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JP2016163579A - 細胞からの脂質の抽出およびそれに由来する生産物 - Google Patents

細胞からの脂質の抽出およびそれに由来する生産物 Download PDF

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Abstract

【課題】細胞を溶解し、細胞を塩基および／または塩と接触させ、および脂質を分離することにより微生物細胞から脂質を得る方法の提供。
【解決手段】微生物細胞組成物から脂質を得る方法であって、前記細胞組成物のｐＨを８以上に上昇させるステップと、前記細胞組成物から脂質を分離するステップと、を含み、前記脂質が５重量％未満の有機溶媒を含有する、方法。更にｐＨを上昇させるステップの後に塩を添加するステップを行うことが好ましい方法。又はｐＨを上昇させるステップの後に加熱するステップを行うことが好ましい方法。
【選択図】図１

Description

発明の詳細な説明
［発明の背景］
［発明の分野］
[0001]本発明は、細胞を溶解し、細胞のｐＨを上昇させ、および／または細胞を塩と接触させ、並びに脂質を分離することにより、細胞から脂質を得る方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により調製される脂質にも関する。本発明はまた、特定のアニシジン価、過酸化物価、および／またはリン含量を有する微生物脂質にも関する。
［背景技術］
[0002]微生物細胞から多価不飽和脂肪酸などの脂質を得る典型的な方法には、所望の脂質の産生能を有する微生物を発酵槽、池またはバイオリアクターで増殖すること、微生物細胞バイオマスを含む発酵ブロスを分離すること、微生物細胞バイオマスを乾燥させること、および溶媒抽出により脂質を分離することが関わる。分離における工程としては、発酵ブロスを水で希釈する工程、希釈したブロスを遠心する工程、微生物細胞を溶解する工程、および脂質が可溶な水不混和性溶媒、例えばヘキサンを混合物に添加することにより溶解細胞から細胞内脂質を抽出する工程が含まれ得る。
[0003]微生物細胞から脂質を取り出す別の抽出方法は、機械的な力（例えばホモジナイゼーション）、酵素処理、または化学的処理を用いることにより細胞壁を破壊して、発酵ブロス中に細胞を溶解することである。脂質、微生物細胞バイオマス、および水を含む得られた組成物から、有機溶媒、例えばイソプロピルアルコールを使用して脂質を抽出することができる。脂質は組成物から機械的に分離してもよく、脂質およびバイオマス廃水流の双方からアルコールを取り除かなくてはならない。例えば、国際公開第０１／７６３８５号パンフレットおよび国際公開第０１／７６７１５号パンフレットを参照のこと。
[0004]しかしながら、工業規模の脂質生産では、上記の方法のいずれを用いるものも、多量の揮発性且つ引火性の有機溶媒が必要であり、従って危険な運転条件が生じる。抽出法における有機溶媒の使用はまた、必然的に防爆性の脂質回収システムの使用も伴うため、脂質回収コストが増し得る。さらに、微生物細胞からの脂質の抽出に有機溶媒を使用すると、完備された溶媒回収システムまたは適切な廃棄処分方法が求められる有機溶媒廃液流が生じ得るため、脂質抽出の全体的な生産コストがさらに増す。例えば、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）の放散に関する厳しい規制から、さらなる人員並びに容器および他の設備に対する付加コストが要求される。
[0005]従って、有機溶媒を使用することなく細胞から脂質を得る方法が必要とされている。有機溶媒を使用せずに細胞から脂質を分離する方法がいくつか提案されている。例えば、米国特許第６，７５０，０４８号明細書は、実質的に非乳化脂質が得られるまで乳濁液が洗浄水溶液で洗浄される水洗浄方法を開示している。しかしながら、一部の実施形態では、この方法には複数の洗浄工程が必要であり、そのために相当なコストおよび時間を要する。米国特許第７，４３１，９５２号明細書は、溶解細胞を遠心して細胞壁残屑を取り除き、次に油を抽出および精製する方法を開示している。しかしながら、この方法が提供する粗油は、綿密なさらなる精製を必要とするものである。従って、揮発性溶媒を利用することなく細胞から脂質を抽出する方法であって、容易に利用可能な機器および最小限の工程数を用いて実施して高純度の脂質を提供することができる方法が必要とされている。
［発明の概要］
[0006]本発明は、微生物細胞組成物から脂質を得る方法に関し、この方法は、細胞組成物のｐＨを８以上に上昇させるステップと、細胞組成物から脂質を分離するステップとを含み、ここで脂質は場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒を含有する。
[0007]一部の実施形態では、ｐＨを上昇させるステップにより細胞組成物が溶解する。一部の実施形態では、ｐＨを上昇させるステップにより細胞組成物が解乳化する。
[0008]一部の実施形態では、本方法は、細胞組成物に塩を添加するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップを含む。一部の実施形態では、塩を添加するステップはｐＨを上昇させるステップの後に行われる。
[0009]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を加熱するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、加熱するステップはｐＨを上昇させるステップの後に行われる。
[0010]一部の実施形態では、本方法は、細胞組成物のｐＨを２度目に上昇させるステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ｐＨを２度目に上昇させるステップは、塩を添加するステップまたは加熱するステップの後に行われる。
[0011]本発明はまた、細胞から脂質を得る方法にも関し、この方法は、細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、溶解細胞組成物のｐＨを８以上に上昇させるステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、溶解細胞組成物に塩を添加するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップとを含み、ここで脂質は場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒を含有する。
[0012]本発明は、細胞組成物から脂質を得る方法に関し、この方法は、細胞組成物のｐＨを８以上に上昇させるステップであって、それにより細胞組成物を溶解し、および細胞組成物を解乳化するステップと、細胞組成物に塩を添加するステップと、解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップとを含み、ここで脂質は場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒を含有する。
[0013]本発明はまた、細胞から脂質を得る方法にも関し、この方法は、細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、細胞組成物を撹拌するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップとを含み、ここで脂質は場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒を含有する。
[0014]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を加熱するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、加熱するステップは塩を添加するステップの後に行われる。
[0015]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を撹拌するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、撹拌するステップは５分間〜９６時間である。
[0016]一部の実施形態では、撹拌するステップは、３５０センチメートル毎秒〜９００センチメートル毎秒の先端速度を有するインペラで細胞組成物を撹拌することを含む。
[0017]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物のｐＨを上昇させるステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、溶解細胞組成物のｐＨを上昇させるステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップは、塩基を添加することを含む。一部の実施形態では、第２の塩基が、塩を添加するステップまたは加熱するステップの後に添加される。
[0018]一部の実施形態では、加熱するステップは１０分間〜９６時間である。
[0019]一部の実施形態では、細胞組成物は６０℃〜１００℃の温度に加熱される。一部の実施形態では、細胞組成物は９０℃〜１００℃の温度に加熱される。
[0020]一部の実施形態では、ｐＨを上昇させるステップは、塩基を添加することを含む。一部の実施形態では、塩基は１〜１２のｐＫｂを有する。
[0021]一部の実施形態では、脂質を分離するステップは１０℃〜１００℃の温度で起こる。
[0022]一部の実施形態では、本方法は、かき混ぜるか、混ぜ合わせるか、ブレンドするか、振盪するか、振動させるか、またはそれらの組み合わせにより、溶解細胞組成物を撹拌するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、０．１ｈｐ／１０００ｇａｌ〜１０ｈｐ／１０００ｇａｌ溶解細胞組成物で溶解細胞組成物を撹拌するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、２００ｆｔ／分〜１，０００ｆｔ／分のインペラ先端速度を有する撹拌機で溶解細胞組成物を撹拌するステップを含む。
[0023]一部の実施形態では、溶解するステップは、機械的処理、物理的処理、化学的処理、酵素的処理、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、機械的処理はホモジナイゼーションである。
[0024]一部の実施形態では、塩は溶解細胞組成物の０．１重量％〜２０重量％の量で添加される。一部の実施形態では、塩は溶解細胞組成物の０．５重量％〜１５重量％の量で溶解細胞組成物に添加される。一部の実施形態では、塩は溶解細胞組成物の２重量％〜１０重量％の量で溶解細胞組成物に添加される。
[0025]一部の実施形態では、塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、硫酸塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。一部の実施形態では、塩は硫酸ナトリウムである。
[0026]一部の実施形態では、分離するステップは、遠心することを含む。一部の実施形態では、分離するステップは、３０℃〜９０℃の温度で遠心することを含む。
[0027]一部の実施形態では、本方法は、少なくとも５０重量％のトリグリセリドを含む脂質を提供する。
[0028]一部の実施形態では、本方法は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価を有する脂質を提供する。
[0029]一部の実施形態では、本方法は、５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価を有する脂質を提供する。
[0030]一部の実施形態では、本方法は、１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する脂質を提供する。
[0031]一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％の所望の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を有する脂質を提供する。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％のドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、または少なくとも２０重量％のドコサペンタエン酸（「ＤＰＡ ｎ−６」）、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、または少なくとも２０重量％のエイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％のアラキドン酸（「ＡＲＡ」）を有する脂質を提供する。
[0032]一部の実施形態では、細胞は微生物細胞である。一部の実施形態では、本方法は、微生物細胞を含む発酵ブロスを濃縮するステップを含む。
[0033]一部の実施形態では、細胞は油糧種子である。一部の実施形態では、油糧種子は、ヒマワリ種子、キャノーラ種子、菜種、亜麻仁、ヒマシ油種子、コエンドロ種子、キンセンカ種子、およびその遺伝子修飾変異体からなる群から選択される。
[0034]一部の実施形態では、本方法は、細胞または細胞組成物を洗浄するステップを含む。
[0035]一部の実施形態では、本方法は、細胞または細胞組成物を低温殺菌するステップを含む。
[0036]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を濃縮するステップを含む。
[0037]一部の実施形態では、本方法は、脂質を精製するステップを含む。一部の実施形態では、精製するステップは、苛性精製、脱ガム、酸処理、アルカリ処理、冷却、加熱、脱色、脱臭、脱酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
[0038]一部の実施形態では、本方法は、脂質を回収するステップを含み、ここで回収するステップは、撹拌なしに脂質をポンピングするステップを含む。
[0039]本発明はまた、本発明の方法のいずれかにより得られる脂質にも関する。
[0040]一部の実施形態では、脂質は１つ以上の多価不飽和脂肪酸を含む。一部の実施形態では、脂質は少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％の所望のＰＵＦＡを有する。一部の実施形態では、脂質は少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％のＤＨＡ、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、または少なくとも２０重量％のＤＰＡ ｎ−６、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、または少なくとも２０重量％のＥＰＡ、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％のＡＲＡを有する。
[0041]一部の実施形態では、脂質は３以下の全体的なアロマ強度を有する。一部の実施形態では、脂質は２以下の全体的な芳香強度を有する。
[0042]一部の実施形態では、脂質は少なくとも１０重量％のトリアシルグリセロール画分を含み、ここでトリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも１２重量％はエイコサペンタエン酸であり、トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも２５重量％はドコサヘキサエン酸であり、およびトリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の５重量％未満はアラキドン酸である。
[0043]一部の実施形態では、脂質は、少なくとも２０重量％のエイコサペンタエン酸と、各５重量％未満のアラキドン酸、ドコサペンタエン酸ｎ−６、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコセン酸、エルカ酸、およびステアリドン酸とを含む。
[0044]一部の実施形態では、脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。
[0045]一部の実施形態では、脂質は粗脂質である。一部の実施形態では、粗脂質は場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒を有する。
[0046]本発明はまた、２６以下のアニシジン価と、５以下の過酸化物価と、１００ｐｐｍ以下のリン含量と、場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒とを有する粗微生物脂質にも関する。
[0047]一部の実施形態では、粗微生物脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。
[0048]一部の実施形態では、粗微生物脂質は、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％の所望のＰＵＦＡを有する。一部の実施形態では、粗微生物脂質は、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％のＤＨＡ、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、または少なくとも２０重量％のＤＰＡ ｎ−６、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、または少なくとも２０重量％のＥＰＡ、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％のＡＲＡを有する。
[0049]本発明はまた、少なくとも７０重量％のトリグリセリド画分を含む抽出微生物脂質にも関し、ここでトリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量は少なくとも５０重量％であり、トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸ｎ−６含量は少なくとも０．５重量％〜６重量％であり、および油は２６以下のアニシジン価を有する。
[0050]本発明はまた、少なくとも７０重量％のトリグリセリド画分を含む抽出微生物脂質にも関し、ここでトリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量は少なくとも４０重量％であり、トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸ｎ−６含量は少なくとも０．５重量％〜６重量％であり、ドコサヘキサエン酸のドコサペンタエン酸ｎ−６との比は６：１より大きく、および油は２６以下のアニシジン価を有する。
[0051]本発明はまた、少なくとも約７０重量％のトリグリセリド画分を含む抽出微生物脂質にも関し、ここでトリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量は少なくとも６０重量％であり、および油は２６以下のアニシジン価を有する。
[0052]一部の実施形態では、抽出脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。
[0053]一部の実施形態では、抽出微生物脂質は粗脂質または粗油である。一部の実施形態では、粗脂質は場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒を有する。
[0054]本発明はまた、脂質を得る方法にも関し、この方法は、本発明の粗脂質を精製するステップを含む。一部の実施形態では、精製するステップは、苛性精製、脱ガム、酸処理、アルカリ処理、冷却、加熱、脱色、脱臭、脱酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
［図面／図の簡単な説明］
[0055]本明細書に援用され、且つ本明細書の一部をなす添付の図面は、本発明を例示し、さらには、その記載と共に、本発明の原理を説明し、且つ当業者による本発明の作製および使用を可能にする役割を担う。
本発明の方法を説明する概略的なフローチャートを提供する。 本発明の方法を説明する概略的なフローチャートを提供する。 本発明の方法を説明する概略的なフローチャートを提供する。 本発明の方法を説明する概略的なフローチャートを提供する。 様々なｐＨにおける溶解細胞組成物の経時的な電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）を提供するグラフである。
[0058]ここで添付の図面を参照しながら本発明を説明する。図面では、同様の参照符号は同一の要素または機能的に類似した要素を指示する。加えて、参照符号の左端の１つまたは複数の数字は、その参照符号が最初に現れる図面を特定し得る。
［発明の詳細な説明］
[0059]本発明は、微生物細胞組成物から脂質を得る方法に関し、この方法は、細胞組成物のｐＨを８以上に上昇させるステップと、細胞組成物から脂質を分離するステップとを含み、ここで脂質は場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒を含有する。一部の実施形態では、本方法は、細胞組成物に塩を添加するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、細胞を加熱するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、細胞組成物を撹拌するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、細胞組成物のｐＨを２度目に上昇させるステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップとのうちの１つ以上をさらに含む。
[0060]本発明はまた、細胞から脂質を得る方法にも関し、この方法は、細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、溶解細胞組成物のｐＨを８以上に上昇させるステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、溶解細胞組成物に塩を添加するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップとを含み、ここで脂質は場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒を含有する。細胞は微生物細胞または油糧種子細胞であってもよい。一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を加熱するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、溶解細胞組成物を撹拌するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、溶解細胞組成物のｐＨを２度目に上昇させるステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップとのうちの１つ以上をさらに含む。
[0061]本発明は、細胞組成物から脂質を得る方法に関し、この方法は、細胞組成物のｐＨを８以上に上昇させるステップであって、それにより細胞組成物を溶解し、且つ細胞組成物を解乳化するステップと、細胞組成物に塩を添加するステップと、解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップとを含み、ここで脂質は場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒を含有する。一部の実施形態では、本方法は、細胞組成物を加熱するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、細胞組成物を撹拌するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、細胞組成物のｐＨを２度目に上昇させるステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップとのうちの１つ以上をさらに含む。
[0062]本発明は、微生物細胞から脂質を得る方法に関し、この方法は、微生物細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、溶解細胞組成物に塩基を添加するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップとを含み、ここで脂質は場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒を含有する。一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物に塩を添加するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、溶解細胞組成物を加熱するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、溶解細胞組成物を撹拌するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、溶解細胞組成物に第２の塩基を添加するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップとのうちの１つ以上をさらに含む。
[0063]本発明はまた、細胞から脂質を得る方法にも関し、この方法は、細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、溶解細胞組成物に塩基を添加するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、溶解細胞組成物に塩を添加するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップとを含み、ここで脂質は場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒を含有する。細胞は微生物細胞または油糧種子細胞であってもよい。一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を加熱するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、溶解細胞組成物を撹拌するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、溶解細胞組成物に第２の塩基を添加するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップとのうちの１つ以上をさらに含む。
[0064]本発明はまた、細胞から脂質を得る方法にも関し、この方法は、細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、細胞組成物を撹拌するステップであって、それにより細胞組成物を解乳化するステップと、解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップとを含み、ここで脂質は場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒を含有する。
[0065]本発明はまた、本発明の方法のいずれかにより得られる脂質にも関する。
[0066]本発明はまた、細胞から脂質を得るための抽出方法にも関し、この方法は、細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、溶解細胞組成物を第１の塩基と接触させるステップと、溶解細胞組成物を塩と接触させるステップと、溶解細胞組成物を５分間〜９６時間加熱するステップと、溶解細胞組成物を第２の塩基と接触させるステップと、溶解細胞組成物から１０℃〜１００℃の温度で脂質を分離するステップとを含む。
[0067]本発明はまた、細胞から脂質を得るための抽出方法にも関し、この方法は、細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、溶解細胞組成物を塩と接触させるステップと、溶解細胞組成物を５分間〜９６時間撹拌するステップであって、それにより処理済み溶解細胞組成物を提供するステップと、処理済み溶解細胞組成物から１０℃〜１００℃の温度で脂質を分離するステップとを含む。
[0068]本発明はまた、細胞から脂質を得るための抽出方法にも関し、この方法は、細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、溶解細胞組成物を塩と接触させるステップと、溶解細胞組成物から１０℃〜１００℃の温度で脂質を分離するステップとを含む。
[0069]一部の実施形態では、塩基または第２の塩基は１〜１２のｐＫｂを有する。一部の実施形態では、塩基または第２の塩基は３〜５のｐＫｂを有する。
[0070]一部の実施形態では、方法は、溶解細胞組成物を５分間〜９６時間、１０分間〜９６時間、１０分間〜４時間、１２時間〜８４時間、または２４時間〜７２時間撹拌するステップを含む。
[0071]一部の実施形態では、本方法は、かき混ぜるか、混ぜ合わせるか、ブレンドするか、振盪するか、振動させるか、またはそれらの組み合わせにより、溶解細胞組成物を撹拌するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、０．１ｈｐ／１０００ｇａｌ〜１０ｈｐ／１０００ｇａｌ溶解細胞組成物で溶解細胞組成物を撹拌するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、２００ｆｔ／分〜１０００ｆｔ／分のインペラ先端速度を有する撹拌機で溶解細胞組成物を撹拌するステップを含む。
[0072]一部の実施形態では、溶解するステップは、機械的処理、物理的処理、化学的処理、酵素的処理、またはそれらの組み合わせから選択されるプロセスを含む。
[0073]一部の実施形態では、溶解細胞組成物は、溶解細胞組成物の０．１重量％〜２０重量％、０．５重量％〜１５重量％、または２重量％〜１０重量％の量の塩と接触させる。
[0074]一部の実施形態では、塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、硫酸塩およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。一部の実施形態では、塩は硫酸ナトリウムである。
[0075]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を５分間〜９６時間、１０分間〜４時間、１２時間〜８４時間、または２４時間〜７２時間加熱するステップを含む。
[0076]一部の実施形態では、分離するステップは、遠心することを含む。一部の実施形態では、分離するステップは、１０℃〜１００℃の温度で遠心することを含む。
[0077]一部の実施形態では、本方法は、溶解するステップの前に、細胞を含むブロスを洗浄すること、遠心すること、蒸発させること、またはそれらの組み合わせを含む。
[0078]一部の実施形態では、本方法は、１５以下のアニシジン価を有する脂質を提供する。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも５０重量％のトリグリセリドを含む脂質を提供する。
[0079]一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物に有機溶媒を添加しない。有機溶媒としては、極性溶媒、非極性溶媒、水混和性溶媒、水不混和性溶媒、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
[0080]一部の実施形態では、本方法は、細胞を含むブロスを濃縮するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を濃縮するステップを含む。
[0081]本発明はまた、本明細書に記載される方法により調製された脂質にも関する。一部の実施形態では、脂質は１つ以上の多価不飽和脂肪酸を含む。一部の実施形態では、脂質は、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％の所望のＰＵＦＡを有する。一部の実施形態では、脂質は少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％のＤＨＡ、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、または少なくとも２０重量％のＤＰＡ ｎ−６、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、または少なくとも２０重量％のＥＰＡ、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％のＡＲＡを有する。一部の実施形態では、脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。
[0082]一部の実施形態では、脂質は少なくとも１０重量％のトリアシルグリセロール画分を含み、ここでトリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも１２重量％はエイコサペンタエン酸であり、トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも２５重量％はドコサヘキサエン酸であり、およびトリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の５重量％未満はアラキドン酸である。一部の実施形態では、脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。一部の実施形態では、脂質は粗脂質である。
[0083]一部の実施形態では、脂質は、少なくとも２０重量％のエイコサペンタエン酸および各５重量％未満のアラキドン酸、ドコサペンタエン酸ｎ−６、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコセン酸、エルカ酸、およびステアリドン酸を含む。一部の実施形態では、脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。一部の実施形態では、脂質は粗油である。
[0084]本発明はまた、２６以下のアニシジン価と、５以下の過酸化物価と、１００ｐｐｍ以下のリン含量と、場合により５重量％または体積％未満の有機溶媒とを有する粗微生物脂質にも関する。一部の実施形態では、粗微生物脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。一部の実施形態では、粗微生物脂質は、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％の所望のＰＵＦＡを有する。一部の実施形態では、粗微生物脂質は、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％のＤＨＡ、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、または少なくとも２０重量％のＤＰＡ ｎ−６、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、または少なくとも２０重量％のＥＰＡ、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％のＡＲＡを有する。
[0085]本発明はまた、少なくとも７０重量％のトリグリセリド画分を含む抽出微生物脂質にも関し、ここでトリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量は少なくとも５０重量％であり、トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸ｎ−６含量は少なくとも０．５重量％〜６重量％であり、および油は２６以下のアニシジン価を有する。一部の実施形態では、抽出脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。一部の実施形態では、抽出脂質は粗脂質である。
[0086]本発明はまた、少なくとも７０重量％のトリグリセリド画分を含む抽出微生物脂質にも関し、ここでトリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量は少なくとも４０重量％であり、トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸ｎ−６含量は少なくとも０．５重量％〜６重量％であり、ドコサヘキサエン酸のドコサペンタエン酸ｎ−６との比は６：１より大きく、および油は２６以下のアニシジン価を有する。一部の実施形態では、抽出脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。一部の実施形態では、抽出脂質は粗脂質である。
[0087]本発明はまた、少なくとも約７０重量％のトリグリセリド画分を含む抽出微生物脂質にも関し、ここでトリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量は少なくとも６０重量％であり、および油は２６以下のアニシジン価を有する。一部の実施形態では、抽出脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。一部の実施形態では、抽出脂質は粗脂質である。
[0088]本発明はまた、クリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）種の微生物から抽出された、１００ｐｐｍ以下のリン含量を有する粗脂質にも関する。一部の実施形態では、粗脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。
[0089]本発明はまた、脂質を得る方法にも関し、この方法は、本発明の粗脂質を精製するステップを含む。一部の実施形態では、精製するステップは、苛性精製、脱ガム、酸処理、アルカリ処理、冷却、加熱、脱色、脱臭、脱酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
［概要］
[0090]概して、本発明の方法は、脂質の抽出または他の形での分離のために有機溶媒を利用しない。従って、一部の実施形態では、本発明の方法において脂質の抽出に十分な量または濃度の有機溶媒が植物材料を含む細胞ブロスまたは微生物細胞を含む発酵ブロスに添加されることはなく、細胞組成物に添加されることはなく、溶解細胞組成物に添加されることはなく、または脂質に添加されることはない。一部の実施形態では、有機溶媒が細胞組成物、溶解細胞組成物、または解乳化細胞組成物に添加され得る。かかる実施形態において、有機溶媒は、５体積％未満、４体積％未満、３体積％未満、２体積％未満、１体積％未満、０．５体積％未満、０．１体積％未満、または０．０５体積％未満の濃度で添加される。本明細書で使用されるとき、「有機溶媒」は、少なくとも１つの炭素原子を含む溶媒を指す。本明細書で使用されるとき、「溶媒」は、疎水性または親油性であり、且つ脂質でない物質を指す。本明細書で使用されるとき、「疎水性」は、水の塊を撥ねる物質を指す。本明細書で使用されるとき、「親油性」は、脂質を溶解する物質を指す。本発明の方法に用いられない有機溶媒としては、限定はされないが、極性溶媒、非極性溶媒、水混和性溶媒、水不混和性溶媒、およびそれらの組み合わせが挙げられる。有機溶媒の非限定的な例としては、置換および非置換Ｃ４〜Ｃ８アルキル（例えば、ヘキサンなど）、Ｃ５〜Ｃ１２シルコルアルキル（ｃｙｌｃｏｌａｌｋｙｌ）、Ｃ４〜Ｃ１２アルケン、Ｃ１〜Ｃ８アルコール（例えば、イソプロパノールなど）、Ｃ１〜Ｃ８アルデヒド、Ｃ４〜Ｃ８エーテル、Ｃ１〜Ｃ８エステル、Ｃ６〜Ｃ１２アリール、Ｃ１〜Ｃ８アミド、Ｃ５〜Ｃ１２ヘテロアリール、およびそれらの組み合わせが挙げられる。本明細書に定義するとおりの有機溶媒は、場合により溶解細胞組成物に対し、例えば溶解細胞組成物に接触させる塩基および／または塩の一成分として添加されてもよい。しかしながら、かかる実施形態において有機溶媒は、脂質が溶媒によって細胞組成物、溶解細胞組成物、または解乳化細胞組成物から実質的に抽出されない濃度で（すなわち、体積基準または重量基準で５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、または０．０５％未満の濃度で）存在する。
[0091]一部の実施形態では、本発明の方法は、例えば水による、洗浄するステップを含まず、または本方法は、溶解細胞組成物または解乳化細胞組成物の洗浄回数を低減する。「洗浄するステップ」は、組成物を例えば水または緩衝液で希釈し、水または緩衝液を例えば遠心により除去するプロセスを指す。細胞組成物を洗浄すると、細胞から得られる脂質の全収率が低下し得る。本発明では、洗浄するステップを１回、２回、３回だけまたはそれ以上減らすことができる。
［定義］
[0092]本明細書で使用されるとき、「脂質」または「油」は、１つ以上の脂肪酸（遊離脂肪酸および脂肪酸のエステルを含む）、リン脂質、トリアシルグリセロール（すなわちトリグリセリド）、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、リゾリン脂質、石ケン、ホスファチド、ワックス、ステロールおよびステロールエステル、カロテノイド、キサントフィル、炭化水素、並びに当業者に公知の他の脂質を指す。脂質には極性脂質および中性脂質が含まれる。
[0093]本明細書で使用されるとき、「極性脂質」は、極性基を含み、且つ極性溶媒に易溶性である脂質を指す。極性脂質としてはリン脂質が挙げられる。本明細書で使用されるとき、「リン脂質」は、リン酸基を有する脂質を指す。本明細書で使用されるとき、「中性脂質」は、極性領域を含まず、且つ非極性溶媒に易溶性である脂質を指す。中性脂質としてはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）が挙げられる。
