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WO2014116051A1 - 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리 및 이의 제조 방법 - Google Patents

단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리 및 이의 제조 방법 Download PDF

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WO2014116051A1
WO2014116051A1 PCT/KR2014/000697 KR2014000697W WO2014116051A1 WO 2014116051 A1 WO2014116051 A1 WO 2014116051A1 KR 2014000697 W KR2014000697 W KR 2014000697W WO 2014116051 A1 WO2014116051 A1 WO 2014116051A1
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WO
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library
protein
antibody
binding
domain protein
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/000697
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
송병두
윤지선
이송이
김혜인
최효정
최종립
Original Assignee
스크립스코리아 항체연구원
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Publication date
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    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a protein combination-based Fv library, a method for screening an antibody using the prepared Fv library, an Fv antibody screened by the screening method and a Fv library prepared by the method for preparing the Fv library. will be.
  • Antibodies are proteins produced by the stimulation of antigens in B cells (B lymphocytes) of white blood cells in the immune system. Upon encountering an antigen, the antibody recognizes the antigen through the receptors on the cell and binds through the receptor. Such antibodies are considered candidates for protein new drugs for the treatment of diseases, and various antibody libraries are prepared and screened from there to find functional antibodies of interest.
  • Such an antibody library uses genetic recombination technology, extracts a gene encoding an antibody protein from B cells present in the human body to produce an antibody gene library, and selects an antibody having a desired antigen binding specificity from this library.
  • Antibody library technology has revolutionized the fabrication of antibodies, including human antibodies.
  • the most prominent feature of the antibody immune response is that even if an antigen of any kind or shape enters the body from the outside, if the antigen is a foreign substance that is not identical to the components of the body, an antibody that specifically binds to the antigen is produced within a week.
  • Antibodies are made by B lymphocytes and one B lymphocyte produces only one type of antibody. Indeed, our bodies have numerous B lymphocytes, and each B lymphocyte expresses its own unique antigen-binding specificity in the cell membrane. In general, about 10 8 antigen-binding variants are known to exist in the human body. When the antigen invades, only B lymphocytes expressing the antibody specifically binding to the antigen rapidly proliferate and produce a large amount of the antibody.
  • antibody repertoire there are hundreds of millions of antibody diversity in the human body, which is referred to as antibody repertoire. Therefore, after obtaining a sufficient number of B lymphocytes from the human body by collecting blood, mRNA was isolated from these cells, and cDNA encoding the heavy and light chain variable regions of the antibody by RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) method. get, it is possible in a relatively simple manner can be secured in vitro in the human antibody repertoire in the form of a gene (invitro).
  • RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • the core of antibody library technology is the so-called genotype-phenotype linkage, in which a human antibody gene repertoire is expressed as a protein (or expressed as a display) while the gene encoding the antibody protein is linked through any medium.
  • a human antibody gene repertoire is expressed as a protein (or expressed as a display) while the gene encoding the antibody protein is linked through any medium.
  • an antibody binding to a specific antigen is selected from the antibody library and at the same time, a gene encoding the specific antibody is obtained.
  • a complete immunity is not required, and the antibody is expressed in the form of Fab of an antibody having an antigen-binding function or the heavy and light chain variable domains (V H and V L ) are linked by short peptide linkers of about 15 amino acids. It is expressed as an antibody fragment called a single-chain variable fragment (scFv).
  • the media used for genotype-phenotype linkage of such antibodies are classified into phage display, ribosome display, yeast display, etc. according to which surface of the medium is expressed.
  • the desired antigen-binding antibody can be obtained without induction of.
  • a large amount of know-how is required for the production of antibody libraries and antibody selection, and it is not easy to obtain high-affinity antibodies, and thus, antibody optimization processes such as affinity maturation are often performed after antibody screening.
  • the problem is that the function can not be analyzed immediately in mammalian cells (mammalian cells).
  • a therapeutic antibody it is necessary to select an antibody having an actual therapeutic function rather than simply binding to an antigen. Such a disadvantage has been a barrier to the development of a therapeutic antibody.
  • Phage display antibody libraries currently used most in antibody libraries are actually therapeutic antibodies produced by phage display technology, Humira, an anti-TNF-alpha human monoclonal antibody, which is currently commercially available for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • An ideal antibody library contains a huge variety of antibodies, allowing libraries to obtain high-affinity antibody clones with the desired antigen binding specificity at any time. To do this, a library with antibody diversity of about 10 10 to 10 11 needs to be produced. It is very difficult to produce a library of this size through antibody gene cloning, which is the most difficult task of constructing a phage display antibody library. That's a challenge.
  • phage itself acts as a toxic, there is a disadvantage that can not be immediately analyzed.
  • the biggest advantage of ribosome display is the cell-free system, which makes it possible to easily create a library large enough to theoretically produce a 10 13 size library, which is advantageous for the acquisition of high affinity antibodies (generally, antibody libraries).
  • high affinity antibodies generally, antibody libraries.
  • error-prone polymerase can be used to introduce mutations to artificially induce molecular evolution.
  • phage display technology is mainly used for the production of antibody libraries of naive origin due to toxicity and various experimental problems.
  • Yeast display technology has many technical limitations in creating antibody libraries with more than 10 9 diversity due to the insertion of recombinant vectors into S. cerevisiae strains and the large size of yeast cells. Mutant libraries of secured antigen-specific antibodies are prepared and used primarily for the selection of high affinity antibodies.
  • an antibody library is not a form in which all antibodies are separately stored, but in a mixture of all antibodies.
  • the limitation of such an antibody library is that it is practically impossible to select by function (activity) when selecting an antibody for a target substance antigen, and only an antibody selection based on binding to an antigen is possible.
  • Initial antibody candidates obtained in this process are screened for their function in the next step to select substantially functional antibodies. In this screening step, in most cases, antibodies that provide only good binding and no function are obtained in the initial antibody screening step. Therefore, new methods are needed to overcome the limitations of this sorting method. That is, the method of selecting the antibody by a function from the beginning is calculated
  • the existing library is a mixture of several antibodies, it is impossible to select each antibody by a function at a time.
  • One object of the present invention is to provide a method for preparing a variable fragment (Fv) library based on protein combinations.
  • Another object of the present invention is to provide a target Fv antibody screened by the above screening method.
  • Another object of the present invention is to provide a Fv library prepared by the method for producing a protein combination based Fv library.
  • the present invention provides a protein fragment based variable fragment (Fv) library and a method for producing the same.
  • the present invention provides a protein combination based Fv library comprising an Fv to which a V H domain protein and a V L domain protein are bound.
  • step (A) preparing a heavy chain variable region (V H ) domain protein and a light chain variable region (V L ) domain protein; And (b) binding the V H domain protein and the V L domain protein prepared in step (a) to prepare a protein fragment based variable fragment (Fv) library.
  • V H heavy chain variable region
  • V L light chain variable region
  • Figure 1 is a schematic diagram of the fusion protein of the target-LPETG-linker-Sortase and His tag of various lengths of the present invention.
  • A is a linker consisting of 7 amino acids
  • B is a linker consisting of 18 amino acids
  • C is a linker consisting of 20 amino acids.
  • Figure 2 is a diagram showing a pair-binding schematic diagram of the protein combination-based Fv library of the present invention.
  • A shows wild-type bonds
  • B disulfide bonds
  • C shows coiled-coil bonds.
  • Figure 3 is a schematic diagram of a simple protein purification process.
  • FIG. 4 shows the SDS-PAGE results of purified V L and V H mutants.
  • V H domain protein without a Flag tagged V H -G44C the N- terminal Flag tag Flag-V H -G44C which, N- terminal and the C- terminal Flag tag Flag-V H -G44C that Figure showing that the expression of Flag protein increases with the presence of Flag.
  • Figure 6 is a view showing the comparison of the expression and purification yield of recombinant proteins according to whether or not sortase fusion, Flag fusion.
  • FIG. 7 is a schematic diagram of an ELISA experimental method of V H -V L pair binding.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of ELISA experiment of V H -V L pair binding.
  • Figure 9 is a diagram showing the ELISA results of the Flag-V H and Flag-V L pair binding.
  • Figure 10 is a diagram showing the SDS-PAGE results of the V H and V L pair binding introduced cysteine mutations.
  • FIG. 11 is a diagram showing SDS-PAGE results showing that Flag-V H and Flag-V L pair bonds increase V H and V L pair bonds.
  • Figure 13 shows the results of MALDI-TOF analysis of V L , V H and assembled Fv wild type.
  • FIG. 14 shows MALDI-TOF analysis results of V L -Q100C, Flag-V H -G44C-Flag, and assembled Fv.
  • FIG. 15 shows MALDI-TOF analysis results of V L -IAALK3, Flag-V H -IAALE3-Flag, and assembled Fv.
  • Figure 16 shows the results of confirming the effect of the binding 4D5 Fv antibody on the proliferation of BT-474 by CCK8 assay (Dojjindo).
  • FIG. 17 shows the results of monitoring the binding profile of 4D5 IgG, V H domain, V L domain and binding Fv antibody on Her2 expressing cell surface in BT-474 cells by FACS.
  • V H CDR3 and V L CDR3 for CDR design shows the selection of V H CDR3 and V L CDR3 for CDR design.
  • 19 is a view showing the analysis of the high frequency, to introduce the V H CDR and V L CDR diversity.
  • 20 is a diagram illustrating a result of designing a library having diversity according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 21 is a diagram showing the results obtained by SEC-HPLC checking 25 Fvs constructed by the combination of 5 V H s and 5 V L s.
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of confirming the binding Fv prepared by 4D5 V H and five synthetic V L s by SEC-HPLC.
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of confirming the binding Fv prepared by 4D5 V H and five synthetic V L s by SEC-HPLC.
  • FIG. 24 shows the results of screening the mutual binding of individual Fv and 10 mixed antigens via alpha assay.
  • FIG. 25 is a diagram showing the results of secondary screening of mutual binding of individual antigens and Fvs that bind to mixed antigens.
  • FIG. 26 is a diagram showing an alpha assay result of Fv mainly binding to CSF1R.
  • FIG. 27 is a diagram showing the result of confirming the mutual binding by ELISA for Fv mainly binding to CSF1R as a result of alpha assay.
  • FIG. 28 shows the results of confirming the cross-linking of Fvs mainly binding to CSF1R through Western blot.
  • FIG. 29 shows alpha assay results of Fv binding to c-MET.
  • FIG. 30 is a diagram showing the result of confirming the mutual binding by ELISA for Fv mainly binding to c-MET as a result of alpha assay.
  • FIG. 31 shows the results of confirming the cross-linking of Fvs mainly binding to c-MET by Western blot.
  • variable fragment (Fv) library refers to a total collection of Fv's in which each of several Fv's having diversity is gathered.
  • Fv (variable fragment) refers to a heavy chain variable region (V H ) and a light chain variable region (V L ) as part of a fragment antigen binding region of an antibody. Consisting of a minimum of antibody fragments.
  • the variable fragment (Fv) library may be a protein combination based Fv library.
  • the protein combination-based Fv library manufacturing method of the present invention can be characterized in that the protein-based Fv library can be prepared by combining the purified and purified V H domain and the V L domain, respectively, outside the cell.
  • the Fv library may be characterized in that it is possible to test individual functions.
  • the individual functional test may perform the pre-screening step, or more preferably, the pre-screening step according to the target material binding, depending on the purpose according to the target material binding.
  • the existing library is a DNA-based library, and a number of expression and purification processes are required to express and isolate each antibody from DNA to protein, so that each antibody is not separated into the library individually.
  • Each antibody is present in a mixture in the library. Therefore, in order to test the function of the antibody, which is a protein, a step of purifying and separating the antibody into a protein is necessary, which is practically impossible as described above, through the step of primary screening through binding to a target substance such as an antigen. , Secondary screening was performed by functional test only for the antibody bound to the target substance.
  • the Fv library of the present invention can be separated individually, and thus can be prepared without missing a substantially functional Fv antibody by performing individual functional tests without pre-selection step according to primary selection, ie, binding of a target substance.
  • the Fv library may be an Fv library including a V H domain and a V L domain, but is based on a library prepared by a combination of a V H domain protein and a light chain variable region V L domain protein.
  • the antigen binding form of the antibody and the whole antibody including Fab ′, F (ab ′) 2, Fab, Fv and rIgG, to which the CH region, which is a fragment having F, may be included.
  • the antibody may also include recombinant single chain Fv fragments (scFv), bivalent or bispecific molecules, diabodies, triabodies, and tetrabodies. Bivalent and bispecific molecules are described, for example, in Kostelny et al. (1992, J.
  • the total antibody includes IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, and IgG is a subtype, including IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the Fab has one antigen binding site in a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain and a first constant region of the heavy chain (CH1).
  • F (ab ') 2 antibodies are produced by disulfide bonds of cysteine residues in the hinge region of Fab'.
  • Preparing the heavy chain variable region (V H ) domain protein and the light chain variable region (V L ) domain protein in step (a) is preferably a V H domain protein and V L It can be prepared by introducing the desired diversity into the domain protein. Diversity introduction can be performed by known mutation methods. In addition, the V H domain protein and the V L domain protein can be produced by a known method. Preparation of the Fv library consisting of the V H domain protein and the V L domain protein may be performed using a database including all tertiary structures of human proteins such as Protein Data Bank (PDB) and Structural Classification of Protein (SCOP).
