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JP5647981B2 - リンパ球活性化遺伝子−３（ｌａｇ−３）へ結合するヒト抗体およびその使用 - Google Patents

リンパ球活性化遺伝子−３（ｌａｇ−３）へ結合するヒト抗体およびその使用 Download PDF

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Description

発明の背景
リンパ球活性化遺伝子−３またはＬＡＧ−３（ＣＤ２２３としても知られている）は、免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのメンバーであり、構造的および遺伝的にＣＤ４と関連している。ＬＡＧ−３は静止末梢血リンパ球上において発現しないが、活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞上において発現する。ＬＡＧ−３は、ＣＤ４遺伝子の付近である染色体１２の短腕の末端部に位置する遺伝子によってコードされる膜タンパク質であり、ＬＡＧ−３遺伝子は遺伝子重複によって発達したことが示唆される（Triebel et al. (1990) J. Exp. Med. 171:1393-1405）。
ＣＤ４と同様に、ＬＡＧ−３はＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用するが、ＣＤ４とは異なって、ＬＡＧ−３はヒト免疫不全ウイルスのｇｐ１２０タンパク質と相互作用しないことが証明されている（Baixeras et al. (1992) J. Exp. Med. 176:327-337）。可溶性ＬＡＧ−３免疫グロブリン融合タンパク質（ｓＬＡＧ−３Ｉｇ）を使用する試験によって、細胞表面上におけるＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩへの直接的かつ特異的な結合が証明された（Huard et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26:1180-1186）。
抗原特異的Ｔ細胞応答のインビトロ試験において、抗ＬＡＧ−３抗体を加えると、Ｔ細胞増殖の増加、活性化抗原、例えば、ＣＤ２５の高い発現、およびサイトカイン、例えば、インターフェロン−ガンマおよびインターロイキン−４の高い濃度を引き起こし、これは、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の抗原−依存刺激の下方制御におけるＬＡＧ−／ＭＨＣクラスＩＩ相互作用の役割を支持する（Huard et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:3216-3221）。ＬＡＧ−３の細胞質内領域は、ＣＤ３／ＴＣＲ活性化経路の下方制御に関与するシグナル伝達分子であると考えられるＬＡＰと称されるタンパク質と相互作用することが証明されている（Iouzalen et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31:2885-2891）。さらに、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は活性化時にＬＡＧ−３を発現させ、ＬＡＧ−３に対する抗体は、インビトロおよびインビボの両方において、誘導されるＴｒｅｇ細胞による抑制を阻害することが示されており、ＬＡＧ−３がＴｒｅｇ細胞の抑制活性に寄与することが提案される（Huang, C. et al. (2004) Immunity 21:503-513）。さらに、ＬＡＧ−３は、Ｔ細胞依存および独立メカニズムの両方において、制御Ｔ細胞によりＴ細胞ホメオスタシスを負に制御することが示されている（Workman, C.J. and Vignali, D.A. (2005) J. Immunol. 174:688-695）。
ある状況において、ＬＡＧ−３は免疫刺激効果を有することも示されている。例えば、同系マウスに移植されたＬＡＧ−３を導入された腫瘍細胞は、導入されていない腫瘍細胞と比較して著しい増殖減少または完全な退行を示し、腫瘍細胞におけるＬＡＧ−３発現がＭＨＣクラスＩＩ分子によって抗原提示細胞を誘導することにより抗腫瘍応答を刺激することが提案された（Prigent et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:3867-3876）。さらに、可溶性ＬＡＧ−３Ｉｇ融合タンパク質は、抗原と共にマウスに投与されたとき、体液性および細胞性免疫応答の両方を刺激することが示され、可溶性ＬＡＧ−３Ｉｇがワクチンアジュバントとして機能することができることを示す（El Mir and Triebel (2000) J. Immunol. 164:5583-5589）。さらに、可溶性ヒトＬＡＧ−３ＩｇはＩ型腫瘍特異的免疫のインビトロ発生を増幅させることが示されている（Casati et al. (2006) Cancer Res. 66:4450-4460）。ＬＡＧ−３の機能活性は、さらにTriebel (2003) Trends Immunol. 24:619-622に概説されている。上記を考慮すると、ＬＡＧ−３の活性を調節するためのさらなる薬物に関心がある。
要約
本明細書は、ＬＡＧ−３に特異的に結合し、所望の機能特性を有する、単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。これらの特性は、ヒトＬＡＧ−３に高い親和性にて結合し、ヒトおよびサルＬＡＧ−３（例えば、カニクイザルおよび／またはアカゲザルＬＡＧ−３）に結合するが、マウスＬＡＧ−３に結合しない、ＬＡＧ−３の主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子への結合を阻害する能力および／または抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を含む。本発明の抗体は、例えば、腫瘍を有する対象またはウイルスを有する対象において、例えば、ＬＡＧ−３タンパク質を検出する、または抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するために使用することができる。
１つの局面において、本発明は、ヒトＬＡＧ−３に結合し、少なくとも１つの以下の特性：
（ａ）サルＬＡＧ−３に結合する；
（ｂ）マウスＬＡＧ−３に結合しない；
（ｃ）ＬＡＧ−３の主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子への結合を阻害する；および
（ｄ）免疫応答を刺激する．
を示す、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の少なくとも２つを示す。さらに好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の少なくとも３つを示す。さらに好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の全４つを示す。
好ましい態様において、抗体は、抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答におけるインターロイキン−２（ＩＬ−２）生成を刺激する。他の態様において、抗体は、免疫応答、例えば、抗腫瘍応答（例えば、腫瘍移植片モデルにおいてインビボにて腫瘍増殖を阻害する）または自己免疫応答（例えば、ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症を促進する）を刺激する。他の好ましい態様において、抗体は、アミノ酸配列ＰＧＨＰＬＡＰＧ（配列番号：７６）を含むヒトＬＡＧ−３のエピトープに結合する。さらに他の好ましい態様において、抗体は、アミノ酸配列ＨＰＡＡＰＳＳＷ（配列番号：７７）またはＰＡＡＰＳＳＷＧ（配列番号：７８）を含むヒトＬＡＧ−３のエピトープに結合する。さらに他の態様において、抗体は、１×１０−７Ｍ以下のＫＤにてヒトＬＡＧ−３に結合するか、または１×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＬＡＧ−３に結合するか、または５×１０−９Ｍ以下のＫＤにてヒトＬＡＧ−３に結合するか、または１×１０−９Ｍ以下のＫＤにてヒトＬＡＧ−３に結合する。１つの態様において、抗体は、免疫組織化学により下垂体組織を染色するが、他の態様において、抗体は、免疫組織化学により下垂体組織を染色しない。
他の局面において、本発明は、ヒトＬＡＧ−３への結合に対して参照抗体と交差競合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該参照抗体が
（ａ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ｆ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合部分に関する。
好ましい態様において、参照抗体は、配列番号：３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の好ましい態様において、参照抗体は、配列番号：３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の好ましい態様において、参照抗体は、配列番号：３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の好ましい態様において、参照抗体は、配列番号：４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の好ましい態様において、参照抗体は、配列番号：４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の好ましい態様において、参照抗体は、配列番号：４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
他の局面において、本発明は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、ヒトＶＨ３−２０遺伝子、ヒトＶＨ４−３４遺伝子、ヒトＶＨ３−３３遺伝子もしくはＶＨ１−２４遺伝子の産物またはそれ由来である重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。他の局面において、本発明は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、ヒトＶＫＬ１８遺伝子、ヒトＶＫＬ６遺伝子もしくはヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物またはそれ由来である軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。好ましい態様において、本発明は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、
（ａ）ヒトＶＨ４−３４遺伝子の産物またはそれ由来である重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ６遺伝子の産物またはそれ由来である軽鎖可変領域；
（ｂ）ヒトＶＨ３−３３遺伝子の産物またはそれ由来である重鎖可変領域およびヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物またはそれ由来である軽鎖可変領域；
（ｃ）ヒトＶＨ３−２０遺伝子の産物またはそれ由来である重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ１８遺伝子の産物またはそれ由来である軽鎖可変領域；
（ｄ）ヒトＶＨ１−２４遺伝子の産物またはそれ由来である重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ６遺伝子の産物またはそれ由来である軽鎖可変領域；または
（ｅ）ヒトＶＨ３−３３遺伝子の産物またはそれ由来である重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ６遺伝子の産物またはそれ由来である軽鎖可変領域；
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
他の局面において、本発明は、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に特異的に結合する、
（ａ）配列番号：３７−４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号：４３−４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
好ましい組合せは、
（ａ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
他の好ましい組合せは、
（ａ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
他の好ましい組合せは、
（ａ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
他の好ましい組合せは、
（ａ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
他の好ましい組合せは、
（ａ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
他の好ましい組合せは、
（ａ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
本発明の抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプの、例えば、全長抗体であり得る。好ましい態様において、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。他の好ましい態様において、抗体は、重鎖中のジスルフィド架橋不均一性を減少させるか、または破壊するように、重鎖定常領域ヒンジ領域（Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-108に記載されている位置２４１に対応する位置）にてセリンからプロリンへの変異を有するＩｇＧ４アイソタイプである。あるいは、抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦａｂ’２フラグメントまたは一本鎖抗体であり得る。
本明細書は、治療剤、例えば、細胞毒素または放射性同位体と連結している本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫抱合体も提供する。本明細書は、抗体またはその抗原結合部分と異なる結合特異性を有する第２の機能性部分と連結している本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子も提供する。
本発明の抗体もしくはその抗原結合部分または免疫抱合体または二重特異性分子および薬学的に許容される担体を含む組成物も提供する。
本発明の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子ならびにこのような核酸を含む発現ベクターおよびこのような発現ベクターを含む宿主細胞も本明細書に包含される。このような発現ベクターを含む宿主細胞を使用して抗ＬＡＧ−３抗体を製造するための方法も提供し、該方法は（ｉ）宿主細胞において抗体を発現させ、そして（ｉｉ）宿主細胞から抗体を単離する工程を含み得る。
他の局面において、本発明は、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体を使用して免疫応答を刺激する方法に関する。例えば、１つの態様において、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するように、Ｔ細胞を本発明の抗体と接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法を提供する。好ましい態様において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン−２生成が刺激される。他の態様において、本発明は、対象における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激するように、本発明の抗体を対象に投与することを含む、対象における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激する方法を提供する。好ましい態様において、対象が腫瘍を有する対象であり、腫瘍に対する免疫応答を刺激する。他の好ましい態様において、対象がウイルスを有する対象であり、ウイルスに対する免疫応答を刺激する。
さらに他の局面において、本発明は、腫瘍の増殖を対象において阻害するように、本発明の抗体を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。さらに他の局面において、本発明は、ウイルス感染を対象において処置するように、本発明の抗体を対象に投与することを含む、対象におけるウイルス感染を処置するための方法を提供する。
さらに他の局面において、本発明は、例えば、腫瘍増殖を阻害するか、または抗−ウイルス応答を刺激するために対象における免疫応答を刺激するように、抗ＬＡＧ−３抗体および少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法を提供する。１つの態様において、対象に抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＰＤ−１抗体を投与する。他の態様において、対象に抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する。さらに他の態様において、対象に抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与する。１つの態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒト抗体、例えば、本明細書に記載されている抗体である。あるいは、抗ＬＡＧ−３抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体であり得る。他の態様において、少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体）はヒト抗体である。あるいは、少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体であり得る。
さらに他の局面において、本発明は、抗ＬＡＧ−３抗体を製造するための方法に関する。方法は、
（ａ）（ｉ）配列番号：１−６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号：７−１２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／もしくは配列番号：１３−１４、ＧＧＹおよび１６−１８からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；ならびに／または（ｉｉ）配列番号：１９−２４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号：２５−３０からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／もしくは配列番号：３１−３６からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供し；
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を改変して、少なくとも１個が改変された抗体配列を創造し；そして
（ｃ）タンパク質として改変された抗体配列を発現する
ことを含む。
本願の他の特徴および利点は本記載および実施例から明らかであるが、これらに限定すると解釈してはならない。本明細書において引用されているすべての文献、Ｇｅｎｂａｎｋ登録、特許および公開特許出願の内容を出典明示により明確に本明細書に包含させる。
図１Ａは２５Ｆ７ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号：４９）およびアミノ酸配列（配列番号：３７）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１）、ＣＤＲ２（配列番号：７）およびＣＤＲ３（配列番号：１３）領域が描かれており、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。 図１Ｂは２５Ｆ７ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号：５５）およびアミノ酸配列（配列番号：４３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１９）、ＣＤＲ２（配列番号：２５）およびＣＤＲ３（配列番号：３１）領域が描かれており、ＶおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。 図２Ａは２６Ｈ１０ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号：５０）およびアミノ酸配列（配列番号：３８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：２）、ＣＤＲ２（配列番号：８）およびＣＤＲ３（配列番号：１４）領域が描かれており、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。 図２Ｂは２６Ｈ１０ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号：５６）およびアミノ酸配列（配列番号：４４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：２０）、ＣＤＲ２（配列番号：２６）およびＣＤＲ３（配列番号：３２）領域が描かれており、ＶおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。 図３Ａは２５Ｅ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号：５１）およびアミノ酸配列（配列番号：３９）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：３）、ＣＤＲ２（配列番号：９）およびＣＤＲ３領域が描かれており、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。 図３Ｂは２５Ｅ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号：５７）およびアミノ酸配列（配列番号：４５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：２１）、ＣＤＲ２（配列番号：２７）およびＣＤＲ３（配列番号：３３）領域が描かれており、ＶおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。 図４Ａは８Ｂ７ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号：５２）およびアミノ酸配列（配列番号：４０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：４）、ＣＤＲ２（配列番号：１０）およびＣＤＲ３（配列番号：１６）領域が描かれており、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。 図４Ｂは８Ｂ７ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号：５８）およびアミノ酸配列（配列番号：４６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：２２）、ＣＤＲ２（配列番号：２８）およびＣＤＲ３（配列番号：３４）領域が描かれており、ＶおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。 図５Ａは１１Ｆ２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号：５３）およびアミノ酸配列（配列番号：４１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：５）、ＣＤＲ２（配列番号：１１）およびＣＤＲ３（配列番号：１７）領域が描かれており、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。 図５Ｂは１１Ｆ２ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号：５９）およびアミノ酸配列（配列番号：４７）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：２３）、ＣＤＲ２（配列番号：２９）およびＣＤＲ３（配列番号：３５）領域が描かれており、ＶおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。 図６Ａは１７Ｅ５ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号：５４）およびアミノ酸配列（配列番号：４２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：６）、ＣＤＲ２（配列番号：１２）およびＣＤＲ３（配列番号：１８）領域が描かれており、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。 図６Ｂは１７Ｅ５ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号：６０）およびアミノ酸配列（配列番号：４８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：２４）、ＣＤＲ２（配列番号：３０）およびＣＤＲ３（配列番号：３６）領域が描かれており、ＶおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示されている。
図７は２５Ｆ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：３７）とヒト生殖細胞系列ＶＨ４−３４およびＪＨ５ｂアミノ酸配列（配列番号：６１および６２、各々）のアラインメントを示す。 図８は２５Ｆ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：４３）とヒト生殖細胞系列ＶｋＬ６およびＪＫ２アミノ酸配列（配列番号：６３および６４、各々）のアラインメントを示す。 図９は２６Ｈ１０の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：３８）とヒト生殖細胞系列ＶＨ３−３３およびＪＨ６Ｂアミノ酸配列（配列番号：６５および６６、各々）のアラインメントを示す。 図１０は２６Ｈ１０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：４４）とヒト生殖細胞系列ＶｋＡ２７およびＪＫ３アミノ酸配列（配列番号：６７および６８、各々）のアラインメントを示す。 図１１は２５Ｅ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：３９）とヒト生殖細胞系列ＶＨ３−２０およびＪＨ４ｂアミノ酸配列（配列番号：６９および７０、各々）のアラインメントを示す。 図１２は２５Ｅ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：４５）とヒト生殖細胞系列ＶｋＬ１８およびＪＫ２アミノ酸配列（配列番号：７１および６４、各々）のアラインメントを示す。 図１３は８Ｂ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：４０）とヒト生殖細胞系列ＶＨ４−３４およびＪＨ５ｂアミノ酸配列（配列番号：６１および６２、各々）のアラインメントを示す。 図１４は８Ｂ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：４６）とヒト生殖細胞系列ＶｋＬ６およびＪＫ４アミノ酸配列（配列番号：６３および７２、各々）のアラインメントを示す。 図１５は１１Ｆ２の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：４１）とヒト生殖細胞系列ＶＨ１−２４およびＪＨ４ｂアミノ酸配列（配列番号：７３および７０、各々）のアラインメントを示す。 図１６は１１Ｆ２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：４７）とヒト生殖細胞系列ＶｋＬ６およびＪＫ１アミノ酸配列（配列番号：６３および７４、各々）のアラインメントを示す。 図１７は１７Ｅ５の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：４２）とヒト生殖細胞系列ＶＨ３−３３および２−２アミノ酸配列（配列番号：６５および７０、各々）のアラインメントを示す。 図１８は１７Ｅ５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：４８）とヒト生殖細胞系列ＶｋＬ６アミノ酸配列（配列番号：６３および７５、各々）のアラインメントを示す。 図１９はサルＬＡＧ−３ｃＤＮＡクローンｐａ２３−５によってコードされるタンパク質配列（配列番号：９３）とＧｅｎｂａｎｋ寄託アカゲザルＬＡＧ−３タンパク質配列（配列番号：９４）（Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号 ＸＭ＿００１１０８９２３）のアラインメントを示す。余分な(extra)ループペプチド領域および膜貫通ドメインは下線を引いている。２つの配列間で異なる１つのアミノ酸（アミノ酸位置４１９）を太字で強調している。
発明の詳細な説明
本明細書は、ヒトＬＡＧ−３に結合し、そして所望の機能特性を有する、単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体に関する。１つの態様において、本発明の抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖細胞系列配列由来であり、そして／または特定の構造的特徴、例えば、特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域を含む。本明細書は、単離された抗体、このような抗体を製造する方法、このような抗体を含む免疫抱合体および二重特異性分子ならびに本発明の抗体、免疫抱合体または二重特異性分子を含む医薬組成物を提供する。本明細書は、また、例えば、ＬＡＧ−３タンパク質を検出するために抗体を使用する方法、ならびに免疫応答を刺激するために本発明の抗ＬＡＧ−３抗体単独または他の免疫刺激抗体と組み合わせて使用する方法に関する。したがって、本明細書は、また、例えば、腫瘍増殖を阻害するか、またはウイルス感染を処置するために、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体を使用する方法を提供する。
本明細書をさらに容易に理解するために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明中に記載されている。
“ＬＡＧ−３”なる用語は、リンパ球活性化遺伝子−３を示す。“ＬＡＧ−３”なる用語は、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログおよびパラログを含む。例えば、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に対して特異的である抗体は、ある場合において、ヒト以外の種由来のＬＡＧ−３タンパク質と交差反応し得る。他の態様において、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に対して特異的である抗体は、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に対して完全に特異的であってよく、種または他の型の交差反応性を示さなくてもよく、または、全ての他の種ではなくある特定の他の種由来のＬＡＧ−３と交差反応してよい（例えば、マウスＬＡＧ−３ではなくサルＬＡＧ−３と交差反応する）。“ヒトＬＡＧ−３”なる用語は、ヒト配列ＬＡＧ−３、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号 ＮＰ＿００２２７７を有するヒトＬＡＧ−３の完全なアミノ酸配列を示す。“マウスＬＡＧ−３”なる用語は、マウス配列ＬＡＧ−３、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号 ＮＰ＿０３２５０５を有するマウスＬＡＧ−３の完全なアミノ酸配列を示す。ＬＡＧ−３は、また当分野で、例えば、ＣＤ２２３として知られている。ヒトＬＡＧ−３配列は、例えば、保存されている変異または非保存領域における変異を有することにより、Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号 ＮＰ＿００２２７７のヒトＬＡＧ−３と異なっていてよく、ＬＡＧ−３はＧｅｎｂａｎｋ 受入番号 ＮＰ＿００２２７７のヒトＬＡＧ−３と実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトＬＡＧ−３の生物学的機能は本明細書の抗体によって特異的に結合されるＬＡＧ−３の細胞外ドメインにおけるエピトープを有することであるか、またはヒトＬＡＧ−３の生物学的機能はＭＨＣクラスＩＩ分子へ結合することである。
