JP5307353B2 - 多光子励起レーザ走査型顕微鏡および多光子励起蛍光画像取得方法 - Google Patents

Description

本発明は、多光子励起レーザ走査型顕微鏡に関するものである。

従来、多光子励起現象を利用して試料の深さ方向に高い分解能を有する明るい蛍光画像を取得する多光子励起型の顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特許文献１の多光子励起型の顕微鏡装置においては、試料において多光子励起により発生した蛍光を複数のミラーやレンズなどの光学素子を経由させることによる損失によって、光検出器により検出される蛍光が微弱なものとなってしまう不都合を防止するために、対物レンズとダイクロイックミラーのみを透過した位置に光検出器を配置している。このようにすることで、蛍光の損失を低減し、明るい多光子励起蛍光画像を取得することができる。

特開２００６−３５２１号公報

しかしながら、試料において発生し、全方向に放射される蛍光のうち、対物レンズによって集光される蛍光は、対物レンズの開口数によって制限されてしまうので、対物レンズの開口数を大きくできない場合には、発生した蛍光を効率よく検出することができないという不都合がある。特に、電気生理実験等に使用される場合には、試料の観察位置近傍にパッチクランプなどの針を刺すことが多いため、その障害とならないように対物レンズの先端の角度を広くすることができず、その結果、開口数の大きい対物レンズを使用することができない。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、試料において多光子励起により発生した蛍光を効率よく集めてより明るい多光子励起蛍光画像を取得することができる多光子励起レーザ走査型顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、超短パルスレーザ光を出射する多光子励起用レーザ光源と、該多光子励起用レーザ光源から出射された超短パルスレーザ光を２次元的に走査する光走査部と、該光走査部により走査された超短パルスレーザ光を試料に集光する対物レンズと、前記試料を挟んで前記対物レンズと対向する位置に配置され、前記試料において多光子励起により発生する蛍光を集光する集光レンズと、該集光レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器とを備え、前記集光レンズの開口数および視野数が、前記対物レンズの開口数および視野数より大きい多光子励起レーザ走査型顕微鏡を提供する。

本発明によれば、多光子励起用レーザ光源から出射された超短パルスレーザ光が、光走査部により２次元的に走査され、対物レンズを介して試料に集光されることにより、その集光位置において多光子励起現象が発生し、蛍光が発生する。発生した蛍光の内、試料を透過した蛍光が集光レンズにより集光され、光検出器により検出される。これにより、光検出器によって検出された蛍光の強度と、光走査部による超短パルスレーザ光の走査位置とに基づいて、多光子励起蛍光画像を生成することができる。

この場合において、蛍光を集光する集光レンズは、対物レンズよりも大きな開口数および視野数を有しているので、対物レンズにより集光する場合と比較して、より効率よく蛍光を集めることができる。特に、視野数が大きいことにより、厚く散乱の生じ易い試料において、散乱した蛍光を効率よく取り込むことが可能となり、明るい多光子励起蛍光画像を取得することができる。

上記発明においては、前記光検出器がサイドオンタイプの光電子増倍管であることとしてもよい。
このようにすることで、高い感度で、微弱な蛍光まで漏れなく検出することができる。

また、上記発明においては、前記集光レンズにより集光された蛍光を波長毎に分離する光路分割素子を備え、前記光検出器が、前記光路分割素子により分割された異なる波長の蛍光をそれぞれ検出するように複数備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、複数の蛍光色素により多重染色した場合等において、試料から発生する複数の波長の蛍光をそれぞれ検出して同時観察を行うことができる。

また、上記発明においては、前記集光レンズと前記光検出器との間に、２以上の励起光カットフィルタが光軸方向に間隔をあけて配置されていることとしてもよい。
このようにすることで、励起光カットフィルタにより、試料を透過してくる超短パルスレーザ光が光検出器に入射されないように遮断することができる。１枚の励起光カットフィルタによって遮断されることなく漏れた超短パルスレーザ光を、間隔をあけて配置されている他の励起光カットフィルタによって遮断することができる。

また、上記発明においては、前記励起光カットフィルタの間に吸収フィルタが配置されていることとしてもよい。
このようにすることで、２枚の励起光カットフィルタの間に配置された吸収フィルタによって、２枚の励起光カットフィルタの間で発生する繰り返し反射を減衰させ、光検出器への超短パルスレーザ光の漏洩をより効果的に低減することができる。

