本鎖領域であるループ部分と、二本鎖領域であるステム部分とを有するステムループ構造を有する。この場合、ループ部分に第１の配列が含まれるように設計され得る。

例えば、そのようなプライマーセットは、以下のように設計され得る。図４には、検出しようとする二本鎖ＤＮＡを示した。増幅産物のステム・アンド・ループ構造の中央（４Ａまたは４Ｂ）に位置するようなターゲット配列を増幅・検出しようとする場合、その両側に位置する配列に基づいて、合計４種類のプライマー配列（ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー）を設定する。ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々二つの領域（ＦＩＰ＝Ｆ１ｃ＋Ｆ２、ＢＩＰ＝Ｂ２＋Ｂ１ｃ）を含んでいる。上記４種類のプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図４の二本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖から、ステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。

或いは、一本鎖のループ部分にターゲット配列が位置するようにプライマーを設計してもよい。即ち、ターゲット配列が、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間(Ｆ２領域含む)（４Ｃ)、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(Ｆ２ｃ領域含む)（４Ｄ）、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間(Ｂ２領域含む)（４Ｅ）、および／またはプライマー領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(Ｂ２ｃ領域含む)（４Ｆ）の何れかに位置するように、６つのプライマー領域を設定してもよい。こうして設定された６つのプライマー領域に基づいて４種類のプライマーを作製し、これらプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうことにより、ターゲット配列が増幅産物のダンベル構造における一本鎖ループの中に位置することとなる。

塩は、例えば、核酸増幅反応において適切な増幅環境を維持するために用いられる公知の何れかの塩であり得る。核酸増幅反応において適切な増幅環境を維持するとは、例えば、ポリメラーゼが核酸増幅活性が最適となるようにその三次構造を保つことなどであり得る。塩は、例えば、塩化カリウム、硫化マグネシウム、または塩化マグネシウムまたはこれらの何れかの組み合わせなどであり得る。

反応液に含まれる塩の濃度は、次の通りである。

反応液中で第１の配列の増幅反応と増幅産物核酸の検出とを反応液中で行うことは、反応液が上述の塩を次のような塩濃度で含むことによって達成され得る。即ち、当該塩濃度は、以下に説明する第１の塩濃度および第２の塩濃度のうち、より高い方の濃度よりも高く、第３の塩濃度以下である。

前記第１の塩濃度は、前記ポリメラーゼおよび前記プライマーセットを含む評価用反応液中で標準配列を含む評価用核酸から評価用増幅産物核酸が形成されるときの増幅反応速度がピークとなるときの濃度である。前記標準配列は前記第１の配列である。前記第２の塩濃度は、前記核酸プローブと、前記評価増幅反応により形成された評価用増幅産物核酸とのハイブリダイズ速度が０ａｕよりも高くなるときの濃度である。前記第３の塩濃度は、前記評価用増幅産物核酸の検出量が予め定められた閾値以上となる塩濃度のうち最も高い濃度である。第１の塩濃度、第２の塩濃度および第３の塩濃度は、当該核酸検出方法による検出が行われる前に予め決定され得る。

評価用核酸は、標準配列を含む核酸鎖である。例えば、標準配列は、第１の配列であり得る。従って、評価用核酸の増幅速度、評価用核酸を鋳型として生成された評価用増幅産物核酸とプローブとのハイブリダイゼーション速度、および評価用増幅産物核酸の検出量はそれぞれ、反応液の成分および反応条件が同じであれば、標的核酸の増幅速度、標的核酸を鋳型として生成された増幅産物核酸とプローブとのハイブリダイゼーション速度、および前記増幅産物核酸の検出量と同じであるとみなされる。評価用核酸の標準配列以外の塩基配列、長さおよびＴｍ値は、それぞれ標的核酸と異なっていてもよいが、類似することが好ましく、同じであることがより好ましい。

第１_１〜１_ｎの配列含む第１〜第ｎの複数の標的核酸を検出する場合、反応液の塩濃度は、以下のような標準配列を含む評価用核酸を用いて決定され得る。第１_１〜１_ｎの配列は、第１〜第ｎの複数の標的核酸それぞれに含まれる前記第１の配列に該当する配列である。そのような標準配列は、第１_１〜１_ｎの配列の特徴を代表する配列である。第１_１〜１_ｎの配列の特徴とは、Ｔｍ値、配列の長さまたはＧＣ含量などであり得る。特徴を代表する配列とは、例えば、第１_１〜１_ｎの配列のＴｍの平均値と同じ若しくはこれに近い（例えばＴｍ値の±２０％の範囲の）Ｔｍ値を有する配列、第１_１〜１_ｎの配列の塩基長の平均値と同じ若しくはこれに近い（例えば塩基長さの平均値の±２０％の範囲の）塩基長を有する配列、第１_１〜１_ｎの配列のうち最も高いＴｍ値を有する配列、または第１_１〜１_ｎの配列のうち最も長い塩基長を有する配列などであり得る。そのような配列は、第１_１〜１_ｎの配列の中から選択された配列であってもよいし、別に設計した配列であって良い。

第１の濃度は、前記ポリメラーゼおよび前記プライマーセットでの第１の配列を含む評価用核酸についての評価増幅反応速度がピークとなるときの濃度である。ポリメラーゼの三次構造は塩濃度によって変化し、ポリメラーゼによって固有の特定の塩濃度において、ポリメラーゼは核酸合成を行うための酵素活性が最大となる構造になる。従って、反応液の塩濃度に対する核酸の増幅速度は、上に凸の放物線を示す。図５に、ＧｓｐＳＳＤ、Ｂｓｔ、Ｂｓｔ２．０、およびＢｓｔ３．０の反応液の塩濃度に対する核酸の増幅速度の一例を示した。図５に示されるように、増幅速度は、塩濃度０ｍＭから塩濃度が高くなるにつれて徐々に高くなり、ポリメラーゼの種類によって固有の特定の塩濃度でピークとなり、それより塩濃度が高くなると、増幅速度は徐々に低くなる。第１の塩濃度は、そのグラフの頂点、即ちピークとなるときの塩濃度である。ピークとなるときの塩濃度は、図５に示されるように、増幅反応に用いられるポリメラーゼの種類に応じて変わる。そのため、核酸検出方法に用いられるポリメラーゼを用いて、第１の塩濃度が決定され得る。

第１の塩濃度の決定は、例えば、塩濃度の異なる複数の反応液で増幅反応を行い、増幅速度を測定することによって行われ得る。このような塩濃度の決定は、例えば、図６のフローチャートに示される以下のような工程で行われ得る。

まず、塩濃度の異なる複数の反応液を用意する（Ａ）。塩は、当該核酸検出方法に用いられる塩である。これらの反応液に含まれ得る塩濃度は、例えば、１０ｍＭ〜３００ｍＭ、または１０ｍＭ〜１００ｍＭなどの範囲の、１０ｍＭ、２０ｍＭ、または３０ｍＭなどの間隔で異なる濃度であり得る。反応液は、更に所望のポリメラーゼと、濃度既知の評価用核酸と、評価用核酸に含まれる第１の配列を増幅するためのプライマーセットとを含む。ポリメラーゼは、核酸検出方法に用いられ得る所望のポリメラーゼである。プライマーセットは、評価用核酸に含まれる所望の配列を増幅するためのプライマーセットである。プライマーセットの種類、配列は実施形態の核酸検出方法において用いられる増幅方法に応じて選択され得る。当該反応液は、上述の成分に加えて、増幅反応に必要な所望の成分を含み得る。そのような成分は、例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの基質、反応試薬としての増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤および／または逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質などであり得る。

