JP2015180226A

JP2015180226A - ヘテロダイマー結合タンパク質およびその使用

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Publication number: JP2015180226A
Application number: JP2015136676A
Authority: JP
Inventors: ダブリュー．ブランケンシップジョン; w blankenship John; タンフィリップ; Tan Philip
Original assignee: Emergent Product Development Seattle LLC
Current assignee: Aptevo Research and Development LLC
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2015-07-08
Publication date: 2015-10-15
Also published as: CA2785907A1; PL2519543T3; MX2012007533A; IL220398A; CA2784814A1; HK1170741A1; EA201492253A1; HUE029257T2; AU2010343049A2; JP5851419B2; MX341796B; JP2013515508A; HRP20160819T1; PT2519543T; SMT201600335B; RS55229B1; WO2011090761A1; EA201290568A1; EA201290570A1; JP2015221829A

Abstract

【課題】免疫グロブリンＣＨ１領域および免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）の自然ヘテロ二量化を介する２つの異なる１本鎖融合ポリペプチド間で形成されるポリペプチドヘテロダイマーを提供すること。【解決手段】ポリペプチドヘテロダイマーは、１つ以上の標的（例えば、受容体）に特異的に結合する２つ以上の結合ドメインを含む。加えて、ヘテロダイマーのどちらの鎖もさらに、Ｆｃ領域部分を含む。本開示はまた、ポリペプチドヘテロダイマーを製造するための核酸、ベクター、宿主細胞および方法ならびにそのようなポリペプチドヘテロダイマーを、例えばＴ細胞活性化の誘導、固形悪性腫瘍増殖の阻止、および自己免疫または炎症状態の処置において使用するための方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１２月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／２９０，８４０号、および２０１０年７月１６日に出願された米国特許仮出願第６１／３６５，２６６号（これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の恩典を主張する。
配列リストに関する声明
本出願に関連する配列リストは、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により明細書に組み込まれる。配列リストを含むテキストファイル名は、910180_422PC_SEQUENCE_LISTING.txt.である。テキストファイルは８３９ＫＢであり、２０１０年１２月２９日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に、明細書の出願と同時に提出されている。

本開示は一般に、ポリペプチドヘテロダイマー、その組成物、およびそのようなポリペプチドヘテロダイマーの製造および使用方法を提供する。より詳細には、本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーは、一部分において、免疫グロブリンＣＨ１領域と免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）との間の自然ヘテロ二量化を介して形成される。加えて、本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーは、特異的に１つ以上の標的に結合する２つ以上の結合ドメインを含む。さらに、本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーの１本鎖ポリペプチドは両方ともそれぞれ、Ｆｃ領域部分（例えば、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を含む。

シグナル伝達プロセスにはしばしば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを有する受容体タンパク質が関与する。リガンド結合中、細胞表面受容体分子はしばしば、オリゴマー化または多量体化（「架橋」とも呼ばれる）し、シグナルを細胞の細胞内区画に効果的に伝達する。受容体とリガンドとの間のこの相互作用または受容体のその後のオリゴマー化もしくは多量体化の刺激または遮断は、広範囲の疾患に対し重要な治療的意味を有する。

受容体およびリガンド相互作用を調節するのに有用な例示的な分子としては、抗体または抗体から誘導される分子が挙げられる。例えば、抗体またはその誘導体は、細胞表面受容体に結合し、活性化リガンドの結合部位をブロックし、または活性化に必要とされる受容体二量体化もしくは多量体化を防止することにより、それを不活性化する受容体アンタゴニストとして機能し得る。ある他の場合では、抗体またはその誘導体は、複数の膜受容体に結合し、架橋し、天然リガンドの機能を模倣することによりアゴニストとして機能し得る。別の例は、細胞毒性剤または免疫エフェクター細胞を標的部位、例えば腫瘍に向かわせるために使用され得る二特異性抗体誘導体である。

二特異性抗体は、２つの離れた、別の抗原（または同じ抗原の異なるエピトープ）に同時に結合することができる抗体に基づく分子である。二特異性抗体の１つの使用は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）による腫瘍細胞の死滅の増強のために細胞毒性免疫エフェクター細胞を向け直すことであった。この関係において、二特異性抗体の１つのアームが腫瘍細胞上の抗原に結合し、他のアームがエフェクター細胞上で発現される決定基に結合する。腫瘍およびエフェクター細胞を架橋することにより、二特異性抗体は、エフェクター細胞を腫瘍細胞近傍に移動させるだけでなく、同時に、それらの活性化を誘発し、有効な腫瘍細胞死滅に至らしめる。二特異性抗体はまた、腫瘍組織中の化学または放射線治療薬を濃縮し、正常組織への有害作用を最小に抑えるために使用されている。この設定では、二特異性抗体の１つのアームは破壊の標的とされる細胞上で発現される抗原に結合し、他のアームは化学治療薬、放射性同位体、または毒素を送達する。

二特異性抗体の一般的な開発における主な障害は、前臨床および臨床研究の両方のために十分な品質および量の材料を生成することが困難なことであった。最初、二特異性抗体の生成への主経路は、異なる特異性の２つの親抗体の両方の軽鎖および両方の重鎖の単一細胞における同時発現によるものであった。しかしながら、所望の結合適確な二特異性抗体は微量生成物であり、他の生成物からの精製は非常に困難である。二特異性抗体生成のための他の従来法は、異なる特異性を有する２つの抗体またはそれらのフラグメントの化学的結合である。しかしながら、この方法はまた複雑であり、化学修飾プロセスは、抗体を不活性化し、または凝集を促進する可能性がある。望ましくない生成物からの精製は困難なままなので、二特異性抗体の収率は低く、品質が悪く、これにより、このプロセスは、臨床開発のために必要とされる大規模生成には好適ではない。

近年、様々なヘテロ二量化技術が二特異性抗体の生成を改善するために使用されている。しかしながら、Ｊｕｎ／Ｆｏｓコイルドコイルのような簡単なヘテロ二量化ドメインのｓｃＦｖドメインへの融合は、ホモおよびヘテロダイマーの混合物に至らしめ、リフォールディングによる構築が必要とされる(非特許文献１)。ｓｃＦｖフラグメントの全抗体への融合もまた、二量体化装置として使用された(非特許文献２)。しかしながら、そのような融合では、固形組織浸透能力の低い大きな分子となってしまう。２つのｓｃＦｖフラグメントの融合もまた、二特異性タンパク質の作成のために使用されている（例えば、ＭｉｃｒｏｍｅｔＩｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤによるＢＩＴＥ（登録商標）抗体、特許文献１）。しかしながら、そのようなタンパク質は、Ｆｃ領域を含まず、よって、Ｆｃ領域を介するそれらの活性の操作が可能にならない。加えて、これらのタンパク質は小さく（約５５ｋＤａ）、血清中での半減期がかなり短い。

米国特許第７，６３５，４７２号明細書

deKruif and Logtenberg, J. Biol. Chem.（1996）271:7630〜4 Colomaand Morrison, Nat. Biotechnol.（1997）15:159〜63

これまで、免疫グロブリン融合技術は、商業的に実現可能なヘテロダイマータンパク質またはそれらを製造するための方法を提供していない。よって、当技術分野では、依然として別の多特異的ヘテロダイマータンパク質ならびにこれらを生成するための効率的な方法が必要である。

本開示は、免疫グロブリンＣＨ１領域と免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）の自然ヘテロ二量化を介して２つの異なる１本鎖ポリペプチド間で形成されるポリペプチドヘテロダイマーを提供する。本開示はまた、ポリペプチドヘテロダイマーを製造するための核酸、ベクター、宿主細胞および方法ならびに、例えば、指向性Ｔ細胞活性化、固形悪性腫瘍増殖の阻止、自己免疫もしくは炎症状態の処置、またはＢ細胞関連障害もしくは疾患の処置においてそのようなポリペプチドヘテロダイマーを使用するための方法を提供する。

１つの態様では、本開示は、（ａ）１〜４つの標的に特異的に結合する１〜４つの結合ドメイン、ヒンジ（Ｈ−Ｉ）、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）、およびＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）を含む第１の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−Ｉ）；ならびに（ｂ）０〜４つの標的に特異的に結合する０〜４つの結合ドメイン、ヒンジ（Ｈ−ＩＩ）、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）、およびＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）を含む第２の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−ＩＩ）を含むポリペプチドヘテロダイマーを提供し；ここで、（ｉ）免疫グロブリンＨＤ−Ｉおよび免疫グロブリンＨＤ−ＩＩは優先的に互いと結合し、ＳＣＰ−ＩおよびＳＣＰ−ＩＩからなるポリペプチドヘテロダイマーを形成し、（１）第１の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）は第１の免疫グロブリンＣＨ１領域を含み、第２の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）は、第１の免疫グロブリンＣＬ領域を含み、あるいは（２）第１の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）は第１の免疫グロブリンＣＬ領域を含み、第２の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）は第１の免疫グロブリンＣＨ１領域を含み；ならびに、（ｉｉ）ＳＣＰ−ＩのＦｃ領域部分およびＳＣＰ−ＩＩのＦｃ領域部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはそれらの任意の組み合わせの免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはそれらの任意の組み合わせの１つまたは２つの免疫グロブリンＣＨ３ドメイン；あるいはＩｇＥ、ＩｇＭ、またはそれらの任意の組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含み、ただし、ポリペプチドヘテロダイマーは、標的、例えば、少なくとも２つの異なる標的に特異的に結合する少なくとも２つの結合ドメインを含むことを条件とする。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーの結合ドメインは１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドである。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは２つの結合ドメイン（ＢＤ１およびＢＤ２）を含む。１つの実施形態では、２つの結合ドメイン（ＢＤ１およびＢＤ２）はどちらも第１の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−Ｉ）上にあり、ＨＤ−ＩおよびＦＲＰ−ＩはＢＤ１とＢＤ２の間に配置される。別の実施形態では、第１の結合ドメイン（ＢＤ１）は第１の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−Ｉ）上にあり、第２の結合ドメイン（ＢＤ２）は第２の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−ＩＩ）上にある。例えば、第１の結合ドメイン（ＢＤ１）は、第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）へのアミノ末端であってもよく、第２の結合ドメイン（ＢＤ２）は第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）へのアミノ末端であってもよい。また、第１の結合ドメイン（ＢＤ１）は、第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）へのアミノ末端であってもよく、第２の結合ドメイン（ＢＤ２）は第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）へのカルボキシル末端であってもよい。さらにまた、第１の結合ドメイン（ＢＤ１）は第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）へのカルボキシル末端であってもよく、第２の結合ドメイン（ＢＤ２）は第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）へのカルボキシル末端であってもよい。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは３つの結合ドメイン（ＢＤ１、ＢＤ２およびＢＤ３）を含む。１つの実施形態では、ＨＤ−ＩおよびＦＲＰ−ＩがＢＤ１とＢＤ２の間に配置され、第３の結合ドメイン（ＢＤ３）は第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）へのアミノ末端である。別の実施形態では、ＨＤ−ＩおよびＦＲＰ−ＩはＢＤ１およびＢＤ２の間に配置され、第３の結合ドメイン（ＢＤ３）は第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）へのカルボキシル末端である。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは４つの結合ドメイン（ＢＤ１、ＢＤ２、ＢＤ３、およびＢＤ４）を含む。例えば、ＨＤ−ＩおよびＦＲＰ−ＩはＢＤ１およびＢＤ２の間に配置されてもよく、ＨＤ−ＩＩおよびＦＲＰ−ＩＩはＢＤ３およびＢＤ４の間に配置されてもよい。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは５〜８つの結合ドメイン（例えば、５、６、７または８つの結合ドメイン）を含む。

ある実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーの少なくとも１つの結合ドメインは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ２８、ＣＤ７９ｂ、ハイパーＩＬ−６、モノＩＬ−１０、ＣＤ８６、ＣＤ２０、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｒｏｎ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＥＡＣＡＭ−６、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＨＶＥＭ、ＬＴＢＲ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１〜４、アンジオポエチン２、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ１６、ＣＤ７１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＷＥＡＫＲ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡ、ＦＡＳ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ハイパーＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１７Ａ／Ｃ、ＩＰ−１０、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＳＬ、ＴＧＦβ、ＩＬ１０、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬ、ＨＧＦ、ＭＳＰ、ＥＧＦ（例えばエピレギュリン、ヘレグリン、β−レグリン、ニューレグリン）、ＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ、ＴＮＦα、Ｗｎｔ、ｓＨＨ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＣＴＡ−１、ＳＴＥＡＰ−１、ＰＳＣＡ、ＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１５１、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＴＲＯＰ２、ＣＣＲ５、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５_ＡＣ、ＭＵＣ５_ｂ、ＭＵＣ７、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グロボＨ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ
ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）ＩｇＥ、メラノーマ硫酸コンドロイチンプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−α前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６；デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカーおよびミュラー管抑制因子（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアル酸付加Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ１５１、ＴＧＦＢＲ２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０、ＴＮＦＲ２、ＯＳＭＲβ、Ｐａｔｃｈｅｄ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｒｏｂｏ１、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＬＩＦＲβ、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９に特異的に結合する、またはそのアンタゴニストである。

ある他の実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーの少なくとも１つの結合ドメインは、ＩＬ−１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＧＦ、ＩＬ−３５、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＷＥＡＫＲ、またはＦＡＳのアゴニストである。

本明細書で提供される、あるポリペプチドヘテロダイマーでは、少なくとも１つの結合ドメインは、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合し、少なくとも別の結合ドメインはＰＳＭＡ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２０、ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、またはＣＥＡＣＡＭ−６に特異的に結合する。

本明細書で提供される、ある他のポリペプチドヘテロダイマーでは、少なくとも１つの結合ドメインはＣＤ２８に特異的に結合し、少なくとも別の結合ドメインは、ＣＤ７９ｂ、ハイパーＩＬ−６、ＰＤＬ２、モノＩＬ−１０、ＣＤ８６、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０、ＰＤＬ１、ＨＶＥＭ、またはＬＴＢＲに特異的に結合する、またはそのアンタゴニストである。

本明細書で提供される、ある他のポリペプチドヘテロダイマーでは、少なくとも１つの結合ドメインは、ＣＤ２８に特異的に結合し、少なくとも別の結合ドメインは、ＩＬ−１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＧＦ、ＩＬ−３５、ＰＤ−１、またはＢＴＬＡのアゴニストである。

ある実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）は、第１の免疫グロブリンＣＨ１領域を含み、第２の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）は、第１の免疫グロブリンＣＬ領域を含む。１つの実施形態では、第１のＣＨ１領域は第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、第１のＣＬ領域は第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端である。別の実施形態では、第１のＣＨ１領域は、第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、第１のＣＬ領域は第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端である。

第１の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）が第１の免疫グロブリンＣＨ１領域を含み、第２の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）が第１の免疫グロブリンＣＬ領域を含むある実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドはさらに第２のＣＨ１領域を含み、第２の１本鎖ポリペプチドはさらに第２のＣＬ領域を含み、第１の１本鎖ポリペプチドの第２のＣＨ１領域および第２の１本鎖ポリペプチドの第２のＣＬ領域はポリペプチドヘテロダイマー中で互いに結合する。例えば、第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分は、第１と第２のＣＨ１領域の間に配置されてもよく、第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分は第１と第２のＣＬ領域の間に配置されてもよい。また、第１および第２のＣＨ１領域はどちらも、第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端であり得、第１および第２のＣＬ領域はどちらも第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端であり得る。さらにまた、第１および第２のＣＨ１領域はどちらも第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり得、第１および第２のＣＬ領域はどちらも第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり得る。

第１の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）が第１の免疫グロブリンＣＨ１領域を含み、第２の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）が第１の免疫グロブリンＣＬ領域を含むある他の実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドはさらに第２のＣＬ領域を含み、第２の１本鎖ポリペプチドはさらに第２のＣＨ１領域を含み、第１の１本鎖ポリペプチドの第２のＣＬ領域および第２の１本鎖ポリペプチドの第２のＣＨ１領域はポリペプチドヘテロダイマー中で互いに結合する。例えば、１つの実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドでは、第１のＣＨ１領域はＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、第２のＣＬ領域はＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり；第２の１本鎖ポリペプチドでは、第１のＣＬ領域はＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、第２のＣＨ１領域はＦｃ領域部分へのカルボキシル末端である。別の実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドでは、第１のＣＨ１領域はＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、第２のＣＬ領域はＦｃ領域部分へのアミノ末端であり；第２の１本鎖ポリペプチドでは、第１のＣＬ領域はＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、第２のＣＨ１領域はＦｃ領域部分へのアミノ末端である。さらに別の実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドでは、第１のＣＨ１領域および第２のＣＬ領域はどちらもＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、第１のＣＨ１領域は第２のＣＬ領域へのアミノ末端であり；第２の１本鎖ポリペプチドでは、第１のＣＬ領域および第２のＣＨ１領域はどちらもＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、第１のＣＬ領域は第２のＣＨ１領域へのアミノ末端である。さらに別の実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドでは、第１のＣＨ１領域および第２のＣＬ領域はどちらもＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、第２のＣＬ領域は第１のＣＨ１領域へのアミノ末端であり；第２の１本鎖ポリペプチドでは、第１のＣＬ領域および第２のＣＨ１領域はどちらもＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、第２のＣＨ１領域は第１のＣＬ領域へのアミノ末端である。さらなる実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドでは、第１のＣＨ１領域および第２のＣＬ領域はどちらもＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、第１のＣＨ１領域は第２のＣＬ領域へのアミノ末端であり；第２の１本鎖ポリペプチドでは、第１のＣＬ領域および第２のＣＨ１領域はどちらもＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、第１のＣＬ領域は第２のＣＨ１領域へのアミノ末端である。別の実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドでは、第１のＣＨ１領域および第２のＣＬ領域はどちらもＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、第２のＣＬ領域は第１のＣＨ１領域へのアミノ末端であり；第２の１本鎖ポリペプチドでは、第１のＣＬ領域および第２のＣＨ１領域のどちらもＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、第２のＣＨ１領域は第１のＣＬ領域へのアミノ末端である。

ある実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）は第１の免疫グロブリンＣＬ領域を含み、第２の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）は第１の免疫グロブリンＣＨ１領域を含む。１つの実施形態では、第１のＣＬ領域は第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、第１のＣＨ１領域は第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端である。別の実施形態では、第１のＣＬ領域は第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、第１のＣＨ１領域は第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端である。さらに別の実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドはさらに第２のＣＬ領域を含み、第２の１本鎖ポリペプチドはさらに第２のＣＨ１領域を含み、第１の１本鎖ポリペプチドの第２のＣＬ領域および第２の１本鎖ポリペプチドの第２のＣＨ１領域はポリペプチドヘテロダイマー中で互いに結合する。例えば、第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分は、第１と第２のＣＬ領域の間に配置されてもよく、第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分は、第１と第２のＣＨ１領域の間に配置されてもよい。また、第１および第２のＣＬ領域はどちらも第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端であり得、第１および第２のＣＨ１領域はどちらも第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端であり得る。さらにまた、第１および第２のＣＬ領域はどちらも第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり得、第１および第２のＣＨ１領域はどちらも第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり得る。

ある実施形態では、第１のＣＬ領域はＣκ領域である。他の実施形態では、第１のＣＬ領域はＣλ領域である。

ある実施形態では、第２のＣＬ領域はＣκ領域である。他の実施形態では、第２のＣＬ領域はＣλ領域である。

ある実施形態では、Ｃκ領域は、野生型ヒト免疫グロブリンＣκ領域である。ある他の実施形態では、Ｃκ領域は、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｑ５２、Ｖ５５、Ｔ５６、Ｔ５６、Ｓ６８、またはＴ７０で置換された野生型ヒトＣκ領域の１つ以上のアミノ酸を有する変化ヒト免疫グロブリンＣκ領域である。例えば、１つ以上のアミノ酸置換は、Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＰｈｅ（Ｆ）から選択され得る。

ある実施形態では、ＣＨ１領域は、６８位のＶａｌ（Ｖ）がＬｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）またはＨｉｓ（Ｈ）により置換されるアミノ酸置換を含む変化ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域であり、ここで、Ｃｋ領域は、２７位のＬｅｕ（Ｌ）がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）により置換されるアミノ酸置換を含む変化ヒト免疫グロブリンＣｋ領域である。ある他の実施形態では、ＣＨ１領域は、６８位のＶａｌ（Ｖ）がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）に変更されるアミノ酸置換を含む変化ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域であり、ここで、Ｃｋ領域は、２７位のＬｅｕ（Ｌ）がＬｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）またはＨｉｓ（Ｈ）に変更されるアミノ酸置換を含む変化ヒト免疫グロブリンＣｋ領域である。

ある実施形態では、Ｃλ領域は野生型ヒト免疫グロブリンＣλ領域である。

ある実施形態では、第１のＣＨ１領域または存在する場合、第２のＣＨ１領域は、野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域、例えば野生型ヒトＩｇＧ１ＣＨ１領域である。

ある実施形態では、第１のＣＨ１領域または存在する場合、第２のＣＨ１領域は変化ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域、例えば変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ１領域であり、野生型ヒト免疫グロブリンＣＬ領域とのジスルフィド結合の形成に関与する野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域のシステインが欠失または置換されている。

ある実施形態では、Ｃκ領域は、変化ヒト免疫グロブリンＣκ領域、例えば、野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域とのジスルフィド結合の形成に関与する野生型ヒトＣκ領域のシステイン残基が欠失または置換されているものである。

ある実施形態では、Ｃλ領域は、野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域とのジスルフィド結合の形成に関与する野生型ヒトＣλ領域のシステイン残基が欠失または置換されている、変化ヒト免疫グロブリンＣλ領域である。

ある実施形態では、第１のＣＨ１領域または存在する場合、第２のＣＨ１領域は、配列番号１１４、８４４または８４５を含むポリペプチドである。

ある実施形態では、存在する場合Ｃｋ領域は、配列番号１４１〜１７８、２０２、および８３８〜８４３を含むポリペプチドのいずれか１つから選択される。

ある実施形態では、存在する場合Ｃλ領域は配列番号１４０を含むポリペプチドである。

ある実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）および第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）はそれぞれ、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、例えばＩｇＧ１ＣＨ２ドメインまたはＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、もしくはＩｇＤＣＨ２ドメインを含む。

ある実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）および第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）はそれぞれ、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、例えばＩｇＧ１ＣＨ３ドメインまたはＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭＣＨ３ドメインを含む。

ある実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）および第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）はそれぞれ、免疫グロブリンＣＨ２ドメインおよび免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。

Ｆｃ領域部分が、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（例えば、ＣＨ１ドメインまたはＣｋドメイン）へのアミノ末端に近接する免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むいくつかの実施形態では、免疫グロブリンＣＨ３ドメインは、１つの１本鎖ポリペプチド中の免疫グロブリンＣＨ３ドメインへのカルボキシル末端に近接するＣＨ１ドメインに配列番号８４６、８４７、８４８、または８４９を含むペプチドを介して結合され；免疫グロブリンＣＨ３ドメインは他の１本鎖ポリペプチド中の免疫グロブリンＣＨ３ドメインへのカルボキシル末端に近接するＣｋドメインに、配列番号８４６、８５０、９５１、または８５２を含むペプチドを介して結合される。

ある実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）および第２の鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）はＩｇＭまたはＩｇＥＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含む。

Ｆｃ領域部分が免疫グロブリンＣＨ２ドメインを含むある実施形態では、ＣＨ２ドメインは、変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ２ドメインであってもよい。例示的な変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ２ドメインとしては（ａ）２９７位でのアミノ酸置換および２３４〜２３８位での少なくとも１つの追加の置換または欠失；（ｂ）２３４〜２３８位での１つ以上のアミノ酸突然変異および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、または３３１位での少なくとも１つの置換；または（ｃ）２９７位のアスパラギンでのアミノ酸置換、２３４〜２３８位での１つ以上の置換または欠失、および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、または３３１位での少なくとも１つの置換を含むものが挙げられる。別の例示的なＣＨ２ドメインはＬ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２位でのアミノ酸置換を含む変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメインである。

ある実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗを含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、第２の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ａ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインである。ある他の実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、第２の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ｔ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインである。ある他の実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインはＴ３６６Ｗ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、第２の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインである。ある他の実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ａ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、第２の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインである。ある他の実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインはＹ４０７Ｔ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、第２の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインはＴ３６６Ｙ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインである。ある他の実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインはＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｗ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、第２の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインはＴ３６６Ｗ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインである。

ある実施形態では、第１および第２の１本鎖ポリペプチドの両方のヒンジは、免疫グロブリンヒンジ領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはＩｇＥヒンジである。ある実施形態では、免疫グロブリンヒンジは、野生型免疫グロブリンヒンジである。ある他の実施形態では、免疫グロブリンヒンジは配列番号２３２、２３４、２４０、６６４〜６７３、６７５および６７６から選択される変化免疫グロブリンヒンジである。

ある実施形態では、ヒンジ領域は、（ａ）Ｆｃ領域部分へのアミノ末端にあり、（ｂ）結合ドメインと免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインの間に配置され、（ｃ）免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインとＦｃ領域部分の間に配置され、（ｄ）第１または第２の１本鎖ポリペプチドのアミノ末端にあり、（ｅ）Ｆｃ領域部分と結合ドメインの間に配置され、または（ｆ）第１または第２の１本鎖ポリペプチドのカルボキシル末端にある。

ある実施形態では、少なくとも１つの第１および第２の１本鎖ポリペプチドヒンジは、Ｃ型レクチンヒンジ領域、例えばＮＫｇ２ＡもしくはＮＫｇ２Ｄペプチド、またはそれらの誘導体である。

ある実施形態では、第１および第２の１本鎖ポリペプチドのヒンジは同一である。ある他の実施形態では、第１および第２の１本鎖ポリペプチドのヒンジは異なる。

ある実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドは、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含み、第２の１本鎖ポリペプチドはＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ２０に特異的に結合する結合ドメインを含む。

ある実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドは、ＣＤ２８に特異的に結合する結合ドメインを含み、第２の１本鎖ポリペプチドは、（ａ）ＣＤ７９ｂ、ハイパーＩＬ−６、もしくはＣＤ８６に特異的に結合する、または（ｂ）ＰＤＬ外部ドメインもしくはモノＩＬ−１０を含む結合ドメインを含む。

ある実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する結合ドメインを含み、第２の１本鎖ポリペプチドはＲＯＮに特異的に結合する結合ドメインを含む。

ある実施形態では、第１および第２の１本鎖ポリペプチドは、配列番号：配列番号２および４、配列番号６および８、配列番号１０および１２、配列番号１４および１６、配列番号１８および２０、配列番号２０および２２、配列番号２０および２４、配列番号３０および３２、配列番号２９および３１、配列番号２９および３２、配列番号３０および７２、配列番号５３および７２、配列番号５４および７２、配列番号５５および７２、配列番号７０および７２、配列番号７１および７２、配列番号６３および５６、配列番号６４および５７、配列番号６５および６０、配列番号６６および５８、配列番号６７および５９、配列番号６８および６１、配列番号６９および６２、配列番号５４および８１１、配列番号５４および８１２、配列番号５４および８１３、配列番号８１４および８１８、配列番号８１５および８１８、配列番号８１６および８１８、配列番号８１７および８１８、配列番号８１４および８２０、配列番号８１４および８２１、配列番号５４および８１９、配列番号８１４および８２６、配列番号８１４および８２２、配列番号８１４および８２３、配列番号８１４および８２４、配列番号８５９および８６２、配列番号８６０および８６３、配列番号８６１および８６４、配列番号８７４および８２５、配列番号８７５および８７９、配列番号８７６および８８０、配列番号８７７および８８１、または配列番号８７８および８８２を含む。

別の態様では、本開示は本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。

別の態様では、本開示は本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーを発現することができる、第１の１本鎖ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび第２の１本鎖ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

別の態様では、本開示は上記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

別の態様では、本開示は、それぞれ、本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーの第１および第２の１本鎖ポリペプチドを発現することができる第１および第２の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

別の態様では、本開示は、（ａ）本明細書で提供される宿主細胞を、第１および第２の１本鎖ポリペプチドを発現するのに好適な条件下で培養すること、および（ｂ）任意で、培養物から第１および第２の１本鎖ポリペプチドから形成されたヘテロダイマーを単離または精製することを含む、ポリペプチドヘテロダイマーを製造する方法を提供する。

別の態様では、本開示は、必要のある患者に有効量の、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、またはその組み合わせに特異的に結合する結合ドメインおよび異なる標的、例えば、腫瘍特異抗原またはＴ細胞活性化が望ましい部位または細胞で最適な他の抗原に特異的に結合する第２の結合ドメインを含むポリペプチドヘテロダイマーを投与することを含む、Ｔ細胞活性化を誘導するための方法を提供する。

別の態様では、本開示は、必要のある患者に有効量の、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、またはその組み合わせに特異的に結合する結合ドメインを含むポリペプチドヘテロダイマーを投与することを含む、悪性腫瘍の増殖、転移、または転移増殖を阻止するための方法を提供する。ある実施形態では、方法はさらに、必要のある患者に化学療法薬または電離放射線を投与することを含む。

別の態様では、本開示は、必要のある患者に有効量の、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、またはＣＤ２８に特異的に結合する結合ドメインを含むポリペプチドヘテロダイマーを投与することを含む、自己免疫または炎症状態を処置するための方法を提供する。

別の態様では、本開示は、必要のある患者に有効量の、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、またはＣＤ３εに特異的に結合する結合ドメインおよびＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７９ｂまたはＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する第２の結合ドメインを含むポリペプチドヘテロダイマーを投与することを含む、Ｂ細胞関連障害または疾患を処置するための方法を提供する。

