ITUB20159332A1 - Procedimento di rivelazione in fluorescenza dell?amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di un acido nucleico bersaglio, relativi oligonucleotidi e kit. - Google Patents

Description

''Procedimento di rivelazione in fluorescenza dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di un acido nucleico bersaglio, relativi oligonucleotidi e kit"

La presente invenzione riguarda un procedimento di rivelazione in fluorescenza dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di acidi nucleici bersaglio, un set di oligonucleotidi ed un kit per attuare il procedimento dell'invenzione.

L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è un metodo recentemente sviluppato per 1'amplificazione degli acidi nucleici per mezzo di una reazione autociclica di spiazzamento del filamento ("strand displacement") che viene attuata a temperatura costante, usualmente fra 60°C e 65°C (Notomi T. et al 2000. Nucleic acids Res. Voi.

28 (12)—e63). Questa tecnologia fa uso di una DNA polimerasi con attività di spiazzamento del filamento e di un set di quattro oligonucleotidi, chiamati primer interni ed esterni, specificamente progettati per riconoscere sei differenti siti di riconoscimento sull'acido nucleico bersaglio. I due primer esterni svolgono un ruolo solo durante la fase non ciclica nello spiazzamento del filamento, mentre i primer interni includono sia sequenze senso sia sequenze antisenso e contribuiscono alla formazione dei tipici prodotti di amplificazione LAMP aventi una struttura a stelo-ansa ("stemloop").

Oltre ai quattro primer oligonucleotidici, il saggio LAMP può comportare l'uso di due primer aggiuntivi, i cosiddetti loop primers, per migliorare l'efficienza di amplificazione, portando quindi ad un totale di sei primer per sequenza bersaglio. Tale combinazione di differenti primer, che abbracciano otto sequenze distinte sull'acido nucleico bersaglio, consente un notevole grado di specificità del saggio.

La tecnologia basata sulla LAMP possiede il vantaggio dell'elevata sensibilità, della rapidità di amplificazione e della semplicità di attuazione. I saggi LAMP consentono un'alta efficienza di sintesi dei prodotti di amplificazione, che è almeno 50 volte superiore a quella ottenuta per reazione PCR classica con volumi identici. Inoltre, la capacità di amplificare l'acido nucleico in condizioni isotermiche consente l'uso di attrezzature semplici ed economiche, senza la necessità di cicli termici. Nei saggi LAMP, sia l'amplificazione sia la rivelazione di ampliconi specifici possono essere realizzate in un unico passaggio, diminuendo notevolmente il tempo di reazione rispetto a una RT-PCR standard.

Diversi metodi sono stati impiegati per la rivelazione dei prodotti di amplificazione LAMP, compreso l'esame o il monitoraggio visivo della torbidità del pirofosfato di magnesio precipitato (Tornita N., et al. 2008. Nat. Protoc. 3:877-882; Mori Y., et al. 2001. Biochem, Biophys . Res. Commun.

289:150-154), la rivelazione della fluorescenza del DNA a doppio filamento (dsDNA) con un fluoroforo intercalante (Zhang X, et al. 2013, PLoS One 8 (12):e82841; Mair G. et al. 2013, BMC Veterinary Research 9:108.), la generazione di bioluminescenza attraverso la conversione del pirofosfato (Gandelman OA., et al. 2010, PLoS One 5(11): el4155).

Le strategie note per la rivelazione indiretta dell'amplificazione LAMP si basano essenzialmente sulla formazione di pirofosfato come sottoprodotto di reazione. Man mano che una reazione LAMP procede, ioni pirofosfato vengono rilasciati per incorporazione di deossinucleotidi trifosfati (dNTP) nel DNA durante la polimerizzazione dell'acido nucleico e questi ioni reagiscono con gli ioni metallici bivalenti, in particolare ioni magnesio, presenti nella miscela di reazione per produrre un precipitato bianco e insolubile di pirofosfato di magnesio (Mori Y., et al. 2001. Blochem, Biophys. Res. Commun. 289:150-154). Questo prodotto determina un progressivo aumento della torbidità della soluzione di reazione e il pirofosfato precipitato può essere misurato quantitativamente in termini di torbidità od osservato ad occhio nudo come pellet dopo centrifugazione. In un formato alternativo, la rilevazione dell'amplificazione LAMP è ottenuta attraverso l'incorporazione nella reazione di ioni manganese e calceina. La fluorescenza della calceina viene naturalmente spenta dal legame degli ioni manganese. La produzione di pirofosfato come sottoprodotto della reazione LAMP rimuove gli ioni manganese dal buffer tramite precipitazione, e l'aumento della torbidità accoppiato con il ripristino della fluorescenza della calceina consente una facile lettura visiva a seguito di eccitazione con luce visibile o UV (Tornita N., et al. 2008. Nat, Protoc. 3:877-882). In un ulteriore formato di rivelazione, la conversione enzimatica del pirofosfato in ATP, che viene prodotto durante la sintesi del DNA, viene monitorata attraverso la bioluminescenza generata dalla luciferasi termostabile di lucciola (Gandelman OA., et al. 2010, PLoS One 5(11): el4155).

I prodotti dell'amplificazione LAMP possono anche essere rivelati attraverso approcci diretti che agiscono attraverso la generazione di fluorescenza. La maggior parte di tali approcci è basata sull'uso di coloranti intercalanti, quali bromuro di etidio, SYBR Green, EvaGreen e YO-PRO-I (Zhang X, et al.

2013, PLoS One 8(12):e82841; Mair G, et al. 2013, BMC Veterinary Research 9:108,). In genere, i coloranti intercalanti sono coloranti fluorescenti non sequenza-specifici che mostrano un forte aumento nell'emissione di fluorescenza a seguito del legame con dsDNA. Tale proprietà può essere utilizzata per monitorare l'amplificazione dell'acido nucleico in reai tinse misurando la fluorescenza in maniera continua nel corso della reazione LAMP. Tuttavia, dato che i coloranti intercalanti si legano a qualsiasi dsDNA, 1'impiego di questi coloranti nei metodi di amplificazione in reai time non consente di discriminare tra i prodotti dell'amplificazione specifica del bersaglio e gli artefatti che si generano come co-prodotti, come ad esempio gli ampliconi non specifici e i primer-dimeri, il che può comportare una sovrastima della concentrazione del bersaglio. Di conseguenza, la rivelazione dell'amplificazione degli acidi nucleici con coloranti intercalanti richiede un'ottimizzazione, e solitamente per convalidare i risultati sono necessari dei saggi di controllo .

La rivelazione dell'amplificazione LAMP basata su fluorescenza può anche fare affidamento sul meccanismo del trasferimento di energia per risonanza (FRET) (Chen Q, et ai. 1997 Biochemistry 36 (15):4701-11 ). La FRET è un'interazione distanzadipendente fra gli stati elettronici eccitati di due cromofori, in cui l'eccitazione viene trasferita da una molecola donatore ad una molecola accettore. Quando l'accettore stesso è un fluoroforo, lo stato eccitato dell 'accettore indotto dalla FRET può successivamente rilassarsi tramite emissione di fluorescenza dell'accettore . Il cromoforo accettore non ha bisogno di essere di per sé fluorescente e sistemi FRET con accettori scuri sono stati ampiamente implementati negli ultimi anni , Ad esempio, possono essere utilizzati quencher scuri, ossia cromofori che possono essere eccitati a stati elettronici superiori a seguito di assorbimento di fotoni e rilassamento allo stato fondamentale, preferenzialmente tramite processi non radiativi, rimanendo quindi scuri (Le Reste L. et al. 2012. Biophysical Journal 102: 2658-2668). L'assorbimento di energia del donatore da parte di un accettore FRET richiede che lo spettro di assorbimento del cromoforo accettore abbia una zona di sovrapposizione con lo spettro di emissione del cromoforo donatore. Inoltre, i cromofori donatore e accettore devono essere in stretta prossimità affinché si verifichi il trasferimento di energia e l'efficienza di tale trasferimento è fortemente dipendente dalla sesta potenza della distanza tra i due cromofori (Clegg RM. 1995 Curr. Opin. Biotechnol. 6: 103-110).

