JP5779350B2 - 抗体代替軽鎖配列を含む構築物およびライブラリー - Google Patents
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Description
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下を提供する:
(項目1)
異種アミノ酸配列にコンジュゲートされたVpreB配列および/またはλ5配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、標的に結合することができる、ポリペプチド。
(項目2)
VpreB配列を含む、項目1に記載のポリペプチド。
(項目3)
前記VpreB配列が、未変性VpreB1配列、未変性VpreB2配列、未変性VpreB3配列ならびにそれらの断片および変異体からなる群より選択される、項目2に記載のポリペプチド。
(項目4)
前記未変性VpreB配列が、配列番号1のヒトVpreB1、配列番号2および3のマウスVpreB2、配列番号4のヒトVpreB3、ならびにそれらの断片および変異体からなる群より選択される、項目3に記載のポリペプチド。
(項目5)
前記異種アミノ酸配列が、λ5配列を含む、項目2に記載のポリペプチド。
(項目6)
前記異種アミノ酸配列が、配列番号5のヒトλ5または配列番号6のヒトλ5様ポリペプチドの全部または一部を含む、項目5に記載のポリペプチド。
(項目7)
前記λ5配列が、前記VpreB配列に融合される、項目5に記載のポリペプチド。
(項目8)
異種アミノ酸配列へのVpreB配列の融合物を含む、項目2に記載のポリペプチド。
(項目9)
前記異種アミノ酸配列が、λ5配列である、項目8に記載のポリペプチド。
(項目10)
前記VpreB配列が、配列番号1のヒトVpreBl、配列番号2および3のマウスVpreB2、および配列番号4のヒトVpreB3、ならびにそれらの断片および変異体からなる群より選択される、項目9に記載のポリペプチド。
(項目11)
前記λ5配列が、配列番号5のヒトλ5の配列、配列番号6のヒトλ5様ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体である、項目10に記載のポリペプチド。
(項目12)
前記融合が、それぞれ、前記VpreB配列およびλ5のCDR3類似領域においてまたはそのまわりで起きる、項目9に記載のポリペプチド。
(項目13)
前記異種アミノ酸配列が、抗体軽鎖可変領域配列を含む、項目8に記載のポリペプチド。
(項目14)
前記抗体軽鎖可変領域配列が、抗体軽鎖CDR3領域に類似する部位において前記VpreB配列に融合される、項目13に記載のポリペプチド。
(項目15)
前記抗体軽鎖可変領域配列の前記CDR3領域が、前記CDR3領域に類似する部位において前記VpreB配列に融合される、項目13に記載のポリペプチド。
(項目16)
前記抗体軽鎖が、λ鎖である、項目15に記載のポリペプチド。
(項目17)
前記抗体軽鎖が、κ鎖である、項目15に記載のポリペプチド。
(項目18)
前記異種アミノ酸配列が、抗体軽鎖定常領域配列をさらに含む、項目13に記載のポリペプチド。
(項目19)
前記定常領域配列が、抗体軽鎖の定常領域全体である、項目18に記載のポリペプチド。
(項目20)
λ5配列を含む、項目1に記載のポリペプチド。
(項目21)
前記λ5配列が、配列番号5のヒトλ5の配列、または配列番号6のヒトλ5様ポリペプチド、あるいはそれらの断片または変異体である、項目20に記載のポリペプチド。
(項目22)
前記異種アミノ酸配列が、前記λ5配列にコンジュゲートされたVpreB配列である、項目21に記載のポリペプチド。
(項目23)
前記コンジュゲーションが、前記λ5およびVpreB配列の融合である、項目22に記載のポリペプチド。
(項目24)
前記コンジュゲーションが、前記λ5とVpreB配列との間の共有結合である、項目22に記載のポリペプチド。
(項目25)
前記共有結合が、接続ペプチドまたはポリペプチド配列により形成される、項目24に記載のポリペプチド。
(項目26)
VpreB配列およびλ5配列を含み、前記コンジュゲーションが、非共有結合性会合であり、前記VpreBおよびλ5配列の少なくとも一方が、それぞれ、完全長未変性VpreBおよびλ5配列以外である、項目1に記載のポリペプチド。
(項目27)
前記VpreBおよびλ5配列の少なくとも一方が、それぞれ、未変性VpreBおよびλ5配列の断片または変異体である、項目26に記載のポリペプチド。
(項目28)
前記ポリペプチドが、第2の異種アミノ酸配列にさらにコンジュゲートされる、項目1に記載のポリペプチド。
(項目29)
前記第2の異種アミノ酸配列と共有結合的に会合させられた、λ5配列へのVpreB配列の融合物を含む、項目28に記載のポリペプチド。
(項目30)
前記第2の異種ポリペプチド配列が、可変領域を含む抗体重鎖配列である、項目29に記載のポリペプチド。
(項目31)
前記抗体重鎖配列が、前記VpreB配列と前記λ5配列との融合物にペプチドリンカーによってコンジュゲートされる、項目30に記載のポリペプチド。
(項目32)
前記抗体重鎖配列が、前記VpreB配列と前記λ5配列との融合物に非共有結合性の会合によってコンジュゲートされ、二量体複合体を形成する、項目30に記載のポリペプチド。
(項目33)
前記抗体重鎖可変領域配列が、前記ポリペプチドと同じ標的に結合する、項目32に記載のポリペプチド。
(項目34)
前記抗体重鎖可変領域配列が、前記ポリペプチドが結合する標的と異なる標的に結合する、項目32に記載のポリペプチド。
(項目35)