  • PDB Protein Data Bank
  • SSP Structural Classification of Protein
  • V H and V L sequences can be designed by selecting V H and V L sequences from protein databases such as uniprot.org) and PRF / SEQDB (www.prf.or.jp).
  • V H and V L sequences may be supplemented by collection of human V H and V L sequences by direct sequencing of amplified V H and V L mRNAs from one or more individual donors.
  • Various combinations of domains can be considered for the design of the V H and V L domain proteins.
  • sequence selection only antibody domain sequences can be selected by known methods, excluding T cell receptors or other Ig sequences.
  • the PISEC server was selected using the HMMER program (Example 6).
  • V H domain protein and V L domain protein may be of human or non-human origin.
  • mutations may be introduced into the CDR (complementarity-determining resion) in the V H domain protein or the V L domain protein.
  • the CDR may be one or more selected from CDR1, CDR2, and CDR3, but is not limited thereto, and may be one, two, or three. More preferably, it may be CDR3, but a mutation may be introduced without limitation depending on the type of antibody of interest.
  • CDR1 and CDR2 were fixed and mutations were introduced into CDR3 to vary diversity (Example 8).
  • mutations may be introduced into the framework in the V H domain protein or V L domain protein.
  • step (b) which is a step of randomly combining the V H domain protein and the V L domain protein prepared in step (a) is performed by (i) binding between wild-type domains, and (ii) by introducing cysteine.
  • (I) to (iv) include known binding methods without limitation, and for example, may be performed by each of (i) to (iv) or one or more combinations.
  • the binding between the wild type domain may be performed by known pair binding between the wild type V H domain protein and the V L domain protein.
  • wild type binding was confirmed (Experimental Example 2).
  • the (ii) disulfide bond by cysteine introduction of a disulfide bond between the introduced cysteine in V H domain protein and V L domain protein by a known method introduced in the V H domain protein and V L domain protein each cysteine Pairing defects can be achieved.
  • disulfide bonds (twin bonds) were confirmed (Experimental Examples 1 to 4).
  • the coiled-coil binding by the coiled-coil domain fusion is introduced into the V H domain protein and V L domain protein by introducing a known coiled-coil domain to the coiled-coil bond V H domain protein and V L domain Pairing can be achieved between proteins.
  • Such coiled-coil domains can be obtained from known databases and the like, and described by Katja M. Arndt et al. (J. Mol. Biol. (2001) 312, 221-228) can be prepared by applying the method disclosed.
  • Jennifer R. et al. J. Biol. Chem. (2002) 277, 37272-37279
  • JR Litowski J. peptide Res.
  • the binding by the interaction between proteins is included without limitation the known interaction between the proteins, for example, a protein binding such as leucine-zipper such as JUN domain and FOS domain can be used. It may also include a variety of known interactions such as non-covalent interactions, engineered CH domains, engineered mutual binding aspects, and the like.
  • the binding of step (b) may be by random pairing or desired pairing.
  • the method for preparing a protein combination based Fv library may further include (c) placing the bound Fv in individual compartments each assigned a designated identification number.
  • the bound Fv may be by random pair-bonding or by the desired pair-bonding.
  • the library may be prepared according to a predetermined rule in which the V H domain and the V L domain in which each information is known do not overlap.
  • a pair-combination of known V H and V L is carried out, the combined Fv is separated, and distinguished from each other. In this case, the information of the V H and V L domains of the individual partitions to which the designated ID numbers are assigned can be confirmed by the ID numbers.
  • the Fv library of the present invention can be separated individually, it is possible to prepare a library placed in separate compartments.
  • Plates, test tubes, arrays, etc. may have individual compartments with ID numbers assigned to various known devices, but are not limited thereto.
  • the compartment may further include a buffer solution, protein stabilizer and the like.
  • the present invention comprises the steps of (a) preparing a protein combination-based Fv library prepared by the Fv library manufacturing method; And (b) individually functional testing for the desired property, feature or activity using the Fv library.
  • the Fv library preparation method is as described above.
  • the desired property, characteristic or activity may be proliferation, differentiation or cell death of cells.
  • the desired properties, characteristics, or activities may be achieved in protein-protein aggregation, improved protein stability, increased protein solubility, introduction of glycosylation sites, introduction of conjugation sites, reduction of immunogenicity, improvement of protein expression, antigen affinity. Increase, decrease in antigen affinity, change in binding affinity, change in immunogenicity, or improvement in specificity, etc., but the characteristics, characteristics, or activities are selected according to the purpose of the screener. It is not limited.
  • the method of screening may further comprise (c) identifying the ID number of the compartment in which the desired Fv antibody is left.
  • the method of screening comprises: (c) identifying the ID number of the compartment in which the desired Fv antibody is left; And (d) identifying the V H domain protein and the V L domain protein prior to the combination of the Fv antibodies in the identified ID number compartment.
  • the screening method comprises the steps of: (c) identifying the ID number of the compartment in which the desired Fv antibody is left; And (d) isolating the Fv antibody of the identified ID number compartment to identify the DNA sequence.
  • the Fv antibody in the compartment thus identified can be isolated to confirm the DNA sequence, so that only the desired Fv antibody can be amplified.
  • the present invention provides a desired Fv antibody screened by the above screening method.
  • the present invention provides a protein combination based Fv library prepared by the method for producing a protein combination based Fv library.
  • PCR conditions used in Example 1 of the present invention are as follows.
  • PCR mixtures consisted of 31.5 ⁇ l distilled water, 10 ⁇ l 5X PrimeSTAR buffer, 5 ⁇ l dNTP (2.5 mM), 1 ⁇ l forward primer (100 ⁇ M), 1 ⁇ l reverse primer (100 ⁇ M), 1 ⁇ l template (100 ng / ⁇ l), 0.5 ⁇ l of PrimeSTAR polymerase (2.5u / ⁇ l).
  • PCR conditions were carried out in 30 cycles of 10 seconds at 98 °C, 1 minute at 68 °C, the product was stored at 4 °C.
  • Each template was used by synthesizing BAP, sortase, and target sequence.
  • Specifically used primers are as follows.
  • primer 1_sfi (5'-ccgt ggcccaggcggcc GCA AGCAGC GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCC-3 ': SEQ ID NO: 1) or primer 1 (5'-ATGT CATATG GCA AGCAGC GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCC-3' : DNA sequence encoding BAP (biotin acceptor peptide) was amplified by PCR using SEQ ID NO: 2), and Primer 2 (5'-CTGCATTTCGTGCCACTCGATCTTCTGGGCCTCGAAGATGTCGTT-3 ': SEQ ID NO: 3).
  • Primer 5 (5'-CAG TAA GCT TCC CGA GAC CGG CGAT ATC CAG ATG ACT CAG AGC-3 ': SEQ ID NO: 6)
  • Primer 6 (5'-ACTCGAACCCGCCGTACGTTTTATCTCTACCTTTGT-3' and Template Target (V L ) was used to amplify the secondary DNA sequence encoding LPETG-target (V L ) by PCR.
  • linker (7a.a.) The DNA sequence encoding target-LPETG-linker (7a.a.) to which (GGSSRSS: SEQ ID NO: 9) is linked was amplified by PCR.
  • Primer 8 and Primer 10 (5'-GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC GGA TGA GCC GGT CTC GGG AAG AAG AT-3 ': SEQ ID NO: 14) and the PCR product target-LPETG DNA sequences encoding target-LPETG-linker (18a.a.) to which linker (18a.a.) (SSGGGGSGGGGGGSSRSS: SEQ ID NO: 10) was linked were amplified by PCR using -linker (7a.a.).
  • Primer 11 (5'-gag acc ggc ggt ggt tcc tct aga tct tcc cag gct aag ccg cag att-3 ': SEQ ID NO: 15) and primer 12 (5'-taat GC GGC CGC tta atgatggtgATGGTGATGATGATGATGGC-3': SEQ ID NO: 16 DNA sequence encoding linker (7a.a.)-SrtA (60-206) was amplified by PCR.
  • Linker (18a.a.) using primer 13 (5'-gtggttcctctagatcttcc TCG AAG GTC GCG GGA TAT ATT-3 ': SEQ ID NO: 17) and primer 14 (5'-taat ggccggcctggcc tta atgatggtgATGGTGATGATGATGATGGC-3': SEQ ID NO: 18).
  • DNA sequences encoding) -SrtA 60-206 were amplified by PCR.
  • Linker (20a.a.) (SSGGGGSGGGGGGSSRSSGS: SEQ ID NO: 11) is linked using primer 15 (5'-GGT TCC TCT AGA TCT TCC GGA AGC cag gct aag ccg cag att-3 ': SEQ ID NO: 19) and primer 14 DNA sequences encoding linker (20a.a.)-SrtA (60-206) were amplified by PCR.
  • target (V L ) -LPETG-Linker (7a.a.)-Sortase-H10 (FIG. 1A) was transferred to primer 8, primer 12 and the PCR product (target-LPETG-linker (7a.a.) And linker. (7a.a.)-SrtA) was used to amplify by overlapping PCR.
  • the gene encoding target (VL) -LPETG-Linker (18a.a.)-Sortase-H10 (FIG. 1B) was selected from primer 8, primer 14 and the PCR product (target-LPETG-linker (18a.a.) and linker. (18a.a.)-SrtA) was used to amplify by overlapping PCR.
  • the genes encoding target (VL) -LPETG-Linker (20a.a.)-Sortase-H10 are primers 8, primers 14 and the PCR product (target-LPETG-linker (18a.a.) and It was amplified by overlapping PCR using a mixture of linker (20a.a.)-SrtA).
  • the resulting DNA fragment was digested with Nde I and Not I and ligated with pET23a vector (Novagen), a vector expressing the fusion protein target-LPETG-other linker-Sortase-H10.
  • the fusion protein target-kLPETG-linker (20a.a.)-Sortase-H10 has a Hind III site between the target and the sequence encoding kLPETG-linker (20a.a.)-Sortase-H10. All gene constructs were then cleaved with Nde I and Hind III and ligated to pET23a -kLPETG-linker (20a.a.)-Sortase-H10 for expression.
  • the supernatant of the lysate was loaded into 5 ml Ni-NTA (GE) column and with 20-fold column volume buffer A (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 30 mM imidazole, and 5 mM BME). After washing, washed with 5-fold column volume of buffer B (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl). After washing, aliquote of protein-bound resin was equilibrated with cleavage buffer (Buffer B containing 5 mM CaCl 2 and 5 mM tri-Gly), and then reacted at 25 ° C. for 1 hour.
  • buffer A 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl
  • buffer B 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl
  • cleavage buffer Buffer B containing 5 mM CaCl 2 and 5 mM tri-Gly
  • Protein purity was analyzed by SDS-PAGE gel and the molecular weight of the protein was analyzed by MALDI-TOF mass spectroscopy (MS). Protein yield was quantified by UV analysis (# 280 nm) with calculated calculated values.
  • V H and V L of the Fv heterodimer were performed by mixing equal volume of V H and V L. Pairing conditions were reacted at room temperature for 1 hour by mixing 100 ⁇ g / ml of V H and 100 ⁇ g / ml of V L protein in 50 mM Tris (pH 8.0) buffer.
  • Assembled Fv was analyzed by ELISA, size exclusion chromatography, and the molecular weight of the protein was analyzed by MALDI-TOF MS. Fv assembled with disulfide bonds was also analyzed by SDS-PAGE gel and ELISA.
  • Microplates (Nunc, Maxisorp) were coated overnight at 4 ° C. with 300 ng of antigen (Erbb2) and capture antibody in carbonate / bicarbonate buffer (pH 9.6) overnight. After washing with PBS-T 0.05%, the plates were blocked with PBS-T containing 3% skimmed milk for 1 hour at 37 ° C. Granulated Fv (1-0.5 ⁇ g) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Plates were washed and reacted with 1: 2500 dilution of horseradish peroxidase-conjugated anti-HA or myc antibody in PBS-T containing 3% skimmed milk. The plates were allowed to react at 37 ° C. for 1 hour and after washing developed with TMB (Sigma) / peroxidase substrate solution. The reaction was stopped with 2 NH 2 S0 4 and the absorbance was read at 450 nm.
  • HPLC Size exclusion high performance liquid chromatography
  • variable domain region of the antibody structure in PDB entry 1Q9R all sequence data of PDB (non-rich sequence file pdbaanr available on our PISCES Web site) was retrieved with PSI-BLAST. Only sequences with 35% identity or greater and an E-value greater than 1.0 ⁇ 10 ⁇ 20 remained, leaving only the antibody domain (eg excluding T cell receptor and other Ig sequences). As a result, the heavy and light chain sequences were collected at 90% identity using a PISCES server. Multiple-sequence alignments of the heavy and light chain sequences were individually determined as CLUSTAL W, picked up according to the manual and edited.
  • HMM heavy- and light chain-specific hidden Markov models
  • the HMM profile is a statistical model of multiple-sequence alignment of the protein family including location-specific insertion probabilities. This makes it suitable for determining the location of CDRs that are at well-defined locations within variable domain sequences and that vary in length.