[0094]脂肪酸は、炭素鎖の長さおよび飽和特性に基づき分類される。脂肪酸は、鎖中に存在する炭素の数に基づき短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、または長鎖脂肪酸と称される。脂肪酸は、炭素原子間に二重結合が存在しないとき飽和脂肪酸と称され、二重結合が存在するとき不飽和脂肪酸と称される。不飽和長鎖脂肪酸は、二重結合が１つのみ存在するとき一価不飽和であり、２つ以上の二重結合が存在するとき多価不飽和である。
[0095]脂質中に存在する脂肪酸は４〜２８個の炭素原子を有し得る。一部の実施形態では、脂質は１つ以上の多価不飽和脂肪酸を含む。多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、脂肪酸のメチル末端からの最初の二重結合の位置に基づき分類される：ω−３（ｎ−３）脂肪酸は３番目の炭素に最初の二重結合を含み、一方、ω−６（ｎ−６）脂肪酸は６番目の炭素に最初の二重結合を含む。例えば、ドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）は、２２炭素の鎖長および６つの二重結合を有するω−３長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）であり、多くの場合に「２２：６ ｎ−３」と表記される。本願の目的上、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）は炭素鎖長が１８以上の脂肪酸として定義され、好ましくは炭素鎖長が２０以上の脂肪酸であり、３つ以上の二重結合を含む。ω−６系のＬＣ−ＰＵＦＡとしては、限定はされないが、ジ−ホモ−γリノール酸（Ｃ２０：３ｎ−６）、アラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ−６）（「ＡＲＡ」）、ドコサテトラエン酸またはアドレン酸（Ｃ２２：４ｎ−６）、およびドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−６）（「ＤＰＡ ｎ−６」）が挙げられる。ω−３系のＬＣ−ＰＵＦＡとしては、限定はされないが、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３ｎ−３）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４ｎ−３）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５ｎ−３）（「ＥＰＡ」）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−３）、およびドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６ｎ−３）が挙げられる。ＬＣ−ＰＵＦＡにはまた、限定はされないが、Ｃ２４：６（ｎ−３）およびＣ２８：８（ｎ−３）を含む、２２個より多い炭素および４つ以上の二重結合を有する脂肪酸も含まれる。
[0096]用語「脂肪酸」、「多価不飽和脂肪酸」、および「ＰＵＦＡ」には、遊離脂肪酸形態が含まれるのみならず、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）形態、リン脂質（ＰＬ）形態および他のエステル化形態などの、他の形態も同様に含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「エステル」および「エステル化された」は、ＰＵＦＡ分子のカルボン酸基の水素が別の置換基に置き換えられることを指す。典型的なエステルは当業者に公知であり、その考察が、Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｌ．１４，Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ ｅｄ．，Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａ．Ａｓｓｏｃ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、およびＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＭｃＯｍｉｅ ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７３）（これらは各々、全体として参照により本明細書に援用される）により提供される。一般的なエステルの例には、メチル、エチル、トリクロロエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、ニトロベンジル、メトキシベンジルおよびベンズヒドリルが含まれる。
[0097]一部の実施形態では、脂質は、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％または少なくとも８０重量％のＰＵＦＡを含む。一部の実施形態では、脂質は、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％または少なくとも８０重量％のＤＨＡを含む。一部の実施形態では、脂質は、５０重量％未満、４０重量％未満、３０重量％未満、２０重量％未満、１５重量％未満、１０重量％未満、または５重量％未満のＥＰＡを含む。一部の実施形態では、脂質は、１０重量％未満、５重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、または０．５重量％未満のステロールを含む。一部の実施形態では、１つ以上のＰＵＦＡが、脂質中に、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、遊離脂肪酸、エステル化脂肪酸、脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸のアルカリ土類金属塩、およびそれらの組み合わせなどの１つ以上の形態で存在する。
[0098]一部の実施形態では、本発明の方法において遠心後に分離される脂質は、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、または５０重量％〜９５重量％、５０重量％〜９０重量％、５０重量％〜８５重量％、５０重量％〜８０重量％、５０重量％〜７５重量％、６０重量％〜９５重量％、６０重量％〜９０重量％、６０重量％〜８５重量％、７０重量％〜９５重量％、７０重量％〜９０重量％、７０重量％〜８５重量％、７５重量％〜９５重量％、７５重量％〜９０重量％、または７５重量％〜８５重量％のトリグリセリドを含む。
[0099]一部の実施形態では、トリグリセリドは、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％または少なくとも８０重量％のＤＨＡを含む。一部の実施形態では、トリグリセリドは、少なくとも５０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも１０重量％、または少なくとも５重量％のＥＰＡを含む。
[0100]本明細書において考察されるとおり、遠心後に脂質をさらに精製すると、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９９重量％、または８０重量％〜９９．５重量％、８０重量％〜９９重量％、８０重量％〜９７重量％、８０重量％〜９５重量％、８０重量％〜９０重量％、８５重量％〜９９．５重量％、８５重量％〜９９重量％、８５重量％〜９７重量％、８５重量％〜９５重量％、８５重量％〜９０重量％、９０重量％〜９９．５重量％、９０重量％〜９９重量％、９０重量％〜９７重量％、９０重量％〜９５重量％、９５重量％〜９９．５重量％、９５重量％〜９９重量％、９５重量％〜９７重量％、９７重量％〜９９．５重量％、または９８重量％〜９９．５重量％のトリグリセリドを含む脂質が提供され得る。
[0101]本明細書で使用されるとき、「細胞」は、脂質を含有するバイオマテリアル、例えば植物または微生物に由来するバイオマテリアルを指す。一部の実施形態では、好適な植物材料としては、限定はされないが、植物の一部分および油糧種子が挙げられる。油糧種子としては、限定はされないが、ヒマワリ種子、キャノーラ種子、菜種、亜麻仁、ヒマシ油種子、コエンドロ種子、キンセンカ種子など、およびその遺伝子修飾変異体が挙げられる。本明細書に記載される方法に係る、植物材料および／または微生物、例えば油性微生物から産生される油は、植物油とも称される。藻類および／または真菌から産生される油は、それぞれ藻油および／または真菌油とも称される。
[0102]本明細書で使用されるとき、「微生物細胞」または「微生物」は、藻類、細菌、真菌、原生生物、およびそれらの組み合わせ、例えば単細胞生物などの生物を指す。一部の実施形態では、微生物細胞は真核細胞である。本発明での使用に好適な微生物細胞としては、限定はされないが、黄金色藻類（例えば、ストラメノパイル界（ｋｉｎｇｄｏｍ Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）の微生物）、緑藻類、珪藻類、渦鞭毛藻類（例えば、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）のメンバー、例えばクリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）すなわちＣ．コーニイ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ））を含む渦鞭毛藻目（ｏｒｄｅｒ Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）の微生物、酵母（子嚢歯綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）または担子菌綱（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ））、並びにムコール属（Ｍｕｃｏｒ）および限定はされないがモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）およびモルティエレラ・セクト・スクムケリ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｅｃｔ．ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）を含むモルティエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）の真菌が挙げられる。本発明での使用に好適な微生物細胞としては、さらに、限定はされないが、以下の生物群に見られる属を挙げることができる：ストラメノパイル類（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、ハマトレス（Ｈａｍａｔｏｒｅｓ）、プロテロモナス類（Ｐｒｏｔｅｒｏｍｏｎａｄｓ）、オパリナ類（Ｏｐａｌｉｎｅｓ）、デベロパイエラ（Ｄｅｖｅｌｐａｙｅｌｌａ）、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）、ラビリンチュラ類（Ｌａｂｒｉｎｔｈｕｌｉｄｓ）、ヤブレツボカビ類（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）、ビオセシド（Ｂｉｏｓｅｃｉｄｓ）、卵菌綱（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、サカゲツボカビ綱（Ｈｙｐｏｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、コマチオン（Ｃｏｍｍａｔｉｏｎ）、レチキュロスファエラ属（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｈａｅｒａ）、ペラゴモナス属（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、ペラゴコッカス属（Ｐｅｌａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、オリコラ（０ｌｌｉｃｏｌａ）、オーレオコッカス属（Ａｕｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パルマ目（Ｐａｒｍａｌｅｓ）、珪藻類（Ｄｉａｔｏｍｓ）、黄緑色藻類（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔｅｓ）、褐藻類（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔｅｓ）、真眼点藻類（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ）、ラフィド藻類（Ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔｅｓ）、シヌラ藻類（Ｓｙｎｕｒｉｄｓ）、アキソジン類（Ａｘｏｄｉｎｅｓ）（リゾクロムリナ目（Ｒｈｉｚｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａａｌｅｓ）、ペディネラ目（Ｐｅｄｉｎｅｌｌａｌｅｓ）、ディクチオカ目（Ｄｉｃｔｙｏｃｈａｌｅｓ）を含む）、クリソメラ目（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｒｉｄａｌｅｓ）、サルキノクリシス目（Ｓａｒｃｉｎｏｃｈｒｙｓｉｄａｌｅｓ）、ミズオ目（Ｈｙｄｒｕｒａｌｅｓ）、ヒッバーディア目（Ｈｉｂｂｅｒｄｉａｌｅｓ）、およびヒカリモ目（Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａｌｅｓ）。
[0103]一部の実施形態では、本発明で使用される微生物細胞は、ラビリンチュラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）の微生物である。一部の実施形態では、ラビリンチュラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）の微生物細胞は、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）などのヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）である。本発明によれば、用語「ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）」は、ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）を含むヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の任意のメンバーを指し、および用語「ラビリンチュラ（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄ）」は、ラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｃｅａｅ）を含むラビリンチュラ目（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｌｅｓ）の任意のメンバーを指す。
[0104]ラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｃｅａｅ）のメンバーは、以前はヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）のメンバーであると考えられていたが、近年、かかる生物の分類学上の分類が見直され、現在ラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｃｅａｅ）はラビリンチュラ目（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｌｅｓ）のメンバーであると考えられている。ラビリンチュラ目（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｌｅｓ）およびヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の双方とも、ラビリンチュラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）のメンバーであると考えられている。分類学の理論家は、現在、概してこれらの微生物群の双方をストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅ）系統の藻類または藻類様原生生物と共に位置付けている。ヤブレツボカビ類（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）およびラビリンチュラ類（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄｓ）の現行の分類学上の位置付けは以下のとおり要約することができる：
レルム：ストラメノパイラ（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌａ）（クロミスタ（Ｃｈｒｏｍｉｓｔａ））
門：ラビリンチュラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）（不等毛藻類（Ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔａ））
綱：ラビリンチュラ綱（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）（ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｅ））
目：ラビリンチュラ目（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｌｅｓ）
科：ラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｃｅａｅ）
目：ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）
科：ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）
[0105]本発明の目的上、ヤブレツボカビ類（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）として記載する微生物細胞株には、以下の生物が含まれる：目：ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）；科：ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）；属：トラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）（種：エスピー（ｓｐ．）、アルジメンタレ（ａｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、アウレウム（ａｕｒｅｕｍ）、ベンチコラ（ｂｅｎｔｈｉｃｏｌａ）、グロボスム（ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、キンネイ（ｋｉｎｎｅｉ）、モチブム（ｍｏｔｉｖｕｍ）、ムルチルジメンタレ（ｍｕｌｔｉｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、パキデルマム（ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｍ）、プロリフェルム（ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ）、ロセウム（ｒｏｓｅｕｍ）、およびストリアツム（ｓｔｒｉａｔｕｍ））、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属（種：エスピー（ｓｐ．）、アモエボイデア（ａｍｏｅｂｏｉｄｅａ）、ケルグエレンシス（ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ミヌタ（ｍｉｎｕｔａ）、プロフンダ（ｐｒｏｆｕｎｄａ）、ラジアタ（ｒａｄｉａｔａ）、サイレンス（ｓａｉｌｅｎｓ）、サルカリアナ（ｓａｒｋａｒｉａｎａ）、シゾキトロプス（ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｏｐｓ）、ウィスルゲンシス（ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ヨルケンシス（ｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）、およびエスピー（ｓｐ．）ＢＰ−５６０１）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）（種：エスピー（ｓｐ．）、アグレガツム（ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）、リムナセウム（ｌｉｍｎａｃｅｕｍ）、マングロベイ（ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）、ミヌツム（ｍｉｎｕｔｕｍ）、およびオクトスポルム（ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｍ））、ヤポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（種：エスピー（ｓｐ．）、マリヌム（ｍａｒｉｎｕｍ））、アプラノキトリウム属（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）（種：エスピー（ｓｐ．）、ハリオチジス（ｈａｌｉｏｔｉｄｉｓ）、ケルグエレンシス（ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｉｓ）、プロフンダ（ｐｒｏｆｕｎｄａ）、およびストッキノイ（ｓｔｏｃｃｈｉｎｏｉ））、アルトルニア（Ａｌｔｈｏｒｎｉａ）属（種：エスピー（ｓｐ．）、クロウチイ（ｃｒｏｕｃｈｉｉ））、またはエリナ（Ｅｌｉｎａ）属（種：エスピー（ｓｐ．）、マリサルバ（ｍａｒｉｓａｌｂａ）、およびシノリフィカ（ｓｉｎｏｒｉｆｉｃａ））。本発明の目的上、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属の範囲内に記載される種は、トラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）のメンバーであると考えられ得る。アウランチアコキトリウム属（Ａｕｒａｎｔｉａｃｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）およびオブロゴスポラ属（Ｏｂｌｏｇｏｓｐｏｒａ）は、本発明においてラビリンチュラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）に包含される２つのさらなる属である。一部の実施形態では、微生物細胞はトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｓｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびそれらの混合物である。
[0106]本発明での使用に好適な微生物細胞としては、限定はされないが、以下から選択されるラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄｓ）が挙げられる：目：ラビリンチュラ目（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｌｅｓ）、科：ラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａｃｅａｅ）、属：ラビリンチュラ属（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）（種：エスピー（ｓｐ．）、アルゲリエンシス（ａｌｇｅｒｉｅｎｓｉｓ）、コエノシスティス（ｃｏｅｎｏｃｙｓｔｉｓ）、カットニイ（ｃｈａｔｔｏｎｉｉ）、マクロシスティス（ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、マクロシスティス・アトランティカ（ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ）、マクロシスティス・マクロシスティス（ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、マリナ（ｍａｒｉｎａ）、ミヌタ（ｍｉｎｕｔａ）、ロスコフェンシス（ｒｏｓｃｏｆｆｅｎｓｉｓ）、バルカノビイ（ｖａｌｋａｎｏｖｉｉ）、ビテリナ（ｖｉｔｅｌｌｉｎａ）、ビテリナ・パシフィカ（ｖｉｔｅｌｌｉｎａ ｐａｃｉｆｉｃａ）、ビテリナ・ビテリナ（ｖｉｔｅｌｌｉｎａ ｖｉｔｅｌｌｉｎａ）、およびゾプフィイ（ｚｏｐｆｉｉ））、ラビリンチュロイデス（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属（種：エスピー（ｓｐ．）、ハリオチジス（ｈａｌｉｏｔｉｄｉｓ）、およびヨルケンシス（ｙｏｒｋｅｎｓｉｓ））、ラビリントミクサ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｏｍｙｘａ）属（種：エスピー（ｓｐ．）、マリナ（ｍａｒｉｎａ））、ディプロフリス属（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）（種：エスピー（ｓｐ．）、アルケリ（ａｒｃｈｅｒｉ））、ピロソルス属（Ｐｙｒｒｈｏｓｏｒｕｓ）（種：エスピー（ｓｐ．）、マリヌス（ｍａｒｉｎｕｓ））、ソロジプロフリス属（Ｓｏｒｏｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）（種：エスピー（ｓｐ．）、ステルコレア（ｓｔｅｒｃｏｒｅａ））、およびクラミドミクサ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｙｘａ）（種：エスピー（ｓｐ．）、ラビリンチュロイデス（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）、およびモンタナ（ｍｏｎｔａｎａ））（但し、現時点では、ピロソルス属（Ｐｙｒｒｈｏｓｏｒｕｓ）、ソロジプロフリス属（Ｓｏｒｏｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）、およびクラミドミクサ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｙｘａ）の正確な分類学的位置付けに関する共通見解はない）。
[0107]ラビリンチュラ菌門（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ）の宿主細胞としては、限定はされないが、寄託株ＰＴＡ−１０２１２、ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、ＰＴＡ−１０２１５、ＰＴＡ−９６９５、ＰＴＡ−９６９６、ＰＴＡ−９６９７、ＰＴＡ−９６９８、ＰＴＡ−１０２０８、ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、ＰＴＡ−１０２１１、ＳＡＭ２１７９（寄託者により「ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）ＳＡＭ２１７９」と命名されている）として寄託されている微生物、任意のトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の種（旧ウルケニア属（Ｕｌｋｅｎｉａ）の種、例えば、Ｕ．ウィスルゲンシス（Ｕ．ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｕ．アモエボイダ（Ｕ．ａｍｏｅｂｏｉｄａ）、Ｕ．サルカリアナ（Ｕ．ｓａｒｋａｒｉａｎａ）、Ｕ．プロフンダ（Ｕ．ｐｒｏｆｕｎｄａ）、Ｕ．ラジアタ（Ｕ．ｒａｄｉａｔａ）、Ｕ．ミヌタ（Ｕ．ｍｉｎｕｔａ）およびウルケニア・エスピー（Ｕｌｋｅｎｉａ ｓｐ．）ＢＰ−５６０１を含む）、およびトラウストキトリウム・ストリアツム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、トラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）、トラウストキトリウム・ロセウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）を含む；および任意のヤポノキトリウム属（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の種が挙げられる。ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の株としては、限定はされないが、トラウストキトリウム・エスピー（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）（２３Ｂ）（ＡＴＣＣ ２０８９１）；トラウストキトリウム・ストリアツム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）（シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ））（ＡＴＣＣ ２４４７３）；トラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）（ゴールドスタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ））（ＡＴＣＣ ３４３０４）；トラウストキトリウム・ロセウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）（ゴールドスタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ））（ＡＴＣＣ ２８２１０）；ヤポノキトリウム・エスピー（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）（Ｌ１）（ＡＴＣＣ ２８２０７）；ＡＴＣＣ ２０８９０；ＡＴＣＣ ２０８９２；前述の微生物のいずれかに由来する突然変異株；およびそれらの混合物が挙げられる。シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）としては、限定はされないが、シゾキトリウム・アグレガツム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）、シゾキトリウム・リマシヌム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）、シゾキトリウム・エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）（Ｓ３１）（ＡＴＣＣ ２０８８８）、シゾキトリウム・エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）（Ｓ８）（ＡＴＣＣ ２０８８９）、シゾキトリウム・エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）（ＬＣ−ＲＭ）（ＡＴＣＣ １８９１５）、シゾキトリウム・エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）（ＳＲ ２１）、寄託株ＡＴＣＣ ２８２０９、寄託されたシゾキトリウム・リマシヌム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）株ＩＦＯ ３２６９３、前述の微生物のいずれかに由来する突然変異株、およびそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、宿主細胞は、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）である。シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）は、二分裂を繰り返すことでも、胞子嚢を形成し、それが最終的に遊走子を放出することでも、いずれによっても複製することができる。しかしながらトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）は、胞子嚢を形成し、それが後に遊走子を放出することによってのみ複製する。一部の実施形態では、本発明の宿主細胞は組換え宿主細胞である。
[0108]本発明で使用される微生物細胞に有効な培養条件には、限定はされないが、脂質の産生を可能にする有効培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ、および酸素条件が含まれる。有効培地は、微生物細胞、例えばヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の微生物細胞が典型的に培養される任意の培地を指す。かかる培地は、典型的には、同化性の炭素、窒素、およびリン酸塩源、並びに適切な塩、ミネラル、金属、およびビタミンなどの他の栄養素を有する水性培地を含む。本発明で使用される微生物細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリ皿で培養することができる。一部の実施形態では、培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨ、および酸素含量で実施される。
[0109]一部の実施形態では、微生物細胞は、１２ｇ／Ｌ以下、５ｇ／Ｌ以下、または３ｇ／Ｌ以下の塩化ナトリウムの塩分濃度における増殖能を有する。
[0110]一部の実施形態では、微生物細胞は、ω−３および／またはω−６ ＰＵＦＡを含む脂質を産生する。一部の実施形態では、微生物細胞は、ＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ−３）、ＤＰＡ（ｎ−６）、ＥＰＡ、アラキドン酸（ＡＲＡ）など、およびそれらの組み合わせを含む脂質を産生する。ＰＵＦＡを含む脂質を産生する微生物の非限定的な例は上記に開示され、また米国特許第５，３４０，５９４号明細書、同第５，３４０，７４２号明細書および同第５，５８３，０１９号明細書（この各々が全体として参照により本明細書に援用される）にも見ることができる。
[0111]一部の実施形態では、微生物細胞は、少なくとも３０重量％の脂質、少なくとも３５重量％の脂質、少なくとも４０重量％の脂質、少なくとも５０重量％の脂質、少なくとも６０重量％の脂質、少なくとも７０重量％の脂質、または少なくとも８０重量％の脂質を含む。一部の実施形態では、本発明で使用される微生物細胞は、少なくとも０．１グラム毎リットル毎時（ｇ／Ｌ／ｈ）のＤＨＡ、少なくとも０．２ｇ／Ｌ／ｈのＤＨＡ、少なくとも０．３ｇ／Ｌ／ｈのＤＨＡ、または少なくとも０．４ｇ／Ｌ／ｈのＤＨＡの産生能を有する。
［方法］
[0112]本発明の方法は、細胞または細胞バイオマスを溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップを含む。本明細書で使用されるとき、用語「細胞バイオマス」は、植物細胞または微生物細胞の集合を指す。本明細書で使用されるとき、用語「〜を溶解する」および「溶解している」は、細胞の細胞壁および／または細胞膜を破壊するプロセスを指す。一部の実施形態では、溶解するステップは、機械的に処理すること、化学的に処理すること、酵素的に処理すること、物理的に処理すること、またはそれらの組み合わせなどのプロセスを含む。
[0113]本明細書で使用されるとき、機械的処理には、限定はされないが、細胞をホモジナイズすること、細胞に超音波を適用すること、細胞をコールドプレスすること、細胞を磨砕することなど、およびそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、方法は、細胞をホモジナイゼーションにより溶解するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞をホモジナイザーで溶解するステップを含む。
[0114]細胞のホモジナイゼーションには、限定はされないが、フレンチ加圧細胞プレス、超音波処理器、ホモジナイザー、ボールミル、ロッドミル、ペブルミル、ビーズミル、高圧粉砕ロール、垂直軸インパクター、工業用ブレンダー、高剪断ミキサー、パドルミキサー、ポリトロン（ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモジナイザーなど、およびそれらの組み合わせを利用するプロセスが含まれ得る。一部の実施形態では、場合により加熱されるホモジナイザー中に細胞を流し通す。一部の実施形態では、好適なホモジナイゼーションは、高圧および／または低圧のいずれかでホモジナイザーに１〜３パス通すことを含み得る。一部の実施形態では、ホモジナイゼーション中の圧力は、１５０バール〜１，４００バール、１５０バール〜１，２００バール、１５０バール〜９００バール、１５０バール〜３００バール、３００バール〜１，４００バール、３００バール〜１，２００バール、３００バール〜９００バール、４００バール〜８００バール、５００バール〜７００バール、または６００バールであり得る。
[0115]本明細書で使用されるとき、物理的処理には、限定はされないが、細胞を加熱すること、細胞を乾燥させることなど、およびそれらの組み合わせが含まれ得る。
[0116]細胞の加熱には、限定はされないが、抵抗加熱、対流加熱、蒸気加熱、流体浴での加熱、太陽エネルギーによる加熱、集束太陽エネルギーによる加熱などが含まれてもよく、これらのうちの任意の加熱を、タンク、プール、管、導管、フラスコ、または他の封じ込め手段において行うことができる。一部の実施形態では、細胞は、その壁内／壁上に抵抗コイルを備えるタンクで加熱される。一部の実施形態では、細胞は、挿通される配管材を備えた液浴で加熱される。
[0117]細胞の乾燥には、限定はされないが、空気流に曝露すること、熱（例えば、対流熱、加熱表面など）に曝露すること、太陽エネルギーに曝露すること、フリーズドライ（凍結乾燥）すること、噴霧乾燥すること、およびそれらの組み合わせが含まれ得る。一部の実施形態では、乾燥は、場合により加熱される回転ドラムに細胞を適用することを含む。
[0118]本明細書で使用されるとき、化学的処理には、限定はされないが、細胞のｐＨを上昇させること、細胞を化学物質と接触させることなどが含まれる。
[0119]細胞のｐＨの上昇には、限定はされないが、細胞組成物に塩基を添加することが含まれ得る。一部の実施形態において、本発明での使用に好適な塩基としては、限定はされないが、水酸化物塩基（例えば、ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２など、およびそれらの組み合わせ）、炭酸塩塩基（例えば、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＭｇＣＯ３など、およびそれらの組み合わせ）、重炭酸塩塩基（例えば、ＬｉＨＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３など、およびそれらの組み合わせ）、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。塩基は、固体の形態（例えば、結晶、顆粒、ペレットなど）または液体の形態（例えば、水溶液、アルコール溶液、例えばメタノール、エタノール、プロパノールなどの中の水酸化物塩基など）、およびそれらの組み合わせであってもよい。一部の実施形態では、細胞組成物のｐＨは、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、または７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜１２、または１０〜１１のｐＨに上昇させる。
[0120]一部の実施形態では、細胞のｐＨの上昇には、限定はされないが、塩素アルカリ法を実施することが含まれ得る。一部の実施形態では、塩化ナトリウムと細胞組成物とを含む発酵ブロスが電解に供され、それにより水酸化ナトリウムの形成が起こり得る。水酸化ナトリウムが形成されると細胞のｐＨが上昇する。一部の実施形態では、発酵ブロスは、塩化ナトリウムの代わりに、またはそれに加えて、塩化カルシウムまたは塩化カリウムを含み得る。かかる発酵ブロスを電解に供すると、それぞれ水酸化カルシウムまたは水酸化カリウムの形成が起こり、それにより細胞のｐＨが上昇する。
[0121]酵素溶解は、細胞を１つ以上の酵素と接触させることによる細胞の細胞壁または細胞膜の溶解を指す。本発明での使用に好適な酵素としては、限定はされないが、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。プロテアーゼの非限定的な例としては、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ（ｔｈｅｒｏｎｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アラカーゼ（ａｌａｃａｓｅ）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。セルラーゼの非限定的な例としては、スクラーゼ、マルターゼ、ラクターゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、リゾチーム、ノイラミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、プルラナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、アセチルガラクトサミニダーゼ、フコシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、イズロニダーゼ、マルターゼ−グルコアミラーゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。キチナーゼの非限定的な例としては、キトトリオシダーゼが挙げられる。ペクチナーゼの非限定的な例としては、ペクトリアーゼ、ペクトザイム（ｐｅｃｔｏｚｙｍｅ）、ポリガラクツロナーゼ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態において、一部の酵素は加熱することにより活性化される。