“サルＬＡＧ−３”なる用語は、旧世界および新世界サルにより発現されるＬＡＧ−３タンパク質を含むことを意図し、カニクイザルＬＡＧ−３およびアカゲザルＬＡＧ−３に限定されない。サルＬＡＧ−３に対する典型的なアミノ酸配列は、また、Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号 ＸＭ＿００１１０８９２３として寄託されている、図１９および配列番号：８５において示されているアカゲザルＬＡＧ−３アミノ酸配列である。サルＬＡＧ−３に対する他の典型的なアミノ酸配列は、実施例３Ａサブセクション３において記載されているとおりに単離された、図１９および配列番号：８４に示されているクローンｐａ２３−５の別のアカゲザル配列である。この別のアカゲザル配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ−寄託配列と比較して、位置４１９にて１つのアミノ酸の違いを示す。
特定のヒトＬＡＧ−３配列は、一般的に、Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号 ＮＰ＿００２２７７のヒトＬＡＧ−３に対してアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種（例えば、マウス）のＬＡＧ−３アミノ酸配列と比較したとき、ヒトであるアミノ酸配列と同定されるアミノ酸残基を含む。特定の場合において、ヒトＬＡＧ−３は、Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号 ＮＰ＿００２２７７のＬＡＧ−３に対してアミノ酸配列において、少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり得る。１つの態様において、ヒトＬＡＧ−３配列は、受入番号 ＮＰ＿００２２７７のＬＡＧ−３配列と最大１０個のアミノ酸の違いを示し得る。１つの態様において、ヒトＬＡＧ−３は、Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号 ＮＰ＿００２２７７のＬＡＧ−３配列と最大５個、またはさらに最大４、３、２もしくは１個のアミノ酸の違いを示し得る。同一性パーセントは、本明細書に記載されているとおりに決定することができる。
“免疫応答”なる用語は、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または、自己免疫もしくは病的炎症の場合、正常ヒト細胞もしくは組織の人体からの破壊または除去に関する選択的障害を引き起こす、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球および上記細胞または肝臓により生産される可溶性巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の活性を示す。
“抗原特異的Ｔ細胞応答”は、Ｔ細胞に特異的である抗原でのＴ細胞の刺激によって生じるＴ細胞による応答を示す。抗原特異的刺激時のＴ細胞による応答の非限定的な例として、増殖およびサイトカイン生成（例えば、ＩＬ−２生成）を含む。
本明細書において使用される“抗体”なる用語は、全抗体またはその抗原結合フラグメント（すなわち、“抗原結合部分”）または一本鎖を含む。全抗体はジスルフィド結合により相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと省略する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと省略する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域により分断されている相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分類できる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ−末端からカルボキシ−末端へ次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４にて配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への結合を介在し得る。
本明細書において使用される抗体の“抗原結合部分”（または単に“抗体部分”）なる用語は、抗原（例えば、ＬＡＧ−３タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は全長抗体のフラグメントにより行うことができることが示されている。抗体の“抗原結合部分”なる用語内に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ヒンジ領域の一部を有する本質的にＦａｂであるＦａｂ’フラグメント（FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993、参照）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；および（ｖｉｉｉ）ナノボディ、単一可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する一本のタンパク質鎖として作製可能とする合成リンカーにより連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても既知；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883、参照）。このような一本鎖抗体は、また、抗体の“抗原結合部分”なる用語に包含されることを意図する。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の慣用の技術を使用して得られ、これらのフラグメントはインタクトな抗体と同様に有用性に関してスクリーニングされる。
本明細書において使用される“単離された”は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すことを意図する（例えば、ＬＡＧ−３タンパク質に特異的に結合する単離された抗体は特異的にＬＡＧ−３タンパク質以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、他の種の他の抗原抗原、例えば、ＬＡＧ−３タンパク質に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は実質的に他の細胞材料および／または化学物質を含まなくてもよい。
本明細書において使用される“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”なる用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。
本明細書において使用される“ヒト抗体”なる用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含むとき、定常領域は、また、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムまたは部位特異的突然変異またはインビボで体細胞変異により導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される“ヒト抗体”なる用語は、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことを意図しない。
“ヒトモノクローナル抗体”なる用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を意味する。１つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させた遺伝子導入非ヒト動物、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入マウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより製造される。
本明細書において使用される“組換えヒト抗体”なる用語は、組換え手段により製造、発現、創造または単離されたすべてのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入または染色体導入された動物（例えば、マウス）またはそれから製造されたハイブリドーマから単離された抗体（以下に記載されている）、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他の手段により製造、発現、創造または単離された抗体のすべてを含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する。しかしながら、１つの態様において、このような組換えヒト抗体をインビトロ突然変異（または、ヒトＩｇ配列に対して動物遺伝子導入が使用されるとき、インビボ体細胞突然変異）に付すことができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連するが、天然にインビボにおいてヒト抗体生殖細胞系列のレパートリー内に存在しない配列である。
“アイソタイプ”なる用語は重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧｌ）を意味する。
“抗原を認識する抗体”および“抗原に対して特異的な抗体”なる用語は“抗原に特異的に結合する抗体”なる用語と互換的に使用される。
“ヒト抗体誘導体”なる用語は、ヒト抗体の修飾された形態、例えば、抗体および他の薬物または抗体の複合体のすべてを意味する。
“ヒト化抗体”なる用語は、他の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖細胞系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体を示すことを意図する。さらなるフレームワーク領域修飾はヒトフレームワーク配列内に作られ得る。
“キメラ抗体”なる用語は、可変領域配列が１つの種由来であり、定常領域配列が他の種由来である抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体由来であり、定常領域配列がヒト抗体由来である抗体を示すことを意図する。
本明細書において使用される“ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する”抗体は、ヒトＬＡＧ−３タンパク質（あるいは１つ以上の非ヒト種由来のＬＡＧ−３タンパク質）に結合するが、非−ＬＡＧ−３タンパク質に実質的に結合しない抗体を意味することを意図する。好ましくは、抗体は、“高い親和性”、すなわち１×１０−７Ｍ以下、さらに好ましくは５×１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは３×１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは５×１０−９Ｍ以下またはより好ましくは１×１０−９Ｍ以下のＫＤにてヒトＬＡＧ−３タンパク質に結合する。
本明細書において使用されるタンパク質または細胞に“実質的に結合しない”なる用語は、タンパク質または細胞に結合しないか、または高い親和性にて結合しない、すなわちタンパク質または細胞に１×１０−６Ｍ以上、さらに好ましくは１×１０−５Ｍ以上、さらに好ましくは１×１０−４Ｍ以上、さらに好ましくは１×１０−３Ｍ以上、より好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫＤにて結合することを意味する。
本明細書において使用される“Ｋａｓｓｏｃ”または“Ｋａ”なる用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を示すことを意図するが、本明細書において使用される“Ｋｄｉｓ”または“Ｋｄ”なる用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を示すことを意図する。本明細書において使用される“ＫＤ”なる用語は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を示すことを意図する。抗体に対するＫＤ値は当分野で確立している方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、好ましくはバイオセンサーシステム、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用することによる。
ＩｇＧ抗体に対する“高い親和性”なる用語は、標的抗原に対して１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは５×１０−９Ｍ以下およびさらに好ましくは１×１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を意味する。しかしながら、“高い親和性”結合は他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する“高い親和性”結合は、１０−６Ｍ以下、さらに好ましくは１０−７Ｍ以下、さらに好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を意味する。
“対象”なる用語はヒトまたは非ヒト動物のすべてを含む。“非ヒト動物”なる用語は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、鳥類、両生類およびは虫類を含むが、哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシおよびウマが好ましい。
本発明の種々の局面は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載されている。
特定の機能特性を有する抗−ＬＡＧ−３抗体
本発明の抗体は、抗体の特定の機能的特色または特性により特徴付けられる。例えば、抗体はヒトＬＡＧ−３に特異的に結合し、ある他の種由来のＬＡＧ−３、例えば、サルＬＡＧ−３（例えば、カニクイザル、アカゲザル）に結合してもよいが、ある他の種由来のＬＡＧ−３、例えば、マウスＬＡＧ−３に実質的に結合しない。好ましくは、本発明の抗体は高い親和性にてヒトＬＡＧ−３に結合する。
免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する抗体の能力は、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答におけるインターロイキン−２（ＩＬ−２）生成を刺激する抗体の能力により示される。１つの態様において、本発明の抗体はヒトＬＡＧ−３に結合し、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を示す。他の態様において、本発明の抗体はヒトＬＡＧ−３に結合するが、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を示さない。免疫応答を刺激する抗体の能力を評価するための他の手段は、腫瘍増殖、例えば、インビボ腫瘍移植片モデル（例えば、実施例６、参照）を阻害する抗体の能力または自己免疫応答を刺激する抗体の能力、例えば、自己免疫性モデルにおける自己免疫疾患の発症を促進する能力、例えば、ＮＯＤマウスモデルにおける糖尿病の発症を促進する能力（例えば、実施例７、参照）を含む。
ＬＡＧ−３への本発明の抗体の結合は、当分野で確立している１つ以上の技術を使用して評価することができる。例えば、好ましい態様において、抗体は、ヒトＬＡＧ−３を発現する細胞系、例えば、細胞表面上にＬＡＧ−３（例えば、ヒトＬＡＧ−３またはサルＬＡＧ−３（例えば、アカゲザルまたはカニクイザル）またはマウスＬＡＧ−３）を発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ細胞と抗体を反応させるフローサイトメトリーアッセイにより試験することができる（例えば、適当なアッセイに関して実施例３Ａ、参照）。フローサイトメトリーアッセイにおいて使用するために他の適当な細胞は、天然のＬＡＧ−３を発現する抗ＣＤ３−刺激ＣＤ４＋活性化Ｔ細胞を含む。さらに、またはあるいは、結合反応速度（例えば、ＫＤ値）を含む抗体の結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイにおいて試験することができる（例えば、適当なアッセイに関して実施例３Ｂ、参照）。さらに他の適当な結合アッセイは、例えば、組換えＬＡＧ−３タンパク質を使用する、ＥＬＩＳＡアッセイを含む（例えば、適当なアッセイに関して実施例１、参照）。
好ましくは、本発明の抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤにてＬＡＧ−３タンパク質に結合するか、２×１０−８Ｍ以下のＫＤにてＬＡＧ−３タンパク質に結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤにてＬＡＧ−３タンパク質に結合するか、４×１０−９Ｍ以下のＫＤにてＬＡＧ−３タンパク質に結合するか、３×１０−９Ｍ以下のＫＤにてＬＡＧ−３タンパク質に結合するか、２×１０−９Ｍ以下のＫＤにてＬＡＧ−３タンパク質に結合するか、１×１０−９Ｍ以下のＫＤにてＬＡＧ−３タンパク質に結合するか、５×１０−１０Ｍ以下のＫＤにてＬＡＧ−３タンパク質に結合するか、または１×１０−１０Ｍ以下のＫＤにてＬＡＧ−３タンパク質に結合する。
一般的に、本発明の抗体はリンパ球組織、例えば、へんとう腺、脾臓または胸腺におけるＬＡＧ−３に結合し、免疫組織化学により検出することができる。そのうえ、実施例８にさらに記載されているとおり、特定の本発明の抗ＬＡＧ−３抗体は免疫組織化学により測定されるように下垂体組織を染色するが（例えば、下垂体において維持される）、他の本発明の抗ＬＡＧ−３抗体は免疫組織化学により測定されるように下垂体組織を染色しない（例えば、下垂体において維持されない）。したがって、１つの態様において、本発明は免疫組織化学により下垂体組織を染色するヒト抗ＬＡＧ−３抗体を提供するが、他の態様において、本発明は免疫組織化学により下垂体組織を染色しないヒト抗ＬＡＧ−３抗体を提供する。
本発明の好ましい抗体はヒトモノクローナル抗体である。さらに、またはあるいは、抗体は、例えば、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体であり得る。
モノクローナル抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５
本発明の好ましい抗体は、実施例１および２に記載されているように単離され構造的に特徴付けられた、ヒトモノクローナル抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５である。２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５のＶＨアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３７−４２に示されている。２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５のＶＫアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：４３−４８に示されている。
それぞれのこれらの抗体がヒトＬＡＧ−３に結合することができることを考慮すると、本発明の他の抗−ＬＡＧ−３結合分子を創造するために、ＶＨおよびＶＬ配列を“混合および適合させる”ことができる。好ましくは、ＶＨおよびＶＬ鎖を混合および適合させるとき、特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＨ配列を構造的に類似のＶＨ配列と置き換える。同様に、好ましくは、特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＬ配列を構造的に類似のＶＬ配列と置き換える。
したがって、１つの局面において、本明細書は、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に特異的に結合する、
（ａ）配列番号：３７−４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：４３−４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
好ましい重鎖および軽鎖の組合せは：
（ａ）配列番号：３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号：３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号：３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号：４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ｆ）配列番号：４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
他の局面において、本明細書は、２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの組合せを含む抗体を提供する。２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３７−４２に示されている。２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：４３−４８に示されている。２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１３−１４、ＧＧＹおよび１６−１８に示されている。２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５のＶＫＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１９−２４に示されている。２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５のＶＫＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：２５−３０に示されている。２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５のＶＫＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３１−３６に示されている。ＣＤＲ領域はＫａｂａｔシステムを使用して描かれる（Kabat et al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。
それぞれのこれらの抗体がヒトＬＡＧ−３に結合することができ、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域により提供されることを考慮すると、本発明の他の抗−ＬＡＧ−３結合分子を創造するために、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を“混合および適合させる”ことができる（すなわち、異なる抗体由来のＣＤＲを混合および適合させることができるが、それぞれの抗体はＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含まなければならない）。このような“混合および適合させた”抗体のＬＡＧ−３結合は、上記および実施例に記載の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析）を使用して試験することができる。好ましくは、ＶＨのＣＤＲ配列を混合および適合させるとき、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を構造的に類似のＣＤＲ配列と置き換える。同様に、ＶＬのＣＤＲ配列を混合および適合させるとき、特定のＶＬ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を好ましくは構造的に類似のＣＤＲ配列と置き換える。新規ＶＨおよびＶＬ配列が、１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域配列をモノクローナル抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５に関する本明細書に記載のＣＤＲ配列由来の構造的に類似の配列と置き換えることにより創造することができることは当業者に明らかである。
したがって、他の局面において、本明細書は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、
（ａ）配列番号：１−６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：７−１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１３−１４、ＧＧＹおよび１６−１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：１９−２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２５−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３１−３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
好ましい態様において、抗体は：
（ａ）配列番号：１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：１９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
他の好ましい態様において、抗体は：
（ａ）配列番号：２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
他の好ましい態様において、抗体は：
（ａ）配列番号：３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）ＧＧＹを含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
他の好ましい態様において、抗体は：
（ａ）配列番号：４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
他の好ましい態様において、抗体は：
（ａ）配列番号：５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
他の好ましい態様において、抗体は：
（ａ）配列番号：６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインと独立して、ＣＤＲ３ドメインのみは、同一抗原に対する抗体の結合特異性を決定することができ、多数の抗体が予想通りに、共通のＣＤＲ３配列に基づいて、同じ結合特異性を有して製造することができることが当分野で知られている。例えば、Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995); Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996); Berezov et al., BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001); Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995); Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10 (1998); Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993); Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994)およびXu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000)、参照。米国特許第６，９５１，６４６；６，９１４，１２８；６，０９０，３８２；６，８１８，２１６；６，１５６，３１３；６，８２７，９２５；５，８３３，９４３；５，７６２，９０５および５，７６０，１８５号も、参照。これらそれぞれの文献を出典明示によりそれらの全体を本明細書に包含させる。
したがって、本明細書は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合することができる、ヒトまたは非ヒト動物由来の抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供する。１つの局面において、本明細書は、ＬＡＧ−３に特異的に結合することができる、非ヒト抗体、例えば、マウスまたはラット抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において、非ヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むこのような発明の抗体は、（ａ）との結合に対して競合することができ；（ｂ）機能特性を維持し；（ｃ）同じエピトープに結合し；そして／または（ｄ）対応する親非ヒト抗体と同様の結合親和性を有する。
他の局面において、本明細書は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合することができる、ヒト抗体、例えば、非ヒト動物から得られるヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供する。他の局面において、本明細書は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合することができる、第１のヒト抗体、例えば、非ヒト動物から得られるヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体であって、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合することができる第２のヒト抗体を製造するために、第１のヒト抗体由来のＣＤＲ３ドメインをＬＡＧ−３に対する結合特異性を欠いているヒト抗体におけるＣＤＲ３ドメインと置き換えられているモノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において、第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むこのような発明の抗体は、（ａ）との結合に対して競合することができ；（ｂ）機能特性を維持し；（ｃ）同じエピトープに結合し；そして／または（ｄ）対応する親第１のヒト抗体と同様の結合親和性を有する。
特定の生殖細胞系列配列を有する抗体
１つの態様において、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系列の重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系列の軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
