PT1252324E - Processo de extracção sem solvente - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO DE EXTRACÇÃO SEM SOLVENTE"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a um processo para a extracção de lipidos de microrganismos sem a utilização de qualquer quantidade significativa de um solvente orgânico não polar.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Um processo tipico de produção de lipidos de microrganismos, tal como a produção de ácidos gordos ómega-3 altamente insaturados, em particular, uma mistura de lipidos rica em ácido docosa-hexaenóico (dha), envolve o crescimento de microrganismos que são capazes de produzir o lipido desejado num fermentador, bacia ou biorreactor, isolamento da biomassa microbiana, a sua secagem, a extracção dos lipidos intracelulares com um solvente orgânico não polar, e. g., hexano. Geralmente, os lipidos intracelulares de microrganismos são extraídos após ruptura (i. e., lise) de células secas dos microrganismos. Os lipidos extraídos podem ser ainda mais refinados, para produzir lipidos de pureza e/ou qualidade elevada. Os microrganismos são geralmente isolados diluindo primeiro o caldo de fermentação com água e centrifugando a mistura para isolar os microrganismos. As células são, depois, secas e se os lipidos não forem extraídos imediatamente ou pouco 1 depois, as células são embaladas, por exemplo, em sacos selados em vácuo, para impedir a degradação dos lipidos.

Infelizmente, o processo de secagem expõe os microrganismos ao calor, que pode danificar, i. e., degradar, a qualidade dos lipidos, se for feito de modo incorrecto. Os sacos selados em vácuo podem desenvolver fugas o que pode degradar mais ainda a qualidade dos lipidos, devido a exposição dos microrganismos ao ar. Além disso, se os microrganismos secos não forem tratados com um anti-oxidante, os lipidos podem ser adicionalmente degradados devido à exposição ao ar e/ou à luz. Por exemplo, os carotenóides, xantofilas e ácidos gordos de cadeia longa, como o DHA, podem degradar-se devido a oxidação pelo ar e/ou luz. Além disso, em alguns casos os operadores que estão expostos a microrganismos secos podem desenvolver uma reacção alérgica, o que constitui um risco de segurança e/ou risco para a saúde dos operadores.

Além disso, numa produção em escala industrial, a grande quantidade de solvente orgânico não polar, volátil e inflamável, utilizado na extracção de lipidos pode criar condições de operação perigosas. A utilização de solvente orgânico não polar no processo de extracção pode necessitar da utilização de um sistema de recuperação de óleos à prova de explosão, aumentando o custo de recuperação dos lipidos. Além disso, a utilização de um solvente orgânico não polar na extracção de lipidos de microrganismos gera uma corrente de resíduos de solvente orgânico não polar que requer um método de eliminação adequado, o que aumenta, ainda mais, os custos globais de produção da extracção de lipidos.

Consequentemente, há necessidade de um processo para 2 extracção de lípidos de microrganismos que não requeira a utilização de um solvente orgânico não polar. Há também uma necessidade de um processo de extracção de lípidos de microrganismos que não requeira o passo caro de secagem dos microrganismos antes da extracção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção é como descrita nas reivindicações. Divulga-se um processo para obtenção de lípidos de microrganismos compreendendo: (a) lise de células dos microrganismos para produzir uma mistura de células lisadas; (b) tratamento da mistura de células lisadas para produzir uma mistura de fases separadas, compreendendo uma camada pesada e uma camada leve rica em lípidos; (c) separação da camada pesada da camada leve rica em lípidos; e (d) obtenção do lípido e/ou fracções de lípidos a partir da camada leve. É ainda divulgado um processo para a obtenção de lípidos de microrganismos compreendendo: (a) fazer crescer os microrganismos num meio de cultura; (b) tratar o referido meio de cultura e as células do 3 microrganismo para libertar lipidos intercelulares; (c) submeter o meio de cultura contendo os lipidos intercelulares libertados a separação por gravidade para formar uma fase leve contendo lipidos e uma fase pesada; (d) separar a referida fase leve da referida fase pesada; (e) tratar a referida fase leve para quebrar uma emulsão formada entre o referido lípido e água; e (f) recuperar um lipido em bruto. É ainda divulgado um processo para a recuperação de lipidos de microrganismos que compreende os passos de: (a) fazer crescer os referidos microrganismos num meio de cultura; (b) tratar as células de microrganismos do referido meio de cultura, sem secagem das referidas células, para libertar lipidos intercelulares; (c) submeter o meio de cultura contendo lipidos intercelulares libertados a separação por gravidade, para formar uma fase leve contendo lipidos e uma fase pesada; (d) separar a referida fase leve da referida fase pesada; (e) tratar a referida fase leve para quebrar uma emulsão formada entre o referido lipido e água; e 4 (f) recuperar um lípido em bruto.

