JP5551477B2 - 光源装置およびレーザ走査型顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、光源装置およびレーザ走査型顕微鏡装置に関するものである。

従来、フェムト秒パルスレーザを利用したＣＡＲＳ（コヒーレントアンチストークスラマン散乱）システムが知られている（例えば、非特許文献１および特許文献１参照。）。
非特許文献１のシステムは、ポンプ光としてフェムト秒レーザ光源からのパルスレーザ光を狭帯域化した光を使用し、ストークス光としてフェムト秒レーザ光源からのパルスレーザ光をフォトニッククリスタルファイバによって波長変換した光を使用し、２つの光を合波して標本に入射させ、標本中の分子の特定の振動を利用して、分子からＣＡＲＳ光を発生させ、これを検出して観察を行うものである。

特許文献１のシステムは、フェムト秒レーザ光源からのパルスレーザ光を分岐し、一方のパルスレーザ光のみをフォトニッククリスタルファイバによって波長変換した後に、各々のパルスレーザ光を周波数分散させることで周波数差を有するポンプ光とストークス光とを生成し、分子からのＣＡＲＳ光を検出して観察を行うものである。

これらのＣＡＲＳシステムによれば、ポンプ光とストークス光とを合波したパルスレーザ光を標本に入射させることにより、ＣＡＲＳ光画像を得ることができるとともに、同じパルスレーザ光によって標本の多光子蛍光画像を得ることができる。

加納、「応用物理７５（６）」，ｐ．６８２，２００６

米国特許出願公開第２００９／０２９０１５０号明細書

しかしながら、非特許文献１および特許文献１のシステムにおけるＣＡＲＳシステムの光源装置をそのまま利用して標本の多光子蛍光観察を同時に行う場合には、得られる多光子蛍光画像が暗く、鮮明な多光子蛍光観察を行うことができないという不都合がある。
すなわち、非特許文献１のシステムは、ポンプ光を狭帯域化してパワーを削減してしまっているとともに、ストークス光は波長変換によってパワー密度を低下させてしまっているので、十分な蛍光量を得ることができない。また、特許文献１のシステムは、ポンプ光およびストークス光ともに周波数分散させているので、パワー密度が低下しており、同様にして十分な蛍光量を得ることができず鮮明な多光子蛍光観察を行うことができない。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、コントラストの高いＣＡＲＳ光画像を取得すると同時に、明るい多光子蛍光画像を取得することを可能にする光源装置およびレーザ走査型顕微鏡装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられた前記パルスレーザ光から、所定の周波数差を有する２つのパルスレーザ光を生成し、生成された２つのパルスレーザ光を合波して走査型顕微鏡に入力する第１の光路と、前記レーザ光源から発せられた前記パルスレーザ光をそのまま前記走査型顕微鏡に入力する第２の光路と、これら第１の光路と第２の光路とを合流させる合波部と、前記走査型顕微鏡の走査周期に同期して、前記レーザ光源からの前記パルスレーザ光を前記第１の光路または第２の光路に時分割に切り替えて入射させる光路切替部とを備える光源装置を提供する。

本発明によれば、光路切替部の作動により、レーザ光源から発せられたパルスレーザ光を第１の光路に入射させると、入射されたパルスレーザ光から所定の周波数差を有する２つパルスレーザ光が生成され、これらのパルスレーザ光が合波された状態で走査型顕微鏡に入射される。一方のパルスレーザ光をポンプ光とし、他方のパルスレーザ光をストークス光として用いることにより、標本においてＣＡＲＳ光を発生させ、コントラストの高いＣＡＲＳ光画像を得ることができる。

一方、光路切替部の作動により、レーザ光源から発せられたパルスレーザ光を第２の光路に入射させると、入射されたパルスレーザ光はそのまま走査型顕微鏡に入射され、標本において多光子励起効果による多光子蛍光が発生する。パルスレーザ光は分散あるいは狭帯域化されることなく走査型顕微鏡に入射されるので、十分な光子密度のパルスレーザ光を標本内に集光して明るい多光子蛍光画像を取得することができる。

そして、光路切替部は走査型顕微鏡の走査周期に同期してパルスレーザ光を入射させる光路を切り替えるので、コントラストの高いＣＡＲＳ画像と明るい多光子蛍光画像とを同時に取得することが可能となる。すなわち、光路切替部による光路の切り替えを走査型顕微鏡による１フレーム分の走査周期ごとに行うことにより、フレームシーケンシャルにＣＡＲＳ画像と多光子蛍光画像とを得ることができる。また、光路切替部による光路の切り替えを走査型顕微鏡による１走査線分の走査周期ごとに行うことにより、より同時性の高いＣＡＲＳ光画像と多光子蛍光画像とを得ることができる。