また、上記発明においては、前記集光レンズを介して試料に照射する透過照明光を発生する透過照明光源を備え、前記集光レンズと光検出器との間の光路に、前記集光レンズから光検出器への光路と、前記透過照明光源から集光レンズへの光路とを切り替えるミラーが挿脱可能に設けられていることとしてもよい。

このようにすることで、集光レンズと光検出器との間の光路にミラーを挿脱して、簡易に２つの光路を切り替えて、多光子励起蛍光観察と、それ以外の透過観察とを行うことができる。透過観察が選択された場合には、透過照明光源から集光レンズを介して透過照明光が試料に照射され、試料を透過した光を対物レンズによって集光し、観察することができる。また、ミラーを光路に対して４５°傾斜させた状態で挿入することで、光路を９０°折り返すことができる。集光レンズの光軸に沿う方向にスペースが少ない場合に、光路を折り返して光検出器を含む光学系の設置スペースを確保することができる。

また、上記発明においては、前記集光レンズと前記光検出器との間に、該光検出器を前記集光レンズの瞳位置と共役な位置関係にする瞳リレー光学系を備えることとしてもよい。
このようにすることで、瞳リレー光学系により集光レンズの瞳面を光検出器に投影させることができ、試料において超短パルスレーザ光を走査させても、光検出器においては常に同じ位置で蛍光を受光することができる。その結果、光検出器の受光面の感度ムラによる検出光量の変動を防止し、明るさムラのない多光子励起蛍光画像を取得することができる。

また、上記発明においては、前記集光レンズと前記光検出器とが一体的に移動可能に設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、集光レンズを多光子励起観察用の光検出器に対して最適な位置に調節された状態に維持することができる。

また、上記発明においては、前記集光レンズおよび光検出器が、前記対物レンズの光軸方向に移動可能に設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、集光レンズの焦点位置調整を行う都度に、集光レンズと光検出器との位置調整を行う必要がなく、観察時にかかる手間を省くことができる。

また、上記発明においては、前記集光レンズおよび光検出器が、前記対物レンズの光軸に直交する方向に移動可能に設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、集光レンズの光軸位置調整を行う都度に、集光レンズと光検出器との位置調整を行う必要がなく、観察時にかかる手間を省くことができる。

また、上記発明においては、前記対物レンズを介して試料に照射する落射照明光を発生する落射照明光源を備え、該落射照明光源からの落射照明光を試料に照射する際に、前記光検出器による検出光量を低減する検出光量低減手段とを備えることとしてもよい。
このようにすることで、落射照明光源からの落射照明光を試料に照射する際には、検出光量低減手段を作動させて、光検出器による検出光量を低減させ、強い落射照明光を受光してしまうことによる光検出器の劣化を防止することができる。検出光量低減手段としては、集光レンズと光検出器との間の光路を開閉するシャッタや、光検出器への印加電圧を低減する電圧調整部や、光検出器への光路から他の光路へ切り替える切替ミラーを採用することができる。

また、上記発明においては、前記集光レンズが、試料との間をオイルで満たすことが可能な液浸タイプであることとしてもよい。
このようにすることで、試料と集光レンズとの間に満たされたオイルによって集光レンズ側におけるより高い開口数を達成することができる。

また、上記発明においては、前記光検出器が、前記集光レンズの光軸の延長線上に配置されていることとしてもよい。
このようにすることで、折り返しミラーのように損失を発生する不要な光学素子を排除し、シンプルな構成によって効率よく蛍光を集めることができる。