De um modo preferido, os microrganismos são cultivados num meio de fermentação num fermentador. Alternativamente, os microrganismos podem ser cultivadas fotossinteticamente, num fotobiorreactor ou lagoa. De um modo preferido, os microrganismos são microrganismos ricos em lipidos, de um modo mais preferido, os microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em algas, bactérias, fungos e protistas e, de um modo mais preferido, os microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em algas douradas, algas verdes, dinoflagelados, leveduras, fungos do género Mortierella, e Stramenopiles. De um modo preferido, os microrganismos incluem microrganismos do género Mortierella, género Crypthecodinium, e ordem Thraustochytriales, e de um modo mais preferido, os microrganismos são seleccionados do género Thraustochytrium, Schizochytrium e as suas misturas, de um modo mais preferido os microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em microrganismos que têm as caracteristicas identificadoras de ATCC número 20888, ATCC número 20889, ATCC número 20890, ATCC número 20891 e ATCC número 20892, estirpes de Mortierella schmuckerii, estirpes de Crypthecodinium cohnii, estirpes mutantes derivadas de qualquer das anteriores e as suas misturas. O tratamento das células inclui um tratamento para libertar os lipidos, tais como lise, ruptura ou permeabilização. Como aqui utilizados, os termos lisar, lise, lisadas, etc., vão ser utilizados genericamente para referir um tratamento para a libertação de lipidos intercelulares, incluindo a ruptura ou permeabilização das células. De um modo preferido, o tratamento é seleccionado do grupo consistindo em aquecimento das células, 5 exposição das células a condições básicas, exposição das células a um composto quelante ou as suas combinações. De um modo mais preferido, a lise ou ruptura das células compreende o aquecimento das células a, pelo menos, 50 °C enquanto se expões as células a condições básicas, um composto quelante ou as suas misturas.

De um modo preferido, a separação por gravidade compreende passar o caldo de fermentação contendo os lipidos intercelulares libertados através de uma centrífuga, tal como centrífugas do tipo de pilha de discos, separador ou decantador. A mistura de células Usadas separada compreende uma camada pesada que compreende uma solução aquosa que contém os materiais sólidos resultantes de células lisadas e uma camada leve que contém lipidos. As camadas leve e pesada podem ser separadas por centrifugação. Os lipidos podem estar presentes num estado emulsionado. A camada leve pode ser, ainda, lavada com uma solução aquosa de lavagem até o lípido ficar substancialmente não emulsionado. De um modo preferido, o tratamento para quebrar a emulsão compreende misturar a emulsão com água, álcool, acetona ou as suas misturas e submeter a mistura a separação por gravidade. De um modo preferido, o processo é realizado sem utilização de solventes orgânicos não polares, tais como hexano.

Quando o processo de extracção de lipidos da presente invenção inclui a utilização de microrganismos de um processo de fermentação, o processo de extracção também pode incluir a solubilização de, pelo menos, parte de compostos proteináceos de um caldo de fermentação por adição de uma base seleccionada do grupo que consiste em hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos, 6 fosfatos e as suas misturas. 0 processo da presente invenção também pode incluir o aquecimento do microrganismos a uma temperatura de, pelo menos, cerca de 50 °C. De um modo preferido, um composto químico, tal como uma base, é adicionado ao meio de cultura para auxiliar na lise das células.

Como uma alternativa ao aquecimento, as células podem ser lisadas com a ajuda de um composto quelante, tal como edta. Além de ajudar na lise ou ruptura das células, os quelantes ajudam na prevenção da oxidação dos lipidos durante o processamento por quelação com (ligação a) iões metálicos produtores de radicais livres no caldo de fermentação, tais como ferro ou cobre. As formas preferidas de quelantes são as que são consideradas de qualidade alimentar ou GRAS (Geralmente Reconhecido Como Seguro). Os compostos quelantes eficazes incluem EDTA, ácido cítrico ou citrato, ácido láctico, fosfato trissódico, polifosfato, hexametafosfato, EGTA, DTPA, ácido fitico, ou CDTA e outras formas de sais destes compostos. Numa forma de realização, o EDTA de sódio é adicionado às células para degradar as paredes celulares por quelação dos catiões divalentes que ajudam a manter as paredes celulares. O processo pode ser realizado a temperaturas mais elevadas com menos EDTA ou a temperaturas mais baixas com concentrações mais elevadas de EDTA. Por exemplo, verificou-se que células de Schizochytrium sp. ricas em EDTA podem ser permeabilizadas e/ou sofrer ruptura por adição de EDTA às culturas no final do processo de fermentação. É necessária uma concentração de 10000 ppm para ajudar na ruptura das células a 30 °C, uma concentração de 5000 ppm a 50 °C e a temperaturas acima de 70 °C são eficazes concentrações inferiores a 1000 ppm. Podem ser adicionados 7 quelantes ao caldo de fermentação para tornar as células mais fáceis de quebrar por processos físicos, tal como a homogeneização. Além de um agente quelante, também pode ser adicionada água para aumentar a pressão osmótica interna de modo a lisar as células.

De um modo preferido, os microrganismos são capazes de crescimento a um nível de salinidade inferior a cerca de 12 g/L de cloreto de sódio, de um modo mais preferido, inferior a cerca de 5 g/L de cloreto de sódio e, de um modo ainda mais preferido, inferior a cerca de 3 g/L de cloreto de sódio. De um modo preferido, os microrganismos são capazes de crescer a níveis de salinidade inferiores a cerca de 7 g/L de sódio e inferiores a cerca de 250 mg/L de cloreto. De um modo preferido, o cloreto está presente numa quantidade de cerca de 70 a cerca de 150 mg/L.

De um modo preferido, os microrganismos compreendem, pelo menos, cerca de 20% em peso de lípido, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 30% em peso e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 40%. Alternativamente, pelo menos, cerca de 20%, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 20% do lípido é colesterol, fitosteróis, desmosterol, tocotrienóis, tocoferóis, ubiquinonas, carotenóides e xantofilas, tais como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina e ácidos gordos, tais como ácidos linoleicos conjugados, e ácidos gordos ómega-3 e ómega-6 altamente insaturados, tais como ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico e ácido docosa-hexaenóico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido di-homo-gama-linolénico e ácido gama-linolénico ou as suas misturas, de um modo preferido, pelo menos cerca, de 30% e, de um modo mais preferido, pelo menos, 8 cerca de 40%.

