KR101077760B1 - 인간 제대의 워튼 젤리로부터의 전구세포 - Google Patents

Abstract

인간 전구세포는 인간 제대의 혈관주위계 대역 내에 위치하는 워튼 젤리로부터 추출된다. 전구세포 군집은 급속하게 증식하고, 골전구세포 및 MHC-/- 세포 모두로 증식될 것이며, 골을 비롯한 인간 조직의 성장 및 회복에 유용하다.

전구세포, 제대, 혈관주위 대역, 워튼 젤리, 골전구세포, MHC

Description

인간 제대의 워튼 젤리로부터의 전구세포 {PROGENITOR CELLS FROM WHARTON'S JELLY OF HUMAN UMBILICAL CORD}

본 발명은 제대 (UC; umbilical cord)의 결합 조직으로부터 급속하게 증식하는 인간 세포 군집의 수확; 골원성 또는 골형성 조건에서의 이러한 세포의 배양; 세포 표면 조직적합 항원의 그의 부족에 의해 나타나는 바와 같이 면역학적으로 부적격인 이들 군집 내에서의 세포의 높은 백분율의 입증; 및 각종 세포-기재 치료법에 대한 세포의 공급원으로서 사용될 이들 세포의 능력에 초점이 있다.

UC는 추후의 장배형성 (3개의 배아 배엽층의 형성)을 구성하는 제1 구조 중 하나이다. 폴딩이 시작될 때, 배아 원반이 원시 중간장관 (배아 기원)에 의해 제혈관를 형성하기 위해 다시 발생하는 난황 및 요막 혈관을 통해 원시 난황난 (외부-배아 기원)으로 연결된다 [Pereda, 2002 50/id] [Tuchmann-Duplessis, 1972 77/id] [Tuchmann-Duplessis, 1972 77/id] [Haynesworth, 1998 51/id]. 이들 혈관은 워튼 젤리 (WJ; Whaton's Jelly)라는 최초 외부-배아 유도의 원시 중간엽 조직으로 일반적으로 고려되는 것 내에 지지되고, 그에 의해 둘러싸여진다 [Weiss, 1983 80/id]. 이 초기 단계로부터, 임신 동안 UC는 성장하여 출생때 보여지는 30-50 cm 제대가 된다. 따라서, WJ가 섬유모세포-유사, 또는 문헌 (하기 참조)에 기 재된 근육-섬유모세포-유사 세포 뿐만 아니라 배아 및 태아 발생 동안 제대의 성장을 지지하기 위해 필요한 WJ의 확장 부피의 세포를 유발할 수 있는 전구세포의 군집을 함유한다는 것이 예상될 수 있다.

WJ는 그의 논문 아데노그라피아 [Adenographia in 1656]에 공개한 토마스 워튼 (Thomas Wharton)에 의해 처음 기재되었다. 차후에, 히알루론산을 비롯한 프로테오글리칸스 [Schoenberg, 1960 81/id], 및 상이한 유형의 콜라겐 [Nanaev et al., 1997]으로 이루어진 무정형 기저 물질에 분산된 세포를 구성하는 젤라틴성의 느슨한 점액질 결합 조직으로서 정의되었다. 매트릭스에 분산된 세포는 붕괴된 제대의 모양에서 방사상이고, 팽창한 제대에서는 길게 늘어나는 "섬유모세포-유사"로서 기재되어 있다 [Parry, 1970]. 평활근 세포가 초기에 매트릭스 내에서 관찰되지만 [Chacko and Reynolds, 1954], 이는 이들을 외면상으로 평활근 세포를 닮은 다소 "비정상인 섬유모세포"로서 기재한 파리 [Parry, 1970]에 의해 이의가 제기되었다. 이후에, 타케치 등 [Takechi et al. (1993)]이 이들 세포 상에서 면역조직화학 조사를 수행한 1993년까지 이들 세포를 특징화하는 작업이 거이 없었다. 이들은 "무정형 기저 물질에서의 콜라겐 섬유의 장기간 세포질 프로세스 및 불안정한 네트워크를 갖는 방추형 또는 방사형"인 "섬유모세포-유사"와 같은 세포를 기재하고 있다 [Takechi et al., 1993]. 면역조직화학 염색의 경우, 이들은 미오신의 유형들이 WJ 섬유모세포와 회합하는 것을 측정하기 위해 액틴 및 미오신 (세포질 수축성 단백질), 비멘틴 (배아 중간엽 기원의 섬유모세포의 특징) 및 데스민 (근육원성 기원의 세포에 특이적임)에 대한 1차 항체를 사용하였다. 이들은 고수준의 화 학적으로 추출가능한 액토미오신을 관찰하였고; 섬유모세포가 세포질 액토미오신을 함유하지만, 이들은 액틴 또는 미오신에 대해 염색되지 않은 반면, WJ 섬유모세포는 모두에 대해 양성으로 염색되었다. 또한, 비멘틴 및 데스민 모두에 대한 양성 염색이 관찰되었으며, 이는 WJ 중의 이들 개질된 섬유모세포가 원시 중간엽 조직으로부터 유도되었다는 결론을 유도하였다 [Takechi et al., 1993]. 차후에, 더 최근 연구 [Nanaev et al. (1997)]는 조산 제대에서의 중간엽 전구세포 증식의 분화의 5 단계를 입증하였다. 그의 발견은 근섬유모세포가 WJ 매트릭스 내에 존재한다는 제안을 지지하였다. WJ 세포의 면역조직화학 특성은 골 형태형성에서 골원성 세포의 주요 공급원으로 공지되고, 배양액에서 콜로니 형성 단위-골모세포 (CFU-O) [Aubin, 1998]로서 참조된 골 결절을 또한 형성할 수 있는 혈관주위세포의 특성과 두드러진 유사성을 나타낸다 [Canfield et al., 2000].

최근 공개문헌에는 UC 혈액보다는 UC로부터 세포를 수확하는 방법이 보고되어 있다. 미트첼 등 [Mitchell et al., 2003]은 제혈관을 먼저 절단하여 제거하고 잔존 조직을 수확하는 방법을 기술하고 있다. 잔존 WJ (제혈관이 WJ에서 완전히 외피형성되기 때문에 이들 중 일부는 혈관을 제거할 것임) 및 양막 상피 모두를 포함할 잔존 조직은 이어서 주사위꼴로 절단되어 조직 배양 플레이트로 옮겨지는 소조직 단편을 생산한다. 이들 조직 단편은 세포가 배양 하층 상으로 이동하는 1차 이식편으로서 이어서 사용된다.

또다른 공개문헌에서, 로마노브 등 [Romanov et al., 2003]은 이들이 중간엽 줄기 세포-유사 세포를 제대 혈관계로부터 단리하는 데 성공적이었다는 것을 나타 내지만, 이들은 또한 그의 배양액이 WJ로부터의 세포를 함유하지 않다는 것을 나타낸다. 구체적으로는, 이들은 혈관 내피 및 하위-내피 세포의 혼합 군집을 수득하는 제정맥 내로부터의 단일 15 분 콜라게나제 절단을 사용한다. 로마노브 등은 희박한 수의 섬유모세포-유사 세포가 7일 후에 이 세포 수확물로부터 나타난다는 것을 관찰하였다.