次に、前記（Ａ）で得られた反応液のそれぞれに対して前記評価用核酸に含まれる所望の配列を増幅するための評価増幅反応が行われ得る（Ｂ）。評価増幅反応の種類は、核酸検出方法において用いられるものと同じ種類の増幅反応であり得る。それは、例えば、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＴ−ＬＡＭＰ増幅、ＳＤＡ増幅、ＮＡＳＢＡ増幅、ＲＣＡ増幅、ＳＭＡＰ増幅およびＩＣＡＮ増幅などであり得る。

前記評価増幅反応と並行して、反応液それぞれにおいて評価用核酸の増幅の有無がモニタリングされ得る（Ｃ）。評価用核酸の増幅の有無は、例えば、反応液の濁度を計測すること、増幅産物核酸を検出すること、またはピロリン酸を検出することによってモニタリングされ得る。「モニタリング」とは、経時的に検出されることであり、経時的とは、例えば、連続的であっても間欠的であってもよい。

このようなモニタリングによって、増幅反応の開始から増幅産物核酸が生じるまでの時間が最も短い反応液が決定され得る。その反応液の塩濃度を「評価増幅反応速度がピークとなる濃度」とする（Ｄ）。または、塩濃度に対する評価増幅速度の検量線を作成し、第１の塩濃度を決定してもよい。

第１の塩濃度は、例えば、ポリメラーゼがＢｓｔの場合１ｍＭ〜８０ｍＭ、Ｂｓｔ２．０の場合１ｍＭ〜８０ｍＭ、Ｂｓｔ３．０の場合１０ｍＭ〜３００ｍＭ、ＧｓｐＳＳＤの場合１ｍＭ〜２００ｍＭであり得るが、これに限定されるものではない。

第２の塩濃度は、前記核酸プローブと、前記評価増幅反応により形成された評価用増幅産物核酸とのハイブリダイズ速度が０ａｕよりも高くなるときの濃度である。

図７に塩濃度に対するハイブリダイゼーション速度の一例を示すグラフを示した。総じて、核酸は負電荷を有するリン酸基を含む。核酸のハイブリダイゼーションにより、リン酸基由来の負電荷が密集し、ハイブリダイゼーションを解消しようとする静電気的な反発が生じる。しかし、核酸が存在する溶液などに含まれる塩の濃度が高いほど、塩由来の陽イオンによりその負電荷の反発が緩和され、核酸同士が近づきやすく、ハイブリダイゼーションが起こりやすくなる。そのため、図７に示されるように、塩濃度が高いほどハイブリダイゼーション速度が上がる。一方で、詳しくは後述するが、当該核酸検出方法において、標的核酸の検出は、標的核酸の評価用核酸が増幅されて生成された増幅産物核酸を第１の配列に相補的な配列を含むプローブに結合および／または近接させることによって行われる。従って、反応液にハイブリダイゼーションが起こる塩濃度以上、即ち、ハイブリダイゼーション速度が０ａｕ以上である塩濃度で塩が含まれることによって、増幅産物核酸の検出が当該反応液中で行われることが可能となる。

そのような濃度は、前記核酸プローブと、前記評価増幅反応により形成された評価用増幅産物核酸とのハイブリダイズ速度が０ａｕよりも高くなるときの濃度である。

このような第２の濃度は、評価用核酸を鋳型として生成された評価用増幅産物核酸および第１の配列に相補的な配列を含むプローブの長さ、濃度、Ｔｍ、ＧＣ含量などによって選択され得る。評価用核酸は、上述の評価用核酸と同じ構成を有し得る。しかしながら、第１の配列以外の配列は、第１の塩濃度の決定に用いられる評価用核酸と異なっていてもよい。第２の濃度は、公知の何れかの方法で決定され得る。第２の塩濃度は、例えば、０ｍＭ〜１００ｍＭであり得るが、これに限定されるものではない。

次に、第３の塩濃度の決定方法について説明する。

第３の塩濃度は、前記評価用増幅産物核酸の検出量が予め定められた閾値以上となる範囲の塩濃度のうち最も高い濃度である。「増幅産物核酸の検出量」は、増幅産物核酸の有無または量を得るための指標となる標識物質からの信号の検出量として示され得る。標識物質からの信号については後述する。

反応液中の塩濃度に対する増幅産物核酸の検出量の一例を図８に示す。図８に示されるように、増幅産物核酸の検出量は、塩濃度０ｍＭから塩濃度が高くなるにつれて徐々に多くなり、ある塩濃度でピークとなり、それより塩濃度が高くなると少なくなる。その理由は以下の通りである。塩濃度が低いときは核酸のハイブリダイゼーション速度が遅いことから、増幅産物核酸の検出量は少なくなり得る。増幅速度のピークとなる塩濃度では、増幅産物核酸がより多く産出されるため、増幅産物核酸の検出量はより多くなり得る。塩濃度がそれより高い濃度では、増幅速度が低下するため、増幅産物核酸の検出量が少なくなり得る。

予め定められた閾値とは、実施形態の核酸検出方法において、それ以上の検出量が得られれば標的核酸の有無および／または量が判断できる検出量であればよい。予め定められた閾値は、ポリメラーゼの種類、増幅産物核酸の長さ、またはＧＣ含量などに応じて選択され得る。検出量が当該閾値以上となる塩濃度は、特定の範囲の塩濃度であり得る。第３の塩濃度は、上述のような範囲の塩濃度のうち、最も高い塩濃度である。

第３の塩濃度の決定は、例えば、塩濃度の異なる反応液で増幅反応を行い、増幅産物核酸を検出することによって行われ得る。

増幅産物核酸の検出は、当該核酸検出方法で使用される検出方法と塩濃度および試料が評価用核酸であること以外、同じ方法で行われ得る。評価用核酸は、上述の評価用核酸と同じ構成を有し得る。しかしながら、第１の配列以外の配列は、第１または第２の塩濃度の決定に用いられる評価用核酸と異なっていてもよい。そのような検出方法は、例えば、上述のような塩濃度が異なる複数の反応液を用意することと（ａ）；基体と、前記基体の少なくとも一つの面に一方の端が固定されており、前記第１の配列に相補的な配列を含む核酸プローブとを備える複数のプローブ固定基体の、前記少なくとも一つの面上に前記複数の反応液を持ち込むことで複数の反応場を形成することと（ｂ）；前記複数の反応液を評価用核酸および標識物質の存在下で、第１の配列を含む増幅産物核酸を生成するための増幅条件下に維持することと（ｃ）；増幅条件下で前記核酸プローブに前記増幅産物核酸を結合および／または近接させることによって生ずる標識物質からの信号を検出することと（ｄ）を含み、標識物質は、前記核酸プローブに結合および／または近接している核酸の存在または存在量の増加により、それ自身の発する検出可能な信号が変化する標識物質であり、反応液は、ポリメラーゼ、第１の配列を増幅するためのプライマーセットを含む。工程（ａ）は上述の工程（Ａ）と同じであり得る。工程（ｂ）〜（ｄ）、および標識物質については、後述する実施形態の核酸検出方法に含まれる工程と同じであり得る。

その結果得られた検出量が、予め定められた閾値と同じである反応液が存在する場合、その反応液のうち最も塩濃度の高い反応液の塩濃度を第３の塩濃度とする。予め定められた検出量と同じ検出量が得られた反応液が存在しない場合、検出量に対する塩濃度の検量線を作成し、第３の塩濃度を決定してもよいし、検出量が予め定められた検出量より多く、かつ予め定められた検出量に最も近い反応液に含まれる塩濃度を第３の塩濃度としてもよい。