Num aspecto particular da presente invenção, os microrganismos são capazes de produzir, pelo menos, cerca de 0,1 gramas por litro por hora de uma mistura de lipidos, de um modo preferido, incluindo colesterol, fitosteróis, desmosterol, tocotrienóis, tocoferóis, ubiquinonas, carotenóides e xantofilas tais como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina e ácidos gordos, tais como ácidos linoleicos conjugados e ácidos gordos ómega-3 e ómega-6 altamente insaturados, tais como ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico e ácido docosa-hexaenóico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido di-homo-gama-linolénico e ácido gama-linolénico ou as suas misturas, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 0,2 g/L/h, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 0,3 g/L/h e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 0,4 g/L/h.

Num outro aspecto da presente invenção, o microrganismo é seleccionado do grupo consistindo em algas, fungos, bactérias e protistas. De um modo preferido, os microrganismos são da ordem Thraustochytriales. De um modo mais preferido os microrganismos são seleccionados do género Thraustochytrium, Schizochytrium e das suas misturas. E de um modo ainda mais preferido, os microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em microrganismos que têm as caracteristicas identificadoras do ATCC número 20888, ATCC número 20889, ATCC número 20890, ATCC número 20891 e ATCC número 20892, estirpes mutantes derivadas de qualquer dos anteriores e as suas misturas. De um modo preferido, os microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em microrganismos que têm as caracteristicas identificadoras do ATCC número 20888 e ATCC número 20889 e, de 9 um modo mais preferido, do ATCC número 20888, estirpes mutantes derivadas de qualquer das anteriores e as suas misturas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um diagrama de fluxo de uma forma de realização de um processo de extracção sem solvente da presente invenção.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a um processo para extracção, recuperação, isolamento ou obtenção de lipidos de microrganismos. O processo da presente invenção é aplicável à extracção de uma variedade de lipidos a partir de uma variedade de microrganismos, por exemplo, a extracção de lipidos contendo colesterol, fitosteróis, desmosterol, tocotrienóis, tocoferóis, ubiquinonas, carotenóides e xantofilas, tais como beta-caroteno, luteina, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina e ácidos gordos, tais como ácidos linoleicos conjugados e ácidos gordos ómega-3 e ómega-6 altamente insaturados, tais como ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico e ácido docosa-hexaenóico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido di-homo-gama-linolénico e ácido gama-linolénico ou as suas misturas, de um modo mais preferido, ácidos gordos ómega-3 altamente insaturados, tais como ácido docosa-hexaenóico (DHA), ácido eicosapentaenóico (EPA) e/ou ácido docosapentaenóico (dpa) (í. e., a forma ómega-3 do DPA), em particular, lipidos contendo uma quantidade relativamente grande de DHA de microrganismos que o produzem; e extracção de lipidos contendo ácidos gordos ómega- 10 6 altamente insaturados, tais como ácido araquidónico e ácido docosapentaenóico (DPA) (i. e., a forma ómega-6 do D PA) de microrganismos que os produzem. Microrganismos exemplificativos que produzem uma quantidade relativamente grande de ácidos gordos ómega-3 altamente insaturados estão divulgados nas patentes U.S. da mesma requerente com o N° 5340594 e 5340742, ambas concedidas a Barclay, e microrganismos exemplificativos que produzem uma quantidade relativamente grande de ácido araquidónico estão divulgados na patente U.S. da mesma requerente com o N° 5583019, concedida a Barclay.

Por uma questão de brevidade, no entanto, esta descrição pormenorizada da invenção é apresentado para fins de conveniência e ilustração para o caso da extracção de lípidos compreendendo ácido gordo ómega-3 altamente insaturado de microrganismos que o produzem, em particular, a extracção de lipidos de microrganismos que produzem uma quantidade relativamente elevada de DHA. Deve entender-se, contudo, que a invenção como um todo não pretende ser assim limitada e que um especialista na matéria reconhecerá que o conceito da presente invenção vai ser aplicável a outros microrganismos que produzem uma variedade de composições de lipidos de acordo com as técnicas aqui discutidas. Estes microrganismos incluem microrganismos tais como fungos, protistas, algas e bactérias, que produzem uma variedade de lipidos, tais como fosfolipidos, ácidos gordos livres, ésteres de ácidos gordos, incluindo triglicéridos de ácidos gordos; esteróis; pigmentos (e. g., carotenóides e oxicarotenóides) e outros lipidos, e compostos associados a lipidos, tais como fitosteróides, ergotionina, ácido lipóico e anti-oxidantes incluindo beta-caroteno, tocotrienóis, e tocoferol. Os lipidos e compostos associados a lípidos preferidos incluem, mas não estão limitados a 11 colesterol, fitosteróis, desmosterol, tocotrienóis, tocoferóis, ubiquinonas, carotenóides e xantofilas, tais como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina e ácidos gordos, tais como ácidos linoleicos conjugados, e ácidos gordos ómega-3 e ómega-6 altamente insaturados, tais como ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico, e ácido docosa-hexaenóico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido di-homogamalinolénico e ácido gama-linolénico ou suas misturas. Por uma questão de brevidade, salvo indicação em contrário, o termo "lipido" refere-se a lipido e/ou compostos associados ao lípido. Outros lipidos e microrganismos que podem ser adequados para utilização na presente invenção serão facilmente evidentes para os especialistas na matéria.