  • the HMM was used to search for pdbaa (a set of all protein sequences in the PDB, including redundancy) available on our PISCES server (http://dunbrack.fccc.edu/PISCES.php).
  • the cutoff values and E-values of the HMMER scores were chosen so that the heavy and light chain sequence scores of the antibodies were good to cutoff when searching for the pdbaa protein sequence.
  • the sequences found by both HMMs were assigned one with higher score and lower E-value.
  • ⁇ and ⁇ light chain scores are better than the cutoff of the light chain HMM. This HMM profile (one heavy chain and one ⁇ light chain) was used to identify the specific conserved framework locations before and after each CDR.
  • Flag-V H -linker-coiled coil-HA-Flag-LPETG-Linker (7, 18, 20 aa) -SrtA-His10 the following sequence was used.
  • V H (EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS: SEQ ID NO: 21GSSR, DRGSTK (SEGSE) was used.
  • Table 1 coiled-coli order SEQ ID NO: H1.winzipA1 TVAQLEEKVKTLRAQNYELKSRVQRLREQVAQLASEFEL 24 H2. winzipA2 TVAQLRERVKTLRAQNYELESEVQRLREQVAQLASEFEL 25 H3.
  • V L -linker-coiled coil-myc-LPETG-Linker (7, 18, 20 aa) -SrtA-His10 the following sequence was used.
  • V L (L-A43C or L-Q100C) -MYC-LPETG-linker (7, 18, 20 aa) -StrA-His10, incorporating a cysteine mutation, is identical to that above except for V L as shown in Table 4 below. Sequence was used.
  • sequence described in FIG. 4 obtained sequence information from BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). 3 and 4 were randomly mutated by introducing cysteine at the interface of the 4D5 (HERCEPTIN®) heavy and light chain variable regions for heterodimer formation.
  • the purification yield of V L in the non-fusion system was 10 mg / l and V H was 0.2 mg / l.
  • the purification yield increased approximately 3 to 6.5 times (FIG. 6).
  • the Flag tag is attached, it was confirmed that the expression rate increased by about 2 to 55 times (FIG. 6).
  • V H -HA tag and V L -myc tag were designed.
  • a pair of wild-type bonds (wt), 11 pairs of bonds by coiled-coil, and 4 pairs of bonds by disulfide bonds. was analyzed by ELISA method.
  • ELISA results of the V H -V L pair bonds are shown in FIG. 8. As a result, it was confirmed that both pair-binding is observed at a similar level when pairing with the antigen.
  • the wild type had no signal
  • V H winzipA1 / V L winzipB2 had low signal
  • V H winzipA2 / V during 11 pairs of binding by coiled-coil L winzipB2 had no signal.
  • V H G44C / V L Q100C confirmed the signal (FIG. 8, left bar: anti-HA / Fv / anti-myc HRP, right bar: Erbb2 / Fv / anti-myc HRP) Display).
  • V H and V L tagged with flags were designed, and a total of 12 pairs of bonds were analyzed by 8 pairs of coiled-coil bonds and 4 pairs of disulfide bonds by ELISA method. As a result, it was confirmed that both pair-binding is observed at a similar level when pairing with the antigen.
  • anti-HA-pairs-anti-myc HRP was performed without antigen, the signal of V H winzipA1 / V L winzipB1 and V H IAAL E3 / V L IAAL K3 was high and disulfide among 8 pairs of binding by coiled-coil.
  • binding was observed in other assays (SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS, etc.), but there was no signal in ELISA with low affinity (FIG. 9).
  • V H and V L Fv pair binding of V H and V L was confirmed by SDS-PAGE by the method of Example 4.
  • the V H -V L pair bonds by disulfide bonds formed through mutations that introduce cysteines into V L and V H are shown in FIG. 10.
  • V L -Q100C / V H -G44C, V L -A43C / V H -Q100C, and V L -A43C / V H -G44C form a heterodimer by a pair bond by disulfide bond ( 10).
  • V H -V L pair bonds by disulfide bonds of Flag-V H and V L which are tagged with Flag, respectively, are shown in FIG. 11. Indicated. As a result, V L k1-Q100C / FV H -G44C-F, V L k1-Q100C / FV H -G44C, and V L k1-Q100C / V H -G44C form heterodimers as pair bonds by disulfide bonds. And, it was confirmed that the production rate is increased (Fig. 11).
  • SEC-HPLC size exclusion chromatography
  • UV absorbance detector 280 nm, 210 nm
  • V H -HA tag and V L -myc tag tagged as Flag were analyzed by size exclusion chromatography method. Size exclusion chromatography results of V L -IAALK3, Flag-V H -IAALE3-Flag, and assembled Fv-binding are shown in FIG. 12. As a result, it was confirmed that the molecular weight was detected in the order of FV, Flag-V H -IAALE3-Flag, and V L -IAALK3 assembled in a high order.
  • the assembled Fv is the molecular weight as compared with the V H or V L
  • the magnitude shift was shown and confirmed to be detected at the initial time calculated. This is due to the high hydrophobicity that is known to characterize antibodies, making it difficult for V H or V L single domain antibodies to be size-exclusion chromatographed.
  • Most assembled Fvs are assembled with highly hydrophobic residues exposed on the surface of each single domain antibody. It was concealed and changed to hydrophilic and detected.
  • V L , V H and Fv wt are shown in FIG. 13, and the analysis results of V L -Q100C, Flag-V H -G44C-Flag and Fv are shown in FIG. 14, and V L -IAALK3 and Flag-V H -IAALE3.
  • the analysis results of -Flag and Fv are shown in FIG. 15.
  • V L and V H could be confirmed with respect to wt, respectively, and the molecular weight of Fv bound was not confirmed (FIG. 13).
  • the binding was confirmed by confirming the molecular weight of V L -Q100C (13.6 kDa), Flag-V H -G44C-Flag (16.2 kDa), Fv (29.8 kDa) (Fig. 14).
  • the molecular weights of V L -IAALK3 (18.6 kDa), Flag-V H -IAALE3-Flag (21.2 kDa), and Fv (39.8 kDa) were confirmed to confirm the binding (FIG. 15).
  • Functional combinatorial protein libraries prepared by pair binding of V H and V L proteins were designed with well known antigen-antibody conjugates. Natural immune repertoire can produce antibodies that essentially recognize any antigen with high specificity and affinity. Antigen recognition is mediated by six complementarity determining regions (CDRs) present on a large surface in contact with the antigen. The CDR sequences are hypervariable, but the overall composition of the functional CDRs gives a favorable bias against specific amino acid types.
  • Our library has limited functional diversity to a small subset of functional groups that are particularly suitable for mediating molecular recognition.
  • Our library was prepared by introducing high frequency sequences important for antigen-antibody complex formation into the heavy and light chain CDR3 in each of the key antibodies of each of the selected frameworks giving reliable folding and high expression yield.
  • V H3-66 and V LK3 were used as the framework. Most of the hetero dimers are HV3, HV1, HV4 and KV3 and KV1.
  • CDRs fixed the length of the CDRs appearing at high frequencies. Specifically, CDR H1 was fixed to 10 amino acids in length, CDR H2 in 10, CDR H3 in 11, CDR L1 in 11, CDR L2 in 7, and CDR L3 in 9 amino acids. Representative contents of high frequency CDR H3 and CDR L3 are shown in FIG. 18.
  • Ten antigens were selected for library screening, including CTLA4, 41BB, TRAL R1, cMET, TRALI R2, CD40, Frizzled receptor 7, CD30, IL-17R, CSF1-R, conjugated with Fc, 1 the mutual coupling between 10 mixed antigen with individual Fv by primary screening was confirmed as alpha assay (alpha assay, a mplified L uminescent P roximity H omogeneous a ssay), the mutual coupling of the individual antigens to been selected antibody, 2nd Screened.
  • the library screening procedure is shown in FIG. 23.
  • Alpha assay is a bead based proximity assay of donor beads and acceptor beads, where biotinylated antigens are captured by streptavidin coated beads. F V with myc-tag can bind to the anti-myc conjugated acceptor beads. Donor beads and acceptor beads are brought into proximity by antigen-FV interaction. The donor beads are excited at 680 nm as a result of singlet oxygen emission and the fluorescence signal amplified by the singlet oxygen emits light at the acceptor beads, thereby detecting the alpha signal.
  • FIG. 24 The results of screening the mutual binding of individual Fv and 10 mixed antigens via alpha assay are shown in FIG. 24.
  • the Y axis represents an alpha signal and the X axis represents 10,000 Fv screened.
  • Various antibodies were screened from high signal to low signal close to background.
  • FIG. 26 The alpha assay results of Fv's mainly binding to CSF1R are shown in FIG. 26. Referring to FIG. 26, various antibodies showing differences in alpha signals can be identified.
  • the present invention is a platform for the production of new Fv libraries that did not exist previously, in particular the time required for purification and screening through combination at the protein level of V H and V L rather than a combination of libraries at the existing DNA level. It is a technique that can provide a platform for the production of novel antibodies that can significantly reduce the cost. Due to such technical features, the therapeutic antibodies that function substantially can be screened by dramatically reducing the existing time and cost, as well as developing inhibitors, modulators, and the like, without limiting the target substance.

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Abstract

본 발명은 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리의 제조 방법, 상기 제조된 Fv 라이브러리를 이용한 목적 항체의 스크리닝 방법, 상기 스크리닝 방법에 의해 스크리닝된 Fv 항체 및 상기 Fv 라이브러리의 제조 방법에 의해서 제조된 Fv 라이브러리에 관한 것이다. 본 발명의 Fv 라이브러리는 단백질 조합 기반으로 제조되어 개별적 기능 검사가 가능할 뿐 아니라, 목적하는 항원이 없어도 원하는 Fv 항체를 선별할 수 있을 뿐 아니라, 기존의 DNA 기반의 라이브러리보다 단백질 정제 횟수가 획기적으로 줄어들어 비용 및 시간을 절감할 수 있다.

Description

단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리 및 이의 제조 방법
본 발명은 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리의 제조 방법, 상기 제조된 Fv 라이브러리를 이용한 목적 항체의 스크리닝 방법, 상기 스크리닝 방법에 의해 스크리닝된 Fv 항체 및 상기 Fv 라이브러리의 제조 방법에 의해서 제조된 Fv 라이브러리에 관한 것이다.
항체는 면역계 내의 백혈구의 B 세포(B 림프구)에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 단백질로서, 항원을 만나게 되면 세포에 있는 수용체를 통하여 항원을 인식하고 수용체를 통해 결합한다. 이와 같은 항체는 질병을 치료하기 위한 단백질 신약의 후보 물질로 여겨지고 있으며, 목적하고자 하는 기능적인 항체를 찾기 위해 다양한 항체 라이브러리를 제조하여 이로부터 스크리닝한다. 이와 같은 항체 라이브러리는 유전자 재조합 기술을 이용하는 것으로, 인간 체내에 존재하는 B 세포에서 항체 단백질을 코딩하는 유전자를 추출하여 항체 유전자 라이브러리를 제작하고, 이 라이브러리로부터 원하는 항원 결합 특이성을 지닌 항체를 선별한다. 항체 라이브러리 기술은 인간 항체 등 항체의 제작에 일대 혁신을 가져왔다. 항체 면역 반응의 가장 두드러진 특징은 외부로부터 어떤 종류, 혹은 모양의 항원이 체내에 침입하더라도 그 항원이 체내의 성분과 동일하지 않은 외래물질이라면 그 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 일주일 내에 만들어진다는 것이다. 항체는 B 림파구에 의해 만들어지고 하나의 B 림파구는 단 한 종류의 항체만을 생산한다. 실제로 우리 인체에는 수많은 B 림파구가 있고 각각의 B 림파구는 자신만의 독특한 항원 결합 특이성을 지닌 항체를 세포막에 발현하고 있는데, 일반적으로 약 108가지 정도의 항원 결합 다양성이 인체 내에 존재한다고 알려져 있다. 항원이 침입할 경우에는 이 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 발현하고 있는 B 림파구만이 빠르게 증식을 하면서 항체를 다량 생산하게 되며, 결과적으로 혈청 내에 이 특정 항체의 농도가 급격히 상승해 침입한 항원의 신속한 제거 기능을 수행하게 된다. 따라서 인체 내에는 수 억 종의 항체 다양성 (diversity)이 존재하고, 이러한 항체의 다양성을 항체 레퍼토리 (repertoire)라고 표현한다. 그러므로 인체로부터 충분한 숫자의 B 림파구를 채혈로 획득한 후, 이 세포에서 mRNA를 분리한 다음 RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 방법으로 항체 중사슬 및 경사슬의 가변영역을 코딩하는 cDNA를 얻으면, 비교적 간단한 방법으로 인체 내의 항체 레퍼토리를 유전자 형태로 시험관 내(invitro)에 확보할 수 있게 된다. 항체 라이브러리 기술의 핵심은 이러한 인간 항체 유전자 레퍼토리를 단백질로 발현함(혹은 디스플레이라고 표현)과 동시에 그 항체 단백질을 코딩하는 유전자가 어떠한 매체를 통해 연결되는, 이른바 유전형-표현형 연결(genotype-phenotype linkage)이며, 이를 통해 항체 라이브러리로부터 특정 항원과 결합하는 항체를 선별하고 동시에 그 특정 항체를 코딩하는 유전자를 획득하는 것이다. 이 때 완벽한 형태의 면역은 필요치 않으며, 항원 결합 기능을 지닌 항체의 Fab 형태로 발현하거나 혹은 중사슬 및 경사슬 가변 도메인(VH와 VL)이 약 15 아미노산의 짧은 펩타이드 연결자(linker)로 연결된 scFv(single-chain variable fragment)라고 명명된 항체 단편으로 발현한다. 이 때 이러한 항체의 유전형-표현형 연결(genotype-phenotype linkage)에 사용되는 매체를 어떤 매체의 표면에 발현시키는가에 따라 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 효모 디스플레이 등으로 구별되며, 항원을 투여하는 등의 면역 반응의 유도 없이 원하는 항원 결합성의 항체를 얻을 수 있다. 그러나, 항체라이브러리 제작 및 항체 선별에 많은 노하우가 필요하며, 고 친화도의 항체를 얻기 쉽지 않아서, 항체 선별 후 친화도 성숙 등 항체 최적화 과정을 수행하는 경우가 많고, 특히 1차 선별 시, 독성 등의 문제로 곧바로 포유동물 세포 (mammalian cell)에서 기능 분석을 할 수 없는 단점 등이 있다. 치료 항체의 경우에는 단순히 항원과의 결합이 아닌 실제 치료 기능이 있는 항체를 선별하여야 하므로 이와 같은 단점은 치료용 항체 개발에 장벽이 되어 왔다.