前記ポリペプチドが腫瘍抗原に結合し、前記抗体可変領域配列がエフェクター細胞に結合する、項目34に記載のポリペプチド。
(項目36)
非共有結合的に会合させられたVpreB配列およびλ5配列と非共有結合的に会合させられて三量体複合体を形成する可変領域を含む抗体重鎖配列をさらに含む、項目26に記載のポリペプチド。
(項目37)
前記抗体重鎖が、前記ポリペプチドと同じ標的に結合する可変領域配列を含む、項目36に記載のポリペプチド。
(項目38)
前記抗体重鎖が、前記ポリペプチドが結合する標的と異なる標的に結合する可変領域配列を含む、項目36に記載のポリペプチド。
(項目39)
前記ポリペプチドが腫瘍抗原に結合し、前記可変領域配列がエフェクター細胞に結合する、項目38に記載のポリペプチド。
(項目40)
前記VpreB配列および/または前記λ5配列のCDR類似領域が、治療抗体由来の対応するCDR配列をグラフトすることにより設計される、項目1に記載のポリペプチド。
(項目41)
前記標的が、抗原である、項目1に記載のポリペプチド。
(項目42)
前記標的が、ウイルス抗原である、項目1に記載のポリペプチド。
(項目43)
前記標的が、インフルエンザAウイルスである、項目42に記載のポリペプチド。
(項目44)
前記ポリペプチドが、前記インフルエンザAウイルスを無力化する、項目43に記載のポリペプチド。
(項目45)
項目1〜44のいずれか1項に記載のポリペプチドを含むライブラリー。
(項目46)
抗体重鎖と会合させられたVpreB配列とλ5配列とのコンジュゲートを含むライブラリー。
(項目47)
前記コンジュゲートが、前記VpreBとλ5配列との融合物である、項目46に記載のライブラリー。
(項目48)
前記コンジュゲートが、前記VpreBとλ5配列との非共有結合性会合である、項目46に記載のライブラリー。
(項目49)
前記コンジュゲートが、ペプチドリンカーを介した前記VpreBとλ5配列との共有結合である、項目46に記載のライブラリー。
(項目50)
前記抗体重鎖可変領域配列が、前記コンジュゲートと非共有結合的に会合される、項目46に記載のライブラリー。
(項目51)
前記抗体重鎖可変領域配列が、前記コンジュゲートと共有結合的に会合させられる、請求項46に記載のライブラリー。
(項目52)
前記抗体重鎖が、前記コンジュゲートと同じ標的に結合する可変領域配列を含む、項目46に記載のライブラリー。
(項目53)
前記抗体重鎖が、前記コンジュゲートが結合する標的と異なる標的に結合する可変領域配列を含む、項目46に記載のライブラリー。
(項目54)
前記コンジュゲートが腫瘍抗原に結合し、前記可変領域配列がエフェクター細胞に結合する、項目53に記載のライブラリー。
(項目55)
ディスプレイの形態である、項目45に記載のライブラリー。
(項目56)
前記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、DNAディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−DNA結合に基づくディスプレイ、およびミクロビーズディスプレイからなる群より選択される、項目55に記載のライブラリー。
(項目57)
ディスプレイの形態である、項目46に記載のライブラリー。
(項目58)
前記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、DNAディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−DNA結合に基づくディスプレイ、およびミクロビーズディスプレイからなる群より選択される、項目57に記載のライブラリー。
(項目59)
代替軽鎖配列を含むライブラリー。
(項目60)
ディスプレイの形態である、項目59に記載のライブラリー。
(項目61)
前記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、DNAディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−DNA結合に基づくディスプレイ、およびミクロビーズディスプレイからなる群より選択される、項目59に記載のライブラリー。
(項目62)
前記ライブラリーのメンバーに付加されたまたは埋め込まれた少なくとも1つの付加的な機能性をさらに含む、項目45、46または59に記載のライブラリー。
(項目63)
前記付加的な機能性が、抗体、ペプチド、またはポリペプチド配列により提供される、項目62に記載のライブラリー。
(項目64)
前記ポリペプチド配列が、受容体またはリガンド配列である、項目63に記載のライブラリー。
(項目65)
前記抗体、ペプチド、またはポリペプチド配列が、抗体、ペプチド、またはポリペプチドライブラリーのメンバーである、項目63に記載のライブラリー。
(項目66)
前記ペプチドライブラリーが、ランダムペプチド配列のライブラリーである、項目65に記載のライブラリー。
(項目67)
前記ペプチド配列の少なくともいくつかが、標的抗原への結合特異性を有する、項目66に記載のライブラリー。
(項目68)
ディスプレイの形態である、項目62に記載のライブラリー。
(項目69)
前記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、DNAディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−DNA結合に基づくディスプレイ、およびミクロビーズディスプレイからなる群より選択される、項目68に記載のライブラリー。
(項目70)
抗体重鎖可変領域配列と会合させられた代替軽鎖配列のコレクションを含む、ライブラリー。