Chou et al. (Chou PH, et al. 2011 J Virol Methods. 173 (1):67-74) descrivono un test per la diagnosi in gamberetti di infezioni da virus della sindrome della macchia bianca (WSSV), che unisce la tecnologia LAMP e la tecnologia FRET con ibridazione della sonda. Più in particolare, in aggiunta al set standard di primer LAMP, compresi i cosiddetti loop primers, il saggio di Chou et al. prevede l'utilizzo di due sonde fluorescenti marcate rispettivamente alle estremità 3'e 5' (Figura 1A) che si ibridano in una configurazione testa-coda sulla regione loop a singolo filamento presente nei prodotti LAMP intermedi. Portando i due fluorofori in stretta prossimità, si verifica un trasferimento di energia e durante la reazione di amplificazione isotermica viene generato un segnale FRET reai time. Nella Figura 1A, è illustrato un prodotto LAMP intermedio in cui un'estremità loop è stata ingrandita per mostrare in dettaglio l'ibridazione degli oligonucleotidi impiegati nella fase di rivelazione FRET del saggio.

Tra i metodi di rilevazione basati sul trasferimento di energia di fluorescenza, in applicazioni LAMP è stato anche utilizzato lo spegnimento ( "quenching") della fluorescenza indotto dall'ibridazione, in particolare attraverso il principio del quenching da guanina ("guanine quenching") (Zerilli et al. 2010. Clin Chem 56:1287-96). In tale approccio, la fluorescenza emessa da un loop primer LAMP marcato al 5' viene progressivamente spenta a seguito di ibridazione ad una sequenza bersaglio complementare contenente una guanina. Il grado di quenching dipende dal numero e dalle posizioni delle basi G adiacenti sulla sequenza bersaglio complementare. Man mano che durante il saggio LAMP reai time si accumula sequenza bersaglio, l'amplificazione dell'acido nucleico può essere quantificata tramite monitoraggio della quantità di fluorescenza che viene spenta in conseguenza dell'incorporazione del loop primer marcato nei prodotti di amplificazione. Tuttavia, questa strategia presenta lo svantaggio di essere dipendente dalla specifica sequenza nucleotidica dell'acido nucleico bersaglio ed è limitata dalla presenza e/o dalle posizioni dei nucleotidi guanina nella sequenza bersaglio.

In anni recenti sono stati compiuti grossi sforzi per adattare i metodi isotermici, come la LAMP, all'esecuzione di saggi diagnostici molecolari, onde trarre vantaggio dalla disponibilità di apparecchiature di saggio molto semplificate che non richiedono la variazione ciclica della temperatura e che consentono di produrre modelli per 1'impiego in strutture sanitarie estremamente elementari. Dato l'impiego di tecniche isotermiche come strumenti diagnostici, un requisito essenziale di tali tecniche è la loro capacità di generare un risultato in un tempo molto breve, al fine di fornire assistenza rapida e affidabile in decisioni cliniche per ogni fase della cura del paziente, vale a dire la diagnosi precoce, la valutazione del rischio, lo screening, la stadiazione e la prognosi, la selezione e il monitoraggio della terapia. Ad esempio, la diagnosi precoce di neoplasie ematologiche come la leucemia acuta è fondamentale per garantire una buona prognosi per i pazienti, dal momento che un trattamento tempestivo può essere cruciale e decisivo nella gestione della malattia.

Pertanto, esiste la necessità di sviluppare metodi di amplificazione isotermica mediati da loop in grado di realizzare una rapida rivelazione delle sequenze di acido nucleico bersaglio senza influire negativamente sui parametri critici del saggio, quali la specificità, la sensibilità e la precisione.

Questa e altre necessità sono soddisfatte dal procedimento, dal set di oligonucleotidi e dal kit come definiti nelle annesse rivendicazioni, che formano parte integrante della descrizione.

Come sarà illustrato nella sezione sperimentale che segue, la presente invenzione fornisce un pròcedimento di rivelazione dell'amplificazione LAMP di sequenze di acido nucleico bersaglio, che fa uso del principio del trasferimento di energia per risonanza. Il procedimento della presente invenzione impiega una DNA polimerasi avente attività di spiazzamento del filamento e un set di primer oligonucleotidici LAMP consistente in due primer esterni, segnatamente F3 e B3, due primer interni, segnatamente FIP e BIP, uno o due loop primers, segnatamente LF e/o LB, e una sonda di acido nucleico. Una descrizione delle caratteristiche e della funzione dei primer LAMP e dei loop primers si trova ad esempio nel sito Eiken (loopamp.eiken,co .jp/e/lamp/primer.html; loopamp.eiken.co .jp/e/lamp/loop.html).

Secondo la presente invenzione, il primo primer interno FIP consiste di una sequenza di acido nucleico 3' chiamata F2, che è complementare a una regione F2c della sequenza di acido nucleico bersaglio, e di una sequenza di acido nucleico 5' chiamata Flc. Il secondo primer interno BIP consiste di una sequenza di acido nucleico 3' chiamata B2, che è complementare a una regione B2c della sequenza di acido nucleico bersaglio, e di una sequenza di acido nucleico 5' chiamata Blc, Le regioni F2c e B2c sono regioni non sovrapposte che si trovano su filamenti opposti della sequenza di acido nucleico bersaglio.

Il primer esterno F3 consiste della regione F3 che è complementare alla regione F3c; il primer esterno B3 consiste della regione B3 che è complementare alla regione B3c,

Come menzionato in precedenza, il procedimento della presente invenzione fa altresì uso di uno o due loop primer, LF e/o LB. Tipicamente, quando usati in una reazione LAMP, i loop primers si ibridano alla regione loop a singolo filamento presente nei prodotti LAMP intermedi e forniscono un numero incrementato di punti di partenza per la sintesi del DNA. Secondo 1'invenzione, il loop primer LF o il loop primer LB, se presente, è marcato alla propria estremità 5' con almeno una molecola fluorescente.

Rispetto alla tecnologia LAMP standard, il procedimento della presente invenzione implica l'uso di un oligonucleotide aggiuntivo, più in particolare di una sonda di acido nucleico, che è marcata alla propria estremità 3' con almeno un cromoforo. Detta sonda di acido nucleico è atta ad ibridarsi alla sequenza di acido nucleico bersaglio in 5' rispetto al primer LF o LB marcato, cosicché quando la sonda è ibridata alla sequenza di acido nucleico bersaglio, la sua estremità 3' è in stretta prossimità con l'estremità 5' del loop primer LF o LB marcato.

Nella presente descrizione, una sequenza di acido nucleico (primer o sonda) che è atta ad ibridarsi con una data sequenza di acido nucleico bersaglio è ad esempio complementare a detta sequenza di acido nucleico bersaglio.

