KR20180021833A - 증진된 효능제 활성을 갖는 cd40에 대한 항체 - Google Patents

Abstract

인간 CD40에 결합하는 효능작용 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 이러한 항체는 임의로, FcγRIIb에 대해 증진된 특이성을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 본 발명은 또한 암 또는 만성 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체를 투여함으로써 암 또는 만성 감염을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

증진된 효능제 활성을 갖는 CD40에 대한 항체

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2016년 3월 4일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/303,838, 2015년 11월 9일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/252,615 및 2015년 6월 29일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/186,076에 대한 우선권을 주장하며, 그의 개시내용은 모두 본원에 참조로 포함된다.

최근 연구는 인간 암 및 만성 감염이 악성 또는 감염된 세포에 대한 환자의 면역 반응을 조정하는 작용제에 의해 치료될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 예를 들어, 문헌 [Reck & Paz-Ares (2015) Semin. Oncol. 42:402]을 참조한다. 효능작용 항-CD40 항체, 예컨대 CP-870893 및 다세투주맙 (SGN-40)은 그들이 이러한 면역 반응을 증진시킬 수 있다는 믿음에 기초하여 암을 치료하는 것에 대해 시도되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Kirkwood et al. (2012) CA Cancer J. Clin. 62:309; Vanderheide & Glennie (2013) Clin. Cancer Res. 19:1035]을 참조한다. 마우스에서의 최근 실험은 억제 Fc 수용체 FcγRIIb에 대해 증진된 특이성을 갖는 항-CD40 항체가 증가된 항종양 효능을 갖는다는 것을 밝혀내었다. 예를 들어, WO 2012/087928; 문헌 [Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 109:10966;Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754]을 참조한다.

인간 대상체에서 암 및 만성 감염의 치료를 위해 개선된 효능작용 항-인간 CD40 항체에 대한 필요가 존재한다. 이러한 항체는 바람직하게는 활성화 Fc 수용체와 비교하여 억제 Fc 수용체 FcγRIIb에 대해 증진된 특이성을 가질 것이고, 증진된 항종양 및/또는 항감염 활성을 나타낼 것이다.

임의로 FcγRIIb 수용체에의 결합에 대한 특이성을 증진시키는 변형된 Fc 영역을 갖는, 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 단리된 인간화 뮤린 모노클로날 항체 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 성숙 서열)가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 또는 인간화 항체를 포함한, 항체 12D6 (서열식별번호: 3 및 4), 5F11 (서열식별번호: 23 및 24), 8E8 (서열식별번호: 40 및 41), 5G7 (서열식별번호: 52 및 53) 및 19G3 (서열식별번호: 58 및 59) 중 1종 이상과 결합에 대해 경쟁하거나, 이를 교차-차단하거나, 또는 그와 동일한 에피토프에 결합하는 항-huCD40 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 항-인간 CD40 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 WGCLLTAVHPEPPTACRE (서열식별번호: 1의 잔기 11 - 28) (항체 12D6), EPPTACREKQYLINS (서열식별번호: 1의 잔기 21 - 35) (항체 12D6, 5G7 및 19G3), 및 ECLPCGESE (서열식별번호: 1의 잔기 58 - 66) (항체 5F11)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 에피토프에 결합한다.

일부 실시양태에서 본 발명의 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 여기서 중쇄는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 서열을 포함하고 경쇄는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하고, 이는 표 3에 개시된 바와 같이, 항-huCD40 항체 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 또는 19G3과 동일한 마우스 배선 V 영역 유전자 절편 및 J 영역 유전자 절편으로부터 적어도 부분적으로 유래된 것이다. 구체적으로, 항체는 항체 12D6 (뮤린 V 영역 배선 VH1-39_01 및 J 영역 배선 IGHJ4로부터 적어도 부분적으로 유래된 중쇄 CDR 서열 및 뮤린 V 영역 배선 VK1-110_01 및 J 영역 배선 IGKJ1로부터 적어도 부분적으로 유래된 경쇄 CDR 서열), 항체 5F11 (뮤린 V 영역 배선 VH1-4_02 및 J 영역 배선 IGHJ3으로부터 적어도 부분적으로 유래된 중쇄 CDR 서열 및 뮤린 V 영역 배선 VK3-5_01 및 J 영역 배선 IGKJ5로부터 적어도 부분적으로 유래된 경쇄 CDR 서열), 항체 8E8 (뮤린 V 영역 배선 VH1-80_01 및 J 영역 배선 IGHJ2로부터 적어도 부분적으로 유래된 중쇄 CDR 서열 및 뮤린 V 영역 배선 VK1-110_01 및 J 영역 배선 IGKJ2로부터 적어도 부분적으로 유래된 경쇄 CDR 서열), 항체 5G7 (뮤린 V 영역 배선 VH1-18_01 및 J 영역 배선 IGHJ4로부터 적어도 부분적으로 유래된 중쇄 CDR 서열 및 뮤린 V 영역 배선 VK10-96_01 및 J 영역 배선 IGKJ2로부터 적어도 부분적으로 유래된 경쇄 CDR 서열) 또는 항체 19G3 (뮤린 V 영역 배선 VH5-9-4_01 및 J 영역 배선 IGHJ3으로부터 적어도 부분적으로 유래된 중쇄 CDR 서열 및 뮤린 V 영역 배선 VK1-117_01 및 J 영역 배선 IGKJ2로부터 적어도 부분적으로 유래된 경쇄 CDR 서열)과 동일한 뮤린 배선으로부터 유래된 CDR 서열을 포함할 수 있다.

다양한 실시양태에서 본 발명의 항체는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 5의 잔기 31-35, 50-66 및 99-108을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 6의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 12D6-03의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 7의 잔기 31-35, 50-66 및 99-108을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 9의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 12D6-22의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 10의 잔기 31-35, 50-66 및 99-108을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 11의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 12D6-23의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 12의 잔기 31-35, 50-66 및 99-108을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 9의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 12D6-24의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 25의 잔기 31-35, 50-66 및 99-106을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 26의 잔기 24-38, 54-60 및 93-101을 포함하는 것인 항체 5F11-17의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 27의 잔기 31-35, 50-66 및 99-106을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 28의 잔기 24-38, 54-60 및 93-101을 포함하는 것인 항체 5F11-23의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 29의 잔기 31-35, 50-66 및 99-106을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 30의 잔기 24-38, 54-60 및 93-101을 포함하는 것인 항체 5F11-45의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 42의 잔기 31-35, 50-66 및 99-111을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 43의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 8E8-56의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 44의 잔기 31-35, 50-66 및 99-111을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 45의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 8E8-62의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 46의 잔기 31-35, 50-66 및 99-111을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 47의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 8E8-67의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 48의 잔기 31-35, 50-66 및 99-111을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 49의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 8E8-70의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 50의 잔기 31-35, 50-66 및 99-111을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 51의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 8E8-71의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 54의 잔기 31-35, 50-66 및 99-102를 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 55의 잔기 24-34, 50-56 및 89-97을 포함하는 것인 항체 5G7-22의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 56의 잔기 31-35, 50-66 및 99-102를 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 57의 잔기 24-34, 50-56 및 89-97을 포함하는 것인 항체 5G7-25의 CDR; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 60의 잔기 31-35, 50-66 및 99-101을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 62의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 19G3-11의 CDR; 및 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 63의 잔기 31-35, 50-66 및 99-101을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 64의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 19G3-22의 CDR로 이루어진 군으로부터 선택된, 중쇄가 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 서열을 포함하고 경쇄가 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 것인 중쇄 및 경쇄를 포함한다.

다양한 실시양태에서 본 발명의 항체는 IgG1f (서열식별번호: 65), SE (서열식별번호: 66), SELF (서열식별번호: 67), P238D (서열식별번호: 68), V4 (서열식별번호: 69), V4 D270E (서열식별번호: 70), V7 (서열식별번호: 71), V8 (서열식별번호: 72), V9 (서열식별번호: 73), V9 D270E (서열식별번호: 74), V11 (서열식별번호: 75), 및 V12 (서열식별번호: 76)로 이루어진 군으로부터 선택된 FcγRIIb-특이적 Fc 영역을 포함하는 불변 영역을 갖는, 12D6 (서열식별번호: 3의 잔기 1-119), 5F11 (서열식별번호: 23의 잔기 1-117), 8E8 (서열식별번호: 40의 잔기 1-122), 5G7 (서열식별번호: 52의 잔기 1-113) 및 19G3 (서열식별번호: 58의 잔기 1-112)으로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다.

일부 실시양태에서 항체는 12D6-03 (각각 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6의 잔기 1-119 및 1-112), 12D6-22 (각각 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 9의 잔기 1-119 및 1-112), 12D6-23 (각각 서열식별번호: 10 및 서열식별번호: 11의 잔기 1-119 및 1-112), 12D6-24 (각각 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 9의 잔기 1-119 및 1-112), 5F11-17 (각각 서열식별번호: 25 및 서열식별번호: 26의 잔기 1-117 및 1-111), 5F11-23 (각각 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 28의 잔기 1-117 및 1-111), 5F11-45 (서열식별번호: 29 및 서열식별번호: 30의 잔기 1-117 및 1-111), 8E8-56 (각각 서열식별번호: 42 및 서열식별번호: 43의 잔기 1-122 및 1-112), 8E8-62 (각각 서열식별번호: 44 및 서열식별번호: 45의 잔기 1-122 및 1-112), 8E8-67 (각각 서열식별번호: 46 및 서열식별번호: 47의 잔기 1-122 및 1-112), 8E8-70 (서열식별번호: 48 및 서열식별번호: 49의 잔기 1-122 및 1-112), 8E8-71 (각각 서열식별번호: 50 및 서열식별번호: 51의 잔기 1-122 및 1-112), 5G7-22 (각각 서열식별번호: 54 및 서열식별번호: 55의 잔기 1-113 및 1-107), 5G7-25 (각각 서열식별번호: 56 및 서열식별번호: 57의 잔기 1-113 및 1-107), 19G3-11 (각각 서열식별번호: 60 및 서열식별번호: 62의 잔기 1-112 및 1-112), 및 9G3-22 (각각 서열식별번호: 63 및 서열식별번호: 64의 잔기 1-112 및 1-112)로 이루어진 군으로부터 선택된 특이적 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 임의의 이들 항체는 FcγRIIb-특이적 Fc 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1f (서열식별번호: 65), SE (서열식별번호: 66), SELF (서열식별번호: 67), P238D (서열식별번호: 68), V4 (서열식별번호: 69), V4 D270E (서열식별번호: 70), V7 (서열식별번호: 71), V8 (서열식별번호: 72), V9 (서열식별번호: 73), V9 D270E (서열식별번호: 74), V11 (서열식별번호: 75), 및 V12 (서열식별번호: 76)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 이들 항체는 서열식별번호: 77의 경쇄 카파 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.

구체적 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호: 9의 경쇄 및 서열식별번호: 13 - 22 중 임의의 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄를 포함하는 인간화 12D6-24 항체, 또는 서열식별번호: 30의 경쇄 및 서열식별번호: 31 - 39 중 임의의 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄를 포함하는 인간화 5F11-45 항체를 포함한다. 구체적 항체는 12D6-24 SE (서열식별번호: 9 및 14), 12D6-24 SELF (서열식별번호: 9 및 15), 12D6-24 P238D (서열식별번호: 9 및 13), 12D6-24 V4 (서열식별번호: 9 및 16), 12D6-24 V4 D270E (서열식별번호: 9 및 17), 12D6-24 V8 (서열식별번호: 9 및 18), 12D6-24 V9 (서열식별번호: 9 및 19), 12D6-24 V9 D270E (서열식별번호: 9 및 20), 12D6-24 V11 (서열식별번호: 9 및 21), 12D6-24 V12 (서열식별번호: 9 및 22), 5F11-45 SE (서열식별번호: 30 및 31), 5F11-45 SELF (서열식별번호: 30 및 32), 5F11-45 V4 (서열식별번호: 30 및 33), 5F11-45 V4 D270E (서열식별번호: 30 및 34), 5F11-45 V8 (서열식별번호: 30 및 35), 5F11-45 V9 (서열식별번호: 30 및 36), 5F11-45 V9 D270E (서열식별번호: 30 및 37), 5F11-45 V11 (서열식별번호: 30 및 38), 및 5F11-45 V12 (서열식별번호: 30 및 39)를 포함하며, 여기서 서열은 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 제공된다.

추가 실시양태에서 본 발명의 항-huCD40 항체는 12D6-24 SE (서열식별번호: 9 및 14), 12D6-24 SELF (서열식별번호: 9 및 15), 12D6-24 P238D (서열식별번호: 9 및 13), 12D6-24 V4 (서열식별번호: 9 및 16), 12D6-24 V4 D270E (서열식별번호: 9 및 17), 12D6-24 V8 (서열식별번호: 9 및 18), 12D6-24 V9 (서열식별번호: 9 및 19), 12D6-24 V9 D270E (서열식별번호: 9 및 20), 12D6-24 V11 (서열식별번호: 9 및 21), 12D6-24 V12 (서열식별번호: 9 및 22), 5F11-45 SE (서열식별번호: 30 및 31), 5F11-45 SELF (서열식별번호: 30 및 32), 5F11-45 V4 (서열식별번호: 30 및 33), 5F11-45 V4 D270E (서열식별번호: 30 및 34), 5F11-45 V8 (서열식별번호: 30 및 35), 5F11-45 V9 (서열식별번호: 30 및 36), 5F11-45 V9 D270E (서열식별번호: 30 및 37), 5F11-45 V11 (서열식별번호: 30 및 38), 또는 5F11-45 V12 (서열식별번호: 30 및 39)의 중쇄 및 경쇄의 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 및 95% 서열 동일성을 공유하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.

추가 실시양태에서 본 발명의 항-huCD40 항체는 12D6-24 SE (서열식별번호: 9 및 14), 12D6-24 SELF (서열식별번호: 9 및 15), 12D6-24 P238D (서열식별번호: 9 및 13), 12D6-24 V4 (서열식별번호: 9 및 16), 12D6-24 V4 D270E (서열식별번호: 9 및 17), 12D6-24 V8 (서열식별번호: 9 및 18), 12D6-24 V9 (서열식별번호: 9 및 19), 12D6-24 V9 D270E (서열식별번호: 9 및 20), 12D6-24 V11 (서열식별번호: 9 및 21), 12D6-24 V12 (서열식별번호: 9 및 22), 5F11-45 SE (서열식별번호: 30 및 31), 5F11-45 SELF (서열식별번호: 30 및 32), 5F11-45 V4 (서열식별번호: 30 및 33), 5F11-45 V4 D270E (서열식별번호: 30 및 34), 5F11-45 V8 (서열식별번호: 30 및 35), 5F11-45 V9 (서열식별번호: 30 및 36), 5F11-45 V9 D270E (서열식별번호: 30 및 37), 5F11-45 V11 (서열식별번호: 30 및 38), 또는 5F11-45 V12 (서열식별번호: 30 및 39)의 중쇄 및 경쇄의 서열로 본질적으로 이루어진 중쇄 및 경쇄를 포함한다.

일부 실시양태에서, V4 또는 V9 Fc 서열 변이체를 포함하는 본 발명의 항-huCD40 항체는 D270E 서열 변이체를 추가로 포함한다. 이러한 항체는 인간화 12D6-24 V4 D270E (서열식별번호: 9 및 17), 12D6-24 V9 D270E (서열식별번호: 9 및 20), 5F11-45 V4 D270E (서열식별번호: 30 및 34), 및 5F11-45 V9 D270E (서열식별번호: 30 및 37)를 포함하며, 여기서 서열은 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 제공된다. 대안적 실시양태에서, 본 발명의 항-인간 CD40 항체는 이들 중쇄 및 경쇄의 서열로 본질적으로 이루어진 중쇄 및 경쇄를 포함하거나, 또는 이들 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 및 95% 서열 동일성을 공유하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-huCD40 항체는 활성화 수용체에 대한 결합과 대조적으로, 자연 발생 Fc 영역을 갖는 항체보다 FcγRIIb에의 결합에 대해 더 큰 특이성을 갖는 변형된 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서 본 발명의 항-huCD40 항체에 대한 A/I 비는 5 미만이고, 바람직한 실시양태에서, 1 미만이다.

일부 실시양태에서 본 발명의 항-huCD40 항체는 1개 이상의 중쇄 및 1개 이상의 경쇄, 예컨대 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다.

본 발명은 본 발명의 항-CD40 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산, 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 발현 벡터로 형질전환된 세포, 및 발현 벡터로 형질전환된 세포로부터 항체를 발현시키고 항체를 회수함으로써 항체를 생산하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항-huCD40 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 대상체에게 유효량의 본 발명의 항-huCD40 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하여 대상체에서 면역 반응이 증진되도록 하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 종양을 갖고, 종양에 대한 면역 반응이 증진된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 바이러스 감염, 예를 들어 만성 바이러스 감염을 갖고, 항바이러스 면역 반응이 증진된다.

본 발명은 또한 대상체에게 본 발명의 항-huCD40 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하여 종양의 성장이 억제되도록 하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 항-huCD40 항체 또는 그의 항원 결합 단편을, 예를 들어 제약 조성물로서 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 예를 들어 면역요법에 의해 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암은 방광암, 유방암, 자궁/자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 식도암, 위장암, 췌장암, 결장직장암, 결장암, 신장암, 두경부암, 폐암, 위암, 배세포암, 골암, 간암, 갑상선암, 피부암, 중추 신경계의 신생물, 림프종, 백혈병, 골수종, 육종, 및 바이러스-관련 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 전이성 암, 불응성 암 또는 재발성 암이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 면역 기능 조정 방법 및 치료 방법은 본 발명의 항-huCD40 항체를 1종 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 항-PD1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-LAG3 항체, 항-GITR 항체, 항-OX40 항체, 항-CD73 항체, 항-TIGIT 항체, 항-CD137 항체, 항-CD27 항체, 항-CSF-1R 항체, 항-CTLA-4 항체, TLR 효능제, 또는 IDO 또는 TGFβ의 소분자 길항제와 조합하여, 또는 이와 이중특이적 시약으로서 투여하는 것을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 항-huCD40 요법은 항-PD1 및/또는 항-PD-L1 요법, 예를 들어 인간 PD1에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 인간 PD-L1에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용한 치료와 조합된다.

도 1은 본원 (표 4)에 개시된 Fc 서열 변이체를 더 잘 예시하기 위한, 인간 IgG1f 불변 도메인 (서열식별번호: 65) 리넘버링된 118 - 446의 서열을 보여준다. 변이 대상 잔기는 볼드체로 표시되고, 변경된 아미노산은 잔기 아래에 볼드체로 제공된다. D270E 치환은 밑줄표시된다. C-말단 리신 (K) 잔기는 도 1 및 서열식별번호: 65에서, 뿐만 아니라 서열 목록에 개시된 모든 다른 중쇄 및 중쇄 불변 도메인 서열에서 제거되었다. 그러나, 다른 실시양태에서, 특히 본 발명의 항-huCD40 항체의 중쇄 및 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 핵산 구축물에서, 이들 서열은 단백질의 C-말단에 추가의 리신 잔기 또는 핵산의 3' 말단에 여분의 리신을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다.
도 2는 본 발명의 항체에 의해 결합되는, 뿐만 아니라 CD40L 결합을 차단하는 인간 CD40 상의 에피토프 그룹 ("빈")을 예시하는 벤 다이어그램이다. 중첩 타원형 또는 원형에 있는 항체는 인간 CD40에의 결합에 대해 경쟁하고, 직사각형에 속하는 항체는 인간 CD40에의 CD40L 결합을 차단한다.
도 3a 및 3b는 Fc 서열의 함수로서 효능제 항-CD40 항체에 의한, IL-6 분비에 의해 측정된 바와 같은, 수지상 세포의 활성화를 보여준다. 실시예 7을 참조한다. mAb 12D6-24 가변 도메인, 및 IgG1f, SE, SELF, P238D, V4, V8, V9 및 V12 변이체를 포함한 다양한 인간 IgG1f 불변 영역을 포함하는 일련의 항체를 구축하였다. 도 3a는 1명의 공여자로부터의 세포를 사용하여 수득된 데이터를 제시하고, 도 3b는 상이한 공여자로부터의 세포를 사용하여 수득된 데이터를 제시한다.
도 4는 가변 도메인 서열의 함수로서 효능제 항-CD40 항체에 의한, 세포 표면 CD54에 의해 측정된 바와 같은, 세포의 활성화를 보여준다. 실시예 7을 참조한다. 인간 IgG1f-V12 불변 영역, 및 모 (뮤린) 항-CD40 mAb 12D6, 5G7, 8E8, 19G3 및 5F11로부터의 가변 도메인을 포함하는 일련의 항체를 구축하였다. 결과는 중앙 형광 강도 (MFI)로서 항체 농도의 함수로서 플롯팅된다.
도 5는 D270 치환을 갖는 항체를 포함한, 본 발명의 다양한 항체에 의한 퍼센트 FcγR 결합을 보여준다. 실시예 8을 참조한다. "-sup"를 포함하는 항체 명칭은 항체 생산 세포로부터의 상청액을 나타내는 한편, 다른 것은 정제된 항체이다. 포르테바이오 옥테트 시스템에서 측정된 바와 같이, 데이터는 항체 및 수용체의 각각의 조합에 대한 최대 수용체 결합 값의 백분율로서 제시된다. 예를 들어, 실시예 3을 참조한다. 3개의 막대의 각각의 클러스터는, 좌측에서 우측으로, hCD32a/ FcγRIIa-H131 (10 μM) (사선 막대), hCD32b/ FcγRIIa-R131 (10 μM) (흑색 막대), 및 hCD32b/ FcγRIIb (1 μM) (백색 막대)에 대한 결합을 나타낸다.
도 6a 및 6b는 인간 CD40 및 인간 Fcγ 수용체를 발현하는 트랜스제닉 마우스에서, 각각 T 세포 활성화 및 혈소판 수 변화에 대한 본 발명의 선택된 항-CD40 항체의 효과를 보여준다. 실시예 9를 참조한다. 도 6a는 나타난 바와 같이, 본 발명의 선택된 항-CD40 항체로 치료받은 동물에서 Tet-OVA 반응성 CD8+ T 세포의 퍼센트를 보여준다. 도 6b는 항체 주사 24시간 후 치료전 혈소판 수의 백분율로서 혈소판 수를 보여준다. 도면의 비교는 항체 12D6-V11이 최대 활성화를 나타낼 뿐만 아니라 혈소판 수에서 최대 감소를 나타내는 것으로 보아, 활성화의 수준이 혈소판 수의 감소와 상관관계가 있다는 것을 보여준다. 실시예 9를 참조한다.
도 6c는 MC38 종양 세포로 접종되고 항-CD40 12D6-24 및 5F11-45 클론의 Fc 변이체로 치료받은 인간화 CD40/FcγR 마우스의 항종양 반응을 보여준다. 결과는 평균 +/-SEM. n=7(12D6-24) 또는 6 (5F11-45)으로 제시된다. 실시예 9를 참조한다.
도 6d는 MC38 세포로 피하 재-시험접종되고 종양 성장이 추적된, c에 기재된 실험의 12D6-24 군으로부터의 무종양 마우스를 보여준다. 대조군은 나이브 마우스로 이루어진다. 결과는 평균 +/-SEM. n=4로 제시된다. 실시예 9를 참조한다.

본 발명은 인간 CD40 ("huCD40")에 특이적으로 결합하고 효능제 활성을 갖는 단리된 항체, 특히 모노클로날 항체, 예를 들어 인간화 또는 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 서열은 다양한 인간화 뮤린 항-huCD40 모노클로날 항체에 대해 제공된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 특정한 뮤린 중쇄 및 경쇄 배선 서열로부터 유래되고/거나 특정한 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역과 같은 특정한 구조적 특색을 포함한다. 다른 실시양태에서 항체는 본원에 서열이 제공되어 있는 항-CD40 항체와 CD40 결합에 대해 경쟁하거나, 또는 그와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서 중쇄 Fc 영역의 서열은 FcγRIIb에 대한 결합을 특히 증진시키기 위해 변형된다.

이러한 항체, 이러한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 면역접합체 및 이중특이적 분자, 및 항체 또는 단편을 함유하도록 제제화된 제약 조성물을 제조하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 또한, 면역 반응 증진을 위해, 단독으로 또는 다른 면역자극제 (예를 들어, 항체) 및/또는 암 또는 항감염 요법과 조합하여 항체를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 따라서, 본원에 기재된 항-huCD40 항체는, 예를 들어 종양 성장을 억제하고 만성 바이러스 감염을 치료하는 것을 포함하는 광범위한 치료 용도로 치료에 사용될 수 있다.

정의

본 기재내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.

CD40은 "TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 5" (TNFRSF5)를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 또는 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본원에서 CD40에 대한 언급은 인간 CD40 ("huCD40")을 지칭하고, 항-CD40 항체는 항-인간 CD40 항체를 지칭한다. 인간 CD40은 추가로 유전자식별번호(GENE ID NO): 958 및 MIM (인간에서의 멘델 유전): 109535로 기재된다. 20개의 아미노산 신호 서열을 포함한, 인간 CD40 (NP_001241.1)의 서열이 서열식별번호: 1에 제공된다.

CD40은, 또한 TNFSF5, gp39 및 CD154로도 지칭되는 CD40 리간드 (CD40L)와 상호작용한다. 달리 나타내지 않는 한, 또는 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본원에서 CD40L에 대한 언급은 인간 CD40L ("huCD40L")을 지칭한다. 인간 CD40L은 추가로 유전자식별번호: 959 및 MIM: 300386으로 기재된다. 인간 CD40L (NP_000065.1)의 서열은 서열식별번호: 2에 제공된다.

달리 나타내지 않는 한 또는 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄를 포함할 수 있다. "항체"는, 한 실시양태에서, 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 V_H로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 특정 자연 발생 IgG, IgD 및 IgA 항체에서, 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 특정 자연 발생 항체에서, 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 V_L로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. V_H 및 V_L 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

항체는 전형적으로, 10^-7 내지 10^-11 M 또는 그 미만의 해리 상수 (K_D)에 의해 반영되는 높은 친화도로 그의 동족 항원에 특이적으로 결합한다. 약 10^-6 M 초과의 임의의 K_D는 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 본원에 사용된 항원에 "특이적으로 결합하는" 항체는 항원 및 실질적으로 동일한 항원에 높은 친화도로 결합하지만 (이는 10^-7 M 이하, 바람직하게는 10^-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 5 x 10^-9 M 이하, 및 가장 바람직하게는 10^-8 M 내지 10^-10 M 또는 그 미만의 K_D를 갖는 것을 의미함), 비관련 항원에는 높은 친화도로 결합하지 않는 항체를 지칭한다. 항원이 주어진 항원에 대해 고도의 서열 동일성을 나타내는 경우에, 예를 들어 주어진 항원의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 나타내는 경우에, 이러한 항원은 주어진 항원과 "실질적으로 동일"하다. 예로서, 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 특정 비-인간 영장류 종 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이)으로부터의 CD40과 교차-반응할 수 있지만, 다른 종으로부터의 CD40, 또는 CD40 이외의 항원과는 교차-반응하지 않을 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 이뮤노글로불린은 IgA, 분비형 IgA, IgG 및 IgM을 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상적으로 공지된 이소형 중 임의의 것으로부터의 것일 수 있다. IgG 이소형은 특정 종에서 하위부류로 분류된다: 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 마우스에서 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3. 이뮤노글로불린, 예를 들어 인간 IgG1은 최대 수개의 아미노산에서 서로 상이한 여러 동종이형으로 존재한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 항체는 IgG1f 불변 도메인 (서열식별번호: 65)을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, "항체"는 예로서, 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 및 비-인간 항체; 완전 합성 항체; 및 단일 쇄 항체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원 결합 단편"은 항원 (예를 들어, 인간 CD40)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 용어 "항원-결합 부분/단편" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편 - V_L, V_H, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편 - 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) V_H 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편, 및 (v) V_H 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)을 포함한다. 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 또는 합성 링커에 의해 연결된 2개 이상의 단리된 CDR의 조합은, 항원에 결합할 수 있다면, 항체의 항원 결합 도메인에 포함될 수 있다.

단일 쇄 항체 구축물이 또한 본 발명에 포함된다. Fv 단편의 2개의 도메인, V_L 및 V_H가 별개의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 재조합 방법을 사용하여 이들을 단일 단백질 쇄로 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있고, 여기서 V_L 및 V_H 영역은 쌍형성하여 단일 쇄 Fv (scFv)로 공지된 1가 분자를 형성한다; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:5879-5883)]을 참조한다. 이러한 단일 쇄 항체도 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분/단편"에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 및 다른 잠재적 구축물이 문헌 [Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301]에 기재되어 있다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분/단편은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 단어 "단편"이 예컨대 청구범위에서 항체와 관련하여 사용되는 경우에, 이는 항체의 항원 결합 단편을 지칭하며, 이로써 "항체 또는 단편"은 "항체 또는 그의 항원 결합 단편"과 동일한 의미를 갖는다.

"이중특이적" 또는 "이중기능적 항체"는 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 2개의 항원 결합 부위를 발생시키는, 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍을 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함한 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148, 1547-1553]을 참조한다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 디스플레이하는 항체 또는 모든 항체가 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 디스플레이하는 항체의 조성물을 지칭한다. 전형적으로 이러한 모노클로날 항체는 단세포 또는 항체를 코딩하는 핵산으로부터 유래될 것이고, 임의의 서열 변경을 의도적으로 도입하는 것 없이 증식될 것이다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 임의적인 불변 영역을 갖는 모노클로날 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는, 예를 들어, 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말 비-인간 동물 (예를 들어, 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스)로부터 수득된 B 세포를 불멸화 세포와 융합시킴으로써 수득된 하이브리도마에 의해 생산된다.

본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는, 배선 유전자에 의해 코딩되지만 예를 들어 항체 성숙 동안 발생하는 후속 재배열 및 돌연변이를 포함하는, 특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 사용하는 가변 및 불변 영역을 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 (예를 들어, 문헌 [Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125] 참조), 가변 영역은, 재배열되어 외래 항원에 특이적인 항체를 형성하는, 다양한 유전자에 의해 코딩된 항원 결합 도메인을 함유한다. 재배열에 더하여, 가변 영역은 외래 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 다중 단일 아미노산 변화 (체세포 돌연변이 또는 과다돌연변이로 지칭됨)에 의해 추가로 변형될 수 있다. 불변 영역은 항원에 대해 추가로 반응하여 변화할 것이다 (즉, 이소형 스위치). 따라서, 항원에 반응하여 경쇄 및 중쇄 이뮤노글로불린 폴리펩티드를 코딩하는 재배열되고 체세포 돌연변이된 핵산 서열은 원래의 배선 서열과 동일하지 않을 수 있지만, 그 대신 실질적으로 동일하거나 유사할 것이다 (즉, 적어도 80% 동일성을 가짐).

