BR112020019920A2

BR112020019920A2 - Método de redução de emulsão por lavagem de caldo

Info

Publication number: BR112020019920A2
Application number: BR112020019920-6A
Authority: BR
Inventors: Negash Adugna; Neil Leininger; Kirt Matthews Sr.; Ginger SHANK; Nasrin Tabayehnejad; Martin Heining; Vinod Tarwade; Michael Johnson
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.; Evonik Operations Gmbh
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2021-01-05
Also published as: EP3775118A4; WO2019191545A1; EP3775118A1; US20210017467A1; CN112004919A; CA3094704A1

Abstract

método de redução de emulsão por lavagem de caldo. são revelados no presente documento processos para reduzir ou eliminar a emulsão durante o processo de obtenção de um óleo microbiano que compreende um ou mais ácidos graxos poli-insaturados (pufas) de uma ou mais células microbianas por lavagem do caldo de fermentação com pelo menos 1x a quantidade de água. é adicionalmente descrito no presente documento um óleo microbiano que compreende um ou mais pufas que são recuperados de células microbianas por pelo menos um processo descrito no presente documento.

Description

“MÉTODO DE REDUÇÃO DE EMULSÃO POR LAVAGEM DE CALDO” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito dos Pedidos de Patente Norte-Americanos Provisórios nº 62/650.361 depositado em 30 de março de 2018 e 62/652.611 depositado 4 de abril de 2018, cujas revelações estão incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção se refere a um método de obtenção de ácidos graxos poli-insaturados contendo lipídios provenientes de uma biomassa contendo lipídio.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] São revelados no presente documento processos para obter um óleo microbiano que compreende um ou mais ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) de uma ou mais células microbianas. É adicionalmente descrito no presente documento um óleo microbiano que compreende um ou mais PUFAs que são recuperados de células microbianas por pelo menos um processo descrito no presente documento.

[0004] O óleo microbiano contendo um ou mais PUFAs é produzido por microrganismos, como, por exemplo, algas e fungos.

[0005] Um processo típico para obter óleo contendo PUFA de células microbianas envolve cultivar microrganismos que são capazes de produzir o óleo desejado em um fermentador, lagoa ou biorreator para produzir uma biomassa de célula microbiana; separar a biomassa do meio de fermentação em que a biomassa foi cultivada; secar a biomassa de célula microbiana, com o uso de um solvente orgânico imiscível em água (por exemplo, hexano) para extrair o óleo das células secas; e remover o solvente orgânico (por exemplo, hexano) do óleo.

[0006] Outro processo típico para obter óleo contendo PUFA de células microbianas envolve cultivar microrganismos que são capazes de produzir o óleo desejado em um fermentador, lagoa ou biorreator para produzir uma biomassa de célula microbiana; liberar o óleo contendo PUFA no meio de fermentação em que as células foram cultivadas com o uso de força mecânica (por exemplo, homogeneização), tratamento enzimático ou tratamento químico para romper as paredes celulares; e recuperar o óleo da composição resultante que compreende óleo contendo PUFA, debris celulares e líquido com o uso de um solvente orgânico miscível em água. O óleo pode ser separado mecanicamente da composição e o álcool deve ser removido tanto do óleo quanto da corrente de refugo de biomassa aquosa.

[0007] Mais recentemente, um terceiro método sem solvente foi desenvolvido para obter óleo contendo PUFA de células microbianas. O processo sem solvente para obter óleo contendo PUFA de células microbianas envolve cultivar microrganismos que são capazes de produzir o óleo desejado em um fermentador, lagoa ou biorreator para produzir uma biomassa de célula microbiana; liberar o óleo contendo PUFA no meio de fermentação em que as células foram cultivadas com o uso de força mecânica (por exemplo, homogeneização), tratamento enzimático ou tratamento químico para romper as paredes celulares; e recuperar óleo bruto da composição resultante que compreende óleo contendo PUFA, debris celulares e líquido elevando o pH, adicionando um sal, aquecendo e/ou agitando a composição resultante.