Os processos de produção de lipidos microbianos típicos (em particular um óleo contendo ácido gordo ómega-3 altamente insaturado, tal como DHA) envolvem o desenvolvimento de microrganismos que produzem DHA num fermentador, isolamento dos microrganismos, secagem da biomassa microbiana e extracção dos lipidos intracelulares com um solvente orgânico não polar, e. g., hexano. 0 lípido extraído é, geralmente, adicionalmente refinado para produzir uma pureza e/ou qualidade elevadas de lípido. 0 isolamento de microrganismos envolve a diluição do caldo de fermentação com água e centrifugação da mistura para isolar microrganismos. Quando os lipidos são não extraídos imediatamente ou logo após o isolamento dos microrganismos, os microrganismos isolados são, tipicamente, secos, por exemplo, num secador de tambor, e selados numa embalagem, e. g., em sacos selados em vácuo, para impedir a degradação de lipidos. Infelizmente, o processo de secagem expõe os microrganismos ao calor, que pode danificar, í. e., degradar a qualidade do lípido se feito incorrectamente. A embalagem pode desenvolver fugas, 12 que podem degradar mais ainda a qualidade dos lipidos. Além disso, se os microrganismos secos não forem tratados com um anti-oxidante, a exposição de microrganismos ao ar e/ou luz podem degradar mais os lipidos. A recuperação do óleo em bruto directamente a partir do caldo de fermentação evita estes problemas. Evitar o passo de extracção com solvente orgânico não polar reduz os custos de fabrico e, também, elimina a exposição do utilizador aos microrganismos secos, que pode causar uma resposta alérgica em alguns indivíduos. A presente invenção proporciona um método para obtenção de lipidos a partir de microrganismos utilizando um processo de extracção substancialmente isento de solvente orgânico não polar, i. e., um processo de extracção "sem solvente". 0 termo "processo de extracção sem solvente" refere-se a um processo de extracção que, quando é utilizado um solvente aquoso ou polar, 0 solvente aquoso ou polar inclui menos de cerca de 5% de um solvente orgânico não polar, de um modo preferido, menos de cerca de 4%, de um modo mais preferido, menos de cerca de 2% e, de um modo ainda mais preferido, menos de 1%. No entanto, podem ser utilizados solventes em passos a jusante, tal como num processo de refinação. 0 processo da presente invenção pode incluir a obtenção ou o isolamento de microrganismos, de um modo preferido, a partir de um processo de fermentação. Em contraste com os métodos correntes da técnica anterior tais como a extracção de óleos de soja em que a soja tem de ser seca, o processo da presente invenção não requer um passo de secagem antes do processo de extracção. Assim, os processos da presente invenção são aplicáveis à extracção de lipidos de uma biomassa microbiana contendo, pelo menos, cerca de 10% em peso de água 13 entranhada, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 20%, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 30% e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 50%. Quando os microrganismos são obtidos a partir de um processo de fermentação, o processo da presente invenção pode incluir a adição de uma base ao caldo de fermentação para dissolver qualquer composto proteináceo que possa estar presente no caldo. As "bases" são substâncias que apresentam reacções alcalinas (básicas) em soluções aquosas, i. e., fixam protões e dissociam iões hidróxido. A base deve ser suficientemente forte para hidrolisar ou solubilizar, pelo menos, uma porção de compostos proteináceos que podem estar presente no caldo. As bases que são úteis para solubilizar proteínas são bem conhecidas pelas pessoas com conhecimentos correntes na arte da quimica. Bases exemplificativas que são úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a hidróxidos, carbonatos e bicarbonatos de litio, sódio, potássio, cálcio, e carbonato de magnésio. Também podem ser utilizados outros compostos muito básicos como sais de fosfato básicos, tal como o fosfato trissódico. O processo da presente invenção também pode incluir a ruptura ou lise das células de microrganismos para libertar os lipidos que estão presentes no interior das células. As células podem ser lisadas utilizando qualquer dos métodos conhecidos, incluindo químico, térmico, mecânico, incluindo mas não limitado à prensa francesa, moinhos, ultrassonicação, homogeneização e explosão com vapor de água e as suas combinações. Num lise térmica de células, o caldo de fermentação contendo microrganismos é aquecido até as células, i. e., paredes celulares, de microrganismos se degradarem ou sofrerem ruptura. Tipicamente, o caldo de fermentação é aquecido a uma temperatura 14 de, pelo menos, cerca de 50 °C, de um modo preferido de, pelo menos, cerca de 75 °C, de um modo mais preferido de, pelo menos, cerca de 100 °C e, de um modo ainda mais preferido de, pelo menos, cerca de 130 °C. Um aspecto importante do processo é manter a temperatura abaixo da temperatura a que os lipidos extraídos podem ser degradados. A lise térmica das paredes celulares dos microrganismos é particularmente útil para microrganismos cujas paredes celulares são compostas por proteínas. Durante este processo o espaço de cabeça do fermentador pode ser cheio com azoto ou outro gás inerte para evitar a oxidação dos lipidos pelo oxigénio. O aquecimento do caldo também desnatura proteínas e ajuda a solubilizar materiais orgânicos, incluindo proteínas. O passo de aquecimento do caldo de fermentação pode ser conseguido por qualquer dos métodos conhecidos, incluindo a utilização de um permutador de calor em linha e, de um modo preferido, por injecção de vapor no caldo de fermentação e manutenção do caldo a uma temperatura desejada durante menos do que cerca de 90 minutos, de um modo preferido, menos do que cerca de 60 minutos e, de um modo mais preferido, menos do que cerca de 30 minutos. O processo de extracção sem solvente da presente invenção também pode incluir, pelo menos, a separação parcial do caldo de fermentação esgotado dos lipidos. Tipicamente, isto é conseguido por centrifugação, e. g., por passagem do caldo através de uma centrífuga de pilha de discos, separadora ou decantadora, e recolhendo fracções de lipidos como uma fase de emulsão. A centrifugação da mistura resulta numa mistura bifásica que compreende uma camada pesada e uma camada leve. Tipicamente , a camada pesada é uma fase aquosa, que contém a maior parte dos detritos celulares. A camada leve que contém lipidos 15 emulsionados é, então, diluída com água, novamente separada numa mistura bifásica e a camada leve é novamente isolada. Estes processos de diluição com água, separação e isolamento (í. e., processo de lavagem) podem ser realizados continuamente por alimentação de água e remoção da camada pesada ao longo do processo ou podem ser realizados em passos discretos. 0 processo de lavagem é geralmente repetido até que seja obtida uma camada lipídica substancialmente não emulsionada, embora possam permanecer quantidades minoritárias de emulsão. Crê-se que a interface óleo-água da emulsão é estabilizada por detritos celulares residuais que são arrastados pelo processo de lavagem. Durante o processo de lavagem, a quantidade de água sucessiva adicionada é reduzida para aumentar o teor de lípidos. Embora a redução da quantidade de água de alimentação demasiado rapidamente possa resultar em perda de lípidos para a fase aquosa, a redução da quantidade de água de alimentação demasiado lentamente resulta num processo de lavagem ineficiente. Pode-se determinar prontamente uma taxa apropriada de redução da água de alimentação por observação ou análise da camada aquosa separada. Geralmente, a camada lipídica, í. e., a camada leve, é corada; por isso, em muitos casos, pode-se determinar uma velocidade apropriada de redução da água de alimentação por simples análise ou observação da cor da camada aquosa que é separada da camada lipídica.