"인간" 항체 (HuMAb)는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 용어 "인간" 항체 및 "완전 인간" 항체는 동의어로 사용된다.

"인간화" 항체는 비-인간 항체, 예를 들어 마우스 항체의 CDR 도메인 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두가 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 대체된 항체를 지칭한다. 인간화 형태의 항체의 한 실시양태에서, CDR 도메인 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두는 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 아미노산으로 대체된 반면에, 1개 이상의 CDR 영역 내의 일부, 대부분 또는 모든 아미노산은 변화되지 않는다. 특정한 항원에 결합하는 항체의 능력을 제거하지 않는 한, 아미노산의 작은 부가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 허용가능하다. "인간화" 항체는 원래 항체의 것과 유사한 항원 특이성을 보유한다.

"키메라 항체"는, 가변 영역은 한 종으로부터 유래되고, 불변 영역은 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역은 마우스 항체로부터 유래되고, 불변 영역은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다. "하이브리드" 항체는 상이한 유형의 중쇄 및 경쇄, 예컨대 마우스 (모) 중쇄 및 인간화 경쇄, 또는 그 반대의 경우를 갖는 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE 항체)를 지칭한다.

"동종이형"은 특정 이소형 그룹 내의 자연 발생 변이체를 지칭하며, 변이체는 1개 또는 소수의 아미노산에서 상이하다. 예를 들어, 문헌 [Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1]을 참조한다.

어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환가능하게 사용된다.

본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, CD40에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 CD40 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, CD40의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 상이한 종으로부터의 다른 CD40 단백질과 교차-반응성을 가질 수 있다.

항체 Fc 영역과 특정 Fc 수용체의 상호작용으로부터 유래하는 "이펙터 기능"은 Clq 결합, 보체 의존성 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, FcγR-매개 이펙터 기능 예컨대 ADCC 및 항체 의존성 세포-매개 식세포작용 (ADCP), 및 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절을 포함하나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 항원 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 필요로 한다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한, FcγR 패밀리의 수용체를 포함한다. FcγR 패밀리는 3종의 활성화 (마우스에서 FcγRI, FcγRIII, 및 FcγRIV; 인간에서 FcγRIA, FcγRIIA, 및 FcγRIIIA) 및 1종의 억제 (FcγRIIb, 또는 동등한 것으로 FcγRIIB) 수용체로 이루어진다. 인간 FcγR의 다양한 특성이 표 1에 요약되어 있다. 대부분의 선천성 이펙터 세포 유형은 1종 이상의 활성화 FcγR 및 억제 FcγRIIb를 공-발현하는 반면에, 자연 킬러 (NK) 세포는 1종의 활성화 Fc 수용체 (마우스에서 FcγRIII 및 인간에서 FcγRIIIA)를 선택적으로 발현하지만, 마우스 및 인간에서 억제 FcγRIIb는 발현하지 않는다. 인간 IgG1은 대부분의 인간 Fc 수용체에 결합하고, 그것이 결합하는 활성화 Fc 수용체의 유형과 관련하여 뮤린 IgG2a와 동등한 것으로 간주된다.

표 1

인간 FcγR의 특성

"Fc 영역" (결정화가능 단편 영역) 또는 "Fc 도메인" 또는 "Fc"는, 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 상에 위치하는 Fc 수용체 또는 전형적 보체계의 제1 성분 (C1q)에 대한 결합을 포함한, 이뮤노글로불린의 숙주 조직 또는 인자에 대한 결합을 매개하는 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 따라서, Fc 영역은 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인 (예를 들어, CH1 또는 CL)을 제외한 항체의 불변 영역을 포함한다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소형에서, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄의 각각에서 C_H2 및 C_H3 불변 도메인을 포함하고; IgM 및 IgE Fc 영역은 각각의 폴리펩티드 쇄에서 3개의 중쇄 불변 도메인 (C_H 도메인 2-4)을 포함한다. IgG의 경우에, Fc 영역은 이뮤노글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3, 및 Cγ1과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 C226 또는 P230에서의 아미노산 잔기 (또는 이들 2종의 아미노산 사이의 아미노산)로부터 중쇄의 카르복시-말단까지의 스트레치로 정의되고, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따른다. 문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD]; 또한 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0248028의 도 3c-3f를 참조한다. 인간 IgG Fc 영역의 C_H2 도메인은 약 아미노산 231로부터 약 아미노산 340까지 연장되는 반면에, C_H3 도메인은 Fc 영역의 C_H2 도메인의 C-말단 측에 위치하며, 즉, IgG의 약 아미노산 341로부터 약 아미노산 447까지 연장된다 (C-말단 리신 포함). 본원에 사용된 Fc 영역은 임의의 동종이형 변이체를 포함한 천연 서열 Fc, 또는 변이체 Fc (예를 들어, 비-자연 발생 Fc)일 수 있다. Fc는 또한 단리된 상태의 또는 Fc-포함 단백질 폴리펩티드 예컨대 "Fc 융합 단백질" (예를 들어, 항체 또는 이뮤노어드헤신)로도 지칭되는 "Fc 영역을 포함하는 결합 단백질"의 문맥에서의 이러한 영역을 지칭할 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역" 또는 "천연 서열 Fc"는 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 포함한다. 천연 서열 Fc는 Fc의 다양한 동종이형을 포함한다. 예를 들어 문헌 [Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1]을 참조한다.

용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 이뮤노글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위 (예를 들어, huCD40)를 지칭한다. 단백질 항원 내의 에피토프는 인접 아미노산 (통상적으로 선형 에피토프) 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치되는 비인접 아미노산 (통상적으로 입체형태적 에피토프) 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 항상 그러한 것은 아니지만 전형적으로 변성 용매에의 노출 시 유지되는 반면에, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 의한 처리 시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 고유한 공간 입체형태로 포함한다.

용어 "에피토프 맵핑"은 항체-항원 인식에 수반되는 항원 상의 분자 결정기의 확인 과정을 지칭한다. 어떠한 에피토프가 주어진 항체에 의해 결합되는지 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 중첩 또는 인접 펩티드 (예를 들어, CD40으로부터)가 주어진 항체 (예를 들어, 항-CD40 항체)와의 반응성에 대해 시험되는 이뮤노블롯팅 및 면역침전 검정; X선 결정학; 2-차원 핵 자기 공명; 효모 디스플레이 (실시예 6 참조); 및 HDX-MS (예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)] 참조) (실시예 5 참조)를 포함한다.

2종 이상의 항체와 관련하여 용어 "동일한 에피토프에 결합하다"는 항체가 주어진 방법에 의해 결정 시, 아미노산 잔기의 동일한 절편에 결합한다는 것을 의미한다. 항체가 본원에 기재된 항체와 "CD40 상의 동일한 에피토프"에 결합하는지 여부를 결정하는 기술은, 예를 들어, 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 에피토프의 원자 해상도를 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 X선 분석, 및 수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS)을 포함한다. 다른 방법, 예컨대 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 (Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081) 또는 돌연변이체 표적 서열 변이체의 효모 디스플레이 (실시예 6 참조)는, 항체의 항원 단편 (예를 들어 단백질분해 단편)에 대한 또는 항원의 돌연변이된 변경에 대한 결합을 모니터링하며, 여기서 항원 서열 내 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 상실은 종종 에피토프 성분의 지표로 간주된다. 또한, 에피토프 맵핑에 대해 컴퓨터 조합 방법을 사용할 수도 있다. 이들 방법은 관심 항체가 조합 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특이적인 짧은 펩티드를 친화도 단리하는 능력에 의존한다. 동일하거나 밀접하게 관련된 VH 및 VL 또는 동일한 CDR 서열을 갖는 항체는 동일한 에피토프에 결합할 것으로 예상된다.

"표적에 대한 결합에 대해 또 다른 항체와 경쟁하는" 항체는 다른 항체가 표적에 결합하는 것을 (부분적으로 또는 완전히) 억제하는 항체를 지칭한다. 2종의 항체가 표적에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하는지 여부, 즉 하나의 항체가 다른 항체가 표적에 결합하는 것을 억제하는지 여부 및 그 정도는 공지된 경쟁 실험을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 또 다른 항체가 표적에 결합하는 것과 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 경쟁하고, 그의 결합을 억제한다. 억제 또는 경쟁 수준은 항체가 "차단 항체" (즉, 표적과 먼저 인큐베이션되는 콜드 항체)인지에 따라 상이할 수 있다. 경쟁 검정은 예를 들어, 문헌 [Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb. Protoc.; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 또는 Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (USA) 1999]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 경쟁 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 인접한 에피토프에 결합한다 (예를 들어, 입체 장애에 의해 입증되는 바와 같음).

다른 경쟁적 결합 검정은 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al. (1983) Methods in Enzymology 9:242] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al. (1986) J. Immunol. 137:3614] 참조); 고체 상 직접 표지 검정, 고체 상 직접 표지 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow and Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 사용한 고체 상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al. (1988) Mol. Immunol. 25(1):7] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung et al. (1990) Virology 176:546); 및 직접 표지 RIA (Moldenhauer et al. (1990) Scand. J. Immunol. 32:77)를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합하다" 및 "특이적으로 결합하다"는 다른 항원이 아닌 미리 결정된 항원 상의 에피토프에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 (i) 예를 들어 미리 결정된 항원, 예를 들어 재조합 인간 CD40을 분석물로서 사용하고 항체를 리간드로서 사용하는 비아코어(BIACORE)® 2000 표면 플라즈몬 공명 기기에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정하거나 또는 항원 양성 세포에 대한 항체의 결합의 스캐차드 분석에 의해 결정하였을 때, 대략 10^-7 M 미만, 예컨대 대략 10^-8 M, 10^-9 M 또는 10^-10 M 미만 또는 심지어 그 미만의 평형 해리 상수 (K_D)로 결합하고, (ii) 미리 결정된 항원 또는 밀접하게-관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에의 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 2-배 더 큰 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다. 따라서, "인간 CD40에 특이적으로 결합하는" 항체는 가용성 또는 세포 결합 인간 CD40에 10^-7 M 이하, 예컨대 대략 10^-8 M, 10^-9 M 또는 10^-10 M 미만 또는 심지어 그 미만의 K_D로 결합하는 항체를 지칭한다. "시노몰구스 CD40과 교차-반응하는" 항체는 10^-7 M 이하, 예컨대 대략 10^-8 M, 10^-9 M 또는 10^-10 M 미만 또는 심지어 그 미만의 K_D로 시노몰구스 CD40에 결합하는 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "k_assoc" 또는 "K_A"는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률 상수를 지칭하는 반면에, 본원에 사용된 용어 "k_dis" 또는 "K_D"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율 상수를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "K_D"는 K_D 대 K_A의 비 (즉, K_D/K_A)로부터 수득된 평형 해리 상수를 지칭하고, 이는 몰 농도 (M)로 표현된다. 항체에 대한 K_D 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 K_D를 결정하는 바람직한 방법은 바람직하게는 포르테바이오 옥테트 레드 장치를 사용하는 생물층 간섭측정 (BLI) 분석 (실시예 3 참조), 바람직하게는 바이오센서 시스템 예컨대 비아코어® 표면 플라즈몬 공명 시스템을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 (실시예 4 참조), 또는 유동 세포측정법 및 스캐차드 분석이다.

항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하는 시험관내 또는 생체내 검정과 관련하여 용어 "EC50"은 최대 반응의 50%, 즉 최대 반응과 기준선 사이의 중간인 반응을 유도하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 농도를 지칭한다.

용어 "고정된 CD40에 결합하다"는 본원에 기재된 항체가, 예를 들어 세포의 표면 상에 발현된 또는 고체 지지체에 부착된 CD40에 결합하는 능력을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "교차-반응하다"는 본원에 기재된 항체가 상이한 종으로부터의 CD40에 결합하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 인간 CD40에 결합하는 본원에 기재된 항체는 또한 또 다른 종으로부터의 CD40 (예를 들어, 시노몰구스 CD40)에도 결합할 수 있다. 본원에 사용된 교차-반응성은 결합 검정 (예를 들어, SPR, ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적 반응성을 검출하거나, 또는 CD40을 생리학상 발현하는 세포에 결합시키거나, 또는 달리 이와 기능적으로 상호작용시킴으로써 측정될 수 있다. 교차-반응성을 결정하는 방법은, 예를 들어 비아코어® 2000 SPR 기기 (비아코어 아베(Biacore AB), 스웨덴 웁살라)를 사용하는 비아코어® 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석에 의한 본원에 기재된 바와 같은 표준 결합 검정, 또는 유동 세포측정 기술을 포함한다.

대상에 적용되는 바와 같은 본원에 사용된 용어 "자연 발생"은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체 (바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생이다.

"폴리펩티드"는 쇄의 길이에 대한 상한치 없이, 적어도 2개의 연속적으로 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 쇄를 지칭한다. 단백질 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 변형 예컨대, 비제한적으로, 글리코실화, 인산화 또는 디술피드 결합을 함유할 수 있다. "단백질"은 1개 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, cDNA일 수 있다.

또한, 본원에 제공된 항체 서열에 대한 "보존적 서열 변형", 즉 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 또는 아미노산 서열을 함유하는 항체의 항원에 대한 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형이 제공된다. 예를 들어, 변형은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 보존적 서열 변형은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 항-CD40 항체에서 예측되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94:412-417 (1997)]을 참조한다.

대안적으로, 또 다른 실시양태에서, 돌연변이는 항-CD40 항체 코딩 서열의 모두 또는 일부를 따라서 무작위로, 예컨대 포화 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있고, 그에 따라 변형된 항-CD40 항체는 개선된 결합 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.

핵산의 경우에, 용어 "실질적 상동성"은 2개의 핵산 또는 그의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교된 경우에, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실에 의해 적어도 약 80%의 뉴클레오티드, 통상적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 및 보다 바람직하게 적어도 약 98% 내지 99.5%의 뉴클레오티드에서 동일한 것을 나타낸다. 대안적으로, 실질적인 상동성은 절편이 선택적 혼성화 조건 하에 상보적 가닥과 혼성화되는 경우에 존재한다.

폴리펩티드의 경우에, 용어 "실질적 상동성"은 2개의 폴리펩티드 또는 그의 지정된 서열이, 최적으로 정렬되고 비교된 경우에, 적절한 아미노산 삽입 또는 결실에 의해 적어도 약 80%의 아미노산, 통상적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%의 아미노산에서 동일한 것을 나타낸다.

2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열이 최적으로 정렬된 경우에 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이며 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100), 최적 정렬은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 결정된다. 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.

2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된 문헌 [E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))]의 알고리즘을 사용하여 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성이 또한 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로섬 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 내로 혼입된 문헌 [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))] 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

추가로 본원에 기재된 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공중 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 워드길이 = 12로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행하여 본원에 기재된 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 워드길이 = 3으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본원에 기재된 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭드 BLAST를 문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 사용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.

핵산은 전세포 중에서, 세포 용해물 중에서, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 (예를 들어, 염색체의 다른 부분) 또는 단백질로부터, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 것을 포함한 표준 기술에 의해 정제되었을 때 "단리되거나" 또는 "실질적으로 순수해진다". 문헌 [F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조한다.

본원에 사용된 용어 "벡터"는 그것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단하게 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 이는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나, 등가의 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)가 또한 포함된다.

본원에 사용된 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 세포에 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 세포를 지칭하는 것으로 의도되고, 이는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손까지 지칭하는 것으로 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다.

"면역 반응"은 외래 작용제에 대한 척추동물 내에서의 생물학적 반응을 지칭하며, 반응은 이들 작용제 및 그에 의해 유발되는 질환에 대해 유기체를 보호한다. 면역 반응은 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에는 정상 인간 세포 또는 조직의 선택적 표적화, 그에 대한 결합, 그에 대한 손상, 그의 파괴, 및/또는 그의 척추동물 신체로부터의 제거를 발생시키는, 면역계 세포 (예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 또는 호중구) 및 이들 세포 중 임의의 것 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자 (항체, 시토카인 및 보체 포함)의 작용에 의해 매개된다. 면역 반응은 예를 들어 T 세포, 예를 들어 이펙터 T 세포 또는 Th 세포, 예컨대 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포의 활성화 또는 억제, 또는 T_reg 세포의 억제 또는 고갈을 포함한다. "T 이펙터" ("T_eff") 세포는 세포용해 활성을 갖는 T 세포 (예를 들어, CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포) 뿐만 아니라, 시토카인을 분비하여 다른 면역 세포를 활성화시키고 지시하는 T 헬퍼 (Th) 세포를 지칭하지만, 조절 T 세포 (T_reg 세포)는 포함하지 않는다.

본원에 사용된 용어 "T 세포-매개 반응"은 이펙터 T 세포 (예를 들어, CD8⁺ 세포) 및 헬퍼 T 세포 (예를 들어, CD4⁺ 세포)를 포함한 T 세포에 의해 매개되는 반응을 지칭한다. T 세포 매개 반응은, 예를 들어, T 세포 세포독성 및 증식을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "세포독성 T 림프구 (CTL) 반응"은 세포독성 T 세포에 의해 유도되는 면역 반응을 지칭한다. CTL 반응은 주로 CD8⁺ T 세포에 의해 매개된다.

"면역조정제" 또는 "면역조절제"는 면역 반응의 조정, 조절 또는 변형에 수반될 수 있는 작용제, 예를 들어 신호전달 경로의 성분을 지칭한다. 면역 반응의 "조정", "조절" 또는 "변형"은 면역계 세포에서의 또는 이러한 세포 (예를 들어, 이펙터 T 세포)의 활성에서의 임의의 변경을 지칭한다. 이러한 조정은 다양한 세포 유형의 개수에서의 증가 또는 감소, 이들 세포의 활성에서의 증가 또는 감소, 또는 면역계 내에서 발생할 수 있는 임의의 다른 변화에 의해 나타날 수 있는 면역계의 자극 또는 억제를 포함한다. 억제 및 자극 면역조정제 둘 다가 확인된 바 있고, 이들 중 일부는 종양 미세환경에서 증진된 기능을 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 면역조정제는 T 세포의 표면 상에 위치한다. "면역조정 표적" 또는 "면역조절 표적"은 물질, 작용제, 모이어티, 화합물 또는 분자에 의한 결합에 대해 표적화되고, 그의 활성이 결합에 의해 변경되는 면역조정제이다. 면역조정 표적은 예를 들어, 세포 표면 상의 수용체 ("면역조정 수용체") 및 수용체 리간드 ("면역조정 리간드")를 포함한다.

"면역요법"은 면역 반응을 유도, 증진, 억제, 또는 달리 변형하는 것을 포함하는 방법에 의해 질환을 앓거나, 질환에 걸릴 위험이 있거나, 또는 그의 재발을 겪고 있는 대상체를 치료하는 것을 지칭한다.

"면역자극 요법" 또는 "면역자극성 요법"은, 예를 들어 암을 치료하기 위해, 대상체에서 면역 반응의 증가 (유도 또는 증진)를 발생시키는 요법을 지칭한다.

"내인성 면역 반응을 강화시키는 것"은 대상체에서 기존의 면역 반응의 유효성 또는 효력을 증가시키는 것을 의미한다. 유효성 및 효능에서의 이러한 증가는 예를 들어, 내인성 숙주 면역 반응을 억제하는 메카니즘을 극복함으로써 또는 내인성 숙주 면역 반응을 증진시키는 메카니즘을 자극함으로써 달성될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "연결된"은 2개 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 연결은 공유 또는 비-공유일 수 있다. 연결은 또한 유전자적일 수 있다 (즉, 재조합적으로 융합됨). 이러한 연결은 관련 기술분야에서 인지되는 광범위한 기술, 예컨대 화학적 접합 및 재조합 단백질 생산을 사용하여 달성될 수 있다.

본원에 사용된 "투여"는 치료제를 포함하는 조성물을, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본원에 기재된 항체의 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의하는, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 대안적으로, 본원에 기재된 항체는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어, 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다. 또한, 투여는 예를 들어 1회, 복수회, 및/또는 1 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "억제하다" 또는 "차단하다"는 상호교환가능하게 사용되고, 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 부분 및 완전 억제/차단 둘 다를 포괄한다.

본원에 사용된 "암"은 신체 내 비정상 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 질환의 넓은 그룹을 지칭한다. 비조절된 세포 분열은 이웃 조직을 침습하는 악성 종양 또는 세포의 형성을 발생시킬 수 있고, 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 원위 부분으로 전이될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 질환과 연관된 증상, 합병증, 상태 또는 생화학적 징후의 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 역전, 완화, 호전, 억제 또는 지연 또는 예방할 목적으로 대상체에 대하여 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정, 또는 대상체에게 활성제를 투여하는 것을 지칭한다. 예방은 질환을 갖지 않는 대상체에게 질환이 발생하는 것을 방지하거나 또는 발생한 경우에 그의 효과를 최소화하기 위해 투여하는 것을 지칭한다.

용어 "유효 용량" 또는 "유효 투여량"은 목적하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로 정의된다. 약물 또는 치료제의 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 투여량"은 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 사용되는 경우에, 질환 증상의 중증도에서의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간에서의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지에 의해 입증되는 질환 퇴행을 촉진하는 약물의 임의의 양이다. 약물의 "예방 유효량" 또는 "예방 유효 투여량"은 질환이 발생할 위험 또는 질환이 재발할 위험이 있는 대상체에게 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 투여되는 경우에, 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 약물의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하거나 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 치료제 또는 예방제의 능력은 숙련된 진료의에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하게 하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 치료제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.

예로서, 항암제는 대상체에서 암 진행을 늦추거나 암 퇴행을 촉진하는 약물이다. 바람직한 실시양태에서, 약물의 치료 유효량은 암을 제거하는 지점까지 암 퇴행을 촉진한다. "암 퇴행을 촉진하는 것"은 유효량의 약물을 단독으로 또는 항신생물제와 조합하여 투여하여 환자에서 종양 성장 또는 크기의 감소, 종양의 괴사, 적어도 1종의 질환 증상의 중증도 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간 증가, 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지, 또는 달리 질환 증상의 호전을 발생시키는 것을 의미한다. 약리학적 유효성은 환자에게서 암 퇴행을 촉진하는 약물의 능력을 지칭한다. 생리학적 안전성은 약물의 투여로부터 발생하는 세포, 기관 및/또는 유기체 수준에서의 독성의 허용가능하게 낮은 수준, 또는 다른 유해 생리학적 효과 (유해 효과)를 지칭한다.

종양의 치료에 대한 예로서, 치료 유효량 또는 투여량의 약물은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 미치료 대상체에 비해 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80% 억제한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 치료 유효량 또는 투여량의 약물은 세포 성장 또는 종양 성장을 완전히 억제하고 즉, 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 100% 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력은 하기 기재된 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 종양 성장의 억제는 치료 후 즉각적이지 않을 수 있고, 소정의 시간 후 또는 반복 투여 후에만 발생할 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 세포 성장을 억제하는 화합물의 능력을 검사함으로써 평가될 수 있고, 이러한 억제는 숙련된 진료의에게 공지된 검정에 의해 시험관내에서 측정될 수 있다. 본원에 기재된 다른 바람직한 실시양태에서, 종양 퇴행은 적어도 약 20일, 보다 바람직하게는 적어도 약 40일, 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60일의 기간 동안 관찰되고 계속될 수 있다.

본원에 사용된 "조합" 요법은, 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 2종 이상의 치료제의 협응 방식으로의 투여를 포괄하는 것으로 의도되고, 공동 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 구체적으로, 조합 요법은 1종의 치료제의 투여가 또 다른 치료제의 투여에 대해 어떠한 방식으로든 조건화되는 것을 전제로 공-투여 (예를 들어 공동-제제의 투여 또는 별개의 치료 조성물의 동시 투여) 및 일련의 또는 순차적 투여 둘 다를 포괄한다. 예를 들어, 하나의 치료제는 상이한 치료제가 투여되고 규정된 기간 동안 작용이 가능하게 된 후에만 투여될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kohrt et al. (2011) Blood 117:2423]을 참조한다.

용어 "환자" 및 "대상체"는 예방적 또는 치유적 치료를 제공받는 임의의 인간을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 암을 갖는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다.

본원에 기재된 다양한 측면이 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.

I. 항-CD40 항체

본 출원은 질환 예컨대 암을 치료하는데 있어서 치료제로서 사용하기에 바람직한 특성을 갖는 효능작용 항-huCD40 항체를 개시한다. 이들 특성은 인간 CD40에 높은 친화도로 결합하는 능력, 인간 대상체에서 허용가능하게 낮은 면역원성, FcγRIIb에 우선적으로 결합하는 능력, 및 항체의 화학적 안정성을 감소시킬 수 있는 서열 문제의 부재 중 1종 이상을 포함한다.

서열에 의해 본원에 개시된 항-CD40 항체는, 실시예 5 및 6에 기재된 바와 같이 결정될 수 있는 바와 같이, 인간 CD40 상의 특정 에피토프에 결합한다. 동일하거나 밀접하게 관련된 에피토프에 결합하는 다른 항체는 아마도 이들 바람직한 특성을 공유할 것이고, 이는 경쟁 실험을 행하여 발견될 수 있다.

본원에 개시된 항-huCD40 항체와 경쟁하는 항-huCD40 항체

huCD40에의 결합에 대해 본 발명의 항체와 경쟁하는 항-huCD40 항체는 본원에 기재된 것 (실시예 1 및 2)과 유사한 면역화 프로토콜을 사용하여 생성될 수 있다. 서열에 의해 본원에 개시된 항-huCD40 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체는 또한 마우스 또는 다른 비-인간 동물을 인간 CD40 또는 그의 세포외 도메인 (서열식별번호: 1의 잔기 21-193)을 포함하는 구축물로 면역화하거나, 또는 본원에 개시된 항-huCD40 항체에 의해 결합되는 에피토프를 함유하는 인간 CD40의 단편으로 면역화하는 것에 의해 생성될 수 있다. 생성된 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 인간 CD40에 대한 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 및/또는 19G3의 결합을 차단하는 능력에 대해, 예를 들어 ELISA에서 CD40의 세포외 도메인 및 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 융합 단백질에 대한 결합을 차단하는 것, 또는 예를 들어 FACS에 의해 그의 표면 상에서 huCD40을 발현하는 세포에 결합하는 능력을 차단하는 것에 대해 스크리닝될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 시험 항체는 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 또는 19G3의 첨가 전, 그와 동시에, 또는 그 후에 CD40-Fc 융합 단백질과 (또는 그의 표면 상에서 huCD40을 발현하는 세포에 대해) 접촉된다. 예를 들어, "비닝" 실험을 수행하여 (실시예 4) 시험 항체가 서열에 의해 본원에 개시된 항체와 동일한 "빈"에 속하는지 여부를 결정할 수 있고, 여기서 서열에 의해 본원에 개시된 항체는 "참조" 항체이고 시험될 항체는 "시험" 항체이다. 서열에 의해 본원에 개시된 항체의 인간 CD40 (Fc 융합체로서 또는 세포 상)에 대한 결합을, 특히 거의 화학량론적 농도에서, 감소시키는 항체는 동일한, 중첩 또는 인접한 에피토프에 결합할 것이고, 따라서 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 또는 19G3의 바람직한 기능적 특성을 공유할 수 있다.

따라서, 예를 들어 ELISA 또는 FACS에 의한 측정 시, 예컨대 하기 단락에 기재된 검정을 사용함으로써, 세포 상의 huCD40에 대한 본원에 기재된 항-huCD40 항체의 결합을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 억제하고/거나, 세포 상의 huCD40에 대한 그의 결합이 본원에 기재된 항-huCD40 항체에 의해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 억제되는 항-huCD40 항체가 본원에 제공된다.

시험 항체가 참조 항체의 결합을 차단하는지 (즉, "그와 경쟁하는지") 여부를 결정하기 위한 예시적인 경쟁 실험은 하기와 같이 수행될 수 있다: CD40을 발현하는 세포를 96 웰 플레이트에 샘플 웰당 10⁵개의 세포로 시딩한다. 플레이트를 빙상에 둔 후, 비접합된 시험 항체를 0으로부터 50 μg/mL까지의 범위의 농도로 첨가한다 (50 μg/mL의 최고 농도로부터 시작하는 3-배 적정). 비관련 IgG가 제1 항체에 대한 이소형 대조군으로서 사용될 수 있고 이것을 동일한 농도로 첨가한다 (50μg/mL의 최고 농도로부터 시작하는 3-배 적정). 50μg/mL 비표지된 참조 항체와 사전-인큐베이션된 샘플이 완전 차단 (100% 억제)에 대한 양성 대조군으로서 포함될 수 있고, 1차 인큐베이션에서 항체가 존재하지 않는 샘플이 음성 대조군 (경쟁 없음; 0% 억제)으로서 사용될 수 있다. 30분 인큐베이션 후에, 표지된, 예를 들어 비오티닐화된 참조 항체를 세척 없이 웰당 2μg/mL의 농도로 첨가한다. 샘플을 다시 빙상에서 30분 동안 인큐베이션한다. 세포를 FACS 완충제로 세척함으로써 비결합된 항체를 제거한다. 세포-결합된, 표지된 참조 항체를 표지를 검출하는 작용제, 예를 들어 비오틴을 검출하기 위한 PE 접합된 스트렙타비딘 (인비트로젠(Invitrogen), 카탈로그#S21388)을 사용하여 검출한다. 샘플을 FACS 칼리버 유동 세포측정기 (BD, 산호세) 상에서 획득하고 플루우조 소프트웨어 (트리 스타, 인크(Tree Star, Inc), 오레곤주 앳슈랜드)로 분석한다. 결과는 % 억제로서 나타내어질 수 있다.

