JP6178656B2 - 補償光学素子の設定方法及び顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、補償光学素子の設定方法及び顕微鏡に関する。

走査型顕微鏡は、レーザビームを対物レンズを介して観察標本に照射し、これにより観察標本から発生した蛍光等を、再び対物レンズで集光して検出するように構成されている。このような走査型顕微鏡においては、エネルギーの高い蛍光を得るために、標本上の走査する点に励起光を集中させる必要があり、対物レンズを含む光学系の収差を極力小さくしている。また、生体標本を観察する場合、厳密には、生体標本そのものの屈折率やその３次元分布も励起光の集光に影響するので、生体標本そのものの屈折率やその３次元分布も考慮して光学系の収差補正を行う必要がある。しかし、生体標本そのものの屈折率やその３次元分布は未知であるとともに、生体標本によっても異なるため、予め全ての生体標本の屈折率やその３次元分布を考慮した光学系の収差を精度良く補正することは困難である。そのため、入射した光の波面を制御することができる補償光学素子（例えば、デフォーマブルミラー）を用いることにより、光学系の収差を補償する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。ここで、補償光学素子の制御パラメータは、補償光学素子を駆動する駆動機構の駆動量であり、補償光学素子がデフォーマブルミラーの場合、ミラーを駆動するピエゾ素子の駆動量である。

特開平１１−１０１９４２号公報

しかしながら、このような補償光学素子を含む光学系を利用して生体標本を観察した場合、補償光学素子に出力する制御パラメータを変更すると、対物レンズの焦点位置がｚ方向（光軸方向）にずれてしまう場合がある。その場合、生体標本の屈折率やその３次元分布が完全に既知の場合には、制御パラメータの変更にともなう対物レンズのｚ方向の焦点位置ずれ量を予測して、その位置ずれ量の補正も加味した波面収差パラメータ制御を行うことにより、対物レンズのｚ方向の焦点位置ずれを防ぐことは可能であるが、実際の生体標本では屈折率やその３次元分布が未知であるとともに、個体差もあるため、位置ずれ量を予測した制御を行うことは困難である。

本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、生体標本のように屈折率やその３次元分布が未知の標本であっても、補償光学素子に対してより精度の高い制御パラメータを決定することが可能な補償光学素子の設定方法及びこの方法により補償光学素子を設定する顕微鏡を提供することを目的とする。

前記課題を解決するために、本発明に係る補償光学素子の設定方法は、光源部から放射された照明光の波面を変化させる補償光学素子を含み、波面が変化された照明光を対物レンズを介して標本に照射する照明光学系と、標本からの光を検出部へ導く検出光学系と、補償光学素子を制御する制御部と、を有する顕微鏡における補償光学素子の設定方法であって、対物レンズの焦点面が標本の所定位置にあるときの標本の画像を基準画像として取得する第１のステップと、制御部は、補償光学素子を制御して照明光の波面を２以上の異なる状態に変化させ、各々の状態において、所定位置を含む光軸方向の所定の範囲の複数の位置で標本の画像を取得する第２のステップと、波面の各々の状態において、複数の位置の各々に対応する標本の画像と基準画像との相関値に基づいて判定画像をそれぞれ選択する第３のステップと、基準画像及び波面の各々の状態における判定画像のそれぞれについて所定の領域の評価値を算出し、当該評価値及び波面の各々の状態に基づいて、新たに波面の状態を決定する第４のステップと、決定した波面の状態になるように補償光学素子を設定する第５のステップと、を有することを特徴とする。

このような補償光学素子の設定方法は、第２のステップにおいて、照明光の波面の状態変化は、所望の光学収差に対応したツェルニケ多項式の各項の係数変更が反映された制御パラメータによって補償光学素子を制御することにより実現されてなることが好ましい。

また、このような補償光学素子の設定方法は、複数の光学収差の各々に対応するツェルニケ多項式の各項の係数毎に、第２のステップ、第３のステップ、第４のステップ及び第５のステップを実行することが好ましい。

また、このような補償光学素子の設定方法において、第３のステップにおける相関値は、位相限定相関法により算出されることが好ましい。

また、このような補償光学素子の設定方法において、第４のステップにおける評価値は、所定の領域内の各画素の輝度値の積算値、最大値、平均値、コントラスト値の少なくとも１つであることが好ましい。

また、このような補償光学素子の設定方法において、標本の画像は、蛍光、第二高調波、第三高調波の少なくとも１つによる画像であることが好ましい。

また、このような補償光学素子の設定方法において、第４のステップにおける所定の領域は、標本の観察を行いたい領域であることが好ましい。

また、このような補償光学素子の設定方法において、第４のステップにおける所定の領域は、標本の観察を行いたい領域の外側の領域であることが好ましい。この場合、標本の画像を取得するときに、外側の領域にのみ照明光を照射することが好ましい。

また、本発明に係る顕微鏡は、光源部から放射された照明光の波面を変化させる補償光学素子を含み、波面が変化された照明光を対物レンズを介して標本に照射する照明光学系と、標本からの光を検出部へ導く検出光学系と、補償光学素子を制御する制御部と、を有し、制御部は、上述の補償光学素子の設定方法のいずれかにより補償光学素子を設定することを特徴とする。

本発明を以上のように構成すると、補償光学素子に対してより精度の高い制御パラメータを決定することが可能な補償光学素子の設定方法及びこの方法により補償光学素子を設定する顕微鏡を提供することができ、これにより、この顕微鏡を用いた観察（実験）全体の画質及び画像取得効率を向上させることができる。

走査型顕微鏡の構成を説明するための説明図である。 補償光学素子の設定方法の全体の流れを示すフローチャートである。 最適係数算出処理の流れを示すフローチャートである。 波面更新判断処理の流れを示すフローチャートである。 基準画像とＲＯＩとの関係を説明するための説明図である。 スタック画像及びこのスタック画像と基準画像との相関値の関係を説明するための説明図である。 ツェルニケ係数と評価関数との関係を示す説明図である。 補償光学素子の設定方法の概要を説明するための説明図である。 周辺領域内のサブ領域について説明するための説明図である。 ＲＯＩと周辺領域との関係を説明するための説明図である。