Alternativamente e, de um modo preferido, a emulsão pode ser quebrada, e o óleo recuperado utilizando o processo de remoção de óleo descrito no documento WO 96/05278. Neste processo, um composto solúvel em água, e. g., álcool e/ou acetona, é adicionado à emulsão de óleo/água para quebrar a emulsão e a mistura resultante é separada por centrifugação. O lípido isolado pode ser adicionalmente refinado utilizando um 16 processo semelhante ao utilizado para refinar óleos vegetais correntes. Resumidamente, o processo de refinação de lípidos geralmente envolve a hidratação de fosfolipidos por adição de ácido fosfórico ao lipido, seguida pela adição de hidróxido de sódio para neutralizar os ácidos gordos livres. Estes compostos são removidos através de centrifugação. A isto segue-se, então, um passo de lavagem com água para remover adicionalmente quaisquer quantidades remanescentes de fosfolipidos hidratados ("gomas") e ácidos gordos neutralizados ("massa de refinação") no lipido. 0 lipido resultante é branqueado utilizando Trysil™ e uma argila branqueadora corrente. Também é adicionado ácido citrico para remover iões metálicos divalentes por quelação. 0 Trysil™ e a argila branqueadora são, depois, removidos por meio de filtração para produzir lipido refinado. 0 lipido branqueado pode ser filtrado a frio para remover compostos de ponto de fusão elevado que podem estar presentes no lipido; no entanto, este passo, em geral, raramente é necessário. 0 lipido resultante pode ser, ainda, refinado por remoção de quaisquer componentes de baixo peso molecular que podem estar presentes. Tipicamente, estes componentes são removidos por injecção com vapor a altas temperaturas, em alto vácuo. Este processo destrói, também, quaisquer ligações peróxido que possam estar presentes e reduz ou remove maus odores e ajuda a melhorar a estabilidade do óleo. Um anti-oxidante pode, então, ser adicionado ao lipido desodorizado resultante para melhorar a estabilidade do produto.

Durante o processo de refinação, o lipido isolado pode ser winterizado para retirar os compostos de alto ponto de fusão, tais como ácidos gordos saturados. 0 processo de winterização envolve, genericamente, a dissolução do lipido isolado num 17 solvente orgânico, e. g., hexano, arrefecimento da solução orgânica resultante, e filtração da solução para remover os componentes de ponto de fusão elevado do lipido ou fase de estearina. 0 processo de winterização produz, geralmente, um lipido transparente, especialmente quando 0 lipido isolado é turvo ou opaco. Como será compreendido, a utilização de um solvente, tal como o hexano, é aceitável em processos como 0 "processo de refinação" descrito acima. Alternativamente, o lipido isolado pode ser arrefecido e as impurezas solidificadas podem ser separadas por filtração, sem utilização de um solvente. 0 processo de refinação, branqueamento, desodorização descrito acima pode ser utilizado para as misturas de lípidos ricas em triglicéridos. Alternativamente, ou para além deste processo, outros lipidos, por exemplo, pigmentos ou carotenóides podem ser separados e purificados, e. g., por partição em vários solventes, métodos cromatográficos, etc.

Embora o processo da presente invenção possa incluir isolamento de microrganismos de um processo de fermentação, uma das vantagens da presente invenção é que permite que a fermentação de microrganismos e isolamento de lípidos sejam realizados num único recipiente. Por exemplo, após a fermentação, pode adicionar-se base ao vaso de fermentação e aquecer a mistura para lisar as células. Após separação de fases numa camada pesada e numa camada leve, a camada leve pode ser transferida para outro recipiente para processamento adicional ou a camada pesada pode ser removida do vaso de fermentação, por exemplo, por drenagem através do fundo do vaso de fermentação e a restante camada leve pode ser adicionalmente processado dentro do mesmo vaso de fermentação. 18

Se a concentração de lípidos nas células da cultura microbiana for elevada (e. g., superior a cerca de 20%), mas a concentração de células for baixa (e. g., inferior a cerca de 40 g/L), como em células cultivadas em sistemas de fermentação continua, ou culturas de células difíceis (e. g., frágeis) de cultivar, ou culturas produzidas em sistemas de cultura de base fotossintética, as células podem ser concentradas, e. g., por centrifugação, filtração, ou sedimentação, antes da utilização dos métodos da invenção se necessário.