또한, 미국 특허 제5,919,702호에는 인간 UC의 WJ로부터 "전-연골세포"를 단리하는 방법, 및 연골을 생산하기 위한 그의 용도가 기재되어 있다. 특히, 상기 방법은 제대의 1인치 구획을 세로로 절편 개방하는 것, 혈관을 해부해내는 것 및 WJ를 이이서 제거하고, 배양을 위해 2-3 ㎣ 구획 내로 절단한 멸균 컨테이너 내로 WJ를 수집하는 '케이싱 (casing)'을 포함한다. 바람직한 방법에서, 세포는 유리 슬라이드 상의 WJ의 2-3 ㎣ 구획을 페트리 디쉬의 바닥 상에 두고, 그를 또다른 슬라이드로 덮고, '전-연골세포'를 배양 디쉬 표면으로 이동시키기 위해 그를 10-12 일 동안 배양함으로써 단리된다.

본 발명의 목적은 인간 전구세포를 포함하는 세포 군집을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 인간 전구세포를 추출할 수 있는 공급원을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 인간 전구세포의 단리 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 골 조직 생산에 유용한 인간 골전구세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 치료적으로 유용한 인간 면역-부적격 전구세포를 제 공하는 것이다.

<발명의 요약>

본 발명에 이르러 급속한 증식, 골전구세포의 존재, 및 주요 조직적합 마커 (인간 백혈구 항원 (HLA) 이중 음성) 중 어느 하나에서도 나타나지 않는 면역-부적격 세포를 비롯한 기타 인간 전구세포의 존재에 의해 특성화되는 특이한 세포 군집을 수득하는 인간 제대의 워튼 젤리로부터 세포를 추출하는 방법을 고안하였다. 상기 세포 군집은 골 및 다른 결합 조직을 성장시키고, 치료 목적을 위한 환자로의 전구세포의 자율 및 동종이형 전달을 위한 전구세포의 유용한 공급원이다.

더욱 특히, 본 발명의 한 측면에 따라, 인간 전구세포를 포함하고, 인간 제대의 혈관계에 인접한, 유용하게는 혈관주위 대역 (perivascular zone)으로 명명된 영역에서의 워튼 젤리의 효소 절단에 의해 수득되는 워튼 젤리 추출물을 제공한다. 추출 과정은 적합하게 제대 혈액의 세포, UC의 상피 세포 또는 내피 세포 및 제대의 혈관계로부터 유래된 세포를 실질적으로 함유하지 않는 추출물을 유도하며, 여기서 혈관계는 세동맥 또는 정맥 혈관의 내막, 매질 및 외막으로서 정의된다.

그의 또다른 측면에 따라, 본 발명은 세포를 본 발명에 따라 수득한 워튼 추출물로부터 단리하는 단계를 포함하는, 인간 전구세포를 수득하는 방법을 제공한다.

관련 측면에서, 본 발명은 워튼 젤리 추출물에 존재하는 세포를 배양하여 수득한 세포 군집을 제공한다. 일 실시양태에서, 골전구세포의 군집을 제공한다. 다른 실시양태에서, 면역-부적격 전구세포의 군집을 제공한다.

또한, 본 발명에 따라 골 세포로의 분화에 대한 요구가 없는 경우에 보충물 부재하에 배양할 때 골 세포로의 분화하는 특성에 의해 특성화되는 수임 골전구세포의 군집을 제공한다.

그의 또다른 측면에서, 본 발명은 워튼 젤리 추출물로부터 수득한 세포를, 이들 세포를 목적하는 결합 조직 표현형으로 분화하는 데 기여하는 조건으로 처리하는 단계를 포함하는 결합 조직 및 특히 골 조직의 생산 방법을 제공한다. 이 점에 있어서, 본 발명은 추가로 의학적 상태, 질환 및 질병의 세포 이식-매개 처치를 비롯한 세포-기재 치료법에서의 이러한 세포의 용도를 제공한다.

본 발명의 이들 및 다른 측면은 첨부된 도면을 참조하여 하기와 같이 상세하게 기술한다:

도 1은 인간 UC에서 나타난 조직의 3개의 개별적 대역을 나타내는 광학 현미경사진이다;

도 2는 콜라게나제 용액에서의 루프형 혈관의 대표적 도해이다;

도 3은 폴리스티렌 조직 배양 표면에 부착된 WJ로부터 단리된 세포의 광학 현미경사진이다;

도 4는 CFU-O의 초기 형성을 나타내는 광학 현미경사진이다;

도 5는 성숙 CFU-O를 나타내는 광학 현미경사진이다;

도 6은 UV 형광 하에 35 mm 폴리스티렌 조직 배양 디쉬 상의 테트라시클린-표지 CFU-O를 나타낸다;

도 7은 동일한 테트라시클린-표지 CFU-O의 위상차 광학 현미경사진 및 형광 현미경사진을 나란히 도시한다;

도 8은 조직 배양 폴리스티렌 표면 상의 성숙 CFU-O의 주사 전자 현미경사진이다;

도 9는 기저 매트릭스를 노출시키는 CFU-O의 횡단의 주사 전자 현미경사진이다;

도 10은 CFU-O의 도드라진 가장자리 상에 위치한 낮게 무기질화된 콜라겐 섬유의 주사 전자 현미경사진이다;

도 11은 골원성 세포를 분화시킴으로써 폴리스티렌 경계면 상에 놓인 비-콜라겐성 매트릭스 (소구체로서 나타남)의 주사 전자 현미경사진이다;

도 12는 성숙 CFU-O의 중심을 포함하는 높게 무기질화된 콜라겐의 주사 전자 현미경사진이다;

도 13은 WJ-유래 세포가 77.4％의 MHC I 및 MHC II 음성인 것을 나타내는 유세포측정 데이타를 나타낸다;

도 14는 포착되는 상기 세포 (골세포) 내의 콜라겐의 분포 및 일부가 동화된 세포외 매트릭스에 의해 둘러싸여진 말초 세포의 다층화를 나타내는 골 결절의 마손 (Masson) 트리콤-염색 횡단 구획의 흑백 복사물이다;

도 15는 수임된 골전구세포 아군집 및 총 골전구세포 아군집의 증식과 관련된 점착성 혈관주위 WJ 군집의 잠재적 증식을 나타낸다;

도 16은 0-24 시간의 지체기, 24-72 시간의 대수증식기, 및 72-120 시간의 고조기를 갖는 정상 성장 곡선을 나타내는 0-144 시간의 혈관주위 WJ 세포 증식을 나타낸다. 전체 배양 기간 동안의 배가 시간은 24 시간인 반면, 대수증식기 동안의 배가 시간은 16 시간이다;

도 17은 5회 계대배양에 걸쳐 나타난 WJ 세포의 주요 조직적합 복합체 (MHC) 발현, 동결-해동으로 인한 그의 발현의 변화, 및 재배양으로 인한 차후 발현을 나타낸다.