[0008] O processo sem solvente acima tem o benefício de dispensar o uso de uma grande quantidade de solvente orgânico volátil e inflamável. Esse método, no entanto, exige a ruptura da emulsão espessa que é gerada após a célula ter sido lisada e o óleo ter sido liberado e misturado com debris celulares e componentes de caldo de fermentação. Isso causa longos tempos de recuperação de óleo, uso de grandes quantidades de reagentes químicos (sal, ácidos, bases etc.) e/ou muitas etapas, todos podem aumentar os custos de processamento. Além disso, a formação de emulsão durante a etapa de lise celular reduz a eficiência do processo de extração de óleo e afeta diretamente o rendimento de extração desse processo.

[0009] Como resultado, há a necessidade de identificar as condições que são responsáveis pela formação da emulsão e influenciam a qualidade do óleo, a separação e a eficiência geral do processo. Um sucesso na identificação dessas condições pode resultar na redução ou mesmo eliminação de emulsão, minimizando, desse modo, o número de etapas da extração de óleo, encurtando os períodos de recuperação de óleo e auxiliando a fornecer um alto rendimento de óleo contendo PUFA de qualidade superior.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada a um processo para obter um óleo microbiano que compreende um ou mais ácidos poli-insaturados de uma ou mais células microbianas em um caldo de fermentação, em que o processo compreende:

(a) diluir o caldo de fermentação com pelo menos 1X a quantidade de água; (b) separar as células do caldo de fermentação; (c) submeter à lise as células que compreendem o óleo microbiano para formar uma composição celular lisada; (d) desemulsificar a composição celular lisada para formar uma composição celular lisada desemulsificada; (e) separar o óleo da composição celular lisada desemulsificada; e (f) recuperar o óleo.

[0011] Em uma modalidade, na etapa (a), o caldo de fermentação é diluído com uma quantidade de água entre 1X e 4X. Em uma outra modalidade, a etapa (b) pode ser realizada por centrifugação.

[0012] Em uma modalidade, as células microbianas são capazes de produzir pelo menos cerca de 10 % em peso, pelo menos cerca de 20 % em peso, preferencialmente pelo menos cerca de 30 % em peso, more preferencialmente pelo menos cerca de 40 % em peso de sua biomassa como lipídios. Em uma modalidade, os lipídios poli-insaturados compreendem um ou qualquer combinação de DHA, EPA e ARA.

[0013] Em uma modalidade, as células microbianas são de algas, fungos, protistas, bactérias, microalgas e misturas dos mesmos. Em uma outra modalidade, as células microbianas são do gênero Mortierella, gênero Crypthecodinium, ou ordem Thraustochytriales. Em outra modalidade, as células microbianas são do gênero Thraustochytrium, Schizochytrium ou misturas dos mesmos. Em uma outra modalidade, as células microbianas são de Mortierella Alpina.

[0014] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada a um processo para obter um óleo microbiano que compreende um ou mais ácidos poli-insaturados do caldo de fermentação compreendendo uma ou mais células microbianas, em que o caldo de fermentação é diluído com pelo menos 1X a quantidade de água antes das células serem separadas do caldo de fermentação e lisadas para liberar o óleo microbiano. Em uma modalidade específica, o caldo de fermentação é diluído com uma quantidade de água entre 1X e 4X.

BREVE SUMÁRIO DOS DESENHOS

[0015] A Fig. 1 é um diagrama que ilustra o projeto experimental para examinar a influência de lavagem de caldo em formação de emulsão/separação de fase durante processo a jusante (DSP).

[0016] A Fig. 2 mostra as diferenças significativas na quantidade de proteína e carboidratos entre uma amostra de caldo não lavada e uma amostra lavada.