[0122]本明細書で使用されるとき、「溶解細胞組成物」は、細胞残屑および細胞の他の内容物を含めた１つ以上の溶解細胞を、脂質（溶解細胞由来の）、および場合により微生物細胞または植物材料を含むブロスとの組み合わせで含む組成物を指す。一部の実施形態では、植物材料は、植物材料と水とを含むブロスまたは培地中に含まれる。一部の実施形態では、微生物細胞は、微生物細胞と水とを含む発酵ブロスまたは培地中に含まれる。一部の実施形態では、溶解細胞組成物は、１つ以上の溶解細胞、細胞残屑、脂質、細胞の天然の内容物、およびブロス由来の水性成分を含む組成物を指す。一部の実施形態では、溶解細胞組成物は、連続水相と分散脂質相との混合物を含む水中油乳濁液の形態である。一部の実施形態では、分散脂質相は、１重量％〜６０重量％、１重量％〜５０重量％、１重量％〜４０重量％、１重量％〜３０重量％、１重量％〜２０重量％、５重量％〜６０重量％、５重量％〜５０重量％、５重量％〜４０重量％、５重量％〜３０重量％、５重量％〜２０重量％、１０重量％〜６０重量％、１０重量％〜５０重量％、１０重量％〜４０重量％、２０重量％〜６０重量％、２０重量％〜５０重量％、２０重量％〜４０重量％、３０重量％〜６０重量％、３０重量％〜５０重量％、または４０重量％〜６０重量％の濃度の乳化した溶解細胞組成物で存在する。
[0123]いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、本発明の方法は乳化した溶解細胞組成物を破壊し、または解乳化することで、溶解細胞組成物からの脂質の分離を可能にすると考えられる。本明細書で使用されるとき、用語「乳濁液」および「乳化した」は２つ以上の不混和性の相または層の混合物であって、一つの相または層が別の相または層中に分散しているものを指す。本明細書で使用されるとき、用語「〜を壊す」、「〜を破壊する」、「〜を解乳化する」、「解乳化」、「解乳化している」、および「壊している」は、乳濁液の不混和性の相または層を分離するプロセスを指す。例えば、乳化した溶解細胞組成物を解乳化するまたは壊すとは、乳化した溶解細胞組成物を１つ以上の相または層を有する乳濁液から２つ以上の相または層を有する組成物へと変化させるプロセスを指す。例えば、一部の実施形態では、本発明の方法は乳化した溶解細胞組成物を単相から２つ以上の相に壊す。一部の実施形態では、この２つ以上の相には脂質相と水相とが含まれる。一部の実施形態では、本発明の方法は乳化した溶解細胞組成物を１つ以上の相から少なくとも３つの相に壊す。一部の実施形態では、この３つの相には脂質相と水相と固相とが含まれる。一部の実施形態では、この３つの相には脂質相と乳濁液相と水相とが含まれる。
[0124]一部の実施形態では、本発明の方法により、乳濁液の少なくとも７５％、乳濁液の少なくとも８０％、乳濁液の少なくとも８５％、乳濁液の少なくとも９０％、乳濁液の少なくとも９５％、乳濁液の少なくとも９９％が取り除かれ、または壊されることによって溶解細胞組成物が解乳化され、解乳化細胞組成物が形成される。一部の実施形態では、本発明の方法により、重量基準または体積基準で乳濁液の７５％〜乳濁液の９９％、乳濁液の７５％〜乳濁液の９５％、乳濁液の７５％〜乳濁液の９０％、乳濁液の７５％〜乳濁液の８５％、乳濁液の７５％〜乳濁液の８０％、乳濁液の８０％〜乳濁液の９９％、乳濁液の８０％〜乳濁液の９５％、乳濁液の８０％〜乳濁液の９０％、乳濁液の８０％〜乳濁液の８５％、乳濁液の８５％〜乳濁液の９９％、乳濁液の８５％〜乳濁液の９５％、乳濁液の８５％〜乳濁液の９０％、乳濁液の９０％〜乳濁液の９９％、乳濁液の９０％〜乳濁液の９５％、または乳濁液の９５％〜乳濁液の９９％が取り除かれ、または壊されることによって溶解細胞組成物が解乳化される。
[0125]一部の実施形態では、細胞を溶解する前に、細胞は洗浄および／または低温殺菌され得る。一部の実施形態では、細胞の洗浄は、水溶液、例えば水を用いて任意の細胞外水溶性または水分散性化合物を除去することを含む。一部の実施形態では、細胞は、１回、２回、３回、またはそれ以上洗浄され得る。一部の実施形態では、細胞の低温殺菌は、細胞を加熱して任意の望ましくない酵素、例えば脂質を劣化させ得る、またはＰＵＦＡの収率を低下させ得る任意の酵素を不活性化させることを含む。一部の実施形態では、細胞は最初に洗浄され、次に低温殺菌され得る。
[0126]一部の実施形態では、細胞は植物バイオマテリアルであり、植物バイオマテリアルは溶解前に形成される。一部の実施形態では、植物バイオマテリアルは植物から油糧種子を取り出し、または抽出することにより形成される。一部の実施形態では、油糧種子の外皮から油糧種子の内部が、磨砕、粉砕、押出し、吸引、破砕、またはそれらの組み合わせにより取り出される。一部の実施形態では、脱皮された油糧種子が、油糧種子を圧搾機に通して脱皮された油糧種子をケーキ状に磨砕することによるなど、当該技術分野において公知の方法を用いてホモジナイズされまたは搾り出され得る。一部の実施形態では、ケーキに水が添加され、乳化した溶解細胞組成物が形成され得る。一部の実施形態では、乳化した溶解細胞組成物は当該技術分野において公知の方法を用いてろ過することにより、溶解細胞組成物から任意の余分な皮片が取り除かれ得る。
[0127]一部の実施形態では、溶解細胞組成物を第１の塩基で処理することにより、乳化した溶解細胞組成物が破壊される（すなわち解乳化される）。一部の実施形態では、溶解細胞組成物を第２の塩基で処理することにより、乳化した溶解細胞組成物が壊される（すなわち解乳化される）。一部の実施形態では、溶解細胞組成物を塩で処理することにより、乳化した溶解細胞組成物が壊される（すなわち解乳化される）。一部の実施形態では、溶解細胞組成物を加熱することにより、乳化した溶解細胞組成物が壊される（すなわち解乳化される）。一部の実施形態では、溶解細胞組成物を撹拌することにより、乳化した溶解細胞組成物が壊される（すなわち解乳化される）。一部の実施形態では、溶解細胞組成物を同時に加熱し且つ撹拌することにより、乳化した溶解細胞組成物が壊される（すなわち解乳化される）。一部の実施形態では、先述の処理の１つ以上により、乳化した溶解細胞組成物が破壊される（すなわち解乳化される）。
[0128]一部の実施形態では、本発明の方法は、細胞組成物のｐＨを上昇させるステップであって、それにより細胞組成物を溶解および／または解乳化するステップを含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、溶解細胞組成物のｐＨを上昇させるステップであって、それにより溶解細胞組成物を解乳化するステップを含む。一部の実施形態では、ｐＨを上昇させるステップは、細胞組成物または溶解細胞組成物を塩基と接触させることを含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、溶解細胞組成物を塩基と接触させるステップであって、それにより溶解細胞組成物を解乳化するステップを含む。本明細書で使用されるとき、「接触させる」は、細胞組成物または溶解細胞組成物を第２の組成物と（例えば、ある組成物を細胞組成物または溶解細胞組成物に添加したり、細胞組成物または溶解細胞組成物をある組成物に添加したりするなどして）組み合わせることを指す。本明細書で使用されるとき、「組成物」は純粋な材料を含むことができ、または２つ以上の材料、物質、賦形剤、部分などの組み合わせを含むことができる。溶解細胞組成物を第１の塩基と接触させると、溶解細胞組成物のｐＨが上昇する。一部の実施形態では、溶解細胞組成物は第２の塩基と接触させる。一部の実施形態では、溶解細胞組成物または解乳化細胞組成物のｐＨを２度目に上昇させる。一部の実施形態では、ｐＨの２度目の上昇は、溶解細胞組成物または解乳化細胞組成物を第２の塩基と接触させることを含む。一部の実施形態では、溶解細胞組成物を第１の塩基と接触させ、次に加熱、撹拌、またはそれらの組み合わせを行い、続いて第２の塩基と接触させることにより、処理済み溶解細胞乳濁液が提供される。
[0129]一部の実施形態では、第１の塩基および／または第２の塩基は、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜５、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、３〜１０、３〜６、３〜５、４〜１０、４〜８、４〜６、５〜１０、または５〜８のｐＫｂを有する。本明細書で使用されるとき、用語「ｐＫｂ」は、その塩基の塩基結合定数Ｋｂの負の対数を指す。Ｋｂは、水中での塩基のイオン化平衡定数を指し、ここで：
Figure 2016163579

；および
塩基のＫｂであるＢは、以下のとおり定義される：
Figure 2016163579
[0130]本発明での使用に好適な塩基としては、限定はされないが、水酸化物塩基（例えば、ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２など、およびそれらの組み合わせ）、炭酸塩塩基（例えば、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＭｇＣＯ３など、およびそれらの組み合わせ）、重炭酸塩塩基（例えば、ＬｉＨＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３など、およびそれらの組み合わせ）、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。塩基は、固体の形態（例えば、結晶、顆粒、ペレットなど）または液体の形態（例えば、水溶液、アルコール溶液、例えばメタノール、エタノール、プロパノール中の水酸化物塩基など）、およびそれらの組み合わせであってもよい。従って、本発明で使用される塩基に場合により溶媒が存在し得る。本明細書で使用されるとき、「溶媒」は、疎水性または親油性である物質を指す。本明細書で使用されるとき、「疎水性」は、水の塊を撥ねる物質を指す。本明細書で使用されるとき、「親油性」は、脂質に溶解する物質を指す。
[0131]一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物を塩基と接触させると、溶解細胞組成物のｐＨが上昇する。一部の実施形態では、溶解細胞組成物を塩基と接触させると、溶解細胞組成物のｐＨが８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、または７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜１２、若しくは１０〜１１のｐＨに上昇する。一部の実施形態では、溶解細胞組成物を塩基と接触させると、組成物に８以下、７以下、６以下、または５以下のｐＨが提供される。
[0132]一部の実施形態では、塩基の添加により細胞組成物または溶解細胞組成物のｐＨが上昇すると脂質酸化が阻害され、それにより溶解細胞組成物中のフリーラジカルの量が最小限に抑えられ、従って本発明の方法から得られる粗脂質は低い過酸化物価（例えば、５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下）および／または低いアニシジン価（例えば、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下）を有する。本明細書で使用されるとき、用語「過酸化物価」または「ＰＶ」は、脂質の酸化中に生じる過酸化物およびヒドロペルオキシドなどの主反応生成物の尺度を指す。本明細書で使用されるとき過酸化物価はｍｅｑ／ｋｇで計測される。本明細書で使用されるとき、用語「アニシジン価」または「ＡＶ」は、脂質の酸化中に生じるアルデヒドおよびケトンなどの副反応生成物の尺度を指す。
[0133]一部の実施形態では、塩基でｐＨを調整した後の溶解細胞組成物中のフリーラジカルは、電子常磁性共鳴分光計、例えばＢｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ ｅ−ｓｃａｎ ＥＰＲ（システム番号ＳＣ０２７４）（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して検出される。一部の実施形態では、ＥＰＲの計測前に、溶解細胞組成物の試料が脱イオン水よって約１：１の比で希釈される。一部の実施形態では、ＥＰＲを計測するため、溶解細胞組成物の試料にスピントラップ化学剤が添加される。一部の実施形態では、スピントラップ化学剤は当該技術分野において公知の任意のスピントラップ化学剤であり、限定はされないが、ＰＯＢＮ（α−（４−ピリジル１−オキシド）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン）またはＤＭＰＯ（５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド）が挙げられる。一部の実施形態では、スピントラップ化学剤は約１．２５Ｍであり、約５０μＬが約０．５グラムの溶解細胞組成物試料に添加される。一部の実施形態では、スピントラップ化学剤を含む試料が室温（例えば、約２０℃）でインキュベートされる。一部の実施形態では、以下の分光計パラメータが用いられる：約８６Ｈｚの変調周波数、約２ガウスの変調振幅、約５ｍＷのマイクロ波出力、約２０秒の時定数、約１０秒の掃引時間、約１００ガウスの掃引幅、および約８の走査回数。ＥＰＲを経時的に計測して、脂質中に存在するフリーラジカルの濃度を決定する。一部の実施形態では、ＥＰＲは４時間の間にわたり１時間に１回計測される。一部の実施形態では、溶解細胞組成物は、４時間後に０．１５×１０６未満、０．１４×１０６未満、０．１３×１０６未満、０．１２×１０６未満、０．１１×１０６未満、０．１×１０６未満、０．０９×１０６未満、０．０８×１０６未満、０．０７×１０６未満、０．０６×１０６未満、または０．０５×１０６未満の、上掲のパラメータにおけるＥＰＲシグナルの強さ（強度または振幅）を有する。一部の実施形態では、溶解細胞組成物は、０．０５×１０６〜０．１５×１０６、０．０５×１０６〜０．１４×１０６、０．０５×１０６〜０．１３×１０６、０．０５×１０６〜０．１２×１０６、０．０５×１０６〜０．１１×１０６、０．０５×１０６〜０．１×１０６、０．０５×１０６〜０．０９×１０６、０．０７×１０６〜０．１５×１０６、０．０７×１０６〜０．１３×１０６、０．０７×１０６〜０．１１×１０６、０．０８×１０６〜０．１４×１０６、０．０８×１０６〜０．１２×１０６、０．０８×１０６〜０．１×１０６、０．０９×１０６〜０．１３×１０６、または０．０９×１０６〜０．１１×１０６のＥＰＲを有する。一部の実施形態では、上記に特定するＥＰＲをもたらす溶解細胞組成物のｐＨは、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜１２、または１０〜１１である。一部の実施形態では、上記に特定するＥＰＲシグナルの強さを有する溶解細胞組成物は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のＡＶを有する粗脂質をもたらす。一部の実施形態では、上記に特定するＥＰＲを有する溶解細胞組成物は、５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下のＰＶを有する粗脂質をもたらす。
[0134]一部の実施形態では、方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を塩と接触させるステップであって、それにより溶解細胞組成物を解乳化するステップを含む。本明細書で使用されるとき、「塩」は、酸の水素イオンを金属（例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属など）または正電荷の化合物（例えば、ＮＨ４ ＋など）に置き換えることにより形成されるイオン化合物を指す。本発明での使用に好適な塩としては、限定はされないが、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。本発明で使用される塩に存在する負電荷のイオン種としては、限定はされないが、ハロゲン化物、硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸水素、リン酸二水素、炭酸塩、重炭酸塩など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、本発明で使用される塩は、以下から選択される：塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、グルタミン酸モノナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化鉄、硫酸鉄、硫酸アルミニウム、およびそれらの組み合わせ。一部の実施形態では、塩はＮａＯＨを含まない。塩は、固体として（例えば、結晶形態、非晶質形態、ペレット化形態、および／または顆粒状形態）、および／または例えば水、アルコールなどを含む溶液として（例えば、希釈溶液、飽和溶液、または過飽和溶液）、およびそれらの組み合わせとして添加され得る。
[0135]一部の実施形態では、塩は、５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ〜１５ｇ／ｌ、１５ｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、または１０ｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌの量で添加される。
[0136]一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物を解乳化するため塩が添加されるとき、細胞組成物または溶解細胞組成物の温度は、６０℃以下、５５℃以下、４５℃以下、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、または２５℃以下である。一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物を解乳化するため塩が添加されるとき、溶解細胞組成物の温度は、０℃〜６０℃、０℃〜５５℃、０℃〜５０℃、０℃〜４５℃、０℃〜４０℃、０℃〜３５℃、０℃〜３０℃、０℃〜２５℃、２０℃〜６０℃、２０℃〜５５℃、２０℃〜５０℃、２０℃〜４５℃、２０℃〜４０℃、２０℃〜３５℃、２０℃〜３０℃、３０℃〜６０℃、３０℃〜５５℃、３０℃〜５０℃、３０℃〜４５℃、３０℃〜４０℃、３０℃〜４０℃、４０℃〜６０℃、４０℃〜５５℃、４０℃〜５０℃、または５０℃〜６０℃である。
[0137]一部の実施形態では、本方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を、溶解細胞組成物または細胞組成物の２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下、７．５重量％以下、５重量％以下、または２重量％以下の塩と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を、細胞組成物または溶解細胞組成物（例えば、総ブロス重量）の０．１重量％〜２０重量％、０．１重量％〜１５重量％、０．１重量％〜１０重量％、０．５重量％〜２０重量％、０．５重量％〜１５重量％、０．５重量％〜１０重量％、０．５重量％〜５重量％、０．５重量％〜４重量％、０．５重量％〜３重量％、０．５重量％〜２．５重量％、０．５重量％〜２重量％、０．５重量％〜１．５重量％、０．５重量％〜１重量％、１重量％〜２０重量％、１重量％〜１５重量％、１重量％〜１０重量％、１重量％〜５重量％、１重量％〜４重量％、１重量％〜３重量％、１重量％〜２．５重量％、１重量％〜２重量％、１重量％〜１．５重量％、１．５重量％〜５重量％、１．５重量％〜４重量％、１．５重量％〜３重量％、１．５重量％〜２．５重量％、１．５重量％〜２重量％、２重量％〜２０重量％、２重量％〜１５重量％、２重量％〜１０重量％、２重量％〜５重量％、２重量％〜４重量％、２重量％〜３重量％、２重量％〜２．５重量％、２．５重量％〜５重量％、２．５重量％〜４重量％、２．５重量％〜３重量％、３重量％〜５重量％、３重量％〜４重量％、４重量％〜５重量％、５重量％〜２０重量％、５重量％〜１５重量％、５重量％〜１０重量％、１０重量％〜２０重量％、１０重量％〜１５重量％、または１５重量％〜２０重量％の塩と接触させるステップを含む。例えば、溶解細胞組成物の重量が１，０００ｋｇである場合、０．５重量％〜２０重量％の塩と接触させるには、５ｋｇ〜２００ｋｇの塩を溶解細胞組成物と組み合わせる必要がある。
[0138]一部の実施形態では、本方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を加熱するステップであって、それにより溶解細胞組成物を解乳化するステップを含む。一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物は、塩基および／または塩が細胞組成物または溶解細胞組成物を解乳化するのに十分な期間にわたり加熱される。一部の実施形態では、本方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも６６時間、少なくとも７２時間、少なくとも７８時間、少なくとも８４時間、少なくとも９０時間または少なくとも９６時間にわたり加熱するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を５分間〜９６時間、５分間〜４時間、５分間〜２時間、５分間〜１時間、１０分間〜４時間、１０分間〜２時間、１０分間〜１時間、１時間〜９６時間、１時間〜８４時間、１時間〜７２時間、１時間〜６０時間、１時間〜４８時間、１時間〜３６時間、１時間〜２４時間、１時間〜４時間、４時間〜９６時間、４時間〜８４時間、４時間〜７２時間、４時間〜６０時間、４時間〜４８時間、４時間〜３６時間、４時間〜２４時間、８時間〜９６時間、８時間〜８４時間、８時間〜７２時間、８時間〜６０時間、８時間〜４８時間、８時間〜３６時間、８時間〜２４時間、８時間〜１２時間、１２時間〜９６時間、１２時間〜８４時間、１２時間〜７２時間、１２時間〜６０時間、１２時間〜４８時間、１２時間〜３６時間、１２時間〜２４時間、２４時間〜９６時間、２４時間〜８４時間、２４時間〜７２時間、２４時間〜６０時間、２４時間〜４８時間、または２４時間〜３６時間にわたり加熱するステップを含む。
[0139]一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物は、少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃、または少なくとも１００℃の温度で加熱され得る。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を１０℃〜１００℃、１０℃〜９０℃、１０℃〜８０℃、１０℃〜７０℃、２０℃〜１００℃、２０℃〜９０℃、２０℃〜８０℃、２０℃〜７０℃、３０℃〜１００℃、３０℃〜９０℃、３０℃〜８０℃、３０℃〜７０℃、４０℃〜１００℃、４０℃〜９０℃、４０℃〜８０℃、５０℃〜１００℃、５０℃〜９０℃、５０℃〜８０℃、５０℃〜７０℃、６０℃〜１００℃、６０℃〜９０℃、６０℃〜８０℃、７０℃〜１００℃、７０℃〜９０℃、８０℃〜１００℃、８０℃〜９０℃、または９０℃〜１００℃の温度で加熱するステップを含む。一部の実施形態では、塩は、加熱している間に細胞組成物または溶解細胞組成物に添加され得る。
[0140]一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物は、クローズドシステムまたはエバポレーターを備えるシステムにおいて加熱され得る。一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物は、エバポレーターを備えるシステムにおいて、細胞組成物または溶解細胞組成物中に存在する水の一部分が蒸発によって除去されるように加熱され得る。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物をエバポレーターを備えるシステムにおいて加熱するステップであって、それにより細胞組成物または溶解細胞組成物中に存在する水の最大１重量％、５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％または５０重量％を除去するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物をエバポレーターを備えるシステムにおいて加熱するステップであって、それにより１％〜５０％、１％〜４５％、１％〜４０％、１％〜３５％、１％〜３０％、１％〜２５％、１％〜２０％、１％〜１５％、１％〜１０％、１％〜５％、５％〜５０％、５％〜４５％、５％〜４０％、５％〜３５％、５％〜３０％、５％〜２５％、５％〜２０％、５％〜１５％、５％〜１０％、１０％〜５０％、１０％〜４５％、１０％〜４０％、１０％〜３５％、１０％〜３０％、１０％〜２５％、１０％〜２０％、１０％〜１５％、１５％〜５０％、１５％〜４５％、１５％〜４０％、１５％〜３５％、１５％〜３０％、１５％〜２５％、１５％〜２０％、２０％〜５０％、２０％〜４５％、２０％〜４０％、２０％〜３５％、２０％〜３０％、２０％〜２５％、２５％〜５０％、２５％〜４５％、２５％〜４０％、２５％〜３５％、２５％〜３０％、３０％〜５０％、３０％〜４５％、３０％〜４０％、３０％〜３５％、３５％〜５０％、３５％〜４５％、３５％〜４０％、４０％〜５０％、４０％〜４５％、または４５％〜５０％を除去するステップを含む。
[0141]一部の実施形態では、本方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物をベッセル内に所定の期間にわたり保持するステップであって、それにより溶解細胞組成物を解乳化するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物をベッセル内に少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも６６時間、少なくとも７２時間、少なくとも７８時間、少なくとも８４時間、少なくとも９０時間または少なくとも９６時間にわたり保持するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を５分間〜９６時間、５分間〜４時間、５分間〜２時間、５分間〜１時間、１０分間〜４時間、１０分間〜２時間、１０分間〜１時間、１時間〜９６時間、１時間〜８４時間、１時間〜７２時間、１時間〜６０時間、１時間〜４８時間、１時間〜３６時間、１時間〜２４時間、１時間〜４時間、４時間〜９６時間、４時間〜８４時間、４時間〜７２時間、４時間〜６０時間、４時間〜４８時間、４時間〜３６時間、４時間〜２４時間、８時間〜９６時間、８時間〜８４時間、８時間〜７２時間、８時間〜６０時間、８時間〜４８時間、８時間〜３６時間、８時間〜２４時間、８時間〜１２時間、１２時間〜９６時間、１２時間〜８４時間、１２時間〜７２時間、１２時間〜６０時間、１２時間〜４８時間、１２時間〜３６時間、１２時間〜２４時間、２４時間〜９６時間、２４時間〜８４時間、２４時間〜７２時間、２４時間〜６０時間、２４時間〜４８時間、または２４時間〜３６時間にわたり保持するステップを含む。
[0142]一部の実施形態では、本方法は、抗酸化剤を溶解細胞乳濁液と接触させるステップを含む。本発明での使用に好適な抗酸化剤としては、限定はされないが、トコフェロール、トコトリエノール、ポリフェノール、レスベラトロール、フラボノイド、カロテノイド、リコピン、カロチン、ルテイン、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビルなど、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
[0143]一部の実施形態では、本方法は、乳化した溶解細胞組成物を静置させるステップを含み、ここで脂質は重力を用いて乳化した溶解細胞組成物から分離される。
[0144]本明細書で使用されるとき、用語「撹拌する」および「撹拌」は、力を加えることによって溶解細胞組成物における動きに影響を及ぼすプロセスを指す。一部の実施形態では、本発明の方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を、かき混ぜるか、混ぜ合わせるか、ブレンドするか、振盪するか、振動させるか、またはそれらの組み合わせにより撹拌するステップを含む。一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物を撹拌するプロセスにより細胞組成物または溶解細胞組成物が解乳化する。
[0145]一部の実施形態では、本発明の方法は、溶解細胞組成物を０．１ｈｐ／１，０００ｇａｌ〜１０ｈｐ／１，０００ｇａｌ、０．５ｈｐ／１，０００ｇａｌ〜８ｈｐ／１，０００ｇａｌ、１ｈｐ／１，０００ｇａｌ〜６ｈｐ／１，０００ｇａｌ、または２ｈｐ／１，０００ｇａｌ〜５ｈｐ／１，０００ｇａｌ溶解細胞組成物で撹拌するステップを含む。
[0146]一部の実施形態では、本発明の方法は、撹拌機を使用して細胞組成物または溶解細胞組成物を撹拌するステップを含む。一部の実施形態では、撹拌機は、塩基および／または塩を細胞組成物または溶解細胞組成物中に分散させる分散方式の撹拌機である。一部の実施形態では、撹拌機は１つ以上のインペラを有する。本明細書で使用されるとき、「インペラ」は、回転時に細胞組成物または溶解細胞組成物に動きを付与するように構成された装置を指す。本発明での使用に好適なインペラとしては、直線状ブレードインペラ、ラシュトン（Ｒｕｓｈｔｏｎ）ブレードインペラ、軸流インペラ、放射状流インペラ、凹面状ブレードディスクインペラ、高性能インペラ、プロペラ、パドル、タービンなど、およびそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、方法は、９０ｆｔ／分〜１，２００ｆｔ／分、２００ｆｔ／分〜１，０００ｆｔ／分、３００ｆｔ／分〜８００ｆｔ／分、４００ｆｔ／分〜７００ｆｔ／分、または５００ｆｔ／分〜６００ｆｔ／分のインペラ先端速度を有する撹拌機を使用して細胞組成物または溶解細胞組成物を撹拌するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、３５０センチメートル／秒〜９００センチメートル毎秒、３５０センチメートル／秒〜８５０センチメートル毎秒、３５０センチメートル／秒〜８００センチメートル／秒、３５０センチメートル／秒〜７５０センチメートル／秒、３５０センチメートル／秒〜７００センチメートル／秒、３５０センチメートル／秒〜６５０センチメートル／秒、３５０センチメートル／秒〜６００センチメートル／秒、３５０センチメートル／秒〜５５０センチメートル／秒、３５０センチメートル／秒〜５００センチメートル／秒、３５０センチメートル／秒〜４５０センチメートル／秒、３５０センチメートル／秒〜４００センチメートル／秒、４００センチメートル／秒〜９００センチメートル毎秒、４００センチメートル／秒〜８５０センチメートル毎秒、４００センチメートル／秒〜８００センチメートル／秒、４００センチメートル／秒〜７５０センチメートル／秒、４００センチメートル／秒〜７００センチメートル／秒、４００センチメートル／秒〜６５０センチメートル／秒、４００センチメートル／秒〜６００センチメートル／秒、４００センチメートル／秒〜５５０センチメートル／秒、４００センチメートル／秒〜５００センチメートル／秒、４００センチメートル／秒〜４５０センチメートル／秒、４５０センチメートル／秒〜９００センチメートル毎秒、４５０センチメートル／秒〜８５０センチメートル毎秒、４５０センチメートル／秒〜８００センチメートル／秒、４５０センチメートル／秒〜７５０センチメートル／秒、４５０センチメートル／秒〜７００センチメートル／秒、４５０センチメートル／秒〜６５０センチメートル／秒、４５０センチメートル／秒〜６００センチメートル／秒、４５０センチメートル／秒〜５５０センチメートル／秒、４５０センチメートル／秒〜５００センチメートル／秒、５００センチメートル／秒〜９００センチメートル毎秒、５００センチメートル／秒〜８５０センチメートル毎秒、５００センチメートル／秒〜８００センチメートル／秒、５００センチメートル／秒〜７５０センチメートル／秒、５００センチメートル／秒〜７００センチメートル／秒、５００センチメートル／秒〜６５０センチメートル／秒、５００センチメートル／秒〜６００センチメートル／秒、５００センチメートル／秒〜５５０センチメートル／秒、５５０センチメートル／秒〜９００センチメートル毎秒、５５０センチメートル／秒〜８５０センチメートル毎秒、５５０センチメートル／秒〜８００センチメートル／秒、５５０センチメートル／秒〜７５０センチメートル／秒、５５０センチメートル／秒〜７００センチメートル／秒、５５０センチメートル／秒〜６５０センチメートル／秒、５５０センチメートル／秒〜６００センチメートル／秒、６００センチメートル／秒〜９００センチメートル毎秒、６００センチメートル／秒〜８５０センチメートル毎秒、６００センチメートル／秒〜８００センチメートル／秒、６００センチメートル／秒〜７５０センチメートル／秒、６００センチメートル／秒〜７００センチメートル／秒、６００センチメートル／秒〜６５０センチメートル／秒、６５０センチメートル／秒〜９００センチメートル毎秒、６５０センチメートル／秒〜８５０センチメートル毎秒、６５０センチメートル／秒〜８００センチメートル／秒、６５０センチメートル／秒〜７５０センチメートル／秒、６５０センチメートル／秒〜７００センチメートル／秒、７００センチメートル／秒〜９００センチメートル毎秒、７００センチメートル／秒〜８５０センチメートル毎秒、７００センチメートル／秒〜８００センチメートル／秒、７００センチメートル／秒〜７５０センチメートル／秒、７５０センチメートル／秒〜９００センチメートル毎秒、７５０センチメートル／秒〜８５０センチメートル毎秒、７５０センチメートル／秒〜８００センチメートル／秒、８００センチメートル／秒〜９００センチメートル毎秒、８００センチメートル／秒〜８５０センチメートル毎秒、または８５０センチメートル／秒〜９００センチメートル／秒のインペラ先端速度を有する撹拌機を使用して細胞組成物または溶解細胞組成物を撹拌するステップを含む。本明細書で使用されるとき、「インペラ先端速度」は、インペラがその中心軸の周りに回転するときのインペラの最も外側の部分の速度を指す。
[0147]一部の実施形態では、撹拌するステップ（および場合により本明細書に記載されるとおりのさらなるステップ）は、インペラを含む容器において行われ、ここでインペラ径の容器容量に対する比は、０．１〜０．５、０．１〜０．４、０．２〜０．５、０．２〜０．４、０．３〜０．５、または０．３〜０．４である。
[0148]一部の実施形態では、撹拌するステップ（および場合により本明細書に記載されるとおりのさらなるステップ）は、インペラを含む容器において行われ、ここでインペラ径の容器内径に対する比は、少なくとも０．２５、少なくとも０．３４、少なくとも０．６５、０．２５〜０．６５、０．２５〜０．３３、０．３〜０．６、０．３〜０．５、０．３〜０．４、０．３４〜０．６５、０．３４〜０．６、０．３４〜０．５５、０．３７〜０．５５、０．４〜０．６５、０．４〜０．６、０．４〜０．５、または０．４２〜０．５５である。
[0149]一部の実施形態では、撹拌するステップは、細胞組成物または溶解細胞組成物が１０〜１０，０００、１，０００〜１０，０００、１，５００〜１０，０００、または２，０００〜１０，０００のレイノルズ数により表される流動条件下に置かれるように細胞組成物または溶解細胞組成物を混合するステップを含む。一部の実施形態では、撹拌中の溶解細胞乳濁液は、２，０００以上、３，０００以上、または５，０００以上、または２，０００〜１０，０００、３，０００〜１０，０００、または５，０００〜１０，０００のレイノルズ数を有する。
[0150]一部の実施形態では、方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも６６時間、少なくとも７２時間、少なくとも７８時間、少なくとも８４時間、少なくとも９０時間または少なくとも９６時間にわたり撹拌するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を５分間〜９６時間、５分間〜４時間、５分間〜２時間、５分間〜１時間、１０分間〜４時間、１０分間〜２時間、１０分間〜１時間、１時間〜９６時間、１時間〜８４時間、１時間〜７２時間、１時間〜６０時間、１時間〜４８時間、１時間〜３６時間、１時間〜２４時間、１時間〜４時間、４時間〜９６時間、４時間〜８４時間、４時間〜７２時間、４時間〜６０時間、４時間〜４８時間、４時間〜３６時間、４時間〜２４時間、８時間〜９６時間、８時間〜８４時間、８時間〜７２時間、８時間〜６０時間、８時間〜４８時間、８時間〜３６時間、８時間〜２４時間、８時間〜１２時間、１２時間〜９６時間、１２時間〜８４時間、１２時間〜７２時間、１２時間〜６０時間、１２時間〜４８時間、１２時間〜３６時間、１２時間〜２４時間、２０時間〜４０時間、２４時間〜９６時間、２４時間〜８４時間、２４時間〜７２時間、２４時間〜６０時間、２４時間〜４８時間、または２４時間〜３６時間にわたり撹拌するステップを含む。
[0151]一部の実施形態では、方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を同時に撹拌且つ加熱するステップであって、それにより細胞組成物または溶解細胞組成物を解乳化するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃、または少なくとも１００℃の温度で撹拌するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞組成物または溶解細胞組成物を１０℃〜１００℃、１０℃〜９０℃、１０℃〜８０℃、１０℃〜７０℃、２０℃〜１００℃、２０℃〜９０℃、２０℃〜８０℃、２０℃〜７０℃、３０℃〜１００℃、３０℃〜９０℃、３０℃〜８０℃、３０℃〜７０℃、４０℃〜１００℃、４０℃〜９０℃、４０℃〜８０℃、５０℃〜１００℃、５０℃〜９０℃、５０℃〜８０℃、５０℃〜７０℃、６０℃〜１００℃、６０℃〜９０℃、６０℃〜８０℃、７０℃〜１００℃、７０℃〜９０℃、８０℃〜１０００℃、８０℃〜９０℃、または９０℃〜１００℃の温度で撹拌するステップを含む。
[0152]一部の実施形態では、溶解細胞組成物を形成するステップと、溶解細胞組成物を塩基と接触させるか、または溶解細胞組成物のｐＨを上昇させるステップと、溶解細胞組成物を塩と接触させるステップと、溶解細胞組成物を加熱するステップと、溶解細胞組成物を撹拌するステップとの様々な組み合わせが、単一のベッセルにおいて行われ得る。一部の実施形態では、細胞組成物を形成するステップと、細胞組成物を塩基と接触させるか、または細胞組成物のｐＨを上昇させるステップと、細胞組成物を塩と接触させるステップと、細胞組成物を加熱するステップと、細胞組成物を撹拌するステップとの様々な組み合わせが、単一のベッセルにおいて行われ得る。一部の実施形態では、単一のベッセルは発酵ベッセルを含む。一部の実施形態では、発酵ベッセルは少なくとも２０，０００リットル、少なくとも５０，０００リットル、少なくとも１００，０００リットル、少なくとも１２０，０００リットル、少なくとも１５０，０００リットル、少なくとも２００，０００リットル、または少なくとも２２０，０００リットルの容量を有し得る。一部の実施形態では、発酵ベッセルは、２０，０００リットル〜２２０，０００リットル、２０，０００リットル〜１００，０００リットル、２０，０００リットル〜５０，０００リットル、５０，０００リットル〜２２０，０００リットル、５０，０００リットル〜１５０，０００リットル、５０，０００リットル〜１００，０００リットル、１００，０００リットル〜２２０，０００リットル、１００，０００リットル〜１５０，０００リットル、１００，０００リットル〜１２０，０００リットル、１５０，０００リットル〜２２０，０００リットル、１５０，０００リットル〜２００，０００リットル、または２００，０００リットル〜２２０，０００リットルの容量を有し得る。
[0153]一部の実施形態では、ベッセルに形成されるある量の細胞組成物または溶解細胞組成物は、１つ以上の撹拌ベッセルに移され得る。一部の実施形態では、撹拌ベッセルは少なくとも２０，０００リットル、少なくとも３０，０００リットル、少なくとも４０，０００リットルまたは少なくとも５０，０００リットルの容量を有し得る。一部の実施形態では、撹拌ベッセルは２０，０００リットル〜５０，０００リットル、２０，０００リットル〜４０，０００リットル、２０，０００リットル〜３０，０００リットル、３０，０００リットル〜５０，０００リットル、３０，０００リットル〜４０，０００リットルまたは４０，０００リットル〜５０，０００リットルの容量を有し得る。
[0154]一部の実施形態では、撹拌ベッセルは以下の特性の任意の組み合わせを有し得る。一部の実施形態では、撹拌ベッセルは２つのインペラを有し得る。一部の実施形態では、インペラはラシュトン（Ｒｕｓｈｔｏｎ）ブレードインペラである。一部の実施形態では、インペラは、少なくとも最も小さいインペラの直径に等しい距離だけ互いに離間される。一部の実施形態では、インペラは、先端間が３０インチ〜４０インチ、３３インチ〜３７インチ、３３インチ、３４インチ、３５インチ、３６インチまたは３７インチである。一部の実施形態では、撹拌ベッセルは少なくとも１０，０００リットル、少なくとも２０，０００リットル、少なくとも３０，０００リットル、少なくとも４０，０００リットルまたは少なくとも５０，０００リットルの容量を有する。一部の実施形態では、撹拌ベッセルは９０インチ〜１１０インチ、９５インチ〜１０５インチ、９８インチ、９９インチ、１００インチ、１０１インチ、または１０２インチの内径を有する。一部の実施形態では、第１のインペラが撹拌ベッセルの底から１５インチ〜２０インチ、１６インチ〜１９インチ、または１７インチ〜１８インチに位置し、第２のインペラが第１のインペラの上方６０インチ〜８０インチ、６５インチ〜７５インチ、６８インチ、６９インチ、７０インチ、７１インチ、７２インチ、７３インチ、７４インチ、または７５インチに位置する。一部の実施形態では、溶解細胞組成物は少なくとも５０ｒｐｍ、少なくとも６０ｒｐｍ、または少なくとも７０ｒｐｍで撹拌される。一部の実施形態では、溶解細胞組成物は５０ｒｐｍ〜７０ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜６０ｒｐｍ、または６０ｒｐｍ〜７０ｒｐｍで撹拌される。