例えば、好ましい態様において、本明細書は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、ヒトＶＨ３−２０遺伝子、ヒトＶＨ４−３４遺伝子、ヒトＶＨ３−３３遺伝子もしくはヒトＶＨ１−２４遺伝子の産物またはそれ由来である重鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。他の好ましい態様において、本明細書は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、ヒトＶＫＬ１８遺伝子、ヒトＶＫＬ６遺伝子もしくはヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物またはそれ由来である軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。さらに他の好ましい態様において、本明細書は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、ヒトＶＨ３−２０遺伝子の産物またはそれ由来である重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ１８遺伝子の産物またはそれ由来である軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。さらに他の好ましい態様において、本明細書は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、ヒトＶＨ４−３４遺伝子の産物またはそれ由来である重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ６遺伝子の産物またはそれ由来である軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。さらに他の好ましい態様において、本明細書は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、ヒトＶＨ３−３３遺伝子の産物またはそれ由来である重鎖可変領域およびヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物またはそれ由来である軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。さらに他の好ましい態様において、本明細書は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、ヒトＶＨ１−２４遺伝子の産物またはそれ由来である重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ６遺伝子の産物またはそれ由来である軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。さらに他の好ましい態様において、本明細書は、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、ヒトＶＨ３−３３遺伝子の産物またはそれ由来である重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ６遺伝子の産物またはそれ由来である軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
このような抗体は、また、上記に詳細にされている１つ以上の機能特性、例えば、ヒトＬＡＧ−３への結合の高い親和性、サルＬＡＧ−３への結合、マウスＬＡＧ−３への非結合、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を阻害する能力および／または抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を有することができる。
ＶＨ３−２０およびＶＫＬ１８のＶＨおよびＶＬを有する抗体の例は、２５Ｅ３抗体である。ＶＨ４−３４およびＶＫＬ６のＶＨおよびＶＬを有する抗体の例は、２５Ｆ７および８Ｂ７抗体である。ＶＨ３−３３およびＶＫＡ２７のＶＨおよびＶＬを有する抗体の例は、２６Ｈ１０抗体である。ＶＨ１−２４およびＶＫＬ６のＶＨおよびＶＬを有する抗体の例は、１１Ｆ２抗体である。ＶＨ３−３３およびＶＫＬ６のＶＨおよびＶＬを有する抗体の例は、１７Ｅ５抗体である。
抗体の可変領域がヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られるとき、本明細書において使用されるヒト抗体は特定の生殖細胞系列配列の“生成物”であるか、またはそれに“由来”する重鎖または軽鎖可変領域を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスを興味ある抗原にて免疫化するか、またはファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを興味ある抗原にてスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列の“生成物”であるか、またはそれに“由来”するヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系列の免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較して、ヒト抗体の配列と配列において非常に近い（すなわち、同一性％が非常に高い）ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を選択することによりそれ自体同定することができる。特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列の“生成物”であるか、またはそれに“由来”するヒト抗体は、生殖細胞系列配列と比較して、例えば、自然に起こる体細胞変異または人工部位特異的変異によるアミノ酸の違いを含み得る。しかしながら、選択されたヒト抗体は、一般的に、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であり、他の種の生殖細胞系列の免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較したとき、ヒト抗体をヒトとして同定するアミノ酸残基を含む。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。一般的に、特定のヒト生殖細胞系列配列由来のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と最大１０個のアミノ酸の違いを示し得る。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と最大５個、またはさらに最大４、３、２もしくは１個のアミノ酸の違いを示し得る。
同一な抗体
さらに他の態様において、本発明の抗体は、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体の所望の機能特性を維持している、本明細書に記載されている好ましい抗体のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む。例えば、本明細書は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分であって：
（ａ）重鎖可変領域は、配列番号：３７−４２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）軽鎖可変領域は、配列番号：４３−４８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み；そして
（ｃ）抗体はヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、
単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
さらに、またはあるいは、抗体は、上記されている以下の１つ以上の機能特性、例えば、ヒトＬＡＧ−３への結合の高い親和性、サルＬＡＧ−３への結合、マウスＬＡＧ−３への非結合、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を阻害する能力および／または抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を有することができる。
種々の態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
他の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬのアミノ酸配列は、上記配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。上記配列のＶＨおよびＶＬ領域と高い（すなわち、８０％以上）同一性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、配列番号：４９−５４または５５−６０をコードする核酸分子を突然変異（例えば、部位特異的またはＰＣＲ介在突然変異）させ、次に本明細書に記載されている機能アッセイを使用して、維持されている機能（すなわち、上記機能）に関してコードされた改変された抗体を試験することにより、得ることができる。
本明細書において使用される２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと同義である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップ数および各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の＃／位置の全＃×１００）。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、非限定的な例として以下に記載されてような数学アルゴリズムを使用して成し遂げることができる。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）のアルゴリズムを使用して、PAM120 weight residue table、ギャップレングスペナルティー１２およびギャップペナルティー４を使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comにおいて利用することができる）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))のアルゴリズムを使用して、Blossum 62 matrixまたはPAM250 matrixのいずれか、ならびにギャップウェート１６、１４、１２、１０、８、６または４およびレングスウェート１、２、３、４、５または６を使用して決定することができる。
さらに、またはあるいは、本明細書のタンパク質配列は、さらに、例えば、関連配列を同定するために、公のデータベースに対するサーチを行うために、“クエリー配列”として使用することができる。このようなサーチは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、本発明の抗体分子と同一であるアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３で行うことができる。比較目的のためにギャップアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されているとおりに利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が有用である。www.ncbi.nlm.nih.gov、参照。
保存的修飾を有する抗体
１つの態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、１つ以上のこれらのＣＤＲ配列が本明細書に記載されている好ましい抗体（例えば、２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２、１７Ｅ５）に基づく特定のアミノ酸配列またはそれらの保存的修飾を含み、そして本発明の抗ＬＡＧ−３抗体の所望の機能特性を維持している。特定の保存的配列修飾は、抗原結合を取り除くことなく作ることができることが、当分野で理解されている。例えば、Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O'Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6およびBeers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43、参照。したがって、本明細書は：
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号：１３−１４、ＧＧＹおよび１６−１８のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号：３１−３６のアミノ酸配列およびそれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；そして
（ｃ）抗体はヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
さらに、またはあるいは、抗体は、上記されている以下の１つ以上の機能特性、例えば、ヒトＬＡＧ−３への結合の高い親和性、サルＬＡＧ−３への結合、マウスＬＡＧ−３への非結合、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を阻害する能力および／または抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を有することができる。
好ましい態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号：７−１２のアミノ酸配列およびそれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；そして、軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号：２５−３０のアミノ酸配列およびそれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の好ましい態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号：１−６のアミノ酸配列およびそれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；そして、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号：１９−２４のアミノ酸配列およびそれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
種々の態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
本明細書において使用される“保存的配列修飾”なる用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響しないか、または変化させないアミノ酸修飾を示すことを意図する。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当分野で既知の標準技術、例えば、部位特異的突然変異およびＰＣＲ介在突然変異により本発明の抗体に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置換されていてもよく、改変された抗体を本明細書に記載されている機能アッセイを使用して、維持されている機能（すなわち、上記の機能）に関して試験することができる。
抗ＬＡＧ−３抗体と同じエピトープに結合する抗体
他の態様において、本明細書は、本発明の抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体のいずれかと同じＬＡＧ−３上のエピトープに結合する抗体（すなわち、ヒトＬＡＧ−３への結合に対して本発明のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体）を提供する。好ましい態様において、交差競合試験のための参照抗体はモノクローナル抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５であり得る。
このような交差競合抗体は、標準ＬＡＧ−３結合アッセイにおける２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および／または１７Ｅ５と交差競合する能力に基づいて同定することができる。例えば、組換えヒトＬＡＧ−３タンパク質をプレート上に固定し、抗体の１つを蛍光標識し、標識抗体の結合と競合しない非標識抗体の能力を評価する、標準ＥＬＩＳＡアッセイを使用することができる。さらに、またはあるいは、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を、抗体の交差競合する能力を評価するために使用することができる。試験抗体の、例えば、２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および／または１７Ｅ５のヒトＬＡＧ−３への結合を阻害する能力は、試験抗体がヒトＬＡＧ−３への結合に対して２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および／または１７Ｅ５と競合することができ、したがって２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および／または１７Ｅ５と同じヒトＬＡＧ−３上のエピトープに結合することを証明する。好ましい態様において、２５Ｅ３、２５Ｆ７、８Ｂ７、２６Ｈ１０、１１Ｆ２または１７Ｅ５と同じＬＡＧ−３上のエピトープに結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、実施例に記載されているとおりに製造され、単離され得る。
実施例３Ｃにおいてさらに議論されているとおり、２５Ｅ３、２５Ｆ７および８Ｂ７のヒトＬＡＧ−３への結合は、ヒトＬＡＧ−３の第１の細胞外ドメイン内の“余分なループ”領域に位置付けられている。余分なループ領域の配列は配列番号：７９に記載されている。ペプチドスキャン実験を使用して、２５Ｅ３の余分なループ領域への結合は以下のアミノ酸配列：ＰＧＨＰＬＡＰＧ（配列番号：７６）に位置付けられており、２５Ｆ７の余分なループ領域への結合は以下のアミノ酸配列：ＨＰＡＡＰＳＳＷ（配列番号：７７）に位置付けられており、８Ｂ７の余分なループ領域への結合は以下のアミノ酸配列：ＰＡＡＰＳＳＷＧ（配列番号：７８）に位置付けられている。したがって、好ましい態様において、本発明は、アミノ酸配列ＰＧＨＰＬＡＰＧ（配列番号：７６）を含むヒトＬＡＧ−３のエピトープに結合する抗ＬＡＧ−３抗体を提供する。他の好ましい態様において、本発明は、アミノ酸配列ＨＰＡＡＰＳＳＷ（配列番号：７７）またはＰＡＡＰＳＳＷＧ（配列番号：７８）を含むヒトＬＡＧ−３のエピトープに結合する抗ＬＡＧ−３抗体を提供する。

加工および修飾された抗体
本発明の抗体は、さらに、出発抗体から改変された特性を有し得る修飾された抗体を加工するように、出発物質として本明細書に記載されている１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を使用して製造することができる。抗体を、１つまたは両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域および／または１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することにより加工することができる。さらに、または、あるいは、抗体を、例えば、抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することにより加工することができる。
１つの態様において、ＣＤＲグラフト法は抗体の可変領域を加工するために使用することができる。抗体は、主として６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に存在するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列はＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間でさらに異なっている。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク配列にグラフトされた特定の天然抗体のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; 米国特許第５，２２５，５３９；５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号、参照）。
したがって、本発明の他の態様は、それぞれ配列番号：１−６、配列番号：７−１２ならびに配列番号：１３−１４、ＧＧＹおよび１６−１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびに、それぞれ配列番号：１９−２４、配列番号：２５−３０および配列番号：３１−３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関する。したがって、このような抗体はモノクローナル抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を含み、これらの抗体と異なるフレームワーク配列を含み得る。
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは刊行されている文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列のＤＮＡ配列は、“ＶＢａｓｅ”ヒト生殖細胞系列の配列データベース（インターネットwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用できる）、ならびにKabat et al. (1991), cited supra; Tomlinson et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline VH Sequence Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836（これらのそれぞれの内容を出典明示により本明細書に包含させる）において見出すことができる。他の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子に関する生殖細胞系列のＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ データベースにおいて見出すことができる。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂ マウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッションナンバー：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７ ＆ ＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ＿００１０１０９ ＆ ＮＴ＿０２４６３７）および３−７（ＮＧ＿００１０１０９ ＆ ＮＴ＿０２４６３７）において利用することができる。他の例として、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂ マウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッションナンバー：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７ ＆ ＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧ＿００１０１０９ ＆ ＮＴ＿０２４６３７）、４−３４（ＮＧ＿００１０１０９ ＆ ＮＴ＿０２４６３７）、３−３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）＆３−２３（ＡＪ４０６６７８）において利用することができる。
抗体タンパク質配列は、当業者によく知られている、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Altschul et al. (1997)、上記）と称される配列類似検索法の１つを使用して、コンパイルされたタンパク質配列データベースと比較される。
本発明の抗体における使用に好ましいフレームワーク配列は、本発明の選択された抗体により使用されるフレームワーク配列と構造的に類似のもの、例えば、本発明の好ましいモノクローナル抗体により使用されるＶＨ ３−２０（配列番号：６９）、ＶＨ ４−３４（配列番号：６１）、ＶＨ ３−３３（配列番号：６５）またはＶＨ １−２４（配列番号：７３）フレームワーク配列および／またはＶＫ Ｌ１８（配列番号：７１）、ＶＫ Ｌ６（配列番号：６３）またはＶＫ Ａ２７（配列番号：６７）フレームワーク配列と類似のものである。ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子において見出されたものと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフトすることができ、またはＣＤＲ配列を生殖細胞系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域にグラフトすることができる。例えば、ある場合において、抗体の抗原結合力を維持または強化するためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見出されている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号、参照）。
別種の可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域のアミノ酸残基の変異であり、それによって興味ある抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善する。部位特異的突然変異またはＰＣＲ介在突然変異を変異を導入するために実施することができ、抗体結合の作用または興味ある他の機能特性を本明細書および実施例に記載されているインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価することができる。好ましくは保存的修飾（上記）を導入する。変異はアミノ酸の置換、付加または欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、一般的にＣＤＲ領域内の最大１、２、３、４または５個の残基が改変される。
したがって、他の態様において、本明細書は、（ａ）配列番号：１−６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１−６と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号：７−１２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：７−１２と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号：１３−１４、ＧＧＹおよび１６−１８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１３−１４、ＧＧＹおよび１６−１８と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ３領域；を含む重鎖可変領域；（ｄ）配列番号：１９−２４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１９−２４と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号：２５−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：２５−３０と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ２領域；および（ｆ）配列番号：３１−３６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：３１−３６と比較して１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ３領域を含む、単離された抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
本発明の加工された抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に行われたものを含む。一般的にこのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を軽減するために行われる。例えば、１つのアプローチは１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列へと“復帰変異(backmutate)”させることである。さらに特に、体細胞変異がおこった抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体のフレームワーク配列と抗体が由来する生殖細胞系列配列を比較することにより同定することができる。
例えば、表Ａは、フレームワーク領域アミノ酸位置（Ｋａｂａｔ番号方式を使用して）が生殖細胞系列と異なっており、この位置が示されている置換により生殖細胞系列に復帰変異され得る領域を示す：
別種のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を減少させるために、フレームワーク領域内の、さらには１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基の変異を含む。このアプローチは、また、“脱免疫化”として称され、米国特許公報第２００３０１５３０４３号においてさらに詳細に記載されている。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加え、またはあるいは、本発明の抗体は、一般的に１つ以上の抗体の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存細胞毒性を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように加工することができる。さらに、本発明の抗体は、再び１つ以上の抗体の機能特性を改変するために、化学的に修飾させるか（例えば、１つ以上の化学部分を抗体に結合させることができる）、またはそのグリコシル化を改変するために修飾させることができる。これらそれぞれの態様はさらに以下に詳細に記載されている。Ｆｃ領域における残基の番号方式はＫａｂａｔのＥＵ ｉｎｄｅｘのものである。
好ましい態様において、抗体は、重鎖定常領域のヒンジ領域における位置２２８に対応する位置にてセリンからプロリンへの変異を含むＩｇＧ４アイソタイプ抗体である（Ｓ２２８Ｐ；ＥＵ ｉｎｄｅｘ）。この変異は、ヒンジ領域における重鎖中のジスルフィド架橋の不均一性を破壊することが報告されている（Angal et al., 上記；位置２４１はＫａｂａｔ番号方式に基づく）。例えば、種々の態様において、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体は、上記Angal et al.において記載されている位置２４１に対応する位置におけるセリンがプロリンに変異している、ヒトＩｇＧ４定常領域と連結している２５Ｆ７（配列番号：３７）または２６Ｈ１０（配列番号：３８）の重鎖可変領域を含むことができる。したがって、ヒトＩｇＧ４定常領域と連結している２５Ｆ７および２６Ｈ１０重鎖可変領域に関して、この変異はＥＵ ｉｎｄｅｘによるＳ２２８Ｐ変異に対応する。
１つの態様において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基の数が改変、例えば、増加または減少されるように修飾される。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の組み立てを促進するか、または抗体の安定性を増強または低下させるために改変される。
他の態様において、抗体の生体半減期を短縮するために、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させる。さらに特に、１つ以上のアミノ酸変異は、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較してブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を損なうように、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に導入される。このアプローチは米国特許第６，１６５，７４５号においてさらに詳細に記載されている。
他の態様において、生体半減期を延長するために、抗体を修飾する。種々のアプローチが可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているとおり、１つ以上の以下の変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆを導入することができる。あるいは、生体半減期を延長するため、抗体は、米国特許第５，８６９，０４６および６，１２１，０２２号に記載されているとおり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で改変され得る。
さらに他の態様において、抗体のエフェクター機能を改変するために、Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることにより改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が改変されているエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは米国特許第５，６２４，８２１および５，６４８，２６０においてさらに詳細に記載されている。