第３の塩濃度は、例えば、ポリメラーゼがＢｓｔの場合１ｍＭ〜１００ｍＭ、Ｂｓｔ２．０の場合１ｍＭ〜１００ｍＭ、Ｂｓｔ３．０の場合１０ｍＭ〜３００ｍＭ、ＧｓｐＳＳＤの場合１ｍＭ〜２００ｍＭであり得るが、これに限定されるものではない。

反応液に第３の濃度以下で塩が含まれることによって、反応液中で標的核酸の有無および／または量が判断できる増幅産物核酸の検出量が得られる。

実施形態の反応液に含まれる塩の濃度は、第１の塩濃度と第２の塩濃度のうちのより高い方の濃度よりも高く、第３の塩濃度以下である。このような塩濃度は、例えば、３０ｍＭ以上６０ｍＭ未満、６０ｍＭ以上１２０ｍＭ未満、または１２０ｍＭ以上であり得るが、これに限定されるものではない。

反応液が、以上の塩濃度で塩を含むことによって、反応液中で増幅反応と増幅産物核酸の検出とが行われることが可能である。それによって、より高感度かつ高精度で標的核酸の検出および定量を行うことが可能である。

反応液は、上述の成分に加えて、更に、増幅反応に必要な所望の成分を含み得る。そのような成分は、例えば、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの基質、反応試薬としての増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤、アニーリング特異性を増大するイオン、ポリメラーゼのホ因子となるイオン、および／または逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質などであり得る。

以上に説明した何れかの反応液に含まれる成分はそれぞれ、基体のプローブが固定された面上に反応場を形成している反応液に含まれていればよい。従って、例えば、これらの成分はそれぞれ、反応液が反応場となるべき領域に持ち込まれる前に反応液に含まれていてもよいし、反応液の他の成分とは別に用意され、反応液が反応場となるべき領域に持ち込まれると同時に、持ち込まれる前若しくは後に反応液中に持ち込まれてもよいし、反応場となるべき領域に反応液が持ち込まれる前に基体のプローブが固定されている面などの反応場に接する固相などに遊離可能に固定されていて、反応液が持ち込まれた際に反応液中に含められてもよい。

例えば、プライマーセットが予め基体に遊離可能に固定されている場合、プライマーセットは、基体のプローブが固定されている面などの反応場に接する固相などに存在するプライマー固定領域に固定され得る。プライマーセットを複数種類用いる場合、プライマーセットは、アレイ状に互いに独立して配置された複数のプライマー固定領域に配置されてもよい。ここで、「独立して配置される」とは、反応場においてプライマーセットごとに開始および／または進行される増幅を妨げることのない間隔で配置されることである。そのようなプライマー固定領域の位置を示す図を図９に示した。例えば、図９に示されるように、プライマー固定領域２０３ｂは、対応するプローブ固定領域２０３ａに近接して位置し得る。対応するプローブ固定領域２０３ａとは、そのプライマー固定領域２０３ｂに固定されたプライマーセットによって増幅される増幅産物核酸を検出するプローブ３０３が固定されているプローブ固定領域２０３ａを意味する。

上述のような反応液を含む反応場には、更に、試料および標識物質が存在する。試料は上述の試料である。試料は、例えば、反応液が反応場となるべき領域に持ち込まれる前に反応液に含まれていてもよいし、反応液の他の成分とは別に用意され、反応液が反応場となるべき領域に持ち込まれると同時に、持ち込まれる前若しくは後に反応液中に持ち込まれてもよい。

標識物質は、プローブに結合していてもよいし、反応場に含まれる基体の面などの反応場に接する固相などに遊離可能に固定されていてもよいし、反応液中に含まれていてもよいし、プライマーに結合されていてもよい。標識物質を反応場に存在させる方法は、標識物質の種類に応じて選択されればよい。標識物質がプローブに結合している場合、標識物質の結合は、プローブの基体への結合部付近であってもよく、プローブの非結合末端またはその付近であってもよく、プローブの中央部またはその付近であってもよい。標識物質のプローブへの結合方法は、標識物質の種類に応じて選択されればよく、核酸と標識物質とを結合するための何れの方法が選択されてもよい。

標識物質は、検出可能な信号を生ずる物質である。前記信号は、前記プローブに結合および／または近接している核酸の存在または存在量の増加により変化する。後述するが、標識物質は、プローブが二本鎖である場合は、プローブに含まれるアンカー鎖に結合している核酸の存在または存在量の増加により変化する物質であり得る。

「近接」とは、プローブと増幅産物核酸とが結合するために近づいた状態である。近づいた状態とは、増幅核酸鎖がプローブに近づいたことが、例えば、負電荷の増加などによって標識物質の信号を変化させる程度に、当該二つの核酸鎖が近づいていることをいう。

本実施形態において、信号の変化とは、前記プローブに結合および／または近接している核酸の存在または存在量の増加により標識物質が本来的に生ずる信号を検出できない状態から検出ができる状態になること、またはその逆、或いは信号の検出量が変化することである。それは、例えば、プローブと結合および／または近接している増幅産物核酸が存在しないときに検出されない信号が、当該プローブと結合および／または近接している増幅産物核酸が存在することまたは増加することによって、検出可能な信号に変更若しくは変調することなどである。またはその逆で、プローブと結合および／または近接している増幅産物核酸が存在するときに検出される信号が、当該プローブと結合および／または近接している増幅産物核酸が存在することまたは増加することによって、検出されなくなるまたは信号が減少することである。このような変化は、信号の検出可能性の変化とも理解され得る。信号の変化は可逆的であっても不可逆的であってもよい。

このような信号の変化は、増幅産物核酸の有無および量を判定することができる変化である。このような信号の特性から、試料中の標的核酸を簡便かつ高感度に検出できる。実施形態の核酸検出方法においては、反応場に存在する増幅産物核酸を定量的に検出することが可能である。

そのような標識物質は、例えば、電気的または光学的に活性な物質であり得る。

標識物質が電気的に活性な物質である場合、信号は、例えば、電流値、電位値、電気容量値、インピーダンス値などの何れかの電気的な指標であり得る。そのとき、基体のプローブ固定領域は電極であることが好ましい。このような標識物質は、例えば、プローブと増幅産物核酸とにより形成される二本鎖を識別して結合するインタカレータなどの二本鎖認識物質などであり得る。二本鎖核酸に結合した信号は電気信号として検出さ得る。二本鎖認識物質の例は、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーターなどのそれ自身が二本鎖を認識する物質であり得る。例えば、このような二本鎖認識物質は、ハイブリダイズの有無を判定するための信号を発生する挿入剤であり得る。これらの二本鎖認識物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで更に修飾してもよい。

或いは、標識物質は、例えば、その酸化還元電位が検出可能な電気化学的信号となり得る酸化剤などであり得る。そのような標識物質は、例えば、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、鉄錯イオン、ルテニウム錯イオン、コバルト錯イオンなどであり得る。これらの標識物質は、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、鉄錯体、ルテニウム錯体、コバルト錯体を反応液に溶解することにより得られる。例えば、標識物質としてフェリシアン化物イオン（Ｆｅ（ＣＮ）６４−）を用いた場合には、Ｆｅ（ＣＮ）６４−がＦｅ（ＣＮ）６３−になる酸化反応により電子が放出される。Ｆｅ（ＣＮ）６４−は電極付近の核酸が増えると電極から遠ざかる。そのことで、電極に流れ込む電子が減る。この電子の流れの変化が、電気化学的信号の変化として検出され得る。それらの反応液中の濃度は、例えば、１０μＭ〜１００ｍＭであってもよく、また例えば約１ｍＭであってもよい。