[0017] A Fig. 3 mostra a distribuição de gordura que foi recuperada da fase de óleo, a partir da fase de emulsão, e perdida na fase pesada em uma amostra de caldo não lavada e uma amostra lavada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0018] As características e vantagens da invenção podem ser mais prontamente entendidas por técnicos no assunto ao ler a seguinte descrição detalhada. Deve ser observado que determinadas características da invenção que são, para fins de clareza, conforme usado no presente documento acima e abaixo no contexto de modalidades separadas, também podem ser combinadas para formar subcombinações das mesmas.

[0019] As modalidades identificadas aqui como exemplares se destinam a ser ilustrativas e não limitantes.

[0020] É revelado no presente documento um processo para obter um óleo microbiano que compreende um ou mais ácidos poli-insaturados de uma ou mais células microbianas em um caldo de fermentação, em que o processo compreende: (a) diluir o caldo de fermentação com pelo menos 1X a quantidade de água; (b) separar as células do caldo de fermentação; (c) submeter à lise as células que compreendem o óleo microbiano para formar uma composição celular lisada; (d) desemulsificar a composição celular lisada para formar uma composição celular lisada desemulsificada; (e) separar o óleo da composição celular lisada desemulsificada; e (f) recuperar o óleo.

[0021] Uma vantagem específica do processo descrito na presente invenção é que a formação de emulsão é significativamente reduzida ou eliminada pela lavagem das células microbianas coletadas com água destilada. Embora não desejando estar limitado por qualquer teoria específica, os inventores do presente pedido acreditam que lavar as células microbianas coletadas ajuda a remover um ou mais componentes do meio de fermentação que causam a emulsão. Esses componentes incluem, mas não estão limitados a carboidratos simples, oligo- e polissacarídeos, proteínas e complexos dos mesmos. Foi muito surpreendente, de acordo com a presente invenção, descobrir que apenas a lavagem das células coletadas com água destilada reduz significativamente o grau de emulsão.

[0022] O nível preferido de lavagem do caldo foi identificado na presente invenção. Em uma modalidade, o caldo de fermentação é diluído com ao menos 1X a quantidade de água. 1X significa que a água adicionada é 1 vez, ou o mesmo volume, do caldo de fermentação a ser diluído. Em outra modalidade, o caldo de fermentação é diluído com mais de 1X a quantidade de água, que pode ser pelo menos 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X ou 10X a quantidade de água. Em uma outra modalidade, o caldo de fermentação é diluído com uma quantidade de água entre 1X e 4X. Em uma outra modalidade, o caldo de fermentação é diluído com uma quantidade de água entre 1X e 10X. A célula é subsequentemente separada do caldo de fermentação diluído e lisada para liberar o óleo.

[0023] Em outra modalidade, a célula é lavada mais de uma vez. Em uma modalidade, o caldo de fermentação é diluído com pelo menos 1X a quantidade de água e as células no caldo de fermentação são separadas da porção líquida do caldo de fermentação e ressuspensas em pelo menos 1X a quantidade de água e, opcionalmente, essas etapas são repetidas por mais de uma vez. Em uma outra modalidade, as células no caldo de fermentação são separadas da porção líquida do caldo de fermentação e ressuspensas em pelo menos 1X a quantidade de água e, opcionalmente, essas etapas são repetidas por mais de uma vez.

[0024] Além do método acima, qualquer método que é conhecido para reduzir a concentração dos vários componentes no caldo de fermentação, seja por meios mecânicos, meios químicos, meios físicos e uma combinação dos mesmos, pode ser usado por esta invenção.

[0025] Também é revelado no presente documento um óleo microbiano obtido por qualquer um dos processos descritos no presente documento.

[0026] O óleo microbiano descrito no presente documento se refere ao óleo que compreende um ou mais PUFAs e é obtido a partir de células microbianas.