他の態様において、抗体がＣ１ｑ結合を改変され、そして／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を減少または排除するように、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基により置き換えることができる。このアプローチは米国特許第６，１９４，５５１号においてさらに詳細に記載されている。
他の態様において、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つ以上のアミノ酸残基を改変し、それによって抗体が補体を固定する能力を改変する。このアプローチはＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１においてさらに詳細に記載されている。
さらに他の態様において、Ｆｃ領域は、抗体が抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介在する能力を増強するため、および／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性を増強するために、以下の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９の１つ以上のアミノ酸を修飾することにより修飾される。このアプローチはＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２においてさらに詳細に記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、改良された結合を有する変異体が記載されている（Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604、参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９における特異的変異はＦｃγＲＩＩＩへの結合を改良するために示された。さらに、以下の組合せ変異：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡがＦｃγＲＩＩＩ結合を改良するために示された。
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化は修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体がグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗体の抗原に対する親和性を増強するために改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内でグリコシル化の１つ以上の部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによってその部位のグリコシル化を排除するように行うことができる。このような非グリコシル化は抗体の抗原に対する親和性を増強し得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０および６，３５０，８６１号、参照。
さらに、またはあるいは、抗体は、改変された型のグリコシル化を有する抗体、例えば、少ない量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を製造することができる。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増強することが証明されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現することにより達成することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当分野で報告されており、本発明の組換え抗体を発現する宿主細胞として使用し、それによって改変されたグリコシル化を有する抗体を製造することができる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９はフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ）を欠いており、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞系において発現された抗体は炭水化物においてフコースを欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９ ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置換ベクターを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化破壊により創造した（米国特許公開第２００４０１１０７０４号およびYamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22、参照）。他の例として、ＥＰ１，１７６，１９５は、このような細胞系において発現した抗体がα−１，６結合−関連酵素を減少させるか、または除去することにより低フコシル化を示すような、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊されている細胞系を記載している。ＥＰ１，１７６，１９５は、また、抗体のＦｃ領域に結合するか、または酵素活性を有さない、フコースのＮ−アセチルグルコサミンへの付加に関して低い酵素活性を有する細胞系、例えば、ラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）を記載している。ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースがＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に結合する能力を減少させ、また、宿主細胞において発現された抗体の低フコシル化を引き起こす、変異ＣＨＯ細胞系であるＬｅｃｌ３細胞を記載している（Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）。修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、また、ＰＣＴ公開ＷＯ０６／０８９２３１に記載されているとおり、ニワトリ卵において生産することができる。あるいは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、植物細胞、例えば、Ｌｅｍｎａにおいて生産することができる。植物系における抗体の生成のための方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ ＆ Ｂｉｒｄ ＬＬＰ 代理人整理番号０４０９８９／３１４９１１に対応する米国特許出願に記載されている。ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、加工された細胞系において発現された抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増強を引き起こすバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように加工された細胞系を記載している（Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照）。あるいは、フコシダーゼ酵素を使用して、抗体のフコース残基を開裂させることができる；例えば、フコシダーゼであるα−Ｌ−フコシダーゼは抗体からフコシル残基を除去する（Tarentino et al. (1975) Biochem. 14:5516-23）。
本発明により考慮される本明細書の抗体のさらなる修飾はペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生体（例えば、血清）半減期を延長するためにペグ化することができる。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントは、一般的にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ部分が抗体または抗体フラグメントに結合するようになる条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化は反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）でのアシル化反応またはアルキル化反応により実施することができる。本明細書において使用される“ポリエチレングリコール”なる用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの全ての形態を包含することを意図する。１つの態様において、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当分野で既知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４、参照。
抗体の物理的特性
本明細書の抗体は、異なるクラスを検出および／または区別するために、種々の物理的特性により特徴付けることができる。
本明細書の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の免疫原性の増加または改変された抗原結合による抗体のｐＫの改変をもたらし得る（Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706）。グリコシル化はＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフにおいて起こることが知られている。場合によっては、可変領域グリコシル化を含まない抗ＬＡＧ−３抗体を有することが好ましい。これは、可変領域においてグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択するか、またはグリコシル化領域内の残基を変異することのいずれかにより達成することができる。
好ましい態様において、本明細書の抗体はアスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンのアミド分解は、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で起こり得、ポリペプチド鎖へねじれを導入し、安定性を減少させる（イソアスパラギン酸効果）イソアスパラギン酸残基の創造をもたらす。
それぞれの抗体は、特有の等電点（ｐＩ）を有し、一般的に６から９．５のｐＨ範囲内である。ＩｇＧ１抗体におけるｐＩは一般的に７−９．５のｐＨ範囲内であり、ＩｇＧ４抗体におけるｐＩは一般的に６−８のｐＨ範囲内である。正常範囲外のｐＩにて抗体がインビボ条件下においていくつかのアンフォールディングおよび不安定性を有し得ることが推測されている。したがって、正常範囲内であるｐＩ値を含む抗ＬＡＧ−３抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲内のｐＩを有する抗体を選択すること、または荷電表面残基を変異させることのいずれかにより達成することができる。
それぞれの抗体は、インビボにおいてより良い総合安定性を示す高い融点を有する特徴のある融点を有する（Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71）。一般的に、ＴＭ１（最初のアンフォールディングの温度）が６０℃以上、好ましくは６５℃以上、さらに好ましくは７０℃以上であることが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定（Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52）または円偏光二色性（Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9）を使用して測定することができる。
好ましい態様において、抗体は迅速に分解されないものが選択される。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して測定することができる（Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32）。
他の好ましい態様において、抗体は、望ましくない免疫応答、および／または、変化した、もしくは好ましくない薬物動態学的特性を引き起こし得る凝集効果が最小であるものを選択される。一般的に、抗体は、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下、さらに好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下の凝集において許容される。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含むいくつかの技術により測定することができる。
抗体を加工する方法
上記のとおり、本明細書において提供されているＶＨおよびＶＬ配列を有する抗ＬＡＧ−３抗体は、ＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれに結合した定常領域を修飾することにより、新規抗ＬＡＧ−３抗体を創造するために使用することができる。したがって、本発明の他の局面において、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体の構造的特徴、例えば、２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５を使用して、本発明の抗体の少なくとも１つの機能特性、例えば、ヒトＬＡＧ−３への結合を保持する構造的に関連した抗ＬＡＧ−３抗体を創造する。例えば、２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５の１つ以上のＣＤＲ領域またはそれらの変異は、本明細書に記載されているとおり、さらに、組換え的に加工された本発明の抗ＬＡＧ−３抗体を創造するために、既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲで組換えにより組み合わせることができる。他の型の修飾は前のセクションにおいて記載されているものを含む。加工する方法のための出発物質は、本明細書において提供されている１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域である。加工された抗体を創造するため、本明細書において提供されている１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に作製（すなわち、タンパク質として発現）する必要はない。それどころか、配列に含まれる情報を、元の配列に由来する“第二世代”配列を創造するために出発物質として使用し、次に“第二世代”配列をタンパク質として製造および発現させる。
したがって、他の態様において、本明細書は：
（ａ）（ｉ）配列番号：１−６からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号：７−１２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号：１３−１４、ＧＧＹおよび１６−１８からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；ならびに／または（ｉｉ）配列番号：１９−２４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号：２５−３０からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号：３１−３６からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供し；
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を改変し、少なくとも１個が改変された抗体配列を創造し；そして
（ｃ）タンパク質として改変された抗体配列を発現する
ことを含む、抗ＬＡＧ−３抗体を製造するための方法を提供する。
標準分子生物学技術は、改変された抗体配列を製造し、発現させるために使用することができる。
好ましくは、改変された抗体配列によってコードされる抗体は、１つ、いくつか、またはすべての本明細書に記載されている抗ＬＡＧ−３抗体の機能特性を維持しているものであって、機能特性は以下のもの：
（ｉ）ヒトＬＡＧ−３への結合の高い親和性；
（ｉｉ）サルＬＡＧ−３への結合；
（ｉｉｉ）マウスＬＡＧ−３への非結合
（ｉｖ）ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を阻害する能力；および／または
（ｖ）免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激する能力
を含むが、これらに限定されない。
改変された抗体の機能特性は、当分野で利用できる、および／または本明細書に記載されている標準アッセイ、例えば、実施例に記載されているものを使用して評価することができる。
本発明の抗体を加工する方法の１つの態様において、変異は抗ＬＡＧ−３抗体コード配列の全体または一部にランダムまたは選択的に導入することができ、得られた修飾された抗ＬＡＧ−３抗体を本明細書に記載されている結合活性および／または他の機能特性に関してスクリーニングすることができる。変異方法は当分野で報告されている（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０およびＷＯ０３／０７４６７９、参照）。
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の他の局面は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、完全な細胞で、細胞溶解物で、または部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態で存在してよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ結合、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他当分野で既知の技術を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞性核酸またはタンパク質から精製されたとき、“単離された”または“実質的に純粋にされた”である。Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York、参照。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、イントロン配列を含んでいても含まなくてもよい。好ましい態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
本発明の核酸は標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載しているとおりのヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスから製造されたハイブリドーマ）により発現された抗体に関して、ハイブリドーマにより製造された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）得られた抗体に関して、このような抗体をコードする核酸は遺伝子ライブラリーから回収することができる。
好ましい本発明の核酸分子は、２５Ｅ３、２５Ｆ７、８Ｂ７、２６Ｈ１０、１１Ｆ２および１７Ｅ５モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。２５Ｅ３、２５Ｆ７、８Ｂ７、２６Ｈ１０、１１Ｆ２および１７Ｅ５のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号：４９−５４にて示されている。２５Ｅ３、２５Ｆ７、８Ｂ７、２６Ｈ１０、１１Ｆ２および１７Ｅ５のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号：５５−６０にて示されている。
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたとき、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡフラグメントは、他のタンパク質、例えば、抗体定常領域もしくはフレキシブルリンカーをコードする他のＤＮＡフラグメントに作動可能に連結されている。この文脈において使用されるとき“作動可能に連結された”なる用語は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に残るように、２つのＤＮＡフラグメントが連結されることを意味することを意図する。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で既知であり（例えば、Kabat et al. (1991)、上記）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得るが、より好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子に関して、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で既知であり（例えば、Kabat et al.、上記）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。好ましい態様において、軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。
ｓｃＦｖ遺伝子を創造するため、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、フレキシブルリンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有するＶＨおよびＶＬ配列が連続する一本鎖タンパク質として発現することができるように、フレキシブルリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする他のフラグメントに作動可能に連結される（例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554、参照）。
本発明のモノクローナル抗体の生成
本明細書のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495の標準体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技術を使用して、生産することができる。モノクローナル抗体を生産するための他の態様は、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換およびファージディスプレイ技術を含む。キメラまたはヒト化抗体も当分野で知られている。例えば、米国特許第４，８１６，５６７；５，２２５，５３９；５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０、参照（これらの内容を出典明示によりその全体を明確に本明細書に包含させる）。
好ましい態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ヒトＬＡＧ−３に対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろヒト免疫系部分を有する遺伝子導入されたまたは染色体導入されたマウスを使用して製造することができる。これらの遺伝子導入されたまたは染色体導入されたマウスは、本明細書において各々ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）およびＫＭマウス（登録商標）と称されるマウスを含み、本明細書において“ヒトＩｇマウス”と総称される。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Medarex(登録商標), Inc.）は、内因性μおよびκ鎖座を不活性化する標的変異とともに、非再配置ヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を含む（例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859、参照）。したがって、マウスはマウスＩｇＭまたはκの発現低下を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラス切り換えと体細胞変異を受け、高い親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを製造する（Lonberg et al. (1994)、上記; Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding and Lonberg (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）の製造および使用ならびにこのようなマウスが有するゲノム修飾は、さらにTaylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor et al. (1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851に記載されている（これらの全ての内容を出典明示によりその全体を明確に本明細書に包含させる）。さらに、米国特許第５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，７８９，６５０；５，８７７，３９７；５，６６１，０１６；５，８１４，３１８；５，８７４，２９９；５，７７０，４２９；および５，５４５，８０７号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１８；ＷＯ９３／１２２２７；ＷＯ９４／２５５８５；ＷＯ９７／１３８５２；ＷＯ９８／２４８８４；ＷＯ９９／４５９６２およびＷＯ０１／１４４２４（これらの内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる）。
他の態様において、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有するマウスを使用して製造することができる。“ＫＭマウス（登録商標）”として本明細書で称されるこのようなマウスは、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８において詳細に記載されている。内因性ＦｃγＲＩＩＢ受容体遺伝子のホモ接合体の崩壊をさらに含むこのマウスの修飾された形態も、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に記載されており、“ＫＭ／ＦＣＧＲ２Ｄマウス（登録商標）”と称されている。加えて、ＨＣｏ７もしくはＨＣｏ１２重鎖導入遺伝子のいずれか、またはその両方を有するマウスを使用することができる。
さらなる遺伝子導入動物の態様は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅを含む（Abgenix, Inc.、米国特許第５，９３９，５９８；６，０７５，１８１；６，１１４，５９８；６，１５０，５８４および６，１６２，９６３号）。さらなる態様は、“ＴＣマウス”（Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727）およびヒト重鎖および軽鎖導入染色体を有するウシ（Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894；ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２８１２）を含む。これらの特許および刊行物の内容を出典明示によりその全体を明確に本明細書に包含させる。
１つの態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ方法を使用して製造される。例えば、米国特許第５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５８０，７１７；５，９６９，１０８；６，１７２，１９７；５，８８５，７９３；６，５２１，４０４；６，５４４，７３１；６，５５５，３１３；６，５８２，９１５；および６，５９３，０８１号、参照（これらの内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる）。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体応答が免疫化で製造され得るように、ヒト免疫細胞を再構成したＳＣＩＤマウスを使用して製造することもできる。例えば、米国特許第５，４７６，９９６および５，６９８，７６７号、参照（これらの内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる）。
他の態様において、ヒト抗ＬＡＧ−３抗体は、ファージがＬＡＧ−３であらかじめ免疫化された遺伝子導入動物において生産される抗体をコードする核酸を含む、ファージディスプレイを使用して製造される。好ましい態様において、遺伝子導入動物はＨｕＭａｂ、ＫＭまたはＫｉｒｉｎマウスである。例えば、米国特許第６，７９４，１３２号、参照（この内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる）。
ヒトＩｇマウスの免疫化
本発明の１つの態様において、ヒトＩｇマウスは、ＬＡＧ−３抗原、組換えＬＡＧ−３タンパク質またはＬＡＧ−３タンパク質を発現する細胞の精製または濃縮された製造物にて免疫化される。例えば、Lonberg et al. (1994)、上記; Fishwild et al. (1996)、上記；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８８４またはＷＯ０１／１４４２４、参照（これらの内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる）。好ましい態様において、６−１６週齢マウスを５−５０μｇのＬＡＧ−３タンパク質にて免疫化する。あるいは、非−ＬＡＧ−３ポリペプチドに融合したＬＡＧ−３の部分を使用する。
１つの態様において、遺伝子導入マウスを、完全フロイントアジュバント中のＬＡＧ−３抗原を腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）投与により免疫化させ、次に、不完全フロイントアジュバント中の抗原をＩＰまたはＩＶ免疫化させる。他の態様において、フロイント以外のアジュバントまたはアジュバントの非存在下で全細胞を使用する。血漿をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、十分な力価の抗ＬＡＧ−３ヒト免疫グロブリンを有するマウス由来の細胞を融合のために使用することができる。
本発明のヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの製造
本発明のヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを製造するため、免疫マウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、適当な不死化細胞系、例えば、マウス骨髄腫細胞系に融合することができる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の生成に関してスクリーニングすることができる。ハイブリドーマの製造は当分野で知られている。例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York、参照。
本発明のモノクローナル抗体を生産するトランスフェクトーマの製造
本発明の抗体は、また、例えば、当分野で既知である組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマ中で製造することができる（例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202）。１つの態様において、標準分子生物学技術により得られる部分的または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳調節配列に作動可能に連結されるように、１つ以上の発現ベクターに挿入される。これに関して、“作動可能に連結された”なる用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図された機能を果たすように、ベクターに連結されることを意味することを意図する。