ある実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーを使用するための方法はさらに、必要のある患者に第２の活性剤、例えば第２のポリペプチドヘテロダイマー、モノクローナル抗体、または免疫グロブリン由来融合タンパク質を投与することをさらに含み得る。
例えば、本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
（ａ）１〜４つの標的に特異的に結合する１〜４つの結合ドメイン、ヒンジ（Ｈ−Ｉ）、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）、およびＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）を含む第１の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−Ｉ）；ならびに
（ｂ）０〜４つの標的に特異的に結合する０〜４つの結合ドメイン、ヒンジ（Ｈ−ＩＩ）、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）、およびＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）を含む第２の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−ＩＩ）
を含むポリペプチドヘテロダイマーであって、
（ｉ）上記第１の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）および上記第２の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）は優先的に互いと結合し、上記第１の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−Ｉ）および上記第２の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−ＩＩ）からなるポリペプチドヘテロダイマーを形成し、
（１）上記第１の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）は第１の免疫グロブリンＣＨ１領域を含み、上記第２の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）は、第１の免疫グロブリンＣＬ領域を含み、あるいは
（２）上記第１の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）は第１の免疫グロブリンＣＬ領域を含み、上記第２の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）は第１の免疫グロブリンＣＨ１領域を含み；ならびに、
（ｉｉ）上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＣＰ−Ｉ）および上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＣＰ−ＩＩ）はそれぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはそれらの任意の組み合わせの免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはそれらの任意の組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３ドメイン；あるいはＩｇＥ、ＩｇＭ、またはそれらの任意の組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含み、
ただし、上記ポリペプチドヘテロダイマーは、少なくとも２つの異なる標的に特異的に結合する少なくとも２つの結合ドメインを含むことを条件とする、ポリペプチドヘテロダイマー。
（項目２）
上記結合ドメインは１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドである、項目１に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目３）
上記ポリペプチドヘテロダイマーは、２つの結合ドメイン（ＢＤ１およびＢＤ２）を含む、項目１に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目４）
上記２つの結合ドメイン（ＢＤ１およびＢＤ２）はどちらも第１の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−Ｉ）上にあり、上記ＨＤ−ＩおよびＦＲＰ−ＩはＢＤ１とＢＤ２の間に配置される、項目３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目５）
上記第１の結合ドメイン（ＢＤ１）は、上記第１の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−Ｉ）上にあり、上記第２の結合ドメイン（ＢＤ２）は上記第２の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−ＩＩ）上にある、項目３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目６）
上記第１の結合ドメイン（ＢＤ１）は上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）へのアミノ末端であり、上記第２の結合ドメイン（ＢＤ２）は上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）へのアミノ末端である、項目５に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目７）
上記第１の結合ドメイン（ＢＤ１）は上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）へのアミノ末端であり、上記第２の結合ドメイン（ＢＤ２）は上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）へのカルボキシル末端である、項目５に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目８）
上記第１の結合ドメイン（ＢＤ１）は上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）へのカルボキシル末端であり、上記第２の結合ドメイン（ＢＤ２）は上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）へのカルボキシル末端である、項目５に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目９）
上記ポリペプチドヘテロダイマーは、３つの結合ドメイン（ＢＤ１、ＢＤ２およびＢＤ３）を含む、項目１に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目１０）
上記ＨＤ−ＩおよびＦＲＰ−ＩはＢＤ１とＢＤ２の間に配置され、上記第３の結合ドメイン（ＢＤ３）は上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）へのアミノ末端である、項目９に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目１１）
上記ＨＤ−ＩおよびＦＲＰ−ＩはＢＤ１とＢＤ２の間に配置され、上記第３の結合ドメイン（ＢＤ３）は上記第２の１本鎖ポリペプチド（ＦＲＰ−ＩＩ）のＦｃ領域部分へのカルボキシル末端である、項目９に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目１２）
上記ポリペプチドヘテロダイマーは４つの結合ドメイン（ＢＤ１、ＢＤ２、ＢＤ３、およびＢＤ４）含む、項目１に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目１３）
上記ＨＤ−ＩおよびＦＲＰ−ＩはＢＤ１とＢＤ２の間に配置され、上記ＨＤ−ＩＩおよびＦＲＰ−ＩＩは、ＢＤ３とＢＤ４の間に配置される、項目１２に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目１４）
上記ポリペプチドヘテロダイマーは５〜８つの結合ドメインを含む、項目１に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目１５）
上記結合ドメインの少なくとも１つは、ＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ２８、ＣＤ７９ｂ、ハイパーＩＬ−６、モノＩＬ−１０、ＣＤ８６、ＣＤ２０、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｒｏｎ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＥＡＣＡＭ−６、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＨＶＥＭ、ＬＴＢＲ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１〜４、アンジオポエチン２、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ１６、ＣＤ７１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＷＥＡＫＲ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡ、ＦＡＳ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８，ＣＤ７０、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ハイパーＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１７Ａ／Ｃ、ＩＰ−１０、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＳＬ、ＴＧＦβ、ＩＬ１０、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬ、ＨＧＦ、ＭＳＰ、ＥＧＦ（例えばエピレギュリン、ヘレグリン、β−レグリン、ニューレグリン）、ＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ、ＴＮＦα、Ｗｎｔ、ｓＨＨ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＣＴＡ−１、ＳＴＥＡＰ−１、ＰＳＣＡ、ＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１５１、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＴＲＯＰ２、ＣＣＲ５、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５_ＡＣ、ＭＵＣ５_ｂ、ＭＵＣ７、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グロボＨ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）ＩｇＥ、メラノーマ硫酸コンドロイチンプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦα前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６；デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカーおよびミュラー管抑制因子（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアル酸付加Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ１５１、ＴＧＦＢＲ２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０、ＴＮＦＲ２、ＯＳＭＲβ、Ｐａｔｃｈｅｄ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｒｏｂｏ１、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＬＩＦＲβ、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９に特異的に結合する、またはそのアンタゴニストである、項目１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目１６）
上記結合ドメインの少なくとも１つは、ＩＬ−１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＧＦ、ＩＬ−３５、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＷＥＡＫＲ、またはＦＡＳのアゴニストである、項目１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目１７）
少なくとも１つの結合ドメインは、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合し、少なくとも別の結合ドメインは、ＰＳＭＡ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２０、ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、またはＣＥＡＣＡＭ−６に特異的に結合する、項目１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目１８）
少なくとも１つの結合ドメインはＣＤ２８に特異的に結合し、少なくとも別の結合ドメインはＣＤ７９ｂ、ハイパーＩＬ−６、ＰＤＬ２、モノＩＬ−１０、ＣＤ８６、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０、ＰＤＬ１、ＨＶＥＭ、またはＬＴＢＲに特異的に結合する、またはそのアンタゴニストである、項目１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目１９）
少なくとも１つの結合ドメインはＣＤ２８に特異的に結合し、少なくとも別の結合ドメインはＩＬ−１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＧＦ、ＩＬ−３５、ＰＤ−１、またはＢＴＬＡのアゴニストである、項目１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目２０）
上記第１の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）は第１の免疫グロブリンＣＨ１領域を含み、上記第２の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）は第１の免疫グロブリンＣＬ領域を含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目２１）
上記第１のＣＨ１領域は上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、上記第１のＣＬ領域は上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端である、項目２０に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目２２）
上記第１のＣＨ１領域は上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、上記第１のＣＬ領域は上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端である、項目２０に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目２３）
上記第１の１本鎖ポリペプチドはさらに、第２のＣＨ１領域を含み、上記第２の１本鎖ポリペプチドはさらに、第２のＣＬ領域を含み、上記第１の１本鎖ポリペプチドの第２のＣＨ１領域および上記第２の１本鎖ポリペプチドの第２のＣＬ領域は、上記ポリペプチドヘテロダイマー中で互いに結合する、項目２０に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目２４）
上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分は、第１と第２のＣＨ１領域の間に配置され、上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分は第１と第２のＣＬ領域の間に配置される、項目２３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目２５）
上記第１および第２のＣＨ１領域はどちらも上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、上記第１および第２のＣＬ領域はどちらも上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端である、項目２３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目２６）
上記第１および第２のＣＨ１領域はどちらも上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、上記第１および第２のＣＬ領域はどちらも上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端である、項目２３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目２７）
上記第１の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）は第１の免疫グロブリンＣＬ領域を含み、上記第２の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）は第１の免疫グロブリンＣＨ１領域を含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目２８）
上記第１のＣＬ領域は上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、上記第１のＣＨ１領域は上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端である、項目２７に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目２９）
上記第１のＣＬ領域は上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、上記第１のＣＨ１領域は上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端である、項目２７に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目３０）
上記第１の１本鎖ポリペプチドはさらに、第２のＣＬ領域を含み、上記第２の１本鎖ポリペプチドはさらに、第２のＣＨ１領域を含み、上記第１の１本鎖ポリペプチドの第２のＣＬ領域および上記第２の１本鎖ポリペプチドの第２のＣＨ１領域は、上記ポリペプチドヘテロダイマー中で互いに結合する、項目２７に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目３１）
上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分は、第１と第２のＣＬ領域の間に配置され、上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分は、第１と第２のＣＨ１領域の間に配置される、項目３０に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目３２）
上記第１および第２のＣＬ領域はどちらも上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、上記第１および第２のＣＨ１領域はどちらも上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端である、項目３０に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目３３）
上記第１および第２のＣＬ領域のどちらも上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、上記第１および第２のＣＨ１領域はどちらも上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端である、項目３０に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目３４）
上記第１の１本鎖ポリペプチドはさらに第２のＣＬ領域を含み、上記第２の１本鎖ポリペプチドはさらに第２のＣＨ１領域を含み、上記第１の１本鎖ポリペプチドの第２のＣＬ領域および上記第２の１本鎖ポリペプチドの第２のＣＨ１領域は上記ポリペプチドヘテロダイマー中で互いに結合する、項目２０に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目３５）
（ａ）上記第１の１本鎖ポリペプチド中では、上記第１のＣＨ１領域は上記Ｆｃ領域部分へのアミノ末端であり、上記第２のＣＬ領域は上記Ｆｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、
（ｂ）上記第２の１本鎖ポリペプチド中では、上記第１のＣＬ領域は上記Ｆｃ領域部分へのアミノ末端であり、上記第２のＣＨ１領域は上記Ｆｃ領域部分へのカルボキシル末端である、
項目３４に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目３６）
（ａ）上記第１の１本鎖ポリペプチド中では、上記第１のＣＨ１領域は上記Ｆｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、上記第２のＣＬ領域は上記Ｆｃ領域部分へのアミノ末端であり、
（ｂ）上記第２の１本鎖ポリペプチド中では、上記第１のＣＬ領域は上記Ｆｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、上記第２のＣＨ１領域は上記Ｆｃ領域部分へのアミノ末端である、
項目３４に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目３７）
（ａ）上記第１の１本鎖ポリペプチド中では、上記第１のＣＨ１領域および上記第２のＣＬ領域はどちらも上記Ｆｃ領域部分へのアミノ末端であり、上記第１のＣＨ１領域は上記第２のＣＬ領域へのアミノ末端であり、
（ｂ）上記第２の１本鎖ポリペプチド中では、上記第１のＣＬ領域および上記第２のＣＨ１領域のどちらも上記Ｆｃ領域部分へのアミノ末端であり、上記第１のＣＬ領域は上記第２のＣＨ１領域へのアミノ末端である、
項目３４に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目３８）
（ａ）上記第１の１本鎖ポリペプチド中では、上記第１のＣＨ１領域および上記第２のＣＬ領域はどちらも上記Ｆｃ領域部分へのアミノ末端であり、上記第２のＣＬ領域は上記第１のＣＨ１領域へのアミノ末端であり、
（ｂ）上記第２の１本鎖ポリペプチド中では、上記第１のＣＬ領域および上記第２のＣＨ１領域はどちらも上記Ｆｃ領域部分へのアミノ末端であり、上記第２のＣＨ１領域は上記第１のＣＬ領域へのアミノ末端である、
項目３４に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目３９）
（ａ）上記第１の１本鎖ポリペプチド中では、上記第１のＣＨ１領域および上記第２のＣＬ領域はどちらも上記Ｆｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、上記第１のＣＨ１領域は上記第２のＣＬ領域へのアミノ末端であり、
（ｂ）上記第２の１本鎖ポリペプチド中では、上記第１のＣＬ領域および上記第２のＣＨ１領域はどちらも上記Ｆｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、上記第１のＣＬ領域は上記第２のＣＨ１領域へのアミノ末端である、
項目３４に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目４０）
（ａ）上記第１の１本鎖ポリペプチド中では、上記第１のＣＨ１領域および上記第２のＣＬ領域はどちらも上記Ｆｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、上記第２のＣＬ領域は上記第１のＣＨ１領域へのアミノ末端であり、
（ｂ）上記第２の１本鎖ポリペプチド中では、上記第１のＣＬ領域および上記第２のＣＨ１領域はどちらも上記Ｆｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、上記第２のＣＨ１領域は上記第１のＣＬ領域へのアミノ末端である、
項目３４に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目４１）
上記第１のＣＬ領域はＣκ領域である、項目１〜４０のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目４２）
上記第１のＣＬ領域はＣλ領域である、項目１〜４０のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目４３）
上記第２のＣＬ領域はＣκ領域である、項目２４〜２７および３１〜４１のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目４４）
上記第２のＣＬ領域はＣλ領域である、項目２３〜２６および３０〜４０のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目４５）
上記Ｃκ領域は野生型ヒト免疫グロブリンＣκ領域である、項目４１または４３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目４６）
上記Ｃκ領域は、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｑ５２、Ｖ５５、Ｔ５６、Ｔ５６、Ｓ６８、またはＴ７０で置換された野生型ヒトＣκ領域の１つ以上のアミノ酸を有する変化ヒト免疫グロブリンＣκ領域である、項目４１または４３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目４７）
上記１つ以上のアミノ酸置換は、Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＰｈｅ（Ｆ）から選択される、項目４６に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目４８）
上記ＣＨ１領域は、６８位でのＶａｌ（Ｖ）がＬｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）またはＨｉｓ（Ｈ）により置換されたアミノ酸置換を含む変化ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域であり、上記Ｃｋ領域は、２９位でのＬｅｕ（Ｌ）がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）により置換されたアミノ酸置換を含む変化ヒト免疫グロブリンＣｋ領域である、項目４１または４３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目４９）
上記ＣＨ１領域は、６８位でのＶａｌ（Ｖ）がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）に変更されるアミノ酸置換を含む変化ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域であり、上記Ｃｋ領域は２９位でのＬｅｕ（Ｌ）がＬｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）またはＨｉｓ（Ｈ）に変更されるアミノ酸置換を含む変化ヒト免疫グロブリンＣｋ領域である、項目４１または４３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目５０）
上記Ｃλ領域は野生型ヒト免疫グロブリンＣλ領域である、項目４２または４４に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目５１）
上記第１のＣＨ１領域または存在する場合、第２のＣＨ１領域は、野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域である、項目１〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目５２）
上記第１のＣＨ１領域または存在する場合、第２のＣＨ１領域は、野生型ヒトＩｇＧ１
ＣＨ１領域である、項目１〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目５３）
上記第１のＣＨ１領域または存在する場合、第２のＣＨ１領域は、野生型ヒト免疫グロブリンＣＬ領域とジスルフィド結合を形成するのに関与する野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域のシステインが欠失または置換されている変化ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域である、項目１〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目５４）
上記第１のＣＨ１領域または存在する場合、第２のＣＨ１領域は、野生型ヒト免疫グロブリンＣＬ領域とジスルフィド結合を形成するのに関与する野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域のシステインが欠失または置換されている変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ１領域である、項目１〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目５５）
上記Ｃκ領域は野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域とジスルフィド結合を形成するのに関与する野生型ヒトＣκ領域のシステイン残基が欠失または置換されている変化ヒト免疫グロブリンＣκ領域である、項目４１または４３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目５６）
上記Ｃλ領域は、野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域とジスルフィド結合を形成するのに関与する野生型ヒトＣλ領域のシステイン残基が欠失または置換されている変化ヒト免疫グロブリンＣλ領域である、項目４２または４４に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目５７）
上記第１のＣＨ１領域および存在する場合、第２のＣＨ１領域は配列番号１１４、８４４または８４５を含むポリペプチドである、項目５３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目５８）
上記Ｃｋ領域は配列番号１４１〜１７８、２０２、および８３８〜８４３を含むポリペプチドのいずれか一つから選択される、項目４６または５５に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目５９）
上記Ｃλ領域は配列番号１４０を含むポリペプチドである、項目５０または５６に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目６０）
上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）および上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）はそれぞれ、免疫グロブリンＣＨ２ドメインを含む、項目１〜５９のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目６１）
上記免疫グロブリンＣＨ２ドメインはＩｇＧ１ＣＨ２ドメインである、項目６０に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目６２）
上記免疫グロブリンＣＨ２ドメインはＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤＣＨ２ドメインである、項目６０に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目６３）
上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）および上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）はそれぞれ、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、項目１〜５９のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目６４）
上記免疫グロブリンＣＨ３ドメインはＩｇＧ１ＣＨ３ドメインである、項目６３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目６５）
上記免疫グロブリンＣＨ３ドメインはＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭＣＨ３ドメインである、項目６３に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目６６）
上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）および上記第２の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）はそれぞれ、免疫グロブリンＣＨ２ドメインおよび免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む、項目１〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目６７）
（ｉ）上記免疫グロブリンＣＨ３ドメインは、１つの１本鎖ポリペプチド中の上記免疫グロブリンＣＨ３ドメインへのカルボキシル末端に近接するＣＨ１ドメインに配列番号８４６、８４７、８４８、または８４９を含むペプチドを介して結合され、
（ｉｉ）上記免疫グロブリンＣＨ３ドメインは、他の１本鎖ポリペプチド中の上記免疫グロブリンＣＨ３ドメインへのカルボキシル末端に近接するＣｋドメインに、配列番号８４６、８５０、９５１、または８５２を含むペプチドを介して結合される、項目６６に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目６８）
上記免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤＣＨ２およびＣＨ３ドメインである、項目６６に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目６９）
上記第１の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）および上記第２の鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）はＩｇＭまたはＩｇＥＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含む、項目１〜５９のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目７０）
上記ＣＨ２ドメインは２９７位でのアミノ酸置換および２３４〜２３８位での少なくとも１つの追加の置換または欠失を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ２ドメインである、項目６０〜６２および６６〜６８のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目７１）
上記ＣＨ２ドメインは、２３４〜２３８位での１つ以上のアミノ酸突然変異および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、または３３１位での少なくとも１つの置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ２ドメインである、項目６０〜６２および６６〜６８のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目７２）
上記ＣＨ２ドメインは２９７位のアスパラギンでのアミノ酸置換、２３４〜２３８位での１つ以上の置換または欠失、および２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、または３３１位での少なくとも１つの置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ２ドメインである、項目６０〜６２および６６〜６８のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目７３）
上記ＣＨ２ドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２位でのアミノ酸置換を含む変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメインである、項目６０〜６２および６６〜６８のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目７４）
（ａ）上記第１の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗを含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、上記第２の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ａ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、
（ｂ）上記第１の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、上記第２の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ｔ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、
（ｃ）上記第１の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、上記第２の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、
（ｄ）上記第１の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ａ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、上記第２の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、
（ｅ）上記第１の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ｔ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、上記第２の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｙ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、あるいは
（ｆ）上記第１の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｗ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインであり、上記第２の１本鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ置換を含む変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ＣＨ３ドメインである、項目６３〜６７のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目７５）
上記第１および第２の１本鎖ポリペプチドの両方のヒンジは免疫グロブリンヒンジ領域である、項目１〜７４のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目７６）
上記免疫グロブリンヒンジはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはＩｇＥヒンジである、項目７５に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目７７）
上記免疫グロブリンヒンジは野生型免疫グロブリンヒンジである、項目７５に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目７８）
上記免疫グロブリンヒンジは、配列番号２３２、２３４、２４０、６６４〜６７３、６７５および６７６から選択される変化免疫グロブリンヒンジである、項目７５に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目７９）
上記ヒンジ領域は、
（ａ）上記Ｆｃ領域部分へのアミノ末端にあり、
（ｂ）上記結合ドメインと上記免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインの間に配置され、
（ｃ）上記免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインと上記Ｆｃ領域部分との間に配置され、または
（ｄ）上記第１または第２の１本鎖ポリペプチドのアミノ末端にある、項目７５〜７８のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目８０）
上記第１および第２の１本鎖ポリペプチドヒンジの少なくとも１つはＣ型レクチンヒンジ領域である、項目１〜７４のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目８１）
上記Ｃ型レクチンヒンジ領域は、ＮＫｇ２ＡもしくはＮＫｇ２Ｄペプチド、またはそれらの誘導体である、項目８０に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目８２）
上記ヒンジ領域は上記Ｆｃ領域部分と結合ドメインの間、または上記第１もしくは第２の１本鎖ポリペプチドのカルボキシル末端に配置される、項目８０または８１に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目８３）
上記第１および第２の１本鎖ポリペプチドのヒンジは同一である、項目１〜８２のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目８４）
上記第１および第２の１本鎖ポリペプチドのヒンジは異なる、項目１〜８２のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマー。
（項目８５）
上記第１の１本鎖ポリペプチドはＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する結合ドメインを含み、上記第２の１本鎖ポリペプチドはＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ２０に特異的に結合する結合ドメインを含む、項目１〜１４および２０〜８４のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。
（項目８６）
上記第１の１本鎖ポリペプチドはＣＤ２８に特異的に結合する結合ドメインを含み、上記第２の１本鎖ポリペプチドは、（ａ）ＣＤ７９ｂ、ハイパーＩＬ−６、またはＣＤ８６に特異的に結合する、あるいは（ｂ）ＰＤＬ外部ドメインまたはモノＩＬ−１０を含む結合ドメインを含む、項目１〜１４および２０〜８４のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。
（項目８７）
上記第１の１本鎖ポリペプチドは、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する結合ドメインを含み、上記第２の１本鎖ポリペプチドは、ＲＯＮに特異的に結合する結合ドメインを含む、項目１〜１４および２０〜８４のいずれか一項に記載のヘテロダイマー。
（項目８８）
上記第１および第２の１本鎖ポリペプチドは、配列番号２および４、配列番号６および８、配列番号１０および１２、配列番号１４および１６、配列番号１８および２０、配列番号２０および２２、配列番号２０および２４、配列番号３０および３２、配列番号２９および３１、配列番号２９および３２、配列番号３０および７２、配列番号５３および７２、配列番号５４および７２、配列番号５５および７２、配列番号７０および７２、配列番号７１および７２、配列番号６３および５６、配列番号６４および５７、配列番号６５および６０、配列番号６６および５８、配列番号６７および５９、配列番号６８および６１、配列番号６９および６２、配列番号５４および８１１、配列番号５４および８１２、配列番号５４および８１３、配列番号８１４および８１８、配列番号８１５および８１８、配列番号８１６および８１８、配列番号８１７および８１８、配列番号８１４および８２０、配列番号８１４および８２１、配列番号５４および８１９、配列番号８１４および８２６、配列番号８１４および８２２、配列番号８１４および８２３、配列番号８１４および８２４、配列番号８５９および８６２、配列番号８６０および８６３、配列番号８６１および８６４、配列番号８７４および８２５、配列番号８７５および８７９、配列番号８７６および８８０、配列番号８７７および８８１、または配列番号８７８および８８２を含む、項目１に記載のヘテロダイマー。
（項目８９）
項目１〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマーおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物。
（項目９０）
上記第１の１本鎖ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび上記第２の１本鎖ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、項目１〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマーを発現することができる発現ベクター。
（項目９１）
項目９０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目９２）
それぞれ、項目１〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマーの上記第１および第２の１本鎖ポリペプチドを発現することができる第１および第２の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目９３）
（ａ）項目９１または９２の宿主細胞を第１および第２の１本鎖ポリペプチドを発現するのに好適な条件下で培養すること、および
（ｂ）任意で、上記第１および第２の１本鎖ポリペプチドから形成されたヘテロダイマーを上記培養物から単離または精製すること
を含む、ポリペプチドヘテロダイマーを製造するための方法。
（項目９４）
必要のある患者に有効量の、項目１〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマーを投与することを含み、上記ポリペプチドヘテロダイマーは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εまたはその組み合わせに特異的に結合する結合ドメイン、および異なる標的に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む、Ｔ細胞活性化を誘導するための方法。
（項目９５）
必要のある患者に有効量の、項目１〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマーを投与することを含み、上記ポリペプチドヘテロダイマーは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ｃ−Ｍｅｔ、またはＲｏｎに特異的に結合する結合ドメインを含む、悪性腫瘍の増殖、転移、または転移増殖を阻止するための方法。
（項目９６）
必要のある患者に有効量の、項目１〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマーを投与することを含み、上記ポリペプチドヘテロダイマーは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、またはＣＤ２８に特異的に結合する結合ドメインを含む、自己免疫または炎症状態を処置するための方法。
（項目９７）
必要のある患者に有効量の、項目１〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチドヘテロダイマーを投与することを含み、上記ポリペプチドヘテロダイマーは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、またはＣＤ３εに特異的に結合する結合ドメイン、およびＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７９ｂまたはＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する第２の結合ドメインを含む、Ｂ細胞関連障害または疾患を処置するための方法。
（項目９８）
必要のある患者に化学療法薬または電離放射線を投与することをさらに含む項目９５に記載の方法。
（項目９９）
必要のある患者に第２の活性剤を投与することをさらに含む項目９４〜９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
上記第２の活性剤は、項目１〜８８のいずれか一項に記載の第２のポリペプチドヘテロダイマーである、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
上記第２の活性剤はモノクローナル抗体または免疫グロブリン由来融合タンパク質である、項目９９に記載の方法。

二価抗ＣＤ２８ポリペプチドヘテロダイマーＸ０１７２（左）およびＸ０１７２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（右）の略図である。「ＮＲ」は「非還元」を表し、「Ｒｅｄ」は「還元」を表す。一価（Ｘ０１２４）および二価（Ｘ０１７２）抗ＣＤ２８ポリペプチドヘテロダイマーはどちらも、抗ＣＤ２８ｓｃＦｖ（２Ｅ１２ｓｃＦｖ）と比べた場合、精製ヒトＴ細胞を刺激するのに最適濃度以下のＰＭＡと協同するが、二価抗ＣＤ２８ＳＭＩＰタンパク質（２Ｅ１２ＳＭＩＰ）より低いことを示す。二価ポリペプチドヘテロダイマーＸ０１７２は、２Ｅ１２ｓｃＦｖおよび一価ポリペプチドヘテロダイマーＸ０１２４よりもよくＣＤ４^＋Ｔ細胞に結合することを示す。ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２５１、Ｘ０２５２およびＸ０２５３のカチオン交換クロマトグラフィーを示し（左）、同じポリペプチドヘテロダイマーの非還元（ＮＲ）および還元（Ｒｅｄ）条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析を示す（右）。ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２５２の質量スペクトルを示し、これはヘテロダイマーが主要種であることを証明する。ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２８３およびＸ０２８４の、非還元（ＮＲ）および還元（Ｒｅｄ）条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析（左）およびポリペプチドヘテロダイマーＸ０２８３のカチオン交換クロマトグラフィー分析を示す。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析により試験したポリペプチドヘテロダイマーＸ０２８３によるＣＤ８６への直接結合を示し、応答単位（Ｒｕ）が時間に対しプロットされ（左）、Ｘ０２８３の略図が示される。二特異性抗ＲＯＮおよび抗ＣＤ３コンストラクト（ポリペプチドヘテロダイマーＳ０２６８およびＳＣＯＲＰＩＯＮタンパク質Ｓ０２６６）のＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞への（Ａ）および単離されたＴ細胞への結合を示す（Ｂ）。二特異性抗ＲＯＮおよび抗ＣＤ３コンストラクト（ポリペプチドヘテロダイマーＳ０２６８およびＳＣＯＲＰＩＯＮタンパク質Ｓ０２６６）のＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞への（Ａ）および単離されたＴ細胞への結合を示す（Ｂ）。抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３結合ドメインのいずれかを有する（ＴＳＣ０２０）または抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３結合ドメインを有する（ＴＳＣ０２１）二特異性ヘテロダイマーによる、（Ａ）Ｒｅｃ１（ＣＤ１９^＋、ＣＤ２０^＋）細胞または（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ３^＋）細胞への結合の特異性を示す。抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３結合ドメインのいずれかを有する（ＴＳＣ０２０）または抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３結合ドメインを有する（ＴＳＣ０２１）二特異性ヘテロダイマーによる、（Ａ）Ｒｅｃ１（ＣＤ１９^＋、ＣＤ２０^＋）細胞または（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ３^＋）細胞への結合の特異性を示す。（ＡおよびＢ）Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９^＋）細胞または（ＣおよびＤ）ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＣＤ１９⁻）細胞を用いた二特異性ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０７８、ＴＳＣ０７９、およびｂｓｃ１９ｘ３（ＴＳＣ０３６）に応答するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示す。（ＡおよびＢ）Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９^＋）細胞または（ＣおよびＤ）ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＣＤ１９⁻）細胞を用いた二特異性ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０７８、ＴＳＣ０７９、およびｂｓｃ１９ｘ３（ＴＳＣ０３６）に応答するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示す。（Ａ）Ｄａｕｄｉ（ＲＯＮ⁻、ＣＤ１９^＋）細胞または（Ｂ）ＢｘＰＣ−３（ＲＯＮ^＋、ＣＤ１９⁻）細胞を用いたクロム（^５１Ｃｒ）放出アッセイにおける、二特異性ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０７８、ＴＳＣ０７９、およびＳ０２６８により誘導されたＴ細胞指向細胞毒性を示す。（Ａ）Ｄａｕｄｉ（ＲＯＮ⁻、ＣＤ１９^＋）細胞または（Ｂ）ＢｘＰＣ−３（ＲＯＮ^＋、ＣＤ１９⁻）細胞を用いたクロム（^５１Ｃｒ）放出アッセイにおける、二特異性ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０７８、ＴＳＣ０７９、およびＳ０２６８により誘導されたＴ細胞指向細胞毒性を示す。二特異性ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ１６５、ＴＳＣ１６６、ＴＳＣ１６７、ＴＳＣ１６８およびＴＳＣ１００を０．１ｐＭ〜１００００ｐＭの濃度で使用する、ＣＤ１９＋株細胞（Ｄａｕｄｉ）により誘導される標的依存性Ｔ細胞増殖を示す。ＣＤ１９＋株細胞（Ｄａｕｄｉ）により、二特異性ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ１２７およびＴＳ１６５、ならびに対照としてのｂｓｃ１９ｘ３ＢｉＴＥを、０．００１ｐＭ〜１０００ｐＭの濃度で使用して、誘導される標的依存性Ｔ細胞増殖を示す。二特異性ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ１００、ＴＳＣ１６５、ＴＣ１６６、ＴＳＣ１６７、およびＴＳＣ１６８を使用した、ＣＤ１９＋株細胞（Ｄａｕｄｉ）に対する標的依存性再指向Ｔ細胞細胞毒性を示す。