(項目71)
前記代替軽鎖配列が、1つ以上の標的に対する結合特異性を有する、項目70に記載のライブラリー。
(項目72)
前記代替軽鎖配列が、同じ標的に対する結合特異性を有する、項目71に記載のライブラリー。
(項目73)
前記代替軽鎖配列が、少なくとも2つの異なる標的に対する結合特異性を有する、項目71に記載のライブラリー。
(項目74)
前記代替軽鎖配列が、複数の標的に対する結合特異性を有する、項目71に記載のライブラリー。
(項目75)
前記代替軽鎖配列が、VpreB配列および/またはλ5配列を含む、項目70に記載のライブラリー。
(項目76)
前記VpreB配列が、ヒトVpreB1(配列番号1)、マウスVpreB2(配列番号2および3)、およびヒトVpreB3(配列番号4)配列、ならびにそれらの断片および変異体からなる群より選択される、項目75に記載のライブラリー。
(項目77)
前記λ5配列が、配列番号5のヒトλ5、配列番号6のヒトλ5様ポリペプチド、ならびにそれらの断片および変異体からなる群より選択される、項目75に記載のライブラリー。
(項目78)
前記VpreBおよびλ5配列が、互いに非共有結合的に会合させられる、項目75に記載のライブラリー。
(項目79)
前記VpreBおよびλ5配列が、互いに共有結合的に接続される、項目75に記載のライブラリー。
(項目80)
前記VpreBおよびλ5配列が、互いに直接的に融合される、項目79に記載のライブラリー。
(項目81)
前記ライブラリーのメンバーに付加されたまたは埋め込まれた少なくとも1つの付加的な機能性をさらに含む、項目75に記載のライブラリー。
(項目82)
前記付加的な機能性が、抗体、ペプチド、またはポリペプチド配列により提供される、項目81に記載のライブラリー。
(項目83)
前記ポリペプチド配列が、受容体またはリガンド配列である、項目82に記載のライブラリー。
(項目84)
前記抗体、ペプチド、またはポリペプチド配列が、抗体、ペプチド、またはポリペプチドライブラリーのメンバーである、項目82に記載のライブラリー。
(項目85)
前記ペプチドライブラリーが、ランダムペプチド配列のライブラリーである、項目84に記載のライブラリー。
(項目86)
前記ペプチド配列の少なくともいくつかが、標的抗原への結合特異性を有する、項目85に記載のライブラリー。
(項目87)
ディスプレイの形態である、項目70に記載のライブラリー。
(項目88)
前記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、DNAディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−DNA結合に基づくディスプレイ、およびミクロビーズディスプレイからなる群より選択される、項目87に記載のライブラリー。
他に定義されなければ、本明細書中で用いられる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)は、本出願中で用いられる用語の多くへの一般的指針を当業者に提供する。
本発明の方法を実行するための手法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ausubel et al.,Current Protocols of Molecular Biology,John Wiley and Sons(1997);Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,J.Sambrook and D.W.Russell,eds..Cold Spring Harbor,New York,USA,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001;O’Brian et al.,Analytical Chemistry of Bacillus Thuringiensis,Hickle and Fitch,eds.,Am.Chem.Soc,1990;Bacillus thuringiensis:biology,ecology and safety,T.R.Glare and M.O’Callaghan,eds.,John Wiley,2000;Antibody Phage Display,Methods and Protocols,Humana Press,2001;and Antibodies,G.Subramanian,ed.,Kluwer Academic,2004を含む標準実験室教科書に記載されている。突然変異誘発は、例えば、部位特異的変異誘発を用いて実行できる(Kunkel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 82:488−492(1985))。PCR増幅方法は、米国特許第4,683,192号、同第4,683,202号、同第4,800,159号、および同第4,965,188号、ならびに“PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification”,H.Erlich,ed.,Stockton Press,New York(1989);およびPCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis et al.,eds..Academic Press,San Diego,Calif.(1990)を含むいくつかの教科書に記載されている。