[0155]一部の実施形態では、細胞組成物、溶解細胞組成物、または脂質は、細胞組成物、溶解細胞組成物、または脂質をベッセルからポンピングすることによりベッセルから回収される。一部の実施形態では、細胞組成物、溶解細胞組成物、または脂質は、ベッセルを撹拌することなしにベッセルから回収される。一部の実施形態では、細胞組成物、溶解細胞組成物、または脂質は、細胞組成物、溶解細胞組成物、または脂質をベッセルから撹拌することなしにポンピングすることによりベッセルから回収される。一部の実施形態では、細胞組成物、溶解細胞組成物、または脂質は、空気を吹き込むことなしにベッセルから回収される。一部の実施形態では、上記に記載される技法によって細胞組成物、溶解細胞組成物、または脂質を回収すると、低いアニシジン価（例えば、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下）および／または低いリン含量（例えば、１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下）を有する粗脂質が得られる。
[0156]本明細書に記載されるとおり、本発明は、溶解細胞組成物を第１の塩基と接触させるか、または溶解細胞組成物のｐＨを上昇させるステップと、溶解細胞組成物を塩と接触させるステップと、溶解細胞組成物を加熱するステップと、溶解細胞組成物を撹拌するステップとの様々な組み合わせを利用して、処理済み溶解細胞組成物を提供する。本明細書に記載されるとおり、本発明は、細胞組成物を第１の塩基と接触させるか、または細胞組成物のｐＨを上昇させるステップと、細胞組成物を塩と接触させるステップと、細胞組成物を加熱するステップと、細胞組成物を撹拌するステップとの様々な組み合わせを利用して、処理済み細胞組成物を提供する。処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物は、未処理の細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物（ｔｒｅａｔｅｄ）と比較して、少なくとも部分的に解乳化される。従って、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物を遠心機に入れることができ、およびそこから脂質を分離することができる。
[0157]一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物のｐＨを、例えば第１の塩基と接触させることにより上昇させた後、細胞組成物または溶解細胞組成物を加熱し、および／または細胞組成物または溶解細胞組成物を撹拌することにより、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物のｐＨが低下し得る。処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物から遠心によって脂質をより効果的に分離するため、例えば処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物を第２の塩基と接触させることにより、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物のｐＨを２度目に上昇させる。一部の実施形態では、処理済み溶解細胞組成物を第２の塩基と接触させることで、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物のｐＨが上昇する。一部の実施形態では、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物を第２の塩基と接触させて、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物のｐＨを７以上、７．５以上、８以上、８．５以上、９以上、９．５以上、１０以上、１０．５以上、１１以上、１１．５以上、または１２以上に上昇させる。一部の実施形態では、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物を第２の塩基と接触させて、処理済み溶解細胞組成物のｐＨを７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、７〜８、７〜７．５、７．５〜８、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、８〜８．５、８．５〜９、９〜１２、９〜１１、９〜１０、９〜９．５、９．５〜１０、１０〜１２、または１０〜１１に上昇させる。
[0158]一部の実施形態では、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞乳濁液のｐＨは、７以下、６以下、５以下、４以下、または３以下である。
[0159]本発明の方法は、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物から脂質を分離するステップを含む。一部の実施形態では、脂質は、溶解細胞乳濁液を第２の塩基と接触させた後、溶解細胞乳濁液を撹拌した後、または溶解細胞乳濁液を塩と接触させた後に、例えば処理済み溶解細胞乳濁液から脂質を（例えば、別個の層として）分離するのに十分な期間にわたり処理済み溶解細胞乳濁液を静置しておくことにより、溶解細胞乳濁液から分離される。続いて、例えば処理済み溶解細胞乳濁液の表面から脂質をデカントし、上澄みをすくい取り、減圧をかけ、ポンピングし、吸い出し、汲み出し、サイフォン処理し、または他の方法で取り出すことにより、脂質を取り出すことができる。
[0160]一部の実施形態では、分離するステップは、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物を（例えば、３０℃〜１００℃の温度で）遠心することを含み、従ってこの遠心により、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物から脂質が分離される。
[0161]一部の実施形態では、方法は、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物を少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃、または少なくとも１００℃の温度で遠心するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物を１０℃〜１００℃、１０℃〜９０℃、１０℃〜８０℃、２０℃〜１００℃、２０℃〜９０℃、２０℃〜８０℃、２５℃〜１００℃、２５℃〜９０℃、２５℃〜８０℃、２５℃〜７５℃、３０℃〜１００℃、３０℃〜９０℃、３０℃〜８０℃、４０℃〜１００℃、４０℃〜９０℃、４０℃〜８０℃、５０℃〜１００℃、５０℃〜９０℃、５０℃〜８０℃、５０℃〜７０℃、６０℃〜１００℃、６０℃〜９０℃、６０℃〜８０℃、６０℃〜７０℃、７０℃〜１００℃、または７０℃〜９０℃の温度で遠心するステップを含む。
[0162]一部の実施形態では、遠心は、１キログラム毎分（ｋｇ／分）〜５００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜４００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜３００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜２００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜１００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜７５ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜４０ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜３０ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜２５ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜１０ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜４００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜３００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜２００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜１００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜７５ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜４０ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜３０ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜４００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜３００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜２００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜１００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜７５ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜４０ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜４００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜３００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜２００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜１００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜７５ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、３０ｋｇ／分〜６０ｋｇ／分、３０ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、３０ｋｇ／分〜４０ｋｇ／分、５０ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、１００ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、または２００ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分の（処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物の遠心機への）送り速度で実施される。
[0163]分離のための総所要時間は、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物の容量に応じて異なり得る。典型的な総分離時間（例えば、遠心時間）は、少なくとも０．１時間、少なくとも０．２時間、少なくとも０．５時間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、または０．１時間〜２４時間、０．５時間〜２４時間、１時間〜１２時間、２時間〜１０時間、または４時間〜８時間である。
[0164]一部の実施形態では、本発明の方法は、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物を１，０００ｇ〜２５，０００ｇ、１，０００ｇ〜２０，０００ｇ、１，０００ｇ〜１０，０００ｇ、２，０００ｇ〜２５，０００ｇ、２，０００ｇ〜２０，０００ｇ、２，０００ｇ〜１５，０００ｇ、３，０００ｇ〜２５，０００ｇ、３，０００ｇ〜２０，０００ｇ、５，０００ｇ〜２５，０００ｇ、５，０００ｇ〜２０，０００ｇ、５，０００ｇ〜１５，０００ｇ、５，０００ｇ〜１０，０００ｇ、５，０００ｇ〜８，０００ｇ、１０，０００ｇ〜２５，０００ｇ、１５，０００ｇ〜２５，０００ｇ、または少なくとも１，０００ｇ、少なくとも２，０００ｇ、少なくとも４，０００ｇ、少なくとも５，０００ｇ、少なくとも７，０００ｇ、少なくとも８，０００ｇ、少なくとも１０，０００ｇ、少なくとも１５，０００ｇ、少なくとも２０，０００ｇ、または少なくとも２５，０００ｇの遠心力で遠心するステップを含む。本明細書で使用されるとき、「ｇ」は、標準重力、すなわち約９．８ｍ／ｓ２を指す。一部の実施形態では、本発明の方法は、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物を４，０００ｒｐｍ〜１４，０００ｒｐｍ、４，０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍ、６，０００ｒｐｍ〜１４，０００ｒｐｍ、６，０００ｒｐｍ〜１２，０００ｒｐｍ、８，０００〜１４，０００ｒｐｍ、８，０００ｒｐｍ〜１２，０００ｒｐｍ、または８，０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍで遠心するステップを含む。
[0165]一部の実施形態では、本発明の方法は、脂質から水を除去するため、処理済み細胞組成物または処理済み溶解細胞組成物から脂質を分離した後に脂質を乾燥させるステップを含む。一部の実施形態では、脂質を乾燥させるステップには、限定はされないが、脂質を加熱して水を蒸発させることが含まれ得る。一部の実施形態では、乾燥後に脂質は、脂質に対する重量百分率で３％未満、２．５％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、または０％の含水量を有する。一部の実施形態では、乾燥後、脂質は、脂質に対する重量百分率で０％〜３％、０％〜２．５％、０％〜２％、０％〜１．５％、０％〜１％、０％〜０．５％、０．１％〜３％、０．１％〜２．５％、０．１％〜２％、０．１％〜１．５％、０．１％〜１％、０．１％〜０．５％、０．５％〜３％、０．５％〜２．５％、０．５％〜２％、０．５％〜１．５％、０．５％〜１％、１％〜３％、１％〜２．５％、１％〜２％、１％〜１．５％、１．５％〜３％、１．５％〜２．５％、１．５％〜２％、２％〜３％、２％〜２．５％、または２．５％〜３％の含水量を有する。
[0166]一部の実施形態では、方法は、苛性精製、脱ガム、アルカリ処理、脱色、脱臭、脱酸など、およびそれらの組み合わせから選択される１つ以上の方法により脂質を精製するステップであって、それにより１つ以上のリン脂質、遊離脂肪酸、ホスファチド、色素物質、ステロール、臭気および他の不純物を除去するステップをさらに含む。本明細書で使用されるとき、「精製油」は、精製された粗脂質または粗油である。本明細書で使用されるとき、「粗脂質」または「粗油」は、いまだ精製されていない脂質または油である。一部の実施形態では、解乳化細胞組成物から分離される脂質は粗脂質である。
[0167]本発明の様々な例示的方法を図１〜図４に概略的に示す。図１を参照すると、一部の実施形態では、本発明は、細胞（１０１）を溶解する（１０２）ステップであって、それにより溶解細胞組成物（１０３）を形成するステップを含む、細胞（１０１）から脂質（１１０）を得る方法（１００）に関する。溶解細胞組成物は第１の塩基と接触され（１０４）、それにより溶解細胞組成物（１０３）が解乳化され、塩と接触され（１０５）、それにより溶解細胞組成物（１０３）が解乳化され、および例えば１０分間〜９６時間にわたり加熱され（１０６）、それにより処理済み溶解細胞組成物（１０７）が提供される。処理済み溶解細胞組成物（１０７）は第２の塩基と接触させて（１０８）、例えば１０℃〜１００℃の温度で分離され（１０９）、それにより脂質（１１０）が提供される。
[0168]図２を参照すると、一部の実施形態では、本発明は、細胞から脂質（２１０）を得る方法（２００）に関し、この方法は、細胞（１０１）を溶解する（１０２）ステップであって、それにより溶解細胞組成物（１０３）を形成するステップを含む。次に溶解細胞組成物は塩基と接触され（２０４）、それにより溶解細胞組成物（１０３）が解乳化され、および処理済み溶解細胞組成物（２０７）が提供される。処理済み溶解細胞組成物（２０７）は、例えば１０℃〜１００℃の温度で分離され（２０９）、それにより脂質（２１０）が提供される。
[0169]図３を参照すると、一部の実施形態では、本発明は、細胞から脂質（３１０）を得る方法（３００）に関し、この方法は、細胞（１０１）を溶解する（１０２）ステップであって、それにより溶解細胞組成物（１０３）を形成するステップを含む。次に溶解細胞組成物は塩と接触され（３０５）、それにより溶解細胞組成物（１０３）が解乳化され、および処理済み溶解細胞組成物（３０７）が提供され、それが例えば１０℃〜１００℃の温度で分離されて（３０９）、脂質（３１０）が提供される。
[0170]図４を参照すると、一部の実施形態では、本発明は、細胞から脂質（４１０）を得る方法（４００）に関し、この方法は、細胞（１０１）を溶解する（１０２）ステップであって、それにより溶解細胞組成物（１０３）を形成するステップを含む。次に溶解細胞組成物は塩と接触され（４０５）、それにより溶解細胞組成物（１０３）が解乳化され、および例えば５分間〜９６時間撹拌され（４０１）、場合により加熱され（４０２）、それにより処理済み溶解細胞組成物（４０７）が提供される。次に処理済み溶解細胞組成物は、例えば１０℃〜１００℃の温度で分離され（４０９）、それにより脂質（４１０）が提供される。
[0171]一部の実施形態では、本発明の方法は、微生物細胞を含むブロス、植物材料を含むブロスを濃縮するステップおよび／または溶解細胞組成物を濃縮するステップを含む。本明細書で使用されるとき、「濃縮する」は、組成物から水を除去することを指す。濃縮には、限定はされないが、蒸発、化学的乾燥、遠心など、およびそれらの組み合わせが含まれ得る。
[0172]一部の実施形態では、微生物細胞を含むブロスまたは植物材料を含むブロスが濃縮され、ブロスの少なくとも４重量％、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、または少なくとも３０重量％の脂質濃度が提供される。一部の実施形態では、微生物細胞を含むブロスまたは植物材料を含むブロスが濃縮され、ブロスの４重量％〜４０重量％、４重量％〜３０重量％、４重量％〜２０重量％、４重量％〜１５重量％、５重量％〜４０重量％、５重量％〜３０重量％、５重量％〜２０重量％、１０重量％〜４０重量％、１０重量％〜３０重量％、１０重量％〜２０重量％、１５重量％〜４０重量％、１５重量％〜３０重量％、２０重量％〜４０重量％、２０重量％〜３０重量％、２５重量％〜４０重量％、または３０重量％〜４０重量％の脂質濃度が提供される。
[0173]一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物が濃縮され、溶解細胞組成物の少なくとも４重量％、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、または少なくとも３０重量％の脂質濃度が提供される。一部の実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物が濃縮され、溶解細胞組成物の４重量％〜４０重量％、４重量％〜３０重量％、４重量％〜２０重量％、４重量％〜１５重量％、５重量％〜４０重量％、５重量％〜３０重量％、５重量％〜２０重量％、１０重量％〜４０重量％、１０重量％〜３０重量％、１０重量％〜２０重量％、１５重量％〜４０重量％、１５重量％〜３０重量％、２０重量％〜４０重量％、２０重量％〜３０重量％、２５重量％〜４０重量％、または３０重量％〜４０重量％の脂質濃度が提供される。
[0174]一部の実施形態では、本発明の方法により調製される脂質は、２以下の全体的なアロマ強度を有する。本明細書で使用されるとき、用語「全体的なアロマ強度」は、官能分析の専門家パネルによって脂質に与えられる嗅覚の官能評価を指す。本明細書で使用されるとき、用語「官能分析の専門家」は、物質の官能特性に関するフィードバックを提供し、および／またはそれを評価する、訓練を受けた個人を指す。
[0175]一部の実施形態では、本発明の方法により調製される脂質は、３以下の全体的な芳香強度を有する。本明細書で使用されるとき、用語「全体的な芳香強度」は、官能分析の専門家パネルによって脂質に与えられる味覚の、すなわち味の官能評価を指す。一部の実施形態では、ユニバーサルスペクトルの記述的分析方法（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて試料のアロマおよび芳香特性が評価される。この方法では、０〜１５の強度スケール（０＝検出なし、および１５＝極めて高強度）を使用して油のアロマおよび芳香属性が計測される。
[0176]一部の実施形態では、本発明の方法により調製される脂質は、魚臭として特徴付けられる後味を有しない。本明細書で使用されるとき、用語「後味」は、官能分析の専門家パネルにより特徴付けられるときの、脂質におけるフレーバーの感覚の持続を指す。
[0177]一部の実施形態では、本発明の方法は、５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価（ＰＶ）を有する粗脂質を提供する。本明細書で使用されるとき、用語「過酸化物価」または「ＰＶ」は、脂質の酸化中に生じる過酸化物およびヒドロペルオキシドなどの主反応生成物の尺度を指す。一部の実施形態では、ＰＶは、脂質の品質および脂質に生じた酸化の程度の指標であり、低い（すなわち、５以下の）ＰＶを有することは、５より大きいＰＶを有する脂質と比べて安定性および官能プロファイルが向上していることを示す。一部の実施形態では、上記に考察したとおり溶解細胞組成物に塩基を添加すると、溶解細胞組成物のｐＨが上昇して脂質酸化が阻害され、それにより溶解細胞組成物中のフリーラジカルの量が最小限に抑えられ、従って本発明の方法から得られる粗脂質が低い（すなわち、５以下の）ＰＶを有することになる。
[0178]一部の実施形態では、本発明の方法は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価（ＡＶ）を有する粗脂質を提供する。本明細書で使用されるとき、用語「アニシジン価」または「ＡＶ」は、脂質の酸化中に生じるアルデヒドおよびケトンなどの副反応生成物の尺度を指す。一部の実施形態では、ＡＶは、脂質の品質および脂質に生じた酸化の程度の指標である。低い（すなわち、２６以下の）ＡＶを有する脂質は、２６より大きいＡＶを有する脂質と比べて安定性および官能プロファイルが向上していることを示す。一部の実施形態では、上記に考察したとおり溶解細胞組成物に塩基を添加すると、溶解細胞組成物のｐＨが上昇して脂質酸化が阻害され、それにより溶解細胞組成物中のフリーラジカルの量が最小限に抑えられ、従って本発明の方法から得られる粗脂質が低い（すなわち、２６以下の）ＡＶを有することになる。
[0179]一部の実施形態では、本発明の方法は、１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する粗脂質を提供する。
[0180]一部の実施形態では、本発明の方法は、溶媒を使用して抽出が実施された場合（例えば、非典型的なヘキサン抽出（ａｔｙｐｉｃａｌ ｈｅｘａｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）またはＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ ＡＧ，独国））と比べてより低いアニシジン価、より低い過酸化物価、より低いリン含量および／またはより高い抽出収率を有する粗脂質を提供する。ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法は、米国特許第５，９２８，６９６号明細書並びに国際公開第０１／７６３８５号パンフレットおよび国際公開第０１／７６７１５号パンフレット（各々が全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの水溶性有機溶媒で脂質を抽出する方法である。
[0181]一部の実施形態では、溶解細胞組成物を加熱することで、副反応生成物（例えば、アルデヒドおよびケトン）が、溶解細胞組成物中に存在するタンパク質とのメイラード反応に類似した反応に関与するようになる。この反応は、脂質の酸化を低減する抗酸化活性を有する生成物を作り出すと考えられる。一部の実施形態では、さらなるタンパク質、例えば大豆タンパク質を溶解細胞組成物に添加することにより、抗酸化活性を高めることができる。脂質の酸化を低減すると、脂質のＡＶが低下し、脂質の任意の後味が低減され、および／または脂質の安定性が増加する。一部の実施形態では、安定性は少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％または少なくとも２０％増加する。
[0182]一部の実施形態では、本発明の方法により抽出される脂質、脂質の抽出後に残るバイオマス、またはそれらの組み合わせは、食品または食品成分、例えば、ベビーフード、調製粉乳、飲料、ソース、乳製品（ミルク、ヨーグルト、チーズおよびアイスクリームなど）、油（例えば、調理油またはサラダドレッシング）、およびベイクド製品；栄養補助剤（例えば、カプセルまたは錠剤形態）；任意の非ヒト動物（例えば、その生産物（例えば、肉、ミルク、または卵）がヒトの食用である非ヒト動物）用の飼料または飼料補助剤；栄養補助食品；および医薬品（直接的または補助的な治療用途におけるもの）の一成分として直接使用することができる。用語「動物」は、動物界（Ａｎｉｍａｌｉａ）に属する任意の生物を指し、任意のヒト動物、および生産物（例えば、ミルク、卵、家禽肉、牛肉、豚肉又仔羊肉）が得られる非ヒト動物を含む。一部の実施形態では、脂質および／またはバイオマスは海産物において使用することができる。海産物は、限定なしに、魚、エビおよび甲殻類から得られる。用語「生産物」は、限定なしに、肉、卵、ミルクまたは他の生産物を含めた、かかる動物から得られる任意の生産物を含む。脂質および／またはバイオマスをかかる動物に与えると、多価不飽和脂質がかかる動物の肉、乳、卵または他の生産物に取り込まれ、動物のそのような脂質の含量が増加し得る。
［微生物脂質］
[0183]一部の実施形態では、本発明は、本発明の方法により抽出される微生物脂質に関する。一部の実施形態では、粗微生物脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。一部の実施形態では、粗微生物脂質は、重量基準または体積基準で５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満の有機溶媒を有する。一部の実施形態では、粗微生物脂質は、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％の所望のＰＵＦＡを有する。一部の実施形態では、粗微生物脂質は、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％のＤＨＡ、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、または少なくとも２０重量％のＤＰＡ ｎ−６、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、または少なくとも２０重量％のＥＰＡ、および／または少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、または少なくとも５０重量％のＡＲＡを有する。一部の実施形態では、本発明の方法により抽出される粗微生物脂質は、溶媒を使用して抽出が実施された場合（例えば、典型的なヘキサン抽出またはＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ ＡＧ，独国））と比べてより低いアニシジン価、より低い過酸化物価、より低いリン含量および／またはより高い抽出収率をもたらす。
［単離ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）微生物の第１のセットから抽出される脂質］
[0184]一部の実施形態では、本発明は、さらに、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５３３号明細書および国際公開第２０１０／１０７４１５号パンフレット（各々が全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりのヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）から抽出される微生物脂質に関する。一部の実施形態では、本方法は、ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）を培養液中で増殖させてバイオマスを産生するステップと、バイオマスからω−３脂肪酸を含む脂質を抽出するステップとを含む。脂質は新しく回収したバイオマスから抽出されてもよく、または変質を防止する条件下に保存されていた、予め回収していたバイオマスから抽出されてもよい。公知の方法を用いて本発明のヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）を培養し、培養物からバイオマスを単離し、およびバイオマスから抽出された油の脂肪酸プロファイルを分析することができる。例えば、全体として参照により本明細書に援用される米国特許第５，１３０，２４２号明細書を参照のこと。脂質は本発明の方法により抽出することができる。
[0185]本発明の微生物脂質は、例えば：さらなる加工なしに微生物のバイオマスから抽出される粗油；精製、脱色、および／または脱臭などのさらなる加工ステップで粗微生物油を処理することにより得られる精製油；粗微生物油または精製微生物油を希釈することにより得られる希釈微生物油；または例えば粗微生物油または精製微生物油を、油中の脂肪酸（ＤＨＡなど）の濃度を高めるさらなる精製方法で精製することにより得られる濃縮油を含めた、微生物に由来する任意の脂質であってよい。
[0186]一部の実施形態では、微生物脂質は、０重量％、少なくとも０．１重量％、少なくとも０．２重量％、少なくとも０．５重量％、少なくとも約１重量％、少なくとも１．５重量％、少なくとも２重量％、または少なくとも５重量％のステロールエステル画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、０重量％〜１．５重量％、０重量％〜２重量％、０重量％〜５重量％、１重量％〜１．５重量％、０．２重量％〜１．５重量％、０．２重量％〜２重量％、または０．２重量％〜５重量％のステロールエステル画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、または２重量％未満のステロールエステル画分を含む。
[0187]一部の実施形態では、微生物脂質は、少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、または少なくとも９０重量％のトリグリセリド画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、６５重量％〜９５重量％、７５重量％〜９５重量％、または８０重量％〜９５重量％、または９７重量％、または９８重量％のトリグリセリド画分を含む。
[0188]一部の実施形態では、微生物脂質は、少なくとも０．５重量％、少なくとも１重量％、少なくとも１．５重量％、少なくとも２重量％、少なくとも２．５重量％、または少なくとも５重量％の遊離脂肪酸画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、０．５重量％〜５重量％、０．５重量％〜２．５重量％、０．５重量％〜２重量％、０．５重量％〜１．５重量％、０．５重量％〜１重量％、１重量％〜２．５重量％、１重量％〜５重量％、１．５重量％〜２．５重量％、２重量％〜２．５重量％、または２重量％〜５重量％の遊離脂肪酸画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、または１重量％未満の遊離脂肪酸画分を含む。
[0189]一部の実施形態では、微生物脂質は、少なくとも０．５重量％、少なくとも１重量％、少なくとも１．５重量％、少なくとも２重量％、または少なくとも５重量％のステロール画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、０．５重量％〜１．５重量％、１重量％〜１．５重量％、０．５重量％〜２重量％、０．５重量％〜５重量％、１重量％〜２重量％、または１重量％〜５重量％のステロール画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、または１重量％未満のステロール画分を含む。
[0190]一部の実施形態では、微生物脂質は、少なくとも１．５重量％、少なくとも２重量％、少なくとも２．５重量％、少なくとも３重量％、少なくとも３．５重量％、または少なくとも５重量％のジグリセリド画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、１．５重量％〜３重量％、２重量％〜３重量％、１．５重量％〜３．５重量％、１．５重量％〜５重量％、２．５重量％〜３重量％、２．５重量％〜３．５重量％、または２．５重量％〜５重量％のジグリセリド画分を含む。
[0191]一部の実施形態では、微生物脂質は、油の２重量％未満、１．５重量％未満、１重量％未満、または０．５重量％未満の不鹸化物を含む。
[0192]トリグリセリド画分などの、微生物油中に存在する脂質クラスは、フラッシュクロマトグラフィーにより分離し、且つ薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析することができ、または当該技術分野において公知の他の方法により分離および分析することができる。
[0193]一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも５５重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、または少なくとも８０重量％のＤＨＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、４０重量％〜４５重量％、４０重量％〜５０重量％、４０重量％〜６０重量％、５０重量％〜６０重量％、５５重量％〜６０重量％、４０重量％〜６５重量％、５０重量％〜６５重量％、５５重量％〜６５重量％、４０重量％〜７０重量％、４０重量％〜８０重量％、５０重量％〜８０重量％、５５重量％〜８０重量％、６０重量％〜８０重量％、または７０重量％〜８０重量％のＤＨＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、４５重量％以下、４０重量％以下、３５重量％以下、３０重量％以下、２５重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、または１３重量％以下のＤＨＡを含むステロールエステル画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、１０重量％以下、９重量％以下、８重量％以下、７重量％以下、６重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、または１重量％以下のＥＰＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、２重量％〜３重量％、２重量％〜３．５重量％、２．５重量％〜３．５重量％、２重量％〜６重量％、２．５重量％〜６重量％、３．０重量％〜６重量％、３．５重量％〜６重量％、５重量％〜６重量％、または２重量％〜１０重量％のＥＰＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、ＥＰＡを実質的に含まない。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、少なくとも５：１、少なくとも７：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、または少なくとも５０：１の、ＤＨＡのＥＰＡに対する重量比を含み、ここで微生物脂質および／またはその１つ以上の画分は、１０重量％以下のＥＰＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、少なくとも５：１であるが２０：１未満の、ＤＨＡのＥＰＡに対する重量比を含む。一部の実施形態では、ＤＨＡのＥＰＡに対する重量比は、５：１〜１８：１、７：１〜１６：１、または１０：１〜１５：１である。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、０．１重量％〜０．２５重量％、０．２重量％〜０．２５重量％、０．１重量％〜０．５重量％、または０．１重量％〜１．５重量％のＡＲＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、１．５重量％以下、１重量％以下、０．５重量％以下、０．２重量％以下、または０．１重量％以下のＡＲＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、ＡＲＡを実質的に含まない。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、少なくとも２０：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１、少なくとも４０：１、少なくとも６０：１、少なくとも８０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、または少なくとも３００：１の、ＤＨＡのＡＲＡに対する重量比を含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、０．５重量％〜１重量％、０．５重量％〜２重量％、０．５重量％〜２．５重量％、０．５重量％〜３重量％、０．５重量％〜３．５重量％、０．５重量％〜５重量％、０．５重量％〜６重量％、１重量％〜２重量％、２重量％〜３重量％、２重量％〜３．５重量％、１重量％〜２．５重量％、１重量％〜３重量％、１重量％〜３．５重量％、１重量％〜５重量％、または１重量％〜６重量％のＤＰＡ ｎ−６を含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、６重量％以下、５重量％以下、３重量％以下、２．５重量％以下、２重量％以下、１重量％以下、または０．５重量％以下のＤＰＡ ｎ−６を含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、ＤＰＡ ｎ−６を実質的に含まない。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、６：１より大きい、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも５０：１、または少なくとも１００：１の、ＤＨＡのＤＰＡ ｎ−６に対する重量比を含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１．５重量％以下、１重量％以下、または０．５重量％以下の、リノール酸（１８：２ ｎ−６）、リノレン酸（１８：３ ｎ−３）、エイコセン酸（２０：１ ｎ−９）、およびエルカ酸（２２：１ ｎ−９）の各々を含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはステロールエステル画分、トリグリセリド画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジグリセリド画分、極性画分（リン脂質画分を含む）、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１．５重量％以下、または１重量％以下のヘプタデカン酸（１７：０）を含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはその１つ以上の画分は、０．０１重量％〜５重量％、０．０５重量％〜３重量％、または０．１重量％〜１重量％のヘプタデカン酸を含む。
[0194]一部の実施形態では、抽出微生物脂質は少なくとも７０重量％のトリグリセリド画分を含み、ここでトリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量は少なくとも５０重量％であり、トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸ｎ−６含量は少なくとも０．５重量％〜６重量％であり、および油は２６以下のアニシジン価を有する。一部の実施形態では、抽出微生物脂質は少なくとも７０重量％のトリグリセリド画分を含み、ここでトリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量は少なくとも４０重量％であり、トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸ｎ−６含量は少なくとも０．５重量％〜６重量％であり、ドコサヘキサエン酸のドコサペンタエン酸ｎ−６との比は６：１より大きく、および脂質は２６以下のアニシジン価を有する。一部の実施形態では、抽出微生物脂質は少なくとも７０重量％のトリグリセリド画分を含み、ここでトリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量は少なくとも６０重量％であり、および脂質は２６以下のアニシジン価を有する。一部の実施形態では、上記の脂肪酸プロファイルのいずれかを有する抽出微生物脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。一部の実施形態では、上記の脂肪酸プロファイルのいずれかを有する抽出微生物脂質は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５、ＰＴＡ−９６９６、ＰＴＡ−９６９７、またはＰＴＡ−９６９８として寄託されたヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）種の特徴を有する単離ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）微生物から抽出される。一部の実施形態では、上記の脂肪酸プロファイルのいずれかを有する抽出微生物脂質は粗脂質である。一部の実施形態では、粗脂質は５重量％または体積％未満の有機溶媒を有する。一部の実施形態では、本発明の方法により抽出される微生物脂質は、溶媒を使用して抽出が実施された場合（例えば、非典型的なヘキサン抽出（ａｔｙｐｉｃａｌ ｈｅｘａｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）またはＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ ＡＧ，独国））、より低いアニシジン価、より低い過酸化物価、より低いリン含量および／またはより高い抽出収率をもたらす。