以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、図１を用いて走査型顕微鏡の光学系の構成について説明する。この走査型顕微鏡１０は、光源装置２０から放射されたレーザ光（照明光又は励起光）をステージ上に載置された標本Ｉ０に対して対物レンズ３６を介して走査する走査光学系３０と、上述のレーザ光の波面を変化させる波面補償光学系４０と、対物レンズ３６により集光された標本からの観察光（例えば蛍光）を検出する第１検出部５０及び第２検出部６０と、標本を透過した光を検出する第３検出部７０と、を有して構成される。なお、以降の説明において、走査光学系３０の光軸方向をｚ軸とし、このｚ軸に直交する面内で互いに直交する方向をそれぞれｘ軸及びｙ軸とする。

この走査型顕微鏡１０において、光源装置２０は、波長が異なる複数のレーザ光を、同時又は個別に射出することが可能に構成された光源２１と、通過するレーザ光の強度を０〜１００％の間で変化させる（強度変調する）ＡＯＭ（Acousto-Optic Modulator：音響光学素子）２２とから構成されている。なお、以降の説明においては光源２１から赤外光及び可視光の２種類のレーザ光が射出されるものとして説明する。また、この光源２１から射出される赤外光は、標本の多光子励起を誘発するための、所定の周期で射出される非常に短いパルス状の光である（例えば、１００フェムト秒程度のパルス光であって、以下、「ＩＲパルス光」と呼ぶ）ものとする。

走査光学系３０は、光源装置２０側から順に、第１ダイクロイックミラー３１、走査ユニット３２、スキャンレンズ３３、第２対物レンズ３４、第２ダイクロイックミラー３５、及び、対物レンズ３６を有して構成されている。この第１ダイクロイックミラー３１は、光源装置２０から放射されるレーザ光（照明光又は励起光）を透過し、後述する観察光（蛍光や第二次高調波）を透過した観察光を透過するように構成されている。また第２ダイクロイックミラー３５は挿脱可能に配置されており、光路挿入時には、レーザ光（照明光又は励起光）を透過し、標本で発生する観察光のうち、所定の波長より短い観察光（蛍光や第２次高調波）を反射するように構成されている。

また、波面補償光学系４０は、走査光学系３０のスキャンレンズ３３と第２対物レンズ３４との間に配置され、光源装置２０側から順に、第１リレーレンズ４１、補償光学素子４２、及び、第２リレーレンズ４３を有して構成されている。この波面補償光学系４０において補償光学素子４２は入射した光を反射（又は透過）する際に、入射した光の波面を変化させて出射させることができる素子（例えば、反射型素子としてデフォーマブルミラーや反射型液晶素子、透過型素子として透過型液晶素子）である。反射型液晶素子や透過型液晶素子は、補正したい光学収差（球面収差やコマ収差等）に対応するツェルニケ（Zernike）多項式の各項の係数の値を個別独立に決定・設定・実現することが可能である。一方、デフォーマブルミラーは、ミラー制御の特性上、補正したい光学収差（球面収差やコマ収差等）に対応するツェルニケ（Zernike）多項式の各項の係数の値は相互作用を受ける（ある項の係数を変更すると、他の項の係数も引きずられて変化してしまう）ので、個別独立に決定・設定・実現することが困難であることが多い。

本実施形態では、補償光学素子４２として、反射型素子であるデフォーマブルミラーを例に説明する。デフォーマブルミラーへは、試料への照明光とデフォーマブルミラーの形状をモニタする参照光を同時に入射させる。照明光はデフォーマブルミラーに角度を持たせて入射させ、参照光は正面から入射させる。入射角に合わせてデフォーマブルミラーを楕円状に制御することで、照明光に指定の形状を表現する。なお、デフォーマブルミラーへの照明光の入射角は、光束の楕円化の影響が小さく、かつ斜入射による非対称収差への影響が小さい角度範囲にとどめるのが望ましく、例えば４５度以内、より望ましくは３０度以内に設定される。この補償光学素子４２の作用を受けた出射光の波面の状態を検出するために、参照レーザ装置４４、第１コリメータレンズ４５、ハーフミラー４６、リレーレンズ４７（第３リレーレンズ４７ａ及び第４リレーレンズ４７ｂ）、並びに、波面センサー４８が設けられている。また、参照レーザ装置４４からの参照光を第１コリメータレンズ４５に導くために光ファイバー４９が設けられている。具体的には、補償光学素子４２の作用を受けた、出射光の波面の状態をハーフミラー４６、リレーレンズ４７を介して波面センサー４８（例えば、シャックハルトマン方式、干渉方式）で検出し、検出した波面の状態と、後述する本実施形態の手法によって算出した理論的な波面の状態との差を算出し、差の値が閾値以上であれば、補償光学素子４２へのフィードバック量を算出し、補償光学素子４２へフィードバックする。これらの一連のプロセスは、例えば、以下の公知の方法を用いて行われる。
Adaptive control of a micromachined continuous-membrane deformable mirror for aberration compensation(APPLIED OPTICS y Vol. 38, No. 1 y 1 January 1999),
Methods for the characterization of deformable membrane mirrors(August 2005 Vol. 44, No. 24 APPLIED OPTICS)

また、第１検出部５０は、反射ＮＤＤ（Non Descanned Detector）であって、第２ダイクロイックミラー３５の観察光が反射される方向に配置され、この第２ダイクロイックミラー３５側から順に、第３ダイクロイックミラー５１と、この第３ダイクロイックミラー５１を光が透過する方向に第１集光レンズ５２及び第１光検出器５３とを有し、第３ダイクロイックミラー５１で光が反射する方向に第２集光レンズ５４及び第２光検出器５５とを有する。この第１検出部５０の第３ダイクロイックミラー５１を、所定の波長以上の光（例えば蛍光）を透過し、所定の波長より短い波長の光（例えば第二次高調波）を反射するように構成すると、第１及び第２光検出器５３，５５で異なる波長の光の強度を検出することができる（例えば、第１光検出器５３で蛍光を検出し、第２光検出器５５で第二次高調波を検出することができる）。