[0027] Os ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) são classificados com base na posição da primeira ligação dupla a partir da extremidade metílica do ácido graxo; os ácidos graxos ômega-3 (n-3) contêm uma primeira ligação dupla no terceiro carbono, ao passo que os ácidos graxos ômega-6 (n- 6) contêm uma primeira ligação dupla no sexto carbono. Por exemplo, o ácido docosa-hexaenoico (DHA) é um ácido graxo poli-insaturado ômega-3 de cadeia longa (LC-PUFA) com um comprimento de cadeia de 22 carbonos e 6 ligações duplas, geralmente denominados como “22:6n-3”. Em uma modalidade, o AGPI é selecionado a partir de um ácido graxo ômega-3, um ácido graxo omega-6 e misturas destes. Em uma outra modalidade, o PUFA é selecionado entre LC-PUFAs. Ainda em uma modalidade adicional, o PUFA é selecionado a partir de ácido docosa-hexaenoico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido araquidônico (ARA), ácido gama-linolênico (GLA), ácido di-homo-gama- linolênico (DGLA), ácido estearidônico (SDA), e misturas destes. Em uma outra modalidade, o PUFA é selecionado entre DHA, ARA, e misturas destes. Em uma modalidade adicional, o PUFA é DHA. Em uma modalidade adicional, o PUFA é EPA. Ainda em uma modalidade adicional, o PUFA é ARA.

[0028] Os LC-PUFAs são ácidos graxos que contêm pelo menos 3 ligações duplas e têm um comprimento de cadeia de 18 ou mais carbonos ou 20 ou mais carbonos. Os LC-PUFAs da série ômega-6 incluem, mas não se limitam a ácido di-homo-

gamalinoleico (C20:3n-6), ácido araquidônico (C20:4n-6), ácido docosatetraenoico ou ácido adrênico (C22:4n-6) e ácido docosapentaenoico (C22:5n-6). Os LC-PUFAs da série ômega-3 incluem, mas não se limitam a ácido eicosatrienoico (C20:3n-3), ácido eicosatetraenoico (C20:4n-3), ácido eicosapentaenoico (C20:5n-3), ácido docosapentaenoico (C22:5n-3) e ácido docosa-hexaenoico (C22:6n-3). Os LC- PUFAs também incluem ácidos graxos com mais que 22 carbonos e 4 ou mais ligações duplas incluindo, mas não limitado a C24:6(n-3) e C28:8(n-3).

[0029] Os PUFAs podem estar na forma de um ácido graxo livre, sal, éster de ácido graxo (por exemplo, éster metílico ou etílico), monoacilglicerol (MAG), diacilglicerol (DAG), triacilglicerol (TAG) e/ou fosfolipídio (PL).

[0030] Os ácidos graxos altamente insaturados (HUFAs) são ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 e/ou ômega-6 que contêm 4 ou mais ligações insaturadas carbono-carbono.

[0031] Como usada no presente documento, uma “célula” se refere a um biomaterial contendo óleo, tal como, biomaterial derivado de microrganismos oleaginosos. O óleo produzido por um microrganismo ou obtido a partir de uma célula microbiana é referido como “óleo microbiano”. O óleo produzido por algas e/ou fungos é também denominado óleo de alga e/ou fúngico, respectivamente.

[0032] Como usada no presente documento, uma “célula microbiana” ou “microrganismo” se refere a organismos como algas, bactérias, fungos, levedura, protista, e combinações destes, por exemplo, organismos unicelulares. Em algumas modalidades, a célula microbiana é uma célula eucariótica.

Uma célula microbiana inclui, mas não está limitada a algas douradas (ou seja, microrganismos do reino Stramenopiles); algas verdes; diatomáceas; dinoflagelados (por exemplo, microrganismos da ordem Dinophyceae incluindo membros do gênero Crypthecodinium como, por exemplo, Crypthecodinium cohnii ou C. cohnii); microalgas da ordem Thraustochytriales; leveduras (Ascomicetes ou Basidiomicetes); e fungos do gênero Mucor, Mortierella, incluindo, porém sem limitação, Mortierella alpina e Mortierella sect. schmuckeri, e Pythium, incluindo, porém sem limitação, Pythium insidiosum.