항체 라이브러리에서 현재 가장 많이 사용되고 있는 것은 파지 디스플레이 항체 라이브러리이며, 실제로 현재 상업화되어 있는 류마티스 관절염 치료제인 휴미라 (Humira, anti-TNF-alpha 인간 단클론 항체)가 파지 디스플레이 기술에 의해 제조된 치료용 항체이다. 이상적인 항체 라이브러리는 거대한 항체 다양성을 포함하고 있어 원하는 항원 결합 특이성을 지닌 고친화도의 항체 클론을 언제든지 획득할 수 있는 라이브러리이다. 이를 위해서는 약 1010 내지 1011 정도의 항체 다양성을 지닌 라이브러리를 제작해야 하는데, 항체 유전자 클로닝 작업을 통해 이러한 크기의 라이브러리를 제작하는 것은 매우 어려운 일이며, 바로 이 점이 파지 디스플레이 항체 라이브러리 제작의 가장 어려운 난제라고 할 수 있다. 또한, 파지 자체가 독성으로 작용하여 곧바로 기능 분석을 할 수 없다는 단점이 있다. 리보솜 디스플레이의 가장 큰 장점은 cell-free 시스템이므로 이론적으로 1013 크기의 라이브러리 제작이 가능할 정도로 거대한 크기의 라이브러리를 손쉽게 만들 수 있어 고친화도 항체(high affinity antibody)의 획득에 유리하며(일반적으로 항체 라이브러리의 크기가 클수록 라이브러리 내에 고친화도의 항체가 포함되어 있을 가능성이 높다), PCR 증폭과정이 있기 때문에 error-prone polymerase 등을 이용할 수 있어 분자 진화(molecular evolution)를 인위적으로 유도하기 위한 돌연변이의 도입이 매우 용이하나, 이 또한 독성 문제 및 여러 실험상의 문제점들로 인하여 실제의 경우 naive 기원의 항체 라이브러리의 제작에는 파지 디스플레이 기술을 주로 사용하고 있다. 효모 디스플레이 기술의 경우 재조합 벡터를 S. cerevisiae 균주에 삽입하는 과정과 효모 세포의 큰 크기로 인하여 109 이상의 다양성을 지닌 항체 라이브러리를 만드는데 많은 기술적 제한이 따르며, 따라서 선별 과정에서의 장점을 활용하여 이미 확보되어 있는 항원-특이적 항체의 돌연변이 라이브러리를 제작하고 이로부터 고친화도의 항체를 선별하는데 주로 사용한다.
그러나, 이와 같은 항체 라이브러리는 모든 항체들이 개별적으로 분리 보관하는 형태가 아니라 모든 항체들이 섞여 있는 형태이다. 이러한 항체 라이브러리가 갖는 한계는 목표 물질 항원에 대한 항체를 선별할 때 기능(활성)에 의한 선별이 현실적으로 불가능하고 오직 항원과의 결합에 근거한 항체 선별만이 가능한 단점이 있다. 이 과정에서 얻어진 초기 항체후보들은 다음 단계에서 기능 여부를 조사하여 실질적으로 기능을 갖는 항체를 선별한다. 이와 같은 선별단계에서 대부분의 경우 초기 항체 선별단계에서 결합만 잘하고 기능이 없는 항체들이 얻어지게 된다. 따라서, 이러한 선별 방법의 한계를 극복할 새로운 방법이 요구된다. 즉, 처음부터 기능에 의한 항체를 선별하는 방법이 요구되고 있다. 그러나, 기존의 라이브러리는 여러 항체들이 모두 섞여 있는 상태로, 한 번에 기능에 의한 각각의 항체 선별이 불가능하다. 따라서, 저분자화합물 라이브러리처럼 모든 항체들을 개별적으로 정제하여 보관하는 방법이 가능할 경우, 기능에 의한 선별이 가능해질 수 있다. 그러나 항체는 단백질이기 때문에 발현 및 정제 과정이 필요하며, 이를 통해 십 만개 또는 백 만개의 서로 다른 항체들의 라이브러리를 구축하는 것은 현실적으로 불가능하다. 즉, 기존의 방법은 라이브러리 다양성 (diversity)을 1,000,000으로 가정하면 1,000,000개의 단백질 정제가 필요하며, 다양성이 증가할수록 필요한 단백질 정제 횟수가 기하급수적으로 늘어나는 단점이 있다. 이는 기존의 라이브러리 기술은 벡터 내에서 DNA 수준으로 VH 및 VL을 조합하여 라이브러리를 제조하는 기술 (US8,178,320), DNA 수준에서 항체 중쇄 및 경쇄 라이브러리를 제조하는 기술 (US7,858,559) 등 다양한 라이브러리 제조 기술 등이 있으나, 모두 DNA 수준에서의 조합으로 각각 만족하는 diversity의 라이브러리를 제조하기 위해서는 그 수 만큼의 단백질의 정제가 필요하며, 기하급수적인 개수로 인하여 라이브러리에서 제조된 항체를 곧바로 기능 분석을 할 수 없으므로, 그 수를 줄이기 위해서 항원과의 결합을 통해 선별하여 기능 분석을 할 수 있는 개수를 줄이는 추가 step이 필요하며, 이와 같은 선별 중에서 진짜 중요한 항체를 누락시킬 수 있는 중대한 단점이 있었다. 특히, 기존의 라이브러리 제조 방법들은 DNA 수준에서의 조합으로 Fv를 발현해야 하므로, 다양성만큼의 단백질 정제가 필요하므로, 개별적으로 분리된 항체 라이브러리를 포기한 상태였다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 항체가 기능적으로 선별할 수 있도록 개별적으로 분리되어 있는 라이브러리를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 기존의 DNA 수준에서 조합하는 라이브러리 제조 기술들과 달리 라이브러리를 단백질 수준에서 제조한다는 착안을 통해, VH와 VL의 단백질 수준에서의 조합을 통하여 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리를 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 하나의 목적은 단백질 조합 기반의 Fv (variable fragment) 라이브러리의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리의 제조 방법에 의해 제조된 Fv 라이브러리를 이용하여 목적 항체를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 스크리닝하는 방법에 의해 스크리닝된 목적 Fv 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리의 제조 방법에 의해 제조된 Fv 라이브러리를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 단백질 조합 기반의 Fv (variable fragment) 라이브러리 및 이의 제조 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질이 결합된 Fv를 포함하는 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리를 제공한다.
또한, (a) 중쇄 가변 영역 (heavy chain variable region; VH) 도메인 단백질 및 경쇄 가변 영역 (light chain variable region; VL) 도메인 단백질을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질을 결합하는 단계를 포함하여 단백질 조합 기반의 Fv (variable fragment) 라이브러리를 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 표적-LPETG-다양한 길이의 링커-Sortase 및 His 태그의 융합 단백질의 모식도를 간단히 나타낸 도이다. (A)는 7개 아미노산으로 이루어진 링커, (B)는 18개 아미노산으로 이루어진 링커, (C)는 20개 아미노산으로 이루어진 링커이다.
도 2는 본 발명의 단백질 조합 기반의 Fv라이브러리의 쌍-결합 모식도를 나타낸 도이다. (A)는 야생형 결합, (B)는 이황화 결합, (C)는 coiled-coil 결합을 나타낸 도이다.
도 3은 간단한 단백질 정제 과정의 모식도를 나타낸 도이다.
도 4는 정제된 VL 및 VH 돌연변이의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 Flag 태그가 없는 VH 도메인 단백질인 VH-G44C, N-말단에 Flag 태그가 있는 Flag-VH-G44C, N-말단 및 C-말단에 Flag 태그가 있는 Flag-VH-G44C-Flag 단백질의 발현이 Flag 존재에 따라 증가하는 것을 나타낸 도이다.
도 6은 sortase 융합 여부, Flag 융합 여부에 따른 재조합 단백질의 발현 및 정제 수율을 비교하여 나타낸 도이다.
도 7은 VH-VL 쌍 결합의 ELISA 실험 방법의 모식도이다.
도 8은 VH-VL 쌍 결합의 ELISA 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 Flag-VH 및 Flag-VL 쌍 결합의 ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 시스테인 돌연변이가 도입된 VH 및 VL 쌍 결합의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 Flag-VH 및 Flag-VL 쌍 결합이 VH 및 VL 쌍 결합이 증가시킴을 나타낸 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 VL-IAALK3, Flag-VH-IAALE3-Flag 및 조립된 Fv의 SEC-HPLC 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 VL, VH 및 조립된 Fv 야생형의 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 VL-Q100C, Flag-VH-G44C-Flag, 및 조립된 Fv의 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 VL-IAALK3, Flag-VH-IAALE3-Flag, 및 조립된 Fv의 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 BT-474 세포 증식에 대한 결합 4D5 Fv 항체의 효과를 CCK8 assay (Dojjindo)를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 BT-474 세포에서 4D5 IgG, VH 도메인, VL 도메인 및 결합 Fv 항체의 Her2 발현 세포 표면에의 결합 프로필을 FACS를 통해 모니터링한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 CDR 디자인을 위한 VH CDR3 및 VL CDR3의 선택을 나타낸 도이다.
도 19은 VH CDR 및 VL CDR 다양성을 도입하기 위한, 고빈도 여부를 분석을 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명의 일실시예에 따라 다양성을 가지는 라이브러리를 디자인한 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 5 VHs와 5 VLs의 조합으로 구축된 25 Fvs를 SEC-HPLC로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 4D5 VH 와 5개의 합성 VLs에 의해 제조된 결합 Fv를 SEC-HPLC로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 라이브러리 스크리닝 과정을 나타낸 도이다.
도 24는 알파 어세이를 통해 개별 Fv와 10개의 혼합 항원의 상호 결합을 스크리닝한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 혼합된 항원에 결합하는 Fv들과 개별 항원의 상호 결합을 2차로 스크리닝한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 CSF1R에 주로 결합하는 Fv들의 알파 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 27은 알파 어세이 결과 CSF1R과 주로 결합하는 Fv들에 대한 상호결합을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 28은 알파 어세이 결과 CSF1R과 주로 결합하는 Fv들에 대한 상호결합을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 29는 c-MET에 결합하는 Fv들의 알파 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 30은 알파 어세이 결과 c-MET과 주로 결합하는 Fv들에 대한 상호결합을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 31은 알파 어세이 결과 c-MET과 주로 결합하는 Fv들에 대한 상호결합을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
본 발명의 용어 “Fv (variable fragment) 라이브러리”란 다양성(diversity)을 갖는 각각의 여러 Fv들이 모여있는 Fv들의 총 집합체를 의미한다. 본 발명의 용어 “Fv (variable fragment)”는 항체의 Fab (fragment antigen binding) 영역의 일부분으로 중쇄 가변 영역 (heavy chain variable region; VH) 및 경쇄 가변 영역 (light chain variable region; VL)으로 이루어진 부분으로 최소의 항체 단편을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 Fv (variable fragment) 라이브러리는 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리일 수 있다.
