ES2360434B1 - Celulas madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental. - Google Patents
Celulas madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2360434B1 ES2360434B1 ES200930488A ES200930488A ES2360434B1 ES 2360434 B1 ES2360434 B1 ES 2360434B1 ES 200930488 A ES200930488 A ES 200930488A ES 200930488 A ES200930488 A ES 200930488A ES 2360434 B1 ES2360434 B1 ES 2360434B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- baselineskip
- cell
- medium
- tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 40
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 191
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 9
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 claims description 8
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 abstract description 6
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 abstract description 6
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 abstract description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 46
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 17
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 13
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 12
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 11
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 10
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 10
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 9
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 9
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 9
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 9
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 6
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 6
- 101000713275 Homo sapiens Solute carrier family 22 member 3 Proteins 0.000 description 6
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 6
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 6
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 5
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical group O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 5
- 101100257359 Caenorhabditis elegans sox-2 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 4
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 4
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 4
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 4
- 101100257363 Mus musculus Sox2 gene Proteins 0.000 description 4
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 4
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical group CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 4
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 3
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 3
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 3
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 210000001968 dental pulp cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000004357 third molar Anatomy 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000381 Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101001027382 Homo sapiens Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 2
- 101150012532 NANOG gene Proteins 0.000 description 2
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 2
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 2
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical group N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- -1 SSEA4 Proteins 0.000 description 2
- 101150037203 Sox2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 210000003298 dental enamel Anatomy 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000004283 incisor Anatomy 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 2
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 2
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 206010016717 Fistula Diseases 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101000976618 Mus musculus Zinc finger protein 42 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101150025224 OCT3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 101710121070 Protein mesh Proteins 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N beta-glycerol phosphate Natural products OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHRQXJHBXKYCLZ-UHFFFAOYSA-L beta-glycerolphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CC(CO)OOP([O-])([O-])=O GHRQXJHBXKYCLZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N calcitriol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N 0.000 description 1
- 229960005084 calcitriol Drugs 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000004268 dentin Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003890 fistula Effects 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-L glycerol 2-phosphate(2-) Chemical compound OCC(CO)OP([O-])([O-])=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003076 neurotropic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 210000003903 pelvic floor Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003014 totipotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0664—Dental pulp stem cells, Dental follicle stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Hematology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Células madre pluripotenciales obtenidas a
partir de la pulpa dental con capacidad de diferenciarse en tejidos
de las tres capas embrionarias, endodermo, mesodermo y
ectodermo.
Description
Células madre pluripotenciales obtenidas a
partir de la pulpa dental.
La presente invención está relacionada con
células madre pluripotenciales obtenidas de la pulpa dental de
pacientes de diferentes edades y su aplicación en la regeneración de
tejidos.
En los seres vivos, los tejidos sufren, a lo
largo de la vida un desgaste, pero tienen capacidad de
autorenovarse. De no existir esta renovación, se reduciría
considerablemente la esperanza de vida de los seres vivos. En
concreto son las células madre las que tienen esta capacidad de
autorenovación de los tejidos. La capacidad de autorenovación se
plasma, en la capacidad de producir más células madre y, por otro
lado, de generar células de uno o más tipos celulares
diferenciados.
El descenso replicativo de células madre implica
la degeneración y muerte de los distintos tejidos, ya sea de manera
aguda (infartos) o crónica
(degeneración-envejecimiento).
Por la capacidad de autorenovación citada,
actualmente se aplica la terapia celular con células madre, entre
otras en: patologías cardíacas, patologías de la córnea, patologías
del suelo pélvico. También se tratan fístulas especialmente en
enfermos de Crohn.
Las células madre se pueden clasificar según su
potencial de diferenciación en: totipotenciales, pluripotenciales y
multipotenciales.
Las células madre totipotentes pueden crecer y
formar un organismo completo, tanto los componentes embrionarios
(como por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y
los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como los
extraembrionarios (como la placenta). Es decir, pueden formar todos
los tipos celulares.
Las células madre multipotentes son aquellas que
sólo pueden generar células de su propia capa o linaje embrionario
de origen (por ejemplo: una célula madre mesenquimal de médula ósea,
al tener naturaleza mesodérmica, dará origen a células de esa capa
como miocitos, adipocitos u osteocitos, entre otras).
Las células madre pluripotenciales no pueden
formar un organismo completo, pero pueden diferenciarse en células
provenientes de los tres linajes embrionarios: (a) ectodermo, que es
el origen del sistema nervioso, el sistema respiratorio, tubo
digestivo superior (estomodeo), la epidermis y sus anexos (pelo y
uñas) y las glándulas mamarias; (b) endodermo, que es el origen del
intestino, el hígado, el páncreas, los pulmones y la mayor parte de
los órganos internos; (c) y mesodermo, que es el origen del sistema
esquelético, los músculos, y los sistemas circulatorio y
reproductor. Igualmente, pueden formar cualquier otro tipo de célula
proveniente del germinal y el saco vitelino.
El hecho de que las células pluripotenciales
tengan la capacidad de diferenciarse en un número tan elevado de
tejidos, las hace de especial interés para el diseño de nuevas
terapias, en general, y de terapias regenerativas, en
particular.
Actualmente, las células madre pluripotenciales
en individuos adultos se obtienen principalmente de médula ósea.
Es bien conocido en el estado de la técnica, que
cuando se lleva a cabo el aislamiento y caracterización de las
células madre pluripotenciales a partir de la muestra de médula ósea
extraída, existen diferentes criterios bien establecidos en el
estado de la técnica que permiten clasificar de manera clara a una
célula madre como célula pluripotencial.
Un primer criterio sería determinar la capacidad
de diferenciación de la célula aislada a tejidos que proceden de las
tres capas embrionarias (endodermo, ectodermo y mesodermo) usando
medios de diferenciación disponibles comercialmente, (cfr. Prelle
et al., "Establishment of pluripotent cell lines from
vertebrate species, present status and future prospects", Cell
Tissues Organs, 1999, vol 165, pág. 220-236).
Un segundo criterio consistiría en identificar
los marcadores que expresa la célula madre aislada.
Por ejemplo la expresión del gen OCT3/4 ha sido
descrita como necesaria para que una célula madre sea pluripotencial
(cfr. Niwa et al. "Quantitative expression of
Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation
or self-renewal of ES cells", Nature, 2000 vol.
24, pág. 372-376). La expresión de SSEA4 en células
pluripotenciales ha sido descrita en (cfr. Venable et al.
"Lectin binding profiles of SSEA-4 enriched,
pluripotent human embryonic stem cell surfaces" BMC Dev Biol.
2005, vol 21, pág. 5-15), y la expresión de CD13
igualmente en células pluriputentes se cita en (cfr. Young et
al., "Human pluripotent and progenitor cells display cell
surface cluster differentiation markers cd10, cd13, cd56, and mhc
class-I", Proceedings of the Society for
Experimental Biology and Medicine, 1999 vol. 221, nº 1, pp.
63-7).