본 발명은 골전구세포를 비롯한 인간 전구세포 뿐만 아니라 면역-부적격 세포를 포함하는 급속한 증식 세포 군집의 공급원으로서 워튼 젤리 (WJ)의 추출물을 제공한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "전구세포"는 조절 및(또는) 정의된 조건하에 주어진 표현형의 세포로 분화할 세포를 나타낸다. 따라서, 골전구세포는 골모세포 계통으로 수임되어, 이러한 수임 및 분화를 위해 확립된 조건하에 배양하는 경우에 최종적으로 골조직을 형성할 전구세포이다. "면역-부적격"인 전구세포는 클래스 I 및 클래스 II 주요 조직적합 복합체 (MHC)와 회합된 표면 항원에 대해 음성인 표현형을 갖는 세포이다. 예컨대, 전구세포를 HLA 이중 음성으로서도 본원에서 나타낸다.

WJ로부터 추출된 세포 군집은 또한 추출된 세포가 전구세포 증식에 대해 표준인 조건하에 다른 공지된 전구세포 군집에 상대적으로 성장할 속도를 나타내는 "급속한 증식"에 의해 특성화된다. 본원에 나타낸 실험 결과로부터 인식될 바와 같이, 더불어 도 16에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 전구세포 군집은 적어도 약 25 시간 내에 및 15 시간 만큼 빨리 배가되어서 다른 공지된 골전구세포 군집 및 WJ로부터 추출한 다른 전구세포 군집보다 더 신속하게 증식될 수 있다.

본 발명의 세포 및 세포 군집은 인간 제대의 WJ로부터의 추출에 의해 수득될 수 있다. 선행 기술과는 달리, 본 발명에 따르면, 이러한 세포는 탯줄 혈관계의 외부 벽과 회합된, 즉 그에 인접한 WJ로부터 추출된다. 제대 혈관계의 외부 표면과 회합하거나 매우 인접한 워튼 젤리는 혈관주위 대역이라는 영역 내에 있고, 예를 들어 제대로부터의 워튼 젤리의 추출, 또는 제대 및 회합된 워튼 젤리로부터의 혈관의 추출 중 하나를 실행하기 때문에, 혈관이 제대로부터 절개되는 경우 워튼 젤리는 전형적으로 혈관계와 회합된 채 남아 있다. 전형적으로 선행 기술 실행에서 제거되는 이 혈관주위 대역 내의 워튼 젤리가 본원에 기재된 특징을 갖는 전구세포의 풍부한 공급원이라는 것을 놀랍게도 발견하였다. 따라서, 본 발명은 유용한 인간 전구세포에 대한 공급원으로서 이 혈관주위 대역으로부터 워튼 젤리를 개발한다.

인간 제대로부터 이러한 워튼 젤리를 추출하기 위해, 바람직한 실시양태에서, 추출 프로세스 동안 제대 혈액의 세포, UC의 상피 세포 또는 내피 세포 및 제대의 혈관계로부터 유래된 세포의 추출을 막기 위해 주의하며, 여기서 혈관계는 동맥 또는 정맥 혈관의 내막, 매질 및 외막으로서 정의된다. 이들 원치않는 세포를 실질적으로 함유하는 않는 추출물을 수득하는 것은 절개 전에 제대를 조심스럽게 플러싱하고 세척한 후에, 제대 내로부터 혈관을 조심스럽게 절개함으로써 달성될 수 있다. 또한, 혈관을 주위 제대 조직으로부터 조심스럽게 이탈시킬 수 있으며, 이 경우 혈관주위 워튼 젤리가 혈관으로부터 제거된다. 이들 원치않는 세포 추출을 막기 위해 주의하여도 이들은 여전히 생성된 추출물에 작은 정도로 존재될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이는 본원에 나타내는 관찰된 결과 즉, 중간엽으로부터 유래된 세포 콜로니 및 구체적으로 중배엽 기원의 관찰, CFU-O 형성의 빈도 및 신속성, 및 배양된 군집에서 관찰된 HLA 표현형의 특성화를 간섭하기에 너무 낮아서 간섭할 수 없는 정도로 발생하기 때문에 허용가능하다.

혈관주위 대역 내에 있는 WJ는 탯줄 혈관계의 외부 벽에 인접한 워튼 젤리이고, 전형적으로는 혈관의 외부 벽으로부터 약 3 mm로 연장한 대역 내에 위치한다. 적합하게는, 표적 추출 대역은 3종의 혈관 중 어느 하나의 외부 벽으로부터 약 2 mm, 예컨대, 약 1 mm 내에 위치할 수 있다. 이 영역으로부터의 WJ의 추출은 실시예에 기재된 기술을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다. 이 기술에서, 혈관은 WJ에 대한 담체로서 사용되고, 젤리-보유 혈관 그 자체는 전구세포가 추출되는 기질로서 사용된다. 따라서, 본 발명의 실시양태에서, WJ의 얇은 코팅을 갖는 제대 혈관은 완전히 세척하여 실질적으로 모든 제대 혈액 오염물을 제거한 새로운 제대로부터 외과적으로 또는 수동으로 제거된다. 인접한 워튼 젤리 또는 그의 구획을 갖는 혈관은 이어서 약 37 ℃에서 추출 배지, 예컨대 목적하는 세포가 존재하는 WJ의 콜라겐 매트릭스를 절단하기에 적합한 효소를 함유한 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에서 인큐베이션된다. 이 목적을 위해, 콜라게나제를 사용하는 절단은 약 0.1 mg/mL 내지 1.0 mg/mL의 범위 내의 농도에서 적합하거나 또는 예컨대 0.5 mg/mL 이상의 농도에서 더 적합하다. 추출 동안, 혈관 말단이 묶여지거나 꽉 쥐어져서 혈행이 멎게 되고, 혈관 내에 함유된 제제에 의해 오염을 막기 위해 추출 배지 상에서 현탁될 수 있다. 따라서, 본 발명의 워튼 젤리 추출물은 제대 혈액 세포 및 혈관 내피 세포를 실질적으로 함유하지 않는다는 것을 인식할 것이다.

추출 배지에서 약 24 시간, 예컨대, 12-36 시간, 예컨대 18-24 시간 후에, 혈관을 제거하여 인간 전구세포를 함유한 워튼 젤리 추출물을 남긴다. 이들 세포는 전구세포의 증식에 표준인 조건하에 증식된다. 상기 세포는 예컨대 폴리스티렌 디쉬 또는 플라스크 중에서 예를 들어 점착성 세포에 대해 선별하기 위한 폴리스티렌 상에서 선별되고, 이어서 적합한 배양 배지에서 유지될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 추출된 세포는 문헌 [Baksh et al in WO02/086104]에 기재된 바와 같이 점착성 세포에 대한 예비 선별과 함께 또는 없이 교반 현탁액의 조건 하에 증식을 위해 배양되며, 상기 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 인용된다.