기존의 라이브러리는 항체의 다양성 (diversity)인 항체 유전자 레퍼토리 (antibody gene repertoires)를 만족하기 위하여 DNA 수준에서 조합이 이루어졌다. 일반적으로 항체는 B 림파구에 의해서 만들어지고 하나의 B 림파구는 단 한 종류의 항체만을 생산한다. 이에 인체 내에는 수많은 B 림파구가 존재하며, 각각의 B 림파구는 자신만의 독특한 항원 결합 특이성을 지닌 항체를 세포막에 발현하고 있으며, 일반적으로 약 108가지 정도의 항원 결합 다양성이 인체 내에 존재한다고 알려져 있다. 따라서, 인체 내에는 수억 종의 항체 다양성이 존재하고, 이러한 항체 다양성인 레퍼토리를 형성하기 위해서는 수억 개 조합의 DNA를 제조하고 이로부터 항체를 형성하여야 한다. 예를 들어, 108인 다양성을 가진 라이브러리를 제조하기 위해서는 100,000,000개의 DNA를 합성하고, 100,000,000번의 단백질 정제를 하여야 분리된 단백질 발현 항체 라이브러리를 제조할 수 있는 것으로, 이는 현실적으로 불가능에 가깝다. 그러나, 본 발명의 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리의 경우에는 VH 도메인 10,000개와 VL 도메인 10,000개 발현 및 정제. 즉, 단지 20,000개의 발현 및 정제를 통하여 분리된 Fv 라이브러리를 제조할 수 있다. 이와 같은 본 발명의 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리 제조 방법은 본 발명자들에 의해 최초로 개발된 것이다. 본 발명의 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리 제조 방법은 각각 분리 정제된 VH 도메인 및 VL 도메인을 세포 내가 아닌 세포 외에서 결합시켜서 원하는 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리를 제조할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게, 상기 Fv 라이브러리는 개별적 기능 검사가 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게, 상기 개별적 기능 검사는 목표 물질 결합에 따른 목적에 따라, 전-선별 단계를 수행하거나, 더 바람직하게는 목표 물질 결합에 따른 전-선별 단계를 수행하지 않을 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, 기존의 라이브러리는 DNA 기반의 라이브러리로서, 각각의 항체를 DNA로부터 단백질로 발현하여 분리하기에는 수많은 발현 및 정제 과정이 필요하여, 각각의 항체가 라이브러리 내에 개별적으로 분리되어 있지 않고, 각각의 항체가 라이브러리 내에 혼재해서 존재한다. 이에 단백질인 항체의 기능 검사를 하기 위해서는 항체를 단백질로 정제 분리하는 단계가 필요하며, 이는 앞서 설명한 바와 같이 실질적으로는 불가능하여, 항원과 같은 목표 물질과의 결합을 통해 1차 선별하는 단계를 통해, 목표 물질과 결합된 항체에 대해서만 기능 검사를 하여 2차 선별을 하였다. 그러나, 이와 같은 목표 물질과의 결합에 의해서 선별 시에는 실제 기능을 하는 항체를 놓칠 위험이 있다. 이에 본 발명의 Fv 라이브러리는 개별적 분리가 가능하여, 1차 선별, 즉 목표 물질 결합에 따른 전-선별 단계 없이 개별적 기능 검사를 수행하여 실질적으로 기능을 하는 Fv 항체를 놓치지 않고 제조할 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 Fv 라이브러리는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 Fv 라이브러리일 수 있으나, VH 도메인 단백질 및 경쇄 가변 영역 VL 도메인 단백질의 조합에 의해 제조되는 라이브러리 기반으로, 항원결합능력을 가지는 단편인 CH 영역이 결합된 Fab’, F(ab’)2, Fab, Fv 및 rIgG를 포함하는, 항체의 항원 결합 형태 및 전체 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체는 재조합 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함할 수 있다. 이가 및 양특이성 분자는 예를 들면, Kostelny 등 (1992, J. Immunol., 148:1547), Pack 및 Pluckthun (1992, Biochemistry, 31:1579), Hollinger 등 (1993, Supra), Gruber 등 (1994, J. Immunol., 5368), Zhu 등 (1997, Protein Sci., 6:781 등), Hu 등 (1996, Cancer Res., 56:3055), Adams 등 (1993, Cancer Res., 53:4026) 및 McCartney 등 (1995, Protein Eng., 8:301)에 기술되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab’는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab’)2 항체는 Fab’의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 이루면서 생성된다.
상기 (a) 단계인 중쇄 가변 영역 (heavy chain variable region; VH) 도메인 단백질 및 경쇄 가변 영역 (light chain variable region; VL) 도메인 단백질을 제조하는 단계는 바람직하게는 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질에 목적하는 다양성 (diversity)를 도입하여 제조될 수 있다. 다양성 도입은 공지의 돌연변이 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질은 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질로 이루어진 Fv 라이브러리의 제조는 PDB (Protein Data Bank), SCOP (Structural Classification of Protein)과 같은 인간 단백질의 3차 구조를 모두 포함하는 데이터 베이스를 사용하여 서열을 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 공지의 다양한 인간 또는 비인간 단백질의 서열이 알려진 다양한 데이터 베이스를 통하여 라이브러리 제조를 위한 단백질 서열을 선택할 수 있다. 또한, Kabat 항체 데이터베이스 (www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html)와 NCBI 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.nkh.gov)에서 입수가능한 공지된 가변부위 서열들 및 UniProt (www.ebi.uniprot.org)과 PRF/SEQDB (www.prf.or.jp) 같은 단백질 데이터베이스들로부터 VH 및 VL 서열을 선택하여 VH 및 VL 서열들의 라이브러리를 설계할 수 있다. 또한, 하나 이상의 개별 제공자들 (donors)로부터 증폭된 VH 및 VL mRNA의 직접 순서결정 (direct sequencing)에 의하여 인간 VH 및 VL 서열들의 수집에 의하여 이러한 것들을 보충할 수 있다. 도메인들의 다양한 조합들을 VH 및 VL 도메인 단백질의 설계를 위해 고려할 수 있다. 서열 선택에 있어서는 T 세포 수용체 또는 다른 Ig 서열을 제외하여 항체 도메인 서열만을 공지의 방법에 의해 선별할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 PISEC 서버에서 HMMER 프로그램을 이용하여 선택하였다 (실시예 6).
상기 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질은 인간 또는 비인간 유래일 수 있다.
바람직하게 상기 VH 도메인 단백질 또는 VL 도메인 단백질 내의 CDR (complementarity-determining resion)에 돌연변이가 도입될 수 있다. 상기 CDR은 CDR1, CDR2 및 CDR3에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 1종, 2종, 또는 3종일 수 있다. 더 바람직하게는 CDR3일 수 있으나, 목적하는 항체의 종류에 따라 제한 없이 돌연변이가 도입될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 CDR1 및 CDR2는 고정하고, CDR3에 돌연변이를 도입하여 다양성을 변화시켰다 (실시예 8).
바람직하게 상기 VH 도메인 단백질 또는 VL 도메인 단백질 내의 프레임워크 (Framework)에 돌연변이가 도입될 수 있다.
바람직하게 상기 (a) 단계에서 제조된 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질을 무작위적으로 결합하는 단계인 (b) 단계의 단백질 결합은 (i) 야생형 도메인간의 결합, (ii) 시스테인 도입에 의한 이황화 결합, (iii) coiled-coil 도메인 융합에 의한 coiled-coil 결합, (iv) 단백질 간 상호 작용에 의한 결합, 및 (v) 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 결합일 수 있다. 상기 (i) 내지 (iv)는 공지의 결합 방법을 제한 없이 포함하며, 그 예로 (i) 내지 (iv) 각각 또는 1종 이상의 조합에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게 상기 (i) 야생형 도메인 간의 결합은 야생형 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질 간의 공지된 쌍 결합에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 야생형 결합 (쌍 결합)을 확인하였다 (실험예 2).
바람직하게 상기 (ii) 시스테인 도입에 의한 이황화 결합은 공지의 방법에 의해 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질에 시스테인을 도입하여 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질 각각에 도입된 시스테인 간에 이황화 결합을 이루어 쌍 결함을 이룰 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 이황화 결합 (쌍 결합)을 확인하였다 (실험예 1 내지 4).
바람직하게 상기 (iii) coiled-coil 도메인 융합에 의한 coiled-coil 결합은 공지된 coiled-coil 도메인을 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질에 도입하여 coiled-coil 결합으로 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질 간에 쌍 결합을 이룰 수 있다. 이와 같은 coiled-coil 도메인은 공지된 데이터 베이스 등에서 얻을 수 있으며, Katja M. Arndt et al. (J. Mol. Biol. (2001) 312, 221-228)이 개시한 방법을 응용하여 제조할 수 있다. 또한, Jennifer R. et al.( J.Biol.Chem.(2002) 277, 37272-37279), J.R. Litowski (J. peptide Res.(2001) 58, 477-492), Jesus Fernandez-Rodriguez et al.(protein science(2012) 21, 511-591), Katja M. Arndt et al.(Structure(2002) 10, 1235-1248), Katja M. Arndt et al. (J.Biol.Chem.(2000) 295, 627-639) 등에 기재된 서열 등을 참조할 수 있으나, 일정한 규칙을 갖는 coiled-coil 도메인은 모두 포함되는 것으로, 상기 논문의 서열로 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 coiled-coil 결합에 의한 쌍 결합을 확인하였다 (실험예 1 내지 4).
바람직하게 상기 (iv) 단백질 간 상호 작용에 의한 결합은 공지된 단백질 간 상호 작용에 의한 결합은 제한 없이 포함되나, 그 예로 JUN 도메인 및 FOS 도메인 같은 루신-지퍼와 같은 단백질 결합을 이용할 수 있다. 또한, 비 공유 상호작용, 조작된 CH 도메인, 조작된 상호 결합 면 등 공지의 다양한 상호작용을 포함할 수 있다.
바람직하게 상기 (b) 단계의 결합은 무작위적인 쌍-결합 또는 목적하는 쌍-결합에 의한 것일 수 있다.
바람직하게, 상기 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리 제조 방법은 (c) 결합한 Fv를 각각 지정된 ID (identification) 번호가 부여된 개별 구획에 정치하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결합한 Fv는 무작위적인 쌍-결합 또는 목적하는 쌍-결합에 의한 것일 수 있다. 목적하는 쌍-결합의 경우 각각의 정보를 알고 있는 VH 도메인 및 VL 도메인이 중복되지 않은 일정의 규칙으로 라이브러리를 제조하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게 이와 같이 목적하는 쌍-결합의 경우 이미 알고 있는 VH 및 VL의 쌍-결합을 수행하고, 상기 결합된 Fv를 분리하고, 이를 구별하여 각각 지정된 ID 번호가 부여된 개별 구획에 정치하여, 각각 지정된 ID 번호가 부여된 개별 구획의 VH 및 VL 도메인의 정보를 ID 번호로 확인할 수 있다.
본 발명의 Fv 라이브러리는 개별적 분리가 가능하므로, 개별 구획에 정치된 라이브러리를 제조할 수 있다. 플레이트, 테스트 튜브, array 등 공지의 다양한 장치에 지정된 ID 번호가 부여된 개별 구획을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 상기 구획 내에는 완충 용액, 단백질 안정화제 등이 추가로 포함될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 상기 Fv 라이브러리 제조 방법으로 제조된 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 Fv 라이브러리를 사용하여 목적하는 특성, 특징 또는 활성에 대해 개별적 기능 검사하는 단계를 포함하는, 목적하는 Fv 항체를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
Fv 라이브러리 제조 방법은 상기에서 설명한 바와 같다.
바람직하게, 상기 목적하는 특성, 특징 또는 활성은 세포의 증식, 분화 또는 세포사일 수 있다. 또한, 목적하는 특성, 특징 또는 활성이 단백질-단백질 응집, 단백질 안정성의 향상, 증가된 단백질 가용성, 글리코실화 부위의 도입, 접합 부위의 도입, 면역원성의 감소, 단백질 발현의 향상, 항원 친화성에 있어서의 증가, 항원 친화성에 있어서의 감소, 결합 친화성에 있어서의 변화, 면역원성에 있어서의 변화, 또는 특이성의 향상 등일 수 있으나, 스크리닝하는 자의 목적에 따라 그 특성, 특징 또는 활성이 선택되는 것으로, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 상기 스크리닝하는 방법은 (c) 목적하는 Fv 항체가 정치된 구획의 ID 번호를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 스크링하는 방법은 (c) 목적하는 Fv 항체가 정치된 구획의 ID 번호를 확인하는 단계; 및 (d) 확인한 ID 번호의 구획의 Fv 항체의 조합 전 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이와 같이 확인한 구획의 Fv 항체의 조합 전 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인을 확인하여, 상기 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인이 조합된 목적하는 Fv 항체만을 증폭할 수 있다.
바람직하게, 상기 스크리닝하는 방법은 (c) 목적하는 Fv 항체가 정치된 구획의 ID 번호를 확인하는 단계; 및 (d) 확인한 ID 번호의 구획의 Fv 항체를 분리하여 DNA 서열을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이와 같이 확인한 구획의 Fv 항체를 분리하여 DNA 서열을 확인하여, 상기 목적하는 Fv 항체만을 증폭할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 스크리닝된 목적하는 Fv 항체를 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리의 제조 방법에 의해 제조된 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리를 제공한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 발현 벡터의 제조
1-1: BAP-sortase-LPETG-target(VL) 제조
본 발명의 실시예 1에서 사용된 PCR 조건은 다음과 같다.
PCR 혼합물은 31.5 ㎕의 증류수, 10 ㎕의 5X PrimeSTAR buffer,5 ㎕의 dNTP (2.5 mM), 1 ㎕의 정방향 프라이머 (100 μM), 1 ㎕의 역방향 프라이머 (100 μM), 1 ㎕의 주형 (100 ng/㎕), 0.5 ㎕의 PrimeSTAR polymerase (2.5u/㎕)로 구성하였다. PCR 조건은 98 ℃에서 10초, 68 ℃에서 1분을 30 사이클로 수행하고, 산물을 4 ℃에 보관하였다.