また、第２検出部６０は、第１ダイクロイックミラー３１の観察光が透過する方向に配置されており、この第１ダイクロイックミラー３１側から順に、第３集光レンズ６１と、対物レンズ３６の標本側の焦点面と略共役な位置に配置された遮光板６２と、第２コリメータレンズ６３と、第４ダイクロイックミラー６４と、この第４ダイクロイックミラー６４を光が透過する方向に第４集光レンズ６５及び第３光検出器６６とを有し、第４ダイクロイックミラー６４で光が反射する方向に第５集光レンズ６７及び第４光検出器６８とを有する。なお、遮光板６２にはピンホール６２ａが設けられており、このピンホール６２ａは走査光学系３０の光軸を含むように配置されている。また、遮光板６２のピンホール６２ａを通過した光を、第３及び第４光検出器６６，６８に導くために、この遮光板６２と第２コリメータレンズ６３との間に、リレー光学系６９（第５及び第６リレーレンズ６９ａ，６９ｂ並びに光ファイバー６９ｃ）が設けられている。この第２検出部６０においても、第４ダイクロイックミラー６４により、第３及び第４光検出器６６，６８で異なる波長の光の強度を検出することができる。

また、第３検出部７０は、透過ＮＤＤであって、標本面Ｉ０を挟んで対物レンズ３６の反対側に配置されており、この標本面Ｉ０側から順に、コンデンサレンズ７１と、第５ダイクロイックミラー７２と、この第５ダイクロイックミラー７２を光が透過する方向に第６集光レンズ７３及び第５光検出器７４とを有し、第５ダイクロイックミラー７２で光が反射する方向に第７集光レンズ７５及び第６光検出器７６とを有する。この第３検出部７０においても、第５ダイクロイックミラー７２により、第５及び第６光検出器７４，７６で異なる波長の光の強度を検出することができる。

なお、走査ユニット３２の偏向素子や補償光学素子４２の反射面（又は透過面）は、対物レンズ３６の射出瞳と略共役な位置に配置されていることが好ましいため、スキャンレンズ３３並びに第１及び第２リレーレンズ４１，４３により射出瞳Ｐ０の像をリレーし、この像と一致するように走査ユニット３２及び補償光学素子４２が配置されている（この図１の例では、射出瞳の像Ｐ１と補償光学素子４２が略一致し、射出瞳の像Ｐ２と走査ユニット３２とが略一致している）。また、図１では走査ユニット３２と対物レンズ３６との間に波面補償光学系４０（補償光学素子４２）を配置しているが、走査ユニット３２と光源装置２０との間にこの波面補償光学系４０を配置することも可能である。

また、走査光学系３０において、光源装置２０のＡＯＭ２２を透過したレーザ光を第１ダイクロイックミラー３１に導くために３枚のミラー１１，１２，１３が用いられ、また、遮光板６２のピンホール６２ａを通過した光を第２コリメータレンズ６３に導くために１枚のミラー１７及びリレー光学系６９（第５及び第６リレーレンズ６９ａ，６９ｂ及び光ファイバー６９ｃ）が用いられ、さらに、波面補償光学系４０において、補償光学素子４２にレーザ光及び観察光を導くために３枚のミラー１４，１５，１６が用いられ、また、参照レーザ装置４４からの参照光を第１コリメータレンズ４５に導くために光ファイバー４９が用いられているが、これらは、各光学素子を配置するために光路を折り曲げる目的で用いられているものであり、この構成に限定されることはない。

また、第１〜第６光検出器５３，５５，６６，６８，７４，７６としていは、例えばＰＭＴ（Photo Multiplier Tube：光電子倍増管）が用いられる。

また、この走査型顕微鏡１０には、光源２１から放射されるレーザ光の波長の選択し、ＡＯＭ２２及び走査ユニット３２の作動を制御するとともに、走査ユニット３２でレーザ光を走査する位置（標本上の走査面（標本面）内の座標）及び第１〜第６光検出器５３，５５，６６，６８，７４，７６で検出された値を処理する制御部８０が設けられている。この制御部８０は、波面センサー４８で検出された波面の状態を監視しながら補償光学素子４２の制御も行うように構成されている。具体的には参照レーザ４４から放射された参照光を第１コリメータレンズ４５で略並行光束にし、ハーフミラー４６で一部反射させて補償光学素子４２の反射面に垂直に入射させる。そして、この反射面で垂直反射した参照光をハーフミラー４６で一部透過させ、ミラー１８で反射させた後、リレーレンズ４７を介して波面センサー４８に入射させるように構成されている。さらに、制御部８０は、アクチュエータ３７を制御することにより、対物レンズ３６又はステージを光軸方向に移動させて標本（ｚ方向）における対物レンズ３６の焦点面（標本面Ｉ０）の位置を変化させるように構成されている。なお、この制御部８０には、取得した標本の画像を表示するための表示装置８１や、各種情報の設定や対物レンズ３６又はステージの操作を行うための入力装置８２、及び、取得した画像を記憶する記憶装置８３が接続されている。

この走査型顕微鏡１０において、光源装置２０の光源２１から放射された略平行光束であるレーザ光（照明光又は励起光）は、ＡＯＭ２２を透過した後、３枚のミラー１１，１２，１３で反射されて第１ダイクロイックミラー３１に入射し、この第１ダイクロイックミラー３１で反射されて走査ユニット３２に入射する。この走査ユニット３２は、光軸に直交する方向（上述のｘ方向及びｙ方向）にレーザ光を２次元的に走査するものであり、例えば、レーザ光を反射することによりこのレーザ光を光軸に直交する面内で所定の方向（この方向をｘ方向とする）に偏向させる第１の偏向素子、及び、光軸に直交する面内で第１の偏向素子の偏向方向と略直交する方向（この方向をｙ方向とする）に偏向させる第２の偏向素子からなる２つの偏向素子で構成されている。そして、この走査ユニット３２を出射したレーザ光（略平行光束）はスキャンレンズ３３により二次像面Ｉ２に集光された後、第１リレーレンズ４１で略平行光束に変換され、ミラー１４で反射されて補償光学素子４２に入射する。この補償光学素子４２は、上述したように、入射したレーザ光を反射するときにその波面を変化させるように構成されており、この補償光学素子４２で反射したレーザ光は、第２リレーレンズ４３を透過してミラー１５で反射した後一次像面Ｉ１に集光し、さらにミラー１６で反射されて第２対物レンズ３４を通過することにより再び略平行光束となり、第２ダイクロイックミラー３５を透過して対物レンズ３６によって標本上の対物レンズ３６の焦点面（標本面Ｉ０）に集光される。なお、標本上に集光されたレーザ光は点像となっており、その点像の径は対物レンズ３６の開口数（ＮＡ）で決まる大きさである。