標識物質が光学的に活性な物質である場合、標識物質からの信号は、例えば、特定の波長を有する光、例えば、蛍光または発光などであり得る。このような標識物質は、プライマーに結合させて用いられてもよいし、プローブに結合させて用いられてもよいし、反応液中に含ませて用いられてもよい。例えば、プライマーに結合させて用いられる場合、増幅反応によって標識物質が結合した増幅産物核酸が生成する。これらの増幅産物核酸がプローブに結合することによって、そのプローブ固定領域の蛍光値が増大し得る。プローブに結合させて用いられ得る場合、標識物質は、例えば、プローブが増幅産物核酸と結合して二本鎖になっていることで、発光する、波長を変化させる、または発光しなくなる物質であり得る。標識物質は、反応液中に含まれて用いられる場合、標識物質は、例えば、予め蛍光を生じている物質であり、増幅産物核酸と結合して二本鎖となったプローブに結合することで、そのプローブ固定領域の蛍光値が増大する物質であり得る。標識物質として使用される物質の例は、これらに限定するものではないが、例えば、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ７５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５０／５６０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６９、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ ＢＬＵＥ（登録商標）、ＦＡＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｇａｔｅｗａｙ ＦＷ、Ｇａｔｅｗａｙ ＲＶ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８−Ｘ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｘ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｒｈｏｄｏｌ Ｇｒｅｅｎ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−Ｘ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５などを含む。

以上のような反応場に存在する反応液を等温増幅反応条件下に維持する。等温増幅反応条件とは、反応液を以下のような温度に維持することであり得る。当該温度は、反応液中において、標的核酸の第１の配列の増幅によって第１の配列を増幅産物核酸が生成され、かつプローブおよび増幅産物核酸が結合および／または近接する温度であればよい。当該温度は、使用されるポリメラーゼの種類の選択によって定まる。当該温度は、例えば、２５℃〜７０℃の範囲であってもよく、例えば、５５℃〜６５℃の範囲であってもよい。

このような条件下での等温増幅反応による増幅産物核酸の生成によって、前記プローブの第１の配列結合領域および増幅産物核酸の第１の配列結合および／または近接が起こり得る。それによって標識物質からの信号が変化し得る。

そのような変化した標識物質からの信号を検出する。増幅反応および標的核酸の検出は、同時期内に行われ得る。「同時期内」とは、例えば、同時、順次または並行と解され得る。

標的物質がプローブに結合している電気的に活性な物質である場合、信号は、例えば電極から得られる電流値、電位値、電気容量値またはインピーダンス値などを検出できる装置によって検出され得る。そのような装置は公知の何れかの装置であり得る。標的物質が光学的に活性な物質である場合、信号は、例えば、蛍光または発光などを検出できるセンサによって検出され得る。そのようなセンサは公知の何れかの装置であり得る。

信号の検出は、経時的に行われ得る。経時的とは、連続的であってもよいし、間欠的、即ち所望の時間間隔で複数の時点で検出することであってもよい。等温増幅反応の開始から所望の時間に亘り経時的に検出すると、増幅産物核酸が存在する場合には、増幅産物核酸が存在しない場合に比べて大きな値の信号が得られ得る。或いは、より早い時点で信号の増加の立ち上がりが観察され得る。または増幅産物核酸の量に応じて異なる信号が得られ得る。

前記検出結果から前記標的核酸の有無および／または量を決定する。標的核酸の有無および／または量の決定は、検出信号が予め定められた閾値を超えるまでに要する時間を立ち上がり時間として計測し、得られた結果に基づいて行われ得る。或いは、標的核酸の有無および／または量は、核酸の存在量が既知である異なる複数の標準試料核酸を用意すること、標準試料核酸を用いて測定し、各核酸の存在量に対して得られた測定結果から検量線を作成すること、および標的核酸の測定結果と作成された検量線とを比較することによって、試料中の標的核酸の存在量を算出することによって行われてもよい。

更なる実施形態として、以下のような複数種類のプローブによって複数の標的核酸を検出する方法が提供される。

前記標的核酸は、第１〜第ｎの複数の前記標的核酸を含み、ｎは２以上の整数であり、
前記第１〜第ｎの標的核酸は、それぞれ第１_１〜１_ｎの配列それぞれ含み、
前記核酸プローブは、第１〜第ｎの複数の前記核酸プローブを含み、前記第１〜第ｎの核酸プローブは、それぞれ前記第１_１〜１_ｎの配列に相補的な配列をそれぞれ含み、
前記プライマーセットは、前記第１_１〜１_ｎの配列またはそれらの相補配列をそれぞれ含む、第１〜第ｎの増幅産物核酸を生成するための第１〜第ｎの複数の前記プライマーセットを含み、
前記標準配列は、前記第１_１〜１_ｎの配列の特徴を代表する配列である核酸検出方法。

・プローブが二本鎖である核酸検出方法
更なる実施形態において、プローブは、例えば二本鎖であってもよい。そのようなプローブは、アンカー核酸鎖と被覆核酸鎖とを含む。アンカー核酸鎖は、以下「アンカー鎖」と記す。被覆核酸鎖は、以下「被覆鎖」と記す。

以下にこのようなプローブについて、詳細に説明する。プローブが二本鎖であるプローブ固定基体の一例を図１０に示す。図１０においては、基体に固定されている複数のプローブのうち一つのプローブ３を示した。

プローブ３は、アンカー鎖３ａと被覆鎖３ｂとを含む。アンカー鎖３ａは、基体２に固定されており、第２の配列６を含む。基体２は、上述の基体と同じものであり得る。アンカー鎖３ａの塩基長は、前記プローブと同じであり得る。第２の配列の塩基長の範囲は、第１の配列と同じであり得る。

被覆鎖３ｂは、第１の配列結合領域４’および第２の配列６に相補的な第２の配列結合領域６’を含む。被覆鎖３ｂの第２の配列結合領域６’は、アンカー鎖３ａの第２の配列６と結合ハイブリダイズしている。第１の配列結合領域４’は、一本鎖のプローブに含まれるものと同じであり得る。被覆鎖３ｂは、第１の配列結合領域４’と第２の配列結合領域６’との間またはそれらの３’端側および５’端側に更なる塩基を含んでいてもよい。また第１の配列結合領域４’と第２の配列結合領域６’は、部分的に互いに重なり合って配置されてもよいし、一方の領域の一部分または全体が他方の領域に含まれていてもよいし、完全に重なり合い、１つの配列を共有していてもよい。

被覆鎖３ｂは、第１の配列結合領域４’と第２の配列結合領域６’とが互いに重ならずに独立して配置されていることがより好ましい。これにより、アンカー鎖３ａおよび被覆鎖３ｂの設計の自由度が大きくなり、設計が簡便になる。

被覆鎖３ｂの長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、６０塩基〜７０塩基、７０塩基〜８０塩基、８０塩基〜９０塩基、９０塩基〜１００塩基であり得る。好ましくは１０塩基〜５０塩基であり得る。被覆鎖３ｂに含まれる第１の配列結合領域４’は、一本鎖のプローブに含まれる第１の配列結合領域４’の長さの範囲と同じであり得る。第２の配列結合領域の塩基長は、上述の第１の配列結合領域の長さの範囲と同じであり得る。第１の配列結合領域および第２の配列結合領域の塩基長は同じであっても異なっていてもよい。しかしながら、第１の配列結合領域４’と増幅産物核酸５中の第１の配列４との間の親和性（第１の親和性）と、第２の配列結合領域６’とアンカー鎖３ａとの間の親和性（第２の親和性）は、第１の親和性の方が、第２の親和性よりも強く、結合の後により安定して存在することが好ましい。