“調節配列”なる用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳をコントロールするプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)）に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびパピローマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス調節配列は、例えば、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターを使用され得る。なおさらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーターおよびヒト１型Ｔ細胞白血病ウイルスの長い末端反復配列からの配列を含む異なる源からの配列、例えば、ＳＲαプロモーター系を含む（Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。発現ベクターおよび発現コントロール配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。
抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、同じ、または異なる発現ベクターに挿入することができる。好ましい態様において、可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントと作動可能に連結し、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントと作動可能に連結するように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターに可変領域を挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を創造するために使用される。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞から抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームにおいて抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結するように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）および選択マーカー遺伝子を有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが挿入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６；４，６３４，６６５および５，１７９，０１７号、参照）。例えば、一般的に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが挿入されている宿主細胞において薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８の選択のため）を含む。
軽鎖および重鎖の発現のため、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。“トランスフェクション”なる用語の種々の形態は、外来ＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞に導入するために一般的に使用されている広範な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを含むことを意図する。原核生物または真核生物宿主細胞のいずれにおいても本発明の抗体を発現させることは理論上可能であるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞が、原核細胞よりも適当に折りたたまれた免疫学的に活性な抗体をアッセンブルおよび分泌しやすいため、真核細胞、より好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が非常に好ましい。
本発明の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621に記載されているようなＤＨＦＲ選択可能マーカーと使用されるUrlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ− ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞の使用に関して、さらなる好ましい発現系はＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１に記載されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入するとき、宿主細胞中で抗体の発現、または、より好ましくは、宿主細胞を増殖させる培養培地中への抗体の分泌を可能にする十分な時間、宿主細胞を培養することにより抗体を製造する。抗体は標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収することができる。
抗原への抗体結合の特性化
本発明の抗体は、例えば、標準ＥＬＩＳＡにより、ヒトＬＡＧ−３への結合に対して試験することができる。抗−ＬＡＧ−３ヒトＩｇＧは、さらにウエスタンブロット法によりＬＡＧ−３抗原における反応性を試験することができる。本発明の抗体の結合特異性は、また、ＬＡＧ−３タンパク質を発現する細胞への抗体の結合をモニタリングすること、例えば、フローサイトメトリーにより測定することができる。これらの方法は当分野で既知である。例えば、Harlow and Lane (1988)、上記参照。
免疫抱合体
本発明の抗体は、免疫抱合体、例えば、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するために治療剤と結合させることができる。適当な治療剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩもしくはＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および抗有糸分裂剤を含む。ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、好ましくは、開裂可能なリンカー、例えば、ペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーを介して結合される。さらに好ましくは、リンカーは、ペプチジルリンカー、例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号：１５）、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００；６，９８９，４５２；および７，１２９，２６１号；ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０；ＷＯ０７／０３８６５８；ＷＯ０７／０５１０８１；ＷＯ０７／０５９４０４；ＷＯ０８／０８３３１２；およびＷＯ０８／１０３６９３；米国特許公開２００６００２４３１７；２００６０００４０８１；および２００６０２４７２９５に記載されているとおりに製造することができる（これらの記載を出典明示により本明細書に包含させる）。
二重特異性分子
他の局面において、本発明は、少なくとも１つの他の機能分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド）と連結している抗ＬＡＧ−３抗体を含む二重特異性分子を特徴とし、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を製造する。したがって、本明細書において使用される“二重特異性分子”は３つ以上の特異性を有する分子を含む。好ましい態様において、二重特異性分子は、ＬＡＧ−３に対する第１の結合特異性およびＬＡＧ−３を発現する標的細胞を殺すことができる細胞毒性エフェクター細胞を補充するトリガー分子に対する第２の結合特異性を含む。適当なトリガー分子の例はＣＤ６４、ＣＤ８９、ＣＤ１６およびＣＤ３である。例えば、Kufer et al., TRENDS in Biotechnology, 22 (5), 238-244 (2004)、参照。
１つの態様において、二重特異性分子は、抗−Ｆｃ結合特異性および抗−ＬＡＧ−３結合特異性に加えて、第３の特異性を有する。第３の特異性は、抗増強因子(anti-enhancement factor)（ＥＦ）、例えば、細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫応答を増加させる分子に対してであり得る。例えば、抗増強因子は、細胞毒性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０またはＩＣＡＭ−１を介して）または他の免疫細胞に結合し、標的細胞に対する免疫応答を増加させることができる。
二重特異性分子は多数の異なる形式およびサイズであり得る。粒径スペクトルの一方において、二重特異性分子は、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、それぞれ異なる特異性を有する２つの結合アームを有することを除いては伝統的な抗体形式を維持している。他方において、ペプチド鎖により連結した２つの一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ’ｓ）、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２構築物からなる二重特異性分子である。中間サイズの二重特異性分子は、ペプチジルリンカーにより連結した２つの異なるＦ（ａｂ）フラグメントを含む。これらの二重特異性分子および他の形式は、遺伝子工学、体細胞ハイブリダイゼーションまたは化学的手法により製造することができる。例えば、Kufer et al, 上記; Cao and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998);およびvan Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391-397 (2000)、参照（本明細書に記載されている）。
医薬組成物
他の局面において、本明細書は、製剤化された本明細書の抗体を薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物を提供する。所望により１種以上のさらなる薬学的に活性な成分、例えば、他の抗体または薬物を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、また、抗ＬＡＧ−３抗体がワクチンに対する免疫応答を増強するように、例えば、他の免疫刺激剤、抗癌剤、抗ウイルス剤またはワクチンと併用療法において投与することができる。
医薬組成物はあらゆる賦形剤を含み得る。使用することができる賦形剤は、担体、界面活性剤、増粘剤または乳化剤、固体結合剤、分散もしくは懸濁補助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、崩壊剤、滑剤、甘味剤、防腐剤、等張剤およびそれらの組合せを含む。適当な賦形剤の選択および使用は、Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)（この記載は出典明示により本明細書に包含させる）に教示されている。
好ましくは、医薬組成物は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適当である。投与経路に依存して、活性な化合物は、不活性にし得る酸の作用および他の天然条件から保護するために物質に覆われていてもよい。本明細書において使用されるフレーズ“非経口投与”は、経腸および局所投与以外の通常注射による投与方式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含むが、これらに限定されない。あるいは、本発明の抗体は、非経口経路、例えば、局所、表皮または粘膜投与経路により、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的に投与され得る。
本発明の医薬化合物は薬学的に許容される塩の形態であり得る。“薬学的に許容される塩”は、親化合物の所望の生物学的活性を保持するが、望ましくない毒性作用を付与しない塩を意味する。このような塩の例は酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、無毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸など、ならびに無毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などに由来するものを含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに無毒性の有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものを含む。
医薬組成物は滅菌水溶液または分散媒の形態であり得る。それらは、また、マイクロエマルジョン、リポソームまたはその他の高濃度の薬物に適した調整構造物において製剤化され得る。
単位投与形態を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される対象および特定の投与経路に依存して変化し、一般的に治療効果を引き起こす組成物の量である。一般的に、１００％のうち、この量は薬学的に許容される担体との組み合わせで、活性成分が約０．０１％から約９９％、好ましくは約０．１％から約７０％、さらに好ましくは約１％から約３０％の範囲である。
投与レジメンは所望の最適応答（例えば、治療応答）を提供するために調節される。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、経時的に数回の分割投与で投与してもよく、または治療状況の緊急性により指示されるとき、比例的に用量を減少または増加してもよい。とりわけ、投与の容易性および投与量の均一性のため、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが有利である。本明細書において使用される投与単位形態は、処置される対象に対する単位用量として適した物理的に分離した単位を意味し；それぞれの単位は必要な医薬担体と一緒に所望の治療効果を引き起こすように計算されたあらかじめ決められた量の活性な化合物を含む。あるいは、頻繁な投与があまり必要でない場合、抗体は徐放性製剤として投与することができる。
抗体の投与に関して、用量は約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常、０．０１から５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。典型的な処置レジメンは１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１月に１回、３月に１回または３から６月に１回の投与を必要とする。本発明の抗ＬＡＧ−３抗体のための好ましい投与レジメンは、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、抗体を下記投与スケジュール：（ｉ）４週間ごとに６回投与、次に３月ごと；（ｉｉ）３週間ごと；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、次に３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重の１つを使用して与える。いくつかの方法において、用量は約１−１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調節され、いくつかの方法において約２５−３００μｇ／ｍｌである。
本発明の抗ＬＡＧ−３抗体の“治療有効量”は、好ましくは病状の重症度の減少、疾患の無症状期間の頻度および持続時間の増加、または病気の苦痛に起因する欠陥または障害の阻止をもたらすものである。例えば、腫瘍を有する対象の処置に関して、“治療有効量”は、未処置の対象と比較して、好ましくは腫瘍増殖を少なくとも約２０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％阻害する。治療有効量の治療化合物は、腫瘍サイズを減少させるか、または一般的にヒトもしくは他の哺乳動物である対象における症状を改善することができる。
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤であり得る。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978、参照。
治療組成物は、医療デバイス、例えば、（１）無針皮下注射デバイス（例えば、ＵＳ５，３９９，１６３；５，３８３，８５１；５，３１２，３３５；５，０６４，４１３；４，９４１，８８０；４，７９０，８２４；および４，５９６，５５６）；（２）微小注入ポンプ（ＵＳ４，４８７，６０３）；（３）経皮デバイス（ＵＳ４，４８６，１９４）；（４）点滴装置（ＵＳ４，４４７，２３３および４，４４７，２２４）；および（５）浸透デバイス（ＵＳ４，４３９，１９６および４，４７５，１９６）；（これらの文献は出典明示により本明細書に包含される）を介して投与することができる。
１つの態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、インビボで適切な分布を確実にするため製剤化することができる。例えば、本発明の治療化合物が血液脳関門を通過することを確実にするため、それらはリポソーム中で製剤化することができ、これはさらに特定の細胞または臓器への選択的輸送を増強するための標的分子を含み得る。例えばＵＳ４，５２２，８１１；５，３７４，５４８；５，４１６，０１６；および５，３９９，３３１；V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; およびKillion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273、参照。
本発明の使用および方法
本発明の抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ＬＡＧ−３の検出またはＬＡＧ−３の遮断(Blockade)による免疫応答の増強に関する、多数のインビトロおよびインビボにおける有用性を有する。好ましい態様において、本発明の抗体はヒト抗体である。例えば、これらの分子は、種々の状態における免疫を増強するために、インビトロまたはエキソビボにおいて培養中の細胞、または、例えば、インビボにおいてヒト対象に投与することができる。したがって、１つの局面において、本発明は、対象における免疫応答が修飾されるように、本発明の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を修飾する方法を提供する。好ましくは、応答は増強されるか、刺激されるか、または上方制御される。
好ましい対象は、免疫応答の増強の必要なヒト患者を含む。方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞介在免疫応答）を増加させることにより処置することができる障害を有するヒト患者を処置するために特に適当である。特定の態様において、方法はインビボにおける癌の処置に特に適当である。免疫の抗原特異的増強を達成するために、抗ＬＡＧ−３抗体を興味ある抗原と共に投与するか、または抗原がすでに処置される対象（例えば、腫瘍を有するか、またはウイルスを有する対象）に存在する。ＬＡＧ−３に対する抗体を他の薬剤と共に投与するとき、その２つは順にまたは同時にのいずれかで投与することができる。
本発明は、さらに、抗体またはその部分とヒトＬＡＧ−３の複合体の形成を可能にする条件下で、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分とサンプルおよび対照サンプルを接触させることを含む、サンプルにおけるヒトＬＡＧ−３抗原の存在を検出するか、またはヒトＬＡＧ−３抗原の量を測定するための方法を提供する。次に複合体の形成を検出する（対照サンプルと比較して、サンプル間の複合体形成の違いがサンプルにおけるヒトＬＡＧ−３抗原の存在を示す）。さらに、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体は、イムノアフィニティー精製を介して、ヒトＬＡＧ−３を精製するために使用することができる。
ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を阻害し、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体の能力を考慮すると、本発明は、また、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するか、増強するか、または上方制御するために、インビトロまたはインビボにて本発明の抗体を使用する方法を提供する。例えば、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように、該Ｔ細胞を本発明の抗体と接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法を提供する。抗原特異的Ｔ細胞応答の適当なあらゆる指標が、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定するために使用することができる。このような適当な指標の非限定的な例は、抗体の存在下におけるＴ細胞増殖の増加および／または抗体の存在下におけるサイトカイン生成の増加を含む。好ましい態様において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン−２生成が刺激される。
本発明は、また、対象における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）が刺激されるように、本発明の抗体を対象に投与することを含む、対象における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激する方法を提供する。好ましい態様において、対象は腫瘍を有する対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。他の好ましい態様において、対象はウイルスを有する対象であり、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
他の局面において、本発明は、腫瘍の増殖を対象において阻害するように、本発明の抗体を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。さらに他の局面において、本発明は、ウイルス感染を対象において処置するように、本発明の抗体を対象に投与することを含む、対象におけるウイルス感染を処置する方法を提供する。
本発明のこれらの方法および他の方法は、以下にさらに詳細に記載されている。
癌
抗体によるＬＡＧ−３の遮断は、患者における癌細胞に対する免疫応答を増強することができる。１つの局面において、本発明は、癌性腫瘍の増殖が阻害されるように、抗ＬＡＧ−３抗体を使用するインビボにおける対象の処置に関する。抗ＬＡＧ−３抗体は、癌性腫瘍の増殖を阻害するために単独で使用することができる。あるいは、抗ＬＡＧ−３抗体は、以下に記載されているように、他の免疫原、標準癌処置または他の抗体と共に使用することができる。
したがって、１つの態様において、本発明は、治療有効量の抗ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗ＬＡＧ−３抗体（本明細書に記載されているヒト抗−ヒトＬＡＧ−３抗体のいずれかのような）である。さらに、またはあるいは、抗体はキメラまたはヒト化抗ＬＡＧ−３抗体であり得る。
本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得る好ましい癌は、一般的に免疫療法に応答する癌を含む。処置のために好ましい癌の非限定的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌腫）、前立腺癌（例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌）、乳癌、大腸癌および肺癌（例えば、非小細胞性肺癌）を含む。さらに、本発明は、本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得る難治性または再発性悪性腫瘍を含む。
本発明の方法を使用して処置することができるほかの癌の例は、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸の癌腫、腟の癌腫、外陰の癌腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性白血病、幼児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘導される癌を含む環境的に誘導される癌、および前記癌の組合せを含む。本発明は、また、転移性癌、とりわけＰＤ−Ｌ１を発現する転移性癌の処置に有用である（Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144）。
所望により、ＬＡＧ−３に対する抗体は、免疫原、例えば、癌細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞（He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28）と組み合わせることができる。使用され得る腫瘍ワクチンの非限定的な例は、黒色腫抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチド、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞（以下にさらに記載されている）を含む。
ヒトにおいて、いくつかの腫瘍、例えば、黒色腫は免疫原性であることが示されている。ＬＡＧ−３遮断によるＴ細胞活性化の閾値を上げることにより、宿主における腫瘍応答を活性化させることができる。
ＬＡＧ−３遮断は、ワクチン接種プロトコールと組み合わされたとき、さらに有効である可能性がある。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている（Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738、参照;Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Editionも参照。）。これらの戦略の１つにおいて、ワクチンは自己または同種異系の腫瘍細胞を使用して製造される。これらの細胞ワクチンは、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように腫瘍細胞に形質導入されるとき、さらに有効であることが示された。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種に対する抗原提示の強力な活性化因子であることが示されている（Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43）。
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模な遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原が定義された（Rosenberg, SA (1999) Immunity 10: 281-7）。多数の場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍および腫瘍が発生した細胞において発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことには、これらの多数の抗原は、宿主において見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることを示すことができる。ＬＡＧ−３遮断は、これらのタンパク質に対する免疫応答を発生させるために、腫瘍において発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの回収物と共に使用することができる。これらのタンパク質は、通常、免疫系により自己抗原として見られ、したがって、それらに対して寛容性である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成のために必要であり、ヒト癌の８５％以上および非常に限定された体細胞組織において発現されている、タンパク質テロメラーゼを含むことができる（Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013）。（これらの体細胞組織は、種々の手段により免疫攻撃から保護され得る）。腫瘍抗原は、また、タンパク質配列を改変するか、または２つの無関係な配列（すなわち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂｌ）間の融合タンパク質を創造する体細胞変異による癌細胞において発現される“新抗原”、またはＢ細胞腫瘍由来のイディオタイプであり得る。
他の腫瘍ワクチンは、ヒト癌に関与するウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）由来のタンパク質を含み得る。ＬＡＧ−３遮断と共に使用され得る腫瘍特異的抗原の他の形態は、腫瘍組織それ自体から単離された精製された熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は腫瘍細胞由来のタンパク質のフラグメントを含む、これらのＨＳＰは腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達において非常に効率的である（Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120）。
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を起こすために使用され得る強力な抗原提示細胞である。ＤＣを、エキソビボにおいて生産し、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物で充填することができる（Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332）。ＤＣは、また、遺伝的手段により形質導入され、これらの腫瘍抗原を同様に発現することができる。ＤＣは、また、免疫化の目的のために、腫瘍細胞に直接融合されている（Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化は、ＬＡＧ−３遮断と有効に組み合わせて、さらに強力な抗腫瘍応答を活性化することができる。
ＬＡＧ−３遮断は、また、標準癌処置と組み合わせられ得る。ＬＡＧ−３遮断は、化学療法レジメンと有効に組み合わせられ得る。これらの場合、投与される化学療法剤の用量を減少させることができる可能性がある（Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304）。このような組合せの例は、黒色腫の処置のためにデカルバジンと組み合わせられた抗ＬＡＧ−３抗体である。このような組合せの他の例は、黒色腫の処置のためにインターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わせられた抗ＬＡＧ−３抗体である。ＬＡＧ−３遮断および化学療法の組合せ使用を支持する科学的論拠は、多数の化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増加をもたらすはずであるというものである。細胞死を介してＬＡＧ−３遮断と相乗効果をもたらし得る他の組合せ治療は、放射線、外科手術およびホルモン遮断である。これらのそれぞれのプロトコールは、宿主における腫瘍抗原の源を創造する。血管形成阻害剤は、また、ＬＡＧ−３遮断と組み合わせられ得る。血管形成の阻害は腫瘍細胞死を誘導し、腫瘍抗原を宿主の抗原提示経路に提供し得る。
ＬＡＧ−３を遮断する抗体は、また、ＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現するエフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化する二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５および５，８３７，２４３号、参照）。二重特異性抗体は、２つの別々の抗原を標的化するために使用することができる。例えば、抗−Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、マクロファージを腫瘍部位に標的化するために使用されている。この標的化は腫瘍特異的応答をさらに有効に活性化し得る。Ｔ細胞群のこれらの応答はＬＡＧ−３遮断の使用により増加し得る。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体の使用によりＤＣに直接送達され得る。
