JP3529380B2 - 走査型光学顕微鏡 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【０００１】本発明は、標本からの蛍光を複数の波長域
に分光し、各波長域の蛍光を検出する走査型光学顕微鏡
に関する。

【背景技術】

【０００２】特開平８−４３７３９号公報には、レーザ
ー光を対物レンズにより集光して標本上にスポット光を
結ばせ、光走査手段によりそのスポット光を標本上で２
次元に走査し、標本からの蛍光をグレーティングにより
分光し、分光された光の幅を可変可能なスリットを通し
て検出する共焦点走査型レーザー顕微鏡が開示されてい
る。

【０００３】図６は、上記共焦点走査型レーザー顕微鏡
の構成を示す図である。図６に示すように、レーザー光
源１０１から出射されたレーザー光は、ビームエクスパ
ンダ１０２、ダイクロイックミラー１０４、Ｘ−Ｙ走査
光学系１０５、瞳投影レンズ１０６、顕微鏡１０７を順
次介して標本１０９に導かれる。また測光分離手段は、
標本１０９からの蛍光を分離するダイクロイックミラー
１０４、共焦点光学系１０８、グレーティング１１９、
光の幅を変更可能なスリット１１０，１１１，１１２、
集光レンズ１１６，１１７，１１８、光検出器１１３，
１１４，１１５からなる。

【０００４】このような構成において、標本１０９から
の蛍光は、顕微鏡１０７、瞳投影レンズ１０６、Ｘ−Ｙ
走査光学系１０５、ダイクロイックミラー１０４、共焦
点光学系１０８を順次通過した後、グレーティング１１
９に至り、その波長に合わせ分光される。分光された各
蛍光には、それぞれスリット１１０，１１１，１１２、
及び光検出器１１３，１１４，１１５が対応しており、
各スリット１１０，１１１，１１２の幅を変化させるこ
とで、検出する各蛍光波長範囲を選択することができ
る。

【０００５】また特開平９−５０２２６９号公報には、
蛍光光束をプリズム等のスペクトル分解手段により分光
し、一方では第一スペクトル範囲を絞り込み、他方では
絞りを通過しないスペクトル範囲の少なくとも一部分を
反射して第二スペクトル範囲をなす二つの光路を構成
し、それぞれの光路に対して光検出器を設けた共焦点走
査型レーザー顕微鏡が開示されている。

【０００６】図７は、上記共焦点走査型レーザー顕微鏡
の構成を示す図である。図７に示すように、レーザー光
源２０２から出射されたレーザー光束２０３は、方向変
更ミラー２０４、レーザーラインフィルタ２０５、レン
ズ２０６、絞り２０７を介してダイクロイックミラー２
０８で反射され、レンズ２０９、Ｘ−Ｙ走査光学系２１
０、瞳投影レンズ２１１、対物レンズ２１２を経て標本
２１３に達する。標本２１３からの反射光及び蛍光から
なる光束２１４は、対物レンズ２１２、瞳投影レンズ２
１１、Ｘ−Ｙ走査光学系２１０、レンズ２０９を経てダ
イクロイックミラー２０８に戻る。そして、光束２１４
はダイクロイックミラー２０８を透過し、共焦点絞り２
１５を介して分光器２１６に入る。

【０００７】図８は、分光器２１６の構成を示す図であ
る。選択装置２２５は、光束２１４を分解するスペクト
ル分解手段２２７と、一方では第一スペクトル範囲２２
９を絞り込み他方では絞りを通過しないスペクトル範囲
の少なくとも一部分２３０を反射する手段２２８とを有
している。光検出装置２２６は、絞り込まれた第一スペ
クトル範囲２２９の光路に配置された第一光検出器２３
１と、反射されたスペクトル範囲の光路に設置された第
二光検出器２３２とを有している。さらに選択装置２２
５は、反射されたスペクトル範囲２３０の光路に設置さ
れ、第二スペクトル範囲２３４を絞り込む手段２３３を
有する。第二光検出器２３２は、絞り込まれた第二スペ
クトル範囲２３４の光路に設置されている。