각 주형은 BAP, sortase, 표적 서열을 합성하여 사용하였다.
구체적으로 사용된 프라이머는 다음과 같다.
먼저, 프라이머 1_sfi (5’-ccgt ggcccaggcggcc GCA AGCAGC GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCC-3’: 서열번호 1) 또는 프라이머 1 (5’-ATGT CATATG GCA AGCAGC GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCC-3’: 서열번호 2), 및 프라이머 2 (5’- CTGCATTTCGTGCCACTCGATCTTCTGGGCCTCGAAGATGTCGTT-3’: 서열번호 3)를 이용하여 BAP (biotin acceptor peptide)를 코딩하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하였다.
프라이머 3 (5’-ATC GAG TGG CAC GAA ATG CAG GCT AAG CCG CAG ATT CCG-3’: 서열번호 4) 및 프라이머 4 (5’-GCCGGTCTCGGGAAGCTTCTTGACCTCGGTAGCGACAAA-3’: 서열번호 5)를 이용하여 SrtA (GenBank Accession No. AF162687)의 60 내지 206번째 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하였다.
프라이머 5 (5’-CAG TAA GCT TCC CGA GAC CGG CGAT ATC CAG ATG ACT CAG AGC-3’: 서열번호 6), 프라이머 6 (5’-ACTCGAACCCGCCGTACGTTTTATCTCTACCTTTGT-3’: 서열번호 7) 및 주형 표적 (VL)을 이용하여 LPETG-target (VL)을 코딩하는 2차 DNA 서열을 PCR로 증폭하였다.
그 후, 상기 3가지 PCR 산물을 함께 혼합한 후, 프라이머 1_sfi 또는 프라이머 1 및 프라이머 7 (5’-taat ggccggcctggcc GC GGC CGC TTAAAGATCTTCTTCACTAATTAACTT-3’: 서열번호 8)을 사용하여 SrtAc-LPETG 및 표적 (target)을 코딩하는 서열 사이에 HindIII site가 있는 융합 단백질인 BAP-SrtA-kLPETG-target(VL)을 코딩하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하였다.
결과로 나온 DNA 단편을 NdeI 및 NotI으로 절단하고, pET23a 벡터 (Novagen)에 라이게이션하고, SfiI으로 절단 후, 융합 단백질인 BAP-sortase-LPETG-target을 발현하는 벡터인 pCom3x으로 라이게이션하였다.
1-2: Target(VL)-kLPETG-다른 링커-Sortase-H10 제조
프라이머 8 (5’-ATGT CATATG GAC ATT CAG ATG ACA CAG AGT-3’: 서열번호 12) 및 프라이머 9 (5’-ggaaccaccgccggtctcgggaagAAGATCTTCTTCACTAATTAAC-3’: 서열번호 13)를 이용하여, linker(7a.a.) (GGSSRSS: 서열번호 9)가 연결된 target-LPETG-linker(7a.a.)를 코딩하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하였다.
프라이머 8 및 프라이머 10 (5’-GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC GGA TGA GCC GGT CTC GGG AAG AAG AT-3’: 서열번호 14) 및 상기 PCR 산물인 target-LPETG-linker(7a.a.)를 이용하여 linker(18a.a.) (SSGGGGSGGGGGGSSRSS: 서열번호 10)가 연결된 target-LPETG-linker(18a.a.)를 코딩하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하였다.
프라이머 11 (5’-gag acc ggc ggt ggt tcc tct aga tct tcc cag gct aag ccg cag att-3’: 서열번호 15) 및 프라이머 12 (5’-taat GC GGC CGC tta atgatggtgATGGTGATGATGATGATGGC-3’: 서열번호 16)를 이용하여 linker(7a.a.)-SrtA(60-206)를 코딩하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하였다.
프라이머 13 (5’-gtggttcctctagatcttcc TCG AAG GTC GCG GGA TAT ATT-3’: 서열번호 17) 및 프라이머 14 (5’-taat ggccggcctggcc tta atgatggtgATGGTGATGATGATGATGGC-3’: 서열번호 18)를 이용하여 linker(18a.a.)-SrtA(60-206)를 코딩하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하였다.
프라이머 15 (5’-GGT TCC TCT AGA TCT TCC GGA AGC cag gct aag ccg cag att-3’: 서열번호 19) 및 프라이머 14를 이용하여 linker(20a.a.) (SSGGGGSGGGGGGSSRSSGS: 서열번호 11)가 연결된 linker(20a.a.)-SrtA(60-206)를 코딩하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하였다.
마지막으로, target(VL)-LPETG-Linker(7a.a.)-Sortase-H10 (도 1A)을 프라이머 8, 프라이머 12 및 상기 PCR 산물 (target-LPETG-linker(7a.a.) 및 linker(7a.a.)-SrtA)의 혼합물을 이용하여 overlapping PCR로 증폭하였다.
target(VL)-LPETG-Linker(18a.a.)-Sortase-H10 (도 1B)을 코딩하는 유전자를 프라이머 8, 프라이머 14 및 상기 PCR 산물 (target-LPETG-linker(18a.a.) 및 linker(18a.a.)-SrtA)의 혼합물을 이용하여 overlapping PCR로 증폭하였다.
target(VL)-LPETG-Linker(20a.a.)-Sortase-H10 (도 1C)을 코딩하는 유전자를 프라이며 8, 프라이머 14 및 상기 PCR 산물 (target-LPETG-linker(18a.a.) 및 linker(20a.a.)-SrtA)의 혼합물을 이용하여 overlapping PCR로 증폭하였다.
결과로 나온 DNA 단편을 NdeI 및 NotI으로 절단하고, 융합 단백질인 target-LPETG-다른 링커-Sortase-H10을 발현하는 벡터인 pET23a 벡터 (Novagen)으로 라이게이션하였다.
융합 단백질인 target-kLPETG-linker(20a.a.)-Sortase-H10은 표적 및 kLPETG-linker(20a.a.)-Sortase-H10을 코딩하는 서열 사이에 HindIII site가 있다. 그 후, 발현을 위해서, 모든 유전자 작제물을 NdeI 및 HindIII로 절단하고, pET23a- kLPETG-linker(20a.a.)-Sortase-H10에 라이게이션하였다.
실시예 2: 수용성 발현 확인
모든 발현 실험은 E. coli Origami2(DE3)를 이용하여 수행하였다. 100 ㎎/ℓ의 암피실린 및 0.5% (w/v)의 글루코스를 포함하는 dYT 배지 (30 ㎖)에 단일 박테리아 콜로니를 접종하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. dYT medium (100 ㎎/ℓ의 암피실린, 50 mM K2HPO4) 0.3ℓ에 전 배양 (preculture)를 접종하고 37℃에서 배양하였다 (배플이 있는 1ℓ플라스크 (1ℓ flask with baffles, 200 rpm). OD600 값이 0.6일때 IPTG를 최종 농도 0.5 mM이 되도록 첨가하여 발현을 유도하였다. 배양을 18시간 동안 18℃에서 유지하였다. 세포를 원심분리로 수집하고 (10,000rpm, 10분, 4℃), 30 ㎖의 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 150 mM NaCl으로 현탁하고, 초음파 (sonication)로 파쇄하였다. 조추출을 원심분리하고 (10,000rpm, 30분, 4℃), 상등액을 0.2 mm 필터로 여과하고, 하기 실시예 3의 Ni FF 크로마토그래피에 직접 적용하였다.
실시예 3: Ni-NTA 정제
용해물의 상등액을 5 ㎖의 Ni-NTA (GE) 컬럼에 로딩하고, 20배 컬럼 부피의 버퍼 A (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 30 mM 이미다졸, 및 5mM BME)로 세척 후, 5배 컬럼 부피의 버퍼 B (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl)로 세척하였다. 세척 후, 단백질-결합 레진의 aliquote를 절단 버퍼 (5 mM CaCl2 및 5mM tri-Gly를 포함하는 버퍼 B)로 평형화시킨 후, 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
단백질 순도는 SDS-PAGE 겔로 분석하고, 단백질의 분자량은 MALDI-TOF MS (mass spectroscopy)로 분석하였다. 단백질 수율은 계산된 계산 값을 갖는 UV 분석 (＠280nm)으로 정량하였다.
실시예 4: VH 및 VL 도메인 항체의 쌍 결합
VH 및 VL의 Fv 헤테로다이머 (heterodimer)로의 도메인 결합 반응을 동일 부피의 VH 및 VL을 혼합하여 수행하였다. 쌍 결합 조건 (pairing condition)은 50 mM Tris (pH 8.0) 버퍼 내에 100 ㎍/㎖의 VH 및 100 ㎍/㎖의 VL 단백질을 혼합하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다.
본 발명의 VH 및 VL 도메인의 결합 방법은 야생형 간의 결합, 이황화 결합에 의한 결합, coiled-coil에 의한 결합으로, 각 결합 방법에 대한 모식도를 도 2에 나타냈다.
조립된 Fv (assembled Fv)를 ELISA, 크기 배제 크로마토그래피로 분석하고, 단백질의 분자량은 MALDI-TOF MS로 분석하였다. 또한, 이황화 결합으로 조립된 Fv를 SDS-PAGE 겔 및 ELISA로 분석하였다.
마이크로 플레이트 (Nunc, Maxisorp)를 밤새 carbonate/bicarbonate 버퍼 (pH 9.6) 내의 300 ng의 항원 (Erbb2) 및 포획 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBS-T 0.05%로 세척 후, 플레이트를 3% 스킴 밀크 (skimmed milk)를 포함하는 PBS-T로 1시간 동안 37℃에서 블로킹하였다. 조립된 Fv (1~0.5 ㎍)를 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 플레이트를 세척하고, 3% 스킴 밀크 (skimmed milk)를 포함하는 PBS-T 내의 horseradish peroxidase-conjugated anti-HA 또는 myc 항체를 1:2500 희석하여 반응시켰다. 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 반응시키고, 세척 후 TMB (Sigma)/peroxidase 기질 용액으로 발색시켰다. 상기 반응을 2 N H2S04으로 멈추고, 450 nm에서 흡광도를 읽었다.
실시예 5: HPLC 분석
다이오드 어레이 검출기를 가진 Aglient 1260 시리즈 HPLC 시스템으로 크기 배제 HPLC (high performance liquid chromatography)를 수행하였다. 컬럼 (7.80 X 300 mm BioSep-SEC-s2000)은 Phenomenex로부터 구입하였다. 50mM KH2PO4, 100mM KCl (pH6.5)를 이동상으로 사용하였다.
실시예 6: 항체 서열의 수집
PDB entry 1Q9R 내의 항체 구조의 가변 도메인 영역 (variable domain region)을 이용하여, PSI-BLAST로 PDB (본 발명자들의 PISCES Web site 상에서 이용가능한 비-풍부 서열 파일 pdbaanr)의 모든 서열 데이터를 검색하였다. 35％ 동일성 (identity) 이상 및 E-value가 1.0 × 10-20 보다 좋은 서열만 유지하여, 단지 항체 도메인만 남겼다 (예를 들어, T 세포 수용체 및 다른 Ig 서열을 제외함). 결과적으로 중쇄 및 경쇄 서열을 PISCES 서버를 이용하여 90％ 동일성에서 골라 모았다. 중쇄 서열 및 경쇄 서열의 multiple-sequence alignment를 개별적으로 CLUSTAL W로 결정하고, 매뉴얼대로 골라 모으고, 편집하였다. 상기 alignment는 그 후, HMMER프로그램을 이용하여, 중쇄-특이적 및 경쇄-특이적 hidden Markov 모델 (HMM)을 만드는데 사용하였다. HMM 프로파일은 위치-특이적 삽입 확률을 포함하는 단백질 패밀리의 multiple-sequence alignment의 통계적 모델이다. 이는 가변 도메인 서열 내에 잘 결정된 위치에 있고 길이가 다양한 CDR의 위치를 결정하는 데 적합하게 만든다. 상기 HMM은 본 발명자들의 PISCES 서버 (http://dunbrack.fccc.edu/PISCES.php)에서 이용가능한 pdbaa (풍부함 (redundncy)를 포함한, PDB 내의 모든 단백질 서열의 세트)를 검색하는 데 사용하였다. HMMER 스코어의 cutoff 값 및 E-value는 pdbaa 단백질 서열을 검색할 때 단지 항체의 중쇄 및 경쇄 서열 스코어가 cutoff가 좋도록 선택하였다. 양 HMM에 의해 찾은 서열을 더 높은 스코어 및 더 낮은 E-value인 하나로 할당하였다. κ 및 λ 경쇄 스코어는 경쇄 HMM의 cutoff 보다 좋다. 이러한 HMM 프로파일 (하나는 중쇄 및 하나는 λ 경쇄임)은 각 CDR의 앞 뒤로 특이적인 보존 프레임워크 (conserved framework) 위치를 확인하는데 사용하였다.
실시예 7: CDR 분석
재배열된 항체 VH 및 VL 서열의 정렬된 수집은 CDR 길이 및 조성의 분석에 사용하였다. 각 alignment 내의 CDR은 CDR 길이에 따라 그룹으로 분류하였다. 개별적 그룹은 Chothia et al. (Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989; 342:877-883)에 기재된 규칙에 따라 표준 구조 (canonical structure)로 분류하였다. 모든 분석은 엑셀을 이용하여 수행하였다.