전형적으로, 반대로, 즉 시험 항체를 참조 항체로 및 참조 항체를 시험 항체로 하여 동일한 실험을 이어서 수행한다. 특정 실시양태에서, 하나의 항체 또는 다른 항체가 참조 항체인 경우에 억제가 발생하는지 여부에 관계없이, 항체는 다른 항체가 표적, 예를 들어 인간 CD40 또는 그의 단편에 결합하는 것을 적어도 부분적으로 (예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%) 또는 완전히 (100%) 차단한다. 참조 항체 및 시험 항체는 항체가 서로 둘 다의 방식으로, 즉 참조 항체가 먼저 첨가되는 경쟁 실험에서 및 시험 항체가 먼저 첨가되는 경쟁 실험에서 경쟁하는 경우에 표적에 대한 서로의 결합을 "교차-차단"한다.

항-huCD40 항체는 예를 들어 실시예 4에 기재된 것과 유사한 경쟁 실험에서 거의 동등한 농도로 존재하는 경우에 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 및/또는 19G3이 인간 CD40에 결합하는 것을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 억제한다면 본원에 개시된 항-huCD40 항체와 경쟁하는 것으로 간주된다. 달리 나타내지 않는 한, 항체는 상기 2개의 단락에서 약술된 바와 같은 경쟁 ELISA 실험에서 측정된 바와 같이, 선택된 항체와 거의 동등한 몰 농도에서 사용된 경우에 선택된 항체가 인간 CD40 (서열식별번호: 1)에 결합하는 것을 적어도 20%만큼 감소시킨다면 본 발명의 항-CD40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 경쟁하는 것으로 간주될 것이다.

동일한 에피토프에 결합하는 항-huCD40 항체

본원에 개시된 항체에 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하는 항-huCD40 항체는 본원에 기재된 것 (실시예 1 및 2)과 유사한 면역화 프로토콜을 사용하여 생성될 수 있다. 생성된 항체는 인간 CD40에 대한 높은 친화도 결합에 대해 스크리닝될 수 있다 (실시예 3). 선택된 항체는 이어서 huCD40의 서열 변이체가 효모 세포의 표면 상에 제시되는 효모 디스플레이 검정에서 연구되거나 (실시예 6) 또는 수소-중수소 교환 실험에 의해 연구되어 (실시예 5), 항체에 의해 결합되는 정확한 에피토프가 결정될 수 있다.

에피토프 결정은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있다. 다양한 실시양태에서, 항-huCD40 항체는 그들이 huCD40의 적어도 하나의 영역 내의 동일한 잔기 중 1개 이상과 접촉하는 경우; 그들이 huCD40의 적어도 하나의 영역 내의 대부분의 잔기와 접촉하는 경우; 그들이 huCD40의 각각의 영역 내의 대부분의 잔기와 접촉하는 경우; 그들이 huCD40의 전체 길이를 따른 대부분의 접촉과 접촉하는 경우; 그들이 인간 CD40의 모든 동일한 별개 영역 내에서 접촉하는 경우; 그들이 인간 CD40 상의 어느 하나의 영역에서 모든 잔기와 접촉하는 경우; 또는 그들이 모든 동일한 영역에서 모든 동일한 잔기와 접촉하는 경우에, 본원에 개시된 항-huCD40 mAb와 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 에피토프 "영역"은 1차 서열에 따른 잔기의 클러스터이다.

본원에 기재된 항체와 "huCD40 상의 동일한 에피토프"에 결합하는 항체를 결정하는 기술은, 에피토프의 원자 해상도를 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 X선 분석을 포함한다. 다른 방법은 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 것으로, 항원 서열 내의 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 상실은 종종 에피토프 성분의 지표로 간주된다. 방법은 또한 조합 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 또는 표적 단백질의 프로테아제 소화로부터 특이적인 짧은 펩티드 (천연 3차원 형태 또는 변성된 형태)를 친화도 단리하는 관심 항체의 능력에 의존할 수 있다. 이어서, 펩티드는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된 항체에 상응하는 에피토프를 정의하기 위한 리드로서 간주된다. 에피토프 맵핑을 위해 컴퓨터 알고리즘이 또한 개발되어 있고, 이는 입체형태적 불연속 에피토프를 맵핑하는 것으로 제시된 바 있다.

에피토프 또는 에피토프를 포함하는 영역은 또한 CD40에 걸쳐있는 일련의 중첩 펩티드에 대한 결합을 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 대안적으로, 문헌 [Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899]의 방법을 사용하여 본원에 기재된 항-CD40 항체와 동일한 에피토프를 갖고 따라서 유사한 특성을 갖는 항체의 선택을 가이드할 수 있다. 파지 디스플레이를 사용하여, 먼저 항-CD40 항체의 중쇄를 (바람직하게는 인간) 경쇄의 레퍼토리와 쌍형성되게하여 CD40-결합 항체를 선택하고, 이어서 새로운 경쇄를 (바람직하게는 인간) 중쇄의 레퍼토리와 쌍형성되게하여 본원에 기재된 항-huCD40 항체와 동일한 에피토프 또는 에피토프 영역을 갖는 (바람직하게는 인간) CD40-결합 항체를 선택한다. 대안적으로, 본원에 기재된 항체의 변이체는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA의 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.

또한 CD40에서 아미노산 잔기의, 문헌 [Cunningham & Wells (1989) Science 244: 1081]에 기재된 바와 같은 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 또는 일부 다른 형태의 점 돌연변이유발 (예컨대 실시예 6에 제공되는 효모 디스플레이 방법)을 사용하여 항-CD40 항체에 대한 기능적 에피토프를 결정할 수 있다.

또한 특이적 항체에 의해 결합되는 에피토프 또는 에피토프 영역 ("에피토프 영역"은 에피토프를 포함하거나 또는 에피토프와 중첩되는 영역임)은 CD40의 단편을 포함하는 펩티드에 대한 항체의 결합을 평가함으로써 결정될 수 있다. CD40 (예를 들어, 인간 CD40)의 서열을 포괄하는 일련의 중첩 펩티드가 합성될 수 있고, 예를 들어 직접 ELISA, 경쟁적 ELISA (여기서, 펩티드는 마이크로타이터 플레이트의 웰에 결합된 CD40에 대한 항체의 결합을 방지하는 그의 능력에 대해 평가됨)에서, 또는 칩 상에서 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 펩티드 스크리닝 방법은 일부 비연속 기능적 에피토프, 즉 CD40 폴리펩티드 쇄의 1차 서열을 따라서 연속적이지 않은 아미노산 잔기를 수반하는 기능적 에피토프는 검출하지 못할 수 있다.

에피토프는 또한 MS-기반 단백질 풋프린팅, 예컨대 수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS) 및 단백질의 급속 광화학적 산화 (FPOP)에 의해 확인될 수 있다. HDX-MS는 예를 들어 문헌 [Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95]에 추가로 기재된 바와 같이 수행될 수 있고, 이 방법은 구체적으로 본원에 참조로 포함된다. 또한, 실시예 5를 참조한다. FPOP는 예를 들어 문헌 [Hambley & Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있고, 이 방법은 구체적으로 본원에 참조로 포함된다.

항-CD40 항체가 결합하는 에피토프는 또한, 유리 상태인 경우 및 관심 항체와 복합체로 결합된 경우에 CD40 내의 불안정성 아미드 수소의 H-D 교환율의 NMR 결정을 포함한 구조적 방법, 예컨대 X선 결정 구조 결정 (예를 들어, WO 2005/044853), 분자 모델링 및 핵 자기 공명 (NMR) 분광분석법에 의해 결정될 수 있다 (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31:11335; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884).

X선 결정학과 관련하여, 결정화는 마이크로배치 (예를 들어 Chayen (1997) Structure 5:1269), 행잉-드롭 증기 확산 (예를 들어 McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300), 시딩 및 투석을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 방법 (예를 들어 Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1) 중 임의의 것을 사용하여 달성될 수 있다. 적어도 약 1 mg/mL, 및 바람직하게는 약 10 mg/mL 내지 약 20 mg/mL의 농도를 갖는 단백질 제제를 사용하는 것이 바람직하다. 결정화는 약 10% 내지 약 30% (w/v) 범위의 농도로, 폴리에틸렌 글리콜 1000-20,000 (PEG; 약 1000 내지 약 20,000 Da 범위의 평균 분자량), 바람직하게는 약 5000 내지 약 7000 Da, 보다 바람직하게는 약 6000 Da을 함유하는 침전제 용액에서 가장 잘 달성될 수 있다. 또한, 약 0.5% 내지 약 20% 범위의 농도로 단백질 안정화제, 예를 들어 글리세롤을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 염, 예컨대 염화나트륨, 염화리튬 또는 시트르산나트륨이 또한, 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 1000 mM 범위의 농도로 침전제 용액에서 바람직할 수 있다. 침전제는 바람직하게는 약 3.0 내지 약 5.0, 바람직하게는 약 4.0의 pH로 완충된다. 침전제 용액에 유용한 특정 완충제는 달라질 수 있고 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York). 유용한 완충제의 예는 HEPES, 트리스, MES 및 아세테이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 결정은 2℃, 4℃, 8℃ 및 26℃를 포함한 광범위한 온도에서 성장할 수 있다.

항체:항원 결정은 널리 공지된 X선 회절 기술을 사용하여 연구될 수 있고, 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 X-PLOR (예일대학교, 1992, 몰리큘러 시뮬레이션즈, 인크.(Molecular Simulations, Inc.) 배포; 예를 들어, 문헌 [Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press]; 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0014194 참조), 및 BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323)을 사용하여 정밀화될 수 있으며, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

달리 나타내지 않는 한, 및 청구범위를 참조하여, 항체에 의해 결합되는 에피토프는 실시예 5에 실질적으로 기재된 바와 같은, HDX-MS 방법에 의해 결정된 바와 같은 에피토프이다.

높은 친화도로 결합하는 항-CD40 항체

일부 실시양태에서, 본 발명의 항-huCD40 항체는 본원에 개시된 항-huCD40 항체와 같이 높은 친화도로 huCD40에 결합하고, 이는 그것이 유효 치료제일 가능성을 증가시킨다. 다양한 실시양태에서 본 발명의 항-huCD40 항체는 huCD40에 10nM, 5nM, 2nM, 1nM, 300pM, 또는 100pM 미만의 K_D로 결합한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-huCD40 항체는 huCD40에 2nM 내지 100pM의 K_D로 결합한다. huCD40에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정은 ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, 생물층 간섭측정 (BLI) (실시예 3 참조) 및 비아코어® SPR 분석 (실시예 4 참조)을 포함한다.

항-CD40 항체 서열 변이체

본원에 개시된 항체 서열에서 일부 가변성은 허용될 수 있고, 여전히 항체의 바람직한 특성을 유지할 수 있다. CDR 영역은 카바트 시스템을 사용하여 서술된다 (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 따라서, 본 발명은 본원에 개시된 항체 (즉 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 및 19G3 및 그의 인간화 유도체)의 CDR 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 CDR 서열을 포함하는 항-huCD40 항체를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 개시된 항체 (즉 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 및 19G3 및 그의 인간화 유도체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-huCD40 항체를 제공한다.

CDR 서열을 공유하거나 또는 동일한 뮤린 배선으로부터 유래된 항-CD40 항체

항원-결합 특이성이 주로 CDR에 의해 결정된다는 것을 고려하면, 본원에 개시된 항체 (즉 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 및 19G3)와 CDR 서열을 공유하는 항체는 그의 바람직한 특성을 공유할 가능성이 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-huCD40 항체는 항체 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 또는 19G3과 동일한 뮤린 V 영역 및 J 영역 배선 서열로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 항체 12D6은 뮤린 배선 VH1-39_01 및 IGHJ4로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 배선 VK1-110_01 및 IGKJ1을 갖는다. 항체 5F11은 뮤린 배선 VH1-4_02 및 IGHJ3으로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 배선 VK3-5_01 및 IGKJ5를 갖는다. 항체 8E8은 뮤린 배선 VH1-80_01 및 IGHJ2로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 배선 VK1-110_01 및 IGKJ2를 갖는다. 항체 5G7은 뮤린 배선 VH1-18_01 및 IGHJ4로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 배선 VK10-96_01 및 IGKJ2를 갖는다. 항체 19G3은 뮤린 배선 VH5-9-4_01 및 IGHJ3으로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 배선 VK1-117_01 및 IGKJ2를 갖는다. 중쇄 D 영역 배선 서열 (CDRH3의 부분을 구성함)은, 종종 주어진 그의 높은 가변성을 부여하기 곤란하여 명시되지 않고, 따라서 본 발명의 항체는 열거된 V 및 J 영역 배선 및 임의의 D 영역 배선으로부터 유래된 중쇄를 포함할 수 있다. 인간 CD40에 결합하고 이들 배선 서열 중 일부 또는 모두로부터 유래된 다른 항체, 특히 동일한 V-영역 유전자로부터 유래된 것은 서열 면에서 밀접하게 관련될 가능성이 있고, 따라서 동일한 바람직한 특성을 공유할 것으로 예상될 것이다.

본원에 사용된 뮤린 항체는, 항체의 가변 영역이 뮤린 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득되고 항체 서열이 배선과 충분히 관련되어 임의의 다른 것으로부터의 것보다 주어진 배선으로부터 유래될 가능성이 더 높은 경우에 특정한 배선 서열"로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 시스템은 마우스를 관심 항원으로 면역화하는 것을 포함한다. 항체의 서열이 "유래된" 뮤린 배선 이뮤노글로불린 서열(들)은 항체의 아미노산 서열을 뮤린 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 항체의 서열과 서열 면에서 가장 근접한 (즉, 최대 % 동일성) 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정한 배선 이뮤노글로불린 서열"로부터 유래된" 뮤린 항체는, 예를 들어 자연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적 도입으로 인해, 배선 서열과 비교 시 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 뮤린 항체는 전형적으로, 배선 이뮤노글로불린 유전자 (예를 들어 V 영역)에 의해 코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열 면에서 적어도 90% 동일하다. 특정 경우에, 뮤린 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자 (예를 들어 V 영역)에 의해 코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열 면에서 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정한 뮤린 배선 서열로부터 유래된 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자 (예를 들어 V 영역)에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 디스플레이할 것이다. 특정 경우에, 뮤린 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자 (예를 들어 V 영역)에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 포함할 수 있다.

II. 조작 및 변형된 항체

VH 및 VL 영역

또한, 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 본원에 개시된 V_H 및/또는 V_L 서열 중 1개 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있는 조작 및 변형된 항체가 제공되며, 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, V_H 및/또는 V_L) 내, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역 내 및/또는 1개 이상의 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다.

수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 유형은 CDR 그라프팅이다. 이러한 그라프팅은 특히 본원에 개시된 항-huCD40 항체와 결합에 대해 경쟁하고/거나 본원에 개시된 항-huCD40 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 비-인간 항-CD40 항체를 인간화하는데 유용하다. 항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 우세하게 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프팅된, 특정 참조 항체로부터 유래된 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써, 특정 참조 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. (USA) 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).

이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공중 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스, 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline V_H Sequences Reveals about Fifty Groups of V_H Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line V_H Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836]에서 찾아볼 수 있고; 이들 각각의 내용은 명확하게 본원에 참조로 포함된다.

본원에 기재된 항체에 사용하기에 바람직한 프레임워크 서열은 본원에 기재된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. V_H CDR1, 2 및 3 서열, 및 V_L CDR1, 2 및 3 서열은 프레임워크 서열이 유래되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 배선 서열과 비교 시 최대 20개의, 바람직하게는 보존적, 아미노산 치환을 함유하는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).

본원에 기재된 조작된 항체는, 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 V_H 및/또는 V_L 내의 프레임워크 잔기에 대한 변형이 이루어진 것을 포함한다. 종종 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 항체가 유래된 배선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배위로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "복귀돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이"된 항체가 또한 포괄되는 것으로 의도된다.

또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로도 지칭되고, 미국 특허 공개 번호 20030153043 (Carr et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 유형의 가변 영역 변형은 관심 항체의 1종 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선시키기 위해 CDR 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들) 및 항체 결합에 대한 효과, 또는 다른 기능적 관심 특성을 도입할 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 부가, 결실, 또는 바람직하게는 치환일 수 있다. 또한, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.

항체의 CDR에서 메티오닌 잔기는 산화되어, 항체의 효력에서 잠재적인 화학적 분해 및 결과적인 환원을 발생시킬 수 있다. 따라서, 중쇄 및/또는 경쇄 CDR에서 산화성 분해를 겪지 않는 아미노산 잔기로 대체되는 1개 이상의 메티오닌 잔기를 갖는 항-CD40 항체가 또한 제공된다. 유사하게, 탈아미드화 부위가 항-CD40 항체로부터, 특히 CDR에서 제거될 수 있다. 항원 결합 도메인 내의 잠재적 글리코실화 부위는 항원 결합을 방해할 수 있는 글리코실화를 방지하기 위해 바람직하게 제거된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,714,350을 참조한다.

표적화된 항원 결합

다양한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항원 결합이 유해할 조직 및 환경에서는 항원 결합을 선택적으로 차단하기 위해 변형되지만, 이것이 유익할 경우에는 항원 결합을 허용하기 위해 변형된다. 한 실시양태에서, 항체의 항원 결합 표면에 특이적으로 결합하고 항원 결합을 방해하는 차단 펩티드 "마스크"가 생성되고, 이러한 마스크는 펩티다제 절단가능한 링커에 의해 항체의 각각의 결합 아암에 연결된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,518,404 (시톰엑스(CytomX))를 참조한다. 이러한 구축물은 프로테아제 수준이 비-종양 조직과 비교 시 종양 미세환경에서 매우 증가된 암을 치료하는데 유용하다. 종양 미세환경에서 절단가능한 링커의 선택적 절단은 마스킹/차단 펩티드의 해리를 허용하여, 항원 결합이 원치않는 부작용을 유발할 수 있는 말초 조직에서보다 항원 결합이 종양에서 선택적으로 일어나게 한다.

대안적으로, 관련 실시양태에서, (2가) 항체의 둘 다의 항원 결합 표면에 결합하고 항원 결합을 방해하는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 2가 결합 화합물 ("마스킹 리간드")이 개발되며, 여기서 2개의 결합 도메인 마스크는, 예를 들어 펩티다제에 의해 절단가능한, 절단가능한 링커에 의해 서로 (그러나 항체는 아님) 연결된다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2010/077643 (테고팜 코포레이션(Tegopharm Corp))을 참조한다. 마스킹 리간드는 항체가 결합하고자 하는 항원을 포함할 수 있거나 또는 그로부터 유래될 수 있거나, 또는 독립적으로 생성될 수 있다. 이러한 마스킹 리간드는 프로테아제 수준이 비-종양 조직과 비교 시 종양 미세환경에서 매우 증가된 암을 치료하는데 유용하다. 종양 미세환경에서 절단가능한 링커의 선택적 절단은 2개의 결합 도메인이 서로 해리되도록 하여, 항체의 항원-결합 표면에 대한 결합력을 감소시킨다. 항체로부터 마스킹 리간드의 해리 발생은 항원 결합이 원치않는 부작용을 유발할 수 있는 말초 조직에서보다 항원 결합이 종양에서 선택적으로 일어나게 한다.

Fc 및 변형된 Fc

본 발명의 항체는 의도되는 용도에 대해 항체의 생물학적 활성 (존재하는 경우)에 기초하여 선택된, 상이한 Fc 영역을 포함하는 불변 도메인과 조합된 본 발명의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 문헌 [Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25:1369]. 인간 IgG는, 예를 들어 4종의 하위부류, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 분류될 수 있고, 이들 각각은 Fcγ 수용체 (활성화 수용체 FcγRI (CD64), FcγRIIA, FcγRIIC (CD32a,c); FcγRIIIA 및 FcγRIIIB (CD16a,b) 및 억제 수용체 FcγRIIB (CD32b)) 중 1종 이상에 대한 결합, 및 보체의 제1 성분 (C1q)에 대해 고유한 프로파일을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 인간 IgG1 및 IgG3은 모든 Fcγ 수용체에 결합하고; IgG2는 FcγRIIA_H131에 결합하고, FcγRIIA_R131 FcγRIIIA_V158에 보다 낮은 친화도로 결합하고; IgG4는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, 및 FcγRIIIA_V158에 결합하고; 억제 수용체 FcγRIIB는 모든 다른 Fcγ 수용체보다 IgG1, IgG2 및 IgG3에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다. 문헌 [Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716]. 연구는 FcγRI가 IgG2에 결합하지 않고, FcγRIIIB가 IgG2 또는 IgG4에 결합하지 않는다는 것을 제시한다. Id. 일반적으로, ADCC 활성과 관련하여, 인간 IgG1 ≥ IgG3 ≫ IgG4 ≥ IgG2이다. 그 결과, 예를 들어, IgG2 또는 IgG4보다 IgG1 불변 도메인이 ADCC를 목적으로 하는 약물에서의 사용을 위해 선택될 수 있고; IgG3은 FcγRIIIA-발현 NK 세포, 대식세포의 단핵구의 활성화의 경우에 선택될 수 있고; IgG4는 알레르기 환자를 탈감작시키는데 항체를 사용하고자 하는 경우에 선택될 수 있다. IgG4는 또한 모든 이펙터 기능이 결여된 항체를 목적으로 하는 경우에 선택될 수 있다.

본원에 기재된 항-huCD40 가변 영역은 Fc, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc에 연결 (예를 들어, 공유 연결 또는 융합)될 수 있고, 이는 임의의 동종이형 또는 이소동종이형, 예를 들어, IgG1의 경우에: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); IgG2의 경우에: G2m, G2m23(n); IgG3의 경우에: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v)일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1]을 참조한다. 동종이형의 선택은, 예를 들어 항-약물 항체의 형성을 최소화하기 위해 잠재적 면역원성 우려에 의해 영향을 받을 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD40 항체는 FcγRIIb에 결합하거나 또는 그에 대해 증진된 결합을 갖는 Fc를 갖고, 이는 증진된 효능작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, WO 2012/087928; 문헌 [Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754]을 참조한다. 본원에 기재된 가변 영역은, 예를 들어 아폽토시스-유도 또는 아주반트 활성을 증진시키기 위해, 억제 수용체 FcyRIIb에 대한 친화도를 증진시키는 Fc 변이체에 연결될 수 있다. 문헌 [Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 109:10966]; 미국 특허 출원 공개 2014/0010812. 이러한 변이체는 예를 들어 B 세포 및 단핵구를 포함한 FcγRIIb⁺ 세포와 관련된 면역조정 활성을 항체에게 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, Fc 변이체는 1종 이상의 활성화 수용체에 비해 FcγRIIb에 대해 선택적으로 증진된 친화도를 제공한다. 이러한 변이체는 또한 증진된 FcR-매개 가교를 나타낼 수 있고, 이는 증진된 치료 효능을 발생시킬 수 있다. FcγRIIb에 대한 결합을 변경시키기 위한 변형은 EU 인덱스에 따라 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, 및 332로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 1종 이상의 변형을 포함한다. FcγRIIb 친화도를 증진시키기 위한 예시적인 치환은 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, 및 332E를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 치환은 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, 및 328Y를 포함한다. FcγRIIb에 대한 결합을 증진시키기 위한 다른 Fc 변이체는 235Y-267E, 236D-267E, 239D-268D, 239D-267E, 267E-268D, 267E-268E, 및 267E-328F를 포함한다. 구체적으로, 인간 IgG1의 S267E-L328F 이중 변이체를 포함한 S267E, G236D, S239D, L328F 및 I332E 변이체는 억제 FcγRIIb 수용체에 대한 친화도를 특이적으로 증진시키는데 있어서 특히 가치있다. 문헌 [Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926]; 미국 특허 출원 공개 2006/024298; WO 2012/087928. (FcγRIIa_R131과 구별되는 바와 같은) FcγRIIb에 대한 증진된 특이성은 P238D 치환 및 다른 돌연변이 (Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26:589; WO 2012/1152410), 뿐만 아니라 V262E 및 V264E (Yu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135:9723, 및 WO 2014/184545)를 부가함으로써 수득될 수 있다. 표 4 (상기)를 참조한다.

반감기 연장

특정 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 이는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화도를 증가시킴으로 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경된다. FcRn에 대한 결합을 증가시키고/거나 약동학적 특성을 개선시키는 다른 예시적인 Fc 변이체는, 예를 들어 259I, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y, 및 434M을 포함한 위치 259, 308, 및 434에서의 치환을 포함한다. FcRn에 대한 Fc 결합을 증가시키는 다른 변이체는 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 305A, 307A, 31 1A, 312A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al., Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252Y, 252W, 254T, 256Q, 256E, 256D, 433R, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H (Dall'Acqua et al., Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)를 포함한다. 미국 특허 번호 8,367,805를 참조한다.

IgG Fc에서 특정 보존된 잔기 (I253, H310, Q311, H433, N434)의 변형, 예컨대 N434A 변이체 (Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663)는 FcRn 친화도를 증가시키는 방식으로서 제안된 바 있고, 이에 따라 순환 중 항체의 반감기가 증가된다. WO 98/023289. M428L 및 N434S를 포함하는 조합 Fc 변이체는 FcRn 결합을 증가시키고 혈청 반감기를 최대 5-배 증가시키는 것으로 제시된 바 있다. 문헌 [Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157]. T307A, E380A 및 N434A 변형을 포함하는 조합 Fc 변이체는 또한 IgG1 항체의 반감기를 연장시킨다. 문헌 [Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759]. 또한, M252Y-M428L, M428L-N434H, M428L-N434F, M428L-N434Y, M428L-N434A, M428L-N434M, 및 M428L-N434S 변이체를 포함하는 조합 Fc 변이체가 반감기를 연장시키는 것으로 또한 제시된 바 있다. WO 2009/086320.

추가로, M252Y, S254T 및 T256E를 포함하는 조합 Fc 변이체는 반감기를 거의 4-배 증가시킨다. 문헌 [Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514]. 증가된 FcRn 친화도 및 감소된 pH 의존성을 제공하는 관련 IgG1 변형 (M252Y-S254T- T256E- H433K- N434F)이 FcRn에 대한 다른 항체의 결합을 방지하기 위한 경쟁자로서 사용하기 위해 IgG1 구축물 ("MST-HN Abdeg")을 생성하는데 사용된 바 있고, 이는 다른 항체, 내인성 IgG (예를 들어 자가면역 설정에서) 또는 또 다른 외인성 (치료) mAb의 증가된 클리어런스를 발생시킨다. 문헌 [Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283; WO 2006/130834].

FcRn 결합을 증가시키기 위한 다른 변형이 문헌 [Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671; 6,277,375; 6,821,505; WO 97/34631; WO 2002/060919]에 기재되어 있다.

특정 실시양태에서, FcRn 결합을 증가시키고, 잠재적으로 반감기를 증가시키기 위해 하이브리드 IgG 이소형이 사용될 수 있다. 예를 들어, CH2 및/또는 CH3 영역 내 IgG1 위치를 2종의 이소형이 상이한 위치에서 IgG3으로부터의 아미노산으로 치환함으로써 IgG1/IgG3 하이브리드 변이체를 구축할 수 있다. 따라서 1종 이상의 치환, 예를 들어, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R, 및 436F를 포함하는 하이브리드 변이체 IgG 항체가 구축될 수 있다. 본원에 기재된 다른 실시양태에서, CH2 및/또는 CH3 영역 내 IgG2 위치를 2종의 이소형이 상이한 위치에서 IgG1으로부터의 아미노산으로 치환함으로써 IgG1/IgG2 하이브리드 변이체를 구축할 수 있다. 따라서 1종 이상의 치환, 예를 들어, 하기 아미노산 치환 중 1종 이상: 233E, 234L, 235L, -236G (위치 236에서의 글리신의 삽입을 지칭함), 및 327A를 포함하는 하이브리드 변이체 IgG 항체가 구축될 수 있다. 미국 특허 번호 8,629,113을 참조한다. 보고된 바로는 혈청 반감기를 증가시키고 발현을 개선시킨 IgG1/IgG2/IgG4 서열의 하이브리드가 생성된 바 있다. 미국 특허 번호 7,867,491 (그 안의 서열 번호 18).

본 발명의 항체의 혈청 반감기는 또한 PEG화에 의해 증가될 수 있다. 항체는, 예를 들어 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화될 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해, 항체 또는 그의 단편을 전형적으로 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되도록 하는 조건 하에 PEG 시약, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비-글리코실화된 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 기재된 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0154316 (Nishimura et al.) 및 EP 0401384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.

대안적으로, 일부 상황 하에 본 발명의 항체의 반감기를 증가시키기 보다는 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 인간 IgG1의 Fc에서의 I253A (Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41:355) 및 H435A/R, I253A 또는 H310A (Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819)와 같은 변형은 FcRn 결합을 감소시켜, 신속한 클리어런스가 바람직한 상황, 예컨대 의학 영상화에서의 사용을 위해 반감기를 감소 (클리어런스를 증가)시킬 수 있다. 또한 문헌 [Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622]을 참조한다. 클리어런스를 증진시키기 위한 다른 수단은 본 발명의 항원 결합 도메인을 FcRn에 결합하는 능력이 결여된 항체 단편, 예컨대 Fab 단편으로서 포맷하는 것을 포함한다. 이러한 변형은 항체의 순환 반감기를 2주 정도로부터 수시간까지 감소시킬 수 있다. 항체 단편의 선택적 PEG화는 이어서, 필요한 경우에 항체 단편의 반감기를 미세-조정 (증가)하기 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780]. 항체 단편은 또한, 예를 들어 융합 단백질 구축물에서 인간 혈청 알부민에 융합되어 반감기를 증가시킬 수 있다. 문헌 [Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904]. 대안적으로, 본 발명의 제1 항원 결합 도메인 및 인간 혈청 알부민 (HSA)에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 갖는 이중특이적 항체가 구축될 수 있다. 국제 특허 출원 공개 WO 2009/127691 및 그 안에서 인용된 특허 참고문헌을 참조한다. 대안적으로, 특화된 폴리펩티드 서열, 예를 들어 "XTEN" 폴리펩티드 서열이 항체 단편에 부가되어 반감기를 증가시킬 수 있다. 문헌 [Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186]; 국제 특허 출원 공개 WO 2010/091122.

추가의 Fc 변이체

IgG4 불변 도메인을 사용하는 경우에, 치환 S228P를 포함하는 것이 통상적으로 바람직하고, 이는 IgG1의 힌지 서열을 모방하여 예를 들어 치료될 환자에서 치료 항체와 내인성 IgG4 사이의 Fab-아암 교환을 감소시킴으로써 IgG4 분자를 안정화시킨다. 문헌 [Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925].

IgG1 구축물의 힌지 내의 잠재적인 프로테아제 절단 부위는 D221G 및 K222S 변형에 의해 제거될 수 있고, 이는 항체의 안정성을 증가시킨다. WO 2014/043344.