Objectivos adicionais, vantagens e novas características desta invenção tornar-se-ão evidentes para os especialistas na matéria após exame dos seus exemplos que se seguem, que não pretendem ser limitativos.

Exemplos A reprodutibilidade do processo foi caracterizada por produção de três amostras de óleo completamente refinado, utilizando óleo em bruto do novo processo de extracção sem solvente. Uma amostra extraída com hexano foi também completamente refinada para servir como um controlo. Os passos de fermentação, extracção e isolamento de óleo foram realizados numa escala grande, enquanto que os estudos de refinação de óleo foram realizados em pequena escala.

As amostras de óleo completamente refinado foram analisadas para demonstrar a reprodutibilidade do processo. 19

Fermentação :

Um microrganismo rico em óleo (Schizochytrium sp.) foi cultivado num fermentador de 1200 galões para produzir um caldo de fermentação para os processos de extracção seguintes. Foi utilizado um único lote para gerar o caldo de partida para os três processos de extracção sem solvente. A fermentação foi deixada decorrer durante 94 horas, enquanto se controlava os niveis de glucose a 13 g/L, período de tempo após o qual foi terminada a alimentação de xarope de milho. Os niveis de glucose residuais desceram para <5 g/L quatro horas mais tarde. Isto resultou numa idade final de 98 horas. O volume final do caldo foi de 958 galões. O rendimento final foi de 146 g/L de peso seco de células. Ambas as verificações de contaminação do processo e uma análise minuciosa de uma amostra de caldo final não mostram quaisquer sinais de contaminação.

Amostra de Controlo Extraída Com Hexano:

Uma pequena alíquota do caldo de lote de fermentação foi seca em tambor e extraída com hexano, de modo a servir como uma amostra de controlo. A biomassa intermediária foi recuperada utilizando um secador de tambor duplo. A análise deste lípido está apresentada na Tabela 1. 20

Tabela 1. Análise de biomassa de Schizochytrium sp. seca em tambor.

Parâmetro Valor Teor de DHA (com base em FAME) 35,7% Teor de Óleo 62,7% índice de Peróxido (meq/kg) 2, 6 Contagem da Placa Total (ufc/g) <50 Teor de DHA* 20,3% Teor de FAME 56,9% *com base no peso de células secas

Processo de Extracção Sem Solvente:

Obteve-se óleo em bruto por tratamento de três alíquotas de 400 galões (aprox.) do caldo de fermentação. Cada alíquota de 400 galões do fermentador foi processada separadamente, começando com os passos de tratamento cáustico/térmico. Cada alíquota foi tratada com 20 gramas de KOH a 45% por litro e aquecida a 130 °C, durante cerca de 30 minutos por passagem de vapor através do caldo de fermentação. O óleo em bruto foi recuperado do caldo tratado, utilizando uma centrífuga de pilha de discos em escala comercial Westfalia HFA-100. O sumário dos resultados para vários parâmetros de processo estão apresentados na Tabela 2 e os resultados das análises do óleo em bruto final estão apresentados na Tabela 3. 21

Tabela 2. Dados de processo do processo de extracção sem solvente.

SFE-1 SFE-2 SFE-3 Tratamento do caldo Volume de caldo processado 288 gal 288 gal 258 gal pH Final após tratamento 7,5 8, 0 8,7 Volume Final Após Tratamento térmico 388 gal 398 gal 308 gal Aumento de Volume do Condensado 34, 7% 38, 2% 19,4% Emulsão de l5 passagem Volume Total (gal) 180 133 149 Concentração do Óleo Est. (p/p) 12, 0% 24, 5% 16,1% Densidade Aparente (g/mL) 0, 986 0, 991 0,999 Isolamento do óleo Óleo Em Bruto Total Recuperado (lb) 182 165 174 Número de Lote Atribuído ao Óleo de dha SFlA SF2A SF3A

Tabela 3. Análise de lotes de óleo de DHA do processo de extracção sem solvente.

Parâmetro SFlA SF2A SF3A Teor de DHA (% FAME) 39,0% 38, 6% 39, 2% índice de Peróxido (meq/kg) 4, 6 1,8 2,0 índice de Ácido (mg de KOH/g) N/D N/D N/D Teor de Humidade N/D N/D N/D

Refinação:

Uma amostra de cada alíquota de óleo em bruto foi winterizada, refinada, branqueada e desodorizada em pequena escala, como foi uma amostra do óleo em bruto do controlo 22 extraído com hexano. Diversos dados de processo destas experiências em pequena escala estão apresentados na Tabela 4, incluindo as eficiências de recuperação para os vários passos de processamento. Embora seja difícil de ler muito nas eficácias de recuperação para processos em escala laboratorial, uma vez que as perdas tendem a ser desproporcionadamente grandes, os valores listados na Tabela 4 mostram que os valores para as amostras extraídas sem solvente tendem a equiparar-se aos valores determinados para o controlo extraído com hexano, com a única excepção a ser o passo de winterização. Enquanto que a eficiência de recuperação durante o passo de winterização para o controlo de hexano foi mais baixa do que as observadas para as outras três amostras, esta diferença é insignificante de uma perspectiva estatística. As perdas elevadas durante o passo de winterização fizeram com que a eficiência de recuperação global para o controlo de hexano ser também mais baixa. Não seria de esperar que o rendimento mais baixo tivesse um impacto significativo sobre a qualidade global do óleo. De todo em todo, as diferenças no processamento das várias amostras de óleo foram mínimas.