추출물에 존재하는 세포는 그의 증식 직후 또는 이후에 주어진 표현형의 세포에 대해 풍부한 증식가능한 아군집을 제공하는 확립된 기술을 사용하여 분류될 수 있다. 따라서, 본 발명은 골전구세포에 대해 풍부한 WJ 추출 세포 군집, 면역-부적격 전구세포에 대해 풍부한 세포 군집, 및 면역-부적격인 골전구세포에 대해 풍부한 세포 군집을 추가로 제공한다.

도 17에 나타낸 바와 같이, 전구세포 군집 내의 MHC 마커의 분포가 동결-해동에 의해 변경된다는 것이 발견되었다. 새로운 세포의 계대시에, MHC 이중 음성 세포의 빈도가 상대적으로 일정하게/근소하게 증가된다. 그러나, 본원의 실시예에 나타내는 바와 같이, 전구세포 군집 중의 MHC 이중 음성 세포의 빈도가 동결 후에 플레이팅된 세포에서 유의하게 증가된다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 전구세포 군집에서, MHC 이중 음성 표현형의 세포는 동결 후에 빈도가 증가하는 경향에 의해 추가로 특성화된다. 이러한 동결은 먼저 세포 분취량을 제조하고, 이어서 목적하는 기간 동안 세포 제조물을 분류함으로써 일반적 방식으로 수행된다. 이러한 세포가 필요에 따라 다수해 동안 분류될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 워튼 젤리 추출물 또는 그의 MHC 이중 음성-풍부 분획을 수득하고, 그의 추출물 또는 분획을 동결 처리하고, 이어서 동결 세포를 배양함으로써 MHC 이중 음성 전구세포를 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 기재된 바와 같은 생성된 세포는 조직 형성을 유도하거나 또는 인간 대상체에서 회복하는 데 잠재적으로 유용하다.

추출물 또는 그의 적합하게 풍부한 분획으로부터 수득한 세포 군집은 그의 증식 직후 또는 이후에 분화된 세포 군집을 제공하는 데 유용하다. 그의 분획화 및 풍부화, 및 그의 증식에 적합한 모든 과정은 선행 기술에 확립되어 있고, 본원에 예시된다. 증식은 예를 들어, 인자, 예컨대 IL-3 및 줄기 세포 인자, 및 당업계에 공지된 유사한 제제의 존재하에 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 세포 군집, 특히 본원에서의 골전구세포는 그로부터의 골 조직 성장에 대해 확립된 조건을 사용하여 분화 처리된다. 놀랍게도, 수임 골전구세포로 칭해지는, 본 발명의 전구세포 군집의 배양으로부터 발생되는 골전구세포의 아군집은 골원성 보충물의 부재하에 분화 능력을 나타냈다. 또는, 골전구세포를 골형성을 자극하는 1종 이상의 제제, 예컨대 덱사메타손으로 보충한 배지에서 배양된다. 또한, 전구세포는 연골, 근육, 힘줄, 지방 등을 비롯한 기타 중간엽-유래 결합 조직 [Caplan, 1991]으로 분화를 자극하기에 적합한 보충물과 함께 배양될 수도 있으며, 이들 모두는 당업계의 표준 실무에 따른다.

본 발명의 세포 군집에서의 세포의 시험관내 배양에 대한 실무적 대안으로서, 세포가 생체내 이식되어 환자 내에서 직접적으로 목적하는 조직의 형성을 유도할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이 경로에 의해, 골의 동일계내 형성은 특히 골 골절 및 골다공증을 비롯한 각종 골 증상, 질환 및 질병을 앓고 있는 환자의 이익을 위해 골전구세포를 이식함으로써 제공된다. 세포 군집에 존재하는 면역-부적격 전구세포는 이 점에서 특히 유익하며, 그의 이식 후에 예상될 수 있는 거부 반응을 실질적으로 저하시킨다.

본 발명의 실시양태는 하기 실시예에 기재한다.

인간 워튼 젤리로부터의 전구세포의 수확

UC를 캐나다 토론토 소재의 써니브룩 앤드 우먼즈 칼리지 하스피틀 (Sunnybrook & Women's College Hospital)에서 전달된 즉시 정상 임신 기간이 다 찬 제왕절개 영아로부터 수집하였다. UC를 외과의사에 의해 멸균 혈관 함유 배지 (75％ α-MEM, 15％ 소 태아 혈청 (FBS), 10％ 항생물질) 내로 옮기고, 즉시 토론토 대학교 생체재료 및 생의학 가공 연구소 (the Institute of Biomaterials & Biomedical Engineering, University of Toronto)의 본 발명자의 실험실로 옮겼다.

이 시점으로부터의 모든 과정은 생물학적 안전 캐비넷 내에서 무균적으로 수 행하였다. UC를 포스페이트 완충 염수 (PBS) (-Mg²⁺, -Ca²⁺)에서 3회 세척하여 가능한 많은 UC 혈액을 제거하고, 배지를 함유하는 컨테이너 내로 다시 옮겼다. 대략 6 cm 길이의 제대를 멸균 가위로 절단하여 멸균 코르크 절개 보드 상에 두었다. 잔존 제대 (30-45 cm)를 배지-충전 컨테이너에 재배치하고, 37 ℃의 인큐베이터 내에 두었다. 6 cm 구획의 제대를 그의 나선에 반대로 '꼬고', 양쪽 끝을 핀으로 고정하여 UC 상피의 매끄럽고 곧은 표면이 드러나게 하였다. 미세한 가위를 사용하여, UC를 대략 1-2 mm 깊이로 그의 길이에 따라 절단하여 WJ를 드러나게 하였다. 절단한 상피의 '플랩 (flap)' 각각으로 시작하며, WJ를 스캘펄의 무딘 가장자리를 사용하여 그의 내부 표면으로부터 벗겨내고, 벗겨낸 상피 (대략 0.5 mm 두께)를 핀으로 밑으로 고정하였다. 이 과정으로 WJ를 노출시키고, 그의 함몰된 그의 3개의 혈관이 그의 세로 축을 따라서 나선형보다는 말단에서 말단으로 직선으로 뻗게 하였다. 구획을 37 ℃의 PBS로 빈번하게 조심스럽게 침지하였다. 혈관의 한쪽 끝을 집게로 단리하고, 그것이 WJ 매트릭스의 벌크를 함유하지 않을 때까지 그를 WJ로부터 그의 길이에 따라 벗겨내었다. 달리, 혈관의 중간을 매트릭스로부터 절개하고, 집게로 잡고, 매트릭스로부터 그의 말단을 향해 각 방향으로 벗겨낼 수 있었다. 둘 중 하나의 방법에 의해 혈관을 들어낸 후에, 혈관을 대략 1-2mm의 세포-보유 WJ 매트릭스로 둘러쌌다. 절개된 혈관을 이어서 외과용 클램프 또는 모스키토 클립으로 양 끝을 집거나 또는 봉합하여 '루프'를 생성시키며, 혈관 내외로 유액의 통과를 막았다. '루프'를 즉시 가위로 PBS (-Mg²⁺, -Ca²⁺)를 갖는 콜라게나제 용액 0.5 mg/ml을 함유한 15 ml 투브 내에 두고, 37 ℃의 인큐베이터 내에 두었다. 잔존 2개의 혈관을 유사형 방식으로 절개하고, 루프형으로 만들고, 또한 인큐베이터 내의 콜라게나제 용액에 두었다. 혈관을 이어서 제거하고, WJ의 스트립에서 상피를 용이하게 절개해내고, 콜라게나제 용액을 갖는 15 ml 튜브 내에 둘 수 있었다. 잔존 상피 층을 이어서 생물재해 폐기물 컨테이너 내에 배치하였다. 동일한 프로토콜을 잔존 30-45 cm의 UC에 사용하여 '루프' 또는 WJ 스트립을 갖는 15 내지 25개의 튜브를 제조하였다.