上記発明においては、前記光路切替部が、ガルバノミラーを備えていてもよい。
このようにすることで、光路の切り替えを簡易な構成で光速に行うことができる。

また、本発明の第１の参考例は、パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられた前記パルスレーザ光を２つの光路に分岐する分波部と、該分波部により分岐された一方の光路に設けられ、前記パルスレーザ光を狭帯域化する狭帯域化機構または周波数分散させる分散調整機構と、前記分波部により分岐された他方の光路に設けられ、前記パルスレーザ光の波長を変換する波長変換部と、前記分波部により分岐されたいずれかの光路に設けられ、これら光路を通過する前記パルスレーザ光相互の光学遅延を調節する遅延調節部と、２つの光路を通過してきた前記パルスレーザ光を合波して走査型顕微鏡に入力する合波部とを備え、前記分波部が、２つの光路への前記パルスレーザ光の分岐比率を、前記走査型顕微鏡の走査周期に同期して調節可能である光源装置を提供する。

上記第１の参考例によれば、レーザ光源から発せられたパルスレーザ光が、分波部によって２つの光路に分岐される。一方の光路に分岐されたパルスレーザ光は、狭帯域化機構によって狭帯域化あるいは分散調整機構によって周波数分散され、他方の光路に分岐されたパルスレーザ光は波長変換部によって波長変換される。そして、２つのパルスレーザ光が遅延調節部によって、相互間の光学遅延を調節された状態で合波部により合波されて、走査型顕微鏡に入射される。一方のパルスレーザ光をポンプ光とし、他方のパルスレーザ光をストークス光として用いることにより、標本においてＣＡＲＳ光を発生させ、コントラストの高いＣＡＲＳ光画像を得ることができる。

この場合に、分波部が２つの光路へのパルス光の分岐比率を調節するので、２つの光路へのパルスレーザ光の分岐比率を所定の比率に設定することで、適正なポンプ光とストークス光とを生成してコントラストの高いＣＡＲＳ光画像を得ることができる。また、分岐比率を調節して一方の光路に入射させるパルスレーザ光の光量を増加させることにより、標本に集光させるパルスレーザ光の絶対量を増大させて明るい多光子蛍光画像を得ることができる。分岐比率の切り替えを走査型顕微鏡の走査周期に同期して行うことにより、同時性の高いＣＡＲＳ光画像と多光子蛍光画像とを取得することができる。

上記第１の参考例においては、前記分波部が、電気光学変調器と偏光ビームスプリッタとを組み合わせたもの、または、音響光学変調器であってもよい。
このようにすることで、電気光学変調器に加える電圧を調節することにより、偏光ビームスプリッタに入射させるパルスレーザ光の偏光方向を変化させ、偏光ビームスプリッタによる分岐比率を変化させることができる。また、音響光学変調器に入射させる音響波を変化させることで、０次光と回折光との比率を変化させ、簡易に分岐比率を調節することができる。機械的な切り替えを行わずに済み、高速に分岐比率を切り替えて、より同時性の高いＣＡＲＳ光画像と多光子蛍光画像とを取得することができる。

また、本発明の第２の参考例は、パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられた前記パルスレーザ光を２つの光路に分岐する分波部と、該分波部により分岐された一方の光路に設けられた音響光学チューナブルフィルタと、前記分波部により分岐された他方の光路に設けられた音響光学変調器および前記パルスレーザ光の波長を変換する波長変換部と、前記分波部により分岐されたいずれかの光路に設けられ、これら光路を通過する前記パルスレーザ光相互の光学遅延を調節する遅延調節部と、２つの光路を通過してきた前記パルスレーザ光を合波して走査型顕微鏡に入力する合波部と、前記走査型顕微鏡の走査周期に同期して、前記音響光学チューナブルフィルタを狭帯域化させる変調信号と、広帯域化させる変調信号とを切り替え、前記音響光学チューナブルフィルタを広帯域化させているときに、前記音響光学変調器を遮断する変調信号に設定する制御部とを備える光源装置を提供する。

上記第２の参考例によれば、レーザ光源から発せられたパルスレーザ光が、分波部によって２つの光路に分岐される。一方の光路に分岐されたパルスレーザ光は、音響光学チューナブルフィルタに単一周波数の変調信号を付与することにより、適正なパワーに変調された形態でそのまま導光され、多重周波数の変調信号を付与することにより、さらに狭帯域化された形態で同行される。他方の光路に分岐されたパルスレーザ光は音響光学変調器によって出力が変調されるとともに波長変換部によって波長が変換されて導光される。

ＣＡＲＳ光観察を行う際には、音響光学チューナブルフィルタに多重周波数の変調信号を入射させて、パルスレーザ光を狭帯域化するとともに、音響光学変調器をＯＮ状態に設定して他の光路に入射されたパルス光を波長変換部に入射させ、２つの光路を通過するパルスレーザ光に所定の周波数差を設定する。これにより、一方の光路を通過したパルスレーザ光をポンプ光とし、他方のパルスレーザ光をストークス光として、２つのパルスレーザ光が遅延調節部によって、相互間の光学遅延を調節された状態で合波部により合波されて、走査型顕微鏡に入射されることにより、標本においてＣＡＲＳ光を発生させることができる。この場合に、ポンプ光とストークス光との比率を適正に調節して、コントラストの高いＣＡＲＳ光画像を得ることができる。