Si noti che un ''stretta vicinanza" fra detto loop primer marcato e detta sonda di acido nucleico si verifica solo durante la fase di amplificazione della reazione LAME, quando il loop primer viene incorporato ed esteso nel prodotto di amplificazione LAME»

Secondo una prima forma di realizzazione mostrata in Figura 1B, il procedimento secondo 1'invenzione impiega un loop primer marcato alla propria estremità 5' con almeno un accettore di fluorescenza in combinazione con una sonda di acido nucleico marcata alla propria estremità 3' con almeno un donatore di fluorescenza. Nella Figura 1B, è illustrato un prodotto LAME intermedio in cui un'estremità loop è stata ingrandita per mostrare in dettaglio l'ibridazione degli oligonucleotidi impiegati nella fase di rivelazione FRET del saggio.

Il loop primer marcato può essere LF o LB (se LB è presente). Secondo l'invenzione, a seguito dell'ibridazione di detti oligonucleotidi alla sequenza di acido nucleico bersaglio durante la reazione LAME, il donatore di fluorescenza all'estremità 3' della sonda di acido nucleico è portato in stretta vicinanza con l'accettore di fluorescenza all'estremità 5' del loop primer LF o LB. Fra queste molecole si verifica un trasferimento di energia di fluorescenza e, come risultato, viene generata e rilevata una variazione in un parametro di fluorescenza. Tale variazione indica 1'avvenuta amplificazione del DNA, poiché la variazione si genera a seguito dell'incorporazione del loop primer marcato nel prodotto di amplificazione LAMP e della successiva estensione del primer.

In un'altra forma di realizzazione mostrata in Figura 1C, il procedimento della presente invenzione utilizza il loop primer LF o LB marcato alla propria estremità 5' con almeno un donatore di fluorescenza in combinazione con una sonda di acido nucleico marcata alla propria estremità 3' con almeno un quencher. Secondo l'invenzione, quando l'estremità 3' della sonda di acido nucleico marcata e l'estremità 5' del loop primer marcato sono portati in stretta prossimità sulla sequenza di acido nucleico bersaglio durante l'amplificazione LAMP, il quencher fa da accettore assorbendo l'energia emessa dal donatore e dissipandola come calore. Una variazione associata di un parametro di fluorescenza può quindi essere rilevata come indicatore dell'amplificazione durante la reazione LAMP. Nella Figura 1C, è illustrato un prodotto LAMP intermedio in cui un'estremità loop è stata ingrandita per mostrare in dettaglio l'ibridazione degli oligonucleotidi impiegati nella fase di rivelazione FRET del saggio.

Le prestazioni del procedimento dell'invenzione secondo la prima forma di realizzazione sono state valutate in confronto con saggi LAMP fluorescenti secondo la tecnica nota, più specificamente il saggio LAMP basato sulla fluorescenza descritto da Chou et al. e il sistema LAMP facente uso di coloranti intercalanti.

Al fine di confrontare le prestazioni del procedimento LAMP dell'invenzione con il saggio di Chou et al., è stato utilizzato uno schema di diluizioni, ed una serie di titolazioni, variabili da 2x1ο<1>copie/pL a 2xl0<6>copie/pL, di un plasmide denaturato contenente un frammento genomico di WSSV è stata sottoposta ad amplificazione LAMP su uno strumento Rotor-Gene Q (Qiagen). In particolare, l'analisi comparativa è stata effettuata sulle di luizioni corrispondenti a 2xl0<3>copie/pL e 2xl0<6>copie/pL. L'amplificazione del bersaglio ha prodotto un incremento del segnale di fluorescenza con andamento sigmoidale, che è stato rivelato programmando le letture ad una cadenza di 1 minuto.

Stabilendo una soglia di fluorescenza a 0,2, corrispondente a circa il 50% dell'incremento della fluorescenza, è stato ottenuto il tempo di soglia ("threshold time") (minuti), allo scopo di rivelare l'amplificazione del bersaglio.

L'analisi comparativa del tempo di soglia generato dai campioni diluiti per ciascun procedimento LAMP esaminato ha mostrato che il procedimento dell'invenzione permette una rilevazione significativamente anticipata della sequenza di acido nucleico bersaglio, in confronto con il procedimento di Chou et al (mostrato in Figura 2).

E' stata inoltre calcolata la significatività statistica della differenza fra i tempi di rivelazione misurati con i vari metodi LAMP esaminati utilizzando un t-test di Student, che ha fornito un valore di p inferiore a 0,05.

Per valutare ulteriormente la capacità del procedimento della presente invenzione di rivelare acidi nucleici bersaglio in una matrice naturale, la procedura sperimentale descritta in precedenza è stata applicata alle stesse diluizioni del plasmide WSSV (2xl0<3>copie/pL e 2xl0<6>copie/pL) in DNA genomico umano (20ng/pL). Le reazioni di amplificazione LAMP effettuate su tali diluizioni hanno rivelato che la presenza di materiale che potrebbe causare interferenza, come ad esempio DNA genomico, ha generato un ritardo nella rivelazione del bersaglio in entrambi i metodi. Inoltre, con il procedimento dell'invenzione si è conseguita la rivelazione del bersaglio almeno 10 minuti prima rispetto alla rivelazione conseguita con il sistema LAMP di Chou et al.

Nella validazione di un saggio, la linearità rappresenta uno degli indicatori più rilevanti dell'accuratezza del saggio, poiché misura la capacità della procedura di restituire valori che siano direttamente proporzionali alla concentrazione dell'analita bersaglio nel campione esaminato. Nel presente studio, i dati di amplificazione LAMP ottenuti applicando il procedimento della presente invenzione oppure il procedimento di Chou et al, alla summenzionata serie di titolazioni sono stati sottoposti ad analisi di regressione lineare.

In Figura 3 il tempo di soglia (indicato in minuti) è posto in grafico in funzione della concentrazione dell'acido nucleico bersaglio plasmidico espresso come copie/ uL, sia per il procedimento dell'invenzione (A) sia per il procedimento LAMP di Chou et al. (B). Questa figura mostra che il procedimento della presente invenzione, confrontato con il procedimento LAMP di Chou et al,, fornisce una linearità superiore, poiché per la linea di regressione sono stati calcolati un coefficiente di correlazione (R<2>) = 0,99 e una pendenza = -7,2. Inoltre, la determinazione di una linearità così buona è anche indicativa di precisione del saggio, in quanto indica una elevata riproducibilità fra diverse repliche delle misurazioni.

I presenti inventori hanno effettuato un'ulteriore valutazione, confrontando le prestazioni del procedimento dell'invenzione con un saggio LAMP che prevede l'uso di coloranti fluorescenti intercalanti. L'analisi di regressione lineare è stata applicata sui dati di amplificazione LAMP ottenuti eseguendo il procedimento della presente invenzione o il procedimento basato sui coloranti intercalanti, su campioni di DNA plasmidico contenenti il gene MYH11 sottoposti a diluizioni seriali di 10 volte. I risultati dell'analisi di regressione lineare sono mostrati in Figura 4. In questa figura, il tempo di soglia (indicato in minuti) è posto in grafico in funzione della concentrazione dell'acido nucleico bersaglio plasmidico, espresso come copie/μΐ, sia per il procedimento dell'invenzione (A) sia per il saggio con colorante intercalante (B). I dati confermano una linearità significativamente maggiore del procedimento della presente invenzione in confronto al sistema LAMP facente uso del colorante intercalante YO-PRO (R<2>= 0,97 contro R<2>= 0,80).