上記で論じられたように、プレB細胞は、μ重鎖を産生するが成熟した軽鎖の代わりに、それぞれVpreB(l−3)およびλ5と呼ばれるB系統特定的遺伝子のセットを発現するリンパ球として骨髄中で同定されてきた。VpreBおよびλ5ポリペプチドは一緒に、非共有結合的に会合したIg軽鎖様構造を形成し、これは代替軽鎖と呼ばれる。代替軽鎖は、抗体鎖ではないものの、すべての抗体重鎖と自然に会合し、代替軽鎖−抗体重鎖複合体は、自己抗原と結合することが明らかにされている。
本発明の代替軽鎖構築物は、周知の組み換えDNA技術を含む当該技術分野において知られている方法により調製され得る。
本発明はさらに、代替軽鎖配列およびそのような配列を含む構築物の様々なライブラリーに関する。従って、そのようなライブラリーは、上記で具体的に説明され、図に例示されおよび/または実施例中で説明されるものを制限なく含む本発明のVpreB−および/またはλ5−含有構築物のような代替軽鎖配列のディスプレイを含んでもよく、それらで本質的に構成されてもよく、またはそれらで構成されてもよい。
本発明のライブラリーは、所望の特性を有する代替軽鎖配列を含む融合物のような代替軽鎖配列および代替軽鎖構築物を識別するために用いることができる。例えば、本明細書中におけるライブラリーのin vitroまたはin vivoスクリーニングは、高い結合特異性および親和性で所望の標的に結合する代替軽鎖配列を含むポリペプチドを産生できる。従って、本明細書中のライブラリーは、腫瘍マーカーまたは治療的介入の他の分子標的に結合する代替軽鎖配列を含むポリペプチドのような治療および診断目的のための分子を識別するために使用できる。加えて、上述の技術によって、同じ標的に結合するポリペプチドのコレクションを含むライブラリー、異なる標的に結合するポリペプチドのライブラリー、複数の特性を備えるポリペプチドのライブラリー等を含む、代替軽鎖の非常に多岐にわたるライブラリーを設計することができる。
結合ドメインタンパク質としてのVpreBおよびそれを含む融合物
VpreB結合ドメインを作るため、図5に示される単一タンパク質を、組み換え的作成する。SLC結合ドメインタンパク質構築物は、VpreB1からのアミノ酸20〜121およびλ5からのアミノ酸87〜105で構成される。もし所望されれば、新規かつ特定の結合能力を作り出すため、分子を、構造的または配列エビデンスに従って再設計される。付加的に、または代わりに、変異体のコレクションが、例えば、エラー頻発型PCRにより無作為に、あるいはアミノ酸のコレクションを用いた単一または多部位特定突然変異誘発により直接的に、のいずれかで作り出される。結果として生じるクローンまたはコレクションは次に、ファージまたはファージミドディスプレイで使用するためにpIIIを用いてインフレームでクローニングする。このファージミド構築物をTGl細胞に転換する。次に、50μg/mlアンピシリンおよび2%グルコースを補ったルリアブロス(LB)中で、単一コロニーを、それがOD600〜0.3に達するまで繁殖させ、30分間、37℃で振とうせずにMK307ヘルパーファージで感染させる。次に細胞をペレットにし、次いで、50μg/mlアンピシリンおよび75μg/mlカナマイシンを含有するLB中に再懸濁させ、30℃で、強くエアレーションして一晩成長させる。翌日、ファージミド発現SLC−HC融合タンパク質を含有する上清をファージELISAにおいて使用し、標的とした結合を決定する。簡潔に言えば、ELlSAは、ヒトTNF−αによるELISAプレートの被覆および遮断を伴い、4℃で2時間のSLC−HCファージのインキュベーション、PBS−Tween−20(0.05%)を用いた洗浄および抗m13−HRP抗体による直接検出が続く。あるいは、結合は、結合ファージを直接増幅または溶出し、XL−1Blue細胞を用いてファージ力価を決定することにより評価される。この実施例は、SLC結合ドメイン融合を単一クローンとして記載しているが、このSLCは、共通の標的を認識する他の異種配列と組み換え的に組み換え、ライブラリーとしてスクリーニングされ得る。さらに、このSLC結合タンパク質は、重鎖の前もって選ばれたコレクションと組み合わせ、目的とする同じ標的または目的とする第2の標的に関して直接スクリーニングされて二重特異性分子を作り出すことができる。あるいは、この強化された結合または二重特異性結合は、重鎖の選択されていないコレクションと共にスクリーニングすることによって見出すことができる。加えて、この実施例は抗体重鎖を指している一方で、完全な重鎖が要求されないことが理解されるべきである。重鎖可変領域配列を含む単鎖融合物は、重鎖定常領域、または完全な重鎖定常領域でない場合、類似したやり方で作ることができ、この実施例の範囲内である。
可変重鎖(VH)パートナーとしてのVpreB融合物
図5の第2の図に示される機能性VpreB−λ5融合タンパク質(「VpreBタンパク質融合物−二量体複合体」と呼ばれる)は、組み換え的に作り出される。VpreB−λ5融合タンパク質は、m13遺伝子IIIシグナル配列、VpreB1からのアミノ酸20〜115、およびλ5からのアミノ酸83〜209で構成される。この構築物は、ファージまたはファージミドディスプレイで使用するためにpIIIを用いて可変重鎖−CH1融合物と共にインフレームで同時発現させる。VHコード配列として、抗−TNF−α抗体、D2E7、のVHコード配列が用いられ、CH1は、ヒトIgGlのCHl領域である。このファージミド構築物を、TG1細胞に形質転換させる。次に、50μg/mlアンピシリンおよび2%グルコースを補ったルリアブロス(LB)中で、単一コロニーを、それがOD600〜0.3に達するまで繁殖させ、30分間、37℃で振とうせずにMK307ヘルパーファージで感染させる。次に細胞をペレットにし、次いで、50μg/mlアンピシリンおよび75μg/mlカナマイシンを含有するLB中に再懸濁させ、30度で、強くエアレーションして一晩成長させる。