JP5148873B2

JP5148873B2 - 臍帯組織由来の分娩後細胞、及びその作成及び使用方法

Info

Publication number: JP5148873B2
Application number: JP2006517783A
Authority: JP
Inventors: ミストリー、サンジェイ; キーム、アンソニー、ジェイ．; ハリス、イアン、ロス; ハーモン、アレクサンダー、エム．; メシーナ、ダリン、ジェイ．; セイダ、アグニーズカ; イ、チン−フェン; ゴシェウスカ、アンナ
Original assignee: Ethicon Inc
Current assignee: Ethicon Inc
Priority date: 2003-06-27
Filing date: 2004-06-25
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2024-06-25
Also published as: EP2338980A3; CA2530732A1; EP2341131A2; EP2338981A3; CA2530412C; EP2336298A2; US20170166864A1; WO2005038012A2; WO2005003334A2; ES2542070T3; ES2564044T3; EP2336298A3; AU2004252567B2; AU2004252570B2; CA2530255C; ES2597837T3; WO2005001078A2; US20050058631A1; AU2004252570A1; PL2338982T3

Description

【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年６月２７日に出願された米国仮出願番号第６０／４８３，２６４号に対して優先権を主張しており、この全体の内容はこの参照によって本明細書に組み込まれる。他の関連出願は、以下の同一出願人による同時係属出願：２００４年６月２５日に出願された米国特許番号第１０／８７７，４４６号、２００４年６月２５日に出願された米国特許番号第１０／８７７，２６９号、２００４年６月２５日に出願された米国特許番号第１０／８７７，４４５号、２００４年６月２５日に出願された米国特許番号１０／８７７，５４１号、２００４年６月２５日に出願された米国特許番号１０／８７７，００９号、２００４年６月２５日に出願された米国特許番号１０／８７６，９９８号、及び２００４年３月２４日に出願された米国仮出願番号第６０／５５５，９０８号を含み、これらそれぞれの全体の内容はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、哺乳類、好ましくはヒトの細胞療法に関するものであり、特に分娩後臍帯（ｕｍｂｉｌｉｃｕｓ）から派生された単離細胞、そのような細胞を派生する方法、及びそれらの使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
近年、疾患に対する理解が進むに従って、それらの病気の予後を改善するための細胞療法の潜在的な有用性によって、治療目的に効果がある新たな資源としてのヒト細胞への関心が高まった。そのようなヒト細胞の資源の一つとしては、分娩後の組織であり、特に臍（ｕｍｂｉｌｉｃｕｓ）及び臍帯である。
【０００４】
最近、臍帯血（或いは単に「臍帯血"ｃｏｒｄｂｌｏｄ"」）を、例えば、臍帯血を出生時に保存した個人が使用するための造血細胞の潜在的資源として保存しておくことが注目されている。そのような細胞は、例えば、免疫システムの機能の一部を消失させる放射線療法を必要とする個人にとって有用となる。さらには、拒絶をさけるために慎重に適合された骨髄ドナーを必要とするのではなく、その個人自身の保存された臍帯血を用い、失われた免疫細胞を再組成し、免疫機能を回復させることが出来る。
【０００５】
さらに最近、幹細胞が広い潜在的な治療適用を有していることから、臍帯血から幹細胞を得ることが注目されている。幹細胞は、１）１つの細胞から細胞分裂を経て長期間自己複製する能力を有していて、２）適切な条件を与えると特異的な細胞タイプに分化する能力を有している、細胞として一般的に理解されている。従って、幹細胞は、その人の臍帯血から幹細胞を最初に採取された人だけでなく、個人の集団を治療するために潜在的に有用である。
【０００６】
特に、臍帯血は、造血性前駆幹細胞の源として考えられていた。保存された（或いは凍結保存された）臍帯血、或いはそれらから単離された幹細胞は、例えば骨髄及び関連移植における造血性再構成に対して有用であると考えられた（Ｂｏｙｓｅｅｔａｌ．，米国特許番号第５，００４，６８１号、及び第５，１９２，５５３号）。
【０００７】
臍帯血に加えて、膠様組織（ワートンズジェリー；Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ）、臍静脈或いは動脈組織、及び臍帯基質自体から単離された細胞を含む、ヒト臍からの治療用細胞の他の源が探索された。そのような細胞は、大部分が未同定である、若しくはそれらの生理学的、生化学的、免疫学的及び遺伝的特性に関して最低限特徴付けられているのみである。
【０００８】
例えば、Ｐｕｒｃｈｉｏら（米国特許番号第５，９１９，７０２号）は、膠様組織から軟骨形成前駆細胞（或いは前軟骨細胞）を単離した。彼らは、血液或いは血管を除去し、前軟骨細胞が増殖するように意図された条件下で前記組織をインキュベートすることによるヒト臍帯膠様組織からの細胞の単離を報告した。それ自体では、その方法は、膠様組織の存在下で異なる細胞タイプから望ましい細胞を区別しなかったが、前記組織からの遊走、或いは前軟骨細胞に好都合な成長条件の選択に依存していた。前軟骨細胞は、それらが確立された後、有糸分裂的に増殖された。２〜４代継代された細胞は、ＢＭＰ−１３或いはＴＧＦ−ベータなどの外因性成長の添加によって誘発された場合、因子軟骨細胞を生産するのに有用であるとして報告された。直接注射或いは移植に対する前記細胞の使用、若しくはヒドロゲル或いは組織基質との使用が提案された。しかしながら、前記細胞が約２５％コンフルエンスを超えないことが重要であると考えられた。前記細胞は、それらの生化学的或いは免疫学的特性に関しては、若しくはそれらの遺伝子発現に関しては同定されていなかった。
【０００９】
Ｗｅｉｓｓら（米国特許公開番号第ＵＳ２００３／０１６１８１８号）は、哺乳類の膠様組織或いは非血管臍帯基質源からの多能性或いは系統‐関与細胞単離するための手段を提案した。単離された前記細胞は、造血、間葉系、或いは神経外胚葉株へ分化すると報告された。前記細胞株は、それらの同定される特性に関して特徴付けられていなかった。限られた特徴付けが神経株へと分化した後の細胞に関して提供された。膠様組織由来ウシ及びブタ細胞（ＣＤ３４⁻、ＣＤ４５⁻である）に対して述べた。
【００１０】
Ｗｅｉｓｓらは、ブタ臍帯基質細胞のラット脳への移植を研究したことも報告した（Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒ．１８２：２８８〜２９９，２００３）。単離手段において酵素処理は用いなかった。彼らは、２つの異なる集団である球状間葉細胞及び扁平間葉細胞を得た。前記細胞は、ＧＦＰを発現するように遺伝的に修飾されていた。前記細胞は、異種間で移植された場合、免疫拒絶を刺激するように見えなかった。
Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２１：５０〜６０、２００３）は、ブタ臍帯からの膠様組織基質細胞の獲得を報告した。未分化細胞は、テロメラーゼに対してポジティブであると報告され、分集団もｃ−ｋｉｔ発現に対してポジティブである、すなわちポリメラーゼ^＋、ＣＤ１１７^＋であると報告された。前記細胞は、それらの筋線維芽細胞様性質の指標であるアルファ−平滑筋アクチンを産生するとも報告された。前記細胞は、成長因子の存在下で神経株に沿って分化することができたとされた。しかしながら、分化細胞及び未分化細胞の両者は、神経幹細胞に対するマーカーであるＮＳＥを発現することが見出された。増殖能力、核型解析、及びＨＬＡ抗原の発現の観点では、クローン株及び特徴付けの必要性が認識されていた。
【００１１】
Ｒｏｍａｎｏｖら（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２１（１）：１０５〜１１０、２００３）は、ヒト臍帯静脈からの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）様細胞を単離する手順を報告した。彼らの手順は、切除された静脈組織のコラゲナーゼによる処理を含み、目的（静脈の内皮下層）の細胞集団を獲得するために短い（１５分）酵素消化を必要とした。特に、前記手順では、組織無処置の深層を残し、外層のみを意図的に除去することによって、平滑筋（ＭＳＣｓ）及び線維芽細胞の包含を回避していた。結果生じた"ほぼ同種の"細胞集団は、回避することが求められていた内皮細胞を約０．５〜１％含むことが報告された。前記細胞は、主にＣＤ３４−であり、アルファ−平滑筋アクチンを産生することが報告された。
【００１２】
臍帯基質において見出された細胞集団の多様性のために、哺乳類臍帯に由来した、定義された非血液細胞とそれらの集団を単離する方法が本分野において必要とされており、さらに、それらの生化学的（例えば、成長因子の分泌）、免疫学的（細胞表面マーカー及び免疫反応を刺激する能力）、及び様々な遺伝子の発現に関して特徴付けられた哺乳類臍帯に由来した細胞株も必要とされていた。この必要性は、特にヒト臍帯に由来した細胞に対して切実なものである。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１３】
第１の観点において、本発明は、実質的に血液を含まない哺乳類臍帯組織に由来した単離された臍帯由来細胞（ＵＤＣｓ）を提供するものである。前記細胞は、培養において自己複製及び増殖することができる。前記臍帯由来細胞は、他の表現型の細胞へ分化する能力を有している。好ましい実施形態において、前記細胞は、ヒト臍帯から派生されたものである。
【００１４】
前記細胞は、それらの細胞性、遺伝的、免疫学的、及び生化学的特性のいくつかに関してと同定されていた。例えば、前記細胞は、培養におけるそれらの成長特性によって、それらの細胞表面マーカーによって、それらの遺伝子発現によって、特定の生化学栄養因子を産生する能力によって、及びそれらの免疫学的特性によって同定されていた。
【００１５】
特定の実施形態において、分娩後由来細胞は、臍帯由来細胞である。他の実施形態において、それは胎盤由来細胞である。特定の実施形態において、前記細胞は、細胞タイプＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６０６７）、若しくはＵＭＢ０２２８０３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６０６８）の同定された特徴を全て有している。
【００１６】
別のいくつかの観点において、本発明の単離された臍帯由来細胞を含む細胞培養が提供される。臍帯細胞の培養は、ある好ましい実施形態において母性細胞は含まないものである。
【００１７】
臍帯由来細胞を培養し増殖する方法、細胞培養、及びそれらを含む集団が提供される。
【００１８】
本発明の別の観点において、特異的な細胞表面マーカー発現特性を持つ、単離された臍帯由来細胞が提供され、ここにおいて、特異的細胞表面マーカータンパク質が産生されるものである。特に、前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１４１、ＰＤＧＦｒ−アルファ、或いはＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの１若しくはそれ以上を産生する。加えて、前記細胞は、フローサイトメトリーによって検出されたように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、或いはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの１若しくはそれ以上は産生しない。
【００１９】
本発明の細胞は、幅広い遺伝子の発現に従っても特徴付けられる。従って、本発明の別の観点は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連した、単離された臍帯由来細胞を提供し、この細胞は、低身長感受性（ｓｈｏｒｔｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス（ＳＨＯＸ）２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２クローンから）、間葉ホメオボックス２（成長停止−特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンアルファＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連性活性化因子２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃ相同体３（ＳＨ３）及びシステインリッチドメイン、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、インターロイキン１１受容体アルファ、プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮想上遺伝子ＢＣ００８９６７、８型コラーゲンアルファ１、テネイシンＣ（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイ相同体タンパク質５、へファエスチン（ｈｅｐｈａｅｓｔｉｎ）、インテグリンベータ８、シナプス小胞糖タンパク質２、神経芽細胞腫の腫瘍原性１の抑制、インスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）、ヒトｃＤＮＡＦＬＪ１２２８０ｆｉｓのクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャネルのサブファミリーＮメンバー４、インテグリンベータ７、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写性活性化補助因子（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、小胞関連性膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮想上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−アルファヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプＩＩ）、バイグリカン、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写性活性化補助因子（ＴＡＺ）、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンベータ様１（ＥＧＦ−ｌｉｋｅ反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ１９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿性ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿性ペプチド受容体Ｃ）、仮想上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２クローンから）、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂの１９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、及びシトクロームＣオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）の少なくとも１つの発現が減少しているものである。加えて、これらの単離されたヒト臍帯由来細胞は、インターロイキン８、レチクロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、アルファ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３のそれぞれに対する遺伝子を発現し、その発現は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、腸骨稜骨髄細胞、或いは胎盤由来細胞であるヒト細胞の発現と比較して増加しているものである。前記細胞は、培養で自己複製及び増殖することができ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有している。さらに、前記単離されたヒト臍帯由来細胞を有する治療用細胞培養も提供される。
【００２０】
別のいくつか観点において、本発明は、培養で自己複製及び増殖することができ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する、単離されたヒト臍帯由来細胞を提供し、ここにおいて前記細胞は、混合リンパ球反応において、同種リンパ球を刺激せず、ＰＤ−Ｌ２を発現するが、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１７８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、或いはＢ７−Ｈ２は発現しないものである。いくつかの好ましい実施形態において、前記細胞は、同種ＰＢＭＣｓを刺激しない。より好ましくは、それらは同種リンパ球、同種Ｔ細胞、或いは未処理Ｔ細胞を刺激しない、若しくは適合した或いは適合しないレシピエントにおいて他の有害な免疫反応を産生しないものである。前記細胞は、特定の実施形態において、ビメンチン及びアルファ−平滑筋アクチンも産生することができる。
【００２１】
別の観点において、本発明は、血管新生因子ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、或いはＴＩＭＰ１の１若しくはそれ以上を分泌する、単離されたヒト臍帯由来細胞を提供する。特定の実施形態において、前記細胞は、前述した分子のいくつか、或いは全てを分泌する。別の実施形態において、前記細胞は、ＥＬＩＳＡによって検出されたように、血管新生因子ＳＤＳ−１アルファ、ＴＧＦ−ベータ２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、或いはＶＥＧＦの１若しくはそれ以上を分泌しない。特定の実施形態において、前記細胞は、それらの分子の少しだけ分泌する、若しくは全く分泌しない。
【００２２】
本発明の別の観点において、治療用細胞培養が提供され、前記細胞培養は、血管新生−刺激栄養因子を必要とする患者を治療する際に用いるための、上述されたような単離された細胞を有するものである。そのような治療用細胞培養は、神経成長刺激栄養因子を必要とする治療を治療する際に用いるためにも提供される。
【００２３】
血液を含まないヒト臍帯組織から細胞を派生する方法が提供される。前記細胞は、培養で自己複製及び増殖することができ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有するものである。前記方法は、（ａ）ヒト臍帯組織を入手する工程と、（ｂ）実質的に全ての血液を除去し、実質的に血液を含まない臍帯組織を得る工程と、（ｃ）機械的あるいは酵素的処理、若しくはその両者の処理によって前記組織を分離する工程と、（ｄ）培養液に前記細胞を再懸濁する工程と、及び（ｅ）培養において自己複製及び増殖でき、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する、ヒト臍帯由来細胞の成長を可能にする成長条件を提供する工程とを有するものである。好ましい方法は、例えば、コラゲナーゼ、及びディスパーゼ、或いはコラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼなどでの酵素処理を含み、そのような方法は本発明において提供される。
【００２４】
上記の方法によって派生された単離されたヒト臍帯由来細胞は、本発明において提供される。前記細胞は、特定の実施形態において、継代を繰り返したにも関わらず一貫して正常な核型を維持する。さらに、上記の方法によって派生されたヒト臍帯由来細胞の培養も提供され、ここにおいて前記培養は、母性細胞を含まないものである。
【００２５】
細胞を含む共培養、或いは他の哺乳類細胞を有する本発明の培養も、本発明で提供される。好ましくは、これら共培養は、別のヒト細胞株を有しており、例えば、その別のヒト細胞株の成長や治療用潜在能力は、臍帯由来細胞の存在によって改善されるようなものである。そのような共培養は、ｉｎｖｉｔｒｏ或いはｉｎｖｉｖｏでの治療適用に対して有用である。
【００２６】
さらに本発明では、臍帯由来細胞、及び別の治療薬、因子或いは生理活性因子を有する治療用組成物が提供される。そのような因子は、これに限定されるものではないが、ＩＧＦ、ＬＩＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、さらには、抗血栓形成因子、抗アポトーシス因子、抗炎症因子、免疫抑制性或いは免疫調節性因子、及び抗酸化剤を含む。そのような治療用組成物はさらに、ＵＤＣｓに加えて１若しくはそれ以上の付加的細胞タイプ、及び生理活性構成成分を有することができる。
【００２７】
上記に加えて、前記細胞から由来した組成物が本発明で提供される。細胞溶解液、可溶化細胞画分、及び膜濃縮細胞画分が、本発明で提供される。例えば基底膜を有する、前記細胞に由来した細胞外基質も、本発明において有用であり、提供されるものである。
【００２８】
本発明の組成物は、本発明で提供されるように、条件培養液も含む。そのような培養液は、まず本発明の細胞或いは培養の成長に使用され、成長の間、１若しくはそれ以上の有用な産物を前記培養液に分泌するものである。これら新規細胞からの条件培養液は、例えば、本発明の細胞或いは培養によって前記培養液に分泌された成長因子或いは栄養因子を必要とする他の哺乳類細胞の成長を補助する、及び例えば血管新生を促進する、などの多くの目的に対して有用である。
【００２９】
様々な細胞の前駆体へ、もしくは最終分化細胞自体へと向かう経路に沿って分化するように細胞を誘導する方法が提供される。そのような細胞は、特定の状態、疾患及び病状の治療上処置に対して有用である。そのような細胞はさらに、治療薬を同定するためのアッセイにおける使用などの、診断プロトコールにも有用である。
【００３０】
本発明は、治療的使用に対する分化した臍帯由来細胞或いは前駆体を利用する方法も提供し、この治療的使用は、これに限定されるものではないが、血管新生適用、神経細胞適用、柔組織適用、眼球適用、及び前記細胞が心臓、腎臓、骨、軟骨、膵臓、肝臓及び他の組織に、単独で若しくは他の治療薬との組み合わせで有用である適用を含む。
【００３１】
本発明ではキットも提供される。臍帯由来細胞の成長、単離、及び使用に有用なキットが提供される。
【００３２】
本発明のこれら観点及び更なる観点は、以下に詳細に記載されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
定義
本明細書及び請求項において使用された様々な用語は、以下に説明したように定義されるものである。
【００３４】
幹細胞とは、自己複製し、自己複製前駆体、非複製前駆体、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を産生するように分化する１つの細胞の能力によって定義された未分化細胞である。幹細胞は、複数胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系列へｉｎｖｉｔｒｏで分化するそれらの能力、さらに移植後様々な胚葉の組織を生じ、実質的にほぼ全てに、全てではない場合は胚盤胞への注入後の組織に寄与する能力によっても同定される。
【００３５】
幹細胞は、（１）全能性、（２）多能性、（３）多分化能、（４）少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）、及び（５）単能性としてのそれらの発生潜在能力に従って分類される。全能性細胞は、全ての胚性及び胚外細胞タイプを生じることができる。多能性細胞は、全ての胚性細胞タイプを生じることができる。多分化能細胞は、細胞系列のサブセットを生じることができる細胞を含むが、それら全ては、特定の組織、器官或いは生理システム（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ：自己複製）、血液細胞に限定された少能性前駆体を含む前駆体を産生できる造血幹細胞（ＨＳＣ）、及び血液の正常構成成分である全ての細胞タイプ及び成分（例えば血小板））の範囲内である。少能性の細胞は、多分化能幹細胞に比べて、細胞系列のより限定されたサブセットを生じることができ、単能性の細胞は、１つの細胞系列（例えば精子形成幹細胞）を生じることができる。
【００３６】
幹細胞は、それらを獲得される源に基づいても分類される。成体幹細胞は一般的に、複数の分化した細胞タイプにおいて見出される多分化能未分化細胞である。前記成体幹細胞は、自身を複製できる。正常な環境下で、それは、それが由来する組織の、場合により他の組織タイプの特異的細胞タイプを産生するように分化することもできる。胚性幹細胞は、胚盤胞段階の胚の内部細胞塊からの多能性細胞である。胎性幹細胞は、胎児組織或いは膜から由来する細胞である。分娩後幹細胞は、実質的には、出生後利用可能な胚外組織、すなわち、胎盤及び臍帯から由来する多分化能細胞或いは多能性細胞である。これらの細胞は、素早い増殖、及び多くの細胞系列へ分化する能力を含む多能性幹細胞の特性を有するように見られた。分娩後幹細胞は、血液由来（例えば、臍帯血から得られた細胞など）、或いは非血液由来（例えば、臍帯及び胎盤の非血液組織から得られた細胞など）である。
【００３７】
胚性組織は、一般的に、胚（ヒトでは受精から発生の約６週目までの期間と言及されている）から由来した組織として定義されている。胎性組織は、胎児から由来した組織を意味しており、これはヒトでは発生の約６週目から分娩までの期間と言及されている。胚外組織は、そこから由来はしていないが、胎児の胚に関連した組織である。胚外組織は、胚外膜（絨毛膜、羊膜、卵黄嚢、及び尿膜）、臍帯、及び胎盤（それ自身は絨毛膜、及び母性脱落膜底部から形成される）を含む。
【００３８】
分化とは、未分化（"不確定"）或いはほとんど分化していない細胞が、例えば神経細胞或いは筋細胞などの分化細胞の特性を獲得する過程である。分化した細胞は、細胞の系列内でより分化した（"確定した"）状態を形成した細胞である。確定したという用語は、分化の過程に適用された場合、正常環境下で、特異的な細胞タイプ若しくは細胞タイプのサブセットへと分化し続けるポイントへと分化経路を進んだが、正常環境下で、異なる細胞タイプへ分化する或いはほとんど分化していない細胞タイプへ復帰することはできない細胞を言及する。脱分化という用語は、細胞の系列内で細胞がほぼ分化（或いは確定）していない状態へ復帰する過程を意味する。本明細書で用いられたように、細胞の系列とは、細胞の遺伝、すなわち、どの細胞から由来したか、どのような細胞を生じるかなどを定義するものである。前記細胞の系列は、発生及び分化の遺伝スキーム内に前記細胞を配置するものである。
【００３９】
広義には、前駆体細胞は、それ自身に比べてより分化した子孫を産生する能力を有し、前駆体のプールを補充する能力をまだ保持する細胞である。この定義によると、幹細胞それ自身も前駆体細胞であり、最終分化細胞に対するより即効性のある前駆型（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）である。本発明の細胞を言及する際、以下に詳細に記載されたように、前駆体細胞のこの広い定義が用いられるものである。狭義では、前駆体細胞は、分化経路における中間体である、すなわち、それは幹細胞から生じ、成熟細胞タイプ或いは細胞タイプのサブセットの産生における中間体である細胞としてしばしば定義される。このタイプの前駆体細胞は、一般的に自己複製できない。従って、このタイプの細胞が本明細書で言及された場合、非自己複製前駆体細胞として、或いは中間体前駆体或いは前駆細胞として言及されるものである。
【００４０】
本明細書で用いられたように、中胚葉、外胚葉或いは内胚葉へ分化するというフレーズは、それぞれ、特異的な中胚葉、外胚葉或いは内胚葉に確定されるようになる細胞を意味している。中胚葉へ分化する、或いは特異的な中胚葉細胞を生じる細胞の例としては、これに限定されるものではないが、脂肪生成細胞、軟骨形成細胞、心原性細胞、皮膚形成細胞、造血性細胞、血液血管性細胞、筋原性細胞、腎形成細胞、泌尿生殖器形成細胞、造骨性細胞、心嚢形成（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｏｇｅｎｉｃ）細胞、或いは間質細胞を含む。外胚葉へ分化する細胞の例としては、これに限定されるものではないが、上皮細胞、神経原性細胞、及び神経膠細胞を含む。内胚葉へ分化する細胞の例としては、これに限定されるものではないが、胸膜形成（ｐｌｅｕｒｉｇｅｎｉｃ）細胞、肝性細胞、腸の裏張りを生じる細胞、及び膵形成（ｐａｎｃｒｅｏｇｅｎｉｃ）細胞及び内臓形成（ｓｐｌａｎｃｈｏｇｅｎｉｃ）細胞を生じる細胞を含む。
【００４１】
本発明の細胞は、一般的に臍帯由来細胞（或いはＵＤＣｓ）として言及される。前記細胞は時々、本明細書において、より一般的に分娩後由来細胞或いは分娩後細胞（ＰＰＤＣｓ）として言及される。加えて、前記細胞は、環才能或いは前駆体細胞であるとして記載され、後者は広義に用いられる。由来という用語は、前記細胞がそれらの生物学的源から獲得され、増殖した若しくはｉｎｖｉｔｒｏで操作されたこと（例えば、成長培地内で培養され、集団を拡大する及び／若しくは細胞株を産生する）を意味するために用いられた。臍帯幹細胞のｉｎｖｉｔｒｏ操作、及び本発明の前記臍帯由来細胞のユニークな特性は、以下に詳細に記載する。
【００４２】
培養における細胞を記載するために、様々な用語が用いられる。細胞培養とは、一般的に生きた生物から採取され、管理条件下で増殖した（"培養において"或いは"培養された"）細胞を言及するものである。初代培養は、生物体から第１の継代培養の前に直接採取された細胞、組織、或いは器官の培養である。細胞は、細胞増殖及び／若しくは分裂を促進する条件下でそれらが成長培地に置かれた時、培養において増殖され、結果として前記細胞の大きな集団を生じる。前記細胞が培養において増殖した時、細胞増殖率は、時々細胞が二倍になるために必要な時間の量によって測定される。これは、倍加時間として言及されるものである。
【００４３】
細胞株とは、１若しくはそれ以上の初代細胞培養の継代培養によって形成された細胞の集団である。継代培養の各周期は、継代として言及される。細胞が継代培養された時、それらは、継代されたとして言及される。細胞或いは細胞株の特異的な集団はしばしば、継代された回数によって言及される、若しくは同定される。例えば、１０回継代された培養細胞集団は、Ｐ１０培養として言及される。初代培養、すなわち組織からの細胞の単離の後の第１の培養は、Ｐ０と呼ばれる。第１の継代培養の後、前記細胞は第２培養（Ｐ１或いは継代１）として記載される。第２継代培養の後、前記細胞は第３培養（Ｐ２或いは継代２）となり、以降それが続く。継代期間の間に、倍加した多くの集団が存在し、従って培養の倍加した集団数は継代数より大きくなることが当業者には理解されるであろう。継代の間の期間における細胞の増殖（すなわち、倍加した集団の数）は、これに限定されるものではないが、播種密度、基質、培地、成長条件、及び継代間の時間を含む多くの因子に依存する。
【００４４】
条件培養液とは、特異的な細胞或いは細胞の集団が培養され、次に除去される培養液である。細胞が培養液において培養された時、それらは、他の細胞へ栄養補助を提供できる細胞性因子を分泌する。そのような栄養因子は、これに限定されるものではないが、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体、及び顆粒を含む。前記細胞性因子を含む培養液は、前記条件培養液である。
【００４５】
一般的に、栄養因子は、細胞の生存、成長、増殖、及び／若しくは変異を促進する、或いは少なくとも補助する、若しくは細胞の活性の増加を刺激する物質として定義される。
【００４６】
培養された脊椎動物細胞を言及する際、老化（複製的老化或いは細胞性老化とも呼ばれる）とは、細胞培養に起因する特性、すなわち、それらが倍加した集団の有限数を超えた増殖できないことを言及している（しばしば、ヘイフリックの限界：Ｈａｙｆｌｉｃｋ’ｓｌｉｍｉｔとして言及される）。細胞性老化は、最初に線維芽様細胞を用いて説明されたが、培養においてうまく増殖することができるほとんどの正常ヒト細胞タイプは、細胞性老化を受ける。分化細胞タイプのｉｎｖｉｔｒｏ寿命は変わるが、最大寿命は一般的に１００集団倍加よりも小さい（これは、培養における全ての細胞に対する老化するまでの倍加の回数であり、従って前記培養は分裂できなくなる）。老化は、経時的時間に依存するものではなく、むしろ、前記培養が受けた細胞分裂或いは集団倍加の回数によって測定される。従って、重要な成長因子を除去されることによって静止状態にされた細胞は、前記成長因子が再導入された場合、増殖及び分裂を再開することができ、持続して成長していた細胞と同等に同じ回数の倍加を行う。同様に、様々な回数の集団倍加の後で細胞を液体窒素において冷凍し、次に解凍し培養した場合、それらは、培養において冷凍されないで維持された細胞と同じ回数の倍加を実質的に経る。老化細胞は、死んだ細胞或いは瀕死の細胞ではなく、それらは実際にはプログラム細胞死（アポトーシス）に抵抗しており、３年間非分裂状態で維持されているものである。これらの細胞は、よく生存し、代謝的に活性であるが、分裂しない。老化細胞の非分裂状態が、あらゆる生物学的、化学的、或いはウイルス性薬剤によって可逆化されるということは見出されていない。
【００４７】
本明細書で用いられたように、成長培養液という用語は一般的に、臍帯由来細胞を培養するために十分な培養液を言及している。特に、本発明の細胞を培養するために好ましい１つの既存の培養液は、ダルベッコ変法必須培養液（ここではＤＥＭＥと省略する）を有する。特に好ましいものは、ＤＭＥＭ−低グルコース（ここではＤＭＥＭ−ＬＧとも省略される）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）。前記ＤＭＥＭ−低グルコースは、好ましくは１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（例えば、胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ユタ州）が定義される）、抗生物質／抗真菌剤（好ましくは、ペニシリン（１００ユニット／ミリリットル）、ストレプトマイシン（１００ミリグラム／ミリリットル）アムホテリシンＢ（０．２５マイクログラム／ミリリットル）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州））、及び０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）が追加される。いくつかの場合において、異なる成長培養液が用いられる、若しくは異なる追加（これらは通常、成長培養液への追加として文章中に指示される）が提供される。
【００４８】
さらに、本発明に関して、ここで用いられたように、標準成長条件という用語は、３７℃、５％ＣＯ_２を有する標準雰囲気における細胞の培養を言及する。相対的な湿度は、約１００％で維持される。前述した条件が培養に有用である一方、そのような条件は当業者によって変えられることができることは、本分野において細胞培養で利用可能なオプション、例えば、温度、ＣＯ_２、相対的な湿度、酸素、成長培養液、及びそれらの同等物、を理解している当業者に理解されるであろう。
【００４９】
以下の省略が、本明細書において使用される：
ＡＮＧ２（或いはＡｎｇ２）は、アンジオポエチン２、
ＡＰＣは、抗原−提示細胞、
ＢＤＮＦは、脳由来神経栄養因子、
ｂＦＧＦは、塩基性線維芽細胞成長因子、
ｂｉｄ（或いはＢＩＤ）は、"ｂｉｓｉｎｄｉｅ（ビス・イン・ディエイ）"（１日２回）、
ＢＳＰは、骨シアロタンパク質、
ＣＫ１８は、サイトケラチン１８、
ＣＸＣリガンド３は、ケモカイン受容体リガンド３、
ＤＡＰＩは、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール−２−ＨＣｌ、
ＤＭＥＭ：ｌｇ（或いはＤＭＥＭ：Ｌｇ、ＤＭＥＭ：ＬＧ）は、低グルコースのＤＭＥＭ、
ＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸、
ＥＧＦは、上皮細胞成長因子、
ＥＧＲは、ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｍａｌｇｒａｍ、
ＦＡＣＳは、蛍光標示式細胞分取器、
ＦＢＳは、胎児ウシ血清、
ＧＣＰ−２は、顆粒球走化性タンパク質２、
ＧＦＡＰは、グリア線維性産生タンパク質、
ＨＢ−ＥＧＦは、ヘパリン結合性上皮細胞成長因子、
ＨＣＡＥＣは、ヒト冠動脈内皮細胞、
ＨＧＦは、肝細胞増殖因子、
ｈＭＳＣは、ヒト間葉系幹細胞、
ＨＮＦ−１アルファは、肝細胞特異的転写因子、
ＨＵＶＥＣは、ヒト臍帯静脈内皮細胞、
Ｉ３０９は、ケモカイン及びＣＣＲ８受容体に対するリガンド（ＴＨ２タイプＴ細胞の化学誘引に関与している。Ｉ３０９は、内皮細胞に結合し、これらの細胞の走化性と浸潤を刺激し、ｉｎｖｉｔｒｏマトリゲルアッセイにおけるＨＵＶＥＣの毛細様構造への分化を増強する。さらに、Ｉ３０９は、ウサギ角膜及び奬尿膜アッセイ（ＣＡＭ）の両者におけるｉｎｖｉｖｏ血管新生の誘導因子である。）
ＩＬ−６は、インターロイキン−６、
ＩＬ−８は、インターロイキン−８、
Ｋ１９は、ケラチン１９、
Ｋ８は、ケラチン８、
ＫＧＦは、ケラチノサイト成長因子、
ＭＣＰ−１は、単球走化性タンパク質１、
ＭＤＣは、マクロファージ由来ケモカイン、
ＭＩＰ１アルファは、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ、
ＭＩＰ１ベータは、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ、
ＭＳＣは、間葉系幹細胞、
ＮＨＤＦは、正常ヒト皮膚線維芽細胞、
ＮＰＥは、神経前駆体増殖培養液、
ＰＢＭＣは、末梢血液単核細胞、
ＰＢＳは、リン酸緩衝食塩水、
ＰＤＧＦｂｂは、血小板由来成長因子、
ＰＤＧＦｒ／アルファは、血小板由来成長因子受容体アルファ、
ＰＤ−Ｌ２は、プログラム細胞死リガンド２、
ＰＥは、フィコエリトリン、
ＰＯは、"ｐｅｒｏｓ"（経口の）、
ＰＰＤＣは、分娩後由来細胞、
Ｒａｎｔｅｓ（或いはＲＡＮＴＥＳ）は、活性化を調節された、発現され分泌された正常Ｔ細胞、
ｒｈＧＤＦ−５は、組換えヒト成長・分化因子５、
ＳＣは、皮下、
ＳＤＦ−１アルファは、間質（ストロマ）由来因子１アルファ、
ＳＨＨは、ソニックヘッジホッグ、
ＳＯＰは、標準操作手順、
ＴＡＲＣは、胸腺及び活性化調節ケモカイン、
ＴＣＰは、組織培養プラスチック、
ＴＧＦベータ２は、トランスフォーミング増殖因子ベータ２、
ＴＧＦベータ−３は、トランスフォーミング増殖因子ベータ−３、
ＴＩＭＰ１は、組織メタロプロテアーゼ阻害因子１、
ＴＰＯは、トロンボポエチン、
ＴｕＪ１は、ＢＩＩＩチューブリン、
ＵＤＣは、臍帯由来細胞、
ＶＥＧＦは、血管内皮細胞増殖因子、
ｖＷＦは、ウィルブランド因子、
アルファＦＰは、アルファ−フェトプロテイン（胎児タンパク質）を表している。
【００５０】
説明
様々な特許及び他の刊行物が、本説明内に及び本明細書に亘って引用されており、それぞれは、この参照により完全に本明細書に組み込まれるものである。
【００５１】
第１の観点において、本発明は、実質的に血液を含まないヒト臍帯組織から派生された細胞を有する、単離された臍帯由来細胞を提供する。前記細胞は、培養において自己複製及び増殖することができる。前記臍帯由来細胞は、他の表現型の細胞へ分化する能力を有している。好ましい実施形態において、前記細胞は、外胚葉、中胚葉、或いは内胚葉期限のあらゆる細胞へ分化することができる。そのいくつかの観点の１つにおいて、本は杖未は、ヒト臍帯組織から単離された細胞を提供する。本明細書に記載されたように、前記細胞は、好ましくは臍帯血液から派生されないものである。それらは、例えば血管などから派生した内皮細胞でもない。正確には、前記細胞は残りの臍帯組織に由来するものである。
【００５２】
前記細胞は、いくつかの細胞性、遺伝的、免疫学的、及び生化学的特性によって特徴付けられている。例えば、前記細胞は、それらの細胞表面マーカー、それらの遺伝子発現、特定の生化学的栄養因子を産生するそれらの能力、及びにそれらの免疫学的特性よってよく特徴付けられている。
【００５３】
別のいくつかの観点において、本発明の前記単離された臍帯由来細胞を有する細胞培養が提供される。前記培養は、好ましい実施形態において母性細胞を含まないものである。さらに、正常の核型を有する細胞も好ましく、それらは継代培養された場合もその核型を維持するものである。最も好ましくは、それらの細胞は、少なくとも老化後までの継代を通じて正常の核型を有し維持しているものである。
【００５４】
臍帯由来細胞及びそれらを有する細胞培養を培養し増殖する方法が提供される。現在好ましい細胞は、成長因子の添加を必要とせず、むしろ多くの利用可能な培養液で増殖かのうなものである。前記細胞を培養し増殖するために好ましい培養液は、ダルベッコ変法必須培養液（ここではＤＭＥＭとも省略される）を有する培養液として本明細書で定義されている増殖培養液を含む。好ましくは、ＤＭＥＭ−低グルコース（ここではＤＭＥＭ−ＬＧとも記載される）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）である。前記ＤＭＥＭ−低グルコースは、１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（例えば、胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ユタ州）が定義される）、抗生物質／抗真菌剤（好ましくは、ペニシリン（１００ユニット／ミリリットル）、ストレプトマイシン（１００ミリグラム／ミリリットル）アムホテリシンＢ（０．２５マイクログラム／ミリリットル）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州））、及び０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）が追加されることが最も好ましい。
【００５５】
前記増殖培養液は、様々に追加され、本分野で既知であるあらゆる方法で変えられることができ、特別な理由に対して最適化されるということを当業者は理解するであろう。加えて、前記細胞は、血清を添加されていない化学的に定義された培養液を含む多くの他の培養液において増殖できる。そのような培養液のいくつかは、以下に例示されている。細胞の日常的な培養及び維持に加えて、そのような潜在的細胞の特異的なタイプの細胞或いは特異的な細胞の前駆体への分化に影響を及ぼすような多くの他の培養液が、本分野では知られている。これらの培養液は、多くの目的に対して有用であり、本発明の範囲内に含まれるが、それらは日常的な培養と増殖に対して必ずしも好ましいと限らないということは、当業者によって理解されるであろう。
【００５６】
培養液に関する前記細胞の柔軟性に加えて、前記細胞は、様々な環境的条件下で増殖することができる。特に、前記細胞は、広範囲の雰囲気条件下で増殖することができる。現在好ましい雰囲気は、約５％Ｏ_２〜約２０％以上のＯ_２の範囲である。前記細胞は、これらの条件下、特に約５％ＣＯ_２（残りの雰囲気は窒素）存在下で、増殖培養液においてよく生長し増殖する。前記細胞は、異なる培養液における広範囲の条件に許容し、特別な目的に対する最適化は適切であるということを当業者は理解するであろう。
【００５７】
前記細胞が特異的な成長因子を必要とすることが示されていないが、前記細胞は、Ｄ−バリンに対してＬ−バリンを必要とすることが示された。従って、好ましい培養液は、このアミノ酸のＬ−異性体が存在しなくてはならない。説明されたそれらの増殖要求性に関する細胞の柔軟性に加えて、コーティング或いは非コーティングされた組織培養容器上に接着し増殖できる、単離された細胞が好ましい。組織培養血管は、プレート、フラスコ、チューブ、及び、例えばプラスチック、ポリスチレン、ガラスなどの本分野では既知であるあらゆる材料で作られたそれらと同等物を含む。コーティングされたそのような血管は、当業者には知られているような様々な化合物でコーティングされている。現在好ましいコーティングされた容器は、例えばゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ポリリシン、ビトロネクチン、或いはフィブロネクチンでのコーティングを有するものである。
【００５８】
本発明の前記単離された細胞は、好ましくは約２％〜約１５％の血清、好ましくは胎児ウシ血清、より好ましくは、規定胎児ウシ血清の存在下でも増殖する。前記細胞は、ベータ−メルカプトエタノールの存在下或いは非存在下、及びＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦＶＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ及びＬＩＦの１若しくはそれ以上を含む添加された成長因子の存在下或いは非存在下でも増殖する。当業者は、これらの柔軟性成長要求性によって、これらの細胞を培養或いは実験する際の多くのオプションが可能になるということを理解するであろう。特定の実施形態において、細胞は、以前に列挙した成長因子の任意の１つ、特にｂＦＧＦを含む高度（Ａｄｖａｎｃｅｄ）ＤＭＥＭにおいて増殖される。上述したように、増殖培養液が現在好ましい一方、血清に関する絶対的な要求はなく、成長は無血清培養液において達成された。
【００５９】
好ましい実施形態において、前記細胞は、優れた倍加能力及び増殖潜在能力を有しており、それらの数は素早くスケールアップするので、診断及び治療適用にしようするのに適している。前記単離された細胞は、好ましくは、適切な培養液中に約１０^３細胞／ｃｍ^２で播種された場合、約８０日以下の培養において約１０^１４細胞以上の収率を生むように十分に倍加するものである。より好ましくは、それら細胞は、約５，０００細胞／ｃｍ^２で播種された場合、約６５日以下の培養において約１０^１７細胞以上の収率を生むように十分に倍加するものである。
【００６０】
本発明の単離された細胞は、多数の倍加を経ることができる。好ましくは、前記細胞は、老化に到達する前に少なくとも３０回倍加を経るものである。より好ましくは、培養において少なくとも４０回の倍加を達成できる。より好ましくは、それら細胞は、老化する前に４０回以上の倍加を達成することができる。本発明の細胞は、好ましくは、例えば銅条件下のヒト間葉系細胞或いはヒト線維芽細胞よりも長期間に亘り分裂を経ることができるものである。
【００６１】
１実施形態において、臍帯細胞は、１若しくはそれ以上の酵素活性の存在下で単離される。組織から細胞を単離するために使用する広範囲の消化酵素は、当業者には知られており、弱く消化すると考えられている酵素（デオキシリボヌクレアーゼ或い中性プロテアーゼ、ディスパーゼ）から強く消化する酵素（例えば、パパイン及びトリプシン）までの範囲の酵素を含む。現在好ましい粘膜溶解（ｍｕｃｏｌｙｔｉｃ）酵素活性は、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、或いはエラスターゼ）、及びデオキシリボヌクレアーゼである。より好ましい酵素活性は、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及び粘膜溶解酵素活性から選択されるものである。現在好ましいのは、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、及びディスパーゼの１若しくはそれ以上の存在下で単離された細胞である。より好ましくは、それら細胞は、コラゲナーゼ存在下でヒストリチクス菌から、及びプロテアーゼ活性、ディスパーゼ、及びサーモリシンの存在下で単離されるものである。より好ましいのは、コラゲナーゼ及びディスパーゼ酵素活性を用いて単離された細胞である。さらに好ましいのは、コラゲナーゼ及びディスパーゼ活性に加えて、ヒアルロニダーゼ活性の存在下で単離されたそのような細胞である。
【００６２】
本発明の別の観点において、特異的な細胞表面マーカー特性を有する、発現単離された臍帯由来細胞が提供される。好ましい細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＰＤＧＦｒ−アルファ、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＨＬ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱから選択される１若しくはそれ以上の細胞表面マーカーを産生するか或いはしないかで特徴付けられる。より好ましい細胞は、前記細胞の特性を提供する前述の細胞表面マーカーのいくつか（例えば、２、４、５、或いは８）、若しくは１０、或いは全てを産生する或いはしないという観点で特徴付けられる。好ましい実施形態において、前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、或いはＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの１若しくはそれ以上を産生する。より好ましい細胞は、前述のマーカーのいくつか、或いは全てを発現するものである。より好ましいそれらの細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、或いはＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現するものである。
【００６３】
好ましい細胞は、産生しないマーカーに関しても特徴付けられ、そのような情報は、前記細胞の特徴付け或いは免疫特性を決める際にも有用である。好ましくは、前記細胞は、フローサイトメトリーによって検出されたように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、或いは及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの１若しくはそれ以上を産生しないものである。より好ましい細胞は、前述のマーカーのいくつか或いはそれ以上を産生しないものである。より好ましい細胞において、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生は、ここで記載された条件下でのフローサイトメトリーによって全く検出されないものである。
【００６４】
他の好ましい実施形態において、前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのいくつか或いはそれ以上を産生し、同時にフローサイトメトリーによって検出されたように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、或いはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれも産生しないことが示される。より好ましい細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを産生し、同時にフローサイトメトリーによって検出されたように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、或いはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれも産生しないものである。
【００６５】
そのような細胞は、それらの細胞表面タンパク質の産生に関して、非常に特徴付けられている。好ましい実施形態において、そのような産生に関する細胞の特徴付けは、実質的に普遍であり、単離手順、継代、培養条件、或いは組織培養血管上のコーティング或いは非コーティングというバリエーションには実質的に変化しない。
【００６６】
本発明の細胞は、広範囲の遺伝子の発現に従っても特徴付けられる。従って、本発明の別の観点は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、以下の遺伝子：低身長感受性ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮想上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮想上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡＦＬＪ１２２８０ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮想上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ１９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ１９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、インスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）、さらにインターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、アルファ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、及び腫瘍壊死因子アルファ誘導性タンパク質３に対する発現において特徴付けられた、単離されたヒト臍帯由来細胞を提供する。
【００６７】
１実施形態において、好ましい細胞は、前述した細胞表面マーカー特徴を有しており、さらに、関連遺伝子発現において特徴付けられる。例えば、いくつかの好ましい細胞はｍ前述した細胞表面特徴を有し、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、アルファ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、及び腫瘍壊死因子アルファ誘導性タンパク質３の１若しくはそれ以上に対する遺伝子を発現する。より好ましくは、これら細胞は、前述のそれぞれをいくつか（例えば、少なくとも２、４、５或いはそれ以上）に対する遺伝子を発現するものである。前記細胞は、培養において自己複製及び増殖することができ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有している。さらに、前記単離されたヒト臍帯由来細胞を有する治療用細胞培養も提供される。
【００６８】
前記細胞表面マーカー特徴を有し、繊維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、低身長感受性ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮想上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮想上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡＦＬＪ１２２８０ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮想上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ１９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ１９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、インスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）から選択される１若しくはそれ以上の遺伝子の発現が減少しているＵＤＣｓも提供される。好ましい細胞は、前述のいくつか（例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、或いはそれ以上、若しくは全て）に対する遺伝子の発現が減少している。
【００６９】
より好ましくは、それら細胞は上述された前記細胞表面マーカー特徴を有し、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、アルファ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、或いは腫瘍壊死因子アルファ誘導性タンパク質３に対する遺伝子も発現しており、繊維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、低身長感受性ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮想上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮想上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡＦＬＪ１２２８０ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮想上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ１９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ１９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、インスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）から選択された１若しくはそれ以上の遺伝子の発現が減少しているものである。
【００７０】
この別の観点において、本発明は、単離されたヒト臍帯由来細胞を提供し、繊維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連して、低身長感受性ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮想上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮想上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡＦＬＪ１２２８０ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮想上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ１９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ１９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、インスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）のそれぞれに対する遺伝子の発現が減少しており、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、アルファ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、或いは腫瘍壊死因子アルファ誘導性タンパク質３に対する遺伝子が発現しているものであり、この発現は、繊維芽細胞、間葉系幹細胞、腸骨稜骨髄細胞、或いは胎盤由来細胞であるヒト細胞の発現に相対的に増加している。そのような細胞は、それらの細胞表面マーカーに関連して特徴付けられる必要はないが、この細胞は、培養において自己複製及び増殖することができ、培養において分化する能力も有している。最も好ましい細胞は、以下に記載されるように接着細胞として単離されるが、そのような細胞は、単離された後、特定の条件下で球状形態において増殖されるので、義務的に接着性ではない。