Fc 변이체의 그의 리간드 (Fc 수용체)에 대한 친화도 및 결합 특성은 평형 방법 (예를 들어, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 방사선면역검정 (RIA)) 또는 동역학적 (예를 들어, 비아코어® SPR 분석), 및 다른 방법 예컨대 간접 결합 검정, 경쟁적 억제 검정, 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피 (예를 들어, 겔 여과)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 다양한 시험관내 검정 방법 (생화학적 또는 면역학적 기반 검정)에 의해 결정될 수 있다. 이들 및 다른 방법은 검사되는 성분 중 1종 이상에 대한 표지를 사용하고/거나, 발색, 형광, 발광, 또는 동위원소 표지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 검출 방법을 사용할 수 있다. 결합 친화도 및 동역학의 상세한 설명은 문헌 [Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)]에서 찾아볼 수 있으며, 이는 항체-면역원 상호작용에 초점을 맞춘다.

또 다른 실시양태에서, 이펙터 기능을 증가 또는 감소시키기 위해 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 위치 297에서 보존된 아스파라긴 잔기를 돌연변이시키고 (예를 들어 N297A), 이에 따라 보체 및 FcγRI 결합을 무효화함으로써 모든 이펙터 기능이 결여된 비-글리코실화 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403. 또한 문헌 [Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595 (위치 297에서 글리코실화를 제거하기 위해 IgG1에서 N297Q를 사용함)]을 참조한다.

비-글리코실화 항체는 일반적으로 이펙터 기능이 결여되어 있지만, 그러한 기능을 회복시키기 위해 돌연변이를 도입할 수 있다. 비-글리코실화 항체, 예를 들어 N297A/C/D/ 또는 H 돌연변이로부터 생성되거나 또는 단백질을 글리코실화하지 않는 시스템 (예를 들어 이. 콜라이(E. coli))에서 생산된 것은 FcγR 결합을 회복시키기 위해 추가로, 예를 들어 S298G 및/또는 T299A/G/ 또는 H (WO 2009/079242), 또는 E382V 및 M428I (Jung et al. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 107:604)로 돌연변이될 수 있다.

당조작은 또한 Fc 영역의 Asn297에 부착된 탄수화물 쇄의 α2,6 시알릴 함량을 변화시킴으로써 IgG 구축물의 항염증 특성을 변형하는데 사용될 수 있고, 여기서 α2,6 시알릴화 형태의 증가된 비율은 증진된 항염증 효과를 발생시킨다. 문헌 [Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513]을 참조한다. 반대로, α2,6 시알릴화 탄수화물을 갖는 항체의 비율의 감소는 항염증 특성을 원치않는 경우에 유용할 수 있다. 예를 들어 α2,6 시알릴화 형태의 선택적 정제에 의해 또는 효소적 변형에 의해 항체의 α2,6 시알릴화 함량을 변형하는 방법이 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0206246에서 제공된다. 다른 실시양태에서, α2,6 시알릴화의 영향을 모방하기 위해, 예를 들어 F241A 변형을 포함시키는 것에 의해 Fc 영역의 아미노산 서열이 변형될 수 있다. WO 2013/095966.

III. 항체 물리적 특성

본원에 기재된 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에 1개 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 이러한 글리코실화 부위는 변경되는 항원 결합으로 인해 항체의 증가된 면역원성 또는 항체의 pK 변경을 발생시킬 수 있다 (Marshall et al. (1972) Ann. Rev. Biochem. 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol. 172:5489-94; Wallick et al. (1988) J. Exp. Med. 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al. (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol. 37:697-706). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 모티프에서 일어나는 것으로 공지되어 있다. 일부 경우에, 가변 영역 글리코실화를 함유하지 않는 항-huCD40 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이것은 가변 영역 내에 글리코실화 모티프를 함유하지 않는 항체를 선택하거나, 또는 글리코실화 영역 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 아스파라긴 이성질현상 부위를 함유하지 않는다. 아스파라긴의 탈아미드화는 N-G 또는 D-G 서열 상에서 일어날 수 있고, 이는 폴리펩티드 쇄 내에 킹크를 도입하고 그의 안정성을 감소시키는 이소아스파르트산 잔기의 생성을 발생시킨다 (이소아스파르트산 효과).

각각의 항체는 고유한 등전점 (pI)을 가질 것이고, 이는 일반적으로 6 내지 9.5의 pH 범위에 속한다. IgG1 항체에 대한 pI는 전형적으로 7-9.5의 pH 범위에 속하고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6-8의 pH 범위에 속한다. 정상 범위를 벗어난 pI를 갖는 항체는 생체내 조건 하에 약간의 언폴딩 및 불안정성을 가질 수 있다는 의견이 존재한다. 따라서, 정상 범위에 속하는 pI 값을 함유하는 항-CD40 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이것은 정상 범위 내의 pI를 갖는 항체를 선택하거나 또는 하전된 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.

각각의 항체는 특징적인 용융 온도를 가질 것이고, 용융 온도가 높을수록 생체내에서 보다 큰 전체적인 안정성을 나타낸다 (Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3:361-71). 일반적으로, T_M1 (초기 언폴딩 온도)은 60℃ 초과, 바람직하게는 65℃ 초과, 보다 더 바람직하게는 70℃ 초과인 것이 바람직하다. 항체의 융점은 시차 주사 열량측정 (Chen et al. (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al. (1999) Immunol. Lett. 68:47-52) 또는 원형 이색성 (Murray et al. (2002) J. Chromatogr. Sci. 40:343-9)을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 신속하게 분해되지 않는 항체가 선택된다. 항체의 분해는 모세관 전기영동 (CE) 및 MALDI-MS (Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem. 67:3626-32)를 사용하여 측정될 수 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 원치않는 면역 반응 및/또는 변경된 또는 바람직하지 않은 약동학적 특성의 촉발로 이어질 수 있는 응집 효과를 최소로 갖는 항체가 선택된다. 일반적으로, 응집이 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 보다 더 바람직하게는 15% 이하, 보다 더 바람직하게는 10% 이하, 및 보다 더 바람직하게는 5% 이하인 항체가 허용된다. 응집은 크기-배제 칼럼 (SEC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 광 산란을 포함한 여러 기술에 의해 측정될 수 있다.

IV. 핵산 분자

본원에 기재된 또 다른 측면은 본원에 기재된 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 (예를 들어, 다른 염색체 DNA, 예를 들어 자연에서 단리된 DNA에 연결된 염색체 DNA) 또는 단백질로부터, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 제한 효소, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 것을 포함하는 표준 기술에 의해 정제되었을 때 "단리되거나" 또는 "실질적으로 순수하게 된다". 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조한다. 본원에 기재된 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.

본원에 기재된 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 하기에 추가로 기재된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우에, 하이브리도마에 의해 제조되는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득될 수 있다. 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득되는 항체의 경우에 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술 사용), 항체를 코딩하는 핵산은 라이브러리로부터 회수될 수 있다.

VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편이 수득되면, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작할 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 이러한 문맥에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 인-프레임으로 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결되는 것을 의미하는 것으로 의도된다.

VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (힌지, CH1, CH2 및/또는 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication number 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역, 예를 들어 IgG1 영역일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우에, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.

VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.

scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly₄ -Ser)₃을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결하여, VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결되어 VH 및 VL 서열이 연속 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 한다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:5879-5883; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554] 참조).

V. 항체 생성

본 발명의 다양한 항체, 예를 들어 본원에 개시된 항-인간 CD40 항체와 경쟁하거나 또는 그와 동일한 에피토프에 결합하는 것은 다양한 공지된 기술, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)]에 기재된 표준 체세포 혼성화 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 바람직하지만, 원칙적으로는, 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환, 인간 항체 유전자의 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 기술이 또한 사용될 수 있다.

하이브리도마를 제조하는데 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.

본원에 기재된 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득되고 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조)).

한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 인간 CD40에 대해 지시된 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하며, 이는 본원에서 집합적으로 "인간 Ig 마우스"로 지칭된다.

HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 대한 반응으로, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 부류 전환 및 체세포 돌연변이를 거쳐 높은 친화도의 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 ([Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌]; 문헌 [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 검토됨). HuMab 마우스의 제조 및 용도, 및 이러한 마우스가 보유하는 게놈 변형은 문헌 [Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; 및 Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기재되어 있고, 이들 모두의 내용은 구체적으로 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 추가로 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429 (모두 Lonberg 및 Kay); 미국 특허 번호 5,545,807 (Surani et al.); PCT 공개 번호 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 Lonberg 및 Kay); 및 PCT 공개 번호 WO 01/14424 (Korman et al.)를 참조한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모솜 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 사용하여 생성된다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되며, PCT 공개 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세하게 기재되어 있다.

추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안의 트랜스제닉 동물 시스템이 관련 기술분야에서 입수가능하고 본원에 기재된 항-huCD40 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 (아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))로 지칭되는 대안적 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있으며; 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.

또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 관련 기술분야에서 입수가능하고 본원에 기재된 항-CD40 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜 둘 다를 보유하는 마우스가 사용될 수 있으며; 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 추가로, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 소가 관련 기술분야에 기재되어 있고 (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894), 본원에 기재된 항-huCD40 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.

인간 항체, 예를 들어 인간 항-huCD40 항체를 생성하기 위한, 관련 기술분야에 기재된 추가의 마우스 시스템은 (i) 내인성 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역이, 상동 재조합을 통해 내인성 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 대체되어, 키메라 항체 (인간 V/마우스 C)가 마우스에서 생성되고, 이어서 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 완전 인간 항체로 후속 전환되는, 벨로크이뮨(VelocImmune)® 마우스 (레게네론 파마슈티칼스, 인크.(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)); 및 (ii) 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 영역 및 단일 재배열된 인간 공통 경쇄 가변 영역을 함유하는 마우스인 메모(MeMo)® 마우스 (메루스 바이오파마슈티칼스, 인크.(Merus Biopharmaceuticals, Inc.))를 포함한다. 이러한 마우스, 및 항체를 생성하기 위한 그의 용도가, 예를 들어, WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 및 US 2012/0073004에 기재되어 있다.

본원에 기재된 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있다. 예를 들어 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner et al.); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (Dower et al.); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths et al.)을 참조한다.

본원에 기재된 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화 시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.

면역화

인간 CD40에 대한 완전 인간 항체를 생성하기 위해, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 함유하는 마우스 또는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스 (예를 들어, HCo12, HCo7 또는 KM 마우스)는, 다른 항원에 대해 예를 들어 문헌 [Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851] 및 WO 98/24884에 기재된 바와 같이, CD40 항원 및/또는 CD40을 발현하는 세포의 정제된 또는 풍부화된 제제로 면역화될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 인간 CD40을 코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 제1 주입 시 6-16주령일 것이다. 예를 들어, 재조합 인간 CD40 항원의 정제된 또는 풍부화된 제제 (5-50 μg)가 마우스를 복강내로 면역화시키는데 사용될 수 있다. CD40 항원의 정제된 또는 풍부화된 제제를 사용한 면역화가 항체를 발생시키지 않는 사건에서, 마우스는 또한 면역 반응을 촉진하기 위해 CD40을 발현하는 세포, 예를 들어 세포주로 면역화될 수 있다.

다양한 항원을 사용한 축적된 경험은 HuMAb 트랜스제닉 마우스가 Ribi 아주반트 중의 항원에 의해 복강내로 (IP) 또는 피하로 (SC) 초기 면역화된 다음, 격주로 Ribi 아주반트 중의 항원에 의해 IP/SC 면역화 (최대 총 10회)되는 경우에 최상으로 반응한다는 것을 제시한 바 있다. 면역 반응은 안와후 채혈에 의해 수득되는 혈장 샘플을 사용하여 면역화 프로토콜 과정에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 혈장은 ELISA 및 FACS (하기 기재된 바와 같음)에 의해 스크리닝될 수 있고, 충분한 역가의 항-CD40 인간 이뮤노글로불린을 갖는 마우스가 융합을 위해 사용될 수 있다. 마우스는 희생 및 비장 및 림프절 제거 3일 전에 항원으로 정맥내로 부스팅될 수 있다. 각각의 면역화를 위해 2-3회 융합이 수행될 필요가 있을 수 있는 것으로 예상된다. 각각의 항원에 대해 전형적으로 6 내지 24마리의 마우스를 면역화한다. 통상적으로, HCo7, HCo12, 및 KM 계통이 사용된다. 또한, HCo7 및 HCo12 둘 다의 트랜스진이 2종의 상이한 인간 중쇄 트랜스진을 갖는 단일 마우스로 함께 교배될 수 있다 (HCo7/HCo12).

CD40에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성

본원에 기재된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성되는 하이브리도마는 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단세포 현탁액을 50% PEG를 갖는 Sp2/0 비분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1581)에 융합시킬 수 있다. 세포를 대략 2 x 10⁵개로 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅하고, 이어서 10% 태아 클론 혈청, 18% "653" 조건화 배지, 5% 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 단위/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (시그마)를 함유하는 선택 배지에서 2주 인큐베이션한다. 대략 2주 후에, HAT를 HT로 대체한 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 개별 웰을 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상적으로 10-14일 후에 배지를 관찰할 수 있다. 항체 분비 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 모노클로날 항체를 한계 희석함으로써 적어도 2회 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관내 배양하여 조직 배양 배지 중에서 특징화를 위한 소량의 항체를 생성할 수 있다.

모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제를 위한 2-리터 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과하고 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이)로 친화성 크로마토그래피할 수 있다. 순도를 보장하기 위해 용리된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 체크할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환하고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고, -80℃에서 저장할 수 있다.

VI. 항체 제조

CD40에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성

서열이 제공된 특이적 항체 및 다른, 관련 항-CD40 항체 둘 다를 포함한 본 발명의 항체는, 예를 들어 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다 (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이러한 문맥에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 제공하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션된 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나 또는 둘 다의 유전자는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터(들) 내로 삽입된다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 이들을 목적하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입하여 V_H 절편이 벡터 내 C_H 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 V_L 절편이 벡터 내 C_L 절편에 작동가능하게 연결되도록 함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 인-프레임으로 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 쇄 유전자에 더하여, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유할 수 있다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))]에 기재되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 조절 서열의 선택을 포함한 발현 벡터의 설계가 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위해 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 추가로, 조절 요소는 상이한 공급원으로부터의 서열, 예컨대 SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복부로부터의 서열을 함유하는 SRα 프로모터 시스템으로 구성된다 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 Axel et al.) 참조). 예를 들어, 전형적으로 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에서의 사용을 위함) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위함)를 포함한다.

경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로의 외인성 DNA의 도입을 위해 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것은 이론상 가능하지만, 진핵 세포, 및 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서의 항체의 발현이 가장 바람직하며, 이는 이러한 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비할 가능성이 원핵 세포보다 높기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 발현은 높은 수율의 활성 항체의 생산에 비효과적인 것으로 보고된 바 있다 (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13). 본 발명의 항체는 또한 효모 피키아 파스토리스의 당조작된 균주에서 생산될 수 있다. 문헌 [Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210].

본원에 기재된 재조합 항체의 발현을 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같이 DHFR 선택 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위한, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포 내로 도입한 경우에, 항체는, 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하는데 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지 내로 항체의 분비를 허용하는데 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

본 발명의 항체 폴리펩티드 쇄의 N- 및 C-말단은 통상적으로 관찰되는 번역후 변형으로 인해 예상되는 서열과 상이할 수 있다. 예를 들어, C-말단 리신 잔기는 종종 항체 중쇄에서 누락된다. 문헌 [Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132]. N-말단 글루타민 잔기, 및 더 적은 정도로 글루타메이트 잔기는, 치료 항체의 경쇄 및 중쇄 둘 다에서 피로글루타메이트 잔기로 빈번하게 전환된다. 문헌 [Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et al. (2011) JBC 28611211; Liu et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:11211].

본 발명의 다양한 효능제 항-huCD40 항체를 위한 아미노산 서열이 표 8에 요약된 서열 목록에서 제공된다. 상기 언급된 이유로 인해, C-말단 리신은 중쇄 또는 중쇄 불변 도메인에 대한 서열 목록 중 임의의 서열에서 포함되지 않는다. 그러나, 대안적 실시양태에서, 본 발명의 항-huCD40 항체 및/또는 이러한 항체 또는 그의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 유전적 구축물에 대한 각각의 중쇄는 중쇄(들)의 C-말단에 이러한 추가의 리신 잔기를 포함한다.

VII. 검정

본원에 기재된 항체는 CD40에 대한 결합에 대해, 예를 들어 표준 ELISA에 의해 시험될 수 있다. 간략하게, 마이크로타이터 플레이트를 정제된 CD40으로 PBS 중 1-2 μg/ml로 코팅한 다음, PBS 중 5% 소 혈청 알부민으로 차단한다. 항체의 희석액 (예를 들어, CD40-면역화된 마우스로부터의 혈장의 희석액)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/트윈으로 세척한 다음, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 2차 시약 (예를 들어, 인간 항체 또는 달리 인간 중쇄 불변 영역을 갖는 항체의 경우에, 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약)과 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척한 후, 플레이트를 ABTS 기질 (모스 인크(Moss Inc), 제품: ABTS-1000)로 발색시키고 OD 415-495에서 분광광도계에 의해 분석한다. 이어서, 면역화된 마우스로부터의 혈청을 유동 세포측정법에 의해 CD40을 발현하지 않는 대조 세포주가 아닌, 인간 CD40을 발현하는 세포주에 대한 결합에 대해 추가로 스크리닝한다. 간략하게, 항-CD40 항체의 결합은 CD40 발현 CHO 세포를 항-CD40 항체와 1:20 희석으로 인큐베이션함으로써 평가된다. 세포를 세척하고 결합을 PE-표지된 항-인간 IgG Ab로 검출한다. 유동 세포측정 분석은 FACS캔 유동 세포측정법 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 캘리포니아주 산호세)을 사용하여 수행된다. 바람직하게는, 최고 역가를 발생시킨 마우스가 융합을 위해 사용될 것이다. 마우스 항-huCD40 항체를 검출하고자 하는 경우에 항-마우스 검출 항체를 사용하여 유사한 실험을 수행할 수 있다.

상기 기재된 ELISA를 사용하여 CD40 면역원과의 양성 반응성을 제시하는 항체, 및 그에 따라 항체를 생산하는 하이브리도마가 스크리닝될 수 있다. 이어서 바람직하게는 높은 친화도로 CD40에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 서브클로닝하고 추가로 특징화할 수 있다. 이어서 (ELISA에 의해) 모 세포의 반응성을 보유하는 각각의 하이브리도마로부터의 1종의 클론이 세포 은행의 제조를 위해, 및 항체 정제를 위해 선택될 수 있다.

항-CD40 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제를 위한 2-리터 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과하고 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (파마시아, 뉴저지주 피스카타웨이)로 친화성 크로마토그래피할 수 있다. 순도를 보장하기 위해 용리된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 체크할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환하고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD₂₈₀에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고, -80℃에서 저장할 수 있다.

선택된 항-CD40 모노클로날 항체가 고유한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 각각의 항체를 상업적으로 입수가능한 시약 (피어스(Pierce), 일리노이주 록포드)을 사용하여 비오티닐화할 수 있다. 비오티닐화된 MAb 결합은 스트렙타비딘 표지된 프로브로 검출할 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체 및 비오티닐화된 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁 연구를 상기 기재된 바와 같이 CD40 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다.

정제된 항체의 이소형을 결정하기 위해, 특정한 이소형의 항체에 특이적인 시약을 사용하여 이소형 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체의 이소형을 결정하기 위해, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 1 μg/ml의 항-인간 이뮤노글로불린으로 4℃에서 밤새 코팅할 수 있다. 1% BSA로 차단한 후, 플레이트를 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 1 μg /mL 이하의 시험 모노클로날 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 발색시키고 분석한다.

모노클로날 항체가 CD40을 발현하는 살아있는 세포에 결합하는 것을 시험하기 위해, 유동 세포측정법을 사용할 수 있다. 간략하게, 막-결합 CD40을 발현하는 세포주 (표준 성장 조건 하에 성장됨)를 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중의 다양한 농도의 모노클로날 항체와 4℃에서 1시간 동안 혼합한다. 세척한 후, 세포를 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에 피코에리트린 (PE)-표지된 항- IgG 항체와 반응시킨다. 단세포에 대해 게이팅하기 위해 광 및 측방 산란 특성을 사용하여 FACS캔 기기에 의해 샘플을 분석할 수 있고, 표지된 항체의 결합이 결정된다. 형광 현미경검사를 사용한 대안적 검정이 유동 세포측정 검정(에 더하여 또는 그 대신에) 사용될 수 있다. 세포는 상기 기재된 바와 같이 정확하게 염색되고 형광 현미경검사에 의해 검사될 수 있다. 이러한 방법은 개별 세포의 가시화를 허용하지만, 항원의 밀도에 따라 감소된 감수성을 가질 수 있다.

항-huCD40 항체는 웨스턴 블롯팅에 의해 CD40 항원과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간략하게, CD40을 발현하는 세포로부터의 세포 추출물을 제조하여 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용할 수 있다. 전기영동 후에, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 20% 마우스 혈청으로 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙할 것이다. IgG 결합은 항-IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 정제 (시그마 켐. 캄파니(Sigma Chem. Co.), 미주리주 세인트 루이스)로 발색시킬 수 있다.

다양한 항-CD40 항체의 결합 친화도, 교차-반응성, 및 결합 동역학을 분석하는 방법은 관련 기술분야에 공지된 표준 검정, 예를 들어 생물층 간섭측정 (BLI) 분석, 및 비아코어® 2000 SPR 기기 (비아코어 아베, 스웨덴 웁살라)를 사용하는 비아코어® 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체는 인간 CD40의 세포외 영역에 특이적으로 결합한다. 항체는 CD40의 세포외 도메인 내의 특정한 도메인 (예를 들어, 기능적 도메인)에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 CD40의 세포외 영역 및 시노몰구스 CD40의 세포외 영역에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 항체는 인간 CD40에 높은 친화도로 결합한다.

VIII. 이중특이적 분자

본원에 기재된 항체는 이중특이적 분자를 형성하는데 사용될 수 있다. 항- CD40 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도체화되거나 또는 이에 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본원에 기재된 항체는 실제로, 1종 초과의 다른 기능적 분자로 유도체화되거나 또는 이에 연결되어, 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고; 이러한 다중특이적 분자도 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 포괄되는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본원에 기재된 항체는 1종 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결되어 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 또는 그 이외의 것에 의함) 이중특이적 분자를 발생시킬 수 있다.

따라서, CD40에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자가 본원에 제공된다. 이중특이적 분자가 다중특이적인 본원에 기재된 실시양태에서, 분자는 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 분자는 결합 특이성으로서 적어도 1종의 항체, 또는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 또는 단일 쇄 Fv를 포함한 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner et al.)에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있고, 그의 내용은 명확하게 참조로 포함된다.

인간 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본원에 기재된 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.

본원에 기재된 이중특이적 분자는 구성성분 결합 특이체를 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이체를 개별적으로 생성한 다음 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교제가 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), 및 Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 바람직한 접합제는 SATA 및 술포-SMCC이며, 둘 다는 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.) (일리노이주 록포드)로부터 입수가능하다.

결합 특이체가 항체인 경우에, 이들을 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 술프히드릴 결합을 통해 접합시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수, 바람직하게는 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.

대안적으로, 둘 다의 결합 특이체가 동일한 벡터 내에 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본원에 기재된 이중특이적 분자는 1개의 단일 쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.

이중특이적 분자가 그의 특이적 표적에 결합하는 것은 관련 기술분야-인식 방법, 예컨대 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (RIA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 검정을 사용하여 확인될 수 있다. 각각의 이들 검정은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용하여 특정한 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.

IX. 조성물

제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 항-CD40 항체, 또는 그의 항원-결합 단편(들)을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물이 추가로 제공된다. 이러한 조성물은 (예를 들어, 2종 이상의 상이한) 항체 중 1종 또는 그의 조합, 또는 본원에 기재된 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 제약 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 또는 상보적 활성을 갖는 항체 (또는 면역접합체 또는 이중특이체)의 조합을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 조성물은 항-CD40 항체를 적어도 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 또는 1-300 mg/ml, 또는 100-300 mg/ml의 농도로 포함한다.

본원에 기재된 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 본원에 기재된 항-CD40 항체를 적어도 1종의 다른 항암제 및/또는 T-세포 자극제 (예를 들어, 활성화제)와 조합하여 포함할 수 있다. 조합 요법으로 사용될 수 있는 치료제의 예는 본원에 기재된 항체의 용도에 관한 하기 섹션에서 보다 상세히 기재된다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 조성물은 암 치료에 사용되는 다른 화합물, 약물, 및/또는 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 화합물, 약물 및/또는 작용제는, 예를 들어 화학요법 약물, 소분자 약물, 또는 주어진 암에 대한 면역 반응을 자극하는 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 치료 조성물은 예를 들어 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 (CD134, TNFRSF4, ACT35 및/또는 TXGP1L로도 공지됨) 항체, 항-LAG-3 항체, 항-CD73 항체, 항-CD137 항체, 항-CD27 항체, 항-CSF-1R 항체, TLR 효능제, 또는 IDO 또는 TGFβ의 소분자 길항제 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다. 투여 경로에 의존하여, 활성 화합물, 즉 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.

본원에 기재된 제약 화합물은 1종 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 바람직하지 않은 어떠한 독성학적 효과도 제공하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 아인산 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.

본원에 기재된 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.

본원에 기재된 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올리에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

이들 조성물은 또한, 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재를 방지하는 것은 상기의 멸균 절차, 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시키는 것 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써, 주사가능한 제약 형태의 지속 흡수를 달성할 수 있다.

제약상 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 용도가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본원에 기재된 제약 조성물에서의 그의 용도가 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.

치료 조성물은 전형적으로, 제작 및 저장 조건 하에 멸균이고 안정적이어야 한다. 이러한 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴을 사용하고, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 다수의 경우에 등장화제, 예를 들어 당, 다가알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내로 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써, 주사가능한 조성물의 지속 흡수를 달성할 수 있다.

적절한 용매 중의 필요한 양의 활성 화합물을, 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 1종 또는 그의 조합과 함께 혼입시킨 다음, 멸균 마이크로여과함으로써, 멸균 주사가능한 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을, 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 분산액을 제조한다. 멸균 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 플러스 이전의 그의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.

단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료하고자 하는 대상체, 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로, 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 100 퍼센트 중에서, 제약상 허용되는 담체와 조합되는 활성 성분 약 0.01 퍼센트 내지 약 99 퍼센트의 범위, 바람직하게는 활성 성분 약 0.1 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 1 퍼센트 내지 약 30 퍼센트의 범위일 것이다.

투여 요법은 목적하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 여러 분할 용량을 시간의 경과에 따라 투여할 수 있거나 또는 용량은 치료 상황의 위급성에 의해 제시되는 바와 같이 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며; 각 단위는 목적하는 제약 담체와 연합하여 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 본원에 기재된 투여 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성하고자 하는 특정한 치료 효과, 및 (b) 개체에서의 감수성을 처리하기 위해 이러한 활성 화합물의 배합 기술분야에 내재된 제한사항에 의해 좌우되고 직접적으로 그에 의존한다.

항체를 투여하는 경우, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 및 보다 통상적으로 0.01 내지 5 mg/kg 범위이다. 예를 들어 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg의 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월 1회, 3개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여하는 것을 수반한다.

일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2종 이상의 모노클로날 항체를 동시에 투여하며, 이러한 경우에 투여되는 각 항체의 투여량은 상기 제시된 범위 내에 속한다. 치료 항체는 통상적으로 다중 투여된다. 단일 투여 사이의 간격은, 예를 들어 매주, 매월, 3개월마다 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 제시되는 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 약 1-1000 μg/ml의 혈장 항체 농도 및 일부 방법에서 약 25-300 μg/ml를 달성하도록 투여량이 조정된다.

항체는 지속 방출 제제로서 투여될 수 있고, 이러한 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 제시하고, 이어서 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서는, 비교적 적은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그의 나머지 여생 동안 계속 치료받는다. 치료적 적용에서는, 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 제시할 때까지 비교적 짧은 간격으로의 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 많은 면역-종양학 적응증에서 계속적인 치료가 필요하지 않을 수 있지만, 그 후, 환자에게 예방적 요법을 임의로 투여할 수 있다.

본원에 기재된 제약 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 아니면서, 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 유효한 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 사용된 본원에 기재된 특정한 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용된 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술분야에 널리 공지된 다른 인자를 포함한 다양한 약동학적 인자에 의존할 것이다.

본원에 기재된 항-CD40 항체의 "치료 유효 투여량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도에서의 감소, 질환 증상 부재 기간의 빈도 및 지속기간에서의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지를 발생시킨다. 암과 관련해서, 치료 유효 용량은 바람직하게는 암과 연관된 신체 증상이 추가로 악화되는 것을 방지한다. 암의 증상은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 비통상적 모반 특색, 비대칭, 경계, 색상 및/또는 직경을 포함한 모반의 외관에서의 변화, 새롭게 착색된 피부 영역, 비정상적 모반, 손발톱 아래의 거무스름한 영역, 유방 종괴, 유두 변화, 유방 낭, 유방 통증, 사망, 체중 감소, 쇠약, 지나친 피로, 섭식 곤란, 식욕 상실, 만성 기침, 호흡곤란 악화, 객혈, 혈뇨, 혈변, 오심, 구토, 간 전이, 폐 전이, 골 전이, 복부 포만감, 복부팽창, 복막액, 질 출혈, 변비, 복부 팽만, 결장 천공, 급성 복막염 (감염, 열, 통증), 통증, 토혈, 다한, 열, 고혈압, 빈혈, 설사, 황달, 어지럼증, 오한, 근육 연축, 결장 전이, 폐 전이, 방광 전이, 간 전이, 골 전이, 신장 전이, 및 췌장 전이, 삼킴 곤란 등을 포함한다. 치료 효능은 본 발명의 효능작용 항-huCD40 mAb의 제1 투여 직후에 관찰가능할 수 있거나, 또는 단지 소정의 시간 및/또는 일련의 용량 후에만 관찰될 수 있다. 이러한 지연된 효능은 단지 치료의 수개월 후, 최대 6, 9 또는 12개월 후에만 관찰될 수 있다. 일부 면역-종양학 작용제에 의해 나타나는 지연된 효능에 비추어 본 발명의 효능작용 항-huCD40 mAb가 치료상 효능이 결여된 것으로 성급하게 결정하지 않는 것이 중요하다.