一方、多光子蛍光観察を行う際には、音響光学チューナブルフィルタに単一周波数の変調信号を入射させて、出力調整されたパルスレーザ光をそのまま導光させ、音響光学変調器をＯＦＦ状態に設定して、他の光路に入射したパルスレーザ光を遮断する。これにより、狭帯域化されることなく導かれたパルスレーザ光をそのまま標本に入射させ、また、周波数分散されたストークス光を遮断すので、標本中に集光するパルスレーザ光の光子密度を向上して明るい多光子蛍光画像を得ることができる。この場合においても、機械的な切り替えを行わずに済み、高速にパルスレーザ光を切り替えて、より同時性の高いＣＡＲＳ光画像と多光子蛍光画像とを取得することができる。

また、本発明の第３の参考例は、パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられた前記パルスレーザ光を２つの光路に分岐する分波部と、該分波部により分岐された一方の光路に設けられ、前記パルスレーザ光を狭帯域化する狭帯域化機構または周波数分散させる分散調整機構と、前記分波部により分岐された他方の光路に設けられ、前記パルスレーザ光の波長を変換する波長変換部と、前記分波部により分岐されたいずれかの光路に設けられ、これら光路を通過する前記パルスレーザ光相互の光学遅延を調節する遅延調節部と、２つの光路を通過してきた前記パルスレーザ光を合波して走査型顕微鏡に入力する合波部と、前記分波部と前記合波部との間に、前記狭帯域化機構または分散調整機構を迂回し、前記狭帯域化機構または前記分散調整機構を通過する光路とは光路長が異なる迂回光路とを備える光源装置を提供する。

上記第３の参考例によれば、分波部によって一方の光路に分岐されたパルスレーザ光が狭帯域化機構によって狭帯域化させられ、あるいは分散調整機構によって周波数分散させられることにより、ストークス光となり、他方の光路に分岐されたパルスレーザ光が波長変換部によって波長変換されることによりストークス光となる。そして光学遅延部によって相互間の光学遅延を調節された状態で合波部において合波され、走査型顕微鏡に導入されることで、標本においてコントラストの高いＣＡＲＳ光画像を取得することができる。

一方、上記光路のうち、狭帯域化機構または分散調整機構を有する光路に分岐された一部のパルスレーザ光は、狭帯域化機構または分散調整機構を迂回する迂回光路に入射されることにより、そのままの形態で走査型顕微鏡に入力される。迂回光路は狭帯域化機構または分散調整機構を有する光路とは光路長が異ならされているので、ポンプ光に対して時間的にずれたパルスレーザ光として走査型顕微鏡に入射される。これにより、ＣＡＲＳ光と多光子蛍光とが時間的に分離されて発生することになり、コントラストの高いＣＡＲＳ光画像と、明るく鮮明な多光子蛍光画像とをより高い同時性を保ちながら取得することができる。
また、本発明は、上記いずれかの光源装置と、該光源装置からのパルスレーザ光を入射させる走査型顕微鏡とを備えるレーザ走査型顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、コントラストの高いＣＡＲＳ光画像を取得すると同時に、明るい多光子蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係る光源装置およびレーザ走査型顕微鏡装置を示すブロック図である。 本発明の第２の実施形態に係る光源装置およびレーザ走査型顕微鏡装置を示すブロック図である。 本発明の第３の実施形態に係る光源装置およびレーザ走査型顕微鏡装置を示すブロック図である。 本発明の第４の実施形態に係る光源装置およびレーザ走査型顕微鏡装置を示すブロック図である。 本発明の第５の実施形態に係る光源装置およびレーザ走査型顕微鏡装置を示すブロック図である。

本発明の第１の実施形態に係る光源装置およびレーザ走査型顕微鏡装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡装置１は、図１に示されるように、本実施形態に係る光源装置２と、該光源装置２からのパルスレーザ光を入射させ標本Ａを観察するための走査型顕微鏡３とを備えている。

本実施形態に係る光源装置２は、フェムト秒パルスレーザ光Ｌを出射する単一のレーザ光源４と、該レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光Ｌから一定の周波数差を有する２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を生成する第１の光路５と、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光Ｌをそのまま通過させる第２の光路６と、これらの光路５，６を合流させる合波部７と、レーザ光源４からこれらの光路５，６へのフェムト秒パルスレーザ光Ｌの入射を切り替える光路切替部８とを備えている。