翌日、ファージミド発現SLC−HC融合タンパク質を含有する上清をファージELISAにおいて使用し、標的とした結合を決定する。簡潔に言えば、ELlSAは、ヒトTNF−αによるELISAプレートの被覆および遮断を伴い、4度で2時間のSLC−HCファージのインキュベーション、PBS−Tween−20(0.05%)を用いた洗浄および抗m13−HRP抗体による直接検出が続く。あるいは、結合は、結合ファージを直接増幅または溶出し、XL−1Blue細胞を用いてファージ力価を決定することにより評価される。この実施例は、重鎖可変−CH1融合物とパートナーにされたSLC融合物を単一クローンとして記載しているが、このSLCは、共通の標的を認識する重鎖可変領域のフォーカスされたコレクションと組み合わせ、ライブラリーとしてスクリーニングすることもできる。さらに、このSLC融合物は、重鎖の選択されていないコレクションと組み合わせ、目的とする標的に関して直接スクリーニングすることができる。SLC融合の妥当な代案として、VH会合を、λ5タンパク質断片の代わりに従来の抗体軽鎖からの定常ラムダ領域を融合させることにより強化することができる。
会合させられた可変重鎖(VH)パートナーとしてのVpreBおよびλ5
図5の第3の図に示されるVpreB−λ5同時発現タンパク質は、(「VpreBおよびλ5−三量体複合体」と呼ばれる)は、m13遺伝子IIIシグナル配列ならびに予測され成熟した処理されたVpreBl(アミノ酸20〜146)およびλ5(アミノ酸31〜209)の対応するアミノ酸で構成される。これらは、ファージまたはファージミドディスプレイにおいて使用するためにpIIIを用いて可変重鎖−CH1融合物と共にインフレームで同時発現させる。VHコード配列として、抗−TNF−α抗体、D2E7、のVHコード配列が用いられ、CH1は、ヒトIgGlのCHl領域である。このファージミド構築物を、TG1細胞に形質転換させる。次に、50μg/mlアンピシリンおよび2%グルコースを補ったルリアブロス(LB)中で、単一コロニーを、それがOD600〜0.3に達するまで繁殖させ、30分間、37℃で振とうせずにMK307ヘルパーファージで感染させる。次に細胞をペレットにし、次いで、50μg/mlアンピシリンおよび75μg/mlカナマイシンを含有するLB中に再懸濁させ、30度で、強くエアレーションして一晩成長させる。翌日、ファージミド発現SLC−HC三量体タンパク質複合体を含有する上清をファージELISAにおいて使用し、標的とした結合を決定する。簡潔に言えば、ELlSAは、ヒトTNF−αによるELISAプレートの被覆および遮断を伴い、4度で2時間のSLC−HCファージのインキュベーション、PBS−Tween−20(0.05%)を用いた洗浄および抗m13−HRP抗体による直接検出が続く。あるいは、結合は、結合ファージを直接増幅または溶出し、XL−1Blue細胞を用いてファージ力価を決定することにより評価される。この実施例は、重鎖可変−CH1融合物とパートナーにされたSLC融合物を単一クローンとして記載しているが、このSLCは、共通の標的を認識する重鎖可変領域のフォーカスされたコレクションと組み合わせ、ライブラリーとしてスクリーニングすることができる。さらに、このSLC融合物は、重鎖の選択されていないコレクションと組み合わせ、目的とする標的に関して直接スクリーニングすることができる。
VpreBl CDR3類似領域への多様性の設計
代替軽鎖(SLC)のCDR類似領域は、抗体軽鎖のCDRの機能と同様な機能を有するので、VpreBとλ5との間の融合点を決定することが重要である。1つのアプローチによれば、特定の目的に最も適切な融合点は、すべてのVpreBアミノ酸を含有するCDR3類似部位から始め、アミノ酸位置を、クローニング可能なオリゴヌクレオチド中でコードされたλ5の位置により増分的に置換することにより決定される。この増分的置換は、CDR類似部位が、λ5ソースの配列によって完全に構成されるまで続く。このプロセスの間のある時点で、相補的重鎖を付加し、その抗原結合および認識を可能/容易にすることが望ましいかもしれない。この相補性をさらに強化または可能にするため、一致CDR長さ分析に基づく多様性だけでなく、ランダム多様性をCDR類似部位のうちのいずにおいても用いることができる。代わりに、またはそれに加えて、多様性を付加するために抗体Vλ5配列を用いることができる。なぜならば、それらのCDR長さが、VpreB CDR類似部位長さと良好に一致するからである。
SLCコンポーネントへの機能性の付加
SLCは2つの独立なポリペプチドで構成されているので、これにより第2の機能性を付加または埋め込むための自然な機会が作り出される。本実施例では、第1の例において、VpreBをλ5と結合する融合タンパク質を作り出するために、抗VEGFscFvが挿入される(図9A)。この結果として生じる設計されたSLC−制約scFvは、抗TNF−α抗体の重鎖と対にされる。結果として生じる構築物は、ファージまたはファージミドディスプレイで使用するためにpIIIを用いてインフレームクローニングされた重鎖と共に同時発現させる。このファージミド構築物を、TGl細胞に形質転換し、50μg/mlアンピシリンおよび2%グルコースを補ったルリアブロス(LB)中で、単一コロニーを、それがOD600〜0.3に達するまで繁殖させ、30分間、37℃で振とうせずにMK307ヘルパーファージで感染させる。次に細胞をペレットにし、次いで、50μg/mlアンピシリンおよび75μg/mlカナマイシンを含有するLB中に再懸濁させ、30度で、強くエアレーションして一晩成長させる。翌日、ファージミド発現SLC−HC融合タンパク質を含有する上清をファージELISAにおいて使用し、標的とした結合を決定する。簡潔に言えば、ELlSAは、ヒトTNF−αまたはヒトVEGFによるELISAプレートの被覆および遮断を伴い、4℃で2時間のSLC−HCファージのインキュベーション、PBS−Tween−20(0.05%)を用いた洗浄および抗m13−HRP抗体による直接検出が続く。