【００７１】
特定の好ましい実施形態は、ビメンチン或いはアルファ−平滑筋アクチンも産生する、上述されたような細胞を含む。より好ましい細胞は、ビメンチン及びアルファ−平滑筋の両方を産生するものである。これらのタンパク質の産生は、本発明の細胞と、例えば臍帯血から単離された造血性細胞とを区別するように見られる。
【００７２】
好ましい実施形態において、上述の遺伝子発現特性は、実質的に安定であり、継代或いは正常培養条件では変化しない。もちろん、そのような特性は、例えば他の表現型への分化、或いは異なるセットの遺伝子の発現を刺激或いは誘導する条件下で細胞が増殖された場合、変化する。
【００７３】
本発明は、前述したような、前記細胞表面産生特性、或いは遺伝子発現特性、若しくはその両者を有する細胞を有する治療用細胞培養も提供する。治療用培養を有する細胞バンクは、本発明の範囲内に同様に含まれる。例えば、細胞バンクは、様々な継代数の本発明の培養細胞、及び異なる表現型へ分化するように誘導された本発明の細胞を含む。他の細胞は、本発明の細胞と別々に、或いは共培養で保存されることに成功した。完全な細胞バンクは、多種多様な個人の保存された細胞を含む。好ましい実施形態において、保存された細胞は、例えば−１８０℃で凍結保存される。細胞は、好ましくはいくつかの実施形態において、−９０℃で保存される。本発明の細胞は、当業者には知られている様々な条件下で容易に凍結保存される。
【００７４】
好ましい実施形態において、前記細胞は、混合リンパ球反応において同種間リンパ球を実質的に刺激することが必要とされる前記細胞表面分子を欠如している。より好ましい実施形態において、前記細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏ評価において、或いは同種間、同系間、或いは自己レシピエントにおいてはｉｎｖｉｖｏで、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を実質的に刺激することが必要とされる前記表面分子を欠如している。さらに好ましくは、これら細胞は、ｉｎｖｉｖｏ適用に対して、あらゆる有害な免疫結果も引き起こさないものである。前記治療用細胞培養は、フローサイトメトリーによって決定されたように、検出可能な量の刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の少なくとも２、或いはいくつか、若しくは全てを欠如している。前述したタンパク質は、全て欠如していることが好ましい。さらに治療用細胞培養は、フローサイトメトリーによって決定されたように、検出可能な量の免疫調節タンパク質ＨＬＡ−Ｇ及びＣＤ１７８の１若しくは両方を欠損していることも好ましい。さらに、治療用細胞培養は、フローサイトメトリーによって決定されたように、検出可能な量の免疫調節タンパク質ＰＤ−Ｌ２を発現していることも好ましい。１実施形態において、前記治療用細胞培養は、混合リンパ球反応における同種間対照と比較して、ｉｎｖｉｔｒｏでリンパ球仲介性反応を実質的に刺激しないものである。
【００７５】
いくつかの別の観点において、本発明は、培養において自己複製及び増殖でき０他の表現型の細胞へ分化する能力を有する、単離されたヒト臍帯由来細胞を提供し、ここにおいて前記細胞は、混合リンパ球反応において同種間リンパ球を実質的に刺激しないものである。より好ましい細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を実質的に刺激せず、ＰＤ−Ｌ２を産生するが、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１７８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０．ＣＤ８６、或いはＢ７−Ｈ２の１若しくはそれ以上を産生しないものである。前記細胞は、特定の実施形態において、ビメンチン及びアルファ−平滑筋アクチンも産生することができる。より好ましい細胞は、ビメンチン及びアルファ−平滑筋の両方を産生するものである。より好ましくは、それら細胞は、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１７８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の全てを産生しないものである。
【００７６】
本発明の細胞は、好ましくは、例えば成長因子などの有用な分子を分泌するものである。そのような細胞は、それらの細胞性特性だけでなく、例えば条件培地或いは細胞を含まない溶解液中に分泌された分子も有用である。別の観点において、本発明は、血管新生因子ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＰＯ、或いはＴＩＭＰ１の１若しくはそれ以上を分泌する、単離されたヒト臍帯由来細胞を提供する。特定の実施形態において、前記細胞は、前述した因子の全てを分泌する。前記細胞は、ＥＬＩＳＡによって検出されたように、血管新生因子ＳＤＳ−１アルファ、ＴＧＦ−ベータ２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、或いはＶＥＧＦの１若しくはそれ以上を分泌しない。特定の実施形態において、前記細胞は、ＥＬＩＳＡによって検出されたように、ＳＤＳ−１アルファ、ＴＧＦ−ベータ２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、或いはＶＥＧＦを全く分泌しない。
【００７７】
別の観点において、本発明の前記細胞は、ここに提供された多くの特徴を組み合わせることによって定義される。例えば、本発明は、実質的に血液を含まない哺乳類分娩後組織から単離された、Ｌ−バリン要求性細胞を有する単離された臍帯由来細胞を提供する。前記細胞は、培養で自己複製及び増殖することができ、例えば、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）、或いはそれらの前駆体などの他の表現型の細胞へ分化する能力を有している。細胞は、ここに提供された技術によって、目的の哺乳類の臍帯組織から単離される。ヒトは、本発明において好ましい。前記細胞は、広範囲の培養液を含む広範囲の条件、及び環境条件下で増殖され得る。前記細胞は、少なくとも約３５℃〜約３９℃で、場合により、他の条件に依存してより広範囲で、増殖され得る。前記細胞は、化学的に定義された培地において、或いは例えば胎児ウシ血清などの哺乳類血清を添加された培地において増殖され得る。前記細胞は、様々な段階で冷凍保存に耐性でもある。細胞は、冷凍で維持される、或いは好ましくは−８０℃かそれ以下で長期間保存され得る。他の好ましい温度範囲は、約−９０℃〜約１８０℃、或いはそれ以下である。特殊化電動フリーザーを用いる、或いは細胞は窒素の液体或いは気体相内に保存され得る。組織は、前記細胞の単離前に保存され得る。当業者には知られているような、好ましい優れた保存手順は、以下に説明される。
【００７８】
前記細胞は、酸素を約５％〜少なくとも２０％含有する雰囲気において増殖でき、以下の特徴の少なくとも１つを有する：前記細胞は、培養において少なくとも約４０倍加する能力を有し、前記細胞は、好ましくは接着性であり、従ってコーティング或いは非コーティングされた組織培養容器上に接着し増殖することが好ましく、コーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ポリリシン、ビトロネクチン、或いはフィブロネクチンのコーティングを有するものである。
【００７９】
前記細胞は、好ましくは、組織因子、ビメンチン、及びアルファ−平滑筋アクチンの少なくとも１つを産生し、より好ましくは、前記細胞は、組織因子、ビメンチン、及びアルファ−平滑筋アクチンのそれぞれを産生し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つを産生することも好ましい。前記細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出されるとおり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１つの産生が欠如している、より好ましくは、細胞はこれらの表面マーカーの全ての産生を欠如していることで特徴付けられてもよい。さらに好ましくは、細胞は、インターロイキン８、レチクロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、アルファ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、及び腫瘍壊死因子アルファ誘導性タンパク質３の少なくとも１つを発現する。好ましい細胞は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、腸骨稜骨髄細胞、或いは胎盤由来細胞であるヒト細胞の発現と比較して、以下の少なくとも１つ：低身長感受性ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮想上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮想上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡＦＬＪ１２２８０ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮想上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ１９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ１９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、インスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）の発現が減少しているものであり、当業者は、広範囲の遺伝子の発現が、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）などの遺伝子アレイで容易に特徴付けられることを理解するであろう。
【００８０】
前記細胞は、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、及びそれらの同等物など、様々な生化学的活性因子を分泌する。好ましい細胞は、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ベータ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１の少なくとも１つを分泌し、好ましい細胞は、ＥＬＩＳＡ．によって検出されたように、ＴＧＦ−ベータ２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１アルファ、及びＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如において代わりに特徴付けられる。前記細胞を同定し、特徴付けるため、また当該分野で既知のその他の細胞と本発明の細胞を区別するため、これらの特徴を利用できる。
【００８１】
好適な実施形態では、前記細胞が前記特徴の２若しくはそれ以上を有する。より好ましくは、前記特徴の３、４、または５若しくはそれ以上を有する細胞である。さらに好ましくは、前記特徴の６、７、または８若しくはそれ以上の特徴を有する単離された分娩後細胞である。さらに好ましくは、現在、前記請求された特徴の９つすべてを有する細胞である。
【００８２】
また現在好ましくは、組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンの少なくとも２つを生産する細胞である。より好ましくは、前記細胞は、組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンタンパク質の３つ全てを産生するものである。
【００８３】
当業者は、細胞マーカーが非常に異なる増殖条件でやや変化しやすく、一般にここで説明されているものは成長培地、またはその変化物における特徴であることを理解するものとする。ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１、２、３、或いは４種類を産生する分娩後由来細胞が好ましい。より好ましくは、これらの細胞表面マーカーの５、６、または７種類を生産する細胞である。さらに好ましくは、前記細胞表面マーカータンパク質の８種類全てを生産することができる分娩後細胞である。
【００８４】
同様に、フローサイトメトリーで検出されたように、タンパク質ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１、２、３、または４種類の産生が欠如した分娩後細胞が好ましい。これらのマーカーの少なくとも５、６、７、または８若しくはそれ以上が生産されない細胞が好ましい。より好ましくは、前記細胞表面マーカーの少なくとも９または１０種類が生産されない細胞である。最も好ましくは、前記同定されたタンパク質の１１種類全部の生産が欠如した細胞である。
【００８５】
フローサイトメトリーで検出されるとおり、現在の好ましい細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれを生産し、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれかを生産しない。
【００８６】
現在、分娩後由来細胞は、インターロイキン８、レチキュロン１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性α）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、腫瘍壊死因子α−誘導性タンパク質３の少なくとも１、２、或いは３種類を発現することが好ましい。より好ましくは、それらの細胞は４或いは５種類を発現し、さらに好ましくは、前記細胞は、前述した遺伝子の６種類全てを発現することができるものである。
【００８７】
いくつかの実施形態に対して、好ましい細胞は、繊維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関連し、以下の：低身長感受性ホメオボックス２、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）、ヒトｍＲＮＡ、ｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２より）、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体１（ショウジョウバエ）、クリスタリンαＢ、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ関連アクチベーター２、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質、ニューラリン１の類似体、テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメイン、Ｂ細胞転座遺伝子１（抗増殖性物質）、コレステロール２５−水酸化酵素、ラント関連性転写因子３、仮想上タンパク質ＦＬＪ２３１９１、インターロイキン１１受容体α、プロコラーゲンＣ−エンドペプチターゼエンハンサー、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）相同体７（ショウジョウバエ）、仮想上遺伝子ＢＣ００８９６７、コラーゲンタイプＶＩＩＩα１、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン：ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ）、イルコイホメオボックスタンパク質５、へファエスチン、インテグリンβ８、シナプス小胞糖タンパク質２、ヒトｃＤＮＡＦＬＪ１２２８０ｆｉｓクローンＭＡＭＭＡ１００１７４４、サイトカイン受容体様因子１、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャンネルサブファミリーＮメンバー４、インテグリンα７、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質、ＰＤＺ−結合モチーフを有する転写コアクチベーター（ＴＡＺ）、ｓｉｎｅｏｃｕｌｉｓホメオボックス相同体２（ショウジョウバエ）、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質、初期成長反応３、ディスタル−レス（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ）ホメオボックス５、仮想上タンパク質ＦＬＪ２０３７３、アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイド脱水素酵素タイプＩＩ）、バイグリカン、フィブロネクチン１、プロエンケファリン、インテグリンβ様１（ＥＧＦ様反復ドメインを有する）、ヒトｍＲＮＡ完全長挿入ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ１９６８４２２、ＥｐｈＡ３、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）、仮想上タンパク質ＦＬＪ１４０５４、ヒトｍＲＮＡｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２より）、小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）、ＥＧＦ−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ＢＣＬ２／アデノウィルスＥ１Ｂ１９ｋＤａ相互作用タンパク質３様、ＡＥ結合タンパク質１、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）、線維芽細胞腫の腫瘍原性の抑制１、インスリン様成長因子結合タンパク質２（３６ｋＤａ）に対応する遺伝子の少なくとも１種類の発現が減少しているものである。より好ましくは、ヒト線維芽細胞、間葉幹細胞、または回腸稜の骨髄細胞と関連し、上記に対応する少なくとも５、１０、１５、または２０遺伝子の発現が低下した細胞である。現在、より好ましくは、前記配列に対応する遺伝子の少なくとも２５、３０、または３５種類の発現が低下した細胞である。またより好ましくは、ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞に関連し、前記配列の３５若しくはそれ以上、４０若しくはそれ以上、或いは全部に対応する遺伝子が減少した発現を有する分娩後由来細胞である。
【００８８】
特定の増殖因子および他の細胞性タンパク質の分泌は、特に有用な本発明の細胞を作ることができる。好適な分娩後由来細胞は、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１の少なくとも１、２、３、または４種類を分泌する。前記タンパク質の５、６、７、または８種類以上を分泌する細胞も好ましい。前記因子の少なくとも９、１０、１１若しくはそれ以上を分泌することができる細胞がより好ましく、前記リストで前記タンパク質の１２若しくはそれ以上、またはさらに１３種類すべてを分泌できる細胞が好ましい。
【００８９】
そのような因子の分泌は有用であるが、細胞は、前記培地への因子の分泌を欠如することでも特徴付けられる。ＥＬＩＳＡで検出されるとおり、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１アルファ、及びＶＥＧＦの少なくとも１、２、３、または４種類の分泌が欠如する臍帯由来細胞は、現在使用するのに好ましい。前記タンパク質の５種類の分泌が欠如していることで特徴付けられる細胞は、より好ましい。
【００９０】
本発明の別の観点において、治療用細胞培養が提供され、前記細胞培養は、血管新生−刺激栄養因子を必要とする患者を治療する際に用いるための、上述されたような単離された細胞を有するものである。そのような治療用細胞培養は、神経成長刺激栄養因子を必要とする患者を治療する際に用いるためにも提供される。
【００９１】
ヒト臍帯組織からのＵＤＣｓを由来する方法が提供される。前記細胞は、培養で自己複製及び増殖することができ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有している。前記方法は、（ａ）ヒト臍帯組織を入手する工程と、（ｂ）実質的に全ての血液を除去し、実質的に血液を含まない臍帯組織を得る工程と、（ｃ）機械的あるいは酵素的処理、若しくはその両者の処理によって前記組織を分離する工程と、（ｄ）培養液に前記細胞を再懸濁する工程と、及び（ｅ）培養において自己複製及び増殖でき、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する、ヒト臍帯由来細胞の成長を可能にする成長条件を提供する工程とを有するものである。
【００９２】
組織は、経膣的または他の経路、例えば帝王切開を介して由来されるかによらず、完了妊娠、満期または満期前すべてから得られる可能性がある。組織バンクからの得られた組織も、本発明の範囲内として考慮される。
【００９３】
前記組織は、当業者には知られたあらゆる手段によって実質的に血液を含まない状態にされる。例えば、血液は、例えば吸引或いは排出などによって大量の血液除去の前後に、洗浄、すすぎ、希釈、及びそれらと同等な手段によって物理的に除去され得る。実質的に血液を含まない細胞組織を得るための他の手段としては、酵素的或いは化学的処理を含む。
【００９４】
臍帯組織の解離は、例えば機械的破壊によってなどを含む、本分野において既知である様々な技術によって達成され得、組織は、ハサミ或いはメスで無菌的に切除され得る、或いはそのような組織は、ヒト組織からの回復した無傷或いは生細胞に適合するあらゆる方法によって刻まれる、混ぜられる、粉砕される、或いはホモジナイズされ得る。
【００９５】
現在好ましい実施形態において、前記単離手順も、酵素的消化過程を使用する。複合組織基質から個々の細胞を単離するために有用であり、培養における増殖を容易にする、多くの酵素が本分野において知られている。上述されたように、組織からの細胞単離に有用である広範囲の消化酵素を、当業者は利用可能である。弱い消化（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ或いは中性プロテアーゼ、ディスパーゼ）から強い消化（例えば、パパイン及びトリプシン）までの範囲の酵素は、商業上利用可能である。適用可能な酵素の非完全のリストとしては、粘膜溶解（ｍｕｃｏｌｙｔｉｃ）酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、或いはエラスターゼなど）、及びデオキシリボヌクレアーゼを含む。現在好ましい酵素活性は、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及び粘膜溶解酵素活性から選択されるものである。例えば、コラゲナーゼは、組織から様々な細胞を単離する際に有用であると知られている。デオキシリボヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡを消化でき、単離の間、細胞凝集を最小限にすることができる。酵素は、単独或いは組み合わせで使用され得る。セリンプロテアーゼは、使用された他の酵素を分解するために、他の酵素の使用後に、配列において使用されることが好ましい。セリンプロテアーゼとの接触温度と時間は、モニタリングされるべきである。セリンプロテアーゼは、血清中においてα２ミクログロブリンで阻害されてもよく、そのため前記消化に用いる培地は通常血清を含まない。ＥＤＴＡ及びＤＮａｓｅは、一般的に使用され、収量或いは効率を改善する。好ましい方法は、例えば、コラゲナーゼやディスパーゼ、或いはコラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼによる酵素処理を含み、そのような方法の特定の好ましい実施形態において、コラゲナーゼ及び中性プロテアーゼであるディスパーゼの混合物が解離する工程において使用されるものである。より好ましくは、それら方法は、ヒストリチクス菌からのコラゲナーゼの少なくとも１つの存在下で、及びプロテアーゼ活性、ディスパーゼ、及びサーモリシンのいずれかの存在下での消化に使用されるものである。さらに好ましくは、前記方法は、コラゲナーゼ及びディスパーゼ酵素活性の両方での消化を使用するものである。さらに好ましくは、前記方法は、コラゲナーゼ及びディスパーゼ活性に加えて、ヒアルロニダーゼ活性での消化を含むものである。様々な組織源から細胞を単離するための多くのそのような酵素処理が本分野では既知であることを、当業者は理解するであろう。例えば、コラゲナーゼ及び中性プロテアーゼの酵素組み合わせのＬＩＢＥＲＡＳＥＢＬＥＮＤＺＹＭＥ（Ｒｏｃｈｅ）シリーズは非常に有用であり、入手可能な方法において使用される。他の酵素源も既知であり、前記当業者は自然供給源から直接そのような酵素を入手してもよい。前記当業者は、本発明の前記細胞の単離に利用するため、新規、または追加の酵素、若しくは酵素の組み合わせを評価するための十分な知識を有する。好ましい酵素処理は、０．５、１、１．５、または２時間若しくはそれ以上である。好ましい他の実施例では、前記解離工程の酵素処理中、前記組織は３７℃でインキュベートされるものである。前記消化を希釈することによっても、細胞が粘稠性消化内に補足されるように、細胞の収率が改善される。
【００９６】
酵素活性の使用が現在好ましいが、ここに提供されたように単離する方法には必要ではない。機械的分離単独に基づいた方法は、上述したように、臍帯から瞬時に細胞を単離するのに成功した。
【００９７】
前記細胞は、ここにおいて上述されたように、組織が培養液へと解離された後、再懸濁され得る。細胞は、細胞を組織或いは他の細片から分ける遠心分離工程に続いて、再懸濁される。再懸濁とは、再懸濁の機械的方法、或いは単純に細胞への培養液の添加を含む。
【００９８】
成長条件を提供することによって、前記細胞に対する培養液、追加物、雰囲気条件、及び相対的湿度の広範囲のオプションが可能となる。好ましい温度は３７℃であるが、温度は、他の培養条件、及び前記細胞或いは培養の望ましい使用に依存して、約３５℃〜３９℃までの範囲である。
【００９９】
現在好ましくは、前記方法は、成長培地で提供される追加血清において利用可能なものを除く外因性成長因子を必要としない細胞を提供するものである。さらにここにおいては、特定の成長因子の非存在下で増殖することができる臍帯細胞を由来する方法も提供される。前記方法は、上記方法と類似するが、それらは特定の成長因子（前記細胞は必要としない）が、前記細胞が最終的に再懸濁され増殖される培養液において存在しないことを必要とする。この意味において、前記方法は、特定の成長因子の非存在下で分裂することができる細胞に対して選択的である。いくつかの実施形態において好ましい細胞は、血清が添加されていない、化学的に定義された成長培地において成長及び増殖することができる。そのような場合において、前記細胞は、細胞を支持し維持するために培養液に添加される、特定の成長因子を必要とする。現在好ましい、無血清培養液に添加される因子は、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、及びＰＤＧＦの１若しくはそれ以上を含む。より好ましい実施形態において、２、３、或いは４種類全ての因子は、無血清或いは化学的に定義された培養液に添加されるものである。他の実施形態において、ＬＩＦは、前記細胞の支持或いは成長を改善するために、無血清培養液に添加される。
【０１００】
さらに、前記細胞が、その雰囲気において約５％〜約２０％の酸素の存在下で増殖することができる方法も提供される。Ｌ−バリン要求性細胞を得るための方法は、前記細胞がＬ−バリンの存在下で培養されることを必要とする。細胞が得られた後、Ｌ−バリン要求性は、Ｌ−アイソマーを欠如したＤ−バリン含有培養液において増殖させることによって検査され確認され得る。
【０１０１】
老化状態に到達する前に、前記細胞が少なくとも２５、３０、３５、或いは４０代倍加を受けることができる方法も提供される。１０^１４或いはそれ以上に到達するように倍加することができる細胞を分裂するための方法が提供される。好ましい方法は、少なくとも約１０^１４、１０^１５、１０^１６、或いは１０^１７、若しくはそれ以上の細胞を産生するのに十分に倍加できるように細胞を分裂するものである。好ましいそれらの細胞数は、８０、７０、或いは６０日以下で産生される。
【０１０２】
上記の方法によって派生された単離されたヒト臍帯由来細胞は、本発明において提供される。前記細胞は、特定の実施形態において、継代を繰り返したにも関わらず一貫して正常な核型を維持する。さらに、上記の方法によって派生されたヒト臍帯由来細胞の培養も提供され、ここにおいて前記培養は、母性細胞を含まないものである。本発明の方法によって得られる治療用培養も提供される。
【０１０３】
本発明の細胞は、様々に使用できる。例えば、細胞によって分泌された栄養性因子のため、それらは、他の有用細胞の成長、維持、支持などに、直接的に或いは間接的に有用である。例えば、前記細胞は、条件培養液を作成するために使用される、若しくは、治療用に使用されると意図されている細胞の直接的或いは間接的なｅｘｖｉｖｏ同時培養を含む、他の目的細胞と同時培養される。直接的な同時培養では、前記細胞は共に混合されるのに対して、間接的な同時培養では、前記細胞は、細胞遊走を除去する半透性膜によって分けられたコンパートメントにおいて培養される。例えば、３ミクロン名目孔サイズのポリカーボネート、ポリエステル（ＰＥＴ）、及びコラーゲンコーティングしたポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜は、細胞遊走を除去し、そのような目的に有用である。培養システムに対するそのような膜は、例えば、前記臍帯由来細胞及び別の細胞タイプ間の可溶性成長因子などを交換することができる。本分野において既知である例或いは他のいくつかは、商業的に利用可能である（例えば、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ培養膜（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ，Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州））。
【０１０４】
さらに本発明では、臍帯由来細胞、及び別の治療薬或いは因子を有する治療用組成物が提供される。そのような因子は、これに限定されるものではないが、ＩＧＦ、ＬＩＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、さらには抗血栓形成性因子及び抗アポトーシス因子を含む。そのような治療用組成物は、さらに１若しくはそれ以上の付加的な細胞タイプを有することができる。
【０１０５】
上記に加えて、前記細胞自体から由来した組成物が本発明で提供される。細胞溶解液、可溶化細胞画分、及び膜濃縮細胞画分が全て、本発明で提供される。細胞溶解液は、例えば、機械的なせん断、酵素的処理、界面活性剤、或いは他の化学的処理、及びそれらと同等なこと、若しくはそれらの組み合わせによって溶解された前記細胞を実質的に全て、より好ましくは全て含む溶解液を含む。結果生じた溶解液は、前記細胞の全構成成分を含み、例えば、本発明や他の目的細胞の成長を支持する或いは維持するなどの、多くの有用性がある。加えて、前記細胞溶解液は、目的の細胞産物の精製或いは濃縮のための出発材料として役立つこともできる。好ましい実施形態において、細胞溶解液はさらに、少なくとも可溶性細胞画分と膜濃縮細胞画分へと分離される。それぞれは、特異的な目的に対して有用である。例えば注入による投与などのｉｎｖｉｖｏでの使用が考えられ、可溶性細胞画分は、同種間ＰＢＭＣｓの刺激を最小限にするのに特に有用である。より好ましくは、可溶性細胞画分は、例えば、同種間リンパ球、同種間ＣＤ４^＋Ｔ細胞、或いは未処理ＣＤ４^＋Ｔ細胞の刺激など、有害な免疫反応を刺激するために必要とされる抗原が欠如しているものである。例えば、基底膜を有する、前記細胞に由来した細胞外マトリックスも、本発明において有用であり、提供されるものである。そのような細胞外マトリックスは、例えば血管新生アッセイなどのｉｎｖｉｔｒｏアッセイに有用である。それらは、治療用投与計画の一環としてｉｎｖｉｖｏでも有用である。例えば、細胞外マトリックスル化合物は、例えば急性及び慢性創傷の治癒に関連した適用などの増大及び修復において、或いは美容及び再建外科において有用であると知られている。前記細胞外マトリックス材料は、コラーゲン様特性が望ましい場合、しばしば有用である。細胞外マトリックス材料は、弾性或いは粘性起因を提供することができるため、弾性或いは粘性を必要とする適用において特に有用である。細胞外マトリックスの別の適用は、移植可能な治療用装置との組み合わせである。穏やか〜激しいまでの範囲の細胞性破壊に対する技術に関して、当業者は、そのように得られた前記細胞溶解液の最終用途に基づいた細胞破壊の技術を選択することに熟知している。
【０１０６】
本発明の組成物は、本発明で提供されるように、条件培養液も含む。そのような培養液は、まず本発明の細胞或いは培養の成長に使用され、成長の間、１若しくはそれ以上の有用な産物を前記培養液に分泌するものである。これら新規細胞からの条件培養液は、例えば、本発明の細胞或いは培養によって前記培養液に分泌された成長因子或いは栄養因子を必要とする他の哺乳類細胞の成長を補助する、及び例えば血管新生を促進する、などの多くの目的に対して有用である。条件培養液は、それらが含有する分泌された成長因子に対して有用であり、好ましくは、本発明の前記条件培養液は、そのような成長因子を必要としている別の哺乳類細胞の増殖を支持するために有用である１若しくはそれ以上の成長因子を含有するものである。条件培養液の使用は、当業者にはよく理解されている。条件培養液を産生するための継続培養システムはここにおいて検討されており、本発明の前記細胞は、成長因子などの分泌された細胞性産生物の大量或いは継続産生に有用である。
【０１０７】
好ましくは、本発明の前記条件培養液は、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、或いはＴＩＭＰ１の１若しくはそれ以上を有するものである。より好ましくは、それら条件培養液は、前述のいくつか（例えば、少なくとも２、３、或いは４）を有するものである。さらに好ましくは、それらは前述の成長因子の多く（例えば、少なくとも、５、６、７、８以上）を含有するものである。さらに好ましくは、前記条件培養液は、目的の、付加的な分泌された分子を有するものである。
【０１０８】
別の実施形態では、前記条件培養液、及びＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、或いはＴＩＭＰ１を必要とする哺乳類細胞を有する哺乳類細胞培養が提供される。条件培養液における培養は、例えば他の細胞の成長或いは維持を支持する間接的な方法を提供する。例えば、そのような間接的な方法は、成長因子要求性のため、前記条件培養液の非存在下での培養において増殖することが困難である哺乳類細胞の集団を増殖する方法を提供する。
【０１０９】
本発明の別の観点は、臍帯由来細胞、及びあらゆる表現型の別の哺乳類細胞の同時培養を提供する。これら同時培養は、あらゆる表現型の細胞を有し、例えば、増殖因子要求性のため、増殖することが困難である、哺乳類細胞の集団を増殖する方法を提供する。これは、他の細胞の成長を直接的に支持する臍帯由来細胞の特性を使用する方法である。そのような同時培養も、様々な適用、特にそのような細胞の使用が望ましくない免疫反応を生産しないような適用に対してｉｎｖｉｖｏで使用される。臍帯由来細胞の存在は、例えば、移植足場への或いは手術修復部位での細胞の樹立と成長を促進することができる。好ましい実施形態において、前記同時培養は、前記臍帯由来細胞に加えて、ヒト細胞株を有する。さらに好ましくは、ドナーの家族メンバー或いはドナーの近縁関係のヒトの細胞を使用することができる。前記細胞が由来された個々における使用に対する同時培養であることがより好ましい。
【０１１０】
本発明の他の観点において、前記培養の使用が提供される。例えば、臍帯由来細胞の培養は、血管新生を促進するために有用である。それらは、柔組織疾患或いは障害の治療においても有用である。好ましい実施形態において、前記治療用細胞培養は、足場或いはマトリックス上で増殖されるものである。前記足場或いはマトリックス、又は同様の基質上での増殖は、ｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏ、或いはそれらの組み合わせであり得る。ｉｎｖｉｖｏ適用に対して、前記基質は、例えば損傷柔組織を修復するように、外科的に適用されることができる。前記基質は、ＵＤＣｓと共に播種される、若しくは、外科的使用の前に、ＵＤＣ−条件培養液、或いは、細胞溶解液或いは可溶性細胞抽出液、若しくは細胞外マトリックスを含む他の細胞画分で前処理され得る。ｉｎｖｉｔｒｏ適用に対して、前記細胞は、基質或いはその間隙上に、或いはそれら内に確立するために、他の細胞を助けることができる。例えば、皮膚、若しくは皮膚或いは皮下層の他の柔組織は、後の使用のために、そのような基質上にｉｎｖｉｔｒｏで増殖され得る。組み合わせの使用に対して、細胞集団は、前記基質或いは足場上にｉｎｖｉｔｒｏで樹立され、次に、さらなる増殖のために外科的に接着、グラフト、或いは移植され得るものである。前樹立した細胞集団、特に血管新生因子を分泌する細胞集団は、よりすばやい治癒を導く可能性がある。そのような足場に対して現在好ましいのは、非永久性、生体吸収性ポリマーマトリックス及びそれらと同等物である。
【０１１１】
様々な足場或いはマトリックスは、組織工学や、例えば創傷治癒の分野で既知であり、ここにおける前記細胞や方法に有用である。例としては、これに限定されるものではないが、マット、発泡体、或いは自己集合性ペプチドを含む。好ましいマットは、不織繊維を有するものである。不織マットは、例えば商品名ＶＩＣＲＹＬ（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、サマビル、ニュージャージー州）で販売されているグリコール酸および乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマーから成る繊維を使用して形成されてもよい。ここにおける使用に対して好ましい発泡体は、例えば、ポリ（エプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマー（米国特許番号第６，３５５，６９９号に記載されている）などを有する多孔性発泡体を含む。そのような物質は、細胞或いは組織の増殖を支持する物として利用されることが多い。
【０１１２】
本発明の治療用細胞培養に対する付加的な利用もここに提供され、これは、骨疾患或いは障害の治療、膵臓疾患或いは障害の治療、腎臓疾患或いは障害の治療、神経疾患或いは障害、心臓疾患或いは障害の治療、及び肝臓疾患或いは障害の治療における使用を含むが、これに限定されるものではない。
【０１１３】
この別の観点において、本発明は、本発明の細胞、前記細胞を有する移植可能なヒト組織マトリックス、及びこれら細胞を有するヒト器官を含む、移植可能な組織構造体などの高次構造を提供する。
【０１１４】
別のいくつか観点において、本発明は、培養で自己複製及び増殖することができ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する、単離されたヒト臍帯由来細胞有する注入可能な治療用細胞を提供し、ここにおいて前記細胞は、混合リンパ球反応において同種リンパ球を刺激せず、ＰＤ−Ｌ２を産生するが、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１７８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、或いはＢ７−Ｈ２は産生しないものである。この注入可能な治療用細胞組成物は、あらゆる適用における治療的処置として有用であり、ここにおいて未分化細胞は、循環を通じて部位へ補充され得るものである。好ましい実施形態において、前記注入可能な細胞は、組織因子を不活性化するために処理される。そのような処理は、前記細胞の整合性を壊すことなく、組織因子を不活性化することができるあらゆる処理を含む。より好ましくは、前記処理は、生存率、倍加時間、或いは増殖に対して影響を及ぼさないものである。前記注入可能な細胞は、現在好ましい１実施形態において、抗組織因子抗体で処理されるものである。
【０１１５】
治療用細胞に関連して、抗血栓形成因子、抗アポトーシス因子、及び抗炎症性因子などの他の生物活性分子は、有用であり、順に投与される、若しくは、個々に、或いはそのような化合物や因子の２若しくはそれ以上の組み合わせで、前記細胞と共に同時投与されるものである。例えば、抗アポトーシス因子は、プログラム細胞死を最小化するために有用である。そのような因子は、これに限定されるものではないが、ＥＰＯ、ＥＰＯ誘導体及び類似体、及びそれらの塩類、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びカスパーゼ阻害剤を含む。抗炎症性因子は、これに限定されるものではないが、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６及びＩＬ−１阻害剤、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリムス、例えばテポキサリン（Ｔｅｐｏｘａｌｉｎ）、トルメチン、及びスプロフェンなどの非ステロイド性抗炎症化合物を含む。
【０１１６】
本発明の治療用細胞と共に同時投与され得る他の生物活性因子或いは治療因子は、例えば、抗血栓形成因子、免疫抑制性或いは免疫調節性因子、及び抗酸化剤を含む。免疫抑制性及び免疫調節性因子の例としては、例えばシクロシポリンなどのカルシニュリン阻害剤、タクロリムス、シロリムスやエベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）などのｍＴＯＲ阻害剤、アザチオプリンやミコフェノール酸モフェチルなどの抗増殖因子、例えばプレドニロゾン或いはヒドロコルチゾンなどの副腎皮質ステロイド、例えばモノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体、バシリキシマブ、ダクリズマブなどの抗体、例えば抗−胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）などの抗ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体、及びモノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３などを含む。本発明の前記細胞との組み合わせで治療用に提供され得る抗血栓形成化合物は、例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、及びＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニンプロリンアルギニンクロロメチルケトン）、抗血栓形成化合物、血小板受容体アンタゴニスト、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害剤、及び血小板阻害剤を含む。抗酸化剤は、本分野ではよく知られており、あらゆる薬学的に許容可能な抗酸化剤は本発明の前記細胞と組み合わせで投与され、これにはプロブコール、ビタミンＡ、Ｃ、及びＥ、コレンザイムＱ−１０、グルタチオン、Ｌシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、或いはそれらの抗酸化誘導体、類似体、或いは塩類が含まれる。
【０１１７】
本発明の別の観点において、臍帯由来細胞を成長及び維持し、単離及び使用するためのキットが提供される。前記細胞、細胞溶解液、可溶性細胞画分、膜及びマトリックス画分は、例えば、培養或いは移植用のキットなどのキットの一部として簡便に利用され得る。本発明は、ＵＤＣｓ、及び、前記細胞或いは細胞画分の成長或いは維持、単離、若しくは使用に対する取扱説明書、さらに例えば、マトリックス（例えば足場などの）材料、水和剤（例えば、生理学的に適合可能な生理食塩水、調整された細胞培養液）、細胞培養基質（例えば、培養皿、プレート、バイアル等）、細胞培養液（液体或いは脱水形態において）、抗生化合物、ホルモン、及びそれらの同等物などを含む付加的な構成成分を有するキットを提供する。増殖に対するキットは、例えば、胎児ウシ血清などの血清を含有する、ここで用いられた成長培地の全構成成分を含むことができる。前記キットはそのような構成成分のいずれかを含むが、好ましくはその意図した使用に必要なすべての成分を含む。望ましい場合は、前記キットは、（典型的には凍結保存された）細胞を含み、ここで述べられているとおり、前記格子に播種される可能性がある。単離用のキットは、ここに提供されたような前記単離方法を実行するために必要とされる、単離の際に、新鮮に或いは組織バンクから凍結されて得られるべき臍帯組織以外の、全ての物を含むものである。前記組織を解離するための外科的設備、好ましい酵素、或いは安定形態の酵素の選択は、上述した方法に必須である或いは好ましいように、緩衝液及び培養液、細胞ストレーナー、及びそれと同等物として提供される。オプション工程及び任意の供給業者のリスト、或いは代替材料が記載された詳細な取扱説明書も、便宜上提供される。対照細胞は、例えば、ＡＴＣＣに保存されたＵＤＣ培養に対して単離された前記細胞の比較のために含まれ得る。臍帯由来細胞を利用するためのキットは、好ましくは前記細胞の集団、若しくは、上述したような、前記細胞、構成成分及び産生物、或いは前記細胞から由来した分画または条件培養液を有する治療用組成物を含む。いくつかの実施例では、前記キットが少なくともＵＤＣｓおよび薬学的に許容可能な担体（液体、半固体、または固体）を含む１若しくはそれ以上の細胞集団を含んでもよい。いくつかの実施形態において前記集団は、同種、或いはＵＤＣｓのクローン細胞株である。他の実施形態において、前記キットは、同時培養において使用するための他の細胞株を含む。治療適用キットは好ましくは、望ましくは、例えば抗血栓形成因子、抗炎症性因子、抗アポトーシス因子、及び免疫抑制性或いは免疫調節性化合物などの付加的な生体活性因子を含む。前記キットは、状況に応じて、例えば注入により前記細胞を投与する手段を含んでもよい。前記キットはさらに、前記細胞の使用説明書を含んでもよい。軍事行為に使用するなど、医療現場で使用するために準備されたキットは、組織足場、外科縫合などの処置全体の供給品を含んでもよく、前記細胞が急性障害の治療と連動して使用される。ここで説明されるとおり、アッセイとｉｎｖｉｔｒｏ法に用いるキットには、１若しくはそれ以上の（１）ＵＤＣｓまたはＵＤＣｓの分画、構成成分または産生物、（２）前記ｉｎｖｉｔｒｏ法を実行するための試薬、（３）例えば、同時培養用の他の細胞または細胞集団（適宜）、及び（４）ｉｎｖｉｔｒｏ法を行うための取扱説明書を含んでもよい。
【０１１８】
以下の実施例では、本発明の実施例のいくつかの観点について、詳細を説明している。これらの実施例は、ここに記載された本発明の観点をさらに説明することを意図しているものである。これらの実施例は、前記観点を例示されたように限定すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１１９】
分娩後臍帯組織からの細胞の単離
満期または早期妊娠いずれかの出産で、分娩後臍帯組織が入手された。細胞は、５つの別々のドナーの臍帯組織から回収した。細胞単離の異なる方法は、以下のような細胞：１）異なる表現型、幹細胞に共通の特徴を有する細胞へ分化する能力、或いは２）他の細胞及び組織に対して有用な、重要な栄養性因子を提供する能力を有する細胞を産生する能力をテストされた。
【０１２０】
方法と物質
臍帯細胞単離：臍帯は国立疾病研究互助組織（ＮａｔｉｏｎａｌＤｉｓｅａｓｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ、ＮＤＲＩ、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）から入手された。前記組織は正常出産後に入手された。前記細胞単離プロトコールは、層流フードで無菌的に実行された。血液と壊死組織片を除去するため、前記臍帯を、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン、及び０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）の存在下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）で洗浄した。５０ミリリットルの培地（ＤＭＥＭ低グルコースまたはＤＭＥＭ高グルコース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、前記組織が細いパルプに切断されるまで、前記組織を１５０ｃｍ^２の組織培養プレートにおいて機械的に分離した。前記細かく切断された組織を、５０ミリリットルの円錐管（１本当たり約５グラムの組織）に移動した。
【０１２１】
前記組織は、次に１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ、および消化酵素をそれぞれ含有するＤＭＥＭ低グルコース培地またはＤＭＥＭ高グルコース培地において、消化した。いくつかの実験では、コラゲナーゼとディスパーゼの酵素混合物が使用された（「Ｃ：Ｄ」、ＤＭＥＭ低グルコース培地中、５００ユニット／ミリリットルのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）、５０ユニット／ミリリットルのディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（Ｃ：Ｄ：Ｈ＝５００ユニット／ミリリットルのコラゲナーゼ：５０ユニット／ミリリットルのディスパーゼ：５ユニット／ミリリットルのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）（ＤＭＥＭ低グルコース中））。前記組織、培地、及び消化酵素を含む円錐管を、３７℃、環状シェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ、ブルックリン、ニューヨーク州）で、２２５ｒｐｍ、２時間インキュベートした。
【０１２２】
消化後、前記組織は、１５０ｘｇで５分間遠心分離し、その上清を吸引した。このペレットは、２０ミリリットルの成長培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（ＦＢＳ、規定ウシ血清、ロット＃ＡＮＤ１８４７５、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンフォテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州））で再懸濁した。前記細胞懸濁液は、７０ミクロンナイロンＢＤＦＡＬＣＯＮ細胞ストレイナーを通して濾過した。成長培地を有する付加的な５ミリリットルのリンスを、前記ストレイナーに通過させた。前記細胞懸濁液は、次に４０マイクロメーターのナイロン製細胞ストレイナー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、カリフォルニア州）を通過させ、付加的な５ミリリットルの成長培地のリンスで流した。
【０１２３】
この濾液は、成長培地に再懸濁し（総量５０ミリリットル）、１５０ｘｇで５分間遠心分離した。前記上清を吸引し、前記細胞は５０ミリリットルの新鮮成長培地に再懸濁した。このプロセスを２回以上繰り返した。
【０１２４】
最終遠心分離の後で上清を吸引し、前記細胞ペレットを５ミリリットルの新鮮成長培地中に再懸濁した。生存可能な細胞数は、ＴｒｙｐａｎＢｌｕｅ染色により決定された。細胞は標準的な条件下で培養された。
【０１２５】
臍帯組織から単離された前記細胞は、ゼラチンコーティングしたＴ−７５フラスコ（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州）上へ、成長培地中に５，０００細胞／ｃｍ^２で播種した。２日後、消費培地及び非接着細胞をフラスコから吸引した。接着細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、壊死組織片と血液由来細胞を除去した。次に細胞を成長培地と共に補充し、コンフルエンスになるように継代１まで増殖させた（継代０から約１０日）。それに続く継代（継代１から２など）において、細胞は、４〜５日でサブコンフルエンス（７５〜８５％コンフルエンス）に達した。これらのその後の継代では、細胞が５，０００細胞／ｃｍ^２で播種された。細胞は、３７℃で、５％二酸化炭素を有する湿度インキュベーターにおいて増殖した。
【０１２６】
ＬＩＢＥＲＡＳＥＢＬＥＮＤＺＹＭＥＳを用いた細胞単離：細胞は、リベラーゼＬＩＢＥＲＡＳＥ（２．５ミリグラム／ミリリットル、ブレンザイム３（コラゲナーゼ（４Ｗｕｎｓｃｈユニット／グラム）及びサーモリシン（１７１４カゼイン単位／グラム））、ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅｓ、インディアナポリス、インディアナ州）、及びヒアルロニダーゼ（５ユニット／ミリリットル、Ｓｉｇｍａ）を用い、ＤＭＥＭ低グルコース培地において、分娩後組織から単離した。前記組織の消化、及び前記細胞の単離は、上記の他のプロテアーゼ消化に対して記載されているが、前記ＬＩＢＥＲＡＳＥ／ヒアルロニダーゼ混合物は、Ｃ：Ｄ、或いはＣ：Ｄ：Ｈ酵素混合物の代わりに使用した。ＬＩＢＥＲＡＳＥを用いた組織消化は、すばやく増殖した分娩後組織からの細胞集団の単離を生じた。
【０１２７】
他の酵素の組み合わせを用いた細胞単離：異なる酵素の組み合わせを用い、前記臍帯から細胞を単離する処置が比較された。消化のために比較された酵素としては、ｉ）コラゲナーゼ、ｉｉ）ディスパーゼ、ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ、ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ：Ｄ）、ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）、ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）、及びｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）を含む。これらの異なる酵素消化条件を利用した細胞単離の差が観察された（表１−１）。
【０１２８】
前記臍帯中の残留血液からの細胞単離：異なるアプローチにより、臍帯から細胞プールを単離する他の試みがなされた。一例では、臍帯をスライスし、成長培地で洗浄し、血餅とゼラチン状物質を除去した。血液、ゼラチン状物質、及び成長培地の混合物を回収し、１５０ｘｇで遠心分離した。そのペレットを再懸濁し、成長培地中でゼラチンコーティングしたフラスコ上へ播種した。これらの実験から、容易に増殖する細胞集団が単離された。
【０１２９】
臍帯血からの細胞単離：ＮＤＲＩから得られた臍帯血サンプルからも、細胞が単離された。ここで用いた単離プロトコールは、Ｈｏらの米国特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０２／２９９７１号に記載されたものである。臍帯血（ＮＤＲＩ、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）のサンプル（それぞれ５０ミリリットルと１０．５ミリリットル）を、溶解緩衝液（フィルターで殺菌された１５５ミリモル塩化アンモニウム、１０ミリモルの炭酸水素カリウム、ｐＨ７．２に緩衝された０．１ミリモルのＥＤＴＡ（全構成成分は、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州より））と混合した。細胞は、臍帯と溶解緩衝液を１：２０の比で溶解した。前記で得られた細胞懸濁液は、５秒間ボルテックスし、周囲温度で２分間インキュベートした。前記溶解液は遠心分離した（２００ｘｇで１０分間）。前記細胞ペレットは、１０％の胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）、４ミリモルのグルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、ハーンドン、バージニア州）、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、及び１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カールズバッド、カリフォルニア州）を含有する完全基礎培地（Ｇｉｂｃｏ、カールズバッド、カリフォルニア州）に再懸濁した。前記再懸濁細胞は、遠心分離し（２００ｘｇで１０分間）、前記上清を吸引し、前記細胞ペレットは完全培地で洗浄した。Ｔ７５フラスコ（コーニング、ニューヨーク州）、Ｔ７５ラミニンコーティングしたフラスコ、またはＴ１７５フィブロネクチンコーティングしたフラスコ（いずれもＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）に直接細胞を播種した。
【０１３０】
異なる酵素の組み合わせと増殖条件を用いた細胞の単離：細胞集団が異なる条件で単離され、単離直後に様々な条件下で増殖される可能性があるか否かを判断するため、上述の方法に沿って、Ｃ：Ｄ：Ｈの酵素の組み合わせを用い、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）含有或いは非含有成長培地において、細胞を消化した。全ての細胞は、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン及び１００ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシンの存在下で増殖した。すべてのテスト条件下で、細胞は、継代０と１の間で接着しよく増殖した（表１−２）。条件５〜８と１３〜１６の細胞は、接種後４継代まで十分増殖することが示され、この時点で凍結保存した。
【０１３１】
結果
異なる酵素の組み合わせを用いた細胞単離：Ｃ：Ｄ：Ｈの組み合わせは単離後の最高細胞収率を提供し、前記他の条件よりも培養においてより多くの世代を増殖させる細胞を産生した（表１−１）。増殖させた細胞集団は、コラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼのみを用いて達成されなかった。この結果がテストされた前記コラゲナーゼに特異的であるか否かを決定する試みは行われなかった。
【０１３２】
【表１】