腫瘍は、多種多様のメカニズムにより宿主の免疫監視から逃れる。多数のこれらのメカニズムは、腫瘍により発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化により克服され得る。これらは、数ある中でＴＧＦ−β（Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050）、ＩＬ−１０（Howard & O’Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200）およびＦａｓリガンド（Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365）を含む。これらの存在物それぞれに対する抗体は、免疫抑制剤の効果を中和し、宿主による腫瘍免疫応答を支持するために、抗−ＬＡＧ−３と組み合わせて使用することができる。
宿主の免疫応答性を活性化する他の抗体は、抗−ＬＡＧ−３と組み合わせて使用することができる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する、樹状細胞の表面上の分子を含む。抗−ＣＤ４０抗体は、有効にＴ細胞ヘルパー活性と置き換えることができの代わりに（Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478）、ＬＡＧ−３抗体と共に使用することができる（Ito et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40）。例えば、ＣＴＬＡ−４（例えば、米国特許第５，８１１，０９７号）、ＯＸ−４０（Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169）、４−１ＢＢ（Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997)およびＩＣＯＳ（Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266）のようなＴ細胞共刺激分子に対する抗体の活性化は、また、Ｔ細胞活性化のレベルを増加させるために提供され得る。
骨髄移植は、現在、造血起源の種々の腫瘍を処置するために使用されている。移植片対宿主病はこの処置の結果であるが、治療利益は移植片対腫瘍応答から得ることができる。ＬＡＧ−３遮断は、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増加させるために使用することができる。
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、エキソビボにおける抗原特異的Ｔ細胞の活性化および増殖ならびにこれらの細胞のレシピエントへの養子移入に関連する、いくつかの実験的処置プロトコールもある（Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51）。これらの方法は、また、感染因子、例えば、ＣＭＶに対するＴ細胞応答を活性化するために使用することができる。抗ＬＡＧ−３抗体の存在下におけるエキソビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度および活性を増加させることができる。
感染症
本発明の他の方法は、特定の毒素または病原体に暴露されている患者を処置するために使用される。したがって、本発明の他の局面は、対象が感染病を処置されるように、抗ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む対照における感染病を処置する方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗−ヒトＬＡＧ−３抗体（本明細書に記載されているヒト抗ＬＡＧ−３抗体のいずれかのような）である。さらに、またはあるいは、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。
上記の腫瘍に対する適用と同様に、抗体介在ＬＡＧ−３遮断は、病原体、毒素および自己−抗原に対する免疫応答を刺激するために、単独またはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて使用することができる。この治療アプローチが特に有用であり得る病原体の例は、現在、有効であるワクチンがない病原体、または慣用のワクチンが十分に有効でない病原体を含む。これらは、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ＆Ｃ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌を含むが、これらに限定されない。ＬＡＧ−３遮断は、感染因子、例えば、感染の経過にわたって改変した抗原が存在するＨＩＶにより確立されている感染に対して特に有用である。これらの新規エピトープは、抗−ヒトＬＡＧ−３投与時に外来物として認識され、したがって、ＬＡＧ−３を介する負のシグナルにより抑制されない強いＴ細胞応答を刺激する。
本発明の方法により処置することができる感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例は、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コルノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスを含む。
本発明の方法により処置することができる感染症を引き起こす病原性細菌のいくつかの例は、クラミジア、リケッチア細菌、ミコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌(pneumonococci)、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風菌、ボツリヌス、炭疽菌、ペスト、レプトスピラおよびライム病菌を含む。
本発明の方法により処置することができる感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例は、カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリスなど）、クリプトコックス・ネオフォルマンス、アスペルギルス（フミガーツス、ニガー(niger)など）、ケカビ（ケカビ、アブシディア、クモノスカビ）、スポロトリックス・シェンキー、ブラストマイセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミティスおよびヒストプラスマ・カプスラーツムを含む。
本発明の方法により処置することができる感染症を引き起こす病原寄生虫のいくつかの例は、赤痢アメーバ、大腸バランチジウム、フォーラーネグレリア、アカントアメーバ属、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム属、ニューモシスティス・カリニ、三日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、トリパノソーマ・ブルーセイ、クルーズ・トリパノソーマ、ドノバン・リーシュマニア、トキソプラズマ原虫、ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス(Nippostrongylus brasiliensis)を含む。
上記方法のすべてにおいて、ＬＡＧ−３遮断は、免疫療法の他の形態、例えば、サイトカイン処置（例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）、または腫瘍抗原の提示の増強を提供する二重特異性抗体治療と組み合わせることができる（例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123、参照）。
自己免疫反応
抗−ＬＡＧ−３抗体は自己免疫応答を誘導および増幅し得る。実際に、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを使用する抗腫瘍応答の誘導は、多数の抗腫瘍応答が抗−自己反応性に関連することを示す（van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4）。したがって、疾患処置に関するこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に発生させるようにワクチン接種プロトコールを考案するために、種々の自己タンパク質と共に抗−ＬＡＧ−３遮断を使用することを考えることができる。例えば、アルツハイマー病は脳においてアミロイド沈着におけるＡβペプチドの不適当な蓄積に関する；アミロイドに対する抗体反応は、これらのアミロイド沈着を明らかにすることができる（Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177）。
他の自己タンパク質、例えば、アレルギーおよび喘息の処置に関するＩｇＥならびにリウマチ性関節炎に関するＴＮＦαも、標的として使用することができる。最後に、種々のホルモンに対する抗体反応が、抗ＬＡＧ−３抗体の使用により誘導され得る。生殖ホルモンに関する抗体反応を中和することは、避妊のために使用することができる。特定の腫瘍の増殖のために必要であるホルモンおよび他の可溶性因子に関する抗体反応を中和することも、可能なワクチン標的として考えることができる。
抗ＬＡＧ−３抗体の使用に関する上記の類似の方法は、他の自己−抗原、例えば、アルツハイマー病におけるＡβを含むアミロイド沈着、サイトカイン、例えば、ＴＮＦαおよびＩｇＥの不適当な蓄積を有する患者を処置するために、治療的自己免疫応答の誘導のために使用することができる。
ワクチン
抗−ＬＡＧ−３抗体は、抗ＬＡＧ−３抗体と興味ある抗原（例えば、ワクチン）の共投与により、抗原特異的免疫応答を刺激するために使用することができる。したがって、他の局面において、本発明は、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように、（ｉ）抗原；および（ｉｉ）抗ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗−ヒトＬＡＧ−３抗体（本明細書に記載されているヒト抗ＬＡＧ−３抗体のいずれかのような）である。さらに、またはあるいは、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来の抗原であり得る。このような抗原の非限定的な例は、上記のセクションにおいて記載されているもの、例えば、上記腫瘍抗原（または腫瘍ワクチン）、または上記ウイルス、細菌もしくは他の病原体由来の抗原を含む。
インビボおよびインビトロにおいて本発明の抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに免疫抱合体）を投与する適当な経路は、当分野で既知であり、当業者により選択することができる。例えば、抗体組成物は注射により（例えば、静脈内または皮下に）投与され得る。使用される分子の適当な用量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または製剤化に依存している。
前記のとおり、本発明のヒト抗ＬＡＧ−３抗体は、１つ以上のさらなる治療剤、例えば、細胞毒性剤、放射毒性物質または免疫抑制剤と共投与することができる。抗体は、薬物と組合せられてよく（免疫複合体として）、また薬物と別々に投与されてもよい。後者の場合（別々の投与）において、抗体は薬物の前、後もしくは同時に投与されてよく、また、他の既知の治療、例えば、抗癌療法、例えば、放射線療法と共投与されてもよい。このような治療剤は、数ある中の抗腫瘍剤、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラスチン硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシウレア（これらはそれら自体、患者に対して毒性または準毒性であるレベルでのみ有効である）を含む。シスプラスチンは４週間毎に１回１００ｍｇ／ｍｌ用量として静脈内に投与され、アドリアマイシンは２１日ごとに１回６０−７５ｍｇ／ｍｌ用量として静脈内に投与される。本発明のヒト抗ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントと化学療法剤との共投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性作用をもたらす異なるメカニズムを介して機能する２つの抗癌剤を提供する。このような共投与は、抗体と非反応性にする薬物耐性の発生または腫瘍細胞の抗原性の変化による問題を解決することができる。
本発明の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性分子または免疫抱合体）および素養のための指示書を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、少なくとも１つのさらなる試薬または１つ以上のさらなる本発明のヒト抗体（例えば、第１のヒト抗体と異なるＬＡＧ−３抗原におけるエピトープに結合する相補的な活性を有するヒト抗体）をさらに含むことができる。キットは、一般的にキットの内容物の意図される使用を指示するラベルを含む。ラベルなる用語は、キット上もしくはキットと共に提供されている、または別な方法でキットに添付されている、あらゆる文書または記録媒体を含む。
併用療法
他の局面において、本発明は、抗ＬＡＧ−３抗体を、免疫応答を刺激し、それによりさらに対象における免疫応答を増強、刺激または上方制御するために有効である１つ以上のさらなる抗体と共投与する、併用療法の方法を提供する。例えば、本発明は、例えば、腫瘍増殖を阻害するか、または抗−ウイルス応答を刺激するために、対象における免疫応答を刺激するように、抗ＬＡＧ−３抗体および１つ以上のさらなる免疫刺激抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法を提供する。１つの態様において、対象は抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＰＤ−１抗体を投与される。他の態様において、対象は抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与される。さらに他の態様において、対象は抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与される。１つの態様において、抗ＬＡＧ−３抗体はヒト抗体、例えば、本明細書の抗体である。あるいは、抗ＬＡＧ−３抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体（例えば、マウス抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂから製造される）であり得る。他の態様において、少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体）はヒト抗体である。あるいは、少なくとも１つのさらなる免疫刺激抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体（例えば、マウス抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体から製造される）であり得る。
１つの態様において、本発明は、ＬＡＧ−３抗体およびＣＴＬＡ−４抗体を対象に投与することを含む、過増殖性疾患（例えば、癌）を処置するための方法を提供する。さらなる態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は治療量以下の用量で投与されるか、抗ＣＴＬＡ−４抗体は治療量以下の用量で投与されるか、または両方が治療量以下の用量で投与される。他の態様において、本発明は、抗ＬＡＧ−３抗体および治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を対象に投与することを含む、免疫刺激剤にて過増殖性疾患の処置と関連する有害事象を改変する方法を提供する。１つの態様において、対象はヒトである。１つの態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体はヒト配列モノクローナル抗体１０Ｄ１（ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４に記載されている）であり、抗ＬＡＧ−３抗体はヒト配列モノクローナル抗体、例えば、本明細書に記載されている２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５である。本発明の方法に包含される他の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４；米国特許第６，２０７，１５６号；Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206);およびMokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304に記載されているものを含む。１つの態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＣＴＬＡ−４に結合するか、１×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＣＴＬＡ−４に結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤにてヒトＣＴＬＡ−４に結合するか、または１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍ以下のＫＤにてヒトＣＴＬＡ−４に結合する。
１つの態様において、本発明は、ＬＡＧ−３抗体およびＰＤ−１抗体を対象に投与することを含む、過増殖性疾患（例えば、癌）を処置するための方法を提供する。さらなる態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は治療量以下の用量で投与されるか、抗ＰＤ−１抗体は治療量以下の用量で投与されるか、または両方が治療量以下の用量で投与される。他の態様において、本発明は、抗ＬＡＧ−３抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−１抗体を対象に投与することを含む、免疫刺激剤にて過増殖性疾患の処置と関連する有害事象を改変する方法を提供する。１つの態様において、対象はヒトである。１つの態様において、抗ＰＤ−１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＬＡＧ−３抗体はヒト配列モノクローナル抗体、例えば、本明細書に記載されている２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５である。ヒト配列抗ＰＤ−１抗体の例は、ＰＣＴ公開ＷＯ０６／１２１１６８に記載されている、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４および４Ａ１１を含む。１つの態様において、抗ＰＤ−１抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−１に結合するか、１×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−１に結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−１に結合するか、１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−１に結合する。
１つの態様において、本発明は、ＬＡＧ−３抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、過増殖性疾患（例えば、癌）を処置するための方法を提供する。さらなる態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は治療量以下の用量で投与されるか、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は治療量以下の用量で投与されるか、または両方が治療量以下の用量で投与される。他の態様において、本発明は、抗ＬＡＧ−３抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、免疫刺激剤にて過増殖性疾患の処置と関連する有害事象を改変する方法を提供する。１つの態様において、対象はヒトである。１つの態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＬＡＧ−３抗体はヒト配列モノクローナル抗体、例えば、本明細書に記載されている２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５である。ヒト配列抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例は、ＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４に記載されている、３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４を含む。１つの態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合するか、１×１０−８Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合するか、または、１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍ以下のＫＤにてヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。
抗体によるＬＡＧ−３ならびに１つ以上の第２の標的抗原、例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の遮断は、患者における癌細胞に対する免疫応答を増強することができる。本明細書の抗体を使用して増殖が阻害され得る癌は、一般的に免疫療法に応答する癌を含む。本明細書の併用療法における処置のための典型的な癌の例は、抗ＬＡＧ−３抗体における単剤療法の議論において特に上記されている癌を含む。
１つの態様において、本明細書に記載されている治療抗体の組合せは、薬学的に許容される担体中で単一の組成物として同時に、または薬学的に許容される担体中でそれぞれの抗体を有する別々の組成物として同時に投与され得る。他の態様において、治療抗体の組合せは連続して投与され得る。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＬＡＧ−３抗体は、連続して投与され得る、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体が第１に、そして抗ＬＡＧ−３抗体が第２に投与されるか、または抗ＬＡＧ−３抗体が第１に、そして抗ＣＴＬＡ−４抗体が第２に投与される。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ−１抗体および抗ＬＡＧ−３抗体は、連続して投与され得る、例えば、抗ＰＤ−１抗体が第１に、そして抗ＬＡＧ−３抗体が第２に投与されるか、または抗ＬＡＧ−３抗体が第１に、そして抗ＰＤ−１抗体が第２に投与される。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＬＡＧ−３抗体は、連続して投与され得る、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が第１に、そして抗ＬＡＧ−３抗体が第２に投与されるか、または抗ＬＡＧ−３抗体が第１に、そして抗ＰＤ−Ｌ１抗体が第２に投与される。
さらに、併用療法の１つ以上の投与が連続して投与されるとき、連続投与の順番は投与のそれぞれの時点で順番が逆転もしくは維持されていてよく、連続投与は同時投与と組み合わせられていてよく、またそれらが組み合わされていてよい。例えば、組合せ抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＬＡＧ−３抗体の第１の投与は同時であり、第２の投与は第１に抗ＣＴＬＡ−４および第２に抗−ＬＡＧ−３で連続であり、そして第３の投与は第１に抗−ＬＡＧ−３および第２に抗ＣＴＬＡ−４で連続などであってよい。さらに、またはあるいは、組合せ抗ＰＤ−１抗体および抗ＬＡＧ−３抗体の第１の投与は同時であり、第２の投与は第１に抗ＰＤ−１および第２に抗−ＬＡＧ−３で連続であり、そして第３の投与は第１に抗−ＬＡＧ−３および第２に抗ＰＤ−１で連続などであってよい。さらに、またはあるいは、組合せ抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＬＡＧ−３抗体の第１の投与は同時であり、第２の投与は第１に抗ＰＤ−Ｌ１および第２に抗−ＬＡＧ−３で連続であり、そして第３の投与は第１に抗−ＬＡＧ−３および第２に抗ＰＤ−Ｌ１で連続などであってよい。他の典型的な投与スキームは、第１の投与は第１に抗−ＬＡＧ−３および第２に抗ＣＴＬＡ−４（および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１）で連続であり、そして後の投与は同時であることを含み得る。
所望により、抗−ＬＡＧ−３ならびに１つ以上のさらなる抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）の組合せは、さらに免疫原、例えば、癌細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞（He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28）と組み合わされ得る。使用することができる腫瘍ワクチンの非限定的な例は、黒色腫抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチド、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞（以下でさらに記載されている）を含む。組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断は、さらに、ワクチン接種プロトコール、例えば、抗ＬＡＧ−３抗体における単剤療法に対して詳細に上記されているあらゆるワクチン接種プロトコールと組み合わせることができる。
組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断は、またさらに、標準癌処置と組み合わせられ得る。例えば、組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断は、化学療法レジメンと有効に組み合わせられ得る。こうした場合において、本明細書の組合せにおいて投与される他の化学療法剤の用量を減少させることができる可能性がある（Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304）。このような組合せの例は、黒色腫の処置のためにさらにデカルバジンと組み合わせられた抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せである。他の例は、黒色腫の処置のためにさらにインターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わせられた抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せである。ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断と化学療法の組合せ使用を支持する科学的論拠は、多数の化学治療化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増加をもたらすはずであるというものである。細胞死を介して組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断と相乗効果をもたらし得る他の組合せ治療は、放射線、外科手術およびホルモン遮断である。これらのそれぞれのプロトコールは、宿主における腫瘍抗原の源を創造する。血管形成阻害剤は、また、組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断と組み合わせられ得る。血管形成の阻害は腫瘍細胞死を誘導し、腫瘍抗原を宿主の抗原提示経路に提供し得る。
ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１を遮断する抗体の組合せは、また、ＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現するエフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化する二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５および５，８３７，２４３号、参照）。二重特異性抗体は、２つの別々の抗原を標的化するために使用することができる。Ｔ細胞群のこれらの応答は組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断の使用により増加し得る。
他の態様において、抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せは、抗−新生物抗体、例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（トシツモマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブ）、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（アレムツズマブ）、Ｌｙｍｐｈｏｃｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）およびＴａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）などと組み合わせて使用することができる。一例として、理論により束縛されている願望なく、抗癌抗体または毒素と結合した抗癌抗体における処置が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３が介在する免疫応答を増強し、癌細胞（例えば、腫瘍細胞）死を引き起こし得る。典型的な態様において、過増殖性疾患（例えば、癌腫瘍）の処置は、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強することができる、同時にもしくは連続してまたはそれらの組合せにおいて、抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせられた抗−癌抗体を含むことができる。
腫瘍は、多種多様のメカニズムにより宿主の免疫監視から逃れる。多数のこれらのメカニズムは、腫瘍により発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化により克服され得る。これらは、数ある中でＴＧＦ−β（Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200）およびＦａｓリガンド（Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365）を含む。他の態様において、これらの存在物それぞれに対する抗体は、免疫抑制剤の効果を中和し、宿主による腫瘍免疫応答を支持するために、さらに抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せと組み合わせて使用することができる。
宿主の免疫応答性を活性化するために使用することができる他の抗体は、さらに抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せと組み合わせて使用することができる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する、樹状細胞の表面上の分子を含む。抗−ＣＤ４０抗体（Ridge et al., 上記）は、抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１の組合せ（Ito et al., 上記）と共に使用することができる。Ｔ細胞共刺激分子に対する抗体（Weinberg et al., 上記, Melero et al. 上記, Hutloff et al., 上記）の活性化は、また、Ｔ細胞活性化のレベルを増加させるために提供され得る。
上記のとおり、骨髄移植は、現在、造血起源の種々の腫瘍を処置するために使用されている。組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断は、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増加させるために使用することができる。