Jiang y colaboradores (cfr. Jiang et al.,
"Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult
marrow", Nature, 2002, vol 418, pág. 41-47), han
descrito la caracterización de células madre pluripotenciales en una
población celular de la médula ósea. Esta población son las
denominadas MAPC (Células progenitoras multipotenciales adultas). En
este artículo se indica que las MAPCs expresan niveles altos de
CD13, SSEA-4 y OCT3/4, marcadores propios de células
pluripotenciales. Al igual que las células madre embrionarias, en
las MAPCs se detecta la activación de los factores de transcripción
OCT-4, NANOG y REX-1, factores que
son necesarios para mantener la célula en un estado proliferativo e
indiferenciado.
Adicionalmente, se incluyen ensayos de clonación
que demuestran que es una única célula la que es capaz de
diferenciarse a tejidos procedentes de cualquiera de las tres capas
embrionarias (endodermo, mesodermo o ectodermo). A diferencia de las
células de la invención, estas células no expresan el gen CD105 y sí
expresan el gen CD44 y CD73. El origen de estas células es
mesodérmico, mientras que el origen de las células de la invención
es ectodérmico.
La fuente de células madre pluripotenciales que
describe este artículo es la médula ósea. En las extracciones de
células madre de médula ósea es necesario una anestesia general o
local. El método que se emplea para obtenerlas es el aspirado del
contenido medular mediante la punción de un hueso. El material que
se obtiene pasa por una serie de procesos de cribado para separar
las células. Todo esto hace que la obtención de estas células sea un
proceso complejo y poco eficiente.
Por todo lo anterior existe la necesidad de
encontrar fuentes alternativas a partir de las cuales se puedan
extraer células madre pluripotenciales.
Los investigadores de la presente invención han
descubierto que la pulpa dental es una fuente de células madre
pluripotenciales. Ventajosamente, las células de la invención están
siempre presentes en los humanos, independientemente de la edad de
los mismos, aunque la proporción disminuya. Tal y como se ilustra
más abajo, las células madre obtenidas a partir de este tejido
expresan preferiblemente los marcadores CD13, SSEA4 OCT3/4 y CD105,
lo cual indica que dichas células son de tipo pluripotencial.
Además se ha comprobado que las células madre
pluripotenciales aisladas a partir de pulpa dental tienen la
capacidad de diferenciarse a tejidos procedentes de cada una de las
tres capas embrionarias. Esto las hace de interés en el campo de la
cirugía, y en particular en el campo de la reconstrucción de
tejidos, tales como óseo, neuronal y hepático.
Así, la presente invención se refiere en un
primer aspecto a una célula madre pluripotente caracterizada porque
se obtiene a partir de la pulpa dental y expresa al menos los genes
NANOG, SOX2, y expresa los marcadores SSEA4, OCT3/4 y CD105.
Entre las características ventajosas de las
células de la invención es que la fuente de donde provienen, la
pulpa dental, es de fácil extracción sin acarrear los problemas de
extracción que presentan las células de la médula ósea.
La células de la invención tienen un tamaño
pequeño entre 5 y 8 micras. Además no presentan anomalías de
cromosomas o cambios estructurales durante el cultivo, elemento muy
importante para su aplicación como terapia celular para la
regeneración de tejidos.
Por otro lado, las células de la invención son
células madre pluripotenciales adultas. Que sean adultas es de
especial importancia ya que se evita el rechazo (cuando son
transplantadas) al ser células que se extraen del mismo individuo
que ha de recibir el tratamiento.
En una realización preferida del primer aspecto
de la invención, las células madre pluripotenciales expresan,
adicionalmente, CD13, CMyc y CD90, y no expresa los marcadores CD34,
CD45, CD73 y CD44.
Los investigadores han realizado un depósito de
las células de la invención en la institución
DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un
Zellkulturen GmbH, con la identificación de referencia "Human
dental pulp pluripotent stem cells (hDPPSC)" y con nº de acceso
DSM ACC3002.
La posibilidad de extraer células madre
pluripotenciales a partir de pulpa dental supone una alternativa a
las fuentes de obtención conocidas hasta ahora de este tipo de
células, con las siguientes ventajas: facilidad de extracción, no
implica grandes riesgos frente a la intervención en médula ósea, ni
costes elevados.
El diente está formado por dos componentes
básicos: la corona y la raíz. Un diente maduro se compone de tejidos
duros: esmalte, dentina y cemento, así como de un núcleo de tejido
blando conocido como pulpa dental.
Los investigadores han utilizado preferentemente
los terceros molares, a partir de los cuales han aislado las células
que forman parte de la invención. Dado que el tercer molar es el
último diente que se desarrolla en los humanos, está normalmente en
una fase más temprana de desarrollo y es capaz de proporcionar una
cantidad óptima de tejido de pulpa dental para el aislamiento de las
células madre pluripotentes.
Noriaki y colaboradores (cfr. Noriaki et
al. "Evaluation of Pluripotency in Human Dental Pulp
Cells", J. Oral Maxillofac Surg, 2009, vol. 67, pág.
501-506), indican en este artículo que aislan
células pluripotenciales de pulpa dental. Sin embargo, en dicha
publicación los únicos ensayos incluidos demuestran la capacidad
diferenciadora a tejidos cuyo origen es para todos, la misma capa
embrionaria, el mesodermo. Como ya se ha indicado anteriormente,
existen criterios bien establecidos que permiten clasificar a una
célula como pluripotencial o multipotencial. El experto en la
materia, a partir de los ensayos de diferenciación realizados por
Noriaki et al., únicamente podría concluir que se trata de
células multipotenciales, ya que comprueba la diferenciación a
adipocito, condreocito y osteocito (tejidos que proceden de la misma
capa embrionaria) y no aporta datos que indiquen que las células
aisladas tengan la capacidad de diferenciarse a tejidos procedentes
de las otras dos capas embrionarias (endodermo y ectodermo).
Por otro lado, no hay en el artículo de Noriaki
y colaboradores ningún análisis de la presencia de marcadores que
determinen la pluripotencialidad de la célula. Tampoco muestran
otras características propias de las células pluripotenciales como
su morfología, tamaño pequeño, alto potencial proliferativo, y alta
clonogenicidad.
Por otro lado, el medio usado por Noriaki es un
medio conocido en el estado de la técnica como específico de
crecimiento de células multipotenciales (cfr. Gronthos et al
"Postnatal human dental pulp stem cells in vitro and in
vivo" PNAS, 2000, vol. 97, pág
13625-13630).
Los inventores de la presente invención han
tenido que optimizar un medio de crecimiento adecuado para conseguir
cultivar las células madre pluripotenciales presentes en la muestra
de pulpa dental. Dicho medio se caracteriza por incluir los
siguientes factores: LIF, EGF y PDGF. En el documento de Noriaki, se
utiliza un medio de cultivo propio de las células multiponteciales.
En el ejemplo 8 de la presente invención se muestra como no es
posible el crecimiento de células pluripotenciales en un medio
inadecuado, como es el medio de Noriaki para células
pluripotenciales.