ここで、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０において、標本の観察時には、光源２１から放射されるレーザ光のうち、ＩＲパルス光又は可視光の何れか一方が、標本の画像を得るためのイメージング用の照明光（励起光）として用いられる。

例えば、ＩＲパルス光を照明光（励起光）として用いる場合、可視光は全く使用されないか、又は、標本の光刺激用として使用される。この場合、ＩＲパルス光が標本に照射されると、標本からは多光子励起による蛍光が発生し、この蛍光は観察光となって対物レンズ３６に入射し、この対物レンズ３６で略平行光束となり第２ダイクロイックミラー３５で反射されて第１検出部５０に入射する。そして、この観察光は第３ダイクロイックミラー５１を透過したときは第１集光レンズ５２で第１光検出器５３の受光面に集光されて検出され、第３ダイクロイックミラー５１で反射したときは第２集光レンズ５４で第２光検出器５５の受光面に集光されて検出される。なお、この第１検出部５０には、標本や対物レンズ３６等で反射され、観察光とともにこの第１検出部５０に入射するＩＲパルス光を除去するために、図示しないＩＲカットフィルタを配置してもよい。

一方、可視光を照明光（励起光）として用いる場合、ＩＲパルス光は標本の光刺激用として使用してもよい。この場合、照明光が標本に照射されると、標本からは蛍光が発生し、この蛍光は観察光となって対物レンズ３６に入射し、この対物レンズ３６で略平行光束となり第２ダイクロイックミラー３５を透過する。そして、この観察光は、第２対物レンズ３４により一次像面Ｉ１に集光された後、上述の照明光と逆の経路をたどってスキャンレンズ３３で略平行光束にされて走査ユニット３２に入射し、この走査ユニット３２でデスキャンされて出射し、さらに第１ダイクロイックミラー３１を透過して第３集光レンズ６１により遮光板６２のピンホール６２ａ上に集光される。この遮光板６２のピンホール６２ａを通過した光のみが第２検出部６０の第３又は第４光検出器６６，６８に到達して検出される。

上述のように、遮光板６２のピンホール６２ａは標本上の走査面（標本面Ｉ０）に集光されたレーザ光の点像と共役であり、標本上の照射領域（対物レンズ３６の焦点面（標本面Ｉ０））から出た観察光（蛍光）はこのピンホール６２ａを通過することができる。一方、標本上の他の領域から出た光のほとんどはこのピンホール６２ａ上には集光されず、通過することができない。そのため、光軸方向に高い分解能を持った画像を取得することができる。

さらに、標本を透過した照明光、又は、照明光により発生した観察光（例えば、第二次高調波等）はコンデンサレンズ７１で略平行光束にされ、ミラー１７で反射されて第３検出部７０に入射する。そして、この観察光は第５ダイクロイックミラー７２を透過したときは第６集光レンズ７３で第５光検出器７４の受光面に集光されて検出され、第５ダイクロイックミラー７２で反射したときは第７集光レンズ７５で第６光検出器７６の受光面に集光されて検出される。

以上より、走査光学系３０は、光源部である光源装置２０から照射された照明光により標本を走査する照明光学系及び走査手段、並びに、標本からの光を第１及び第２検出部５０，６０に導く集光手段の機能を有している。そして、制御部８０が走査ユニット３２の走査に同期させて第１〜第３検出部５０，６０，７０で検出された光信号を処理することにより、標本上のレーザ光の走査位置と光信号から求められる輝度を用いて、標本の走査面（標本面Ｉ０）における二次元的な画像を得ることができる。これによりこの走査型顕微鏡１０は、高い分解能で標本の像を得ることができる。このように、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０は、走査型多光子顕微鏡及び走査型共焦点顕微鏡の両方として使用することができる。

それでは、上述した構成の走査型顕微鏡１０において、波面補償光学系４０の補償光学素子４２を制御して光学系の収差を補正する方法について説明する。なお、本実施形態に係る波面補償光学系４０の制御方法においては、補償光学素子４２に対して、補正したい光学収差（球面収差やコマ収差等）に対応するツェルニケ（Zernike）多項式の各項の係数を選択し、それぞれの係数毎に最適な画像が取得できる最適値を決定し、最終的に各項の係数の最適値を実現する制御パラメータによって補償光学素子４２を制御して入射した光に対して最適な波面を付与するように構成されている。ツェルニケ多項式は、その係数の各項が光学収差に対応するので直感的に分かり易く、また、各係数は直交性があるため各項を独立に扱うことができるためである。なお、各光学収差とツェルニケ（Zernike）多項式の係数との関係（対応関係）は公知技術であるので、本実施形態では説明を省略する。また、以降の説明では、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０を用いて標本の多光子蛍光観察（特に２光子蛍光観察）を行う場合について説明する。

まず、観察者は、対物レンズ３６及びステージの少なくとも一つをｚ方向（光軸方向）に移動させて、観察したい標本に対する対物レンズ３６の位置（ｚ方向位置であって、標本における対物レンズ３６の焦点面）を決定する。以下、標本を載置するステージは固定し、対物レンズ３６をｚ方向に移動させる場合について説明するが、これに限定されるものではない。そして、この状態で補償光学素子４２を制御する最適な制御パラメータ（以下、「最適値」と呼ぶ）の設定処理が開始されると、制御部８０は、図２に示すように、所定の位置（標本に対する対物レンズ３６のｚ方向の位置であって、以下「基準位置」と呼ぶ）での標本面Ｉ０の画像を取得し、記憶装置８３に記憶する（ステップＳ１００）。そして、ステップＳ１００で取得した画像を記憶装置８３から読み出し、表示装置８１に表示する（ステップＳ１１０）。この状態で、制御部８０は、観察者に対し、表示装置８１に表示されている画像において、観察したい領域（以下、「ＲＯＩ（Region Of Interest）」と呼ぶ）を選択させ、基準位置及びＲＯＩを記憶する（ステップＳ１２０）。例えば、図５に示すように、表示装置８１に走査顕微鏡１０で取得した視野全体の画像Ｇを表示し、入力装置８２を用いてＲＯＩを選択させる。