【０００８】一方、近年蛍光観察においては、単染色の
みならず、多重染色が多用されている。もとより、蛍光
染色は細胞、組織内の特定対象を視認可能にするために
行なわれる。このため多重染色観察では、各染色部位が
明確な色の差、即ち蛍光波長の違いとして検出されなけ
ればならない。しかも、蛍光波長の部分的な重なり（ク
ロスオーバー部分）を効率良く除去して検出する必要が
ある。さらに蛍光観察においては、高いコントラストと
高い光学分解能が要求される。走査型共焦点レーザー顕
微鏡はこれらの要求を満たすものであり、近年、生物分
野の研究目的で広く利用されるようになっている。

【０００９】上記特開平８−４３７３９号公報及び特開
平９−５０２２６９号公報では、いずれも走査型共焦点
レーザー顕微鏡をベースに、多重染色の蛍光分離手段と
して、プリズムや回折格子のようなスペクトル分解手段
と、蛍光波長域を制限するためのスリットで構成するこ
とにより、共焦点顕微鏡のもつ高コントラストと高分解
能を実現しつつ、多重染色標本からの蛍光をクロスオー
バーさせることなく、高い効率で検出することを可能に
している。

【特許文献１】特許文献１は、特開平８−４３７３９号
公報である。

【特許文献２】特許文献２は、特開平９−５０２２６９
号公報である。

【発明の開示】 【発明が解決しようとする課題】

【００１０】一般的に標本からの蛍光は、光検出器にフ
ォトマルチプライヤーを必要とするほど微弱である。ま
た、蛍光標本は励起光（レーザー光）を強く当てるほど
退色が激しくなるので、通常観察者は、標本の退色と得
られる画像ノイズのバランスを見て、許容できる範囲内
で可能な限り励起光量を下げようとする。したがってこ
の種の装置では、蛍光の損失を極力抑えることが極めて
重要なポイントになる。

【００１１】ここで例として、二つの蛍光色素（ＤＡＰ
Ｉ，ＣＹ５）で標識された標本をとりあげる。ＤＡＰＩ
はＵＶ域（３４０〜３６５ｎｍ）に吸収波長域を有し、
放出される蛍光波長は、そのピークがほぼ４５０ｎｍに
現れる。一方、ＣＹ５は赤色域（６３０〜６５０ｎｍ）
に吸収波長域を有し、蛍光波長は、そのピークがほぼ６
７０ｎｍに現れる。

【００１２】以下、これらの蛍光が結像位置で形成され
るスポットについて、図７を基に述べる。対物レンズ２
１２で標本２１３上にレーザースポットを形成し、標本
から放射される蛍光は、対物レンズ２１２、瞳投影レン
ズ２１１、Ｘ−Ｙ走査光学系２１０を経て、レンズ２０
９に入射する。さらに光束２１４はダイクロイックミラ
ー２０８を透過し、共焦点絞り２１５が配置されている
位置、すなわちレンズ２０９による結像位置にそのスポ
ットを結ぶ。なお、そのスポット径（回折径）は次式で
表わされる。

【００１３】φ＝１．２２×λ／ＮＡここでＮＡはレン
ズ２０９を出射する出射ＮＡであり、λは波長である。
この式から、ＤＡＰＩ（蛍光波長４５０ｎｍ）とＣＹ５
（蛍光波長６７０ｎｍ）のスポット径を比べると、ＣＹ
５の方が約１．５倍ほど大きい。

【００１４】したがって上述した従来の技術では、共焦
点効果を確保するためにＤＡＰＩのスポット径に合わせ
て共焦点絞り２１５の径を設定することになる。これは
ＤＡＰＩに対しては最適に設定されていることになる
が、ＣＹ５に対しては、不必要に共焦点絞り２１５によ
り絞られてしまい、貴重な蛍光を失ってしまう。逆に、
共焦点絞り２１５の径をＣＹ５に合わせると、ＤＡＰＩ
は十分な共焦点効果が得られないという欠点がある。

【００１５】また、図８に示した特開平９−５０２２６
９号公報の構成では、光束２１４がスペクトル分解手段
２２７でスペクトル分解され、一方では第一スペクトル
範囲２２９を絞り込み、他方では絞りを通過しないスペ
クトル範囲の少なくとも一部分２３０を反射する手段２
２８（可変スリット）で、各蛍光の波長域に分割してい
る。しかし、スペクトル分解手段として図８に示すよう
なプリズムを用いている場合は、光束２１４の光束径が
大きいと、十分な精度で各検出光路に分割されないとい
う欠点がある。