치료 유효 용량은 암의 발병을 방지 또는 지연시킬 수 있고, 예컨대 질환의 초기 또는 예비 징후가 존재하는 경우에 바람직할 수 있다. 암을 진단하는데 사용되는 실험실 시험은 화학 (가용성 CD40 또는 CD40L 수준의 측정 포함) (Hock et al. (2006) Cancer 106:2148; Chung & Lim (2014) J. Trans. Med. 12:102), 혈액학, 혈청학 및 방사선학을 포함한다. 따라서, 상기 중 임의의 것을 모니터링하는 임의의 임상적 또는 생화학적 검정을 사용하여, 특정한 치료가 암을 치료하기 위한 치료 유효 용량인지 여부를 결정할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 대상체의 크기, 대상체의 증상의 중증도, 및 선택된 특정한 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다.

본원에 기재된 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 1종 이상을 사용하여 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본원에 기재된 항체에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 경장 및 국소 투여 이외의, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.

대안적으로, 본원에 기재된 항체는 비-비경구 경로를 통해, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질내로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.

활성 화합물은 화합물의 급속 방출을 방지할 담체와 함께, 예컨대 이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제를 제조하기 위한 많은 방법이 특허되었거나 또는 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.

치료 조성물은 관련 기술분야에 공지된 의료 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 치료 조성물은 무바늘 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 본원에 기재된 항-huCD40 항체와 함께 사용하기 위한 것으로 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는 의약을 제어된 속도로 분배하기 위한 이식가능한 마이크로-주입 펌프를 개시한 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 장치를 개시한 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시한 미국 특허 번호 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능 주입 장치를 개시한 미국 특허 번호 4,447,224; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 미국 특허 번호 4,475,196을 포함한다. 이들 특허는 본원에 참조로 포함된다. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-huCD40 항체는 생체 내에서 적당한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 본원에 기재된 치료 화합물이 (경우에 따라) BBB를 가로지르기 위해서는, 이들을, 예를 들어 리포솜에 제제화시킬 수 있다. 리포솜을 제작하는 방법에 관해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조할 수 있다. 리포솜은 특이적 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되는 1종 이상의 모이어티를 포함할 수 있으므로, 표적화된 약물 전달을 증강시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 엽산 또는 비오틴 [예를 들어, 미국 특허 5,416,016 (Low et al.) 참조]; 만노시드 (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체 (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함하며; 또한 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.

X. 용도 및 방법

본원에 기재된 항체, 항체 조성물 및 방법은, 예를 들어 CD40 신호전달을 효능작용하는 것에 의한 면역 반응의 증진을 수반하는, 수많은 시험관내 및 생체내 유용성을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 예를 들어, 본원에 기재된 항-huCD40 항체는 시험관내 또는 생체외에서 배양물 내의 세포에 투여되거나, 또는 예를 들어 생체내에서 인간 대상체에 투여되어, 다양한 질환에서 면역을 증진시킬 수 있다. 따라서, 대상체에서 면역 반응이 증진, 자극 또는 상향-조절되도록 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 변형시키는 방법이 본원에 제공된다.

바람직한 대상체는 면역 반응의 증진이 바람직할 인간 환자를 포함한다. 방법은 면역 반응 (예를 들어, T-세포 매개 면역 반응)을 증대시킴으로써 치료될 수 있는 장애를 갖는 인간 환자를 치료하는데 특히 적합하다. 특정한 실시양태에서, 방법은 생체내 암의 치료에 특히 적합하다. 면역의 항원-특이적 증진을 달성하기 위해, 본원에 기재된 항-huCD40 항체는 관심 항원과 함께 투여될 수 있거나 또는 항원이 치료할 대상체 (예를 들어, 종양-보유 또는 바이러스-보유 대상체)에 이미 존재할 수 있다. CD40에 대한 항체가 또 다른 작용제와 함께 투여되는 경우에, 2종은 개별적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.

또한, 항체 또는 그의 단편과 인간 CD40 사이에 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에, 샘플 및 대조군 샘플을 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플에서 인간 CD40 항원의 존재를 검출하거나, 또는 인간 CD40 항원의 양을 측정하는 방법이 포괄된다. 이어서, 복합체의 형성이 검출되며, 여기서 대조군 샘플과 비교 시 샘플 사이의 복합체 형성에서의 차이는 샘플 중 인간 CD40 항원의 존재를 나타낸다. 더욱이, 본원에 기재된 항-CD40 항체를 사용하여 면역친화성 정제를 통해 인간 CD40을 정제할 수 있다.

본원에 기재된 항-huCD40 항체가 T 세포 반응, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 반응의 공동-자극을 증진시키는 능력을 고려하여, 항원-특이적 T 세포 반응, 예를 들어 항종양 T 세포 반응을 자극, 증진 또는 상향조절하기 위해 본원에 기재된 항체를 시험관내 및 생체내 사용하는 방법이 본원에 제공된다. CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 반응은 항-CD40 항체를 사용하여 증진될 수 있다. T 세포는 T_eff 세포, 예를 들어, CD4+ T_eff 세포, CD8+ T_eff 세포, T 헬퍼 (T_h) 세포 및 T 세포독성 (T_c) 세포일 수 있다.

추가로, 본원에 기재된 항-huCD40 항체를 대상체에게 투여하여 대상체에서 면역 반응 (예를 들어, 항원-특이적 T 세포 반응)이 증진되도록 하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응 (예를 들어, 항원-특이적 T 세포 반응)을 증진시키는 방법이 포괄된다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 종양-보유 대상체이고, 종양에 대한 면역 반응이 증진된다. 종양은 고형 종양 또는 액상 종양, 예를 들어, 혈액학적 악성 종양일 수 있다. 특정 실시양태에서, 종양은 면역원성 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 비-면역원성이다. 특정 실시양태에서, 종양은 PD-L1 양성이다. 특정 실시양태에서, 종양은 PD-L1 음성이다. 대상체는 또한 바이러스-보유 대상체일 수 있고 바이러스에 대한 면역 반응이 증진된다.

대상체에서 종양의 성장이 억제되도록 본원에 기재된 항-huCD40 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법이 추가로 제공된다. 대상체에서 만성 바이러스 감염이 치료되도록 본원에 기재된 항-huCD40 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 만성 바이러스 감염을 치료하는 방법이 또한 제공된다.

특정 실시양태에서, 항-huCD40 항체는 보조 요법으로서 대상체에게 제공된다. 암을 갖는 대상체를 항-huCD40 항체로 치료하는 것은 현행 표준 관리에 비해 장기간 지속적인 반응; 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10년 또는 그 초과의 장기간 생존, 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 10년 또는 그 초과의 무재발 생존으로 이어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 암을 갖는 대상체를 항-huCD40 항체로 치료하는 것은 암의 재발을 방지하거나 또는 암의 재발을, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 또는 10년 또는 그 초과만큼 지연시킨다. 항-CD40 치료는 1차 또는 2차 치료로서 사용될 수 있다.

본원에 기재된 이들 및 다른 방법이 하기에 추가로 상세히 논의된다.

암

암을 갖는 대상체에게 본원에 기재된 항-huCD40 항체를 투여하여, 이러한 대상체를 치료하도록 하는, 예를 들어 암성 종양의 성장이 억제 또는 감소되고/거나 종양이 퇴행되도록 하는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 항-huCD40 항체를 단독으로 사용하여 암성 종양의 성장을 억제할 수 있다. 대안적으로, 항-huCD40 항체를 또 다른 작용제, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은, 다른 면역원성 작용제, 표준 암 치료, 또는 다른 항체와 함께 사용할 수 있다. PD-1의 억제제, 예컨대 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체와의 조합이 또한 제공된다. 예를 들어, 문헌 [Ellmark et al. (2015) OncoImmunology 4:7 e1011484]을 참조한다.

따라서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 항-huCD40 항체, 예를 들어, 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 또는 19G3의 인간화 형태, 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하는, 이러한 대상체에서 예를 들어 종양 세포의 성장을 억제함으로써 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 항체는 인간화 항-huCD40 항체 (예컨대 본원에 기재된 인간화 항-huCD40 항체 중 임의의 것), 인간 키메라 항-huCD40 항체, 또는 인간화 비-인간 항-huCD40 항체, 예를 들어 본원에 구체적으로 기재된 항-huCD40 항체 중 적어도 1종과 결합에 대해 경쟁하거나 또는 그와 동일한 에피토프에 결합하는 인간, 키메라 또는 인간화 항-huCD40 항체일 수 있다.

그의 성장이 본 발명의 항체를 사용하여 억제될 수 있는 암은 전형적으로 면역요법에 대해 반응성인 암을 포함한다. 치료하기 위한 암의 비-제한적 예는 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 편평 비소세포 폐암 (NSCLC), 비-NSCLC, 신경교종, 위장암, 신장암 (예를 들어 투명 세포 암종), 난소암, 간암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암 (예를 들어, 신세포 암종 (RCC)), 전립선암 (예를 들어 호르몬 불응성 전립선 선암종), 갑상선암, 신경모세포종, 췌장암, 교모세포종 (다형성 교모세포종), 자궁경부암, 위암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장 암종, 및 두경부암 (또는 암종), 위암, 생식 세포 종양, 소아 육종, 비부비동 자연 킬러, 흑색종 (예를 들어, 전이성 악성 흑색종, 예컨대 피부 또는 안내 악성 흑색종), 골암, 피부암, 자궁암, 항문 영역의 암, 고환암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연질 조직의 육종, 요도의 암, 남근의 암, 소아기 고형 종양, 수뇨관의 암, 신우의 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유표피암, 편평 세포암, T-세포 림프종, 환경적으로 유도된 암 (석면에 의해 유도된 암 포함), 바이러스 관련 암 (예를 들어, 인간 유두종 바이러스 (HPV)-관련 종양), 및 2종의 주요 혈액 세포 계통 중 어느 하나, 즉 골수 세포주 (과립구, 적혈구, 혈소판, 대식세포 및 비만 세포를 생산함) 또는 림프성 세포주 (B, T, NK 및 형질 세포를 생산함)로부터 유래된 혈액 악성종양, 예컨대 모든 유형의 백혈병, 림프종 및 골수종, 예를 들어, 급성, 만성, 림프구성 및/또는 골수성 백혈병, 예컨대 급성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 및 만성 골수성 백혈병 (CML), 미분화된 AML (M0), 골수모구성 백혈병 (M1), 골수모구성 백혈병 (M2; 세포 성숙화를 수반함), 전골수구성 백혈병 (M3 또는 M3 변이체 [M3V]), 골수단핵구성 백혈병 (M4 또는 호산구 증가증을 동반한 M4 변이체 [M4E]), 단핵구성 백혈병 (M5), 적백혈병 (M6), 거핵모구성 백혈병 (M7), 단리된 과립구성 육종, 및 녹색종; 림프종, 예컨대 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), B-세포 림프종, T-세포 림프종, 림프혈장세포양 림프종, 단핵구 모양 B-세포 림프종, 점막 관련 림프계 조직 (MALT) 림프종, 악성 (예를 들어, Ki 1+) 대형 세포 림프종, 성인 T-세포 림프종/백혈병, 외투 세포 림프종, 혈관 면역모구성 T-세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 장내 T-세포 림프종, 원발성 종격 B-세포 림프종, 전구체 T-림프모구성 림프종, T-림프모구성; 및 림프종/백혈병 (T-Lbly/T-ALL), 말초 T-세포 림프종, 림프모구성 림프종, 이식후 림프증식성 장애, 진성 조직구성 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 원발성 삼출 림프종, 림프모구성 림프종 (LBL), 림프 계통의 조혈 종양, 급성 림프모구성 백혈병, 확산성 대형 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 여포성 림프종, 확산성 조직구성 림프종 (DHL), 면역모세포성 대형 세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 피부 T-세포 림프종 (CTLC) (균상 식육종 또는 세자리 증후군으로도 지칭됨), 및 발덴스트롬 매크로글로불린혈증을 동반한 림프혈장세포양 림프종 (LPL); 골수종, 예컨대 IgG 골수종, 경쇄 골수종, 비-분비성 골수종, 억제할 수 없는 골수종 (무통성 골수종으로도 지칭됨), 고립성 형질세포종, 및 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발 세포 림프종; 골수 계열의 조혈 종양, 중간엽 기원의 종양 (섬유육종 및 횡문근육종 포함); 정상피종, 기형암종, 중추 및 말초 신경의 종양 (성상세포종, 신경초종 포함); 중간엽 기원의 종양 (섬유육종, 횡문근육종, 및 골육종 포함); 및 다른 종양, 예를 들어 흑색종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포성 암 및 기형암종, 림프 계열의 조혈 종양, 예를 들어 T-세포 및 B-세포 종양 [T-세포 장애, 예컨대 T-전림프구성 백혈병 (T-PLL) (소세포 및 대뇌모양의 세포 유형 포함)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다]; 바람직하게 T-세포 유형의 대형 과립상 림프구 백혈병 (LGL); a/d T-NHL 간비장 림프종; 말초/흉선 후 T 세포 림프종 (다형성 및 면역모세포성 하위유형); 혈관중심성 (비내) T-세포 림프종; 두경부암, 신장암, 직장암, 갑상선암; 급성 골수성 림프종 뿐만 아니라 상기 암의 임의의 조합을 포함한다. 본원에 기재된 방법은 또한, 전이성 암, 불응성 암 (예를 들어, 기존의 면역요법에 대해, 예를 들어 차단 CTLA-4 또는 PD-1 항체에 의해 불응성인 암), 및 재발 암의 치료를 위해 사용될 수 있다.

상기에 불구하고, 본 발명의 효능제 항-huCD40 항체는 CD40을 발현하는 혈액암을 치료하는데 있어서의 용도를 발견하지 못할 것이고, 이는 CD40 효능제에 의한 치료에 의해 악화될 수 있다. 특정 암은 CD40을 발현하는 것으로 공지되어 있고, 따라서 이러한 악화를 겪을 수 있으므로, 카테고리상 배제될 수 있다. 다른 실시양태에서 특정 종양 샘플은 CD40의 발현에 대해 시험되고, 시험 결과에 기초하여 본 발명의 효능제 항-huCD40 항체를 사용한 요법에서 배제된다.

항-huCD40 항체는 단독요법으로서 또는 유일한 면역자극 요법으로서 투여될 수 있거나, 또는 암 백신 전략에서 면역원성 작용제, 예컨대 암성 세포, 정제된 종양 항원 (재조합 단백질, 펩티드, 및 탄수화물 분자 포함), 세포, 및 면역 자극 시토카인을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포와 조합될 수 있다 (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). 사용될 수 있는 종양 백신의 비-제한적 예는 흑색종 항원의 펩티드, 예컨대 gp100, MAGE 항원, Trp-2, MART1 및/또는 티로시나제의 펩티드, 또는 시토카인 GM-CSF를 발현하도록 형질감염된 종양 세포를 포함한다. 종양에 대한 백신접종을 위한 많은 실험적 전략이 고안되었다 (문헌 [Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738] 참조; 또한 문헌 [Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition] 참조). 이들 전략 중 하나에서는, 자가 또는 동종이계 종양 세포를 사용하여 백신을 제조한다. 이들 세포성 백신이, 종양 세포가 GM-CSF를 발현하도록 형질도입되는 경우에 가장 유효한 것으로 밝혀졌다. GM-CSF는 종양 백신접종을 위한 항원 제시의 강력한 활성화제인 것으로 밝혀졌다. 문헌 [Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 3539-43].

다양한 종양에서의 유전자 발현 및 대규모 유전자 발현 패턴의 연구는 소위 종양 특이적 항원의 규정으로 이어지게 되었다. 문헌 [Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7]. 많은 경우에서, 이들 종양 특이적 항원은 종양에서, 및 종양이 발생한 세포에서 발현된 분화 항원, 예를 들어 멜라닌 세포 항원 gp100, MAGE 항원, 및 Trp-2이다. 보다 중요하게는, 이들 항원 중 많은 항원이 숙주에서 발견되는 종양 특이적 T 세포의 표적인 것으로 제시될 수 있다. CD40 효능제를 종양에서 발현된 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 집합과 함께 사용하여, 이들 단백질에 대한 면역 반응을 생성할 수 있다. 이들 단백질은 통상적으로 면역계에 의해 자기 항원으로 간주되고, 따라서 그에 대해 허용된다. 종양 항원은 염색체의 텔로미어의 합성에 필요하고 인간 암의 85% 초과에서 발현되며 제한된 수의 체세포 조직에서만 발현되는 단백질 텔로머라제를 포함할 수 있다 (Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013). 종양 항원은 또한, 단백질 서열을 변경시키거나 또는 2개의 비관련 서열 (즉, 필라델피아 염색체 내의 bcr-abl) 또는 B 세포 종양으로부터의 이디오타입 사이에 융합 단백질을 생성하는 체세포 돌연변이 때문에 암 세포에서 발현된 "신생-항원"일 수 있다.

다른 종양 백신은 인간 암과 관련된 바이러스, 예컨대 인간 유두종 바이러스 (HPV), 간염 바이러스 (HBV 및 HCV) 및 카포시 헤르페스 육종 바이러스 (KHSV)로부터의 단백질을 포함할 수 있다. CD40 억제와 함께 사용될 수 있는 또 다른 형태의 종양 특이적 항원은 종양 조직 자체로부터 단리된 정제된 열 쇼크 단백질 (HSP)이다. 이들 열 쇼크 단백질은 종양 세포로부터의 단백질의 단편을 함유하고, 이들 HSP는 종양 면역을 도출하기 위해 항원 제시 세포에 전달하는데 고도로 효율적이다 (Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120).

수지상 세포 (DC)는 항원-특이적 반응을 프라이밍하기 위해 사용될 수 있는 강력한 항원 제시 세포이다. DC는 생체외에서 생성될 수 있고, 다양한 단백질 및 펩티드 항원뿐만 아니라 종양 세포 추출물이 로딩될 수 있다 (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). DC는 또한, 이들 종양 항원을 또한 발현하는 유전적 수단에 의해 형질도입될 수 있다. DC는 또한, 면역화의 목적으로 종양 세포에 직접 융합된 바 있다 (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). 백신접종 방법으로서, DC 면역화는 CD40 효능작용과 효과적으로 조합되어 보다 강력한 항종양 반응을 활성화 (촉발)시킬 수 있다.

CD40의 효능작용은 또한, 표준 암 치료 (예를 들어, 수술, 방사선, 및 화학요법)와 조합될 수 있다. CD40의 효능작용은 화학요법적 요법과 효과적으로 조합될 수 있다. 이들 경우에는, 투여되는 화학요법 시약의 용량을 감소시키는 것이 가능할 수 있다 (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). 이러한 조합의 한 예는 흑색종을 치료하기 위해 항-huCD40 항체를 데카르바진과 조합하는 것이다. 이러한 조합의 또 다른 예는 흑색종을 치료하기 위해 항-huCD40 항체를 인터류킨-2 (IL-2)와 조합하는 것이다. CD40 효능제와 화학요법의 조합 사용 배후의 과학적 근거는 대부분의 화학요법 화합물의 세포독성 작용의 결과인 세포 사멸이 항원 제시 경로에서 종양 항원의 수준을 증가시켜야 한다는 것이다. 세포 사멸을 통해 CD40 효능작용과 상승작용을 발생시킬 수 있는 다른 조합 요법은 방사선, 수술 및 호르몬 고갈이다. 이들 프로토콜 각각은 숙주에서 종양 항원의 공급원을 생성한다. 혈관형성 억제제가 또한 CD40 효능제와 조합될 수 있다. 혈관형성의 억제는 종양 항원을 숙주 항원 제시 경로 내로 공급할 수 있는 종양 세포 사멸로 이어진다.

본원에 기재된 항-huCD40 항체는 또한, Fcα 또는 Fcγ 수용체-발현 이펙터 세포를 종양 세포로 표적화하는 이중특이적 항체와 조합되어 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,922,845 및 5,837,243 참조). 이중특이적 항체를 사용하여 2개의 개별 항원을 표적화할 수 있다. 예를 들어 항-Fc 수용체/항종양 항원 (예를 들어, Her-2/neu) 이중특이적 항체는 대식세포를 종양 부위로 표적화하는데 사용된다. 이러한 표적화는 종양 특이적 반응을 보다 효과적으로 활성화시킬 수 있다. 이들 반응의 T 세포 부문은 CD40의 효능작용에 의해 증대될 것이다. 대안적으로, 종양 항원 및 수지상 세포 특이적 세포 표면 마커에 결합하는 이중특이적 항체를 사용함으로써, 항원을 DC에 직접적으로 전달할 수 있다.

종양은 광범위한 메카니즘에 의해 숙주의 면역 감시를 피한다. 많은 이들 메카니즘은 종양에 의해 발현되는 면역억제 단백질의 불활성화에 의해 극복될 수 있다. 이들은 특히, TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), 및 Fas 리간드 (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)를 포함한다. 이들 엔티티 각각에 대한 항체를 항-huCD40 항체와 조합하여 사용하여, 면역억제제의 효과를 상쇄시키고 숙주에 의한 종양 면역 반응을 선호할 수 있다.

항-CD40 항체는 T 세포 헬퍼 활성을 효과적으로 대체할 수 있다. 문헌 [Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478]. T 세포 공동자극 분자, 예컨대 CTLA-4 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,811,097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol. 164: 2160-2169), CD137/4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997), 및 ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266)에 대한 활성화 항체가 또한, 증가된 수준의 T 세포 활성화를 제공할 수 있다. PD1 또는 PD-L1의 억제제를 또한, 항-huCD40 항체와 함께 사용할 수 있다.

또한, 항원 특이적 T 세포의 생체외 활성화 및 확장, 및 종양에 대한 항원-특이적 T 세포를 자극하기 위한 이들 세포의 수용자 내로의 입양 전달을 수반하는 여러 실험적 치료 프로토콜이 존재한다 (Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51). 또한, 이들 방법은 감염원 예컨대 CMV에 대한 T 세포 반응을 활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 항-CD40 항체의 존재 하에서의 생체외 활성화는 입양 전달된 T 세포의 빈도 및 활성을 증가시킬 수 있다.

만성 바이러스 감염

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 본 발명은 대상체의 감염성 질환이 치료되도록 항-huCD40 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 논의된 바와 같은 종양에 대한 그의 적용과 유사하게, 항체-매개 CD40 효능작용은 병원체, 독소 또는 자기-항원에 대한 면역 반응을 증진시키기 위해 단독으로 또는 아주반트로서 백신과 조합되어 사용될 수 있다. 이러한 치료 접근법이 특히 유용할 수 있는 병원체의 예는 현재 어떠한 효과적인 백신도 존재하지 않는 병원체, 또는 통상적인 백신이 덜 완벽하게 효과적인 병원체를 포함한다. 이들은, HIV, 간염 (A, B, & C), 인플루엔자(Influenza), 헤르페스(Herpes), 지아르디아(Giardia), 말라리아(Malaria), 리슈마니아(Leishmania), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. CD40 효능작용은 감염 과정에 걸쳐 변경된 항원을 제시하는 작용제, 예컨대 HIV에 의해 확립된 감염에 대해 특히 유용하다. 이들 신규 에피토프는 항-인간 CD40 항체 투여 시 외래물질로서 인식되어, 강력한 T 세포 반응이 유발된다.

본원에 기재된 방법에 의해 치료가능한 감염을 유발하는 병원성 바이러스의 일부 예는 HIV, 간염 (A, B 또는 C), 헤르페스 바이러스 (예를 들어, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr virus)), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파르보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종바이러스, 연속종 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스성 뇌염 바이러스를 포함한다.

본원에 기재된 방법에 의해 치료가능한 감염을 유발하는 병원성 박테리아의 일부 예는 클라미디아(chlamydia), 리케치아 박테리아(rickettsial bacteria), 미코박테리아(mycobacteria), 스타필로코쿠스(staphylococci), 스트렙토코쿠스(streptococci), 뉴모노코쿠스(pneumonococci), 메닝고코쿠스(meningococci) 및 고노코쿠스(gonococci), 클레브시엘라(klebsiella), 프로테우스(proteus), 세라티아(serratia), 슈도모나스(pseudomonas), 레지오넬라(legionella), 디프테리아(diphtheria), 살모넬라(salmonella), 바실루스(bacilli), 콜레라(cholera), 파상풍, 보툴리눔독소증, 탄저병, 흑사병, 렙토스피라증 및 라임병 박테리아를 포함한다.

본원에 기재된 방법에 의해 치료가능한 감염을 유발하는 병원성 진균의 일부 예는 칸디다(Candida) (알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스페르길루스(Aspergillus) (푸미가투스(fumigatus), 니거(niger) 등), 뮤코랄레스(Mucorales) 속 (뮤코르(mucor), 압시디아(absidia), 리조푸스(rhizopus)), 스포로트릭스 쉔크키이(Sporothrix schenkii), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum)을 포함한다.

본원에 기재된 방법에 의해 치료가능한 감염을 유발하는 병원성 기생충의 일부 예는 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜라이(Balantidium coli), 네글레리아포울레리(Naegleriafowleri), 아칸트아메바(Acanthamoeba) 종, 지아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디움(Cryptosporidium) 종, 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 니포스트롱길루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)를 포함한다.

상기 모든 방법에서, CD40 효능작용은 다른 형태의 면역요법 예컨대 시토카인 치료 (예를 들어, 인터페론, GM-CSF, G-CSF, IL-2), 또는 종양 항원의 증진된 제시를 제공하는 이중특이적 항체 요법과 조합될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123]을 참조한다.

백신 아주반트

본원에 기재된 항-huCD40 항체는 항-huCD40 항체와 관심 항원, 예를 들어 백신의 공-투여에 의해 항원-특이적 면역 반응을 증진시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 대상체에서 항원에 대한 면역 반응이 증진되도록 (i) 항원; 및 (ii) 항-huCD40 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법이 본원에 제공된다. 항원은 예를 들어 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 병원체로부터의 항원일 수 있다. 이러한 항원의 비제한적 예는 상기 섹션에서 논의된 것, 예컨대 상기 논의된 종양 항원 (또는 종양 백신), 또는 바이러스, 박테리아 또는 상기 기재된 다른 병원체로부터의 항원을 포함한다.

본원에 기재된 항체 조성물 (예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)의 적합한 생체내 및 시험관내 투여 경로는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 주사에 의해 (예를 들어, 정맥내 또는 피하) 투여될 수 있다. 사용되는 분자의 적합한 투여량은 대상체의 연령 및 체중 및 항체 조성물의 농도 및/또는 제제에 의존할 것이다.

이전에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 항-huCD40 항체는 1종 이상의 다른 치료제, 예를 들어 세포독성제, 방사성독성제 또는 면역억제제와 공투여될 수 있다. 항체는 작용제에 연결될 수 있거나 (면역-복합체로서), 또는 작용제와 별개로 투여될 수 있다. 후자의 경우에 (별개의 투여), 항체는 작용제 전에, 그 후에 또는 그와 공동으로 투여될 수 있거나, 또는 다른 공지된 요법, 예를 들어 항암 요법, 예를 들어 방사선과 공-투여될 수 있다. 이러한 치료제는 특히 항신생물제, 예컨대 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 다카르바진 및 시클로포스파미드 히드록시우레아를 포함하며, 이는 그 자체로 환자에게 독성 또는 준독성인 수준에서만 효과적이다. 시스플라틴은 4주마다 1회 100 mg/ml 용량으로 정맥내로 투여되고 아드리아마이신은 21일마다 1회 60-75 mg/ml 용량으로 정맥내로 투여된다. 본원에 기재된 항-CD40 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 화학요법제의 공-투여는 상이한 메카니즘을 통해 작동하여, 인간 종양 세포에 대해 세포독성 효과를 생성하는 2종의 항암제를 제공한다. 이러한 공-투여는 약물에 대한 저항성의 발생, 또는 항체와 비반응성이 되게 할 종양 세포의 항원성에서의 변화로 인한 문제점을 해결할 수 있다.

또한, 본원에 기재된 항체 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자, 또는 면역접합체) 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트가 본원에 기재된 범주 내에 포함된다. 키트는 적어도 1종의 추가의 시약, 또는 본원에 기재된 1종 이상의 추가의 인간 항체 (예를 들어, 제1 인간 항체와 구분되는 CD40 항원 내의 에피토프에 결합하는 상보적 활성을 갖는 인간 항체)를 추가로 함유할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트의 내용물의 의도되는 용도를 지시하는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나, 또는 달리 키트에 동반되는 임의의 문서 또는 기록물을 포함한다.

조합 요법

상기 제공된 조합 요법에 더하여, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 또한, 예를 들어 하기 기재된 바와 같이, 암을 치료하기 위해 조합 요법에 사용될 수 있다.

본 발명은 항-huCD40 항체를, 면역 반응을 자극하는데 유효한 1종 이상의 추가의 작용제, 예를 들어 항체와 공-투여함으로써, 대상체에서 면역 반응을 추가로 증진, 자극 또는 상향조절하는 조합 요법의 방법을 제공한다.

일반적으로, 본원에 기재된 항-huCD40 항체는 (i) 또 다른 공동-자극 수용체의 효능제 및/또는 (ii) T 세포 상의 억제 신호의 길항제와 조합될 수 있고, 이 중 어느 하나는 항원-특이적 T 세포 반응의 증폭을 발생시킨다 (면역 체크포인트 조절제). 대부분의 공동-자극 및 공동-억제 분자는 이뮤노글로불린 슈퍼 패밀리 (IgSF)의 구성원이고, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 IgSF 패밀리의 구성원을 표적화하여 면역 반응을 증가시키는 작용제와 함께 투여될 수 있다. 공동-자극 또는 공동-억제 수용체에 결합하는 막-결합 리간드의 1종의 중요한 패밀리는 B7 패밀리이며, 이는 B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), 및 B7-H6을 포함한다. 공동-자극 또는 공동-억제 수용체에 결합하는 막 결합 리간드의 또 다른 패밀리는 동족 TNF 수용체 패밀리 구성원에 결합하는 TNF 패밀리의 분자이며, 이는 CD40 및 CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137/4-1BB, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTβR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, 림프독소 α/TNFβ, TNFR2, TNFα, LTβR, 림프독소 α 1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1] 참조).