本開示は、２つの異なる１本鎖ポリペプチド間で、免疫グロブリンＣＨ１領域および免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）の自然ヘテロ二量化を介して形成されるポリペプチドヘテロダイマーを提供する。ポリペプチドヘテロダイマーは１つ以上の標的（例えば、抗原、受容体、またはリガンド）に特異的に結合する２つ以上の結合ドメインを有する。加えてヘテロダイマーの両方の鎖はそれぞれさらに、Ｆｃ領域部分（例えば、免疫グロブリンＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン）を含む。本開示はまた、ポリペプチドヘテロダイマーを製造するための核酸、ベクター、宿主細胞および方法を提供する。

本明細書で記載されるヘテロ二量化技術は下記利点の１つ以上を有する：（１）ダイマーが免疫グロブリンＣＨ１領域および免疫グロブリンＣＬ領域の自然ヘテロ二量化を介して形成されることによる、ポリペプチドヘテロダイマーの最小免疫原性の可能性；（２）実施例で示されるように、２つの異なる１本鎖ポリペプチドを同時発現することにより本開示のポリペプチドヘテロダイマーの効率的な生成および精製が可能である；（３）変異誘発により上方または下方調節することができるＦｃエフェクター機能（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ）を媒介する能力、および本開示によるポリペプチドヘテロダイマーの各鎖がＦｃ領域部分（例えば、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を有するためのより長い血清半減期；ならびに（４）本開示のポリペプチドヘテロダイマーは、抗体分子よりも典型的に小さいサイズを有し、よって、例えば固形悪性腫瘍中へのより良好な組織浸透が可能になる。

本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーは治療薬または免疫エフェクター細胞を標的細胞に向かわせるのに有用である。例えば、ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは、ＴＣＲ複合体またはその構成要素（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε）に特異的に結合する結合ドメインおよび第２の異なる標的、例えばオンコロジー標的（例えば、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、ＣＥＡＣＡＭ−６およびＰＳＭＡ）またはＢ細胞標的（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ２０）に特異的に結合する別の結合ドメインを含んでもよい。第２の異なる標的に特異的な結合ドメインは、ＴＣＲ複合体またはその構成要素、例えばＣＤ３に対する結合ドメインの親和性よりも、その標的に対しより高い親和性を有し得る。そのようなポリペプチドヘテロダイマーは、最初に、オンコロジー標的またはＢ細胞標的に優先的に結合し、その後、オンコロジー標的またはＢ細胞標的を発現する腫瘍または癌細胞にＴ細胞を動員し、悪性腫瘍（Ｂ細胞癌を含む）の増殖、転移または転移増殖の阻止に有用である。本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーの追加の用途としては、Ｔ細胞活性化の指向および自己免疫または炎症状態の処置が挙げられる。

本明細書で使用されるセクション表題は、組織目的のためのものにすぎず、記載される主題を制限するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含むが、それらに限定されない、本明細書で引用される全ての文書、または文書の一部は、いかなる目的に対しても、参照によりその全体が明確に本明細書に組み込まれる。１つ以上の組み込まれた文書または文書の一部が規定する用語が、本出願における用語の定義と矛盾する場合、本出願で現れる定義が支配する。

本記載では、いずれの濃度範囲、パーセンテージ範囲、比範囲、または整数範囲も、別記されない限り、列挙された範囲内の任意の整数値、および適切な場合、その分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解されるべきである。本明細書では、「約」は、別記されない限り、示された範囲、値、配列、または構造の±２０％を意味する。本明細書では「１つの（ａおよびａｎ）」という用語は、別記されない限りまたはその文脈で指示されない限り、列挙された構成要素の「１つ以上」を示すことが理解されるべきである。選択肢（例えば「または」）の使用は、選択肢の１つ、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書では、「含む」および「備える」という用語は同義に使用される。加えて、本明細書で記載される構造および置換成分（例えば、ドメイン、領域、ヒンジ、およびリンカー）の様々な組み合わせから誘導される個々の１本鎖ポリペプチまたはヘテロダイマーは、本出願により、各１本鎖ポリペプチドまたはヘテロダイマーが個別に説明されたかのように同じ程度まで開示されることが理解されるべきである。よって、個々の１本鎖ポリペプチドまたはヘテロダイマーを形成するための特定の構成要素の選択は、本開示の範囲内にある。

本明細書では、タンパク質の他の部分（例えば、アミノまたはカルボキシ末端あるいは２つのドメイン間のアミノ酸）が、組み合わされて、タンパク質の長さのせいぜい２０％（例えば、せいぜい１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）を占め、様々なドメインの活性（例えば、結合ドメインの標的結合親和性、Ｆｃ領域部分の活性、およびヘテロ二量化を促進する際の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインの能力）に実質的には影響しない（すなわち５０％を超えて、例えば４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％を超えて活性を減少させない）場合、タンパク質はいくつかのドメイン（例えば、標的に特異的に結合する結合ドメイン、ヒンジ、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン、およびＦｃ領域部分）から「本質的に構成される」。ある実施形態では、タンパク質（例えば、１本鎖ポリペプチド）は、標的に特異的に結合する結合ドメイン、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン、ヒンジ、およびＦｃ領域部分から本質的に構成され、タンパク質のアミノおよび／またはカルボキシ末端および／または２つの異なるドメイン間（例えば、結合ドメインと免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインの間、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインとヒンジの間、および／またはヒンジとＦｃ領域部分の間）に接合アミノ酸を含んでもよい。

本明細書では、「ポリペプチドヘテロダイマー」または「ヘテロダイマー」は、２つの異なる１本鎖ポリペプチドから形成されるダイマーを示す。この用語は、４つの１本鎖ポリペプチド（すなわち、２つの軽鎖および２つの重鎖）から形成される抗体を含まない。「ダイマー」は、１つ以上の形態の分子内力、例えば共有結合（例えば、ジスルフィド結合）および他の相互作用（例えば、静電相互作用、塩橋、水素結合、および疎水性相互作用）を介して互いに結合された２つのサブユニットから構成され、適切な条件下（例えば、生理条件下、組換えタンパク質の発現、精製および／または貯蔵に好適な水溶液中、または非変性および／または非還元電気泳動のための条件下）で安定である生物学的実体を示す。

「１本鎖ポリペプチド」は、共有結合されたアミノ酸の１本のの直線状の連続した配列である。これは非線形様式で、例えば、鎖間ジスルフィド結合を介して共に結合する２つのポリペプチド鎖(例えば、軽鎖が重鎖とジスルフィド結合を介して結合する半免疫グロ
ブリン分子)は含まない。ある実施形態では、１本鎖ポリペプチドは、１つ以上の鎖内ジ
スルフィド結合を有する、または形成することができる。

本明細書では、「免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン」は、別の１本鎖ポリペプチドの異なる免疫グロブリンドメインと優先的に相互作用する、または結合する１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンドメインを示し、ここで、異なるヘテロ二量化ドメインの相互作用は、第１および第２の１本鎖ポリペプチドのヘテロ二量化（すなわち、２つの異なる１本鎖ポリペプチド間のダイマーの形成、これはまた、「ヘテロダイマー」とも呼ばれる）に実質的に貢献し、またはこれを効率的に促進する。ヘテロ二量化ドメイン間の相互作用（複数可）は、第１の１本鎖ポリペプチドのヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）および／または第２の１本鎖ポリペプチドのヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）のない場合の第１および第２の１本鎖ポリペプチド間の二量体化において統計学的に有意な減少がある場合、第１および第２の１本鎖ポリペプチドのヘテロ二量化に「実質的に貢献し、またはこれを効率的に促進する」。ある実施形態では、第１および第２の１本鎖ポリペプチドが同時発現される場合、少なくとも６０％、少なくとも約６０％〜約７０％、少なくとも約７０％〜約８０％、少なくとも約８０％〜約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％、および少なくとも約９０％〜約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の第１および第２の１本鎖ポリペプチドが、互いにヘテロダイマーを形成する。本開示の代表的な免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインとしては、免疫グロブリンＣＨ１領域、免疫グロブリンＣＬ領域（例えば、ＣκまたはＣλアイソタイプ）、またはその誘導体、例えば、本明細書で提供される、野生型免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬ領域ならびに変化（または変異）免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬ領域が挙げられる。

本明細書では、「結合ドメイン」または「結合領域」は、標的（例えば、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ）を特異的に認識し、結合する能力を有するタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを示す。結合ドメインは、生体分子または対象の他の標的に対する任意の天然、合成、半合成、または組換えにより生成された結合パートナーを含む。例示的な結合ドメインとしては１本鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）、受容体外部ドメイン（例えば、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ）、またはリガンド（例えば、サイトカイン、ケモカイン）が挙げられる。特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための様々なアッセイが知られており、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット、ＥＬＩＳＡ、およびＢｉａｃｏｒｅ分析が挙げられる。

結合ドメインおよびその融合タンパク質は、１０^５Ｍ^−１以上である親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡結合定数）で標的に結合するが、試験試料中に存在する他の構成要素には有意には結合しないで、標的に「特異的に結合する」。結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、「高親和性」結合ドメイン（またはその融合タンパク質）および「低親和性」結合ドメイン（またはその融合タンパク質）として分類され得る。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０^７Ｍ^−１、少なくとも１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、または少なくとも１０^１３Ｍ^−１のＫ_ａを有する結合ドメインを示す。「低親和性」結合ドメインは最大１０^７Ｍ^−１、最大１０^６Ｍ^−１、最大１０^５Ｍ^−１までのＫ_ａを有する結合ドメインを示す。または、親和性は、Ｍの単位（例えば、１０^−５Ｍ〜１０^−１３Ｍ）を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋ_ｄ）として規定され得る。結合ドメインポリペプチドおよび本開示による１本鎖ポリペプチドの親和性は、従来の技術を用いて容易に決定することができる（例えば、Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; および米国特許第5,283,173号、第5,468,614号、または等価物を参照されたい)。

「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、ＣＤ３と共に、一般に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合された抗原の認識に関与するＴ細胞の表面上で見られる分子である。これはほとんどのＴ細胞中で高可変αおよびβ鎖のジスルフィド結合されたヘテロダイマーから構成される。他のＴ細胞では、可変γおよびδ鎖からなる別の受容体が発現される。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端の短い細胞質テイルを有する(Abbas and Lichtman, Cellular and Molecular Immunology
(5thEd.),Editor: Saunders、Philadelphia、2003; Janeway et al., Immunobiology:
TheImmune Systemin Health and Disease、4^th Ed., Current BiologyPublications、p148、149、and172, 1999を参照されたい）。本開示で使用されるＴＣＲは、様々な動物
種、例えばヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物由来としてもよい。

「ＣＤ３」は当技術分野では６つの鎖の多タンパク質複合体として知られている(Abbasand Lichtman, 2003; Janeway et al., p. 172 and 178, 1999を参照されたい)。哺乳動
物では、複合体はＣＤ３γCD3γ鎖、ＣＤ３δCD3δ鎖、２つのＣＤ３εCD3ε鎖、および
ＣＤ３ζ鎖のホモダイマーを含む。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。CD3γＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は負に
帯電し、この特性により、これらの鎖は正に帯電したＴ細胞受容体鎖と結合できる。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖の細胞内テイルはそれぞれ、免疫受容体チロシン系活性化モチーフimmunoreceptor tyrosine-based activation motifまたはＩＴＡＭとして知られている単一の保存モチーフを含み、一方、各ＣＤ３ζ鎖は３つを有する。ＩＴＡＭはＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力にとって重要であると考えられている。本開示で使用されるＣＤ３は、様々な動物種、例えばヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物由来としてもよい。

本明細書では、「ＴＣＲ複合体」はＣＤ３のＴＣＲとの結合により形成された複合体示す。例えば、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γCD3γ鎖、CD3δＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３εCD3
ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモダイマー、ＴＣＲα鎖、およびＴＣＲβ鎖から構成することができる。また、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γCD3γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３εCD3ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモダイマー、ＴＣＲγ鎖、およびＴＣＲδ鎖から構成することができる。

本明細書では、「ＴＣＲ複合体の構成要素」はＴＣＲ鎖（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγまたはＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖すなわち、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εまたはＣＤ３ζ）、または２つ以上のＴＣＲ鎖もしくはＣＤ３鎖により形成される複合体（例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβの複合体、ＴＣＲγおよびＴＣＲδの複合体、ＣＤ３εおよびＣＤ３δの複合体、ＣＤ３γおよびＣＤ３εの複合体、またはＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、および２つのＣＤ３ε鎖のサブＴＣＲ複合体）を示す。

抗体技術の当業者により理解される用語にはそれぞれ、本明細書で明確に異なって規定されない限り、当技術分野で獲得される意味が与えられる。抗体は可変領域、ヒンジ領域、および定常ドメインを有することが知られている。免疫グロブリン構造および機能は、例えば、Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)においてレビューされている。

例えば、「ＶＬ」および「ＶＨ」という用語は、それぞれ、抗体軽および重鎖由来の可変結合領域を示す。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られている別々の、明確なサブ領域から構成される。「ＣＬ」という用語は、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体軽重鎖由来の定常領域を示す。「ＣＨ」という用語は「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」を示し、これは抗体アイソタイプによってさらにＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）に分けられる。「Ｆａｂ」（抗原結合フラグメント）は、抗原に結合する抗体の一部であり、鎖間ジスルフィド結合を介して軽鎖に結合された重鎖の可変領域およびＣＨ１を含む。

本明細書では、「Ｆｃ領域定常ドメイン部分」または「Ｆｃ領域部分」は、抗体由来のＦｃフラグメント（「結晶化可能フラグメント」領域またはＦｃ領域）の重鎖定常領域セグメントを示し、これは１つ以上の定常ドメイン、例えばＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。背景として、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンのエフェクター機能、例えばＡＤＣＣ（抗体依存細胞媒介細胞毒性）、ＡＤＣＰ（抗体依存細胞食作用）、ＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）および補体結合、Ｆｃ受容体への結合（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＦｃＲｎ）、Ｆｃ領域が欠失したポリペプチドに対するインビボでの半減期の増大、プロテインＡ結合、およびおそらくは胎盤通過にも関与する(Capon et al.、Nature、337:525 (1989)を参照されたい)。

加えて、抗体は、典型的にはＦａｂおよびＦｃ領域の間に配置されたヒンジ配列を有する（が、ヒンジの下位セクションはＦｃ領域のアミノ末端部分を含み得る）。背景として、免疫グロブリンヒンジは、可動性スペーサとして機能し、Ｆａｂ部分を空間内で自由に移動させる。定常領域とは対照的に、ヒンジは構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス間およびサブクラス間でも配列および長さの両方が変動する。例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域は自由に可動性であり、Ｆａｂフラグメントは、その対称軸周りに回転し、２つの重鎖間ジスルフィド架橋の第１のものが中心にある球内で移動することができる。比較して、ヒトＩｇＧ２ヒンジは相対的に短く、４つの重鎖間ジスルフィド架橋により安定化された剛性ポリプロリン二重らせんを含み、これが可動性を制限する。ヒトＩｇＧ３ヒンジは独特の伸張ヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）により他のサブクラスとは異なり、６２アミノ酸（２１プロリンおよび１１システインを含む）を含み、不動性ポリプロリン二重らせんを形成し、より大きな可動性を提供し、というのは、ＦａｂフラグメントがＦｃフラグメントから比較的遠く離れているからである。ヒトＩｇＧ４ヒンジは、ＩｇＧ１よりも短いが、ＩｇＧ２とは同じ長さを有し、その可動性はＩｇＧ１およびＩｇＧ２の間の中間にある。

結晶学的研究によれば、ＩｇＧヒンジドメインは、機能的および構造的に、３つの領域に細分することができる：上部、コアまたは中央、および下部ヒンジ領域（Shin et al.,
ImmunologicalReviews 130:87 (1992)）。例示的な上部ヒンジ領域はＩｇＧ１で見られるＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号２２７）、ＩｇＧ２で見られるＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号２１１）、ＩｇＧ３で見られるＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号２４５）またはＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ（配列番号２４６）、およびＩｇＧ４で見られるＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号２４７）を含む。例示的な中央またはコアヒンジ領域は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２で見られるＣＰＰＣＰ（配列番号２２８）、ＩｇＧ３で見られるＣＰＲＣＰ（配列番号２４８）、およびＩｇＧ４で見られるＣＰＳＣＰ（配列番号２４９）を含む。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４抗体はそれぞれ、単一の上部および中央ヒンジを有するように見えるが、ＩｇＧ３は４つをタンデムに有し−１つはＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号２５０）であり、３つはＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ（配列番号２５１）である。

ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体は、ＩｇＧ様コア領域を欠いているように見え、ＩｇＤは２つの上部ヒンジ領域をタンデムに有しているように見える（配列番号２２２および２５２を参照されたい）。ＩｇＡ１およびＩｇＡ２抗体で見られる例示的な野生型上部ヒンジ領域は、配列番号２１５および２１６で示される。

ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体は、対照的に、典型的なヒンジ領域を欠き、代わりにヒンジ様特性を有するＣＨ２ドメインを有する。ＩｇＥおよびＩｇＭの例示的な野生型ＣＨ２上部ヒンジ様配列は、それぞれ、配列番号２５３（ＶＣＳＲＤＦＴＰＰＴＶＫＩＬＱＳＳＳＤＧＧＧＨＦＰＰＴＩＱＬＬＣＬＶＳＧＹＴＰＧＴＩＮＩＴＷＬＥＤＧＱＶＭＤＶＤＬＳＴＡＳＴＴＱＥＧＥＬＡＳＴＱＳＥＬＴＬＳＱＫＨＷＬＳＤＲＴＹＴＣＱＶＴＹＱＧＨＴＦＥＤＳＴＫＫＣＡ）および配列番号２５４（ＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＧＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰ）において示される。

本明細書では、「ヒンジ領域」または「ヒンジ」は、（ａ）免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、上部およびコア領域から構成される）またはその機能的変異体、例えば野生型および変化免疫グロブリンヒンジ、（ｂ）レクチンドメイン間領域またはその機能的変異体、（ｃ）分化抗原群（ＣＤ）分子ストーク領域またはその機能的変異体、あるいは（ｄ）免疫グロブリンＶ様または免疫グロブリンＣ様ドメインに結合する細胞表面受容体（ドメイン間領域）の一部を示す。

本明細書では、「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体の重鎖で見られるＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間に挿入され、結合する（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ）またはＣＨ１およびＣＨ３ドメインの間に挿入され、結合する（ＩｇＥおよびＩｇＭ）天然上部および中央ヒンジアミノ酸配列を示す。ある実施形態では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列はヒトであり、ヒトＩｇＧヒンジ領域を含み得る。例示的なヒト野生型免疫グロブリンヒンジ領域は、配列番号２１５（ＩｇＡ１ヒンジ）、２１６（ＩｇＡ２ヒンジ）、２１７（ＩｇＤヒンジ）、６６７（ＩｇＧ１ヒンジ）、２１９（ＩｇＧ２ヒンジ）、２２０（ＩｇＧ３ヒンジ）および２２１（ＩｇＧ４ヒンジ）において示される。

「変化野生型免疫グロブリンヒンジ領域」または「変化免疫グロブリンヒンジ領域」は、（ａ）最大３０％までのアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％までのアミノ酸置換もしくは欠失）を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域、あるいは（ｂ）約５アミノ酸（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸）から最大約１２０アミノ酸までの長さ（例えば、約１０〜約４０アミノ酸または約１５〜約３０アミノ酸または約１５〜約２０アミノ酸または約２０〜約２５アミノ酸の長さ）を有する、最大約３０％までのアミノ酸変化（例えば、最大約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％までのアミノ酸置換または欠失あるいはその組み合わせ）を有する、配列番号２２８、２４８、または２４９で示されるＩｇＧコアヒンジ領域を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域の部分を示す。

「ペプチドリンカー」は、重鎖可変領域を軽鎖可変領に結合し、２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合するスペーサ機能を提供するアミノ酸配列を示し、よって、得られたポリペプチドは同じ軽および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対し特異的な結合親和性を保持する。ある実施形態では、リンカーは、５〜約３５アミノ酸、例えば、約１５〜約２５アミノ酸から構成される。

「接合アミノ酸」または「接合アミノ酸残基」は、１本鎖ポリペプチドの２つの隣接する領域またはドメイン間の、例えばヒンジと隣接Ｆｃ領域部分間またはヒンジと隣接結合ドメイン間または２つの免疫グロブリン可変ドメインを結合させるペプチドリンカーと隣接免疫グロブリン可変ドメイン間の１つ以上（例えば、約２〜１０）のアミノ酸残基示す。接合アミノ酸は、１本鎖ポリペプチドのコンストラクト設計から得られる（例えば、１本鎖ポリペプチドをコードする核酸分子の構成中での制限酵素部位の使用により得られるアミノ酸残基）。

「ＣＨ３とＣＨ１またはＣＬ間のリンカー」は、ＣＨ３ドメイン（例えば、野生型ＣＨ３または変異ＣＨ３）のＣ末端とＣＨ１ドメインまたはＣＬドメイン（例えば、Ｃｋ）のＮ末端の間の１つ以上（例えば、約２〜１２）のアミノ酸残基を示す。

「野生型免疫グロブリン領域」または「野生型免疫グロブリンドメイン」は、様々な免疫グロブリンクラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭを含む）由来の、および様々な種（例えば、ヒト、ヒツジ、マウス、ラット、および他の哺乳動物）由来の天然免疫グロブリン領域またはドメイン（例えば、天然ＶＬ、ＶＨ、ヒンジ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）を示す。例示的な野生型ヒトＣＨ１領域は配列番号１１４、１８６〜１９２および１９４で示され、野生型ヒトＣκ領域は配列番号１１２で示され、野生型ヒトＣλ領域は配列番号１１３および２２４〜２２６で示され、野生型ヒトＣＨ２ドメインは配列番号１１５、１９５〜２０１および２０３で示され、野生型ヒトＣＨ３ドメインは配列番号１１６、２０４〜２１０および２１２で示され、野生型ヒトＣＨ４ドメインは配列番号２１３および２１４で示される。

「変化免疫グロブリン領域」、「変化免疫グロブリンドメイン」、「変異免疫グロブリンドメイン」などは、少なくとも７５％（例えば、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％）の野生型免疫グロブリン領域またはドメイン（例えば、野生型ＶＬ、ＶＨ、ヒンジ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）に対する配列同一性を有する免疫グロブリン領域を示す。例えば、「変化免疫グロブリンＣＨ１領域」または「変化ＣＨ１領域」は、少なくとも７５％（例えば、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％）の野生型免疫グロブリンＣＨ１領域（例えば、ヒトＣＨ１）に対する配列同一性を有するＣＨ１領域を示す。同様に、「変化免疫グロブリンＣＨ２ドメイン」または「変化ＣＨ２ドメイン」は少なくとも７５％（例えば、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％）の野生型免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、ヒトＣＨ２）に対する配列同一性を有するＣＨ２ドメインを示す。

本明細書では、「配列同一性」は、配列を整列させ、必要ならばギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成し、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しなかった場合の、別の参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である１つの配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを示す。パーセンテージ配列同一性値は、Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: anewgeneration of protein database search programs," Nucleic AcidsRes.25:3389-3402により規定されるＮＣＢＩＢＬＡＳＴ２．０ソフトウェアにより、パラメータはデフォルト値に設定されて、作成される。

ある実施形態では、変化免疫グロブリンドメインは野生型免疫グロブリンドメインの保存的アミノ酸置換のみを含む。ある他の実施形態では、変化免疫グロブリンドメインは野生型免疫グロブリンドメインの非保存的アミノ酸置換のみを含む。さらに別の実施形態では、変化免疫グロブリンドメインは保存的および非保存的アミノ酸置換の両方を含む。

「保存的置換」は、当技術分野では１つのアミノ酸の同様の特性を有する別のアミノ酸による置換として認識される。例示的な保存的置換は、当技術分野ではよく知られている（例えば、１９９７年３月１３日に公開された国際公開第９７／０９４３３号、１０ページ；Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc.NY:NY(1975),pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and CellPress,Cambridge, MA (1990), p. 8を参照されたい)。ある実施形態では、保存的置換は、ロイシンからセリンへの置換を含む。

本明細書では、「誘導体」という用語は、ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の、化学的または生物学的手段による、酵素を用いた、もしくは酵素なしの、例えば、グリコシル化、アルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成による修飾を示す。一般に、「誘導体」は、親ポリペプチドは「誘導体」を作製するための開始材料とすることができるが、一方、親ポリペプチドは必ずしも「類似体」を作製するための開始材料として使用されなくてもよいという点で「類似体」とは異なる。誘導体は、親ポリペプチドとは異なる化学、生物または物理特性を有し得る。例えば、誘導体はより親水性であってもよく、または親ポリペプチドに比べて変化した反応性を有し得る（例えば、ＣＤＲは標的に対するその親和性を変化させるアミノ酸変化を有する）。

本明細書では、別段の定めがない限り、免疫グロブリン分子の可変領域内のアミノ酸残基の位置は、Ｋａｂａｔナンバリング協定に従い番号付けされ(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^thed.Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991))、免疫グロブリン分子の定常領域内のアミノ酸残基の位置は、ＥＵ命名法に従い番号付けされる(Wardetal., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94)。

「受容体」は、シグナル分子（すなわち、リガンド、例えばホルモン、神経伝達物質、毒素、サイトカイン）が付着し得る細胞の細胞膜または細胞質中に存在するタンパク質分子である。シグナル分子の受容体への結合により、受容体の立体構造変化が起こり、これが通常細胞応答を開始する。しかしながら、いくつかのリガンドは、いかなる応答も誘導せずに単に受容体をブロックする（例えば、アンタゴニスト）。いくつかの受容体タンパク質は、表在性膜タンパク質である。多くのホルモンおよび神経伝達物質受容体は細胞膜のリン脂質二重層中に埋め込まれた膜貫通タンパク質であり、別の主クラスの受容体は、細胞内タンパク質、例えばステロイドおよびイントラクラインペプチドホルモン受容体に対するものである。

「Ｂ細胞関連障害または疾患」または「異常Ｂ細胞活性と関連する疾患または障害」は、異常Ｂ細胞活性または正常、適正、もしくは期待される過程から逸脱した活性と関連する（例えば、誘発するまたは起因する）疾患または障害を示す。例えば、Ｂ細胞関連障害または疾患としては、損傷されたまたは欠陥のあるＤＮＡまたは他の細胞構成要素を有するＢ細胞の不適切な増殖が挙げられる。異常Ｂ細胞活性としては、不適切に高いレベルのＢ細胞分裂、不適切に低いレベルのＢ細胞アポトーシス、またはその両方により特徴づけられる細胞増殖が挙げられる。そのような疾患は例えば、癌性か非癌性、良性か悪性かに関係なく、Ｂ細胞、Ｂ細胞の群または組織（複数可）の単一または複数の局所異常増殖を有し得る。Ｂ細胞関連障害または疾患はまた、異常抗体産生、例えば自己抗体の生成、または正常レベルで生成された場合により望ましい抗体の過剰産生を含み得る。本明細書では、異常Ｂ細胞活性は、Ｂ細胞のある亜集団で起こる可能性があり、他の亜集団では起こらず、または例えば、Ｔ細胞への不適切な抗原提示による、または他のＢ細胞経路によるＴ細胞の不適切な刺激を含む場合があることも企図される。Ｂ細胞関連障害または疾患の例としてはＢ細胞悪性腫瘍またはＢ細胞癌（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病またはＢ細胞骨髄腫）、自己抗体産生または炎症により特徴づけられる疾患（例えば、自己免疫疾患）あるいはＴ細胞への不適切なＢ細胞抗原提示により引き起こされる、またはＢ細胞が関与する他の経路により引き起こされる不適切なＴ細胞刺激により特徴づけられる疾患が挙げられる。

「処置」、「処置する」または「寛解」は、治療的処置または予防／防止処置のいずれかを示す。処置は、処置を受けた個体において疾患の少なくとも１つの症状が改善し、または処置が個体における進行性疾患の悪化を遅延させ、もしくは追加の関連疾患の発症を防止することができる場合に治療的である。

特異的結合分子または化合物の「治療的有効量（または用量）」または「有効量（または用量）」は、統計学的に有意な様式で処置される疾患の１つ以上の症状の寛解が得られるのに十分な化合物の量を示す。単独で投与される、個々の活性成分に言及する場合、治療的有効用量はその成分単独を示す。併用に言及する場合、治療的有効用量は、連続的または同時に（同じ製剤中または別々の製剤中で同時的に）投与されたかに関係なく、治療効果が得られる活性成分の組み合わされた量を示す。

「薬学的に許容される」という用語は、当技術分野ではよく知られている経路を用いて投与された場合、アレルギーまたは他の重篤な有害反応を発生させない分子実体および組成物を示す。

「必要のある患者」は、本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーまたはその組成物による処置または寛解を受けやすい、疾患、障害もしくは病状の危険がある、またはこれを患う患者を示す。