【００１６】本発明の第一の目的は、多重染色時の各蛍
光波長に対して、共焦点効果を落とすことなく、かつ蛍
光を損失することなく光検出器に導くことができる走査
型光学顕微鏡を提供することにある。本発明の第二の目
的は、多重染色時の各蛍光波長に対して、精度良く各検
出光路に分割することができる走査型光学顕微鏡を提供
することにある。

【課題を解決するための手段】

【００１７】上記課題を解決し目的を達成するために、
本発明の走査型光学顕微鏡は以下の如く構成されてい
る。 （１）本発明の走査型光学顕微鏡は、レーザー光源から
のレーザー光で標本を走査する走査型光学顕微鏡におい
て、前記標本からの蛍光を前記レーザ光源と前記標本を
結ぶ光路から分岐させるビームスプリッタと、前記ビー
ムスプリッタで分岐された光路上に配置され蛍光を分光
するスペクトル分解手段と、前記スペクトル分解手段で
分光された蛍光を複数の波長域に分割する波長域分割手
段と、前記複数の波長域に分割された各光路にそれぞれ
設けられ、前記標本からの蛍光を検出する複数のサイド
オン型フォトマルチプライヤと、を具備し、前記サイド
オン型フォトマルチプライヤの軸心方向が、前記スペク
トル分解手段によりスペクトル分解される面にほぼ平行
であるようにした。

【００１８】（２）本発明の走査型光学顕微鏡は上記
（１）に記載の顕微鏡であり、かつ前記複数の波長域に
分割された各光路における前記サイドオン型フォトマル
チプライヤの手前に、前記標本からの蛍光を結像する結
像光学系と、前記結像光学系の焦点位置に配置された共
焦点絞りとをそれぞれ設けている。

【００１９】（３）本発明の走査型光学顕微鏡は上記
（２）に記載の顕微鏡であり、かつ前記スペクトル分解
手段はスペクトル分解された光束を平行に出射する光学
手段を有する。 （４）本発明の走査型光学顕微鏡は上記（１）に記載の
顕微鏡であり、かつ前記標本からの蛍光を分離するため
のビームスプリッタと前記スペクトル分解手段との間
に、光束を縮小する縮小光学系を設けている。

【００２０】上記手段を講じた結果、それぞれ以下のよ
うな作用を奏する。（１）本発明の走査型光学顕微鏡に
よれば、多重染色された標本からの各蛍光は、スペクト
ル分解されて各蛍光が有する波長域に光路を分割され
る。これらの光を光検出器としてのサイドオン型フォト
マルチプライヤに導くにあたり、その軸心方向が、前記
スペクトル分解手段によりスペクトル分解される面、す
なわちスペクトル分解された光の分散方向にほぼ平行で
あるようにした。これにより、サイドオン型フォトマル
チプライヤの感度分布が広がる軸方向に検出光の広がり
方向が一致するので、蛍光を損失することなく光検出器
に導くことができる。

【００２１】（２）本発明の走査型光学顕微鏡によれ
ば、各蛍光が有する波長域に分割された光路のそれぞれ
に、標本からの蛍光を結像する結像光学系と、結像光学
系の焦点位置に配置された共焦点絞りとが設けられてい
るので、各共焦点絞りを各波長域に最適な絞り径に設定
することができる。これにより、蛍光を損失することな
く完全な共焦点効果を得ることができる。

【００２２】（３）本発明の走査型光学顕微鏡によれ
ば、スペクトル分解され、各検出光路に波長分解された
光束が平行に出射するので、これらの光束は全て共焦点
位置に集光する。したがって、この位置に共焦点絞りを
配置するだけで上記（２）の走査型光学顕微鏡を構成で
きる。また各検出光路において、光束を分離した後の光
路に共焦点絞り及び光検出器を配置するだけで、独立し
た共焦点光学系を設けることができるので、装置を簡易
かつ安価に構成できる。 （４）本発明の走査型光学顕微鏡によれば、前記スペク
トル分解手段はプリズムであり、標本からの各蛍光の光
束がスペクトル分解手段に入射する前に縮小されるの
で、蛍光を精度良く各検出光路に分割することができ
る。