【０１３３】
異なる酵素の組み合わせと増殖条件を用いた細胞の単離：酵素の消化と増殖を検討するすべての条件において、継代０〜１の間で細胞は十分接着し、よく増殖した（表１−２）。実験条件５〜８と１３〜１６の細胞は、接種後４継代まで十分増殖し、この時点で凍結保存した。全ての細胞は、更なる解析のために凍結保存した。
【０１３４】
【表２】

【０１３５】
前記臍帯中の残留血液からの細胞単離：有核細胞は急速に接着、増殖した。これらの細胞はフローサイトメトリーで分析し、酵素消化によって得られる細胞と同等であった。
【０１３６】
臍帯血からの細胞単離：前記製剤には赤血球細胞と血小板を含んでいた。最初の３週間で接着および分裂した有核細胞はなかった。前記培地は播種後３週間で交換し、接着および増殖した細胞は観察されなかった。
【０１３７】
要約
細胞集団は、前記酵素の組み合わせであるコラゲナーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）、及びヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘膜溶解酵素）を用い、臍帯組織から効率的に単離され得る。コラゲナーゼ及び中性プロテアーゼのブレンドであるＬＩＢＥＲＡＳＥも使用される。コラゲナーゼ（４Ｗｕｎｓｃｈ単位／グラム）及びサーモリシン（１７１４カゼイン単位／グラム）であるブレンドザイム（ＢＬＥＮＤＺＹＭＥ）３は、ヒアルロニダーゼと一緒に使用し、細胞を単離した。これらの細胞は、ゼラチンコーティングしたプラスチック上で成長培地において培養した場合、多数の継代を超えて容易に増殖した。
細胞は、臍帯における残存血液からも単離されるが、臍帯血からは単離されない。使用された前記条件下で接着し、増殖する前記組織から洗い流される血餅中の細胞の有無は、前記解剖プロセス中に放出された細胞によるものと考えられる。
【０１３８】
参考文献
１．Ｈｏ，Ｔｏｎｙ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，ＷＯ２００３０２５１４９Ａ２"ＣＥＬＬＰＯＰＵＬＡＴＩＯＮＳＷＨＩＣＨＣＯ−ＥＸＰＲＥＳＳＣＤ４９ＣＡＮＤＣＤ９０"ＮＥＵＲＯＮＹＸ，ＩＮＣ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．ＰＣＴ／ＵＳ０２／２９９７１，Ｆｉｌｅｄ２００２０９２０，Ａ２Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ２００３０３２７，Ａ３Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ２００３１２１８
【実施例２】
【０１３９】
臍帯由来細胞の増殖特徴
臍帯由来細胞の細胞増殖能力を、単離された幹細胞の他の集団と比較した。老化に対する細胞増殖の方法は、Ｈａｙｆｌｉｃｋの限度として引用される（ＨａｙｆｌｉｃｋＬ．Ｔｈｅｌｏｎｇｅｖｉｔｙｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．２２（１）：１〜１２，１９７４；ＨａｙｆｌｉｃｋＬ．Ｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ１４（１）：３７〜４５），１９７４）。
【０１４０】
材料と方法
ゼラチンコーティングフラスコ：組織培養プラスチックフラスコは、Ｔ７５フラスコ（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ニューヨーク州）へ２０ミリリットルの２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（タイプＢ：２２５Ｂｌｏｏｍ；Ｓｉｇｍａ，ＳｔＬｏｕｉｓ，マサチューセッツ州）２０分間室温で添加するによってコーティングした。前記ゼラチン溶液を除去した後、１０ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を添加し、次に吸引した。
【０１４１】
臍帯由来細胞の増殖能力の他の細胞集団との比較：増殖能力を比較するため、ｉ）間葉幹細胞（ＭＳＣ；Ｃａｍｂｒｅｘ、ウォーカーズビル、メリーランド州）、ｉｉ）脂肪由来細胞（米国特許番号第６，５５５，３７４Ｂ１号、米国特許出願番号第ＵＳ２００４００５８４１２号）、ｉｉｉ）正常皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９ロット＃９Ｆ０８４４；Ｃａｍｂｒｅｘ、ウォーカーズビル、メリーランド州）、及びｉｖ）臍帯由来細胞を利用した。細胞は、まず、成長培地中に５，０００細胞／ｃｍ^２でゼラチンコーティングＴ７５フラスコ上に播種した。その後の継代では、細胞培養が以下のように処理された。トリプシン処理後、生存可能な細胞がトリパンブルー染色後に計数された。細胞懸濁液（５０マイクロリットル）がトリパンブルー（５０マイクロリットル、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）と混合された。血球計数板を用い、生存可能細胞数が推定された。
【０１４２】
計数後、細胞は、新鮮成長培地２５ミリリットルの５，０００細胞／ｃｍ^２で、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコ上に播種した。細胞は、標準雰囲気（５％二酸化炭素（ｖ／ｖ））、３７℃において増殖させた。成長培地は、１週間に２回交換した。細胞が約８５％コフルエントに達したときに継代し、このプロセスを前記細胞が老化に達するまで繰り返した。
【０１４３】
各継代で細胞をトリプシン処理し、計数した。前記生存可能な細胞収率、集団倍加［ｌｎ（最終細胞数／最初の細胞数）／ｌｎ２］、倍加時間（培養時間／集団倍加）を計算した。最適な細胞増殖を決定する目的として、継代ごとに前記増殖係数（つまり、増殖係数＝最終細胞数／最初の細胞数）で前記継代の総収率を掛け算することで、１継代あたりの総細胞収率が決定された。
【０１４４】
低密度での細胞バンクの増殖能力：継代１０で貯蔵した細胞の増殖能力も検討された。異なる条件セットが利用された。正常な皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９ロット＃９Ｆ０８４４；Ｃａｍｂｒｅｘ、ウォーカーズビル、メリーランド州）、臍帯由来細胞、及び胎盤由来細胞を検討した。これらの細胞集団は、これまで継代１０で貯蔵したものであり、５，０００細胞／ｃｍ^２で播種し、その時点まで各継代でコフルエントまで増殖させた。継代１０で細胞解凍後、前記細胞集団で細胞密度の効果を決定した。細胞は、標準的な条件で解凍し、トリパンブルー染色により計数した。解凍した細胞は次に、成長培地中に１，０００細胞／ｃｍ^２で播種した。細胞は、標準雰囲気条件下、３７℃で増殖させた。成長培地は、１週間に２回交換した。細胞は約８５％コフルエントに達するまで継代した。その後細胞は老化まで、つまりそれ以上増殖できなくなるまで継代した。細胞は、トリプシン処理し、各継代で計数した。前記細胞収率、集団倍加［ｌｎ（最終細胞数／最初の細胞数）／ｌｎ２］、倍加時間（培養時間（ｈ）／集団倍加）を計算した。継代ごとに前記増殖係数（つまり、増殖係数＝最終細胞数／最初の細胞数）で前記継代の総収率を掛け算することで、１継代あたりの総細胞収率を決定した。
【０１４５】
最初の細胞播種から低密度での臍帯由来細胞の増殖：低細胞播種条件下で単離直後の臍帯由来細胞の増殖能力を、別の実験で検討した。臍帯由来細胞は、以前の実施例において説明したように単離した。細胞は１，０００細胞／ｃｍ^２で播種し、老化まで前述の通り継代した。細胞は、標準雰囲気条件下、３７℃で増殖させた。成長培地は、１週間に２回交換した。細胞は約８５％コフルエントに達するまで継代した。各継代で細胞をトリプシン処理し、トリパンブルー染色で計数した。各継代で前記細胞収率、集団倍加［ｌｎ（最終細胞数／最初の細胞数）／ｌｎ２］、倍加時間（培養時間（ｈ）／集団倍加）を計算した。継代ごとに前記増殖係数（つまり、増殖係数＝最終細胞数／最初の細胞数）で前記継代の総収率を掛け算することで、１継代あたりの総細胞収率を決定した。細胞は、ゼラチンコーティングと非ゼラチンコーティングフラスコで増殖した。
【０１４６】
低酸素培養条件での細胞増殖：低Ｏ_２酸素培養条件は、特定の環境において細胞増殖を改善できることが示された（Ｃｓｅｔｅ，Ｍａｒｉｅ；Ｄｏｙｌｅ，Ｊｏｈｎ；Ｗｏｌｄ，ＢａｒｂａｒａＪ．；ＭｃＫａｙ，Ｒｏｎ；Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌｏｒｅｎｚ．Ｌｏｗｏｘｙｇｅｎｃｕｌｔｕｒｉｎｇｏｆｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ．米国特許番号第ＵＳ２００４０００５７０４号）。臍帯由来細胞の細胞増殖は細胞増殖条件を変化させることで改善されるか否かを決定するため、臍帯由来細胞の培養を低酸素条件で増殖させた。ゼラチンコーティングフラスコ上に成長培地中５，０００細胞／ｃｍ^２で細胞を播種した。細胞は最初に標準的雰囲気条件下、継代５まで培養され、この時点で細胞は低酸素（５％Ｏ_２）培養条件へ移動した。
【０１４７】
他の増殖条件：他の実験において、細胞は、非コーティング、コラーゲンコーティング、フィブロネクチンコーティング、ラミニンコーティング、及びマトリゲルコーティングプレート上に増殖させた。培養は、これらの異なる基質で十分増殖することが証明された。
【０１４８】
結果
臍帯由来細胞の増殖能力の他の細胞集団との比較：臍帯由来細胞は、６０日間、１Ｅ１７細胞以上の細胞収率を生じながら４０継代以上増殖した。対照的に、ＭＳＣｓと線維芽細胞は、それぞれ２５日未満、及び６０日未満後に老化した。脂肪由来および大網細胞のいずれもほぼ６０日間増殖したが、これらの細胞の総細胞収率はそれぞれ４．５Ｅ１２および４．２４Ｅ１３となった。したがって、利用される前記実験条件下、５，０００細胞／ｃｍ^２で播種された場合、臍帯由来細胞は、同じ条件で増殖される他の細胞タイプよりもはるかに増殖した（表２−１）。
【０１４９】
【表３】

【０１５０】
低密度での細胞バンクの増殖能力：臍帯由来細胞、及び線維芽細胞は、１０継代以上増殖し、６０日間で細胞収率が>１Ｅ１１細胞となった（表２−２）。この条件下で、繊維芽細胞及び臍帯由来細胞集団の両者は、８０日後に老化し、それぞれ５０集団倍加以上、及び４０集団倍加以上を完了した。
【０１５１】
【表４】

【０１５２】
低酸素培養条件での細胞増殖：細胞は、減少した酸素条件下ではよく増殖したが、低酸素条件下での培養は、分娩後由来細胞へは有意な影響を及ぼさないように見られる。これら結果は、低下した酸素の効果に関してなされる最終的な結論は、最初の単離から低酸素において増殖した細胞での実験から記載されるのが最高であるという点では予備である。標準的な雰囲気条件は、十分な細胞数に増殖させることに成功することがすでに証明され、低酸素培地は分娩後由来細胞の増殖に必要ない。
【０１５３】
要約
約５，０００細胞／ｃｍ２の密度、ゼラチンコーティング或いは非コーティングフラスコ上で成長培地において、標準雰囲気酸素下で、単離されたヒト臍帯由来細胞を増殖させる現在の細胞増殖条件は、継代１１での大量の細胞を生産するのには十分である。さらに、前記データによって、前記細胞は、低密度培養条件（例えば、１，０００細胞／ｃｍ２）を用いてすばやく増殖させることができると示された。低酸素状態での臍帯由来細胞の増殖は細胞増殖を促すが、これらの増殖条件を利用する場合、細胞増殖能力における改善の増分はまだ観察されなかった。現在、標準的雰囲気条件下で臍帯由来細胞の培養が細胞の大量プールを発生させるために好まれている。しかし、前記培養条件を変化させると、臍帯由来細胞の増殖も同様に変化される可能性がある。この戦略は、これらの細胞集団の増殖能力および分化能力を増強するために利用されうる。
【０１５４】
利用された前記条件下で、ＭＳＣｓと脂肪由来細胞の増殖能力は制限されるが、臍帯由来細胞は容易に多数増殖する。
【０１５５】
参考文献
１）ＨａｙｆｌｉｃｋＬ．Ｔｈｅｌｏｎｇｅｖｉｔｙｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ．ＪＡｍＧｅｒｉａｔｒＳｏｃ．２２：１〜１２，１９７４．
２）ＨａｙｆｌｉｃｋＬ．Ｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ１４（１）：３７〜４５，１９７４．
３）ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰａｔｅｎｔＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．２００４００５８４１２
４）ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰａｔｅｎｔＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．２００４００４８３７２
６）Ｃｓｅｔｅ，Ｍａｒｉｅ；Ｄｏｙｌｅ，Ｊｏｈｎ；Ｗｏｌｄ，ＢａｒｂａｒａＪ．；ＭｃＫａｙ，Ｒｏｎ；ａｎｄＳｔｕｄｅｒ，Ｌｏｒｅｎｚ．Ｌｏｗｏｘｙｇｅｎｃｕｌｔｕｒｉｎｇｏｆｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ．ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰａｔｅｎｔＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．２００４０００５７０４．
【実施例３】
【０１５６】
Ｄ−バリンを含有する培地中の臍帯由来細胞の増殖
通常のＬ−バリンアイソフォームの代わりにＤ−バリンを含有する培地が利用され、培養において線維芽細胞様細胞の増殖を選択的に抑制させることが報告された（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ、２０００；Ｓｏｒｄｉｌｌｏら、１９８８）。臍帯由来細胞がＤ−バリン含有培地において増殖できるかどうかを決定するために実験を行なった。
【０１５７】
方法と物質
臍帯由来細胞（Ｐ５）、及び線維芽細胞（Ｐ９）を、ゼラチンコーティングＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ニューヨーク州）上に、５，０００細胞／ｃｍ^２で播種した。２４時間後、前記培地を除去し、前記細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、コーニング、ニューヨーク州）で洗い流し、残りの培地を除去した。前記培地は、変法成長培地（Ｄ−バリン含有ＤＥＭＥ（Ｄ−バリン（特注、Ｇｉｂｃｏ）、１５％（ｖ／ｖ）透析胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）、０．００１％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））に交換した。
【０１５８】
結果
透析された血清を含有する成長培地に播種された細胞とは異なり、Ｄ−バリン含有培地において播種されたヒト臍帯由来細胞も、線維芽細胞も増殖しなかった。線維芽細胞は、形態学的に変化し、サイズが増加し、形が変化した。前記細胞のすべてが死滅し、最終的に４週間後、フラスコ表面から剥離した。従って、臍帯由来細胞は、細胞増殖、及び長期生存を維持するために、Ｌ−バリンを必要とすると結論付けられた。
【０１５９】
参考文献
ＨｏｎｇｐａｉｓａｎＪ．（２０００）ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｂｙＤ−ｖａｌｉｎｅｉｎｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｍｙｏｍｅｔｒｉｕｍ．ＣｅｌｌＢｉｏｌＩｎｔ．２４：１−７．ＣｅｌｌＢｉｏｌＩｎｔ．２４：１〜７．
ＳｏｒｄｉｌｌｏＬＭ，ＯｌｉｖｅｒＳＰ，ＡｋｅｒｓＲＭ．（１９８８）ＣｕｌｔｕｒｅｏｆｂｏｖｉｎｅｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｉｎＤ−ｖａｌｉｎｅｍｏｄｉｆｉｅｄｍｅｄｉｕｍ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｒｅｍｏｖａｌｏｆｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．ＣｅｌｌＢｉｏｌＩｎｔＲｅｐ．１２：３５５〜６４．
【実施例４】
【０１６０】
臍帯由来ＰＰＤＣＳの核型解析
細胞療法で利用される細胞株は、好ましくは均一であり、汚染細胞タイプを含まない。細胞療法において利用されるヒト細胞は、正常構造を有した正常数（４６）の染色体を有しているべきである。均一で非臍帯組織由来の臍帯由来細胞株を同定するため、細胞サンプルの核型を解析した。
【０１６１】
材料と方法
男性新生児の分娩後組織からのＰＰＤＣｓは、成長培地において培養した。男性新生児（Ｘ，Ｙ）の分娩後組織は、新生児由来細胞と母体由来細胞（Ｘ，Ｘ）を区別できるように選択された。細胞は、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、コーニング、ニューヨーク州）において成長培地中に５，０００細胞／平方センチメートルで播種し、約８０％コンフルエントに増殖させた。細胞を含むＴ２５フラスコは、成長培地で頸部まで充填させた。サンプルは、宅配業者によって臨床細胞遺伝学研究室に配達された（研究室から研究室への推定移動時間は１時間）。染色体分析は、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌのＣｅｎｔｅｒｆｏｒＨｕｍａｎ & ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ（ニューアーク、ニュージャージー州）によって実施された。前記染色体は最も可視化される中期で細胞を分析した。計数された中期の２０個の細胞のうち、５個で正常な均一核型数（２）が解析された。２個の核型が観察された場合、細胞サンプルは均一なものとして特徴付けられた。２個以上の核型が観察された場合、細胞サンプルは不均一なものとして特徴付けられた。不均一な核型数（４）が同定されると、追加中期細胞数を計数、分析した。
【０１６２】
結果
染色体分析に送られたすべての細胞サンプルは、正常な形態を示すと解釈された。各細胞サンプルは、均一と特徴付けられた。（表４−２）。
【０１６３】
【表５】

【０１６４】
要約
染色体分析では、臨床細胞遺伝学研究室により解釈されるとおり、核型が正常に見える臍帯由来ＰＰＤＣを同定した。均一の核型で決定されたとおり、核型解析でも母体細胞を含まない細胞株を同定した。
【実施例５】
【０１６５】
ヒト臍帯由来細胞表面マーカーのフローサイトメトリー評価
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質または「マーカー」の特徴は、細胞株の同定を決定するために利用されうる。発現の一貫性は、複数のドナーから、異なる処理と培養条件に曝露された細胞で決定できる。臍帯から単離された分娩後細胞株は、フローサイトメトリーによって特徴付けられ、これにより、これら細胞株の同定に対する特性（プロファイル）を提供する。
【０１６６】
材料と方法
培養液及び培養容器：細胞は、血漿で処理されたＴ７５、Ｔ１５０、及びＴ２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、コーニング、ニューヨーク州）において成長培地中でコフルエントまで培養した。前記フラスコの増殖表面は、室温で２０分間、２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）によりコーティングされた。
【０１６７】
抗体染色：フラスコ中の接着細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カールズバッド、ミズーリ州）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で乖離させた。細胞は、回収し、遠心分離し、１×１０^７個／ミリリットルの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで再懸濁した。前記製造業者の仕様書に沿って、対象の前記細胞表面マーカーに対する抗体（下を参照）を１００マイクロリットルの細胞懸濁液に添加し、前記混合物を４℃で３０分間、暗所でインキュベートさせた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄し、非結合性抗体を除去するために遠心分離した。細胞は、５００マイクロリットルのＰＢＳ中で再懸濁し、フローサイトメトリーで解析した。
【０１６８】
フローサイトメトリー解析：ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）でフローサイトメトリー解析を実施した。
【０１６９】
細胞表面マーカーに対する抗体：以下の細胞表面マーカーに対する抗体を使用した。
【０１７０】
【表６】

【０１７１】
継代と継代の比較：臍帯由来細胞は、継代８、１５、２０で分析した。
【０１７２】
ドナーとドナーの比較：ドナー間の違いを比較するために、異なるドナーからの臍帯をそれぞれ比較した。
【０１７３】
表面コーティングの比較：ゼラチンコーティングされたフラスコ上に培養された臍帯由来細胞は、非コーティングされたフラスコ上に培養された臍帯と比較した。
【０１７４】
結果
臍帯由来細胞特徴：フローサイトメトリーで分析された臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現が陽性であることが示され、これはＩｇＧ対照に相対する蛍光値が上昇することで示された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの検出可能な発現が陰性であり、これはＩｇＧ対照と比較可能な蛍光値によって示された。陽性曲線の蛍光値の変化を説明する。前記陽性曲線の平均（つまりＣＤ１３）と範囲（つまりＣＤ９０）は、やや変化を示したが、前記曲線は正常に見え、均一な集団であることが確認された。いずれの曲線も、それぞれＩｇＧ対照以上の値を示した。
【０１７５】
継代と継代の比較：フローサイトメトリーで分析された継代８、１５、２０の胎盤由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを全て発現しており、これはＩｇＧ対照に対する蛍光値が上昇することで示された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱが陰性であり、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値によって示された。陽性曲線の蛍光検出値における評価は、予想された範囲内であった。陽性曲線の平均（つまりＣＤ１３）は変化したが、全ての曲線は、それぞれＩｇＧ対照以上の値を示した。
【０１７６】
ドナーとドナーの比較：前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値が上昇することに反映されるとおり、フローサイトメトリーで分析され、別のドナーから単離された臍帯由来細胞では、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現がそれぞれ陽性であることが示された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現が陰性であり、蛍光値は前記ＩｇＧ対照と一致した。陽性曲線の蛍光値の変化を説明する。陽性曲線の平均（つまりＣＤ１０）は変化したが、両方の曲線は、それぞれＩｇＧ対照以上の値を示した。
【０１７７】
ゼラチンでの表面コーティングの効果：フローサイトメトリーで分析され、ゼラチンおよび非コーティングフラスコで増殖された臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現がすべて陽性であり、ＩｇＧ対照に対する蛍光値が上昇していた。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現が陰性であり、蛍光値は前記ＩｇＧ対照と一致した。
【０１７８】
要約
フローサイトメトリーによる臍帯由来細胞の分析は、これらの細胞株を同定するのに有用な特性（プロファイル）を確立した。臍帯由来分娩後細胞では、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃが陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱが陰性である。この同定は、ドナー、継代、培養容器表面コーティング、及び前記細胞を単離し調整するのに使用された消化酵素を含む変数における変化間で一致していた。個々の蛍光値のヒストグラム曲線の平均と幅におけるいくつかの変化が観察されたが、すべての検討された条件下ですべての陽性曲線が正常であり、前記ＩｇＧ対照よりも大きな蛍光値を発現していたため、前記細胞は、均一な集団を有し、前記マーカーの陽性発現を有することを確認した。
【実施例６】
【０１７９】
オリゴヌクレオチドアレイによる細胞の解析
オリゴヌクレオチドを使用し、臍帯由来細胞と胎盤由来細胞の遺伝子発現プロフィールを線維芽細胞、ヒト間質幹細胞、及びヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この分析では、前記分娩後由来細胞の特徴を提供し、これらの細胞に独特の分子マーカーを同定した。
【０１８０】
材料と方法
細胞の単離と培養
分娩後組織由来細胞：ヒトの臍帯と胎盤は、患者の同意を得て、正常な満期出産において国立疾病研究互助組織（ＮＤＲＩ、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）から得られた。実施例１に記載したように、前記組織を回収し、細胞を単離した。細胞は、ゼラチンコーティング組織培養プラスチックフラスコ上、成長培地中で培養した。前記培地は、３７℃で５％ＣＯ_２によりインキュベートした。
【０１８１】
線維芽細胞：ヒト皮膚線維芽細胞は、ＣａｍｂｒｅｘＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ウォーカーズビル、メリーランド州、ロット番号９Ｆ０８４４）から購入し、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）から入手された。いずれの株も、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）とペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）で培養させた。前記細胞は標準組織で処理されたプラスチックで増殖された。
【０１８２】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）：ｈＭＳＣは、ＣａｍｂｒｅｘＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ウォーカーズビル、メリーランド州、ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６、２Ｆ１６５７）から購入し、ＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）の製造業者の仕様書に沿って培養させた。前記細胞は、５％ＣＯ_２、３７℃で標準的な組織培養プラスチック上に増殖させた。
【０１８３】
ヒト腸骨稜骨髄細胞（ＩＣＢＭ）：ヒト腸骨稜骨髄は、患者の同意を得てＮＤＲＩから受理された。前記骨髄は、Ｈｏらが概要を示した方法に沿って処理した。（ＷＯ０３／０２５１４９）前記骨髄は、２０パーツの溶解緩衝液に対して１パーツの骨髄の比で、溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ_３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）と混合した。前記細胞懸濁液は、ボルテックスにかけ、２分間、周囲の温度でインキュベートし、５００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清及び４ｍＭグルタミンを添加した最小必須培地アルファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。前記細胞は再び遠心分離され、前記細胞ペレットは新鮮培地に再懸濁された。前記生存可能な単核細胞は、トリパンブルー排除（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）を用いて計数した。前記単核細胞は、５ｘ１０^４細胞／ｃｍ^２で組織培養プラスチックフラスコに播種した。前記細胞は、標準的雰囲気Ｏ_２または５％Ｏ_２で５％ＣＯ_２を用い、３７℃でインキュベートした。細胞は培地を取り替えずに、５日間培養させた。培地と非接着細胞は、５日間の培養後に除去した。前記接着細胞は培地で維持させた。
【０１８４】
ｍＲＮＡの単離及びＧＥＮＥＣＨＩＰ（ジーンチップ）解析：細胞の活性増殖培養は、細胞スクレーパーを用い、冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で前記フラスコから除去した。前記細胞は、３００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞は申請ＰＢＳに再懸濁し、再び遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを即座に凍結させ、−８０℃で保存した。細胞ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへ転写した。次に、ｃＤＮＡをｃＲＮＡへ転写し、ビオチン標識した。前記ビオチン標識ｃＲＮＡは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧＥＮＥＣＨＩＰＨＧ−Ｕ１３３Ａオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタクララ、カリフォルニア州）を用いてハイブリダイズした。前記ハイブリッド形成とデータ収集は、前記製造業者の仕様書に沿って実施した。前記ハイブリッド形成とデータ収集は、前記製造業者の仕様書に沿って実施した。データ解析は、"ＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＭｉｃｒｏａｒｒａｙｓ"（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピュータソフトウェア（Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．ｅｔａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：５１１６〜５１２１）．解析ソフトウェアのライセンスは、ｔｈｅＯｆｆｉｃｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｉｃｅｎｓｉｎｇ，ＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙを通じて可能であり、より詳しい情報は、Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ教授（ｔｈｅＤｅｐ’ｔｏｆＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ，ＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の（ｗｗｗ−ｓｔａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｔｉｂｓ／ＳＡＭ／）から入手可能である。
【０１８５】
結果
この研究では、１４種類の異なる細胞集団が分析された。継代情報、培養基質、及び培地に沿って細胞は、表６−１に掲載した。
【０１８６】
【表７】