また、上記発明においては、前記光検出器が２次元的なアレイ状に配列された複数の光検出部を備えることとしてもよい。
このようにすることで、高開口数かつ高視野数の集光レンズによって集められた蛍光を大きな光束のままで広い範囲に配列された光検出部により検出することができる。したがって、光検出器を集光レンズに近接して配置することができ、集光レンズ側のコンパクト化を図ることができるとともに、瞳リレーレンズ等のレンズを排除して、損失を低減し、より明るい多光子励起蛍光画像を取得することができる。
本発明は、多光子励起用レーザ光源から出射された超短パルスレーザ光を２次元的に走査しながら試料の内部に対物レンズにより集光させ、この集光位置において多光子励起により発生する蛍光を、前記試料を挟んで前記対物レンズと対向する位置に配置した集光レンズにより集光して光検出器により検出し画像取得する多光子励起蛍光画像取得方法であって、前記集光レンズの開口数および視野数が、前記対物レンズの開口数および視野数より大きいことを特徴とする多光子励起蛍光画像取得方法を提供する。
上記発明においては、前記対物レンズを介して試料に落射照明光を照射して落射照明観察を行う場合に、前記光検出器による検出光量を低減することができる。
上記発明においては、前記試料のパッチクランプ実験に用いる針を前記対物レンズと同じ側から試料に刺すようにすることができる。

本発明によれば、試料において発生した蛍光を効率よく集めてより明るい多光子励起蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る多光子励起レーザ走査型顕微鏡１について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る多光子励起レーザ走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、２種類の多光子励起蛍光観察、共焦点蛍光観察および透過照明観察を行うことができる顕微鏡であって、試料Ａを載置するステージ２の上方に、超短パルスレーザ光および連続レーザ光を出射するレーザ光源３と、該レーザ光源３から出射されるレーザ光を２次元的に走査するスキャナ（光走査部）４と、走査されたレーザ光を集光する瞳投影レンズ５および結像レンズ６と、結像レンズ６により集光されたレーザ光を集光して試料Ａに照射する対物レンズ７とを備えている。

また、多光子励起レーザ走査型顕微鏡１は、ステージ２の上方に、試料Ａにおいて発生し、対物レンズ７、結像レンズ６、瞳投影レンズ５およびスキャナ４を介して戻る蛍光をレーザ光から分岐するダイクロイックミラー８と、分岐された蛍光を集光する共焦点レンズ９と、該共焦点レンズ９の焦点位置近傍に配置された共焦点ピンホール１０と、該共焦点ピンホール１０を通過した蛍光を検出する光検出器１１とを備えている。

さらに、多光子励起レーザ走査型顕微鏡１は、ステージ２の上方に、試料Ａにおける超短パルスレーザ光の集光位置から発生し、対物レンズ７により集光された蛍光を超短パルスレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー１２と、分岐された蛍光を集光する結像レンズ１３と、結像レンズ１３により集光された蛍光に含まれる超短パルスレーザ光を遮断する励起光カットフィルタ１４と、蛍光を集光する集光レンズ１５と、集光された蛍光を検出する光検出器１６とを備えている。

図中、符号１７は、後述する透過照明光源１８からの照明光による透過観察時に使用される接眼レンズ、符号２０は、接眼レンズ１７による透過観察時に光路から離脱させられるミラーである。また、前記ダイクロイックミラー１２も透過観察時には光路から離脱させられるようになっている。

また、本実施形態に係る多光子励起レーザ走査型顕微鏡１は、ステージ２の下方に、試料Ａを挟んで前記対物レンズ７に対向する位置に配置された集光レンズ２１と、集光レンズ２１により集められた蛍光を検出する多光子用透過検出ユニット２２と、集光レンズ２１を介して試料Ａの下方から透過照明光を入射させる透過照明光源１８、ミラー２３および窓レンズ２４を備えている。

前記集光レンズ２１は、図２に示されるように、前記対物レンズ７よりも大きな開口数および視野数を有している。
また、前記多光子用透過検出ユニット２２は、集光レンズ２１により集光された蛍光を９０°折り返すミラー２５と、結像レンズ２６と、励起光カットフィルタ２７および吸収フィルタ２８と、シャッタ２９と、蛍光を波長毎に分岐するダイクロイックミラー３０と、集光レンズ３１と、２つの光検出器３２とを備えている。

前記ミラー２５は、光路に挿脱可能に設けられ、光路に挿入されたときに、集光レンズ２１により集光された蛍光を反射して、光検出器３２への光路に指向させるようになっている。一方、ミラー２５が光路から離脱させられたときには、透過照明光源１８からミラー２３および窓レンズ２４を介して導かれてきた透過照明光を集光レンズ２１に入射させる光路に切り替えられるようになっている。