【発明の効果】

【００２３】本発明によれば、多重染色時の各蛍光波長
に対して、共焦点効果を落とすことなく、かつ蛍光を損
失することなく光検出器に導くことができる走査型光学
顕微鏡を提供できる。また本発明によれば、多重染色時
の各蛍光波長に対して、精度良く各検出光路に分割する
ことができる走査型光学顕微鏡を提供できる。

【発明を実施するための最良の形態】

【００２４】（第１の実施の形態）図１及び図２は、本
発明の第１の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の構成
を示す図である。図１に示すように、レーザー光源１
は、アルゴン、クリプトン混合ガスレーザーの光源であ
る。このレーザー光源１から出射されたレーザー光は、
ビームエクスパンダ２、波長選択フィルタ３、ビームス
プリッタ４、Ｘ−Ｙ走査光学系５、瞳投影レンズ６、結
像レンズ７、対物レンズ８を順次介して、標本９に導か
れる。

【００２５】レーザー光源１により、主に３５１ｎｍ，
４８８ｎｍのアルゴン線、及び５６８ｎｍ，６４７ｎｍ
のクリプトン線が放射される。ビームエクスパンダ２は
レーザー光の光径が対物レンズ８の瞳径をほぼ満たすよ
うに設定されている。またビームスプリッタ４は、到達
した光の２０％程度を反射し、８０％程度を透過する。

【００２６】波長選択フィルタ３は、３５１ｎｍ，４８
８ｎｍ，５６８ｎｍ，６４７ｎｍの波長を選択的に透過
する。標本９は、色素ＤＡＰＩ，ＦＩＴＣ，Ｔｅｘａｓ
Ｒｅｄ，ＣＹ５で四重染色されており、ＤＡＰＩはア
ルゴン線３５１ｎｍで、ＦＩＴＣはアルゴン線４８８ｎ
ｍで、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄはクリプトン線５６８ｎｍ
で、ＣＹ５はクリプトン線６４７ｎｍで、それぞれ励起
される。

【００２７】上記励起によって、ＤＡＰＩはほぼ４５０
ｎｍにピークをもつ蛍光を放出する。同様にＦＩＴＣは
５３０ｎｍに、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄは６１０ｎｍに、Ｃ
Ｙ５は６７０ｎｍにピークをもつ蛍光を放出する。これ
らの蛍光は対物レンズ８、結像レンズ７、瞳投影レンズ
６、Ｘ−Ｙ走査光学系５を経て、ビームスプリッタ４を
通過する。

【００２８】ビームスプリッタ４を通過した光束２０
は、光束を縮小する縮小光学系１０を通過して縮小さ
れ、光束２１が形成される。光束２１はプリズム１１ａ
を通過してそのスペクトルが分解され、プリズム１１ａ
と光学的に同一のプリズム１１ｂによりスペクトルが分
解された光束が平行光束２２として形成され、三角ミラ
ー１２ａに入射する。三角ミラー１２ａは入射軸に対し
て垂直な方向に移動可能に構成されており、ここでは約
５７０ｎｍを境に左右の光路に蛍光光束が分離されるよ
うに設定されている。この結果、ＤＡＰＩとＦＩＴＣの
蛍光は光束２３ａとして、またＴｅｘａｓ ＲｅｄとＣ
Ｙ５の蛍光は光束２３ｂとして分離される。

【００２９】光束２３ａは、さらに三角ミラー１２ｂに
入射する。三角ミラー１２ｂも入射軸に対して垂直な方
向に移動可能に構成されており、ここでは約４９０ｎｍ
を境に左右の光路に蛍光光束が分離されるように設定さ
れている。この結果、ＤＡＰＩの蛍光は光束２４ｂとし
て、またＦＩＴＣの蛍光は光束２４ａとして分離され
る。

【００３０】もう一方の光束２３ｂは、同様に三角ミラ
ー１２ｃに入射する。三角ミラー１２ｃも入射軸に対し
て垂直な方向に移動可能に構成されており、ここでは約
６５０ｎｍを境に左右の光路に光束が分離されるように
設定されている。この結果、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄの蛍光
は光束２４ｃとして、またＣＹ５の蛍光は光束２４ｄと
して分離される。