Por todo lo anterior, el documento de Noriaki
describe el aislamiento de células madre multipotenciales.
En el documento (CFR. Kerkis et al,
"Isolation and characterization of a population of immature dental
pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic
stem cell markers", Cell Tissues Organs, 2006, vol 184,
105-116) se dice que se extrae células
pluripotenciales de la pulpa dental. Sin embargo el origen de las
células no es la pulpa dental, porque se indican que la obtención se
realiza en pacientes de cinco a siete años. En estas edades se
presenta gérmenes dentales, la pulpa dental y la bolsa germinal
están unidas y la separación de la pulpa del germen es inviable. El
origen de las células de Kerkis son el germen y no la pulpa. El
origen de las células de la invención es la pulpa dental, y se
pueden obtener de adultos de cualquier edad. La fuente de células de
Kerkis sólo se puede obtener de cinco a siete años. Por otro lado,
el medio que utilizan para cultivar las células es propio de células
mesenquimales, y la técnica de sembraje no es la adecuada para el
cultivo de células pluripotenciales.
Con un sembraje de 10.000 células por cm^{2}
es imposible el cultivo de células pluripotenciales por la
diferenciación a fibroblastos. En la figura 1a del documento de
Kerkis muestran las células cultivadas y su morfología no es propia
de células pluripotenciales, sino que es una morfología propia de
células multipotenciales (cfr. Todorov et al. "Multipotent
progenitor cells isolated from adult human pancreatic tissue"
TRansplant Proc., 2005 37(8), pág. 3420-1)).
El cariotipo que se muestra en la figura 1e del documento de Kerkis,
se observa alterado a pesar de que se diga que es normal, porque el
cromosoma 1 y 3, 4 no presentan el tamaño correcto. Esto implica que
la aplicación a humanos podría generar tumores. Se observan
cromosomas fragmentados.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a un cultivo de células madre definidas en el primer aspecto
de la invención, en un medio capaz de soportar la proliferación de
dichas células, dicho medio incluyendo al menos un factor de
transcripción.
En el estado de la técnica son bien conocidos
medios que soporten la proliferación de células madre
pluripotenciales, tales como el descrito en Smith y colaboradores
(cfr. Smith et al "Inhibition of pluripotential embryonic
stem cell diffentiation by purified polypeptides", Nature 1988,
vol 336, pág. 688-690).
En una realización preferida del segundo aspecto
de la invención, el medio de crecimiento comprende al menos los
factores de crecimiento EGF y PDGF, y el factor de transcripción
LIF.
En un tercer aspecto la presente invención se
refiere a un método para obtener células definidas según el primer
aspecto de la invención, que comprende los pasos de:
a) disgregación del tejido de la pulpa dental
aislada;
b) separación de las células del tejido de la
pulpa de la etapa b);
c) obtención de las células DPPSC mediante
cultivo en un medio adecuado y concentración de sembraje entre
40-60 células/cm^{2}.
Una ventaja que presenta el medio de cultivo,
rico en factores de crecimiento, y con la presencia de al menos un
factor de transcripción, y el protocolo de aislamiento es que no
produce alteraciones genéticas en las células, lo cual permite la
aplicación de estas células en terapia celular para la regeneración
de tejidos.
\newpage
La disgregación tisular consiste en romper la
malla de proteínas que forman la matriz extracelular que mantiene a
las células, que forman parte del tejido, unidas. De esta manera,
como consecuencia de la disgregación tisular, se acaba obteniendo
una suspensión de células. Para llevar a cabo la disgregación se
utilizan procesos que separan las proteínas de la matriz
extracelular (por ejemplo, secuestrando los iones calcio que
permiten la unión), o bien rompiendo proteolíticamente dichas
proteínas (mediante la acción de proteasas), consiguiendo así una
suspensión de las células presentes en el tejido. Generalmente, los
métodos empleados se pueden clasificar en tres categorías:
- a)
- mecánicos (por ejemplo cortar, picar, cribar, rascar, etc.). En cultivos celulares se emplean con frecuencia los métodos de rascado ("scarpping") de la placa para arrancar las células adheridas.
- b)
- químicos. Generalmente se trata de la adición de soluciones en las que no hay iones divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones. En cualquier caso se reduce las concentraciones de los iones que estabilizan las uniones de las proteínas de la matriz extracelular y de éstas con los receptores celulares.
- c)
- enzimáticos. Tratamiento del tejido o del cultivo celular con soluciones de proteasas activas (colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, papaína, pronasa, hialuronidasa, etc.).
En una realización preferida del tercer aspecto
de la invención, la disgregación de tejido tiene lugar mediante
digestión enzimática. Más preferiblemente, la disgregación del
tejido tiene lugar mediante digestión con colagenasa tipo I.
Para llevar a cabo la separación de las células
del tejido disgregado (etapa (b) del procedimiento de acuerdo con el
tercer aspecto de la invención), se puede usar cualquiera de las
técnicas estándar bien conocidas para el experto en la materia,
tales como la floculación, la flotación, la filtración y la
centrifugación, entre otros. En una realización preferida del
segundo aspecto de la invención, la separación tiene lugar mediante
centrifugación del tejido disgregado resultante de la etapa (a).
Forma parte del trabajo rutinario del experto en
la materia la elección de un método u otro para llevar a cabo tanto
la disgregación del tejido como la separación de las células.
Para llevar a cabo la obtención de células DPPSC
en el medio de cultivo adecuado, el sembraje debe ser de una
concentración baja, entre 40-60 células/cm^{2}. Se
observó que con concentraciones mayores de sembraje las células se
diferencian a fibroblastos, lo que se considera una contaminación.
Tal y como se ha indicado anteriormente, el hecho de que las células
aisladas de la pulpa dental sean pluripotenciales las hace de
interés en la regeneración y/o transplante de tejidos.
Así, en un cuarto aspecto la presente invención
se refiere a una composición terapéutica que comprende las células
de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable, dichas
células estando presentes en una cantidad efectiva para producir
células de tejidos.
En realizaciones preferidas del cuarto aspecto
de la invención, las células producidas son de tejido óseo, neuronal
y hepático.
Para producir células de tejido óseo, hepático y
neuronal se pueden usar técnicas bien conocidas por el experto en la
materia. Por ejemplo, si se desea la diferenciación a tejido óseo se
se podría usar cualquiera de los medios de crecimiento celular que
se describen en en Haynesworth y colaboradores (cfr. Haynesworth
et al "Characterization of cells with osteogenic potential
from human marrow", Bone, 1992, vol. 13, pág.
81-88). Para producir células de tejido hepático se
podría usar el medio de crecimiento celular que se describe en Jiang
y colaboradores (cfr. Jiang et al "Multipotent adult
progenitor cells from human bone marrow differentiate into
hepatocyte-like cells induced by
co-culture with human hepatocyte line", Zhonghua
Yi Xue Za Zhi, 2007, vol. 87, pág. 414-418). Para
producir células de tejido neuronal se podría usar el medio de
crecimiento celular descrito en Jiang y colaboradores (cfr. Jiang
et al "Multipotent progenitor cells can be isolated from
postnatal murine bone marrow, muscle and brain", Exp. Hematol.,
2002, vol. 30, 896-904).