또 다른 측면에서, 항-huCD40 항체는 면역 반응을 자극하기 위해, 예를 들어 증식성 질환, 예컨대 암을 치료하기 위해, T 세포 활성화를 억제하는 시토카인 (예를 들어, IL-6, IL-10, TGF-β, VEGF); 또는 다른 "면역억제 시토카인"의 길항제, 또는 T 세포 활성화를 자극하는 시토카인과 조합되어 사용될 수 있다.

한 측면에서, T 세포 반응은 본 발명의 항-huCD40 mAb, 및 (i) T 세포 활성화를 억제하는 단백질 (예를 들어, 면역 체크포인트 억제제) 예컨대 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, 갈렉틴 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, 갈렉틴-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1, 및 TIM-4의 길항제, 및 (ii) T 세포 활성화를 자극하는 단백질 예컨대 B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, CD40, DR3 및 CD28H의 효능제 중 1종 이상의 조합에 의해 자극될 수 있다.

암을 치료하기 위해, 상기 단백질 중 1종을 조정하고 효능제 항-huCD40 항체, 예를 들어, 본원에 기재된 것과 조합될 수 있는 예시적인 작용제는 예르보이(YERVOY)®/이필리무맙 또는 트레멜리무맙 (CTLA-4에 대한 것), 갈릭시맙 (B7.1에 대한 것), BMS-936558 (PD-1에 대한 것), 피딜리주맙/CT-011 (PD-1에 대한 것), 키트루다(KEYTRUDA)®/펨브롤리주맙/MK-3475 (PD-1에 대한 것), AMP224 (B7-DC/PD-L2에 대한 것), BMS-936559 (B7-H1에 대한 것), MPDL3280A (B7-H1에 대한 것), MEDI-570 (ICOS에 대한 것), AMG557 (B7H2에 대한 것), MGA271 (B7H3에 대한 것 - WO 11/109400), IMP321 (LAG-3에 대한 것), 우렐루맙/BMS-663513 및 PF-05082566 (CD137/4-1BB에 대한 것), 바를리루맙/CDX-1127 (CD27에 대한 것), MEDI-6383 및 MEDI-6469 (OX40에 대한 것), RG-7888 (OX40L에 대한 것 - WO 06/029879), 아타시셉트 (TACI에 대한 것), 무로모납-CD3 (CD3에 대한 것), 이필리무맙 (CTLA-4에 대한 것)을 포함한다.

암의 치료를 위해 효능제 항-huCD40 항체와 조합될 수 있는 다른 분자는 NK 세포 상의 억제 수용체의 길항제 또는 NK 세포 상의 활성화 수용체의 효능제를 포함한다. 예를 들어, 효능제 항-huCD40 항체는 KIR의 길항제 (예를 들어, 리릴루맙)와 조합될 수 있다.

조합 요법을 위한 다른 작용제는 CSF-1R 길항제, 예컨대 RG7155 (WO 11/70024, WO 11/107553, WO 11/131407, WO 13/87699, WO 13/119716, WO 13/132044) 또는 FPA-008 (WO 11/140249; WO 13/169264; WO 14/036357)을 포함한 CSF-1R 길항제 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 대식세포 또는 단핵구를 억제 또는 고갈시키는 작용제를 포함한다.

일반적으로, 본원에 기재된 효능제 항-huCD40 항체는 양성 공동-자극 수용체를 라이게이션하는 효능작용제, 억제 수용체를 통한 신호전달을 감쇠시키는 차단제, 및 항종양 T 세포의 빈도를 전신적으로 증가시키는 1종 이상의 작용제, 종양 미세환경 내에서의 별개의 면역 억제 경로를 극복하는 (예를 들어, 억제 수용체 맞물림 (예를 들어, PD-L1/PD-1 상호작용)을 차단하거나, T_reg를 고갈 또는 억제하거나 (예를 들어, 항-CD25 모노클로날 항체 (예를 들어, 다클리주맙)를 사용하거나 또는 생체외 항-CD25 비드 고갈에 의함), 대사 효소, 예컨대 IDO를 억제하거나, 또는 T 세포 무반응 또는 소진을 역전/방지하는) 작용제, 및 종양 부위에서 선천성 면역 활성화 및/또는 염증을 촉발시키는 작용제 중 1종 이상과 함께 사용될 수 있다.

대상체에게 CD40 효능제, 예를 들어, 항체, 및 1종 이상의 추가의 면역자극 항체, 예컨대 PD-1 길항제, 예를 들어, 길항제 항체, PD-L1 길항제, 예를 들어, 길항제 항체, CTLA-4 길항제, 예를 들어, 길항제 항체 및/또는 LAG3 길항제, 예를 들어, 길항제 항체를 투여하여, 대상체에서 면역 반응이 자극되어, 예를 들어 종양 성장을 억제하거나 또는 항바이러스 반응을 자극하도록 하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 본원에 제공된다. 한 실시양태에서, 대상체에게 효능제 항-huCD40 항체 및 길항제 항-PD-1 항체를 투여한다. 한 실시양태에서, 대상체에게 효능제 항-huCD40 항체 및 길항제 항-PD-L1 항체를 투여한다. 한 실시양태에서, 대상체에게 효능제 항-huCD40 항체 및 길항제 항-CTLA-4 항체를 투여한다. 한 실시양태에서, 적어도 1종의 추가의 면역자극 항체 (예를 들어, 길항제 항-PD-1, 길항제 항-PD-L1, 길항제 항-CTLA-4 및/또는 길항제 항-LAG3 항체)는 인간 항체이다. 대안적으로, 적어도 1종의 추가의 면역자극 항체는 (예를 들어 마우스 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA-4 및/또는 항-LAG3 항체로부터 제조된) 예를 들어 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다.

효능제 항-huCD40 항체 및 길항제 PD-1 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 질환 (예를 들어, 암)을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 효능제 항-huCD40 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 항-PD-1 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 또는 둘 다 치료 용량 미만으로 투여된다. 또한 효능제 항-huCD40 항체 및 치료 용량 미만의 항-PD-1 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제를 사용하여 과다증식성 질환을 치료하는 것과 연관된 유해 사건을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 인간 서열 모노클로날 항체이고, 효능제 항-huCD40 항체는 인간화 모노클로날 항체, 예컨대 본원에 개시된 항체의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체이다.

본원에 기재된 방법에 사용하기 적합한 PD-1 길항제는 리간드, 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체 및 이중특이적 항체), 및 다가 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, PD-1 길항제는 융합 단백질, 예를 들어, Fc 융합 단백질, 예컨대 AMP-244이다. 한 실시양태에서, PD-1 길항제는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체이다.

예시적인 항-PD-1 항체는 옵디보®/니볼루맙 (BMS-936558), 또는 WO 2006/121168에 기재된 항체 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 7D3, 5F4 및 4A11 중 1종의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 WO 2012/145493에 기재된 MK-3475 (키트루다®/펨브롤리주맙/ 이전의 람브롤리주맙); WO 2012/145493에 기재된 AMP-514/MEDI-0680; 및 CT-011 (피딜리주맙; 이전의 CT-액티바디 또는 BAT; 예를 들어, 문헌 [Rosenblatt et al. (2011) J. Immunotherapy 34:409] 참조)이다. 추가의 공지된 PD-1 항체 및 다른 PD-1 억제제는 WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699, WO 2012/145493, 미국 특허 번호 7,635,757 및 8,217,149, 및 미국 특허 공개 번호 2009/0317368에 기재된 것을 포함한다. WO 2013/173223에 개시된 항-PD-1 항체 중 임의의 것을 사용할 수도 있다. 이들 항체 중 1종과 결합에 대해 경쟁하고/거나 이와 PD-1 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항-PD-1 항체가 또한 조합 치료에 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 5x10^-8 M 이하의 K_D로 인간 PD-1에 결합하거나, 1x10^-8 M 이하의 K_D로 인간 PD-1에 결합하거나, 5x10^-9 M 이하의 K_D로 인간 PD-1에 결합하거나, 또는 1x10^-8M 내지 1x10^-10 M 또는 그 미만의 K_D로 인간 PD-1에 결합한다.

효능제 항-huCD40 항체 및 길항제 PD-L1 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 질환 (예를 들어, 암)의 치료 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 효능제 항-huCD40 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 항-PD-L1 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 또는 둘 다 치료 용량 미만으로 투여된다. 효능제 항-huCD40 항체 및 치료 용량 미만의 항-PD-L1 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제를 사용하여 과다증식성 질환을 치료하는 것과 연관된 유해 사건을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 인간 서열 모노클로날 항체이고, 효능제 항-huCD40 항체는 인간화 모노클로날 항체, 예컨대 본원에 개시된 항체의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체이다.

한 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 BMS-936559 (WO 2007/005874 및 미국 특허 번호 7,943,743에서 12A4로 지칭됨), MSB0010718C (WO 2013/79174), 또는 PCT 공개 WO 07/005874 및 미국 특허 번호 7,943,743에 기재된 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 및 13G4의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체이다. 특정 실시양태에서 항-PD-L1 항체는 MEDI4736 (항-B7-H1로도 공지됨) 또는 MPDL3280A (RG7446으로도 공지됨)이다. WO 2013/173223, WO 2011/066389, WO 2012/145493, 미국 특허 번호 7,635,757 및 8,217,149 및 미국 공개 번호 2009/145493에 개시된 항-PD-L1 항체 중 임의의 것을 사용할 수도 있다. 이들 항체 중 임의의 것과 경쟁하고/거나 이와 동일한 에피토프에 결합하는 항-PD-L1 항체가 또한 조합 치료에 사용될 수 있다.

추가 실시양태에서, 본 발명의 효능제 항-huCD40 항체는, 제3 면역요법제와 조합된, PD-1/PD-L1 신호전달의 길항제, 예컨대 PD-1 길항제 또는 PD-L1 길항제와 조합된다. 한 실시양태에서 제3 면역요법제는 GITR 길항제 또는 OX-40 길항제, 예컨대 본원에 개시된 항-GITR 또는 항-OX40 항체이다.

또 다른 측면에서, 면역-종양학 작용제는 GITR 효능제, 예컨대 효능작용 GITR 항체이다. 적합한 GITR 항체는, 예를 들어, BMS-986153, BMS-986156, TRX-518 (WO 06/105021, WO 09/009116) 및 MK-4166 (WO 11/028683)을 포함한다.

또 다른 측면에서, 면역-종양학 작용제는 IDO 길항제이다. 적합한 IDO 길항제는, 예를 들어, INCB-024360 (WO 2006/122150, WO 07/75598, WO 08/36653, WO 08/36642), 인독시모드, 또는 NLG-919 (WO 09/73620, WO 09/1156652, WO 11/56652, WO 12/142237)를 포함한다.

본원에 기재된 효능제 항-huCD40 항체 및 CTLA-4 길항제 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 질환 (예를 들어, 암)을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 효능제 항-huCD40 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 항-CTLA-4 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 또는 둘 다 치료 용량 미만으로 투여된다. 효능제 항-huCD40 항체 및 치료 용량 미만의 항-CTLA-4 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제를 사용하여 과다증식성 질환을 치료하는 것과 연관된 유해 사건을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 예르보이® (PCT 공보 WO 01/14424에 기재된 이필리무맙 또는 항체 10D1), 트레멜리무맙 (이전의 티실리무맙, CP-675,206), 및 하기 공보에 기재된 항-CTLA-4 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체이다: WO 98/42752; WO 00/37504; 미국 특허 번호 6,207,156; 문헌 [Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206); 및 Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304]. WO 2013/173223에 개시된 항-CTLA-4 항체 중 임의의 것이 또한 사용될 수 있다.

효능제 항-huCD40 항체 및 항-LAG-3 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 질환 (예를 들어, 암)을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 추가 실시양태에서, 효능제 항-huCD40 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 항-LAG-3 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 또는 둘 다 치료 용량 미만으로 투여된다. 효능제 항-huCD40 항체 및 치료 용량 미만의 항-LAG-3 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제를 사용하여 과다증식성 질환을 치료하는 것과 연관된 유해 사건을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 항-LAG-3 항체는 인간 서열 모노클로날 항체이고, 효능제 항-huCD40 항체는 인간화 모노클로날 항체, 예컨대 본원에 개시된 항체의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체이다. 항-LAG3 항체의 예는 미국 특허 공개 번호 US 2011/0150892 및 WO 2014/008218에 기재된 항체 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 또는 17E5의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LAG-3 항체는 BMS-986016이다. 사용될 수 있는, 관련 기술분야에서 승인된 다른 항-LAG-3 항체는 US 2011/007023에 기재된 IMP731을 포함한다. IMP-321을 사용할 수도 있다. 이들 항체 중 임의의 것과 경쟁하고/거나 이러한 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-LAG-3 항체가 또한, 조합 치료에 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 항-LAG-3 항체는 5x10^-8 M 이하의 K_D로 인간 LAG-3에 결합하거나, 1x10^-8 M 이하의 K_D로 인간 LAG-3에 결합하거나, 5x10^-9 M 이하의 K_D로 인간 LAG-3에 결합하거나, 또는 1x10^-8 M 내지 1x10^-10 M 또는 그 미만의 K_D로 인간 LAG-3에 결합한다.

본원에 기재된 효능제 항-huCD40 항체, 및 길항제, 예를 들어 LAG-3 및/또는 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1과 같은 1종 이상의 제2 표적 항원에 대한 길항제 항체의 투여는, 환자에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 그의 성장이 본 개시내용의 항체를 사용하여 억제될 수 있는 암은 전형적으로 면역요법에 대해 반응성인 암을 포함한다. 본 개시내용의 조합 요법을 사용하여 치료하기 위한 암의 대표적인 예는 효능제 항-huCD40 항체를 사용한 단독요법의 논의에서 상기에 구체적으로 열거된 암을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 논의된 치료 항체의 조합물은 제약상 허용되는 담체 중 단일 조성물로서 공동으로 투여될 수 있거나, 또는 제약상 허용되는 담체 중 각각의 항체를 함유하는 개별 조성물로서 공동으로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 치료 항체의 조합물은 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-CTLA-4 항체 및 효능제 항-huCD40 항체는 순차적으로 투여될 수 있으며, 예컨대 항-CTLA-4 항체가 제1로 투여되고 효능제 항-huCD40 항체가 제2로 투여되거나, 또는 효능제 항-huCD40 항체가 제1로 투여되고 항-CTLA-4 항체가 제2로 투여된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항-PD-1 항체와 효능제 항-huCD40 항체는 순차적으로 투여될 수 있으며, 예컨대 항-PD-1 항체가 제1로 투여되고 효능제 항-huCD40 항체가 제2로 투여되거나, 또는 효능제 항-huCD40 항체가 제1로 투여되고 항-PD-1 항체가 제2로 투여된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항-PD-L1 항체와 효능제 항-huCD40 항체는 순차적으로 투여될 수 있으며, 예컨대 항-PD-L1 항체가 제1로 투여되고 효능제 항-huCD40 항체가 제2로 투여되거나, 또는 효능제 항-huCD40 항체가 제1로 투여되고 항-PD-L1 항체가 제2로 투여된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항-LAG-3 항체와 효능제 항-huCD40 항체는 순차적으로 투여될 수 있으며, 예컨대 항-LAG-3 항체가 제1로 투여되고 효능제 항-huCD40 항체가 제2로 투여되거나, 또는 효능제 항-huCD40 항체가 제1로 투여되고 항-LAG-3 항체가 제2로 투여된다.

더욱이, 하나 초과의 용량의 조합 요법을 순차적으로 투여하는 경우, 순차적 투여의 순서는 역전될 수 있거나 또는 각 투여 시점에 동일한 순서로 유지될 수 있거나, 순차적 투여를 공동 투여와 조합할 수 있거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 항-CTLA-4 항체 및 효능제 항-huCD40 항체의 조합의 제1 투여는 공동일 수 있고, 제2 투여는 항-CTLA-4 항체가 제1 및 효능제 항-huCD40 항체가 제2로 순차적일 수 있고, 제3 투여는 효능제 항-huCD40 항체가 제1 및 항-CTLA-4 항체가 제2로 순차적일 수 있는 등이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항-PD-1 항체 및 효능제 항-huCD40 항체의 조합의 제1 투여는 공동일 수 있고, 제2 투여는 항-PD-1 항체가 제1 및 효능제 항-huCD40 항체가 제2로 순차적일 수 있고, 제3 투여는 효능제 항-huCD40 항체가 제1 및 항-PD-1 항체가 제2로 순차적일 수 있는 등이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항-PD-L1 항체 및 효능제 항-huCD40 항체의 조합의 제1 투여는 공동일 수 있고, 제2 투여는 항-PD-L1 항체가 제1 및 효능제 항-huCD40 항체가 제2로 순차적일 수 있고, 제3 투여는 효능제 항-huCD40 항체가 제1 및 항-PD-L1 항체가 제2로 순차적일 수 있는 등이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항-LAG-3 항체 및 효능제 항-huCD40 항체의 조합의 제1 투여는 공동일 수 있고, 제2 투여는 항-LAG-3 항체가 제1 및 효능제 항-huCD40 항체가 제2로 순차적일 수 있고, 제3 투여는 효능제 항-huCD40 항체가 제1 및 항-LAG-3 항체가 제2로 순차적일 수 있는 등이다. 또 다른 대표적인 투여 스킴은 효능제 항-huCD40가 제1 및 항-CTLA-4 항체 (및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체 및/또는 항-LAG-3 항체)가 제2로 순차적인 제1 투여를 수반할 수 있고, 후속 투여는 공동일 수 있다.

임의로, 단독 면역요법제로서의 효능제 항-huCD40, 또는 효능제 항-huCD40 항체와 1종 이상의 추가의 면역요법 항체 (예를 들어, 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 차단)의 조합물은 면역원성 작용제, 예컨대 암성 세포, 정제된 종양 항원 (재조합 단백질, 펩티드, 및 탄수화물 분자 포함), 세포, 및 면역 자극성 시토카인을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포와 추가로 조합될 수 있다 (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). 사용될 수 있는 종양 백신의 비-제한적 예는 흑색종 항원의 펩티드, 예컨대 gp100, MAGE 항원, Trp-2, MART1 및/또는 티로시나제의 펩티드, 또는 시토카인 GM-CSF를 발현하도록 형질감염된 종양 세포 (하기에 추가로 논의됨)를 포함한다. CD40 효능제 및 1종 이상의 추가의 항체 (예를 들어, CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단)는 또한, 표준 암 치료와 추가로 조합될 수 있다. 예를 들어, CD40 효능제 및 1종 이상의 추가의 항체 (예를 들어, CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단)는 화학요법적 요법과 효과적으로 조합될 수 있다. 이들 경우에, 본 개시내용의 조합물과 함께 투여되는 다른 화학요법 시약의 용량을 감소시키는 것이 가능하다 (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). 이러한 조합물의 한 예는 흑색종을 치료하기 위한 데카르바진과 추가로 조합된, 추가의 항체, 예컨대 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체 및/또는 항-LAG-3 항체의 존재 또는 부재 하의 CD40 효능제 항체의 조합물이다. 또 다른 예는 흑색종을 치료하기 위한 인터류킨-2 (IL-2)와 추가로 조합된, 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체 및/또는 LAG-3 항체의 존재 또는 부재 하의 효능제 항-huCD40 항체의 조합물이다. CD40 효능작용 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단과 화학요법의 조합 사용 배후의 과학적 근거는 대부분의 화학요법 화합물의 세포독성 작용의 결과인 세포 사멸이 항원 제시 경로에서 종양 항원의 수준을 증가시켜야 한다는 것이다. 세포 사멸을 통해 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단의 존재 또는 부재 하의 조합된 CD40 효능작용과 상승 작용을 일으킬 수 있는 다른 조합 요법은 방사선, 수술 및 호르몬 고갈을 포함한다. 이들 프로토콜 각각은 숙주에서 종양 항원의 공급원을 생성한다. 혈관형성 억제제가 또한, 조합된 CD40 효능작용 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단과 조합될 수 있다. 혈관형성의 억제는 숙주 항원 제시 경로 내로 공급되는 종양 항원의 공급원일 수 있는, 종양 세포 사멸로 이어진다.

단독 면역요법제로서의 효능제 항-huCD40 항체, 또는 CD40 효능제 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단 항체의 조합물은 또한, Fcα 또는 Fcγ 수용체-발현 이펙터 세포를 종양 세포로 표적화하는 이중특이적 항체와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,922,845 및 5,837,243을 참조한다. 이중특이적 항체를 사용하여 2개의 별도의 항원을 표적화할 수 있다. 이들 반응의 T 세포 부문은 조합된 CD40 효능작용 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단을 사용함으로써 증대될 것이다.

또 다른 예에서, 단독 면역요법제로서의 효능작용 항-CD40 항체, 또는 항-CD40 항체와 추가의 면역자극제, 예를 들어, 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체 및/또는 LAG-3 작용제, 예를 들어, 항체의 조합물은 항신생물성 항체, 예컨대 리툭산(RITUXAN)® (리툭시맙), 헤르셉틴(HERCEPTIN)® (트라스투주맙), 벡사르(BEXXAR)® (토시투모맙), 제발린(ZEVALIN)® (이브리투모맙), 캄파트(CAMPATH)® (알렘투주맙), 림포사이드(LYMPHOCIDE)® (에프르투주맙), 아바스틴(AVASTIN)® (베바시주맙), 및 타르세바(TARCEVA)® (에를로티닙) 등과 함께 사용될 수 있다. 예로서 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 항암 항체 또는 독소에 접합된 항암 항체를 사용한 치료는 암 세포 (예를 들어, 종양 세포) 사멸로 이어질 수 있고, 이는 면역자극제, 예를 들어, CD40, TIGIT, CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 LAG-3 작용제, 예를 들어, 항체에 의해 매개되는 면역 반응을 강화할 것이다. 예시적인 실시양태에서, 과다증식성 질환 (예를 들어, 암 종양)의 치료는 항암제, 예를 들어, 항체를, 효능제 항-huCD40 항체 및 임의로 추가의 면역자극제, 예를 들어, 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 작용제, 예를 들어, 항체와 공동으로 또는 순차적으로 또는 그의 임의의 조합으로 조합하는 것을 포함할 수 있으며, 이는 숙주에 의한 항종양 면역 반응을 강화할 수 있다.

치료 용량 미만의 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 작용제, 예를 들어, 항체의 존재 또는 부재 하에 효능제 항-huCD40 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제를 사용하여 과다증식성 질환 (예를 들어, 암)을 치료하는 것과 연관된 유해 사건을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 비-흡수성 스테로이드를 환자에게 투여함으로써, 면역자극성 치료 항체-유도된 결장염 또는 설사의 발병률을 저하시키는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은, "비-흡수성 스테로이드"는 간에서의 대사 후, 스테로이드의 생체이용률이 낮도록, 즉 약 20% 미만이 되도록 광범위한 1차 통과 대사를 나타내는 글루코코르티코이드이다. 본원에 기재된 한 실시양태에서, 비-흡수성 스테로이드는 부데소니드이다. 부데소니드는 경구 투여 후, 주로 간에 의해 광범위하게 대사되는, 국소적으로 작용하는 글루코코르티코스테로이드이다. 엔토코르트 EC(ENTOCORT EC)® (아스트라-제네카(Astra-Zeneca))는 회장 및 결장 전체에 대한 약물 전달을 최적화하기 위해 개발된 부데소니드의 pH- 및 시간-의존성 경구 제형이다. 엔토코르트 EC®는 회장 및/또는 상행 결장과 관련된 경도 내지 중등도의 크론병의 치료를 위해 미국에서 승인되었다. 크론병의 치료를 위한 엔토코르트 EC®의 통상적인 경구 투여량은 6 내지 9 mg/일이다. 엔토코르트 EC®는 흡수되기 전에 장에서 방출되고 소화관 점막에 보유된다. 일단 소화관 점막 표적 조직을 관통하면, 엔토코르트 EC®는 간에서의 시토크롬 P450 시스템에 의해 광범위하게 대사되어, 무시할만한 수준의 글루코코르티코이드 활성을 지닌 대사물로 된다. 따라서, 생체이용률은 낮다 (약 10%). 이러한 부데소니드의 낮은 생체이용률은 덜 광범위한 1차 통과 대사를 수반하는 다른 글루코코르티코이드와 비교하여 개선된 치료 비를 발생시킨다. 부데소니드는 전신-작용 코르티코스테로이드보다 더 낮은 시상하부-뇌하수체 억제를 포함한, 더 적은 유해 사건을 발생시킨다. 그러나, 엔토코르트 EC®를 만성적으로 투여하면, 전신 글루코코르티코이드 효과, 예컨대 부신피질 항진증 및 부신 억제가 초래될 수 있다. 문헌 [PDR 58^th ed. 2004; 608-610]을 참조한다.

추가 실시양태에서, 비-흡수성 스테로이드와 함께, CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단의 존재 또는 부재 하에 CD40 효능제 (즉, CD40에 대한 면역자극성 치료 항체 및 임의로 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 항체)가 살리실레이트와 추가로 조합될 수 있다. 살리실레이트는 5-ASA 작용제, 예컨대, 예를 들어: 술파살라진 (아줄피딘(AZULFIDINE)®, 파마시아 & 업존(Pharmacia & UpJohn)); 올살라진 (디펜툼(DIPENTUM)®, 파마시아 & 업존); 발살라지드 (콜라잘(COLAZAL)®, 살릭스 파마슈티칼스, 인크.(Salix Pharmaceuticals, Inc.)); 및 메살라민 (아사콜(ASACOL)®, 프록터 & 갬블 파마슈티칼스(Procter & Gamble Pharmaceuticals); 펜타사(PENTASA)®, 샤이어 유에스(Shire US); 카나사(CANASA)®, 악스칸 스칸디파마, 인크.(Axcan Scandipharm, Inc.); 로와사(ROWASA)®, 솔베이(Solvay))을 포함한다.

본원에 기재된 방법에 따라, 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 LAG-3 항체 및 비-흡수성 스테로이드의 존재 또는 부재 하에 효능제 항-huCD40 항체와 조합되어 투여되는 살리실레이트는, 면역자극 항체에 의해 유도되는 결장염의 발병률을 저하시키기 위해, 살리실레이트 및 비-흡수성 스테로이드의 임의의 중복 또는 순차적 투여를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기재된 면역자극 항체에 의해 유도되는 결장염의 발병률을 저하시키는 방법은 살리실레이트 및 비-흡수성 스테로이드를 공동으로 또는 순차적으로 투여하거나 (예를 들어, 비-흡수성 스테로이드 투여 6시간 후에 살리실레이트를 투여함), 또는 그의 임의의 조합으로 투여하는 것을 포괄한다. 추가로, 살리실레이트 및 비-흡수성 스테로이드는 동일한 경로에 의해 (예를 들어, 둘 다 경구로 투여됨) 또는 상이한 경로에 의해 (예를 들어, 살리실레이트는 경구로 투여되고, 비-흡수성 스테로이드는 직장으로 투여됨) 투여될 수 있고, 이는 항-huCD40 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 항체를 투여하기 위해 사용되는 경로(들)와 상이할 수 있다.

본원에 기재된 효능제 항-huCD40 항체 및 조합 항체 요법은 또한, 치료하고자 하는 적응증 (예를 들어, 암)에 대한 그의 특정한 유용성에 대해 선택되는, 다른 널리 공지된 요법과 함께 사용될 수 있다. 본원에 기재된 효능제 항-huCD40 항체의 조합물은 공지된 제약상 허용되는 작용제(들)와 순차적으로 사용될 수 있다.

예를 들어, 본원에 기재된 효능제 항-huCD40 항체 및 조합 항체 요법은 추가의 치료, 예컨대 방사선 조사, 화학요법 (예를 들어, 캄프토테신 (CPT-11), 5-플루오로우라실 (5-FU), 시스플라틴, 독소루비신, 이리노테칸, 파클리탁셀, 젬시타빈, 시스플라틴, 파클리탁셀, 카르보플라틴-파클리탁셀 (탁솔), 독소루비신, 5-fu, 또는 캄프토테신 + apo2l/TRAIL (6X 콤보)을 사용함), 1종 이상의 프로테아솜 억제제 (예를 들어, 보르테조밉 또는 MG132), 1종 이상의 Bcl-2 억제제 (예를 들어, BH3I-2' (bcl-xl 억제제), 인돌아민 디옥시게나제-1 (IDO1) 억제제 (예를 들어, INCB24360), AT-101 (R-(-)-고시폴 유도체), ABT-263 (소분자), GX-15-070 (오바토클락스), 또는 MCL-1 (골수성 백혈병 세포 분화 단백질-1) 길항제), iAP (아폽토시스 단백질의 억제제) 길항제 (예를 들어, smac7, smac4, 소분자 smac 모방체, 합성 smac 펩티드 (문헌 [Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15] 참조), ISIS23722 (LY2181308), 또는 AEG-35156 (GEM-640)), HDAC (히스톤 데아세틸라제) 억제제, 항-CD20 항체 (예를 들어, 리툭시맙), 혈관형성 억제제 (예를 들어, 베바시주맙), VEGF 및 VEGFR을 표적화하는 항혈관형성제 (예를 들어, 아바스틴®), 합성 트리테르페노이드 (문헌 [Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808] 참조), c-FLIP (세포성 FLICE-억제성 단백질) 조정제 (예를 들어, PPARγ (퍼옥시솜 증식자-활성화 수용체 γ)의 자연 및 합성 리간드, 5809354 또는 5569100), 키나제 억제제 (예를 들어, 소라페닙), 트라스투주맙, 세툭시맙, 템시롤리무스, mTOR 억제제, 예컨대 라파마이신 및 템시롤리무스, 보르테조밉, JAK2 억제제, HSP90 억제제, PI3K-AKT 억제제, 래날릴도미드, GSK3β 억제제, IAP 억제제 및/또는 유전자독성 약물과 조합하여 (예를 들어, 동시에 또는 별도로) 사용될 수 있다.

본원에 기재된 효능제 항-huCD40 항체 및 조합 항체 요법은 1종 이상의 항증식 세포독성제와 조합하여 추가로 사용될 수 있다. 항증식 세포독성제로서 사용될 수 있는 화합물 부류는 다음을 포함하지만, 그에 제한되지 않는다:

알킬화제 (질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠을 포함하나 이에 제한되지는 않음): 우라실 머스타드, 클로르메틴, 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)™ 포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 피포브로만, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포르아민, 부술판, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 데카르바진, 및 테모졸로미드.

항대사제 (엽산 길항제, 피리미딘 동족체, 퓨린 동족체 및 아데노신 데아미나제 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않음): 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 플록수리딘, 시타라빈, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴, 및 젬시타빈.