Tabela 4. Diversos dados de processo dos passos de refinação de óleo. HEX-1 SF1A SF2A SF3A Condições de Processamento Concentração de Micélio 45, 0% 52, 9% 52,8% 45, 0% Taxa de Injecção de Vapor 3, 4% 3,4% 2,5% 2,2% Eficiências de recuperação Winterização 80, 6% 92,3% 87, 7% 85,5% Refinação 89, 4% 84, 8% 91,8% 95, 0% 23 (continuação)

Lavagem com Água 90, 6% 94, 5% 95,8% 81,2% Branqueamento 86,1% 89,2% 87,3% 84,1% Desodorização 97, 4% 96,1% 97,2% 97,5% Embalagem 88,2% 89, 7% 89,3% 95,8% Global 48,2% 56,9% 58,5% 51,8%

Amostras de óleo completamente refinado dos três ensaios de extracção sem solvente e o controlo extraído com hexano, foram analisados e os resultados estão apresentados na Tabela 5. Estão também indicados as correspondentes especificações de libertação para cada parâmetro.

Uma amostra de óleo bruto de partida do ensaio de extracção sem solvente também foi analisada quanto ao teor de ferro. 0 teor de ferro desta amostra era de 0,08 ppm. A concentração dos outros metais vestigiais era inferior aos seus respectivos limites de detecção.

Tabela 5. Resultados do CQ de Óleo de dha rbd do Processo de Extracção Sem solvente em comparação com óleo extraído com hexano.

Hexano Processo de Extracção sem Solvente N° ID do ensaio HEX-1 SFAl SFA2 SFA3 índice de Peróxido (meq/kg) 0,28 0,69 0,35 0,34 índice de Ácido (mg de KOH/g) 0,17 0,11 0,57 0,24 Humidade & Voláteis 0, 00% 0,06%** 0, 00% 0,00% Metais Vestigiais (ppm) 24 (continuação)

Hexano Processo de Extracção sem Solvente N° ID do ensaio HEX-1 SFAl SFA2 SFA3 Chumbo <0,20 <0, 20 <0,20 <0,20 Arsénio <0,20 <0, 20 <0, 20 <0, 20 Ferro 0,22 0,21 0,56*** 0, 02 Cobre <0, 05 <0, 05 <0, 05 <0,05 Mercúrio <0,20 <0, 20 <0, 20 <0, 20 DHA (% FAME) 36,9 37, 3 37, 0 37, 7 DHA (mg/g de óleo) 342 345 343 351 Hexano (ppm) <3 <3 <3 <3 *0 valor foi reduzido para 0,22 mg de KOH/g após a repetição dos passos de refinação e branqueamento ** Amostra analisada por San Diego Fermentation Sciences Analytical Group. *** 0 valor foi reduzido para 0,02 ppm após repetição dos passos de refinação e branqueamento

Na Tabela 6 está apresentada uma comparação mais directa dos resultados médios das análises das três amostras do processo de extracção de solvente em comparação com os do controlo de hexano. 25

Tabela 6. Comparação de Valores Médios.

Hexano Extracção Sem Solvente Parâmetro Controlo Média Desvio padrão CV % Dif. índice de Peróxido (meq/kg) 0,28 0,46 0,20 43,3% 64, 3% índice de Ácido (mg KOH/g) 0,17 0,19* 0, 06 33,3% 11, 2% Humidade & Voláteis 0,00% 0,02% 0, 03% 173% ND Metais Vestigiais (ppm) Chumbo <0,20 <0,20 N/A N/A 0,0% Arsénio <0,20 <0,20 N/A N/A 0,0% Ferro 0,22 0,26 0,27 104% 18, 2% Cobre <0,05 <0,05 N/A N/A 0,0% Mercúrio <0,20 <0,20 N/A N/A 0,0% DHA (% FAME) 36,9% 37,3% 0,4% 0,9% 1,1% DHA (mg/g de óleo) 342 346 4 1,2% 1,2% Hexano (ppm) <3 <3 N/A N/A 0, 0% *Calculado utilizando o índice de ácido da amostra reprocessada.

Os resultados desta experiência demonstram, claramente, que o processo de extracção sem solvente é reprodutível e os lípidos da extracção sem solvente são relativamente indistinguíveis dos lípidos obtidos do processo de extracção com hexano em termos de desempenho do processo e da qualidade do produto. 0 produto final do processo de extracção sem solvente é substancialmente equivalente aos lipidos de um processo de extracção corrente à base de hexano, como determinado por semelhanças entre os perfis de ácidos gordos e esteróis do produto destes dois processos.