워튼 젤리 전구세포 배양의 개시

18-24 시간 후에, '루프'를 그의 부착된 현수 클램프 또는 봉합 및 피펫의 조력으로 제거하고, 잔존 현탁액을 T-75 ㎠ 조직 배양 폴리스티렌 디쉬 상에 직접적으로 플레이팅하고, 72 시간 동안 두어 세포를 폴리스티렌 표면에 부착시켰다. 배지를 이어서 매 2일 마다 바꾸었다.

광학 현미경으로 관찰하여 80-90％ 전면생장을 나타낼 때 7일 후에 1％ 트립신 용액을 사용하여 부착된 세포를 계대배양하였고, 위상 현미경 하에 관찰되고, 광학 특성의 예상된 변화에 의해 나타난 바와 같이 '무기질화된' 응집체 형성 증거가 있었다. 계대시에, 세포를 75％ α-MEM, 15％ FBS, 10％ 항생물질 중의 35 mm 조직 배양 폴리스티렌 디쉬 또는 6 웰 플레이트에 1 x 10⁴ 세포/㎠로 플레이팅하고, 10^-8 M 덱스 (Dex), 5 mM β-GP 및 아스코르브산 50 ㎍/ml로 처리하여 이들 세포의 골원성 역량을 시험하였다. 이들 플레이트를 CFU-O에 대한 배양 2, 3, 4 및 5일째 에 관찰하였다 (달리, '골 결절' 형성으로 지칭함).

하기 프로토콜을 사용하는, 워튼 젤리 전구세포 배양물을 수득하는 또다른 유용한 접근법을 채택하였다:

1. 제왕절개 환자로부터 멸균 제대 (UC)를 수득하고, 배지 (80％ α-MEM, 20％ 항생물질) 중의 생물학적 안전 캐비넷으로 옮긴다.

2. UC를 멸균 37 ℃ 포스페이트 완충 염수 (PBS)에서 2회 세척한다.

3. UC를 날카로운 가위로 대략 1-2 인치 구획으로 절단한다.

4. UC의 각 구획을 멸균 37 ℃ PBS로 2회 세척하여 가능한 많은 잔존 제대 혈액 (UCB)을 제거한다.

5. 건조 멸균 디쉬 상의 UC 구획 중 하나를 단리한다.

6. 2세트의 포셉을 사용하여, 상피를 대략 2 mm 떨어지게 붙잡고, 서로로부터 멀리 잡아 당겨 상피를 찢는다.

7. 상피를 UC 구획의 길이를 따라서 잡고, 상피를 연속으로 찢어서 WJ 하부를 노출시킨다.

8. 단계 6과 유사하게, 상피의 대략 절반 정도가 찢어질 때까지 상피를 연속으로 '스트립'으로 찢는다.

9. 제혈관이 WJ를 통해 명확하게 보이게 하여야 하고, 말단을 UC 구획의 절단 가장자리 상에서 느슨하게 한다.

10. 1세트의 포셉을 사용하여 상피의 잔존 부분을 잡고, 둘러싸는 PVWJ를 갖는 벌크 WJ로부터 혈관의 말단과 다른 말단을 '잡아당길' 수 있다.

11. 3개 모두가 기저 WJ 매트릭스를 함유하지 않을 때까지 이 프로세스를 혈관 각각에 대해 반복한다.

12. 방출되자마자, 혈관을 각각 37 ℃ PBS 내에 둔다.

13. 모든 혈관이 멸균 37 ℃ PBS-충전 비이커에서 단리될 때까지 단계 5-12를 각 구획의 UC에 대해 반복한다.

14. 이어서, 청결한 멸균 표면 상에 혈관을 각각 개별적으로 둠으로써 말단을 '루프'내로 이중 매듭을 사용하는 봉합으로 서로 결찰할 수 있다.

15. 모든 혈관이 루프 내로 결찰된 후에, 루프를 멸균 50 ml 튜브 내의 콜라게나제 용액 1 mg/ml 내에 둔다.

16. 50 ml 튜브를 37 ℃, 5％ CO₂ 인큐베이터의 로테이터 내에 밤새 둔다.

17. 다음날, 콜라게나제를 소 태아 혈청 (FBS) 1 ml로 불활성화시키고, 루프를 현탁액으로부터 제거한다.

18. 잔존 현탁액을 PBS로 희석하고, 1150 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한다.

19. 펠렛에 잔존한 세포를 보충된 배지 (SM) (75％ α-MEM, 15％ FBS, 20％ 항생물질)에서 재현탁하고, 분취량을 혈구계 상에서 계수한다.

20. 세포 현탁액을 이어서 T-25 조직-배양 폴리스티렌 플라스크 상에 플레이팅하고, 증식시킨다.

21. 2차 배양 (계대배양)되는 시점에서 세포가 서브-전면생장에 도달할 때 (1-2 주)까지 SM을 매 2 일 마다 교환한다.

전구세포 분석

세포 증식 분석

매주 계대 과정 (매 6 일마다 발생함) 동안, 2 x 10⁵ 세포의 분취량을 20 T-25 ㎠ 조직 배양 폴리스티렌 플라스크 내로 플레이팅하였다. 배양 2, 4, 6, 10 및 12일째에, 4개의 T-25 플라스크를 계대배양하고, 세포를 계수하였다. 기하급수적 증식의 이들 세포를 플로팅하고, 이들 배양액 중의 세포에 대한 중간 배가 시간을 계산하였다. 결과를 도 16에 나타낸다. PVWJ 세포 배양에 대한 배가 시간은 전체 배양 기간에 걸쳐 약 24 시간임을 알 것이다. 대수증식기 동안, 배가 시간은 놀랍게도 16 시간이다. 이는 골수 중간엽 세포에 대한 배가 시간이 약 33 시간 [Conget, P, J J Minguell, 1999, Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells: Journal of Cell Physiology, v. 181, p. 67-73.]이고, 지방 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기 세포의 경우 약 3.2 일 [Sen, A, J. Cell Biochem., v. 81, p. 312-319.]로 보고된 문헌과 비교된다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 혈관주위 워튼 젤리 (PVWJ)-유래 전구세포는 상이한 아군집의 전구세포를 포함한다. 이 군집 내에, 본원에 나타내는 바와 같이 이러한 분화 유도에 보통 요구되는 배양 보충물 (예컨대 덱사메타손의 존재하에 배양됨)의 부재하에 골 결절을 형성하는 능력에 의해 특성화되는 소위 "수임된" 골전구세포가 있다. 따라서, 이들 수임 골전구세포는 자발적으로 분화되어 골 결절을 형성한다. 또한, PVWJ 내에 전구세포 군집은 요구 인자, 예컨대 덱사메타손, β-글리세로포스페이트 및 아스코르브산의 존재하에 배양되는 경우 유도되어 골 결절을 형성할 수 있는 골전구세포이다. 따라서, 도 15에 도시된 하위 군집인 "총 골전구세포"는 "수임된 골전구세포" 군집 뿐만 아니라 "비수임된 골전구세포" 군집을 포함하고, 골원성 계통으로 분화 유도할 수 있는 세포의 총 수를 나타낸다. "수임된" 군집 및 "비수임된" 군집 간의 실제 비율이 대략 1:1이고, 따라서 "총 골전구세포" 군집 및 "수임된 골전구세포" 군집 간의 비율이 약 2:1이다. 전구세포의 골 형성 특성의 분석을 하기 기재되는 바와 같이 수행하였다.