실시예 8: 단백질 조합에 의한 효과적인 Fv 항체형성 및 활성검증
잘 알려진 HERCEPTIN을 모델로 하여 VH 및 VL 단백질을 이용하여 다양한 변이체를 도입하여 단백질 조합에 의한 효율적인 Fv항체 형성 및 활성 검증을 확인 하였다.
실험예 1: 융합 단백질의 자가 절단에 의한 간단 정제 확인
상기 실시예 1 내지 3의 방법에 의해 간단하게 융합 단백질에서 표적 단백질인 VH 도메인 또는 VL 도메인을 분리할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, Flag-VH-linker-coiled coil-HA-Flag-LPETG-Linker(7, 18, 20 a.a.)-SrtA-His10의 경우, 다음과 같은 서열을 사용하였다.
Flag (DYKD: 서열번호 20), VH (EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS: 서열번호 21), Linker (SLEGTGGTSGSTSGTGGSSRSSST: 서열번호 22), HA (YPYDVPDYAK: 서열번호 23)를 사용하고, coiled-coil은 하기 표 1에 기재된 서열을 사용하였다.
표 1
coiled-coli 서열 서열번호
H1.winzipA1 TVAQLEEKVKTLRAQNYELKSRVQRLREQVAQLASEFEL 24
H2. winzipA2 TVAQLRERVKTLRAQNYELESEVQRLREQVAQLASEFEL 25
H3. Vel A1 TVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLASEFEL 26
H4.Max TMRRKNDTHQQDIDDLKRQNALLEQQVRALASEFEL 27
H5. EE1234L TLEIEAAFLEQENTALETEVAELEQEVQRLENIVSQYETRYGPLGGASEFEL 28
H6.VSAL E5 TEVSALKEKVSALEKEVSALKEKVSALEKEVSALEKGGASEFEL 29
H7.VSAL E3ox TCGGEVSALEKEVSALEKEVSALEKASEFEL 30
H8. IAALE3 TEIAALEKEIAALEKEIAALEKASEFEL 31
구체적으로, VL-linker-coiled coil-myc-LPETG-Linker(7, 18, 20 a.a.)-SrtA-His10의 경우, 다음과 같은 서열을 사용하였다.
VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK: 서열번호 32), linker (ALEGTGSSTGSSTGPGGSSRSSST: 서열번호 33), myc (EQKLISEEDLKLPET: 서열번호 34)를 사용하고, coiled-coil은 하기 표 2에 기재된 서열을 사용하였다.
표 2
coiled-coli 서열 서열번호
L1.wizipB1 SVDELQAEVDQLQDENYALKTKVAQLRKKVEKLASEFEL 35
L2.winzipB2 GPGGSSRSSSTSVDELKAEVDQLQDQNYALRTKVAQLRKEVEKLSEEFEL 36
L3. Vel B1 GPGGSSRSSSTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLASEFEL 37
L4. myc GPGGSSRSSSTSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLASEFEL 38
L5. RR1234L GPGGSSRSSSTSKGGGLEIRAAFLRRRNTALRTRVAELRQRVQRLRNIVSQYETRYGPASFEEL 39
L6. VSAL K5 GPGGSSRSSSTKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGGEFEL 40
L7. VSAL k3ox GPGGSSRSSSTCGGKVSALKEKVSALKEKVSALKEGGEFEL 41
L8.IAAL K3 GPGGSSRSSSTSKIAALKEKIAALKEKIAALKEASEFEL 42
시스테인 돌연변이를 도입한, Flag-VH(H-G44C 또는 H-Q105C)-HA-Flag-LPETG-linker (7, 18, 20 a.a.)-StrA-His10의 서열은 하기 표 3에 기재한 VH 이외에는 상기와 동일한 서열을 사용하였다.
표 3
CYSMUTANTS 서열 서열번호
C1. H-G44C EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSYPYDVPDYA 43
C2. H-Q105C EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGCGT LVTVSSYPYDVPDYA 44
시스테인 돌연변이를 도입한, VL(L-A43C 또는 L-Q100C)-MYC-LPETG-linker (7, 18, 20 a.a.)-StrA-His10의 서열은 하기 표 4에 기재한 VL 이외에는 상기와 동일한 서열을 사용하였다.
표 4
CYS MUTANTS 서열 서열번호
C3. L-A43C DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKCPKLLIY SASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKEQKLISEEDL 45
C4. L-Q100C DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIKEQKLISEEDL 46
이와 같은 간단 정제 방법은 도 3에 간단히 모식화하였다.
도 3의 방법에 의해 정제된 VL 및 VH의 SDS-PAGE 결과를 도 4에 나타냈다. 또한, 도 5에 Flag 태그에 의한 정제 수율을 나타냈다. 이와 같은 결과를 도 6에 정리하였다.
상기 도 4에 기재된 서열은 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 서열 정보를 수득하였다. 도 3과 4의 서열은 헤테로다이머 형성을 위해 4D5 (HERCEPTIN®) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 interface에 시스테인을 도입하여 임의로 돌연변이를 하였다.
그 결과, 상기 비-융합 시스템 (non-fusion system)에서의 VL의 정제 수율은 10 ㎎/ℓ이고, VH는 0.2 ㎎/ℓ이었다. 이에, 정제 방법의 단순화를 위해서 본 발명자들이 고안한 Sortase 융합 방법에 의한 결과, 정제 수율이 대략 3~6.5 배가 증가한 것을 확인하였다 (도 6). 또한, Flag 태그를 단 경우에, 발현율이 약 2~55 배 증가한 것을 확인하였다 (도 6).
실험예 2: ELISA 분석을 통한 단백질 수준에서 VH-VL 쌍 결합 확인
상기 실시예 4의 방법으로 VH 및 VL의 Fv 쌍 결합을 ELISA로 확인하였다. 이와 같은 ELISA 방법의 간단한 모식도를 도 7에 나타냈다.
구체적으로 VH-HA tag 및 VL-myc tag로 디자인하였고, 1쌍의 야생형 결합 (wt), coiled-coil에 의한 11쌍의 결합, 이황화 결합에 의한 4쌍의 결합으로 총 16쌍의 결합을 ELISA 방법으로 분석하였다. VH-VL 쌍 결합의 ELISA 결과를 도 8에 나타냈다. 그 결과, 항원과 함께 쌍 결합 시 모두 쌍-결합이 비슷한 수준에서 관찰되는 것을 확인하였다. 항원 없이 anti-HA-pairs-anti-myc HRP로 진행하였을 때, 야생형은 시그널이 없고, coiled-coil에 의한 11쌍의 결합 중 VH winzipA1/VL winzipB2는 시그널이 낮고, VH winzipA2/VL winzipB2은 시그널이 없었다. 이황화 결합에 의한 4쌍의 결합 중에는 VH G44C/VL Q100C만 시그널을 확인하였다 (도 8, 좌측 막대: anti-HA/Fv/anti-myc HRP, 우측 막대: Erbb2/Fv/anti-myc HRP 표시).
아울러, Flag로 태그된 VH 및 VL을 디자인하였고, coiled-coil에 의한 8쌍의 결합, 이황화 결합에 의한 4쌍의 결합으로 총 12쌍의 결합을 ELISA 방법으로 분석하였다. 그 결과, 항원과 함께 쌍 결합 시 모두 쌍-결합이 비슷한 수준에서 관찰되는 것을 확인하였다. 항원 없이 anti-HA-pairs-anti-myc HRP로 진행하였을 때, coiled-coil에 의한 8쌍의 결합 중 VH winzipA1/VL winzipB1과 VH IAAL E3/VL IAAL K3의 시그널이 높고, 이황화 결합에 의한 4쌍의 결합 중에는 다른 분석(SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS등)에서는 쌍-결합이 관찰되었으나 낮은 친화도로 ELISA에서 시그널이 없었다 (도 9).
상기와 같은 결과는 본 발명의 단백질 VH 및 VL 도메인이 무작위적으로 쌍-결합을 통하여 다양한 다양성을 부여하는 Fv 라이브러리를 제조할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
실험예 3: SDS-PAGE 분석을 통한 단백질 수준에서 VH-VL 쌍 결합 확인
상기 실시예 4의 방법으로 VH 및 VL의 Fv 쌍 결합을 SDS-PAGE로 확인하였다. VL 및 VH에 시스테인을 도입하는 돌연변이를 통해 형성된 이황화 결합에 의한 VH-VL 쌍 결합을 도 10에 나타냈다. 그 결과, VL-Q100C/VH-G44C, VL-A43C/VH-Q100C, 및 VL-A43C/VH-G44C가 이황화 결합에 의한 쌍 결합으로 헤테로다이머를 형성하는 것을 확인하였다 (도 10).
또한, VL 및 VH에 시스테인을 도입하는 돌연변이를 통해 형성된 이황화 결합 중, 각각 Flag 태그를 부착한, Flag-VH 및 VL의 이황화 결합에 의한 VH-VL 쌍 결합을 도 11에 나타냈다. 그 결과, VLk1-Q100C/F-VH-G44C-F, VLk1-Q100C/F-VH-G44C, 및 VLk1-Q100C/VH-G44C가 이황화 결합에 의한 쌍 결합으로 헤테로 다이머를 형성하며, 생산율이 증가하는 것을 확인하였다 (도 11).
상기와 같은 결과는 본 발명의 단백질 VH 및 VL 도메인이 무작위적으로 쌍-결합을 통하여 다양한 다양성을 부여하는 Fv 라이브러리를 제조할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
실험예 4: SEC-HPLC 분석을 통한 단백질 수준에서 VH-VL 쌍 결합 확인
상기 실시예 4 및 5의 방법으로 VH 및 VL의 Fv 쌍 결합을 크기배제크로마토그래피 (SEC-HPLC)로 확인하였다. SEC-HPLC의 조건은 다음과 같다:
컬럼: 7.80×300 mm BioSep-SEC-s2000
이동상: PBS, pH 7.4
컬럼 flow rate: 0.5 ㎖/min
컬럼 온도: 25 ℃
UV 흡광도 검출기: 280 nm, 210 nm
주입 부피 (Injection volume): 100 ㎕
VL-IAALK3, Flag-VH-IAALE3-Flag 및 조립된 Fv의 크기배제크로마토그래피 결과를 도 12에 나타냈다.
구체적으로 Flag로 태그된 VH-HA tag 및 VL-myc tag로 디자인하였고, 1쌍의 야생형 결합 (wt), coiled-coil에 의한 11쌍의 결합, 이황화 결합에 의한 4쌍의 결합으로 총 16쌍의 결합을 크기배제크로마토그래피 방법으로 분석하였다. VL-IAALK3, Flag-VH-IAALE3-Flag 및 조립된 Fv결합의 크기배제크로마토그래피 결과를 도 12에 나타냈다. 그 결과, 분자량이 큰 순서로 조립된 FV, Flag-VH-IAALE3-Flag, VL-IAALK3의 순서로 검출되는 것을 확인하였다.
야생형을 포함하여 VL-IAALK3, Flag-VH-IAALE3-Flag 및 조립된 Fv결합 이외의 결과에서는 VH 혹은 VL이 검출되지 않았고, 조립된 Fv는 VH 혹은 VL에 비교하여 분자량의 크기 이동을 보이며, 계산되는 초기 시간에 검출되는 것을 확인하였다. 이는 항체의 특징으로 알려진 높은 소수성으로 인해 VH 혹은 VL 단일 도메인 항체는 크기배제크로마토그래피 분석이 어려웠고, 대부분의 조립된 Fv는 각 단일 도메인 항체의 표면에 노출된 소수성이 높은 잔기들이 조립된 Fv에 의해 감추어 지면서 친수성으로 변하여 검출이 되어졌다.
상기와 같은 결과는 본 발명의 단백질 VH 및 VL 도메인이 쌍-결합을 통하여 다양한 다양성을 부여하는 Fv 라이브러리를 제조할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
실험예 5: MALDI-TOF MS분석을 통한 VH-VL 쌍 결합 분자량 분석
상기 실시예 4 및 5의 방법으로 VH 및 VL의 Fv 쌍 결합의 분자량을 MALDI-TOF MS로 분석하였다.
VL, VH 및 Fv wt의 분석결과를 도 13에, VL-Q100C, Flag-VH-G44C-Flag 및 Fv의 분석 결과를 도 14에, VL-IAALK3, Flag-VH-IAALE3-Flag 및 Fv의 분석 결과를 도 15에 나타냈다.
그 결과 wt에 대해 각각 VL 및 VH의 분자량을 정확히 확인할 수 있었고, 결합된 Fv의 분자량은 확인되지 않았다 (도 13). VL-Q100C(13.6kDa), Flag-VH-G44C-Flag (16.2kDa), Fv(29.8kDa)의 분자량을 확인하여 결합을 확인할 수 있었다 (도 14). VL-IAALK3 (18.6kDa), Flag-VH-IAALE3-Flag (21.2kDa), Fv(39.8kDa)의 분자량이 확인하여 결합을 확인할 수 있었다 (도 15).