このようなプローブ固定基体は、複数の二本鎖プローブを備え得る。当該複数のプローブはプローブ固定基体の基体の少なくとも一面にアレイ状に独立に配置されたプローブ固定領域に配置され得る。このようなプローブ固定領域の配置は、図２に示したプローブ固定基体と同じであり得る。

このようなプローブ固定基体を含む反応場に存在する反応液を増幅条件下に維持する。反応液は、上述のものと同じであり得る。

等温増幅反応における反応場の温度は、以下の条件を満たす温度であればよい。（ｉ）アンカー鎖と被覆鎖との結合が、反応場に増幅産物核酸が存在しない場合には維持されること；（ｉｉ）反応場に増幅産物核酸が存在する場合、増幅産物核酸とアンカー鎖とが被覆鎖との結合に対して競合し、アンカー鎖と被覆鎖との結合が解消すること。

例えば、アンカー鎖と被覆鎖とのＴｍ値が６０℃以上となるように、アンカー鎖および被覆鎖の塩基長および塩基配列が調整されており、等温増幅反応条件として、反応場の温度条件が２５℃〜６０℃であることが好ましい。

そのような等温増幅反応による増幅産物核酸の生成によって、被覆鎖とのハイブリダイズに対して増幅産物核酸とアンカー鎖とが競合し得る。当該競合は、上述のように、被覆鎖がアンカー鎖が結合するための領域と増幅産物核酸が結合するための領域とを含むことによって達成される。競合反応は、例えば、図１１に示されるような反応であり得る。図１１の（ａ）は、等温増幅反応条件下で、前記標的核酸および／または増幅産物核酸５が存在しない場合の当該プローブ固定基体の一例を示す図である。この場合、アンカー鎖３ａおよび被覆鎖３ｂの第２の配列６および第２の配列結合領域６’のハイブリダイズによる結合が維持される。増幅反応が進み、増幅産物核酸５が生成されると（図１１（ｂ））、被覆鎖３ｂは、アンカー鎖３ａから乖離する。乖離した被覆鎖は、増幅産物核酸５の第１の配列４および被覆鎖の第１の配列結合領域４’のハイブリダイゼーションにより、増幅産物核酸５と結合する（図１１（ｃ））。増幅産物核酸５が増えるにしたがって、アンカー鎖３ａから乖離して増幅産物核酸５に結合する被覆鎖３ｂが増加し、一本鎖のプローブ３が増加する。

ここにおいて、アンカー鎖および被覆鎖のそれぞれは、上述被覆鎖とのハイブリダイズに対する増幅産物核酸とアンカー鎖との競合、アンカー鎖からの被覆鎖の乖離が得られる配列になるように設計され得る。

また、アンカー鎖および被覆鎖は、その塩基配列の長さおよびＴｍ値が、等温増幅反応条件下で、ハイブリダイズによるアンカー鎖と被覆鎖との結合が、反応場に前記標的核酸が存在しない場合には維持され、反応場に標的核酸が存在する場合には、標的核酸とアンカー鎖とが被覆鎖に対して競合することにより解消するような範囲になるように設計され得る。

上述のような反応液中で、標識物質からの信号を検出する。標識物質は、アンカー鎖に結合していてもよいし、反応場に含まれる基体の面上に遊離可能に固定されていてもよいし、反応液中に含まれていてもよいし、プライマーに結合されていてもよい。標識物質を反応場に存在させる方法は、標識物質の種類に応じて選択されればよい。標識物質がアンカー鎖に結合している場合、標識物質の結合は、アンカー鎖の基体への結合部付近であってもよく、アンカー鎖の非結合末端またはその付近であってもよく、アンカー鎖の中央部またはその付近であってもよい。標識物質のアンカー鎖への結合方法は、標識物質の種類に応じて選択されればよく、核酸と標識物質とを結合するための何れの方法が選択されてもよい。

標識物質は、検出可能な信号を生ずる物質である。前記信号は、プローブのアンカー鎖に結合している核酸の存在または存在量の増加により変化する。

本実施形態において、信号の変化とは、標識物質が本来的に生ずる信号を検出できない状態から検出ができる状態になること、またはその逆、或いは信号の検出量が変化することである。それは、例えば、増幅産物核酸が存在せずアンカー鎖と被覆鎖とが結合しているときに検出されない信号が、増幅産物核酸が存在し、被覆鎖と乖離したアンカー鎖が増加することによって、検出可能な信号に変更若しくは変調することである。またはその逆で、アンカー鎖と被覆鎖とが結合しているときに検出される信号が、被覆鎖と乖離したアンカー鎖が増加することによって、検出されなくなるまたは信号が減少することである。信号の変化は可逆的であっても不可逆的であってもよい。

このような信号特性の違いから、試料中の標的核酸を簡便かつ高感度に検出できる。実施形態の核酸検出方法においては、反応場に存在する増幅産物核酸を定量的に検出することが可能である。

当該実施形態に用いられ得る標識物質は、電気的に活性な物質または光学的に活性な物質であり得る。電気的に活性な物質の場合、標識物質は、例えば、その酸化還元電位が検出可能な電気化学的信号となり得る上述の酸化剤などであり得る。その場合、被覆鎖が増幅産物核酸と結合してアンカー鎖と乖離した場合、プローブに近づくまたは遠ざかることで、信号が変化し得る。または、それは上述の二本鎖認識物質であり得る。その場合、被覆鎖が増幅産物核酸と結合してアンカー鎖と乖離したときに信号が小さくまたは無くなり得る。光学的に活性な物質である場合、標識物質は、例えば、プローブに結合させて用いられ得る。そのような標識物質は、被覆鎖が増幅産物核酸と結合してアンカー鎖が一本鎖となることで発光する、波長を変化させる、または発光しなくなる物質であり得る。

このような標識物質を用いる場合、光学的信号のより効果的な検出を可能にするクエンチャーが用いられてもよい。クエンチャーは、当該被覆鎖の第１の配列結合領域以外の何れかの位置に配置され得る。このようなクエンチャーは、例えば、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＤａｂｃｙｌなどであり得る。また、例えば、標識物質としてＣｙ３またはＣｙ５が選択される場合には、クエンチャーとして例えば、ＥｕキレートまたはＵｌｉｇｈｔが用いられ得る。

クエンチャーが被覆鎖３ｂに含まれることにより、クエンチャーを含まない場合に比べて、光学的に活性な物質からの信号の発生は更に抑制される。即ち、アンカー鎖３ａと被覆鎖３ｂとが結合して二本鎖を形成している状態の信号値と、二本鎖から被覆鎖３ｂが脱離した状態の信号値との差が大きくなる。言い換えれば、増幅産物核酸５が存在するときの信号値と、増幅産物核酸５が存在しないときの信号値の差が大きくなる。これにより、更により高精度に標的核酸の検出を行うことが可能となる。