Oltre ad una migliore linearità del saggio, con 11 procedimento della presente invenzione sono anche state osservate una maggiore sensibilità analitica e un più ampio intervallo di linearità. Infine, rispetto alla LAMP basata su coloranti intercalanti, il procedimento della presente invenzione, facente uso di una coppia FRET loop primer/sonda marcati, porta ad una maggiore specificità del saggio, poiché i coloranti intercalanti come YO-PRO emettono un segnale di fluorescenza a seguito del legame con qualunque DNA a doppio filamento, indipendentemente dalla specifica sequenza nucleotidica.

Nel presente studio, la valutazione delle prestazioni della seconda forma di realizzazione del procedimento dell'invenzione è stata effettuata mediante confronto con un saggio LAMP facente affidamento del meccanismo dello spegnimento ("guenching") del fluoroforo da parte della guanina per la rivelazione del segnale di amplificazione. Quest'ultimo saggio è basato sull'uso di un loop primer marcato con un fluoroforo il cui segnale viene spento da un nucleotide guanosina presente sulla sequenza stampo.

Gli esperimenti di amplificazione LAMP effettuati dai presenti inventori sul gene modello GUS beta (regione amplificata corrispondente alla regione esone 3 - esone 4) hanno rivelato che, usando una sonda di spegnimento (”quenching probe"), la rivelazione di questo amplinone viene raggiunta entro lo stesso tempo di soglia (circa 29 minuti). Questo risultato dimostra quindi che la presenza di una sonda di spegnimento ("quenching probe") nella reazione LAMP non influisce sulla cinetica di rivelazione. Anzi, l'effetto additivo di quenching della sonda marcata ha migliorato il quenching ottenuto col solo metodo del quenching da guanina.