En un quinto aspecto la presente invención se
refiere al uso de una célula pluripotencial definida en el primer
aspecto de la invención, para la fabricación de un medicamento
destinado a la regeneración, reparación de tejidos o transplante de
tejidos en mamíferos.
En una realización preferida del quinto aspecto
de la invención, la regeneración del tejido es neuronal, hepático u
óseo.
Son numerosos los protocolos existentes en el
estado de la técnica para llevar a cabo la regeneración de tejido en
general, y de tejido óseo, hepático y neuronal, en particular, a
partir de células madre pluripotenciales.
La expresión "uso de una célula
pluripotencial" incluye el uso de una población de células madre,
la cual se obtiene mediante el cultivo en medios celulares
adecuados. El número de células aplicado dependerá del tamaño de la
lesión del tejido. La aplicación se puede llevar a cabo
habitualmente mediante cirugía, de manera que las células de la
invención se pueden aplicar directamente.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
La Fig. 1 muestra en las Fig. 1A y Fig. 1B la
morfología de las células pluripotentes de la pulpa dental (DPPSC)
vistas a a través de un microscopio óptico con objetivos de 20 (Fig.
1A) y 40 (Fig. 1B) aumentos y células obtenidas cuando el cultivo
era a alta densidad vistas con objetivos de 40 (Fig. 1C) y 100 (Fig.
1D).
La Fig. 2 muestra una imagen por microscopio
convencional (20X) donde se observa la morfología de células
seleccionadas o separadas en el ejemplo 3 de la invención después de
cuatro días de cultivo.
La Fig. 3 muestra la expresión de los marcadores
NANOG y SOX2 de las células DPSSC en los pases 5, 10 y 15 y la
expresión de los marcadores en las células MSC de la pulpa.
La Fig. 4 muestra una imagen por microscopio
convencional (40x) donde se observa la morfología de las células de
la invención diferenciadas a osteoblastos en el día 4.
La Fig. 5 muestra la expresión de osteocalcina
mediante Q-RT-PCR día 4 y día 10
respecto a los controles positivo y negativo. Los resultados se
muestran en relación al control positivo (SAOS, células de
osteoblastos), al que se le da un valor de 1000.
La Fig. 6 muestra una imagen por microscopio
convencional (40x) donde se observa la morfología de las células de
la invención diferenciadas a neuronas en el día 4.
La Fig. 7 muestra la expresión de nestina
mediante Q-RT-PCR día 4 y día 10
respecto a los controles positivo y negativo. Los resultados se
muestran en relación al control positivo (Schwann), al que se le da
un valor de 1000.
La Fig. 8 muestra una imagen por microscopio
convencional (40x) donde se observa la morfología de las células de
la invención diferenciadas a hepatocitos en el día 4.
La Fig. 9 muestra la expresión de HNF3 (Factor
nuclear de hepatocitos) mediante
Q-RT-PCR día 4 y día 10 respecto a
los controles positivo y negativo. Los resultados se muestran en
relación al control positivo (Ntera), al que se le da un valor de
1000.
La Fig. 10 muestra el estudio citogenético de
las células DPPSC de la pulpa dental en el pase 15.
La Fig. 11 muestra una imagen por microscopio
convencional donde se observan los resultados del ejemplo 8. Fig 11A
Medio 2. Fig 11B Medio3.
Medio 1. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium)
se utiliza para el mantenimiento y transporte de las muestras del
quirófano al laboratorio.
Medio 2. Este medio se utiliza para el cultivo
de las células de la invención DPPSC (células pluripotenciales de la
pulpa dental). La composición del medio es 300 ml de DMEM, 200 ml de
MCDB (105 Medio SIGMA), 5 ml de SITE (insulina, transferrina,
selenito de sodio, etanolamina), 1 ml de LA-BSA
(albúmina de suero bovino), 5 ml de Pen/Strep, 5 ml de ácido
ascórbico, 10 ml de FBS (suero bovino fetal), 500 \mul de PDGF
(factor de crecimiento derivado de las plaquetas), 500 \mul de EGF
(factor de crecimiento epidérmico), 50 \mul de LIF (factor
inhibidor de leucemia), 0,4 g de BSA (albúmina de suero bovino), 5
ml de Chemically defined Lipid concéntrate.
Medio 3 MSC (células madre mesenquimales). Medio
de cultivo de las células de control. Se utiliza para el cultivo de
MSC de la médula ósea y de MSC de la pulpa dental. La composición
del medio es DMEM bajo en glucosa (DMEM-LG, Gibco
Brl 11885-084), 1X Pen/Strep (Cellgro
30-002-CI), 1X (0.1 mM) L-Ácido
ascórbico (Sigma A-8960), 2% FBS Hyclone.
Medio 4 Ntera. Se utiliza para el cultivo de la
línea celular Ntera. La composición del medio es: DMEM alto en
glucosa (DMEM-HG Gibco41966), 2% Suero de caballo
(Gibco26050-070), 10% FBS (Biochrom S 0115), 10%
Pen/Strep.
Medio 5 SAOS. Se utiliza para el cultivo de las
células SAOS. La composición del medio es: DMEM-HG,
(Gibco41966), 2% Suero de caballo (Gibco26050-070),
10% FCS (Biochrom S 0115), 10% Pen/Strep.
Medio 6 Schwann. Se utiliza para el cultivo de
células Schwann. La composición del medio es:
DMEM-LG, (Gibco 41966), 2% Suero de caballo (Gibco
26050-070), 10% FCS (Biochrom S 0115), 10%
Pen/Strep.
Medio 7. Medio de diferenciación basal. La
composición del medio es: 60% DMEM-LG (GIBCO/BRL),
40% MCDB-201 (Sigma) con 1X
insulina-transferrina-selenio, 1X
ácido linoleico BSA (albúmina modificada con linoleico), 10^{-9} M
dexametasona (Sigma), y 10^{-4} M ácido ascórbico
2-fosfato (Sigma), 100 unidades de penicilina y
1.000 unidades de estreptomicina (GIBCO).
Medios 8 de diferenciación.
A: Medio de hepatocitos: Medio de diferenciación
basal con 10 ng/ml FGF-4 (R&D Systems), 10 ng/ml
HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) (R&D Systems).
B: Medio de neuronas: los primeros 4 días se
utilizó medio basal, 100 ng/ml factor de crecimiento de fibroblastos
básico (bFGF). En el día 5 se cambio el medio por el medio basal,
FGF8 (10 ng/ml), SHH (100 ng/ml). El octavo día: basal media, BDNF
(Factor neurotropico derivado del cerebro) (10 ng/ml), GDNF (Factor
neurotropico derivado de célula glial) (10 ng/ml) + N2 (R & D
Systems).