[0033] Em uma modalidade, as células microbianas são do gênero Mortierella, gênero Crypthecodinium, ou ordem Thraustochytriales. Ainda em uma modalidade adicional, as células microbianas são de Crypthecodinium Cohnii. Ainda em uma outra modalidade adicional, as células microbianas são selecionadas entre Crypthecodinium Cohnii, Mortierella alpina, gênero Thraustochytrium, gênero Schizochytrium, e misturas destes.

[0034] Ainda em uma modalidade adicional, as células microbianas incluem, mas não se limitam a microrganismos que pertencem ao gênero Mortierella, gênero Conidiobolus, gênero Pythium, gênero Phytophthora, gênero Penicillium, gênero Cladosporium, gênero Mucor, gênero Fusarium, gênero Aspergillus, gênero Rhodotorula, gênero Entomophthora, gênero Echinosporangium e gênero Saprolegnia. Em uma outra modalidade, o ARA é obtido de células microbianas do gênero Mortierella, que inclui, mas não está limitado a Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella alpina, Mortierella schmuckeri, e

Mortierella minutissima.

[0035] Ainda em uma outra modalidade adicional, as células microbianas são provenientes de microalgas da ordem Thraustochytriales, que incluem, mas não estão limitadas aos gêneros Thraustochytrium (as espécies incluem arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kinnei, motivum, multirudimentale, pachydermum, proliferum, roseum, striatum); aos gêneros Schizochytrium (as espécies incluem aggregatum, limnaceum, mangrovei, minutum, octosporum); aos gêneros Ulkenia (as espécies incluem amoeboidea, kerguelensis, minuta, profunda, radiate, sailens, sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis); aos gêneros Aurantiacochytrium; aos gêneros Oblongichytrium; aos gêneros Sicyoidochytium; aos gêneros Parientichytrium; aos gêneros Botryochytrium; e combinações destes. As espécies descritas em Ulkenia serão consideradas como membros do gênero Schizochytrium. Em uma outra modalidade, as células microbianas são da ordem Thraustochytriales. Ainda em uma modalidade adicional, as células microbianas são de Thraustochytrium. Ainda em uma outra modalidade adicional, as células microbianas são de Schizochytrium. Ainda em uma modalidade adicional, as células microbianas são escolhidas a partir dos gêneros Thraustochytrium, Schizochytrium, ou misturas destes.

[0036] Em uma modalidade, o processo compreende submeter à lise células microbianas que compreendem um óleo microbiano para formar uma composição celular lisada. Os termos “lise” e “submeter à lise” se referem a um processo por meio do qual a parede e/ou membrana da célula microbiana é rompida. Em uma modalidade, a célula microbiana é lisada ao ser submetida a pelo menos um tratamento selecionado entre mecânico, químico, enzimático, físico, e combinações destes. Em uma outra modalidade, o processo compreende a lise das células microbianas compreendendo o óleo microbiano para formar uma composição de células lisadas, em que a lise é selecionada a partir de tratamento mecânico, químico, enzimático, físico, e combinações destes.

[0037] Como usada no presente documento, uma “composição de células lisadas” se refere a uma composição compreendendo um ou mais células lisadas, incluindo debris celulares e outros conteúdos da célula, em combinação com óleo microbiano (proveniente das células lisadas) e, opcionalmente, um caldo de fermentação que contém líquido (por exemplo, água), nutrientes, e células microbianas. Em algumas modalidades, uma célula microbiana é contida em um caldo de fermentação ou meios que compreendem água. Em algumas modalidades, uma composição celular lisada se refere a uma composição que compreende uma ou mais células lisadas, debris celulares, óleo microbiano, o conteúdo natural da célula e componentes aquosos de um caldo de fermentação. Em uma modalidade, a composição de células lisadas compreende líquido, debris celulares e óleo microbiano. Em algumas modalidades, uma composição de células lisadas está na forma de uma emulsão de óleo em água compreendendo uma mistura de uma fase aquosa contínua e uma fase de óleo dispersa.