また、前記励起光カットフィルタ２７は、光軸方向に間隔をあけて２枚設けられ、その間に吸収フィルタ２８が配置されている。これにより、２枚の励起光カットフィルタ２７により、超短パルスレーザ光をより効果的に遮断することができるとともに、間に配置された吸収フィルタ２８によって励起光カットフィルタ２７間における繰り返し反射が減衰され、さらに効果的に超短パルスレーザ光が光検出器３２側に漏洩するのを防止することができるようになっている。

また、前記シャッタ２９は、試料Ａに超短パルスレーザ光が入射され、試料Ａの下方に発生する蛍光を集光レンズ２１により集光する場合のみ開放され、それ以外の場合には遮断されるようになっている。
また、前記光検出器３２は、いずれもサイドオンタイプの光電子増倍管であり、高い感度で蛍光を検出することができるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る多光子励起レーザ走査型顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る多光子励起レーザ走査型顕微鏡１を用いて多光子励起蛍光観察を行うには、レーザ光源３から出射された超短パルスレーザ光をスキャナ４によって２次元的に走査し、瞳投影レンズ５、結像レンズ６および対物レンズ７を介して試料Ａに集光させる。試料Ａにおいては、超短パルスレーザ光の集光位置において蛍光が発生する。

試料Ａにおいて発生し、ステージ２の下方に発せられた蛍光は、集光レンズ２１によって集光され、ミラー２５によって９０°偏向された後に、結像レンズ２６によって集光され、励起光カットフィルタ２７および吸収フィルタ２８によって超短パルスレーザ光を除去される。そして、ダイクロイックミラー３０によって波長毎に分離された後に、光検出器３２によってそれぞれ検出される。光検出器３２により検出された蛍光の強度と、該蛍光が発生したときのスキャナ４による走査位置とに基づいて、２次元的な多光子励起蛍光画像を波長毎に生成することができる。

この場合において、本実施形態に係る多光子励起レーザ走査型顕微鏡１によれば、図２に示されるように、集光レンズ２１の開口数および視野数が対物レンズ７のそれより大きいので、より多くの蛍光を集光することができ、より明るい多光子励起蛍光画像を取得することができる。
すなわち、多光子励起蛍光観察の場合、超短パルスレーザ光を集光させる各走査位置および深さを精度よく達成するために、対物レンズ７には精密な光学性能が要求されるが、発生した蛍光の検出においては、精密な光学性能は必ずしも必要ではなく、むしろ可能な限り多くの光量を検出することが要求される。

したがって、検出側の集光レンズ２１として、対物レンズ７より開口数および視野数が大きなレンズを採用することにより、超短パルスレーザ光の集光位置において全方向に発生した蛍光のうちのより多くの部分を集光することができる。特に、視野数を大きくすることにより、比較的厚く散乱の大きな脳スライス標本のような試料Ａを観察する場合に、散乱によって視野範囲内に戻る蛍光をも効率的に集光することができるという利点がある。

また、パッチクランプのように、試料Ａの観察位置近傍に刺す針Ｓを対物レンズ７との干渉を発生させることなく配置するために、対物レンズ７としては、その口径を抑えたものを採用する場合でも、鮮明な多光子励起蛍光画像を取得することができる。

また、本実施形態に係る多光子励起レーザ走査型顕微鏡１によれば、集光レンズ２１によって集光された蛍光が、結像レンズ２６および集光レンズ３１によって光検出器３２まで導かれる際に、集光レンズ２１の瞳位置が光検出器３２の受光面に投影される。その結果、スキャナ４によって超短パルスレーザ光の集光位置を走査させても、光検出器３２は常に同一の位置で蛍光を受光することができる。すなわち、光検出器３２の受光面における感度ムラが存在しても、その影響を受けることなく、明るさムラのない多光子励起蛍光画像を取得することができる。

また、光検出器３２としてサイドオンタイプの光電子増倍管を採用しているので、感度が高く、明るい多光子励起蛍光画像を取得することができる。
また、励起光カットフィルタ２７を間隔をあけて２枚設け、その間に吸収フィルタ２８を配置したので、比較的大きな光量の超短パルスレーザ光が入射される透過側の光路においても、超短パルスレーザ光を効果的に遮断して、光検出器３２に入射するのを防止することができる。