C: Medio osteogénico: DMEM-LG
(GIBCO/BRL), Glutamina (100X), Antibiótico (100X), FBS 10%, 0,01
\muM 1,25 dihidroxivitamina D3(1000X), 50 \muM
ascorbato-2-fosfato (1000X), 10
\mu M B-Glicerolfosfato (32,67X).
Inmediatamente después de la extracción de los
terceros molares se procedió a realizar el lavado de los mismos
utilizando una gasa mojada con etanol al 70% y posteriormente con
agua destilada estéril.
Se realizó un corte entre el esmalte y el
cemento utilizando una fresa cilíndrica de turbina sujetando el
diente con fórceps de incisivos superiores.
Se realizó una fractura en la misma línea del
corte mediante dos fórceps de incisivos superiores y se colocaron
los dos fragmentos del diente en un frasco de Falcon con el Medio
1.
Se trasladaron las muestras al laboratorio. Una
vez en la campana de flujo, se virtió el contenido en una placa de
Petri.
Se procedió a aislar los tejidos de la pulpa
dental mediante una lima de tiranervios del 15 y una pinza de
estériles.
Posteriormente, utilizando una jeringa de
insulina, se realizó un lavado de los conductos con DMEM y se
descartaron los fragmentos dentarios.
El siguiente paso fue realizar la disgregación
celular mediante la digestión de colagenasa tipo I (3 mg/ml) del
tejido de pulpa durante 40 minutos a 37ºC, posteriormente se
centrifugó la muestra durante diez minutos a 1.800 rpm para separar
las células del tejido disgregado.
Se realizó un lavado de las células con PBS
(tampón fosfato salino) estéril y se centrifugó de nuevo durante 15
minutos a 1.800 rpm, y se determinó la viabilidad celular mediante
la tinción con trypan blue. El porcentaje de la viabilidad celular
era alrededor del 95%.
Se resuspendieron las células en el medio 2. Se
incubaron las células obtenidas a 37ºC durante 2-3
días en frascos previamente tratados con fibronectina y se evaluó la
aparición de clones o células pegadas al frasco del cultivo. Cuando
se observaron suficientes células pegadas, se tripsinizaron y se
expandieron manteniendo siempre una densidad baja.
Las células fueron cultivadas en placas de seis
pocillos tratadas con fibronectina humana al 10% en PBS (BD
Bioscience) una hora antes de sembrar las células en la incubadora
de CO_{2}. En el segundo día se añadieron 2 ml de medio de cultivo
y en el cuarto día se aspiraron 2 ml y se añadieron 2 ml de medio
nuevo. A partir de la semana se cambió el medio cada tres días.
Para los diferentes análisis mediante citometría
de flujo (FACS) fue necesario añadir a las células anticuerpos
portadores de fluorocromo (Ver tabla 1).
- MS:MS, HUM (producido en ratón, reconoce ratón y humano)
\vskip1.000000\baselineskip
Como control de fluorescencia se utilizaron
anticuerpos IgGI unidos a isotiocianato de fluoresceína (FITC),
ficoeritrina (PE), PE-Cy5 (BD Pharmingen). La
suspensión celular (células resuspendidas en PBS y 2% FBS) se
dividió en fracciones de 1,5 millones de células y se incubaron con
los respectivos anticuerpos durante 45 minutos a 4ºC y en la
oscuridad. Posteriormente, las células se lavaron 2 veces con PBS y
2% FBS, y se centrifugaron 6 minutos a 1.800 rpm. Esto evitó que
quedaran restos del fluorocromo, ya que darían un falso porcentaje
de fluorescencia.
Dependiendo del número de células, estás se
resuspendieron entre 300-600 \mul de PBS y 2%
FBS.
Todas las medidas de citometría de flujo se
realizaron en el citómetro FACScan y su análisis se llevó a cabo
mediante el programa winMDI 2.8.
Durante todo el proceso de cultivo, las células
se controlaron y se observaron al microscopio para descartar la
posible contaminación por levaduras, hongos o bacterias. Se intentó
mantener una densidad baja teniendo en cuenta la proporción de
células pequeñas (5-8 micras) respecto las grandes
(10-25 micras), con el objeto de intentar aumentar
el número de células pequeñas. Son estas células pequeñas las
propias de la invención. En el análisis de la morfología de las
células madre de la pulpa dental se realizó un seguimiento
exhaustivo de los cultivos para que tuvieran capacidad adherente,
hasta alcanzar la subconfluencia de estas células. En la Fig. 1 (A y
B) se observa el aspecto de la morfología de las células
pluripotentes de la pulpa dental (DPPSC) vistas a través de un
microscopio óptico con objetivos de 20 y 40 aumentos,
respectivamente. Es importante que la densidad de siembra sea baja
preferentemente entre 40-60 células por cm^{2}. En
la Figura 1 (B, C) se observa el aspecto de la morfología de las
células cuando la densidad de siembra es alta 80-100
células por cm^{2}. A estas densidades de siembra las células
pluripotenciales se diferencian y se observan un tipo diferente de
célula, grande y con morfología fusiforme.
\vskip1.000000\baselineskip
Este análisis se realizó al cabo de una, dos y
tres semanas de cultivo. En este estudio se analizó el fenotipo de
células de distintos clones obtenidos a partir de una muestra de
pulpa dental de un donantes de 14, 17, 18, 28, 38 años de edad
cultivadas a baja densidad, 80 a 100 células por cm^{2}, y
expandirlas cuando el cultivo llegó a una confluencia de cultivo al
70%.
El análisis por FACS se realizó en cada semana
de cultivo de las células de todos los clones (14, 17, 18, 28, 38
años) durante tres semanas de cultivo para ver el cambio de
porcentaje de marcadores específicos de pluripotencialidad. Se
utilizaron los anticuerpos CD13 FITC, SSEA4 PE, OCT3/4 FITC. Se
analizaron más de 200.000 células por cada muestra para detectar
uniones inespecíficas o autofluorescencia. No se detectaron uniones
inespecíficas. También se observó una disminución de la presencia de
marcadores específicos de DPPSC con el aumento de la edad, pero se
veían aumentados durante el cultivo (Ver Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
- PAC Y: paciente con edad Y.
Se observa un aumento del porcentaje de
marcadores específicos de células DPPSC, cultivadas a baja densidad
celular, respecto al tiempo de cultivo. También se observa una
disminución de la presencia de marcadores específicos de DPPSC con
el aumento de la edad aunque, como se ha indicado anteriormente, se
vea aumentado el porcentaje de marcadores durante el tiempo de
cultivo.
Se realizó también un análisis adicional por
FACS utilizando la muestra del donante de 14 años en la tercera
semana de cultivo. Además de los anticuerpos CD13, SSEA4, OCT3/4, se
utilizaron los marcadores CD45, CD73, CD105, CD34. La tabla 3
muestra los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
Según se desprende de la tabla 3 las células
DPPSC de la invención expresan los marcadores CD105, CD14, CD90,
CD13, SSEA4, OCT3/4 y no expresan los marcadores CD45, CD73, CD44 y
CD34, por ser la mayoría marcadores de células pluripotenciales,
queda demostrado la pluripotencialidad de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo una muestra de pulpa dental de un
paciente de 18 años.