CFU-O 분석

매주 계대 과정 동안, 75％ α-MEM, 15％ FBS (스템셀 배치 (StemCell Batch) #: S13E40), 페니실린 G (167 유닛/ml), 젠타마이신 (50 ㎍/ml) 및 암포테리신 B (0.3 ㎍/ml), 및 덱스 (10^-8 M), β-글리세로포스페이트 (5 mM) 및 L-아스코르브산 (50 ㎍/ml)을 함유한 10％ 항생물질 저장 용액을 함유한 골 형성 배지에서 시험 세포 군집의 분취량을 조직-배양 폴리스티렌 상에 직접적으로 세포 시딩 밀도 1 x 10⁴ 세포/㎠로 플레이팅하였다. 배양액을 12일 동안 매 2일 마다 재공급하였다. 골 결절로서 탐지된 무기질화된 결절 영역이 관찰될 때까지 (일반적으로 3일)배양액을 유지하며, 이 시점에 최종 배양시에 재공급된 배지를 함유한 테트라시클린과 함께 배양액을 재공급하고, 이어서 카르노브스키 (Karnovsky) 고정제에서 고 정하고, 분석을 위해 준비하였다. 레이츠 아리스토플란 (Leitz Aristoplan) 현미경 (Esselte Leitz GmbH & Co KG, Stuttgart, Germany)을 사용하여 위상차 하에 테트라시클린 표지 배양물을 시각화시킬 뿐만 아니라 UV 형광 및 히타치 (Hitachi) S-2000 주사 전자 현미경 (가속 전압 15 kV)을 사용하여 영상을 생성시켜 형태학상 확인가능한 골 매트릭스의 존재를 측정하였다.

데이타 분석

테트라시클린 염색

테트라시클린 (9 ㎍/ml)을 종결 전에 배양액에 첨가하였다. 종결 시에, 세포를 카르노브스키 고정제에서 밤새 고정하고, 이어서 결절 영역의 미네랄 성분을 표지하는 테트라시클린에 대한 UV-여기 형광 영상화에 의해 시각화하였다.

주사 전자 현미경 검사 (SEM)

CFU-O 배양물의 대표적 샘플은 먼저 그를 70％, 80％, 90％ 및 95％ 에탄올 중에 1 시간 동안 둔 후에, 100％ 에탄올 중에 3 시간 동안 침지함으로써 SEM을 위해 준비하였다. 이를 이어서 임계점까지 건조시켰다. 대략 3 nm 층인 금 층을 폴라론 SC515 SEM 코팅 시스템 (Polaron SC515 SEM Coating System)으로 시편 상으로 스퍼터링 코팅하였으며, 이를 이어서 가속 전압 15 kV에서의 히타치 S-2000 주사 전자 현미경의 각종 확대에서 조사하였다. 형태학상 확인가능한 골 매트릭스의 존재를 측정하기 위해 생성된 상을 사용하였다.

HLA-타이핑에 대한 유세포측정

1 x 10⁵ 세포 초과하는 시험 세포 군집을 2％ FBS (스템셀 배치 #: S13E40)를 함유한 PBS에서 세척하고, 포화 농도 (1:100 희석)의 하기 컨쥬게이트된 마우스 IgG1 HLA-A,B,C-PE 및 HLA-DR,DP,DQ-FITC를 갖는 PBS + 2％ FBS에서 30 분 동안 4 ℃에서 재현탁하였다. 세포 현탁액을 PBS + 2％ FBS로 2회 세척하고, 7-AAD (BD Biosciences) 1 ㎍/ml로 염색하고, ExpoADCXL4 소프트웨어 (Beckman-Coulter)를 사용하는 유세포측정기 (XL, Beckman-Coulter, Miami, FL) 상의 분석을 위해 PBS + 2％ FBS에서 재현탁하였다. 양성 염색은 필적되는 이소형 항체 (FITC- 및 PE-컨쥬게이트 마우스 IgG1,κ 모노클로날 이소형 표준 (BD Biosciences))로 염색된 대조군 군집으로부터 99％ 초과의 세포에 의해 과잉 수준이 얻어지는 형광 신호의 방출로서 정의된다. 각 샘플의 경우에, 10,000 이상의 리스트 모드 현상이 수집되었다. 모든 플롯을 EXPO 32 ADC 분석 소프트웨어에서 작성하였다.

결과

골 결절 콜로니의 광학 현미경사진

도 3, 4 및 5는 3 및 5일째의 배양액에 존재하는 CFU-O를 나타낸다. 이들은 결절 영역을 둘러싸는 "섬유모세포-유사" 세포의 전면생장 층이 골-매트릭스를 생산하는 다각형 세포의 '응집'에 의해 나타났다는 것을 나타냈다. 이들 CFU-O는 덱스 (+) 및 덱스 (-) 배양액 모두에 관찰되고, 연속하는 계대 상에 유사한 형태를 나타냈다.

CFU-O 배양물의 테트라시클린 표지

배양물의 테트라시클린 표지는 골의 생물학적 미네랄 상과 회합된 새롭게 형성된 인산칼슘을 표지하기 위해 사용하였다. 배양물의 테트라시클린 표지는 무기질화된 결절 영역과 일치하며, 이는 배양물을 UV 광에 노출시킴으로써 시각화되었다. 도 6 및 7은 WJ 전구세포의 3 및 5일째 배양액의 테트라시클린 표지 CFU-O 배양물을 나타낸다. 이들 상을 UV-여기 형광 상으로 생성시키고, 촬영하였다.

주사 전자 현미경 검사

무기질화된 콜라겐 매트릭스의 형성에 대해 CFU-O를 SEM 하에 관찰하였으며, 이는 성숙 CFU-O에 밀집한 무기질화된 매트릭스를 통한 콜라겐 형성의 초기 단계로부터의 CFU-O의 형성을 나타낸다. 도 8, 9, 10, 11, 12 및 14는 CFUO의 주사 전자 현미경사진을 나타낸다.