【０１８７】
前記データは、上述したように、ＳＡＭソフトウェアを用いてＰｒｉｎｃｉｐｌｅＣｏｍｐｏｎｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓによって評価した。解析によって、テストした細胞において異なる相対量で発現された２９０遺伝子を明らかにした。この解析は、集団間の相対的比較を提供した。
【０１８８】
表６−２は、前記細胞ペアの比較を計算したユークリッド距離を示す。前記ユークリッド距離は、前記細胞タイプの間で異なって発現された２９０種類の遺伝子に基づいた、細胞の比較に基づいている。前記ユークリッド距離は、前記２９０遺伝子の発現の類似性に反比例している。
【０１８９】
【表８】

【０１９０】
表６−３、６−４、６−５は、胎盤由来細胞における遺伝子の発現の増加（表６−３）、臍帯由来細胞における遺伝子の発現の増加（表６−４）、及び臍帯と胎盤由来細胞における遺伝子の発現の減少（表６−５）を示す。
【０１９１】
【表９】

【０１９２】
【表１０】

【０１９３】
【表１１−１】

【０１９４】
【表１１−２】

【０１９５】
【表１１−３】

【０１９６】
表６−６、６−７、６−６は、ヒト線維芽細胞（表６−６）、ＩＣＢＭ細胞（表６−７）、及びＭＳＣｓ（表６−８）で増加した遺伝子の発現を示す。
【０１９７】
【表１２】

【０１９８】
【表１３】

【０１９９】
【表１４】

【０２００】
要約
本発明は、臍帯と胎盤に由来する前記分娩後細胞の分子特徴を提供するために実行した。この分析には、３種類異なる臍帯と３種類の異なる胎盤に由来する細胞を含む。この研究でも、２種類の異なる皮膚線維芽細胞株、３種類の異なる間葉系幹細胞、及び３種類の腸骨稜骨髄細胞を含む。これらの細胞によって発現された前記ｍＲＮＡは、２２，０００遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプローブを含んだＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイにより分析した。
【０２０１】
この解析によって、２９０遺伝子の転写物は、これらの５つの異なる細胞タイプにおいて異なる量で存在することが明らかになった。これらの遺伝子には、前記胎盤由来細胞で特異的に増加する１０種類の遺伝子と、前記臍帯由来細胞で特異的に増加する７種類の遺伝子を含む。５４種類の遺伝子では、胎盤と臍帯で特異的に発現レベルが低下することが分かった。
【０２０２】
選択された遺伝子の発現は、実施例７に示したように、ＰＣＲで確認した。分娩後由来細胞では一般的に、臍帯由来細胞では特に、例えば、骨髄由来細胞及びここでテストされた線維芽細胞他のヒト細胞と比較した場合、異なる遺伝子発現特性（プロフィール）を有している。
【実施例７】
【０２０３】
臍帯由来細胞の細胞マーカー
ヒト臍帯から派生させた細胞の遺伝子発現特性は、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧＥＮＥＣＨＩＰを用いて、他の源から派生させた細胞の特性と比較した。６つの「サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」遺伝子：酸化ＬＤＬ受容体１、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レニン、レチキュロン、ケモカイン受容体リガンド３（ＣＸＣリガンド３）、及び顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）が同定された。これらの「サイン」遺伝子は、臍帯由来細胞で比較的高レベルで発現された。
【０２０４】
本実施例に説明された手順は、遺伝子及びタンパク質発現に対するマイクロアレイデータ及び比較データを変更するために、さらに、臍帯由来細胞に対してユニークな識別子の検出するための信頼できる一連のアッセイを確立するために実行した。
【０２０５】
方法と物質
細胞：臍帯由来細胞（４単離体）、及び正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ：新生児及び生態）は、ゼラチンコーティングＴ７５フラスコにおいて成長培地中で増殖させた。間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、間葉系幹細胞成長培地一括（Ｂｕｌｌｅｔ）キット（ＭＳＣＧＭ；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、メリーランド州）で増殖させた。
【０２０６】
ＩＬ−８実験では、細胞を液体窒素から解凍し、５，０００細胞／ｃｍ^２でゼラチンコーティングされたフラスコに播種し、成長培地で４８時間増殖させ、次にさらに８時間、１０ミリリットルの血清飢餓培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カールズバッド、カリフォルニア州）、ペニシリン（５０単位／ミリリットル）、ストレプトマイシン（５０マイクログラム／ミリリットル）（Ｇｉｂｃｏ、カールズバッド、カリフォルニア州）、及び０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州））で増殖させた。次に、ＲＮＡを抽出し、前記上清を１５０ｘｇで５分間遠心分離し、細胞片を除去した。ＥＬＩＳＡ分析まで、上清は−８０℃で凍結させた。
【０２０７】
ＥＬＩＳＡアッセイの細胞培養：ヒト臍帯由来の細胞、およびヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞を、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコにおいて、成長培地中で培養させた。細胞は継代１１で液体窒素中に凍結させた。細胞を解凍し、１５ミリリットルの遠心分離管に移動させた。５分間、１５０ｘｇでの遠心分離後、前記上清を廃棄した。細胞は、４ミリリットルの培地に再懸濁し、計数した。細胞は、３７５，０００細胞／フラスコで、１５ミリリットルの成長培地を含む７５ｃｍ^２のフラスコにおいて２４時間増殖させた。前記培地は、８時間、血清飢餓培地に変更した。血清飢餓培地は、インキュベーションの最後に回収し、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離した（そして−２０℃で保存した）。
【０２０８】
各フラスコにおける細胞数を推定するため、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カールズバッド、カリフォルニア州）を各フラスコに添加した。細胞を前記フラスコから乖離させた後、トリプシン活性を８ミリリットルの成長培地で中和させた。細胞は、１５ミリリットルの遠心分離管に移し、１５０ｘｇで５分間、遠心分離した。上清を除去し、１ミリリットルの成長培地を各管に添加し、前記細胞を再懸濁した。血球計数板を用い、細胞数を決定した。
【０２０９】
ＥＬＩＳＡアッセイ：前記細胞により血清飢餓培地に分泌されたＩＬ−８の量は、ＥＬＩＳＡアッセイで分析した（Ｒ&ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）。すべての分析は、前記製造業者によって提供された使用説明書に沿って検査した。
【０２１０】
総ＲＮＡ単離：ＲＮＡは、コフルエント臍帯由来細胞と線維芽細胞から抽出されるか、ＩＬ−８の発現では前述の通り処理された細胞から抽出した。細胞は、製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州）に沿って、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を含む３５０マイクロリットルの緩衝液ＲＬＴを用いて溶解した。ＲＮＡは、製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州）に沿って抽出し、ＤＮＡａｚｅで処理した（２．７ユニット／サンプル）（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）。ＲＮＡは、５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で溶出し、−８０℃で保存した。ＲＮＡは、ヒト臍帯からも抽出した。組織（３０ミリグラム）は、β−メルカプトエタノールを含む７００マイクロリットルの緩衝液ＲＬＴに懸濁した。サンプルは、機械的にホモジナイズし、前記ＲＮＡ抽出は、製造業者の使用説明書に沿って処理した。ＲＮＡは、５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で抽出し、−８０℃で保存した。
【０２１１】
逆転写：ＲＮＡは、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）を用いたランダム六量体を用い、逆転写した。サンプルは−２０℃で保存した。
【０２１２】
分娩後由来細胞（サイン遺伝子−酸化ＬＤＬ受容体、インターロイキン−８、レニン、レチキュロンを含む）で独自に制御されるとおり、ｃＤＮＡマイクロアレイで同定された遺伝子は、さらにリアルタイムおよび従来のＰＣＲを用いて検討した。
【０２１３】
リアルタイムＰＣＲ：ＰＣＲは、商品名ＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）遺伝子発現産物で販売されている遺伝子発現産物を用いて、ｃＤＮＡサンプルで実行した。酸化ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）、レニン（Ｈｓ００１６６９１５）レチキュロン（Ｈｓ００３８２５１５）、ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）、ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）、ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）及びＧＡＰＤＨは、ＡＢＩＰｒｉｓｍ７０００ＳＤＳソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有する７０００配列検出システムを用いて、取扱説明書に従って、ｃＤＮＡとＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲマスターミックスと混合した。熱サイクル条件は、最初２分間で５０℃、１０分間で９５℃とし、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル行なった。ＰＣＲデータは、製造業者の使用説明書（ＡＢＩプリズム７７００配列検出システムについて、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのユーザー掲示板＃２）に沿って分析した。
【０２１４】
従来のＰＣＲ：従来のＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲの結果を確認するため、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州ボストン）を用いて実施した。ＰＣＲは、２マイクロリットルのｃＤＮＡ溶液（１×Ｔａｑポリメラーゼ）（商品名ＡＭＰＬＩＴＡＱＧＯＬＤ）ユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９４℃、５分で最初の変性を実行した。増幅は、各プライマーセットで最適化した。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、及びレチキュロンの場合（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル）、レニンの場合（９４℃で１５秒間、５３℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を３８サイクル）、酸化ＬＤＬ受容体とＧＡＰＤＨの場合（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を３３サイクル）。増幅のために使用されたプライマーは、表７−１に記載した。最終ＰＣＲ反応におけるプライマー濃度は、ＧＡＰＤＨ（０．５マイクロモル）を除いて、１マイクロモルで行なった。前記製造業者のＴａｑＭａｎプローブが前記最終ＰＣＲ反応に追加されなかった場合を除き、ＧＡＰＤＨプライマーはリアルタイムＰＣＲと同じであった。サンプルは、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイド（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）で染色した。画像は、焦点距離ＰＯＬＡＲＯＩＤカメラ（ＶＷＲＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、サウスプレーンフィールド、ニュージャージー州）を用い、６６７フィルム（ＵｎｉｖｅｒｓａｌＴｗｉｎｐａｃｋ、ＶＷＲＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、サウスプレーンフィールド、ニュージャージー州）上で捕獲した。
【０２１５】
【表１５】

【０２１６】
免疫蛍光検査：細胞は、冷却した４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）で１０分間、室温で固定した。継代０（Ｐ０）（１単離体、単離後直接）、及び継代１１（臍体由来細胞の２単離体）の臍体由来細胞、及び線維芽細胞（Ｐ１１）を使用した。免疫細胞化学は、以下のエピトープに対して作られた抗体を用いて実行した：ビメンチン（１：５００、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、デスミン（（Ｓｉｇｍａ）１：１５０、ウサギに対して作成、または（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、カリフォルニア州）１：３００、マウスに対して作成）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、及びＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カーピンテリア、カリフォルニア州）。加えて、以下のマーカーを継代１１の分娩後細胞でテストした：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ、サンタクルーズ、カリフォルニア州）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬＲ１；１：１００；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）、及び抗ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；ＳａｎｔａＣｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【０２１７】
培養は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、カリフォルニア州）、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を含むタンパク質遮断溶液に３０分間曝露させ、細胞内抗原にアクセスした。対象エピトープが前記細胞表面に位置する場合（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬＲ１）、エピトープの損失を予防するため、前記処置のすべての段階でＴｒｉｔｏｎＸ−１００を省略した。さらに、前記一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬＲ１、ＮＯＧＯ−Ａ）に対して作成された場合、ヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）のロバ血清が使用された。ブロッキング溶液に希釈した一次抗体は、次に室温で１時間前記培地に適用させた。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＴｅｘａｓＲｅｄ（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０，ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）とともにブロックを含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、前記一次抗体溶液を除去し、前記培地をＰＢＳで洗浄した。次に培養を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０２１８】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ逆落射型蛍光顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｏｌｙｍｐｕｓ、メルビル、ニューヨーク州）上で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。すべてのケースで、対照染色の上に陽性染色が蛍光シグナルを示し、上記に概要を示した方法全体がフォローされたが、一次抗体溶液の適用は例外であった（１゜コントロールなし）。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、代表的な画像を捕らえた。３つ組で染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像を回収した。次に、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて層状のモンタージュを用意した。
【０２１９】
ＦＡＣＳ分析：フラスコ中の接着細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カールズバッド、カリフォルニア州）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡで分離させた（Ｇｉｂｃｏ、カールズバッド、カリフォルニア州）。細胞は、回収し、遠心分離し、１×１０^７個／ミリリットルの濃度で、３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳのＰＢＳで再懸濁した。１００マイクロリットルの一定分量を円錐管に移した。細胞内抗原で染色された細胞は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）で透過させた。抗体は、製造業者の使用説明書により一定分量に添加し、前記細胞は３０分間４℃で暗所においてインキュベートさせた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離し、過剰な抗体を除去した。二次抗体を必要とする細胞は、１００マイクロモルの３％ＦＢＳに再懸濁させた。二次抗体は、製造業者の使用説明書により添加し、前記細胞は３０分間４℃で暗所においてインキュベートさせた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、遠心分離し、過剰な二次抗体を除去した。洗浄された細胞は、０．５マイクロリットルのＰＢＳ中で再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。以下の抗体を使用した。酸化ＬＤＬ受容体１（ｓｃ−５８１３；ＳａｎｔａＣｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＧＲＯアルファ（５５５０４２；ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）、マウスＩｇＧ１κ（Ｐ−４６８５およびＭ−５２８４；Ｓｉｇｍａ）、ロバ抗ヤギＩｇＧ（ｓｃ−３７４３；ＳａｎｔａＣｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．）。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）でフローサイトメトリー分析を実施した。
【０２２０】
結果
ヒト臍帯、成人および新生児の線維芽細胞、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）から由来した細胞のｃＤＮＡについて実施した、選択された「サイン」遺伝子のリアルタイムＰＣＲの結果によって、レチキュロン及び酸化ＬＤＬ受容体発現は、他の細胞と比べ、前記臍帯由来細胞において高レベルであったことを示している。リアルタイムＰＣＲから得られたデータは、ΔΔＣＴ法によって分析し、対数スケールで表現した。分娩後由来細胞と対照では、ＣＸＣリガンド３とＧＣＰ−２の発現レベルに有意な差は認められなかった。リアルタイムＰＣＲの結果は、従来のＰＣＲによって確認した。ＰＣＲ産物の配列決定によって、さらにこれらの観察の妥当性を確認した。表７−１に掲載された従来のＰＣＲＣＸＣリガンド３プライマーを用い、分娩後細胞と対照との間でＣＸＣリガンド３の発現レベルに有意な差は認められなかった。
【０２２１】
分娩後細胞におけるサイトカインＩＬ−８の発現は、成長培地での培養、及び血清飢餓分娩後由来細胞の両方において増加した。すべてのリアルタイムＰＣＲデータは、従来のＰＣＲとＰＣＲ産物の配列決定で妥当性を確認した。
【０２２２】
無血清培地中で増殖させた後、条件培地におけるＩＬ−８の存在を検討した。臍帯細胞を増殖させた培地において大量のＩＬ−８が検出された（表７−２）。ヒト皮膚線維芽細胞を増殖させた培地では、ＩＬ−８が検出されなかった。
【０２２３】
【表１６】

【０２２４】
継代０のヒト臍帯由来の細胞では、免疫細胞化学的分析により選択されたタンパク質の発現がプローブされた。単離後すぐ（継代０）で、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、以下の６つの抗体にさらした：フォン・ウィルブランド因子、ＣＤ３４、サイトカイン１８、デスミン、アルファ−平滑筋アクチン、及びビメンチン。臍帯由来細胞では、α−平滑筋アクチン、ビメンチンが陽性であり、前記染色パターンは継代１１まで一致した。
【０２２５】
免疫細胞化学により、継代１１での臍帯由来細胞におけるＧＲＯα、ＧＣＰ−２、酸化ＬＤＬ受容体１、及びレチキュロンの発現を検討した。
【０２２６】
要約：マイクロアレイで測定された遺伝子発現レベルとＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲと従来のＰＣＲの両方）との間の一致は、以下の４つの遺伝子で確認された：酸化型ＬＤＬ受容体１、レニン、レチキュロン、及びＩＬ−８。これら遺伝子の発現は、出産後細胞においてｍＲＮＡレベルで制御されていた。ＩＬ−８は、タンパク質レベルでも制御されていた。ＧＣＰ−２及びＣＸＣリガンド３の発現における違いは、ｍＲＮＡレベルでは確認されなかった。
【０２２７】
継代０におけるヒト臍帯由来細胞では、α−平滑筋アクチンとビメンチンの発現がプローブされ、いずれも陽性であった。染色パターンは、継代１１でも保存されており、これは、ビメンチン及びアルファ−平滑筋アクチンの発現が、少なくとも成長培地を用いた場合の継代では細胞に保存されていることを示していた。
【実施例８】
【０２２８】
臍帯細胞表現型の免疫組織化学的特徴
ヒト臍帯組織内に見られる細胞の表現型は、免疫組織化学によって解析した。
【０２２９】
方法と物質
組織標本：ヒト臍帯組織を播種し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで一晩、４℃で液浸固定した。免疫組織化学は、以下のエピトープ（表８−１参照）に直接対する抗体を用いて実行した：ビメンチン（１：５００、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、デスミン（１：１５０、ウサギに対して作成、Ｓｉｇｍａ、または１：３００、マウスに対して作成、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、カリフォルニア州）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、及びＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カーピンテリア、カリフォルニア州）。加えて、以下のマーカーもテストした：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ、サンタクルーズ、カリフォルニア州）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬＲ１；１：１００；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）、及び抗ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；ＳａｎｔａＣｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）。固定された標本を外科用メスで削り、エタノールを含むドライアイス浴でＯＣＴ包埋化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−ＴｅｋＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ、トランス、カリフォルニア州）内に入れた。次に、標準的な低温切片作製装置（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、冷凍ブロックを切片化し（厚さ１０ミクロン）、染色用ガラススライドに載せた。
【０２３０】
免疫組織化学：免疫組織化学は、以前の研究（例えば、Ｍｅｓｓｉｎａ，ｅｔａｌ．（２００３）Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８４：８１６〜８２９）と同様に実行した。組織切片は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、カリフォルニア州）、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に１時間曝露させ、細胞内抗原にアクセスした。対象エピトープが前記細胞表面に位置する場合（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬＲ１）、エピトープの損失を予防するため、前記処置のすべての段階でＴｒｉｔｏｎを省略した。さらに、前記一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬＲ１、ＮＯＧＯ−Ａ）に対して作成された場合、前記処置を介してヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）のロバ血清が使用された。ブロッキング溶液に希釈された一次抗体は、次に室温で４時間前記切片に適用した。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＴｅｘａｓＲｅｄ（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）とともにブロックを含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、一次抗体溶液を除去し、培養をＰＢＳで洗浄した。培養を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０２３１】
免疫染色後、逆落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、メルビル、ニューヨーク州）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。陽性染色は対照染色を上回る蛍光シグナルにより表された。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、代表的な画像を捕らえた。３つ組で染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像を回収した。次に、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて層状のモンタージュを用意した。
【０２３２】
【表１７】

【０２３３】
結果
臍帯の特徴：ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、ＣＤ３４マーカーは、臍帯に認められる細胞のサブセットで発現された。特に、ｖＷＦとＣＤ３４の発現は、前記臍帯に含まれる血管に限定されていた。ＣＤ３４＋細胞は最内の層（内腔側）にあった。ビメンチンの発現は、前記臍帯の基質と血管に亘って認められた。ＳＭＡは、動脈および静脈の基質と外壁に限定されていたが、前記血管自体には含まれていなかった。ＣＫ１８とデスミンは、血管内のみに観察され、デスミンは中間層と外層に限定されていた。
【０２３４】
要約：ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ウィルブランド因子、及びＣＤ３４は、ヒト臍帯内の細胞に産生された。
【実施例９】
【０２３５】
分娩後由来細胞による栄養性因子の分泌
臍帯由来ＰＰＤＣｓからの選択された栄養性因子の分泌を測定した。因子は、血管新生活性（すなわち、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（１９９７）ＣｉｂａＦｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２１２：２１５〜２６）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏｅｔａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ９６；３４〜４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｌｉｅｔａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３３６９〜７６）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓｅｔａｌ．（２００４）Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７７：８１２〜８）、組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン−結合性上皮細胞成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質−由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１ａｌｐｈａ））、神経栄養性／神経保護性活性（脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇｅｔａｌ．（２００３）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５８；３１９〜３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦβ２））、或いはケモカイン（炎症性細胞遊走因子）活性（マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１アルファ）、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ１ベータ）、単球化学誘引物質−１（ＭＣＰ−１）、Ｒａｎｔｅｓ（発現され分泌された正常Ｔ細胞の活性化を制御する）、Ｉ３０９、胸腺及び活性化調節性ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＩＬ−８）を有するものから選択した。
【０２３６】
方法と物質
細胞培養：臍帯由来のＰＰＤＣｓ、およびヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞を、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコにおいて、成長培地中で培養させた。細胞は継代１１で凍結保存され、液体窒素に保存された。前記細胞を解凍後、成長培地を前記細胞に添加した後、１５ミリリットルの遠心分離管に移し、１５０ｘｇで５分間、前記細胞を遠心分離した。前記細胞ペレットは、４ミリリットルの成長培地に再懸濁し、細胞を計数した。細胞は、成長培地１５ミリリットルを含むＴ７５フラスコに５，０００細胞／ｃｍ^２で播種し、２４時間培養させた。前記培地は、８時間、無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ストレプトマイシン（５０単位／ミリリットル）、ストレプトマイシン（５０マイクログラム／ミリリットル、Ｇｉｂｃｏ））に交換した。無血清条件培地は、インキュベーションの最後に１４，０００×ｇで５分間遠心分離によって回収し、−２０℃で保存した。
【０２３７】
各フラスコの細胞数を推定するため、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて乖離させた。トリプシン活性は、８ミリリットルの成長培地を加えることで停止した。細胞は、１５０ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞は１ミリリットルの成長培地に再懸濁した。血球計数板を用い、細胞数を推定した。
【０２３８】
ＥＬＩＳＡアッセイ：細胞は、３７℃で５％二酸化炭素と大気酸素中で増殖した。各細胞サンプルで生産されたＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１アルファ、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、及びＴＧＦ−ベータ２の量は、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ&ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）で測定した。すべてのアッセイは前記製造業者の使用説明書に沿って実施した。値は、ピコグラム／ミリリットル／１００万細胞（ｎ＝２、ｓｅｍ）で示している。
【０２３９】
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔＭｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄＥＬＩＳＡアッセイ：ケモカイン（ＭＩＰ１アルファ、ＭＩＰ１ベータ、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、エオタキシン、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、及び血管新生因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦ）は、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔＰｒｏｔｅｏｍｅアレイ（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ．）を用いて測定した。前記プロテオームアレイは、１ウェル当たり１６タンパク質に対して２つの定量測定を行う多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。前記アレイは、１６ウェルプレートの各ウェルに４〜１６種類の異なる捕捉抗体の２×２、３×３、または４×４パターンをスポットすることで作成された。サンドイッチＥＬＩＳＡ法後、前記プレートの各ウェル内の各スポットで発生した化学蛍光シグナルを捕捉するため、前記プレート全体を画像化した。各スポットで発生したシグナルの量は、最初の標準またはサンプルにおいて、標的タンパク質の量と比例する。
【０２４０】
結果
ＥＬＩＳＡアッセイ：ＭＣＰ−１およびＩＬ−６は、臍帯由来ＰＰＤＣと皮膚線維芽細胞により分泌された（表９−１）。ＳＤＦ−１アルファ及びＧＣＰ−２は、線維芽細胞によって分泌された。ＧＣＰ−２およびＩＬ−８は、臍帯由来ＰＰＤＣにより分泌された。ＴＧＦ−ベータ２は、ＥＬＩＳＡによってどちらの細胞タイプからも検出されなかった。
【０２４１】
【表１８】

【０２４２】
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔＭｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄＥＬＩＳＡアッセイ：ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ベータ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、及びＩＬ−８は、臍帯由来ＰＰＤＣｓから分泌された（表９−２、及び９−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、或いはＰＤＧＦｂｂは検出されなかった。
【０２４３】
【表１９】

【０２４４】
【表２０】

【０２４５】
要約：臍帯由来細胞は、多数の栄養性因子を分泌した。これらの栄養因子の一部、例えばＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１、及びＩＬ−８などは、血管新生に重要な役割を果たしている。ＢＤＮＦおよびＩＬ−６などの他の栄養因子は、神経の再生或いは保護に重要な役割を果たしている。
【実施例１０】
【０２４６】
ＩｎＶｉｔｒｏ免疫学
これらの細胞をｉｎｖｉｖｏ移植で誘発する前記免疫反応を予測するため、分娩後細胞株は、その免疫学的特徴をｉｎｖｉｔｒｏで評価した。分娩後細胞株は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の発現について、フローサイトメトリーによりアッセイした。これらのタンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により発現され、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞の直接刺激が必要とされる（Ａｂｂａｓ & Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈＥｄ．（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１）。前記細胞株も、ＨＬＡ−Ｇ（Ａｂｂａｓ & Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈＥｄ．（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１）、ＣＤ１７８（Ｃｏｕｍａｎｓ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９９）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ２２４，１８５〜１９６）、およびＰＤ−Ｌ２（Ａｂｂａｓ & Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈＥｄ．（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ．ａｌ．（２００３）ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１７０，１２５７〜１２６６）の発現でフローサイトメトリーにより分析された。胎盤組織に存在する細胞によるこれらのタンパク質の発現は、子宮内の胎盤組織の免疫に特別の状態を媒介すると考えられる。分娩後臍帯由来細胞株がｉｎｖｉｖｏで免疫反応を誘発する程度を予測するため、前記細胞株は一方向性の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で検査した。
【０２４７】
材料と方法
細胞培養：細胞は、２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ−州）でコーティングしたＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ニューヨーク州）において成長培地中で、コンフルエンスまで培養した。
【０２４８】
抗体染色：細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カールズバッド、カリフォルニア州）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡで乖離させた（Ｇｉｂｃｏ、カールズバッド、カリフォルニア州）。細胞は、回収し、遠心分離し、１×１０^７個／ミリリットルの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで再懸濁した。製造業者の仕様書により抗体（表１０−１）は、１００マイクロリットルの細胞懸濁液に添加し、４℃で３０分間、暗所でインキュベートした。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄し、非結合性抗体を除去するために遠心分離した。細胞は、５００マイクロリットルのＰＢＳで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用い、フローサイトメトリーにより分析した。
【０２４９】
【表２１】

【０２５０】
混合リンパ球反応：細胞株"Ａ"と標識された継代１０の臍帯由来ＰＰＤＣｓの凍結保存したバイアルは、ＣＴＢＲ（Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ、ケベック）にドライアイスに載せて送付し、ＣＴＢＲＳＯＰｎｏ．ＣＡＣ−０３１を用いた混合リンパ球反応を実施した。末梢血単球細胞（ＰＢＭＣｓ）を、複数の男性と女性ボランティアドナーから回収した。６種類のヒトボランティア血液ドナーをスクリーニングし、他の５種類の血液ドナーを用いた混合リンパ球反応において、強固な増殖反応を示す単一の同種ドナーを同定した。このドナーは、前記同種ポジティブ対照ドナーとして選択された。前記残りの５種類の血液ドナーは、レシピエントとして選択された。刺激物（ドナー）の同種ＰＢＭＣ、自家ＰＢＭＣ、及び分娩後由来細胞株は、マイトマイシンＣで処理した。自家およびマイトマイシンＣ処理刺激細胞は、応答者（レシピエント）ＰＢＭＣｓに添加し、４日間培養した。インキュベーション後、［^３Ｈ］チミジンを各サンプルに添加し、１８時間培養した。前記細胞の採取後、放射標識したＤＮＡを抽出し、［^３Ｈ］−チミジンの取り込みをシンチレーションカウンターで測定した。１プレート当たり３種類のレシーバーを用いた２種類の細胞培養プレートを用い、反応は３回行った。
【０２５１】
前記レシーバーの増殖の平均とマイトマイシンＣ処理同種ドナーを足し、前記レシーバーのベースラインでの増殖で割って、同種ドナーの刺激指数（ＳＩＡＤ）を計算した。前記レシーバーの増殖の平均とマイトマイシンＣ処理分娩後細胞を足し、前記レシーバーのベースラインでの増殖で割って、分娩後細胞の刺激指数を計算した。
【０２５２】
結果
混合リンパ球反応−臍帯由来細胞：結果は、下の表１０−２及び１０−３に示した。前記平均刺激指数は６．５（プレート１）から９（プレート２）の範囲で、前記同種ドナーのポジティブコントロールは４２．７５（プレート１）から７０（プレート１）の範囲であった（表１０−３）。
【０２５３】
【表２２−１】

【０２５４】
【表２２−２】

【０２５５】
【表２３】

【０２５６】
臍帯由来細胞によって産生された抗原提示細胞マーカー：フローサイトメトリーで分析されたヒストグラムより、臍帯細胞は、前記ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値に認められるとおり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の産生が陰性（ネガティブ）であったことが示された。これは、臍帯細胞株は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を直接刺激するために必要な前記細胞表面分子が欠如していることを示している。
【０２５７】
臍帯由来細胞の免疫調節マーカー：フローサイトメトリーにより分析された臍帯細胞株は、前記ＩｇＧコントロールに対する蛍光値の上昇に認められるとおり、ＰＤ−Ｌ２の発現が陽性であった。前記細胞は、前記ＩｇＧコントロールと一致した蛍光値で認められるとおり、ＣＤ１７８とＨＬＡ−Ｇの発現が陰性であった。
【０２５８】
要約：臍帯細胞株を用いて実施した前記混合リンパ球反応では、前記平均刺激指数が６．５〜９の範囲であり、前記同種間ポジティブコントロールの指数は４２．７５〜７０の範囲であった。フローサイトメトリーによって測定されたように、臍帯細胞株は、検出可能な量の刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ２は発現されなかった。臍帯細胞株は、免疫調節性タンパク質ＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８は発現しなかったが、ＰＤ−Ｌ２の発現はフローサイトメトリーによって検出された。同種間ドナーＰＢＭＣｓは、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＲ、ＤＱ、ＣＤ８、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２を発現した抗原提示細胞を含み、それによって同種間リンパ球の刺激を可能とした。未処理ＣＤ４^＋Ｔ細胞の直接的な刺激、さらには免疫調節性タンパク質であるＰＤ−Ｌ２の存在に必要な、抗原提示細胞表面分子が臍帯由来細胞上にないことによって、同種間コントロールと比べて、ＭＬＲのこれらの細胞による刺激指数が低くなる原因となっている可能性がある。
【実施例１１】
【０２５９】
血漿凝固アッセイ
細胞が前記作用部位を標的とすることができる特定の応用について、細胞療法に有用な細胞は、全身に注入されてもよい。注入された細胞が、致死的と考えられる血栓症を引き起こさないことが重要である。組織因子、つまり膜結合凝血促進性糖タンパク質は、外因性凝固カスケードのイニシエーターであり、これはｉｎｖｉｖｏで主な凝固経路である。組織因子も、例えば、原始的血管壁の形成において、胚血管形成に重要な役割を果たす（Ｂｒｏｄｓｋｙｅｔａｌ．（２００２）Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０：２９９−３０６）。凝固を開始するＰＰＤＣの能力を決定するため、臍帯由来ＰＰＤＣｓを、組織因子の発現と、血漿凝固を開始するその能力を評価した。
【０２６０】
方法と物質
ヒト組織因子：ヒト組織因子（ＳＩＭＰＬＡＳＴＩＮ、ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋａｉｌｃａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ダラム、ノースカロライナ州）を、２０ミリリットルの蒸留水でもどした。前記原液は、８本の管に連続的に蒸留した（１：２）。正常なヒト血漿（ＧｅｏｒｇｅＫｉｎｇＢｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ、オーバーランドパーク、カンザス州）は、水浴中３７℃で解凍し、使用前に氷中で保存した。１００マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１０マイクロリットルの希釈ＳＩＭＰＬＡＳＴＩＮ、３０マイクロリットルの０．１モル塩化カルシウム、及び１００マイクロリットルの正常ヒト血漿を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ネガティブ対照ウェルは、ＳＩＭＰＬＡＳＴＩＮを添加しなかった。前記プレートは、直ちに温度制御マイクロプレートリーダーに設置し、４０５ナノメーター、４０秒間隔で、３０分吸光度測定を行なった。
【０２６１】
Ｊ−８２および臍帯由来細胞：Ｊ−８２細胞（ＡＴＣＣ、メリーランド州）は、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）、１マイクロモルのピルビン酸ナトリウム（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ、セントルイス、ミズーリ州）、２ミリモルのＬ−グルタミン（ＭｅｄｉａｔｅｃｈＨｅｒｎｄｏｎ、バージニア州）、１×非必須アミノ酸（ＭｅｄｉａｔｅｃｈＨｅｒｎｄｏｎ、バージニア州）を含有するイスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ、カールズバッド、カリフォルニア州）で増殖させた。７０％コフルエントで、細胞を１００，０００、５０，０００、及び２５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートのウェルに移した。臍帯由来細胞は、ゼラチンコーティングＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州）における成長培地中に培養した。継代１８での臍帯由来細胞は、５０，０００細胞／ウェルの密度でウェルに移した。１５０ｘｇで５分間遠心分離後、培地は各ウェルから除去した。細胞は、カルシウムとマグネシウムを含有しないＰＢＳに懸濁した。抗組織因子抗体細胞を用いてインキュベートされた細胞は、３０分間、２０マイクログラム／ミリリットルのＣＮＴＯ８５９（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、マルヴァーン、ペンシルバニア州）でインキュベートした。塩化カルシウム（３０マイクロリットル）を各ウェルに添加した。前記プレートは、直ちに温度制御マイクロプレートリーダーに設置し、４０５ナノメーター、４０秒間隔で、３０分吸光度を測定した。
【０２６２】
抗体染色：細胞は、ＰＢＳ中で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いてフラスコから乖離させた。細胞は、回収し、遠心分離し、１×１０^７個／ミリリットルの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで再懸濁した。前記製造業者の仕様書に沿って、抗体を１００マイクロリットルの細胞懸濁液に添加した。細胞は、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄、１５０×ｇで５分間遠心分離し、結合していない抗体を除去した。細胞は１００マイクロリットルの３％ＦＢＳに再懸濁し、前記製造業者の使用説明書の通り二次抗体を添加した。細胞は、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、結合していない二次抗体を除去するため、細胞はＰＢＳで洗浄し、遠心分離した。洗浄された細胞は、５００マイクロリットルのＰＢＳ中で再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。
【０２６３】
フローサイトメトリー分析：フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）で実施された。
【０２６４】
結果
フローサイトメトリー分析によって、ヒト臍帯由来分娩後細胞は、Ｊ８２細胞と比べて、血漿凝固を促進する活性が少ないことが示された。血漿凝固アッセイによって、臍帯由来細胞に存在する組織因子が活性であったことを示されたが、最大吸光度の半分（Ｔ^１／２ｔｏｍａｘ（Ｔ^１／２〜最大値）；表１１−１）まで長い時間がかかることによって証明されるように、凝固にはＪ−８２細胞よりも時間がかかる。前記Ｔ^１／２ｔｏｍａｘは、Ｊ−８２細胞数と反比例している。臍帯細胞は、Ｔ^１／２ｔｏｍａｘによって示されたように、凝固率が減少していた。凝固は、初期（Ｐ５）及び後期（Ｐ１８）継代細胞の両者で観察された。組織因子に対する抗体であるＣＮＴＯ８５９を用いた臍帯細胞のプレインキュベーションは、凝固反応を抑制し、それによって組織因子が前記凝固の原因となっていることを示した。
【０２６５】
【表２４】