【００３１】各光束２４ａ，２４ｂ，２４ｃ，２４ｄ
は、それぞれ幅が可変であり光軸に垂直な方向に移動可
能なスリット１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄにより、
標本からの励起光の戻り光と、蛍光波長の部分的な重な
り部分（蛍光のクロスオーバー部分）が制限される。ス
リット１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄを通過した各蛍
光光束はそれぞれ共焦点レンズ１４ａ，１４ｂ，１４
ｃ，１４ｄに入射する。各光束２４ａ，２４ｂ，２４
ｃ，２４ｄは平行光束で出射しているので、その焦点位
置に配置された共焦点絞り１５ａ，１５ｂ，１５ｃ，１
５ｄの位置に集光し、これら共焦点絞りを通過して、フ
ォトマルチプライヤー１６ａ，１６ｂ，１６ｃ，１６ｄ
で検出される。

【００３２】ここで、共焦点絞りはそれぞれ下式で計算
された絞り径に設定されている。φ＝１．２２×λ／Ｎ
Ａここで、ＮＡは共焦点レンズ１４ａ，１４ｂ，１４
ｃ，１４ｄを出射する出射ＮＡであり、λは蛍光波長で
ある。

【００３３】したがって、ＤＡＰＩ，ＦＩＴＣ，Ｔｅｘ
ａｓ Ｒｅｄ，ＣＹ５の各蛍光に対して、蛍光を損失す
ることなく、最高の共焦点効果を得ることができる。ま
た、フォトマルチプライヤー１６ａ，１６ｂ，１６ｃ，
１６ｄは、サイドオン型であって、その軸心方向はプリ
ズム１１ａによりスペクトル分解される面とほぼ平行に
なるように構成されている。サイドオン型のフォトマル
チプライヤーは、一般的に高感度でありながらヘッドオ
ン型のフォトマルチプライヤーより安価であり、走査型
の共焦点レーザー顕微鏡によく用いられる。しかしなが
ら、サイドオン型のフォトマルチプライヤーは軸方向の
感度分布に大きな差は見られないが、軸方向と垂直な方
向には感度に大きな差があり、この点がヘッドオン型の
フォトマルチプライヤーより劣る点である。なお参考と
して、図３にサイドオン型のフォトマルチプライヤーの
感度分布のデータを示す。

【００３４】本実施の形態では、サイドオン型フォトマ
ルチプライヤーの軸心方向が、プリズム１１ａによりス
ペクトル分解される面とほぼ平行になるように構成して
いるので、サイドオン型のフォトマルチプライヤーの感
度分布がほとんど問題にならない。

【００３５】以上、標本９が四重染色標本である場合に
各蛍光を各検出光路に導く方法について示したが、標本
９が単染色であっても何ら問題なく対応できる。また、
標本９がＦＩＴＣで単染色されている場合、他の蛍光と
のクロスオーバーは考慮しなくてもよいので、得られる
蛍光を全て一つの光検出器で導けばよい。

【００３６】この場合、図２に示すように三角ミラー１
２ａ，１２ｂの位置を調整してＦＩＴＣを完全に取り込
めるように設定する。なお、図２において図１と同一な
部分には同一符号を付してある。また、図２において、
縮小光学系１０以下の構成は図１と同様であるので図示
を省略する。

【００３７】例えば、６００ｎｍ以下の光を完全に取り
込めるようにすれば、完全にＦＩＴＣの蛍光を取り込め
るので、三角ミラー１２ａ，１２ｂの位置を６００ｎｍ
以下の光を取り込めるように設定する。また、スリット
１３ｂは４８８ｎｍの励起光をカットし、６００ｎｍ以
下の光を取り込めるように設定すればよい。また、二重
染色、三重染色の場合も同様に簡単に対応できる。

【００３８】なお第１の実施の形態では、スペクトル分
解手段として光学的に同一な一対のプリズム１１ａ，１
１ｂを使用しているが、光学的に同一な一対の回折格
子、あるいはホログラムを使用してもよい。また、スペ
クトル分解された光束が平行光束として出射すればよい
ので、プリズムと回折光子のように異なる光学素子を組
合せてもよい。