哺乳動物細胞における代替軽鎖構築物(SURROBODY(商標))の発現
図11において「三量体」(「SURROBODY(商標)変異体」とも呼ばれる)と呼ばれる構造物の代替軽鎖コンポーネントのコード配列を、完全長IgGl抗体重鎖を用いてCHO−Kl細胞(ATCC CCL−61)に同時形質移入し、生化学分析のための代替軽鎖構築物を一時的に産生した。具体的には、完全長ヒトVpreBlおよびλ5を、哺乳動物発現ベクターpCI(Promega,Madison WI)中にクローニングした。これらの構築物は、それらの未変性の予測される分泌物シグナルを含んでいた。VpreB1の場合、予測されるシグナルペプチドは、配列番号1のアミノ酸1−20であり、λ5については、予測されるシグナル配列は、配列番号5のアミノ酸1−30である。これらのタンパク質の双方について、それらの予測される非構造的尾部の部分は欠失されていた。VpreBlについては、これは、配列番号1のC末端アミノ酸122−146を含んでおり、ラムダ5については、これは、配列番号5のN末端アミノ酸30−86を含んでいた。
加えて、代替軽鎖融合物(図11参照)を、VpreBl遺伝子とλ5遺伝子か軽鎖定常ラムダドメインとで構成されたキメラタンパク質を設計することにより作り出した。具体的には、VpreB(配列番号1)からλ5タンパク質アミノ酸121−209(配列番号5)(配列番号10)までのアミノ酸1−87を含む組み換え的に融合されたタンパク質を産生した。加えて、VpreB(配列番号1)から抗体λ軽鎖定常(配列番号11)のC末端121アミノ酸までのアミノ酸1−87を含む第2の融合物を作成した。各代替軽鎖融合物を、基本的には上記で記載されたように、一時的に発現させ、収集し、精製し、ウェスタンブロット分析により試験した。特に、両方の融合物が、抗VpreB1抗ペプチド血清に対するエピトープを含んでいたので、これはウェスタンブロット分析に用いた。(図12、レーン5−6)
(実施例7)
E.coliにおける代替軽鎖構築物(SURROBODY(商標))の発現
組み換えタンパク質は、細菌中でしばしば有用に発現させられるので、原核生物系において可溶性代替軽鎖構築物を産生する能力を試験した。これに対処するため、図11において「二量体」と呼ばれる代替軽鎖融合を、E.coli発現/分泌系中でクローニングした。plac抑制発現系が用いられ、成熟哺乳動物タンパク質、原核生物リーダー配列への組み換え融合によりペリプラズムに発現および分泌された。具体的には、代替軽鎖融合物は、m13 gIIIリーダーコード配列(配列番号12および13)のC末端へ成熟タンパク質のコード配列を融合させることにより、ペリプラズムへ誘導した。重鎖は、IgGl重鎖可変領域および抗インフルエンザ抗体の重鎖定常領域ドメインを、pelBリーダー配列(配列番号14)のC末端に融合させることにより発現させた。両方のタンパク質を発現させるプラスミドを、HB2151 E.coli細胞(Stratagene)に形質変換し、100mcg/mlアンピシリンおよび200ミクロモルIPTGを含有するLB培地中で、30度で一晩発現させた。細胞を収集し、当該技術分野において知られている方法に従い、ペリプラズムライゼートを調製した。このペリプラズムライゼートを、ウェスタンブロット分析により直接試験、または上述のように精製した(図13、パネルA)。
代替軽鎖構築物(SURROBODY(商標))m13ファージミドの発現
組み換えタンパク質は、細菌においてだけでなく、個別におよび細菌ウイルス粒子の表面上の多様なライブラリーコレクションにおいて有用に発現されるので、本発明者らは、m13ファージミドの表面上に可溶性代替軽鎖構築物を産生したいと考えた。これに対処するため、代替軽鎖融合物(図11の「二量体」)を、E.coli発現/分泌系にクローニングした。すべての系について、上述のpLac抑制発現系を用いた。しかしながら、この場合、本発明者らは、E−タグエピトープ(GAPVPYPDPLEPR)(配列番号16)を代替軽鎖融合物、ならびに軽鎖制御タンパク質にも付加した。遺伝子III VpreBl−ラムダ5−E−タグ融合物(融合物1)および遺伝子III VpreBl−CI−Eタグ融合物(融合物2)の配列が、それぞれ配列番号12および13として示してある。重鎖構築物をm13ファージミドに固着するため、重鎖構築物を、可変重鎖およびガンマ定常重ドメイン1領域とインフレームでm13遺伝子III生成物により組み換え的にクローニングした。具体的には、組み換えタンパク質は、介在性のヘキサヒスチジンペプチド(配列番号34)、抗c−myc抗体(GEQKLISLEEDL)(配列番号17)のためのペプチドエピトープ、およびアンバー終止コドンを含んでいた。本発明者らは、抗ヒスチジンおよび抗E−捕獲ELISAにより、タンパク質発現および複合体形成の忠実度をそれぞれ調べた。
哺乳動物細胞中で発現された代替軽鎖構築物の抗原結合
代替軽鎖変異体が、ニッケルキレートクロマトグラフィーの後に容易に検出可能な複合体を形成すると思われたので、同族の重鎖パートナーの親抗原に結合するそれらの能力を試験した。一時的発現および精製は、上述の通り実行した。抗原結合を、ELlSAにより試験した。簡潔に言えば、マイクロタイターウェルを、不活性化したH5N1ベトナム12−3/04ウイルス製剤(USFDA−CBER、抗原基準)で塗布し、ブロックし、次に、定量した連続希釈精製タンパク質でインキュベートした。洗浄後、複合体を、抗ヒトFcペルオキシダーゼコンジュゲート抗体で検出した。最後に、結合を、TMB基質発色により、比色的に視覚化し、定量した(図15参照)。