【０２６６】
要約：臍帯由来ＰＰＤＣｓは、いくつかの組織因子を産生するが、組織因子に対する抗体を添加することによって、前記組織因子の凝固活性を阻害することができる。組織因子は通常、不活性な高次構造で細胞に認められるが、機械的または化学的（例えばＬＰＳ）ストレスにより活性化される（Ｓａｋａｒｉａｓｓｅｎｅｔａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１０４：１４９〜７４；Ｅｎｇｓｔａｄｅｔａｌ．（２００２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２：１５８５〜９７）。従って、ＰＰＤＣの調整プロセス中におけるストレスの最小化は、組織因子の活性化を防止することができる。血栓形成活性に加え、組織因子は血管新生活性と関連していた。従って、組織因子の活性は、臍帯由来ＰＰＤＣｓが組織に移植される場合に有益と考えられるが、ＰＰＤＣｓが静脈内に注入される場合に抑制される必要がある。
【実施例１２】
【０２６７】
臍帯由来細胞の移植
前記分娩後臍帯から由来した細胞は、再生治療に有用である。臍帯由来細胞を有する或いは有さない生体分解性物質を移植した後の、ＳＣＩＤマウスによって産生された組織を評価した。評価された物質は、ＶＩＣＲＹＬ不織足場、３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体、及び自己集合性ペプチドヒドロゲルであった。
【０２６８】
方法と物質
細胞培養：臍帯由来細胞は、ゼラチンコーティングフラスコにおいて成長培地中で増殖させた。
【０２６９】
マトリックスの調整：下記に説明された、従来の針穿刺法により不織足場を調整した。商品名ＶＩＣＲＹＬで販売されている、グリコール酸と乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマーから成る繊維は、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（サマービル、ニュージャージー州）から入手した。前記繊維は、直径約２０ミクロンのフィラメントであった。前記繊維を切断され、実質的に均一な２インチの長さに圧着し、２インチの短繊維を形成した。前記ＶＩＣＲＹＬ短繊維を用い、乾燥した状態の針穿刺不織基質を調整した。前記短繊維を開口し、標準的な不織機械にかけた。前記で得られたマットは、クモの巣状の短繊維の形であった。前記クモの巣状の短繊維に針穿刺し、乾燥した状態の針穿刺不織足場を作製した。前記不織足場を水ですすぎ、次にエタノール中、別のインキュベーションを行い、前記製造工程中、残留化学物質または処理した酸を除去した。
【０２７０】
３５／６５ポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから成る発泡体は、米国特許番号第６，３５５，６９９号で説明されているとおり、凍結乾燥処理により形成した。
【０２７１】
自己集合性ペプチドヒドロゲル（ＲＡＤ１６自己集合性ペプチド（３次元マトリックス，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，マサチューセッツ州））は、水中で無菌１％（ｗ／ｖ）溶液として入手した。
【０２７２】
サンプル調整：１、０００，０００個の生存可能な細胞は、１５マイクロリットルの成長培地中で、５ミリメーター、２．２４ミリメーター厚のＶＩＣＲＹＬ不織足場（６４．３３ミリグラム／ｃｃ）へ；或いは直径５ミリメーターの３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体ディスクへ播種した。前記足場をカバーするために、さらに成長培地を添加する前に、２時間細胞を接着させた。細胞は、一晩足場上で増殖させた。細胞のない対照足場も培地中でインキュベートさせた。
【０２７３】
前記自己集合性ペプチド溶液は、使用直前に、１０％（ｗ／ｖ）スクロース（Ｓｉｇｍａ，ＳｔＬｏｕｉｓ、ミズーリー州）１０ミリモルのＨＥＰＥＳ（ｐＨは約７）を含むダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）中の１ｘ１０^６細胞と１：１で混合した。自己集合性ヒドロゲルにおける細胞の最終濃度は、１×１０^６細胞／１００マイクロリットルであった。
【０２７４】
試験物質（Ｎ＝４／条件）
１．ＶＩＣＲＹＬ不織＋１ｘ１０^６臍帯由来細胞
２．３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体＋１×１０^６臍帯由来細胞
３．自己集合性ペプチド＋１ｘ１０^６臍帯由来細胞
４．３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体
５．ＶＩＣＲＹＬ不織
【０２７５】
動物調整：本研究で利用される動物は、動物保護法の現在の要件に従って取扱い、維持した。前記動物保護規定（９Ｃ．Ｆ．Ｒ）に順守し、実験動物の治療および使用に関するガイド第７版（ＧｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ，７ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ）で公表されている前記現行の基準に従うことで、前記一般法を用いたコンプライアンスが達成された。
【０２７６】
動物：雄マウス（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）（フォックスチェイスＳＣＩＤ、ＨａｒｌａｎＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．、インディアナポリス、インディアナ州）は、５週齢で使用した。前記ＳＣＩＤマウスのすべての取扱いは、フード下で行った。前記マウスは、個別に体重を量り、６０ミリグラム／キログラムのＫＥＴＡＳＥＴ（ｋｅｔａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡｖｅｃｏＣｏ．，Ｉｎｃ．、フォートドッジ、アイオア州）、１０ミリグラム／キログラムのＲＯＭＰＵＮ（ｘｙｌａｚｉｎｅ）（ＭｏｂａｙＣｏｒｐ．、シャウニー、カンザス州）および生理食塩水の混合物の腹腔内注射で麻酔させた。麻酔誘導後、背側頚部から背側腰仙部への前記動物の背部において、動物用電気大ばさみで体毛を刈り込んだ。前記部位は次に二酢酸クロルヘキシジンで洗浄し、アルコールで洗い流し、乾燥させ、１％の利用可能なヨウ素溶液のヨードフォア溶液を塗布した。眼に眼軟膏を適用し、麻酔期間中の組織の乾燥を予防した。
【０２７７】
皮下移植法：前記マウスの背側に、４箇所の皮膚切開をそれぞれ約１ｃｍ長で作成した。脊柱左右に各１つの２箇所の頭側移植部位は、尾側から検診された肩甲骨の下縁に向かって約５ミリメータ、皮膚側面胸部領域の横方向に位置した。２箇所の付加的なインプラントは、触診された腸骨稜に向かって約５ミリメーターのところで、正中線の各側に１つずつ、尾側仙腰レベルで殿筋部にかけて横に位置させた。インプラントは、これらの部位でランダムに位置させた。前記皮膚は、下層の結合組織から分離させ、小さなポケットを作り、前記切開部に向かって約１ｃｍのところに前記インプラントを配置した（または自己集合性ペプチドの場合は注入した）。前記適切な試験物質を前記皮下腔に埋め込んだ。前記皮膚切開を金属クリップで閉じた。
【０２７８】
動物の飼育：動物は、個別に温度範囲６４°Ｆ〜７９°Ｆ、相対湿度３０％〜７０％で研究経過中、マイクロアイソレーターケージで飼育し、約１２時間（明）／１２時間（暗）の明暗サイクルで管理した。食事は、ＩｒｒａｄｉａｔｅｄＰｉｃｏＭｏｕｓｅＣｈｏｗ５０５８（ＰｕｒｉｎａＣｏ．）から成り、水は自由に摂取させた。
【０２７９】
マウスは、二酸化炭素を吸入させることで、指定された間隔で安楽死させた。覆っている皮膚を用いた皮下インプラントは、組織像を取るために切除し、凍結させた。
【０２８０】
組織像：インプラントと共に切除された皮膚は、１０％中性緩衝化ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−ＡｌｌａｎＫａｌａｍａｚｏｏ、ミシガン州）で固定した。覆っていて隣接している組織を用いたサンプルは、ルーティンな方法により中心で二等分し、パラフィン処理し、切除した表面を包埋させた。マイクロトームにより包埋させた組織の切片を作製し、ルーティンな方法によりヘマトキシリンとエオシン（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＢａｙＳｈｏｒｅ、ニューヨーク州）で染色した。
【０２８１】
結果
３０日後、ＳＣＩＤマウスに皮下移植された臍帯由来細胞ないのコントロール発泡体への組織の最小限内殖が見られた。対照的に、臍帯由来細胞とともに移植された発泡体へ満たされた組織の伸長が見られた。
【０２８２】
ＶＩＣＲＹＬ不織足場で一部の組織の内植が見られた。臍帯由来細胞を播種した不織足場は、基質沈着と成熟した血管が増加していることが示された。
【０２８３】
要約：ヒト臍帯由来細胞は、生体分解性足場において優れた質の組織形成を劇的に増加することを示した。合成吸収性不織足場／発泡体ディスク（直径５．０ミリメーターｘ厚さ１．０ミリメーター）、または自己集合性ペプチドヒドロゲルに、ヒト臍帯由来細胞を播種し、ＳＣＩＤマウスの背側脊柱領域の両側に皮下移植した。臍帯由来細胞は、免疫欠損マウスにおいて、臍帯由来細胞と共に播種されていない足場上のそれらと比較して、組織内植及び足場上での血管形成を増強した。
【実施例１３】
【０２８４】
腎臓被膜下への臍帯由来細胞の移植
腎臓被膜への膵島の移植は、糖尿病の治療に対する移植方法論を評価するために日常的に実行した（Ｒｅｆａｉｅｅｔａｌ．，１９９８）。膵島に加えて、他の細胞は、血液グルコース恒常性を保つことができるインスリン分泌細胞へと分化させた。この目的に対する臍帯由来細胞の適合性を評価した。
【０２８５】
方法と物質
細胞培地：臍帯由来細胞（単離１、Ｐ１０）は、液体窒素から除去し、成長培地におい、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）コーティングＴ２５５（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州）フラスコ上でコンフルエンスまで増殖させた。
【０２８６】
臍帯由来細胞への培養液は、１０ミリモルのニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ）、２５ミリモルのグルコース（Ｓｉｇｍａ）、１０ナノグラム／ミリリットルのＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ、ニュージャージー州）、２０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、及び１５ミリモルのＧＬＰ−１（Ｓいｇま）を含有するＨａｍ’ｓＦ１２培養液（Ｇｉｂｃｏ）に交換し、細胞はさらに２週間培養させた。
【０２８７】
２つのフラスコからの細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、単一の細胞懸濁液を、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて得た。凍結保存されたＧＭ−ＣＳＦ動員性ＣＤ３４^＋細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）（ロット１Ｆ０１７４ドナー７９５６）から購入した。ＣＤ３４^＋細胞を解凍し、ＤＭＥＭ培養液で洗浄した。
【０２８８】
前記細胞懸濁液は、ＤＭＥＭで２回洗浄した。細胞数及び生存率は、トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）染色後、血球計数器を用いて推定した。〜３００，０００生存細胞を含有する一定量の前記細胞懸濁液を、１５０ｘｇで遠心分離し、前記細胞を約６マイクロリットルのＤＭＥＭに再懸濁し、１ミリリットルシリンジをつけた２０マイクロリットルピペットチップで吸い込んだ。前記細胞を含むピペットチップは、ｓｍａｌｌＬｉｇａｃｌｉｐ(ＥｔｈｉｃｏｎＥｎｄｏｓｕｒｇｅｒｙ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、オハイオ州)を用いて挟んだ（クランプ）。
【０２８９】
動物調整：マウス（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）／フォックスチェイスＳＣＩＤ／雄（ＨａｒｌａｎＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．、インディアナポリス、インディアナ州）は８週齢のものであった。前記ＳＣＩＤマウスのすべての取扱いは、フード下で行った。前記マウスは個別に体重を量り、６０ミリグラム／キログラムのＫＥＴＡＳＥＴ（ｋｅｔａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＡｖｅｃｏＣｏ．，Ｉｎｃ．、アイオア州フォートドッジ）、１０ミリグラム／キログラムＲＯＭＰＵＮ（ｘｙｌａｚｉｎｅ，ＭｏｂａｙＣｏｒｐ．、カンザス州シャウニー）および生理食塩水の混合物の腹腔内注射で麻酔させた。麻酔誘導後、前記背側頚部から前記背側腰仙部への前記動物の背部全体において、電気大ばさみで体毛が刈り込まれた。前記部位は、二酢酸クロルヘキシジンで洗浄し、アルコールで洗い流し、乾燥させ、１％の利用可能なヨウ素溶液のヨードフォア溶液を塗布した。眼に眼軟膏を適用し、麻酔期間中の組織の乾燥を予防した。麻酔され外科的に調整された動物は、好ましい横臥ポジションに置いた。左腹腔上に尾側から胸郭にかけて約２センチメートル横行切開を作った。腎臓をさらし、２６−ゲージ針で被膜に穴を開けた。被膜ランス（改変ガラスピペットチップ）を用いて、腎臓被膜の真下に、細胞を導入するようにスペースを作った。前記細胞を、取り付けられたマイクロピペットチップを用いてシリンジから注入した。ポケットは、開口部上を眼科焼灼ペン(ＡａｒｏｎＭｅｄｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，フロリダ)を通過させることによって閉じた（腎臓には触れない）。腎臓を正確な解剖学的位置に戻し、筋肉層を縫合して閉じた。前記皮膚を創傷クリップで閉じた。
【０２９０】
実験設計としては、各マウスにおいて１つの細胞を移植し、ｎ値を４（１処理当たり）で４つの処理を行い、３点（１、１４及び３０日）で実験した。
【０２９１】
マウスは、二酸化炭素を吸入させることで、指定された間隔で安楽死させた。腎臓移植部位を切除し、組織像を作成するために冷凍した。
【０２９２】
免疫組織化学：凍結された腎臓移植部位は、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（ＳａｋｕｒａＩｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ、カリフォルニア州）における縁部上に包埋した。腎臓組織は、凍結切片処理によって切り取り、移植部位で組織に隣接した５ミクロン切片を得た。得られた切片は、リン酸緩衝食塩水（Ｇｉｂｃｏ）中で新鮮に調整された４％パラホルムアルデヒド(ＥＭＳｃｉｅｎｃｅｓＧｉｂｂｓｔｏｗｎ、ニュージャージー州)で、１５分間固定した。切片は、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳブロッキング溶液中の３％ヤギ血清において、１時間インキュベートした。ブロッキング溶液は穏やかな吸引によって除去した。切片は、ブロッキング溶液中で１：１００で希釈された抗ヒト核抗体（ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）に、１時間インキュベートした。切片はＰＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液中で１：２００で希釈された蛍光標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＥｕｇｅｎｅ、オレゴン州)において、暗室で３０分間インキュベートした。切片は、ＰＢＳで洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）において５分間インキュベートした。切片はＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡観察によって評価した。
【０２９３】
トリ−クロム染色：凍結された腎臓移植部位は、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（ＳａｋｕｒａＩｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ、カリフォルニア州）における縁部上に包埋した。腎臓組織は、凍結切片処理によって切り取り、移植部位で組織に隣接した５ミクロン切片を得た。得られた切片は、１０％中性緩衝ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−ＡｌｌｅｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において１５分固定した。製造者の方法を用いて、切片をトリ−クロム（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）染色した。
【０２９４】
処理：
１．臍帯からの３ｘ１０^３細胞
２．臍帯からの３ｘ１０^３細胞＋３ｘ１０^３ＣＤ３４^＋細胞
対照として３個体動物を加えた（細胞なし）。
【０２９５】
結果
臍帯由来細胞の生存率は、〜７５％であり、ＣＤ３４^＋細胞の生存率は、９５％であった。１ｘ１０６生存細胞を移植する初期試験は、腎臓被膜が前記細胞を収納するのに十分なほど大きくなかったため、不成功であった。細胞は、トリプシン処理の３時間以内に移植した。腎臓被膜下の分娩後細胞の局在は、顕微鏡観察で確認した。ＣＤ３４^＋を有する臍帯由来細胞と有さない臍帯由来細胞の数と分布には有意な違いは見られなかった。長期間では細胞数が著しく減少した。
【０２９６】
腎臓被膜の下の細胞の染色は、移植された細胞の保持を示していた。ヒト細胞は、ヒト核抗原を用いて検出した。全ての細胞（ヒト及びマウス）は、ＤＡＰＩを用いて検出した。
【０２９７】
臍帯由来細胞は、移植後１４及び３０日で顕微鏡的に観察された。ヒト細胞は、ヒト核抗原に対して染色した。トリクロム染色は、コラーゲンの存在を検出するために使用した。
【０２９８】
要約：腎臓被膜への細胞の移植は成功であった。長期間の実験において観察された細胞数の減少は、移植時の細胞の生存率、自然免疫、及び血管新生組織である故の不十分な栄養分利用能などの多数の因子に起因する可能性がある。iｎｖｉｖｏでの細胞の長期間生存或いは増殖は、特定の目的には有用であるが、多くの適用に使用される細胞としては必要とされず、これらの結果は長期間を超えて生存し増殖する細胞の能力を反映するものではない。
【０２９９】
参考文献
ＲｅｆａｉｅＡ．，ＧａｂｒＭ．ｅｔａｌ．，（１９９８）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓｌｅｔｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎｒａｔｓ：Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｓｉｔｅ．Ｔｒａｎｓ．Ｐｒｏｃ．３０：４００〜４０３
【実施例１４】
【０３００】
臍帯由来細胞の短期間神経分化
臍帯由来分娩後細胞（ＰＰＤＣｓ）の神経系へ分化する能力を検討した。
【０３０１】
方法と物質
細胞の単離と培養：実施例１及び２に記載されたように、臍帯由来ＰＰＤＣｓを単離し、増殖させた。
【０３０２】
変法Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコール
（Ａ）このアッセイは、骨髄間質細胞の神経系誘導能力を検査するために本来行われたアッセイ（１）を適応した。臍帯ＰＰＤＣｓ（Ｐ４）を解凍し、５，０００細胞／ｃｍ^２で成長培地において、サブコンフルエント（７５％）に達するまで増殖させた。細胞は、次にトリプシン処理し、ＴｉｔｒｅｔｅｋＩＩスライドグラス（ＶＷＲインターナショナル、ブリストル、コネチカット州）の各ウェルごとに６，０００細胞で播種した。コントロールとして、間葉系幹細胞（Ｐ３、１Ｆ２１５５、Ｃａｍｂｒｅｘ、ウオーカーズビル、メリーランド州）、骨芽細胞（Ｐ５、ＣＣ２５３８、Ｃａｍｂｒｅｘ）、大網細胞（Ｐ６）、脂肪由来細胞（ＵＳ６５５５３７４Ｂ１）（Ｐ６）、およびヒト新生児皮膚線維芽細胞（Ｐ６、ＣＣ２５０９、Ｃａｍｂｒｅｘ）もまた、同一の条件下で播種された。
【０３０３】
すべての細胞はまず、１５％（ｖ／ｖ）の胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロックヒル、ニュージャージー州）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ペニシリン（５０ユニット・ミリリットル）、及びストレプトマイシン（５０マイクログラム／ミリリットル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）において４日間増殖させた。４日後、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、次にＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液＋２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ＋ペニシリン（５０マイクログラム／ミリリットル）＋ストレプトマイシン（５０マイクログラム／ミリリットル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で２４時間培養させた。２４時間後、細胞は、ＰＢＳで洗浄した。その後、細胞は、２００ミリモルのブチル化ヒドロキシアニソール、１０マイクロモルの塩化カリウム、５ミリグラム／ミリリットルのインスリン、１０マイクロモルのホルスコリン、４マイクロモルのバルプロ酸、および２マイクロモルのヒドロコルチゾン（全ての化学薬品は、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州から購入）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（無血清）から成る、誘導培養液中で１〜６時間培養させた。その後、細胞は、氷冷した（−２０℃）１００％メタノールで固定し、ヒトネスチンタンパク質の発現を測定するために、免疫細胞化学（方法は以下を参照のこと）を実行した。
【０３０４】
（Ｂ）ＰＰＤＣｓ（臍帯、Ｐ１１）およびヒト成人皮膚線維芽細胞（１Ｆ１８５３、Ｐ１１）を解凍し、５，０００細胞／ｃｍ^２で成長培地において、サブコンフルエント（７５％）に達するまで増殖させた。細胞はその後、トリプシン処理し、（Ａ）と同様の密度で播種したが、これらは、（１）２４ウェル組織培養用処理プレート（ＴＣＰ、Ｆａｌｃｏｎｂｒａｎｄ、ＶＷＲインターナショナル）、（２）ＴＣＰウェル＋２％（ｗ／ｖ）ゼラチンで、室温で１時間吸着処理した、または（３）ＴＣＰウェル＋２０マイクログラム／ミリリットルのマウスラミニンで吸着処理した（３７℃で最低２時間吸着、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ播種した。
【０３０５】
（Ａ）の場合と同様に、細胞はまず、前述のタイムフレームで増殖させ、培養液を交換した。１組目の培養を、５日目に固定し、また６時間で、氷冷した（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で、室温で１０分間固定した。２組目の培養は、培養液を除去し、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン（４ミリモル）、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）、及びストレプトマイシン（５０ミリグラム／ミリリットル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から成る神経前駆細胞増殖培養液（ＮＰＥ）に切り替えた。ＮＰＥ培養液にはさらに、レチノイン酸（ＲＡ、１マイクロモル、Ｓｉｇｍａ）を添加した。この培養液は、４日後に除去し、培養は、氷冷した（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で１０分間固定し、ネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪ１タンパク質発現に関して染色した（表１４−１を参照）。
【０３０６】
【表２５】

【０３０７】
二段階分化プロトコール：臍帯由来ＰＰＤＣｓ（Ｐ１１）、ヒト成人皮膚線維芽細胞（Ｐ１１、１Ｆ１８５３、Ｃａｍｂｒｅｘ）を解凍し、５，０００細胞／ｃｍ^２で成長培地において、サブコンフルエント（７５％）に達するまで増殖させた。その後、細胞をトリプシン処理し、２，０００細胞群／ｃｍ^２で播種したが、ｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロックヒル、ニュージャージー州）およびＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＮＰＥ培養液（この全培養液組成は、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅと言及する）の存在下で、ラミニン（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ、フランクリンレーク、ニュージャージー州）でコーティングされた２４ウェルプレートに播種した。同時に、海馬から単離されたラット成体神経前駆細胞（Ｐ４、（０６２６０３））もまた、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ培養液内で、ラミニンコーティングされた２４ウェルプレート上にプレーティングした。すべての培養群は、６日間、そのような条件下で維持し（細胞は、その期間中１回栄養補給した。）、その時点で、培地を表１４−２に挙げた分化条件下に切り替え、さらに７日間維持した。培養は、氷冷した（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で１０分間固定し、ヒトまたはラットのネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪ１タンパク質発現に対して染色した。
【０３０８】
【表２６】

【０３０９】
複数増殖因子誘導プロトコール：臍帯由来ＰＰＤＣｓ（Ｐ１１）を解凍し、５，０００細胞／ｃｍ^２で成長培地において、サブコンフルエント（７５％）まで増殖させた。その後、細胞はトリプシン処理し、２，０００細胞群／ｃｍ^２で、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）の存在下で、ラミニンコーティング２４ウェルプレート（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播種した。さらに、いくつかのウェルは、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ＋２％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳを含有させた。４日間の「分化前」条件の後、全ての培養液を除去し、サンプルは、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ、２００ナノグラム／ミリリットル、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、ＦＧＦ８（１００ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＢＤＮＦ（４０ナノグラム／ミリリットル、Ｓｉｇｍａ）、ＧＤＮＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｓｉｇｍａ）、およびレチノイン酸（１マイクロモル、Ｓｉｇｍａ）を添加したＮＰＥ培養液に切り替えた。培養液の交換後７日で、培養は、氷冷した（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で１０分間固定し、ヒトのネスチン、ＧＦＡＰ、ＴｕＪ１、デスミン、およびアルファ−平滑筋アクチン発現に対して染色した。
【０３１０】
神経前駆体同時培養プロトコール：成体ラット海馬前駆細胞群（０６２６０３）は、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）において、ラミニンコーティングされた２４ウェルディッシュ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に、ニューロスフェアとして、または単一の細胞として（１０，０００細胞／ウェル）プレーティングした。
【０３１１】
臍帯由来ＰＰＤＣｓ（Ｐ１１）を解凍し、５，０００細胞／ｃｍ^２で、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）に、４８時間の期間で増殖させた。その後、細胞はトリプシン処理し、神経前駆細胞の存在する培養の上に、２，５００細胞／ウェルで播種した。その培養液は、新鮮な培養液に交換した。４日後に、培養は、氷冷した（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で１０分間固定し、ヒト核タンパク（ｈＮｕｃ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（上記の表１４−１に対して染色し、ＰＰＤＣｓを同定した。
【０３１２】
免疫細胞化学：免疫細胞化学を、表１４−１に記載した抗体を用いて実行した。培養は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、カリフォルニア州）、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に３０分間曝露させ、細胞内抗原にアクセスした。ブロッキング溶液に希釈した一次抗体は、次に室温で１時間前記培地に適用させた。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＴｅｘａｓＲｅｄ（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）とともにブロック溶液を含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、一次抗体溶液を除去し、培養をＰＢＳで洗浄した。次に培養を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０３１３】
免疫染色後、逆落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、メルビル、ニューヨーク州）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化させた。対照染色の上に陽性染色が蛍光シグナルを示し、上記に概要を示した方法全体がフォローされたが、一次抗体溶液の適用は例外であった。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、代表的な画像を捕らえた。３つ組で染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像を回収した。次に、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて層状のモンタージュを用意した。
【０３１４】
結果
変法Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコール
（Ａ）この神経誘導性組成内でインキュベートすると、全ての細胞タイプは、双極性の形態及び伸長した突起を有する細胞に形質転換した。他の大きな非双極性の形態も観察された。さらに、誘導された細胞集団は、多分化能神経幹細胞および前駆細胞のマーカーであるネスチンに対して陽性に染色された。
【０３１５】
（Ｂ）組織培養用プラスチック（ＴＣＰ）ディシュ上で繰返し行われた時、ラミニンが培養表面に前もって吸着されていない場合は、ネスチン発現は観察されなかった。さらに、ネスチンを発現する細胞群が、成熟したニューロンを発生させ得るかどうかを評価するために、ＰＰＤＣｓおよび線維芽細胞を、ＮＰＥ＋ＲＡ（１マイクロモル）（神経幹細胞及び前駆細胞のそのような細胞への分化を誘導すると知られている培養液組成（２、３、４））にさらした。細胞は、未成熟ニューロンおよび成熟ニューロンのマーカーであるＴｕＪ１、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ、および神経前駆体を示すマーカーであるネスチンに対して染色した。いかなるテスト条件下でも、ＴｕＪ１発現は検出されず、神経性の形態を有する細胞も観察されず、これはニューロンが前記短期間では発生されなかったことを示唆するものである。さらに、ネスチンおよびＧＦＡＰ発現は、ラミニンコーティングされた基質上のＰＰＤＣｓ及び線維芽細胞では見られたが、これらの条件下では産生されていなかった。
【０３１６】
二段階分化結果：臍帯由来細胞単離、さらにヒト線維芽細胞群及びげっ歯類神経前駆細胞（それぞれネガティブおよびポジティブコントロール細胞タイプとして）を、ラミニン（神経促進）コーティングされたディシュにプレーティングし、神経前駆細胞をニューロンおよびアストロサイトに分化するように促進すると知られている１３の異なる成長条件（および２つのコントロール条件）にさらした。さらに、ＰＰＤＣｓの分化に対するＧＤＦ５およびＢＭＰ７の影響を検証するために、２つの条件を加えた。一般的に、２段階分化アプローチを実行し、細胞はまず６日間、神経前駆細胞増殖条件に置き、その後７日間、完全な分化条件に置いた。形態的には、臍帯細胞は、この手順の期間を通じて、細胞形態で根本的な変化を示した。しかしながら、神経細胞またはアストロサイト形の細胞は、神経前駆細胞をプレーティングした条件であるコントロールを除いては観察されなかった。ヒトのネスチン、ＴｕＪ１、およびＧＦＡＰに対して陰性であった免疫細胞化学では、これら形態学的観察が確認された。結果は、以下の表１４−３に要約した。
【０３１７】
【表２７】

【０３１８】
複数増殖因子誘導結果：様々な神経分化薬剤に１週間さらした後、細胞は、神経前駆細胞（ヒトネスチン）、ニューロン（ＴｕＪ１）、およびアストロサイト（ＧＦＡＰ）を示すマーカーで染色した。最初の段階で無血清含有培養液で増殖させた細胞は、血清含有（２％または１０％）培養液の細胞と比べて、異なる形態を有しており、これは潜在的な神経分化を示すものである。特に、臍帯ＰＰＤＣｓをＥＧＦおよびｂＦＧＦにさらし、その後、ＳＨＨ、ＦＧＦ８、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびレチノイン酸にさらす２段階手順の後に、細胞は、培養アストロサイトの形態に類似した長く伸長した突起を示した。２％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳが分化の第１段階に含まれた場合には、細胞数が増加し、細胞形態は、高密度のコントロール培養と変わらなかった。潜在的な神経分化は、ヒトのネスチン、ＴｕＪ１、またはＧＦＡＰに対する免疫細胞化学分析によって明らかにはならなかった。
【０３１９】
神経前駆体及びＰＰＤＣ同時培養手順：臍帯由来細胞は、神経増殖条件（ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ）に２日前に播種されたラット神経前駆細胞の培養の上にプレーティングした。プレーティングされた臍帯の肉眼での確認によって、これらの細胞が単一の細胞としてプレーティングされたことが確かめられたが、プレーティング後４日目（実験の合計では６日目）に行ったヒト特異的な核染色（ｈＮｕｃ）によって、それらが丸くなりがちで、神経前駆細胞との接触を避ける傾向があると示された。さらに、臍帯細胞が接着している場合は、これらの細胞は、伸展し、ラット由来である分化したニューロンによって神経支配されているようであり、これは、臍帯細胞が筋細胞に分化した可能性があることを示唆するものである。この観察は、位相差顕微鏡下の形態に基づいている。別の観察では、大きな細胞体（神経前駆細胞より大きい）は通常、神経前駆細胞に似た形態を有しており、複数の方向に細い突起が出ていた。ＨＮｕｃ染色（前記細胞の核の半分に見られた）によって、いくつかの場合には、これらのヒト細胞は、ラット前駆細胞群と融合し、その表現型を示していた可能性があったことが示唆された。神経前駆細胞のみを含むコントロールウェルでは、臍帯を含む共培養のウェルに比べて、前駆細胞および明らかに分化した細胞の合計が少なく、これはさらに、臍帯由来細胞が、ケモカインおよびサイトカインの放出によって、または接触仲介性効果によって、神経前駆細胞の分化及び挙動に影響を与えたことを示している。
【０３２０】
要約：臍帯由来ＰＰＤＣｓの神経系統細胞に分化するための短期間の能力を決定するために、複数のプロトコールを実行した。これらには、多分化能神経幹細胞及び前駆細胞、未成熟ニューロン及び成熟ニューロン、およびアストロサイトのそれぞれに関連するタンパク質である、ネスチン、ＴｕＪ１、およびＧＦＡＰに対する免疫細胞化学と組み合わせた、形態の位相差画像法が含まれた。これらの短期間プロトコールの特定の場合に、神経分化が起こったことを示唆する証拠が観察された。
【０３２１】
神経前駆細胞とのＰＰＤＣｓの共培養で、いくつかの顕著な観察結果が得られた。ヒトＰＰＤＣｓを異種細胞タイプと共に使用するこのアプローチは、これらの培養において各細胞の由来の絶対的な決定を可能にした。まず、いくつかの細胞がこれらの培養で観察され、その細胞質は増大し、神経突起様突起が前記細胞体から伸展し、しかし前記細胞体の半分のみがｈＮｕｃタンパク質で標識されていた。前記細胞は、神経系統細胞に分化したヒトＰＰＤＣｓである可能性があり、またラット由来の神経前駆細胞と融合したＰＰＤＣｓである可能性もある。第２に、神経前記細胞は、ある程度ＰＰＤＣｓへ突起を伸長したように見られ、これは前記前駆細胞がニューロンに分化し、前記ＰＰＤＣｓを神経支配したことを示す。第３に、神経前駆細胞およびＰＰＤＣｓの培養は、ラット由来の細胞がより多くあり、神経前駆細胞のみのコントロール培養より分化の量が大きかった。これは、プレーティングされたＰＰＤＣｓが、可溶性因子、若しくは接触依存性メカニズムを提供し、これらが神経前駆細胞の生存、増殖、及び／若しくは分化を刺激したことをさらに示した。
【０３２２】
参考文献
（１）Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．ｅｔａｌ．（２０００）．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６１（４）：３６４〜７０．
（２）Ｊａｎｇ，Ｙ．Ｋ．ｅｔａｌ．（２００４）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７５（４）：５７３〜８４．
（３）Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ，Ｅ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９８３）．ＭｏｌＣｅｌＢｉｏｌ．３（１２）：２２７１〜９．
（４）Ｍａｙｅｒ−Ｐｒｏｓｃｈｅｌ，Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９７）．Ｎｅｕｒｏｎ．１９（４）：７７３〜８５．
【実施例１５】
【０３２３】
臍帯由来細胞の長期間神経分化
臍帯由来細胞の神経系への長期間分化を経るための能力を検討した。
【０３２４】
方法と物質
分娩後細胞（ＰＰＤＣｓ）の単離と増殖：実施例１及び２に記載されたように、臍帯由来ＰＰＤＣｓを単離し、増殖させた。
【０３２５】
臍帯由来細胞の解凍とプレーティング：以前に成長培地で増殖させた一定量の冷凍臍帯由来細胞（Ｐ１１及びＰ１２）を解凍し、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン（４ミリモル）、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）及びストレプトマイシン（５０マイクログラム／ミリリットル）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）（この組み合わせは、本明細書で、神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培養液と呼ぶ）中で、ラミニン（ＢＤ、フランクリンレーク、ニュージャージー州）でコーティングされたＴ７５フラスコにおいて、５，０００細胞／ｃｍ^２でプレーティングした。ＮＰＥ培養液にはさらに、ｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）およびＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）を添加した（本明細書では、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦと呼ばれる）。
【０３２６】
コントロール細胞プレーティング：さらに、成人ヒト皮膚線維芽細胞（Ｐ１１、Ｃａｍｂｒｅｘ、ウオーカーズビル、メリーランド州）および間葉系幹細胞（Ｐ５、Ｃａｍｐｒｅｘ）を解凍し、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ中で、ラミニンコーティングされたＴ７５フラスコに同一の細胞播種密度でプレーティングした。更なるコントロールとして、線維芽細胞、及び臍帯細胞を、成長培地においてすべての培養に対して指定された期間で増殖させた。
【０３２７】
細胞増殖：全ての培養からの培養液は、１週間で１回新鮮な培養液と取り替え、細胞の増殖を観察した。一般的には、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ内での増殖が限られているため、各培養は１ヶ月の期間で１回、継代した。
【０３２８】
免疫細胞化学：１ヶ月の期間後、全てのフラスコは、冷却（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で１０分間固定した。免疫細胞化学は、ＴｕＪ１（ＢＩＩＩチューブリン、１：５００、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）およびＧＦＡＰ（グリア細胞線維性酸性タンパク、１：２０００、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カーピンテリア、カリフォルニア州）に対する抗体を用いて実施した。簡潔には、培養は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、カリフォルニア州）、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に３０分間曝露させ、細胞内抗原にアクセスした。ブロッキング溶液に希釈した一次抗体は、次に室温で１時間前記培地に適用させた。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＴｅｘａｓＲｅｄ（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）とともにブロック溶液を含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、一次抗体溶液を除去し、培養をＰＢＳで洗浄した。次に培養を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０３２９】
免疫染色後、逆落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、メルビル、ニューヨーク州）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化させた。全ての場合において、対照染色の上に陽性染色が蛍光シグナルを示し、上記に概要を示した方法全体がフォローされたが、一次抗体溶液の適用は例外であった。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、代表的な画像を捕らえた。３つ組で染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像を回収した。次に、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて層状のモンタージュを用意した。
【０３３０】
結果
ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地は、ＰＰＤＣｓの増殖を示し、それらの形態を変化させる：プレーティング後すぐに、臍帯細胞のサブセットを、ラミニンでコーティングした培養フラスコに接着させた。これは、冷凍／解凍の過程の機能としての、または新しい増殖条件のための、細胞死によるものであった。接着した細胞は、成長培地で観察された形態とは異なる形態を取っていた。
【０３３１】
コンフルエント時に、培養を継代し、増殖を観察した。継代で生存したこれらの細胞で、増殖はほとんど起こらなかった。この時点では、伸展した形態をもたず、位相差で明るい特徴を有する非常に少数の細胞が、臍帯細胞の培養で現れ始めた。前記フラスコのこの範囲は、長期にわたって観察された。これらの少数の細胞から、その長軸に沿って軸索瘤群を伴う分岐過程が始まり、この特徴は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋神経前駆細胞、およびＴｕＪ１＋未成熟なニューロン（脳および脊髄から由来する）に非常に類似している（１、２）。時間と共に、これらの細胞はより多数になるが、クローンにのみ見つけられた。
【０３３２】
神経性タンパク質を発現するが、グリア性タンパク質は産生しない臍帯細胞のクローン：培養は、解凍／プレーティングの後、１ヶ月で固定し、前記神経タンパク質であるＴｕＪ１およびＧＦＡＰ（アストロサイトに見られる中間径フィラメント）に対して染色した。成長培地で増殖させた全てのコントロール培養、及びＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦで増殖させたヒト線維芽細胞およびＭＳＣｓは、ＴｕＪ１−／ＧＦＡＰ−であることが見出され、臍帯細胞はＴｕＪ１を発現した。発現は、神経細胞様形態を有する、及び有さない細胞で観察された。ＧＦＡＰの発現は、どちらの培養でも観察されなかった。ＴｕＪ１を発現し、神経細胞様形態を有する細胞の割合は、全集団の１％以下であった（ｎ＝３で臍帯単離を試験した）。
【０３３３】
要約：臍帯細胞から分化ニューロン（ＴｕＪ１発現およびニューロン形態に基づく）を発生する方法を開発した。１ヶ月以前では、ｉｎｖｉｔｒｏでのＴｕＪ１の発現は、観察されなかったが、少なくとも少数の集団の臍帯由来細胞が、初期設定分化を通じて、或いはＬ−グルタミン、塩基性ＦＧＦ、及びＥＧＦを添加した最小培地に１ヶ月さらした後の長期間誘導を通じて、ニューロンを生じ得ることは明らかである。
【０３３４】
実施例１５の参考文献
（１）Ｍａｙｅｒ−Ｐｒｏｓｃｈｅｌ，Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９７）．Ｎｅｕｒｏｎ．１９（４）：７７３〜８５．
（２）Ｙａｎｇ，Ｈ．ｅｔａｌ．（２０００）．ＰＮＡＳ．９７（２４）：１３３６６〜７１．
【実施例１６】
【０３３５】
神経前駆体分化に対する臍帯由来細胞栄養性因子
非接触依存性（栄養性）メカニズムを通じた、成体神経幹細胞及び前駆細胞の生存、及び分化に対する臍帯由来分娩後細胞（ＰＰＤＣｓ）の影響を検討した。
【０３３６】
方法と物質
成体神経幹細胞及び前駆体細胞単離：Ｆｉｓｈｅｒ３４４成体ラットは、ＣＯ_２で窒息させて、その後、頚椎脱臼させて殺戮した。骨鉗子を用いて脳全体を無傷で除去し、海馬組織を、脳の運動野及び体性感覚野の後方での冠状切開に基づいて解離させた（１）。組織は、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）、Ｌ−グルタミン（４ミリモル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）、及びストレプトマイシン（５０マイクログラム／ミリリットル）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（この組み合わせは、本明細書で、神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培養液と呼ばれる）で洗浄した。ＮＰＥ培養液にはさらに、ｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）及びＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）を添加した（本明細書では、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦと呼ばれる）。
【０３３７】
洗浄後、覆っている髄膜を除去し、前記組織を外科用メスで刻んだ。刻まれた組織を回収し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を全容量の７５％添加した。ＤＮＡｓｅ（１００マイクロリットル／８ミリリットルの全容量、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）も添加した。次に、前記組織／培養液を、順に１８ゲージ注射針、２０ゲージ注射針、最後に２５ゲージ注射針にそれぞれ一回づつ通した（全ての注射針は、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、フランクリンレークス、ニュージャージー州から購入した）。前記混合液は、２５０ｘｇで３分間遠心分離した。上清を除去し、新鮮なＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦを添加し、ペレットを再懸濁した。その結果得られる細胞懸濁液は、４０マイクロンのセルストレーナー（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）に通され、ラミニンコーティングされたＴ７５フラスコ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）、或いは低クラスター２４ウェルプレート（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）にプレーティングし、概要された研究のために十分な細胞数が得られるまで、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培養液において増殖させた。
【０３３８】
ＰＰＤＣ細胞プレーティング：成長培地で以前に増殖させた分娩後由来細胞（Ｐ１２）は、５，０００細胞／トランスウェル（２４ウェルプレート用の大きさ）でプレーティングし、インサート内で、成長培地において一週間の期間増殖させ、コンフルエントを達成した。
【０３３９】
成体神経前駆体プレーティング：ニューロスフェアとして、或いは単一の細胞として増殖させた神経前駆細胞は、約２，０００細胞／ウェルの密度で、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦにおいて、ラミニンコーティングされた２４ウェルプレート上に、１日播種し、細胞接着を促進させた。１日後、分娩後細胞を含むトランスウェルインサートは、以下のスキームに従って添加した。
【０３４０】
（１）トランスウェル（成長培地における臍帯、２００マイクロリットル）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（２）トランスウェル（成長培地における成人ヒト皮膚線維芽細胞[１Ｆ１８５３；Ｃａｍｂｒｅｘ、ウォーカーズビル、メリーランド州]Ｐ１２、２００マイクロリットル）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（３）コントロール：神経前駆細胞のみ（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（４）コントロール：神経前駆細胞のみ（ＮＰＥのみ、１ミリリットル）
【０３４１】
免疫細胞化学：同時培養の７日後、全ての条件は、冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で、１０分間、室温で固定した。免疫細胞化学を、表１６−１に記載したエピトープ見対する抗体を用いて実行した。簡潔には、培養は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、カリフォルニア州）、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に３０分間曝露させ、細胞内抗原にアクセスした。ブロッキング溶液に希釈した一次抗体は、次に室温で１時間前記培地に適用させた。次に、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＴｅｘａｓＲｅｄ（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）とともにブロック溶液を含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、一次抗体溶液を除去し、培養をＰＢＳで洗浄した。次に培養を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０３４２】
免疫染色後、逆落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、メルビル、ニューヨーク州）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化させた。全ての場合において、対照染色の上に陽性染色が蛍光シグナルを示し、上記に概要を示した方法全体がフォローされたが、一次抗体溶液の適用は例外であった。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、代表的な画像を捕らえた。３つ組で染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像を回収した。次に、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて層状のモンタージュを用意した。
【０３４３】
【表２８】