【００３９】上述した第１の実施の形態によれば、三角
ミラーにより蛍光を複数の波長域に分割できるので、蛍
光検出光路数を自由に設定できる。この例では４チャン
ネル構成として示したが、目的に応じて、２チャンネル
構成、３チャンネル構成、あるいは５チャンネル以上の
構成に簡単に実施できる。また、サイドオン型フォトマ
ルチプライヤーの軸心方向が、プリズム１１ａによりス
ペクトル分解される面とほぼ平行になるように構成して
いるので、感度分布がほとんど問題にならない。このよ
うに安価なサイドオン型フォトマルチプライヤーを使用
できるので、装置を安価に構成することができる。

【００４０】（第２の実施の形態）図４及び図５は、本
発明の第２の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の構成
を示す図である。図４，図５において同一な部分には同
一符号を付してある。また、図４，図５において、縮小
光学系１０以下の構成は図１と同様であるので図示を省
略する。

【００４１】図１に示したレーザー光源１は、アルゴ
ン、クリプトン混合ガスレーザーの光源である。このレ
ーザー光源１から出射されたレーザー光は、第１の実施
の形態と同様に、ビームエクスパンダ２、波長選択フィ
ルタ３、ビームスプリッタ４、Ｘ−Ｙ走査光学系５、瞳
投影レンズ６、結像レンズ７、対物レンズ８を順次介し
て、標本９に導かれる。

【００４２】レーザー光源１により、主に４８８ｎｍの
アルゴン線、及び５６８ｎｍ、６４７ｎｍのクリプトン
線が放射される。ビームエクスパンダ２はレーザー光の
光径が対物レンズ８の瞳径をほぼ満たすように設定され
ている。またビームスプリッタ４は、到達した光の２０
％程度を反射し、８０％程度を透過する。

【００４３】波長選択フィルタ３は、４８８ｎｍ，５６
８ｎｍ，６４７ｎｍの波長を選択的に透過する。標本９
は、色素ＦＩＴＣ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，ＣＹ５で三重
染色されており、ＦＩＴＣはアルゴン線４８８ｎｍで、
Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄはクリプトン線５６８ｎｍで、ＣＹ
５はクリプトン線６４７ｎｍで、それぞれ励起される。

【００４４】上記励起によって、ＦＩＴＣはほぼ５３０
ｎｍにピークをもつ蛍光を放出する。同様にＴｅｘａｓ
Ｒｅｄは６１０ｎｍに、ＣＹ５は６７０ｎｍにピーク
をもつ蛍光を放出する。これらの蛍光は対物レンズ８、
結像レンズ７、瞳投影レンズ６、Ｘ−Ｙ走査光学系５を
経て、ビームスプリッタ４を透過する。

【００４５】ビームスプリッタ４を透過した光束２０
は、光束を縮小する縮小光学系１０を透過して縮小さ
れ、光束２１が形成される。光束２１はプリズム１１を
透過してそのスペクトルが分解され、レンズ３０に入射
する。レンズ３０はその焦点位置がプリズム１１への光
束の入射点１１ｘに一致するように配置されている。し
たがって、レンズ３０から射出するスペクトル分解され
た光束はスペクトル分解された面内においては平行光束
となって射出される。このスペクトル分解された光束は
ミラー３１ａ，３１ｂ，３１ｃにより各検出光路に分離
される。なおミラー３１ｂと３１ｃは入射光軸に対し４
５°方向に移動可能である。

【００４６】ミラー３１ｃの端面３１ｃｘは、ほぼ６４
７ｎｍの励起光が当たる位置に設定され、ミラー３１ｂ
の端面３１ｂｘは、ほぼ５６８ｎｍの励起光が当たる位
置に設定される。このような構成により、ＦＩＴＣの蛍
光は光束３３ａとして、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄの蛍光は光
束３３ｂとして、ＣＹ５の蛍光は光束３３ｃとして分離
される。なおミラー３１ａ，３１ｂ，３１ｃの位置はレ
ンズ３０の焦点位置から少しずれているが、縮小光学系
１０により光束系が縮小されているので、各検出光路へ
の分離を十分に精度良く行なうことができる。