次に、制御部８０は、補正対象の光学収差（ツェルニケ係数）のうちの一つを選択し（ステップＳ１３０）、最適係数算出処理を実行する（ステップＳ１４０）。ここで、補正対象の光学収差（ツェルニケ係数）は、予め制御部８０に設定しておいてもよいし、この制御を実行する前までに観察者に選択させてもよい。図３に示すように、最適係数算出処理Ｓ１４０において制御部８０は、対物レンズ３６をｚ方向の基準位置に移動させ、この基準位置で標本の画像を取得し、記憶装置８３に記憶する（ステップＳ１４０１）。この基準位置での画像を「基準画像」と呼ぶ。そして、制御部８０は、ステップＳ１４０１で取得した画像を記憶装置８３から読み出し（ステップＳ１４０２）、この読み出した画像におけるＲＯＩ内に対して、この画像を評価するための評価値を算出する（ステップＳ１４０３）。ここで、本実施形態においては、ＲＯＩ内の各画素の輝度を積算した値を評価値としている。上述した走査型顕微鏡１０において多光子蛍光観察、例えば、２光子蛍光観察を行う場合、その蛍光強度は励起光の２乗に比例するため感度が良く、取得した画像を評価するのに適しているからである。もちろん、評価関数としては、輝度値に限定されることはなく、ＲＯＩ内のコントラスト（例えば、各画素の輝度値のうちの最大値をＬmax、最小値をＬminとすると、（Ｌmax−Ｌmin）／（Ｌmax＋Ｌmin）、Ｌmax／Ｌmin）を用いてもよい。また、ＲＯＩ内の各画素の輝度値の積算に限定されることはなく、ＲＯＩ内の各画素の輝度値の平均値又は各画素の輝度値のうちの最大値とすることも可能である。あるいは、輝度値やコントラスト等の複数の評価値を用いてもよい。

また、制御部８０は、選択されているツェルニケ係数の現在の値（基準画像を取得したときの値）に所定の値を加算して変更したツェルニケ多項式に基づいた制御パラメータ（値）を補償光学素子４２に出力する（ステップＳ１４０４）。このように補償光学素子４２を制御すると、波面収差が補正された照明光（励起光）が対物レンズ３６を介して標本（標本面Ｉ０）に照射される。但し、対物レンズ３６の焦点位置は、基準位置からｚ方向にズレる。そして、制御部８０は、基準位置を含むｚ方向の所定の範囲で対物レンズ３６を所定の刻み幅で移動させて、各位置で標本の画像を取得し、記憶装置８３に記憶する（ステップＳ１４０５）。これらの画像を「スタック画像」と呼ぶ。このスタック画像を取得するｚ方向の範囲及び刻み幅は、予め決定しておいてもよいし、現在選択されている光学収差（ツェルニケ係数）に基づいて変化させてもよい。例えば、球面収差に対応するツェルニケ係数を変化させるとデフォーカス量が大きくなる場合は、広い範囲をスキャンするようにし、非点収差に対応するツェルニケ係数を変化させるとデフォーカス量が小さくなる場合は、狭い範囲を細かい刻み幅でスキャンするようにすることが可能である。

制御部８０は、このようにして取得したスタック画像を記憶装置８３から読み出し（ステップＳ１４０６）、各々の画像と、ステップＳ１４０１で取得した基準画像との相関値を算出し、最も相関値の大きい画像を選択する（ステップＳ１４０７）。この画像を「加算側判定画像」と呼ぶ。ここで、基準画像と最も相関値の大きな画像を選択する理由は、スタック画像の中から、波面収差が補正された照明光によって基準位置で取得されたであろう画像を探し出すためである。なお、本実施形態では、相関値の算出方法として、位相限定相関法を用いる。位相限定相関法とは、画像の位相成分（これは形状の情報に相当する）のみを、この画像をフーリエ変換することにより抽出し、その位相成分の相関値を求めることにより類似度を測定するパターンマッチングの手法である。画像の濃淡情報の影響を受けないため、「形状」に着目した相関を精度良く得ることができ、画像の位置ズレ（対物レンズ３６やステージの移動に伴い、ｘｙ平面内で発生するズレや、生体標本自体の微動）の影響等を受けることがない。上述したように、制御パラメータが変更された補償光学素子４２により入射した光の波面を変化させると、それに伴って、対物レンズ３６の焦点面が基準位置から移動する（デフォーカスする）ため、基準位置を含む所定の範囲の画像を取得し、基準画像との相関値を求めることにより、この基準画像と最も類似している画像（「加算側判定画像」）を選択する。この相関値とｚ方向位置の関係は、例えば図６のようになる。ここで、刻み幅をΔｚとして表している。そして、制御部８０は、選択した加算側判定画像において、ステップＳ１４０３と同様の方法で、ＲＯＩ内の評価値を算出する（ステップＳ１４０８）。

また、制御部８０は、選択されているツェルニケ係数から所定の値を減算し、ツェルニケ多項式に基づいた制御パラメータ（値）を補償光学素子４２に出力する（ステップＳ１４０９）。そして制御部８０は、ステップＳ１４０５と同様に、対物レンズ３６を、基準位置を含むｚ方向の所定の範囲において、所定の刻み幅で移動させて、各位置で標本の画像を取得して記憶装置８３に記憶し（ステップＳ１４１０）、このようにして取得したスタック画像を記憶装置８３から読み出し（ステップＳ１４１１）、各々の画像と、ステップＳ１４０１で取得した基準画像との相関値を算出し、最も相関値の大きい画像を選択する（ステップＳ１４１２）。この画像を「減算側判定画像」と呼ぶ。基準画像と最も相関値の大きな画像を選択する理由は、前述したとおりである。また、制御部８０は、選択した減算側判定画像において、ステップＳ１４０３と同様の方法で、ＲＯＩ内の評価値を算出する（ステップＳ１４１３）。