E.coliにおいて発現された代替軽鎖構築物の抗原結合
代替軽鎖融合物が安定な複合体を形成すると思われたので、本発明者らは、抗インフルエンザ抗体からの重鎖と対にされたそのような融合物が抗体の同族ウイルスと結合するかどうかを確かめたいと考えた。結合について試験するため、ペリプラズムライゼートを、上述の通りに調製した。ライゼートを次に、本質的には上述の通りにELISA抗原結合に供したが、重鎖のC末端の付加されたヘキサヒスチジン(配列番号34)エピトープか、あるいは代替軽鎖融合物のC末端の付加されたE−タグかのどちらか一方に対するモノクロナール抗体を用いてポリクロナール親和性精製抗体を介して結合を検出した点が異なる。エピトープ検出は、抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲート抗体か抗ウサギペルオキシダーゼコンジュゲート抗体のどちらか一方により達成した。最後に、結合を、TMB基質発色により比色的に視覚化し、定量した。結果は、図17に示してある。
ファージディスプレイされた代替軽鎖構築物の抗原結合
異種系中で代替軽鎖変異体を作成することが可能であり、ファージディスプレイされたコレクションが将来のタンパク質発見および設計に望ましいので、本発明者らは、代替軽鎖変異体および/または融合物が、m13ファージの表面で遺伝子III−会合複合体として容易にディスプレイされるかどうかを決定したいと考えた。変異体(配列番号18−22)および前に記載された融合物(配列番号12および13)を、上述の通りに2つの抗インフルエンザ抗体重鎖(配列番号19および14)のどちらか一方と共に同時発現させ、結合は本質的に、同じく上述された条件に従った。簡潔に言えば、マイクロタイターウェルを、H5N1ベトナム1203/04ウイルスで塗布し、ファージミドを結合させ、次に洗浄し、抗m13ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体で直接検出した。結合は、TMBを用いて比色基質生成物形成に従って定量的に決定した。結果は、図18および19に示してある。
ファージ代替軽鎖構築物ライブラリー構築、選択、およびクロナールELlSA
抗原に結合した代替軽鎖構築物を発生および試験するため、組み合わせ抗体ライブラリーを用いた反復アプローチを使用した。簡潔に言えば、H5N1トリインフルエンザ生存者の骨髄から調製した組み合せ抗体ライブラリーを作成した。これらのライブラリーを、H5N1ウイルス血球凝集素タンパク質に対して2ラウンドの選択についてスクリーニングした。次に、ファージミドプラスミドを増幅および精製した。重鎖可変領域を制限消化によりこのプラスミド調製物から単離し、定常重ドメイン1と共にインフレームでクローニングして、ファージミドディスプレイのためのm13遺伝子IIIコートタンパク質への組み換えの融合を形成した。重要なことに、本発明者らは、VpreBlおよびラムダ5(SLC融合物1)(配列番号10)か、VpreBlおよび古典的なラムダ軽鎖(SLC融合物2)からの定常ラムダドメイン(配列番号11)かで構成される代替軽鎖融合物を同時発現させる2つの受容体プラスミドを用いた。融合物1ライブラリーが3.84×107の独立した形質転換体を産生したのに対し、融合物2ライブラリーは、7.8×107の形質転換体を産生した。両方のライブラリーを、2ラウンドを通して独立してスクリーニングし、両方ともバックグラウンド(融合物1=5×、融合物2=20×)に対し有意な濃縮を示し、この濃縮は第2のパンニングラウンドにおいて増大した(融合物1=97×、融合物2=48×)。
血清半減期を増大させる代替軽鎖融合物
in vivoの抗体断片の半減期は、その抗体断片が、すべての重鎖定常ドメインを含む元のままの完全な重鎖への融合の一部であって、安定な抗原結合断片を形成するのに必要なものではない場合に、大きく延長される。IgGの場合、このことは、ドメインCHl、CH2、およびCH3の包含を意味する。特に、CH2およびCH3がin vivoでこの効果の大部分を付与することが十分に確認されている。実際、異種タンパク質へのこれらのCH2およびCH3ドメインの融合は一般に、親分子と比較してこれらのキメラ分子の効力およびPK/PDを改善するのに十分である。同様に、VpreBおよびλ5の両方またはどちらか一方への機能的融合は、重鎖の定常ドメインとのこの会合により恩恵を受ける。
血球凝集素−結合代替軽鎖構築物の親和性決定
融合代替軽鎖構築物(SURROBODIES(商標)、図11参照)の親和性を決定するため、本発明者らは、E.coli中で様々なsurrobodyを過剰発現および精製し、それらを、重鎖が最初に同定された親Fabと比較した。親和性は、基本的に以下の通り、BioForte Octet上でのBio−Layer Interferometryにより決定した。最初に、100μgの精製血球凝集素タンパク質を、製造業者の取扱説明に従いPierce No−Weight PEO4ビオチン(cat#21329)を用いて20:1モル過剰でビオチニル化し、室温で1〜3時間、間欠的に撹拌しつつインキュベートし、次に、4Cで一晩インキュベートした。過剰ビオチンは、サイズ排除スピンカラムによって除去し、PBSに交換した。次に、HA結合代替軽鎖構築物およびFabを、Ni2+アフィニティークロマトグラフィーを用いてFPLCにより精製し、脱塩して過剰なイミダゾールを除去し、濃縮し、製造業者の取扱説明に従って実行する定量的軽鎖ELlSA(Bethel Labs,cat#E80−115−κ、およびE80−116−λ)により定量した。最後に、親和性を、一般に連続2倍希釈して15nM〜500nMである試料濃度の範囲を分析することにより決定した。試料を、HAタンパク質を塗布したバイオセンサーを用いて最高15分間インキュベートし、次に試料希釈剤中で最高1時間インキュベートした。これらのステップのすべては、1500 RPMでの試料プレート回転で行った。会合は、HA−塗布バイオセンサーによりFabインキュベーションの間に測定し、解離は、結合の後に試料希釈剤インキュベーションにおいて測定する。親和性は、以下の表に示してある。