当該プローブ固定基体は、上述したクエンチャーのように、被覆鎖３ｂによる信号検出の阻害効果を増強または補助する修飾物質が被覆鎖３ｂに含まれてもよい。そのような修飾物質は、被覆鎖３ｂのアンカー鎖への結合によって阻害される標識物質の本来的な信号の検出の阻害を促進または補助する物質であればよい。例えば、そのような修飾物質は、被覆鎖３ｂの結合による標識物質からの信号のマスキング、減少若しくは消失を増強する物質および／または標識物質の信号特性を検出不可能な方向に変更若しくは修飾する物質などであればよい。例えば、電気化学的に活性な物質を標識物質として用いる場合には、被覆鎖３ｂによる電気信号の減少または消失を増強または補助する物質であってもよい。例えば、光学的に活性な物質を標識物質として用いる場合には、被覆鎖３ｂによる本来的に生じる光学的信号を減少および／または光学的信号の波長を変更する物質などであってもよい。言い換えれば、被覆鎖３ｂは、それ単独で用いられる場合よりも、修飾物質と共に用いられる方が、増幅産物の存在量若しくは不在に応じた、標識物質の信号特性の変化量を大きくできる。従って、修飾物質の使用によって、より高い精度で増幅産物核酸５の存在状態を示すことが可能となる。

標識物質からの信号の検出と、標的核酸の有無および／または量の決定は、上述の方法と同じであり得る。

プローブが二本鎖であるプローブ固定基体では、増幅産物の存在に応じて生ずるアンカー鎖と被覆鎖との間のハイブリダイズの解消を利用して検出を行う。そのため、実施形態の塩濃度の反応液による増幅反応条件下で、増幅反応と同時に増幅産物をより高感度かつ高精度で測定することが可能となる。これにより、試料中の標的核酸をより精度よく定量することも可能である。

以上のような二本鎖プローブを用いた核酸検出方法の一例を以下に記載する。

前記第１〜第ｎの複数の核酸プローブは、それぞれ第１〜第ｎのアンカー核酸鎖と第１〜第ｎの被覆核酸鎖とをそれぞれ含む複数の二本鎖核酸プローブであり、
前記第１〜第ｎのアンカー核酸鎖は、前記基体の少なくとも一つの面に一方の端が固定されており、第２_１〜２_ｎの配列をそれぞれ含み、前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖は、前記第２_１〜２_ｎの配列のそれぞれに相補的な前記第２_１〜２_ｎの配列結合領域と前記第１_１〜１_ｎの配列のそれぞれに相補的な第１_１〜１_ｎの配列結合領域とをそれぞれ含み、前記第１〜第ｎのアンカー核酸鎖にそれぞれハイブリダイズしており
前記標準配列は、前記第１_１〜１_ｎの配列の特徴を代表する配列である。

ｎは、任意の整数である。ｒは、１〜ｎの任意の整数である。

実施形態の塩濃度の反応液を用いた核酸検出方法によれば、標的核酸を従来よりも高い精度で簡便に検出および定量することが可能となる。また、従来よりも短時間で多くの標的核酸の検査を行うことが可能となる。また、試料の取り違いが生じる可能性が低くなる。

［例］
＜例１＞
塩濃度に対するハイブリダイゼーション速度を測定した例を記載する。塩濃度に対するパルボウイルスの人工配列の増幅産物とプローブとのハイブリダイズ速度を求めた。パルボウイルスの人工配列は１０^３〜１０^５コピーであり、表１に示した配列である（配列番号１）。プローブは、表２の配列番号２に示す配列を有する。

まず、反応液を調製した。反応液は、上述の何れかのポリメラーゼ、ｐＨ調製用緩衝剤、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン、界面活性剤、ｄＮＴＰｓ、ＬＡＭＰプライマーを標準的な濃度で含む。使用したＬＡＭＰプライマーの配列を表３に示した。

各反応液のｐＨは、ｐＨ８〜９に調節した。これらの反応液を各ポリメラーゼごとに所望の数で調製した。各反応液に、塩化カリウムを加え、２４μＬに調製した。塩化カリウムは、各反応液における塩の終濃度が１０ｍＭ〜３００ｍＭまでの複数の所望の種類の濃度となるように反応液に加えられた。その後、各反応液にパルボウイルスまたはパピローマウイルスの人工配列を１μＬとなるように加え、６０℃〜６５℃の等温で加温し、増幅反応を開始した。ハイブリダイゼーション速度は例えば、生化学実験講座２ 核酸の化学Ｉ Ｐ３１２〜３２１（東京化学同人）に記載の方法を用いて決定する事ができる。

＜例２＞
塩濃度に対するポリメラーゼによる核酸増幅速度を測定した例を記載する。ポリメラーゼとしてＢｓｔ、Ｂｓｔ２．０、Ｂｓｔ３．０、ＧｓｐＳＳＤを用いて、パルボウイルスまたはパピローマウイルスの人工配列（１０^３〜１０^５コピー）（表１，配列番号１に示す）の塩濃度に対する増幅速度を求めた。まず上述のポリメラーゼを一種類ずつ含む反応液を調製した。反応液は、上述の何れかのポリメラーゼ、ｐＨ調製用緩衝剤、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン、界面活性剤、ｄＮＴＰｓ、ＬＡＭＰプライマー（表３，配列番号３〜６に示す）を各ポリメラーゼの反応に必要な標準的な濃度で含む。各反応液のｐＨは、ポリメラーゼの種類に応じて、ｐＨ８〜９に調節した。例えば、Ｂｓｔを含む反応液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、８ｍＭの硫酸マグネシウム、１０ｍＭの硫酸アンモニウム、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、１．４ｍＭのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ）、８ユニットのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡＭＰプライマー（表３，配列番号３〜６に示す）を含む。これらの反応液を各ポリメラーゼごとに所望の数で調製した。各反応液に、塩化カリウムを加え、２４μＬに調製した。塩化カリウムは、各反応液における塩の終濃度が１０ｍＭ〜３００ｍＭまでの複数の所望の種類の濃度となるように反応液に加えられた。その後、各反応液にパルボウイルスまたはパピローマウイルスの人工配列（配列番号１）を１μＬとなるように加え、６０℃〜６５℃の等温で加温し、増幅反応を開始した。増幅反応と並行して、各反応液の濁度を濁度計ＬＴ−１６によって測定した。濁度（ａｕ）を増幅速度として、図１２に、各ポリメラーゼにおける塩濃度に対する増幅速度の実験結果を示した。

＜例３＞
プローブ固定基体を含む遺伝子定量チップを作成し、ポリメラーゼとしてＧｓｐＳＳＤを用いて標的核酸の検出を行った例を示す。

・チップの作成
Ｐｙｒｅｘ（登録商標）（ｄ＝８ｍｍ）ガラス表面にチタン（５００ｎｍ）および金（２０００ｎｍ）の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極を形成した。その上に絶縁膜を塗布して、エッチング処理により、絶縁膜に円形窓および矩形窓を開口して作用極、対極、参照極およびプローバー接触部を露出させた。

・遺伝子チップの作成
表４に示す配列番号８の３’末端をチオールで標識したプローブ核酸ＤＮＡを３μＭずつ含むプローブ核酸ＤＮＡ溶液を調製して、この溶液１００ｎＬを作用極上にスポットした。４０℃にて乾燥し、超純水により洗浄後、作用極表面に残った超純水を除去し、チップ素材の作用極にプローブ核酸ＤＮＡを固定した。

次に、プライマーセットとして使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、ＬＡＭＰ法による増幅のためのプライマーセットである。使用したプライマーＤＮＡの塩基配列を表３に示す。プライマーの濃度は、ＦＩＰとＢＩＰが３．２μＭ、Ｆ３とＢ３が０．４μＭ、ＬＰＦが１．６μＭであった。

・ＬＡＭＰ反応液の作成
表５に示す組成の塩濃度の異なる４つのＬＡＭＰ反応液を作成した。塩濃度は、１０ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭおよび９０ｍＭとなるように調製した。