以上の処理を実行すると、基準画像、加算側判定画像及び減算側判定画像の各々のＲＯＩ内の評価値（すなわち、現在選択されているツェルニケ係数を変化（基準画像を中心に正方向及び負方向に変化）させたときのＲＯＩ内の評価値）が求まり、制御部８０は、これらの値に対し２次のフィッティングを行うことで、図７に示すように、評価値が最も大きくなるときのツェルニケ係数の最適値（加算側を正とし減算側を負とする）を算出することができる（ステップＳ１４１４）。

図２に戻り、ステップＳ１４０で選択されているツェルニケ係数の最適値が算出されると、制御部８０は、制御パラメータを更新する必要があるか否かを判断する（ステップＳ１５０）。すなわち、選択されているツェルニケ係数の値を最適値に更新する必要があるか否かを判断し、制御部８０は、制御パラメータを更新する必要があると判断すると、その更新により当該収差が改善されるか否かを検証して判断する（ステップＳ１６０）。

この制御パラメータ更新の判断処理Ｓ１６０において、制御部８０は、図４に示すように、制御パラメータを更新する前の状態で、対物レンズ３６をｚ方向の基準位置に移動させ、この基準位置で再度、標本の画像（基準画像）を取得し、記憶装置８３に記憶する（ステップＳ１６０１）。そして、制御部８０は、ステップＳ１６０１で取得した基準画像を記憶装置８３から読み出し（ステップＳ１６０２）、この読み出した基準画像におけるＲＯＩ内に対して、ステップＳ１４０３と同じ評価値を算出する（ステップＳ１６０３）。次に、制御部８０は、選択されているツェルニケ係数を上述した最適値に更新し、ツェルニケ多項式に基づいた制御パラメータ（値）を補償光学素子４２に出力する（ステップＳ１６０４）。そして制御部８０は、ステップＳ１４０５と同様に、対物レンズ３６を、基準位置を含むｚ方向の所定の範囲において、所定の刻み幅で移動させて、各位置で標本の画像を取得して記憶装置８３に記憶し（ステップＳ１６０５）、このようにして取得したスタック画像を記憶装置８３から読み出し（ステップＳ１６０６）、各々の画像と、ステップＳ１６０１で取得した基準画像との相関値を算出し、最も相関値の大きい画像を選択する（ステップＳ１６０７）。この画像を「最適値判定画像」と呼ぶ。また、制御部８０は、選択した最適値判定画像において、ステップＳ１４０３と同様の方法で、ＲＯＩ内の評価値を算出する（ステップＳ１６０８）。さらに、制御部８０は、ステップＳ１６０８の評価値から、当該光学収差の補正（当該ツェルニケ係数に最適値を加算したときの収差）が改善されたか否かを判定し（ステップＳ１６０９）、ステップＳ１６０３で算出された評価値（最適値で制御パラメータを更新する前の画像の状態）に対してステップＳ１６０８で算出された最適値で制御パラメータが更新された後の評価値を比較し、その差が所定の閾値より大きくなり、画像が改善されたと判断したときは、当該最適値で補償光学素子４２の制御パラメータを更新し（ステップＳ１６１０）、改善されていないと判断したときは制御パラメータを更新しない（ステップＳ１６１１）。

図２に戻り、制御部８０は、全ての収差について上述の処理を実行したか否かを判断し（ステップＳ１７０）、全ての収差について実行していないときは次の収差（ツェルニケ係数）を選択してステップＳ１４０に戻ってこのステップＳ１４０からステップＳ１７０を繰り返し（ステップＳ１８０）、全ての収差について補正が完了したと判断したときは、この処理を終了する。

なおステップＳ１４０１〜Ｓ１４０３、Ｓ１６０１〜Ｓ１６０３の操作は、下記とおり省略することも可能である。すなわち、一連のシーケンスにおいて、直前の状態における最適画像Image-bestおよび評価関数値Value-bestを記憶しておき、ステップＳ１６１０にて制御パラメータを更新するたびに、それぞれの値を最新の値に置き換える。より具体的には、まずステップＳ１２０において基準位置における画像と評価関数を最適画像Image-Bestおよび評価関数値Value-bestとして記憶する。次に、ステップＳ１４０１〜Ｓ１４０３の初回ループにおいてステップＳ１４０１〜Ｓ１４０３の操作を行う代わりに、記憶した最適画像Image-Bestおよび評価関数値Value-bestの値を評価関数の代わりに使用する。２回目以降のループにおいては、ステップＳ１６１０にて制御パラメータを更新した場合にはステップＳ１６０８にて選択した画像と評価関数を直前のループにおける最適画像Image-bestおよび評価関数値Value-bestとして更新し、ステップＳ１６１０にて制御パラメータを更新しなかった場合には更新しない。そして次のループでは再び、Ｓ１４０１〜Ｓ１４０３の操作を行うかわりに、最適画像Image-bestおよび評価関数値Value-bestの値を使用する。なお、このように最適画像Image-bestおよび評価関数値Value-bestを常に記憶し、制御パラメータを更新するたびにそれぞれの値も更新するという方法は、一連のシーケンスにおいて標本からの信号強度が補償光学素子４２の制御パラメータを変更する以外の要因で変動する懸念がない、もしくは少ない場合に適用することが可能である。たとえば第二高調波発生（ＳＨＧ）や第三高調波発生（ＴＨＧ）などのように標本の褪色の心配のない観察法に対して本発明を用いる場合には適用可能であり、シーケンスを減らして時間短縮を図ることが可能である。一方、たとえば褪色の激しい標本において多光子蛍光画像を取得し本発明を適用する場合には、シーケンス中に何度も画像取得を行うことにより標本の褪色の影響が懸念される。このような場合には、ステップを省略することなく、実施例どおりに制御パラメータを更新するかどうか判定する直前に、評価関数を計算するための画像を取得しなおすことが望ましい。なお、ステップを省略するかどうかは、標本や取得条件に応じてユーザが選択できることが望ましい。