［単離ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）微生物の第２のセットから抽出される脂質］
[0195]一部の実施形態では、本発明は、さらに、米国特許出願第１２／７２９，０１３号明細書およびＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８１７５号明細書（各々が全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりのヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）から抽出される微生物脂質に関する。一部の実施形態では、本方法は、ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）を培養液中で増殖させてバイオマスを産生するステップと、バイオマスからω−３脂肪酸を含む脂質を抽出するステップとを含む。脂質は新しく回収したバイオマスから抽出されてもよく、または変質を防止する条件下に保存されていた、予め回収していたバイオマスから抽出されてもよい。公知の方法を用いて本発明のヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）を培養し、培養物からバイオマスを単離し、およびバイオマスから抽出された油の脂肪酸プロファイルを分析することができる。例えば、全体として参照により本明細書に援用される米国特許第５，１３０，２４２号明細書を参照のこと。脂質は本発明の方法により抽出することができる。
[0196]本発明の微生物脂質は、例えば：さらなる加工なしに微生物のバイオマスから抽出される粗油；精製、脱色、および／または脱臭などのさらなる加工ステップで粗微生物油を処理することにより得られる精製油；粗微生物油または精製微生物油を希釈することにより得られる希釈微生物油；または例えば粗微生物油または精製微生物油を、油中の脂肪酸（ＤＨＡなど）の濃度を高めるさらなる精製方法で精製することにより得られる濃縮油を含めた、微生物に由来する任意の脂質であってよい。
[0197]一部の実施形態では、微生物脂質は、０重量％、少なくとも０．１重量％、少なくとも０．２重量％、少なくとも０．５重量％、少なくとも１重量％、少なくとも１．５重量％、少なくとも２重量％、または少なくとも５重量％のステロールエステル画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、０重量％〜１．５重量％、０重量％〜２重量％、０重量％〜５重量％、１重量％〜１．５重量％、０．２重量％〜１．５重量％、０．２重量％〜２重量％、または０．２重量％〜５重量％のステロールエステル画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下、０．５重量％以下、０．３重量％以下、０．２重量％以下、０．５重量％以下、０．４重量％以下、０．３重量％以下、または０．２重量％以下のステロールエステル画分を含む。
[0198]一部の実施形態では、微生物脂質は、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも５５重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、または少なくとも９０重量％のトリアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、３５重量％〜９８重量％、３５重量％〜９０重量％、３５重量％〜８０重量％、３５重量％〜７０重量％、３５重量％〜７０重量％、３５重量％〜６５重量％、４０重量％〜７０重量％、４０重量％〜６５重量％、４０重量％〜５５重量％、４０重量％〜５０重量％、６５重量％〜９５重量％、７５重量％〜９５重量％、７５重量％〜９８重量％、８０重量％〜９５重量％、８０重量％〜９８重量％、９０重量％〜９６重量％、９０重量％〜９７重量％、９０重量％〜９８重量％、９０重量％、９５重量％、９７重量％、または９８重量％のトリアシルグリセロール画分を含む。
[0199]一部の実施形態では、微生物脂質は、少なくとも１０重量％、少なくとも１１重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１３重量％、少なくとも１４重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも１６重量％、少なくとも１７重量％、少なくとも１８重量％、少なくとも１９重量％、または少なくとも２０重量％のジアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、１０重量％〜４５重量％、１０重量％〜４０重量％、１０重量％〜３５重量％、１０重量％〜３０重量％、１５重量％〜４０重量％、１５重量％〜３５重量％、または１５重量％〜３０重量％のジアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、少なくとも０．２重量％、少なくとも０．３重量％、少なくとも０．４重量％、少なくとも０．５重量％、少なくとも１重量％、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１１重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１３重量％、少なくとも１４重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも１６重量％、少なくとも１７重量％、少なくとも１８重量％、少なくとも１９重量％、または少なくとも２０重量％の１，２−ジアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、０．２重量％〜４５重量％、０．２重量％〜３０重量％、０．２重量％〜２０重量％、０．２重量％〜１０重量％、０．２重量％〜５重量％、０．２重量％〜１重量％、０．２重量％〜０．８重量％、０．４重量％〜４５重量％、０．４重量％〜３０重量％、０．４重量％〜２０重量％、０．４重量％〜１０重量％、０．４重量％〜５重量％、０．４重量％〜１重量％、０．４重量％〜０．８重量％、０．５重量％〜１重量％、０．５重量％〜０．８重量％、１０重量％〜４５重量％、１０重量％〜４０重量％、１０重量％〜３５重量％、１０重量％〜３０重量％、１５重量％〜４０重量％、１５重量％〜３５重量％、１５重量％〜３０重量％、または１５重量％〜２５重量％のジアシルグリセロール画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、少なくとも０．１重量％、少なくとも０．２重量％、少なくとも０．５重量％、少なくとも１重量％、少なくとも２重量％、少なくとも２．５重量％、または少なくとも３重量％の１，３−ジアシルグリセロール画分を含む。
[0200]一部の実施形態では、微生物脂質は、少なくとも０．３重量％、少なくとも０．４重量％、少なくとも０．５重量％、少なくとも１重量％、少なくとも１．５重量％、少なくとも２重量％、または少なくとも５重量％のステロール画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、０．３重量％〜５重量％、０．３重量％〜２重量％、０．３重量％〜１．５重量％、０．５重量％〜１．５重量％、１重量％〜１．５重量％、０．５重量％〜２重量％、０．５重量％〜５重量％、１重量％〜２重量％、または１重量％〜５重量％のステロール画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１．５重量％以下、または１重量％以下のステロール画分を含む。
[0201]一部の実施形態では、微生物脂質は、少なくとも２重量％、少なくとも５重量％、または少なくとも８重量％のリン脂質画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、２重量％〜２５重量％、２重量％〜２０重量％、２重量％〜１５重量％、２重量％〜１０重量％、５重量％〜２５重量％、５重量％〜２０重量％、５重量％〜２０重量％、５重量％〜１０重量％、または７重量％〜９重量％のリン脂質画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質は、２０重量％未満、１５重量％未満、１０重量％未満、９重量％未満、または８重量％未満のリン脂質画分を含む。一部の実施形態では、微生物脂質はリン脂質を実質的に含まない。
[0202]一部の実施形態では、微生物脂質は、油の２重量％未満、１．５重量％未満、１重量％未満、または０．５重量％未満の不鹸化物を含む。
[0203]トリアシルグリセロール画分などの、微生物脂質中に存在する脂質クラスは、フラッシュクロマトグラフィーにより分離し、且つ薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析することができ、または当該技術分野において公知の他の方法により分離および分析することができる。
[0204]一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジアシルグリセロール画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、１０重量％超、少なくとも１２重量％、少なくとも１３重量％、少なくとも１４重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも１６重量％、少なくとも１７重量％、少なくとも１８重量％、少なくとも１９重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、または少なくとも４５重量％のＥＰＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、遊離脂肪酸画分、ステロール画分、ジアシルグリセロール画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、５重量％〜５５重量％、５重量％〜５０重量％、５重量％〜４５重量％、５重量％〜４０重量％、５重量％〜３５重量％、５重量％〜３０重量％、１０重量％〜５５重量％、１０重量％〜５０重量％、１０重量％〜４５重量％、１０重量％〜４０重量％、１０重量％〜３５重量％、１０重量％〜３０重量％、少なくとも１２重量％〜５５重量％、少なくとも１２重量％〜５０重量％、少なくとも１２重量％〜４５重量％、少なくとも１２重量％〜４０重量％、少なくとも１２重量％〜３５重量％、または少なくとも１２重量％〜３０重量％、１５重量％〜５５重量％、１５重量％〜５０重量％、１５重量％〜４５重量％、１５重量％〜４０重量％、１５重量％〜３５重量％、１５重量％〜３０重量％、１５重量％〜２５重量％、１５重量％〜２０重量％、２０重量％〜５５重量％、２０重量％〜５０重量％、２０重量％〜４５重量％、２０重量％〜４０重量％、または２０重量％〜３０重量％のＥＰＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、または少なくとも６０重量％のＤＨＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、５重量％〜６０重量％、５重量％〜５５重量％、５重量％〜５０重量％、５重量％〜４０重量％、１０重量％〜６０重量％、１０重量％〜５０重量％、１０重量％〜４０重量％、２０重量％〜６０重量％、２５重量％〜６０重量％、２５重量％〜５０重量％、２５重量％〜４５重量％、３０重量％〜５０重量％、３５重量％〜５０重量％、または３０重量％〜４０重量％のＤＨＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、１０重量％以下、９重量％以下、８重量％以下、７重量％以下、６重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、または１重量％以下のＤＨＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、脂肪酸の１重量％〜１０重量％、１重量％〜５重量％、２重量％〜５重量％、３重量％〜５重量％、または３重量％〜１０重量％をＤＨＡとして含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、ＤＨＡを実質的に含まない。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、０．１重量％〜５重量％、０．１重量％〜５重量％未満、０．１重量％〜４重量％、０．１重量％〜３重量％、０．１重量％〜２重量％、０．２重量％〜５重量％、０．２重量％〜５重量％未満、０．２重量％〜４重量％、０．２重量％〜３重量％、０．２重量％〜２重量％、０．３重量％〜２重量％、０．１重量％〜０．５重量％、０．２重量％〜０．５重量％、０．１重量％〜０．４重量％、０．２重量％〜０．４重量％、０．５重量％〜２重量％、１重量％〜２重量％、０．５重量％〜１．５重量％、または１重量％〜１．５重量％のＡＲＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、５重量％以下、５重量％未満、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１．５重量％以下、１重量％以下、０．５重量％以下、０．４重量％以下、０．３重量％以下、０．２重量％以下、または０．１重量％以下のＡＲＡを含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、ＡＲＡを実質的に含まない。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、０．４重量％〜２重量％、０．４重量％〜３重量％、０．４重量％〜４重量％、０．４重量％〜５重量％、０．４重量％〜５重量％未満、０．５重量％〜１重量％、０．５重量％〜２重量％、０．５重量％〜３重量％、０．５重量％〜４重量％、０．５重量％〜５重量％、０．５重量％〜５重量％未満、１重量％〜２重量％、１重量％〜３重量％、１重量％〜４重量％、１重量％〜５重量％、または１重量％〜５重量％未満のＤＰＡ ｎ−６を含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、５重量％、５重量％未満、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下、０．７５重量％以下、０．６重量％以下、または０．５重量％以下のＤＰＡ ｎ−６を含む。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、ＤＰＡ ｎ−６を実質的に含まない。一部の実施形態では、微生物脂質および／またはトリアシルグリセロール画分、ジアシルグリセロール画分、ステロール画分、ステロールエステル画分、遊離脂肪酸画分、リン脂質画分、およびそれらの組み合わせから選択されるその１つ以上の画分は、５重量％以下、５重量％未満、４重量％以下、３重量％以下、または２重量％以下のオレイン酸（１８：１ ｎ−９）、リノール酸（１８：２ ｎ−６）、リノレン酸（１８：３ ｎ−３）、エイコセン酸（２０：１ ｎ−９）、エルカ酸（２２：１ ｎ−９）、ステアリドン酸（１８：４ ｎ−３）、またはそれらの組み合わせを有する脂肪酸を含む。
[0205]一部の実施形態では、抽出微生物脂質は、少なくとも２０重量％のエイコサペンタエン酸と、各５重量％未満のアラキドン酸、ドコサペンタエン酸ｎ−６、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコセン酸、エルカ酸、およびステアリドン酸とを含む。一部の実施形態では、抽出微生物脂質は少なくとも１０重量％のトリアシルグリセロール画分を含み、ここでトリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも１２重量％はエイコサペンタエン酸であり、トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも２５重量％はドコサヘキサエン酸であり、およびトリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の５重量％未満はアラキドン酸である。一部の実施形態では、上記の脂肪酸プロファイルのいずれかを有する抽出微生物脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。一部の実施形態では、上記の脂肪酸プロファイルのいずれかを有する抽出微生物脂質は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８、ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、ＰＴＡ−１０２１１、ＰＴＡ−１０２１２、ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、またはＰＴＡ−１０２１５として寄託されたヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）種の特徴を有する単離ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）微生物から抽出される。一部の実施形態では、上記の脂肪酸プロファイルのいずれかを有する抽出微生物脂質は粗脂質である。一部の実施形態では、粗脂質は５重量％または体積％未満の有機溶媒を有する。一部の実施形態では、本発明の方法により抽出される微生物脂質は、典型的なヘキサン抽出またはＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ ＡＧ，独国）を用いて抽出が実施された場合と比べてより低いアニシジン価、および／またはより低い過酸化物価、および／またはより低いリン含量をもたらす。
[0206]一部の実施形態では、本発明の方法のいずれかにより得られる脂質は、少なくとも２０重量％のエイコサペンタエン酸と、各５重量％未満のアラキドン酸、ドコサペンタエン酸ｎ−６、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコセン酸、エルカ酸、およびステアリドン酸とを含む。一部の実施形態では、本発明の方法のいずれかにより得られる脂質は、少なくとも１０重量％のトリアシルグリセロール画分を含み、ここでトリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも１２重量％はエイコサペンタエン酸であり、トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも２５重量％はドコサヘキサエン酸であり、およびトリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の５重量％未満はアラキドン酸である。一部の実施形態では、上記の脂肪酸プロファイルのいずれかを有する本発明の方法のいずれかにより得られる脂質は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、または２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価、および／または１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を有する。一部の実施形態では、上記の脂肪酸プロファイルのいずれかを有する本発明の方法のいずれかにより得られる脂質は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８、ＰＴＡ−１０２０９、ＰＴＡ−１０２１０、ＰＴＡ−１０２１１、ＰＴＡ−１０２１２、ＰＴＡ−１０２１３、ＰＴＡ−１０２１４、またはＰＴＡ−１０２１５として寄託されたヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）種の特徴を有する単離ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）微生物から抽出される。一部の実施形態では、上記の脂肪酸プロファイルのいずれかを有する本発明の方法のいずれかにより得られる脂質は、粗脂質である。一部の実施形態では、粗脂質は５重量％または体積％未満の有機溶媒を有する。一部の実施形態では、本発明の方法により抽出される脂質は、溶媒を使用して抽出が実施された場合（例えば、非典型的なヘキサン抽出（ａｔｙｐｉｃａｌ ｈｅｘａｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）またはＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ ＡＧ，独国））、より低いアニシジン価、より低い過酸化物価、より低いリン含量および／またはより高い抽出収率をもたらす。
［クリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）種の単離微生物から抽出される脂質］
[0207]一部の実施形態では、本発明は、さらに、クリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）種の微生物から抽出される粗脂質に関する。一部の実施形態では、本方法は、クリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）種の微生物を培養液中で増殖させてバイオマスを産生するステップと、バイオマスからω−３脂肪酸を含む脂質を抽出するステップとを含む。脂質は新しく回収したバイオマスから抽出されてもよく、または変質を防止する条件下に保存されていた、予め回収していたバイオマスから抽出されてもよい。公知の方法を用いてクリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）種の微生物を培養し、および培養物からバイオマスを分離することができる。例えば、全体として参照により本明細書に援用される米国特許第７，１６３，８１１号明細書を参照のこと。脂質は本発明の方法により抽出することができる。
[0208]一部の実施形態では、本発明の抽出方法によりクリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）種の微生物から抽出される粗脂質は、典型的なヘキサン抽出法を用いる場合と比較して、より低いリン含量を有し得る。一部の実施形態では、クリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）種の微生物から抽出される粗脂質は、１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下、または１ｐｐｍ以下のリン含量を含む。一部の実施形態では、粗油は、２６以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、５以下、または２以下、または１以下のアニシジン価、および／または５以下、４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、０．５以下、０．２以下、または０．１以下の過酸化物価を有する。一部の実施形態では、本発明の方法により抽出される粗微生物脂質は、溶媒を用いて抽出が実施された場合（例えば、非典型的なヘキサン抽出（ａｔｙｐｉｃａｌ ｈｅｘａｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）またはＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ ＡＧ，独国））、より低いアニシジン価、より低い過酸化物価、より低いリン含量および／またはより高い抽出収率をもたらす。
[0209]本発明を概略的に説明したが、本明細書に提供される例を参照することにより、さらなる理解を得ることができる。これらの例は例示のために提供されるに過ぎず、限定することを意図したものではない。以下の例は、本発明の方法および方法により調製される脂質を、限定するのではなく、例示するものである。細胞からの脂質の抽出において通常直面する条件およびパラメータの種類についての、且つ当業者に明らかとなるであろう他の好適な改良例および適応例が、本発明の趣旨および範囲内にある。
［実施例］
［実施例１］
[0210]微生物細胞（シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））を含む細胞ブロス（２０，０００ｋｇ）を６０℃に加熱した。酵素（すなわち、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）２．４Ｌ ＦＧ ０．５％）を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を、最初に第１の塩基（ＮａＯＨ、５０％ｗ／ｗ溶液の２５０ｋｇ）で処理して、溶解細胞組成物のｐＨを１０．４から１０．６にした。次に、塩（固形ＮａＣｌ、溶解細胞組成物の２重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を８５℃〜１０２℃の温度に加熱し、２４時間〜７０時間にわたりその温度レベルに保持した。次に第２の塩基（ＮａＯＨ、５０％ｗ／ｗ溶液、４０ｋｇ）を、ｐＨが８を上回るまで溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を遠心して溶解細胞組成物を３相に分離した：脂質層を含む上相、乳濁液層を含む中間相、および固体層を含む下相。次に溶解細胞組成物を、Ｗｅｓｔｆａｌｉａ ＲＳＥ１１０遠心機（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ＧｍｂＨ，独国）を使用し、６，０００ｒｐｍ、３０ｋｇ／分の送り速度で運転して４０℃〜８０℃で遠心することにより、溶解細胞組成物から脂質を分離した。この遠心により３相が提供された：脂質を含む上相、乳濁液を含む中間相、および固体／液体乳濁液を含む下相。遠心中、溶解細胞組成物のｐＨは７．５〜８．５に維持した。２０，０００ｋｇバッチ全体の総遠心時間は約１０〜１１時間であった。脂質層を分離し、その含水率は約１重量％であった。
［実施例２］
[0211]微生物細胞（クリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ））を含む細胞ブロス（５００ｇ）を、ブロスの約７重量％のバイオマスから１３．５重量％のバイオマスに濃縮した。このブロスを、１０，０００ｐｓｉの圧力で（２パス）ホモジナイズし、溶解細胞組成物を形成した。溶解細胞組成物を塩基（すなわちＮａＯＨ、５０％ｗ／ｗ溶液の１０ｇ）で処理して、溶解細胞組成物のｐＨを１０．４〜１０．６にした。塩（固形ＮａＣｌ、溶解細胞組成物の２重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を８５℃〜９２℃の温度に加熱し、１５分間〜２時間にわたりその温度範囲に保持した。次に溶解細胞組成物を、Ｂｅｎｃｈ Ｔｏｐ Ｓｉｇｍａ ６Ｋ１５遠心機（ＳＩＧＭＡ Ｌａｂｏｒｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ ＧｍｂＨ，独国）を使用して、５，４００ｒｐｍで運転して７０℃〜９０℃の温度で遠心することにより、溶解細胞組成物を３相に分離した：脂質を含む上相、乳濁液を含む中間相、および固体／液体乳濁液を含む下相。遠心中、溶解細胞組成物のｐＨは６．５〜８．５に維持した。総遠心時間は５分であった。脂質層を分離し、その含水率は約１重量％であった。
［実施例３］
[0212]微生物細胞（シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））を含む細胞ブロス（２０，０００ｋｇ）を６０℃に加熱した。酵素（すなわち、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）２．４Ｌ ＦＧ ０．５％）を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、溶解細胞組成物を形成した。次に、塩（固形Ｎａ２ＳＯ４、２，０００ｋｇ、または溶解細胞組成物の１０重量％）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を室温で２４時間〜４８時間撹拌した。次に溶解細胞組成物を、Ｗｅｓｔｆａｌｉａ ＲＳＥ１１０ 遠心機（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ＧｍｂＨ，独国）を使用して、６，０００ｒｐｍ、４０ｋｇ／分の送り速度で運転して４０℃〜７５℃で遠心することにより、溶解細胞組成物から脂質を分離した。この遠心により３相が提供された：脂質を含む上相、乳濁液を含む中間相、および固体／液体乳濁液を含む下相。２０，０００ｋｇバッチ全体の総遠心時間は約８〜９時間であった。遠心した溶解細胞組成物から脂質層を分離した。
［実施例４］
[0213]微生物細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８）を含む低温殺菌した細胞ブロス（５００ｇ）を提供した。酵素（すなわち、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）２．４Ｌ ＦＧ ０．５％）を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を第１の塩基（すなわち、２５％ＮａＯＨ溶液）で処理して溶解細胞組成物のｐＨを１０．５に調整した。次に、塩（固形ＮａＣｌ、溶解細胞組成物の２重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を９５℃の温度に加熱し、溶解細胞組成物を撹拌しながら２時間にわたりその温度レベルに保持した。次に溶解細胞組成物に第２の塩基（すなわち、２５％ＮａＯＨ溶液）を添加してｐＨを８．３とした。次に溶解細胞組成物を５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層および少量の乳濁液層を得た。
［実施例５］
[0214]微生物細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）を含む濃縮および低温殺菌した細胞ブロス（５００ｇ）を提供した。酵素（すなわち、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）２．４Ｌ ＦＧ ０．５％）を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を塩基（すなわち、２５％ＮａＯＨ溶液）で処理して溶解細胞組成物のｐＨを１０．５に調整した。次に、塩（固形ＮａＣｌ、溶解細胞組成物の２重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を９５℃の温度に加熱し、溶解細胞組成物を撹拌しながら１時間にわたりその温度レベルに保持すると、ｐＨが８．５に降下した。合計１０ｍｌの発酵ブロス中で１時間後、約１ｍｌの油（脂質）層および約６ｍｌの乳濁液層が存在した。溶解細胞組成物を合計２２０分間加熱すると、乳濁液層が消失し始めた。次に溶解細胞組成物を５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離した。脂質の抽出収率は５８．８重量％であった。粗油のアニシジン価（ＡＶ）は１１．３であった。細胞破壊収率は９３重量％〜９５重量％の範囲であった。
［実施例６］
[0215]ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５として寄託された単離ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）の微生物細胞を含む低温殺菌した細胞ブロス（４７３ｇ）を提供した。酵素（すなわち、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）２．４Ｌ ＦＧ ０．５％）を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を第１の塩基（すなわち、２５％ＮａＯＨ溶液）で処理することにより溶解細胞組成物のｐＨを１０．６２に調整した。次に、塩（固形ＮａＣｌ、溶解細胞組成物の２重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を９５℃の温度に加熱し、溶解細胞組成物を撹拌しながら３時間にわたりその温度レベルに保持した。次に溶解細胞組成物に第２の塩基（すなわち、ＮａＯＨの２５％苛性溶液）を添加してｐＨを８．１３とした。次に溶解細胞組成物を５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、等量の脂質層および乳濁液層を得た。ｐＨを上昇させると脂質層の収率が上がるかどうかを決定するため、分離した溶解細胞組成物にさらなる第２の塩基（すなわち、２５％ＮａＯＨ溶液）を添加してｐＨを９．０２とし、その溶解細胞組成物を再び５，１００ｒｐｍで５分間遠心した。これにより得られた脂質層の収率は同程度であった。分離した溶解細胞組成物に再びさらなる第２の塩基を添加してｐＨを１０．１２とし、その溶解細胞組成物を再び５，１００ｒｐｍで５分間遠心した。再び、これにより得られた脂質層の収率は同程度であった。
［実施例７］
[0216]微生物細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）を含む低温殺菌した細胞ブロス（４７０ｇ）を提供した。細胞バイオマスを機械的にホモジナイズして細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を第１の塩基（すなわち、２５％ＮａＯＨ溶液）で処理することにより溶解細胞組成物のｐＨを１０．５に調整した。次に、塩（固形ＮａＣｌ、溶解細胞組成物の２重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を９５℃の温度に加熱し、溶解細胞組成物を撹拌しながら３時間にわたりその温度レベルに保持した。次に溶解細胞組成物に第２の塩基（すなわち、２５％ＮａＯＨ溶液）を添加してｐＨを８．０７とした。次に溶解細胞組成物を５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離すると、脂質層および乳濁液層が得られ、ここでは乳濁液層が脂質層より多かった。ｐＨを上昇させると脂質層の収率が上がるかどうかを決定するため、分離した溶解細胞組成物にさらなる第２の塩基を添加してｐＨを９．１１とし、その溶解細胞組成物を再び５，１００ｒｐｍで５分間遠心した。これにより得られた脂質層の収率は同程度であった。分離した溶解細胞組成物に再びさらなる第２の塩基を添加してｐＨを１０．０９とし、その溶解細胞組成物を再び５，１００ｒｐｍで５分間遠心した。再び、これにより得られた脂質層の収率は同程度であった。
［実施例８］
[0217]ビオチン抑制試験発酵槽において微生物細胞（クリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ））を含む細胞ブロスを使用した。２０，０００ｋｇの洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌したブロスを回収した。これは低温殺菌の開始時に抜き出した。それを約１日間保持してから、移し替えてホモジナイズした。この材料を８１３バール／１パスでホモジナイズし、処理タンクに集め戻した。顕微鏡で調べることにより、細胞の約８０％が溶解したと推定された。
[0218]ブロスを約４０℃に加熱した後、処理を開始した。ｐＨを１０．５に調整し、２％ＮａＣｌを添加して６６℃に加熱した。この時点で既に多量の油層が形成され、１〜２時間後にはｐＨが９．５に降下していた。ブロスは６６℃で一晩保持した。
[0219]翌日、１５５ｍｍの環状ダムが設置されたＷｅｓｔｆａｌｉａ ＲＳＥ−１１０でブロスを遠心した。粘度は４０℃で約１８０ｃＰであった。遠心機には４８ｋｇ／分で供給し、軽量相で５〜１０ｐｓｉの背圧および重量相で３０ｐｓｉの背圧とした。供給温度は７０℃に維持した。廃棄相に油は存在せず、イソプロピルアルコールの添加後にわずか数滴が認められた。
[0220]表１は、この手順から得られた粗油に関して実施した分析の結果を示す。
Figure 2016163579
[0221]提供した２０，０００ｋｇのブロスのうち１０．５重量％（２，１００ｋｇ）がバイオマスであった。このバイオマスのうち５０重量％が油（１，０５０ｋｇ）であった。この油のうち５８．９重量％がＤＨＡ（６１８ｋｇ）であった。上記に記載される方法の実行後、脂質層に５９２．５ｋｇの材料が存在し、そのうち約８７．８重量％（５２０．２ｋｇ）が油であった。従って、このバイオマスからの油の抽出収率は４９．５％であった。当該の油のうち６０．５重量％（３１４．６ｋｇ）がＤＨＡであったため、バイオマスからのＤＨＡの抽出収率は５１重量％となった。
［実施例９］
[0222]微生物細胞（シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））を含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス（約５００ｇ）を提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基（すなわち、２５％ＮａＯＨ溶液）で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのｐＨが５．８から１１．２に上昇した。塩基の添加およびｐＨの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に、塩（固形Ｎａ２ＳＯ４、溶解細胞組成物の５重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を９０℃〜９５℃の範囲の温度に加熱し、９０分間にわたりその温度レベルに保持すると、溶解細胞組成物のｐＨが９．７に降下した。９０分後、４５ｍｌの発酵ブロス当たり約２．５ｍｌの油層が存在し、および水分損失はなかった。３時間後、ｐＨは９．２に降下していた。次に溶液を約５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。脂質の抽出収率は８１重量％であった。粗油のアニシジン価（ＡＶ）は２０．１であった。細胞破壊収率は９２重量％〜９８重量％の範囲であった。
［実施例１０］
[0223]微生物細胞（シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））を含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス（約５００ｇ）を提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基（すなわち、２５％ＮａＯＨ溶液）で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのｐＨが４．８から１１に上昇した。塩基の添加およびｐＨの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に、塩（固形ＮａＣｌ、溶解細胞組成物の２重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を９０℃〜９５℃の範囲の温度に加熱し、３．５時間にわたりその温度レベルに保持すると、溶解細胞組成物のｐＨが８．７に降下し、および水分損失はなかった。次に溶液を約５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。３．５時間後の脂質の抽出収率は９２重量％であった。
[0224]溶解細胞組成物の一部分を６時間保持すると、溶解細胞組成物のｐＨが８．６に降下した。次に溶液を約５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。６時間後の脂質の抽出収率は８９重量％であった。粗油のアニシジン価（ＡＶ）は１４．４であった。細胞破壊収率は９５重量％であった。
［実施例１１］
[0225]微生物細胞（シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））を含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス（約５００ｇ）を提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基（すなわち、５０％ＮａＯＨ溶液）で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのｐＨが５．８から１１．２に上昇した。塩基の添加およびｐＨの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に溶解細胞組成物を真空下で７０℃に加熱して含水量を８８．７％から８５．５％に低下させた。蒸発中、ｐＨが１０．３６に降下した。次に溶液を約５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。脂質の抽出収率は８３．９重量％であった。粗油のアニシジン価（ＡＶ）は１０．５であった。細胞破壊収率は９３．１７重量％であった。