효능제 항-huCD40 항체와 조합하는데 적합한 항증식제: 관련 기술분야에 공지된 다른 마이크로투불린 안정화제 이외에, 제한 없이 탁산, 파클리탁셀 (파클리탁셀은 탁솔(TAXOL)™로서 상업적으로 입수가능함), 도세탁셀, 디스코데르몰리드 (DDM), 딕티오스타틴 (DCT), 펠로루시드 A, 에포틸론, 에포틸론 A, 에포틸론 B, 에포틸론 C, 에포틸론 D, 에포틸론 E, 에포틸론 F, 푸라노에포틸론 D, 데스옥시에포틸론 Bl, [17]-데히드로데스옥시에포틸론 B, [18]데히드로데스옥시에포틸론 B, C12,13-시클로프로필-에포틸론 A, C6-C8 브릿지된 에포틸론 A, 트랜스-9,10-데히드로에포틸론 D, 시스-9,10-데히드로에포틸론 D, 16-데스메틸에포틸론 B, 에포틸론 B10, 디스코데로몰리드, 파투필론 (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A (디스코데르몰리드), TZT-1027 (소블리도틴), ILX-651 (타시도틴 히드로클로라이드), 할리콘드린 B, 에리불린 메실레이트 (E-7389), 헤미아스테를린 (HTI-286), E-7974, 크립토피신, LY-355703, 마이탄시노이드 면역접합체 (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (이스피네십), SB-743921, MK-0731, STA-5312, 엘레우테로빈, 17베타-아세톡시-2-에톡시-6-옥소-B-호모-에스트라-1,3,5(10)-트리엔-3-올, 시클로스트렙틴, 이소라울리말리드, 라울리말리드, 4-에피-7-데히드록시-14,16-디데메틸-(+)-디스코데르몰리드, 및 크립토틸론 1.

본원에 기재된 효능제 항-huCD40 항체를 사용한 치료와 함께 또는 이러한 치료 전에, 비정상적으로 증식하는 세포를 휴지기로 만드는 것이 바람직한 경우에는, 호르몬 및 스테로이드 (합성 동족체 포함), 예컨대 17a-에티닐에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 테스토스테론, 프레드니손, 플루옥시메스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 테스토락톤, 메게스트롤아세테이트, 메틸프레드니솔론, 메틸-테스토스테론, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 클로로트리아니센, 히드록시프로게스테론, 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴, 메드록시프로게스테론아세테이트, 류프롤리드, 플루타미드, 테레미펜, 졸라덱스(ZOLADEX)™를 환자에게 투여할 수 있다. 본원에 기재된 방법 또는 조성물을 사용하는 경우에는, 임상 환경에서 종양 성장 또는 전이를 조정하는데 사용된 다른 작용제, 예컨대 항모방제를 원하는 만큼 투여할 수도 있다.

화학요법제를 안전하고 유효하게 투여하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 또한, 그의 투여가 표준 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 많은 화학요법제의 투여가 문헌 [Physicians' Desk Reference (PDR), e.g., 1996 edition (Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, (USA)]에 기재되어 있고; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.

화학요법제(들) 및/또는 방사선 요법은 관련 기술분야에 널리 공지된 치료 프로토콜에 따라 투여될 수 있다. 화학요법제(들) 및/또는 방사선 요법의 투여는 치료하고자 하는 질환 및 이러한 질환에 대한 화학요법제(들) 및/또는 방사선 요법의 공지된 효과에 따라 다양할 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 또한, 숙련된 임상의의 지식에 따라, 치료 프로토콜 (예를 들어, 투여량 및 투여 시간)은 환자에 대한 투여된 치료제의 관찰되는 효과의 관점에서, 및 투여된 치료제에 대한 질환의 관찰되는 반응의 관점에서 달라질 수 있다.

XI. 본 발명의 특정 효능제 항-CD40 항체의 특징화

본 발명의 효능제 항-CD40 항체는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득되었다. 본 발명의 예시적인 항체의 가변 도메인 및 CDR 서열 영역이 서열 목록에 제공되고, 표 2에 요약된다. 가변 도메인 및 CDR 영역 넘버링은 동일한 원래 클론으로부터 유래된 모든 항체에 대해 동일하고, 즉 본원에 제공된 인간화 변이체는 어떠한 삽입 또는 결실도 포함하지 않는다.

표 2

항체 가변 도메인 및 CDR

본 발명은 또한 동일한 뮤린 배선 서열, 구체적으로 V 및 J 영역 유전자 절편으로부터 유래된 것에 의한 서열에 의해 본원에 개시된 것과 관련된 항-huCD40 항체를 제공한다. 본원에 개시된 각각의 항체에 대한 뮤린 배선 서열이 표 3에 제공된다.

표 3

항-huCD40 mAb에 대한 마우스 배선 서열

본 발명은, 그렇지 않을 경우 인간화에서 상실될 항원 (인간 CD40) 친화도를 회복시키거나 또는 서열 문제를 제거하기 위해, 추가의 돌연변이 ("복귀 돌연변이")의 존재 또는 부재 하에 뮤린 프레임워크 서열을 인간 프레임워크 서열로 대체하는 것에 의한, 본원에 개시된 뮤린 모 항체로부터 유래된 인간화 항-huCD40 항체를 추가로 제공한다. 실시예 3을 참조한다.

본 발명은 또한, 본원에 개시된 신규 가변 도메인 서열, 및 다른 Fc 수용체, 즉 활성화 수용체에 대한 그의 친화도와 비교하여 FcγRIIb에 대해 증진된 친화도를 갖는 변형된 Fc 영역을 갖는 불변 도메인을 포함하는 항체 구축물을 제공한다. 증진된 FcγRIIb-특이성을 갖는 이러한 효능작용 항-huCD40 항체는 암 및 만성 감염의 치료에 있어서 뛰어난 효능을 나타낼 것으로 예상된다. 문헌 [Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754]. 이론에 의해 제한되는 것을 의도하지는 않지만, 이러한 FcγRIIb-특이적 효능작용 항-CD40 mAb는 수지상 세포의 성숙을 증가시키고, 세포독성 CD8⁺ T 세포의 확장 및 활성화를 촉진시킴으로써 증진된 아주반트 효과를 나타낼 수 있고, 이는 증진된 항종양 반응으로 이어질 수 있다. Id. 이론에 의해 제한되는 것을 의도하지는 않지만, 본 발명의 증가된 수용체 클러스터링 또는 "가교"로 인한 효능제 CD40 항체의 FcR-매개 신호 증강은 치료 효능의 주요 기여인자일 수 있다. 항체의 Fc 부분에 의한 FcR 맞물림에 의한 CD40 효능제 항체의 가교는 신호 강도를 증가시킬 수 있고, 그에 의해 세포의 활성화를 증진시킬 수 있다.

활성화 (A) 대 억제 (I) Fc 수용체에 대한 항체의 상대적 결합 친화도는 "A/I" 비로 표현될 수 있고, 이는 전형적으로 IgG 항체의 Fc 영역의 구조의 함수이다. WO 2012/087928을 참조한다. 억제 수용체 FcγRIIb에의 결합에 대해 증진된 특이성을 갖는 항체는 보다 낮은 A/I 비를 갖는다. 본 발명의 효능작용 항-huCD40 항체의 경우에 바람직한 항체는 예를 들어 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.3, 0.1, 0.05, 0.03 또는 0.01 미만의 A/I 비를 갖는다.

FcγRIIb 특이성을 증진시키기 위한 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 불변 도메인이 또한 서열 목록에 제공되고, 표 4에 요약되고, 도 1에 예시된다. 서열 변이체는 서열식별번호: 65에 제공된 인간 IgG1f 불변 도메인 서열과 관련하여 정의된다. Fc 영역에서의 돌연변이의 위치와 관련한 명명법 (넘버링)은 문헌 [Kabat et al. (1981) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]에서와 같은 EU 인덱스에 따르며, 이는 상이한 가변 도메인 길이를 갖는 항체에서 동등한 위치에서의 Fc 서열의 비교를 용이하게 한다. 또한, 문헌 [Edelman et al. (1969) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 63:78]; WO 2012/130831 (동일한 넘버링 시스템을 사용함)을 참조한다. 이는 서열 목록에서의 서열 넘버링과 매칭되지 않는다. 도 1은 표 4의 Fc 서열 변이체의 그래프 표현을 제공하며, 이로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 항체 서열에서 상응하는 위치를 용이하게 인식할 수 있다. SE 및 SELF 변이체는 문헌 [Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926]에 기재되어 있다. P238D, V4, V7, V8, V9, V11 및 V12 변이체는 문헌 [Mimoto et al. (2013) Protein Engineering Design & Selection 26:589 (예를 들어, 그 안의 표 1)]에 기재되어 있다.

표 4

Fc 서열 변이체

예를 들어 S267E 및 L328F와 조합하여 사용하기 위한, V262E 및 V264E를 포함하는, FcγRIIb에 대해 증진된 친화도를 갖는 추가의 Fc 서열 변이체가 문헌 [Yu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135:9723] (및 WO 2014/184545)에 개시되어 있다.

V4 및 V9 Fc 서열 변이체에서 발생하는 D270 이성질화를 감소시키기 위해 D270E 돌연변이를 갖는 추가의 변이체를 생산하였고, 이는 그렇지 않을 경우 가속 분해 연구에서 증진된 이성질화율을 나타내어, PBS 중 4℃에서 2년 후 다른 변이체의 경우의 ~5-7%와 비교하여 ~12-16% 이성질화를 시사하였다. 표 5를 참조한다 (이는 단일 실험으로부터의 데이터를 제공하나, 반복 실험은 대등한 값을 나타내었음). 위치 270에서 아스파르트산의 글루탐산에 의한 치환은 이러한 DG 이성질화의 가능성을 제거하여, 보다 화학적으로 안정한 항체 및 보다 균질한 항체 제제를 발생시켰다. V9의 다른 D270 치환, 예컨대 D270A, D270Q, D270S 및 D270T는 FcγRIIa 및 FcγRIIb 수용체에 대한 결합을 효과적으로 제거하였다 (K_D는 5μM을 초과함). D270E 돌연변이는 FcγRIIb 수용체에 대한 결합을 한 자릿수 감소시켰지만, V9-D270E 변이체는 FcγRIIa와 비교하여 FcγRIIb 수용체에 대해 친화도에 있어서 바람직한 편향을 유지하였고, FcγRIIb에 대해 허용되는 절대 친화도를 유지하였다. 실시예 8을 참조한다.

표 5

Fcγ 수용체에 대한 Fc 서열 변이체 친화도

(nM 단위의 K_D)

본 발명의 다양한 항-CD40 항체의 효능제 활성을 측정하였다. 실시예 7, 및 도 3a, 3b 및 4를 참조한다. 효능제 활성은 항원 (인간 CD40) 결합을 결정하는 가변 도메인 서열 (mAb 클론 번호), 및 Fc 수용체 (FcγRIIb) 결합을 결정하는 Fc 영역의 서열 둘 다에 의존하는 것으로 확인되었다.

본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전반에서 인용되는 모든 도면 및 모든 참고문헌, 진뱅크 서열, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명확하게 본원에 참조로 포함된다.

실시예

실시예 1

인간 CD40에 대한 마우스 모노클로날 항체의 생성

뮤린 항-인간 CD40 모노클로날 항체를 하기와 같이, 마우스 항체 유전자를 발현하는 야생형 Balb/c 마우스 (찰스 리버 랩스(Charles Rivers Labs))를 사용하여 생성하였다.

항원

huCD40-muFc 가용성 재조합 단백질을 면역화를 위한 항원으로서 사용하였다. 가용성 융합 단백질은 91.6 K_D의 MW를 갖고, 마우스 IgG2b Fc에 그의 C-말단에서 연결된 huCD40의 세포외 부분으로 구성된다. 이러한 융합 단백질은 본원에서 "huCD40-muFc 융합 단백질"로 지칭된다. 융합 단백질을 표준 재조합 DNA 방법에 의해 생성하였고, 이는 형질감염된 CHO 세포에서 발현되어 가용성 융합 단백질을 배양물 상청액으로 분비하였다. 형질감염에 사용된 CHO 숙주 세포는 인비트로젠(Invitrogen) (Cat #11619-012)으로부터 입수하였다. 분비된 가용성 융합 단백질을 면역원으로 사용하기 위해 정제하였다.

마우스의 면역화

인간 CD40에 대한 마우스 모노클로날 항체를 생성하기 위해, Balb/c 마우스를 정제된 huCD40-muFc 융합 단백질로 면역화하였다. 마우스는 항원의 제1 주입 시 대략 2-4개월령이었다. 정제된 재조합 huCD40-muFc 항원 제제 (융합 단백질을 발현하는 형질감염된 포유동물 세포로부터 정제된 10 μg)를 사용하여 2종의 면역화 프로토콜 (A 및 B)을 사용하여 마우스를 면역화하였다. 프로토콜 A는 매주 4회 발바닥 (FP) 면역화로 이루어졌고, 프로토콜 B는 매주 7회 피하 (SC)/복강내 (IP)/호크(Hock) 면역화로 이루어졌다. 둘 다의 경우에, 면역원은 RIBI 아주반트 (시그마(Sigma) Cat#M6536)와 1:1 혼합하였다.

모든 마우스에서 제4 면역화 1주 후에 채혈하여 항원 특이적 역가를 평가하였다. 또한 희생 시점에 각각의 마우스로부터 최종 채혈을 수득하였다. 안와후 채혈에 의해 면역 반응을 모니터링하였다. 면역화에 사용된 재조합 단백질을 사용한 ELISA 분석에 의해 혈장을 스크리닝하였다. 프로토콜 A로부터의 마우스에게 가용성 항원으로 융합 전 제-2일 및 제-3일에 정맥내로 (IV) 및 발바닥으로 (FP) 2회 최종 부스팅을 제공하였다. 프로토콜 B로부터의 마우스에게 가용성 항원으로 융합 전 제-2일 및 제-3일에 정맥내로 뿐만 아니라 IP 및 호크로 2회 최종 부스팅을 제공하였다.

프로토콜 A로부터의 모든 4마리의 마우스 (ID 291763, 291764, 291765, 291766)를 희생시켰다. 림프절 및 비장 세포를 추출하고, 융합을 위해 혼합하였다 (융합 3582 및 3583). 프로토콜 B로부터는 오직 2마리의 마우스 (ID 294286 및 294288)만을 희생시켰다. 각각의 마우스로부터의 비장 및 림프절을 혼합하고 융합시켰다 (융합 3716 및 3717).

인간 CD40에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성

높은 역가 Balb/c 마우스로부터 단리된 마우스 비장세포 및 림프절을 전기장 기반 전기융합 하이브리뮨 기기 및 대형 0.9ml 융합 챔버 (비티엑스 하버드 어패러투스, 인크.(BTX Harvard Apparatus, Inc.), 매사추세츠주 홀리스톤)를 사용하여 마우스 골수종 융합 파트너와 융합시켰다. 면역화된 마우스로부터의 림프구의 단세포 현탁액을 동등 수의 P3X63 Ag8.6.53 (ATCC CRL 1580) 비-분비 마우스 골수종 세포에 융합시켰다. 생성된 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에, 하이브리도마를 선택하기 위해 아미노프테린이 첨가된 선택적 클로나셀-HY 배지 E (카탈로그 # 03805; 스템셀 테크놀로지스 인크.(STEMCELL Technologies Inc.), 캐나다 밴쿠버 BC) 중 2.0 x 10⁴개 세포/웰로 플레이팅하였다. 약 7일 후, 배양 배지를 (아미노프테린이 없는) 배지 E로 대체하였다.

10 내지 12일 후, 균질 HTRF 검정을 사용하여 개별 웰을 마우스 IgG/마우스 카파 경쇄 항체의 존재에 대해 스크리닝하였다. 이러한 검정에서, 96 웰 융합 플레이트로부터의 상청액을 맞춤 표지된 테르븀-크립테이트 염소 항-마우스 IgG (Fcγ 특이적) (시스바이오 유에스 인크.(Cisbio US Inc.) 매사추세츠주 베드포드) 및 알렉사플루오르 647로 표지된 염소 항-마우스 IgG Fab'2 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch); 카탈로그 # 109-605-098)와 혼합하였다. 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 루비스타 판독기 상에서 판독하였다. 이어서 마우스 IgG/마우스 카파 경쇄 항체에 대해 양성인 웰로부터의 하이브리도마 세포를 인간 CD40으로 형질감염된 CHO 세포 및 대조군으로서 CHO 비형질감염된 세포를 사용하여 FACS에 의해 (융합 3582/ 3583), 또는 재조합 단백질을 사용한 ELISA에 이어 음성 대조군으로서 Daudi B 세포 및 Jurkat T 세포에 대한 FACS에 의해 (융합 3716/3717) 스크리닝하였다. FACS 양성 모 계통을 24-웰 플레이트로 옮겼다. 수일 후, 개별 웰로부터의 세포 상청액을 FACS에 의해 재스크리닝하여 인간 CD40에 대한 IgG 특이성을 확인하였다.

한 패널의 항원 특이적 하이브리도마를 연속 희석에 의해 클로닝하고, CHO 형질감염체 또는 Daudi 세포를 사용한 FACS에 의해 재스크리닝하였다. 융합 3582/3583으로부터의 19종의 항체 및 융합 3716/3717로부터의 20종의 항체를 정제하고, 기능적 활성에 대해 시험하였다. 이러한 패널의 항체로부터, 제2 서브클로닝을 위한 5종의 강력한 효능제를 선택하였다. 이들 5종의 항체, 즉 1802.3582.19G3.F10.E1, 1802.3583.5G7.F12.G3, 1802.3583.8E8.C10.G2, 1802.3716.12D6.B1.E3, 및 1802.3717.5F11.A11.E7이 후속적으로 서열분석 및 추가의 분석에 제출되었다.

실시예 2

완전 인간 항-huCD40 항체의 생성

본원에 개시된 인간화 항-CD40 항체와 동일한 에피토프에 결합하고/거나 그의 결합을 교차-차단하는 완전 인간 항-huCD40 모노클로날 항체는 본 발명의 방법에서 용도를 발견할 수 있다. 이러한 항체는 하기와 같이, 인간 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성할 수 있다.

항원

huCD40 가용성 재조합 단백질을 면역화를 위한 항원으로서 사용하였다. 가용성 융합 단백질은 마우스 IgG2a Fc에 그의 C-말단에서 연결된 huCD40의 세포외 부분으로 구성된다. 이러한 융합 단백질은 본원에서 "huCD40-muFc 융합 단백질"로 지칭된다. 융합 단백질을 표준 재조합 DNA 방법에 의해 생성하였고, 이는 형질감염된 CHO 세포에서 발현되어 가용성 융합 단백질을 배양물 상청액으로 분비하였다. 형질감염에 사용된 CHO 숙주 세포는 인비트로젠 (Cat #11619-012)으로부터 입수하였다. 분비된 가용성 융합 단백질을 면역원으로 사용하기 위해 정제하였다. 신호 서열을 포함한 전장 인간 CD40의 서열이 서열식별번호: 1에 제공된다.

트랜스제닉 마우스

인간 CD40에 대한 완전 인간 모노클로날 항체는 CMD++;JKD++;KCo5(9272)+^;SC20+ 유전자형으로부터의 마우스 (이하 KM® 마우스로 불림)를 사용하여 제조하였다. 개개의 트랜스진 명칭이 괄호 안에 제시되고, 이어서 무작위로 통합된 트랜스진에 대한 라인 번호가 제시된다. 기호 ++ 및 +는 동형접합 또는 반접합을 나타내지만; 무작위로 통합된 인간 Ig 트랜스진에 대해 본 발명자들이 이형접합성과 동형접합성 사이를 구별하지 못하게 하는 PCR-기반 검정을 사용하여 마우스가 상용적으로 스크리닝되기 때문에, 실제로는 이들 요소에 대해 동형접합인 마우스에 대해 + 명칭이 주어질 수 있다. 이러한 계통에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자를 문헌 [Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820]에 기재된 바와 같이 동형접합적으로 파괴하고, 내인성 마우스 중쇄 유전자를 WO 2001/09187의 실시예 1에 기재된 바와 같이 동형접합적으로 파괴하였다. 게다가, 이러한 마우스 계통은 문헌 [Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 기재된 바와 같은 인간 카파 경쇄 트랜스진, KCo5, WO 2000/026373에 기재된 바와 같은 대부분의 인간 카파 경쇄 유전자좌를 보유하는 효모 인공 염색체 (YAC)를 보유한다.

마우스의 면역화

인간 CD40에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위해, KM 마우스를 정제된 huCD40-muFc 융합 단백질로 면역화하였다. 일반적 면역화 스킴은 문헌 [Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851] 및 WO 98/24884에 기재되어 있다. 마우스는 제1 항원 주입 시 대략 4개월령이었다. 정제된 재조합 huCD40-muFc 항원 제제 (융합 단백질을 발현하는 형질감염된 포유동물 세포로부터 정제된 10 μg) 또는 인간 CD40으로 형질감염된 300-19 세포를 사용하여 마우스를 복강내로 및 피하로 면역화하였다. 면역원을 RIBI 아주반트 (시그마 Cat#M6536)와 1:1 혼합하였다.

마우스를 5-7일 간격으로 5회 면역화하였다. 제1 및 제2 면역화는 재조합 단백질로 수행하였다. 제3 면역화는 세포로 행하고, 제4 면역화는 단백질로, 및 제5 면역화는 세포로 행하였다. 마지막 면역화 1주 후에 마우스에서 채혈하여 항원 특이적 역가를 평가하였다. 면역 반응은 안와후 채혈에 의해 모니터링하였다. 형질감염된 300-19 세포를 사용하여 FACS 분석에 의해 혈장을 스크리닝하고, 항-인간 CD40 인간 IgG에 대해 최대 역가를 갖는 마우스를 융합을 위해 사용하였다. 희생 및 비장 제거 2일 전에는 가용성 항원, 및 3일 전에는 형질감염된 세포의 정맥내 (IV) 및 복강내 (IP) 주사에 의해 마우스에게 최종 부스팅을 제공하였다.

인간 CD40에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성

높은 역가 KM 마우스로부터 단리된 마우스 비장세포 및 마우스 골수종 융합 파트너를 시토 펄스 대형 챔버 세포 융합 전기천공기 (시토 펄스 사이언시스, 인크.(Cyto Pulse Sciences, Inc.), 메릴랜드주 글렌 버니)를 사용하여 전기장 기반 전기융합에 의해 융합시켰다. 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단세포 현탁액을 동등 수의 P3X63 Ag8.6.53 (ATCC CRL 1580) 비-분비 마우스 골수종 세포와 융합시켰다 (융합 번호: 2541). 생성된 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에, 높은 글루코스 (셀그로(Cellgro) #10-013-CM) 및 10% 소 태아 혈청 (하이클론(Hyclone) #SH30071.03)을 함유하고 베타-메르캅토에탄올 (1000X, 깁코(Gibco) #21985-023), 7 mM HEPES (셀그로 25-060-Cl), 추가의 2 mM L-글루타민 (셀그로 25-005-Cl), HAT (50X, 시그마 #H-0262), 5% 하이브리도마 클로닝 인자 (바이오베리스(BioVeris) #210001), 10% P388DI (ATCC #CRL TIB-63) 조건화 배지 및 페니실린-스트렙토마이신 (100x, 셀그로 #30-002-CI)으로 보충된 선택적 DMEM 배지 중 2.0 x 10⁴개 세포/웰로 플레이팅하였다. 약 7일 후에, HAT를 함유하는 배지 중 일부를 HT (셀그로 #25-047-CI)를 함유하는 배지로 대체하였다.

10 내지 12일 후에, 균질 HTRF 검정을 사용하여 개별 웰을 인간 IgG/인간 카파 경쇄 항체의 존재에 대해 스크리닝하였다. 이러한 검정에서, 96 웰 융합 플레이트로부터의 상청액을 유로퓸-크립테이트 표지된 염소 항-인간 IgG (Fc 단편 특이적), 비오티닐화 염소 항-인간 카파 경쇄 (베틸(Bethyl) #A80-115B), 스트렙타비딘-엑스렌트(XLent)와 혼합하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 루비스타 판독기 상에서 판독하였다.

이어서 인간 IgG/인간 카파 경쇄 또는 인간 IgG/인간 람다 경쇄 항체에 대해 양성인 웰로부터의 하이브리도마 세포를 인간 CD40으로 형질감염된 300-19 세포 및 대조군으로서 300-19 비형질감염된 세포를 사용하여 FACS에 의해 스크리닝하였다. FACS 양성 모 계통을 24-웰 플레이트로 옮겼다. 수일 후, 개별 웰로부터의 세포 상청액을 FACS에 의해 재스크리닝하여 인간 CD40에 대한 IgG 특이성을 확인하였다.

하이브리도마를 연속 희석에 의해 클로닝하고 FACS에 의해 재스크리닝하였다.

실시예 3

항-huCD40 항체의 인간화

본 발명의 모 (뮤린) 항체를 인간 치료제로서의 잠재적 용도를 위해 인간화하였다. 각각의 마우스 가변 도메인에 대해 가장 가까운 매칭 인간 배선 영역 서열을 선택하고, 이들 인간 프레임워크 영역을 사용하여 뮤린 프레임워크를 항체의 "CDR 이식편" 버전으로 대체하였다. 이어서, 인간화 항체의 결합 친화도를 회복시키기 위해 필요에 따라 추가의 아미노산 치환, 예컨대 프레임워크 복귀-돌연변이를 행하였다. 서열 문제를 제거하기 위해 추가의 아미노산 치환을 행하였다. 본 발명의 항체의 다양한 형태 사이의 서열 관계가 표 6에 제공된다. 가용성 인간 CD40에 대한 다양한 효능작용 항-huCD40 항체의 결합은 포르테바이오 옥테트 레드 (신속 시스템 - 확대된 검출) 무표지 상호작용 분석 기기를 사용하여 생물층 간섭측정 (BLI) 분석에 의해 결정하였다. 모든 연구는 10 mM Na_xPO₄, 130 mM NaCl, 0.05% 계면활성제 P20 (pH 7.1) 중 25℃에서 수행하였다. 간략하게, 항-huCD40 항체 상청액 (10 μg/ml로 희석되거나, 또는 상청액 농도가 10 μg/ml 미만인 경우에는 비희석 포획됨)을 단백질 A 코팅된 바이오센서 (폴 포르테바이오(Pall Fortebio) #18-5010) 상에 90s의 로딩 시간 및 1000 rpm의 진탕 속도를 사용하여 포획시켰다. 상청액을 180s 회합 및 해리 시간을 사용하여 1000 rpm에서 1 μM 재조합 인간 CD40 단량체 (huCD40-단량체)에의 결합에 대해 제1 스크리닝하였고, 결합 사이클 사이에는 10 mM 글리신 pH 1.5를 사용하는 2개의 15s 조건화 단계가 존재하였다. 이어서 1 μM huCD40-단량체 실험에서 결합 신호가 입증된 모든 상청액을 3-배 연속 희석된 7종의 상이한 농도의 huCD40-단량체에 대한 결합에 대해 시험하였고, 여기서 최고 농도는 1 μM 스크리닝 실험에서의 결합 신호의 강도에 의존하여 10 μM huCD40-단량체 또는 1 μM huCD40-단량체였다. 선택된 항체 및 그의 서열 변이체에 대한 결과를 표 6에 제시한다.

표 6

항-CD40 항체의 결합 친화도

* = 비교 목적상, 모 5F11은 동일한 검정에서 5F11-45 항체와 병렬 실행한 경우에 (4.7nM 보다는) 8.2nM의 K_D를 나타내었음.

인간화 항체의 경우에, V_H 및 V_L 열은 프레임워크 영역의 기초가 되는 인간 가변 도메인 배선을 제공한다. "CDR 이식편"은 언급된 인간 프레임워크 서열에 직접 그라프팅된 비변형된 모 (마우스) CDR을 포함하는 가변 도메인을 지칭한다. 표 6에서의 모든 서열 변이체에 대한 잔기 넘버링은 카바트에 따르고, 따라서 표 6에서 서열 변화의 위치는 서열 목록의 항체 서열의 잔기 넘버링과 매칭되지 않는다. 밑줄표시는 생성물 불균질성으로 이어지는 잠재적 서열 문제를 교정하기 위해 의도되는 서열 변형, 즉 화학적으로 변형되고 잠재적으로 분해될 잔기를 나타내는데 사용되었다. 다른 서열 변형, 전형적으로 프레임워크 복귀 돌연변이 (인간 배선 프레임워크 서열로부터 원래 뮤린 프레임워크 잔기로의 복귀)가 친화도를 회복시키기 위해 의도된다. 항체 5G7의 중쇄에서의 M69L 변형은 프레임워크 복귀 돌연변이 및 문제 교정 둘 다이다.

실시예 4

항-CD40 항체 에피토프 비닝 실험

항-인간 CD40 항체가 huCD40에의 결합에 대해 어떠한 다른 것과 경쟁하고, 따라서 유사한 에피토프에 결합하는지 결정하기 위해, 에피토프 비닝 실험이 수행될 수 있다. 항-huCD40 항체 사이의 쌍별 경쟁은 하기와 같이 결정하였고, 여기서 참조 항체를 센서 칩의 표면에 결합시키고, 시험 항체를 혼합물 중에서 huCD40 폴리펩티드 구축물과 사전-인큐베이션하고, 사전-인큐베이션된 혼합물을 센서 칩 상에 유동시켜 huCD40 폴리펩티드 구축물이 칩 표면 상의 참조 항체에 결합하는 것을 시험 항체가 방해하는 정도를 결정하였다. 이러한 경쟁 실험은 비아코어® SPR 기기를 사용하여 수행할 수 있다. 간략하게, 참조 항-huCD40 항체를 센서 칩 CM5 칩 (시리즈 S, 지이 헬스케어(GE Healthcare) CAT# BR-1005-30) 표면, 플로우셀2, 플로우셀3 & 플로우셀4 상에 고정시키고 (5000 RU), 플로우셀1은 음성 대조군으로서 사용하였다. 시험 항체를 출발 농도에서 120 μg/mL (2X)로 희석하였다. 적정 곡선을 수득하기 위해 항체를 7개의 상이한 농도를 위해 완충제로 1:3 농도로 및 대조군 샘플 (0 μg/ml)로 희석함으로써 시험 항체의 일련의 희석물을 제조하였다. 각각의 항체 농도 시리즈를 2등분하였다. 농도 시리즈의 제1 절반에서, 40 nM (2X) 인간 CD40 항원 (예를 들어 huCD40/Fc)을 첨가하여 각각의 웰에서 최종 농도 시리즈 (60 μg/ml - 0.0 μg/ml) 및 20 nM의 최종 항원 농도를 만들었다. 농도 시리즈의 제2 절반에서는, 항원 대신, 완충제를 첨가하여 항체를 동일한 농도로 희석하고, 이 절반을 블랭크로서 처리하였다. 시험 항-CD40 항체 및 huCD40/Fc의 복합체를 2시간 동안 인큐베이션하였다. 40 μL 복합체를 참조 항체-코팅된 표면에 30 μL/분으로 주입하였다. 비아코어® T200 표면 플라즈몬 공명 기기를 사용하였고 구동 완충제는 HBE-EP, 지이 헬스케어 CAT# BR-1001-88, 여과, 탈기, 0.01M HEPES, pH7.4, 0.15 NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20이었다. 표면을 25 mM NaOH (주문 코드: BR-1003-58, 지이 헬스케어)로 5초 동안 100 μL/분으로 재생시켰다. 데이터를 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 분석하였고, 시험 항체의 농도를 상응하는 반응 단위에 대해 플롯팅하여 적정 곡선을 수득하였다.