また、本実施例ではツェルニケ（Zernike）係数をひとつ選択して最適係数を算出するたびにステップＳ１６０にて制御パラメータの更新判断を行い制御パラメータを更新していたが、このように順番に波面収差値を更新していく方法は、デフォーマブルミラーのように、補正したい光学収差（球面収差やコマ収差）に対応するツェルニケ（Zernike）多項式の各項の係数の値の相互作用を受ける傾向のある補償光学素子を使用する場合や、生体標本の深部における観察のように補正すべき収差が複雑でその収差量も大きい場合などに、特に有効となる。最適値を計算して更新するツェルニケ（Zernike）係数の項の順序を、使用する補償光学素子の応答特性や生体標本の収差特性に応じて選択することにより、より精度良く短時間で良好な最適値を見出すことが可能となる。

前述したように、補償光学素子４２として、反射型液晶素子又は透過型液晶素子を用いる場合は、その特性から補正したい光学収差（球面収差やコマ収差等）に対応するツェルニケ（Zernike）多項式の各項の係数の値を個別独立に決定・設定・実現することが可能であるので、図２に示す補償光学素子の設定方法は、ステップＳ１５０〜ステップＳ１７０省略して、ステップＳ１４０からステップＳ１８０のループを廻して、補正対象の光学収差（ツェルニケ係数）の全ての最適係数算出処理を実行した後、算出した全てのツェルニケ係数を用いて、ステップＳ１５０、ステップＳ１６０を実行してもよい。

本実施形態に係る走査型顕微鏡１０において、補償光学素子４２の制御を以上のように行うと、波面を変化させることにより対物レンズ３６の焦点面（標本面Ｉ０）がｚ方向に移動したとしても、図８に示すように、基準位置を中心とした所定の範囲において所定の刻み幅でスタック画像を取得し、基準画像との相関値を算出して基準画像と最も近い画像を選択することで、移動する前の焦点面の画像であろうものを選択することができる。また、複数の光学収差をツェルニケ多項式の各項の係数で制御するため、その直交性を利用することができるので、それぞれの光学収差（ツェルニケ係数）毎に制御を行っても（上述のステップＳ１４０〜Ｓ１８０を繰り返しても）、それぞれの光学収差を制御できるため、補償光学素子４２の制御を単純化することができる。以上より、上述の処理を行うことにより、補償光学素子のより精度の高い制御パラメータを決定することが可能にとなり、最適値への収束速度を短縮することができるので、特性（屈折率やその３次元分布）が未知の標本（例えば生体標本）に対しても、精度の良い観察を行うことができる。

なお、以上の説明では、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０を用いて標本の多光子蛍光観察（２光子蛍光観察）を行う場合について説明したが、本発明がこの観察方法に限定されることはない。上述したように、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０は、標本からの観察項を走査ユニット３２でデスキャンすることなく検出する第１検出部５０だけでなく、この走査ユニット３２でデスキャンした後、遮光板６２のピンホール６２ａを介して検出する第２検出部６０や、標本を透過した光を検出する第３検出部７０を有し、それぞれの検出部５０，６０，７０は、異なる波長の光を検出可能に構成されている。そのため、例えば、通常の共焦点顕微鏡における１光子蛍光や、励起光を照射することで上記蛍光とともに発生する、第二次高調波発生（Second Harmonic Generation）により発生した第二高調波、第三次高調波発生（Third Harmonic Generation）により発生した第三高調波、又は、標本の自家蛍光による観察光を検出して観察する場合も、上記方法により、照明光（励起光）の波面を変化させて収差を少なくし、精度の良い画像を得ることができる。

また、以上の説明では、標本の深さ方向の光学断層像を取得可能な観察方法として走査型顕微鏡１０による多光子蛍光観察を例に説明したが、本発明はこれに限られるものではなく、たとえばSelective Plane Illumination Microscope（ＳＰＩＭ）と呼ばれるシート照明顕微鏡のような、選択された深さの光学断層像を取得可能な他の観察法や顕微鏡法を用いてもよい。ＳＰＩＭは、標本を観察する対物レンズの光学軸とほぼ垂直な方向から、別の照明光学系を用いて対物レンズの焦点面近傍だけをシート状の照明光で照明することにより、選択された深さの光学断層像を得るものであり、より詳細には、例えば特表２００６−５０９２４６号公報に開示されている。

また、以上の説明では、一つの光学収差（ツェルニケ係数）に対して、基準画像と、係数に所定の値を加減算したときの画像からなる３つの状態の画像で最適値を算出する場合について説明したが、当該ツェルニケ係数を４つの状態以上に変化させ、それらの状態で得られた画像から最適値を決定するように構成してもよい。

［変形例］
以上の説明では、ＲＯＩを用いて収差補正光学素子４２の最適値を決定する方法について説明したが、ＲＯＩの外側の領域（以下「周辺領域Ａ」と呼ぶ）を用いてもよい。上述したように、ＳＨＧ観察又はＴＨＧ観察のための励起光（第２の波長の照明光）は、標本が劣化するのを抑えることができるが、収差補正光学素子４２の最適値の決定時は、周辺領域Ａを用いることにより、観察領域（ＲＯＩ）へ励起光を照射することを避けて、この観察領域内の標本の劣化をさらに抑えることができる。以下、周辺領域Ａを用いた収差補正光学素子４２の最適値の決定方法について説明する。なお、図２〜図４に示すフローチャートのうち、異なる部分を中心に説明する。

まず、周辺領域Ａを用いる場合のＲＯＩの決定（ステップＳ１２０）は、ステップＳ１００において、２光子蛍光観察により取得した標本の画像を用いて行う。なお、このステップＳ１００における標本の観察は２光子蛍光観察であるので、レーザ光（照明光）の標本に対する照射時間を最低限に抑えるように作業を行う必要がある。そして、以降の処理における評価値の算出（ステップＳ１４０３、Ｓ１４０８、Ｓ１４１３、Ｓ１４１４、Ｓ１６０３及びＳ１６０８）は、上述したようにＳＨＧ又はＴＨＧ観察を、ＲＯＩの代わりに周辺領域Ａに対して行う。