[0226]溶解細胞組成物を真空下で７０℃に加熱して含水量を８８．７％から７９．２％に低下させたことを除き、この方法を繰り返した。含水量を７９．２％まで低下させたとき、脂質の抽出収率は８７．５重量％であり、および細胞破壊収率は９２．３重量％であった。またこの方法を繰り返し、含水量を８８．７％から８０．８％まで低下させた。含水量を８０．８％まで低下させたとき、脂質の抽出収率は９０重量％であり、および細胞破壊収率は９５．９重量％であった。
［実施例１２］
[0227]微生物細胞（シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））を含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス（約５００ｇ）を提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基（すなわち、５０％ＮａＯＨ溶液）で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのｐＨが５．６から１１．１に上昇した。塩基の添加およびｐＨの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に溶解細胞組成物をクローズドシステムにおいて４０分間、９０℃に加熱した。４０分後、発酵ブロス４０ｍｌ当たり約１ｍｌの油（脂質）の層が存在した。次に溶液を約５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。脂質の抽出収率は８５．１重量％であった。粗油のアニシジン価（ＡＶ）は１６．３であった。細胞破壊収率は９７．６重量％であった。
［実施例１３］
[0228]微生物細胞（シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））を含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス（約５００ｇ）を提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基（すなわち、５０％ＮａＯＨ溶液）で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのｐＨが４．９から１１．２に上昇した。塩基の添加およびｐＨの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に溶解細胞組成物を室温で４時間混合した。次に溶液を約５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離すると、少量の脂質層が得られた。
[0229]溶解細胞組成物の一部分を室温で約９６時間混合した。次に溶液を約５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離すると、多量の脂質層が得られた。脂質の抽出収率は６１．４重量％であった。粗油のアニシジン価（ＡＶ）は２２．６であった。
［実施例１４］
[0230]微生物細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）を含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス（約５００ｇ）を提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基（すなわち、５０％ＮａＯＨ溶液）で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのｐＨが５．６から１１．１に上昇した。塩基の添加およびｐＨの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に溶解細胞組成物を７０℃〜７５℃の範囲で３時間加熱した。次に溶液を約５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。脂質の抽出収率は８４．４重量％であった。
[0231]溶解細胞組成物の一部分を合計５時間加熱した。次に溶液を約５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離すると、同様の脂質層が得られた。脂質の抽出収率は８７．３重量％であった。細胞破壊収率は８９．１重量％であった。
［実施例１５］
[0232]微生物細胞（シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））を含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス（約５００ｇ）を提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基（すなわち、５０％ＮａＯＨ溶液）で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのｐＨが７．３から１１に上昇した。塩基の添加およびｐＨの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に、塩（固形Ｎａ２ＳＯ４、溶解細胞組成物の５重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を９０℃の温度に加熱し、２時間にわたりその温度レベルに保持した。９０℃の温度をさらに２〜４時間維持しながら、溶解細胞組成物が入ったベッセルを開放して水を蒸発させた。次に溶液を約５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。脂質の抽出収率は７０重量％超であった。粗油のアニシジン価（ＡＶ）は１１．６であった。
［実施例１６］
[0233]微生物細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）を含む細胞ブロス（９，９２５ｋｇ）を提供した。細胞ブロスを水によって１：１の重量比で希釈し、２０，０００ｋｇの希釈ブロスを形成した。希釈前のブロスの固形分含量は１６．１３重量％であり、希釈後は８．２５重量％であった。希釈ブロスを混合し、スラッジ除去用遠心機により６，４００ｒｐｍで遠心して、細胞外水溶性または水分散性化合物を取り除いた。遠心機からの濃縮物（１０，２５０ｋｇ）を収集し、その固形分含量は１０．５重量％であった。収集した濃縮物を６２℃〜６４℃に加熱して濃縮物を低温殺菌した。低温殺菌した濃縮物に酵素（すなわち、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）２．４Ｌ ＦＧ ０．５％）を添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を塩基（すなわち、２５％ＮａＯＨ溶液）で処理して溶解細胞組成物のｐＨを１１に調整した。次に、塩（固形Ｎａ２ＳＯ４、溶解細胞組成物の５重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を９５℃の温度に加熱し、溶解細胞組成物を撹拌しながら１０時間〜１２時間にわたりその温度レベルに保持した。撹拌後、溶解細胞組成物のｐＨは８．６となり、極めて少量の乳濁液層が存在した。撹拌タンクを６０℃に放冷し、冷却する間に溶解細胞組成物のｐＨは９．６に上昇した。リン酸を添加することにより溶解細胞組成物のｐＨは８．２に降下した。リン酸の添加が脂質層と極めて少量の乳濁液層との分離を阻害することはなかった。次に溶解細胞組成物を、５，１００ｒｐｍ、４８ｋｇ／分の送り速度で５分間、６０℃〜６３℃で遠心することにより溶解細胞組成物を分離すると、１．７重量％〜２．３重量％の含水率を有する脂質層が得られた。
［実施例１７］
[0234]微生物細胞（クリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ））を含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス（５００ｇ）を提供した。ブロスを８，０００〜１２，０００ｐｓｉの圧力で（２パス）ホモジナイズすることにより、溶解細胞組成物を形成した。溶解細胞組成物を塩基（すなわち、１２．５％ＮａＯＨ溶液）で処理すると、溶解細胞組成物のｐＨは７．８〜８．２に達した。塩（固形Ｎａ２ＳＯ４、溶解細胞組成物の５重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を６０℃の温度に加熱し、その温度に保持した。溶解細胞組成物のｐＨは、塩基（すなわち、１２．５％ＮａＯＨ溶液）を添加することにより、クローズドシステムにおいて水分損失はほとんど乃至まったくなしに、１０〜１５時間にわたり７．８〜８．２レベルに維持した。次に溶解細胞組成物を約５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、油層を得た。これにより４０ｍｌの試料において約２ｍｌの油層がもたらされた。油の抽出収率は７３重量％であった。粗油のアニシジン価（ＡＶ）は１３．５であった。細胞破壊収率は８２重量％〜８６重量％であった。
［実施例１８］
[0235]微生物細胞（シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））を含む低温殺菌した細胞ブロス（１，０００ｇ）を提供した。酵素（すなわち、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）２．４Ｌ ＦＧ ０．５％）を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を塩基（すなわち、１２．５％ＮａＯＨ溶液）で処理して溶解細胞組成物のｐＨを７．２１から１０．５２に調整した。次に、塩（固形ＮａＣｌ、溶解細胞組成物の２重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次にこのブロスを４つの部分量に分け、各部分量を４つの異なる温度および時間で保持した：１）試験＃１は９０℃で２２時間保持した；２）試験＃２は９０℃で２時間保持し、次に２５℃で２０時間保持した；３）試験＃３は６０℃で２２時間保持した；および４）試験＃４は２５℃で２２時間保持した。次に個々の試験材料を、それ以上ｐＨ調整することなく遠心した。試験＃１、＃２、および＃３について、ブロスは約６，６００ｒｐｍ（４，８００のｇ力）で５分間遠心して溶解細胞組成物を分離した。試験＃４は４，８００のｇ力では良好に分離されなかった（＜２０％）ため、ｇ力を１５，０００に上げ、ブロスを１５，０００のｇ力で５分間スピンした。重量パーセントとしての脂質の抽出収率およびアニシジン価（ＡＶ）を以下の表に掲載する。
Figure 2016163579
[0236]表２のアニシジン価は予想より高かった。先述の例と本例との一つの違いは、脂質の抽出前に溶解細胞組成物を長時間静置させたことであった。抽出前のこの長い時間により、溶解細胞組成物中に存在する溶存酸素の酸化が生じると仮定される。次に酸化が増すことによりアニシジン価の上昇が生じる。一般に溶解細胞組成物の溶存酸素含量は温度が上昇すると低下するため、最も高い温度で最も長い時間にわたり加熱した試験材料（試験＃１）が最も低いアニシジン価を有したという事実が、この仮説を裏付ける。従ってアニシジン価の上昇は例外的で、溶解細胞組成物からの脂質の抽出が遅延した結果であったと考えられる。生産時には、溶解細胞組成物からの脂質の抽出に遅延時間はないものと思われ、そのアニシジン価は、２６以下のアニシジン価という先の結果と一致するものと思われる。
［実施例１９］
[0237]微生物細胞（シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））を含む低温殺菌した細胞ブロス（１，０００ｇ）を提供した。次にこのブロスを３つの部分量に分け、以下のとおり希釈した：１）試験＃１は一切希釈せず、対照部分量として供した；２）試験＃２は水で２５％希釈した；および３）試験＃３は水で５０％希釈した。酵素（すなわち、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）２．４Ｌ ＦＧ ０．５％）を細胞バイオマスに添加することにより細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を塩基（すなわち、１２．５％ＮａＯＨ溶液）で処理して溶解細胞組成物のｐＨを６．８から１０．６に調整した。次に、溶解細胞組成物に塩（固形ＮａＣｌ、溶解細胞組成物の２重量％の量）を添加した。次にブロスを９０℃に加熱して２０時間保持した。保持時間の後、各試験材料のブロスを２つに分け、一方の半分量はそのまま遠心し、他方の半分量はそのｐＨを約８．５に調整してから遠心した。次に双方の部分量とも約８，５４５ｒｐｍ（８，０００のｇ力）で５分間遠心した。重量パーセントとしての脂質の抽出収率およびアニシジン価（ＡＶ）を以下の表に掲載する。
Figure 2016163579
[0238]表３のアニシジン価は予想より高かった。先述の例（実施例１８を除く）と本例との一つの違いは、脂質の抽出前に溶解細胞組成物を長時間静置させたことであった。抽出前のこの長い時間により、溶解細胞組成物中に存在する溶存酸素の酸化が生じると仮定される。次に酸化が増すことによりアニシジン価の上昇が生じる。従ってアニシジン価の上昇は例外的で、溶解細胞組成物からの脂質の抽出が遅延した結果であったと考えられる。生産時には、溶解細胞組成物からの脂質の抽出に遅延時間はないものと思われ、そのアニシジン価は、２６以下のアニシジン価という先の結果と一致するものと思われる。
［実施例２０］
[0239]様々な発酵ロットから得られた細胞ブロスを、実施例２に記載される方法を用いて処理し、但し塩を添加するタイミング（例えば、ホモジナイゼーションの前および後）および塩の量は変更した。得られた分離後の脂質を分析した。この分析を表４に提供する。
Figure 2016163579
[0240]表４に提供するデータは、ホモジナイゼーション後に塩を添加すると、ホモジナイゼーション前に塩を添加するより％脂質値が高くなることを示している。表４に提供するデータはまた、試料を希釈すると％脂質値が低くなることも示している。
［実施例２１］
[0241]微生物細胞（シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））から得られたアルカーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）酵素処理済み溶解細胞組成物の試料を使用した。この試料のｐＨは約５．５であった。試料を４つのより少量の試料に分割し、それらのうち３つの試料のｐＨを、水酸化ナトリウムを添加することによってそれぞれ約７．４、約１０．５、および約１２に調整した。試料を脱イオン水により１：１比で希釈した。各０．５ｇの希釈試料に、ＰＯＢＮ（α−（４−ピリジル１−オキシド）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、１．２５Ｍ；５０μＬ）をスピントラップ化学剤として添加した。Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ ｅ−ｓｃａｎ ＥＰＲ（電子常磁性共鳴）分光計（システム番号ＳＣ０２７４）（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で試料を計測して脂質酸化により存在するフリーラジカルの量を計測した。試料を室温（２０℃）でインキュベートし、および各５０μＬのＰＯＢＮ含有試料をｐＨの調整後１時間毎に４時間にわたり、以下の分光計パラメータを使用して試験した：変調周波数８６Ｈｚ、変調振幅２．１１ガウス、マイクロ波出力５．１９ｍＷ、時定数２０．４８秒、掃引時間１０．４９秒、掃引幅１００ガウス、および走査回数８。ＥＰＲ分光計の測定値の結果を図５に提供する。
[0242]図５のデータは、当初、フリーラジカルのレベルがｐＨ５．５の試料について最も高く、ｐＨ１０．５および１２の試料について最も低かったことを示している。このデータはまた、４時間にわたり、ラジカルの形成速度がｐＨ１０．５の試料について最も遅く、ｐＨ５．５の試料について最も速かったことも示している。このデータはまた、溶解細胞組成物に塩基を添加すると脂質酸化が阻害され、そのため粗脂質および精製油の低いＡＶがもたらされることも示している。
［実施例２２］
[0243]油糧種子はナタネ植物から抽出され、次に粉砕ミルに通されることで油糧種子の外殻が割られ、壊される。次に油糧種子は、吸引によるなど、公知の手段により脱皮され、油糧種子の外皮から種子の肉部（内部）が取り出される。次に脱皮された油糧種子を圧搾機に通すことによりホモジナイズしまたは搾り出すと、脱皮された油糧種子はケーキ状に粉砕され、それにより油糧種子の細胞が溶解される。水を添加することにより乳化した溶解細胞組成物が形成される。乳化した溶解細胞組成物はろ過され、溶解細胞組成物からあらゆる余分な皮片が取り除かれる。乳化した溶解細胞組成物は塩基（すなわち、２５％ＮａＯＨ溶液）で処理して溶解細胞組成物のｐＨが１１に調整される。次に溶解細胞組成物に塩（固形ＮａＣｌ、溶解細胞組成物の２重量％の量）が添加される。次に溶解細胞組成物は９０℃の温度に加熱され、溶解細胞組成物を撹拌しながら６時間〜４８時間にわたりそのレベルに保持される。次に溶解細胞組成物を５，１００ｒｐｍで５分間遠心することにより溶解細胞組成物が分離され、脂質層および乳濁液層が得られる。
［実施例２３］
［ヘキサン抽出により得られる粗脂質の比較分析］
[0244]実施例２に記載される方法を用いるロットから得られた粗脂質を分析し、様々な仕様を決定した。実施例２で利用した同じ微生物細胞に対し典型的なヘキサン抽出法を用いて、さらなる粗脂質を得た。ヘキサン抽出法には、発酵ブロスを噴霧乾燥し、その噴霧乾燥バイオマスにヘキサンを添加して１５重量％〜２０重量％固形分の溶液を得ることが含まれた。次に溶液をホモジナイズして細胞を溶解し、溶解細胞組成物を形成した。溶解細胞組成物を遠心し、脂質およびヘキサンを含む層を取り出した。次に脂質からヘキサンを除去した。分析の結果を表５に提供する。
Figure 2016163579
[0245]表５に提供するデータは、本発明の方法により得られる粗脂質が、典型的なヘキサン抽出法により調製される脂質と比較して、優れたアニシジン価、脂質率、ＤＨＡ量およびＤＨＡ率を呈することを示している。
［ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法により得られる粗脂質の比較分析］
［実施例２４］
[0246]実施例１および実施例３に記載される方法を用いる様々な発酵ロットから得られた粗脂質を分析し、様々な仕様を決定した。米国特許第５，９２８，６９６号明細書並びに国際公開第０１／７６３８５号パンフレットおよび国際公開第０１／７６７１５号パンフレットに記載されるとおり水溶性有機溶媒で脂質を抽出する方法であるＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ ＡＧ，独国）を用いて、さらなる粗脂質を得た。分析の結果を表６に提供する。
Figure 2016163579
[0247]表６に提供するデータは、本発明の方法から得られる粗脂質が（溶解細胞組成物を加熱しなかったときに得られた脂質を除き）、ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法により調製される脂質と比較して優れたアニシジン価を呈することを示している。本発明の方法により調製される脂質は、ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法を用いて調製される脂質のアニシジン価の４．４％〜１９．７％であるアニシジン価を呈する。
[0248]本発明の方法により調製される脂質は高い安定性を有すると考えられる。例えば、表６に示されるとおり、本発明の方法を用いて溶解細胞組成物から脂質を抽出したが、ここで溶解細胞組成物は抽出プロセス前に３週間静置させた。溶解細胞組成物における脂質のアニシジン価は時間の経過に伴い高くなると考えられ、従って３週間を経た溶解細胞組成物から抽出される脂質はより高いアニシジン価を有すると予想され得る。しかしながら、表６に示されるとおり、３週間を経た溶解細胞組成物から本発明の方法を用いて得られる脂質は、ＦＲＩＯＬＥＸ法により調製される脂質のアニシジン価の１９．７％であるアニシジン価を有した。
［実施例２５］
[0249]実施例１６に記載する方法を用いて微生物細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）のブロスから得られた粗脂質を分析し、様々な仕様を決定した。微生物細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）のブロスからＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ ＡＧ，独国）を用いてさらなる粗脂質を得た。ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法は、米国特許第５，９２８，６９６号明細書並びに国際公開第０１／７６３８５号パンフレットおよび国際公開第０１／７６７１５号パンフレットに記載されるとおり水溶性有機溶媒（例えば、イソプロピルアルコール）で脂質を抽出する方法である。分析の結果を表７に提供する。
Figure 2016163579
[0250]表７に提供するデータは、本発明の方法により得られる粗脂質が、ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法により調製される脂質と比較して優れたアニシジン価（ＡＶ）および過酸化物価（ＰＶ）を呈することを示している。このデータはまた、本発明の方法により得られる脂質の抽出収率が、ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法により得られる脂質の抽出収率と比較して優れていることも示している。
［実施例２６］
［粗脂質の精製］
[0251]実施例１に概説する方法およびＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法を用いて粗脂質を得た。粗脂質を、以下を逐次的に行うことによってさらに処理した：１）脱ガムおよび苛性精製；２）脱色；３）チルドろ過；および４）抗酸化剤による脱臭。粗脂質、苛性精製した脂質、脱色した脂質、および脱臭した脂質のデータを表８ａおよび表８ｂに提供する。精製油の比較を表９に提供する。
Figure 2016163579
Figure 2016163579
Figure 2016163579
[0252]表８ａ、表８ｂ、および表９に提供するデータは、本発明の方法により調製される精製油が、ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法により調製される精製油と比較してより低いアニシジン価を呈することを示している。
［実施例２７］
［官能プロファイル比較］
[0253]実施例２６において得られた精製油を、８〜１２名の官能分析の専門家パネルが分析した。官能分析の専門家は、アロマ、芳香、および後味に基づき様々な脂質仕様を格付けし、各脂質についての「全体的なアロマ強度」を提供した。ユニバーサルスペクトルの記述的分析方法を用いて試料のアロマおよび芳香特性を評価した。この方法では、０〜１５の強度スケール（０＝検出なし、および１５＝極めて高強度）を使用して油のアロマおよび芳香属性が計測される。官能データの結果を表１０に提供する。
Figure 2016163579
[0254]表１０に提供するデータは、本発明の方法により調製される精製油が、ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法により調製される精製油と比較して優れた官能データを呈することを示している。上記に示すとおり、本発明により提供される脂質は、それぞれ３および２の全体的なアロマ強度を有したが、一方、ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）の脂質は４および３の全体的なアロマ強度をもたらした。
［実施例２８］
［比較例］
[0255]有機溶媒を使用することなしに微生物から脂質を得るための抽出法が、米国特許第６，７５０，０４８号明細書に記載されている。本発明の方法により調製される粗脂質から得られる精製油と、米国特許第６，７５０，０４８号明細書に開示される抽出法により調製される粗脂質から得られる精製油との比較を表１１に提供する。
Figure 2016163579
[0256]表１１に提供するデータは、本発明の方法により調製される粗脂質から得られる精製油が、米国特許第６，７５０，０４８号明細書に開示される抽出法により調製される粗脂質から得られる精製油と比較して優れた特性を呈することを示している。
［実施例２９］
[0257]単離ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）を、分類学上の分類について特徴付けた。
[0258]干潮時に潮間生息地から試料を採取した。水、堆積物、生きている植物材料および死滅した植物／動物の残骸を滅菌した５０ｍｌ管に入れた。水と共に各試料の部分量を、単離培地の固形寒天プレートに塗布した。単離培地は以下からなった：５００ｍの人工海水、５００ｍｌの蒸留水、１ｇのグルコース、１ｇのグリセロール、１３ｇの寒天、１ｇのグルタミン酸塩、０．５ｇの酵母エキス、０．５ｇのカゼイン加水分解物、１ｍｌのビタミン溶液（１００ｍｇ／Ｌのチアミン、０．５ｍｇ／Ｌのビオチン、０．５ｍｇのＢ１２）、１ｍｌの微量ミネラル溶液（ＰＩＩ金属、１リットル当たり６．０ｇのＦｅＣｌ３６Ｈ２Ｏ、６．８４ｇのＨ３ＢＯ３、０．８６ｇのＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ、０．０６ｇのＺｎＣｌ２、０．０２６のＣｏＣｌ２６Ｈ２Ｏ、０．０５２ｇのＮｉＳＯ４Ｈ２Ｏ、０．００２ｇのＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏおよび０．００５ｇのＮａ２ＭｏＯ４２Ｈ２Ｏを含有）、並びに各５００ｍｇのペニシリンＧおよび硫酸ストレプトマイシン。寒天プレートを暗所において２０〜２５℃でインキュベートした。２〜４日後、寒天プレートを顕微鏡下で調べ、細胞のコロニーを滅菌したつまようじで取り、新鮮な培地プレートに再びストリークした。汚染生物が除去されるまで、細胞を新鮮な培地に繰り返しストリークした。
[0259]寒天プレートからのコロニーを、半分の強度の海水および加圧滅菌した新しく孵化した幼生ブラインシュリンプの懸濁液（１ｍｌ）と共にペトリ皿に移した。２〜３日後、幼生ブラインシュリンプは胞子嚢の塊がひどく生い茂った状態となった。放出される遊走子は放たれるときに双鞭毛であり、成熟胞子嚢から遊離して活動的に泳ぎ出す。その残された壁は胞子放出後（位相差法で）明確に確認することができる。胞子嚢の直径は１２．５μｍ〜２５μｍであり、遊走子は２．５μｍ〜２．８μｍ×４．５μｍ〜４．８μｍのサイズであった。個々の胞子嚢につき８〜２４個の胞子があった。定着した遊走子は大きくなり、急速に二分裂を起こし、四分子、八分子、および最終的に胞子嚢の塊を生じた。四分子の形成は胞子嚢の成熟前の極めて早い段階で始まった。これらの特徴はシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に一致している。
[0260]単離ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）を、１８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子についての既知の種との類似性に基づきさらに特徴付けた。ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）からの全ゲノムＤＮＡを標準的手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）により調製し、１８ｓ ＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅に使用した。１８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅は以前に記載されているプライマー（Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６（６）１９９９）で実行した。染色体ＤＮＡ鋳型を含むＰＣＲ条件は、以下のとおりとした：０．２μＭのｄＮＴＰ、各０．１ｕＭのプライマー、８％ＤＭＳＯ、２００ｎｇの染色体ＤＮＡ、２．５ＵのＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標）ＩＩ融合ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および１Ｘ ＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標）緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で５０μＬの総容量。ＰＣＲプロトコルは以下のステップを含んだ：（１）９５℃で２分間；（２）９５℃で４５秒間；（３）５５℃で３０秒間；（４）７２℃で２分間；（５）ステップ２〜４を４０サイクル繰り返し；（６）７２℃で５分間；および（７）６℃で保持。
[0261]ＰＣＲ増幅により、上記に記載される染色体鋳型を使用して予想されたサイズを有する明確なＤＮＡ産物が得られた。このＰＣＲ産物をベクターｐＪＥＴ１．２／平滑端（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）に製造者の指示に従いクローニングし、供給された標準プライマーを使用してインサート配列を決定した。
[0262]表１２は、ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）由来の１８ｓ ｒＲＮＡ配列の、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）電子データベースのＤＮＡ配列との比較を示す。簡潔に言えば、ＤＮＡアラインメントの標準である、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩプログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の「ＡｌｉｇｎＸ」プログラムに含まれるスコアリング行列「ｓｗｇａｐｄｎａｍｔ」により、「％同一性」を決定した。ＮＣＢＩ電子データベースによるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）の計算結果から「％カバレッジ」を取った。これはアラインメントした区間に含まれる問い合わせ配列の長さの割合である。
Figure 2016163579
[0263]表１２に示すとおり、％同一性の点でヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）由来の１８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、Ｈｏｎｄａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｕｋ．Ｍｉｃｒｏ．４６（６）：６３７−６４７（１９９９）に提供されるＴ．アグレガツム（Ｔ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）の１８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と、全く同じではないものの、近縁関係にあることが分かった。トラウストキトリウム・アグレガツム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）について発表されている１８ｓ ｒＲＮＡ配列は部分配列であり、配列の中央に約７１ＤＮＡヌクレオチドのギャップを含む。カバレッジ率に関して、本発明の単離物の１８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、Ｔ．アグレガツム（Ｔ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）よりもシゾキトリウム・エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＴＣＣ ２０８８８とより近縁の関係にある。
[0264]アクチンおよびβ−チューブリンなどの高度に保存されたタンパク質が、生物間の系統発生的な関係を評価するためのマーカーとして１８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と共に広く用いられている（Ｂａｌｄａｕｆ，Ｓ．Ｍ．Ａｍ．Ｎａｔ．１５４，Ｓ１７８（１９９９））。ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）由来の全ゲノムＤＮＡをまた、アクチンおよびβ−チューブリンの双方の遺伝子のＰＣＲ増幅用鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅は、Ｔ．アグレガツム（Ｔ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）由来のアクチンおよびβ−チューブリンＤＮＡ配列の保存領域用に設計されたプライマーで実施した。
[0265]染色体ＤＮＡ鋳型を含むＰＣＲ条件は以下のとおりであった：０．２μＭのｄＮＴＰ、各０．１ｕＭのプライマー、８％ＤＭＳＯ、２００ｎｇの染色体ＤＮＡ、２．５ＵのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および１× Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で５０μＬの総容量。ＰＣＲプロトコルは以下のステップを含んだ：（１）９５℃で２分間；（２）９５℃で３０秒間；（３）５５℃で３０秒間；（４）７２℃で２分間；（５）ステップ２〜４を４０サイクル繰り返し；（６）７２℃で５分間；および（７）６℃で保持。
[0266]ＰＣＲ増幅により、上記に記載される染色体鋳型を使用して予想されたサイズを有する明確なＤＮＡ産物が得られた。それぞれのＰＣＲ産物をベクターｐＪＥＴ１．２／平滑端（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）に製造者の指示に従いクローニングし、供給された標準プライマーを使用して各々のインサート配列を決定した。
[0267]表１３は、公開データベースで利用可能なアクチン配列と比較したときの、ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）由来のアクチンアミノ酸配列の同一性を示す。同一性は、タンパク質アラインメントの標準である、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩプログラムの「ＡｌｉｇｎＸ」プログラムに含まれるスコアリング行列「ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２」を使用して決定した。
Figure 2016163579
[0268]表１４は、公開データベースで利用可能なβ−チューブリン配列と比較したときの、ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）由来のβ−チューブリンアミノ酸配列の同一性を示す。同一性は、タンパク質アラインメントの標準である、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩプログラムの「ＡｌｉｇｎＸ」プログラムに含まれるスコアリング行列「ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２」を使用して決定した。
Figure 2016163579
[0269]上記の特徴に基づけば、単離されたヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）は新しいシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の種に相当すると考えられ、従ってまたシゾキトリウム・エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＴＣＣ ＰＴＡ−９６９５と命名される。
［実施例３０］
[0270]単離ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）は、以下に記載するとおり、様々な培養条件下で高レベルの細胞成長を生じた。典型的な培地および培養条件を表１５に示す。また、高レベルの脂肪酸およびＤＨＡが認められた（すなわち、乾燥細胞重量の５０重量％超が脂肪酸であり、脂肪酸メチルエステルの５０重量％超がＤＨＡであった）。
Figure 2016163579
[0271]ｐＨ７．０で２０％溶存酸素を有し２２．５℃で８２００ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素および窒素供給培養液において、培養７日後に単離株から１４０ｇ／Ｌの乾燥細胞重量が生じ、脂肪酸含量は７０重量％であった。閉ループアンモニア供給を用い、ｐＨは７．０に維持した。これらの条件下でω−３産生能力は８．９２ｇ／（Ｌ＊日）であり、７日で４．７ｇ／ＬのＥＰＡ（脂肪酸の５重量％）および５６．３ｇ／ＬのＤＨＡ（脂肪酸の５７重量％）であった。
[0272]ｐＨ７．０で２０％溶存酸素を有し２２．５℃で３６４０ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素および窒素供給培養液において、培養７日後に単離株から８２ｇ／Ｌの乾燥細胞重量が生じ、脂肪酸含量は５８重量％であった。これらの条件下でω−３産生能力は４．５ｇ／（Ｌ＊日）であり、７日で２．１ｇ／ＬのＥＰＡ（脂肪酸の４．３重量％）および２８．５ｇ／ＬのＤＨＡ（脂肪酸の５８．７重量％）であった。
[0273]ｐＨ７．０で２０％溶存酸素を有し２２．５℃で９８０ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素および窒素供給培養液において、培養７日後に単離株から６０ｇ／Ｌの乾燥細胞重量が生じ、脂肪酸含量は５３重量％であった。これらの条件下でω−３産生能力は２．８ｇ／（Ｌ＊日）であり、７日で１．１ｇ／ＬのＥＰＡ（脂肪酸の３．４重量％）および１８．４ｇ／ＬのＤＨＡ（脂肪酸の５６．８重量％）であった。
［実施例３１］
[0274]単離ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）のバイオマス試料（試料Ａ）から油を抽出した。このバイオマス試料は、ｐＨ７．０で２０％溶存酸素を有し２２．５℃で９８０ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素および窒素供給培養液で産生された。バイオマス試料Ａからヘキサン抽出法により油を抽出して微生物油試料Ａ１を得た。簡潔に言えば、乾燥バイオマスをヘキサンと共に、ステンレス鋼製の管およびステンレス鋼製のボールベアリングを使用して約２時間粉砕した。スラリーを真空ろ過し、ろ液を回収した。ロータリーエバポレータを使用してヘキサンを除去した。また、ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法（ＧＥＡ Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ ＵＫ Ｌｔｄ．，Ｍｉｌｔｏｎ Ｋｅｙｎｅｓ，英国）を用いてバイオマス試料Ａから油を抽出し、微生物油試料Ａ２を得た。微生物油試料Ａ１およびＡ２から低圧フラッシュクロマトグラフィーを用いて個々の脂質クラスを単離し、各クラスの重量パーセントを決定した。水素炎イオン化検出ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＦＩＤ）を用いて各クラスの脂肪酸プロファイルを脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）として決定した。
[0275]フラッシュクロマトグラフィー−フラッシュクロマトグラフィーを用いて粗油中に存在する脂質クラスを分離し、油中に存在する各クラスの重量パーセントを決定した。クロマトグラフィーシステムはシリカゲル６０（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を利用し、その移動相は石油エーテルおよび酢酸エチルからなり、３ｍＬ／分であった。段階的勾配を用いてカラムから各脂質クラスを選択的に溶出した。移動相勾配は１００％石油エーテルから開始し、５０％酢酸エチルで終了した（その後１００％メタノールで洗浄した）。Ｇｉｌｓｏｎ ＦＣ ２０４ラージベッド（ｌａｒｇｅ−ｂｅｄ）フラクションコレクター（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を使用して画分を１０ｍＬ試験管に回収した。各管を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析し、個々の脂質クラスが入った管（予想保持係数（Ｒｆ）を有するＴＬＣプレート上のシングルスポットにより判断するとき）をプールし、濃縮乾固して秤量した。次に総画分含量を重量測定法で決定した。
[0276]ＴＬＣ分析−シリカゲルプレートで薄層クロマトグラフィーを実施した。石油エーテル：エチルエーテル：酢酸（８０：２０：１）からなる溶媒系を使用してプレートを溶出し、ヨウ素蒸気を用いて可視化した。次に各スポットのＲｆ値を各脂質クラスについて既報の文献値と比較した。
[0277]脂肪酸分析−バイオマスの試料および単離した脂質クラスを脂肪酸組成についてＦＡＭＥとして分析した。試料をねじ口試験管に直接量り取り、１ｍＬのトルエン中Ｃ１９：０内部標準（ＮｕＣｈｅｃｋ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）および２ｍＬのメタノール中１．５Ｎ ＨＣｌを各管に加えた。管を短時間ボルテックスし、加熱ブロックに１００℃で２時間置いた。管を加熱ブロックから取り出して放冷し、１ｍＬの水中飽和ＮａＣｌを添加した。管を再びボルテックスして遠心し、上層（有機層）の一部分をＧＣバイアルに入れてＧＣ−ＦＩＤにより分析した。Ｎｕ−Ｃｈｅｋ−Ｐｒｅｐ ＧＬＣ参照標準（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を使用して作成した３点内部標準校正曲線を用いてＦＡＭＥを定量化し、保持時間に基づき仮に同定した。脂肪酸の存在量は全ＦＡＭＥに対するｍｇ／ｇおよび％として表現した。