また、試料Ａに超短パルスレーザ光が入射され、試料Ａの下方に発生する蛍光を集光レンズ２１により集光する場合のみ開放され、それ以外の場合には遮断されるシャッタ２９が配置されているので、光検出器３２がアクティブな状態において検出レンジを越える強い光が入射することが防止され、光検出器３２の劣化を防止することができる。

また、試料Ａにおいて発生し、ステージ２の上方に発せられた蛍光は、対物レンズ７によって集光され、ダイクロイックミラー１２によって超短パルスレーザ光から分離されて結像レンズ１３、ミラー２０、励起光カットフィルタ１４および集光レンズ１５を介して光検出器１６により検出される。対物レンズ７によって蛍光を集光するので、前記多光子用透過検出ユニット２２の場合と比較して、効率的に蛍光を集めることはできないが、超短パルスレーザ光の集光位置が試料Ａの上面側に近い場合には、比較的明るい多光子励起蛍光画像を取得することができる。この場合には、シャッタ２９が閉じられているので、蛍光が光検出器３２に入射されるのが防止される。

また、試料Ａの共焦点観察を行う場合には、レーザ光源３から連続レーザ光を出射し、スキャナ４において走査した連続レーザ光を瞳投影レンズ５、結像レンズ６および対物レンズ７を介して試料Ａに集光し、試料Ａにおいて発生し、対物レンズ７、結像レンズ６、瞳投影レンズ５およびスキャナ４を介して戻る蛍光をダイクロイックミラー８によって連続レーザ光の光路から分離し、共焦点レンズ９によって集光し、共焦点ピンホール１０を通過した蛍光のみを光検出器１１により検出する。これにより、対物レンズ７の焦点面に沿って広がる試料Ａのスライス蛍光画像を取得することができる。この場合においても、シャッタ２９が閉じられているので、蛍光が光検出器３２に入射されるのが防止される。

また、試料Ａの透過観察を行う場合には、多光子用透過検出ユニット２２のミラー２５、ダイクロイックミラー１２およびミラー２０を光路から離脱させ、シャッタ２９を閉鎖し、透過照明光源１８を作動させる。透過照明光源１８から出射された透過照明光は、ミラー２３によって偏向されて鉛直上方に指向され、窓レンズ２４および集光レンズ２１によって試料Ａに集光される。試料Ａを透過した透過照明光は、対物レンズ７および結像レンズ１３によって集光され、接眼レンズ１７に導かれることで、試料Ａの目視観察を行うことができる。

なお、本実施形態に係る多光子励起レーザ走査型顕微鏡１においては、シャッタ２９により光検出器３２への強い光の入射を遮断することとしたが、これに限定されるものではなく、光検出器３２への印加電圧を低減することにより、検出感度を低下させることにしてもよい。

また、集光レンズ２１として、試料Ａとの間をオイルで満たすことができる液浸タイプの集光レンズ２１を採用することとすれば、より大きな開口数を得ることができるので効果的である。
また、図３に示されるように、多光子用透過検出ユニット２２と集光レンズ２１を一体化し、集光レンズ２１の光軸方向（Ｚ方向）および該光軸方向に直交する２方向（Ｘ，Ｙ方向）にそれぞれ移動可能とすることにより、集光レンズ２１と光検出器３２との配置を最適な状態に維持したまま、集光レンズ２１の焦点位置調整および光軸調整を行うことができる。

また、図４に示されるように、集光レンズ２１の光軸の延長線上に光検出器３２′を配置することにしてもよい。この場合には、大きな視野数と開口数とを有する集光レンズ２１により集光された蛍光の光束が大きな位置で検出するので、光検出器３２′としては、図５に示されるように複数の光検出部３２ａをアレイ状の２次元配列したものを採用し、個々の光検出部３２ａにおける検出信号を合算することにすればよい。

本発明の一実施形態に係る多光子励起レーザ走査型顕微鏡を示す全体構成図である。 図１の多光子励起レーザ走査型顕微鏡の対物レンズと集光レンズとの関係を示す図である。 図１の多光子励起レーザ走査型顕微鏡の第１の変形例を示す全体構成図である。 図１の多光子励起レーザ走査型顕微鏡の第２の変形例を示す全体構成図である。 図４の多光子励起レーザ走査型顕微鏡に用いられる光検出器の例を示す図である。