[0038] Em geral, os processos descritos no presente documento podem ser aplicados em quaisquer células microbianas contendo lipídio em que a emulsão pode ser formada durante o processo de extração de lipídios. Em uma modalidade, as células microbianas são selecionadas a partir de algas, fungos, protistas, bactérias, microalgas e misturas dos mesmos. Em outra modalidade, as microalgas são selecionadas a partir do filo Stramenopiles, em particular da família de Thraustochytrids, preferencialmente do gênero Schizochytrium. Em outra modalidade, as células microbianas descritas no presente documento são capazes de produzir pelo menos cerca de 10 % em peso, pelo menos cerca de 20 % em peso, preferencialmente pelo menos cerca de 30 % em peso, more preferencialmente pelo menos cerca de 40 % em peso de sua biomassa como lipídios. Em outra modalidade, os lipídios poli-insaturados compreendem um ou qualquer combinação de DHA, EPA, e ARA.

EXEMPLOS Exemplo 1

[0039] Nesse exemplo, o impacto de uma etapa de lavagem do caldo celular adicional na formação de emulsão/separação de fase foi examinado.

[0040] O projeto experimental é mostrado na Figura 1. Em um experimento de controle, um caldo de células não pasteurizado contendo células microbianas foi pasteurizado e submetido a um processo subsequente a jusante sem ser submetido a qualquer etapa de lavagem. Em um experimento de caldo lavado, o caldo de células não pasteurizadas contendo células microbianas foi primeiro lavado com água destilada, antes de ser pasteurizado e submetido a um processo subsequente a jusante. Teste 1A - Experimento de caldo não lavado

[0041] Neste experimento de controle, um caldo celular não lavado contendo células microbianas (Schizochytrium sp.) a uma densidade de biomassa de mais de 100 g/l foi aquecido a 60 °C por 1 horas em um vaso de fundo redondo de fundo redondo de 3 gargalos agitado para pasteurização.

Após a pasteurização, uma amostra foi coletada e analisada em relação ao seu teor de proteína e carboidrato.

O resultado é mostrado na Fig. 2. Para o caldo de pasteurização restante, o pH foi ajustado a 7,5 com o uso de soda cáustica (20 % em peso de solução de NaOH), antes que uma enzima protease (produto da Novozymes 37071) fosse adicionada em forma líquida em uma quantidade de 0,15 % em peso (em peso de caldo). A agitação foi continuada por 2 horas a 60 °C.

Em seguida, a mistura celular lisada foi aquecida a uma temperatura de 90 °C.

A mistura foi concentrada por evaporação de água do caldo lisado, até que um teor total de matéria seca de cerca de 36,6 % em peso fosse alcançado.

O caldo concentrado foi então desemulsificado alterando o pH para 10,5 com a adição de soda cáustica (20 % em peso de solução de NaOH). A quantidade total de soda cáustica era de cerca de 5,96 % em peso (com base na quantidade de peso de caldo inicial) adicionada no início da desemulsificação, assegurando que o pH estivesse sempre abaixo de 10,5. Após 24 horas, o caldo desemulsificado foi neutralizado a um pH 7,5 pela adição de solução de ácido sulfúrico (3N). Após a neutralização, cerca de 250 g da amostra de caldo homogeneizado foram tomados e a separação dos debris celulares foi realizada por centrifugação a 4500 rpm por 15 min.

As distribuições de gordura percentuais dos óleos que foram recuperados da fase oleosa, recuperados da fase de emulsão e perdidos na fase pesada foram medidas. O resultado é mostrado na Fig. 3. Teste 1B - Experimento de caldo lavado

[0042] Neste experimento, um caldo de células não pasteurizado foi diluído com água destilada (proporção caldo: água destilada foi de 1:3). Esta mistura foi agitada vigorosamente e depois centrifugada. O sobrenadante (lavagem com água) foi separado das células.