[0278]粗油をヘキサンに溶解してカラムのヘッドに適用することにより、試料Ａ１を調製した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて試料を分画したところ、粗油の１．２重量％をステロールエステル画分が占め、８２．７重量％をトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）画分が占め、０．９重量％を遊離脂肪酸（ＦＦＡ）画分が占め、および２．９重量％をジアシルグリセロール（ＤＡＧ）画分が占めた。試料Ａ１粗油および単離画分の全脂肪酸プロファイルを、それぞれｍｇ／ｇおよび％ＦＡＭＥとして計算した以下の表１６および表１７に示す。
Figure 2016163579
Figure 2016163579
[0279]粗油をヘキサンに溶解してカラムのヘッドに適用することにより、試料Ａ２を調製した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて試料を分画したところ、粗油の０．８重量％をステロールエステル画分が占め、８３．４重量％をトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）画分が占め、１．８重量％を遊離脂肪酸（ＦＦＡ）画分が占め、および５．６重量％をジアシルグリセロール（ＤＡＧ）画分が占めた。試料Ａ２粗油および単離画分の全脂肪酸プロファイルを、それぞれｍｇ／ｇおよび％ＦＡＭＥとして計算した以下の表１８および表１９に示す。
Figure 2016163579
Figure 2016163579
[0280]試料Ａ１およびＡ２は、それぞれ典型的なヘキサン抽出およびＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法を用いて抽出した点が注記される。表１６〜表１９の脂肪酸プロファイルは、本発明の方法を用いて試料が抽出された場合に実質的に同じになることが予想される。
［実施例３２］
[0281]実施例３１に記載されるとおり、Ｆｒｉｏｌｅｘ法を用いて発酵ブロスから油を抽出した後、精製、脱色、および脱臭ステップによって粗油をさらに処理して最終油を得た。この最終油を高オレイン酸ヒマワリ油で希釈し、ＤＨＡ含量が約４００ｍｇ／ｇの完成した市販品の油を得た。個々の脂質クラスを単離し、水素炎イオン化検出ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＦＩＤ）を用いて各クラスの脂肪酸プロファイルを脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）として決定した。
[0282]フラッシュクロマトグラフィー−フラッシュクロマトグラフィーを用いて最終油中に存在する脂質クラスを分離し、油中に存在する各クラスの重量パーセントを決定した。クロマトグラフィーシステムはシリカゲル６０（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を利用し、その移動相は石油エーテルおよび酢酸エチルからなり、３ｍＬ／分であった。段階的勾配を用いてカラムから各脂質クラスを選択的に溶出した。移動相勾配は１００％石油エーテルから開始し、５０％酢酸エチルで終了した（その後１００％メタノールで洗浄した）。Ｇｉｌｓｏｎ ＦＣ ２０４ラージベッド（ｌａｒｇｅ−ｂｅｄ）フラクションコレクター（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を使用して画分を１０ｍＬ試験管に回収した。各管を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析し、個々の脂質クラスが入った管（予想保持係数（Ｒｆ）を有するＴＬＣプレート上のシングルスポットにより判断するとき）をプールし、濃縮乾固して秤量した。次に総画分含量を重量測定法で決定した。
[0283]ＴＬＣ分析−シリカゲルプレートで薄層クロマトグラフィーを実施した。石油エーテル：エチルエーテル：酢酸（８０：２０：１）からなる溶媒系を使用してプレートを溶出し、ヨウ素蒸気を用いて可視化した。次に各スポットのＲｆ値を各脂質クラスについて既報の文献値と比較した。
[0284]脂肪酸分析−最終油の試料および単離脂質クラスを脂肪酸組成についてＦＡＭＥとして分析した。試料をねじ口試験管に直接量り取り、１ｍＬのトルエン中Ｃ１９：０内部標準（ＮｕＣｈｅｃｋ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）および２ｍＬのメタノール中１．５Ｎ ＨＣｌを各管に加えた。管を短時間ボルテックスし、加熱ブロックに１００℃で２時間置いた。管を加熱ブロックから取り出して放冷し、１ｍＬの水中飽和ＮａＣｌを添加した。管を再びボルテックスして遠心し、上層（有機層）の一部分をＧＣバイアルに入れてＧＣ−ＦＩＤにより分析した。Ｎｕ−Ｃｈｅｋ−Ｐｒｅｐ ＧＬＣ参照標準（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を使用して作成した３点内部標準校正曲線を用いてＦＡＭＥを定量化し、保持時間に基づき仮に同定した。脂肪酸の存在量は全ＦＡＭＥのｍｇ／ｇおよび％として表現した。
[0285]２５０ｍｇの最終油を６００μＬのヘキサンに溶解してカラムのヘッドに適用することにより試料を調製した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて試料を分画したところ、最終油の１．２重量％をステロールエステル画分が占め、９２．１重量％をトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）画分が占め、２．１重量％を遊離脂肪酸（ＦＦＡ）画分が占め、１．１％をステロール画分が占め、２．８重量％をジアシルグリセリド（ＤＡＧ）画分が占めた。
[0286]プールした画分のＴＬＣ分析から、ＦＦＡ画分およびステロール画分はそれぞれＴＡＧおよびＤＡＧと混合していることが分かった。ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）の最終油および単離画分の全脂肪酸プロファイルを、それぞれｍｇ／ｇおよび％ＦＡＭＥとして計算した以下の表２０および表２１に示す。
Figure 2016163579
Figure 2016163579
[0287]表２０および表２１の脂肪酸プロファイルは、ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法を用いて抽出した試料から得られた点が注記される。表２０および表２１の脂肪酸プロファイルは、本発明の方法を用いて試料が抽出された場合に実質的に同じになることが予想される。
［実施例３３］
[0288]９８０ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素および窒素供給培養液（ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）培地）において単離ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５）の２日経過播種フラスコを調製した。
[0289]突然変異生成を以下の手順に従い実施した：
[0290]滅菌したＴ＝２日経過フラスコ、約５０ｍｌを、滅菌した４０ｍｌガラスホモジナイザーに注ぎ入れた。ホモジナイザーにおいて培養物に５０回のプランジを与えた。培養物をピペットで取り出し、５０ｍｌ滅菌管に置かれた滅菌５０ミクロンメッシュフィルターでろ過した（メッシュは、より小さい塊および単一の細胞をｌ０ミクロンメッシュに通過させる一方で、より大きいコロニー群を保持する手段として使用した）。濃縮された浸軟物（ｍａｃｅｒａｔｅ）の全体を滅菌５０ｍｌ管に回収した。浸軟した培養物をボルテックスし、ヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）培地が入った管に最高１：１００倍レベルの希釈液を作製した。希釈した浸軟試料をボルテックスした後、４〜５個のガラスビーズ（３ｍｍガラスビーズ）が入ったヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）培地の寒天ペトリ皿１００×１５ｍｍに２００μｌの播種材料を添加した。ビーズによって播種材料をプレート全体に均等に広げるようにして、各プレートを穏やかに撹拌した。ビーズをプレートから空け、プレートを、蓋をして約５分間静置し、乾燥させた。手順は薄暗い所で行うため、滅菌フードおよび隣接領域の双方の照明を消した。手順を実行可能とするための最小限の光は利用できたが、間接的な薄暗いもののみであった。
[0291]５枚の複製プレートをＸＬクロスリンカー（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の底に置き、試料を照射する間、蓋は外した。このクロスリンカーはマイクロジュール単位で出力を送り、９０％〜９５％死滅を達成するレベルを求めた。同じプロトコルを用いて５枚の複製対照プレートに突然変異を誘発されていない細胞を播種した。これらの細胞カウントを使用して％死滅を計算した。照射の終了後プレートを取り出し、蓋を交換し、プレートをパラフィルム（ｐａｒａｆｉｌｍ）で包み、続いてアルミニウム箔で包んだ。最初の週はプレートを暗所で増殖させることで、損傷した遺伝子を修復できないようにすることが不可欠であった。
[0292]プレートを２２．５℃の室内に約１０日置いてからコロニーを計数した。最終的な計数を行ったとき、個々のコロニーを滅菌した播種用ループで選び取り、新しいヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）培地プレートに再度ストリークした。各コロニーを個々のプレートに植えた。プレートが密に増殖したところで播種用ループを使用して試料を採取し、５０ｍｌのヤブレツボカビ（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）培地が入った滅菌２５０ｍｌ振盪フラスコに播種した。このフラスコを２２．５℃の室内において２００ｒｐｍの振盪機に置いた。Ｔ＝７日目に振盪フラスコ培養物を５０ｍｌ滅菌管に回収した。ｐＨをとり、試料をスピンダウンしてバイオマスペレットを回収した。各試料をリンスし、イソプロピルアルコールと蒸留水との５０：５０混合物中に再懸濁した後、再度スピンした。回収したペレットを凍結乾燥して秤量し、ＦＡＭＥ分析を実施した。表２２〜表２８のデータは、上記の方法で産生した突然変異体を表す。
Figure 2016163579
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［実施例３４］
［微生物の単離］
[0293]米国西海岸（カリフォルニア州（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、オレゴン州（Ｏｒｅｇｏｎ）、およびワシントン州（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ））およびハワイ州（Ｈａｗａｉｉ）に沿った入り江および河口域を含む潮間生息地から、干潮時に試料を採取した。水、堆積物、生きている植物材料、および死滅した植物／動物の残骸を滅菌した５０ｍｌ管に入れた。水と共に各試料の部分量を、単離培地の固形寒天プレートに塗布した。単離培地は以下からなった：５００ｍｌの人工海水、５００ｍｌの蒸留水、１ｇのグルコース、１ｇのグリセロール、１３ｇの寒天、１ｇのグルタミン酸塩、０．５ｇの酵母エキス、０．５ｇのカゼイン加水分解物、１ｍｌのビタミン溶液（１００ｍｇ／Ｌのチアミン、０．５ｍｇ／Ｌのビオチン、０．５ｍｇのＢ１２）、１ｍｌの微量ミネラル溶液（ＰＩＩ金属、１リットル当たり６．０ｇのＦｅＣｌ３６Ｈ２Ｏ、６．８４ｇのＨ３ＢＯ３、０．８６ｇのＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ、０．０６ｇのＺｎＣｌ２、０．０２６のＣｏＣｌ２６Ｈ２Ｏ、０．０５２ｇのＮｉＳＯ４Ｈ２Ｏ、０．００２ｇのＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏおよび０．００５ｇのＮａ２ＭｏＯ４２Ｈ２Ｏを含有）、並びに各５００ｍｇのペニシリンＧおよび硫酸ストレプトマイシン。寒天プレートを暗所において２０〜２５℃でインキュベートした。２〜４日後、寒天プレートを顕微鏡下で調べ、細胞のコロニーを滅菌したつまようじで取り、新鮮な培地プレートに再びストリークした。汚染生物が除去されるまで、細胞を新鮮な培地に繰り返しストリークした。単離した微生物のうち２つをＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２およびＰＴＡ−１０２０８のもとに寄託した。
［ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２として寄託した単離微生物の分類学上の特性決定］
[0294]ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２として寄託した単離微生物（「ＰＴＡ−１０２１２」）の培養物は、白色の、湿潤した、塗抹されたコロニーのように見え、目に見える独立した胞子嚢群はなかった。
[0295]ＰＴＡ−１０２１２を固形および液体ＦＦＭ、固形ＫＭＶ、ＫＭＶスラッシュ（１％）、ＫＭＶブロス、およびＭＨブロスで増殖して増殖特性をさらに調べた。ＰＴＡ−１０２１２はＫＭＶおよびＭＨで急速に増殖することが観察された。例えば、Ｐｏｒｔｅｒ Ｄ．，１９８９．Ｐｈｙｌｕｍ Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｏｔａ．Ｉｎ Ｍａｒｇｕｌｉｓ，Ｌ．，Ｃｏｒｌｉｓｓ，Ｊ．Ｏ．，Ｍｅｌｋｏｎｉａｎ，Ｍ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（Ｅｄｓ．）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｏｃｔｉｓｔａ，Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．３８８−３９８（ＫＭＶ）；Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．１０２：４３９−４４８（１９９８）（ＭＨ）；および米国特許第５，１３０，２４２号明細書（ＦＦＭ）を参照のこと。
[0296]以下の観察は、ＰＴＡ−１０２１２の数日間にわたる固形ＦＦＭ培地での増殖後、７２時間のＫＭＶ培地、およびＭＨブロスにおける増殖後に行った。胞子嚢はいずれの培地中／培地上においても集塊せず、極めて小さかった（５〜１０μｍ）。ＰＴＡ−１０２１２はシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の分割パターンに特徴的な多量の四分子を示さなかった。新鮮な固形培地に移して約２４時間後、アメーバ状細胞が現れた。このアメーバ状細胞は数日後に消え、および液体培地またはスラッシュ培地では明白でなかった。Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ４８（６）：３２９−３４１（２００７）によって、液体培地で増殖したとき「フラスコの底にある細かい砂粒」の外観を有するものとして記載されるオーランチオキトリウム属（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）と異なり、ＰＴＡ−１０２１２はフラスコの底に沈降することなく、ＫＭＶおよびＭＨの双方の液体培地に懸濁された。胞子嚢は、ＰＴＡ−１０２１２に存在しなかった外質の網目も有するシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはオリゴキトリウム属（Ｏｌｉｇｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に典型的なものほど密ではなかった。ほとんどの種は、大きい胞子嚢が数時間かけて分裂することによる小さい胞子嚢または同化細胞の栄養分割を行うが、ＰＴＡ−１０２１２はダンベル形の細長い同化細胞を形成し、次にはそれがダンベルの端部の分離に伴い引き離される細い峡部を形成した。得られた細胞は小さい同化細胞のように見えた。アメーバ状細胞がダンベル形同化細胞に直接変化した例は観察されなかった。典型的な双鞭毛遊走子は遊泳が観察されたが、比較的まれであった。ＰＴＡ−１０２１２は多産でなく、栄養分割により分裂した。遊走子の直接放出は観察されなかったが、遊走子は遊泳が観察された。栄養細胞は極めて小さかった（２μｍ〜５μｍ）。
[0297]フロースルー技法を用いてＰＴＡ−１０２１２をさらに調べ、ここでは半分の強度の一滴の海水に少量の寒天増殖コロニーを懸濁することにより、顕微鏡スライドを調製した。この技法により、一次胞子嚢が球形で直径約１０μｍであることが観察された。壁は極めて薄く、プロトプラストの二分裂の開始時に残存物は観察されなかった。二分裂の繰り返しによって８〜１６個のより小さい（直径４〜５μｍの）二次胞子嚢が生じた。この二次胞子嚢は数時間休眠状態にとどまり、その後再び無定形のプロトプラストを放出した。無定形のプロトプラストは挟みつぶして引きちぎるように分割すると、最初は典型的なダンベル形の中間段階を生じ、最終的に直径２．５〜２．８μｍの４〜８個の小さい球状体になった。それらは数分間から最長１〜２時間までそのままの状態にあり、次に形を（細長く）変化させて、２．３〜２．５×３．７〜３．９μｍの双鞭毛遊走子になった。遊走子は多量にあり、それらが静止したときに正確に計測することができた。次に遊走子は丸くなり、新しい成長サイクルを開始した。遊走子はシシオイドキトリウム・ミヌツム（Ｓｉｃｙｏｉｄｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ）より大きく、ウルケニア・ウィスルゲンシス（Ｕｌｋｅｎｉａ ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ）より小さかった。
[0298]ＰＴＡ−１０２１２を、１８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子についての既知の種との類似性に基づきさらに特徴付けた。標準的手順によりＰＴＡ−１０２１２からゲノムＤＮＡを調製した。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。簡潔には：（１）対数期中期培養物から５００μＬの細胞を遠心した。細胞を再度遠心し、細胞ペレットから小口径の先端部で痕跡量の液体を全て除去した；（２）２００μＬの溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、１２５μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．５％ＳＤＳ）でペレットを再懸濁した；（３）細胞を５０℃で１時間溶解した；（４）溶解混合物をピペットでフェーズロックゲル（ＰＬＧ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）２ｍＬチューブに移した；（５）等容量のＰ：Ｃ：Ｉを添加し、１．５時間混合した；（６）チューブを１２，０００×ｇで５分間遠心した；（７）ＰＬＧチューブ内のゲルの上側から水相を取り出し、その水相に等容量のクロロホルムを添加して３０分間混合した；（８）チューブを１４，０００×ｇで約５分間遠心した；（９）最上層（水相）をピペットでクロロホルムから取り、新しいチューブに入れた；（１０）０．１容量の３Ｍ ＮａＯＡＣを添加して混合した（数回反転させた）；（１１）２容量の１００％ＥｔＯＨを添加して混合し（数回反転させた）、この段階でゲノムＤＮＡの沈殿が形成された；（１２）微量遠心機において１４，０００×ｇで約１５分間、チューブを４℃で遠心した；（１３）その液体を静かに流し捨てると、チューブの底にゲノムＤＮＡが残った；（１４）そのペレットを０．５ｍＬの７０％ＥｔＯＨで洗浄した；（１５）微量遠心機において１４，０００×ｇで約５分間、チューブを４℃で遠心した；（１６）ＥｔＯＨを静かに流し捨て、ゲノムＤＮＡペレットを乾燥させた；および（１７）好適な容量のＨ２ＯおよびＲＮアーゼをゲノムＤＮＡペレットに直接添加した。１８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅は、以前に記載されているプライマーで実施した（Ｈｏｎｄａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｅｕｋ Ｍｉｃｒｏ．４６（６）：６３７−６４７（１９９９）。染色体ＤＮＡ鋳型を含むＰＣＲ条件は以下のとおりであった：０．２μＭのｄＮＴＰ、各０．１μＭのプライマー、８％ＤＭＳＯ、２００ｎｇの染色体ＤＮＡ、２．５ＵのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、およびＨｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で合計容量５０μＬ。ＰＣＲプロトコルは以下のステップを含んだ：（１）９５℃で２分間；（２）９５℃で３５秒間；（３）５５℃で３５秒間；（４）７２℃で１分間および３０秒間；（５）ステップ２〜４を３０サイクル繰り返し；（６）７２℃で５分間；および（７）４℃で保持。
[0299]ＰＣＲ増幅により、上記に記載される染色体鋳型を使用して予想されたサイズを有する明確なＤＮＡ産物が得られた。ＰＣＲ産物をベクターｐＪＥＴ１．２／平滑端（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）に製造者の指示に従いクローニングし、供給された標準プライマーを使用してインサート配列を決定した。
[0300]系統発生解析では、ＰＴＡ−１０２１２は、適度の裏付けをもって、トラウストキトリウム・パキデルムム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｍ）およびトラウストキトリウム・アグレガツム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）を含む系統内に位置付けられる。Ｔ．パキデルムム（Ｔ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｍ）の胞子嚢は極めて厚い細胞壁を有する。Ｔ．アグレガツム（Ｔ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）は、明確に視認可能な、不透明な胞子嚢群の塊を形成する。ＰＴＡ−１０２１２はこれらの特徴のいずれも示さない。多くのアメーバ状細胞の存在は、ウルケニア属（Ｕｌｋｅｎｉａ）、Ｔ．ガエルトネリウム（Ｔ．ｇａｅｒｔｎｅｒｉｕｍ）、Ａ．リマシヌム（Ａ．ｌｉｍｉａｃｉｎｕｍ）、およびＳ．マングロベイ（Ｓ．ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）などの他の分類群で記載されている；しかしながら、これらの分類群に関連する記載は、本単離物に観察される特徴と異なる。さらに、ＰＴＡ−１０２１２は、これらの分類群のいずれに対しても系統発生的な類縁性を示さない。
[0301]表２９は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２として寄託された微生物由来の１８ｓ ｒＲＮＡ配列の、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）電子データベースのＤＮＡ配列との比較を示す。２つの異なる計算を用いて同一性パーセントを決定した。「計算＃１」は、非相同領域または部分配列のいずれからも、配列に出現する任意の「ギャップ」を考慮する（ＡｌｉｇｎＸ−ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ初期設定）。「計算＃２」は、ギャップの計算ペナルティを含まない（ＡｌｉｇｎＸ−ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ「ＩＤＥＮＴＩＴＹ」行列設定）。
Figure 2016163579
[0302]表２９に示すとおり、％同一性の点で、受託番号ＰＴＡ−１０２１２として寄託された微生物由来の１８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、ＮＣＢＩデータベースで利用可能な１８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と、全く同じではないものの、近縁関係にあることが分かった。一般に、生物は異なる属または種に属しながらより近縁の関係にある１８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有し得ることが認識されている。
[0303]上記の特徴付けに基づけば、単離された微生物（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２）は新しいトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の種に相当すると考えられ、従ってまたトラウストキトリウム・エスピー（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１０２１２と命名される。
［ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８として寄託された単離微生物の分類学的特徴］
[0304]ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８として寄託された微生物（「ＰＴＡ−１０２０８」）は、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５３３号明細書および国際公開第２０１０／１０７４１５号パンフレットに記載されるＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９５として寄託された微生物（「ＰＴＡ−９６９５」）のサブ単離株（培養物から単離され、新しい別個の明確に異なる培養物として維持される個々の細胞）として同定された。
[0305]ＰＴＡ−１０２０８はＰＴＡ−９６９５と分類学的特徴を共有する。ＰＴＡ−９６９５は放出時に双鞭毛遊走子を有し、それが活動的に泳ぎ出して成熟胞子嚢から遊離し、その残された壁は胞子放出後（位相差法で）明確に確認できることが分かった。ＰＴＡ−９６９５胞子嚢の直径は１２．５μｍ〜２５μｍであり、遊走子は２．５μｍ〜２．８μｍ×４．５μｍ〜４．８μｍのサイズであった。個々のＰＴＡ−９６９５胞子嚢につき８〜２４個の胞子があった。定着したＰＴＡ−９６９５遊走子は大きくなり、急速に二分裂を起こし、四分子、八分子、および最終的に胞子嚢の塊を生じた。四分子の形成は胞子嚢の成熟前の極めて早い段階で始まった。これらの特徴はシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に一致している。％同一性の点で、ＰＴＡ−１０２０８が共有するＰＴＡ−９６９５ １８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、Ｈｏｎｄａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｕｋ．Ｍｉｃｒｏ．４６（６）：６３７−６４７（１９９９）に提供されるＴ．アグレガツム（Ｔ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）の１８ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と、全く同じではないものの、近縁関係にあることが分かった。トラウストキトリウム・アグレガツム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）について発表されている１８ｓ ｒＲＮＡ配列は部分配列であり、配列の中央に約７１ＤＮＡヌクレオチドのギャップがある。ＰＴＡ−９６９５は新しいシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の種に相当すると考えられる。従って、サブ単離株ＰＴＡ−１０２０８もまた、シゾキトリウム・エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１０２０８として命名される。
［実施例３５］
［ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２として寄託された単離微生物の増殖特性］
[0306]単離微生物（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２１２）を、以下に記載するとおり、個別の発酵ランで増殖特性について調べた。典型的な培地および培養条件を表３０に示す。
Figure 2016163579
[0307]ｐＨ７．３で２０％溶存酸素を有し２２．５℃で１０００ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素（グリセロール）および窒素供給培養液において、１０Ｌの発酵槽容量で１３８時間の培養後、ＰＴＡ−１０２１２は２６．２ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は７．９ｇ／Ｌであり；ω−３収率は５．３ｇ／Ｌであり；ＥＰＡ収率は３．３ｇ／Ｌであり；およびＤＨＡ収率は１．８ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は３０．３重量％であり；ＥＰＡ含量は脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の４１．４％であり；およびＤＨＡ含量はＦＡＭＥの２６．２％であった。これらの条件下で脂質産生能力は１．３８ｇ／Ｌ／日であり、およびω−３産生能力は０．９２ｇ／Ｌ／日であり、０．５７ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ産生能力および０．３１ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ産生能力であった。
[0308]ｐＨ７．３で２０％溶存酸素を有し２２．５℃で１０００ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素（グリセロール）および窒素供給培養液において、１０Ｌの発酵槽容量で１８９時間の培養後、ＰＴＡ−１０２１２は３８．４ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は１８ｇ／Ｌであり；ω−３収率は１２ｇ／Ｌであり；ＥＰＡ収率は５ｇ／Ｌであり；およびＤＨＡ収率は６．８ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は４５重量％であり；ＥＰＡ含量はＦＡＭＥの２７．８％であり；およびＤＨＡ含量はＦＡＭＥの３７．９％であった。これらの条件下で脂質産生能力は２．３ｇ／Ｌ／日であり、およびω−３産生能力は１．５ｇ／Ｌ／日であり、０．６３ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ産生能力および０．８６ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ産生能力であった。
[0309]ｐＨ６．８〜７．７で２０％溶存酸素を有し２２．５℃で１０００ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素（グリセロール）および窒素供給培養液において、１０Ｌの発酵槽容量で１８９時間の培養後、ＰＴＡ−１０２１２は１３ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は５．６ｇ／Ｌであり；ω−３収率は３．５ｇ／Ｌであり；ＥＰＡ収率は１．５５ｇ／Ｌであり；およびＤＨＡ収率は１．９ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は３８重量％であり；ＥＰＡ含量はＦＡＭＥの２９．５％であり；およびＤＨＡ含量はＦＡＭＥの３６％であった。これらの条件下で脂質産生能力は０．６７ｇ／Ｌ／日であり、ω−３産生能力は０．４ｇ／Ｌ／日であり、０．２０ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ産生能力および０．２４ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ産生能力であった。
[0310]ｐＨ６．６〜７．２で２０％溶存酸素を有し２２．５〜２８．５℃で１０００ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素（グリセロール）および窒素供給培養液において、１０Ｌの発酵槽容量で１９１時間の培養後、ＰＴＡ−１０２１２は３６．７ｇ／Ｌ〜４８．７ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は１５．２ｇ／Ｌ〜２５．３ｇ／Ｌであり；ω−３収率は９．３ｇ／Ｌ〜１３．８ｇ／Ｌであり；ＥＰＡ収率は２．５ｇ／Ｌ〜３．３ｇ／Ｌであり；およびＤＨＡ収率は５．８ｇ／Ｌ〜１１ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は４２．４重量％〜５３重量％であり；ＥＰＡ含量はＦＡＭＥの９．８％〜２２％であり；およびＤＨＡ含量はＦＡＭＥの３８．１％〜４３．６％であった。これらの条件下で脂質産生能力は１．９ｇ／Ｌ／日〜３．２ｇ／Ｌ／日であり、ω−３産生能力は１．２ｇ／Ｌ／日〜１．７ｇ／Ｌ／日であり、０．３１ｇ／Ｌ／日〜０．４１ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ産生能力および０．７２ｇ／Ｌ／日〜１．４ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ産生能力であった。
［ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８として寄託された単離微生物の増殖特性］
[0311]単離微生物（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８）を、以下に記載するとおり、個別の発酵ランで増殖特性について調べた。典型的な培地および培養条件を表３１に示す。
Figure 2016163579
[0312]窒素供給中は２０％溶存酸素およびその後１０％溶存酸素を有し、ｐＨ７．０、２２．５℃で１０００ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素（グルコース）および窒素供給培養液において、１０Ｌの発酵槽容量で２００時間の培養後、ＰＴＡ−１０２０８は９５ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は５３．７ｇ／Ｌであり；ω−３収率は３７ｇ／Ｌであり；ＥＰＡ収率は１４．３ｇ／Ｌであり；およびＤＨＡ収率は２１ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は５７重量％であり；ＥＰＡ含量はＦＡＭＥの２７．７％であり；およびＤＨＡ含量はＦＡＭＥの３９．１％であった。これらの条件下で脂質産生能力は６．４ｇ／Ｌ／日であり、およびω−３産生能力は４．４ｇ／Ｌ／日であり、１．７ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ産生能力および２．５ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ産生能力であった。
[0313]窒素供給中は２０％溶存酸素およびその後１０％溶存酸素を有し、ｐＨ７．５、２２．５℃で１０００ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素（グルコース）および窒素供給培養液において、１０Ｌの発酵槽容量で１３９時間の培養後、ＰＴＡ−１０２０８は５６ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は５３ｇ／Ｌであり；ω−３収率は３４ｇ／Ｌであり；ＥＰＡ収率は１１．５ｇ／Ｌであり；およびＤＨＡ収率は２２ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は５８重量％であり；ＥＰＡ含量はＦＡＭＥの２１．７％であり；およびＤＨＡ含量はＦＡＭＥの４１．７％であった。これらの条件下で脂質産生能力は９．２ｇ／Ｌ／日であり、およびω−３産生能力は５．９ｇ／Ｌ／日であり、２ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ産生能力および３．８ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ産生能力であった。
[0314]窒素供給中は２０％溶存酸素およびその後１０％溶存酸素を有し、ｐＨ７．０、２２．５℃で１０００ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素（グルコース）および窒素供給培養液において、２０００Ｌの発酵槽容量で１６７時間の培養後、ＰＴＡ−１０２０８は９３．８ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は４７．２ｇ／Ｌであり；ω−３収率は３３．１ｇ／Ｌであり；ＥＰＡ収率は１０．５ｇ／Ｌであり；およびＤＨＡ収率は２０．４ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は５０．６重量％であり；ＥＰＡ含量はＦＡＭＥの２３％であり；およびＤＨＡ含量はＦＡＭＥの４２．６％であった。これらの条件下で脂質産生能力は６．８ｇ／Ｌ／日であり、およびω−３産生能力は４．７ｇ／Ｌ／日であり、１．５ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ産生能力および２．９ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ産生能力であった。
[0315]窒素供給中は２０％溶存酸素およびその後１０％溶存酸素を有し、ｐＨ７．０、２２．５℃で１０００ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素（グルコース）および窒素供給培養液において、２０００Ｌの発酵槽容量で１６８時間の培養後、ＰＴＡ−１０２０８は１０５ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は４６．４ｇ／Ｌであり；ω−３収率は３３ｇ／Ｌであり；ＥＰＡ収率は１０．７ｇ／Ｌであり；およびＤＨＡ収率は２０．３ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は４３．９重量％であり；ＥＰＡ含量はＦＡＭＥの２４％であり；およびＤＨＡ含量はＦＡＭＥの４３．７％であった。これらの条件下で脂質産生能力は６．６ｇ／Ｌ／日であり、およびω−３産生能力は４．７ｇ／Ｌ／日であり、１．５ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ産生能力および２．９ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ産生能力であった。
[0316]窒素供給中は２０％溶存酸素およびその後１０％溶存酸素を有し、ｐＨ７．０、２２．５℃で１０００ｐｐｍ Ｃｌ−を含む炭素（グルコース）および窒素供給培養液において、２０００Ｌの発酵槽容量で１６８時間の培養後、ＰＴＡ−１０２０８は６４．８ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は３８．７ｇ／Ｌであり；ω−３収率は２９．９ｇ／Ｌであり；ＥＰＡ収率は８．５ｇ／Ｌであり；およびＤＨＡ収率は１６．７ｇ／Ｌであった。脂肪酸含量は５９．６重量％であり；ＥＰＡ含量はＦＡＭＥの２３％であり；およびＤＨＡ含量はＦＡＭＥの４２．３％であった。これらの条件下で脂質産生能力は５．５３ｇ／Ｌ／日であり、およびω−３産生能力は３．８ｇ／Ｌ／日であり、１．２ｇ／Ｌ／日のＥＰＡ産生能力および２．３ｇ／Ｌ／日のＤＨＡ産生能力であった。
［実施例３６］
［微生物株ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１０２０８およびＰＴＡ−１０２１２の脂肪酸プロファイル］
[0317]４つのバイオマス試料（ＰＴＡ−１０２０８試料＃１；ＰＴＡ−１０２０８試料＃２；ＰＴＡ−１０２１２試料＃１；およびＰＴＡ−１０２１２試料＃２）を溶媒抽出により総粗油含量について分析し、高速液体クロマトグラフィー／蒸発光散乱検出（ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ）により脂質クラスを決定し、ＨＰＬＣ／質量分析法（ＨＰＬＣ／ＭＳ）によりトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を分析し、および水素炎イオン化検出ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＦＩＤ）により脂肪酸（ＦＡ）プロファイルを決定した。各凍結乾燥バイオマスの粗脂質含量を、ヘキサンによる溶媒粉砕（ｓｏｌｖｅｎｔ ｇｒｉｎｄｉｎｇ）を用いて決定し、直接エステル交換反応により生成したＦＡＭＥの合計（ｍｇ／ｇ）と比較し、得られた脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をＧＣ／ＦＩＤ分析により定量化した。抽出された粗脂質中の脂肪酸もまたエステル交換反応により定量化し、得られたＦＡＭＥのＧＣ／ＦＩＤ分析を用いて定量化した。抽出された粗脂質において、ＥＬＳＤを伴う順相ＨＰＬＣおよび大気圧化学イオン化ＭＳ（ＡＰＣＩ−ＭＳ）同定法を用いて全ての中性脂質（ＮＬ）および遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の重量パーセントを決定した。この方法は、ステロールエステル（ＳＥ）、ＴＡＧ、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、１，３−ジアシルグリセロール（１，３−ＤＡＧ）、ステロール、１，２−ジアシルグリセロール（１，２−ＤＡＧ）、およびモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）を分離し、定量化する。結果を以下の表３２および表３３に示す。表３２および表３３の脂肪酸プロファイルは、溶媒を使用して抽出した試料から得られたことが注記される。表３２および表３３の脂肪酸プロファイルは、本発明の方法を用いて試料を抽出した場合に実質的に同じになることが予想される。