유세포측정 및 HLA-타이핑

주요 조직적합 복합체 (MHC) 모두를 나타내는 세포-표면 항원을 확인하는 유세포측정은 단리된 세포의 군집 중 77.4％를 MHC^-/-로서 나타냈다. 도 13은 음성 대조군에 관한 유세포측정 결과를 나타낸다. 도 17은 전구세포 군집에서 MHC-/- 세포의 빈도에 대한 동결-해동의 영향을 나타낸다. 동결-해동의 영향을 하기와 같이 연구하였다:

1 x 10⁵ 초과의 세포의 시험 세포 군집을 2％ FBS를 함유한 PBS에서 세척하고, 포화 농도 (1:100 희석)의 하기 컨쥬게이트된 마우스 IgG1 HLA-A,B,C-PE (BD Biosciences #555553, Lot M076246) (MHC I), HLA-DR,DP,DQ-FITC (BD Biosciences #555558, Lot M074842) (MHC II) 및 CD45-Cy-Cychrome (BD Biosciences #555484, Lot 0000035746)를 갖는 PBS + 2％ FBS에서 30 분 동안 4 ℃에서 재현탁하였다. 세포 현탁액을 PBS + 2％ FBS로 2회 세척하고, ExpoADCXL4 소프트웨어 (Beckman-Coulter)를 사용하는 유세포측정기 (XL, Beckman-Coulter, Miami, FL) 상의 분석을 위해 PBS + 2％ FBS에서 재현탁하였다. 양성 염색은 필적되는 이소형 항체 (FITC-, PE-, 및 Cy-cychrome-컨쥬게이트 마우스 IgG1,κ 모노클로날 이소형 표준 (BD Biosciences))로 염색된 대조군 군집으로부터 99％ 초과의 세포에 의해 과잉 수준이 얻어지는 형광 신호의 방출로서 정의되며, 이는 인간 BM 샘플의 양성 형광에 의해 확인하였다. 각 샘플의 경우에, 10,000 이상의 리스트 모드 현상이 수집되었다. 모든 플롯을 EXPO 32 ADC 분석 소프트웨어에서 작성하였다.

2차 배양 및 세포 시딩

부착된 세포는 0.1％ 트립신 용액을 사용하여 7일 후에 2차 배양 (계대배양)하며, 이 시점에서 이들은 광학 현미경에 의해 관찰되는 바와 같이 80-90％ 전면생장을 나타냈다. 계대 시에, PVWJ (혈관주위계 대역 워튼 젤리) 세포를 MHC-A,B,C, MHC-DR,DP,DQ, 및 CD45의 발현에 대해 유세포측정에 의해 관찰하였다. 이들을 이어서 T-75 조직 배양 폴리스티렌 플라스크 내에서 4 x 10³ 세포/㎠로 SM에서 플레이팅하고, 10^-8 M 덱스, 5 mM β-GP 및 아스코르브산 50 ㎍/ml로 처리하여 이들 세포의 골원성 역량(osteogenic capacity)을 시험하였다. 이들 플라스크를 배양 2, 3, 4, 5 및 6일째에 CFU-O 또는 골 결절 형성에 대해 관찰하였다. 계대 과정으로부터의 임의의 잔존 세포를 또한 추후 사용을 위해 냉동 보존하였다.

세포의 냉동보존

1 x 10⁶ PVWJ 세포의 분취량을 90％ FBS, 10％ 디메틸 술폭시드 (DMSO) (Sigma D-2650, Lot# 11K2320)로 이루어진 총용적 1 ml에서 제조하고, 1 ml 폴리프로필렌 냉동보존-바이알 내로 피펫으로 옮겼다. 바이알을 -70 ℃ 냉동고 내에 밤새 두고, 다음날 -150 ℃ 냉동고로 장기간 저장을 위해 옮겼다. 냉동보존 1주일 후에, PVWJ 세포를 해동하고, MHC-A,B,C, MHC-DR,DP,DQ, 및 CD45의 발현에 대해 유세포측정으로 관찰하였다. PVWJ 세포를 냉동보존 1주일 후에 해동하고, 1주일 동안 재배양하고, 2차 배양하고, 이어서 MHC-A,B,C, MHC-DR,DP,DQ, 및 CD45의 발현에 대해 유세포측정으로 재분석하는 데 제2 프로토콜을 사용하였다.

결과를 도 17에 나타낸다. 새로운 세포 군집 내의 MHC-/-의 빈도가 수회 계대배양을 통해 유지된다는 것을 인지할 것이다. 새로운 세포를 계대배양 후에 -150 ℃에서 1주일 동안 동결하고, 이어서 MHC 표현형에 대해 즉시 분석할 경우에, 이 분석된 군집은 MHC-/- 표현형의 세포의 두드러지게 향상된 빈도를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 실시양태에 따라, MHC-/- 표현형의 세포는 동결에 의해 PVWJ 세포의 군집으로부터 유용하게 풍부해질 수 있다. 여전히 추가 풍부는 예비 동결 세포의 배양을 계대배양할 때 실현된다. 동결 PVWJ 세포 그 자체는 면역-부적격을 나타내는 인간의 치료법에 잠재적으로 매우 유용하다.

본원에 나타낸 바와 같이, PVWJ 전구세포 군집은 이러한 분화에 대한 적절한 조건 하에 배양함으로써 골 이외에 중간엽 세포 및 조직을 발생시키기 위해 개발될 수도 있다. 지방세포를 생성하기 위해, 예를 들어, 전구세포를 10⁴ 세포/㎠의 농도에서 제조하고, 35 mm 조직 배양 디쉬에서 플레이팅하였다. 세포를 전-지방세포 배지 (PM) (DMEM/햄스(Ham's) F-10 (1:1, 부피/부피), 10％ 송아지 태아 혈청, 15 mM HEPES, 100 U/ml 페니실린, 스트렙토마이신 100 ㎍/ml, 암포테리신 B 0.25 ㎍/ml)에서 3일 동안 유지하였다. 3일 후에, PM을 제거하고, 세포에 지방형성 배지 (DMEM/ 햄스 F-10 영양 브로쓰, 1:1, v/v; HEPES 완충액 (15 mM); 소 태아 혈청 (3％); 비오틴 (33 μM), 판토테네이트 (17 μM), 인간 인슐린 (100 nM), 덱사메타손 (0.5 μM), PPARγ 아고니스트 (1 μM) 및 항생물질)를 공급하고, 3일 동안 배양하였다. 유도 3일 후에, 지방형성 배지를 제거하고, 모든 배지가 제거되는 경우에는 지방세포가 떠오를 것이기 때문에 확실하게 배지의 절반만 제거하고, 동일 용적의 AM을 보충하면서 매 3일 마다 규칙적으로 공급하며 배양액을 지방세포 배지 (AM) (DMEM/햄스 F-10 (1:1, 부피/부피), 3％ 송아지 태아 혈청, 1 μM 덱사메타손, 100 nM 인간 인슐린, 33 μM D-비오틴, 17 μM Na-판토테네이트, 15 mM HEPES, 페니실린 100 U/ml, 스트렙토마이신 100 ㎍/ml, 암포테리신 B 0.25 ㎍/ml)에서 유지하였다. 4회 공급 (12일째)후에, 세포는 지질 방울로 둥글게 나타났다. 지방세포로의 분화된 중간엽 세포의 양성 확인은 오일 레드 (Oil Red) O 및 닐 레드 (Nile Red)로 염색함으로써 확인할 수 있었다.