【００４７】各光束３３ａ，３３ｂ，３３ｃは、それぞ
れ幅が可変であり光軸に垂直な方向に移動可能なスリッ
ト１３ａ，１３ｂ，１３ｃにより、標本からの励起光の
戻り光と、蛍光波長の部分的な重なり部分（蛍光のクロ
スオーバー部分）が制限される。スリット１３ａ，１３
ｂ，１３ｃは、レンズ３０の焦点位置に置かれている。
したがって、スペクトル分解された各光束はスリット位
置でスポットを結ぶので、スリットにより極めて高精度
に波長域を制限することができる。なおスリット１３
ａ，１３ｂ，１３ｃとミラー３１ａ，３１ｂ，３１ｃの
位置は、それらの中間的な位置にレンズ３０の焦点位置
がくるように設定してもよい。

【００４８】スリットを通過した各蛍光光束はそれぞれ
レンズ３４ａ，３４ｂ，３４ｃ及びプリズム３５ａ，３
５ｂ，３５ｃを透過する。レンズ３４ａ，３４ｂ，３４
ｃ及びプリズム３５ａ，３５ｂ，３５ｃは、それぞれレ
ンズ３０、プリズム１１と同一のものである。これによ
り、スペクトル分解された光束は各光路で合成され、そ
れぞれ光束４０ａ，４０ｂ，４０ｃとなって共焦点レン
ズ１４ａ，１４ｂ，１４ｃに入射し、その焦点位置に配
置された共焦点絞り１５ａ，１５ｂ，１５ｃを通過し、
紙面に対して垂直に軸がなすように配置されたフォトマ
ルチプライヤー１６ａ，１６ｂ，１６ｃで検出される。

【００４９】光束４０ａ，４０ｂ，４０ｃはスペクトル
が完全に合成されているので、第１の実施の形態とは異
なり、共焦点絞り１５ａ，１５ｂ，１５ｃを通過した後
にスペクトル分解された方向へ広がることはない。した
がって、フォトマルチプライヤー１６ａ，１６ｂ，１６
ｃを紙面に対して垂直に軸がなすように配置しても何ら
問題はない。

【００５０】ここで、共焦点絞りはそれぞれ下式で計算
された絞り径に設定されている。φ＝１．２２λ／ＮＡ
ここで、ＮＡは共焦点レンズ１４ａ，１４ｂ，１４ｃを
出射する出射ＮＡであり、λは蛍光波長である。

【００５１】したがって、ＦＩＴＣ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅ
ｄ，ＣＹ５の各蛍光に対して、蛍光を損失することな
く、最高の共焦点効果を得ることができる。なお、この
例では３チャンネル構成で示したが、３チャンネルに限
らず目的に応じてチャンネル数を設定できる。

【００５２】以上、標本９が三重染色標本である場合に
各蛍光を各検出光路に導く方法について示したが、標本
９が単染色であっても何ら問題なく対応できる。標本９
がＦＩＴＣで単染色されている場合、他の蛍光とのクロ
スオーバーは考慮しなくてもよいので、得られる蛍光を
全て一つの光検出器に導けばよい。

【００５３】この場合、図５に示すようにミラー３１ｃ
の位置を調整してＦＩＴＣを完全に取り込めるように設
定する。例えば６００ｎｍ以下の光を完全に取り込める
ようにすれば、完全にＦＩＴＣの蛍光を取り込めるの
で、ミラー３１ｃの位置を６００ｎｍ以下の光を取り込
めるように設定する。また、スリット１３ｃは４８８ｎ
ｍの励起光をカットし、６００ｎｍ以下の光を取り込め
るように設定すればよい。また、二重染色、三重染色の
場合も同様に簡単に対応できる。