標的核酸として、１０^５ｃｏｐｙ／μＬのプラスミドを使用した。使用されたプラスミドは、ｐＭＡベクターに表１に示す配列（Ｐａｒｖｏ ｖｉｒｕｓのＶＰ遺伝子、長さ１０００ｂｐ）が挿入されたものである。

・ＬＡＭＰ増幅反応およびプローブ核酸ＤＮＡよる標的核酸の検出
ＬＡＭＰ増幅反応は６３℃で行った。プローブ核酸を固定したチップ上でＬＡＭＰ増幅を行った後、７５μＭのヘキスト３３２５８溶液を作用させ、酸化電流値の測定を行った。検出結果を図１３に示す。図１３に示されるように、塩濃度３０ｍＭからヘキスト電流値が増え、６０ｍＭで最大となった。従って、ＧｓｐＳＳＤを用いた場合、塩濃度６０ｍＭの反応液において標的核酸の検出が可能であることが明らかとなった。

＜例４＞
遺伝子定量チップを作成し、ポリメラーゼとしてＢｓｔ３．０を用いて標的核酸の検出を行った例を示す。

チップ素材の作製、および遺伝子チップの作製は例３と同様に行った。次に、表６に示す組成の塩濃度の異なる５つのＬＡＭＰ反応液を作成した。塩濃度は、１０ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭ、１２０ｍＭおよび２３０ｍＭとなるように調製した。標的核酸およびプライマーセットは、例３と同じものを用いた。

プローブ核酸を固定したチップ上でＬＡＭＰ増幅を行った後、７５μＭのヘキスト３３２５８溶液を作用させ、酸化電流値の測定を行った。結果を図１４に示す。図１４に示される通り、塩濃度６０ｍＭから電流値が増大し、１２０ｍＭで最大となった。従って、Ｂｓｔ３．０を用いた場合、塩濃度１２０ｍＭの反応液において標的核酸の検出が可能であることが明らかとなった。

例３および例４の結果から塩濃度に対する電流値／増幅産物量を算出した。その結果を図１５に示す。塩濃度が高い方が増幅産物量当たりの電流値が大きくなることが分かった。従って、塩濃度が高いほど検出の感度が高まることが示唆された。

以上の例から、実施形態の塩濃度を含む反応液により、増幅反応と標的核酸の検出とを行うことが可能であることが明らかとなった。

本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
試料中の標的核酸を検出する方法であって、
前記標的核酸は第１の配列を含み、
前記方法は、
基体と、前記基体の少なくとも一つの面に一方の端が固定されており、前記第１の配列に相補的な配列または前記第１の配列と同じ配列を含む核酸プローブとを備えるプローブ固定基体の、
当該少なくとも一つの面に接して前記核酸プローブを含むように反応場を形成し、前記反応場で、前記試料、検出可能な信号を生ずる標識物質、前記第１の配列またはその相補配列を含む増幅産物核酸を生成するポリメラーゼ、プライマーセット、および予め定められた濃度の塩を含んでいる反応液を増幅条件下に維持することと；
前記増幅条件下で前記増幅産物核酸と前記核酸プローブとの結合および／または近接により生ずる前記標識物質からの信号を検出することと；
前記検出結果から前記標的核酸の有無および／または量を決定することと
を含み、
前記標識物質は、前記核酸プローブに結合および／または近接している核酸の存在または存在量の増加により、信号が変化する物質であり、
前記予め定められた濃度は、以下の第１の塩濃度および第２の塩濃度のうちのより高い方の濃度よりも高く、第３の塩濃度以下であり、
前記第１の塩濃度は、前記ポリメラーゼおよび前記プライマーセットを含む評価用反応液中で標準配列を含む評価用核酸から評価用増幅産物核酸が形成されるときの増幅反応速度がピークとなるときの濃度であり、前記標準配列は前記第１の配列であり、
前記第２の塩濃度は、前記核酸プローブと、前記評価用増幅産物核酸とのハイブリダイズ速度が０ａｕよりも高くなるときの濃度であり、
前記第３の塩濃度は、前記評価用増幅産物核酸の検出量が予め定められた閾値以上となる塩濃度のうちの最も高い濃度である
核酸検出方法。
［２］
前記標的核酸は、第１〜第ｎの複数の前記標的核酸を含み、
前記ｎは２以上の整数であり、
前記第１〜第ｎの標的核酸は、それぞれ第１ _１ 〜１ _ｎ の配列をそれぞれ含み、
前記核酸プローブは、第１〜第ｎの複数の前記核酸プローブを含み、前記第１〜第ｎの核酸プローブは、それぞれ前記第１ _１ 〜１ _ｎ の配列に相補的な配列をそれぞれ含み、
前記プライマーセットは、前記第１ _１ 〜１ _ｎ の配列またはそれらの相補配列をそれぞれ含む、第１〜第ｎの増幅産物核酸を生成するための第１〜第ｎの複数の前記プライマーセットを含み、
前記標準配列は、前記第１ _１ 〜１ _ｎ の配列の特徴を代表するする配列である
［１］に記載の方法。
［３］
前記第１〜第ｎの複数の核酸プローブは、それぞれ第１〜第ｎのアンカー核酸鎖と第１〜第ｎの被覆核酸鎖とをそれぞれ含む複数の二本鎖核酸プローブであり、
前記第１〜第ｎのアンカー核酸鎖は、前記基体の少なくとも一つの面に一方の端が固定されており、第２ _１ 〜２ _ｎ の配列をそれぞれ含み、前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖は、前記第２ _１ 〜２ _ｎ の配列のそれぞれに相補的な前記第２ _１ 〜２ _ｎ の配列結合領域と前記第１ _１ 〜１ _ｎ の配列のそれぞれに相補的な第１ _１ 〜１ _ｎ の配列結合領域とをそれぞれ含み、前記第１〜第ｎのアンカー核酸鎖にそれぞれハイブリダイズしており
前記標準配列は、前記第１ _１ 〜１ _ｎ の配列の特徴を代表する配列であり、
前記ｎは、２以上の整数である
［１］に記載の方法。
［４］
前記標準配列が、前記第１ _１ 〜１ _ｎ の配列から選択される何れかの配列を含む［２］または［３］に記載の方法。
［５］
前記増幅産物核酸の生成と、前記検出とが同時期内に行われる［１］〜［４］の何れか１つに記載の方法。
［６］
前記ポリメラーゼが、ＧｓｐＳＳＤ、Ｂｓｔ２．０またはＢｓｔ３．０である［１］〜［５］の何れか１つに記載の方法。
［７］
前記塩が塩化カリウムである［１］〜［６］の何れか１つに記載の方法。
［８］
前記反応液中の前記塩の濃度が、３０ｍＭ以上６０ｍＭ未満である［１］〜［７］の何れか１つに記載の方法。
［９］
前記反応液中の前記塩の濃度が、６０ｍＭ以上１２０ｍＭ未満である［１］〜［７］の何れか１つに記載の方法。
［１０］
前記反応液中の前記塩の濃度が、１２０ｍＭ以上である［１］〜［７］の何れか１つに記載の方法。

１…プローブ固定基体，２…基体，２ａ…プローブ固定領域，３…プローブ，３ａ…アンカー鎖，３ｂ…被覆鎖，４…第１の配列，４’…第１の配列結合領域，５…増幅産物核酸，６…第２の配列，６’…第２の配列結合領域

Claims (17)