【０３４４】
神経前駆体分化の定量的分析：海馬の神経前駆細胞の分化を検討し定量化した。各条件につき、最小１０００の細胞を計数し、それより少ない場合は、その条件で観察された全細胞数を計数した。所定の染色に対し陽性である細胞の割合は、陽性の細胞数を、ＤＡＰＩ（核）染色によって決定された全細胞数で割って評価した。
【０３４５】
質量分析法及び２Ｄゲル電気泳動：共培養の結果としてのユニークな分泌因子を同定するために、培養固定の前に取られた条件培養液サンプルを−８０℃で一晩冷凍した。その後、サンプルは、限外濾過回転装置（名目上の分子量カットオフ：３０ｋＤ）に供した。保持液を、免疫親和性クロマトグラフィー（抗ヒトアルブミン、ＩｇＹ）に供した（免疫親和性は、前記サンプルからアルブミンを除去しなかった）。濾液は、ＭＡＬＤＬ−ＴＯＦＦによって解析した。溶出液は、シバクロンブルー（ＣｉｂａｃｈｒｏｎＢｌｕｅ）親和性クロマトグラフィーに共した。サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２次元（２Ｄ）ゲル電気泳動によって解析した。
【０３４６】
結果
臍帯同時培養は、成体神経前駆体分化を刺激する：臍帯由来分娩後細胞との培養後、成体ラット海馬から由来した共培養神経前駆細胞は、中枢神経系の３種類の全ての主要系統に沿った有意な分化を示した。この効果は、共培養の５日後にはっきりと観察され、多くの細胞は複雑な突起を伸ばし、分裂する前駆細胞の特徴である位相差で明るい特徴を失っていた。逆に、ｂＦＧＦ及びＥＧＦの非存在下で単独に増殖させた神経前駆細胞は、健康的でないように見え、生存率も限定されていた。
【０３４７】
前記手順の終了後に、培養は、未分化幹細胞及び前駆細胞を示すマーカー（ネスチン）、未成熟ニューロン及び成熟ニューロンを示すマーカー（ＴｕＪ１）、アストロサイトを示すマーカー（ＧＦＡＰ）、及び成熟オリゴデンドロサイトを示すマーカー（ＭＢＰ）に対して染色した。３種類の全ての系統に沿った分化が確認されたが、コントロール条件では、大多数の細胞でのネスチン陽性染色の保持によって明らかなように、有意な分化を示さなかった。
【０３４８】
臍帯由来ＰＰＤＣｓとの共培養後の分化した神経前駆細胞の割合を定量化した（表１６−２）。臍帯由来細胞は、成熟オリゴデンドロサイト（ＭＢＰ）の数を有意に増加した（２４％ｖｓ（対）０％（両方のコントロール条件において））。さらに、共培養は、培養において、ＧＦＡＰ＋アストロサイト、及びＴｕＪ１＋ニューロンの数を増加させた（それぞれ、４７．２％および８．７％）。これらの結果は、ネスチン染色によって確認され、前駆細胞の状態が共培養後に失われたことを示唆した（１３．４％ｖｓ（対）７１．４％（コントロール条件３））。
【０３４９】
さらに分化は、成人ヒト線維芽細胞によって影響を受けるように見えたが、そのような細胞は、成熟オリゴデンドロサイトの分化を促進することはできず、またかなりの量のニューロンを発生することもできなかった。しかしながら、定量化されなかったが、線維芽細胞は神経前駆細胞の生存率を増強するようであり、それらの子孫は、臍帯由来分娩後細胞での所見と類似していた。
【０３５０】
【表２９】

【０３５１】
ユニークな化合物の同定：臍帯テスト条件からの条件培養液は、適切なコントロールと（ＮＰＥ培養液±１．７％血清、線維芽細胞との共培養からの培養液）と共に、それらの差異について検討した。潜在的にユニークな化合物が同定され、それら個々の２Ｄゲルから切り取られた。
【０３５２】
要約：この実施例で示された結果より、臍帯由来分娩後細胞との共培養後の成人神経前駆細胞の分化は、特に顕著であったことが示された。特に、有意な割合の成熟オリゴデンドロサイトが、臍帯細胞との共培養内で発生した。前記臍帯細胞及び前記神経前駆細胞の間で接触がなかったことから考えると、この結果は、前記臍帯細胞から放出された可溶性因子の機能であると考えられる（栄養作用）。
【０３５３】
いくつかの他の観察結果が見られた。第１に、ＥＧＦ及びｂＦＧＦを除去した場合のコントロールでは非常に少数の細胞しか見られなかった。ほとんどの細胞が死亡し、平均で各ウェルに約１００或いはそれ以下の細胞が見られた。第２に、ＥＧＦ及びｂＦＧＦが培養の間ずっと培養液に保持されたコントロール条件では、通常の増殖培養液であるため、分化がほとんどないと予想されている。約７０％の細胞がその前駆細胞の状態（ネスチン＋）を保持していることが観察されたが、約３０％はＧＦＡＰ＋（アストロサイトの徴候）であった。これは、そのような著しい増殖が一連のこの手順の間を通じて起こったため、前駆細胞の間での接触がこの分化を誘導した可能性がある。同様な発見は、参考文献（２）に報告されていた。
【０３５４】
実施例１６の参考文献
（１）Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．&Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．（１９９７）．ＴｈｅＲａｔＢｒａｉｎｉｎＳｔｅｒｅｏｔａｘｉｃＣｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ．
（２）Ｓｏｎｇ，Ｈ．ｅｔａｌ．（２００２）．Ｎａｔｕｒｅ．４１７（６８８４）：３９〜４４．
【実施例１７】
【０３５５】
血管新生に対する栄養性因子の影響
血管新生、または新しい脈管構造の形成は、新しい組織の増殖に必要である。血管新生の誘導は、多くの病的状態において重要な治療ゴールである。ｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおける臍帯由来細胞の血管新生活性を検討した。血管新生活性を評価するよく確立された方法は、内皮細胞を基底膜抽出物でコーティングされた培養プレートへ播種する工程を含み（ＮｉｃｏｓｉａａｎｄＯｔｔｉｎｅｔｔｉ（１９９０）ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．２６（２）：１１９〜２８）、この方法を使用した。そのような基底膜、或いは細胞外マトリックス材料上で内皮細胞に血管形成因子を処理すると、前記細胞を刺激し、毛細管現象と同様のネットワークを形成する。これらのタイプのアッセイは、血管形成の刺激因子及び阻害因子をテストするための共通ｉｎｖｉｔｒｏアッセイである（Ｉｔｏｅｔａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６７（１）：１４８〜５２）．本研究では使用されたプロトコールでは、培養ウェルインサートに播種された臍帯由来細胞との共培養システムを利用した。これらの透過性インサートでは、内皮細胞および臍帯由来細胞の培地間の培地成分を受動的に交換することが可能である。
【０３５６】
物質と方法
細胞培地
臍帯由来細胞：ヒト臍帯を受取り、細胞はこれまでの説明どおり単離した（実施例１）。細胞は、ゼラチンコーティング培養プラスチックフラスコ上で成長培地において培養した。前記培養は、３７℃で５％ＣＯ_２によりインキュベートした。実験に使用された細胞は、継代４〜１２であった。
【０３５７】
積極的に増殖するＵＤＣｓは、トリプシン処理し、計数し、１インサート当たり１５，０００細胞で直径６．５ミリメーターの組織培養インサート（ＣＯＳＴＡＲＴＲＡＮＳＷＥＬＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、コーニング、ニューヨーク州）に播種した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２で、成長培地中、４８〜７２時間、前記インサート上で培養した。
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）：ｈＭＤＣｓは、Ｃａｍｂｒｅｘ（ウォーカーズビル、メリーランド州）から購入し、ＭＳＣＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ）に培養した。前記培養は、３７℃で５％ＣＯ_２によりインキュベートした。
【０３５８】
積極的に増殖するＭＳＣｓは、トリプシン処理し、計数し、１インサート当たり１５，０００細胞で直径６．５ミリメーターの組織培養インサート（ＣＯＳＴＡＲＴＲＡＮＳＷＥＬＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、コーニング、ニューヨーク州）に播種した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２で、成長培地中、４８〜７２時間、前記インサート上で培養した。
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）：ＨＵＶＥＣはＣａｍｂｒｅｘ（ウォーカーズビル、メリーランド州）から入手した。細胞は、ＥＢＭまたはＥＧＭ内皮細胞培地のいずれか（Ｃａｍｂｒｅｘ）において、別の培養で増殖させた。前記細胞は、５％ＣＯ_２、３７℃で標準的な組織培養プラスチックに増殖させた。前記アッセイに使用された細胞は、継代４〜１０の範囲であった。
【０３５９】
ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）：ＨＣＡＥＣはＣａｍｂｒｅｘＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ウォーカーズビル、メリーランド州）から入手した。これらの細胞も、ＥＢＭまたはＥＧＭ培地処方において、別の培地で管理された。前記細胞は、５％ＣＯ_２、３７℃で標準的な組織培養プラスチックに増殖させた。実験に用いられた細胞は、継代４〜８までの範囲である。
【０３６０】
細胞外マトリックスにおける血管新生アッセイ：培養プレートは、製造業者の仕様書に従って、細胞外マトリックス材料でコーティングした。簡潔には、細胞外マトリックス材料（ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ＢＤＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬａｂｗａｒｅ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を４℃で解凍し、約２５０マイクロリットルを冷却された２４ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに均等に分配した。前記プレートは３７℃で３０分間インキュベートし、前記材料を凝固させた。積極的に増殖した内皮細胞培養は、トリプシン処理し、計数した。細胞は、遠心分離し、懸濁して、その上清を吸引することによって、２％ＦＢＳのみが添加された成長培地で２回洗浄２回洗浄された。２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳのみが添加された約０．５ミリリットルの成長培地中で、２０，０００細胞／ウェルをコーティングしたウェルに細胞を播種した。次に、細胞を定着させるため、細胞は約３０分間インキュベートした。
【０３６１】
次に、内皮細胞反応のポジティブコントロールとするため、内皮細胞培養は、１０ナノモルのヒトｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）、または１０ナノモルのヒトＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）で処理した。分娩後由来細胞が播種されたトランスウェルインサートは、前記インサートチャンバーに２％ＦＢＳを有する成長培地で適切なウェルに添加された。培養は、５％ＣＯ２、３７℃で約２４時間インキュベートした。前記ウェルプレートは前記インキュベーターから除去し、前記内皮細胞培地の画像はＯｌｙｍｐｕｓ倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、メルビル、ニューヨーク州）を用いて回収した。
【０３６２】
結果
臍帯由来細胞との同時培養システムにおいて、ＨＵＶＥＣは構造細胞ネットワークを形成した。ＨＵＶＥＣ細胞は、ｈＭＳＣおよび１０ナノモルのｂＦＧＦを有する同時培養実験において限定された細胞ネットワークを形成する。処理を行わないＨＵＶＥＣ細胞で示されたネットワークの形成は、非常に少ないか、全くなかった。これらの結果は、前記臍帯由来細胞が前記ＨＵＶＥＣを刺激する血管新生因子を放出していることを示唆している。同様に、ＨＣＡＥＣｓは、臍帯由来細胞との同時培養の場合のみ細胞ネットワークを形成した。
【０３６３】
表１７−１は、大気酸素条件での、成長培地中のＵＤＣｓによって放出された既知血管新生因子の量を示している。ＵＤＣｓは、上述したように、インサートに播種した。前記細胞は、前記インサートに４８時間、大気中の酸素下、３７℃で培養し、次に２％ＦＢＳ培地に切り替え、３７℃で２４時間戻した。培地を除去し、直ちに凍結し、−８０℃で保存し、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔｍｕｌｔｉｐｌｅｘＥＬＩＳＡアッセイ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、イリノイ州）で分析した。示された結果は二つ組測定の平均である。結果より、ＵＤＣｓは検出可能なレベルの血小板由来成長因子−ｂｂ（ＰＤＧＦｂｂ）、ヘパリン結合上皮細胞成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、或いは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を放出しないことが示された。検出されたアンジオポエチン２（ＡＮＧ２）の量は、細胞を有さない培養液コントロールのレベルより低かった。臍帯由来細胞は、測定可能な量の組織メタロプロテアーゼ阻害物質１（ＴＩＭＰ−１）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を放出した。ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の量は、非常に低く、コントロール培養液に対してわずかに多いものであった。
【０３６４】
【表３０】

【０３６５】
表１７−２は、５％Ｏ_２での既知血管新生因子のレベルを示したものである。ＵＤＣｓは、上述したように、インサートに播種した。前記細胞は、前記インサートに、４８時間、５％酸素で、成長培地において培養し、次に２％ＦＢＳ培地に切り替え、５％Ｏ_２インキュベーションに２４時間戻した。培地を除去し、直ちに凍結し、−８０℃で保存し、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔｍｕｌｔｉｐｌｅｘＥＬＩＳＡアッセイ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、イリノイ州）で分析した。示された結果は二つ組測定の平均である。結果により、ＵＤＣｓは大気酸素条件下での細胞と同程度であることが示された。ＵＤＣｓによるＡＮＧ２、ＰＤＧＦＢＢ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＨＢ−ＥＧＦの産生では実質的な変化はないが、ＴＩＭＰ１、ＫＧＦ、及びＨＧＦの産生においてわずかな上昇が見られ、ＴＰＯの産生ではわずかな減少が見られた。これらの加工していないデータにおける明らかな違いは、統計学的な有意差はテストしなかった。
【０３６６】
【表３１】

【０３６７】
要約：本研究の結果によって、臍帯由来細胞は、ヒト静脈及び冠動脈内皮細胞の両方を刺激し、血管新生のｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおいてネットワークを形成することが示された。この効果は、このアッセイシステムで既知の血管由来因子で認められたものと同様である。これらの結果は、ＵＤＣｓがｉｎｖｉｖｏで血管新生を刺激するのに有用であることを示唆している。
【実施例１８】
【０３６８】
臍帯由来細胞の肝細胞への分化
臍帯由来細胞の肝細胞への分化に対する基礎培養液および成長因子の適切な組み合わせを決定するために、様々な条件を検討した。ＨＮＦ−１アルファ、肝細胞特異的転写因子、ケラチン１９（Ｋ１９）、ケラチン８（Ｋ８）、及びサイトケラチン１８（ＣＫ１８）（これらは上皮細胞のマーカーである）などの細胞質中間体フィラメントタンパク質、及び２つの肝臓特異的分泌タンパク質であるアルブミン、シトクロムｐ４５０２Ｂ６は、肝細胞分化に対するマーカーとして選択した（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｔａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１０）：１２９１〜１３０２；Ｏｋｕｍｏｔｏｅｔａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０４（４）：６９１〜６９５；Ｃｈａｇｒａｏｕｉｅｔａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ１０１（８）：２９７３〜２９８２）。
【０３６９】
方法と物質
実施例１の方法に従って得られた臍帯由来細胞、さらに新生児或いは成人正常ヒト上皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ中、成長培地において増殖させた。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、オンコスタチンＭ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＩｎｃ．（ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ、ニュージャージー州）から購入した。血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦｂｂ）は、Ｒ&ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）から購入した。
【０３７０】
以下の条件をテストした。
【０３７１】
方法１
臍帯由来細胞（Ｐ５）、新生児及び成人正常ヒト上皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）：細胞は、無血清培地（１ｘインスリン／トランスフェリン／セレニウム、４．７マイクログラム／ミリリットルのリノール酸、１ミリグラム／ミリリットルのウシ血清アルブミン、１０ナノモルのデキサメタゾン、１００マイクロモルのリン酸アスコルビン酸（全てＳｉｇｍａより）、５０ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ＨｙｃｌｏｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、及び１０ナノグラム／ミリリットルのＥＧＦ及びＰＤＧＦｂｂを添加した、６０％（ｖ／ｖ）低グルコースＤＭＥＭ）（ＤＭＥＭ−ＬＧ；Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、４０％（ｖ／ｖ）ＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州））中で、１％マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏ．，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ニュージャージー州）上に、２２．５ｘ１０^３細胞／ｃｍ^２でプレーティングした。８〜１２時間後、培養液を除去し、細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、上述した培養液でＥＧＦ及びＰＤＧＦｂｂを含有しないが、２０ナノグラム／ミリリットルのＨＧＦ及び／若しくは１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ−４（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｔａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１０）：１２９１〜１３０２）を添加した培養液で培養した。
【０３７２】
方法２
臍帯由来細胞（Ｐ５）、新生児及び成人ＮＨＤＦ：細胞は低密度（２２，５００細胞／ｃｍ^２）で、ゼラチンでコーティングした２４ウェルプレートに播種し、上述したように増殖させた。
【０３７３】
方法３
臍帯由来細胞（Ｐ１７）、臍帯由来細胞（Ｐ１５）、臍帯由来細胞（Ｐ１０）、成人ＮＨＤＦ：細胞は、高密度（５０，０００細胞／ｃｍ^２）で、２４ウェルＴＣＰプレートに播種し、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｂ２７添加物（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）、ストレプトマイシン（５０マイクログラム／ミリリットル）、２０ナノグラム／ミリリットルのＨＧＦ及び／若しくは１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ−４において増殖させた。細胞は、これらの条件で４週間増殖させた。
【０３７４】
方法４
臍帯由来細胞（Ｐ４）、臍帯由来細胞（Ｐ９）、新生児及び成人ＮＨＤＦ：細胞は５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で、ＣｈａｎｇＣ培養液（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＳａｎｔａＡｎａ、カリフォルニア州）中、Ｔ２５フラスコにおいて、フィブロネクチン（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ、ニュージャージー州）上、或いはゼラチン（Ｓｉｇｍａ）上に播種し、コンフルエンスまで２継代増殖させた。細胞は次に、１，０００細胞／ｃｍ^２で、２４ウェルＴＣＰプレートに播種し、それらが約４０〜６０％コンフルエンスに到達するまで上述したように増殖させた。
【０３７５】
方法５
臍帯由来細胞（Ｐ５）及び成人ＮＨＤＦ：細胞は、２４ウェルプレートのゼラチン上に、１ナノグラム／ミリリットル或いは１０ナノグラム／ミリリットルのオンコスタチンＭ（Ｃｈａｒｇｒａｃｕｉ（２００３）Ｂｌｏｏｄ１０１（８）：２９７３〜２９８２）を添加した成長培地にプレーティングした。細胞は、これらの条件で４週間増殖させた。
【０３７６】
方法６
臍帯由来細胞（Ｐ５）及び成人ＮＨＤＦ：細胞は、２４ウェルプレートのゼラチン上に、１０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦ、１０ナノグラム／ミリリットルのＨＧＦ、１０ナノグラム／ミリリットルのＳＣＦを添加した成長培地にプレーティングした。細胞は、これらの条件で４週間増殖させた（Ｏｋｕｍｏｔｏｅｔａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０４（４）：６９１〜６９５）。
【０３７７】
総ＲＮＡ単離及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ：ＲＮＡは、各プロトコールにおいて記載されたように増殖させた臍帯由来細胞及び線維芽細胞から抽出した。細胞は、ベータメルカプトエタノール（ＳｉｇｍａＳｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を含有する３５０マイクロリットルの緩衝ＲＬＴで、取り扱い説明書（ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア州）に従って溶解し、ＲＮＡを、２．７ユニット／サンプルのＤＮａｓｅ処理（Ｓｉｇｍａ）で、取扱い説明書（ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア州）に従って抽出した。ＲＮＡは、５０マイクロリットルＤＥＰＣ−処理水で溶出し、−８０℃で保存した。ＲＮＡは、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）を含むランダム六量体を用い、逆転写した。サンプルは−２０℃で保存した。
【０３７８】
リアルタイムＰＣＲ：ＰＣＲは、アルブミン（Ｈｓ００６０９４１１）、シトクロムｐ４５０２Ｂ６（Ｈｓ００１６７９３７）、ＧＡＰＤＨ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、カリフォルニア州）に対するＡＳＳＡＹＳ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤ遺伝子発現産生物を用いて、及び、ＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘを取り扱い説明書（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、カリフォルニア州）に従って、ＡＢＩｐｒｉｓｍ７０００ＳＤＳソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、カリフォルニア州）で７０００配列検出システムを用いて、ｃＤＮＡサンプルに対して実行し実行した。熱サイクル条件は、最初５０℃で２分間、９５℃で１０分間とし、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル行なった。ＰＣＲデータは、製造業者の使用説明書（ＡＢＩプリズム７７００配列検出システムについて、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのユーザー掲示板＃２）に沿って分析した。
【０３７９】
免疫蛍光検査：細胞培養は、冷却（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで、室温、１０分間固定した。免疫細胞化学は、以下のエピトープに対して作られた抗体を用いて実行した：ケラチン９（Ｋ９；１：４００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，カリフォルニア州）、ケラチン１９（Ｋ１９；１：４００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、細胞質ケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、ビメンチン（１：５００；Ｓｉｇｍａ）、デスミン（１：１５０；Ｓｉｇｍａ）、アルブミン（１：２００；Ｓｉｇｍａ）、ｃ−ｍｅｔ（１：４００；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ、カリフォルニア州）、及びＨＮＦ−１アルファ（１：４００；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）。一般には、培養は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、カリフォルニア州）、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に３０分間曝露させ、細胞内抗原にアクセスした。対象エピトープが前記細胞表面に位置する場合（ｃ−ｍｅｔ）、エピトープの損失を予防するため、前記処置のすべての段階でＴｒｉｔｏｎを省略した。ブロッキング溶液に希釈した一次抗体は、次に室温で１時間前記培地に適用させた。次に、Ｋ８、Ｋ１９、ＣＫ１８、ビメンチン、及びアルブミンに対してはヤギ抗マウスＩｇＧ−ＴｅｘａｓＲｅｄ（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）、デスミン及びｃ−ｍｅｔに対してはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）、またはＨＮＦ−１アルファ染色に対してはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）とともにブロック溶液を含む二次抗体溶液（室温で１時間）を適用する前に、一次抗体溶液を除去し、培養をＰＢＳで洗浄した。培養を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０３８０】
免疫染色後、逆落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、メルビル、ニューヨーク州）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化させた。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、代表的な画像を捕らえた。３つ組で染色したサンプルでは、１回の放射フィルターのみを用い、各画像を回収した。次に、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて層状のモンタージュを用意した。
【０３８１】
結果
臍帯由来細胞が上皮細胞性マーカーを発現できるかどうかを検討するために、細胞は、ＣｈａｎｇＣ培養液において培養した。臍帯由来細胞（Ｐ２）は、ＣｈａｎｇＣ培養液で１１日間増殖させた。臍帯由来細胞は、免疫細胞化学分析によって、サイトケラチン１８及びケラチン８に対する染色は陰性であった。成長培地で増殖させたサンプルは、両方のマーカーに対して陰性であった。
【０３８２】
継代の影響、さらにゼラチン及びフィブロネクチン基質の影響を検討した。細胞は、ＣｈａｎｇＣ培養液において１１日間増殖させた。上皮細胞性／肝細胞特異的タンパク質のＲＮＡ及びタンパク質発現を分析した。サイトケラチン１８、ケラチン８、ケラチン１９、ｃ−ｍｅｔ、アルブミン、デスミン、及びＨＮＦ−１アルファに対する免疫細胞化学染色は、全ての条件において陰性であった。細胞は、ビメンチン染色に対して陽性であった。ＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤプライマーによる検出より、アルブミン及びシトクロムｐ４５０２Ｂ６両者の発現は、ヒトＨｅｐＧ２細胞の発現よりも低いレベルであった。アルブミン及びシトクロムｐ４５０２Ｂ６発現は、成長培地で増殖させた細胞においても検出された。
【０３８３】
臍帯由来細胞は、Ｓｃｈｗａｒｔｚら（（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１０）：１２９１〜１３０２．）によって開発されたプロトコールに従った方法１に記載されたように処理した。アルブミン及びシトクロムｐ４５０２Ｂ６の両者は、ＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤプライマーを用いて、ＨｅｐＧ２ポジティブコントロールよりも低いレベルで検出された。適用された条件と遺伝子発現レベルとの間に明らかなパターンは見られず、すなわち、アルブミン及びシトクロムｐ４５０２Ｂ６発現はそれぞれコントロールサンプルにおいても検出された。アルブミン及びシトクロムｐ４５０２Ｂ６の発現は、ＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤプライマーによっていくらか検出されたが、そのレベルはＨｅｐＧ２細胞において観察されたレベルより有意に低かった。
【０３８４】
１ナノグラム／ミリリットルの低濃度でのオンコスタチンＭは、ゼラチンコーティングしたフラスコ上で、成長培地において増殖させた臍帯由来細胞シトクロムｐ４５０２Ｂ６の発現レベルを増加させた（データは示さず）。ＦＧＦ−４及びＨＧＦ処理は、ほとんど影響せず、アルブミン及びシトクロムｐ４５２Ｂ６の発現を減少させた。
【０３８５】
要約：臍帯由来細胞の肝細胞表現型への分化を誘導する能力を、６つのプロトコールでテストした。肝細胞特異的マーカー、例えばアルブミンやシトクロムｐ４５０２Ｂ６の発現が検出され、それによって、前記細胞は肝細胞へのいくらかの分化を経ることが示された。
【実施例１９】
【０３８６】
臍帯由来細胞の脂肪生成分化
幹細胞の集団は、脂肪生成表現型へ分化することが示されていた（Ｊａｎｄｅｒｏｖａｅｔａｌ．（２００３）Ｏｂｅｓ．Ｒｅｓ．１１（１）：６５〜７４；Ｚａｎｇａｎｉｅｔａｌ．（１９９９）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ６４（２）：９１〜１０１；Ｌｉｕｅｔａｌ．．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３（４）：３２５〜４０）。脂肪生成表現型へ分化する臍帯由来細胞の能力を評価した。
【０３８７】
方法と物質
脂肪分化：臍帯由来細胞（Ｐ４）は、１ウェル当たり２００，０００細胞で、６ウェル培養処理プレート上に増殖培地において播種した。間葉系幹細胞（Ｐ３、ＩＦ２１５５）、骨芽細胞（Ｐ５、ＣＣ２５３８、Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、メリーランド州）、大網細胞（Ｐ６）（実施例１における分娩後由来細胞単離に使用したプロトコールに従って、ＮＤＲＩからの大網組織より単離された）、脂肪由来細胞（ＵＳ６５５５３７４Ｂ１）（Ｐ６）、及び線維芽細胞（Ｐ６、ＣＣ２５０９）（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、メリーランド州）も、同条件下で播種した。脂肪生成を開始する前に、間葉系幹細胞は間葉系幹細胞成長培地Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、メリーランド州）において増殖させた。２日後、浪費された培養液を吸引除去し、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次に培養液を、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、１ミリリットル当たり０．０２ミリグラムのインスリン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）、及び１ミリリットル当たり１００ユニットのペニシリン、１ミリリットル当たり１００ミリグラム
のストレプトマイシン、１ミリリットル当たり０．２５ミリグラムのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を含有するダルベッコ最小必須培養液−高グルコース（ＤＭＥＭ−Ｈｇ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）へ切り替えた。一度細胞をコンフルエンスまで到達させ、浪費した培養液を除去した。細胞は次に、１０％規定化胎児ウシ血清（（ｖ／ｖ）、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、０．０２ミリグラム／ミリリットルのインスリン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）、1ミリリットル当たり１００ユニットのペニシリン、1ミリリットル当たり１００マイクログラムのストレプトマイシン、1ミリリットル当たり０．２５マイクログラムのアンホテリシンＢ、５マイクロモルのイソブチルメチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）、１００マイクロモルのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）、及び２．５マイクロモルのインドメタシン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）を含有する脂肪分化培養液（ＤＭＥＭ−Ｈｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州））において、４週間まで培養した。細胞は、オイルレッドＯ（Ｏｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏ）で染色し、脂肪滴形成の存在を決定した。
【０３８８】
オイルレッドＯ染色：細胞は、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−ＡｌｌａｎＫａｌａｍａｚｏｏ、ミシガン州）で固定した。固定後、細胞は脱イオン化水で洗浄し、プロピレングリコール（無水；ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＢａｙＳｈｏｒｅ、ニューヨーク州）で２分間インキュベートした。プロピレングリコールを吸引によって除去し、サンプルはオイルレッドＯ（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１時間インキュベートした。染色溶液を吸引によって除去し、染色したサンプルは８５％（ｖ／ｖ）プロピレングルコール溶液（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１分間インキュベートした。染色したサンプルは、脱イオン化水で２回洗浄した。染色されたサンプルは、Ｍａｙｅｒ’ｓヘマトキシリン（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で逆染色（ｃｏｕｎｔｅｒ‐ｓｔａｉｎｅｄ）し、光学顕微鏡で検討した。画像は、２０ｘ拡大率で得た。
【０３８９】
レプチンアッセイ：脂肪由来細胞及び臍帯由来細胞は、２００，０００細胞／ウェルで、６ウェル組織培養処理プレートに播種した。細胞はまず成長培地において播種し、１マイクロモルのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）、０．２マイクロモルのインドメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、０．０１ミリグラム／マイクロリットルのインスリン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ミリモルのイソブチルメチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ）、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（カタログ＃ＳＨ３００７０．０３；Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、1ミリリットル当たり１００ユニットのペニシリン、及び１ミリリットル当たり１００マイクログラムのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有する脂肪生成分化培養液（ＤＭＥＭ−Ｈｇ培養液；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）へ切り替えた。アッセイの最後に、前記条件培地を回収し、レプチンレベルを、ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ，Ｒ&ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）を用いて測定した。
【０３９０】
結果
脂肪分化：形態学的に、このアッセイの５日目で、ＭＳＣｓ及び脂肪由来細胞において脂肪滴形成を観察した。大量の脂肪滴形成が、培養の１５日目でこれらの培養において観察された。骨芽細胞の培養でも、培養の１０日後にこれらの条件下で大量の脂肪滴の蓄積があり、１５日目では広範囲であった。脂肪滴形成は、培養の１５日後で臍帯由来細胞及び大網細胞培養において観察された。低レベルの脂肪滴形成は、脂肪生成誘導性条件における２０日後の線維芽細胞培養において観察された。
【０３９１】
レプチン：レプチンは、臍帯由来細胞条件培地におけるＥＬＩＳＡによっては検出されなかった。
【０３９２】
要約：レプチンは、使用された脂肪生成分化後のＥＬＩＳＡによって、臍帯由来細胞において検出されず、データより、間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、或いは骨芽細胞の培養と比較して、臍帯由来細胞は、脂肪細胞表現型への低レベルの分化を経ることが明らかに示された。
【実施例２０】
【０３９３】
ベータ細胞表現型への分化
膵臓は、ランゲルハンスの島を形成する内分泌細胞を含み、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド（ＰＰ）を産生する。臍帯由来細胞のインスリン産生表現型を有する細胞へ分化する能力を、８つの異なる誘導プロトコールでテストした。
【０３９４】
方法と物質
臍帯由来細胞（様々な単離体−以下を参照）、さらに新生児或いは成人正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコで、成長培地において増殖させ、さらに異なるベータ細胞促進性分化条件においても増殖させた。フラスコは、２％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）を用いて、室温で２０分間コーティングした。ゼラチン溶液は、吸引除去し、フラスコはＰＢＳで洗浄した。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦアルファ）、及び線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ−１０）は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＩｎｃ．（ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ，ニュージャージー州）から購入した。ＧＬＰ−１はＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリー州）から購入した。
【０３９５】
以下のプロトコールを実施した：
【０３９６】
プロトコール１：
細胞：脂肪誘導細胞（米国特許番号第ＵＳ６，５５５，３７４号）及び大網由来細胞、臍帯由来細胞（Ｐ１５）、（Ｐ１７）、（Ｐ３）、及び成人正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（Ｐ１０）を使用した。細胞は、正常或いは５％Ｏ_２条件下で維持した。細胞は、低密度（５，０００細胞／ｃｍ^２）でｍゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコのゼラチン上に播種し、Ｈａｍ’ｓＦ１２培養液（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＳａｎｔａＲｏｓａ。カリフォルニア州）、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）、ストレプトマイシン（５０ミリグラム／ミリリットル）、１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦにおいて、コンフルエンスまで増殖させた。コンフルエンス細胞は、トリプシン処理し、５０，０００細胞／ｃｍ^２で、ゼラチン或いはコラーゲンコーティングあり或いはなしの２４ウェル組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，マサチューセッツ州）プレートにプレーティングした。細胞はＨａｍ’ｓＦ１２培養液、２％ＦＢＳ、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）、ストレプトマイシン（５０ミリグラム／ミリリットル）、１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦ、及び１５ナノモルのＧＬＰ−１（７〜３７アイソフォーム）において、３週間まで増殖させた。
【０３９７】
プロトコール２：
細胞：臍帯由来細胞、単離体２（Ｐ１７）、単離体１（Ｐ１５）、単離体４（Ｐ１０）、及び成人ＮＨＤＦＰ１０を使用した。細胞は、５０，０００細胞／ｃｍ^２で、２４ウェルＴＣＰプレートに播種し、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ１２（１：１）培養液、Ｂ−２７添加物（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、１ミリリットル当たり５０ユニットのペニシリン、１ミリリットル当たり５０ミリグラムのストレプトマイシン、２０ナノグラム／ミリリットルのＥＧＦ、４０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦにおいて増殖させ、球状クラスターを産生させた（通常４〜６日）。この期間後、前記球状クラスターを回収し、ラミニンコーティングした２４ウェルプレート（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）上へ置き、１０ナノモルのＧＬＰ−１（７〜３７アイソフォーム）を含有するが他の成長因子を含まない（すなわちｂＦＧＦ及びＥＧＦなし）Ｂ−２７添加培養液において３週間まで培養した。
【０３９８】
プロトコール３：
細胞：臍帯由来細胞、単離体２（Ｐ１７）、単離体１（Ｐ１５）、単離体４（Ｐ１０）、及び成人ＮＨＤＦＰ１０を使用した。細胞は、高密度（５０，０００細胞／ｃｍ^２）で、２４ウェルＴＣＰプレートに播種し、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ１２（１：１）培養液、Ｂ−２７添加物、Ｐ／Ｓ、２０ナノグラム／ミリリットルのＥＧＦ、４０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦにおいて増殖させ、球状クラスターを産生した（通常４〜６日）。この期間後、前記球状クラスターを回収し、遠心分離し、ラミニンコーティングした２４ウェルプレート上へ置き、１０ナノモルのＧＬＰ−１（７〜３７アイソフォーム）を含有するが他の成長因子を含まない（すなわちｂＦＧＦ及びＥＧＦなし）Ｂ−２７添加培養液において３週間まで培養した。
【０３９９】
プロトコール４：
細胞：成人ＮＨＤＦ（Ｐ１５）、臍帯由来細胞単離体１（Ｐ１８）、単離体２（Ｐ２１）、単離体３（Ｐ５）、単離体３（Ｐ４）を、Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（２）による方法に従って、単離した。細胞は、５０，０００細胞／ｃｍ^２で、２４ウェルＴＣＰプレートに播種し、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ１２（１：１）培養液、Ｂ−２７添加物（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）、ストレプトマイシン（５０ミリグラム／ミリリットル）、１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ−１０、及び／若しくは４０ナノグラム／ミリリットルのＴＧＦアルファにおいて、２週間以上増殖させた。
【０４００】
プロトコール５：
細胞：成人ＮＨＤＦ、臍帯由来細胞単離体１（Ｐ１８）、単離体２（Ｐ２１）、単離体３（Ｐ５）、単離体３（Ｐ４）を、Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（２）による方法に従って、単離した。細胞は、５０，０００細胞／ｃｍ^２で、２４ウェルＴＣＰプレートに播種し、ＥＢＭ−２培養液、１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ−１０、及び／若しくは４０ナノグラム／ミリリットルのＴＧＦアルファにおいて、２週間以上増殖させた。
【０４０１】
プロトコール６：
細胞：臍帯由来、単離３（Ｐ２）を使用した。細胞は、５０，０００細胞／ｃｍ^２で、Ｔ７５フラスコのゼラチン上に播種し、成長培地或いはＨａｍ’ｓＦ１２培養液、２％ＦＢＳ、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）、ストレプトマイシン（５０ミリグラム／ミリリットル）、１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦにおいて、コンフルエンスまで増殖させた。コンフルエンス細胞は、トリプシン処理し、５０，０００細胞／ｃｍ^２で、ゼラチンコーティングあり或いはなしの２４ウェルＴＣＰプレートにプレーティングした。３種類の基礎培養液を３週間まで使用した：
ベータＩ培養液：Ｈａｍ’ｓＦ１２培養液、２％ＦＢＳ、１０ミリモルのニコチンアミド、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）、ストレプトマイシン（５０ミリグラム／ミリリットル）、２５ミリモルのグルコース；
ベータＩＩ培養液：同等量のＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２培養液、２％ＦＢＳ、１０ミリモルのニコチンアミド、２５ミリモルのグルコース；
内皮細胞基礎培養液（ＥＢＭ）、（ｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＳａｎｔａＲｏｓａ，カリフォルニア州）。
【０４０２】
以下の成長因子が各培養液に添加された：１０ナノグラム／ミリリットルのＦＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットルのｂＦＧＦ、１０ナノモルのＧＬＰ−１（７〜３７アイソフォーム）。
【０４０３】
総ＲＮＡ単離及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ：ＲＮＡは、各プロトコールにおいて記載されたように増殖させた臍帯由来細胞及び線維芽細胞から抽出した。細胞は、ベータメルカプトエタノール（ＳｉｇｍａＳｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を含有する３５０マイクロリットルの緩衝ＲＬＴで、取り扱い説明書（ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア州）に従って溶解し、ＲＮＡを、２．７ユニット／サンプルのＤＮａｓｅ処理（Ｓｉｇｍａ）で、取扱い説明書（ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア州）に従って抽出した。ＲＮＡは、５０マイクロリットルＤＥＰＣ−処理水で溶出し、−８０℃で保存した。ＲＮＡは、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）を含むランダム六量体を用い、逆転写した。サンプルは−２０℃で保存した。
【０４０４】
リアルタイムＰＣＲ：ＰＣＲは、ＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤ遺伝子発現産物を用いて、ｃＤＮＡサンプルで実行した。ＰＤＸ−１（Ｈｓ００４２６２１６）、前インスリン（ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎ）（Ｈｓ００３５５７７３）、Ｎｇｎ−３（Ｈｓ００３６０７００）及びＧｌｕｔ−２（Ｈｓ００１６５７７５）、ＧＡＰＤＨ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、カリフォルニア州）及びＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘは、取り扱い説明書（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、カリフォルニア州）に従って、ＡＢＩｐｒｉｓｍ７０００ＳＤＳソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、カリフォルニア州）で７０００配列検出システムを用いた。熱サイクル条件は、最初２分間で５０℃、１０分間で９５℃とし、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル行なった。加えて、ＰＤＸ−１及びＮｇｎ−３に対するイン−ハウス設計したプライマーの別のセットもテストした。表２０−１は、プライマー配列を示している。これらのプライマーを用いたＰＣＲを、上述したように実行した。膵臓総ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、オースティン、テキサス州）を、対照として使用した。ＰＣＲデータは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（１）が推薦するΔΔＣＴ方法に従って、分析した。
【０４０５】
【表３２】