Claims (22)
- 構築物であって、前記構築物は、
(1)λ5配列または抗体軽鎖配列のN末端に未変性VpreB配列のC末端を直接融合させた配列を含むポリペプチド、および
(2)抗体重鎖配列を含み、前記ポリペプチドは前記抗体重鎖配列にコンジュゲートされ、
前記構築物が、標的に結合することができ、
前記未変性VpreB配列は、配列番号1のVpreB1、配列番号2および3のVpreB2、配列番号4のVpreB3、配列番号8のVpreB1、ならびに、それらと少なくとも90%の配列同一性を有する、それらの断片からなる群より選択され、
前記λ5配列が、配列番号5のλ5、配列番号6のλ5様ポリペプチド、配列番号7のλ5、またはそれらと少なくとも90%の配列同一性を有するそれらの断片であり、
前記VpreB配列またはそれらと少なくとも90%の配列同一性を有するそれらの断片において、前記VpreB配列のC末端における非Ig様ユニーク尾部が部分的にまたは完全に除去されており、前記λ5配列またはそれらと少なくとも90%の配列同一性を有するそれらの断片において、前記λ5配列のN末端におけるユニーク尾部が部分的または完全に除去されており、
前記VpreB配列の前記λ5配列に対する融合は、それぞれ前記VpreB配列およびλ5のCDR3類似領域のどちらか一方の側でまたはそのどちらか一方の側から10アミノ酸残基以内の位置で起こり、前記VpreB配列のCDR3類似領域は、配列番号1に示すVpreB1配列のアミノ酸116〜126に対応し、そして、前記λ5配列のCDR3類似領域は配列番号5に示すλ5配列のアミノ酸82〜93に対応する、
前記VpreB配列の前記抗体軽鎖配列に対する融合は、配列番号11または13によって示されるVpreB1−古典的なλ軽鎖融合を含む、
構築物。 - VpreB1のアミノ酸20〜121とλ5のアミノ酸87〜105との融合物を含む、請求項1に記載の構築物。
- 異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項1に記載の構築物。
- 前記VpreB配列の前記λ5配列に対する融合物は、前記異種アミノ酸配列と共有結合する、請求項3に記載の構築物。
- 請求項3に記載の構築物であって、前記異種アミノ酸配列は、可変領域を含む抗体重鎖配列である、構築物。
- 前記抗体重鎖配列が、前記VpreB配列と前記λ5配列との融合物にペプチドリンカーまたは非共有結合的な会合のいずれかによってコンジュゲートされ、二量体複合体を形成する、請求項5に記載の構築物。
- 前記標的が、抗原である、請求項1に記載の構築物。
- 前記標的が、ウイルス抗原である、請求項1に記載の構築物。
- 前記標的が、インフルエンザAウイルスである、請求項8に記載の構築物。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の構築物のライブラリー。
- 前記ライブラリーのメンバーに付加されたまたは埋め込まれた少なくとも1つの付加的な機能性をさらに含み、ここで前記付加的な機能性は、付加的な抗体、ペプチドまたはポリペプチドの配列によって提供される、請求項10に記載のライブラリー。
- 前記付加的なポリペプチド配列が、受容体またはリガンド配列である、請求項11に記載のライブラリー。
- 前記付加的な抗体、ペプチド、またはポリペプチドの配列が、異なる抗体、ペプチド、またはポリペプチドライブラリーのメンバーである、請求項11に記載のライブラリー。
- 前記異なるポリペプチドライブラリーが、ランダムペプチド配列のライブラリーである、請求項13に記載のライブラリー。
- 前記ランダムペプチド配列の少なくともいくつかが、標的抗原への結合特異性を有する、請求項14に記載のライブラリー。
- ディスプレイの形態である、請求項10または11に記載のライブラリー。
- 前記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、DNAディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−DNA結合に基づくディスプレイ、およびミクロビーズディスプレイからなる群より選択される、請求項16に記載のライブラリー。
- 前記構築物は、1つ以上の標的に対して結合特異性を有する、請求項10に記載のライブラリー。
- 前記構築物は、請求項1〜9の構築物と同じ標的に対して結合特異性を有する、請求項18に記載のライブラリー。
- 前記構築物は、少なくとも2つの異なる標的に対して結合特異性を有する、請求項18に記載のライブラリー。
- 配列番号10のVpreB1−λ5融合物が可変領域を含む抗体重鎖配列にコンジュゲートしたものからなるポリペプチドを含むコンジュゲート。
- 配列番号12のVpreB1−λ5融合物が可変領域を含む抗体重鎖配列にコンジュゲートしたものからなるポリペプチドを含むコンジュゲート。
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