1. 予め定められた濃度の塩を含む同一の反応液中で、試料中の標的核酸に含まれる第１の配列の増幅反応と、前記増幅反応により得られた増幅産物核酸の核酸プローブへの結合及び／又は近接と、前記結合及び／又は近接の検出とを行うための、前記予め定められた濃度を決定する方法であって、
   前記増幅反応に使用するポリメラーゼおよびプライマーセットを含む評価用反応液中で前記第１の配列を含む評価用核酸から評価用増幅産物核酸が形成されるときの増幅反応速度がピークとなるときの塩濃度（第１の塩濃度）と、
   前記核酸プローブと、前記評価用増幅産物核酸とのハイブリダイズ速度が０ａｕよりも高くなるときの塩濃度（第２の塩濃度）と、
   前記評価用増幅産物核酸の検出量が予め定められた閾値以上となる塩濃度のうちの最も高い塩濃度（第３の塩濃度）とを決定することと；
   前記第１の塩濃度および前記第２の塩濃度のうちのより高い方の濃度よりも高く、前記第３の塩濃度以下である塩濃度を前記予め定められた濃度と決定することと；
   を含む塩濃度決定方法。
2. 試料中の、第１の配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
   検出可能な信号を生ずる標識物質、前記第１の配列またはその相補配列を含む増幅産物核酸を生成するポリメラーゼおよびプライマーセットを含み、請求項１の方法により決定された前記予め定められた濃度で塩を含む反応液を調整することと；
   基体と、前記基体の少なくとも一つの面に一方の端が固定されており、前記第１の配列に相補的な配列または前記第１の配列と同じ配列を含む前記核酸プローブとを備えるプローブ固定基体の、
   当該少なくとも一つの面に接して前記核酸プローブを含むように反応場を形成し、前記反応場で、前記試料及び前記反応液を増幅条件下に維持することと；
   前記増幅条件下で、前記予め定められた濃度の塩を含む前記反応液内において、前記増幅産物核酸と前記核酸プローブとの結合および／または近接により生ずる前記標識物質からの信号を検出することと；
   前記検出結果から前記標的核酸の有無および／または量を決定することと；
   を含み、
   前記標識物質は、前記核酸プローブに結合および／または近接している核酸の存在または存在量の増加により、信号が変化する物質である
   核酸検出方法。
3. 試料中の、第１の配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
   基体と、前記基体の少なくとも一つの面に一方の端が固定されており、前記第１の配列に相補的な配列または前記第１の配列と同じ配列を含む核酸プローブとを備えるプローブ固定基体を用意することと；
   反応液の塩濃度（予め定められた濃度）を決定する工程であって、
   前記第１の配列またはその相補配列を含む増幅産物核酸を生成するためのポリメラーゼおよびプライマーセットを含む評価用反応液中で前記第１の配列を含む評価用核酸から評価用増幅産物核酸が形成されるときの増幅反応速度がピークとなるときの塩濃度（第１の塩濃度）と、
   前記核酸プローブと、前記評価用増幅産物核酸とのハイブリダイズ速度が０ａｕよりも高くなるときの塩濃度（第２の塩濃度）と、
   前記評価用増幅産物核酸の検出量が予め定められた閾値以上となる塩濃度のうちの最も高い塩濃度（第３の塩濃度）とを決定し、
   前記第１の塩濃度および前記第２の塩濃度のうちのより高い方の濃度よりも高く、前記第３の塩濃度以下である塩濃度を、前記予め定められた濃度と決定することと；
   前記基体の前記少なくとも一つの面に接して前記核酸プローブを含むように反応場を形成し、前記反応場で、前記試料、検出可能な信号を生ずる標識物質、前記ポリメラーゼ、前記プライマーセット、および前記予め定められた濃度の塩を含んでいる前記反応液を増幅条件下に維持することと；
   前記増幅条件下で、前記予め定められた濃度の塩を含む前記反応液内において、前記増幅産物核酸と前記核酸プローブとの結合および／または近接により生ずる前記標識物質からの信号を検出することと；
   前記検出結果から前記標的核酸の有無および／または量を決定することと；
   を含み、
   前記標識物質は、前記核酸プローブに結合および／または近接している核酸の存在または存在量の増加により、信号が変化する物質である、
   核酸検出方法。
4. 前記標的核酸は、第１〜第ｎの複数の前記標的核酸を含み、
   前記ｎは２以上の整数であり、
   前記第１〜第ｎの標的核酸は、それぞれ第１_１〜１_ｎの配列をそれぞれ含み、
   前記核酸プローブは、第１〜第ｎの複数の前記核酸プローブを含み、前記第１〜第ｎの核酸プローブは、それぞれ前記第１_１〜１_ｎの配列に相補的な配列をそれぞれ含み、
   前記プライマーセットは、前記第１_１〜１_ｎの配列またはそれらの相補配列をそれぞれ含む、第１〜第ｎの増幅産物核酸を生成するための第１〜第ｎの複数の前記プライマーセットを含み、
   前記第１の塩濃度の決定に用いられる前記第１の配列は、前記第１_１〜１_ｎの配列の特徴を代表するする配列である
   請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
5. 前記第１〜第ｎの複数の核酸プローブは、それぞれ第１〜第ｎのアンカー核酸鎖と第１〜第ｎの被覆核酸鎖とをそれぞれ含む複数の二本鎖核酸プローブであり、
   前記第１〜第ｎのアンカー核酸鎖は、前記基体の少なくとも一つの面に一方の端が固定されており、第２_１〜２_ｎの配列をそれぞれ含み、前記第１〜第ｎの被覆核酸鎖は、前記第２_１〜２_ｎの配列のそれぞれに相補的な前記第２_１〜２_ｎの配列結合領域と前記第１_１〜１_ｎの配列のそれぞれに相補的な第１_１〜１_ｎの配列結合領域とをそれぞれ含み、前記第１〜第ｎのアンカー核酸鎖にそれぞれハイブリダイズしており
   前記第１の塩濃度の決定に用いられる前記第１の配列は、前記第１_１〜１_ｎの配列の特徴を代表する配列であり、
   前記ｎは、２以上の整数である
   請求項４に記載の方法。
6. 前記第１の塩濃度の決定に用いられる前記第１の配列が、前記第１_１〜１_ｎの配列から選択される何れかの配列である請求項４または５に記載の方法。
7. 前記増幅産物核酸の生成と、前記検出とが同時期内に行われる請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
8. 前記ポリメラーゼが、ＧｓｐＳＳＤ、Ｂｓｔ２．０またはＢｓｔ３．０である請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
9. 前記塩が塩化カリウムである請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
10. 前記反応液中の前記塩の濃度が、３０ｍＭ以上である請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
11. 前記反応液中の前記塩の濃度が、３０ｍＭ以上６０ｍＭ未満である請求項１０に記載の方法。
12. 前記反応液中の前記塩の濃度が、６０ｍＭ以上１２０ｍＭ未満である請求項１０に記載の方法。
13. 前記反応液中の前記塩の濃度が、１２０ｍＭ以上である請求項１０に記載の方法。
14. 請求項２〜１３の何れか１項に記載の方法に用いるためのキットの製造方法であって、
    前記プローブ固定基体と、
    前記ポリメラーゼと、
    前記プライマーセットと、
    前記反応液中に存在させたときの濃度が、前記予め定められた濃度となるような量で含まれる前記塩と、
    を含むキットの製造方法。
15. 前記ポリメラーゼが、ＧｓｐＳＳＤ、Ｂｓｔ２．０またはＢｓｔ３．０である請求項１４に記載のキットの製造方法。
16. 前記塩が塩化カリウムである請求項１４又は１５に記載のキットの製造方法。
17. 前記塩が、前記反応液中の濃度が３０ｍＭ以上となるような量で前記キットに含まれる請求項１４〜１６の何れか１項に記載のキットの製造方法。

Images