실험예 6: 세포수준에서 조립된 Fv의 활성 검증
BT-474 세포 증식에 대한 결합 4D5 Fv 항체의 효과를 CCK8 어세이 (Dojjindo)를 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16을 참조하면, 인간 유방암 세포 BT-474는 세포 표면에서 HER-2를 과발현하며, 결합된 4D5 FV에 의해 4D5 IgG 항체에 의해 감소된 것과 유사한 정도로 BT-474의 성장이 감소되었음을 확인할 수 있다.
간접 면역형광체 라벨링 후에 4D5 IgG과 FITC-conjugated anti-human-Fc를 차례로 사용하여 FACS를 통해, 세포 표면에서 Her2 발현 수준을 확인하였다. VH 도메인, VL 도메인 및 결합 Fv 항체의 BT-474 세포에 대한 결합은 1ug anti-c-Myc antibody로 세포를 1시간 동안 라벨링하고, FACS 전 Alexa 488-conjugated anti-mouse antibody로 이차 라벨링하여 확인하였다.
BT-474 세포에서 4D5 IgG, VH 도메인, VL 도메인 및 결합 Fv 항체의 Her2 발현 세포 표면에의 결합 프로필을 FACS를 통해 모니터링하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다. 시판 중인 4D5 IgG(positive controls)로 분석한 결과 BT-474 세포에서 HER-2 과발현이 확인되었다.
실험예 7: 라이브러리 디자인
VH 및 VL 단백질의 쌍 결합에 의해 제조된 기능적 조합 단백질 라이브러리를 잘 알려진 항원-항체 결합체로 디자인하였다. 자연 면역 레퍼토리 (natural immune repertoire)는 높은 특이성 및 친화도를 갖는 임의의 항원을 근본적으로 인식하는 항체를 생성할 수 있다. 항원 인식은 항원과 접촉하는 넓은 표면에 존재하는 6개의 CDR (complementarity determining region)에 의해 매개된다. CDR 서열은 초가변적이나 (hypervariable), 기능적 CDR의 전체 조성이 특정 아미노산 타입에 대하여 우호적인 편견을 갖게 한다. 본 발명자들의 라이브러리는 분자 인식을 매개하는데 특별히 적합한 기능적 그룹의 작은 서브세트에 기능적 다양성 (functional diversity)을 제한하였다. 본 발명자들의 라이브러리는 믿을 만한 폴딩 및 고 발현 수율을 주는 선택된 프레임워크 각각의 key 항체 내의 중쇄 및 경쇄 CDR3에 항원-항체 복합체 형성에 중요한 고 빈도 서열을 도입하여 제조하였다. 모든 CDR 길이는 수집된 항체로부터 고 빈도로 고정하였다. CDR 1 및 2 조성은 수집된 항체 중 가장 많은 잔기로 디자인하였다. 본 발명자들의 라이브러리는 VH (100) 및 VL (100)의 쌍 결합에 의해 104 항체의 조합된 복잡성 (combined complexity)를 갖고 있다. 인간 germline의 VH3, VLk3 및 VLk1 절편은 매우 높은 빈도로 재배열된 항체 내에서 확인되고, 발현이 잘 되며, 쌍을 이룬다.
본 발명자들은 VH3-66 및 VLk1 프레임위크 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3 DNA 서열을 합성하고, 항원-항체 복합체 형성에 중요한 고 빈도 서열을 이용하여 CDR-H3 및 CDR-L3에 다양성을 도입하였다.
상기 실시예 6 내지 8의 방법으로 라이브러리 디자인을 하였다. 프레임워크로 VH3-66 및 VLK3를 사용하였다. 헤테로 다이머의 대부분은 HV3, HV1, HV4와 KV3 및 KV1이다.
CDR은 고빈도로 나오는 CDR의 길이를 고정하였다. 구체적으로 CDR H1은 길이를 10, CDR H2는 10, CDR H3는 11, CDR L1은 11, CDR L2는 7, CDR L3는 9개의 아미노산으로 고정하였다. 고빈도로 나오는 CDR H3 및 CDR L3의 대표적인 내용을 도 18에 나타냈다.
실험예 8: 라이브러리 구축
다양성 (diversity) 디자인은 CDR1 및 2는 가장 고빈도의 잔기로 고정하고, CDR3은 높은 빈도의 잔기로 디자인하였다. 그 예를 도 19에 나타냈다. VH 도메인 100개 및 VL 도메인 100개를 조합하여, 100 × 100 =10000개의 다양성을 갖는 라이브러리를 디자인하였다. 그 결과는 도 20에 표시한 바와 같다. 단백질 조합에 의해 구축된 10,000 FVs 중 5 VHs와 5 VLs의 조합으로 구축된 25 Fvs를 SEC-HPLC로 확인하였으며, 그 결과를 도 21에 나타내었다.
4D5 VH 와 5개의 합성 VLs에 대한 조합을 FACS와 SEC-HPLC로 확인하고, 그 결과를 도 22에 나타내었다. 4D5 VH 와 5개의 합성 VLs에 의해 제조된 결합 Fv를 SEC-HPLC로 확인하였다. 그러나, BT-474 세포에는 결합하지 않았음을 확인하였다.
실험예 9: 라이브러리 스크리닝
라이브러리 스크리닝을 위해 Fc가 컨쥬게이션(conjugation)된 CTLA4, 41BB, TRAL R1, cMET, TRALI R2, CD40, Frizzled receptor 7, CD30, IL-17R, CSF1-R를 포함하는 10개의 항원을 선정하였고, 1차 스크리닝으로 10개의 혼합된 항원과 개별 Fv와의 상호결합을 알파 어세이(alpha assay, Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)로 확인하였고, 선별되어진 항체에 대한 개별 항원의 상호결합을 2차로 스크리닝하였다. 라이브러리 스크리닝 과정을 도 23에 도시하였다.
알파 어세이는 도너 비드(donor bead)와 어셉터 비드(acceptor bead)의 비드 기반 근접성 어세이(bead based proximity assay)로, 비오틴화된 항원은 스트렙타비딘(streptavidin)이 코팅된 비드로 캡쳐할 수 있고, myc-tag이 있는 FV는 anti-myc가 컨쥬게이션된 어셉터 비드에 결합 할 수 있다. 도너 비드와 어셉터 비드는 항원-FV 상호결합에 의해 근접성을 가지게 된다. 도너 비드는 일중항산소(singlet oxygen) 방출의 결과로 680 ㎚에서 여기되고 일중항산소에 의해 증폭된 형광 시그널이 어셉터 비드에서 발광되어, 알파 시그널을 검출하게 된다.
알파 어세이를 통해 개별 Fv와 10개의 혼합 항원의 상호 결합을 스크리닝한 결과를 도 24에 나타내었다. 도 24를 참조하면, Y축은 알파 시그널을, X축은 스크리닝 한 10000개의 Fv를 나타내었다. high 시그널부터 background에 가까운 low 시그널까지 다양한 항체들이 스크리닝 되었음을 확인할 수 있다.
혼합된 항원에 결합하는 Fv들과 개별 항원의 상호 결합을 2차로 스크리닝하였으며, 그 결과를 도 25에 나타내었다. CSF1R, MET, CD30, TRAIL-R1에 특이성(specificity)을 보이는 항체들을 찾을 수 있었고, 다양한 항원의 조합에 다가 특이성(multi- specificity)을 가지는 항체들을 확인할 수 있었다.
CSF1R에 주로 결합하는 Fv들의 알파 어세이 결과를 도 26에 나타내었다. 도 26을 통해, 알파 시그널의 차이를 보이는 다양한 항체를 확인할 수 있다.
알파 어세이 결과 CSF1R과 주로 결합하는 Fv들에 대한 상호결합을 ELISA로 동시에 확인하고 그 결과를 도 27에 나타내었다. 확인한 Fvs가 대체로 CSF1R과 c-MET(HGFR)에 동시에 결합하는 결과를 나타냄을 확인하였다. Fv ＃7197 와 ＃7195등 일부는 다가 특이성(multi- specificity)을 보였다.
알파 어세이 결과 CSF1R과 주로 결합하는 Fv들에 대한 상호결합을 웨스턴 블랏으로 확인하고, 그 결과를 도 28에 나타내었다. Fvs가 대체로 CSF1R과 c-MET(HGFR)에 동시에 결합하는 결과를 나타냄을 확인하였다.
c-MET에 결합하는 Fv들의 알파 어세이 결과를 도 29에 나타내었다. 도 29를 통해 알파 시그널의 차이를 보이는 다양한 항체를 확인하였다.
알파 어세이 결과 c-MET과 주로 결합하는 Fv들에 대한 상호결합을 ELISA로 동시에 확인하였으며, 그 결과를 도 30에 나타내었다. 확인한 Fvs가 대체로 CSF1R과 c-MET(HGFR)에 동시에 결합하는 결과를 확인하였다. Fv ＃724 와 ＃6900등 일부는 다가 특이성(multi- specificity)을 보였다.
알파 어세이 결과 c-MET과 주로 결합하는 Fv들에 대한 상호결합을 웨스턴 블랏으로 확인하고 그 결과를 도 31에 나타내었다. 도 31을 참조하면, Fvs가 대체로 CSF1R과 c-MET(HGFR)에 동시에 결합하는 결과를 나타냄을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명은 기존에 존재하지 않던 새로운 Fv 라이브러리 제조의 플랫폼 (platform)으로, 특히 기존의 DNA 수준에서 라이브러리의 조합이 아닌 VH와 VL의 단백질 수준에서의 조합을 통하여 정제 및 스크리닝에 드는 시간 및 비용을 대폭적으로 감소할 수 있는 신규한 항체 제조의 플랫폼을 제공할 수 있는 기술이다. 이와 같은 기술적 특징으로 인하여 실질적으로 기능을 하는 치료 항체를 기존의 시간 및 비용을 획기적으로 절감시켜 선별할 수 있을 뿐 아니라, 목표 물질에 제한 없이, 저해제, 조절제 등을 개발할 수 있을 것이다.
또한, 기존 라이브러리가 갖는 독성 문제가 없으므로 기능 분석을 곧바로 할 수 있어서, 다양한 목적에 따른 항체를 선별할 수 있으며, 세포 증식, 분화, 세포사 등에 관여하는 기능에 따른 항체를 선별하거나, 정상 및 비정상(목적 질병, 현상, 상태) 세포 또는 개체 간에 있어서 항체를 이용한 구분이 가능할 수 있다. 즉, 항체의약품의 생산에 적용할 수 있고, 그 외에 다양한 질병의 진단, 줄기세포 분화능의 확인 및 분화 촉진, 질병의 매커니즘 연구, 항체 스크리닝, 저해제와 조절제의 동시개발 가능, 각종 상태 (분화 및 미분화, 질병 군과 정상 군)에 대하여 항체 mapping (finger-printing) 가능성 등의 다양한 분야에 적용 가능할 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (21)

  1. (a) 중쇄 가변 영역 (heavy chain variable region; VH) 도메인 단백질 및 경쇄 가변 영역 (light chain variable region; VL) 도메인 단백질을 제조하는 단계; 및(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질을 결합하는 단계를 포함하는, 단백질 조합 기반의 Fv (variable fragment) 라이브러리의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질을 무작위적인 쌍-결합 또는 목적하는 쌍-결합에 의해 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 Fv 라이브러리는 개별적 기능 검사가 가능한 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 개별적 기능 검사는 목표 물질 결합에 따른 전-선별 단계를 수행하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질은 목적하는 다양성 (diversity)을 도입한 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질은 인간 또는 비인간 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 VH 도메인 단백질 또는 VL 도메인 단백질 내의 CDR (complementarity-determining resion) 또는 프레임워크 (Framework)에 돌연변이가 도입된 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 CDR은 CDR3인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 야생형 도메인 간의 결합, 시스테인 도입에 의한 이황화 결합, coiled-coil 도메인 융합에 의한 coiled-coil 결합, 단백질 간 상호 작용에 의한 결합, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 결합에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, (c) 결합한 Fv를 각각 지정된 ID (identification) 번호가 부여된 개별 구획에 정치하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. (a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 Fv 라이브러리를 사용하여 목적하는 특성, 특징 또는 활성에 대해 개별적 기능 검사하는 단계를 포함하는, 목적하는 Fv 항체를 스크리닝하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 목적하는 특성, 특징 또는 활성은 세포의 증식, 분화 또는 세포사인 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, (c) 목적하는 Fv 항체가 정치된 구획의 ID 번호를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, (d) 확인한 ID 번호의 구획의 Fv 항체의 조합 전 VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, (d) 확인한 ID 번호의 구획의 Fv 항체를 분리하여 DNA 서열을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법으로 스크리닝된 목적하는 Fv 항체.
  17. VH 도메인 단백질 및 VL 도메인 단백질이 결합된 Fv를 포함하는 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리.
  18. 제17항에 있어서, 상기 결합은 야생형 도메인 간의 결합, 시스테인 도입에 의한 이황화 결합, coiled-coil 도메인 융합에 의한 coiled-coil 결합, 단백질 간 상호 작용에 의한 결합, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  19. 제17항에 있어서, 상기 VH 도메인 단백질 또는 VL 도메인 단백질 내의 CDR (complementarity-determining resion) 또는 프레임워크 (Framework)에 돌연변이가 도입된 라이브러리.
  20. 제17항에 있어서, 상기 Fv는 지정된 ID 번호가 부여된 개별 구획에 정치되는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  21. 제17항에 있어서, 상기 라이브러리는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
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