なお、評価値の算出においては、図９に示すように、周辺領域Ａを複数のサブ領域Ａｎ（ｎは各サブ領域の番号）に分割し、各々のサブ領域Ａｎ内の輝度値を積算して評価値とする。この図９に示すように、周辺領域Ａの媒質の構成が異なる場合、その媒質の性質により屈折率等が異なるためである。すなわち、上述の評価値の算出は、周辺領域Ａの各々のサブ領域Ａｎ内の各々に対して行われる。同様に、ステップＳ１４１４における、評価値が最も大きくなるときのツェルニケ係数の最適値の算出は、各々のサブ領域Ａｎ毎に、これらの値に対し２次のフィッティングを行い、各サブ領域Ａｎの最適値の平均を算出し、ＲＯＩを観察するための最適値として決定される。さらに、ステップＳ１６０９における判定は、ステップＳ１６０８の評価値から、各サブ領域Ａｎ毎に当該光学収差の補正（当該ツェルニケ係数に最適値を設定したときの収差）が改善されたか否かを判定し、このステップＳ１６０８で算出された最適値で制御パラメータが更新された後の評価値を比較し、少なくとも１つのサブ領域Ａｎにおいて、その差が所定の閾値より大きくなり、画像が改善されたと判断したときは、当該最適値で補償光学素子４２の制御パラメータを更新し（ステップＳ１６１０）、いずれのサブ領域Ａｎでも改善されていないと判断したときは制御パラメータを更新しないように構成する（ステップＳ１６１１）。

以上のように、周辺領域Ａを用いて収差補正光学素子４２の最適値を決定する場合、図１０（ａ）に示すように、２光子蛍光観察でＲＯＩを決定するが、図１０（ｂ）に示すように、収差補正光学素子４２の制御パラメータの決定は周辺領域Ａを用いられる。上述した２光子蛍光観察をするための励起光を標本に照射すると標本が劣化する場合があり、補償光学素子４２の最適値の決定のための画像の取得時には、周辺領域Ａにのみ励起光を照射することにより、図１０（ｃ）に示す実際の観察領域であるＲＯＩ内の標本の劣化を抑えることが可能となる。なお、図９では周辺領域Ａを８つのサブ領域Ａ１〜Ａ８に分割した場合について示しているが、分割数は８に限定されることはない。また、サブ領域Ａｎの各ツェルニケ係数の平均値ではなく、Ａｎの領域ごとに異なる重みづけ係数を掛けて決定した係数を用いてもよい。また、サブ領域Ａｎに分割せず、周辺領域Ａ全体で評価値を算出してツェルニケ係数の最適値を決定することも可能である。

１０ 走査型顕微鏡 ２０ 光源装置 ３０ 走査光学系
３２ 走査ユニット ３６ 対物レンズ ４０ 波面補償光学系
４２ 補償光学素子 ５０ 第１検出部 ８０ 制御部

Claims (10)

1. 光源部から放射された照明光の波面を変化させる補償光学素子を含み、前記波面が変化された前記照明光を対物レンズを介して標本に照射する照明光学系と、
   前記標本からの光を検出部へ導く検出光学系と、
   前記補償光学素子を制御する制御部と、を有する顕微鏡における前記補償光学素子の設定方法であって、
   前記対物レンズの焦点面が前記標本の所定位置にあるときの前記標本の画像を基準画像として取得する第１のステップと、
   前記制御部は、前記補償光学素子を制御して、前記照明光の波面を２以上の異なる状態に変化させ、各々の前記状態において、前記所定位置を含む前記光軸方向の所定の範囲の複数の位置で前記標本の画像を取得する第２のステップと、
   前記波面の各々の状態において、前記複数の位置の各々に対応する前記標本の画像と前記基準画像との相関値に基づいて判定画像をそれぞれ選択する第３のステップと、
   前記基準画像及び前記波面の各々の状態における前記判定画像のそれぞれについて所定の領域の評価値を算出し、当該評価値及び前記波面の各々の状態に基づいて、新たに前記波面の状態を決定する第４のステップと、
   決定した前記波面の状態になるように前記補償光学素子を設定する第５のステップと、を有することを特徴とする補償光学素子の設定方法。
2. 前記第２のステップにおいて、前記照明光の波面の状態変化は、所望の光学収差に対応したツェルニケ多項式の各項の係数変更が反映された制御パラメータによって前記補償光学素子を制御することにより実現されてなることを特徴とする請求項１に記載の補償光学素子の設定方法。
3. 複数の光学収差の各々に対応する前記ツェルニケ多項式の前記各項の前記係数毎に、前記第２のステップ、前記第３のステップ、前記第４のステップ及び前記第５のステップを実行することを特徴とする請求項２に記載の補償光学素子の設定方法。
4. 前記第３のステップにおける前記相関値は、位相限定相関法により算出されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の補償光学素子の設定方法。
5. 前記第４のステップにおける前記評価値は、前記所定の領域内の各画素の輝度値の積算値、最大値、平均値、コントラスト値の少なくとも１つであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の補償光学素子の設定方法。
6. 前記標本の画像は、蛍光、第二高調波、第三高調波の少なくとも１つによる画像であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の補償光学素子の設定方法。
7. 前記第４のステップにおける前記所定の領域は、前記標本の観察を行いたい領域であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の補償光学素子の設定方法。
8. 前記第４のステップにおける前記所定の領域は、前記標本の観察を行いたい領域の外側の領域であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の補償光学素子の設定方法。
9. 前記標本の画像を取得するときに、前記外側の領域にのみ前記照明光を照射することを特徴とする請求項８に記載の補償光学素子の設定方法。
10. 光源部から放射された照明光の波面を変化させる補償光学素子を含み、前記波面が変化された前記照明光を対物レンズを介して標本に照射する照明光学系と、
    前記標本からの光を検出部へ導く検出光学系と、
    前記補償光学素子を制御する制御部と、を有し、
    前記制御部は、請求項１〜９のいずれか一項に記載の補償光学素子の設定方法により前記補償光学素子を設定することを特徴とする顕微鏡。

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