본 발명의 항-CD40 항체에 대한 이러한 에피토프 비닝 실험의 결과를 도 2에 제공한다. 항체 5F11 및 8E8은 리간드 (CD40L) 결합을 차단한다. 본 발명의 5종의 항-CD40 항체는 3개의 에피토프 군 - 12D6/5G7/19G3, 5F11/5G7/19G3, 및 8E8에 속한다.

실시예 5

HDX에 의한 에피토프 맵핑

본 발명의 항-huCD40 항체 12D6, 5G7, 19G3 및 5F11에 대한 에피토프를 수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS)에 의해 결정하였다. HDX-MS는 백본 아미드 수소 원자의 중수소 교환율 및 그의 정도를 모니터링함으로써 용액 중 단백질 입체형태 및 입체형태적 역학을 조사한다. 문헌 [Huang & Chen (2014) Anal. Bioanalytical Chem. 406:6541; Wei et al. (2014) Drug Disc. Today 19:95]. HDX의 수준은 백본 아미드 수소 원자의 용매 접근성 및 단백질 수소 결합에 의존한다. HDX 시 단백질의 질량 증가는 MS에 의해 정확하게 측정될 수 있다. 이러한 기술이 효소적 소화와 쌍을 이루는 경우, 폴리펩티드 수준에서의 구조적 특색이 설명될 수 있고, 이는 표면 노출된 펩티드를 내부에 폴딩된 것 또는 단백질-단백질 복합체의 계면에 격리된 것과 구별가능하게 한다. 전형적으로, 중수소 표지 및 후속 켄칭 실험이 수행되고, 이어서 효소적 소화, 펩티드 분리, 및 MS 분석이 수행된다.

에피토프 맵핑 실험 전에, 재조합 인간 CD40 단량체 (10 μM), 및 CD40의 mAb 12D6, 5G7, 19G3, 및 5F11과의 단백질 복합체 (1:1 몰비)에 대한 공통 펩티드의 목록을 생성하기 위해 비-중수소화 실험을 수행하였다. HDX-MS 실험에서, 5 μL의 각각의 샘플 (CD40 또는 mAb 12D6, 5G7, 19G3, 및 5F11 각각과의 CD40)을 D₂O 완충제 (10 mM 포스페이트 완충제, D₂O, pH7.0) 55 μL 중에 희석시켜 표지 반응을 시작하였다. 반응을 상이한 시간 기간: 20초, 1분, 10분 및 240분 동안 수행하였다. 각각의 표지 반응 기간 말미에, 켄칭 완충제 (4M GdnCl 및 0.4M TCEP를 함유하는 100 mM 포스페이트 완충제, pH 2.5, 1:1, v/v)를 첨가하여 반응을 켄칭시키고, 50 μL의 켄칭된 샘플을 분석을 위해 워터스 HDX-MS 시스템에 주입하였다. 공통 소화 펩티드의 중수소 흡수 수준을 CD40 mAb의 부재/존재 하에 모니터링하였다. 수득된 서열 커버리지는 82%였다.

항-CD40 mAb 12D6, 5G7, 19G3, 및 5F11에 대한 HDX 에피토프를 표 7에 제공한다. 항체 12D6은 2개의 펩티드를 보호하였고, 그 중 1개 (잔기 11 - 28)는 신호 서열의 일부를 포함하여 그 자체로는 생리학상 관련이 없을 수 있지만, 12D6은 mAb 5G7 및 19G3에 의해서는 접촉되지 않는 영역 21 - 28에서 접촉하는 것으로 나타났다.

표 7

HDX 에피토프

실시예 6

효모 디스플레이에 의한 에피토프 맵핑

본 발명의 선택된 키메라 또는 인간화 항-huCD40 항체에 대한 에피토프는, 무작위 돌연변이유발된 huCD40 세포외 영역 변이체를 효모 상에 디스플레이하고, 이들 효모를 특정한 항체에 대한 그의 결합 실패에 기초하여 분류함으로써 결정하였다. 결합에 실패한 선택된 효모 세포를 증폭시키고, 본 발명의 항체의 특정한 키메라 또는 인간화 형태에 대한 그의 결합 불능에 기초하여 추가의 라운드의 선택에 적용하였다. 예를 들어, 문헌 [Chao et al. (2004) J. Mol. Biol. 342:539]을 참조한다. 생성된 효모에 대해 huCD40 변이체에 대한 서열을 결정하고 항체 결합에 대한 각각의 잔기의 효과에 대해 분석하였다. 본 발명의 항체에 대한 결합 에피토프는 단일 아미노산 돌연변이가 본 발명의 항-huCD40 항체에 대한 결합을 파괴하는 huCD40 서열 내의 유전자좌로서 결정되었다.

간략하게, 오류-유발 PCR을 사용하여 인간 CD40-코딩 DNA를, huCD40 변이체의 발현이 c-myc 태그 서열 및 효모 세포벽 단백질 Aga1p를 추가로 포함하는 융합 단백질의 아미노-말단 부분으로 되게 하는 구축물로 클로닝하였다. 이러한 구축물은, 효모 (사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae))에서 발현되는 경우에, 효모 세포의 표면에서 Aga1p 폴리펩티드에 의해 세포 표면에 고정된, 변이체 huCD40 폴리펩티드를 디스플레이한다. c-myc 태그는 주어진 효모 세포 상에서의 huCD40 융합 단백질의 디스플레이에 대한 양성 대조군으로서 임의로 사용될 수 있다. 효모 세포를 FACS에 의해 분류하고, 적절하게 폴딩된 huCD40 융합 단백질로서 발현되었지만 (알로피코시아닌 (APC)-표지된 염소 항-마우스 IgG 2차에 의해 검출되는 대조군 마우스 항-huCD40 항체의 결합에 의해 결정된 바와 같음), 본 발명의 항체에 결합하지 않은 (2차로서 피코에리트린 (PE) 표지된 염소 항-인간 IgG를 사용한 검출에 의해 결정된 바와 같음) 것을 풀링하고, 증폭시키고, 후속 라운드의 선택에 사용하였다. 여러 라운드의 선택 후에 남은 효모로부터의 구축물에 대해 huCD40 서열을 결정하였다. 항-huCD40 항체 선택이 부재하는 대조군 실험을 수행하여 huCD40 서열에 따라 각각의 위치에서의 양호한 돌연변이체 커버리지를 확인하였고, 선택된 라이브러리에 의해 수득된 결과를 정규화하기 위한 기준선을 제공하였다.

실시예 7

항-CD40 항체의 효능제 활성

본 발명의 선택된 항-CD40 항체의 효능제 활성에 대한 Fc 서열 변이의 효과를, 미성숙 수지상 세포 (DC)의 활성화를 측정함으로써 평가하였다. 실험은 인간 IgG1f (대조군), SE, SELF, P238D, V4, V8 및 V12 Fc 서열을 갖는 항-CD40 mAb 12D6-24 구축물을 사용하여 수행하였다. 인간 단핵구 (CD14⁺)를 건강한 정상 공여자로부터 플라스틱 부착 또는 인간 CD14-마이크로 비드 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 사용하여 단리하였다. 100 ng/mL GM-CSF (밀테니 바이오텍) 및 100 ng/mL IL-4 (밀테니 바이오텍)를 사용하여 단핵구를 배양하였다. 배지의 절반을 덜어내고 제2일 및 제5일에 보충하였다. 미성숙 수지상 세포를 제6일-제7일에 수거하였다. 2명의 공여자로부터의 DC를 표시된 농도의 항체와 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포 배양물 상청액을 수집하고, 인간-IL-6 생산에 대해 검정하였다 (시스바이오(Cisbio)). 도 3a 및 3b를 참조한다.

대조군 인간 IgG1f 항체는 최대 100 nM로 사용한 경우에 IL-6 분비를 유도하지 않았고, P238D 변이체는 단지 약하게 유도하였다. 대조적으로, SE, SELF, V9 및 V12 변이체는 모두 IL-6 분비를 현저하게 증진시켰고, V8 및 V4는 중간정도의 효과를 나타내었다. 이들 결과는 FcγRIIb에 대한 결합 친화도와 대략적으로 상관되었고, 적절한 Fc 서열 변이체의 사용이 증진된 효능제 활성을 갖는 항-CD40 항체를 발생시킬 수 있다는 것을 확인시켜주었다.

또한, 8E8, 5G7, 12D6, 19G3 및 5F11 가변 영역을 갖는 항체 사이에 효능제 활성에서의 차이를 공통 인간 IgG1f V12 불변 도메인을 갖는 키메라 항-CD40 mAb 구축물을 사용한 실험에서 평가하였다. 세포를 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, 표시된 바와 같은 항체를 첨가하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션함으로써, 활성화를 미성숙 수지상 세포에 대해 시험관내에서 (상기 단락에 기재된 바와 같이 단리됨) 측정하였다. 이어서 세포를 수거하고, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 검출되는 형광 항-CD54 항체로 염색하였다. 도 4를 참조한다.

대조군 인간 IgG1f 항체는 CD54 상향조절을 유의하게 유발하지 않은 반면에, 12D6은 현저한 CD54 상향조절을 유발하였다. 항체 19G3 및 8G8은 12D6보다 다소 덜 효과적이었고, 항체 5G7 및 5F11은 서로 유사하였고 상대적으로 낮은 자극을 나타내었다. 항체 5F11이 거의 최고의 결합 친화도를 가졌지만 약한 효능제인 반면에, 항체 19G3은 그 반대이므로, 활성화 결과는 CD40에 대한 결합 친화도와 반드시 상관되지는 않았다. 차이에 대한 이유와 관계없이, 이들 결과는 적절한 항원 결합 도메인 서열의 사용이 증진된 효능제 활성을 갖는 항-CD40 항체를 수득하는데 있어서 중요하다는 것을 확인시켜준다.

실시예 8

DG 이성질화의 복원

V4 및 V9 Fc 변이체 서열을 갖는 본 발명의 항체는 위치 D270에서 허용되지 않는 수준의 DG 이성질화를 나타내었다. 이러한 이성질화는 생성물 불균질성 및 잠재적으로 감소된 효능으로 이어지기 때문에 바람직하지 않다. 이러한 이성질화를 감소시키기 위해, V4 Fc의 위치 270에서의 아스파르트산 잔기를 글루탐산으로 변화시키고 (D270E), V9 Fc의 위치 270은 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 세린 및 트레오닌으로 변화시켰다 (D270A, D270E, D270Q, D270S, D270T). 이들 항체를 발현하는 세포로부터 상청액을 수득하여, hCD32/FcγRII에 대한 결합에 대해 검정하였다. 위치 270에서 돌연변이가 부재하는 선택된 정제된 항체를 대조군으로서 사용하였다. 이들 실험을 mAb 12D6-24 및 5F11-45로부터의 가변 도메인을 갖는 항체에 대해 수행하였다. 결과를 도 5에 제공한다.

V4 및 V9 Fc 변이체 둘 다의 경우에, D270E 치환은 수용체 결합에서 중간 정도의 감소로 이어졌다. 시험된 다른 V9 Fc 변이체 (D270A, D270Q, D270S, D270T)는 수용체 결합에서 보다 큰 감소로 이어졌다. 결과는 항체가 12D6인지 또는 5F11인지에 관계없었다. 모든 경우에서 시험된 3종의 수용체 (FcγRIIa-H131, FcγRIIa-R131, 및 FcγRIIb)에 대한 상대적 (순위) 결합은 유사하게 유지되었고, FcγRIIa-R131 및 FcγRIIb에 대한 결합은 대략 동등하고, FcγRIIa-H131에 대한 결합은 유의하게 더 약했다.

V4 및 V9 변이체 둘 다의 경우에, D270E 치환은 허용가능하게 높은 FcγR 친화도를 보유하였고, 본 발명의 항-CD40 항체의 효능작용 활성을 증진시키는데 바람직한 FcγRIIb에 대한 특이성을 유지하였다.

실시예 9

인간 CD40/인간 FcγR 트랜스제닉 마우스에서 항-CD40 활성

본 발명의 선택된 효능제 항-CD40 항체를 인간 CD40 및 인간 Fcγ 수용체 [CD40^-/-hCD40⁺ Fcgra^-/-Fcgr1^-/- hFCGRI⁺hFCGRIIA⁺hFCGRIIB⁺hFCGRIIIA⁺hFCGRIIIB⁺]에 대한 트랜스제닉 마우스에 투여하였다. 인간 Fcγ 수용체에 대한 트랜스제닉 마우스는 문헌 [Smith et al. (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 109(16):6181-6]에 기재되어 있다. 이러한 트랜스제닉 인간 CD40/FcγR 마우스는 인간 CD40 및 인간 FcγR에 필수적으로 결합하는, 잠재적 인간 치료 항-CD40 항체를 연구하는데 적합하다. 효능제 활성은 문헌 [Li & Ravetch (2011) Science 333:1030]에 기재된 "DEC-OVA" 모델에서 측정하였고, 혈소판 수준 또한 측정하였다. 결과를 도 6a 및 6b에 제시한다. 가장 큰 효능제 활성을 나타내는 항체, 예컨대 12D6-V11 및 더 낮은 정도의 12D6-V4는 또한 24시간에 혈소판 수에서 가장 큰 감소를 나타냈다. 혈소판 수에서의 감소는 일시적인 현상이었고, 수준은 주사후 7일까지는 정상으로 되돌아왔다 (데이터는 제시되지 않음).

12D6 항체가 CP-870,893과 유사하게, CD40L 결합 에피토프와 별개인 hCD40에 결합하는 것과 달리, 5F11 항체는 CD40L 결합 에피토프와 중첩되는 에피토프를 인식한다. 12D6 항체는 CP-870,893 결합을 차단하지만, 5F11 항체는 그렇지 않다 (데이터는 제시되지 않음). 시험관내 DC 활성화 검정이 12D6의 SE-Fc, 및 V11-Fc 변이체에 대해 유의한 활성을 입증한 반면, 12D6 Fc 변이체는 5F11 변이체에 비해 증진된 활성을 나타내었다. 12D6-Fc 변이체의 시험관내 활성이 야생형 IgG1보다 더 크지만, 시험관내 연구는 상이한 Fc 변이체의 활성을 구별하지 않는다. 따라서 본 발명자들은 인간화 CD40/인간 FcγR 마우스에서 이들 항체 및 그의 Fc 변이체의 활성을 평가하였다. 클론 CP-870,893에 대하여 관찰된 바와 같이, 이들 mAb의 선택적 FcγRIIB-증진된 V11 Fc 변이체는 그의 FcγRIIA/IIB-증진된 SE 변이체 및 야생형 IgG1 하위부류에 비해 우수한 생체내 활성을 나타내었다. 더욱이, 새롭게 개발된 12D6-V11의 생체내 활성의 크기는 CP-870,893 (IgG2)의 활성보다 약 20배 더 크다.

CD40 효능작용 Ab, 12D6-24 및 5F11-45의 항 종양 활성을 평가하였다. 각 클론의 야생형 IgG1, SE 및 V11 돌연변이체를 MC38 종양 모델에서 그의 활성에 대해 시험하였다. 이들 항체의 FcγRIIB-선택적 증진된 V11 변이체는 다른 시험된 Fc 변이체에 비해 우수한 항 종양 활성을 가지며, 이는 그의 생체내 T 세포 자극 활성 및 CP-870,893 유도체에서 관찰된 항 종양 활성 계층과 일치한다. 결과를 도 6c에 제시한다. 12D6-24 치료된 군으로부터의 무종양 마우스는 그의 CD40 Ab 치료 30일 후에 MC38 종양 세포로 재-시험접종되었다. 결과를 도 6d에 제시한다. 이 군의 모든 마우스는 재-시험접종 2주 내에 종양을 거부하였으며, 이는 장기 보호가 12D6-24의 단일 주사에 의해 매개된다는 것을 입증한다.

이들 데이터는 효능작용 인간 CD40 Ab의 항종양 활성이 FcγRIIB-결속의 선택적 증진을 제공하는 Fc 조작에 의해 증진될 수 있고 V11 Fc 변이체가 효능작용을 증진시키는 데 특히 효과적이라는 것을 나타낸다.

표 8

서열 목록의 개요

서열 목록은 성숙한 중쇄 및 경쇄의 서열을 제공한다 (즉 서열은 신호 펩티드를 포함하지 않음). 예를 들어 인간 세포에서, 본 발명의 항체의 생산을 위한 신호 서열은 서열식별번호: 78에 제공된다.

등가물:

관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용을 넘지 않는 실험을 사용하여 본원에 개시된 구체적 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나 또는 그를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> The Rockefeller University & Bristol-Myers Squibb Company <120> ANTIBODIES TO CD40 WITH ENHANCED AGONIST ACTIVITY <130> 036707.00300/RUBMS12724PCT/RU1281 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(277) <220> <221> DOMAIN <222> (21)..(193) <223> extracellular domain <220> <221> DOMAIN <222> (194)..(215) <223> transmembrane domain <220> <221> DOMAIN <222> (216)..(277) <223> intracellular domain <400> 1 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile 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68 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala 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constant domain <400> 71 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 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Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr 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variant of human IgG1f constant domain <400> 74 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Glu Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 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sapiens <400> 77 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu 1 5 10 15 Ala

Claims (22)

1. 인간 CD40에 특이적으로 결합하고, 교차-차단 검정에서 인간 CD40에의 결합에 대해 12D6 (서열식별번호: 3 및 4), 5F11 (서열식별번호: 23 및 24), 8E8 (서열식별번호: 40 및 41), 5G7 (서열식별번호: 52 및 53), 및 19G3 (서열식별번호: 58 및 59)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 중 1종 이상과 경쟁하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
2. 제1항에 있어서, 교차-차단 검정에서의 경쟁이 경쟁 ELISA에서 인간 CD40에 대한 선택된 항체의 결합을 선택된 항체와 동등한 몰 농도로 사용한 경우에 적어도 20%만큼 감소시키는 능력을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
3. a. 서열 EPPTACREKQYLINS (서열식별번호: 1의 잔기 21 - 35)를 포함하거나 또는 이로 이루어진 에피토프(항체 12D6, 5G7 및 19G3); 또는
   b. 서열 ECLPCGESE (서열식별번호: 1의 잔기 58 - 66)을 포함하거나 또는 이로 이루어진 에피토프(항체 5F11)
   에서 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
4. a) 뮤린 V 영역 배선 VH1-39_01 및 J 영역 배선 IGHJ4로부터 적어도 부분적으로 유래된 중쇄 CDR 서열 및
   뮤린 V 영역 배선 VK1-110_01 및 J 영역 배선 IGKJ1로부터 적어도 부분적으로 유래된 경쇄 CDR 서열 (12D6);
   b) 뮤린 V 영역 배선 VH1-4_02 및 J 영역 배선 IGHJ3으로부터 적어도 부분적으로 유래된 중쇄 CDR 서열 및
   뮤린 V 영역 배선 VK3-5_01 및 J 영역 배선 IGKJ5로부터 적어도 부분적으로 유래된 경쇄 CDR 서열 (5F11);
   c) 뮤린 V 영역 배선 VH1-80_01 및 J 영역 배선 IGHJ2로부터 적어도 부분적으로 유래된 중쇄 CDR 서열 및
   뮤린 V 영역 배선 VK1-110_01 및 J 영역 배선 IGKJ2로부터 적어도 부분적으로 유래된 경쇄 CDR 서열 (8E8);
   d) 뮤린 V 영역 배선 VH1-18_01 및 J 영역 배선 IGHJ4로부터 적어도 부분적으로 유래된 중쇄 CDR 서열 및
   뮤린 V 영역 배선 VK10-96_01 및 J 영역 배선 IGKJ2로부터 적어도 부분적으로 유래된 경쇄 CDR 서열 (5G7); 또는
   e) 뮤린 V 영역 배선 VH5-9-4_01 및 J 영역 배선 IGHJ3으로부터 적어도 부분적으로 유래된 중쇄 CDR 서열 및
   뮤린 V 영역 배선 VK1-117_01 및 J 영역 배선 IGKJ2로부터 적어도 부분적으로 유래된 경쇄 CDR 서열 (19G3)
   을 포함하는, 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
5. 제1항에 있어서,
   a) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 5의 잔기 31-35, 50-66 및 99-108을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 6의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 12D6-03의 CDR;
   b) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 7의 잔기 31-35, 50-66 및 99-108을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 9의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 12D6-22의 CDR;
   c) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 10의 잔기 31-35, 50-66 및 99-108을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 11의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 12D6-23의 CDR;
   d) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 12의 잔기 31-35, 50-66 및 99-108을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 9의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 12D6-24의 CDR;
   e) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 25의 잔기 31-35, 50-66 및 99-106을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 26의 잔기 24-38, 54-60 및 93-101을 포함하는 것인 항체 5F11-17의 CDR;
   f) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 27의 잔기 31-35, 50-66 및 99-106을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 28의 잔기 24-38, 54-60 및 93-101을 포함하는 것인 항체 5F11-23의 CDR;
   g) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 29의 잔기 31-35, 50-66 및 99-106을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 30의 잔기 24-38, 54-60 및 93-101을 포함하는 것인 항체 5F11-45의 CDR;
   h) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 42의 잔기 31-35, 50-66 및 99-111을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 43의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 8E8-56의 CDR;
   i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 44의 잔기 31-35, 50-66 및 99-111을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 45의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 8E8-62의 CDR;
   j) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 46의 잔기 31-35, 50-66 및 99-111을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 47의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 8E8-67의 CDR;
   k) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 48의 잔기 31-35, 50-66 및 99-111을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 49의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 8E8-70의 CDR;
   l) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 50의 잔기 31-35, 50-66 및 99-111을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 51의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 8E8-71의 CDR;
   m) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 54의 잔기 31-35, 50-66 및 99-102를 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 55의 잔기 24-34, 50-56 및 89-97을 포함하는 것인 항체 5G7-22의 CDR;
   n) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 56의 잔기 31-35, 50-66 및 99-102를 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 57의 잔기 24-34, 50-56 및 89-97을 포함하는 것인 항체 5G7-25의 CDR;
   o) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 60의 잔기 31-35, 50-66 및 99-101을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 62의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 19G3-11의 CDR; 및
   p) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 각각 서열식별번호: 63의 잔기 31-35, 50-66 및 99-101을 포함하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 각각 서열식별번호: 64의 잔기 24-39, 55-61 및 94-102를 포함하는 것인 항체 19G3-22의 CDR
   로 이루어진 군으로부터 선택되는, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 서열을 포함하는 중쇄 및 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
6. 제5항에 있어서,
   a) 각각 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6의 잔기 1-119 및 1-112를 포함하는 항체 12D6-03의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   b) 각각 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 9의 잔기 1-119 및 1-112를 포함하는 항체 12D6-22의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   c) 각각 서열식별번호: 10 및 서열식별번호: 11의 잔기 1-119 및 1-112를 포함하는 항체 12D6-23의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   d) 각각 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 9의 잔기 1-119 및 1-112를 포함하는 항체 12D6-24의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   e) 각각 서열식별번호: 25 및 서열식별번호: 26의 잔기 1-117 및 1-111을 포함하는 항체 5F11-17의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   f) 각각 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 28의 잔기 1-117 및 1-111을 포함하는 항체 5F11-23의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   g) 각각 서열식별번호: 29 및 서열식별번호: 30의 잔기 1-117 및 1-111을 포함하는 항체 5F11-45의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   h) 각각 서열식별번호: 42 및 서열식별번호: 43의 잔기 1-122 및 1-112를 포함하는 항체 8E8-56의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   i) 각각 서열식별번호: 44 및 서열식별번호: 45의 잔기 1-122 및 1-112를 포함하는 항체 8E8-62의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   j) 각각 서열식별번호: 46 및 서열식별번호: 47의 잔기 1-122 및 1-112를 포함하는 항체 8E8-67의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   k) 각각 서열식별번호: 45 및 서열식별번호: 49의 잔기 1-122 및 1-112를 포함하는 항체 8E8-70의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   l) 각각 서열식별번호: 50 및 서열식별번호: 51의 잔기 1-122 및 1-112를 포함하는 항체 8E8-71의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   m) 각각 서열식별번호: 54 및 서열식별번호: 55의 잔기 1-113 및 1-107을 포함하는 항체 5G7-22의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   n) 각각 서열식별번호: 56 및 서열식별번호: 57의 잔기 1-113 및 1-107을 포함하는 항체 5G7-25의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   o) 각각 서열식별번호: 60 및 서열식별번호: 62의 잔기 1-112 및 1-112를 포함하는 항체 19G3-11의 중쇄 및 경쇄 가변 영역;
   p) 각각 서열식별번호: 63 및 서열식별번호: 64의 잔기 1-112 및 1-112를 포함하는 항체 19G3-22의 중쇄 및 경쇄 가변 영역
   으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, FcγRIIb에 결합하는 특이성을 증진시키도록 변형된 Fc 영역을 추가로 포함하는 항체.
8. 제7항에 있어서, 5 미만의 A/I 비를 나타내는 항체.
9. 제8항에 있어서, 1 미만의 A/I 비를 나타내는 항체.
10. 제7항에 있어서, 변형된 Fc 영역이 SE (서열식별번호: 66), SELF (서열식별번호: 67), P238D (서열식별번호: 68), V4 (서열식별번호: 69), V4 D270E (서열식별번호: 70), V7 (서열식별번호: 71), V8 (서열식별번호: 72), V9 (서열식별번호: 73), V9 D270E (서열식별번호: 74), V11 (서열식별번호: 75) 및 V12 (서열식별번호: 76)로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역에 있는 것인 항체.
11. 제5항에 있어서,
    a) 각각 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 항체 12D6-24-P238D의 중쇄 및 경쇄;
    b) 각각 서열식별번호: 14 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 항체 12D6-24-SE의 중쇄 및 경쇄;
    c) 각각 서열식별번호: 15 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 항체 12D6-24-SELF의 중쇄 및 경쇄;
    d) 각각 서열식별번호: 16 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 항체 12D6-24-V4의 중쇄 및 경쇄;
    e) 각각 서열식별번호: 17 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 항체 12D6-24-V4 D270E의 중쇄 및 경쇄;
    f) 각각 서열식별번호: 18 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 항체 12D6-24-V8의 중쇄 및 경쇄;
    g) 각각 서열식별번호: 19 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 항체 12D6-24-V9의 중쇄 및 경쇄;
    h) 각각 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 항체 12D6-24-V9 D270E의 중쇄 및 경쇄;
    i) 각각 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 항체 12D6-24-V11의 중쇄 및 경쇄;
    j) 각각 서열식별번호: 22 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 항체 12D6-24-V12의 중쇄 및 경쇄;
    k) 각각 서열식별번호: 31 및 서열식별번호: 30의 서열을 포함하는 항체 5F11-45-SE의 중쇄 및 경쇄;
    l) 각각 서열식별번호: 32 및 서열식별번호: 30의 서열을 포함하는 항체 5F11-45-SELF의 중쇄 및 경쇄;
    m) 각각 서열식별번호: 33 및 서열식별번호: 30의 서열을 포함하는 항체 5F11-45-V4의 중쇄 및 경쇄;
    n) 각각 서열식별번호: 34 및 서열식별번호: 30의 서열을 포함하는 항체 5F11-45-V4 D270E의 중쇄 및 경쇄;
    o) 각각 서열식별번호: 35 및 서열식별번호: 30의 서열을 포함하는 항체 5F11-45 V8의 중쇄 및 경쇄;
    p) 각각 서열식별번호: 36 및 서열식별번호: 30의 서열을 포함하는 항체 5F11-45-V9의 중쇄 및 경쇄;
    q) 각각 서열식별번호: 37 및 서열식별번호: 30의 서열을 포함하는 항체 5F11-45-V9 D270E의 중쇄 및 경쇄;
    r) 각각 서열식별번호: 38 및 서열식별번호: 30의 서열을 포함하는 항체 5F11-45-V11의 중쇄 및 경쇄;
    s) 각각 서열식별번호: 39 및 서열식별번호: 30의 서열을 포함하는 항체 5F11-45-V12의 중쇄 및 경쇄
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 항체.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산.
13. 제12항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
14. 제13항의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
15. a) 제14항의 세포에서 항-인간 CD40 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 발현시키는 것; 및
    b) 세포로부터 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 단리하는 것
    을 포함하는, 항-인간 CD40 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제조하는 방법.
16. a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분; 및
    b) 담체
    를 포함하는 제약 조성물.
17. 제16항의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 대상체가 종양을 갖고, 종양에 대한 면역 반응이 자극되는 것인 방법.
19. 제17항에 있어서, 대상체가 만성 바이러스 감염을 갖고, 바이러스 감염에 대한 면역 반응이 자극되는 것인 방법.
20. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제16항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 자궁/자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 식도암, 위장암, 췌장암, 결장직장암, 결장암, 신장암, 두경부암, 폐암, 위암, 배세포암, 골암, 간암, 갑상선암, 피부암, 중추 신경계의 신생물, 림프종, 백혈병, 골수종, 육종, 및 바이러스-관련 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
22. 만성 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제16항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 만성 바이러스 감염을 치료하는 방법.

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