[0043] O caldo celular lavado contendo células microbianas (Schizochytrium sp.) a uma densidade de biomassa de mais de 100 g/l foi aquecido a 60 °C por 1 horas em um vaso de fundo redondo de 3 gargalos agitado para pasteurização. Após a pasteurização, uma amostra foi coletada e analisada em relação ao seu teor de proteína e carboidrato. O resultado é mostrado na Fig. 2. Para o caldo de pasteurização restante, o pH foi ajustado a 7,5 com o uso de soda cáustica (20 % em peso de solução de NaOH), antes que uma enzima protease (produto da Novozymes 37071) fosse adicionada em forma líquida em uma quantidade de 0,15 % em peso (em peso de caldo). A agitação continuou durante 2 horas a 60 °C. Depois disso, a mistura de células lisadas foi aquecida a uma temperatura de 90 °C. A mistura foi concentrada por evaporação da água do caldo lisado, até ser alcançado um teor de matéria seca total de cerca de 35,7 % em peso. O caldo concentrado foi então desemulsificado alterando o pH para 10,5 com a adição de soda cáustica (20 % em peso de solução de NaOH). A quantidade total de soda cáustica foi de cerca de 3,87% em peso (com base na quantidade de peso inicial do caldo) adicionada no início da desemulsificação, garantindo que o pH estivesse sempre abaixo de 10,5. Após 24 horas, o caldo desemulsificado foi neutralizado a um pH 7,5 pela adição de solução de ácido sulfúrico (3N). Após a neutralização, cerca de 250 g da amostra de caldo homogeneizado foram tomados e a separação dos debris celulares foi realizada por centrifugação a 4500 rpm por 15 min.

As distribuições de gordura percentuais dos óleos que foram recuperados da fase oleosa, recuperados da fase de emulsão e perdidos na fase pesada foram medidas.

O resultado é mostrado na Fig. 3.

Claims

REIVINDICAÇÕES EMENDADAS

1. Processo para obter um óleo microbiano que compreende um ou mais ácidos poli-insaturados de uma ou mais células microbianas em um caldo de fermentação, sendo o processo caracterizado por compreender: (a) diluir o caldo de fermentação com pelo menos 1X a quantidade de água; (b) separar as células do caldo de fermentação; (c) submeter à lise as células que compreendem o óleo microbiano para formar uma composição celular lisada; (d) desemulsificar a composição celular lisada para formar uma composição celular lisada desemulsificada; (e) separar o óleo da composição celular lisada desemulsificada; e (f) recuperar o óleo.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa (a), o caldo de fermentação é diluído com uma quantidade de água entre 1X e 4X.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada por centrifugação.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as células microbianas são capazes de produzir pelo menos cerca de 10 % em peso, pelo menos cerca de 20 % em peso, preferencialmente pelo menos cerca de 30 % em peso, mais preferencialmente pelo menos cerca de 40 % em peso de sua biomassa como lipídios.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de os ditos lipídios poli-

insaturados compreendem um ou qualquer combinação de DHA, EPA e ARA.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as células microbianas são de algas, fungos, protistas, bactérias, microalgas e misturas dos mesmos.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as células microbianas são do gênero Mortierella, gênero Crypthecodinium ou ordem Thraustochytriales.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as células microbianas são da ordem Thraustochytriales.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as células microbianas são do gênero Thraustochytrium, Schizochytrium ou misturas dos mesmos.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as células microbianas são de Mortierella Alpina.

11. Óleo caracterizado por ser obtido por meio de processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

12. Processo caracterizado por ser para obter um óleo microbiano que compreende um ou mais ácidos poli-insaturados do caldo de fermentação compreendendo uma ou mais células microbianas, em que o caldo de fermentação é diluído com pelo menos 1X a quantidade de água antes das células serem separadas do caldo de fermentação e lisadas para liberar o óleo microbiano.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o caldo de fermentação é diluído com uma quantidade de água entre 1X e 4X.