第１の光路５は、レーザ光源４からのパルスレーザ光Ｌを２つに分岐するビームスプリッタ（分波部）９と、該ビームスプリッタ９により分岐された２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２をそれぞれ通過させる２つの光路１０，１１と、該２つの光路１０，１１を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を合波する導入光学系１２とを備えている。

一方の光路１０には、パルスレーザ光Ｌ１に周波数分散を付与する分散調整ガラス１４が配置され、ポンプ光Ｌ１’（以下、ポンプ光Ｌ１’とも言う。）を生成するようになっている。他方の光路１１には、フォトニッククリスタルファイバ１５および分散調整ガラス１６が配置され、ストークス光Ｌ２’（以下、ストークスＬ２’とも言う。）を生成するようになっている。

分散調整ガラス１４，１６は、通過したパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２に所定の周波数分散を付与するようになっている。
フォトニッククリスタルファイバ１５は、通過するパルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を変更または拡大させることができる。また、フォトニッククリスタルファイバ１５を通過したパルスレーザ光Ｌ２はフォトニッククリスタルファイバ１５の種類および通過させるパルスレーザ光Ｌ２の条件に応じた周波数分散を持った状態となっている。また、例えば、周波数変換手段としては、フォトニッククリスタルファイバ１５の代わりに、同様の機能・作用を持つ、バルク、薄膜、フィルム、フォトニック結晶構造体のいずれかを用いてもよい。

また、合波部７は、ポンプ光Ｌ１’を生成する一方の光路１０の分散調整ガラス１４の後段に配置された偏光ビームスプリッタである。この合波部７は、分散調整ガラス１４を通過したパルスレーザ光Ｌ１’を透過させるように透過軸が設定されているとともに、後述する第２の光路６を通過してきたパルスレーザ光Ｌを反射して、前記光路１０を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１’と合波するようになっている。

導入光学系１２には、２つの光路１０，１１を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’相互間に時間遅延を付与するパルスタイミング調節手段１７と、これらのパルスレーザ光Ｌ，Ｌ１’，Ｌ２’を合波させるレーザコンバイナ１８とを備えている。パルスタイミング調節手段１７は、例えば、ミラー（リフレクタ）により構成される（図示略）。少なくとも２組以上のリフレクタを用いて、例えば、パルスレーザ光Ｌ２’の光路を折り返し、少なくとも２組以上のリフレクタの間隔を調節することで、パルスレーザ光Ｌ２’の光路長を変化させることができる。これによって、パルスレーザ光Ｌ２’のパルスの時間的タイミングをパルスレーザ光Ｌ１’に対してずらし、その時間遅延量を調節することができるようになっている。

第２の光路６は、レーザ光源４からのパルスレーザ光Ｌをそのまま導光し、第１の光路５の内、ポンプ光Ｌ１’を生成する一方の光路１０に、分散調整ガラス１４の後段において、偏光ビームスプリッタからなる合波部７により合流されている。第２の光路６には、λ／２板１９が配置され、第２の光路６を導光されてきたパルスレーザ光Ｌが合波部７によって全て反射されるように、合波部７に入射する際の偏光方向を設定することができるようになっている。

光路切替部８は、所定の軸線回りに揺動可能に設けられたガルバノミラー２０と、該ガルバノミラー２０の揺動を制御する制御部２１とを備えている。ガルバノミラー２０は、揺動角度位置を異なる２つの角度位置に切り替えることにより、レーザ光源４からのパルスレーザ光Ｌを第１の光路５または第２の光路６のいずれかに択一的に入射させることができるようになっている。

制御部２１は、後述する走査型顕微鏡３のスキャナ２２によるパルスレーザ光Ｌ，Ｌ１’，Ｌ２’の走査周期と同期してガルバノミラー２０に対し、揺動角の切替指令信号Ｓを出力するようになっている。
例えば、走査型顕微鏡３のスキャナ２２によりパルスレーザ光Ｌ，Ｌ１’，Ｌ２’が、標本Ａ上において１フレーム分走査される毎に、制御部２１がガルバノミラー２０の揺動角度の切替指令信号Ｓを出力することにより、フレームシーケンシャルにＣＡＲＳ光画像と多光子蛍光画像とを切り替えて取得することができる。

また、走査型顕微鏡３のスキャナ２２によるパルスレーザ光Ｌ，Ｌ１’，Ｌ２’が、標本Ａ上において１ライン分走査される毎に、制御部２１がガルバノミラー２０の揺動角度の切替指令信号Ｓを出力することにより、ラインシーケンシャルにＣＡＲＳ光画像と多光子蛍光画像とを切り替えて取得することができるようになっている。フレームシーケンシャルに切り替える場合と比較してラインシーケンシャルに切り替えた方が、ＣＡＲＳ光画像と多光子蛍光画像とのより高い同時性を達成することができる。