[0318]４つのバイオマス試料（ＰＴＡ−１０２０８試料＃１；ＰＴＡ−１０２０８試料＃２；ＰＴＡ−１０２１２試料＃１；およびＰＴＡ−１０２１２試料＃２）から抽出した粗油から、ＴＡＧおよびリン脂質（ＰＬ）を単離した。ＴＡＧは低圧フラッシュクロマトグラフィーを用いて単離し、およびＰＬは固相抽出（ＳＰＥ）を用いて単離した。各単離された画分の同一性を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって確認した。単離したＴＡＧ画分およびＰＬ画分の脂肪酸プロファイルは、ＧＣ−ＦＩＤを用いて直接エステル交換反応後にＦＡＭＥとして決定した。結果を以下の表３４および表３５に示す。
[0319]微生物株ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１０２１２に由来するバイオマスのさらに２つの試料（ＰＴＡ−１０２１２試料＃３およびＰＴＡ−１０２１２試料＃４）についての総粗油含量および単離した脂質クラスの脂肪酸プロファイルもまた決定した。粗油は各試料からヘキサン抽出により得て、個々の脂質クラスは低圧フラッシュクロマトグラフィーを用いて単離した。バイオマス、粗油、および単離画分の脂肪酸プロファイルをＧＣ−ＦＩＤを用いてＦＡＭＥとして決定した。結果を以下の表３６〜表３９に示す。表３６〜表３９の脂肪酸プロファイルは、典型的なヘキサン抽出を用いて抽出した試料から得られたことが注記される。表３６〜表３９の脂肪酸プロファイルは、本発明の方法を用いて試料を抽出した場合に実質的に同じになることが予想される。
[0320]先にＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法を用いて抽出した微生物株ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１０２１２由来の粗油の試料（ＰＴＡ−１０２１２試料＃５）から個々の脂質クラスを単離し、ＧＣ−ＦＩＤを用いて各クラスの脂肪酸プロファイルをＦＡＭＥとして決定した。結果を以下の表４０および表４１に示す。表４０および表４１の脂肪酸プロファイルは、ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法を用いて抽出した試料から得られたことが注記される。表４０および表４１の脂肪酸プロファイルは、本発明の方法を用いて試料を抽出した場合に実質的に同じになることが予想される。
[0321]微生物株ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１０２０８由来の粗油の試料（ＰＴＡ−１０２０８試料＃３）から、ＥＬＳＤを伴う順相ＨＰＬＣおよびＡＰＣＩ−ＭＳ同定法を用いて個々の脂質クラスを単離した。
［実験手順］
[0322]粗油抽出−粗油は凍結乾燥バイオマスの試料から溶媒粉砕を用いて抽出した。例えば、約３グラムのバイオマスをスウェーデン管（Ｓｗｅｄｉｓｈ ｔｕｂｅ）に秤量した。スウェーデン管に３個のボールベアリングおよび３０ｍＬのヘキサンを加え、それをネオプレン栓で密閉し、振盪機に２時間置いた。得られたスラリーを、ブフナー漏斗およびワットマンろ紙を使用してろ過した。ろ過された液体を回収して溶媒を真空下で除去し、残った粗脂質の量を重量測定法で決定した。
[0323]脂肪酸分析−バイオマス、抽出した粗脂質、および単離した脂質クラスの試料を、脂肪酸組成についてＦＡＭＥとして分析した。簡潔に言えば、凍結乾燥したバイオマスおよび単離した脂質クラスをねじ口試験管に直接量り取り、一方で粗油の試料を約２ｍｇ／ｍＬの濃度となるようヘキサンに溶解した。内部標準を含むトルエン、およびメタノール中１．５Ｎ ＨＣｌを各管に加えた。管をボルテックスし、次に蓋をして１００℃に２時間加熱した。管を放冷し、水中飽和ＮａＣｌを添加した。管を再びボルテックスし、遠心して層を分離させた。次に有機層の一部分をＧＣバイアルに入れ、ＧＣ−ＦＩＤにより分析した。Ｎｕ−Ｃｈｅｃｋ−Ｐｒｅｐ ＧＬＣ参照標準（ＮｕＣｈｅｃｋ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を使用して作成した３点校正曲線を用いてＦＡＭＥを定量化した。抽出物中に存在する脂肪酸は、ｍｇ／ｇおよび重量パーセントとして表現した。ＧＣ−ＦＩＤにより分析したときの内部標準と等しい反応を仮定して、試料中の脂肪含量を推定した。
[0324]ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ／ＭＳ方法−
Figure 2016163579
[0325]固相抽出−粗脂質から、Ｖａｃ Ｅｌｕｔ装置（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，米国）に置いた２ｇのアミノプロピルカートリッジ（Ｂｉｏｔａｇｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）を使用して固相抽出（ＳＰＥ）によりＰＬ画分を分離した。カートリッジは１５ｍｇのヘキサンでコンディショニングし、約６０ｍｇの各試料を１ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解してカートリッジに適用した。カラムを１５ｍＬの２：１ ＣＨＣｌ３：イソプロピルアルコールで洗浄して全ての中性脂質を溶出し、それを廃棄した。次に１５ｍＬのエーテル中２％酢酸（ＨＯＡｃ）で脂肪酸を溶出し、それを廃棄した。ＰＬ部分を１５ｍＬの６：１のメタノール：クロロホルムで溶出し、それを回収して窒素下で乾燥し、秤量した。
[0326]フラッシュクロマトグラフィー−フラッシュクロマトグラフィーを用いて粗油中に存在する脂質クラスを分離した。ヘキサンに溶解した約２００ｍｇの粗油をカラムのヘッドに注入した。クロマトグラフィーシステムはシリカゲル６０（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を利用し、その移動相は石油エーテルおよび酢酸エチルからなり、５ｍＬ／分（表６〜表７）または３ｍＬ／分（表８〜表１３）であった。段階的勾配を用いてカラムから各脂質クラスを選択的に溶出した。移動相勾配は１００％石油エーテルから開始し、５０％酢酸エチルで終了した。Ｇｉｌｓｏｎ ＦＣ ２０４ラージベッド（ｌａｒｇｅ−ｂｅｄ）フラクションコレクター（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を使用して画分を１０ｍＬ試験管に回収した。各管を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析し、個々の脂質クラスが入った管（予想保持係数（Ｒｆ）を有するＴＬＣプレート上のシングルスポットにより判断するとき）をプールし、濃縮乾固して秤量した。次に総画分含量を重量測定法で決定した。
[0327]ＴＬＣ分析−シリカゲルプレートで薄層クロマトグラフィーを実施した。石油エーテル：エチルエーテル：酢酸（８０：２０：１）からなる溶媒系を使用してプレートを溶出し、ヨウ素蒸気を用いて可視化した。次に各スポットのＲｆ値を各脂質クラスについて既報の文献値と比較した。
[0328]ＴＡＧ画分およびＰＬ画分の分析−単離したＴＡＧ画分およびＰＬ画分を、脂肪酸組成について脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）として分析した。ＴＡＧ画分を約１〜２ｍｇ／ｍＬの濃度となるようヘキサンに溶解した。その溶液の１ｍＬアリコートを窒素下で濃縮乾固した。内部標準を含むトルエン、およびメタノール中１．５Ｎ ＨＣｌを各管に加えた。管をボルテックスし、次に蓋をして１００℃に２時間加熱した。内部標準およびＨＣｌメタノールは、ＰＬ画分が入った管に直接添加して加熱した。管を放冷し、水中飽和ＮａＣｌを添加した。管を再びボルテックスして遠心し、層を分離させた。次に有機層の一部分をＧＣバイアルに入れ、ＧＣ−ＦＩＤにより分析した。Ｎｕ−Ｃｈｅｃｋ−Ｐｒｅｐ ＧＬＣ ５０２Ｂ参照標準（ＮｕＣｈｅｃｋ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を使用して作成した３点校正曲線を用いてＦＡＭＥを定量化した。抽出物中に存在する脂肪酸は、ＦＡＭＥのｍｇ／ｇおよび％として表現した。
［結果］
［ＰＴＡ−１０２０８試料＃１］
[0329]ＰＴＡ−１０２０８試料＃１についてのバイオマスおよび抽出した粗脂質の脂肪酸プロファイルを、ＧＣ／ＦＩＤを用いて決定した。バイオマス中の脂肪酸は、２８．６ｍｇのバイオマスをＦＡＭＥ管に直接量り取ることによりインサイチュでエステル交換し、一方、抽出した粗脂質の試料は、５５．０ｍｇの粗脂質を５０ｍＬメスフラスコに量り取り、且つ１ｍｌを別のＦＡＭＥ管に移すことにより調製した。バイオマスの推定粗脂質含量は、ＦＩＤ検出によるＧＣを用いて５３．２％（ＦＡＭＥの合計として）と決定され、一方、乾燥バイオマスから５２．０％（ｗｔ／ｗｔ）の脂質が抽出され、９７．８％の総脂質回収率が得られた。粗脂質はＧＣ／ＦＩＤを用いて９１．９％脂肪酸（ＦＡＭＥの合計として）と決定された。粗脂質に含まれる主要な脂肪酸は、Ｃ１６：０（１８２．５ｍｇ／ｇ）、Ｃ２０：５ ｎ−３（１８６．８ｍｇ／ｇ）、およびＣ２２：６ ｎ−３（４２３．１ｍｇ／ｇ）であった。
[0330]抽出した粗脂質の脂質クラスプロファイルを、５５．０ｍｇの粗脂質を５０ｍＬメスフラスコに秤量し、且つアリコートをＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ／ＭＳ分析用のＨＰＬＣバイアルに移すことにより決定した。ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ／ＭＳ分析によれば、粗脂質は０．２％のステロールエステル（ＳＥ）、９５．１％のＴＡＧ、０．４％のステロール、および０．５％の１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含有した。ＴＡＧ画分の５％はＴＡＧピークのすぐ後に溶出したピークを含んだが、これは認識可能な質量スペクトルを提供しなかった。
[0331]フラッシュクロマトグラフィーにより決定されたとおりのこの試料からの単離ＴＡＧは、粗油の約９２．４％を構成した。ＰＬはＳＰＥ単離後の重量またはＴＬＣによっては検出されなかった。ＴＡＧに含まれた主要な脂肪酸（＞５０ｍｇ／ｇ）は、Ｃ１６：０（１８９ｍｇ／ｇ）、Ｃ２０：５ ｎ−３（１９７ｍｇ／ｇ）、およびＣ２２：６ ｎ−３（４４１ｍｇ／ｇ）であった。
［ＰＴＡ−１０２０８試料＃２］
[0332]ＰＴＡ−１０２０８試料＃２についてのバイオマスおよび抽出した粗脂質の脂肪酸プロファイルを、ＧＣ／ＦＩＤを用いて決定した。バイオマス中の脂肪酸は、３２．０ｍｇのバイオマスをＦＡＭＥ管に直接量り取ることによりインサイチュでエステル交換し、一方、抽出した粗脂質の試料は、６０．１ｍｇの粗脂質を５０ｍＬメスフラスコに量り取り、且つ１ｍｌを別のＦＡＭＥ管に移すことにより調製した。バイオマスの推定粗脂質含量は、ＦＩＤ検出によるＧＣを用いて５２．４％（ＦＡＭＥの合計として）と決定され、一方、乾燥バイオマスから４８．０％（ｗｔ／ｗｔ）の脂質が抽出され、９１．７％の総脂質回収率が得られた。粗脂質はＧＣ／ＦＩＤを用いて９５．３％脂肪酸（ＦＡＭＥの合計として）と決定された。粗脂質に含まれる主要な脂肪酸は、Ｃ１６：０（２１７．５ｍｇ／ｇ）、Ｃ２０：５ ｎ−３（１６９．３ｍｇ／ｇ）、およびＣ２２：６ ｎ−３（４４４．１ｍｇ／ｇ）であった。
[0333]抽出した粗脂質の脂質クラスプロファイルを、６０．１ｍｇの粗脂質を５０ｍＬメスフラスコに秤量し、且つアリコートをＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ／ＭＳ分析用のＨＰＬＣバイアルに移すことにより決定した。ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ／ＭＳ分析によれば、粗脂質は、０．２％のＳＥ、９５．７％のＴＡＧ、０．３％のステロール、および０．７％の１，２−ＤＡＧを含有した。ＴＡＧ画分の５．１％はＴＡＧピークのすぐ後に溶出したピークを含んだが、これは認識可能な質量スペクトルを提供しなかった。
[0334]この試料からの単離ＴＡＧは、粗油の約９３．９％を構成した。ＰＬはＳＰＥ分離後の重量またはＴＬＣによっては検出されなかった。ＴＡＧに含まれた主要な脂肪酸（＞５０ｍｇ／ｇ）は、Ｃ１６：０（２１８ｍｇ／ｇ）、Ｃ２０：５ ｎ−３（１６７ｍｇ／ｇ）およびＣ２２：６ ｎ−３（４３０ｍｇ／ｇ）であった。
［ＰＴＡ−１０２０８試料＃３］
[0335]ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８として寄託された微生物由来の粗油の試料（試料ＰＴＡ−１０２０８＃３）を、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ／ＭＳを用いて分析した。合計９８．３８％の脂質が回収され、ステロールエステル（ＳＥ）画分が０．３２％を占め、ＴＡＧ画分が９６．１３％を占め、１，３−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）画分が０．２２％を占め、１，２−ＤＡＧ画分が０．７８％を占め、およびステロール画分が０．９３％を占めた。
［ＰＴＡ−１０２１２試料＃１］
[0336]ＰＴＡ−１０２１２試料＃１についてのバイオマスおよび抽出した粗脂質の脂肪酸プロファイルを、ＧＣ／ＦＩＤを用いて決定した。バイオマス中の脂肪酸は、２７．０ｍｇのバイオマスをＦＡＭＥ管に直接量り取ることによりインサイチュでエステル交換し、一方、抽出した粗脂質の試料は、５２．５ｍｇの粗脂質を５０ｍＬメスフラスコに量り取り、且つ１ｍｌを別のＦＡＭＥ管に移すことにより調製した。バイオマスの推定粗脂質含量は、ＦＩＤ検出によるＧＣを用いて３８．３％（ＦＡＭＥの合計として）と決定され、一方、乾燥バイオマスから３６．３％（ｗｔ／ｗｔ）の脂質が抽出され、９４．６％の総脂質回収率が得られた。粗脂質はＧＣ／ＦＩＤを用いて８３．２％脂肪酸（ＦＡＭＥの合計として）と決定された。粗脂質に含まれる主要な脂肪酸は、Ｃ１６：０（３２８．５ｍｇ／ｇ）、Ｃ２０：５ ｎ−３（９０．０８ｍｇ／ｇ）、およびＣ２２：６ ｎ−３（２８９．３ｍｇ／ｇ）であった。
[0337]抽出した粗脂質の脂質クラスプロファイルを、５２．５ｍｇの粗脂質を５０ｍＬメスフラスコに秤量し、且つアリコートをＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ／ＭＳ分析用のＨＰＬＣバイアルに移すことにより決定した。ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ／ＭＳ分析によれば、粗脂質は、０．２％のＳＥ、６４．２％のＴＡＧ、１．９％のＦＦＡ、２．８％の１，３−ＤＡＧ、１．４％のステロール、１８．８％の１，２−ＤＡＧ、および０．５％のＭＡＧを含有した。ＴＡＧ画分の３．４％はＴＡＧピークのすぐ後に溶出したピークを含んだが、これは認識可能な質量スペクトルを提供しなかった。
[0338]この試料からの単離ＴＡＧは、粗油の約４９．８％を構成した。単離ＰＬは粗油の約８．１％を構成した。ＴＡＧ画分に含まれた主要な脂肪酸（＞５０ｍｇ／ｇ）は、Ｃ１６：０（４００ｍｇ／ｇ）、Ｃ２０：５ ｎ−３（９１ｍｇ／ｇ）、およびＣ２２：６ ｎ−３（２７３ｍｇ／ｇ）である。ＰＬ画分に含まれた主要な脂肪酸（＞５０ｍｇ／ｇ）は、Ｃ１６：０（９８ｍｇ／ｇ）、Ｃ２０：５ ｎ−３（３３ｍｇ／ｇ）、およびＣ２２：６ ｎ−３（２２７ｍｇ／ｇ）である。
［ＰＴＡ−１０２１２試料＃２］
[0339]バイオマスおよび抽出した粗脂質ＰＴＡ−１０２１２試料＃２の脂肪酸プロファイルを、ＧＣ／ＦＩＤを用いて決定した。バイオマス中の脂肪酸は、２９．５ｍｇのバイオマスをＦＡＭＥ管に直接量り取ることによりインサイチュでエステル交換し、一方、抽出した粗脂質の試料は、５６．５ｍｇの粗脂質を５０ｍＬメスフラスコに量り取り、且つ１ｍｌを別のＦＡＭＥ管に移すことにより調製した。バイオマスの推定粗脂質含量は、ＦＩＤ検出によるＧＣを用いて４０．０％（ＦＡＭＥの合計として）と決定され、一方、乾燥バイオマスから４１．３％（ｗｔ／ｗｔ）の脂質が抽出され、１０６．１％の総脂質回収率が得られた。粗脂質はＧＣ／ＦＩＤを用いて８２．８％脂肪酸（ＦＡＭＥの合計として）と決定された。粗脂質に含まれる主要な脂肪酸は、Ｃ１６：０（３２７．３ｍｇ／ｇ）、Ｃ２０：５ ｎ−３（９２．５ｍｇ／ｇ）、およびＣ２２：６ ｎ−３（２７７．６ｍｇ／ｇ）であった。
[0340]抽出した粗脂質の脂質クラスプロファイルを、５６．５ｍｇの粗脂質を５０ｍＬメスフラスコに秤量し、且つアリコートをＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ／ＭＳ分析用のＨＰＬＣバイアルに移すことにより決定した。ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ／ＭＳ分析によれば、粗脂質は、０．２％のＳＥ、５８．２％のＴＡＧ、２．３％のＦＦＡ、３．４％の１，３−ＤＡＧ、１．７％のステロール、２３．４％の１，２−ＤＡＧ、および０．６％のＭＡＧを含有した。ＴＡＧ画分の３．３％はＴＡＧピークのすぐ後に溶出したピークを含んだが、これは認識可能な質量スペクトルを提供しなかった。
[0341]この試料からの単離ＴＡＧは、粗油の約５１．９％を構成した。単離ＰＬは粗油の約８．８％を構成した。ＴＡＧ画分に含まれた主要な脂肪酸（＞５０ｍｇ／ｇ）は、Ｃ１６：０（４０２ｍｇ／ｇ）、Ｃ２０：５ ｎ−３（９２ｍｇ／ｇ）、およびＣ２２：６ ｎ−３（２４５ｍｇ／ｇ）である。ＰＬ画分に含まれた主要な脂肪酸（＞５０ｍｇ／ｇ）は、Ｃ１６：０（１２１ｍｇ／ｇ）、Ｃ２０：５ ｎ−３（４８ｍｇ／ｇ）、およびＣ２２：６ ｎ−３（２４６ｍｇ／ｇ）である。
Figure 2016163579
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Figure 2016163579
Figure 2016163579
Figure 2016163579
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［ＰＴＡ−１０２１２試料＃３］
[0342]ＰＴＡ−１０２１２試料＃３についてのバイオマスの脂質含量は、ＦＡＭＥ合計として３４％であると推定され、溶媒抽出後に得られた粗油の量は３７重量％であり、バイオマス中に存在する脂質の１０９％の回収率が得られた。フラッシュクロマトグラフィーを用いた分画後、粗油の約４６％がＴＡＧとして単離され、２８％がＤＡＧとして単離された。粗油は３０９ｍｇ／ｇのＤＨＡおよび２６４ｍｇ／ｇのＥＰＡを含有した。単離ＴＡＧは、３４１ｍｇ／ｇのＤＨＡおよび２７４ｍｇ／ｇのＥＰＡを含有した。単離ＤＡＧ画分は、２６２ｍｇ／ｇのＤＨＡおよび２３７ｍｇ／ｇのＥＰＡを含有した。バイオマス、抽出した粗油、および単離した画分の全脂肪酸プロファイルを、それぞれｍｇ／ｇおよび％ＦＡＭＥとして計算した以下の表３６および表３７に示す。
Figure 2016163579
Figure 2016163579
［ＰＴＡ−１０２１２試料＃４］
[0343]ＰＴＡ−１０２１２試料＃４は、ＦＡＭＥ合計として決定される約２３％の脂質を含有し、そのうち１０７％がヘキサン抽出を用いて回収された。フラッシュクロマトグラフィーを用いた分画後、粗油の約４２％がＴＡＧとして単離され、１８％がＤＡＧとして単離された。粗油は、２７５ｍｇ／ｇのＤＨＡおよび２０９ｍｇ／ｇのＥＰＡを含有した。単離ＴＡＧは２９６ｍｇ／ｇのＤＨＡおよび２０５ｍｇ／ｇのＥＰＡを含有した。単離ＤＡＧ画分は２４５ｍｇ／ｇのＤＨＡおよび２１９ｍｇ／ｇのＥＰＡを含有した。バイオマス、抽出した粗油、および単離した画分の全脂肪酸プロファイルを以下の表３８（ｍｇ／ｇ）および表３９（％ＦＡＭＥ）に示す。
Figure 2016163579
Figure 2016163579
［ＰＴＡ−１０２１２試料＃５］
[0344]ＰＴＡ−１０２１２のバイオマスからＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）法（ＧＥＡ Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ ＵＫ Ｌｔｄ．，Ｍｉｌｔｏｎ Ｋｅｙｎｅｓ，英国）を用いて粗油の試料を抽出し、微生物油ＰＴＡ−１０２１２試料＃５を得た。ＰＴＡ−１０２１２試料＃５から低圧フラッシュクロマトグラフィーを用いて個々の脂質クラスを単離し、各クラスの重量パーセントを決定した。各クラスの脂肪酸プロファイルを、ＧＣ−ＦＩＤを用いて決定した。
[0345]簡潔に言えば、２４０ｍｇの粗油を６００μＬのヘキサンに溶解してカラムのヘッドに適用することにより、試料を調製した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて試料を分画したところ、全ての画分の合計重量は２４０ｍｇであり、１００％の回収率が得られた。ステロールエステル画分が０．９％を占め、ＴＡＧ画分が４２．６％を占め、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）画分が１．３％を占め、ステロール画分が２．２％を占め、およびＤＡＧ画分が４１．６％を占めた。それぞれｍｇ／ｇおよび％ＦＡＭＥとして計算したＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）粗油および単離した画分の全脂肪酸プロファイルを、以下の表４０および表４１に示す。
Figure 2016163579
Figure 2016163579
［実施例３７］
[0346]粗油を、精製、脱色および脱臭によってさらに処理して精製油を得た。この精製油を高オレイン酸ヒマワリ油で希釈して、ＤＨＡ含量が約４００ｍｇ／ｇの最終油を得た。個々の脂質クラスを単離し、各クラスの脂肪酸プロファイルをＧＣ−ＦＩＤを用いてＦＡＭＥとして決定した。
［ＰＴＡ−１０２０８最終油］
[0347]単離したＴＡＧ画分（表４４〜表４５）および単離したステロール／ＤＡＧ画分（表４６〜表４７）に関連するプロファイルを含めた、ＰＴＡ−１０２０８最終油＃１〜５についての脂肪酸プロファイルを、表４２〜表４３に要約する。
[0348]最終油における個々の脂質クラスもまた、フラッシュクロマトグラフィー（表４８）およびＥＬＳＤによる順相ＨＰＬＣおよびＡＰＣＩ−ＭＳの確認（表４９）を用いて決定した。
Figure 2016163579
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Figure 2016163579
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Figure 2016163579
［ＰＴＡ−１０２１２最終油］
[0349]ＤＨＡはＰＴＡ−１０２１２最終油中に４１．６３％で３６６．９ｍｇ／ｇ存在し、一方、ＥＰＡは１６．５２％で存在した。個々の脂肪酸プロファイルを決定した。それを表５０に要約する。
Figure 2016163579
［実施例３８］
[0350]ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０２０８および１０２１２として寄託された単離微生物の２日経過した播種フラスコを、表３０および表３１による培地中の炭素および窒素供給培養物として調製した。
[0351]突然変異生成を以下の手順に従い実施した：
[0352]滅菌したＴ＝２日経過フラスコ、約５０ｍｌを、滅菌した４０ｍｌガラスホモジナイザーに注ぎ入れた。ホモジナイザーにおいて培養物に５０回のプランジを与えた。培養物をピペットで取り出し、滅菌５０ミクロンメッシュフィルターでろ過し、それを５０ｍｌ滅菌管に入れた（メッシュは、より小さい塊および単一の細胞を５０ミクロンメッシュに通過させる一方で、より大きいコロニー群を保持する手段として使用した）。濃縮された浸軟物の全体を滅菌５０ｍｌ管に回収した。浸軟した培養物をボルテックスし、最高１：１００倍レベルの希釈液を作製した。希釈した浸軟試料をボルテックスした後、４〜５個のガラスビーズ（３ｍｍガラスビーズ）が入った培地寒天プレート１００×１５ｍｍに２００μｌの播種材料を添加した。ビーズによって播種材料をプレート全体に均等に広げるようにして、各プレートを穏やかに撹拌した。ビーズをプレートから空け、プレートを、蓋をして約５分間静置し、乾燥させた。手順は薄暗い所で行うため、滅菌フードおよび隣接領域の双方の照明を消した。手順を実行可能とするための最小限の光は利用できたが、間接的な薄暗いもののみであった。
[0353]５枚の複製プレートをＸＬクロスリンカー（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の底に置き、試料を照射する間、蓋は外した。このクロスリンカーはマイクロジュール単位で出力を送り、９０％〜９５％死滅を達成するレベルを求めた。同じプロトコルを用いて５枚の複製対照プレートに突然変異を誘発されていない細胞を播種した。これらの細胞カウントを使用して％死滅を計算した。照射の終了後プレートを取り出し、蓋を交換し、プレートをパラフィルム（ｐａｒａｆｉｌｍ）で包み、続いてアルミニウム箔で包んだ。最初の週はプレートを暗所で増殖させることで、損傷した遺伝子を修復できないようにすることが不可欠であった。
[0354]プレートを２２．５℃の室内に約１０日置いてからコロニーを計数した。最終的な計数を行ったとき、個々のコロニーを滅菌した播種用ループで選び取り、新しい培地プレートに再度ストリークした。各コロニーを個々のプレートに植えた。プレートが密に増殖したところで播種用ループを使用して試料を採取し、５０ｍｌの培地が入った滅菌２５０ｍｌ振盪フラスコに播種した。このフラスコを２２．５℃の室内において２００ｒｐｍの振盪機に置いた。Ｔ＝７日目に振盪フラスコ培養物を５０ｍｌ滅菌管に回収した。ｐＨをとり、試料を遠心してバイオマスペレットを回収した。各試料をリンスし、イソプロピルアルコールと蒸留水との５０：５０混合物中に再懸濁した後、再度遠心した。回収したペレットを凍結乾燥して秤量し、ＦＡＭＥ分析を実施した。表５１および表５２のデータは、それぞれＰＴＡ−１０２０８株およびＰＴＡ−１０２１２株から上記の方法で産生した突然変異体を表す。
Figure 2016163579
Figure 2016163579
Figure 2016163579
Figure 2016163579
［実施例３９］
[0355]微生物細胞（シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））を含む２つの細胞ブロス（約１３．３ｋｇ）を２０リットル発酵槽において６０℃に加熱した。発酵槽は直径１５ｃｍの６ブレードラシュトン（Ｒｕｓｈｔｏｎ）インペラを２つ有した。上のインペラは１２リットル標線に位置し、下のインペラは上のインペラの１０ｃｍ下方に位置した。第１の細胞ブロスは３０７センチメートル／秒で連続撹拌した。第２の細胞ブロスは４６４センチメートル／秒で連続撹拌した。酵素（すなわち、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）２．４Ｌ ＦＧ ０．５％）を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を、最初に、溶解細胞組成物のｐＨが１０．４から１０．６になるまで塩基（ＮａＯＨ、５０％ｗ／ｗ溶液の２５０ｋｇ）で処理した。次に、塩（固形ＮａＣｌ、溶解細胞組成物の２重量％の量）を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を９０℃の温度に加熱し、２０時間にわたりその温度レベルに保持した。各細胞ブロスの試料を取り、ｐＨを８．０に調整して５０ｍｌ試験管に入れた。試験管を遠心し、油抽出データを計測した。油抽出データを表５３に提供する。
Figure 2016163579
[0356]表５３に提供するデータは、撹拌速度が高いほど、回収される油の質量が大きくなり、ブロスからの油の％収率が高くなり、および未処理の低温殺菌ブロスの固形分含量からの油の％収率が高くなることを示している。
［結論］
[0357]本明細書に記載される様々な実施形態または選択肢は全て、いかなる変形例にも組み合わせることができる。本発明は、そのいくつかの実施形態を参照して詳細に図示および記載されているが、当業者は、それらが単に例として、且つ限定としてではなく提示されているもので、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくそこに形態および詳細の様々な変更を加え得ることを理解するであろう。従って、本発明の広さおよび範囲は上述の例示的実施形態のいずれによっても限定されてはならず、以下の特許請求の範囲およびその均等物に従ってのみ定義されるべきである。
[0358]本明細書に引用される全ての文献は、学術誌論文または抄録、公開済みまたは対応する米国または外国の特許文献、発行済みのまたは外国の特許、または任意の他の文献を含めて、各々が、引用される文献中にある全てのデータ、表、図、およびテキストを含め、全体として参照により本明細書に援用される。

Claims (59)

  1. 微生物細胞組成物から脂質を得る方法であって、
    前記細胞組成物のｐＨを８以上に上昇させるステップと、
    前記細胞組成物から脂質を分離するステップと、
    を含み、前記脂質が５重量％未満の有機溶媒を含有する、方法。
  2. 前記ｐＨを上昇させるステップにより前記細胞組成物が溶解する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｐＨを上昇させるステップにより前記細胞組成物が解乳化する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記細胞組成物に塩を添加するステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記塩を添加するステップが前記ｐＨを上昇させるステップの後に行われる、請求項４に記載の方法。
  6. 前記細胞組成物を加熱するステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記加熱するステップが、前記ｐＨを上昇させるステップの後に行われる、請求項６に記載の方法。
  8. 前記細胞組成物のｐＨを２度目に上昇させるステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ｐＨを２度目に上昇させるステップが、前記塩を添加するステップまたは前記加熱するステップの後に行われる、請求項８に記載の方法。
  10. 細胞から脂質を得る方法であって、
    細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、
    前記溶解細胞組成物のｐＨを８以上に上昇させるステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップと、
    前記溶解細胞組成物に塩を添加するステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップと、
    前記解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップと、
    を含み、前記脂質が５重量％未満の有機溶媒を含有する、方法。
  11. 細胞組成物から脂質を得る方法であって、
    前記細胞組成物のｐＨを８以上に上昇させるステップであって、それにより前記細胞組成物を溶解し、且つ前記細胞組成物を解乳化するステップと、
    前記細胞組成物に塩を添加するステップと、
    前記解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップと、
    を含み、前記脂質が５重量％未満の有機溶媒を含有する、方法。
  12. 前記溶解細胞組成物を加熱するステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記加熱するステップが、前記塩を添加するステップの後に行われる、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記溶解細胞組成物を撹拌するステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記溶解細胞組成物のｐＨを上昇させるステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記溶解細胞組成物のｐＨを上昇させるステップが、前記塩を添加するステップまたは前記加熱するステップの後に行われる、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ｐＨを上昇させるステップが、塩基の添加を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記塩基が１〜１２のｐＫｂを有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. かき混ぜるか、混ぜ合わせるか、ブレンドするか、振盪するか、振動させるか、またはそれらの組み合わせにより、前記溶解細胞組成物を撹拌するステップを含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記溶解するステップが、機械的処理、物理的処理、化学的処理、酵素的処理、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記機械的処理がホモジナイゼーションである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記塩が前記溶解細胞組成物の０．１重量％〜２０重量％の量で添加される、請求項４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、硫酸塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記分離するステップが遠心を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 少なくとも５０重量％のトリグリセリドを含む脂質を提供する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. ２６以下のアニシジン価を有する脂質を提供する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記細胞が微生物細胞である、請求項１０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記微生物細胞を含む発酵ブロスを濃縮するステップをさらに含む、請求項１〜９および２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記細胞が油糧種子である、請求項１０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記油糧種子が、ヒマワリ種子、キャノーラ種子、菜種、亜麻仁、ヒマシ油種子、コエンドロ種子、キンセンカ種子、およびその遺伝子修飾変異体からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記細胞または細胞組成物を洗浄するステップをさらに含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記細胞または細胞組成物を低温殺菌するステップをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記溶解細胞組成物を濃縮するステップをさらに含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記脂質を精製するステップをさらに含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記精製するステップが、精製、脱ガム、酸処理、アルカリ処理、冷却、加熱、脱色、脱臭、脱酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記脂質を回収するステップをさらに含み、前記回収するステップが、撹拌なしに前記脂質をポンピングすることを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 細胞から脂質を得る方法であって、
    細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、
    前記細胞組成物を撹拌するステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップと、
    前記解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップと、
    を含み、前記脂質が５重量％未満の有機溶媒を含有する、方法。
  38. 前記撹拌するステップが、３５０センチメートル毎秒〜９００センチメートル毎秒の先端速度を有するインペラで前記細胞組成物を撹拌することを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法により得られる脂質。
  40. １つ以上の多価不飽和脂肪酸を含む、請求項３９に記載の脂質。
  41. 少なくとも３５重量％のドコサヘキサエン酸を含む、請求項３９または４０に記載の脂質。
  42. ３以下の全体的なアロマ強度を有する、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の脂質。
  43. ２以下の全体的な芳香強度を有する、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の脂質。
  44. ２６以下のアニシジン価を有する、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の脂質。
  45. １００ｐｐｍ以下のリン含量を有する、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の脂質。
  46. ５以下の過酸化物価を有する、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の脂質。
  47. 少なくとも２０重量％のエイコサペンタエン酸と、各５重量％未満のアラキドン酸、ドコサペンタエン酸ｎ−６、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコセン酸、エルカ酸、およびステアリドン酸とを含む、請求項３９に記載の脂質。
  48. 少なくとも１０重量％のトリアシルグリセロール画分を含み、前記トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも１２重量％がエイコサペンタエン酸であり、前記トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも２５重量％がドコサヘキサエン酸であり、および前記トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の５重量％未満がアラキドン酸である、請求項３９に記載の脂質。
  49. ５以下の過酸化物価を有する、請求項４７または４８に記載の脂質。
  50. 粗油である、請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の脂質。
  51. ２６以下のアニシジン価、５以下の過酸化物価、１００ｐｐｍ以下のリン含量、および５重量％未満の有機溶媒を有する粗微生物脂質。
  52. 少なくとも７０重量％のトリグリセリド画分を含む抽出微生物脂質であって、前記トリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量が少なくとも５０重量％であり、前記トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸ｎ−６含量が少なくとも０．５重量％〜６重量％であり、および前記油が２６以下のアニシジン価を有する、抽出微生物脂質。
  53. 少なくとも７０重量％のトリグリセリド画分を含む抽出微生物脂質であって、前記トリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量が少なくとも４０重量％であり、前記トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸ｎ−６含量が少なくとも０．５重量％〜６重量％であり、ドコサヘキサエン酸のドコサペンタエン酸ｎ−６との比が６：１より大きく、および前記油が２６以下のアニシジン価を有する、抽出微生物脂質。
  54. 少なくとも約７０重量％のトリグリセリド画分を含む抽出微生物脂質であって、前記トリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量が少なくとも６０重量％であり、および前記油が２６以下のアニシジン価を有する、抽出微生物脂質。
  55. 前記油が５以下の過酸化物価を有する、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の抽出微生物脂質。
  56. 前記油が１００ｐｐｍ以下のリン含量を有する、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の抽出微生物脂質。
  57. 前記脂質が粗油である、請求項５２〜５６のいずれか一項に記載の抽出微生物脂質。
  58. 脂質を得る方法であって、請求項５０、５１、または５７のいずれか一項に記載の粗脂質を精製するステップを含む方法。
  59. 前記精製するステップが、苛性精製、脱ガム、酸処理、アルカリ処理、脱色、脱臭、脱酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
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