Come mostrato in Figura 5, il procedimento della presente invenzione genera un grado di quenching significativamente maggiore (il 28% invece del 19% dell'intensità, p < 0,05), con un miglioramento superiore al 40% in termini di quenching. In questa figura, la fluorescenza (espressa come unità arbitrarie) è posta in grafico in funzione del tempo di reazione (indicato in minuti). La linea tratteggiata superiore rappresenta la LAMP basata sul quenching da guanina, la linea tratteggiata inferiore rappresenta la Quenching FRET LAMP. Il tasso di quenching è stato calcolato come uguale a 100-( (Min/Max)*100). ;Nel procedimento della presente invenzione, 1'amplificazione della sequenza di acido nucleico bersaglio porta a una variazione rivelabile in un parametro di fluorescenza. Ad esempio, la fase di rivelazione può svelare un incremento dell'intensità della fluorescenza dell'accettore quando si verifica un trasferimento di energia fra il donatore all'estremità 3' della sonda di acido nucleico e l'estremità 5' del loop primer LF o LB. In alternativa, si può misurare una diminuzione dell'intensità di fluorescenza del donatore all'estremità 5' del loop primer marcato, quando l'accettore all'estremità 3' della sonda di acido nucleico fa da quencher. ;Secondo la presente invenzione, possono anche essere monitorati altri parametri di fluorescenza che possono risentire della prossimità del donatore e dell'accettore fluorescenti, ivi inclusi ad esempio il rapporto fra le intensità di fluorescenza di donatore e/o accettore e il tempo di fluorescenza. ;Come indicato in precedenza, l'assorbimento dell'energia del donatore da parte di una molecola FRET quencher o accettore richiede che vi sia una stretta prossimità tra le suddette molecole, e l'efficienza della FRET è molto sensibile alla distanza e all'orientazione relativa fra il donatore e l'accettore. Secondo il procedimento della presente invenzione, a seguito dell'ibridazione alla sequenza di acido nucleico bersaglio, la distanza fra l'estremità 3' marcata della sonda di acido nucleico e l'estremità 5' marcata del loop primer dovrebbe essere preferibilmente compresa nell'intervallo fra zero e 6 nucleotidi, come ad esempio 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 nucleotidi. ;Secondo la presente invenzione, la sonda di acido nucleico comprende almeno un cromoforo - un un donatore di fluorescenza o un quencher di fluorescenza - legato alla propria estremità 3'. Tale cromoforo blocca la sintesi del DNA poiché rende l'estremità 3' della sonda di acido nucleico non più disponibile come origine di polimerizzazione del DNA. ;Al contrario, nella presente invenzione la molecola fluorescente portata dal loop primer marcato - o un donatore di fluorescenza o un accettore di fluorescenza - è legata all'estremità 5' di detto oligonucleotide in modo da evitare qualsivoglia interferenza con la sintesi del DNA durante la reazione LAMP, In particolare, il loop primer marcato utilizzato nell'invenzione ha un gruppo idrossilico libero in 3' che serve come origine per la sintesi del filamento di DNA complementare. ;Dal momento che la rilevazione del bersaglio è conseguita direttamente tramite componenti segnale legati a specifici oligonucleotidi, il procedimento della presente invenzione mette a disposizione una tecnologia di rivelazione sequenza-specifica. Secondo l'invenzione, la sonda di acido nucleico marcata e il loop primer marcato possono essere progettati per tollerare variazioni di sequenza per la rivelazione di differenti sequenze di DNA o RNA o per distinguere tra sequenza polimorfiche. Inoltre, resta inteso che l'ibridazione tra la sonda di acido nucleico e il loop primer e le rispettive sequenze complementari sull'acido nucleico bersaglio può essere migliorata incorporando in tali oligonucleotidi alcuni tipi di nucleotidi modificati, ad esempio, 2'-0 -metilribonucleitidi o nucleotidi basati su nitropirolo, o certi tipi di analoghi degli acidi nucleici a scheletro non naturale, come ad esempio PNA (acidi peptido-nucleici) o LNA (acidi nucleici bloccati). L'uso di analoghi di acidi nucleici nell'amplificazione di acidi nucleici è consolidato nella tecnica anteriore e noto alle persone esperte del settore. ;Nel contesto della presente invenzione, il termine "sequenza di acido nucleico bersaglio" si riferisce alle sequenze di acido nucleico che devono essere amplificate e rilevate. Queste possono includere la sequenza di acido nucleico originale da amplificare, il suo secondo filamento complementare e uno o l'altro filamento di una copia della sequenza originale prodotta per amplificazione o replicazione. L'acido nucleico bersaglio può provenire da una varietà di fonti. Ad esempio, gli acidi nucleici bersaglio possono essere DNA o RNA naturale isolati da qualsiasi fonte, molecole ricombinanti, cDNA o analoghi sintetici, come noti nello stato della tecnica. In alcune forme di realizzazione, la sequenza di acido nucleico bersaglio può comprendere uno o più polimorfismi a singolo filamento (SNPs), varianti alleliche e altre mutazioni quali delezioni, inserzioni o mutazioni puntiformi. In altre forme di realizzazione, la sequenza di acido nucleico bersaglio può comprendere una sequenza di giunzione di un gene di fusione, eventualmente associata al cancro. In ancora un'altra forma di realizzazione, la sequenza di acido nucleico bersaglio può provenire da un microrganismo, ivi inclusi specifici cloni o ceppi di microrganismi, eventualmente coinvolti nell'induzione di malattie negli essere umani e negli animali. ;Il procedimento della presente invenzione è anche adatto alla determinazione quantitativa della quantità di acido nucleico bersaglio in un campione. In una forma di realizzazione preferita, la quantificazione della sequenza di acido nucleico bersaglio è conseguita generando una curva standard, ponendo in grafico un numero noto di copie (o concentrazione) della suddetta sequenza di acido nucleico bersaglio in funzione del tempo alla positività del saggio LAMP. La quantificazione di un numero non noto di copie (o concentrazione) del bersaglio nel campione in esame può essere estrapolata dalla curva standard, sulla base del tempo alla positività misurato per il campione non noto. ;Un altro aspetto della presente invenzione è un set di oligonucleot idi per la rivelazione dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di una sequenza di acido nucleico bersaglio, il set consistendo in un primo primer esterno F3, un secondo primer esterno B3, un primo primer interno FIP, un secondo primer interno BIP, un primo loop primer LF, opzionalmente un secondo loop primer LB e una sonda di acido nucleico, il tutto come sopra definito in riferimento al procedimento dell'invenzione. In una prima forma di realizzazione, il loop primer LF o il loop primer LB (quando LB è presente) è marcato alla propria estremità 5' con almeno un accettore di fluorescenza e la sonda di acido nucleico è marcata alla propria estremità 3' con almeno un donatore di fluorescenza. ;In una seconda forma di realizzazione, il loop primer LF o il loop primer LB (quando LB è presente) è marcato alla propria estremità 