走査型顕微鏡３は、光源装置２から入射されてきたパルスレーザ光Ｌ，Ｌ１’，Ｌ２’を２次元的に走査するスキャナ２２およびレンズ群２３と、スキャナ２２により走査されたパルスレーザ光Ｌ，Ｌ１’，Ｌ２’を標本Ａに集光する集光レンズ２４と、標本Ａにおいて発生し、集光レンズ２４によって集光された蛍光を検出する第１の光検出器２５と、標本Ａを透過する方向に発生するＣＡＲＳ光を集光する集光レンズ２６と、該集光レンズ２６により集光されたＣＡＲＳ光を検出する第２の光検出器２７とを備えている。

図中、符号２８はダイクロイックミラー、符号２９はステージ、符号３０はミラーである。また、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ２６により集光され第２の光検出器２７で検出されてもよい。また、標本Ａにおいて発生したＣＡＲＳ光は集光レンズ２４によって集光され第１の光検出器２５によって検出されてもよい。

このように構成された本実施形態に係る光源装置２およびレーザ走査型顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る光源装置２によれば、レーザ光源４から発せられたパルスレーザ光Ｌが、光路切替部８の作動によって第１の光路５または第２の光路６に入射される。第１の光路５に入射されたパルスレーザ光Ｌは、ビームスプリッタ９によって２つの光路１０，１１に分岐され、一方が分散調整ガラス１４によって所定の周波数分散が与えられてポンプ光Ｌ１’となり、他方がフォトニッククリスタルファイバ１５によって周波数帯域を変化させられるとともに分散調整ガラス１６によって周波数分散が付与されてストークス光Ｌ２’となる。

そして、ポンプ光Ｌ１’は合波部７を透過して導入光学系１２のレーザコンバイナ１８に入射される。一方、ストークス光Ｌ２’は導入光学系１２に入射され、導光光学系１２内のパルスタイミング調整手段１７によって、ポンプ光Ｌ１’に対するタイミングを調整された後、レーザコンバイナ１８によって同一光路に合波されて走査型顕微鏡３に入射される。

一方、第２の光路６に入射されたパルスレーザ光Ｌは、λ／２板１９を通過することによって偏光方向を調整された後に合波部７に入射されることにより反射され、ポンプ光Ｌ１’と同一光路に入射される。

第１の光路５を通過したパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’が走査型顕微鏡３に入射されると、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’がスキャナ２２によって２次元的に走査され、レンズ群２３および集光レンズ２４によって標本Ａ上に集光され、２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差に応じて、標本Ａの集光位置においてＣＡＲＳ光が発生し、発生したＣＡＲＳ光が集光レンズ２６によって集光され、第２の光検出器２７により検出される。

また、第２の光路６を通過したパルスレーザ光Ｌが走査型顕微鏡３に入射されると、パルスレーザ光Ｌがスキャナ２２によって２次元的に走査され、レンズ群２３および集光レンズ２４によって標本Ａ上に集光されることによって、集光位置において多光子励起効果により蛍光が発生し、発生した蛍光が集光レンズ２４によって集光され、ダイクロイックミラー２８によってパルスレーザ光Ｌの光路から分岐されて第１の光検出器２５により検出される。

この場合において、本実施形態に係る光源装置２およびレーザ走査型顕微鏡装置１によれば、走査型顕微鏡３のスキャナ２２の走査周期に同期して制御部２１が光路切替部８を作動させるので、フレームシーケンシャルに、あるいは、ラインシーケンシャルにＣＡＲＳ光画像および多光子蛍光画像を取得することができる。そして、このとき得られるＣＡＲＳ光画像と多光子蛍光画像とは、相互に影響を与えることなく、コントラストの高いＣＡＲＳ光画像と明るい多光子蛍光画像とを同時に得ることができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、ポンプ光Ｌ１’およびストークス光Ｌ２’として、パルスレーザ光Ｌを分散調整ガラス１４，１６に透過させることにより周波数分散を付与したものを使用する周波数分散量調整ＣＡＲＳの場合を例に挙げて説明したが、これに代えて、２つの光路１０，１１における分散調整ガラス１４，１６をなくし、ポンプ光Ｌ１’の光路１０にパルスレーザ光Ｌを狭帯域化する狭帯域化機構（図示略）を配置した場合に適用することにしてもよい。

次に、本発明の第２の実施形態に係る光源装置４０およびレーザ走査型顕微鏡装置４１について図２を参照して説明する。
本実施形態に係る光源装置４０およびレーザ走査型顕微鏡装置４１の説明において、上述した第１の実施形態に係る光源装置２およびレーザ走査型顕微鏡装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る光源装置４０は、図２に示されるように、第１の実施形態に係る光源装置２における第２の光路６を第１の光路５の２つの光路１０，１１のうちのポンプ光Ｌ１’の光路１０と共通化し、分波部４２が、ポンプ光Ｌ１’の光路１０に入射するパルスレーザ光Ｌの入射量を切り替えるように構成されている。