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、エキソビボにおける抗原特異的Ｔ細胞の活性化およびこれらの細胞のレシピエントへの養子移入に関連する、いくつかの実験的処置プロトコールがある（Greenberg & Riddell、上記）。これらの方法は、また、感染因子、例えば、ＣＭＶに対するＴ細胞応答を活性化するために使用することができる。抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在下におけるエキソビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度および活性を増加させることが予期される。
１つの態様において、本発明は、抗ＬＡＧ−３抗体ならびに治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、免疫刺激剤にて過増殖性疾患（例えば、癌）の処置と関連する有害事象を改変する方法を提供する。例えば、本発明の方法は、非吸収性ステロイドを患者に投与することにより、免疫刺激治療抗体−誘導大腸炎または下痢の発症を減少させる方法を提供する。免疫刺激治療抗体を受けるすべての患者がこのような抗体により誘発される大腸炎または下痢を発症する危険性があるため、全患者集団は本発明の方法にしたがう治療が適当である。ステロイドは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置およびＩＢＤの増悪を予防するために投与されているが、それらは、ＩＢＤと診断されていない患者におけるＩＢＤは予防する（発症率を低下させる）ために使用されていない。ステロイド、とりわけ非吸収性ステロイドと関連する有意な副作用は、予防使用を阻止させている。
さらなる態様において、組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断（すなわち、免疫刺激治療抗体、抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）は、さらに、何らかの非吸収性ステロイドの使用と組み合わせることができる。本明細書において使用される“非吸収性ステロイド”は、肝臓の代謝後、ステロイドのバイオアベイラビリティが低くなるように、すなわち、約２０％未満であるように、大規模な初回通過代謝を示すグルココルチコイドである。本発明の１つの態様において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後、主に肝臓により大規模に代謝される局所作用性糖質コルチコステロイドである。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ）は、開発されたブデソニドのｐＨ−および時間−依存性経口製剤であり、回腸および大腸への薬物送達に最適化されている。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、回腸および／または上行結腸のクローン病を抑えるための穏やかな処置のために米国において承認されている。クローン病の処置のためのＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）の通常の経口用量は、６から９ｍｇ／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、腸粘膜において吸収され保持される前に腸に放出される。腸粘膜標的組織を通過すると、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、肝臓におけるシトクロムＰ４５０系によりごくわずかなグルココルチコイド活性を有する代謝産物に大規模に代謝される。したがって、バイオアベイラビリティは低い（約１０％）。ブデソニドの低いバイオアベイラビリティは、大規模な初回通過代謝が小さい他のグルココルチコイドと比較して、改善された治療可能比をもたらす。ブデソニドは、全身作用性コルチコステロイドよりも少ない視床下部−下垂体抑制を含む小さい副作用をもたらす。しかしながら、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）の慢性投与は、全身性グルココルチコイド作用、例えば、副腎皮質機能亢進症および副腎抑制をもたらし得る。PDR 58th ed. 2004; 608-610、参照。
さらなる態様において、非吸収性ステロイドと組み合わせられた組合せＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断（すなわち、免疫刺激治療抗体 抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）は、さらに、サリチル酸塩と組み合わせることができる。サリチル酸塩は５−ＡＳＡ剤、例えば：スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ（登録商標）、Pharmacia & UpJohn）；オルサラジン（ＤＩＰＥＮＴＵＭ（登録商標）、Pharmacia & UpJohn）；バルサラジド（ＣＯＬＡＺＡＬ（登録商標）、Salix Pharmaceuticals, Inc.）；およびメサラミン（ＡＳＡＣＯＬ（登録商標）、Procter & Gamble Pharmaceuticals；ＰＥＮＴＡＳＡ（登録商標）、Shire US；ＣＡＮＡＳＡ（登録商標）、Axcan Scandipharm, Inc.；ＲＯＷＡＳＡ（登録商標）、Solvay）を含む。
本発明の方法において、抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および非吸収性ステロイドと組み合わせて投与されるサリチル酸塩は、免疫刺激抗体により誘導される大腸炎の発症を減少する目的のために、サリチル酸塩および非吸収性ステロイドの任意の重複もしくは連続投与を含み得る。したがって、例えば、本発明の免疫刺激抗体により誘導される大腸炎の発症を減少させる方法は、サリチル酸塩および非吸収性のものを同時にまたは連続して（例えば、サリチル酸塩を非吸収性ステロイドの６時間後に投与する）、またはそれらの任意の組合せを投与することを含む。さらに、本発明において、サリチル酸塩および非吸収性ステロイドは、同じ経路（例えば、両方が経口的に投与される）または異なる経路（例えば、サリチル酸塩が経口的に投与され、非吸収性ステロイドが経直腸的に投与される）（抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与するために使用される経路と異なっていてよい）により投与され得る。
本明細書は、さらに以下の実施例により説明されるが、さらなる限定と解釈してはならない。本出願のすべての図およびすべての文献、本出願において引用されているＧｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開された特許出願の内容は、出典明示により明確に本明細書に包含される。特に、ＰＣＴ公開ＷＯ０９／０４５９５７、ＷＯ０９／０７３５３３、ＷＯ０９／０７３５４６およびＷＯ０９／０５４８６３の記載は出典明示により明確に本明細書に包含される。
実施例１：ＬＡＧ−３に対するヒトモノクローナル抗体の作製
抗−ＬＡＧ−３ヒトモノクローナル抗体は、以下のとおりヒト抗体遺伝子を発現する遺伝子導入マウスを使用して製造した。
抗原
抗−ヒトＬＡＧ−３抗体を産生するために、組換えヒトＬＡＧ−３融合タンパク質を免疫原として使用した。特定の免疫化において、ヒト免疫グロブリン Ｆｃドメイン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔａｌｏｇ ＃２３１９−Ｌ３）（Ｄ１−Ｄ４ ｈＦｃ）またはマウス免疫グロブリン Ｆｃドメイン（Ｄ１−Ｄ４ ｍＦｃ）に融合したヒトＬＡＧ−３の全細胞外領域（ドメイン １−４）を含む融合タンパク質を、免疫原として使用した。他の免疫化のために、マウス免疫グロブリン Ｆｃドメイン（Ｄ１−Ｄ２ ｍＦｃ）に融合したヒトＬＡＧ−３の第１の２つの細胞外ドメインのみを含む融合タンパク質を、免疫原として使用した。ＬＡＧ−３融合タンパク質は標準組換えＤＮＡ技術を使用して製造した。
遺伝子を導入し、染色体を導入したＫＭマウス ＴＭ およびＫＭ／ＦＣＧＲ２Ｄマウス ＴＭ 血統
ヒトＬＡＧ−３に対する完全ヒトモノクローナル抗体を、ヒト抗体遺伝子を発現する、遺伝子を導入し、染色体を導入したＫＭマウスＴＭおよびＫＭ／ＦＣＧＲ２ＤマウスＴＭ血統のマウスを使用して製造した。
ＫＭマウスＴＭ血統において、内因性マウスカッパ軽鎖遺伝子は、Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820において記載されているとおりホモ接合的に崩壊され、内因性マウス重鎖遺伝子はＰＣＴ公開ＷＯ０１／０９１８７の実施例１に記載されているとおりホモ接合的に崩壊される。さらに、このマウス血統は、Fishwild et al.上記に記載されているとおり、ヒトカッパ軽鎖導入遺伝子であるＫＣｏ５を有する。該血統は、また、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に記載されているとおり、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を有するＳＣ２０導入染色体を含む。ＫＭ／ＦＣＧＲ２ＤマウスＴＭ血統は、ゲノムが内因性ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子のホモ接合的崩壊も含むこと以外、ＫＭマウスＴＭ血統と同じである。ＫＭマウスＴＭおよびＫＭ／ＦＣＧＲ２ＤマウスＴＭ血統は、また、米国出願公開第２００２０１９９２１３号に記載されている。
ＫＭマウス ＴＭ およびＫＭ／ＦＣＧＲ２Ｄマウス ＴＭ 免疫化：
ＬＡＧ−３に対する完全ヒトモノクローナル抗体を製造するために、ＫＭマウスＴＭおよびＫＭ／ＦＣＧＲ２ＤマウスＴＭ血統のマウスを、上記３種の異なる組換えＬＡＧ−３融合タンパク質（Ｄ１−Ｄ４ ｈＦｃ、Ｄ１−Ｄ４ ｍＦｃ、Ｄ１−Ｄ２、ｍＦｃ）の１つで免疫化した。一般的な免疫化スキームはLonberg et al.（１９９４）上記；Fishwild et al.上記およびＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８８４に記載されている。マウスは抗原の第１の注入時に６−１６週齢であった。マウスを腹腔内（ＩＰ）および／または皮下（ＳＣ）により免疫化した。マウスを１０μｇの組換えＬＡＧ−３融合タンパク質にて隔週で４回免疫化し、アジュバントとしてＲｉｂｉ中の２０μｇの同じ免疫原にて２回免疫化した。免疫応答を後眼窩によりモニタリングした。血漿をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし（以下のとおり）、十分な力価の抗−ＬＡＧ−３ヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合のために使用した。屠殺および脾臓の除去前に、マウスを静脈内および腹腔内により２０μｇの抗原で追加免疫し、次に静脈内により２０μｇの抗原で追加免疫した。
抗ＬＡＧ−３抗体を生産するＫＭおよびＫＭ／ＦＣＧＲ２Ｄマウスの選択
ＬＡＧ−３タンパク質に結合している抗体を生産するマウスを選択するために、Ｄ１−Ｄ４ ｈＦｃ融合タンパク質にて免疫化されたマウス由来の血清を、Fishwild et al.（１９９６）に当初に記載されているとおりに、修飾されたＥＬＩＳＡにより試験した。簡潔には、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌにて精製された組換えＬＡＧ−３融合タンパク質でコートし、５０μｌ／ウェルにて４℃で一晩インキュベートし、次にＰＢＳ中の２００μｌ／ウェルの５％のＢＳＡにてブロックした。ＬＡＧ−３−免疫化マウス由来の血漿の希釈物をそれぞれのウェルに加え、１−２時間、環境温度でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ−抗−ヒトカッパ軽鎖ポリクローナル抗体と１時間、室温でインキュベートした。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質を使用して発色させ、ＯＤ４０５において分光光度計により分析した。
Ｄ１−Ｄ４ ｍＦｃまたはＤ１−Ｄ２ ｍＦｃ融合タンパク質にて免疫化されたマウスに関して、これらのマウス由来の血清を、マウスＦｃ部分への非特異的結合を除去するために、コーティングの１時間前にプレートを抗原でコートして、ヤギ抗−マウスＩｇＧを使用する間接的ＥＬＩＳＡにより試験した。次に、上記と同じＥＬＩＳＡ工程を実施した。
非常に高い力価の抗ＬＡＧ−３抗体を発生させるマウスを、融合のために使用した。融合は以下に記載されているとおに実施し、ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡにより抗−ＬＡＧ−３活性において試験した。
ＬＡＧ−３タンパク質に対するヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの産生
ＫＭまたはＫＭ／ＦＣＧＲ２Ｄマウスから単離されたマウス脾細胞を、Cyto Pulse large chamber cull fusion electroporator（Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD）を使用して電場ベース電気融合によりマウス骨髄腫細胞系に融合した。次に得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の生成においてスクリーニングした。免疫化マウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液を、Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６．５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０）を分泌しないマウス骨髄腫細胞の４分の１に融合させた。細胞を平底マイクロタイタープレートに約１×１０５／ウェルにて置き、次にＲＰＭＩ中のオリゲン（ＩＧＥＮ）、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ｌ×ＨＡＴおよびβ−メルカプトエタノールを補った、１０％のウシ胎仔血清を含む選択培地中で、約２週間インキュベーションした。１−２週間後、細胞を、ＨＡＴをＨＴと置き換えた培地中で培養した。次に、個々のウェルをヒト抗−ＬＡＧ−３モノクローナルＩｇＧ抗体に対してＥＬＩＳＡ（上記）によりスクリーニングした。大規模なハイブリドーマ増殖後、培地を通常、１０−１４日後にモニタリングした。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングし、ヒトＩｇＧに関して陽性が維持されているとき、抗−ＬＡＧ−３モノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２回サブクローニングした。次に、安定なサブクローンをインビトロで培養して、さらなる特性化のために組織培養培地中において少量の抗体を産生した。
ハイブリドーマクローン２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５をさらなる分析およびシーケンシングのために選択した。
実施例２：ヒト抗−ＬＡＧ−３モノクローナル抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５の構造的特性化
実施例１に記載されているとおり、２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５クローンにより発現されるｍＡｂの重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を、以下のプロトコールを使用してシーケンシングした。全ＲＮＡを、RNeasy Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA）を使用して、５×１０６個のハイブリドーマ細胞から製造した。ｃＤＮＡを、SMART RACE cDNA Amplification Kit（Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA）およびSuperScript II Reverse Transcriptase（Invitrogen, Carlsbad, CA）にて、５’−ＲＡＣＥプロトコールにより製造した。それぞれの抗体のＶ−領域を、５’ＲＡＣＥ ユニバーサルプライマーミックスと共に、３’ヒト−特異的定常領域プライマーを使用して増幅した。Ｖ−領域を含むＰＣＲ生成物は、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローンさせ、大腸菌血統ＴＯＰ１０（Invitrogen, Carlsbad, CA）に形質転換させた。ミニプレップＤＮＡまたはＴｅｍｐｌｉｐｈｉ（GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ, USA）サンプルのいずれかを製造し、ＤＮＡシーケンシング（Sequetech, Mountain View, CA）に付した。得られたＤＮＡ配列を、インフレーム再配列および他の抗体特性に対して分析した。発現されたタンパク質を標準タンパク質化学分析により特徴付けた。２５Ｅ３、２５Ｆ７および２６Ｈ１０クローンはＩｇＧ１重鎖およびカッパ軽鎖を含む抗体を発現することが見出されたが、８Ｂ７および１７Ｅ５クローンはＩｇＧ４重鎖およびカッパ軽鎖を含む抗体を発現することが見出され、１１Ｆ２クローンはＩｇＧ２重鎖およびカッパ軽鎖を含む抗体を発現することが見出された。
２５Ｆ７の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図１Ａならびにそれぞれ配列番号：４９および３７に示されている。２５Ｆ７のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図１Ｂならびにそれぞれ配列番号：５５および４３に示されている。２５Ｆ７重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン重鎖配列（図７）との比較により、２５Ｆ７重鎖がヒト生殖細胞系列ＶＨ４−３４（配列番号：６１）由来のＶＨセグメントおよびヒト生殖細胞系列ＪＨ５ｂ（配列番号：６２）由来のＪＨセグメントを利用していることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用して、２５Ｆ７ ＶＨ配列のさらなる分析により、図１Ａならびにそれぞれ配列番号：１、７および１３に示されている重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を得た。２５Ｆ７軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン軽鎖配列（図８）との比較により、２５Ｆ７カッパ軽鎖がヒト生殖細胞系列ＶＫＬ６（配列番号：６３）由来のＶＫセグメントおよびヒト生殖細胞系列ＪＫ２（配列番号：６４）由来のＪＫセグメントを利用していることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用して、２５Ｆ７ ＶＫ配列のさらなる分析により、図１Ｂならびにそれぞれ配列番号：１９、２５および３１に示されている軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を得た。
２６Ｈ１０の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図２Ａならびにそれぞれ配列番号：５０および３８に示されている。２６Ｈ１０の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図２Ｂならびにそれぞれ配列番号：５６および４４に示されている。２６Ｈ１０重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン重鎖配列（図９）との比較により、２６Ｈ１０重鎖がヒト生殖細胞系列ＶＨ３−３３（配列番号：６５）由来のＶＨセグメントおよびヒト生殖細胞系列ＪＨ６Ｂ（配列番号：６６）由来のＪＨセグメントを利用していることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用して、２６Ｈ１０ ＶＨ配列のさらなる分析により、図２Ａならびにそれぞれ配列番号：２、８および１４に示されている重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を得た。２６Ｈ１０軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン軽鎖配列（図１０）との比較により、２６Ｈ１０カッパ軽鎖がヒト生殖細胞系列ＶＫＡ２７（配列番号：６７）由来のＶｋセグメントおよびヒト生殖細胞系列ＪＫ３（配列番号：６８）由来のＪｋセグメントを利用していることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用して、２６Ｈ１０ Ｖｋ配列のさらなる分析により、図２Ｂならびにそれぞれ配列番号：２０、２６および３２に示されている軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を得た。
２５Ｅ３の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図３Ａならびにそれぞれ配列番号：５１および３９に示されている。２５Ｅ３の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図３Ｂならびにそれぞれ配列番号：５７および４５に示されている。２５Ｅ３重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン重鎖配列（図１１）との比較により、２５Ｅ３重鎖がヒト生殖細胞系列ＶＨ３−２０（配列番号：６９）由来のＶＨセグメントおよびヒト生殖細胞系列ＪＨ４ｂ（配列番号：７０）由来のＪＨセグメントを利用していることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用して、２５ｅ３ ＶＨ配列のさらなる分析により、図３Ａならびにそれぞれ配列番号：３、９およびＧＧＹに示されている重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を得た。２５Ｅ３軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン軽鎖配列（図１２）との比較により、２５Ｅ３カッパ軽鎖がヒト生殖細胞系列ＶＫＬ１８（配列番号：７１）由来のＶｋセグメントおよびヒト生殖細胞系列ＪＫ２（配列番号：６４）由来のＪＫセグメントを利用していることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用して、２５Ｅ３ Ｖｋ配列のさらなる分析により、図３Ｂならびにそれぞれ配列番号：２１、２７および３３に示されている軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を得た。
８Ｂ７の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図４Ａならびにそれぞれ配列番号：５２および４０に示されている。８Ｂ７の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図４Ｂならびにそれぞれ配列番号：５８および４６に示されている。８Ｂ７重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン重鎖配列（図１３）との比較により、８Ｂ７重鎖がヒト生殖細胞系列ＶＨ４−３４（配列番号：６１）由来のＶＨセグメントおよびヒト生殖細胞系列ＪＨ５Ｂ（配列番号：６２）由来のＪＨセグメントを利用していることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用して、８Ｂ７ ＶＨ配列のさらなる分析により、図４Ａならびにそれぞれ配列番号：４、１０および１６に示されている重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を得た。８Ｂ７軽鎖免疫グロブリン配列（図１４）と既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン軽鎖配列との比較により、８Ｂ７カッパ軽鎖がヒト生殖細胞系列ＶＫＬ６（配列番号：６３）由来のＶｋセグメントおよびヒト生殖細胞系列ＪＫ４（配列番号：７２）由来のＪＫセグメントを利用していることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用して、２６Ｈ１０ Ｖｋ配列のさらなる分析により、図４Ｂならびにそれぞれ配列番号：２２、２８および３４に示されている軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を得た。
１１Ｆ２の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図５Ａならびにそれぞれ配列番号：５３および４１に示されている。１１Ｆ２の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図５Ｂならびにそれぞれ配列番号：５９および４７に示されている。１１Ｆ２重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン重鎖配列（図１５）との比較により、１１Ｆ２重鎖がヒト生殖細胞系列ＶＨ１−２４（配列番号：７３）由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系列２−１５由来のＤセグメントおよびヒト生殖細胞系列ＪＨ４Ｂ（配列番号：７０）由来のＪＨセグメントを利用していることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用して、１１Ｆ２ ＶＨ配列のさらなる分析により、図１３Ａならびにそれぞれ配列番号：５、１１および１７に示されている重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を得た。１１Ｆ２軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン軽鎖配列（図１６）との比較により、１１Ｆ２カッパ軽鎖がヒト生殖細胞系列ＶＫＬ６（配列番号：６３）由来のＶｋセグメントおよびヒト生殖細胞系列ＪＫ１（配列番号：７４）由来のＪｋセグメントを利用していることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用して、１１Ｆ２ Ｖｋ配列のさらなる分析により、図５Ｂならびにそれぞれ配列番号：２３、２９および３５に示されている軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を得た。
１７Ｅ５の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図６Ａならびにそれぞれ配列番号：５４および４２に示されている。１７Ｅ５の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図６Ｂならびにそれぞれ配列番号：６０および４８に示されている。１７Ｅ５重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン重鎖配列（図１７）との比較により、ヒト生殖細胞系列ＶＨ３−３３（配列番号：６５）由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系列２−２由来のＤセグメントおよびヒト生殖細胞系列ＪＨ４Ｂ（配列番号：７０）由来のＪＨセグメントを利用していることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用して、１７Ｅ５ ＶＨ配列のさらなる分析により、図６Ａならびにそれぞれ配列番号：６、１２および１８に示されている重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を得た。１７Ｅ５軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン軽鎖配列（図１８）との比較により、１７Ｅ５カッパ軽鎖がヒト生殖細胞系列ＶＫＬ６（配列番号：６３）由来のＶｋセグメントおよびヒト生殖細胞系列ＪＫ５（配列番号：７５）由来のＪＫセグメントを利用していることが示された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用して、１７Ｅ５Ｖｋ配列のさらなる分析により、図６Ｂならびにそれぞれ配列番号：２４、３０および３６に示されている軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を得た。
２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５可変領域は、標準組換えＤＮＡ技術を使用して、所望のアイソタイプの全長抗体に変換され得る。例えば、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡは、可変領域が定常領域と作動可能に連結するように、重鎖および軽鎖定常領域を有する発現ベクターにクローンすることができる。あるいは、別々のベクターが全長重鎖および全長軽鎖の発現のために使用することができる。全長抗体の創造において使用するために適当な発現ベクターの非限定的な例は、米国特許公開第２００５０１５３３９４号に記載されているｐＩＥベクターを含む。
実施例３：ＬＡＧ−３モノクローナル抗体の結合特性の特性化
この実施例において、細胞表面ＬＡＧ−３（ヒト、サルおよびマウスＬＡＧ−３）へのヒト抗ＬＡＧ−３抗体の結合をフローサイトメトリーにより試験した。さらに、ＬＡＧ−３に対する結合反応速度をＢＩＡＣＯＲＥ分析により分析した。さらなるエピトープマッピングをペプチドスキャン実験を使用して実施した。
Ａ．フローサイトメトリー試験
１．ＣＨＯ−ヒトＬＡＧ−３細胞結合
細胞表面ＬＡＧ−３タンパク質に結合する抗体の能力を試験するために、抗体を、細胞表面上にヒトＬＡＧ−３を発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系とインキュベートした。２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５モノクローナル抗体を、冷１×ＰＦＡＥバッファー（１×ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ、０．０２％ アジ化ナトリウム、２ｍＭ Ｎａ ＥＤＴＡ）で連続希釈した。結合反応のために、５０μｌの希釈抗体溶液を２×１０５細胞を含む５０μｌの細胞懸濁液に加え、混合物を氷上で３０分インキュベートした。次に細胞を１×ＰＦＡＥバッファーで２回洗浄した。ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗−ヒトカッパ軽鎖抗体（Bethyl Laboratories, Inc., Cat. # A80-115F）の１：１００希釈物を加え、混合物を３０分４℃でインキュベートし、次に冷１×ＰＦＡＥバッファーで２回洗浄した。最後の洗浄後、１０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Roche Applied Science, Cat #1_348_639）を含む１５０μｌの冷１×ＰＦＡＥをそれぞれの溶液に加え、抗体結合の分析をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ フローサイトメーター（BD Bioscience）を使用するフローサイトメトリーにより実施した。
フローサイトメトリー分析の結果は以下の表１に要約されており、これはＣＨＯ−ヒトＬＡＧ−３への結合に関するＥＣ５０を示し、２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２および１７Ｅ５が、２５Ｆ７は２５Ｅ３よりも約２０倍低いＥＣ５０を有して、８Ｂ７と２６Ｈ１０はほぼ等価のＥＣ５０において、細胞表面ヒトＬＡＧ−３に有効に結合することを証明した。１１Ｆ２および１７Ｅ５に対するＥＣ５０結果は２５Ｅ３と同じ範囲であった。
表１：ヒトＬＡＧ−３を発現するＣＨＯ細胞への抗ＬＡＧ−３抗体の結合
２．活性化されたヒトＣＤ４ ＋ Ｔ細胞結合
活性化されたヒトＴ細胞の表面上の天然ヒトＬＡＧ−３に結合する抗体の能力を試験するため、静止ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製された末梢血単核細胞から単離し、ポリスチレンビーズを付着させた抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８抗体の組合せでの刺激に３日間付した。２５Ｆ７、８Ｂ７および２６Ｈ１０モノクローナル抗体を、冷１×ＰＦＡＥバッファー（１×ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ、０．０２％ アジ化ナトリウム、２ｍＭ Ｎａ ＥＤＴＡ）で連続希釈した。結合反応のために、５０μｌの希釈抗体溶液を５０μｌのＰＥ標識化抗−ヒトＣＤ４（BD Bioscience, Cat # 555347)と混合した。活性化Ｔ細胞を上記と同じプロトコールにより処理した。抗体結合の分析を上記のとおりに行った。
フローサイトメトリー分析の結果は以下の表２に要約されており、これは活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞への結合に関するＥＣ５０を示し、全３つの抗体が細胞表面ヒトＬＡＧ−３に同様に結合することを証明した。