【０４０６】
免疫蛍光検査：成人ヒト膵臓組織を回収し、液浸は４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリー州）を用いて、４℃で一晩固定した。免疫組織化学は、以下のエピトープに対する抗体を用いて実行した：インスリン（インスリン血清；１：５０；ＬＩＮＣＯＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ミズーリー州）、ＰＤＸ−１（１：５０；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，カリフォルニア州）、グルカゴン（１：１００；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）、ソマトスタチン（１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，カリフォルニア州）及びサイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）。固定された標本を外科用メスで切り取り、エタノールを含むドライアイス浴でＯＣＴ包埋化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−ＴｅｋＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ、トランス、カリフォルニア州）内に入れた。次に標準的な低温保持装置（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、冷凍ブロックを切片にし（厚さ１０ミクロン）、染色用ガラススライドに載せた。
【０４０７】
組織切片は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、カリフォルニア州）、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に１時間曝露させた。ブロッキング溶液で希釈させた一次抗体は、次に室温で４時間、前記サンプルに適用した。一次抗体溶液を除去し、二次抗体溶液を適用する前にサンプルはＰＢＳで洗浄し、ＣＫ１８染色に対してはヤギ抗マウスＩｇＧ−ＴｅｘａｓＲｅｄ（テキサスレッド：１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，オレゴン州）、グルカゴン及びソマトスタチン染色に対してはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）、インスリン染色に対してはヤギ抗モルモットＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）、或いはＰＤＸ−１染色に対してはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＯＴＣ（１：１５０；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）と共に、ブロッキング溶液を含有する二次抗体溶液は、室温で１時間適用された。次にサンプルを洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して細胞核を可視化した。
【０４０８】
免疫染色後、逆落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、メルビル、ニューヨーク州）で適切な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化させた。デジタルカラービデオカメラとＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、代表的な画像を捕らえた。３つ組で染色したサンプルでは、１度に１回の放射フィルターのみを用い、各画像を回収した。次に、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて層状のモンタージュを用意した。
【０４０９】
結果
プロトコール１〜６に従って処理した臍帯由来細胞では、Ｎｇｎ−３がプロトコール３からの細胞において検出されたことを除いては、膵臓特異的マーカーの発現は、リアルタイムＰＣＲ及びＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤプライマーを用いて検出されなかった。同じプライマーは、膵臓組織ＲＮＡから由来したｃＤＮＡを用いたポジティブな結果を導いた。
【０４１０】
ｎｇｎ‐３に対するリアルタイムＰＣＲを、プロトコール６に従って増殖させたヒト臍帯から由来したｃＤＮＡサンプルに実行した。ＰＣＲは、ＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤＮｇｎ−３プライマー（Ｈｓ００３６０７００）を用いても実行した。ヒト膵臓由来ｃＤＮＡは、コントロールとして使用した。ＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤプライマーを用いて、他の膵臓特異的マーカー（ＰＤＸ−１、前インスリン、或いはＧｌｕｔ−２）は検出されなかった。
【０４１１】
臍帯由来組織へ適用したが、線維芽細胞へは適用しなかったプロトコール２及び６の実験条件では、膵臓上皮細胞の細胞性集合に類似する構造を産生した。これらの構造は、前記プロトコールの移植後３〜５日で現れた。しかしながら、島とは異なり、これらの構造は、膵臓マーカー（ＰＤＸ−１、Ｎｇｎ３、Ｇｌｕｔ−２、及び前インスリン）発現に対して陰性であった（リアルタイムＰＣＲによってテストされた）。
【０４１２】
膵臓特異的マーカーは、免疫蛍光技術及び抗体のアレイ（物質及び方法を参照）を用いて、ヒト膵臓から由来した組織において検出された。ヒト膵臓組織における膵臓特異的マーカー（例えば、インスリン、ＰＤＸ−１、グルカゴン、ソマトスタチン、及びサイトケラチン１８）の発現は、容易に検出可能であった。
【０４１３】
要約：ＰＤＸ−１及びＮｇｎ−３の限られた発現は、様々な実験プロトコールで処理した臍帯由来細胞において観察された。インハウスで設計したプライマーと商業的に利用可能なプライマーとの間では結果に違いがあった。例えば、プロトコール１は、インハウスで設計したプライマーを用いた場合、ＰＤＸ−１及びＮｇｎ−３に対してはポジティブデータが示されたが、同じ遺伝子に対するＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤプライマーでは、ネガティブデータが示された。結果は、免疫学的技術によって直接は変更されなかった。そのような違いにも関わらず、いくつかの膵臓マーカーの発現が観察され、これは臍帯由来細胞の膵臓表現型へ分化する能力を示唆するものであった。
【０４１４】
実施例２０の参考文献
１．ＵｓｅｒＢｕｌｌｅｔｉｎ＃２ｆｒｏｍＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒＡＢＩＰｒｉｓｍ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ
２．ＭｉｔｃｈｅｌｌＫＥ，ＷｅｉｓｓＭＬ，ＭｉｔｃｈｅｌｌＢＭ，ＭａｒｔｉｎＰ，ＤａｖｉｓＤ，ＭｏｒａｌｅｓＬ，ＨｅｌｗｉｇＢ，ＢｅｅｒｅｎｓｔｒａｕｃｈＭ，Ａｂｏｕ−ＥａｓａＫ，ＨｉｌｄｒｅｔｈＴ，ＴｒｏｙｅｒＤ，ＭｅｄｉｃｅｔｔｙＳ．（２００３）ＭａｔｒｉｘｃｅｌｌｓｆｒｏｍＷｈａｒｔｏｎ’ｓｊｅｌｌｙｆｏｒｍｎｅｕｒｏｎｓａｎｄｇｌｉａ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２１（１）：５０〜６０．
３．Ｈ．Ｅｄｌｕｎｄ．（２００２）Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ − ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３：５２４〜５３２．
４．Ｓ．Ｋ．ＫｉｍａｎｄＭ．Ｈｅｂｒｏｋ．（２００１）Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｓｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｐａｎｃｒｅａｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１５：１１１〜１２７．
５．ＳｔｒｅｅｔＣＮ，ＲａｊｏｔｔｅＲＶ，ＫｏｒｂｕｔｔＧＳ．（２００３）Ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ａｐｒｏｍｉｓｉｎｇｓｏｕｒｃｅｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｓｆｏｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｅｓ．ＣｕｒｒＴｏｐＤｅｖＢｉｏｌ．５８：１１１〜３６．
【実施例２１】
【０４１５】
臍帯由来細胞の軟骨形成分化
軟骨組織損傷及び欠損に対して、アメリカのみで１年間に約６００，０００外科的手術が行われている（１）。これらの状態を治療するための多くの戦略が開発されたが、これらの成功率は限られていた。１つのアプローチであるＣａｒｔｅｃｅｌ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）は、患者から回収し、ｉｎｖｉｔｒｏで増殖させ、患者へ移植させる自家軟骨細胞を用いる（１）。このアプローチは、健康な軟骨細胞を回収し、前記培養された細胞を移植するという２次的な手順を必要とするという不都合がある。代替的な可能性としては、幹細胞ベースの治療であり、細胞は欠損部位に或いはその近くに置かれ、損傷組織を直接置換するものである。細胞は、適用前に軟骨細胞へ分化される或いはｉｎｓｉｔｕで分化できる前駆細胞が使用される。そのような移植された細胞は、欠損において失われた軟骨細胞を置換する。
【０４１６】
この効能に対する候補細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで軟骨細胞に分化するためのそれらの能力によって評価されるべきである。分化し軟骨細胞マーカー遺伝子を発現する細胞の能力をテストするための多くのプロトコールが開発された、臍帯由来細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで軟骨細胞に分化するそれらの能力に対して、２つの異なるアッセイシステム：ペレットアッセイ培養システム、及びコラーゲンゲル培養においてテストされた。ペレット培養システムは、多数のヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を選択する場合に成功的に使用された。このアッセイで増殖し、トランスフォーミング増殖因子−ベータ３で処理されたＭＳＣは、軟骨細胞へ分化することが示された（２）。コラーゲンゲルシステムは、軟骨細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養するために使用された（３）。これらの条件下で増殖された軟骨細胞は、軟骨様構造を形成した。
【０４１７】
材料と方法
細胞培養：ヒト臍帯を入手し、臍帯由来細胞は上述した実施例１に記載されたように調整した。細胞は、成長培地のゼラチンコーティングＴＣＰフラスコにおいて培養した。培養は、５％ＣＯ_２、３７℃でインキュベートした。実験に使用した細胞は、継代４〜１２の範囲であった。
【０４１８】
ヒト間接軟骨細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）から購入し、分娩後細胞と同じ培養液で培養した。実験の２４時間前に、前記培養液は、１％ＦＢＳを含有する培養液へ交換した。
【０４１９】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）から購入し、ＭＳＣＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ）において培養した。実験に使用した細胞は、継代２〜４の間であった。
【０４２０】
コラーゲンゲルアッセイ：培養された細胞は、トリプシン処理し、培養プレートから除去した。細胞は、血清なしのＤＭＥＭにおいて、３００ｘｇで５分間、２回遠心分離することで洗浄し、計数した。細胞は、記載した最終濃度になるように以下の構成成分と混合した。ラット尾コラーゲン（１ミリグラム／ミリリットル、ＢＤＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）、０．０１正常ＮａＯＨ、軟骨細胞培養液ＤＭＥＭ、ペニシリン（１００ユニット／ミリリットル）、ストレプトマイシン（１００マイクログラム／ミリリットル）、２ミリモルのＬ−グルタミン、１ミリモルのピルビン酸ナトリウム、０．３５ミリモルのＬ−プロリン、１００ナノモルのデキサメタゾン、０．１７ミリモルのＬ−アスコルビン酸、１％（ｖ／ｖ）のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、セレニウム）（全ての構成成分は、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙより購入）。前記細胞は、前記培養液と穏やかに混合し、サンプルは、２４ウェルｕｌｔｒａ−ｌｏｗクラスタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州）の個々のウェルに、２ｘ１０^５／ウェル或いは５ｘ１０^５／ウェルの濃度での一定量で添加した。培養はインキュベーターに置き、２４〜４８時間平静に放置した。培養液は、適切な成長因子を添加した新鮮な軟骨細胞培養液に、２４〜４８時間毎に交換した。サンプルは、２８日以上培養させ、その時点で除去し、１０％（ｖ／ｖ）ホルマリン（ＶＷＲＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ、ペンシルバニア州）で固定し、組織学的試験に供した。サンプルは、評価するためにサフラニンＯ或いはヘマトキシリン／エオシンで染色した。
【０４２１】
ペレット培養アッセイ：培養された細胞は、トリプシン処理し、培養プレートから除去した。細胞は、血清なしのＤＭＥＭにおいて、３００ｘｇで５分間、２回遠心分離することで洗浄し、計数した。細胞は、新しいポリプロピレンチューブに、２．５ｘ１０^５細胞／チューブという一定量で添加した。適切なサンプルは、ＴＧＦ−ベータ３（１０ナノグラム／ミリリットル、Ｓｉｇｍａ）或いはＧＤＰ−５（１００ナノグラム／ミリリットル、Ｒ&ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）で処理した。細胞は次に、１５０ｘｇで３分間遠心分離した。チューブをインキュベーターへ移し、５％ＣＯ_２、３７℃で４〜４８時間、平静に放置した。培養液は、２〜３日毎に適切に、新鮮な軟骨細胞培養液及び成長因子に交換した。サンプルは、２８日まで培養させ、その時点で、除去し、固定し、上述したように染色した。
【０４２２】
結果
方法の欄に説明したように、ペレットを調整し、培養した。ペレットは、培養液（コントロール）、或いはＴＧＦ−ベータ３（１０ナノグラム／ミリリットル）、或いはＧＤＰ−５（１００ナノグラム／ミリリットル）を添加した培養液において増殖させ、培養液は２〜３日毎に交換した。ペレットは、培養の２１日後に回収し、グルコサミノグリカンの存在をテストするために、サフラニンＯで染色した。ＴＧＦ−ベータ３及びＧＤＰ−５で処理した前記ペレットは、コントロール細胞と比較して、サフラニンＯ染色に対していくつか陽性を示した。臍帯由来細胞の形態は、いくつかの限定された軟骨様形態を示した。
【０４２３】
要約：臍帯由来細胞は、ペレット培養、及びコラーゲンゲルアッセイシステムにおいてｉｎｖｉｔｒｏで軟骨細胞へ部分的に分化した。臍帯由来細胞は、細胞によるグリコサミノグリカン発現の指標をいくつか示した。形態学では、軟骨組織と限られた類似を示した。これらの結果より、臍帯由来細胞のより完全な軟骨細胞分化を刺激するように条件は最適化されるものであると示唆された。
【０４２４】
実施例２１の参考文献
１．Ｕ．Ｓ．ＭａｒｋｅｔｓｆｏｒＣｕｒｒｅｎｔａｎｄＥｍｅｒｇｉｎｇＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓＰｒｏｄｕｃｔｓａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ＭｅｄｔｅｃｈＩｎｓｉｇｈｔＬ．Ｌ．Ｃ．２００２
２．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｂ，Ｔ．Ｍ．Ｈｅｒｉｎｇ，Ａ．Ｉ．Ｃａｐｌａｎ，Ｖ．Ｍ．ＧｏｌｄｂｅｒｇａｎｄＪ．Ｕ．Ｙｏｏ．ＩｎＶｉｔｒｏＣｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＢｏｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ−ＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．１９９８．ＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ２３８：２６５〜２７２．
３．Ｇｏｓｉｅｗｓｋａ，Ａ．，Ａ．Ｒｅｚａｎｉａ，Ｓ．Ｄｈａｎａｒａｊ，Ｍ．Ｖｙａｋａｒｎａｍ，Ｊ．Ｚｈｏｕ，Ｄ．Ｂｕｒｔｉｓ，Ｌ．Ｂｒｏｗｎ，Ｗ．Ｋｏｎｇ，Ｍ．ＺｉｍｍｅｒｍａｎａｎｄＪ．Ｇｅｅｓｉｎ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａＴｈｒｅｅ−ＤｉｍｅｎｓｉｏｎａｌＴｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙｆｏｒＴｅｓｔｉｎｇＣｅｌｌ−ＰｏｌｙｍｅｒＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｆｏｒＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．２００１ＴｉｓｓｕｅＥｎｇ．７：２６７〜２７７．
【実施例２２】
【０４２５】
ＩｎＶｉｔｒｏペレット培養ベースアッセイにおける臍帯組織から由来した細胞の軟骨形成能力のさらなる評価
臍帯組織から由来した細胞の軟骨形成能力の評価は、ｉｎｖｉｔｒｏペレット培養ベースアッセイを用いて実行した。臍帯からの、初期継代（Ｐ３）及び後期継代（Ｐ１２）での細胞を使用した。前記細胞の軟骨形成能力は、トランスフォーミング増殖因子ベータ−３（ＴＧＦベータ−３）、組換えヒト増殖及び分化因子５（ｒｈＧＤＦ−５）、或いは両者の組み合わせを添加した培養液における、軟骨形成誘導条件下でのペレット培養アッセイを用いて評価した。
【０４２６】
材料と方法
試薬：ダルベッコ変法必須培養液（ＤＭＥＭ）、ペニシリン及びストレプトマイシンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）は、ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ユタ州）から購入した。間葉系幹細胞増殖培養液（ＭＳＣＧＭ）及びｈＭＳＣ軟骨形成分化ｂｕｌｌｅｔｋｉｔは、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）から購入した。ＴＧＦベータ−３は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、カリフォルニア州）から購入した。ｒｈＧＤＦ−５は、Ｂｉｏｐｈａｒｍ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ（国際特許番号第ＷＯ９６０１３１６Ａ１号、米国特許番号第ＵＳ５９９４０９４Ａ号））から購入した。
【０４２７】
細胞：ヒト間葉系幹細胞（ロット＃２Ｆ１６５６）は、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）から購入し、取扱説明書に従ってＭＳＣＧＭにおいて培養した。このロットは、以前にテストされており、軟骨形成アッセイにおいてポジティブであったと示された。ヒト成人及び新生児線維芽細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓバージニア州）から入手し、成長培地において、ゼラチンコーティングされた組織培養プラスチックフラスコ上に培養した。以前の実施例で記載されたようにヒト臍帯から単離した分娩後組織由来細胞を使用した。細胞は、線維芽細胞の培養と同様な方法で、成長培地において培養した。前記細胞培養は、３７℃で５％ＣＯ_２によりインキュベートした。実験に使用された細胞は、継代３〜１２の間であった。
【０４２８】
ペレット培養アッセイ：ペレット培養に対して、０．２５ｘ１０^６細胞を１５ミリリットルコニカルチューブにプレーティングし、室温において１５０ｘｇで５分間遠心分離し、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒからの軟骨形成アッセイに対するプロトコールに従って、球状ペレットを形成した。ペレットは、ＴＧＦベータ−３（１０ナノグラム／ミリリットル）、ｒｈＧＤＦ−５（５００ナノグラム／ミリリットル）、或いはＴＧＦベータ−３（１０ナノグラム／ミリリットル）とｒｈＧＤＦ−５（５００ナノグラム／ミリリットル）との組み合わせを含有する軟骨形成誘導培養液において３週間培養した。未処理コントロールは、成長培地において培養した。培養の間、ペレットには毎日新鮮な培養液を与えた。処理群は、以下に示したとおりである。
【０４２９】
処理群
Ａ．臍帯由来細胞初期継代（ＵＥＰ）＋ｒｈＧＤＰ−５
Ｂ．臍帯由来細胞後期継代（ＵＬＰ）＋ｒｈＧＤＰ−５、ｎ＝２
Ｃ．ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）＋ｒｈＧＤＰ−５
Ｄ．ヒト成体線維芽細胞（ＨＡＦ）＋ｒｈＧＤＰ−５
Ｅ．臍帯由来細胞初期継代（ＵＥＰ）＋ＴＧＦベータ−３
Ｆ．臍帯由来細胞後期継代（ＵＬＰ）＋ＴＧＦベータ−３、ｎ＝２
Ｇ．ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）＋ＴＧＦベータ−３
Ｈ．ヒト成体線維芽細胞（ＨＡＦ）＋ＴＧＦベータ−３
Ｉ．臍帯由来細胞初期継代（ＵＥＰ）＋ｒｈＧＤＦ＋５＋ＴＧＦベータ−３
Ｊ．臍帯由来細胞後期継代（ＵＬＰ）＋ｒｈＧＤＰ＋５＋ＴＧＦベータ−３、ｎ＝２
Ｋ．ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）＋ｒｈＧＤＦ−５＋ＴＧＦベータ−３
Ｌ．ヒト成体線維芽細胞（ＨＡＦ）＋ｒｈＧＤＦ−５＋ＴＧＦベータ−３
Ｍ．ヒト新生児線維芽細胞（ＨＮＦ）＋ｒｈＧＤＦ＋５＋ＴＧＦベータ−３
Ｎ．臍帯由来細胞初期継代（ＵＥＰ）
Ｏ．臍帯由来細胞後期継代（ＵＬＰ）
Ｐ．ヒト間葉幹細胞（ＨＭＳＣ）
Ｑ．ヒト成体線維芽細胞（ＨＡＦ）
【０４３０】
ｉｎｖｉｔｒｏサンプルの組織像：培養期間の最後で、ペレットは１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、切片化し、ヘマトキシリン&エオシン（Ｈ&Ｅ）及びサフラニンＯ（ＳＯ）染色で染色するためにＭＰＩＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｍａｔｔａｗａｎ、ミシガン州）へ送付した。
【０４３１】
結果
臍帯由来細胞、ＭＳＣｓ、及び線維芽細胞は、異なる成長因子を有する軟骨形成誘導培養液において、細胞ペレットを形成した。培養期間の最後でのペレットのサイズは、異なる細胞タイプによって変わった。臍帯細胞で形成されたペレットは、大きく、ＭＳＣｓや線維芽細胞によって形成されたものより緩かった。全ての細胞タイプによって形成され、コントロール培養液において培養されたペレットは、軟骨形成誘導培養液で培養されたペレットより小さかった。
【０４３２】
Ｈ&Ｅ及びサフラニンＯで染色されたペレットの断面の試験より、初期継代での臍帯由来細胞は、軟骨形成分化を経る能力を有していた。細胞凝縮、細胞形態、及び基質のサフラニンＯ陽性染色によって評価されたように、軟骨形成は、ＴＧＦベータ−３、ｒｈＧＤＦ−５、或いはその両者を添加した軟骨形成誘導培養液において培養された臍帯細胞ペレットにおいて観察された。ペレットにおける軟骨形成は、ＴＧＦベータ−３、ｒｈＧＤＦ−５、及びそれらの組み合わせで処理したものと類似していた。成長培地において培養されたコントロールペレットは、軟骨形成の証拠は示さなかった。臍帯由来細胞の軟骨形成は、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒから得られたＭＳＣｓで観察されたものよりわずかに低かった。
【０４３３】
後期継代での臍帯由来細胞は、初期継代での臍帯由来細胞の軟骨形成能力とは区別できないと示された。しかしながら、これは、軟骨形成誘導条件はＭＳＣｓに対して最適化され、分娩後由来細胞に対しては最適化されないという事実に起因するものである。いくつかの細胞凝縮が、線維芽細胞で観察されたが、サフラニンＯ染色に付随するものではなかった。
【実施例２３】
【０４３４】
心筋細胞表現型への分化
虚血性疾患及びうっ血性心不全などの心臓疾患の進行及び／若しくは治療を示す治療が、極めて必要とされている。不整脈なしで患者の心筋へ完全に結合できる心筋細胞へ分化できる細胞が、非常に望まれている。５−アザシチジンで処理したげっ歯類間葉系幹細胞は、心筋細胞のマーカーを発現すると示された（Ｆｕｋｕｄａｅｔａｌ．（２００２）Ｃ．Ｒ．Ｂｉｏｌ．３２５：１０２７〜３８）。これは、成人ヒト幹細胞では示されていなかった。低酸素（Ｓｔｏｒｃｈ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０５５：１２６〜９）、レチノイン酸（Ｗｏｂｕｓｅｔａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＣａｒｄｉｏｌ．２９：１５２５〜３９）、ＤＭＳＯ（Ｘｕｅｔａｌ．（２００２）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１：５０１〜８）、及び細胞質から原形質膜へのＰＫＣの転位に影響し、ＰＫＣ活性化の阻害剤である、塩化ケレリトリン（国際特許番号第ＷＯ０３／０２５１４９号公報）を含む付加的な因子は、幹細胞分化を促進するために使用した。
【０４３５】
この実施例において、臍帯由来細胞は、５−アザシチジン単独、若しくはＤＭＳＯ或いは塩化ケレリトリンとの組み合わせで処理し、心筋細胞のマーカーをリアルタイムＰＣＲで測定した。
【０４３６】
方法と物質
細胞：凍結保存臍帯由来細胞（Ｐ１０）は、ゼラチンコーティングフラスコにおいて増殖培地中で増殖させた。細胞は、２４時間、９６ウェルプレートに増殖培地中で５ｘ１０^４細胞／ウェルで播種した。培養液は、０、３、１０、及び３０マイクロモルの５−アザシチジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）単独で、或いは５マイクロモルの塩化ケレリトリン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ）、或いは１マイクロモルのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）を含む、ＭＥＭ−アルファ（Ｓｉｇｍａ）、インスリン、トランスフェリン、及びセレニウム（ＩＴＳ；Ｓｉｇｍａ）、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清、ペニシリン及びストレプトマイシンに交換した。前記細胞は、３７℃、５％（ｖ／ｖ）Ｏ_２で４８〜７２時間インキュベートした。前記培養液は、ＭＥＭ−アルファ、インスリン、トランスフェリン及びセレニウム、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）、及びストレプトマイシン（５０マイクログラム／ミリリットル）へ交換し、細胞は、３７℃、５％（ｖ／ｖ）Ｏ_２で１４日間インキュベートした。
【０４３７】
ＲＮＡ抽出及び逆転写：細胞は、製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州）に沿って、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を含む１５０マイクロリットルの緩衝液ＲＬＴを用いて溶解し、−８０℃で保存した。細胞溶解液を解凍し、取扱説明書（ＲＮｅａｓｙ９６ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）に従って、２．７ユニット／サンプルのＤＮａｓｅ処理（Ｓｉｇｍａ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、５０マイクロリットルのＤＥＰＣ−処理水で溶出し、−８０℃で保存した。ＲＮＡは、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）を含むランダム六量体を用い、逆転写した。サンプルは−２０℃で保存した。
【０４３８】
ＰＣＲ：ＰＣＲは、ｃＤＮＡサンプルに対してＡＳＳＡＹ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤ遺伝子発現産物心臓性ミオシン（Ｈｓ００１６５２７６ｍｌ）、骨格ミオシン（Ｈｓ００４２８６００）、ＧＡＴＡ４（Ｈｓ００１７１４０３ｍｌ）、ＧＡＰＤＨ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、カリフォルニア州）及び取り扱い説明書（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、カリフォルニア州）に従って、ＡＢＩＰｒｉｓｍ７０００ＳＤＳソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有する７０００配列検出システムを用いたＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘを用いて実行した。熱サイクル条件は、最初２分間で５０℃、１０分間で９５℃とし、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル行なった。心筋及び骨格筋からのｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）は、コントロールとして使用した。
【０４３９】
結果
心筋からのコントロールＲＮＡは、心臓性ミオシン及びＧＡＴＡ４の発現が見られ、骨格筋ＲＮＡは、骨格ミオシン及び心臓性ミオシンを示したが、ＧＡＴＡ４発現は見られなかった。４８時間因子で処理し、さらに１４日間培養した臍帯由来細胞（Ｐ１２）は、低レベルのＧＡＴＡ４を発現したが、骨格ミオシン及び心臓性ミオシンは発現していなかった。臍帯由来細胞からの付加的なサンプルでも、ＧＡＴＡ４の発現が見られた。
【０４４０】
要約：未処理臍帯由来細胞は、心筋細胞、セリトル細胞、及び幹細胞における核転写因子である、ＧＡＴＡ４を構成的に発現した。
【実施例２４】
【０４４１】
げっ歯類冠動脈結紮（ライゲーション）モデルにおける心血管治療に対する臍帯由来細胞の評価
心不全の動物モデルは、疾患の病態生理学の理解に役立ち、うっ血性心不全（ＣＨＦ）に対する新しい治療の開発の手助けをする。ラットにおける冠動脈結紮、或いは心臓組織へ供給する血管の遮断は、ヒトにおける急性心筋梗塞の病態生理学をそっくりに模倣しており、ＣＨＦに対する薬学的処置を研究するために成功的に使用されていた。心臓病変部へのヒト細胞の細胞移植は、ＣＨＦに対する潜在的で実行可能な治療である。
【０４４２】
心臓内ヒト臍帯由来細胞治療の有効性は、冠動脈閉塞語１５分で投与された場合、心筋虚血／梗塞のげっ歯類モデルにおいて評価した。
【０４４３】
方法&材料
ＴｈｅＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＷｏｒｃｅｓｔｅｒ（マサチューセッツ州）テスト施設は、米国実験動物管理認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）によって正式許可を受けており、実験動物における研究を行うために米国農務省から認可されている。テストする全ての条件は、動物保護法（９ＣＦＲ）及びその修正案に従った。プロトコールは、研究を開始する前に、研究機関内の動物の管理および使用に関する委員会（ＩＡＣＵＣ）によって再検討され許可された。
【０４４４】
表２５−１に特定された特徴を有する動物は、マイクロ−隔離飼育器の高圧滅菌されたベッド上に個々に収容した。飼育器は、実験動物の管理および使用に対するガイドにおいて説明されている標準に従った。
【０４４５】
【表３３】

【０４４６】
Ｐｕｒｉｎａ認定食餌（照射された）は、適宜動物に提供した。この食餌は、栄養成分及び環境混入物に対して製造業者によって日常的に分析された。製造業者の分析の結果は、テスト施設で記録した。
【０４４７】
高圧滅菌し濾過された水道水は、適宜提供した、濾過された水のサンプルは、溶解固体、硬度、特定の微生物含有量、及び選択された環境混入物の総量を分析した。これらの分析の結果は、テスト施設で記録した。
【０４４８】
環境的コントロールは、１８〜２６℃（６４〜７９°Ｆ）の温度、相対湿度３０％〜７０％で維持するように設定した。１２：１２時間の明：暗サイクルを維持した。1時間に１０回以上の動物室の空気交換を維持した。レセプト及び研究での使用の前に、前記動物は、「実験動物のテスト施設標準操作手順、レセプト、条件、及び検疫（ｔｈｅＴｅｓｔＦａｃｉｌｉｔｙＳｔａｎｄａｒｄＯｐｅｒａｔｉｎｇＰｒｏｃｅｄｕｒｅ，Ｒｅｃｅｉｐｔ，Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ，ａｎｄＱｕａｒａｎｔｉｎｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ）」に記載されているテスト施設製造供給元マネージメントプログラム（ｔｈｅＴｅｓｔＦａｃｉｌｉｔｙＶｅｎｄｏｒＭａｎａｇｅｍｅｎｔＰｒｏｇｒａｍ）に従った条件で最低４日間保持した。
【０４４９】
各動物は、耳パンチ（穿孔）によって示された独特な数によって特定した。動物は、個々の体重が平均体重±２０％を超えないようにした体重順分配によって、ランダムにグループに割り当てた。
【０４５０】
前記動物は、ペントバルビタールナトリウム（４０ミリグラム／キログラム）、及びブプレノルフィン（０．０５ミリグラム／キログラム）を単一カクテルとしたもので、筋肉内（ＩＭ）に麻酔した。麻酔が達成された後、動物は、１８〜１６ゲージ、２インチ長血管カテーテル、或いは適切なサイズの血管カテーテルを用いて挿管し、大気呼吸（酸素を添加した）、及び陽圧換気を手術の間維持した。必要であれば、付加的な麻酔を徐々に増加するように与えた。手術前抗生剤治療（ベンザチン／プロカインペニシリンＧ、４０，０００ユニット／キログラムでＩＭ）も施した。付加的な抗生剤治療は、４８時間毎に施した。
【０４５１】
電極パッドを、動物の足へ適切に配置し、使用可能なＥＣＧシグナルを受信した。動物は、加熱パッド上に置かれ、手術中の体温の維持を補助した。直腸温度プローブを動物に挿入し、体温をモニタリングした。眼科軟膏を各眼に投与した。外科的部位（胸部領域）は、余計な毛を除去することによって無菌的な手術に対して準備し、７０％イソプロピルアルコールに浸したスポンジでその領域を穏やかに拭き、乾燥させた。次に、イオドン（Ｉｏｄｏｎｅ；ＭＥＤＩＳＥＰＰＳ或いは類似溶液）をその領域に適用し、乾燥させた。前記領域は、厳密な無菌手術のために適切にドレープした。
【０４５２】
外科的切開を、第４番目の肋間スペースを覆う皮膚上に作った。筋肉層を通る鈍的切開は、胸腔にアクセスするために使用した。開創器を、第４番目の肋間スペースへ注意深く挿入し、開き、胸腔へのアクセスを可能にした。無菌生理食塩水で湿らせたコットンスワブを穏やかに挿入することによって心膜を注意深く開いた。湿ったコットンスワブは、心臓の手術のための、長さが６−０シルクの縫合が心筋へ付けられた場所へ、心尖を穏やかに押すために使用した。停止後、心臓を回復させ、心尖に置かれた縫合は、胸腔から心臓と取り出すことを容易にし、十分な張力を心臓に与え、心臓上部や冠動脈左前下行枝（ＬＡＤ）へのアクセスを可能にするために使用した。別の長さの６−０シルク縫合は、ＬＡＤを取り囲むように心筋へ配置した。尖端縫合への圧力を放出させ、心臓を胸腔の内部へ戻した。
【０４５３】
心拍数及びＥＣＧがベースライン値に戻った時点で、ＬＡＤの周りの結紮を縛り、ＬＡＤを閉塞させた。これは、縛られた縫合と切り揃えられた末端とを有する持続的な結紮である。結紮を縛った後、外科医は、結紮の成功を意味する以下の特徴：結紮の真下の心臓の領域の白色／灰色への色の変化（白色は、前記領域への血流の終結、及びＬＡＤの閉塞に対応するＥＧＤの有意な変化の結果である。）を調査した。不整脈は、結紮の最初の１０分間以内で発現した。ラットは、蘇生が必要である事象の期間の間、精密にモニタリングした。重症な不整脈、及び補助なしでの正常洞リズムの変換におけるラットの不全では、心臓マッサージを介して補助した。ＬＡＤ結紮の開始後、約１５分で、左心室の領域が虚血になり、虚血心筋への直接注入によって、溶媒或いはテスト物質で処理した。処置は、心筋の虚血領域への３〜１０回の心筋内注入（１００μＬ／注入）によって構成されている。
【０４５４】
ヒト細胞は、成長培地のゼラチンコーティングされたＴ３００フラスコ上に増殖させた。細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を用いてトリプシン処理した。トリプシン処理は、成長培地を添加することによって停止させた。前記細胞は、１５０ｘｇで遠心分離し、上清を除去し、前記細胞ペレットは１００万細胞当たり約１ミリリットルの成長培地で再懸濁した。一定量の再増を除去し、トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を添加した。生存細胞数を、血球計数器を用いて推定した。前記細胞懸濁液は、遠心分離し、５００万細胞当たり１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（Ｈｙｂｒｉｍａｘ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を含有する１ミリリットルの成長培地に再懸濁し、クリオバイアル（Ｃｒｙｏｖｉａｌｓ：Ｎａｌｇｅｎｅ）へ移した。前記細胞は、「ＭｒＦｒｏｓｔｙ」冷凍庫を用い、約１℃／分で一晩、−８０℃の冷凍庫で冷却した（Ｎａｌｇｅｎｅ、ニューヨーク州、ロチェスター）。細胞のバイアルは、液体窒素へ移した。バイアルは、ドライアイス上においてＣＢＡＴ（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ニュージャージー州）からＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、マサチューセッツ州）へ送付され、−８０℃で保存された。動物への細胞の注入前約１〜２時間、細胞のバイアルは３７℃水浴において素早く解凍させた。ＢＳＬ２バイオセーフティーキャビネットにおける無菌条件下で、細胞は、マグネシウム及びカルシウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）を含む４０マイクロリットルのＰＢＳへ添加し、前記細胞ペレットを１０ミリリットルＰＢＳに再懸濁する前に１５０ｘｇで５分間遠心分離した。細胞数及び生存率は、上述したように推定した。細胞は、１５０ｘｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳに最終濃度が１０^６生細胞／１００マイクロリットルになるように再懸濁した。前記細胞懸濁液を、３０Ｇ注射針を有する１ミリリットルのシリンジに入れ、氷上に置いた。生存率を、再び５時間まで氷上で評価した。
【０４５５】
治療の投与（表２４−１）及び心臓の安定化の後、外科医は外科的切開を閉じ始めた。開創器は除去した。肺は３〜４呼吸過剰膨張させ、それらは完全に再膨張しているかを確認できるまで可視的に視察した。これは、回復後の気胸症を予防するために必要な負圧を作るものである。腔を閉じた後の胸腔からの体液及び過剰な空気を排除するために、静脈内カテーテル（すなわち、２０ゲージ、長さ２ミリメーター）は、皮膚及び筋肉層を通じて、チップが胸腔に残るように設置した。前記チップが肺或いは心臓を突き刺さないように気をつけた。分離させた肋骨及び付随する筋肉は、適切な縫合と共に縫合した。筋肉の上層は、単純な連続性パターンを用いて縫合した。皮膚は、水平マットレスパターンを用いて４−０シルクで閉じた。１０ミリリットルシリンジは、胸腔に以前設置した静脈内カテーテルへ接着させ、プランジャーをゆっくりと引き、胸腔からの体液と空気を取り除いた。同時に、前記カテーテルを侵入部位からゆっくり取り除き、それによって周囲の筋肉塊及び皮膚によって穿刺が密封された。外科的ドレープを除去し、体液（すなわち、乳酸加リンガー溶液、２５ミリリットル／キログラム、皮下（ＳＣ）或いは腹腔内（ＩＰ））を与えた。
【０４５６】
【表３４】