Seguidamente, se aislaron por FACS las
poblaciones positivas al CD13 FITC (eBioscience) y SSEA4 PE
(eBioscience), y se aisló también la población doble positivas al
CD13 y SSEA4. Se recogieron las células en placas de cultivos de 24
pocillos. La separación por FACS se realizó en un Coulter, EPICS
ELITE-ESP®.
Se realizó la separación, mediante citometría de
flujo, de la población de células SSEA4 positivas (SSEA4+)
contenidas en la muestra original de la pulpa dental obtenida el
mismo día de la extracción. De estas células se estudió su fenotipo
y se comparó con el de las células DPPSC cultivadas pero no
seleccionadas por citometría de flujo.
La citada separación o el aislamiento se realizó
en un citómetro de flujo con un dispositivo separador de células,
EPICS ELITE-ESP®.
Se consiguieron separar 250 células positivas a
SSEA4 (SSEA4+), se cultivaron estas células en una placa de 90
pocillos tratadas con fibronectina humana (BD Bioscience) una hora
antes de sembrar las células en la incubadora a 37ºC y 5% de
CO_{2}. En cada pocillo se sembraron 10 células con 150 ml de
Medio 2.
Las células así separadas sobrevivieron al
proceso y fueron proliferando hasta obtener los pocillos
subconfluentes. También presentaban una morfología muy similar a las
DPPSC de la pulpa dental no separadas por citometría (ver Fig.
2).
También se determinó el fenotipo de estas
células mediante marcadores siendo similar a las células de la pulpa
dental no separadas por citometría (ejemplo 2). Ver tabla 4.
De esta tabla se desprende que el proceso de
aislamiento celular mediante citómetro (cell-sorter)
no mejora la pureza o homogeneidad de las DPPSC obtenidas mediante
el cultivo in vitro durante distintos pases.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la expresión de genes mediante
Q-RT-PCR se utilizó el sistema
Syber-Green.
En este sistema la reacción se llevó a cabo en
un volumen de 22 \mul totales: 20 \mul de mezcla
(Syber-Green subermix) y 2 \mul de muestra de ADN
complementario (cDNA Las muestras se sometieron a 40 ciclos tras un
ciclo de desnaturalización de 2 min. A 50ºC. Se utilizaron en todos
los casos un control positivo y negativo para cada muestra, así como
un control de carga GAPDH
(Gliceraldehído-fosfato-deshidrogenasa).
Mediante
Q-RT-PCR se demostró la expresión
NANOG, SOX-2, en las células DPPSC de la pulpa
dental del clon del paciente con 14 años, y se realizó la
comparación de expresión de estos genes en pase 5, 10, 15,
utilizando la células NTERA como control positivo y MSC de la pulpa
como control negativo.
Se observó que la expresión del NANOG y
SOX-2 aumentaba entre los pases 5, 10 y el pase 15.
Ver Fig. 3.
Anteriormente se realizó la eficiencia de
amplificación de cada gen en las células NTERA en diferentes
concentraciones (1, 0.1, 0.0 1, 0.001, 0.0001) del cDNA. Se observo
que la amplificación del cDNA resulta lineal entre 19.98 a 28.46
ciclos para GAPDH, entre 24.15 a 30.73 ciclos para NANOG, y entre
25.30 a 31.27 ciclos para SOX-2. Las pendientes de
amplificación de los genes fueron: GAPDH y = 3,0196x +14,412,
R^{2} = 0,97. NANOG y=3,2878x+20,841, R^{2} = 0,9999. Sox2 y =
2,9832x + 22,563, R^{2} = 0,9802. Las secuencias de los cebadores
y sondas utilizadas se describen a continuación:
Detección de GADPH por
Syber-Green:
| Cebador directo (SEC ID NO 1): | TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC | |
| Cebador reverso (SEC ID NO 2): | ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC |
\vskip1.000000\baselineskip
Detección SOX-2 sistema
Syber-Green:
| Cebador directo (SEC ID NO 3): | GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG | |
| Cebador reverso (SEC ID NO 4): | TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG |
\vskip1.000000\baselineskip
Detección NANOG sistema
Syber-Green:
| Cebador directo (SEC ID NO 5): | AAAGAATCTTCACCTATGCC | |
| Cebador reverso (SEC ID NO 6): | GAAGGAAGAGGAGAGACAGT |
\vskip1.000000\baselineskip
Con el objetivo de determinar la
pluripotencialidad de las DPPSC de la pulpa dental analizamos el
potencial de diferenciación in vitro hacia tejidos de cada
una de las tres capas embrionarias, mesodermo, endodermo y
ectodermo.
Se sembraron las células a diferenciar en placas
de 24 pocillos en el medio de cultivo a una densidad de 3 x 10^{3}
células por cm^{2} en medio basal. Al día siguiente se cambió el
medio de cultivo por medio de diferenciación
DMEM-LG, 10% FBS, 10 mM
\beta-glicerolfosfato (Sigma), 50 \muM de ácido
L-ascórbico (Sigma), 0,01 \muM 1,25 dexametasona y
1% penicilina y streptomicina. Se cambió el medio cada 3 días
durante 10 días. Mediante técnicas de
Q-RT-PCR se demostró que estas
células se habían diferenciado a tejido óseo, expresando genes
específicos de este tejido, como osteocalcina. Para determinar la
presencia de osteocalcina en
Q-RT-PCR se utilizó como cebador
directo la secuencia (SEC ID NO 7) GGTGCAGAGTCCAGCAAAGG y como
cebador reverso la secuencia (SEC ID NO 8) AGCGCCTGGGTCTCTTCCTA.
Se utilizaron células de SAOS como control
positivo y células DPPSC de pulpa dental indiferenciadas como
control negativo y GAPDH como gen constitutivo (HK). Como se observa
en la Fig. 5 la concentración de osteocalcina se ve aumentada en el
día 4 respecto al día 0.
En la Fig. 4 se observa también la
diferenciación a osteoblastos por microscopio convencional,
mostrando las células la morfología propia de dicho tipo
celular.
Se sembraron las células a diferenciar en placas
de 24 pocillos en el medio de cultivo a una densidad de
25-30 células por cm^{2} en medio basal. Al día
siguiente se cambió el medio de cultivo por medio de diferenciación;
en los primeros 4 días medio basal 100 ng/ml (bFGF); el octavo día,
medio basal m, FGF8 (10 ng/ml), SHH (100 ng/ml), BDNF (10 ng/ml),
GDNF (10 ng/ml) + N2 (R&D Systems). Se cambió el medio cada 3
días durante 10 días. En la Q-RT-PCR
se utilizaron células de Schwann como control positivo y GAPDH como
control de carga (HK). Como se observa en la Fig. 7 la concentración
de NESTINA aumentó en el día 4 respecto al día 0.
Para determinar la NESTINA en
Q-RT-PCR se utilizó como cebador
directo la secuencia (SEC ID NO 9) CAGGA
GAAACAGGGCCTACA y como cebador reverso la secuencia (SEC ID NO 10) TGGGAGCAAAGATCCAAGAC.