本明細書では、「免疫グロブリン由来融合タンパク質」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン領域、例えばＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインを含む融合タンパク質を示す。免疫グロブリン領域は、野生型免疫グロブリン領域または変化免疫グロブリン領域としてもよい。例示的な免疫グロブリン由来融合タンパク質としては、１本鎖可変抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）(例えば、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83, 1988を参照されたい)、ＳＭＩＰ（商標）タン
パク質（米国特許公開第２００３／０１３３９３９号、第２００３／０１１８５９２号、および第２００５／０１３６０４９号を参照されたい）、ＰＩＭＳタンパク質（ＰＣＴ出願公開番号第２００９／０２３３８６号を参照されたい）、および多機能結合タンパク質（例えばＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）およびＸｃｅｐｔｏｒタンパク質）（ＰＣＴ出願公開第２００７／１４６９６８号、米国特許出願公開番号第２００６／００５１８４４号、および米国特許第７，１６６，７０７号を参照されたい）が挙げられる。

追加の定義は本開示を通して提供される。
ポリペプチドヘテロダイマー
１つの態様では、本開示は２つの異なる１本鎖ポリペプチドの結合により形成されるポリペプチドヘテロダイマーを提供する。第１の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−Ｉ）は、１〜４つの標的に特異的に結合する１〜４つの結合ドメイン、ヒンジ（Ｈ−Ｉ）、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）、およびＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）を含み、本質的に構成され、または構成され、一方、第２の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−ＩＩ）は、０〜４つの標的に特異的に結合する０〜４つの結合ドメイン、ヒンジ（Ｈ−ＩＩ）、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）、およびＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）を含み、本質的に構成され、または構成され、ただし、ポリペプチドヘテロダイマーは１つ以上の標的、例えば、少なくとも２つの異なる標的に特異的に結合する少なくとも２つの結合ドメインを含むことを条件とする。Ｈ−ＩおよびＨ−ＩＩは同じ配列を有してもよいが、異なってもよい。ＨＤ−Ｉは免疫グロブリンＣＨ１領域を含んでもよく、ＨＤ−ＩＩは免疫グロブリンＣＬ領域を含んでもよい。また、ＨＤ−Ｉは免疫グロブリンＣＬ領域を含んでもよく、ＨＤ−ＩＩは免疫グロブリンＣＨ１領域を含んでもよい。ＦＲＰ−ＩおよびＦＲＰ−ＩＩは、同じ配列を有してもよいが、異なってもよい。本開示のポリペプチドヘテロダイマーの個々の構成要素は、本明細書で詳細に記載される。
結合ドメイン
上記で示されるように、本開示のポリペプチドヘテロダイマーは、２つの１本鎖ポリペプチドを含み：１つの１本鎖ポリペプチドは１〜４つの標的に特異的に結合する１〜４つの結合ドメインを含み、およびポリペプチドヘテロダイマーの他の１本鎖ポリペプチドは０〜４つの標的に結合する０〜４つの結合ドメインを含む。ポリペプチドヘテロダイマーの結合ドメインの総数は、約２〜８の範囲であり、結合ドメインが結合する異なる標的の総数は約１〜８、例えば、２〜８、２〜４、２〜３または２つの標的の範囲である。

ポリペプチドヘテロダイマーの１本鎖ポリペプチドが単一の結合ドメインを含む場合、結合ドメインは、１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノまたはカルボキシル末端のいずれかに配置されてもよい。例えば、２つの結合ドメインを含む１本鎖ポリペプチドはアミノ末端に配置された１つの結合ドメイン、および１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端に配置された他のものを有してもよく、または、両方の結合ドメインはＦｃ領域部分へのアミノ末端にあってもよく、もしくは両方がカルボキシル末端にあってもよい。別の例では、１本鎖ポリペプチドは３つの結合ドメインを含んでもよく、この場合、（ａ）２つの結合ドメインは異なる１本鎖タンパク質上のアミノ末端であり、第３の結合ドメインはＳＣＰ−ＩまたはＳＣＰ−ＩＩのいずれか上のＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、（ｂ）２つの結合ドメインは、異なる１本鎖タンパク質上のカルボキシル末端であり、第３の結合ドメインはＳＣＰ−ＩまたはＳＣＰ−ＩＩのいずれか上のＦｃ領域部分へのアミノ末端である。さらに別の例では、ポリペプチドヘテロダイマーは４つの結合ドメインを含んでもよく、この場合、２つの結合ドメインは、異なる鎖上のＦｃ領域部分へのアミノ末端に配置され、他の２つの結合ドメインは、異なる鎖上のＦｃ領域部分へのカルボキシル末端に配置される。また、これらの実施形態のいずれにおいても、存在する結合ドメインの数によって、２つの結合ドメインは互いにタンデムに結合され、ＳＣＰ−ＩもしくはＳＣＰ−ＩＩのいずれかまたは両方上に配置されてもよく−結合された５〜８結合ドメインがＳＣＰ−ＩおよびＳＣＰ−ＩＩ中に存在する場合、タンデムスタッキングが使用される。

結合ドメインによる標的の結合は、標的（例えば、受容体またはリガンド）と別の分子間の相互作用を調節する。ある実施形態では、結合ドメインによる標的（例えば、受容体）の結合は、標的のある機能（例えば、シグナル伝達）を刺激し、または生物学的効果のために異なる標的を共に近接させる（例えば、Ｔ細胞を腫瘍に向かわせ、ひいてはＴ細胞を活性化させる）。ある他の実施形態では、結合ドメインによる標的の結合は、標的と別の分子の間の相互作用をブロックし、よって、標的のある機能を妨害し、減少させ、または排除する。

本開示のポリペプチドヘテロダイマーに含まれる結合ドメインにより特異的に結合される標的分子は、対象の細胞（「標的細胞」）上に見いだされ、またはこれと結合している可能性がある。例示的な標的細胞としては癌細胞、自己免疫疾患または障害もしくは炎症疾患または障害と関連する細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞が挙げられる。標的分子はまた、細胞と結合されていなくてもよい。細胞と結合されていない例示的な標的分子としては可溶性タンパク質、分泌タンパク質、貯蔵タンパク質、および細胞外構造（マトリクス）タンパク質が挙げられる。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの結合ドメインは、Ｔ細胞標的、腫瘍抗原、Ｂ細胞標的、炎症促進性サイトカインもしくはケモカイン、発癌促進性サイトカインもしくは増殖因子、血管新生作用物質、Ｆｃ受容体、トランスフェリン受容体、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、ＴＮＦＳＦＲ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される標的に特異的に結合する。例えば、本開示のポリペプチドヘテロダイマーは、Ｔ細胞標的および腫瘍標的に特異的に結合する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの結合ドメインは、Ｔ細胞標的、例えばＴＣＲ複合体またはその構成要素（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε）、ＣＤ２８、ＰＤ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＧＩＴＲ、およびＴＧＦＢＲ１に特異的に結合する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの結合ドメインは、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的に結合する。例えば、ある実施形態では、結合ドメインは、個々のヒトＣＤ３鎖（例えば、ヒトＣＤ３γCD3γ鎖、ヒトＣＤ３δCD3δ鎖、およびヒトＣＤ３εCD3ε鎖）または個々のヒトＣＤ３鎖の２つ以上の組み合わせ（例えば、ヒ
トＣＤ３γおよびヒトＣＤ３εの複合体またはヒトＣＤ３δおよびヒトＣＤ３εの複合体）に特異的に結合する。ある実施形態では、結合ドメインは、ヒトＣＤ３εCD3ε鎖に特
異的に結合する。ある他の実施形態では、結合ドメインは、ヒトＴＣＲα、ヒトＴＣＲβ、またはヒトＴＣＲαおよびヒトＴＣＲβから形成されるヘテロダイマーの１つ以上に特異的に結合する。ある他の実施形態では、本開示の結合ドメインは、１つ以上のヒトＣＤ３鎖から１つ以上のヒトＴＣＲ鎖と共に形成された複合体、例えば、ヒトＣＤ３γ鎖、ヒトＣＤ３δ鎖、またはヒトＣＤ３ε鎖からヒトＴＣＲα鎖またはヒトＴＣＲβ鎖と共に形成された複合体に結合する。これらの実施形態のいずれにおいても、本開示のポリペプチドヘテロダイマーはまた、腫瘍標的に結合し得る。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの１つ以上の結合ドメインは、腫瘍標的、例えば、ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＥＡＣＡＭ−６、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＰＣＴＡ−１、ＳＴＥＡＰ−１、ＰＳＣＡ、ＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１５１、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＴＲＯＰ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、ＴＧＦＢＲ２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０、ＴＮＦＲ２、ＯＳＭＲβ、Ｐａｔｃｈｅｄ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｒｏｂｏ１、ＬＴβＴ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＣＲ５、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５_ＡＣ、ＭＵＣ５_ｂ、ＭＵＣ７、βｈＣＧ、ルイス−Ｙ、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、グロボＨ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原、（膜結合）ＩｇＥ、メラノーマ硫酸コンドロイチンプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−α前駆体、ＳＴＥＡＰ−２、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６；デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカーおよびミュラー管抑制因子（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアル酸付加Ｔｎ抗原；ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳ、ＣＤ６３、Ｂ７−Ｈ３、またはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの１つ以上の結合ドメインは、Ｂ細胞標的、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ、またはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの１つ以上の結合ドメインは、炎症促進性サイトカインまたはケモカイン、例えばＴＮＦα、ＩＬ−６、ハイパーＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＳＬ、ＴＧＦβ、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２もしくはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬ、またはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの１つ以上の結合ドメインは、発癌促進性サイトカインまたは増殖因子、例えばＨＧＦ、ＭＳＰ、ＥＧＦ（例えばエピレギュリン、ヘレグリン、β−レグリン、ニューレグリン）、ＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ハイパーＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｗｎｔ、ｓＨＨ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、またはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの１つ以上の結合ドメインは、血管新生作用物質、例えばＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１〜４、ＮＲＰ１、アンジオポエチン２、ｃ−Ｍｅｔまたはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの１つ以上の結合ドメインは、Ｆｃ受容体、例えばＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６、ＦｃＲｎ、またはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの結合ドメインは、トランスフェリン受容体、例えばＣＤ７１に特異的に結合する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの１つ以上の結合ドメインは、受容体チロシンキナーゼ、例えばＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、またはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの１つ以上の結合ドメインは、ＴＮＦＳＦＲ、例えばＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＷＥＡＫＲ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡ、ＦＡＳ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４−１−ＢＢ、ＬＴｂｅｔａＲ、ＨＶＥＭ、ＲＡＮＫ、またはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの１つ以上の結合ドメインは、ハイパーＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、またはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの１つ以上の結合ドメインは、下記分子の１つのアゴニストである：ＩＬ−１０、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＧＦ、ＩＬ−３５、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＷＥＡＫＲ、ＦＡＳ、またはそれらの任意の組み合わせ。

結合ドメインは対象の標的に特異的に結合する任意のペプチドであり得る。結合ドメイン源としては、様々な種、例えばヒト、齧歯類、トリ、およびヒツジ由来の抗体可変領域（抗体、ｓＦｖｓ、ｓｃＦｖｓ、Ｆａｂｓ、または可溶性ＶＨドメインもしくはドメイン抗体としてフォーマットすることができる）が挙げられる。追加の結合ドメイン源としては他の種、例えばラクダ科(ラクダ、ヒトコブラクダ、またはラマ由来; Ghahroudi et al. (1997) FEBSLetters414(3):521-526; Vincke et al. (2009) Journal of Biological Chemistry(2009)284:3273-3284; Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363:44６およびNguyen etal.(1998) J. Mol. Biol., 275:413)、テンジクザメ(Roux et al. (1998)
Proc. Nat'l.Acad.Sci. (USA) 95:11804)、スポッティッドラットフィッシュ(Nguyen et al. (2002)Immunogenetics,54:39)、またはヤツメウナギ(Herrin et al., (2008) Proc. Nat'l. Acad. Sci.(USA)105:2040-204５およびAlder et al. (2008) Nature Immunology 9:319-327)由来の抗体の可変領域が挙げられる。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して、見かけ上、抗原結合領域を形成することができ、すなわち、これらの機能的抗体は、重鎖のみのホモダイマー（「重鎖抗体」と呼ばれる）である(Jespersetal. (2004) Nature Biotechnology 22:1161-1165; Cortez-Retamozo et al. (2004)Cancer Research 64:2853-2857; Baral et al. (2006) Nature Medicine12:580-58４およびBarthelemyet al. (2008) Journal of Biological Chemistry283:3639-3654)。

この開示の結合ドメインが由来し得る例示的な抗ＣＤ３抗体としては、Ｃｒｉｓ−７モノクローナル抗体(Reinherz, E. L. et al. (eds.)、Leukocyte typing II., SpringerVerlag,New York, (1986))、ＢＣ３モノクローナル抗体 (Anasetti et al. (1990) J. Exp. Med.172:1691)、ＯＫＴ３(Orthomulticenter Transplant Study Group (1985) N. Engl. J. Med.313:337)およびそれらの誘導体、例えばＯＫＴ３ａｌａ−ａｌａ(Heroldet
al. (2003) J.Clin. Invest.11:409)、ビジリズマブ(Carpenter et al. (2002) Blood 99:2712)、および１４５−２Ｃ１１モノクローナル抗体(Hirschetal. (1988) J. Immunol. 140: 3766)が挙げられる。例示的な抗ＴＣＲ抗体はＨ５７モノクローナル抗体である(Lavasanietal. (2007) Scandinavian Journal of Immunology 65:39-47)。

この開示の別の結合ドメイン源は、ランダムペプチドライブラリをコードする配列または別の非抗体スカフォールドのループ領域中の操作された様々なアミノ酸をコードする配列を含み、例えばフィブリノーゲンドメイン(例えば、Weisel et al. (1985) Science230:1388を参照されたい)、クニッツドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照されたい）、アンキリン反復タンパク質(Binzet al.(2003) Journal of Molecular Biology 332:489-503およびBinz et al. (2004)NatureBiotechnology 22(5):575-582)、フィブロネクチン結合ドメイン(Richards et al. (2003)Journal ofMolecular Biology 326:1475-1488; Parker et al. (2005) ProteinEngineeringDesign and Selection 18(9):435-44４およびHackel et al. (2008) Journal ofMolecularBiology 381:1238-1252)
、システイン-ノットミニタンパク質(Vitaet al. (1995) Proc. Nat'l. Acad.Sci. (USA) 92:6404-6408; Martin et al. (2002)Nature Biotechnology 21:71-7６およびHuanget
al. (2005)Structure 13:755-768)、テトラトリコペプチド反復ドメイン(Main et al. (2003)Structure 11:497-508およびCortajarenaet al. (2008) ACS Chemical Biology3:161-166)、ロイシンリッチ反復ドメイン(Stumpp et al. (2003)Journal of Molecular Biology332:471-487)、リポカリンドメイン(例えば、国際公開第２００６／０９５１６４
号、Besteet al. (1999) Proc. Nat'l.Acad. Sci. (USA) 96:1898-1903およびSchonfeld
et al. (2009)Proc. Nat'l. Acad. Sci.(USA) 106:8198-8203を参照されたい)、Ｖ様ドメイン(例えば、米国特許出願公開番号第２００７／００６５４３１号を参照されたい)、Ｃ型レクチンドメイン(ZelenskyandGready (2005) FEBS J. 272:6179; Beavil et al. (1992) Proc. Nat'l. Acad.Sci.(USA) 89:753-757およびSato et al. (2003) Proc. Nat'l. Acad. Sci.(USA)100:7779-7784)、ｍＡｂ^２またはＦＣＡＢ（商標）（例えば、PCT
特許出願公開番号第２００７／０９８９３４号；国際公開第２００６／０７２６２０号を参照されたい)、または同様のもの(Nordet al. (1995) Protein Engineering 8(6):601-608; Nordet al. (1997) NatureBiotechnology 15:772-777; Nord et al. (2001) EuropeanJournal of Biochemistry268(15):4269-4277およびBinz et al. (2005) NatureBiotechnology 23:1257-1268)である。

この開示の結合ドメインは、本明細書で記載されるように、または当技術分野では知られている様々な方法により作製することができる（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号および第６，２９１，１５号を参照されたい）。例えば、この開示の結合ドメインは、対象の標的に特異的に結合するＦａｂフラグメントに対しＦａｂファージライブラリをスクリーニングすることにより同定され得る(Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:34４を参照されたい)。さらに、対象の標的を免疫原として都合のよい系（例えば、マウス、ＨＵＭＡＢマウス（登録商標）、ＴＣＭＯＵＳＥ（商標）、ＫＭ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギ、など）において使用するハイブリドーマ開発のための従来の戦略は、この開示の結合ドメインを開発するために使用することができる。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは、ＣＤ８６結合ドメイン、例えばＣＴＬＡ４外部ドメイン、ＣＤ２８外部ドメイン、またはＣＤ８６に特異的な免疫グロブリン可変領域結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）（例えば、モノクローナル抗体３Ｄ１またはＦＵＮ１由来）を含む。いくつかの実施形態では、全未満の外部ドメインが使用される。例えば、ＣＤ８６に結合し、ＣＤ８６のＣＤ２８への結合を防止するＣＴＬＡ４外部ドメイン内のドメインが使用され得る。ＣＤ８６結合ドメインは、ＣＤ８６のＣＤ２８への結合をブロックし、よって、Ｔ細胞活性化を下方制御することができる。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーはＩＬ−１０アゴニスト、例えばＩＬ−１０、モノＩＬ−１０、またはその機能的領域を含む。「モノＩＬ−１０」は、分子の２つのサブドメイン（アミノおよびカルボキシル末端ドメイン）を分離する短いリンカー（ＧＧＧＳＧＧ、配列番号７６０）を有し、よってこれらのサブドメインが分子内ダイマーを形成することができる、ＩＬ−１０分子を示す。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーはＨＬＡ−Ｇアゴニスト、例えばＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇムテイン、またはその機能的領域；ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｇムテインの外部ドメイン；あるいＩＬＴ２、ＩＬＴ４またはＫＩＲ２ＤＬ４に特異的な免疫グロブリン可変領域結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）を含む。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーはＨＧＦアゴニスト、例えばＨＧＦまたはそのサブドメインを含む。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーはＩＬ３５アゴニスト、例えばＩＬ３５ＲもしくはＩＬ３５に特異的な免疫グロブリン可変領域結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）、またはその機能的領域を含む。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、例えばＬＩＧＨＴに特異的な免疫グロブリン可変領域結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）、またはＨＶＥＭ外部ドメインあるいはその機能的領域を含む。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーはＰＤ−１アゴニスト、例えばＰＤ−１に特異的な免疫グロブリン可変領域結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）、またはＰＤ−１リガンド（例えばＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）あるいはその機能的領域を含む。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーはＢＴＬＡアゴニスト、例えばＢＴＬＡに特異的な免疫グロブリン様可変領域結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）、またはＨＶＥＭ外部ドメインあるいはその機能的領域を含む。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーはＧＩＴＲＬアンタゴニスト、例えばＧＩＴＲＬに特異的な免疫グロブリン様可変領域結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）、またはＧＩＴＲ外部ドメイン、可溶性ＧＩＴＲ、あるいはその機能的領域を含む。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーはＣＤ４０アンタゴニスト、例えばＣＤ４０に特異的な免疫グロブリン様可変領域結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）を含む。

いくつかの実施形態では、結合ドメインは、対象の標的に特異的なＶＨおよびＶＬ領域を含む１本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ある実施形態では、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインはヒトである。例示的なＶＨ領域としては、配列番号１０６で示される２Ｅ１２（抗ＣＤ２８）ｓｃＦｖのＶＨ領域、配列番号１８４で示されるＰ２Ｃ２（抗ＣＤ７９ｂ）ｓｃＦｖのＶＨ領域、配列番号２５８で示される５Ｄ５（抗ｃ−Ｍｅｔ）ｓｃＦｖのＶＨ領域、配列番号８０で示されるＡ２（抗ハイパーＩＬ−６）ｓｃＦｖのＶＨ領域、配列番号９２で示される３Ｄ１（抗ＣＤ８６）ｓｃＦｖのＶＨ領域、配列番号１００で示されるＭＥＴ０２１（抗ｃ−Ｍｅｔ）ｓｃＦｖのＶＨ領域、配列番号１０３で示されるＧ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖのＶＨ領域、配列番号１１７で示されるＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖのＶＨ領域、配列番号１２１で示されるＭ００４２（抗ＨＬＡ−ＤＲ）ｓｃＦｖのＶＨ領域、配列番号８２８で示されるＢＭＡ０３１（抗ＴＣＲ）ｓｃＦｖのＶＨ領域、配列番号８３１で示されるＯＫＴ３−Ｍ（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖのＶＨ領域、および配列番号８３５で示されるＨｕＭ２９１（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖのＶＨ領域が挙げられる。Ａ２（抗ハイパーＩＬ−６）および３Ｄ１（抗ＣＤ８６）ｓｃＦｖのＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号７９および９１で示される。

例示的なＶＬドメインは、配列番号１０７で示される２Ｅ１２（抗ＣＤ２８）ｓｃＦｖのＶＬ領域、配列番号１８２で示されるＰ２Ｃ２（抗ＣＤ７９ｂ）ｓｃＦｖのＶＬ領域、配列番号２５９で示される５Ｄ５（抗ｃ−Ｍｅｔ）ｓｃＦｖのＶＬ領域、配列番号８４で示されるＡ２（抗ハイパーＩＬ−６）ｓｃＦｖのＶＬ領域、配列番号９６で示される３Ｄ１（抗ＣＤ８６）ｓｃＦｖのＶＬ領域、配列番号１０１で示されるＭＥＴ０２１（抗ｃ−Ｍｅｔ）ｓｃＦｖのＶＬ領域、配列番号１０４で示されるＧ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖのＶＬ領域、配列番号１１９で示されるＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖのＶＬ領域、配列番号１２２で示されるＭ００４２（抗ＨＬＡ−ＤＲ）ｓｃＦｖのＶＬ領域、配列番号８２９で示されるＢＭＡ０３１（抗ＴＣＲ）ｓｃＦｖのＶＬ領域、配列番号８３３で示されるＯＫＴ３−Ｍ（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖのＶＬ領域、および配列番号８３６で示されるＨｕＭ２９１（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖのＶＬ領域である。Ａ２（抗ハイパーＩＬ−６）および３Ｄ１（抗ＣＤ８６）ｓｃＦｖのＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号８３および９５で示される。

いくつかの実施形態では、結合ドメインは、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に特異的なＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含む１本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ある実施形態では、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインはヒトまたはヒト化Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインである。例示的なＶ_Ｈドメインとしては、それぞれ、配列番号３０１、３０３、３１３、および３１７で示されるＢＣ３（抗ＣＤ３）Ｖ_Ｈ、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３）Ｖ_Ｈ、Ｈ５７（抗ＴＣＲ）Ｖ_Ｈ、および２Ｃ１１（抗ＣＤ３）Ｖ_Ｈドメインが挙げられる。さらなる例示的なＶ_Ｈドメインとしては、Ｃｒｉｓ−７（抗ＣＤ３）Ｖ_Ｈドメイン、例えば配列番号３２７および３３１〜３３３で示されるものが挙げられる。例示的なＶ_Ｌドメインはそれぞれ、配列番号３０２、３０４、３１５および３１８で示される、ＢＣ３（抗ＣＤ３）Ｖ_Ｌ、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３）Ｖ_Ｌ、Ｈ５７（抗ＴＣＲ）Ｖ_Ｌ、および２Ｃ１１（抗ＣＤ３）Ｖ_Ｌドメインである。さらなる例示的なＶ_Ｌドメインとしては、Ｃｒｉｓ−７（抗ＣＤ３）Ｖ_Ｌドメイン、例えば配列番号３２８、３２９および３３０で示されるものが挙げられる。

ある実施形態では、結合ドメインは軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）もしくは重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）のアミノ酸配列、または両方に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列を含み、またはそれであり、ここで、各ＣＤＲは、対象の標的（例えば、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、ＣＤ２８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３ε、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ハイパーＩＬ−６、ＣＤ８６、ＣＤ１９、およびＨＬＡ−ＤＲ）に特異的に結合するモノクローナル抗体もしくはフラグメントまたはその誘導体から０の変化またはせいぜい１、２、もしくは３つの変化を有し、そのような変異体または誘導体は依然としてその標的に結合する。

ある実施形態では、本開示の結合ドメインＶＨまたはＶＬ領域は、公知のモノクローナル抗体のＶＨまたはＶＬから誘導することができ、またはそれらに基づくことができ、公知のモノクローナル抗体のＶＨまたはＶＬと比較した場合、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）、あるいは上記変化の組み合わせを含む。挿入（複数可）、欠失（複数可）または置換（複数可）は、ＶＨ領域のいずれの場所、例えば、この領域のアミノまたはカルボキシ末端あるいは両端にあってもよく、ただし、各ＣＤＲが０の変化またはせいぜい１、２、もしくは３つの変化を有すること、修飾ＶＨまたはＶＬ領域を含む結合ドメインが、野生型結合ドメインとほぼ同じ親和性でその標的に依然として特異的に結合することができることを条件とする。

ＶＨおよびＶＬドメインは、いずれかの配向で（すなわち、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）配列させることができ、スペーサ機能を提供することができるアミノ酸配列（例えば、約５〜約３５アミノ酸の長さを有する）により結合させることができ、よって、２つのサブ結合ドメインは相互作用して機能的結合ドメインを形成することができる。ある実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインを結合させるアミノ酸配列（本明細書では、「リンカー」とも呼ばれる）としては、（Ｇｌｙ_ｎＳｅｒ）ファミリーに属するもの、例えば（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_ｎ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_１、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_１（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎ、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_ｎ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎ、または（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎが挙げられ、ここで、ｎは１〜５の整数である。ある実施形態では、リンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８３）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０８）である。追加の例示的なリンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＡＳ（配列番号７３９）である。ある実施形態では、これらの（Ｇｌｙ_ｎＳｅｒ）に基づくリンカーは、結合ドメインにおいてＶＨおよびＶＬドメインを結合するために使用されるが、結合ドメインを免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインまたはＦｃ領域部分に結合するためには使用されない。

ＣＤ２８に特異的な例示的な結合ドメインとしては配列番号１０９で示される２Ｅ１２ｓｃＦｖが挙げられ、ＣＤ７９ｂに特異的な結合ドメインとしては配列番号１８５で示されるＰ２Ｃ２ｓｃＦｖが挙げられ；ｃ−Ｍｅｔに特異的な結合ドメインとしては配列番号２５７で示される５Ｄ５ｓｃＦｖが挙げられ；ＲＯＮに特異的な結合ドメインとしては配列番号２６１で示される４Ｃ０４ｓｃＦｖおよび配列番号２６５で示される１１Ｈ０９ｓｃＦｖが挙げられ；ハイパーＩＬ−６に特異的な結合ドメインとしては配列番号８６で示されるＡ２ｓｃＦｖが挙げられ；ＣＤ８６に特異的な結合ドメインとしては配列番号９８で示される３Ｄ１ｓｃＦｖが挙げられ；ＨＬＡ−ＤＲに特異的な結合ドメインとしては配列番号１２０で示されるＭ００４２ｓｃＦｖが挙げられ；ＣＤ３に特異的な結合ドメインとしては配列番号１０２で示されるＧ１９−４ｓｃＦｖ、配列番号８３４で示されるＯＫＴ３−ＭｓｃＦｖ、配列番号８３７で示されるＨｕＭ２９１ｓｃＦｖが挙げられ；ＣＤ１９に特異的な結合ドメインとしては配列番号１０５で示されるＨ３７ｓｃＦｖが挙げられ；ｃ−Ｍｅｔに特異的な結合ドメインとしては配列番号１２０で示されるＭＥＴ０２１ｓｃＦｖが挙げられる（それぞれ、配列番号２９６〜２９および４６４〜４６６で示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３ならびに重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有する）。Ａ２（抗ハイパーＩＬ６）および３Ｄ１（抗ＣＤ８６）ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号８５および９７において示される。ＴＣＲ複合体またはその構成要素に結合する例示的な結合ドメインとしては、配列番号８３０で示されるＢＭＡ０３１ｓｃＦｖならびに配列番号３１０、３１１、３１２、３１９、および３３４〜３４０で示される他のｓｃＦｖが挙げられる。

追加の例示的な結合ドメインとしては、配列番号８８で示されるＰＤＬ２外部ドメインおよび配列番号９０で示されるモノＩＬ−１０が挙げられる。ＰＤＬ２外部ドメインおよびモノＩＬ−１０をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号８７および８９で示される。

４Ｃ０４（抗ＲＯＮ）ｓｃＦｖの軽鎖アミノ酸配列は、配列番号６０２で示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号６０４〜６０６で示される。４Ｃ０４（抗ＲＯＮ）ｓｃＦｖの重鎖アミノ酸配列は配列番号６０３で示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号６０７〜６０９で示される。

１１Ｈ０９（抗ＲＯＮ）ｓｃＦｖの軽鎖アミノ酸配列は配列番号６１０で示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号６１２〜６１４で示される。１１Ｈ０９（抗ＲＯＮ）ｓｃＦｖの重鎖アミノ酸配列は、配列番号６１１で示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号６１５〜６１７で示される。

結合ドメインは本開示の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分へのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかに配置され得る。ある実施形態では、結合ドメインは、１本鎖ポリペプチドのアミノ末端に配置される。ある他の実施形態では、結合ドメインは、１本鎖ポリペプチドのカルボキシル末端に配置される。ある他の実施形態では、結合ドメインは、１本鎖ポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端の両方に配置される。
ヘテロ二量化ドメイン
上記で示されるように、本開示のポリペプチドヘテロダイマーは、各ポリペプチド鎖中に免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインを含む。ポリペプチドヘテロダイマーの２つの１本鎖ポリペプチド中の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは互いに異なり、よって、両方の鎖のヘテロ二量化を促進し、いずれかの鎖のホモ二量体化を最小に抑えるために異なって修飾され得る。実施例で示されるように、本明細書で提供される免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、異なるポリペプチド間での効率的なヘテロ二量化を可能にし、得られたポリペプチドヘテロダイマーの精製を容易にする。