すなわち、本実施形態に係る光源装置４０は、分波部４２として、ビームスプリッタ９に代えて、電気光学変調器４３と偏光ビームスプリッタ４４とを用いている。電気光学変調器４３は入射する電圧信号を調節することにより、パルスレーザ光Ｌの偏光方向を切り替えて、偏光ビームスプリッタ４４による分岐比率を変化させることができるようになっている。

また、電気光学変調器４３は、スキャナ２２の走査周期に同期して制御部２１から出力される切替指令信号Ｓによって入射する電圧信号を調節するようになっている。さらに、電気光学変調器４３はレーザ光源４から出力されるパルスレーザ光Ｌの波長に応じて入射する電圧信号Ｔを調節するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る光源装置４０およびレーザ走査型顕微鏡装置４１によれば、走査型顕微鏡３のスキャナ２２の走査周期に同期して制御部２１から出力される切替指令信号Ｓによって、電気光学変調器４３に入射される電圧信号が切り替えられるので、スキャナ２２の走査周期に同期して、偏光ビームスプリッタ４４に入射されるパルスレーザ光Ｌの偏光方向が切り替えられ、ポンプ光Ｌ１’の光路１０とストークス光Ｌ２’の光路１１へのパルスレーザ光Ｌの分岐比率が切り替えられる。

例えば、ポンプ光Ｌ１’の光路１０への分岐比率を７０％、ストークス光Ｌ２’の光路１１への分岐比率を３０％とすることにより、一定の周波数差を有するパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’が合波された状態で走査型顕微鏡３に入射され、標本ＡのＣＡＲＳ光画像を取得することができる。また、ポンプ光Ｌ１’の光路１０への分岐比率を１００％、ストークス光Ｌ２’の光路１１への分岐比率を０％とすることにより、ポンプ光Ｌ１’の光量を増大させて、標本Ａにおける明るい多光子蛍光画像を取得することが可能となる。

このように、本実施形態に係る光源装置４０によれば、走査型顕微鏡３に入射させるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を電気光学変調器４３により切り替えるので、機械的な駆動系を設ける必要がなく、高速に切り替えることができるという利点がある。その結果、高速に駆動されるスキャナ２２を有する走査型顕微鏡３においてもＣＡＲＳ光画像の取得と多光子蛍光画像の取得とを高速に切り替えて、２種類の観察の同時性を向上することができるという利点がある。
なお、本実施形態においても、周波数分散量調整ＣＡＲＳの場合を例示して説明したが、これに代えて、２つの光路１０，１１における分散調整ガラス１４，１６をなくし、ポンプ光Ｌ１‘の光路１０にパルスレーザ光Ｌを狭帯域化する狭帯域化機構（図示略）を配置した場合に適用することにしてもよい。

次に、本発明の第３の実施形態に係る光源装置５０およびレーザ走査型顕微鏡装置５１について、図３を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る光源装置５０の説明において、上述した第２の実施形態に係る光源装置４０と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る光源装置５０は、図３に示されるように、第２の実施形態に係る光源装置４０の電気光学変調器４３および偏光ビームスプリッタ４４の組み合わせに代えて、音響光学変調器５２を採用している。
音響光学変調器５２は、入力する変調信号を切り替えることで、音響光学結晶中において回折により発生する回折光の比率を切り替えることができるようになっている。本実施形態においては、音響光学変調器５２を透過する０次光の射出方向にポンプ光Ｌ１’の光路１０を配置し、回折により射出される回折光の射出方向にストークス光Ｌ２’の光路１１を配置している。

例えば、変調信号を０％とすることで、ポンプ光Ｌ１’の光路１０のみ０次光からなるパルスレーザ光Ｌ１を入射させ、ストークス光Ｌ２’の光路１１への回折光からなるパルスレーザ光Ｌ２の入射を停止することができる。また、変調信号を３０％とすることで、ポンプ光Ｌ１’の光路１０に７０％のパルスレーザ光Ｌ１を入射させ、ストークス光Ｌ２’の光路１１に３０％の回折光からなるパルスレーザ光Ｌ２を入射させることができる。

これにより、標本ＡにおけるＣＡＲＳ光の発生と多光子蛍光の発生を、機械的な駆動系を設けることなく高速に切り替えて、２種類の観察を同時に行うことができる。
この場合においても、多光子蛍光観察の場合に、ストークス光Ｌ２’を発生させないので、十分な光量のパルスレーザ光Ｌ１’を標本Ａに入射させて明るい多光子蛍光画像を得ることができるという利点がある。また、ＣＡＲＳ光観察の場合には、適正な比率のポンプ光Ｌ１’とストークス光Ｌ２’とを発生させて、コントラストの高いＣＡＲＳ光画像を得ることができる。
また、本実施形態においても、周波数分散量調整ＣＡＲＳの場合を例示して説明したが、これに代えて、２つの光路１０，１１における分散調整ガラス１４，１６をなくし、ポンプ光Ｌ１‘の光路１０にパルスレーザ光Ｌを狭帯域化する狭帯域化機構（図示略）を配置した場合に適用することにしてもよい。