GAAACAGGGCCTACA y como cebador reverso la secuencia (SEC ID NO 10) TGGGAGCAAAGATCCAAGAC.
En la Fig. 6, se observa también la
diferenciación a neuronas por microscopio convencional, mostrando
las células la morfología propia de las neuronas.
Se sembraron las células a diferenciar en placas
de 24 pocillos en el medio de cultivo a una densidad de 25 \times
10^{3} células por cm^{2} en medio basal. Al día siguiente se
cambió el medio de cultivo por medio de diferenciación: medio basal
sin FBS, 10 ng/ml HGF, 10 ng/ml FGF-4 (R&D
Systems). Se cambió el medio cada 3 días durante 10 días. Mediante
técnicas de Q-RT-PCR se determinó
que estas células se habían diferenciado a tejido hepático,
expresando genes específicos de este tejido como HNF3 (Factor
nuclear de hepatocitos). Se utilizaron células Ntera como control
positivo y GAPDH como control de carga (HK). Como se observa en la
Fig. 9 la concentración de HNF3 se ve aumentada en el día 4 respecto
al día 0.
Para determinar la presencia de HNF3 en
Q-RT-PCR se utilizó como cebador
directo la secuencia (SEC ID NO 11) CAGGAGAAACAGGGCCTACA y como
cebador reverso la secuencia (SEC ID NO 12) TGGGAGCAAAGATC
CAAGAC.
CAAGAC.
En la Fig. 8 se observa también la
diferenciación a hepatocitos por microscopio convencional, mostrando
las células la morfología propia de este tipo de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un estudio cada semana de
citogenética y microscopía electrónica de barrido (SEM) para ver si
había anomalías de cromosomas o cambios de estructuras celulares de
cultivo. Esto se realizó con el objetivo de aplicar estas células a
nivel clínico en el futuro como terapia celular para la regeneración
de tejidos.
En la Fig. 10 se muestra el citado estudio
citogenético y SEM y puede apreciarse que no se observan ni
anomalías ni fragmentación de cromosomas o de estructuras celulares.
Para este estudio se analizaron 200 metafases y se observó más del
85% de las células sin anomalías o fragmentaciones. En 15% de las
metafases restantes, se observaron roturas cromosómicas, las cuales
son habituales como consecuencia de la técnica utilizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se comparó la expresión o no de los genes
mostrados el la tabla 5, mediante FACS de las células de las
invención DPPSC, MAPSC (células madre adultas multipotentes
progenitoras), MSC (Células madre mesenquimales), IPS (induced
pluripotent stem) y Ntera.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una comparativa entre el Medio 2, el
Medio para DPPSC, el Medio 3, y el Medio MSC con la finalidad de
determinar cuál de ellos permitía obtener las células madre
pluripotenciales de la presente invención. Para ello, se utilizó una
muestra de la pulpa dental del mismo paciente. En el mismo día la
muestra fue repartida en dos partes; una parte en medio de MSC y la
otra parte en medio de DPPSC. Se mantuvo con la misma concentración
de sembraje durante 3 semanas y se observó la gran diferencia de
morfología y de fenotipo. Esto demuestra que las células DPPSC solo
pueden vivir en su medio escrito. La Fig. 11 muestra las células que
se cultivaron en el medio 2 a la izquierda (Fig. 11A) y las células
que se cultivaron en el medio 3 a la derecha (Fig. 11B).
\vskip1.000000\baselineskip
<110> UIC Universidad Internacional de
Cataluña
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Células madre pluripotenciales
obtenidas a partir de la pulpa dental
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P1454ES00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo detección
gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenasa (GADPH)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador reverso detección
gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenasa (GADPH)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo detección gen SOX2
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador reverso detección gen SOX2
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo detección gen NANOG
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso detección gen NANOG
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo detección del gen
osteocalcina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso detección gen
osteocalcina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo detección del gen
nestina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso detección del gen
nestina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo gen (HNF3) Factor
nuclear de hepatocito
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso gen (HNF3) Factor
nuclear de hepatocito
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Célula madre pluripotente que tiene la
identificación de referencia "Human dental pulp pluripotent stem
cells (hDPPSC)" en la institución DSMZ-Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen un Zellkulturen GmbH con nº de acceso
DSM ACC3002.
2. Cultivo de una célula madre según la
reivindicación 1 en un medio capaz de soportar la proliferación de
dichas células, dicho medio incluyendo al menos un factor de
transcripción.
3. Cultivo según reivindicación 2
caracterizado porque el medio comprende al menos los factores
de crecimiento EGF y PDGF, y al menos el factor de transcripción
LIF.
4. Método para obtener células madre
pluripotenciales de acuerdo con cualquiera la reivindicación 1, que
comprende los pasos de: (a) disgregación del tejido de la pulpa
dental aislada de un ser mamífero; y (b) separación de las células
madre del tejido disgregado resultante de la etapa (a) c) cultivo de
las células en un medio que presente al menos un factor de
transcripción.
5. Composición terapéutica que comprende una
célula madre pluripotente según se definen en la reivindicación 1 y
un portador farmacéuticamente aceptable, dicha célula estando
presente en una cantidad efectiva para producir células de
tejidos.
6. Composición terapéutica según reivindicación
5 para producir células del tejido óseo.
7. Composición terapéutica según reivindicación
5 para producir células del tejido neuronal.
8. Composición terapéutica según reivindicación
5 para producir células del tejido hepático.
9. Uso de una célula pluripotencial según se
define en la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento
destinado a la regeneración, reparación de tejidos o transplante de
tejidos en mamíferos.
10. Uso según reivindicación 9, para la
regeneración de tejido óseo.
11. Uso según reivindicación 9, para la
regeneración de tejido neuronal.