5' con almeno un donatore di fluorescenza e la sonda di acido nucleico è marcata alla propria estremità 3' con un quencher. ;Affinché si verifichi il trasferimento di energia per risonanza occorre che lo spettro di emissione del donatore di fluorescenza presenti una regione di sovrapposizione con lo spettro di assorbimento dell'accettore, in modo tale che l'eccitazione del donatore causata da una luce a lunghezza d'onda inferiore sia seguita dal trasferimento di parte dell'energia di eccitazione all'accettore . ;Vi sono molti cromofori che possono servire come donatori, accettori o quencher nella presente invenzione-Secondo una forma di realizzazione preferita, il donatore è scelto dal gruppo che consiste di Fluoresceina, BODIPY FL, Alexa555, ATTO550, Cy3, FAM, TET, HEX, JOE, VIC, Cy3, NED, Quasar 570, Oyster 556, TAMRA e/o 1'accettore è scelto dal gruppo che consiste di Cy5.5, Cy5, ATT0647N, Alexa 647, ROX, LC red 610, Texas red, LC red 640, LC red 670, Quasar 670, Oyster 645, LC red 705. ;In un'altra forma di realizzazione preferita, il donatore è scelto dal gruppo che consiste di Fluoresceina, BODIPY FL, Alexa555, ATTO550, Cy3, FAM, TET, HEX, JOE, VIC, Cy3, NED, Quasar 570, Oyster 556, TAMRA, Cy5.5, Cy5, ATTQ647N, Alexa 647, ROX, LO red 610, Texas red, LC red 640, LC red 670, Quasar 670, Oyster 645, LC red 705 e/o il quencher è scelto dal gruppo che consiste di DDQ-I, Dabcyl, Eclipse, Iowa Black FQ, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, QSY-7, DDQ-II, Iowa Black RQ, QSY-21, ATTO 540Q, ATTO 580Q, ATTO 612Q. ;Particolarmente preferite sono la coppia donatore/accettore BODIPY FL/ATT0647N e la coppia donatore/quencher BODIPY 630/BHQ3. ;In ancora un'altra forma di realizzazione preferita, la sonda di acido nucleico e/o il looop primer sono marcati con più di una molecola fluorescente, preferibilmente due. ;Nella forma di realizzazione più preferita, la coppia donatore/accettore FRET consiste di due molecole di BODIPY FL e una molecola di ATT0647N, rispettivamente. La selezione delle coppie donatore/accettore e donatore/quencher adatte al procedimento della presente invenzione rientra nelle capacità del tecnico del ramo. ;Come menzionato in precedenza, un ulteriore aspetto della presente invenzione è un kit per la rivelazione dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di una sequenza di acido nucleico bersaglio, il kit comprendendo il set di oligonucleotidi come sopra definito e una o più DNA polimerasi aventi attività di spiazzamento del filamento, La DNA polimerasi è preferibilmente scelta dal gruppo che consiste di polimerasi Bst frammento grande, Bst 2.0, Bst 3.0, Bea (exo-), Vent, Vent (exo-), Deep Vent, Deep Vent (exo-), Φ29 phage, MS-2 phage, Z-Taq, KOD, Klenow fragment, GspSSD, GspF, OmniAmp Polimerasi, SD Polimerasi e qualsiasi loro combinazione. La DNA polimerasi maggiormente preferita è la polimerasi Bst frammento grande. ;La sezione sperimentale che segue è fornita a puro titolo illustrativo e non limitativo della portata dell'invenzione come definita dalle annesse rivendicazioni . ;ESEMPIO 1: Confronto tra il procedimento LAMP dell invenzione ed il saggio LAMP di Chou et al. Preparazione del campione ;Allo scopo di operare un confronto tra il procedimento LAMP dell'invenzione ed il saggio LAMP descritto in Chou et al., è stata preparata una idonea sequenza di acido nucleico bersaglio. In breve, un frammento di DNA di 350 bp derivato dal genoma del virus della sindrome della macchia bianca (WSSV) (nt226681- 227934, GenBank AF332093.1) è stato clonato nel vettore pMA-T (GENEART) utilizzando la combinazione di siti di restrizione Sfil/SfiI per fornire il controllo positivo. ;Per il plasmide ricombinante WSSV sono state preparate diluizioni seriali decimali in un intervallo da approssimativamente 2x10<6>copie/μΐ a 2x1ο<1>copie/μΐ. Sono state preparate due diverse diluizioni plasmidiche seriali usando come diluente o soltanto Tris-HCl lOmM, pH 8.5, o questo tampone contenente in aggiunta anche DNA genomico umano (20 ng/μΐ). ;Nel presente studio, le diluizioni plasmidiche analizzate sono state denaturate a 100°C per 10 minuti, Dopo la denaturazione, i campioni plasmidici sono stati posti immediatamente in ghiaccio per 10 minuti. ;Reazione LAMP ;Gli oligonucleotidi LAMP primer e sonda impiegati per l'analisi comparativa, sono stati disegnati come descritto in Chou et al,, e sono riportati nella Tabella 1 sottostante. ;Tabella 1 ;Nome Sequenza nucleotidica SEQ ID Oligo (5' → 3') NO: ;;;TGATTCAGATGGCATGGATACTT 1 ;F3 ;(Primer esterno diretto) ;;;CCGATACTGCCATTGAAAGC 2 ;B3 ;{Primer esterno inverso) ;;TGTTATGGTAGTGAACCCCTTTGCACGACTTTCATT- 3 ;FIP CAAGACATCAAT ;{Primer interno diretto) ;GGAAGAAAGATACAAGCCCATTGGCGCTCCCTTAC- 4 ;BIP CACCTTCCTTAATC ;{Primer interno inverso) ;;;GATCGTTAACAACAACAATACTGGA 5 ;LoopF ;{Loop primer diretto) ;;;GCCATTGAAGCAGTGTTGGGAT 6 ;LoopB ;{Loop primer inverso) ;;CACCCACAGCGGCTCTTGC-Fluoresceina 7 LCF {Sonda FRET marcata all'estremità 3' ;con Fluoresceina) ;;LC640-CGTTCGCCATTGAAGCAGTGTTGG- 8 ;Fosfato ;LCQ ;{Sonda FRET marcata all'estremità 5' con LC640) ;La Tabella 1 contiene il set completo di primer oligonucleotidici usati nel saggio di Chou et al. Il set di oligonucleotidi impiegati nel procedimento LAMP secondo l'invenzione differisce dal set di oligonucleotidi di Chou et al. per le seguenti caratteristiche : ;1) contiene una singola sonda di acido nucleico, ossia LCF, che è marcata con fluoresceina alla propria estremità 3'; ;2) non include nessun loop primer LoopB, e quest'ultimo è sostituito dal primer LCQ, che è marcato alla propria estremità 5' con il gruppo fluorescente LC640. ;Alla luce di quanto sopra illustrato, il procedimento di Chou et al. prevede la generazione di un segnale fluorescente di amplificazione mediante il meccanismo FRET tra una sonda marcata donatore ed una sonda marcata accettore. Diversamente, nel procedimento secondo la presente invenzione, la funzione di oligonucleotide accettore è eseguita da uno dei loop primer, precedentemente marcato, riducendo pertanto il numero di oligonucleotidi impiegati nella reazione LAMP. Inoltre, il procedimento dell'invenzione supera 1'inconveniente associato al saggio di Chou et al. di una possibile competizione delle sonde FRET impiegate in detto saggio con i loop primer per il legame alla medesima sequenza nucleotidica bersaglio. ;Nel presente studio, le seguenti concentrazioni di primer sono state utilizzate nelle reazioni LAME: primer esterni (F3 and B3) 0,375 μΜ, primer interni (FIP and BIP) 2 μΜ, loop primer LoopF 1,1 μΜ, loop primer LoopB 0,3 μΜ (presente soltanto nella reazione secondo Chou et al), LCF e LCQ 0,25 μΜ. ;Le reazioni LAMP sono state condotte in una miscela di 20 μΐ contenente: dNTPs 0,375 mM, 2,4 U della DNA polimerasi Bst Large Fragment (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), tampone di reazione lx (tampone HEPES 20 mM, pH 7,9, KC1 20 mM, MgCl23 mM, e Triton X1000,1%). ;Le miscele di reazione sono state incubate a 60°C per 120 minuti su uno strumento Rotor-Gene Q (Qiagen), I prodotti di amplificazione sono stati successivamente conservati a 4°C. ;L'amplificazione LAMP