符号の説明

Ａ 試料
１ 光子励起レーザ走査型顕微鏡
３ レーザ光源（多光子励起用レーザ光源：落射照明光源）
４ スキャナ（光走査部）
７ 対物レンズ
１８ 透過照明光源
２１ 集光レンズ
２５ ミラー
２６ 結像レンズ（瞳リレー光学系）
２７ 励起光カットフィルタ
２８ 吸収フィルタ
２９ シャッタ（検出光量低減手段）
３０ ダイクロイックミラー（光路分割素子）
３１ 集光レンズ（瞳リレー光学系）
３２，３２′ 光検出器
３２ａ 光検出部

Claims (17)

1. 超短パルスレーザ光を出射する多光子励起用レーザ光源と、
   該多光子励起用レーザ光源から出射された超短パルスレーザ光を２次元的に走査する光走査部と、
   該光走査部により走査された超短パルスレーザ光を試料に集光する対物レンズと、
   前記試料を挟んで前記対物レンズと対向する位置に配置され、前記試料において多光子励起により発生する蛍光を集光する集光レンズと、
   該集光レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器とを備え、
   前記集光レンズの開口数および視野数が、前記対物レンズの開口数および視野数より大きい多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
2. 前記光検出器がサイドオンタイプの光電子増倍管である請求項１に記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
3. 前記集光レンズにより集光された蛍光を波長毎に分離する光路分割素子を備え、
   前記光検出器が、前記光路分割素子により分割された異なる波長の蛍光をそれぞれ検出するように複数備えられている請求項１または請求項２に記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
4. 前記集光レンズと前記光検出器との間に、２以上の励起光カットフィルタが光軸方向に間隔をあけて配置されている請求項１から請求項３のいずれかに記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
5. 前記励起光カットフィルタの間に吸収フィルタが配置されている請求項４に記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
6. 前記集光レンズを介して試料に照射する透過照明光を発生する透過照明光源を備え、
   前記集光レンズと光検出器との間の光路に、前記集光レンズから光検出器への光路と、前記透過照明光源から集光レンズへの光路とを切り替えるミラーが挿脱可能に設けられている請求項１から請求項５のいずれかに記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
7. 前記集光レンズと前記光検出器との間に、該光検出器を前記集光レンズの瞳位置と共役な位置関係にする瞳リレー光学系を備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
8. 前記集光レンズと前記光検出器とが一体的に移動可能に設けられている請求項１に記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
9. 前記集光レンズおよび光検出器が、前記対物レンズの光軸方向に移動可能に設けられている請求項８に記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
10. 前記集光レンズおよび光検出器が、前記対物レンズの光軸に直交する方向に移動可能に設けられている請求項８に記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
11. 前記対物レンズを介して試料に照射する落射照明光を発生する落射照明光源を備え、
    該落射照明光源からの落射照明光を試料に照射する際に、前記光検出器による検出光量を低減する検出光量低減手段とを備える請求項１から請求項１０のいずれかに記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
12. 前記集光レンズが、試料との間をオイルで満たすことが可能な液浸タイプである請求項１から請求項１１のいずれかに記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
13. 前記光検出器が、前記集光レンズの光軸の延長線上に配置されている請求項１から請求項１２のいずれかに記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
14. 前記光検出器が２次元的なアレイ状に配列された複数の光検出部を備える請求項１３に記載の多光子励起レーザ走査型顕微鏡。
15. 多光子励起用レーザ光源から出射された超短パルスレーザ光を２次元的に走査しながら試料の内部に対物レンズにより集光させ、
    この集光位置において多光子励起により発生する蛍光を、前記試料を挟んで前記対物レンズと対向する位置に配置した集光レンズにより集光して光検出器により検出し画像取得する多光子励起蛍光画像取得方法であって、
    前記集光レンズの開口数および視野数が、前記対物レンズの開口数および視野数より大きいことを特徴とする多光子励起蛍光画像取得方法。
16. 前記対物レンズを介して試料に落射照明光を照射して落射照明観察を行う場合に、前記光検出器による検出光量を低減する請求項１５に記載の多光子励起蛍光画像取得方法。
17. 前記試料のパッチクランプ実験に用いる針を前記対物レンズと同じ側から試料に刺すようにした請求項１５に記載の多光子励起蛍光画像取得方法。

Images