유사하게는, 연골세포는 10⁴ 세포/㎠의 농도에서 제조한 세포 현탁액을 사용 하여 생성하고, 35 mm 조직 배양 디쉬에 플레이팅할 수 있다. 연골발생을 촉진하기 위해 상기 세포는 혈청 없이 성장 인자-ß3 형질전환과 함께 배양하였다. 세포 펠렛은 다층화된 매트릭스-풍부 형태를 발달시키고, 배양 동안 조직학적으로 증가된 프로테오글리칸-풍부 세포외 매트릭스를 나타냈다.

근육모세포를 생성시키기 위해, 세포 현탁액은 10⁴ 세포/㎠의 농도에서 제조하고, 35 mm 조직 배양 디쉬에 플레이팅하였다. 세포를 15％ 소 태아 혈청 (FBS)을 보충한 MCDB 120 배지에서 1주 동안 (근육모세포 증식 배지, MPM) 유지하였다. 1주째에, 기준 배지 (MPM)중의 혈청 수준은 2％로 떨어지고 (근육모세포 분화 배지, MDM), 배양을 7일 후에 종결하였다. 배양액에 1주 3회 적절한 배양액 배지를 재공급하였다.

따라서, 본 발명이 골을 비롯한 각종 결합 조직의 생산에 유용한 특성을 갖는 인간 전구세포를 제공하고, 추가로 면역 부적격이고 골 질환 및 질병을 비롯한 결합 조직 증상을 치료하기 위해 인간 환자내로 이식하기에 이상적인 전구세포를 제공하는 것을 인지할 것이다. 인간 전구세포는 제대 혈관의 외부 벽으로부터 인접하게 연장되는 인간 제대 워튼 젤리의 특정 대역 (혈관주위 대역으로 지칭됨)의 추출물로부터 생성된다. 이 대역으로부터 추출된 세포 군집은 모든 2차 배양된 플라스크에서 7일 전에 발생되는 세포 콜로니의 형성 (대략 7-10 배가) 및 배양 배지에 대한 골원성 보충물의 첨가 없이 골 결절 형성의 출현, 뿐만 아니라 MHC 이중 음성 세포의 상대적으로 높은 빈도 (이 빈도는 동결되었었던 세포의 배양시에 증가됨)에 의해 입증되는 바와 같이 급속한 증식, 세포 형태의 변화를 비롯한 두드러진 특성을 나타낸다.

하기 참고문헌은 참조로 본원에 인용된다:

Claims (26)

1. 인간 제대의 혈관주위 대역(perivascular zone)으로부터 인간 전구세포를 포함하는 세포 군집을 추출하는 단계를 포함하는, MHC 이중 음성 표현형을 갖는 전구세포를 포함하며 상기 혈관주위 대역 외부의 워튼 젤리로부터 추출된 다른 전구세포 군집에 비해 신속하게 증식하는 상기 세포 군집의 수득 방법.
2. 제1항에 있어서, 제대로부터 절개된 하나 이상의 혈관에서 추출 단계를 수행하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적합한 세포 추출 배지에서 혈관주위 대역으로부터의 워튼 젤리로부터 그의 효소 절단에 의해 상기 세포 군집을 추출하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 효소 절단이 상기 워튼 젤리의 콜라겐 매트릭스로부터 세포의 방출을 유발하는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 세포 군집의 추출 단계를 37 ℃에서 포스페이트 완충 염수 및 콜라게나제 0.1 내지 10.0 mg/mL 중에서 12 내지 36 시간 동안 수행하는 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 군집을 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 골전구세포를 포함하도록 상기 군집을 처리하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
8. 제6항에 있어서, MHC 이중 음성 표현형을 갖는 전구세포를 포함하는 세포가 증가되도록 상기 군집을 처리하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
9. 제8항에 있어서, MHC 이중 음성 표현형을 갖는 전구세포를 포함하는 세포가 증가되도록 상기 군집을 동결/해동하는 단계를 실시하는 방법.
10. (1) 인간 제대의 혈관주위 대역에서의 워튼 젤리로부터 추출가능하고, (2) 상기 혈관주위 대역 외부의 워튼 젤리로부터 추출된 다른 전구세포 군집에 비해 신속하게 증식하며, (3) 골전구세포를 포함하고, (4) MHC 이중 음성 표현형을 갖는 전구세포를 포함하는, 인간 전구세포를 포함하는 단리된 세포 군집.
11. 삭제
12. 제10항에 있어서, 냉동 보존된 상태의 세포 군집.
13. 제10항에 따른 세포 군집을 골 세포로의 분화를 유도하는 조건 하에 성장시키는 단계를 포함하는, 골 세포의 생산 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 세포를 골 세포 분화를 자극하는 보충물의 부재 하에 배양하는 방법.
15. 제10항에 따른 세포 군집을 지방 세포로의 분화를 유도하는 조건 하에 성장시키는 단계를 포함하는, 지방 세포의 생산 방법.
16. 제10항에 따른 세포 군집을 근육모세포로의 분화를 유도하는 조건 하에 성장시키는 단계를 포함하는, 근육모세포의 생산 방법.
17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 전구세포의 군집에 제대의 혈관 구조로부터 유래된 세포가 없는 것인 방법.
18. 제10항에 있어서, 제대의 혈관 구조로부터 유래된 세포가 없는 단리된 세포 군집.
19. 인간 전구세포를 포함하고, 인간 제대의 혈관계에 인접한 워튼 젤리의 효소 절단에 의해 수득되는 워튼 젤리 추출물.
20. 제19항에 있어서, 제대 혈액의 세포가 없는 워튼 젤리 추출물.
21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 인접한 워튼 젤리를 보유하는 제대 혈관계를 적합한 세포 추출 배지에서 효소 절단처리함으로써 수득되는 워튼 젤리 추출물.
22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 효소 절단 단계가 워튼 젤리의 콜라겐 매트릭스로부터 세포의 방출을 유발하는 것인 워튼 젤리 추출물.
23. 제19항 또는 제20항에 있어서, 추출이 37 ℃에서 포스페이트 완충 염수 및 콜라게나제 0.1 내지 10.0 mg/mL 중에서 12 내지 36 시간 동안 수행되는 것인 워튼 젤리 추출물.
24. 제13항 또는 제14항에 있어서, 인간 전구세포의 군집에 제대의 혈관 구조로부터 유래된 세포가 없는 것인 방법.
25. 제15항에 있어서, 인간 전구세포의 군집에 제대의 혈관 구조로부터 유래된 세포가 없는 것인 방법.
26. 제16항에 있어서, 인간 전구세포의 군집에 제대의 혈관 구조로부터 유래된 세포가 없는 것인 방법.

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