本明細書で提供されるように、本開示による２つの異なる１本鎖ポリペプチド（例えば、１つは短く、１つは長い）のヘテロ二量化を促進するのに有用な免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインとしては、免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬドメイン、例えば、ヒトＣＨ１およびＣＬドメインが挙げられる。ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは野生型ＣＨ１領域、例えば野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭＣＨ１領域である。さらなる実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、それぞれ、配列番号１１４、１８６〜１９２および１９４で示される、野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭＣＨ１領域である。ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、配列番号１１４で示される野生型ヒトＩｇＧ１ＣＨ１領域である。

さらなる実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、変化免疫グロブリンＣＨ１領域、例えば変化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２
ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭＣＨ１領域である。ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、変化ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭＣＨ１領域である。さらに別の実施形態では、野生型免疫グロブリンＣＬドメイン（例えば、ヒトＣＬ）とのジスルフィド結合の形成に関与する野生型ＣＨ１領域（例えば、ヒトＣＨ１）のシステイン残基は、変化免疫グロブリンＣＨ１領域では欠失または置換されており、よって、ジスルフィド結合は変化ＣＨ１領域と野生型ＣＬドメインの間では形成されない。

ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは野生型ＣＬドメイン、例えば野生型Ｃκドメインまたは野生型Ｃλドメインである。特定の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインはそれぞれ、配列番号１１２および１１３で示される野生型ヒトＣκまたはヒトＣλドメインである。さらなる実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、変化免疫グロブリンＣＬドメイン、例えば変化ＣκまたはＣλドメイン、例えば、変化ヒトＣκまたはヒトＣλドメインである。

ある実施形態では、野生型免疫グロブリンＣＨ１領域（例えば、ヒトＣＨ１）とのジスルフィド結合の形成に関与する野生型ＣＬドメイン（例えば、ヒトＣＬ）システイン残基は、変化免疫グロブリンＣＬドメインでは欠失または置換されている。そのような変化ＣＬドメインはさらに、それらのアミノ末端でのアミノ酸欠失を含み得る。例示的なＣκドメインは、配列番号１４１で示され、野生型ヒトＣｋドメインの最初のアルギニンおよび最後のシステインは両方とも欠失している。ある実施形態では、野生型ヒトＣｋドメインの最後のシステインのみが変化Ｃｋドメインで欠失しているが、というのも、野生型ヒトＣｋドメインから欠失している最初のアルギニンは、そのカルボキシル末端にアルギニンを有し、変化Ｃｋドメインのアミノ末端を別のドメイン（例えば、Ｆｃ領域部分）と結合するリンカーにより提供され得るからである。例示的なＣλドメインは、配列番号１４０で示され、この場合、野生型ヒトＣλドメインの最初のアルギニンが欠失しており、ＣＨ１領域におけるシステインとのジスルフィド結合の形成に関与するシステインはセリンにより置換される。

さらなる実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、野生型Ｃκドメインに比べ、Ｃκ−Ｃκインターフェースでの鎖間−水素結合ネットワークの形成に関与し得る位置で、１つ以上のアミノ酸置換を含む変化Ｃκドメインである。例えば、ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、異なるアミノ酸で置換されたＮ２９、Ｎ３０、Ｑ５２、Ｖ５５、Ｔ５６、Ｓ６８またはＴ７０位で１つ以上のアミノ酸を有する変化ヒトＣκドメインである。アミノ酸の番号付けは、配列番号１４１で示される変化ヒトＣκ配列におけるそれらの位置に基づく。ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｖ５５、またはＴ７０位で１、２、３または４アミノ酸置換を有する変化ヒトＣκドメインである。上記位置で置換基として使用されるアミノ酸は、アラニン、またはバルク側鎖部分を有するアミノ酸残基、例えばアルギニン、トリプトファン、チロシン、グルタミン酸、グルタミン、またはリシンとすることができる。上記位置（例えば、Ｎ３０）で野生型ヒトＣｋ配列のアミノ酸残基を置換するために使用され得る追加のアミノ酸残基としては、アスパラギン酸、メチオニン、セリンおよびフェニルアラニンが挙げられる。例示的な変化ヒトＣκドメインは、配列番号１４２〜１７８で示される。変化ヒトＣκドメインは、ＣＨ１領域とのヘテロ二量化を促進するが、別のＣκドメインとのホモ二量体化を最小に抑えるものである。代表的な変化ヒトＣκドメインは、配列番号１６０（Ｎ２９ＷＶ５５ＡＴ７０Ａ）、１６１（Ｎ２９ＹＶ５５Ａ
Ｔ７０Ａ）、２０２（Ｔ７０ＥＮ２９ＡＮ３０ＡＶ５５Ａ）、１６７（Ｎ３０Ｒ
Ｖ５５ＡＴ７０Ａ）、１６８（Ｎ３０ＫＶ５５ＡＴ７０Ａ）、１７０（Ｎ３０Ｅ
Ｖ５５ＡＴ７０Ａ）、１７２（Ｖ５５ＲＮ２９ＡＮ３０Ａ）、１７５（Ｎ２９Ｗ
Ｎ３０ＹＶ５５ＡＴ７０Ｅ）、１７６（Ｎ２９ＹＮ３０ＹＶ５５ＡＴ７０Ｅ）、１７７（Ｎ３０ＥＶ５５ＡＴ７０Ｅ）、１７８（Ｎ３０ＹＶ５５ＡＴ７０Ｅ）、８３８（Ｎ３０ＤＶ５５ＡＴ７０Ｅ）、８３９（Ｎ３０ＭＶ５５ＡＴ７０Ｅ）、８４０（Ｎ３０ＳＶ５５ＡＴ７０Ｅ）、および８４１（Ｎ３０ＦＶ５５ＡＴ７０Ｅ）で示される。

ある実施形態では、本明細書で記載されるＣｋドメインにおける突然変異に加えて、またはその代わりに、ポリペプチドヘテロダイマーの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（すなわち、免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬドメイン）のどちらも突然変異を有し、よって、得られた免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、変異部位のアミノ酸残基間で塩橋（すなわち、イオン相互作用）を形成する。例えば、ポリペプチドヘテロダイマーの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、変異Ｃｋドメインと組み合わされた変異ＣＨ１ドメインとしてもよい。変異ＣＨ１ドメインでは、野生型ヒトＣＨ１ドメインの６８位のバリン（Ｖ６８）が負電荷を有するアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）により置換され、最初のアルギニンおよび最後のシステインが欠失している変異ヒトＣｋドメインの２７位のロイシン（Ｌ２７）が正電荷を有するアミノ酸残基（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）により置換される。得られた変異ＣＨ１ドメインの負電荷を有するアミノ酸残基と得られた変異Ｃｋドメインの正電荷を有するアミノ酸残基との間の電荷−電荷相互作用は塩橋を形成し、変異ＣＨ１およびＣｋドメイン間のヘテロダイマーインターフェースを安定化する。また、野生型ＣＨ１のＶ６８は正電荷を有するアミノ酸残基により置換することができ、最初のアルギニンおよび最後のシステインが欠失している変異ヒトＣｋドメインのＬ２７は、負電荷を有するアミノ酸残基により置換することができる。Ｖ６８が負または正電荷のいずれかを有するアミノ酸により置換された例示的な変異ＣＨ１配列は配列番号８４４および８４５で示される。Ｌ２７が負または正電荷のいずれかを有するアミノ酸により置換された例示的な変異Ｃｋ配列が配列番号８４２および８４３で示される。

ＣＨ１ドメインのＶ６８およびＣｋドメインのＬ２７における突然変異に加えてまたはその代わりに、ヒトＣＨ１ドメインのＶ６８およびヒトＣｋドメインのＬ２７以外の位置が、アミノ酸間のイオン相互作用を生成させる反対電荷を有するアミノ酸により置換され得る。そのような位置は、任意の好適な方法、例えばランダム変異誘発、ＣＨ１−Ｃｋインターフェースのアミノ酸残基を同定するためのＣＨ１−Ｃｋ対の結晶構造の分析、および一組の基準（例えば、イオン相互作用に関与する傾向、潜在的パートナー残基への近接、など）を用いたＣＨ１−Ｃｋインターフェースでのアミノ酸残基間の好適な位置のさらなる同定により同定することができる。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーは、一対の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインしか含まない。例えば、ポリペプチドヘテロダイマーの第１の鎖は、ＣＨ１領域を免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインとして含むことができ、第２の鎖はＣＬドメイン（例えば、ＣκまたはＣλ）を免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインとして含むことができる。また、第１の鎖はＣＬ領域（例えば、ＣκまたはＣλ）を免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインとして含むことができ、第２の鎖はＣＨ１領域を免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインとして含むことができる。本明細書で説明されるように、第１および第２の鎖の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、結合してこの開示のポリペプチドヘテロダイマーを形成することができる。

ある他の実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーは２対の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインを有し得る。例えば、ポリペプチドヘテロダイマーの第１の鎖は、２つのＣＨ１領域を含むことができ、一方、第２の鎖は第１の鎖中の２つのＣＨ１領域と結合する２つのＣＬドメインを含むことができる。また、第１の鎖は２つのＣＬドメインを含むことができ、一方、第２の鎖は第１の鎖中の２つのＣＬドメインと結合する２つのＣＨ１領域を有することができる。ある実施形態では、第１の鎖ポリペプチドはＣＨ１領域およびＣＬドメインを含み、一方、第２の鎖ポリペプチドは、それぞれ、第１の鎖ポリペプチドのＣＨ１領域およびＣＬドメインと結合するＣＬドメインおよびＣＨ１領域を含む。

ポリペプチドヘテロダイマーが、１つのヘテロ二量化対のみ（すなわち、各鎖中１つの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン）を含む実施形態では、各鎖の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、その鎖のＦｃ領域部分へのアミノ末端に配置され得る。また、各鎖中の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、その鎖のＦｃ領域部分へのカルボキシル末端に配置され得る。

ポリペプチドヘテロダイマーが２つのヘテロ二量化対（すなわち、各鎖中２つの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン）を含む実施形態では、各鎖中の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインはどちらも、その鎖のＦｃ領域部分へのアミノ末端に配置され得る。また、各鎖中の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインはどちらも、その鎖のＦｃ領域部分へのカルボキシル末端に配置され得る。さらなる実施形態では、各鎖中の１つの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、その鎖のＦｃ領域部分へのアミノ末端に配置され得、一方、各鎖の他の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインはその鎖のＦｃ領域部分へのカルボキシル末端に配置され得る。言い換えれば、それらの実施形態では、Ｆｃ領域部分は、各鎖の２つの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン間に挿入される。
Ｆｃ領域部分
本明細書で示されるように、本開示のポリペプチドヘテロダイマーは、各ポリペプチド鎖中にＦｃ領域定常ドメイン部分（Ｆｃ領域部分とも呼ばれる）を含む。Ｆｃ領域部分を含むと、被験体への投与後の循環からのヘテロダイマーのクリアランスが遅くなる。突然変異または他の変化により、Ｆｃ領域部分はさらに、ヘテロダイマーポリペプチドエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体結合およびＦｃ受容体への結合）の比較的容易な調節を可能にし、これらは、当技術分野で知られているおよび本明細書で記載されるように、処置される疾患によって増加または減少させることができる。ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーのＦｃ領域部分は、これらのエフェクター機能の１つ以上を媒介することができる。

本開示のポリペプチドヘテロダイマーの一部を形成する１本鎖ポリペプチド中に存在するＦｃ領域部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメインまたはそれらの任意の組み合わせを含み得る。例えば、Ｆｃ領域部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの両方、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインの両方、２つのＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、または２つのＣＨ４ドメインを含み得る。

本開示のヘテロダイマーの１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分を形成し得るＣＨ２ドメインは、ある免疫グロブリンクラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤ）由来の、および様々な種（ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳動物を含む）由来の野生型免疫グロブリンＣＨ２ドメインまたはその変化免疫グロブリンＣＨ２ドメインとすることができる。

ある実施形態では、ＣＨ２ドメインは野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、例えば、それぞれ、配列番号１１５、１９９〜２０１および１９５〜１９７で示される、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤの野生型ＣＨ２ドメインである。ある実施形態では、ＣＨ２ドメインは、配列番号１１５で示される野生型ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメインである。

ある実施形態では、ＣＨ２ドメインは、２９７位のアスパラギンでのアミノ酸置換（例えば、アスパラギンからアラニンへ）を含む変化免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン）である。そのようなアミノ酸置換は、この部位でのグリコシル化を減少または排除し、ＦｃγＲおよびＣ１ｑへの効率的なＦｃ結合を抑止する。２９７位でのＡｓｎからＡｌａへの置換を有する変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメインの配列は、配列番号３２４で示される。

ある実施形態では、ＣＨ２ドメインは、２３４〜２３８位で少なくとも１つの置換または欠失を含む変化免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２３４、２３５、２３６、２３７または２３８位、２３４および２３５位、２３４および２３６位、２３４および２３７位、２３４および２３８位、２３４〜２３６位、２３４、２３５および２３７位、２３４、２３６および２３８位、２３４、２３５、２３７、および２３８位、２３６〜２３８位での１置換、または２３４〜２３８位での２、３、４、もしくは５つのアミノ酸の任意の他の組み合わせを含むことができる。加えてあるいはその代わりに、変化ＣＨ２領域は、２３４〜２３８位で、例えば、２３６位または２３７位の１つで１つ以上（例えば、２、３、４、または５）のアミノ酸欠失を含むことができ、他の位置は置換される。上記突然変異（複数可）は、変化ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロダイマーの抗体依存細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性またはＦｃ受容体結合能力を減少または排除する。ある実施形態では２３４〜２３８位の１つ以上のアミノ酸残基は、１つ以上のアラニン残基で置換されている。さらなる実施形態では、２３４〜２３８位のアミノ酸残基の１つのみが欠失しており、２３４〜２３８位の残りのアミノ酸の１つ以上が、別のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）で置換され得る。

ある他の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、および３３１位での１つ以上のアミノ酸置換を含む変化免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、または３３１位、３１８および３２０位、３１８および３２２位、３１８、３２０および３２２位での一置換、または２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、および３３１位での２、３、４、５、もしくは６つのアミノ酸の任意の他の組み合わせを含むことができる。上記突然変異（複数可）は、変化ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロダイマーの補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を減少または排除する。

ある他の実施形態では、２９７位でのアミノ酸置換に加えて、変化ＣＨ２領域（例えば、変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン）はさらに、２３４〜２３８位での１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）の追加の置換を含むことができる。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２３４および２９７位、２３４、２３５および２９７位、２３４、２３６および２９７位、２３４〜２３６および２９７位、２３４、２３５、２３７および２９７位、２３４、２３６、２３８および２９７位、２３４、２３５、２３７、２３８および２９７位、２３６〜２３８および２９７位での一置換、または２９７位に加えて２３４〜２３８位での２、３、４、または５つのアミノ酸の任意の組み合わせを含むことができる。加えてまたはその代わりに、変化ＣＨ２領域は２３４〜２３８位、例えば２３６位または２３７位での１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のアミノ酸欠失を含み得る。追加の突然変異（複数可）は、変化ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロダイマーの抗体依存細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性またはＦｃ受容体結合能力を減少または排除する。ある実施形態では、２３４〜２３８位の１つ以上でのアミノ酸残基は、１つ以上のアラニン残基と置換されている。さらなる実施形態では、２３４〜２３８位でのアミノ酸残基の１つのみが欠失しており、２３４〜２３８位の残りのアミノ酸の１つ以上が、別のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）で置換され得る。

ある実施形態では、２３４〜２３８位での１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のアミノ酸置換に加えて、本開示の融合タンパク質中の変異ＣＨ２領域（例えば、変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン）は、補体結合に関与する１つ以上の位置（例えば、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、またはＰ３３１位）で１つ以上（例えば、２、３、４、５、または６つ）の追加のアミノ酸置換（例えば、アラニンによる置換）を含み得る。変異免疫グロブリンＣＨ２領域の例としては、２３４、２３５、２３７（存在する場合）、３１８、３２０および３２２位でのアラニン置換を有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびマウスＩｇＧ２ａＣＨ２領域が挙げられる。例示的な変異免疫グロブリンＣＨ２領域はＬ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２でのアラニン置換を有するマウスＩＧＨＧ２ｃＣＨ２領域（配列番号３１４）である。

さらに別の実施形態では、２９７位でのアミノ酸置換および２３４〜２３８位での追加の欠失（複数可）または置換（複数可）に加えて、変化ＣＨ２領域（例えば、変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン）はさらに、２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、および３３１位での１つ以上（例えば、２、３、４、５、または６つ）の追加の置換を含むことができる。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、（１）２９７位での置換、（２）２３４〜２３８位での１つ以上の置換もしくは欠失またはその組み合わせ、およびＩ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、およびＰ３３１位での１つ以上（例えば、２、３、４、５、または６つ）のアミノ酸置換、例えばＥ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２位での１、２、３つの置換を含むことができる。上記位置でのアミノ酸は、アラニンまたはセリンで置換され得る。

ある実施形態では、免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドは下記を含む：（ｉ）２９７位のアスパラギンでのアミノ酸置換および２３４、２３５、２３６または２３７位での１つのアミノ酸置換；（ｉｉ）２９７位のアスパラギンでのアミノ酸置換および２３４〜２３７位の２つでのアミノ酸置換；（ｉｉｉ）２９７位のアスパラギンでのアミノ酸置換および２３４〜２３７位の３つでのアミノ酸置換；（ｉｖ）２９７位のアスパラギンでのアミノ酸置換、２３４、２３５および２３７位でのアミノ酸置換、および２３６位でのアミノ酸欠失；（ｖ）２３４〜２３７位の３つでのアミノ酸置換および３１８、３２０および３２２位でのアミノ酸置換；または（ｖｉ）２３４〜２３７位の３つでのアミノ酸置換、２３６位でのアミノ酸欠失、ならびに３１８、３２０および３２２位でのアミノ酸置換。

２９７位のアスパラギンでのアミノ酸置換を有する例示的な変化免疫グロブリンＣＨ２領域としては下記が挙げられる：Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７でのアラニン置換およびＧ２３６での欠失を有するヒトＩｇＧ１ＣＨ２領域（配列番号３２５）、Ｖ２３４、Ｇ２３６およびＮ２９７でのアラニン置換を有するヒトＩｇＧ２ＣＨ２領域（配列番号３２６）、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７でのアラニン置換およびＧ２３６の欠失を有するヒトＩｇＧ４ＣＨ２領域（配列番号３２２）、Ｆ２３４およびＮ２９７でのアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４ＣＨ２領域（配列番号３４３）、Ｌ２３５およびＮ２９７でのアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４ＣＨ２領域（配列番号３４４）、Ｇ２３６およびＮ２９７でのアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４ＣＨ２領域（配列番号３４５）、ならびにＧ２３７およびＮ２９７でのアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４ＣＨ２領域（配列番号３４６）。

ある実施形態では、上記アミノ酸置換に加えて、変化ＣＨ２領域（例えば、変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン）は、上記位置以外の１つ以上の位置での１つ以上の追加のアミノ酸置換を含み得る。そのようなアミノ酸置換は保存的または非保存的アミノ酸置換であり得る。例えば、ある実施形態では、Ｐ２３３は、変化ＩｇＧ２ＣＨ２領域ではＥ２３３に変化され得る（例えば、配列番号３２６を参照されたい）。加えてまたはその代わりに、ある実施形態では、変化ＣＨ２領域は、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、または両方を含み得る。挿入（複数可）、欠失（複数可）または置換（複数可）は、免疫グロブリンＣＨ２領域中のどこにあってもよく、例えば、ＣＨ２領域を別の領域（例えば、結合ドメインまたは免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン）とヒンジを介して結合することにより得られる野生型免疫グロブリンＣＨ２領域のＮ−またはＣ末端にある。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマー中の変化ＣＨ２領域は、野生型免疫グロブリンＣＨ２領域、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４、またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列を含む、またはそのような配列である。

本開示のポリペプチドヘテロダイマー中の変化免疫グロブリンＣＨ２領域は、様々な種（ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳動物を含む）由来の様々な免疫グロブリンアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、およびＩｇＤのＣＨ２領域から誘導され得る。ある実施形態では、本開示の融合タンパク質中の変化免疫グロブリンＣＨ２領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４、またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域由来としてもよく、その配列は、配列番号１１５、１９９、２０１および３２０で示される。

ある実施形態では、変化ＣＨ２ドメインは、２３５、３１８、３２０、および３２２位でのアラニン置換、および任意でＮ２９７突然変異（例えば、アラニンへ）を有するヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン（すなわち、Ｌ２３５Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン）（配列番号５９５）である。ある他の実施形態では、変化ＣＨ２ドメインは、２３４、２３５、２３７、３１８、３２０および３２２位でのアラニン置換、および任意でＮ２９７突然変異（例えば、アラニンへ）を有するヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン（すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメイン）（配列番号５９６）である。

ある実施形態では、変化ＣＨ２ドメインは、免疫学的活性、例えばＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体結合、Ｆｃ受容体結合、またはそれらの任意の組み合わせを増強する当技術分野で知られている突然変異を有する変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ドメインである。

本開示のヘテロダイマーの１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分を形成し得るＣＨ３ドメインは、様々な種（ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳動物を含む）のある免疫グロブリンクラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）由来の野生型免疫グロブリンＣＨ３ドメインまたはその変化免疫グロブリンＣＨ３ドメインとすることができる。ある実施形態では、ＣＨ３ドメインは、野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、例えば、それぞれ、配列番号１１６、２０８〜２１０、２０４〜２０７、および２１２で示される、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの野生型ＣＨ３ドメインである。ある実施形態では、ＣＨ３ドメインは、配列番号１１６で示される野生型ヒトＩｇＧ１ＣＨ３ドメインである。ある実施形態では、ＣＨ３ドメインは、変化ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体の野生型ＣＨ３ドメインに基づく、または由来する変化ＣＨ３ドメインである。例えば、変化ＣＨ３ドメインは、Ｈ４３３およびＮ４３４位（位置は、ＥＵナンバリングに従い番号付けされる）での１または２つの突然変異を有するヒトＩｇＧ１ＣＨ３ドメインとすることができる。そのような位置での突然変異は、補体結合に関与し得る。ある他の実施形態では、変化ＣＨ３ドメインは、Ｆ４０５またはＹ４０７位での１つまたは２つのアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１ＣＨ３ドメインとすることができる。そのような位置でのアミノ酸は、別のＣＨ３ドメインとの相互作用に関与する。ある実施形態では、変化ＣＨ３ドメインは、その最後のリシンが欠失している変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ３ドメインとすることができる。この変化ＣＨ３ドメインの配列は、配列番号７６１で示される。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは、いわゆる「ノブイントゥホール（knobs-into-holes）」突然変異を含むＣＨ３対を含む(Marvinand Zhu, Acta PharmacologicaSinica 26:649-58, 2005; Ridgway et al., ProteinEngineering 9:617-21, 196６を参照されたい)。より詳細には、突然変異は２つのＣＨ３ドメインの各々中に導入するこ
とができ、そのため、ＣＨ３／ＣＨ３結合のために要求される立体的相補性は、これらの２つのＣＨ３ドメインに、互いに強制的に対形成させる。例えば、ポリペプチドヘテロダイマーの１つの１本鎖ポリペプチド中のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ突然変異（「ノブ」突然変異、これは小さなアミノ酸を大きなもので置換する）を含むことができ、ポリペプチドヘテロダイマーの他の１本鎖ポリペプチド中のＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ａ突然変異（「ホール」突然変異、これは、大きなアミノ酸を小さなもので置換する）を含むことができる。他の例示的なノブイントゥホール突然変異としては、（１）１つのＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｙ突然変異および他のＣＨ３ドメイン中のＹ４０７Ｔ、ならびに（２）１つのＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｗ突然変異および他のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異が挙げられる。

本開示のヘテロダイマーの１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分を形成し得るＣＨ４ドメインは、ＩｇＥまたはＩｇＭ分子由来の野生型免疫グロブリンＣＨ４ドメインまたはその変化免疫グロブリンＣＨ４ドメインとすることができる。ある実施形態では、ＣＨ４ドメインは、野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメイン、例えば、それぞれ、配列番号２１３および２１４で示されるヒトＩｇＥおよびＩｇＭ分子の野生型ＣＨ４ドメインである。ある実施形態では、ＣＨ４ドメインは、変化ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメイン、例えば、ヒトＩｇＥまたはＩｇＭ分子のＣＨ４ドメインに基づく、または由来する変化ＣＨ４ドメインであり、これは、ＩｇＥまたはＩｇＭＦｃ領域と関連することが知られている免疫学的活性を増加または減少させる突然変異を有する。

ある実施形態では、本開示のヘテロダイマー中のＦｃ領域定常ドメイン部分は、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメインの組み合わせ（すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４から選択される１を超える定常サブドメイン）を含む。例えば、Ｆｃ領域部分は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含み得る。ある他の実施形態では、Ｆｃ領域部分は、２つのＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２またはＣＨ４ドメインを含まない（すなわち、２つ以上のＣＨ３のみ）可能性がある。Ｆｃ領域部分を形成する複数の定常サブドメインは、同じ免疫グロブリン分子、または同じクラスもしくはサブクラスの免疫グロブリン分子に基づく、または由来する可能性がある。ある実施形態では、Ｆｃ領域部分はＩｇＧＣＨ２ＣＨ３（例えば、ＩｇＧ１ＣＨ２ＣＨ３、ＩｇＧ２ＣＨ２ＣＨ３、およびＩｇＧ４ＣＨ２ＣＨ３）であり、ヒト（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４）ＣＨ２ＣＨ３とすることができる。例えば、ある実施形態では、Ｆｃ領域部分は、（１）野生型ヒトＩｇＧ１ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、（２）Ｎ２９７Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１ＣＨ２（すなわち、ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ））および野生型ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、または（３）ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）および最後のリシンが欠失している変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ３を含む。

また、複数の定常サブドメインは、異なる免疫グロブリン分子、または異なるクラスもしくはサブクラスの免疫グロブリン分子に基づく、または由来し得る。例えば、ある実施形態では、Ｆｃ領域部分は、ヒトＩｇＭＣＨ３ドメインおよびヒトＩｇＧ１ＣＨ３ドメインの両方を含む。Ｆｃ領域部分を形成する複数の定常サブドメインは、共に直接結合されてもよく、または１つ以上（例えば、約２〜１０）のアミノ酸を介して互いに結合されてもよい。

例示的なＦｃ領域部分は配列番号３０５〜３０９、３２１、３２３、３４１、３４２、および７６２で示される。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーの両方の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分は、互いに同一である。ある他の実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーの１つの１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分は、ヘテロダイマーの他の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分とは異なる。例えば、１つのＦｃ領域部分は、「ノブ」突然変異を有するＣＨ３ドメインを含むことができ、一方、他のＦｃ領域部分は、「ホール」突然変異を有するＣＨ３ドメインを含むことができる。
ヒンジ
本開示によるポリペプチドヘテロダイマーの１本鎖ポリペプチドに含まれるヒンジ領域は、（ａ）Ｆｃ領域部分へのアミノ末端に近接して（例えば、アイソタイプによって、Ｆｃ領域部分がＣＨ２ＣＨ３であるＣＨ２ドメインへのアミノ末端、またはＦｃ領域部分がＣＨ３ＣＨ４であるＣＨ３ドメインへのアミノ末端）、（ｂ）結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインの間に挿入され、それらを結合するように、（ｃ）免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインとＦｃ領域部分（例えば、この場合、その１つまたは複数のアイソタイプによって、Ｆｃ領域部分はＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ３ＣＨ４である）の間に挿入され、それらを結合するように、（ｄ）Ｆｃ領域部分と結合ドメインの間に挿入され、それらを結合するように、（ｅ）１本鎖ポリペプチドのアミノ末端に、または（ｆ）１本鎖ポリペプチドのカルボキシル末端に、配置され得る。本明細書で記載されるヒンジ領域を含む１本鎖ポリペプチドは、異なる１本鎖融合ポリペプチドと結合して、本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーを形成することができ、形成されたポリペプチドヘテロダイマーは、その標的特異性またはその特異的標的結合親和性を保持する結合ドメインを含む。

ある実施形態では、別の１本鎖ポリペプチドとポリペプチドヘテロダイマーを形成する１本鎖ポリペプチド中に存在するヒンジは、免疫グロブリンヒンジ領域、例えば野生型免疫グロブリンヒンジ領域またはその変化免疫グロブリンヒンジ領域であり得る。

ある実施形態では、ヒンジは野生型ヒト免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、配列番号２１５〜２２１で示されるヒト免疫グロブリンヒンジ領域）である。ある他の実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基は、融合タンパク質コンストラクト設計の一部として野生型免疫グロブリンヒンジ領域のアミノまたはカルボキシ末端で追加され得る。例えば、ヒンジアミノ末端での追加の接合アミノ酸残基は「ＲＴ」、「ＲＳＳ」、「ＴＧ」もしくは「Ｔ」とすることができ、またはヒンジカルボキシ末端では、「ＳＧ」とすることができ、またはヒンジ欠失は、カルボキシル末端で「ＳＧ」が付加されたΔＰなどの付加と組み合わせることができる。