del plasmide ricombinante WSSV è stata rilevata mediante l'analisi del segnale di fluorescenza normalizzato generato durante la reazione. Il Tempo di soglia è stato identificato fissando una soglia di fluorescenza a 0,2, corrispendente a circa il 50% dell'incremento di fluorescenza. ;Analisi dei dati e normalizzazione ;L'analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il pacchetto statistico contenuto in Microsoft Excel. Lo stesso pacchetto è stato utilizzato per l'analisi di regressione lineare. ;La normalizzazione dei dati è stata ottenuta mediante il programma Rotor-Gene Pure Detection v2.1. ;ESEMPIO 2: Confronto tra il procedimento LAMP dell'invenzione ed il saggio LAMP facente uso dei coloranti intercalanti ;Preparazione del campione ;Al fine di confrontare le prestazioni del procedimento LAMP dell'invenzione con il sistema LAMP facente uso di coloranti intercalanti, è stata preparata una idonea sequenza di acido nucleico bersaglio. In breve, un frammento di DNA di 350 bp derivato dal gene MYH11 (GenBank D10667.1) è stato clonato nel vettore pMA-T (GENEART) utilizzando la combinazione di siti di restrizione Sfil/SfiI per fornire il controllo positivo. ;Il plasmide ricombinante MYH11 è stato diluito serialmente di 10 volte nel tampone Tris-HCl 10 mM, ρΗ 8,5, da approssimativamente 2xl0<6>copie/μΐ a 2x1ο<1>copie/μΐ. ;Nel presente studio, le diluizioni plasmidiche analizzate sono state denaturate a 100°C per 10 minuti. Dopo la denaturazione, i campioni plasmidici sono stati posti immediatamente in ghiaccio per 10 minuti. ;Reazione LAMP ;Nella Tabella 2 che segue sono elencati gli oligonucleotidi primer e sonda impiegati per l'analisi comparativa. ;Tabella 2 ;Nome SEQ ID Sequenza nucleotidica (5<f>→ 3') ;oligo NO: ;;TCAAGAAACTGGAGGATGAG ;F3 9 ;{Primer esterno diretto) ;;TTCCGTTTCAGCTTCTCC ;B3 10 ;{Primer esterno inverso) ;;TGTCGTTAAGTCACTAATCCTCTGGTCATGGATGAT- ;FIP CAGA 11 ;{Primer interno diretto) ;;GCCAAGAATCTTACCAAGCTGAAGGCTCTTCTCTTCC ;BIP 12 ;{Primer interno inverso) ;Sonda GAATCTATGATTTCAG-Bodipy FL ;FRET Do (Sonda FRET marcata al 3' con Bodi- 13 natore pyFL) ;Loop pri ATT0647N-ACTGGAAGTGCGGCTAAAG ;mer LB (Loop primer LB marcato al 5' con AT- 14 Accettore T0647N) ;;Nella reazione LAMP secondo il procedimento dell'invenzione, sono state usate le seguenti concentrazioni di oligonucleotidi: primer esterni (F3 e B3) 0,05 μΜ, primer interni (FIP e BIP) 0,4 μΜ, loop primer LB Accettore 0,2 μΜ e sonda FRET Donatore 0,2 μΜ. Diversamente, il set di oligonucleotidi impiegati nel saggio LAMP facente uso dei coloranti intercalanti includeva, oltre i primer esterni ed interni sopra indicati, soltanto il loop primer LB in forma non marcata. ;Le reazioni LAMP sono state condotte in una miscela di 25 μΐ contenente; dNTPs 1,4 mM, 8 U della DNA polimerasi Bst Large Fragment (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), MgCl2 8 mM, tampone di reazione lx (tampone Tris-HCl 30 mM, pH 8,0, KC130 mM, e Triton X1000,1%) . ;Le miscele di reazione allestite per il saggio LAMP facente uso dei coloranti intercalanti ind ù devano inoltre il colorante intercalante Yo-Pro (Life Technologies), alla concentrazione di 1 μΜ. ;La reazione di amplificazione LAMP è stata condotta a 65°C per 40 minuti su uno strumento Rotor-Gene Q (Qiagen), I prodotti di amplificazione sono stati successivamente conservati a 4°C. ;L'amplificazione LAMP del plasmide ricombinante MYH11 è stata rilevata mediante l'analisi del segnale di fluorescenza normalizzato generato durante la reazione. Il Tempo di soglia è stato identificato fissando una soglia di fluorescenza a 0,2, corrispondente a circa il 50% dell'incremento di fluorescenza. ;Analisi dei dati e normalizzazione ;L'analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il pacchetto statistico contenuto in Microsoft Excel. Lo stesso pacchetto è stato utilizzato per l'analisi di regressione lineare. ;La normalizzazione dei dati è stata ottenuta mediante il programma Rotor-Gene Pure Detection v2.1. ;ESEMPIO 3: Confronto tra il metodo LAMP dell'invenzione ed un saggio LAMP basato sullo spegnimento da guanina ("gxianine quenching") ;Preparazione del campione ;Ε' stata eseguita una valutazione delle prestazioni del procedimento della presente invenzione in confronto con un saggio LAMP facente uso dello spegnimento da guanina ("guanine quenching" ) per la rilevazione del segnale di amplificazione. ;In breve, è stata preparata una idonea sequenza di acido nucleico bersaglio mediante clonaggio di un frammento di DNA di 240 bp, derivato dal gene GUS beta (GenBank D10667.1), nel vettore pMK-RQ (kanR) (Life Technologies). La strategia di clonaggio ha fatto uso della combinazione dei siti di restrizione Sfil/Sfil. ;Il plasmide ricombinante GUS beta è stato diluito serialmente di 10 volte nel tampone Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, da approssimativamente 2xl0<6>copie/μΐ a 2x1ο<1>copie/μΐ. ;Nel presente studio, le diluizioni plasmidiche analizzate sono state denaturate a 100°C per 10 minuti. Dopo la denaturazione, i campioni plasmidici sono stati posti immediatamente in ghiaccio per 10 minuti . ;Reazione LAMP ;Gli oligonucleot idi primer e sonda impiegati nelle reazioni LAMP sono illustrati nella Tabella 3 che segue. ;Tabella 3 ;;Nome SEQ ID Sequenza nucleotidica (5<f>→ 3<f>) ;oligo NO: ;;TAGAGCATGAGGGGGGCTA ;F3 15 ;{Primer esterno diretto) ;;GTGTTCTGGACAAAGTAACC ;B3 16 ;{Primer esterno inverso) ;;GGCGATAGTGATTCGGAGCATCAGCAACCTGGT FIP 17 ;{Primer interno diretto) ;;CAACAACACACTCACCCCTTGGGATACTTGGAGG BIP 18 ;{Primer interno inverso) ;;Sonda ;CCACCCTGCCACCAGGG-BHQ3 ;Quencher ;{Sonda Quencher marcata al 3' con 19 Accetto-BHQ3) ;re ;;Loop ;BODIPY630-CCATCCAATACCTGACT ;primer ;{Loop primer marcato al 5' con BO- 20 ;LB Dona-DIPY 630) ;tore ;;Nel procedimento LAMP dell'invenzione, gli oli- ;gonucleotidi primer e sonda sono stati usati alle ;seguenti concentrazioni: primer esterni (F3 e B3) ;0,03 μΜ, primer interni (FIP e BIP) 0,3 μΜ, loop primer LB 0,2 μΜ e sonda Quencher 0,2 μΜ. Secondo la presente invenzione, il loop primer LB è marcato alla propria estremità 5' con una molecola BODIPY 630, mentre la sonda Quencher è marcata alla propria estremità 3' con una molecola Black Hole Quencher 3 (BHQ3)-Al fine di eseguire l'analisi comparativa dettagliata sopra, gli esperimenti di amplificazione LAME sono stati condotti sia in presenza che in assenza della sonda Quencher. ;Le reazioni LAME sono state eseguite in una miscela di 25 μΐ contenente: dNTPs 1,2 mM, MgCl2 6 mM, 8 unità della DNA polimerasi Bst Large Fragment (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), tampone di reazione lx (Tris-HCl 30 mM, pH 8.0, KC1 30 mM e Triton X1000,1 %). ;L'amplificazione LAME è stata eseguita a 63°C per 40 minuti sullo strumento AB7500 (Life Technologies). I prodotti di amplificazione sono stati successivamente conservati a 4°C. ;Analisi dei dati ;L'analisi dei dati è stata effettuata calcolando il segnale di quenching di fluorescenza mediante impiego dei dati non elaborati riportati dal programma SDS (v 2.3). La percentuale di Quenching è stata calcolata corrispondente a 100-( (Min/Max)*100) .