Lisboa, 7 de Dezembro de 2010 26

Claims (32)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para obtenção de lípidos de microrganismos compreendendo: (a) tratamento das células dos microrganismos cultivados num meio de fermentação, para libertar lipidos intracelulares, em que o tratamento compreende aquecimento das células, exposição das células a condições básicas, exposição das células a um composto quelante ou as suas combinações; (b) produção de uma mistura com fases separadas compreendendo uma camada pesada, em que a referida camada pesada compreende uma fase aquosa e uma camada leve, em que a referida camada leve compreende os referidos lípidos por separação por gravidade do produto do passo a) (c) separação da referida camada pesada da referida camada leve (d) tratamento da referida camada leve para quebrar uma emulsão formada entre o referido lipido e água; e (e) obtenção dos referidos lipidos da referida camada leve ; em que o processo utiliza menos de 5% de um solvente orgânico não polar, enquanto evita a extracção com solvente orgânico para obter o lipido. 1
2. 2. Processo da Reivindicação 1, em que o passo (a) compreende o aquecimento das células.
3. 3. Processo da Reivindicação 1 ou 2, compreendendo, ainda, a solubilização de, pelo menos, parte de quaisquer proteínas presentes no meio de fermentação.
4. 4. Processo da Reivindicação 3, em que o referido passo de solubilização de proteínas compreende aquecimento do meio contendo os lípidos intracelulares libertados.
5. 5. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que o passo (a) de tratamento das células compreende a lise das células para produzir uma mistura de células lisadas.
6. 6. Processo da Reivindicação 5, em que a produção de uma mistura de fases separadas em (b) compreende a centrifugação da referida mistura de células lisadas.
7. 7. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que o passo (a) de tratamento compreende a adição de uma base ao referido meio de fermentação.
8. 8. Processo da Reivindicação 7, em que a referida base dissolve compostos proteináceos no meio de fermentação e em que a referida base é seleccionada do grupo consistindo em hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos, fosfatos e as suas misturas.
9. 9. Processo da Reivindicação 1 ou 2, em que o passo (a) de tratamento compreende o aquecimento dos referidos microrganismos a uma temperatura de, pelo menos, 50 °C. 2
10. 10. Processo da reivindicação 9, em que o passo (a) de tratamento compreende aquecimento das células a, pelo menos, 50 °C durante a exposição das células a um composto básico, um composto quelante ou as suas misturas.
11. 11. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1 a 10, em que o processo é realizado sem secagem das referidas células.
12. 12. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1 a 10, em que o referido passo c) compreende ainda: i) adição de uma solução de lavagem aquosa à referida camada leve; ii) separação da referida solução de lavagem aquosa da referida camada leve; e iii) repetição dos referidos passos (i) e (ii) até o referido lipido estar substancialmente não emulsionado.
13. 13. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1 a 10, em que a referida camada leve compreende um lipido emulsionado.
14. 14. Processo da Reivindicação 13, em que o referido lipido emulsionado compreende uma suspensão do referido lipido numa fase aquosa.
15. 15. Processo de qualquer uma das Reivindicações anteriores, em que a referida solução aquosa compreende materiais celulares sólidos.
16. 16. Processo da Reivindicação 1, em que a referida separação 3 por gravidade compreende a passagem do meio de fermentação contendo os lipidos intracelulares libertados por uma centrífuga de pilha de discos, separadora ou decantadora.
17. 17. Processo da Reivindicação 1, em que a referida separação por gravidade compreende centrifugação.
18. 18. Processo da Reivindicação 1, em que o passo de quebra da emulsão compreende misturar a emulsão com água, álcool e/ou acetona e submeter a mistura a separação por gravidade.
19. 19. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que o processo é realizado na ausência de um solvente orgânico não polar.
20. 20. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que os lipidos obtidos são submetidos a refinação ou processamento adicionais para obter um lípido refinado.
21. 21. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que os lipidos obtidos são branqueados e desodorizados.
22. 22. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que os referidos microrganismos são obtidos de um processo de fermentação.
23. 23. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que os referidos microrganismos são capazes de crescer a um nível de salinidade inferior a cerca de 12 4 g/L de cloreto de sódio.
24. 24. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que os referidos microrganismos são microrganismos ricos em lipidos.
25. 25. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que os referidos microrganismos compreendem, pelo menos, cerca de 20% em peso de lipido.
26. 26. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que os referidos microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em algas, fungos, bactérias e protistas.
27. 27. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que os referidos microrganismos compreendem microrganismos do grupo consistindo em algas douradas, algas verdes, dinoflagelados, levedura, fungos do género Mortierella, e Stramenopíles.
28. 28. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que os referidos microrganismos compreendem microrganismos ordem Thraustochytriales.
29. 29. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que os referidos microrganismos são seleccionados do género de Thraustochytrium, Schizochytrium e das suas misturas. 5
30. 30. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que os referidos microrganismos são seleccionados do grupo consistindo em microrganismos que têm as caracteristicas identificadoras de ATCC número 20888, ATCC número 20889, ATCC número 20890, ATCC número 20891 e ATCC número 20892, estirpes mutantes derivadas de qualquer das anteriores, e as suas misturas.
31. 31. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que os referidos microrganismos são capazes de produzir, pelo menos, cerca de 0,1 gramas por litro por hora de colesterol, fitosteróis, desmosterol, tocotrienóis, tocoferóis, ubiquinonas, carotenóides e xantofilas tais como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, e ácidos gordos, tais como ácidos linoleicos conjugados, e ácidos gordos ómega-3 e ómega-6 altamente insaturados, tais como ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico, e ácido docosa-hexaenóico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido di-homo-gama-linolénico e ácido gama-linolénico ou as suas misturas.
32. 32. Processo de qualquer uma das Reivindicações 1-10, ou 16-18, em que, pelo menos, cerca de 20% do referido lípido é colesterol, fitosteróis, desmosterol, tocotrienóis, tocoferóis, ubiquinonas, carotenóides e xantofilas, tais como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, e ácidos gordos, tais como ácidos linoleicos conjugados, e ácidos gordos ómega-3 e ómega-6 altamente insaturados, tais como ácido eicosapentaenóico, ácido docosapentaenóico, e ácido docosa-hexaenóico, ácido araquidónico, ácido 6 o ácido estearidónico, ácido di-homo-gama-linolénico e gama-linolénico ou as suas misturas. Lisboa, 7 de Dezembro de 2010 7