次に、本発明の第４の実施形態に係る光源装置６０およびレーザ走査型顕微鏡装置６１について、図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る光源装置６０の説明において、上述した第２の実施形態に係る光源装置４０と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る光源装置６０は、図４に示されるように、第２の実施形態に係る光源装置４０の電気光学変調器４３および偏光ビームスプリッタ４４の組み合わせに代えて、ビームスプリッタ９による２つの光路１０，１１への分岐後に、ポンプ光Ｌ１’の光路１０に音響光学チューナブルフィルタ６２を配置し、ストークス光Ｌ２’の光路１１に音響光学変調器６３を配置するとともに、両光路１０，１１における分散調整ガラス１４，１６を取り除いている点において第２の実施形態に係る光源装置と相違している。

本実施形態に係る光源装置６０においては、走査型顕微鏡３のスキャナ２２の走査周期に同期した切替指令信号Ｓが、制御部２１から、音響光学チューナブルフィルタ６２および音響光学変調器６３にそれぞれ出力されている。
音響光学チューナブルフィルタ６２は、異なる所定の周波数の変調信号を入力することによって、出力するパルスレーザ光Ｌ１’の出力変調または狭帯域化を実施することができる。また、これらの周波数の変調信号を多重化して同時に入力することにより、出力変調と狭帯域化を同時に実施することができるようになっている。
また、音響光学変調器６３は、所定の周波数の変調信号を入力することによって、パルスレーザ光Ｌ２’の出力のオンオフを切り替えることができるようになっている。

このように構成された本実施形態によれば、制御部２１の作動により、スキャナ２２の走査周期に同期して、音響光学変調器６３をオフ状態とするとともに、音響光学チューナブルフィルタ６２に単一の周波数の変調信号を入力することによって、音響光学チューナブルフィルタ６２に出力変調のみを実施させることにより、レーザ光源４から出射されたパルスレーザ光Ｌ１に対して出力変調のみを施して走査型顕微鏡３に入射させることができる。これにより、分散を伴わない光子密度の高いパルスレーザ光Ｌ１’によって明るい多光子蛍光画像を得ることができる。

また、出力変調によって、パルスレーザ光Ｌ１’の出力を適正な値に調節して標本Ａにおけるダメージの発生を抑制することができる。
この場合において、上述した第２および第３の実施形態に係る光源装置４０，５０およびレーザ走査型顕微鏡装置４１，５１と比較して、多光子蛍光観察時に、パルスレーザ光Ｌ１’の狭帯域化や周波数分散を行わないので、出力損失がほとんどなく、明るい多光子蛍光画像を得ることができるという利点がある。
また、本実施形態においても、標本ＡにおけるＣＡＲＳ光の発生と多光子蛍光の発生を、機械的な駆動系を設けることなく高速に切り替えて、２種類の観察を同時に行うことができる。

また、制御部２１の作動により、スキャナ２２の走査周期に同期して、音響光学変調器６３をオン状態としてストークス光Ｌ２’を生成させるとともに、音響光学チューナブルフィルタ６２に多重周波数の変調信号を入力することによって、音響光学チューナブルフィルタ６２に出力変調および狭帯域化を実施させてポンプ光Ｌ１’を生成させることにより、標本ＡにおいてＣＡＲＳ光を発生させて、コントラストの高いＣＡＲＳ光画像を取得することができる。

次に、本発明の第５の実施形態に係る光源装置７０およびレーザ走査型顕微鏡装置７１について、図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る光源装置７０の説明において、上述した第２の実施形態に係る光源装置４０と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る光源装置７０は、第２の実施形態における電気光学変調器４３および偏光ビームスプリッタ４４に代えて、ビームスプリッタ９を配置するとともに、ビームスプリッタ９によって分岐されたポンプ光Ｌ１’の光路１０に配置された分散調整ガラス１４を迂回する迂回光路７２をさらに設けている点で第２の実施形態に係る光源装置４０と相違している。図中符号７３，７４は、パルスレーザ光Ｌ１の偏光方向を調整するλ／２板である。