12. Uso según la reivindicación 9, para la
regeneración de tejido hepático.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200930488A ES2360434B1 (es) | 2009-07-21 | 2009-07-21 | Celulas madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental. |
| EP10745189.0A EP2456863B1 (en) | 2009-07-21 | 2010-07-21 | Pluripotent stem cells obtained from dental pulp |
| US13/386,324 US9017663B2 (en) | 2009-07-21 | 2010-07-21 | Pluripotent stem cells obtained from dental pulp |
| PL10745189T PL2456863T3 (pl) | 2009-07-21 | 2010-07-21 | Pluripotencjalne komórki macierzyste otrzymywane z miazgi zęba |
| DK10745189.0T DK2456863T3 (en) | 2009-07-21 | 2010-07-21 | Pluripotent stem cells obtained from dental pulp |
| ES10745189.0T ES2611922T3 (es) | 2009-07-21 | 2010-07-21 | Células madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental |
| PCT/EP2010/060539 WO2011009878A1 (en) | 2009-07-21 | 2010-07-21 | Pluripotent stem cells obtained from dental pulp |
| US14/538,220 US20150299661A1 (en) | 2009-07-21 | 2014-11-11 | Pluripotent stem cells obtained from dental pulp |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200930488A ES2360434B1 (es) | 2009-07-21 | 2009-07-21 | Celulas madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2360434A1 ES2360434A1 (es) | 2011-06-06 |
| ES2360434B1 true ES2360434B1 (es) | 2012-04-12 |
Family
ID=43498792
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200930488A Expired - Fee Related ES2360434B1 (es) | 2009-07-21 | 2009-07-21 | Celulas madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental. |
| ES10745189.0T Active ES2611922T3 (es) | 2009-07-21 | 2010-07-21 | Células madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10745189.0T Active ES2611922T3 (es) | 2009-07-21 | 2010-07-21 | Células madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9017663B2 (es) |
| EP (1) | EP2456863B1 (es) |
| DK (1) | DK2456863T3 (es) |
| ES (2) | ES2360434B1 (es) |
| PL (1) | PL2456863T3 (es) |
| WO (1) | WO2011009878A1 (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9790468B2 (en) * | 2013-03-15 | 2017-10-17 | Avita Iinternational Ltd. | Multifunctional immature dental pulp stem cells and therapeutic applications |
| US11105013B2 (en) | 2014-04-15 | 2021-08-31 | Neo Industries Llc | Ionic liquid electrolyte and method to electrodeposit metals |
| ES2799406T3 (es) * | 2014-07-07 | 2020-12-17 | Medipost Co Ltd | Función promotora del crecimiento del cabello de células madre de tamaño pequeño y uso de las mismas |
| JP6894674B2 (ja) * | 2016-06-13 | 2021-06-30 | 学校法人 日本歯科大学 | 肝臓組織再生用組成物 |
| CN107267451A (zh) * | 2017-07-27 | 2017-10-20 | 温州优牙生物科技有限公司 | 一种原代牙髓干细胞的制备方法及构建牙髓干细胞库的方法 |
| JP2020079329A (ja) * | 2020-03-03 | 2020-05-28 | 学校法人 日本歯科大学 | 肝臓組織再生用組成物 |
| EP3909593A1 (en) | 2020-05-15 | 2021-11-17 | Rigshospitalet | Stem cells for treating skin lesions |
| WO2023227972A1 (en) | 2022-05-24 | 2023-11-30 | Iceta - Instituto De Ciências, Tecnologias E Agroambiente Da Universidade Do Porto | Process for preparation and cryopreservation of dental pulp from definitive teeth and products thereof based on isolated mesenchymal stem cells |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080152629A1 (en) * | 2000-12-06 | 2008-06-26 | James Edinger | Placental stem cell populations |
| CA2530416C (en) * | 2003-06-27 | 2015-08-25 | Ethicon, Incorporated | Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making and using the same |
| WO2006088867A2 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | Medistem Laboratories, Incorporated | Method for expansion of stem cells |
| WO2008080200A1 (en) * | 2006-12-29 | 2008-07-10 | Irina Kerkis | Process for obtaining stem cells |
| WO2009072527A1 (ja) * | 2007-12-05 | 2009-06-11 | National University Corporation Nagoya University | 歯髄幹細胞を用いた自家又は同種移植用組成物及びその用途 |
| ITRM20080342A1 (it) * | 2008-06-26 | 2009-12-27 | Univ Degli Studi Udine | Cellule di polpa dentale midollo-simili, metodi per isolamento ed uso. |
-
2009
- 2009-07-21 ES ES200930488A patent/ES2360434B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-07-21 DK DK10745189.0T patent/DK2456863T3/en active
- 2010-07-21 US US13/386,324 patent/US9017663B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-07-21 PL PL10745189T patent/PL2456863T3/pl unknown
- 2010-07-21 WO PCT/EP2010/060539 patent/WO2011009878A1/en active Application Filing
- 2010-07-21 ES ES10745189.0T patent/ES2611922T3/es active Active
- 2010-07-21 EP EP10745189.0A patent/EP2456863B1/en active Active
-
2014
- 2014-11-11 US US14/538,220 patent/US20150299661A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9017663B2 (en) | 2015-04-28 |
| WO2011009878A1 (en) | 2011-01-27 |
| EP2456863B1 (en) | 2016-09-14 |
| EP2456863A1 (en) | 2012-05-30 |
| ES2611922T3 (es) | 2017-05-11 |
| US20150299661A1 (en) | 2015-10-22 |
| US20120251504A1 (en) | 2012-10-04 |
| DK2456863T3 (en) | 2017-01-09 |
| ES2360434A1 (es) | 2011-06-06 |
| PL2456863T3 (pl) | 2017-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2360434B1 (es) | Celulas madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental. | |
| Fong et al. | Derivation efficiency, cell proliferation, freeze–thaw survival, stem-cell properties and differentiation of human Wharton’s jelly stem cells | |
| Guo et al. | Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root | |
| KR100489248B1 (ko) | 제대혈 유래 간엽줄기세포ㆍ전구세포의 분리배양방법 및간엽조직으로의 분화유도방법 | |
| AU2009343787B2 (en) | Isolation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells | |
| You et al. | Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid | |
| ES2394261T3 (es) | Materiales y métodos relacionados con terapias basadas en células | |
| US20110312091A1 (en) | Pluripotent stem cells, method for preparation thereof and uses thereof | |
| CN106834218B (zh) | 人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法 | |
| TWI523947B (zh) | 人類多能性類胚胎幹細胞先驅細胞 | |
| WO2009061024A1 (en) | Method for isolating and culturing adult stem cells derived from human amniotic epithelium | |
| Ennis et al. | Isolation, characterization, and differentiation of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) | |
| Coppes et al. | Stem cell therapy to reduce radiation-induced normal tissue damage | |
| CN104946590A (zh) | 成人骨髓中Muse细胞诱导为神经前体细胞的方法 | |
| Pilbauerova et al. | Enzymatic Isolation, Amplification and Characterization of Dental Pulp Stem Cells. | |
| KR20080104274A (ko) | 성인 치주 여포 조직으로부터의 배아-유사 줄기세포군의 수집 및 선택 방법 | |
| KR101429110B1 (ko) | 정소의 체세포-유래의 다능성 줄기세포, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 발기부전 치료용 약학 조성물 | |
| US20160053228A1 (en) | Isolation, expansion and characterization of precursor/stem cells from dental tissues | |
| KR20140016841A (ko) | 태아연골조직유래 줄기세포원 및 이를 포함하는 세포치료제 | |
| Sonoyama et al. | Multipotent stem cells in dental pulp | |
| CN102533641B (zh) | 体外无血清成体干细胞放大培养的方法及其培养液 | |
| Obokata et al. | Stem Cells in Tissue Engineering | |
| TWI573873B (zh) | 體外無血清成體幹細胞放大培養技術 | |
| KUMAR et al. | Cellular Properties and Expression of Pluripotent Markers in Human Dental Pulp Stem Cells Cultured in Serum-Free Medium. | |
| EP3523417A1 (en) | Method of cultivation of human salivary gland cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2360434 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20120412 |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20210915 |