表２：活性化されたヒトＣＤ４ ＋ Ｔ細胞への抗ＬＡＧ−３抗体の結合
３．サルＬＡＧ−３抗原結合
抗ＬＡＧ−３抗体がサルＬＡＧ−３と交差反応するか否かを測定するために、ｃＤＮＡ配列を、カニクイザルおよびアカゲザルの組織サンプルの回収物からＲＮＡの逆転写により製造されたプールされているｃＤＮＡの製造物からＲＴ−ＰＣＲによりクローンした。最初に、配列をプライマー（５’フォワードプライマー：５Ｍｃｙｎ１４０８；５’−ａｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｃａｇｔｔｃｃｔｇ−３’（配列番号：９１）＆３’リバースプライマー：３Ｍｃｙｎ１４０８ａ；５’−ｇｔｃａｇａｇｃｔｇｃｔｃｃｇｇｃｔｃ−３’（配列番号：９２））を使用してＧＣ−リッチＰＣＲ増幅系（Roche）を使用してｃＤＮＡプールから増幅させ、配列分析のためにレシピエント ＴＯＰＯ クローニングベクター（Invitrogen）にクローンした。次に、参照Ｇｅｎｂａｎｋ アカゲザルＬＡＧ−３配列（Genbank 受入番号 XM_001108923）にマッチするクローンを、哺乳動物細胞発現ベクターにおいて指向性クローニングのための制限酵素部位が組み込まれている第２のプライマーセットを使用して、ＴＯＰＯ−クローニングベクターＤＮＡから再増幅させた。
サルＬＡＧ−３クローンｐａ２３−５を単離し、シーケンシングした。単離されたサル配列は、参照Ｇｅｎｂａｎｋ アカゲザルＬＡＧ−３配列と９９．６％同一性を示した。ｃＤＮＡクローン ｐａ２３−３のアミノ酸配列（配列番号：９３）とＧｅｎｂａｎｋ（受入番号 ＸＭ＿００１１０８９２３）由来のアカゲザルＬＡＧ−３（配列番号：９４）との比較は、図１９に示されている。位置４１９（クローンｐａ２３−５におけるアルギニン 対 Ｇｅｎｂａｎｋアカゲザル配列におけるスレオニン）における１つのアミノ酸の違いを除いて、２つの配列は同一であり、これに基づいて、ｃＤＮＡクローンｐａ２３−５がアカゲザルＬＡＧ−３遺伝子配列を示すと結論づけられる。
クローンｐａ２３−５のｃＤＮＡを、ヌクレオフェクション（Ａｍａｘａ）によりＣＨＯ−Ｓ懸濁細胞にトランスフェクトされた発現構築物に挿入した。分類された、選択薬剤耐性クローンによるアカゲザルＬＡＧ−３発現をＦＡＣＳ分析により立証した。アカゲザルＬＡＧ−３を過剰発現するこのクローンＣＨＯ細胞系において、上記と同様のＦＡＣＳアッセイを使用して、サルタンパク質に対する抗体交差反応性を測定した。簡潔には、２５Ｆ７、８Ｂ７および２６Ｈ１０モノクローナル抗体を冷１×ＰＦＡＥバッファー（１×ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ、０．０２％ アジ化ナトリウム、２ｍＭ Ｎａ ＥＤＴＡ）で連続希釈した。結合反応のために、５０μｌの希釈抗体溶液を２×１０５細胞を含む５０μｌの細胞懸濁液に加え、混合物を氷上で３０分インキュベートした。細胞を上記と同じプロトコールにより処理した。抗体結合の分析を上記のとおりに行った。
別の実験において、抗体を、活性化されたカニクイザルＴ細胞を使用してカニクイザルＬＡＧ−３への結合に関して試験した。これらのサルＴ細胞のインビトロ活性化を、ヒトＴ細胞のインビトロ活性化に対する上記と本質的に同じプロトコールにより達成し、次にフローサイトメトリー分析をインビトロで活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の染色に対する上記のとおりに行った。
ＣＨＯ−アカゲザルＬＡＧ−３細胞および活性化されたカニクイザルＴ細胞を使用するフローサイトメトリー分析の結果は以下の表２に要約されており、これはサルＬＡＧ−３を発現する２つの異なる型の細胞への結合に関するＥＣ５０を示す。これらの結果は、全ての抗体が活性化されたカニクイザルＴ細胞におけるＬＡＧ−３およびＣＨＯ細胞にトランスフェクトされたアカゲザルＬＡＧ−３（配列番号：９３）の両方に有効に結合することを示した。しかしながら、クローン８Ｂ７および２５Ｆ７よりもそれぞれ約２．５および６倍良く、最も高い親和性を示すクローン２６Ｈ１０と結合親和性の階層がある。２つの細胞型間の結合階層における違いは、アカゲザルおよびカニクイザルＬＡＧ−３タンパク質間のアミノ酸配列の違いを反映するのであろう。
表３：サルＬＡＧ−３への抗ＬＡＧ−３抗体の結合
４．マウスＬＡＧ−３抗原結合
抗体がマウスＬＡＧ−３と交差反応するか否かを測定するために、上記のものに対して同様のフローサイトメトリー試験を、標的細胞として細胞表面上にマウスＬＡＧ−３を発現するようにトランスフェクトされたマウスＴ細胞ハイブリドーマ細胞系（３Ａ９）を使用して実施し、次に抗体結合を検出するためにＦＡＣＳ分析を実施した。結果は、強い染色を示す対照抗−マウスＬＡＧ−３対照抗体と対照的に、ヒト抗体２５Ｅ３、２５Ｆ７、８Ｂ７または２６Ｈ１０は上記バックグラウンドレベルでの細胞表面マウスＬＡＧ−３への結合を示さず、これらの抗体はマウスＬＡＧ−３と交差反応しないことを証明した。
Ｂ．ＢＩＡＣＯＲＥ分析
２５Ｅ３、２５Ｆ７、８Ｂ７、２６Ｈ１０および１７Ｅ５抗体の組換えＬＡＧ−３タンパク質への結合は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭにより捕獲方法を使用して試験した。２５Ｅ３、２５Ｆ７、８Ｂ７、２６Ｈ１０および１７Ｅ５抗体をそれぞれ、ヒト抗体の重鎖定常領域１に対して特異的である抗−ＣＨ１試薬抗体（Zymed, Clone HP6045、貯蔵濃度１．０ｍｇ／ｍＬ）を使用して捕獲した。ＣＭ５チップ（BR-1000-14, Research Grade）上を高密度（9700-11500RUs）にて抗−ＣＨ１でコーティングした。コーティングは製造業者により推奨されている標準固定化方法に基づいて実施した。次に、０．５−３μｇ／ｍＬの範囲である濃度における２５Ｅ３、２５Ｆ７、８Ｂ７、２６Ｈ１０または１７Ｅ５の精製された抗体を、抗−ＣＨ１でコーティングされた表面上に１０ｕＬ／分の流速で１分捕獲させた。単一の濃度の組換えヒトＬＡＧ−３融合タンパク質（２０ｎＭ）を２５μｇ／ｍＬの流速で３分間、捕獲された抗体に注入した。抗原を７．５分間で解離させた。チップ表面を、２５μｌの２５ｍＭのＮａＯＨ、次に３０μｌのＨＢＳ−ＥＰの洗浄のそれぞれのサイクル後、再生させた。アイソタイプ対照をチップ上に流し、データは非特異的結合を引いて使用した。すべての実験は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ソフトウェア ｖ ３．２を使用するＢｉａｃｏｒｅ ３０００ 表面プラズモン共鳴装置において実施した。データ分析は、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖ３．２ ソフトウェアを使用して実施した。結果は以下の表４に示されている。２５Ｅ３、２５Ｆ７、８Ｂ７、２６Ｈ１０および１７Ｅ５に対するＢＩＡｃｏｒｅ結果は、全５つの抗体がヒトＬＡＧ−３に高い親和性にて結合することができるフローサイトメトリー結果を裏付ける。
表４：組換えヒトＬＡＧ−３に対する抗ＬＡＧ−３抗体の結合反応速度
Ｃ．エピトープマッピング
ＬＡＧ−３タンパク質において、細胞外領域の免疫グロブリン様第１のドメインは、アミノ酸配列：ＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳＳＷＧＰＲＰＲＲＹ（配列番号：７９）を有する暴露されている“余分なループ”を含む。２５Ｅ３、２５Ｆ７、８Ｂ７および２６Ｈ１０のＬＡＧ−３のこの領域への結合を試験し、それぞれの抗体により結合されているエピトープをマッピングするため、ペプチドスキャン実験をこの領域にわたって実施した。余分なループ配列の全長にわたってスキャンされる一連の１０の重複ペプチドを製造し、ビオチンに結合させた。ＥＬＩＳＡ分析のために、ストレプトアビジン（Sigma-Aldrich, Cat # M5432）であらかじめコーティングされたマイクロタイタープレートを、２μｇ／ｍＬの濃度で１００μｌの容量において適用されるビオチン化ループペプチド−複合体を捕獲するために使用し、１８時間４℃でインキュベートし、この後、プレートを３回洗浄し、室温で１時間、ブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ＋１０％ ＦＢＳ）にてブロックした。次に、１０μｇ／ｍＬからブロッキングバッファーにおいて３倍連続希釈されたヒト抗ＬＡＧ−３抗体を適用し、プレートを室温で２時間インキュベートし、次に３回洗浄した。結合したヒト抗体を検出するために、ＨＲＰ−結合ヤギ抗−ヒトカッパ軽鎖抗体（Bethyl Laboratories, Cat #A80-115P）をブロッキングバッファーにて１μｇ／ｍＬに希釈し、１時間アッセイウェルに適用し、次に３回洗浄し、ＴＭＢ基質（eBioscience, Cat #00-4201-56）を適用した。６５０ｎｍ波長での光学濃度測定をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ３４０ＰＣ 分光光度計（Molecular Dynamics, Inc.）にて行った。ペプチドスキャン実験の結果は以下の表５に要約されている。
表５：ＬＡＧ−３の余分なループのペプチドスキャンに対する抗−ＬＡＧ抗体結合
これらの結果に基づいて、２５Ｅ３抗体はアミノ酸配列ＰＧＨＰＬＡＰＧ（配列番号：７６）を含む細胞外ループ内の領域を認識し、２５Ｆ７抗体はアミノ酸配列ＨＰＡＡＰＳＳＷ（配列番号：７７）を含む余分なループ内の領域を認識し、８Ｂ７はアミノ酸配列ＰＡＡＰＳＳＷＧ（配列番号：７８）を含む細胞外ループ内の領域を認識するようであることが決定された。対照的に、２６Ｈ１０抗体による全長の余分なループペプチドあるいはより短いスキャンペプチドへの結合は検出することができなかった。
この試験において同定された領域は、全長の余分なループ配列において下線を引いている：
したがって、ペプチドスキャン結果は、２５Ｅ３、２５Ｆ７および８Ｂ７抗体がヒトＬＡＧ−３内において非常に近い位置であるが異なっているエピトープに結合することを示す。
これらの抗体の余分なループペプチド領域への結合をさらに試験するために、さらなるＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ヒトの全長の余分なループペプチド（配列番号：７９）を使用するＥＬＩＳＡアッセイにおいて、結合に関するＥＣ５０値を２５Ｅ３、２５Ｆ７および８Ｂ７に対して測定した。さらに、同様のペプチドのＥＬＩＳＡを、配列ＧＰＰＡＰＡＰＧＨＰＰＡＰＧＨＲＰＡＡＰ ＹＳＷＧＰＲＰＲＲＹ（配列番号：９０）を有するアカゲザルＬＡＧ−３由来の全長の余分なループペプチド配列を使用して行い、結合に関するＥＣ５０値を２５Ｆ７および８Ｂ７に対して測定した。結果は以下の表６に要約されている。結果は、抗体２５Ｅ３、２５Ｆ７および８Ｂ７が、ヒトＬＡＧ−３の余分なループペプチド領域を認識することができることを裏付ける。さらに、抗体２５Ｆ７および８Ｂ７は、また、ヒト配列と比較して低いが、アカゲザルのＬＡＧ−３の余分なループペプチド領域に結合する。これは、このポリペプチドにおける種配列分散のためであろう。結果は、また、２６Ｈ１０抗体がＬＡＧ−３の余分なループペプチドを認識することができないことを裏付ける。
表６：ヒトおよびアカゲザルのＬＡＧ−３の余分なループペプチドへの抗ＬＡＧ−３抗体の結合
実施例４：抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂによるＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩへの結合の阻害
ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を阻害する抗ＬＡＧ−３抗体の能力を試験するために、マウスＦｃに融合したヒトＬＡＧ−３細胞外ドメイン（ｈＬＡＧ−３−ｍＩｇ）を含むＬＡＧ−３融合タンパク質を、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するＤａｕｄｉ細胞と反応させるインビトロ結合アッセイを実施した。
ＭＨＣクラスＩＩへのＬＡＧ−３結合の抗体阻害を試験するため、２５Ｅ３、２５Ｆ７、８Ｂ７および２６Ｈ１０を２０μｇ／ｍＬからＰＦＡＥバッファーにおいて連続希釈し、これらの連続希釈物に１μｇ／ｍｌのｈＬＡＧ−３−ｍＩｇ融合タンパク質を加えた。この混合物を、２×１０５の１×ＰＦＡＥで洗浄されたＤａｕｄｉ細胞に加える前に、２０分室温でインキュベートした。混合物をＤａｕｄｉ細胞に適用し、４℃で３０分インキュベートした。細胞をペレットにし（３分、４００×ｇ）、１×ＰＦＡＥバッファーで１回洗浄し、再ペレット化し、ｈＬＡＧ−３−ｍＩｇのＤａｕｄｉ細胞への結合を組換えＰＥ−標識抗−ｍＩｇＧＦｃγ二次試薬を使用して検出した。ＬＡＧ−３−ｍＩｇ結合の分析をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ フローサイトメーター（BD Bioscience）にて実施した。結果は以下の表７に要約されており、これらはｎＭにおけるＩＣ５０値を示す。
表７：抗ＬＡＧ−３抗体によるＭＨＣクラスＩＩへのＬＡＧ−３結合の阻害
結果は、２５Ｆ７、８Ｂ７および２６Ｈ１０が２５Ｅ３よりも約７から１３倍低いＩＣ５０値を示し、全４つの抗体がＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩの抗体への結合の阻害において有効であることを証明する。
実施例５：抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂによる抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激
抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する抗ＬＡＧ−３抗体の能力を試験するため、３Ａ９Ｔ細胞ペプチド刺激アッセイ（例えば、Workman et al. (2003) J. Immunol. 169:5392-5395; Workman et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:2255-2263、参照）を使用した。
このアッセイにおいて、ペプチドＨＥＬ４８−６２に特異的であるマウスＴ細胞ハイブリドーマの３Ａ９を、キラーＴ細胞として使用した。キラー３Ａ９Ｔ細胞を、細胞表面上にヒトＬＡＧ−３またはマウスＬＡＧ−３のいずれかを発現するように、レトロウイルスによって形質導入した。ＨＥＬ４８−６２ペプチド抗原を３Ａ９細胞へ提示するために使用される抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、マウスのＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞系ＬＫ３５．２であった。別の試験によって、ヒトＬＡＧ−３融合タンパク質がマウスのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができ、それによりこのアッセイにおけるＬＫ３５．２マウスＡＰＣの使用を有効にすることを決定した。３Ａ９細胞の抗原特異的刺激はインターロイキン−２（ＩＬ−２）の生成により示され、この分泌はＥＬＩＳＡ（mouse IL-2 OptEIA kit, BD Bioscience, Cat #555148 製造業者の推奨にしたがって）により測定された。
抗体の非存在下における３Ａ９Ｔ細胞上のヒトまたはマウスＬＡＧ−３の異所性発現は、対照３Ａ９Ｔ細胞のペプチド用量応答プロフィールと比較して、３Ａ９細胞によるＩＬ−２生成を刺激するために必要とされるペプチド抗原の量の増加により示されるとおり、トランスフェクトされたＴ細胞をＨＥＬ４８−６２ペプチド抗原を提示するＬＫ３５．２ ＡＰＣとインキュベートしたとき、抗原特異的応答における阻害効果を引き起こした。
抗原特異的Ｔ細胞応答の抗体刺激を試験するために、最初にＡＰＣ（２．５×１０４細胞）を３０分３７℃で抗原性ペプチド（２００ｎＭ）とプレインキュベートし、３Ａ９Ｔ細胞（ｍＬＡＧ−３、ｈＬＡＧ−３または対照細胞のいずれかを発現する５．０×１０４細胞）を、２５μｇ／ｍＬから３倍希釈において連続希釈された、抗−ｈＬＡＧ−３抗体（２５Ｅ３、２５Ｆ７、８Ｂ７、２６Ｈ１０、１１Ｆ２、１７Ｅ５）と１５分３７℃でプレインキュベートした。次に３Ａ９Ｔ細胞を抗原−パルスＡＰＣに加え、培養物を２４時間３７℃でインキュベートした。次に上清を回収し、マウスＩＬ−２の生成について測定した。ヒトＬＡＧ−３を発現する３Ａ９Ｔ細胞に関する結果は表８であり、これはｎＭにおいてＩＣ５０値を示す。
表８：抗ＬＡＧ−３抗体による抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激
結果は、抗体２５Ｆ７、８Ｂ７および２６Ｈ１０ならびにより小さい程度で２５Ｅ３が、抗原特異的Ｔ細胞応答アッセイにおいてＩＬ−２生成を刺激することができ、抗体１１Ｆ２が阻害する最小の能力を示し、抗体１７Ｅ５がこのアッセイにおいて機能性ではなかったことを示す。対照３Ａ９Ｔ細胞またはマウスＬＡＧ−３タンパク質をトランスフェクトされた３Ａ９Ｔ細胞により測定されたＩＬ−２生成は、抗体によって変化せず、刺激効果の特異性を証明した。
実施例６：抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂ単独または組合せによる腫瘍増殖阻害
インビボにおける腫瘍細胞の増殖を阻害する、抗ＬＡＧ−３抗体単独または他の免疫刺激抗体と組み合わせての能力を試験するため、２つの異なる同系マウス腫瘍移植片モデルを使用した。第１のモデルとしてマウスＳａ１Ｎ線維肉腫細胞を使用した。第２のモデルとしてマウスＭＣ３８大腸癌細胞系を使用した。
第１の実験において、０日目にマウス（Ａ／Ｊ血統）それぞれに２×１０６のＳａ１Ｎ線維肉腫細胞を移植し、腫瘍細胞を７日間増殖させた。移植後７日目、１０日目および１２日目に、マウスを１０ｍｇ／ｋｇの抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂ単独（ラット抗−マウスＬＡＧ−３ｍＡｂ Ｃ９Ｂ７Ｗ；eBioscience, Cat. No. 14-2231）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体単独（抗−マウスＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ １４Ｄ８）、抗−ＬＡＧ−３および抗ＰＤ−Ｌ１抗体組合せ、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体のいずれかで処理した。１４Ｄ８ｍＡｂは、マウスＩｇＧ１およびマウスカッパ定常領域を含むようにキメラ化されたラット抗−マウスＰＤ−Ｌ１抗体である。
マウスにおける腫瘍容量を移植後５０日間にわたって測定し、平均および中央腫瘍容量を測定した。平均腫瘍増殖阻害を計算した（０％阻害であるアイソタイプ対照ＩｇＧ１抗体での処理に基づく）。移植後２４日目の結果は以下の表９に要約されている：
表９：Ｓａ１Ｎ腫瘍モデルにおける平均腫瘍増殖阻害
したがって、抗−ＬＡＧ−３抗体単独または抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置単独は腫瘍増殖阻害を引き起こすが、両方の抗体の組合せがより良い腫瘍増殖阻害を引き起こす。処置群に対して、実験の終わりまでに、抗−ＬＡＧ−３単独で処置された１０匹のうち４匹のマウスは腫瘍がなくなり、対照ＩｇＧ１抗体で処置された１０匹のうち１匹のマウスのみが腫瘍がなくなるという結果であった。同様に、抗ＰＤ−Ｌ１単独で処置された１１匹のうち４匹のマウスは腫瘍がなくなった。抗−ＬＡＧ−３および抗ＰＤ−Ｌ１の組合せでのマウスの処置では１０匹のうち９匹のマウスは腫瘍がなくなった；腫瘍がなくならなかった残りのマウスは、試験にわたって小さく無痛の腫瘍を有した。
２つのさらなる試験は、マウスＭＣ３８大腸癌細胞系の細胞を移植されたマウスを使用した。最初の実験において、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにそれぞれ、０日目に２×１０６個のＭＣ３８細胞を移植し、移植後７日目、１０日目および１２日目に２００μｇ／用量の抗−ＬＡＧ−３単独（Ｃ９Ｂ７Ｗ ｍＡｂ）、抗ＰＤ−１単独（４Ｈ２ ｍＡｂ）または抗−ＬＡＧ−３および抗ＰＤ−１の組合せで処置した。ＩｇＧ１アイソタイプにマッチした抗体を４００μｇ／用量で対照として使用した。４Ｈ２ ｍＡｂは、マウスＩｇＧ１およびマウスカッパ定常領域を含むキメラ化されたラット抗−マウスＰＤ−１抗体である。
平均腫瘍容量、中央腫瘍容量および生存％を、移植後８０日目に測定した。結果は、この腫瘍モデル（ＭＣ３８）におけるＬＡＧ−３単剤療法は腫瘍増殖を阻害する活性が少ないか、または活性がないことを示し、実験中に生存した処置されたマウスはいなかった。対照的に、抗ＰＤ−１単剤療法は、１０匹のうち４匹のマウスが実験の終わりに腫瘍がなくなるという有意な活性を示した。さらに、Ｓａ１Ｎモデルの結果と同様に、抗−ＬＡＧ−３プラス抗ＰＤ−１の併用療法は、８匹のうち７匹のマウスは腫瘍がなくなるといういずれかの処置単独よりも有効であった。
ＭＣ３８モデルでの第２の実験において、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにそれぞれ、０日目に２×１０６個のＭＣ３８細胞を移植し、移植後５日目、８日目および１１日目に２００μｇ／用量の試験抗体および／または４００μｇ／用量の対照ＩｇＧ抗体で処置した。以下の通り：（ｉ）抗−ＩｇＧ１対照抗体；（ｉｉ）抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂ（Ｃ９Ｂ７Ｗ ｍＡｂ）と対照ＩｇＧ１；（ｉｉｉ）抗ＰＤ−１抗体（４Ｈ２）と対照ＩｇＧ１；（ｉｖ）抗ＣＴＬＡ−４抗体（９Ｄ９マウス抗−マウス ＣＴＬＡ−４ ｍＡｂ）と対照ＩｇＧ１；（ｖ）抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂと抗ＰＤ−１ｍＡｂ；または（ｖｉ）抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂと抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ。９Ｄ９ｍＡｂは、内因性マウスＣＴＬＡ−４がノックアウトされたマウスに生じた、マウス抗−マウスＣＴＬＡ−４抗体である。
平均腫瘍容量、中央腫瘍容量および生存％を、移植後１００日目に測定した。結果は、第１の実験と同様に、ＬＡＧ−３単剤療法は、ＭＣ３８腫瘍増殖を阻害する活性が少ないか、または活性がないことを示し、実験中に生存した処置されたマウスはいなかった。ＣＴＬＡ−４単剤療法は、また、ＭＣ３８腫瘍増殖を阻害する活性が少ないか、または活性がないことを示し、実験中に生存した処置されたマウスはいなかった。対照的に、抗ＰＤ−１単剤療法は、再び、１０匹のうち４匹のマウスは実験の終わりに腫瘍がなくなるという有意な活性を示した。さらに再び、併用療法は単剤療法よりも有効であった。抗−ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４の組合せで処置されたマウスに関しては１０匹のうち３匹のマウスが実験の終わりに腫瘍がなくなり、抗−ＬＡＧ−３および抗ＰＤ−１の組合せで処置されたマウスに関しては１０匹のうち８匹のマウスが実験の終わりに腫瘍がなくなった。
したがって、上記インビボ腫瘍移植片試験は、少なくとも特定の腫瘍モデルに関して、抗−ＬＡＧ抗体処置単独はインビボにおいて腫瘍増殖の有意な阻害を引き起こすことを証明した。さらに、多発性腫瘍モデルに関して、抗ＬＡＧ−３抗体と抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれかの併用療法は単剤療法単独よりも良い抗腫瘍活性を引き起こす。
実施例７：抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂによる阻害によるＮＯＤマウスにおける自己免疫の促進
自己免疫の発症により示される、免疫応答を刺激する抗ＬＡＧ−３抗体の能力を試験するために、糖尿病のＮＯＤマウスモデルを利用した。ＮＯＤマウスは、自己免疫性糖尿病を発症する傾向があることが知られている。糖尿病の進行は、血清グルコースを測定することにより、メスＮＯＤマウスにおいて追跡することができる。したがって、メスＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症における、抗−ＬＡＧ−３処置単独またはいずれかの免疫刺激抗体と組み合わせての効果を実験した。
メスＮＯＤマウスを、０日目、２日目および５日目に２５０μｇ／用量の以下のいずれかで処置した：（ｉ）ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体；（ｉｉ）抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂ単独（Ｃ９Ｂ７Ｗ ｍＡｂ）；（ｉｉｉ）抗ＰＤ−１ｍＡｂ単独（４Ｈ２ ｍＡｂ）；（ｉｖ）抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ単独（９Ｄ９ ｍＡｂ）；（ｖ）抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂと抗ＰＤ−１ｍＡｂ；または（ｖｉ）抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂと抗ＣＴＬＡ−４。結果は、抗−ＬＡＧ−３処置単独または抗ＰＤ−１処置単独（抗ＣＴＬＡ−４処置単独ではない）にて糖尿病性表現型へ転換するマウスの数を増加させることを証明した。さらに、抗−ＬＡＧ−３プラス抗ＰＤ−１または抗−ＬＡＧ−３プラス抗ＣＴＬＡ−４の組合せ処置は、マウスが糖尿病性表現型へ転換することにおいてより効果的であった。
したがって、これらの結果は、ＬＡＧ−３とその受容体の相互作用の遮断がＮＯＤマウスにおける良い免疫学的活性を可能にする負の免疫制御シグナルを妨げ、ＬＡＧ−３処置マウスにおけるこの良い免疫学的活性を抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれかとの組合せ処置により増強することができることを証明した。
実施例８：抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂを使用する免疫組織化学
この実験において、蛍光−標識抗−ＬＡＧ−３ヒト抗体を免疫組織化学実験において使用した。以下のＦＩＴＣ−標識、ヒト抗ＬＡＧ−３抗体を使用して：２５Ｆ７−ＦＩＴＣ（Ｆ：Ｐ＝２．９；ＩｇＧ１バージョン）；２５Ｆ７−Ｇ４−ＦＩＴＣ（Ｆ：Ｐ＝２．７；ＩｇＧ４バージョン）；８Ｂ７−ＦＩＴＣ（Ｆ：Ｐ＝２．６）および２６Ｈ１０−ＦＩＴＣ（Ｆ：Ｐ＝３．４）。リンパ球組織、特にへんとう腺（２つのサンプル）、脾臓（２つのサンプル）および胸腺（２つのサンプル）の一団を、下垂体組織（４つのサンプル）と共に実験した。ＬＡＧ−３をトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、また、対照として使用した。アセトン−固定クリオスタット切片を使用して。切片をＦＩＴＣ−標識抗ＬＡＧ−３抗体（０．２−５μｇ／ｍｌ）で染色し、次にブリッジ(bridge)抗体としてウサギ抗−ＦＩＴＣ抗体で染色し、次にウサギＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ＋Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Dako USA, Carpinteria, CA）を使用して視覚化した。結果は以下の表１０に要約されている。
表１０：抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂを使用する免疫組織化学
ＬＣ＝リンパ球；＋＝ポシティブ染色；−＝ネガティブ染色
予期されたとおり、ＬＡＧ−３発現はリンパ球組織の一団において検出された。さらに、３つのうち２つの抗ＬＡＧ−３抗体、２５Ｆ７（ＩｇＧ１およびＩｇＧ４バージョン）および２６Ｈ１０は、下垂体組織において保持されていることが示されたが、１つの抗体、８Ｂ７は、下垂体組織において保持されていることが示されなかった。したがって、免疫組織化学実験は、一方のサブセットは下垂体組織に維持され、他方のサブセットは下垂体組織に維持されない、抗ＬＡＧ−３抗体の２つのサブセットを同定した。
配列表の要約

Claims (22)

  1. ヒトＬＡＧ−３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体は、配列番号：３７と少なくとも９０％同一である配列からなる重鎖可変領域および配列番号：４３と少なくとも９０％同一である配列からなる軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  2. ヒトＬＡＧ−３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体は、それぞれ配列番号：３７および４３に記載の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  3. ヒトＬＡＧ−３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体は、それぞれ配列番号：１、７および１３に記載の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ配列番号：１９、２５および３１に記載の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  4. それぞれ配列番号：３７および４３に記載の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む抗体またはその抗原結合部分と同じヒトＬＡＧ−３上のエピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  5. 該エピトープがアミノ酸配列ＨＰＡＡＰＳＳＷ（配列番号：７７）を含む、請求項４に記載の抗体または部分。
  6. ＬＡＧ−３の主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子への結合を阻害する、および／または免疫応答を刺激する、請求項１から５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
  7. １×１０ −９ Ｍ以下のＫ Ｄ にてヒトＬＡＧ−３タンパク質に結合する、請求項１から６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
  8. ５×１０ −１０ Ｍ以下のＫ Ｄ にてヒトＬＡＧ−３タンパク質に結合する、請求項１から７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
  9. 治療剤と結合している、請求項１から８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
  10. 請求項１から８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子。
  11. 請求項１０に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  12. 請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  13. 請求項１２に記載の宿主細胞において抗体を発現させ、宿主細胞から抗体を単離することを含む、抗ＬＡＧ−３抗体を製造するための方法。
  14. 対象における抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するための組成物であって、請求項１から８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分を含む組成物。
  15. 対象における免疫応答を刺激するための組成物であって、請求項１から８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分を含む組成物。
  16. 対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物であって、請求項１から８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分を含む組成物。
  17. 対象におけるウイルス感染を処置するための組成物であって、請求項１から８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分を含む組成物。
  18. 少なくとも１つのさらなる免疫刺激剤をさらに含む、請求項１４から１７のいずれかに記載の組成物。
  19. 少なくとも１つのさらなる免疫刺激剤と別々に投与される、請求項１４から１７のいずれかに記載の組成物。
  20. 少なくとも１つのさらなる免疫刺激剤の前、後または同時に投与される、請求項１９に記載の組成物。
  21. 該免疫刺激剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項１８から２０のいずれかに記載の組成物。
  22. 該免疫刺激剤が、抗ＰＤ−１抗体である、請求項２１に記載の組成物。
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