L'analisi di regressione lineare è stata eseguita utilizzando il pacchetto statistico contenuto in Microsoft Excel.

Claims (5)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento di rivelazione dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di una sequenza di acido nucleico bersaglio, il procedimento comprendendo i passaggi di: i. contattare un campione da testare contenente eventualmente la sequenza di acido nucleico bersaglio con una DNA polimerasi avente attività di spiazzamento del filamento e con un set di oligonucleotidi consistente di: a. un primo primer esterno F3 e un secondo primer esterno B3; b, un primo primer interno FIP e un secondo primer interno BIP, in cui FIP consiste di una sequenza di acido nucleico 3' F2 e una sequenza di acido nucleico 5' Flc e in cui BIP consiste di una sequenza di acido nucleico 3' B2 e una sequenza di acido nucleico 5' Blc, in cui F2 è complementare ad una regione F2c della sequenza di acido nucleico bersaglio e B2 è complementare ad una regione B2c della sequenza di acido nucleico bersaglio, in cui F2c e B2c sono regioni non sovrapposte che si trovano su filamenti opposti della sequenza di acido nucleico bersaglio,-c. un primo loop primer LF e opzionalmente un secondo loop primer LB, atti ad ibridarsi a rispettive regioni della sequenza di acido nucleico bersaglio, in cui il loop primer LF o il loop primer LB, se presente, è marcato con almeno un accettore di fluorescenza alla propria estremità 5'; d. una sonda di acido nucleico che è atta ad ibridarsi alla sequenza di acido nucleico bersaglio in 5' rispetto al primer LF o LB marcato, cosicché quando la sonda di acido nucleico è ibridata alla sequenza di acido nucleico bersaglio, la sua estremità 3' è in stretta vicinanza con l'estremità 5' del loop primer LF o LB marcato, in cui detta sonda di acido nucleico è marcata alla propria estremità 3' con almeno un donatore di fluorescenza atto a trasferire energia all'almeno un accettore di fluorescenza di detto loop primer LF o detto loop primer LB, ii. rivelare una variazione in un parametro di fluorescenza come indicatore dell'amplificazione LAMP della sequenza di acido nucleico bersaglio.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la variazione nel parametro di fluorescenza è un incremento dell'emissione di fluorescenza.
3. 3. Procedimento di rivelazione dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di una sequenza di acido nucleico bersaglio, il procedimento comprendendo i passaggi di: i. contattare un campione da testare contenente eventualmente la sequenza di acido nucleico bersaglio con una DNA polimerasi avente attività di spiazzamento del filamento e con un set di oligonucleotidi consistente di: a. un primo primer esterno F3 e un secondo primer esterno B3; b, un primo primer interno FIP e un secondo primer interno BIP, in cui FIP consiste di una sequenza di acido nucleico 3' F2 e una sequenza di acido nucleico 5' Flc e in cui BIP consiste di una sequenza di acido nucleico 3' B2 e una sequenza di acido nucleico 5' Blc, in cui F2 è complementare a una regione F2c della sequenza di acido nucleico bersaglio e B2 è complementare a una regione B2c della sequenza di acido nucleico bersaglio, in cui F2c e B2c sono regioni non sovrapposte che si trovano su filamenti opposti della sequenza di acido nucleico bersaglio,-c. un primo loop primer LF e opzionalmente un secondo loop primer LB, atti ad ibridarsi a rispettive regioni della sequenza di acido nucleico bersaglio, in cui il loop primer LF o il loop primer LB, se presente, è marcato con un donatore di fluorescenza alla propria estremità 5'; d. una sonda di acido nucleico atta ad ibridarsi alla sequenza di acido nucleico bersaglio in 5' rispetto al loop primer LF o LB marcato, cosicché quando la sonda di acido nucleico è ibridata alla sequenza di acido nucleico bersaglio, la sua estremità 3' è in stretta vicinanza con l'estremità 5' del loop primer LF o LB marcato, in cui detta sonda di acido nucleico è marcata alla propria estremità 3' con almeno un quencher di fluorescenza atto ad assorbire l'energia di fluorescenza da detto almeno un donatore di fluorescenza, ii. rivelare una variazione in un parametro di fluorescenza come indicatore dell'amplificazione LAMP della sequenza di acido nucleico bersaglio.
4. 4. Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui la variazione nel parametro di fluorescenza è una diminuzione dell'emissione di fluorescenza. 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui la distanza fra l'estremità 3' della sonda di acido nucleico quando ibridata alla sequenza di acido nucleico bersaglio e l'estremità 5' del loop primer LF o LB marcato è non più di 6 nucleotidi, preferibilmente non più di 1 nucleotide, più preferibilmente zero nucleotidi. 6. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, in cui il loop primer LF o LB marcato è un primer stem-loop estendibile comprendente i) una sequenza centrale capace di riconoscere e ibridarsi selettivamente alla rispettiva regione della sequenza di acido nucleico bersaglio, e ii) una sequenza all'estremità 5' e una sequenza all'estremità 3' che sono complementari l'una all'altra in modo tale da formare uno stem a doppio filamento. 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui la sequenza di acido nucleico bersaglio comprende almeno una mutazione, preferibilmente scelta fra una mutazione puntiforme, una delezione, un'inserzione o una traslocazione. 8. Set di oligonucleotidi per la rivelazione dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di una sequenza di acido nucleico bersaglio, il set consistendo in: a. un primo primer esterno F3 e una secondo primer esterno B3; b. un primo primer interno FIP e un secondo primer interno BIP, in cui FIP consiste di una sequenza di acido nucleico 3' F2 e una sequenza di acido nucleico 5' Flc e in cui BIP consiste di una sequenza di acido nucleico 3' B2 e una sequenza di acido nucleico 5' Blc, in cui F2 è complementare a una regione F2c della sequenza di acido nucleico bersaglio e B2 è complementare a una regione B2c della sequenza di acido nucleico bersaglio, in cui F2c e B2c sono regioni non sovrapposte che si trovano su filamenti opposti della sequenza di acido nucleico bersaglio; c. un primo loop primer LF e opzionalmente un secondo loop primer LB, atti ad ibridarsi a rispettive regioni della sequenza di acido nucleico bersaglio, in cui il loop primer LF o il loop primer LB, se presente, è marcato con almeno un accettore di fluorescenza alla propria estremità 5'; d. una sonda di acido nucleico che è atta ad ibridarsi alla sequenza di acido nucleico bersaglio in 5' rispetto al loop primer LF o LB marcato, cosicché quando la sonda di acido nucleico è ibridata alla sequenza di acido nucleico bersaglio, la sua estremità 3' è in stretta vicinanza con l'estremità 5' del loop primer LF o LB marcato, in cui detta sonda di acido nucleico è marcata alla propria estremità 3' con almeno un donatore di fluorescenza atto a trasferire energia all'almeno un accettore di fluorescenza di detto loop primer LF o detto loop primer LB. 9, Set di oligonucleotidi secondo la rivendicazione 8, in cui 1'almeno un donatore di fluorescenza è scelto dal gruppo che consiste di Fluoresceina, B0-DIPY FL, Alexa555, ATTO550, Cy3, FAM, TET, HEX, JOE, VIC, Cy3, NED, Quasar 570, Oyster 556, TAMRA, Cy5.5, Cy5, ATT0647N, Alexa 647, ROX, LC red 610, Texas red, LC red 640, LC red 670, Quasar 670, Oyster 645, LC red 705 e/o l'almeno un accettore di fluorescenza è scelto dal gruppo che consiste di Cy5.5, Cy5, ATT0647N, Alexa 647, ROX, LC red 610, Texas red, LC red 640, LC red 670, Quasar 670, Oyster 645, LC red 705. 10, Set di oligonucleotidi per la rivelazione dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di una sequenza di acido nucleico bersaglio, il set consistendo in: a. un primo primer esterno F3 e una secondo primer esterno B3; b. un primo primer interno FIP e un secondo primer interno BIP, in cui FIP consiste di una sequenza di acido nucleico 3' F2 e una sequenza di acido nucleico 5' Flc e in cui BIP consiste di una sequenza di acido nucleico 3' B2 e una sequenza di acido nucleico 5' Blc, in cui F2 è complementare a una regione F2c della sequenza di acido nucleico bersaglio e B2 è complementare a una regione B2c della sequenza di acido nucleico bersaglio, in cui F2c e B2c sono regioni non sovrapposte che si trovano su filamenti opposti della sequenza di acido nucleico bersaglio; c. un primo loop primer LF e opzionalmente un secondo loop primer LB, atti ad ibridarsi a rispettive regioni della sequenza di acido nucleico bersaglio, in cui il loop primer LF o il loop primer LB, se presente, è marcato con almeno un donatore di fluorescenza alla propria estremità 5'; d. una sonda di acido nucleico che è atta ad ibridarsi alla sequenza di acido nucleico bersaglio in 5' rispetto al loop primer LF o LB marcato, cosicché quando la sonda di acido nucleico è ibridata alla sequenza di acido nucleico bersaglio, la propria estremità 3' è in stretta vicinanza con l'estremità 5'del loop primer LF o LB marcato, in cui detta sonda di acido nucleico è marcata alla propria estremità 3' con almeno un quencher di fluorescenza atto ad assorbire energia di fluorescenza da detto almeno un donatore di fluorescenza. 11. Set di oligonucleotidi secondo la rivendicazione 10, in cui 1'almeno un donatore di fluorescenza è scelto dal gruppo che consiste di Fluoresceina, BODIPY FL, Alexa555, ATTO550, Cy3, FAM, TET, HEX, JOE, VIC, Cy3, NED, Quasar 570, Oyster 556, TAMRA, Cy5.
5. 5, Cy5, ATT0647N, Alexa 647, ROX, LC red 610, Texas red, LC red 640, LC red 670, Quasar 670, Oyster 645, LC red 705 e l'almeno un quencher di fluorescenza è scelto dal gruppo che consiste di DDQ-I, Dabcyl, Eclipse, Iowa Black FQ, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, QSY-7, DDQ-II, Iowa Black RQ, QSY-21, AT-TO 540Q, ATTO 580Q, ATTO 612Q. 12, Kit per la rivelazione dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di una sequenza di acido nucleico bersaglio, il kit comprendendo il set di oligonucleotidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 11 e una DNA polimerasi avente attività di spiazzamento del filamento ("strand displacement activity"). 13. Kit secondo la rivendicazione 12, in cui la DNA polimerasi è scelta dal gruppo che consiste di polimerasi Bst frammento grande, Bst 2.0, Bst 3.0, Bea (exo-), Vent, Vent (exo-), Deep Vent, Deep Vent (exo-), fago Φ29, MS-2 fago, Z-Taq, KOD, frammento Klenow, GspSSD, GspF, OmniAmp Polimerasi, SD Polimerasi e qualsiasi loro combinazione.