迂回光路７２は、ポンプ光Ｌ１’の光路１０の分散調整ガラス１４を挟んで配置された２つの偏光ビームスプリッタ７５，７６により形成される光路であって、複数のミラー３０によって光路を折り返すことにより、分散調整ガラス１４を通過する光路１０と比較して光路長を長く（あるいは短く）設定している。
これにより、分散調整ガラス１４を通過したポンプ光Ｌ１’と迂回光路７２を通過したパルスレーザ光Ｌ１とが偏光ビームスプリッタ７６によって合波される際に、２つの光路１０，７２を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１．Ｌ１’が互いに重複しないように時間的にずらされるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る光源装置７０によれば、ビームスプリッタ９によってポンプ光Ｌ１’の光路１０に入射されたパルスレーザ光Ｌ１は、λ／２板７３によって、その偏光方向を調節されて偏光ビームスプリッタ７５に入射されることにより、所定の分岐比率で分岐され、一方が分散調整ガラス１４によって周波数分散を付与されてポンプ光Ｌ１’となり、他方が、迂回光路７２を通過させられて時間遅延を付与される。そして、迂回光路７２のパルスレーザ光Ｌ１がλ／２板７４によってその偏光方向を調節されて偏光ビームスプリッタ７６によりポンプ光Ｌ１’と合波される。
その後、光路１０を通過したポンプ光Ｌ１’および迂回光路７２を通過したパルスレーザ光Ｌ１と、光路１１を通過したストークス光Ｌ２’とがレーザコンバイナ１８によって合波された状態で走査型顕微鏡３に入射される。

すなわち、２つの光路１０，１１によって生成されたポンプ光Ｌ１’とストークス光Ｌ２’とによって標本ＡにおいてＣＡＲＳ光を発生させることができるとともに、ポンプ光Ｌ１’に対して時間的に遅延させられたパルスレーザ光Ｌ１によって標本Ａにおいて多光子蛍光を発生させることができる。ＣＡＲＳ光の発生と多光子蛍光の発生とは、パルスレーザ光Ｌ１に時間遅延を付与することにより時間的にずらされているので、相互に干渉させることなく別個独立に行わせることができる。

迂回光路７２を通過したパルスレーザ光Ｌ１は分散調整ガラス１４を通過しないので周波数分散を付与されず、標本Ａ中の集光点における光子密度を向上して明るい多光子蛍光画像を得ることができる。これにより、コントラストの高いＣＡＲＳ光画像と明るい多光子蛍光画像とを同時に取得することができる。
また、本実施形態においても、周波数分散量調整ＣＡＲＳの場合を例示して説明したが、これに代えて、２つの光路１０，１１における分散調整ガラス１４，１６をなくし、ポンプ光Ｌ１‘の光路１０にパルスレーザ光Ｌを狭帯域化する狭帯域化機構（図示略）を配置した場合に適用することにしてもよい。

なお、本発明は、上述した実施形態に限定されず、発明の主旨に基づいて種々の変更が可能である。例えば、上述した例では、検出すべき標本からの検出光（ＣＡＲＳ光や蛍光等）を取得するための照射光として単一の波長を用いた例で示したが、検出する標本の種類や目的に応じて他種類の波長を照射光として使用するようにするとともに、異なる波長に切り替えたり、併用することで多様な検出を行うようにしてもよい。これにより、例えば、上述した非特許文献１に開示されるようなマルチプレックスＣＡＲＳに適用した場合でもマルチモダルな検出が可能になるという利点がある。

Ｌ，Ｌ１，Ｌ２ パルスレーザ光
Ｌ１’ ポンプ光（パルスレーザ光）
Ｌ２’ ストークス光（パルスレーザ光）
１，４１，５１，６１，７１ レーザ顕微鏡装置。
２，４０，５０，６０，７０ 光源装置
３ 走査型顕微鏡
４ レーザ光源
５ 第１の光路
６ 第２の光路
７ 合波部
８ 光路切替部
１０，１１ 光路
１４，１６ 分散調整ガラス（分散調整機構）
１５ フォトニッククリスタルファイバ（波長変換部）
１７ パルスタイミング調節手段（遅延調節部）
２０ ガルバノミラー
４２ 分波部
４３ 電気光学変調器
４４ 偏光ビームスプリッタ
５２ 音響光学変調器
６２ 音響光学チューナブルフィルタ
６３ 音響光学変調器
７２ 迂回光路

Claims (3)

1. パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、
   該レーザ光源から発せられた前記パルスレーザ光から、所定の周波数差を有する２つのパルスレーザ光を生成し、生成された２つのパルスレーザ光を合波して走査型顕微鏡に入力する第１の光路と、
   前記レーザ光源から発せられた前記パルスレーザ光をそのまま前記走査型顕微鏡に入力する第２の光路と、
   これら第１の光路と第２の光路とを合流させる合波部と、
   前記走査型顕微鏡の走査周期に同期して、前記レーザ光源からの前記パルスレーザ光を前記第１の光路または第２の光路に時分割に切り替えて入射させる光路切替部とを備える光源装置。
2. 前記光路切替部が、ガルバノミラーを備える請求項１に記載の光源装置。
3. 請求項１又は請求項２記載の光源装置と、
   該光源装置からのパルスレーザ光を入射させる走査型顕微鏡とを備えるレーザ走査型顕微鏡装置。

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