ある実施形態では、ヒンジは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域中の１つ以上のシステイン残基が、１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、セリンまたはアラニン）で置換された変化免疫グロブリンヒンジである。例えば、ヒンジは配列番号６６７で示される野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジに基づく、または由来する変化免疫グロブリンヒンジとすることができ、これは、アミノ末端からカルボキシル末端へ、上部ヒンジ領域（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ、配列番号２２７）およびコアヒンジ領域（ＣＰＰＣＰ、配列番号２２８）を含む。例示的な変化免疫グロブリンヒンジは、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジで見られる１、２または３つのシステイン残基が、１、２または３つの異なるアミノ酸残基（例えば、セリンまたはアラニン）により置換されている免疫グロブリンヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を含む。変化免疫グロブリンヒンジはさらに、別のアミノ酸（例えば、セリンまたはアラニン）で置換されたプロリンを有し得る。例えば、上記変化ヒトＩｇＧ１ヒンジはさらに、別のアミノ酸残基（例えば、セリン、アラニン）により置換された野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の３つのシステインに対してカルボキシル末端側に配置されたプロリンを有し得る。１つの実施形態では、コアヒンジ領域のプロリンは置換されない。例示的な変化免疫グロブリンヒンジは配列番号２２９〜２４０、２５５、６６４〜６７７、および７４８〜７５９で示される。変化ＩｇＧ１ヒンジの例は、最初のシステインがセリンにより置換された変化ヒトＩｇＧ１ヒンジである。この変化ＩｇＧ１ヒンジの配列は、配列番号６６４で示され、「ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ」または「ＳＣＣ−Ｐヒンジ」と呼ばれる。ある実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基（例えば、「ＲＴ」、「ＲＳＳ」、または「Ｔ」）が、変異免疫グロブリンヒンジ領域のアミノまたはカルボキシ末端に、融合タンパク質コンストラクト設計の一部として追加され得る。

ある実施形態では、ヒンジポリペプチドは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域、例えば野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ、または野生型ヒトＩｇＧ４ヒンジに少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列を含む、または配列である。

さらなる実施形態では、別の１本鎖ポリペプチドと共にポリペプチドヘテロダイマーを形成する１本鎖ポリペプチド中に存在するヒンジは、免疫グロブリンヒンジに基づかない、または由来しないヒンジであり得る（すなわち、野生型免疫グロブリンヒンジまたは変化免疫グロブリンヒンジではない）。これらの型の非免疫グロブリンに基づくヒンジはポリペプチドヘテロダイマーを形成する１本鎖ポリペプチドのカルボキシル末端で、またはその近くで使用され得る（例えば、Ｆｃ領域部分へのカルボキシル末端に配置される）。そのようなヒンジのための例としては、ＩＩＣ型レクチンまたはＣＤ分子のドメイン間またはストーク領域の約５〜約１５０のアミノ酸のペプチド、例えば、約８〜２５のアミノ酸のペプチドおよび約７〜１８のアミノ酸のペプチド、およびその誘導体が挙げられる。

ＩＩＣ型レクチンまたはＣＤ分子の「ドメイン間またはストーク領域」は、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ；例えば、ナチュラルキラー細胞受容体のＣＴＬＤに類似）と膜貫通ドメイン間に配置される、ＩＩＣ型レクチンまたはＣＤ分子の細胞外ドメインの部分を示す。例えば、ヒトＣＤ９４分子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ５０２９１．１、ＰＲＩ、１９９５年１２月３０日）では、細胞外ドメインはアミノ酸残基３４〜１７９に対応し、ＣＴＬＤはアミノ酸残基６１〜１７６に対応する。したがって、ヒトＣＤ９４分子のドメイン間またはストーク領域は、アミノ酸残基３４〜６０を含み、これは膜とＣＴＬＤの間で見られる(Boyington et al., Immunity 10:75, 1999を参照されたい；他のスト
ーク領域の説明に対しては、Beavilet al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 89:753, 1992;およびFigdor etal., Nature Rev.Immunol. 2:77, 2002を参照されたい）。これらの
ＩＩＣ型レクチンまたはＣＤ分子はまた、ストーク領域と膜貫通領域またはＣＴＬＤの間の６〜１０の接合アミノ酸を有し得る。別の例では、２３３アミノ酸ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号．Ｐ２６７１５．１、ＰＲＩ、２０１０年６月１５日）は、アミノ酸７１〜９３の範囲の膜貫通ドメインおよびアミノ酸９４〜２３３の範囲の細胞外ドメインを有する。ＣＴＬＤは、アミノ酸１１９〜２３１から構成され、ストーク領域はアミノ酸９９〜１１６を含み、５および２のアミノ酸の接合部により隣接される。他のＩＩＣ型レクチンまたはＣＤ分子、ならびにそれらの細胞外リガンド結合ドメイン、ドメイン間またはストーク領域、およびＣＴＬＤは当技術分野では知られている（例えば、ヒトＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄの配列ならびにそれらの説明については、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号．ＮＰ＿００１９９３．２；ＡＡＨ０７０３７．１、ＰＲＩ、２００６年７月１５日；ＮＰ＿００１７７３．１、ＰＲＩ、１０１０年６月２０日；ＡＡＬ６５２３４．１、ＰＲＩ、２００２年１月１７日、およびＣＡＡ０４９２５．１、ＰＲＩ、２００６年１１月１４日を参照されたい）。

ＩＩＣ型レクチンまたはＣＤ分子のドメイン間もしくはストーク領域の「誘導体」、またはそれらのフラグメントは、野生型ＩＩＣ型レクチンまたはＣＤ分子のストーク領域の１、２もしくは３つのアミノ酸が欠失、挿入、置換、またはそれらの任意の組み合わせを有する、例えば、１つ以上の変化は置換であり、または１つ以上の突然変異は１つの欠失のみを含む約８〜約１５０のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ドメイン間またはストーク領域の誘導体は、野生型ドメイン間またはストーク領域配列、例えばＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ７２、またはＣＤ９４の約８〜約２０アミノ酸に由来するものに比べ、タンパク質分解的切断に対しより抵抗性である。

ある実施形態では、ドメイン間またはストーク領域ヒンジは７〜１８のアミノ酸を有し、α−へリックスコイルドコイル構造を形成することができる。ある実施形態では、ドメイン間またはストーク領域ヒンジは、０、１、２、３、または４のシステインを含む。例示的なドメイン間またはストーク領域ヒンジは、ドメイン間またはストーク領域のペプチドフラグメント、例えば、配列番号２４１〜２４４、７１６および６０１で示される、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄのストーク領域由来の１０〜１５０アミノ酸フラグメントである。追加の例示的なストーク領域またはドメイン間ヒンジとしては、配列番号７８、７３４〜７３７、７４２〜７４７、および７６６〜７９０で示されるものが挙げられる。

ポリペプチドヘテロダイマーの１本鎖ポリペプチドにおいて使用することができる別のヒンジは、免疫グロブリンＶ様または免疫グロブリンＣ様ドメインを結合する細胞表面受容体の部分（ドメイン間領域）に由来する。細胞表面受容体が複数のＩｇＶ様ドメインをタンデムに含む場合のＩｇＶ様ドメイン間および細胞表面受容体が複数のタンデムＩｇＣ様領域を含む場合のＩｇＣ様ドメイン間の領域はまた、ポリペプチドヘテロダイマーの１本鎖ポリペプチドにおいて有用なヒンジとして企図される。ある実施形態では、細胞表面受容体ドメイン間領域から構成されるヒンジ配列はさらに、天然または追加のモチーフ、例えばポリペプチドヘテロダイマー形成を安定化させるために１つ以上のジスルフィド結合を付与するＩｇＧコアヒンジ配列を含み得る。ヒンジの例としては、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ６６、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５０、ＣＤ１６６およびＣＤ２４４のＩｇＶ様およびＩｇＣ様領域間のドメイン間領域が挙げられる。

ある実施形態では、ヒンジ配列は、約５〜１５０のアミノ酸、５〜１０のアミノ酸、１０〜２０のアミノ酸、２０〜３０のアミノ酸、３０〜４０のアミノ酸、４０〜５０のアミノ酸、５０〜６０のアミノ酸、５〜６０のアミノ酸、５〜４０のアミノ酸、８〜２０のアミノ酸、または１０〜１５のアミノ酸を有する。ヒンジは主に可動性であり得るが、より剛性の特性を提供することができ、または主にα−へリックス構造を含むことができ、β−シート構造は最小に抑えられている。ヒンジの長さまたは配列は、ヒンジが直接または間接的に（別の領域またはドメイン、例えば免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインを介して）結合される結合ドメインの結合親和性、ならびにヒンジが直接または間接的に結合されるＦｃ領域部分の１つ以上の活性に影響することができる（実施例９および１０を参照されたい）。

ある実施形態では、ヒンジ配列は、血漿および血清中で安定であり、タンパク質分解的切断に対し抵抗性である。ＩｇＧ１上部ヒンジ領域の最初のリシンはタンパク質分解的切断を最小に抑えるために変異されてもよく、例えば、リシンは、メチオニン、スレオニン、アラニンまたはグリシンで置換されてもよく、または欠失してもよい（例えば、配列番号３７９〜４３４を参照されたい、これらはＲＴなどのアミノ末端での接合アミノ酸を含み得る）。

いくつかの実施形態では、ヒンジ配列は天然または追加モチーフ、例えば、分子のカルボキシ末端を安定化するために１つまたは複数のジスルフィド結合を形成する能力を付与する免疫グロブリンヒンジコア構造ＣＰＰＣＰ（配列番号２２８）を含み得る。他の実施形態では、ヒンジ配列は、１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。

変化免疫グロブリンヒンジを含む例示的なヒンジは、配列番号３７９〜４３４、６１８〜７４９、および７６３〜７９１で示される。

ある実施形態では、本開示によるポリペプチドヘテロダイマーの１本鎖ポリペプチドは、１を超えるヒンジを含む。例えば、１つはアミノ末端およびもう１つはカルボキシル末端にある２つの結合ドメインを有する１本鎖ポリペプチドは、２つのヒンジを有し得る。１つのヒンジは直接または間接的に（例えば、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインを介して）アミノ末端で、またはその付近で結合ドメインに結合され得、他のヒンジはカルボキシル末端で、またはその付近で他の結合ドメインに結合（例えば、直接結合）され得る。ある実施形態では、たとえ、１本鎖ポリペプチドが１つの結合ドメインしか有しないとしても、１を超えるヒンジを、例えば、そのアミノまたはカルボキシル末端で有することができる。そのようなヒンジは、ヘテロダイマーの他の鎖中の対応するヒンジと相互作用することができ、例えば１つ以上の鎖間ジスルフィド結合を形成し、２つの鎖のヘテロ二量化を促進または増強する。ポリペプチドヘテロダイマーのＳＣＰ−Ｉのヒンジ（Ｈ−Ｉ）は、ヘテロダイマーのＳＣＰ−ＩＩのヒンジ（Ｈ−ＩＩ）に、Ｈ−ＩおよびＨ−ＩＩがそれらの個々の１本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分の同じ端に配置されている場合、「対応する」。例えば、ポリペプチドヘテロダイマーは以下の２つの１本鎖ポリペプチドを含み得る：第１の鎖ポリペプチドはアミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含み、ならびに第２の鎖ポリペプチドはアミノからカルボキシル末端へ、ＣＫ、第１のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む。第１の鎖中のヒンジは、第２の鎖の第１のヒンジに「対応する」と考えられ、というのは、両方ともが、それらが結合されているＦｃ領域部分へのアミノ末端にあるからである。

ポリペプチドヘテロダイマーの１本鎖ポリペプチドがそのカルボキシル末端に、またはその付近に結合ドメインを含む、ある実施形態では、ヒンジは結合ドメインを１本鎖ポリペプチドの別の部分（例えば、Ｆｃ領域部分または免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン）と結合させるために存在し得る。１つの実施形態では、そのようなヒンジは非免疫グロブリンヒンジ（すなわち、野生型免疫グロブリンヒンジに基づかず、または由来しないヒンジ）であり、ＩＩＣ型レクチンまたはＣＤ分子のストーク領域、細胞表面受容体のＩｇＶ様またはＩｇＣ様ドメインを結合するドメイン間領域、またはその誘導体もしくは機能的変異体とすることができる。時として「後端」ヒンジと呼ばれる例示的なカルボキシル末端ヒンジとしては、配列番号７８、７３４〜７３７、７４２〜７４７、および７６６〜７９０で示されるものが挙げられる。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーの１つの１本鎖ポリペプチドのヒンジは、ヘテロダイマーの他の１本鎖ポリペプチドの対応するヒンジと同一である。ある他の実施形態では、１つの鎖のヒンジは、他の鎖のものとは異なる（長さまたは配列において）。異なる鎖中の異なるヒンジは、ヒンジが結合される結合ドメインの結合親和性の異なる操作を可能にし、よって、ヘテロダイマーは、他の結合ドメインの標的よりも優先的に１つの結合ドメインの標的に結合することができる。例えば、ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは１つの鎖中にＣＤ３またはＴＣＲ結合ドメインおよび別の鎖中に腫瘍抗原結合ドメインを有する。２つの鎖中に２つの異なるヒンジを有することにより、ヘテロダイマーは、腫瘍抗原に最初に結合し、その後、ＣＤ３またはＴＣＲ分子に結合することができる。よって、ヘテロダイマーは腫瘍抗原を有する腫瘍細胞にＣＤ３^＋Ｔ細胞を動員することができ、ひいては、腫瘍細胞を損傷または破壊することができる。
他の構成要素または修飾
ある実施形態では、別の１本鎖ポリペプチドとヘテロダイマーを形成する１本鎖ポリペプチドは、１つ以上の追加のドメインまたは領域を含み得る。そのような追加の領域は発現された１本鎖ポリペプチドの分泌のためのアミノ末端にあるリーダー配列（「シグナルペプチド」とも呼ばれる）であり得る。この開示の例示的なリーダーペプチドとしては、天然リーダー配列または他のもの、例えば配列番号１１０および１１１で示されるものが挙げられる。

追加の領域はまた、１本鎖ポリペプチドを同定または精製するためのカルボキシ末端にある配列であり得る(例えば、検出または精製のためのエピトープタグ、例えばヒスチジ
ンタグ、ビオチン、FLAG（登録商標）エピトープ、またはそれらの任意の組み合わせ)。

さらなる任意的な領域は、１〜約１０アミノ酸（例えば、約２〜５アミノ酸）の長さを有する追加のアミノ酸残基（「接合アミノ酸」または「接合アミノ酸残基」とも呼ばれる）とすることができ、これは、本開示の１本鎖ポリペプチドのための特異的な発現系またはコンストラクト設計の使用により得られ得る。そのような追加のアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、または５の追加のアミノ酸）は、１本鎖ポリペプチドのアミノもしくはカルボキシル末端または種々の領域もしくはドメイン間、例えば、結合ドメインと免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインの間、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインとヒンジの間、ヒンジとＦｃ領域部分の間、Ｆｃ領域部分のドメイン間（例えば、ＣＨ２とＣＨ３ドメインの間または２つのＣＨ３ドメイン間）、結合ドメインとヒンジの間、Ｆｃ領域部分と免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインの間、または可変ドメインとリンカーの間に存在し得る。ヒンジへのアミノ末端の例示的な接合アミノ酸としては、ＲＤＱ（配列番号５９８）、ＲＴ、ＳＳ、ＳＡＳＳ（配列番号５９９）およびＳＳＳ（配列番号６００）が挙げられる。ヒンジへのカルボキシ末端の例示的な接合アミノ酸としてはアミノ酸ＳＧが挙げられる。追加の例示的な接合アミノ酸としてはＳＲが挙げられる。

ある実施形態では、接合アミノ酸は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域と免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＣＨ１またはＣＬ）の間に存在する。これらの接合アミノ酸はまた、ＣＨ３のＣ末端とＣＨ１またはＣＬのＮ末端との間に存在する場合、「ＣＨ３とＣＨ１またはＣＬの間のリンカー」と呼ばれる。そのようなリンカーは約２〜１２アミノ酸長であり得る。ある実施形態では、Ｆｃ領域部分はヒトＩｇＧ１ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ここでヒトＩｇＧ１ＣＨ３のＣ末端リシン残基が欠失している。ＣＨ３とＣＨ１の間の例示的なリンカーとしては、配列番号８４７〜８４９で示されるものが挙げられる。ＣＨ３とＣｋの間の例示的なリンカーとしては、配列番号８５０〜８５２で示されるもの（この場合、リンカー中のカルボキシル末端アルギニンは、代わりにＣｋの最初のアルギニンとて見なされ得る）が挙げられる。ある実施形態では、そのようなリンカーまたはリンカー対（例えば、ヘテロダイマーの１つの１本鎖ポリペプチド中のＣＨ３−ＣＨ１リンカーとしての配列番号８４７およびヘテロダイマーの他の１本鎖ポリペプチド中のＣＨ３−Ｃｋリンカーとしての配列番号８５０；ＣＨ３−ＣＨ１リンカーとしての配列番号８４８およびＣＨ３−Ｃｋリンカーとしての配列番号８５１；ならびにＣＨ３−ＣＨ１リンカーとしての配列番号８４９およびＣＨ３−Ｃｋリンカーとしての配列番号８５２）の存在は、ヘテロダイマーの両方の１本鎖ポリペプチド中の配列番号８４６で示される参照リンカー（この場合、ＣＨ３の最後のリシンは、リンカーの対として含められる）の存在に比べ、ヘテロダイマーの生成を改善する。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーの免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＨ４領域）は、免疫グロブリン参照配列に対し変化グリコシル化パターンを有し得る。例えば、様々な遺伝子操作のいずれいかが、グリコシル化部位を形成する１つ以上の特定のアミノ酸残基、例えば、ＣＨ２ドメインのＮ２９７（ＥＵナンバリング）を変化させるために使用され得る(Co et al. (1993) Mol. Immunol. 30:1361; Jacquemon et al. (2006)J.Thromb. Haemost. 4:1047; Schuster et al. (2005) Cancer Res. 65:7934; Warnocketal. (2005) Biotechnol. Bioeng. 92:831
を参照されたい）。また、この開示のポリペプチドヘテロダイマーを生成する宿主細胞は、変化グリコシル化パターンを生成するように操作され得る。当技術分野では知られている１つの方法は、例えば、ＡＤＣＣを増加させる二分された、非フコシル化変異体の形状で変化グリコシル化を提供する。変異体は、オリゴ糖修飾酵素を含む宿主細胞中での発現に由来する。また、ＢｉｏＷａ／ＫｙｏｗａＨａｋｋｏのＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）技術は、この開示によるグリコシル化分子のフコース量を減少させるように企図される。１つの公知の方法では、ＧＤＰ−フコースの生成を介して、免疫グロブリンＦｃ領域のグリコシル化パターンを修飾する、組換え免疫グロブリン生成のためのＣＨＯ宿主細胞が提供される。

または、この開示のポリペプチドヘテロダイマーのグリコシル化パターンを変化させる化学技術が使用される。例えば、様々なグリコシダーゼおよび／またはマンノシダーゼ阻害剤は、ＡＤＣＣ活性の増加、Ｆｃ受容体結合の増加、およびグリコシル化パターン変化の１つ以上の所望の効果を提供する。ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーを発現する細胞は、炭水化物修飾因子を、前記宿主細胞により生成される免疫糖タンパク質分子のＡＤＣＣを増加させる濃度で含む培地中で増殖され、ここで、前記炭水化物修飾因子は、８００μＭ未満の濃度である。１つの実施形態では、これらのポリペプチドヘテロダイマーを発現する細胞は、カスタノスペルミンまたはキフネンシンを、例えば、カスタノスペルミンを１００〜８００μＭ、例として１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、または８００μＭの濃度で含む培地中で増殖される。炭水化物修飾因子、例えばカスタノスペルミンでグリコシル化を変化させるための方法は、米国特許第７，８４６，４３４号またはＰＣＴ公開番号第２００８／０５２０３０号において提供される。
構造配列および例示的なヘテロダイマー
本発明によるポリペプチドヘテロダイマーを形成させるために、２つの１本鎖ポリペプチドは、第１の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインが適正に整列され、第２の１本鎖ポリペプチドの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインと相互作用するように設計される。ある実施形態では、ヘテロダイマーは、２つの鎖のヘテロ二量化を促進または増強するために、第２の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン対を含み得る。ある実施形態では、２つの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン間の相互作用に加えて、第１の鎖中のＦｃ領域部分（例えば、ＣＨ３ドメイン）は、第２の鎖中のＦｃ領域と相互作用することができ、ヘテロ二量化（例えば、２つの野生型ＣＨ３ドメイン間または「ノブイントゥホール」突然変異を有するＣＨ３ドメイン対間の相互作用を介する）が増強される。さらに、ある実施形態では、第１の鎖中のヒンジ（例えば、配列番号６６４で示される２つのシステイン残基を有する変化ヒトＩｇＧ１ヒンジ）は、第２の鎖中のヒンジ（例えば、配列番号６６４で示される同じ変化ヒトＩｇＧ１ヒンジ）と相互作用し、例えば、ジスルフィド結合を形成することができ、これはさらに、第１および第２の１本鎖ポリペプチド間の相互作用を強化することができ、本開示のポリペプチドヘテロダイマーが形成される。さらに、ある実施形態では、第１および第２の鎖は、第２のヒンジ対（例えば、２つの鎖のカルボキシル末端）を含むことができ、２つの鎖間の相互作用がさらに増強される。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーは２つの結合ドメイン（ＢＤ１およびＢＤ２）を含み、この場合、結合ドメインは２つの異なる標的分子に結合する。ある実施形態では、２つの結合ドメイン（ＢＤ１およびＢＤ２）はどちらもＳＣＰ−Ｉ上にあり、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）およびＦｃ領域部分（ＦＲＰ−１）は、ＢＤ１とＢＤ２の間に配置される。ある他の実施形態では、第１の結合ドメイン（ＢＤ１）はＳＣＰ−Ｉ上にあり、第２の結合ドメイン（ＢＤ２）はＳＣＰ−ＩＩ上にある。ある実施形態では、ＢＤ１およびＢＤ２はどちらも、それぞれ、ＳＣＰ−ＩおよびＳＣＰ−ＩＩのＦｃ領域部分へのアミノ末端である。ある他の実施形態では、ＢＤ１は、ＳＣＰ−ＩのＦｃ領域部分へのアミノ末端であり、ＢＤ２はＳＣＰ−ＩＩのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端である。ある他の実施形態では、ＢＤ１はＳＣＰ−ＩのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端であり、ＢＤ２はＳＣＰ−ＩＩのＦｃ領域部分へのアミノ末端である。ある他の実施形態では、ＢＤ１およびＢＤ２はどちらも、それぞれ、ＳＣＰ−ＩおよびＳＣＰ−ＩＩのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端である。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは、３つの結合ドメイン（ＢＤ１、ＢＤ２およびＢＤ３）を含み、この場合、結合ドメインは、２つまたは３つの異なる標的分子に結合する。例えば、ＢＤ１、ＢＤ２、およびＢＤ３はそれぞれ、異なる標的に結合し、またはＢＤ１およびＢＤ２は第１の標的に結合し、一方、ＢＤ３は第２の標的に結合し、またはＢＤ１およびＢＤ３は第１の標的に結合し、一方ＢＤ２は第２の標的に結合し、またはＢＤ２およびＢＤ３は第１の標的に結合し、一方、ＢＤ１は第２の標的に結合する。ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインおよびＦｃ領域部分はＳＣＰ−Ｉ上のＢＤ１とＢＤ２の間に配置され、ＢＤ３はＳＣＰ−ＩＩのＦｃ領域部分へのアミノ末端である。さらなる実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインおよびＦｃ領域部分はＳＣＰ−ＩＩ上のＢＤ１とＢＤ２の間に配置され、ＢＤ３はＳＣＰ−ＩのＦｃ領域部分へのカルボキシル末端である。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは４つの結合ドメイン（ＢＤ１、ＢＤ２、ＢＤ３およびＢＤ４）を含み、この場合、結合ドメインは２〜４つの異なる標的分子に結合する。ある実施形態では、ＳＣＰ−Ｉの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインおよびＦｃ領域部分はＢＤ１とＢＤ２の間に配置され、ＳＣＰ−ＩＩの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインおよびＦｃ領域部分はＢＤ３とＢＤ４の間に配置される。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは５つの結合ドメイン（ＢＤ１、ＢＤ２、ＢＤ３、ＢＤ４およびＢＤ５）を含み、この場合、結合ドメインは２〜４つの異なる標的分子に結合する。ある実施形態では、ＳＣＰ−Ｉは３つの結合ドメイン（ＢＤ１、ＢＤ２およびＢＤ３）を含み、ＳＣＰ−ＩＩは２つの結合ドメイン（ＢＤ４およびＢＤ５）を含む。さらなる実施形態では、ＢＤ１およびＢＤ２は、例えば、ＳＣＰ−Ｉのアミノ（またはカルボキシル）末端で、互いにタンデムに結合され（直接、または約２〜８つのアミノ酸のペプチドリンカーを介して）、ＢＤ３はＳＣＰ−ＩまたはＳＣＰ−ＩＩのカルボキシル（またはアミノ）末端に配置され、ここで、ＢＤ４およびＢＤ５は、ＢＤ３がＳＣＰ−Ｉ上にある場合ＳＣＰ−ＩＩ上に、またはＢＤ４もしくはＢＤ５は、ＢＤ３がＳＣＰ−ＩＩ上にある場合ＳＣＰ−Ｉ上にある。

さらに別の実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは６つの結合ドメイン（ＢＤ１〜ＢＤ６）を含む。ある実施形態では、ＳＣＰ−ＩおよびＳＣＰ−ＩＩはそれぞれ、３つの結合ドメイン（例えば、ＳＣＰ−Ｉ上のＢＤ１〜ＢＤ３、およびＳＣＰ−ＩＩ上のＢＤ４〜ＢＤ６）を含む。そのような実施形態では、例えば、ＢＤ１およびＢＤ２は、タンデムに結合され、ＳＣＰ−Ｉアミノ（またはカルボキシル）末端に配置され得、ＢＤ３はＳＣＰ−Ｉカルボキシル（またはアミノ）末端に配置され得る。同様に、ＢＤ４およびＢＤ５はタンデムに結合され、ＳＣＰ−ＩＩアミノ（またはカルボキシル）末端に配置され得、ＢＤ６はＳＣＰ−ＩＩカルボキシル（またはアミノ）末端に配置され得る。ある他の実施形態では、第１の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−Ｉ）は４つの結合ドメイン（ＢＤ１〜ＢＤ４）を含み、第２の１本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−ＩＩ）は２つの結合ドメイン（ＢＤ５およびＢＤ６）を含む。そのような実施形態では、ＢＤ１およびＢＤ２はタンデムに結合され、ＳＣＰ−Ｉのアミノ末端に、またはその付近に配置され得、ＢＤ３およびＢＤ４はタンデムに結合され、ＳＣＰ−Ｉのカルボキシル末端に、またはその付近に配置され得、ＢＤ５およびＢＤ６はそれぞれ、ＳＣＰ−ＩＩのアミノおよびカルボキシル末端に、またはその付近に配置され得る。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは７つの結合ドメイン（ＢＤ１〜ＢＤ７）を含む。そのような実施形態では、ＳＣＰ−Ｉは４つの結合ドメイン（ＢＤ１〜ＢＤ４）を含み得、ＳＣＰ−ＩＩは他の３つの結合ドメイン（ＢＤ５〜ＢＤ７）を含み得る。例えば、ＢＤ１およびＢＤ２はタンデムに結合され、ＳＣＰ−Ｉのアミノ末端に、またはその付近に配置され得、ＢＤ３およびＢＤ４はタンデムに結合され、ＳＣＰ−ＩＩのカルボキシル末端に、またはその付近に配置され得る。ＢＤ５およびＢＤ６はタンデムに結合され、ＳＣＰ−ＩＩのアミノ（またはカルボキシル）末端に、またはその付近に配置され得、ＢＤ７はＳＣＰ−ＩＩのカルボキシル（またはアミノ）末端に、またはその付近に配置され得る。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーは８つの結合ドメイン（ＢＤ１〜ＢＤ８）を含む。そのような実施形態では、第１および第２の１本鎖ポリペプチドはそれぞれ、４つの結合ドメインを含み得る。各鎖では、２つの結合ドメインは、アミノ末端に、またはその付近に配置され得、他の２つの結合ドメインは、カルボキシル末端に、またはその付近に配置され得る。

本開示のポリペプチドヘテロダイマーを形成する第１および第２の１本鎖ポリペプチドを製造するために、どのように様々な構成要素が配列され得るかの説明を簡単にするために、２つの結合ドメインのみが各ヘテロダイマーに含まれる例示的な実施形態（１）〜（５０）における配列を以下で提供する。

実施形態（１）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、およびＦｃ領域部分を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＬ領域（例えば、Ｃκ、Ｃλ）、ヒンジ、およびＦｃ領域部分を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（２）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＨ１領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＬ領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（３）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、および第２のＣＨ１領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、および第２のＣＬ領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（４）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、第２のＣＨ１領域、ヒンジ、およびＦｃ領域部分を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＬ領域、第２のＣＬ領域、ヒンジおよびＦｃ領域部分を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（５）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、および第２のＣＨ１領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに、第２の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域および第２のＣＬ領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（６）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（７）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（８）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のＣＬ領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（９）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＣＨ１領域、第２のＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＬ領域、第２のＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（１０）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のＣＬ領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（１１）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、およびＦｃ領域部分を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、およびＦｃ領域部分を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（１２）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＬ領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＨ１領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（１３）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、および第２のＣＬ領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、および第２のＣＨ１領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（１４）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＬ領域、第２のＣＬ領域、ヒンジ、およびＦｃ領域部分を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＨ１領域、第２のＣＨ１領域、ヒンジ、およびＦｃ領域部分を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（１５）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、および第２のＣＬ領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、および第２のＣＨ１領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（１６）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（１７）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（１８）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のＣＬ領域、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（１９）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＣＬ領域、第２のＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＨ１領域、第２のＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（２０）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のＣＬ領域、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（２１）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＬ領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＨ１領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（２２）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＨ１領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＬ領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（２３）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ＣＬ領域、ヒンジ、およびＦｃ領域部分を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＬ領域、ＣＨ１領域、ヒンジおよびＦｃ領域部分を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（２４）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＬ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ、およびＦｃ領域部分を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ＣＬ領域、ヒンジおよびＦｃ領域部分を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（２５）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域およびＣＬ領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域およびＣＨ１領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（２６）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域およびＣＨ１領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならび第２の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域およびＣＬ領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（２７）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（２８）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（２９）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＣＨ１領域、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびＣＬ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジおよび第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（３０）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＣＬ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＨ１領域、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（３１）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、ＣＬ領域、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、ＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（３２）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、ＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、ＣＬ領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（３３）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＬ領域、ヒンジ、およびＦｃ領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（３４）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＨ１領域、ヒンジおよびＦｃ領域部分を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（３５）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジおよびＦｃ領域部分を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジおよび第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（３６）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジおよび第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジおよびＦｃ領域部分を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（３７）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、および第２のヒンジを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、および第２のヒンジを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（３８）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＬ領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（３９）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＨ１領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（４０）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＨ１領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のヒンジおよび第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（４１）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のヒンジおよび第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＬ領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（４２）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、および第２のヒンジを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域および第２のヒンジを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（４３）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のヒンジおよび第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分およびＣＨ１領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（４４）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＬ領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第１の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域、ＣＨ１領域、第２のヒンジおよび第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（４５）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＬ領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（４６）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ、第２のヒンジおよび第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第２の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、およびＣＨ１領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（４７）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、および第２のＣＬ領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（４８）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、および第２のＣＨ１領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第１の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のＣＬ領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（４９）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、および第２のＣＨ１領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のＣＬ領域、第２のヒンジおよび第２の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（５０）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第１の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；第２の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、および第２のＣＬ領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