【００５４】なお第２の実施の形態では、スペクトル分
解手段としてプリズムを使用しているが、回折格子、あ
るいはホログラムを使用してもよい。上述した第２の実
施の形態によれば、スペクトル分解された光束を結像レ
ンズ３０によりスポットとして形成しているので、この
位置に置かれたスリットにより、極めて精度良く蛍光の
波長域を制限することができる。また、光束２１のプリ
ズム１１への入射位置１１ｘにレンズ３０の焦点が一致
するように構成しているので、レンズ３０を出射するス
ペクトル分解された光束はスペクトル分離された面内に
おいては平行になる。したがって、レンズ３０、プリズ
ム１１と同一のものをレンズ３４ａ，３４ｂ，３４ｃ、
プリズム３５ａ，３５ｂ，３５ｃとして使用できるの
で、装置を簡易にかつ安価に構成できる。本発明は上記
各実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲
で適時変形して実施できる。

【図面の簡単な説明】

【００５５】

【図１】本発明の第１の実施の形態に係る走査型光学顕
微鏡の構成を示す図。

【図２】本発明の第１の実施の形態に係る走査型光学顕
微鏡の構成を示す図。

【図３】本発明の第１の実施の形態に係るサイドオン型
のフォトマルチプライヤーの感度分布のデータを示す
図。

【図４】本発明の第２の実施の形態に係る走査型光学顕
微鏡の構成を示す図。

【図５】本発明の第２の実施の形態に係る走査型光学顕
微鏡の構成を示す図。

【図６】従来例に係る共焦点走査型レーザー顕微鏡の構
成を示す図。

【図７】従来例に係る共焦点走査型レーザー顕微鏡の構
成を示す図。

【図８】従来例に係る分光器の構成を示す図。

【符号の説明】

【００５６】 １ レーザー光源 ２ ビームエクスパンダ ３ 波長選択フィルタ ４ ビームスプリッタ ５ Ｘ−Ｙ走査光学系 ６ 瞳投影レンズ ７ 結像レンズ ８ 対物レンズ ９ 標本 １０ 縮小光学系 １１，１１ａ，１１ｂ プリズム １２ａ，１２ｂ，１２ｃ 三角ミラー １３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ スリット １４ａ，１４ｂ，１４ｃ，１４ｄ 共焦点レンズ １５ａ，１５ｂ，１５ｃ，１５ｄ 共焦点絞り １６ａ，１６ｂ，１６ｃ，１６ｄ 光検出器 ２０ レーザー光源 ２１ 光束 ３０ レンズ ３１ａ，３１ｂ，３１ｃ ミラー ３３ａ，３３ｂ，３３ｃ 光束 ３４ａ，３４ｂ，３４ｃ レンズ ３５ａ，３５ｂ，３５ｃ プリズム ４０ａ，４０ｂ，４０ｃ 光束

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G02B 19/00 - 21/00 G02B 21/06 - 21/36 G01N 21/64 G01N 21/78 G01N 33/84

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】レーザー光源からのレーザー光で標本を走
   査する走査型光学顕微鏡において、 前記標本からの蛍光を前記レーザ光源と前記標本を結ぶ
   光路から分岐させるビームスプリッタと、 前記ビームスプリッタで分岐された光路上に配置され蛍
   光を 分光するスペクトル分解手段と、 前記スペクトル分解手段で分光された蛍光を複数の波長
   域に分割する波長域分割手段と、 前記複数の波長域に分割された各光路にそれぞれ設けら
   れ、前記標本からの蛍光を検出する複数のサイドオン型
   フォトマルチプライヤと、を具備し、 前記サイドオン型フォトマルチプライヤの軸心方向が、
   前記スペクトル分解手段によりスペクトル分解される面
   にほぼ平行であることを特徴とする走査型光学顕微鏡。
2. 【請求項２】前記複数の波長域に分割された各光路にお
   ける前記サイドオン型フォトマルチプライヤの手前に、
   前記標本からの蛍光を結像する結像光学系と、前記結像
   光学系の焦点位置に配置された共焦点絞りとをそれぞれ
   設けたことを特徴とする請求項１に記載の走査型光学顕
   微鏡。
3. 【請求項３】前記スペクトル分解手段は、スペクトル分
   解された光束を平行に出射する光学手段を有することを
   特徴とする請求項２に記載の走査型光学顕微鏡。
4. 【請求項４】前記標本からの蛍光を分離するためのビー
   ムスプリッタと前記スペクトル分解手段との間に、光束
   を縮小する縮小光学系を設けたことを特徴とする請求項
   １に記載の走査型光学顕微鏡。