【０４５７】
各ラットをテスト物質での処理を受けさせ、切開を縫合した後すぐ、動物は心エコー図検査（ＥＣＧ）試験を受けさせた。エコー試験の完了まで麻酔を維持した。エコー試験が完了したら、換気を中止し、ラットを回復エリアへ戻し、加熱し酸素化した回復ケージにおいて回復させた。
【０４５８】
終了する前に、各生存動物の第２のエコー試験を研究の最後（処理後約２８日）に完了した。第２の試験の間、動物は以前に記載したように麻酔した。
【０４５９】
各エコー試験に対して、左胸部領域を剪毛し、温め、トランスデューサーの接触を増強するために超音波ゲルを皮膚に適用した。電極パッドは、適切な四肢の周囲に配置し、ＥＣＧシグナルを受信した。短軸及び長軸を含む心エコー画像は、心室腔寸法、収縮力、脈管構造を通る血流量、及び壁の厚さの決定を可能にする。これらの画像は、さらなる分析のために光ディスクに保存した。試験後、ガーゼ或いはペーパータオルを用いて皮膚からゲルを除去した。ラットは換気装置からはずし、動くまで温められた回復ケージへ置いた。
【０４６０】
外科的手順の終了時、呼吸換気装置を切った。動物の足反射を観察した。その後、直腸プローブ及びＥＣＧ電極を除去し、動物から抜管し、温められ酸素化された回復ケージへ置いた。麻酔からの完全な回復後、動物にブプレノルフィン（０．０５ミリグラム／キログラム、ＳＣ）を与えた。動物が完全な動きをしめし、食物と水に興味を示すまで、観察を定期的に行った。次に動物は清潔な飼育ケージに置き、動物飼育質に戻した。動物は、手術後１日に２回、外科的切開整合をモニターリングした。
【０４６１】
鎮痛薬（すなわち、ブプレノルフィン、０．０５ミリグラム／キログラム、ＳＣ）を手術後、１日２回を４日間、その後は必要に応じて投与した。手術後の痛みの視覚的指標としては、正常体位及び動きの欠如（例えば、動物が背中を丸める位置を維持するなど）、反感（ａｎｔｉｐａｔｈｙ）、摂食／飲水の欠如、毛づくろいの欠如、及びそれらと同等なことを含む。
【０４６２】
体重は、処理開始前、処理後１週間に１回、及び剖検の日に記録した。死んだ動物は、体重を測定し、剖検した。
【０４６３】
心臓を回収するために、各ラットを手術で行ったように麻酔した。頸静脈をカニューレ処置した。頸静脈カニューレを介して注入したＫＣｌを用いて、弛緩期で心臓を停止させた。次に心臓を胸腔から除去した。次に、心臓を１０％中性緩衝ホルマリンに置いた後、限られた剖検を心臓に行った。各屠殺体の残部は、さらなる評価をせずに破棄した。
【０４６４】
死んだことが確認された、或いは安楽死させて瀕死である全ての動物の心臓は、評価するまで４％パラホルムアルデヒドに置いた。各屠殺体の残部はさらなる評価をせずに破棄した。
【０４６５】
組織学及び画像分析：固定組織は、ステンレススチール冠状心臓マトリックス（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）を用いて切片化し、４つの２ミリメートル厚の連続組織切片を得た。切片を加工し、日常的な方法を用いて連続的にパラフィンに包埋した。５ミクロン切片をミクロトームによって得て、取扱説明書を用いて、結合性組織に対するＭａｓｓｏｎ’ｓトリ−クロム（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＢａｙＳｈｏｒｅ、ニューヨーク州）で染色した。電子顕微鏡写真を記録し、Ｐｈａｓｅ３ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＧｌｅｎＭｉｌｌｓ、ペンシルバニア州）によって開発された画像解析法を用いて分析した。トリ−クロム染色された切片の顕微鏡写真は、電気的に比色分析を行い、心室及び自由壁の全領域、及び異なって染色された領域を決定した。
【０４６６】
結果
氷上で放置されていた時、溶媒において５時間以上、細胞の生存率における欠損はなかった。細胞は、１〜３の注射針の挿入点、及び注射針配向の方向における複数の変更を用いて梗塞へ注入した。
【０４６７】
短縮率値は、Ｓａｈｎら（（１９７８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ５８：１０７２〜１０８３）によって記載されたように計算した。溶媒処理動物の短縮率は、４７．７％±８．３％（０日目）〜２３．５％±３０．２％（２８日目）（ｐ<０．０５）と有意に減少した。臍帯由来細胞で処理された動物は、０日目と２８日目の短縮率の違いは小さく、ほとんど有意差はなかった。０日目での処理群間の短縮率の違いはほとんどなかった。
【０４６８】
研究の終了時、心臓を回収し、組織学的解析に供した。心臓は弛緩期に停止し、固定した。結果は、アルゴリズムから計算し、梗塞を形成する総心臓領域のパーセンテージを推定した。溶媒処理した動物における梗塞サイズは、心臓領域の２２．９％±６．７％であったが、臍帯細胞で処理した心臓における梗塞細部は、１２．５％±２．５％であり、胎盤由来細胞（単離体２）は、１２．９％±３．４％であり、線維芽細胞では１９．３％±８．０％であった。溶媒処理した動物に対する細胞処理した動物の梗塞サイズの違いは、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−テストに基づいて、統計学的に有意ではなかった。
【０４６９】
要約：本研究の結果により、臍帯由来細胞は、ラットにおける外科的に誘導された心筋梗塞の損傷を軽減することにおいていくつかの利点を有していることが示唆された。溶媒処理した動物は、短縮率によって測定されたように、０日目〜２８日目の心機能における有意な減少を示したが、臍帯由来細胞処理した動物は、２８日間の研究において最小限の変化を示した。線維芽細胞処理した動物は、最小限の変化を示したが、２個体の動物のみが本研究で生存した。梗塞サイズの評価によって、中程度であるが統計学的には有意ではない軽減が、２８日目での溶媒コントロールと比較して、分娩後由来細胞処理した動物における梗塞サイズで見られたことが示された。総合すると、これらのデータは、心筋梗塞からの損傷を軽減する臍帯由来細胞の効果を支持するものである。
【実施例２５】
【０４７０】
網膜色素変性症の治療における臍帯由来細胞の使用
現在、網膜における細胞の変性から生じる失明障害に対する実質的な治療は存在しない。アポトーシスや２次変性の結果としての光受容体の損失は、視覚の進行性変質、さらに最終的には失明を引き起こす。これらを生じる疾患は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、及び網膜色素変性症（ＲＰ）を含む。通常、ＲＰは、光受容体細胞死を引き起こす、１つの遺伝子変異に関連している。
【０４７１】
網膜光受容体及び隣接する網膜色素上皮細胞は、機能的ユニットを形成している。英国外科医師会（ＲＣＳ）ラットによって、チロシン受容体キナーゼ（Ｍｅｒｋｔ）欠損は、外側色素食作用に影響を及ぼし、光受容体細胞死を導くことが示された（１）。網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）細胞のＲＣＳラットの網膜下スペースへの移植によって、光受容体損失の進行が限定され、視覚機能の維持が観察された（２）。本実施例では、臍帯由来細胞は、ＲＣＳモデルにおける光受容体の救出を促進するために使用され得ることを説明する。
【０４７２】
方法と物質
細胞移植：ヒト成人臍帯及び線維芽細胞（継代１０）は、１継代増殖させた。全ての細胞は、まず、成長培地中に５，０００細胞／ｃｍ^２でゼラチンコーティングＴ７５フラスコ上に播種した。その後の継代では、全ての細胞が以下のように処理された。トリプシン処理後、生存可能な細胞をトリパンブルー染色後に計数した。簡潔には、５０マイクロリットルの細胞懸濁液を、５０マイクロリットルの０．０４％ｗ／ｖトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）と混合し、生存細胞数と血球計数器を用いて推定した。細胞はトリプシン処理し、添加物を含まないＤＭＥＭ：低グルコース培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で３回洗浄した。ヒト臍帯及び線維芽細胞（継代１１）の培養は、トリプシン処理し、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で２回洗浄した。
【０４７３】
移植手順として、異栄養性ＲＣＳラットをキシラジン−ケタミン（１ミリグラム／キログラム、以下の混合物：２．５ミリリットルのキシラジン（２０ミリグラム／ミリリットル）、５ミリリットルのケタミン（１００ミリグラム／ミリリットル）、及び０．５ミリリットルの蒸留水のｉ．ｐ．）で麻酔し、それらの頭をノーズバーによって固定した。血清を欠いた細胞は、２マイクロリットルのＬｅｉｂｏｖｉｔｚ，Ｌ−１５培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）において再懸濁（２ｘ１０^５細胞／注入）し、微細なガラスピペット（内径７５〜１５０ミクロン）を用いてトランス−強膜的に（ｔｒａｎｓ‐ｓｃｅｒａｌｌｙ）移植した。
【０４７４】
細胞は、麻酔された３週齢異栄養性色素性ＲＣＳラットの背側−側頭網膜下スペースへ供給した（総Ｎ＝１０／細胞タイプ）。細胞は右眼へ一側性に注入し、左眼は担体培養液のみを注入した（ニセコントロール：Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培養液）。残存移植細胞の生存率は、移植セッションの最後でのトリパンブルー排除によって評価されたように、９５％以上を保持していた。細胞注入を実行した後、動物には、移植後１０日間、デキサメタゾン（２ミリグラム／キログラム）を注入した。研究の期間の間、動物は、移植前２日目から研究が終わる時まで、経口シクロスポリンＡ（２１０ミリグラム／リットルの飲料水：結果生じる血中濃度：２５０〜３００マイクログラム／リットル）（ＢｅｄｆｏｒｄＬａｂｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、オハイオ州）を続けた。食物及び水は適宜利用可能にした。動物は、手術後６０或いは９０日で屠殺し、何匹かの動物は、細胞移植に伴う短期間変化での組織学的評価のためにより早い時期に屠殺した。
【０４７５】
ＥＲＧ記録：一晩の暗順応の後、動物は、以前に記載したように（３）、薄暗い赤色光の下でＥＲＧ記録のために調整した。簡潔には、麻酔（１５０ミリグラム／キログラム、ｉ．ｐ．ケタミン、及び１０ミリグラム／キログラムｉ．ｐ．キシラジンの混合物を用いて）下で、動物の頭を定位固定頭保持器を用いて固定し、体温を直腸温度計を通じてモニタリングし、恒温性毛布を用いて３８℃で維持した。瞳孔を、等量の局所的２．５％フェニレフリン及び１％トロピカミドを用いて拡張させた。０．７５％ブピバカインによる局所麻酔を、角膜反射を予防するために使用し、０．９％の生理食塩水の滴下を、脱水を防ぐために角膜へ頻繁に適用し、記録電極（金ワイヤーループ）との電気的接触を可能にするために適用した。２５−ゲージ注射針を、２つの目の間の頭皮の下へ挿入し、これは参考電極として働くものである。増幅（１〜１，０００Ｈｚブランドパス、Ｖ字型フィルタリングなし）、刺激提示、及びデータ獲得は、ＬＫＣＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）からのＵＴＡＳ−３０００システムによって提供される。ＥＲＧｓは、臍帯細胞群の６０〜９０日齢で、線維芽細胞においてのみ６０日で記録した。
【０４７６】
混合ａ−波及びｂ−波記録：暗順応ｂ−波の定量化のために、単一フラッシュ提示（１０マイクロ秒期間）から構成される記録を、３〜５回繰り返し、反応信頼度を変更し、信号対雑音比を必要であれば改善した。刺激は、−３．６〜１．４ｌｏｇｃａｎｄｉｌａ／ｍ^２まで変わる１つのｌｏｇユニットステップにおいて６つの増加した強度で提示した。桿体の潜在的な脱色を最小限にするために、最低刺激強度の１０秒から最高刺激強度の２分目まで刺激輝度が上昇するにつれて、内部刺激間隔を増加させた。最大ｂ−波振幅は、刺激強度は関係なく、フラッシュ強度系列から得られたように定義した。Ｎａｋａ−Ｒｕｓｈｔｏｎ曲線を用いたデータの補正からの真実Ｖ_ｍａｘは、異栄養性動物における輝度レベルが高くなるにつれてＥＲＧ反応がしばしば不安定になり、０．４及び１．４ｌｏｇｃａｎｄｉｌａ／ｍ^２周辺で反応が抑制される傾向を示すので、使用しなかった。ＥＲＧ構成要素が得られたか損失した年齢を決定するために、判定基準振幅：ａ‐波及びｂ−波に対しては２０マイクロボルト、及びＳＴＲ−様反応に対しては１０マイクロボルトを用いた。ｂ−波の振幅は、ａ‐波ネガティブピークからｂ−波ポジティブ尖までで測定し、ｂ−波尖部を超える周期的変動のピークまででは測定しなかった（４）。
【０４７７】
桿体及び錐体反応の分離：二倍フラッシュプロトコールは、桿体及び錐体反応の分離を決定するために用いた（５）。プローブフラッシュは、較正全体野を有するＵＴＡＳ−３０００システム（ＬＫＣＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、調整フラッシュの後１秒提示し、これは使用された条件下での刺激装置の完全な再充電を確実にするものである。この手順における調整フラッシュの役割は、桿体を一時的に飽和し、プローブフラッシュへ無応答性にするものである。桿体由来ｂ−波は、混合反応（プローブフラッシュのみの提示の後で得られる、すなわち調整フラッシュによって優先されない）から錐体由来反応を引くことによって得られた。
【０４７８】
機能的評価：生理学的網膜感受性テストは、薄暗い光に対する網膜反応を説明するために実行した。動物は、回復可能な量のウレタン（１．２５グラム／キログラム、ｉ．ｐ．）で麻酔した。動物における生理学的評価は、動物における移植後９０日で、それぞれの視覚受容体領域の照明に対する、上丘における多ユニット細胞外活性を記録することによってテストした（６）。この手順は、視野を覆った２０個の独立した点（視野における約１０〜１５０転位に一致した各ステップで２００ミリメートルの間隔をあけて）で繰り返した。視覚閾値は、バックグラウンドを越えた強度での増加として測定し、直径で光３°のスポットを有する上丘の表面２００ミクロンにおいて活性化ユニットを必要とされる０．０２ｃａｎｄｉｌａ／ｍ^２（発光ユニット）（桿体飽和以下で少なくとも２．６対数ユニット）で維持された。反応パラメーターは、移植された目、及び溶媒のみを受けたニセコントロール目の間で比較した。
【０４７９】
組織像：動物は、ウレタンを過剰投与（１２．５グラム／キログラム）することによって屠殺した。目の配向は、脱核する前に、上直筋を通って６．０縫合を置くことによって維持した。角膜切開を作った後、目は、０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の２．５％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒド、０．０１％ピクリン酸を用いて固定した。固定後、角膜及びレンズは、毛様体の周りを切ることによって除去した。上直筋の除去の前、配向の維持を補助するために、後網膜の末梢に小さな切れ目を作った。次に、網膜は、１％四酸化オスミウムで１時間、後固定した。アルコールからエポキシプロピレンへの連続による脱水の後、網膜はＴＡＡＢ包埋樹脂（ＴＡＡＢＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌｄｅｍａｒｓｔｏｎ、イギリス）に包埋した。セミ（半）薄切片は、１％ホウ酸緩衝液中の１％トルイジンブルーで染色し、ウルトラ（超）薄切片は、ウラニル酢酸及びリードクエン酸で対照させた。
【０４８０】
ニッスル（Ｎｉｓｓｌ）染色に対して、切片は、７０、９５、及び１００％での勾配アルコールに２回通すことで脱水した後、０．７５％クレシルバイオレット（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）で染色し、キシレン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）に放置し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）ですすぎ、カバーグラスをかぶせ、ＤＰＸ封入液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリー州）と共に載せた。
【０４８１】
結果
ＥＲＧ記録：臍帯由来細胞注入を受けた動物は、手術後６０日及び９０日で視覚反応特性の相対的保護を示した（表２５−１）。これらの動物で観察された反応は、線維芽細胞或いはニセ処理された動物で見られたものより大きかった。
【０４８２】
臍帯由来細胞移植した動物（ｎ＝６）では、６０日目でテストした全ての結果測定において：優れた改善を示した（表２５−１）：ａ−波（２７±１１）対ニセコントロール（０）、混合ｂ−波（１１７±６７）対ニセコントロール（１８±１３）、錐体−ｂ−波（５５±２５）対ニセコントロール（２８±１１）、及び桿体寄与（４９±１６％）対ニセコントロール（６±７％）。これらの結果は、視覚反応性は、光受容体救出という証拠によって、臍帯由来細胞移植された動物において改善されたことを示している。ＥＲＧに対する反応性の減少が９０日目のテスト動物において観察されたが、ニセ処理コントロールと比較して、視覚機能の保護は優れていた。
【０４８３】
臍帯由来細胞と比較して、線維芽細胞移植は、テストされたパラメーターにおける改善は見られなかった。
【０４８４】
【表３５】

【０４８５】
組織像：移植後、炎症性反応の組織学的証拠はなく、浸潤性免疫細胞は、分娩後細胞群のニッセル染色切片において観察されなかった。しかしながら、線維芽細胞移植は、動物の死を生じ（ｎ＝７）、初期段階炎症性反応を示していた。臍帯由来細胞を移植した動物における９０日目の時点での、光受容体の解剖学的救出は、組織学的に明らかに示されていた。内部核層とはギャップによって分けられている薄膜を形成する光受容体は、他の網膜細胞で構成されていた。比較によって、ニセコントロールにおける外側層の幅は、移植された目においては約５細胞厚であるのとは対照的に、よくても不連続な単層であった。正常動物との比較において、これは、正常に観察される光受容体細胞層の厚さのわずかに半分以上である。
【０４８６】
機能的評価：視覚損傷の予防における移植の効果は、２個体の動物において電気生理学的な反応性の評価によってモニタリングした。光に反応する閾値感受性は、ニセ注入されたコントロール目対臍帯由来細胞を移植された目における視野救出の領域を定義するために使用した。非異栄養性ラットにおいて、視覚閾値は、０．５ｌｏｇｃａｎｄｉｌａ／ｍ^２を超えなかった。非手術異栄養性ラットにおいて、前記閾値は、通常、４ｌｏｇｃａｎｄｉｌａ／ｍ^２ユニットの振幅である（８）。対照的に、非手術ニセ注入された異栄養性ラットにおいて、前記閾値は、順に、平均閾値４．０ｌｏｇｃａｎｄｉｌａ／ｍ^２ユニットを有する２．９〜４．９ｌｏｇｃａｎｄｉｌａ／ｍ^２ユニットであり、場合によっては、記録に到達できなかった。従って、ニセ注入されたラットは、側頭網膜において、高度に局在化した機能的救出を示した。しかしながら、ヒト臍帯由来細胞移植されたラットは、０．８〜２．１ｌｏｇｃａｎｄｉｌａ／ｍ^２ユニット（平均閾値は１．３ｌｏｇｃａｎｄｉｌａ／ｍ^２ユニット）の範囲の閾値を有する視覚保護のレベルは実質的に大きかった。
【０４８７】
要約：臍帯由来細胞の異栄養性ＲＣＳラットへの移植は、光受容体を保護できる。この変性モデルにおいて、ａ−波は３０〜６０日以内に消滅し、ｂ−波は３ヶ月以内に消滅することが予想される。従って、基本的に保持されたａ−波は、本物で正常な桿体機能が保護されたことを示していた。ｂ−波への桿体寄与は、異常桿体機能の可能性があることを示唆するものである。持続性非桿体ｂ−波は、錐体機能がどのくらい維持されているかを測定するものであり、視覚の本物の基準である。従って、臍帯由来細胞移植の後で、生理学的に及び解剖学的に評価された改善のレベルは、ここではよく定義されている。ＥＲＧ測定は、光受容体損失後の視覚機能の評価を提供し、これは網膜における電気活性の変化を意味している。しかしながら、ＥＲＧは、形成能力を画像化するような直接的な情報は提供しない。この研究において使用された丘閾値感受性の測定は、視野の相対的保護の指標を提供する。この測定の重要性は、機能的救出と解剖学的保護の量の間の相関性に基づいており、収集したデータは、ヒトにおけるテスト視野測定と比較するものである（９）。移植は、テスト動物における疾患の進行の遅延を示していた。従って、ここに示された結果は、ヒト臍帯由来細胞を網膜下スペースへ移植することの機能的有効性の明らかな証拠、及び光受容体の保護は移植された細胞が位置する一般的な領域に生じるという証拠を示していた。
【０４８８】
実施例２５の参考文献
１．Ｄ’ＣｒｕｚＰＭ，ＹａｓｕｍｕｒａＤ，ＷｅｉｒＪ，ＭａｔｔｈｅｓＭＴ，ＡｂｄｅｒｒａｈｉｍＨ，ＬａＶａｉｌＭＭ，ＶｏｌｌｒａｔｈＤ．ＭｕｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｇｅｎｅＭｅｒｔｋｉｎｔｈｅｒｅｔｉｎａｌｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃＲＣＳｒａｔ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ．２０００Ｍａｒ１；９（４）：６４５〜５１．
２．ＬｉＬＸ，ＴｕｒｎｅｒＪＥ．ＩｎｈｅｒｉｔｅｄｒｅｔｉｎａｌｄｙｓｔｒｏｐｈｙｉｎｔｈｅＲＣＳｒａｔ：ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｙｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＥｘｐＥｙｅＲｅｓ．１９８８Ｄｅｃ；４７（６）：９１１〜７．
３．Ｓａｕｖｅ，Ｙ，Ｌｕ，ＢａｎｄＬｕｎｄＲＤ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｆｕｌｌｆｉｅｌｄｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍａｎｄｐｅｒｉｍｅｔｒｙ−ｌｉｋｅｖｉｓｕａｌｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓｉｎＲＣＳｒａｔｓｄｕｒｉｎｇｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｒｅｓｃｕｅｂｙｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．ＶｉｓｉｏｎＲｅｓ．２００４Ｊａｎ；４４（１）：９〜１８．
４．Ｎｕｓｉｎｏｗｉｔｚ，Ｓ．，Ｒｉｄｄｅｒ，ＷＨ３ｒｄ，ａｎｄＨｅｃｋｏｎｌｉｖｅｌｙ，ＨＲ．Ｒｏｄｍｕｌｔｉｆｏｃａｌｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍｓｉｎｍｉｃｅ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ．１９９９Ｎｏｖ；４０（１２）：２８４８〜５８．
５．Ｎｉｘｏｎ，ＰＪ，Ｂｕｉ，ＰＶ，Ａｒｍｉｔａｇｅ，ＪＡ，ａｎｄＶｉｎｇｒｙｓＡＪ．Ｔｈｅｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｃｏｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｒａｔｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍｓ．ＣｌｉｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００１Ｊｕｎ；２９（３）：１９３〜６．
６．ＬｕｎｄＲＤ，ＡｄａｍｓｏｎＰ，ＳａｕｖｅＹ，ＫｅｅｇａｎＤＪ，ＧｉｒｍａｎＳＶ，ＷａｎｇＳ，ＷｉｎｔｏｎＨ，ＫａｎｕｇａＮ，ＫｗａｎＡＳ，ＢｅａｕｃｈｅｎｅＬ，ＺｅｒｂｉｂＡ，ＨｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎＬ，ＣｏｕｒａｕｄＰＯ，ＣｏｆｆｅｙＰ，ＧｒｅｅｎｗｏｏｄＪ．Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｈｕｍａｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓａｔｔｅｎｕａｔｅｓｌｏｓｓｏｆｖｉｓｕａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃｒａｔｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００１Ａｕｇ１４；９８（１７）：９９４２〜７．
７．ＳｉｍｉｎｏｆｆＲ，ＫｒｕｇｅｒＬ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｒｅｐｔｉｌｉａｎｃｕｔａｎｅｏｕｓｍｅｃｈａｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ．１９６８Ｍａｒ；２０（３）：４０３〜１４．
８．Ｂａｌｋｅｍａ，Ｇ．Ｗ．ａｎｄＤｒａｇｅｒ，Ｕ．Ｃ．１９９１．ＶｉｓｕａｌＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．６：５７７〜５８５．
９．ＢｅｃｋＲＷ，ＢｅｒｇｓｔｒｏｍＴＪ，ＬｉｃｈｔｅｒＰＲ．Ａｃｌｉｎｉｃａｌｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｖｉｓｕａｌｆｉｅｌｄｔｅｓｔｉｎｇｗｉｔｈａｎｅｗａｕｔｏｍａｔｅｄｐｅｒｉｍｅｔｅｒ，ｔｈｅＨｕｍｐｈｒｅｙＦｉｅｌｄＡｎａｌｙｚｅｒ，ａｎｄｔｈｅＧｏｌｄｍａｎｎｐｅｒｉｍｅｔｅｒ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．１９８５Ｊａｎ；９２（１）：７７〜８２．
【実施例２６】
【０４８９】
ＳＣＤＩマウスにおける移植に対する分娩後由来細胞の軟骨形成能力
臍帯或いは胎盤組織から由来した細胞の軟骨形成能力を、生体吸収性の成長因子添加足場上に播種し、ＳＣＩＤマウスに移植した後に評価した。
【０４９０】
材料と方法
試薬：ダルベッコ変法必須培養液（ＤＭＥＭ）、ペニシリン及びストレプトマイシンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）は、ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ユタ州）から購入した。間葉系幹細胞増殖培養液（ＭＳＣＧＭ）は、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅメリーランド州）から購入した。ＴＧＦベータ−３は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、カリフォルニア州）から購入した。ｒｈＧＤＦ−５Ｂｉｏｐｈａｒｍ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）から購入した（国際特許番号第ＷＯ９６／０１３１６Ａ１号公報、米国特許番号第５，９９４，０９４Ａ号）。軟骨細胞増殖培養液は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０ミリモルのＨＥＰＥＳ、０．１ミリモルの非必須アミノ酸、２０マイクログラム／ミリリットルのＬ−プロリン、５０マイクログラム／ミリリットルのアスコルビン酸、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、及び０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢを添加したＤＭＥＭ−高グルコースから成る。ウシフィブリノーゲンはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【０４９１】
細胞：ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ロット＃２Ｆ１６５６）は、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）から購入し、取り扱い説明書に従って、ＭＳＣＧＭにおいて培養した。このロットは、ｉｎｖｉｔｒｏ実験において以前研究室でテストされており、軟骨形成アッセイにおいて陽性であることが示されていた。ヒト成人線維芽細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）から入手し、成長培地においてゼラチンコーティングされた組織培養プラスチックフラスコ上で培養した。ヒト臍帯（ロット＃０２２７０３Ｕｍｂ）及び胎盤（ロット＃０７１００３Ｐｌａｃ）から単離された分娩後由来細胞は、以前に記載したように（実施例１）調整した。細胞は、成長培地においてゼラチンコーティングした培養プラスチックフラスコ上で培養した。前記細胞培養は、３７℃で５％ＣＯ_２によりインキュベートした。実験に使用した細胞は、継代５（"低継代"）及び１４（"高継代"）であった。
【０４９２】
足場（Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）：発泡体は、ポリジオキサノン（ＰＤＳ）メッシュで強化された、３５／６５ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＰＣＬ）／ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）（３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマー（ＰＧＡ／ＰＣＬ発泡体−ＰＤＳメッシュ）から成り、米国特許番号第６，３５５，６９９号に記載されたように、凍結乾燥の過程によって形成された。前記発泡体は、４ｃｍｘ５ｃｍで、１ｍｍ厚である。発泡体は、エチレンオキシド（ＥＴＯ）で処理することによって無菌化した。足場に作られたパンチ（穿孔）（３．５ミリメートル）には、ｒｈＧＤＦ−５（３．４マイクログラム／足場）、ＴＧＦベータ−３（１０ナノグラム／足場）、ｒｈＧＤＦ−５及びＴＧＦベータ−３の組み合わせ、或いはコントロール培養液を添加し、凍結乾燥させた。
【０４９３】
足場上に播種した細胞：胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞は、トリプシンで処理し、細胞数及び生存率を決定した。７．５ｘ１０^５細胞は、１５マイクロリットルの成長培地に再懸濁し、細胞培養ディッシュにおいて３．５ミリリットル足場パンチへ播種した。細胞を播種した足場は、軟骨外移植リング内に配置した後、細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）で２時間、インキュベートした。
【０４９４】
ウシ軟骨外移植片：直径５ミリメートルの軟骨外移植片は、若いウシ肩から得られる軟骨から生成した。パンチ（３ミリメートル）は、外移植片の中心から切除し、３．５ミリメートルの吸収性足場上に播種した細胞と共に配置した。細胞を有する足場は、フィブリングルー（６０マイクロリットルのウシフィブリノーゲン、３ミリグラム／ミリリットル）を用いて外移植片内に保持させた。サンプルは、軟骨細胞増殖培養液において一晩維持し、１日後リン酸緩衝生理食塩水ですすぎ、ＳＣＩＤマウスへ移植した。
【０４９５】
動物：ＳＣＩＤマウス（（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）／ＦｏｘＣｈａｓｅＳＣＩＤ／雄）５週齢は、ＨａｒｌａｎＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）及びＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｏｒｔａｇｅ、ミシガン州）から購入した。この研究で使用された動物は、明らかな系統的なバイアスなしで選択した。それぞれ個々の動物ケージ上にタグを置き、ここにはアクセッション番号、移植技術、動物数、種／系統、手術日、ｉｎｖｉｖｏ期間、及び安楽死の日が記載されている。前記動物は、消し難いインクマーカーを用いて耳に示したシリアル番号によって特定する。
【０４９６】
実験設計：合計４２匹のマウスでテストした。２つの足場は、以下に記載したように、各マウスにおいて皮下的に移植した；皮下的移植の４２匹のマウス；１処理当たり３つのｎ−値を有する２８処理。この研究は、ＩＡＣＵＣ許可番号：ＳｋｉｌｌｍａｎＩＡＣＵＣ０１−０３７と一致する。この研究は６週間続けた。
【０４９７】
ＳＣＩＤ移植
Ａ．体重
各動物は、麻酔をする前と、剖検時に体重測定をした。
【０４９８】
Ｂ．麻酔及び手術準備
前記ＳＣＩＤマウスのすべての取扱いは、フード下で行った。前記マウスは、個々に体重測定し、ＫＥＴＡＳＥＴ（登録商標）（ケタミン塩酸塩（６０ミリグラム／キログラム））、ＲＯＭＰＵＮ（登録商標）（キシラジン（１０ミリグラム／キログラム））、及び生理食塩水の混合物を腹腔内に注入することによって麻酔した。
【０４９９】
麻酔の誘導後、前記背側頚部から前記背側腰仙部への前記動物の背部全体において、動物用電気大ばさみで体毛が刈り込まれた。前記部位は、二酢酸クロルヘキシジンで洗浄し、アルコールで洗い流し、乾燥させ、１％の利用可能なヨウ素溶液のヨードフォア溶液を塗布した。眼に眼軟膏を適用し、麻酔期間中の組織の乾燥を予防した。麻酔され外科的に調整された動物は、好ましい横臥ポジションに置いた。
【０５００】
Ｃ．皮下移植法：約２センチメートルの皮膚切開を、脊柱に平行して胸椎に対する側面に作成した。皮膚は、下にある結合性組織から鈍的切開を解して分離した。各ＳＣＩＤマウスは、１つの皮膚切開を通って各半胸部における鈍的切開によって作られた皮下ポケットに置かれた２つの処理を受けた（表２６−１）。５−０ＥＴＨＩＢＯＮＤＥＸＣＥＬ（ポリエステル）（ＥｔｈｉｃｏｎＩｎｃ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ニュージャージー州）による仮縫い縫合は、各足場周辺の筋系へ皮膚を仮縫いするために使用し、皮下転位を予防した。足場は、６週間移植し、回収した。実験設計は、表２６−１に概説した。
【０５０１】
【表３６】

【０５０２】
Ｄ．安楽死及び組織学的調整
肉眼実験は、一連の研究の間に死んだ、或いは瀕死条件において安楽死させたそれぞれの動物に実行した。選択した組織は、研究指導者及び／若しくは病理学者の判断で保存した。
【０５０３】
マウスは、ＣＯ_２を吸入させることで、指定された間隔で安楽死させた。移植部位の肉眼観察を記録した。覆っている皮膚の皮下移植部位のサンプルは、切除し、１０％緩衝ホルマリンで固定した。各移植は、半分に二分し、半分は、パラフィン包埋、切片化、及びマトキシリン&エオシン（Ｈ&Ｅ）及びサフラニンＯ（ＳＯ）染色のために、ＭＰＩＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｍａｔｔａｗａｎ、ミシガン州）へ送付した。
【０５０４】
結果
新しい軟骨及び骨形成は、成長因子を添加し細胞を播種した足場、細胞を播種したコントロール足場、及び成長因子のみを添加した足場を含むサンプルの大部分で観察された。新しい軟骨及び骨形成の程度は、処理及びコントロール群内で変わった。
【０５０５】
足場に播種された初期及び後期継代の胎盤由来細胞は、足場内に新しい軟骨及び骨形成を示した。異なる成長因子を添加し細胞を播種した足場と、細胞のみを播種した足場との間で、新しい軟骨及び骨形成における明らかな違いは観察されなかった。コントロール足場（成長因子なし及び細胞なし）と比較して、成長因子を有する及び有さない、細胞を播種した足場において、及び生長因子が添加された足場単独において、新しい軟骨形成の程度は、より大きいように見えた。胎盤由来細胞を播種した足場での新しい軟骨形成は、ＭＳＣを播種した足場、及び線維芽細胞を播種した足場と類似していた。
【０５０６】
初期及び後期継代の臍帯由来細胞を播種した、成長因子処理及びコントロール足場において、新しい軟骨及び骨形成が観察された。軟骨形成の程度は、胎盤由来細胞で見られた程度より少ないように見られた。胎盤由来細胞で見られたような大規模な軟骨形成は、どのサンプルにおいても見られなかった。骨形成は、ＴＧＦベータ−３及びｒｈＧＤＦ−５の両方を含有する足場上に臍帯由来細胞を播種した足場においてより高く現れた。
【０５０７】
ｈＭＳＣを添加した足場も、新しい軟骨及び骨形成を示した。新しい軟骨及び骨形成の程度は、全てのｈＭＳＣ処理群と類似していた。ヒト成人線維芽細胞を播種した足場でも、新しい軟骨及び骨形成が観察された。結果は、胎盤由来細胞及びｈＭＳＣで得られたものと類似していた。
【０５０８】
成長因子を添加した足場、或いは足場のみが軟骨リング内に置かれ、移植されたコントロール群においても、新しい軟骨及び骨形成が観察された。予想通り、新しい軟骨形成の程度は、成長因子を含む足場においての方が、成長因子を含まない足場より大きかった。骨形成の増加は、テストされた２つの成長因子の組み合わせを含むコントロールにおいて見られた。
【０５０９】
新しい軟骨形成は、足場内と同様に、軟骨外移植片リングの隣接部でも観察された。軟骨リングに隣接した足場内の新しい軟骨形成は、軟骨細胞の遊走の結果である可能性がある。足場内の島として見られた軟骨形成は、及び播種した細胞が分化する、若しくは内在性マウス前駆細胞が分化して、足場内で軟骨細胞が遊走した結果である可能性がある。この観察は、コントロールの播種された細胞を有さない成長因子を添加した足場において、軟骨形成文化の島が観察された事実に基づいている。新しい骨形成は、独立して足場内に観察され、軟骨細胞にも関連していた。骨形成は、骨芽細胞分化、及び軟骨内骨化から生じている可能性がある。
【０５１０】
遊走した軟骨細胞、対（ｖｅｒｓｕｓ）播種した細胞の軟骨形成及び骨芽細胞分化から生じた軟骨細胞に関して、新しい軟骨及び骨形成を分離するのは困難である。特異的なヒト抗体で切片を染色すると、観察された軟骨形成及び骨芽細胞形勢への播種された細胞の寄与を区別することができる。胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞が軟骨細胞遊走を刺激することも可能である。
【０５１１】
大量な新しい血管は、胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞と添加された足場で観察された。血管は、骨形成の領域では豊富にある。新しい血管は、新しい骨形成と関連して、ｈＭＳＣを播種した足場、及び線維芽細胞を播種した足場内でも観察された。
【０５１２】
コントロール足場（ＧＦなし、細胞なし）と比べた隣接足場（成長因子（ＧＦ）あり）の新しい軟骨及び骨形成の促進に対する全身性効果は、考慮からはずすことはできない。ＳＣＩＤマウスにおいてそれに隣接して移植された足場を考慮に入れると、足場内の新しい軟骨及び骨形成の分析によって、隣接した足場からの成長因子の全身性効果の明らかなパターンは見られなかった。
【０５１３】
要約：結果は、新しい軟骨及び骨形成が、胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞を播種した、成長因子及びコントロール足場において観察されたことを示していた。胎盤由来細胞での結果は、ヒト間葉系幹細胞で観察されたものと類似していたが、新しい軟骨様組織形成の程度は、臍帯由来細胞において宣告されたものよりわずかに少なかった。細胞なしで移植された成長因子を添加した足場でも、新しい軟骨及び骨形成を示した。これらのデータは、足場内での新しい軟骨形成は、ウシ外移植片から遊走した軟骨細胞から、内在性前駆細胞の軟骨形成分化から、及び播種した細胞の軟骨形成分化から生じる可能性はあることを示唆していた。
【０５１４】
これらの結果は、胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞が、軟骨形成及び骨芽細胞形成分化を受けることを示唆していた。これらの結果は、胎盤由来細胞及び臍帯由来細胞は、軟骨外移植片から足場への軟骨細胞の遊走を促進することも示唆していた。大量な新しい血管も、足場内、特に新しい骨形成に関連した足場で観察された。
【０５１５】
臍帯由来細胞及び培養の生物学的寄託：本明細書で提供された詳細な説明及び記載された実施例と一致して、本発明の臍帯由来細胞の実施例は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）に、２００４年６月１０日に寄託され、以下のＡＴＣＣアクセッション番号を割り当てられた：（１）系統命名ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）は、アクセッション番号ＰＴＡ−６０６７；及び（２）系統命名ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）は、アクセッション番号ＰＴＡ−６０６８である。
【０５１６】
本発明は特に現在の好適な実施例を参照して示し、説明したが、本発明は、特に開示され、例示した実施例に限定しないということが理解されるものである。本発明の好適な実施例には多数の変更と修正を行うことができ、そのような変更と修正は、添付の請求項に示された本発明の範囲と要旨から離れることなしに行われるものである。

Claims

実質的に血液を含まないヒト臍帯組織から単離した臍帯組織の均一細胞集団であって、この細胞集団は、培養において自己複製及び増殖することができ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有し、少なくとも４０継代可能であり、更に以下の、
（ａ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれを発現し、
（ｂ）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの何れも発現せず、更に
（ｃ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、或いは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン−８、レチキュロン１、及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３の発現が増加している、
の特徴を有する、細胞集団。
請求項１記載の単離臍帯血組織細胞集団において、更に、以下の、
（ａ）継代した場合に正常核型を維持し、
（ｂ）ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１の各因子を分泌し、
（ｃ）ＳＤＦ−１アルファ、ＴＧＦ−ベータ２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ａ、及びＶＥＧＦのいずれかの因子を分泌しない
という特徴の１若しくはそれ以上を有するものである、細胞集団。
請求項１記載の単離臍帯血組織細胞集団において、この細胞集団は、増殖にＬ−バリンを必要とするものである、細胞集団。
請求項１〜３のいずれか１つに記載の単離臍帯血組織細胞集団において、前記単離細胞集団は、実質的に血液を含まない哺乳類臍帯組織をディスパーゼ、又はディスパーゼとヒアルロニダーゼ及びコラゲナーゼの少なくとも１つと接触させることにより得られるものであり、前記単離細胞集団は、新生児細胞、肝細胞、含脂肪細胞、膵臓ベータ細胞、軟骨細胞、及び心筋細胞から選択される種類への分化を示すマーカーを発現した細胞に分化することができるものである、細胞集団。
請求項１〜３のいずれか１つに記載の単離臍帯血組織細胞集団において、前記細胞集団は、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、粘膜溶解酵素を有する１若しくはそれ以上の酵素活性の存在下で単離されたものである、細胞集団。
請求項５記載の単離臍帯血組織細胞集団において、前記細胞集団は、コラゲナーゼ、及び１若しくはそれ以上のディスパーゼ及びサーモリシンの存在下において単離されるものである、細胞集団。
請求項５記載の単離臍帯血組織細胞集団において、前記細胞集団は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍからのコラゲナーゼ及びディスパーゼの存在下において単離されるものである、細胞集団。
請求項６記載の単離臍帯血組織細胞集団において、更に、ヒアルロニダーゼの存在下において単離されるものである、細胞集団。
請求項１記載の単離臍帯血組織細胞集団において、この細胞集団は、約２％〜約１５％の添加された血清の存在下、ベータ−メルカプトエタノールの存在下又は非存在下、及びＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＬＩＦを含む成長因子添加又は無添加において、増殖するものである、細胞集団。
請求項１〜４のいずれか記載の単離臍帯血組織細胞集団を含む細胞培養物。
請求項１０記載の細胞培養物であって、同種異型のＰＢＭＣｓを実質的に刺激しないものである、細胞培養物。
請求項１０又は１１のいずれか記載の細胞培養物であって、この細胞培養物は、混合リンパ球の反応における同種異型対照と比較して、インビトロにてリンパ球が介在する反応を実質的に刺激しないものである、細胞培養物。
請求項１２記載の細胞培養物であって、さらに、薬学的許容可能な担体、別の細胞培養、抗アポトーシス化合物、抗血栓化合物、抗炎症化合物、免疫抑制化合物、免疫調節化合物、血管新生因子、及び神経栄養因子の１若しくはそれ以上を含むものである、細胞培養物。
請求項１〜４のいずれか１つに記載の臍帯組織細胞集団を得るための生体外の方法であって、
（ａ）単離臍帯組織を入手する工程と、
（ｂ）実質的に血液を含まない臍帯組織を得るために、実質的に全ての血液を前記単離臍帯組織から除去する工程と、
（ｃ）機械的且つ酵素的処理によって、前記組織を解離する工程と、
（ｄ）前記組織を培養液に再懸濁する工程と、
（ｅ）培養において自己複製及び増殖することができ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する臍帯由来細胞の増殖を可能にする、増殖条件を提供する工程であって、これにより、請求項１〜４記載の臍帯組織細胞集団を得るものである、前記提供する工程と
を有し、前記酵素的処理は、（１）中性プロテアーゼによる処理、（２）中性プロテアーゼ及びメタロプロテアーゼによる処理、（３）中性プロテアーゼ及びヒアルロニダーゼによる処理、（４）メタロプロテアーゼ及びヒアルロニダーゼによる処理、又は（５）中性プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ及びヒアルロニダーゼによる処理である、方法。
請求項１４に記載の方法において、
前記解離する工程における酵素的処理は、ディスパーゼによる処理を有するものである、方法。
請求項１４記載の方法において、前記解離する工程における酵素的処理は、コラゲナーゼ及びディスパーゼによる処理を有するものであり、且つ選択的に更にヒアルロニダーゼを含むものである、方法。
請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法において、前記解離する工程は、約３７℃でインキュベートする工程を有するものである、方法。
請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法において、前記方法によって得られた臍帯組織細胞集団は、約２％〜約１５％の胎児ウシ血清の存在下で、ベータ−メルカプトエタノールの存在或いは非存在下で、及びＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、及びＬＩＦを含む１若しくはそれ以上の添加された増殖因子の存在或いは非存在下で増殖するものである、方法。
請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法において、前記除去する工程は、洗浄、吸引、ブロッティング、遠心分離、或いは酵素的除去の１若しくはそれ以上によって、遊離或いは凝固した血液の除去を有するものである、方法。
請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法において、前記解離する工程は、無菌的に達成されるものである、方法。
請求項１４、１５、及び２０のいずれかに記載の方法において、前記解離する工程における機械的処理は、刻む、混ぜる、粉砕する、ホモジナイズする、或いは粉砕する１若しくはそれ以上を有するものである、方法。
請求項１〜４のいずれかに記載の単離臍帯組織細胞集団を有する、３次元マトリックス。
請求項２２記載の３次元マトリックスにおいて、前記マトリックスは、生体適合性或いは生体吸収性ポリマーを有するものである、マトリックス。
請求項２３記載の３次元マトリックスにおいて、前記マトリックスは、Ｖｉｃｒｙｌ（登録商標）マトリックス、ＰＣＬ／ＰＧＡコポリマー、或いは自己集合性ペプチドを有するものである、マトリックス。
請求項２２記載のマトリックスを有する、移植可能な組織構造体。
請求項１０記載の細胞培養物を有する、移植可能な装置。
請求項１〜４のいずれかに記載の単離臍帯組織細胞集団を有する、移植可能なヒト組織マトリックス。
請求項１〜４のいずれかに記載の単離臍帯組織細胞集団を有する、注入可能な細胞組成物。
請求項２８記載の注入可能な細胞組成物において、前記単離臍帯組織細胞集団は、組織因子を不活性化するように処理されるものである、細胞組成物。