例示的な実施形態（５１）〜（６０）もまた、下記で提供され、この場合、３または４つの結合ドメインが各ヘテロダイマーに含められる。追加の結合ドメインは、本明細書で提供される概要を考慮して、本開示による５〜８つの結合ドメインを含むポリペプチドヘテロダイマーを製造するために含められ得る。

実施形態（５１）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジおよび第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第３の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジおよびＦｃ領域部分を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（５２）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジおよび第３の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（５３）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジおよび第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第３の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジおよびＦｃ領域部分を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（５４）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジおよび第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジおよび第３の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（５５）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のヒンジおよび第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第３の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分およびＣＬ領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（５６）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のヒンジ、および第３の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（５７）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第３の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分およびＣＨ１領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（５８）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のヒンジ、および第３の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（５９）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ＣＨ１領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第３の結合ドメイン、ＣＬ領域、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、第２のヒンジおよび第４の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（６０）では、ポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：アミノからカルボキシル末端へ、第１の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＨ１領域、第２のヒンジおよび第２の結合ドメインを含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびに第３の結合ドメイン、ヒンジ、Ｆｃ領域部分、ＣＬ領域、第２のヒンジおよび第４の結合ドメインを含む第２の１本鎖ポリペプチド。

実施形態（１）〜（３２）では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーは下記２つの１本鎖ポリペプチドを含む：Ｔ細胞標的（例えば、ＴＣＲ複合体またはその構成要素、例えばＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε）に特異的に結合する第１の結合ドメイン（ＢＤ１）、ＳＣＣ−ＰＩｇＧ１ヒンジであるヒンジ、野生型または変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ＣＨ３であるＦｃ領域部分、および野生型またはＮ３０ＹＶ５５ＡＴ７０Ｅ（ＹＡＥ）置換を有する変化ヒトＣｋ領域であるＣＬ領域を含む第１の１本鎖ポリペプチド；ならびにＢ細胞標的（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３７、ＣＤ２０）または腫瘍もしくは癌抗原（例えば、ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ−６、ＰＳＭＡ）に特異的に結合する結合ドメイン（ＢＤ２）、ＳＣＣ−ＰＩｇＧ１ヒンジであるヒンジ、野生型または変化ヒトＩｇＧ１ＣＨ２ＣＨ３であるＦｃ領域部分、およびヒトＣＨ１領域であるＣＨ１領域を含む第２の１本鎖ポリペプチド。

さらなる実施形態では、実施形態（１）〜（３２）のポリペプチドヘテロダイマーはさらに、ＢＤ１またはＢＤ２に同一であり、第２のヒンジ（例えば、それぞれ、配列番号７４２および７８で示される、リンカーＨ７５またはＨ６８）を介して１本鎖ポリペプチドに結合される第３の結合ドメイン（ＢＤ３）を含み得る。さらに別の実施形態では、実施形態（１）〜（３２）の実施形態のポリペプチドヘテロダイマーはさらに、それぞれ、ＢＤ１またはＢＤ２と同一であり、または異なり、第２のヒンジ（例えば、配列番号７４２および７８で示されるリンカーＨ７５またはＨ６８）を介して１本鎖ポリペプチド（複数可）に結合される第３および第４の結合ドメイン（ＢＤ３）および（ＢＤ４）を含み得る。

ある実施形態では、本開示のポリペプチドヘテロダイマーは、標的特異的細胞型に対し異なる親和性を有する結合ドメインを有するように操作することができる。例えば、ＴＣＲ複合体またはその構成要素に対する結合ドメインおよび腫瘍抗原（またはＢ細胞標的）に対する別の結合ドメインを有するポリペプチドヘテロダイマーは、腫瘍抗原（またはＢ細胞標的を有するＢ細胞）を有する腫瘍細胞により高い親和性で優先的に結合することが望ましく、よって、ポリペプチドヘテロダイマーは腫瘍細胞（またはＢ細胞）に最初に結合し、その後、そのＴＣＲ／ＣＤ３結合ドメインを介してＴ細胞を腫瘍部位または細胞に動員する。異なる結合親和性は、例えば、他の結合ドメインがその標的に対し有するものよりも高い結合親和性を有する１つの標的に対する結合ドメインを選択することにより、またはポリペプチドヘテロダイマー上で１つの標的に対し複数の結合ドメイン、および第２のまたは他の標的に対し単一の結合ドメインまたはより少ない結合ドメインを含ませることにより、達成され得る。加えて、異なるヒンジを用いて（例えば、異なる長さのヒンジを用いて）他のものよりも１つのドメインの結合に影響させることができ、または結合ドメインの結合活性を変化させるために、異なる結合ドメインに対する異なるヒンジが使用される。

ある実施形態では、複数の結合ドメインは、互いに適切な距離で配置させる必要がある可能性があり、よってそれらの標的との相互作用は所望の効果を生み出すであろう。例えば、ある実施形態では、１本鎖ポリペプチド中のＴＣＲ複合体またはその構成要素に対する結合ドメインおよび第２の１本鎖ポリペプチド中の腫瘍抗原またはＢ細胞標的に対する別の結合ドメインを含むポリペプチドヘテロダイマーは、それらの対応する鎖のアミノまたはカルボキシル末端に両方の結合ドメインを有することができ、よってポリペプチドヘテロダイマー中で互いに物理的に近接する。

例示的なヘテロダイマーは、本明細書で記載される１本鎖ポリペプチド対から形成され得る。本明細書で示される配列識別番号がシグナルペプチド配列（例えば、最初の２０アミノ酸）を含む場合、そのようなシグナルペプチド配列は、例示的なポリペプチドヘテロダイマーを形成する成熟１本鎖ポリペプチドの一部ではなく、除外して考えるべきである。

例示的な１本鎖ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２９〜３２、５３〜７２、７４、８１０〜８２６、８５９〜８６４および８７４〜８８２で示される。

例示的なヘテロダイマーは、下記１本鎖ポリペプチド対から形成され得る：配列番号２および４、配列番号６および８、配列番号１０および１２、配列番号１４および１６、配列番号１８および２０、配列番号２０および２２、配列番号２０および２４、配列番号３０および３２、配列番号２９および３１、配列番号２９および３２、配列番号３０および７２、配列番号５３および７２、配列番号５４および７２、配列番号５５および７２、配列番号７０および７２、配列番号７１および７２、配列番号６３および５６、配列番号６４および５７、配列番号６５および６０、配列番号６６および５８、配列番号６７および５９、配列番号６８および６１、配列番号６９および６２、配列番号５４および８１１、配列番号５４および８１２、配列番号５４および８１３、配列番号８１４および８１８、配列番号８１５および８１８、配列番号８１６および８１８、配列番号８１７および８１８、配列番号８１４および８２０、配列番号８１４および８２１、配列番号５４および８１９、配列番号８１４および８２６、配列番号８１４および８２２、配列番号８１４および８２３、配列番号８１４および８２４、配列番号８５９および８６２、配列番号８６０および８６３、配列番号８６１および８６４、配列番号８７４および８２５、配列番号８７５および８７９、配列番号８７６および８８０、配列番号８７７および８８１、または
配列番号８７８および８８２。
ヘテロダイマーを製造するための核酸、ベクター、宿主細胞、および方法
関連する態様では、本開示はまた、本明細書で提供される１本鎖ポリペプチドをコードする単離された核酸（「ポリヌクレオチド」と同じ意味で使用される）分子を提供する。例示的な核酸分子（シグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列あり、またはなしのいずれか）は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５，１７、１９、２１、２３、２５〜２８、３３〜５２および７９２〜８０８で示される。

本開示はまた、本明細書で提供される１本鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。本明細書では、「ベクター」は、結合されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を示す。例示的なベクターとしては、プラスミド、酵母人工染色体、およびウイルスゲノムが挙げられる。あるベクターは宿主細胞中で自己的に複製することができ、他のベクターは宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、よって、宿主ゲノムと共に複製される。

ある実施形態では、ベクターは組換え発現ベクターとし得る。「組換え発現ベクター」または「発現ベクター」は、発現制御配列（例えば、プロモーター）に機能的に結合され、よって、それらの配列発現を誘導することができる核酸配列を含むベクターを示す。

本明細書で提供される発現ベクターにおいて有用なプロモーター配列は、任意の所望の遺伝子から、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他の選択可能なマーカーを有するベクターを用いて選択することができる。真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。ある実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。

ある実施形態では、ベクターは本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーの第１の１本鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターである。ある他の実施形態では、ベクターは本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーの第２の１本鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターである。

ある実施形態では、ベクターは、ポリペプチドヘテロダイマーの第１および第２の１本鎖ポリペプチドの両方をコードする核酸配列を含む発現ベクターである。第１の１本鎖ポリペプチドをコードする核酸配列のためのプロモーターは、第２の１本鎖ポリペプチドをコードする核酸のためのプロモーターと同じであり得る。また、第１の１本鎖ポリペプチドをコードする核酸配列のためのプロモーターは、第２の１本鎖ポリペプチドをコードする核酸のためのプロモーターとは異なっていてもよく、そのため、第１および第２の１本鎖ポリペプチドの発現レベルは、第１および第２の１本鎖ポリペプチドのヘテロ二量化が最大となるように異なって調節され得る。ある実施形態では、第１および第２の１本鎖ポリペプチドをコードする核酸のためのプロモーターの１つまたは両方が誘導性プロモーターである。

本開示はまた、本明細書で提供される核酸またはベクターのいずれかで形質転換もしくはトランスフェクトされた、あるいはそうでなければそれを含む宿主細胞を提供する。例示的な宿主細胞としては、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）株細胞（発現された多価結合分子のグリコシル化パターンを修飾することができる修飾ＣＨＯ細胞を含む、米国特許出願公開番号第２００３／０１１５６１４号を参照されたい）、ＣＯＳ細胞（例えばＣＯＳ−７）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｎ細胞、３Ｔ３細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞（例
えば、Ｓｆ９細胞）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）細胞
、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、またはストレプトミセス菌ファミリーのメンバーが挙げられる。

ある実施形態では、宿主細胞は、第１の１本鎖ポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現ベクターおよび第２の１本鎖ポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現ベクターを含む。

ある他の実施形態では、宿主細胞は、第１および第２の１本鎖ポリペプチドの両方をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。

本開示はまた、本明細書で記載されるポリペプチドヘテロダイマーを生成する方法を含む。ある実施形態では、方法は、第１および第２の１本鎖ポリペプチドの両方をコードする核酸を含む宿主細胞を、ポリペプチドを発現するのに好適な条件下で培養すること、第１および第２の１本鎖ポリペプチドから形成されたヘテロダイマーを培養物から任意で単離または精製することを含む。第１の１本鎖ポリペプチドをコードする核酸および第２の１本鎖ポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞中の単一の発現ベクター中、または宿主細胞中の２つの異なる発現ベクター中に存在し得る。後者の場合、２つの発現ベクター間の比は、第１および第２の１本鎖ポリペプチドのヘテロ二量化を最大化するように制御され得る。

本開示は、本明細書で記載される精製されたポリペプチドヘテロダイマーを提供する。本明細書では、「精製された」という用語は、本明細書中で用いられる場合、他の構成要素から単離可能な組成物を示し、ここで、ポリペプチドヘテロダイマーは、その天然で得られる状態に比べ任意の程度まで濃縮され得る。ある実施形態では、本開示は本明細書で記載される実質的に精製されたポリペプチドヘテロダイマーを提供する。「実質的に精製された」は、ポリペプチドヘテロダイマーが組成物の主構成要素を形成する、例えば、組成物中でポリペプチドの少なくとも約５０重量％、例えば少なくとも約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、約９０重量％、約９５重量％、約９９重量％を占めるポリペプチドヘテロダイマー組成物を示す。

タンパク質精製技術は当業者によく知られている。これらの技術は、１つのレベルで、ポリペプチドおよび非ポリペプチド画分の粗分別を含む。部分または完全精製（または均一性までの精製）を達成するためのクロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いたさらなる精製がしばしば要求される。純粋融合タンパク質の調製に特に好適な分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；および等電点電気泳動法である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣである。

精製度を定量するための様々な方法が、本開示を考慮すると当業者に知られている。これらとしては例えば、本明細書で提供される実施例で説明される、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析およびＨＰＬＣによる画分中のポリペプチドヘテロダイマーの量の評価が挙げられる。

本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーを製造するための方法は、最初に、個々の１本鎖ポリペプチドを別々に発現させ、精製し、その後、精製された個々の１本鎖ポリペプチドを一緒にインキュベートし、ポリペプチドヘテロダイマーを形成させるための方法よりも好都合である。例えば、ある１本鎖ポリペプチド（例えば、ＣＨ１領域のみをそれらの免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインとして含むあるポリペプチド）は、単独で発現された場合不安定である。加えて、個々の１本鎖ポリペプチドを別々に発現および精製させ、続いて精製された個々の１本鎖ポリペプチドを組み合わせることは、１本鎖ポリペプチドの両方を同時発現させ、続いて、得られたポリペプチドヘテロダイマーを精製することよりも多くの工程を必要とし、一般により効率的ではない。
ヘテロダイマーを使用するための組成物および方法
ポリペプチドヘテロダイマーに加えて、本開示はまた、ポリペプチドヘテロダイマーを含む医薬組成物および単位用量剤形、ならびに、ポリペプチドヘテロダイマー、医薬組成物および単位用量剤形を使用するための方法を提供する。

この開示のポリペプチドヘテロダイマーの組成物は一般に、本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーを、薬学的に許容される賦形剤、例えば薬学的に許容される担体および希釈剤と組み合わせて含む。薬学的に許容される賦形剤は、使用される用量および濃度では、レシピエントにとって無毒である。これらは、製薬技術分野でよく知られており、例えば、Rowe et al., Handbook of Pharmaecutical Excipients: AComprehensiveGuide to Uses, Properties, and Safety, 5^th Ed., 2006において記載される。

治療用途のための薬学的に許容される担体はまた、製薬技術分野においてよく知られており、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro (Ed.) 1985)において記載される。例示的な薬学的に許容される担体としては、生理的ｐＨの滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。保存剤、安定剤、染料などが医薬組成物中で提供され得る。加えて、抗酸化剤および懸濁剤もまた、使用され得る。

医薬組成物はまた、希釈剤、例えば緩衝剤、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、デキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオンならびに他の安定剤および賦形剤を含み得る。中性緩衝生理食塩水または非特異的血清アルブミンと混合された生理食塩水は例示的な希釈剤である。例えば、生成物は、凍結乾燥物として、適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を希釈剤として使用して製剤化され得る。

本開示はまた、例えば、過剰受容体媒介シグナル伝達と関連する疾患または障害を処置するための方法であって、必要のある患者に有効量の、受容体、例えば受容体チロシンキナーゼ、例えばＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、およびＥｐｈＡ２に特異的に結合する結合ドメインを含むポリペプチドヘテロダイマーを投与することを含む方法を提供する。

過剰受容体媒介シグナル伝達と関連する例示的な疾患または障害としては、癌（例えば、固形悪性腫瘍および血液悪性腫瘍）、自己免疫もしくは炎症疾患または状態、細菌感染に起因する敗血症、およびウイルス感染が挙げられる。

１つの態様では、本開示は、Ｔ細胞活性化を誘導するための方法であって、必要のある患者に有効量の、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εまたはその組み合わせに特異的に結合する結合ドメイン、および異なる標的、例えば、腫瘍特異抗原またはＴ細胞活性化が要求される部位または細胞で最適な他の抗原に特異的に結合する第２の結合ドメインを含むポリペプチドヘテロダイマーを投与することを含む方法を提供する。

別の態様では、本開示は、悪性腫瘍（例えば、固形悪性腫瘍または血液悪性腫瘍）の増殖、転移または転移増殖を阻止するための方法であって、必要のある患者に、有効量の本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーまたはその組成物を投与することを含む方法を提供する。

様々な癌、例えば固形悪性腫瘍および血液悪性腫瘍が、本明細書で開示される組成物および方法に適している。処置され得る癌の型としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：乳房、前立腺、膵臓、結腸および直腸の腺癌；肺の全ての型の気管支癌（例えば、扁平上皮癌、腺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌）；ミエロイド；メラノーマ；肝細胞腫；神経芽細胞腫；パピローマ；アプドーマ；分離腫；鰓腫；悪性カルチノイド症候群；カルチノイド心疾患；および細胞腫（例えば、Ｗａｌｋｅｒ、基底細胞、基底扁平、Ｂｒｏｗｎ−Ｐｅａｒｃｅ、腺管癌、Ｅｈｒｌｉｃｈ腫瘍、Ｋｒｅｂｓ２、メルケル細胞、粘液性、非小細胞肺、燕麦細胞、乳頭、スキルス、細気管支、気管支原性、扁平細胞、および移行細胞）。処置され得る追加の型の癌としては下記が挙げられる：組織球性障害；白血病；悪性組織球症；ホジキン病；免疫増殖性小；非ホジキンリンパ腫；形質細胞腫；細網内皮症；メラノーマ；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；線維腫；線維肉腫；巨細胞腫瘍；組織球腫；脂肪腫；脂肪肉腫；中皮腫；粘液腫；粘液肉腫；骨腫；骨肉腫；脊索腫；頭蓋咽頭腫；未分化胚細胞腫；過誤腫；間葉腫；中腎腫；筋肉腫；エナメル上皮腫；セメント質腫；歯牙腫；奇形腫；胸腺腫；絨毛性腫瘍。さらに、下記の型の癌もまた処置に適しているものとして企図される：腺腫；胆管癌；真珠腫；円柱腫；嚢胞腺癌；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫；卵巣男性胚細胞腫；肝細胞腫；汗腺腫；島細胞腫瘍；Ｌｅｙｄｉｇ細胞腫瘍；パピローマ；セルトリ細胞腫；莢膜細胞腫；平滑筋腫；平滑筋肉腫；筋芽細胞腫；筋腫；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；上衣腫；神経節腫；グリオーマ；髄芽腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経腫；パラガングリオーマ；パラガングリオーマ非クロム親和性；および多形神経膠芽腫。処置され得る癌の型としてはまた、下記が挙げられるが、それらに限定されない：被角血管腫；好酸球性血管リンパ球増殖症；硬化性血管腫；血管腫症；グロムス血管腫；血管内皮腫；血管腫；血管外皮腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；葉状嚢肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑筋肉腫；白血肉腫；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症；および子宮頸部異形成。

本明細書で開示される組成物および方法に適している追加の例示的な癌は、Ｂ細胞癌、例えばＢ細胞リンパ腫［例えば、様々な型のホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または中枢神経系リンパ腫］、白血病［例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病および慢性筋芽細胞白血病］および骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）である。追加のＢ細胞癌としては、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾性辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外形質細胞腫、粘膜関連（ＭＡＬＴ）リンパ組織の節外周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大Ｂ細胞リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫／白血病、不確かな悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、および移植後リンパ増殖性障害が挙げられる。

ある実施形態では、固形悪性腫瘍の増殖または固形悪性腫瘍もしくは血液悪性腫瘍の転移もしくは転移増殖を阻止するのに有用なポリペプチドヘテロダイマーとしては腫瘍または癌抗原およびＴ細胞標的に特異的に結合するものが挙げられる。そのようなヘテロダイマーは典型的には、Ｔ細胞標的に対してよりも腫瘍または癌抗原に対し高い（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、７５または１００倍高い）結合親和性を有するように設計され、そのため、それらは、最初に腫瘍または癌抗原に優先的に結合し、その後、Ｔ細胞標的に結合し、ひいては、Ｔ細胞を動員および活性化し、腫瘍または癌抗原をその表面上に有する腫瘍または癌細胞を損傷または破壊する。例示的な腫瘍または癌抗原およびＴ細胞標的としては、ポリペプチドヘテロダイマーの結合ドメインを説明するセクションで、上記で提供されるものが挙げられる。例えば、Ｔ細胞標的はＣＤ３またはＰＳＭＡとすることができる。

ある実施形態では、悪性腫瘍の増殖、転移、または転移増殖を阻止するのに有用な、または指向性Ｔ細胞活性化による、ポリペプチドヘテロダイマーはオンコロジー標的（腫瘍または細胞抗原、例えばＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＥＡＣＡＭ−６、またはＰＳＭＡを含む）に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインおよびＴＣＲ複合体またはその構成要素（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε）に特異的に結合する別の結合ドメインを含む。

ある他の実施形態では、悪性腫瘍の増殖、転移、または転移増殖を阻止するのに有用なポリペプチドヘテロダイマーは、ＣＤ２８に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインおよびＣＤ７９ｂに特異的に結合する別の結合ドメインを含む。そのようなポリペプチドヘテロダイマーはさらに、ＰＤＬ２外部ドメインを含む結合ドメイン、ハイパーＩＬ−６に特異的に結合する結合ドメイン、または両方の結合ドメインをさらに含み得る。

ある他の実施形態では、悪性腫瘍の増殖、転移、または転移増殖を阻止するのに有用なポリペプチドヘテロダイマーは、ＲＯＮに特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインおよびｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する別の結合ドメインを含む。

ある他の実施形態では、悪性腫瘍の増殖、転移、または転移増殖を阻止するのに有用なポリペプチドヘテロダイマーは、下記受容体チロシンキナーゼの１つ以上に特異的に結合する結合ドメインを含む：ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４およびＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２。ある実施形態では、ヘテロダイマーはさらに、下記の抗血管新生作作用物質の１つ以上に特異的に結合する１つ以上の結合ドメインを含み得る：ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１〜４およびアンジオポエチン２。ある実施形態では、上記ヘテロダイマーはさらに、下記Ｆｃ受容体の１つ以上に特異的に結合する１つ以上の結合ドメインを含み得、細胞毒性エフェクター機能のターゲティングを増加させる：ＣＤ６４、ＣＤ３２ＡおよびＣＤ１６。ある実施形態では、上記ヘテロダイマーはさらに、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）に特異的に結合する結合ドメインを含み得、受容体の分解を可能にする。

ある他の実施形態では、悪性腫瘍の増殖、転移、または転移増殖を阻止するのに有用なポリペプチドヘテロダイマーは、下記ＴＮＦＳＦＲの２つ以上のアゴニストである結合ドメインを含む：ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＷＥＡＫＲ、およびＦＡＳ。

ある他の実施形態では、悪性腫瘍の増殖、転移、または転移増殖を阻止するのに有用なポリペプチドヘテロダイマーは、下記発癌促進性サイトカインまたは増殖因子の２つ以上に特異的に結合する結合ドメインを含む：ＨＧＦ、ＭＳＰ、ＥＧＦ（エピレギュリン、ヘレグリン、β−レグリン、ニューレグリンを含む）、ＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ハイパーＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｗｎｔ、ｓＨＨ、ＴＧＦβ、またはＰＤＧＦ。

ある実施形態では、固形悪性腫瘍の増殖または固形悪性腫瘍の転移もしくは転移増殖を阻止するのに有用なポリペプチドヘテロダイマーとしては、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＴＧＦＢＲ２、、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＯＳＭＲβ、Ｐａｔｃｈｅｄ−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、またはＲｏｂｏ１に特異的に結合するものが挙げられる。

血液悪性腫瘍の転移または転移増殖を阻止するのに有用なポリペプチドヘテロダイマーとしては、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＧＦＢＲ２、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＯＳＭＲβ、ＬＴβＲ、ＣＤ１９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、またはＣＤ８６に特異的に結合するものが挙げられる。

別の態様では、本開示は、自己免疫または炎症疾患、障害または状態を処置するための方法であって、必要のある患者に、有効量の、本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーまたはその組成物を投与することを含む方法を提供する。

融合タンパク質ならびにその組成物および単位用量剤形により処置され得る例示的な自己免疫または炎症疾患、障害または状態としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病）、皮膚筋炎、多発性筋炎、悪性貧血、原発性胆汁性肝硬変、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫肝炎、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群、Ｇｒａｖｅｓ病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、特発性血小板減少紫斑病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、神経精神ループス、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、喘息、乾癬性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞動脈炎」としても知られている）、自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、血管炎、セリアック病、慢性閉塞性肺疾患、子宮内膜症、汗腺膿瘍、間質性膀胱炎、モルフェア、強皮症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、白斑、および自己免疫性内耳疾患。

自己免疫または炎症疾患、障害または状態を処置するのに有用な例示的なポリペプチドヘテロダイマーは、ＣＤ２８に特異的に結合する１つ以上の結合ドメイン、および１、２または３つの下記の追加の結合ドメインを含み得る：ＰＤＬ２外部ドメインを含む結合ドメイン、モノＩＬ−１０を含む結合ドメイン、およびＣＤ８６に特異的に結合する結合ドメイン。例えば、ポリペプチドヘテロダイマーは、ＣＤ２８に特異的に結合する結合ドメインおよびＣＤ８６に特異的に結合する１〜３つの結合ドメインを含み得る。

自己免疫または炎症疾患、障害または状態を処置するのに有用な追加の例示的なポリペプチドヘテロダイマーは、ＣＤ２８に特異的に結合する１つ以上の結合ドメインおよびＩＬ−１０アゴニスト（例えば、モノＩＬ−１０）、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである１つ以上の結合ドメインを含み得る。また、ポリペプチドヘテロダイマーは、ＩＬ−１０アゴニスト（例えば、モノＩＬ−１０）、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストから選択される２つ以上の結合ドメインを含み得る。

自己免疫または炎症疾患、障害または状態を処置するのに有用な追加の例示的なポリペプチドヘテロダイマーは、ＣＤ３２Ｂに特異的に結合する１つ以上の結合ドメインおよび、ＩＬ−１０アゴニスト（例えば、モノＩＬ−１０）、ＨＬＡ−Ｇアゴニスト、ＨＧＦアゴニスト、ＩＬ−３５アゴニスト、ＰＤ−１アゴニスト、ＢＴＬＡアゴニスト、ＬＩＧＨＴアンタゴニスト、ＧＩＴＲＬアンタゴニストまたはＣＤ４０アンタゴニストである１つ以上の結合ドメインを含み得る。

自己免疫または炎症疾患、障害または状態を処置するのに有用な追加の例示的なポリペプチドヘテロダイマーは、下記ＴＮＦＳＦＲの１つ以上に特異的に結合する結合ドメインを含み得る：ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＨＶＥＷ、ＬＴβＲ、ＴＷＥＡＫＲ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡ、またはＦＡＳ。

自己免疫または炎症疾患、障害または状態を処置するのに有用な追加の例示的なポリペプチドヘテロダイマーは、下記炎症促進性サイトカイン／ケモカイン、例えばＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＳＬ、ＴＧＦβ、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２またはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬの２つ以上に特異的に結合する結合ドメインを含み得る。

自己免疫または炎症疾患、障害または状態を処置するのに有用なポリペプチドヘテロダイマーとしては、例えば、ＴＧＦＢＲ２、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＬＴβＲ、ＬＩＦＲβ、ＯＳＭＲβ、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、またはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合するものが挙げられる。

別の態様では、本開示は、Ｂ細胞関連障害または疾患を処置するための方法であって、必要のある患者（例えば、Ｂ細胞関連障害または疾患を有するまたは有する疑いがある患者）に、有効量の本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマー、例えばＢ細胞標的に特異的に結合するものを投与することを含む方法を提供する。

Ｂ細胞関連障害または疾患を処置するのに有用なポリペプチドヘテロダイマーは、１つ以上のＢ細胞標的、例えばＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、またはＣＤ７０に特異的に結合する結合ドメインを含み得る。ポリペプチドヘテロダイマーはさらに、Ｔ細胞標的、例えばＴＣＲ複合体またはその構成要素、例としてＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、またはＣＤ３εに特異的に結合する結合ドメインを含み得る。

Ｂ細胞関連障害または疾患を処置するのに有用なポリペプチドヘテロダイマーは、Ｂ細胞標的、例えばＣＤ７９ｂ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、およびＣＤ７０に特異的に結合する結合ドメインならびにＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、またはＣＤ１６に特異的に結合する結合ドメインを含むことができ、細胞毒性エフェクター機能のターゲティングが増加される。

本開示のポリペプチドヘテロダイマーまたはその組成物は、経口で、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入噴霧により、経膣的に、経直腸的に、もしくは頭蓋内注入により、またはそれらの任意の組み合わせにより投与され得る。１つの実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーまたはその組成物は非経口的に投与される。本明細書では、「非経口」という用語は、皮下注射、静脈内、筋内、大槽内注射、または注入技術を含む。静脈内、皮内、筋内、乳房内、腹腔内、くも膜下腔内、眼球後、肺内注射および／または特定の部位での外科的埋込による投与が同様に企図される。例えば、本発明は、ポリペプチドヘテロダイマーまたはその組成物を静脈内注射により投与することを含む。

薬学的に有効な用量は、疾患の型、使用される組成物、投与経路、処置される被験体の型、処置のための対象の特定の被験体の身体特性、併用投薬、および医学分野における当業者が認識する他の因子に依存する。例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１〜１ｍｇ／ｋｇ、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、約５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、約１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、または約５００〜１０００ｍｇ／ｋｇ）体重（単回投与、毎日、毎週、毎月、または任意の適切な間隔で投与することができる）の活性成分の量がこの開示のポリペプチドヘテロダイマーの効力に依って投与され得る。

ポリペプチドヘテロダイマーまたはその組成物の第２の薬剤との併用投与もまた、企図される。第２の薬剤は、当技術分野において、特定の疾患状態または障害、例えば、癌、炎症、自己免疫、および感染のための標準処置として許容されるものとすることができる。企図される例示的な第２の薬剤としては、主ポリペプチドヘテロダイマーが結合するものとは異なる標的に結合するポリペプチドヘテロダイマー、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、免疫グロブリン由来融合タンパク質、化学療法薬、電離放射線、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、抗感染治療薬、または他の活性および補助剤、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

ある実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーおよび第２の薬剤は、相乗的に作用する。言い換えれば、これらの２つの化合物は相互作用し、よって、化合物の併用効果は、単独で投与された場合の各化合物の個々の効果の和よりも大きくなる(例えば、Berenbaum, Pharmacol. Rev. 41:93, 1989を参照されたい)。

ある他の実施形態では、ポリペプチドヘテロダイマーおよび第２の薬剤は相加的に作用する。言い換えれば、これら２つの化合物は相互作用し、よって、化合物の併用効果は、単独で投与された場合の各化合物の個々の効果の和と同じである。

本明細書で提供されるポリペプチドヘテロダイマーまたはその組成物との併用で有用な第２の薬剤は、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン（シロリムス）、テムシロリムス、デフォロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、クルクミン、ファルネシルチオサリチル酸）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、代謝拮抗薬（例えば、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル）、ポリクローナル抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン）、モノクローナル抗体（例えば、ダクリズマブ、バシリキシマブ）、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、アバタセプトまたはベラタセプト）とすることができる。

固形悪性腫瘍の増殖を阻止する、固形悪性腫瘍の転移または転移増殖を阻止する、または血液悪性腫瘍を処置もしくは寛解させるのに有用な第２の薬剤としては、化学療法薬、電離放射線、および他の抗癌剤が挙げられる。さらなる治療薬として企図される化学療法薬の例としては、下記が挙げられる：アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシル）；二機能性化学療法薬（例えば、ベンダムスチン）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ））；エチレンイミンおよびメチル−メラミン（例えば、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレンチオホスホラミド（チオテパ）、およびヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン））；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）；およびトリアジン（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ））；代謝拮抗薬、例えば葉酸類似体（例えば、メトトレキサート、トリメトレキサート、およびペメトレキセド（多標的葉酸代謝拮抗薬））；ピリミジン類似体（例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、および２，２’−ジフルオロデオキシシチジン）；およびプリン類似体（例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ））；Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤、例えばカンプトテシン（ＣＰＴ）、トポテカン、およびイリノテカン；天然物、例えばエピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；およびビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）；抗腫瘍抗生物質、例えばアクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、およびブレオマイシン；放射線増感剤、例えば５−ブロモデオキシウリジン、５−ヨードデオキシウリジン、およびブロモデオキシシチジン；白金配位複合体、例えばシスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチン；置換尿素、例えばヒドロキシ尿素；ならびにメチルヒドラジン誘導体、例えばＮ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジン。

ある実施形態では、悪性腫瘍の増殖、転移、または転移増殖を阻止するのに有用な第２の薬剤としては、第１のポリペプチドヘテロダイマーが結合する標的以外の癌細胞標的に結合する本開示によるポリペプチドヘテロダイマーが挙げられる。ある他の実施形態では、そのような処置に有用な第２の薬剤としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および癌細胞標的に結合する免疫グロブリン由来融合タンパク質が挙げられる。例示的な癌細胞標的が、上記処置に有用なポリペプチドヘテロダイマーを記載する関連で上記で提供される。

自己免疫疾患の処置のためにこの開示により企図されるさらなる治療薬は、免疫抑制剤と呼ばれ、これは、処置される個体の免疫系を抑制または遮蔽するように作用する。免疫抑制剤としては、例えば、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、グルココルチコイド、関節炎を処置するための疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、または生物学的反応修飾因子が挙げられる。ＤＭＡＲＤ記述中の組成物はまた、関節リウマチだけでなく多くの他の自己免疫疾患の処置に有用である。

例示的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、Ｃｏｘ−２阻害剤、例えばＶｉｏｘｘおよびＣｅｌｅｂｒｅｘ、およびシアリレートからなる群より選択される。例示的な鎮痛薬は、アセトアミノフェン、オキシコドン、塩酸プロポキシフェンのトラマドールからなる群より選択される。例示的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンからなる群より選択される。例示的な生物学的応答修飾因子としては、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５、など）に対して誘導される分子、サイトカイン阻害剤、例えばＴＮＦアンタゴニスト（例えばエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）およびインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ））、ケモカイン阻害剤および接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的応答修飾因子としては、モノクローナル抗体ならびに分子の組換え型が挙げられる。例示的なＤＭＡＲＤとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金（経口（オーラノフィン）および筋内）ならびにミノサイクリンが挙げられる。

自己免疫または炎症疾患、障害または状態を処置するのに有用な追加の第２の薬剤は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、免疫グロブリン由来融合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ（商標）、ＰＩＭＳ、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）融合タンパク質）、またはそのような疾患、障害もしくは状態と関連する標的に特異的に結合する本開示によるポリペプチドヘテロダイマーとすることができる。そのような標的の例は、上記処置に有用な本開示のポリペプチドヘテロダイマーの標的の関連で上記で提供される。

結合分子組成物及び第２の活性剤は、同じ製剤中で同時に投与され得ることが企図される。また、第２の薬剤は、別々の製剤中であるが、同時的に(すなわち、互いに１時間以
内に)投与され得る。

ある実施形態では、第２の活性剤は、ポリペプチドヘテロダイマーまたはその組成物の投与前に投与され得る。前投与は、ポリペプチドヘテロダイマーまたはその組成物による処置前少なくとも１時間の第２の活性剤の投与を示す。活性剤は、結合分子組成物の投与後に投与され得ることがさらに企図される。後投与は、ポリペプチドヘテロダイマーまたはその組成物の投与後少なくとも１時間の投与を示すことを意味する。

この開示は、この開示の医薬組成物を含む用量単位を企図する。そのような用量単位としては、例えば、単回投与または複数回投与バイアルまたはシリンジ、例えば２区画バイアルまたはシリンジ（一方は凍結乾燥形態のこの開示の医薬組成物を含み、他方は再構成のための希釈剤を含む）が挙げられる。複数回投与用量単位はまた、例えば、静脈内注入装置への結合のためのバッグまたはチューブとすることができる。

この開示はまた単位用量、または複数回用量のこの開示の医薬組成物、容器、例えば、バイアル、および組成物を、障害、例えば上記障害を患う患者に投与するための１組の説明書を含むキットを企図する。
実施例
実施例１
２対のヘテロ二量化ドメインを有する二価ポリペプチドヘテロダイマー
１本鎖ポリペプチドＸ０１３０（２Ｅ１２ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ）およびＸ０１６８（ＣｋＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１Ｈ６８２Ｅ１２）を同時発現させることにより、ポリペプチドヘテロダイマーＸ０１７２を作製した。１本鎖ポリペプチドＸ０１３０は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：２Ｅ１２（抗ＣＤ２８）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、および変化ヒトＣｋ（最初のＡｒｇまたは最後のＣｙｓを有さない）。Ｘ１３０の核酸およびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１および２で示される。１本鎖ポリペプチドＸ０１６８は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：変化ヒトＣｋ（最初のＡｒｇまたは最後のＣｙｓを有さない）、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１、Ｈ６８リンカー、および２Ｅ１２（抗ＣＤ２８）ｓｃＦｖ。Ｘ０１６８の核酸およびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３および４で示される。Ｈ６８リンカーのアミノ酸配列は配列番号７８で示される。

比較のために、１本鎖ポリペプチドＸ０１１２（２Ｅ１２ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３）およびＸ０１１３（ＣｋＣＨ２ＣＨ３）を同時発現させることによりポリペプチドヘテロダイマーＸ０１２４を作製した。１本鎖ポリペプチドＸ０１１２は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：２Ｅ１２（抗ＣＤ２８）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ３。Ｘ０１１２の核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５および６で示される。１本鎖ポリペプチドＸ０１１３は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：変化ヒトＣｋ（最初のＡｒｇまたは最後のＣｙｓを有さない）、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ３。Ｘ０１１３の核酸およびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号７および８で示される。
発現
トランスフェクションの前日、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ）中０．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁させた。大量トランスフェクションのためには、２５０ｍｌの細胞を使用したが、少量トランスフェクションのためには、６０ｍｌの細胞を使用した。トランスフェクション日に、３２０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、８ｍｌの培地と混合した。同時に、２つの鎖のそれぞれに対する２５０μｇのＤＮＡもまた、８ｍｌの培地と混合し、５分間インキュベートした。１５分のインキュベーション後、ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ混合物を２５０ｍｌの２９３細胞に添加し、３７℃の振盪機に戻し、１２０ＲＰＭの速度で振盪させた。６０ｍｌの細胞を用いるより少量のトランスフェクションでは、４分の１のＤＮＡ、２９３ｆｅｃｔｉｎおよび培地を使用した。
精製
プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを使用して、タンパク質を精製した。２ｍＬの充填プロテインＡアガロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）をＢｉｏｒａｄカラム（Ｅｃｏｎｏ−カラムクロマトグラフィーカラム、サイズ２．５ｘ１０ｃｍ）に添加し、ＰＢＳ（１０ｘカラム体積）で十分に洗浄し、上清をロードし、ＰＢＳで再び洗浄し、３カラム体積のＰｉｅｒｃｅＩｇＧ溶出緩衝剤で溶出させた。タンパク質をその後、ＰＢＳに対し十分に透析させた。その後、タンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルタ装置を用いて濃縮し約０．５ｍＬの最終体積とした。

第２段階の精製のために、プロテインＬアフィニティクロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィーを使用した。プロテインＬ精製のために、プロテインＡ精製ポリペプチドヘテロダイマーを、ＰＢＳと予め平衡化されたプロテインＬアガロースカラム上を通過させ、ＰＢＳ（１０ｘカラム体積）で洗浄させ、その後、ＰｉｅｒｃｅＩｇＧ溶出緩衝剤で溶出した。タンパク質をその後ＰＢＳに対して十分に透析し、Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルタ装置を用いて濃縮し約０．５ｍＬの最終体積とした。

前に親和性精製された（プロテインＡまたはプロテインＬ）ポリペプチドヘテロダイマーコンストラクトの試料（２００〜３００μｇ）を２０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．０（緩衝剤Ａ）中に透析し、ＭｏｎｏＳ５／５０ＧＬカチオン交換カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に２ｍＬ／分の流速で、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒＦＰＬＣを用いてロードさせた。カラムを５カラム体積（ＣＶ）に対し平衡化させ、その後、勾配フォーマットで５０％：５０％緩衝剤Ａ：緩衝剤Ｂ（緩衝剤Ｂは２０ｍＭＭＥＳ、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ６．０である）の混合物になるまで２０ＣＶにわたり、実施した。次の１００％緩衝剤Ｂ混合物を５ＣＶに対し実施し、カラムを清浄にし、系をさらに５ＣＶに対し１００％緩衝剤Ａで実施し、次の注入前に再平衡化させた。ピークを集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびエレクトロスプレー質量分析により分析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
精製されたタンパク質を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＸ−ｃｅｌｌＳｕｒｅｌｏｃｋゲルボックスを用いて分析した。
最適以下濃度のＰＭＡとの相乗作用
社内ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリン処置された全血からリンパ球分離用培地（ＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｄｉａ）（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）上での遠心分離により単離し、２回、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で洗浄した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をその後、ＰＢＭＣから、ＭＡＣＳＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）によるネガティブ選択を用いて濃縮した。濃縮（＞９５％）ＣＤ４＋Ｔ細胞をその後、１ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で完全ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中に再懸濁させた。試験試薬を、完全ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中４０μｇ／ｍｌ（１０μｇ／ｍｌの最終濃度が得られる）で調製し、５０μｌ／ウェルで平底９６ウェルプレート（ＢＤＦａｌｃｏｎ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）に添加した。完全ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中のＰＭＡ（ホルボール１２ミリステート１３アセテート；Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を、５０μｌ／ウェル中４ｎｇ／ｍｌ（１ｎｇ／ｍｌの最終濃度）で添加した。その後、完全ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中のＴ細胞を、５０μｌ体積中５ｘ１０^４細胞／ウェルの濃度で添加し、最終的に適切な量の完全ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳを各ウェル（典型的には５０μｌ）に添加し、最終体積を２００μｌ／ウェルとした。細胞を試験試料＋／−ＰＭＡで処理し、７２時間３７℃で５％ＣＯ_２中インキュベートした。１：５０希釈の完全ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ（５０μｌ／ウェル）中の１μｌのトリチウム標識したチミジン（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃｔａｗａｙ、ＮＪ）をウェルに培養の最後の６時間の間添加した。プレートをＵｎｉｆｉｌｔｅｒ−９６、ＧＦ／Ｃマイクロプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）上にＰａｃｋａｒｄＦｉｌｔｅｒｍａｔｅＨａｒｖｅｓｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて収穫した。数はｃｐｍで表し、複製試料の平均である。

図２はポリペプチドヘテロダイマーＸ０１７２が、２Ｅ１２ＳＭＩＰＭ００３９（配列番号７７）に比べ異なる特性を有することを示す。これは、ＰＭＡならびにＳＭＩＰと協同しなかった。この二価ポリペプチドヘテロダイマーは、二価ＳＭＩＰよりもむしろ一価ポリペプチドヘテロダイマー、Ｘ０１２４に近い特性を有する。

図３は、二価ポリペプチドヘテロダイマーＸ０１７２が、２Ｅ１２ｓｃＦｖ（配列番号１０９）および一価ポリペプチドヘテロダイマーＸ０１２４よりもよく、ＣＤ４^＋細胞に結合したことを示す。
実施例２
単一ヘテロ二量化ドメイン対を用いる二価、三価、四価ポリペプチドヘテロダイマー
１本鎖ポリペプチドＸ０２４４（Ｃｋ（ＹＡＥ）ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）ＣＨ３Ｈ６８２Ｅ１２）およびＸ０２４５（２Ｅ１２ＣＨ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）ＣＨ３）を同時発現させることにより、二価ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２５１を作製した。１本鎖ポリペプチドＸ０２４４は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ヒトＣｋ（ＹＡＥ）（すなわち、最初のＡｒｇまたは最後のＣｙｓを有さないがＮ３０Ｙ、Ｖ５５Ａ、およびＴ７０Ｅ置換を有するヒトＣｋ）、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）（すなわち、Ｎ２９７Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１ＣＨ２）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、Ｈ６８リンカー、および２Ｅ１２（抗ＣＤ２８）ｓｃＦｖ。Ｘ０２４４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号９および１０で示される。１本鎖ポリペプチドＸ０２４５は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：２Ｅ１２（抗ＣＤ２８）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ３。Ｘ０２４５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１１および１２で示される。

１本鎖ポリペプチドＸ０２４６（Ｐ２Ｃ２Ｃｋ（ＹＡＥ）ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）ＣＨ３）およびＸ０２４７（２Ｅ１２ＣＨ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）ＣＨ３Ｈ６８
２Ｅ１２）を同時発現させることにより、三価、二特異性ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２５２を作製した。１本鎖ポリペプチドＸ０２４６は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｐ２Ｃ２（抗ＣＤ７９ｂ）ｓｃＦｖ、ヒトＣｋ（ＹＡＥ）、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ３。Ｘ０２４６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１３および１４で示される。１本鎖ポリペプチドＸ０２４７は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：２Ｅ１２（抗ＣＤ２８）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、Ｈ６８リンカー、および２Ｅ１２（抗ＣＤ２８）ｓｃＦｖ。Ｘ０２４７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１５および１６で示される。

１本鎖ポリペプチドＸ０２４８（Ｐ２Ｃ２ＣＫ（ＹＡＥ）ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）ＣＨ３Ｈ６８Ａ２）およびＸ０２４９（ＰＤＬ２ＥＣＤＣＨ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）ＣＨ３Ｈ６８２Ｅ１２）を同時発現させることにより、四価、三特異性ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２５３を作製した。１本鎖ポリペプチドＸ０２４８は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｐ２Ｃ２（抗ＣＤ７９ｂ）ｓｃＦｖ、ヒトＣｋ（ＹＡＥ）、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、Ｈ６８リンカー、およびＡ２（抗ハイパーＩＬ−６）ｓｃＦｖ。Ｘ０２４８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１７および１８で示される。１本鎖ポリペプチドＸ０２４９は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＰＤＬ２ＥＣＤ（すなわち、ＰＤＬ２外部ドメイン）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）、ヒトＩｇＧ１
ＣＨ３、Ｈ６８リンカー、および２Ｅ１２（抗ＣＤ２８）ｓｃＦｖ。Ｘ０２４９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１９および２０で示される。

１本鎖ポリペプチドＸ０２４９（ＰＤＬ２ＥＣＤＣＨ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）ＣＨ３Ｈ６８２Ｅ１２）およびＸ０２８１（モノＩＬ−１０Ｃｋ（ＹＡＥ）ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）ＣＨ３Ｈ６８３Ｄ１）を同時発現させることにより別の四価、四特異性ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２８３を作製した。１本鎖ポリペプチドＸ０２８１は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：モノＩＬ−１０、ヒトＣｋ（ＹＡＥ）、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、Ｈ６８リンカー、および３Ｄ１（抗ＣＤ８６）ｓｃＦｖ。Ｘ０２８１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号２１および２２で示される。

ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２８３のための対照として、１本鎖ポリペプチドＸ０２４９（ＰＤＬ２ＥＣＤＣＨ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）ＣＨ３Ｈ６８２Ｅ１２）およびＸ０２８２（モノＩＬ−１０ＣｋＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）ＣＨ３Ｈ６８３Ｄ１）を同時発現させることにより四価ヘテロダイマー、ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２８４を作製した。１本鎖ポリペプチドＸ０２８２は、ヒトＣｋ配列中にＮ３０ＹＶ５５ＡＴ７０Ｅ置換を含まないことを除き、Ｘ０２８１と同一である。よって、１本鎖ポリペプチドＸ０２８２は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：モノＩＬ−１０、変化ヒトＣｋ（最初のＡｒｇまたは最後のＣｙｓを有さない）、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、Ｈ６８リンカー、および３Ｄ１（抗ＣＤ８６）ｓｃＦｖ。Ｘ０２８２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２３および２４で示される。

ポリペプチドヘテロダイマー分子を実施例１に従い、発現させ、精製した。精製されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を還元および非還元条件下で用いて分析した。サイズ排除クロマトグラフィーをＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒＦＰＬＣ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）上で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬカラムを使用して実施した。いくつかのタンパク質をエレクトロスプレー質量分析によりＡｇｉｌｅｎｔ６１２０ＴＯＦＥＳ／ＭＳを用いて分析した。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００ＳＰＲ上で、ランニング緩衝剤としてＨＢＳ−Ｐ＋（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。標的を直接、ＣＭ５チップ上に、標準アミンカップリング化学（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＡｍｉｎｅＣｏｕｐｌｉｎｇＫｉｔ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して固定し、最終固定レベルを８００〜１９００Ｒｕ（共鳴単位）とした。ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２８３を２５℃または３７℃で１５０秒間、３０μｌ／分の流速で、１０ｎＭ〜１μＭの一連の濃度で注入した。解離を１２００秒間モニタし、５０ｍＭＮａＯＨを６０秒間注入することにより表面を再生させた。表面との結合相互作用は少なくとも６０再生サイクルを通して安定であった。データを、Ｔ１００ソフトウェア（バージョン２．０、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）のためのＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎを用いて分析した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびカチオン交換クロマトグラフィー分析は、ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２５１、Ｘ０２５２およびＸ０２５３が、適度によく発現され、精製されたことを示す（図４）。Ｘ０２５２の質量分析は、タンパク質はほとんど均質であり、検出できない量のホモダイマーを有することを示す（図５）。加えて、ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２８３およびＸ０２８４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびカチオン交換クロマトグラフィー分析は、ＣＨ１／Ｃｋ（ＹＡＥ）ヘテロ二量化ドメインを有するポリペプチドヘテロダイマーＸ０２８３は、ＣＨ１／Ｃｋヘテロ二量化ドメイン（同様にホモダイマーを形成した）を有する対照ポリペプチドヘテロダイマーＸ０２８４に比べ、効率的にヘテロダイマーを構築した（図６）。Ｂｉｏｃｏｒｅ分析はさらに、１本鎖ポリペプチドＸ０２８１のカルボキシル末端の３Ｄ１（抗ＣＤ８６）結合ドメインは、ＣＤ８６に一価的に結合したことを示す（図７）。
実施例３
抗ＲＯＮおよび抗ｃ−Ｍｅｔ結合ドメインを有するポリペプチドヘテロダイマー
抗ＲＯＮ結合ドメインを有する二価ポリペプチドヘテロダイマー（ＯＲＮ１５１）ならびに抗ＲＯＮおよび抗ｃＭｅｔ結合ドメインを含む２つの二特異性ポリペプチドヘテロダイマー（ＯＲＮ１５２およびＯＲＮ１５３）を作製した。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＯＲＮ１５１は１本鎖ポリペプチドＯＲＮ１４５（４Ｃ０４ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＯＲＮ１４８（１１Ｈ０９ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＯＲＮ１４５は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：４Ｃ０４（抗ＲＯＮ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＯＲＮ１４５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２６および３０で示される。１本鎖ポリペプチドＯＲＮ１４８はそのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：１１Ｈ０９（抗ＲＯＮ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＣＨ２、ヒトＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＯＲＮ１４８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２８および３２で示される。

二特異性（ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ）ポリペプチドヘテロダイマーＯＲＮ１５２は１本鎖ポリペプチドＯＲＮ１１６（ＭＥＴ０２１ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＯＲＮ１４６（４Ｃ０４ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＯＲＮ１１６は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＭＥＴ０２１（抗ｃ−Ｍｅｔ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＯＲＮ１１６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２５および２９で示される。１本鎖ポリペプチドＯＲＮ１４６は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：４Ｃ０４（抗ＲＯＮ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１
ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＣＨ２、ヒトＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＯＲＮ１４６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２７および３１で示される。

二特異性（ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ）ポリペプチドヘテロダイマーＯＲＮ１５３は、１本鎖ポリペプチドＯＲＮ１１６（ＭＥＴ０２１ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＯＲＮ１４８（１１Ｈ０９ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。

ポリペプチドヘテロダイマーＯＲＮ１５１、ＯＲＮ１５２およびＯＲＮ１５３を、実施例１に従い、発現させた。下記発現レベルが得られた：ＯＲＮ１５１では１．９μｇタンパク質／ｍＬの培養物、ＯＲＮ１５２では３．１μｇ／ｍＬ、およびＯＲＮ１５３では４．９μｇ／ｍＬ。
実施例４
抗ＣＤ３結合ドメインを有するポリペプチドヘテロダイマー
抗ＣＤ３結合ドメインを有するいくつかの二特異性ポリペプチドヘテロダイマーを作製した：ポリペプチドヘテロダイマーＳ０２６８、Ｓ０２６９、およびＴＳＣ０２０〜ＴＳＣ０３０。ポリペプチドヘテロダイマーＳ０２６８は、１本鎖ポリペプチドＯＲＮ１４５（４Ｃ０４ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０１９（Ｇ１９−４ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１９は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｇ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＣＨ２、ヒトＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ０１９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５２および７２で示される。

二特異性（ＣＤ３、ｃ−Ｍｅｔ）ポリペプチドヘテロダイマーＳ０２６９は、１本鎖ポリペプチドＯＲＮ１６０（５Ｄ５ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０１９（Ｇ１９−４ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＯＲＮ１６０は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：５Ｄ５（抗ｃ−Ｍｅｔ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＯＲＮ１６０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３３および５３で示される。

二価（ＣＤ１９）ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０２０は１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００１（ＨＤ３７ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０１９（Ｇ１９−４ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００１は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ００１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３４および５４で示される。

二特異性（ＣＤ２０、ＣＤ３）ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０２１は１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００２（２Ｈ７ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０１９（Ｇ１９−４ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００２はそのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：２Ｈ７（抗ＣＤ２０）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ００２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３５および５５で示される。

二特異性（ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３）ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０２２は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１７（Ｐ２Ｃ２Ｈ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０１９（Ｇ１９−４ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１７は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｐ２Ｃ２（抗ＣＤ７９ｂ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ０１７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５０および７０で示される。

二特異性（ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３）ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０２３は１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１８（Ｍ００４２ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０１９（Ｇ１９−４ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１８は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｍ００４２（抗ＨＬＡ−ＤＲ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ０１８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５１および７１で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０２４は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１０（ＨＤ３７−「ＩｇＡ１ヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ００３（Ｇ１９−４−「ＩｇＡ１ヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１０は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＡ１ヒンジ（ＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＣＰＰＣＰ、配列番号７５２）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ０１０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４３および６３で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００３は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｇ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＡ１ヒンジ（配列番号７５２）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ００３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３６および５６で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０２５は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１１（ＨＤ３７−「ＩｇＡ２ヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ００４（Ｇ１９−４−「ＩｇＡ２ヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１１は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＡ２ヒンジ（ＰＰＰＰＰＣＰＰＣＰ、配列番号７４８）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ０１１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４４および６４で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００４は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｇ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＡ２ヒンジ（配列番号７４８）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ００４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３７および５７で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０２６は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１２（ＨＤ３７−「ＩｇＧ１ヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ００７（Ｇ１９−４−「ＩｇＧ１ヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１２はそのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＧ１ヒンジ（ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＣＰＰＣＰ、配列番号７５０）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１
ＣＨ１。ＴＳＣ０１２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４５および６５で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００７は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｇ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＧ１ヒンジ（配列番号７５０）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ００７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４０および６０で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０２７は１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１３（ＨＤ３７−「ＩｇＧ３ヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ００５（Ｇ１９−４−「ＩｇＧ３ヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１３は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＧ３ヒンジ（ＥＰＫＳＳＤＴＰＰＰＳＰＲＳＰＣＰＰＣＰ、配列番号７５１）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１
ＣＨ１。ＴＳＣ０１３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４６および６６で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００５は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｇ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＧ３ヒンジ（配列番号７５１）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ００５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３８および５８で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０２８は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１４（ＨＤ３７−「ＩｇＤヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ００６（Ｇ１９−４−「ＩｇＤヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１４は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＤヒンジ（ＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＣＰＰＣＰ、配列番号７５４）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ０１４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４７および６７で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００６は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｇ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＤヒンジ（配列番号７５４）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ００６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３９および５９で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０２９は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１５（ＨＤ３７−「ＩｇＥＣＨ２ヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ００８（Ｇ１９−４−「ＩｇＥＣＨ２ヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１５は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＥＣＨ２ヒンジ（配列番号７５７）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ０１４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４８および６８で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００８は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｇ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＥＣＨ２ヒンジ（配列番号７５７）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ００８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４１および６１で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０３０は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１６（ＨＤ３７−「ＩｇＭＣＨ２ヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ００９（Ｇ１９−４−「ＩｇＭＣＨ２ヒンジ」−ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１６は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＭＣＨ２ヒンジ（配列番号７５９）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ０１５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４９および６９で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００９は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｇ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、変化ヒトＩｇＭＣＨ２ヒンジ（配列番号７５９）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ００９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４２および６２で示される。

二特異性ポリペプチドヘテロダイマーＳ０２６８（ＲＯＮ、ＣＤ３）およびＳ０２６９（ＣＤ３、ｃ−Ｍｅｔ）を、実施例１に従い発現させた。下記発現レベルが得られた：Ｓ０２６８では２．２μｇタンパク質／ｍＬの培養物、およびＳ０２６９では２．７μｇ／ｍＬ。
実施例５
二特異性ポリペプチドヘテロダイマーの細胞結合
腫瘍細胞抗原およびＴ細胞を標的とするのに二特異性ポリペプチドヘテロダイマー分子の有効性を比較するために、抗ＲＯＮ（４Ｃ０４結合ドメイン）ｘ抗ＣＤ３（Ｇ１９−４結合ドメイン）ポリペプチドヘテロダイマー、Ｓ０２６８（実施例４で記載）、および同じ結合ドメインを含む異なる二特異性足場（ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）タンパク質）、Ｓ０２６６の細胞上結合特性を比較した。さらに、異なるＢ細胞抗原（ＴＳＣ０２０ではＣＤ１９およびＴＳＣ０２１ではＣＤ２０）ならびにＴ細胞抗原（ＣＤ３）を標的とする２つの二特異性ポリペプチドヘテロダイマー、ＴＳＣ０２０およびＴＳＣ０２１（実施例４で記載）の細胞上結合特性を比較した。ＳＣＯＲＰＩＯＮタンパク質Ｓ０２６６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号７３および７４で示される。二特異性ポリペプチドヘテロダイマーＳ０２６８、ＴＳＣ０２０、およびＴＳＣ０２１を構成する１本鎖ポリペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２６および５２（ヌクレオチド）、３０および７２（アミノ酸）；３４および５２（ヌクレオチド）、５４および７２（アミノ酸）；ならびに３５および５２（ヌクレオチド）、５５および７２（アミノ酸）で示される（実施例４も参照されたい）。ヒト２９３細胞における一過性トランスフェクションによりＳ０２６６では６．９μｇタンパク質／ｍＬの培養物；Ｓ０２６８では２．３μｇ／ｍＬの培養物；ＴＳＣ０２０では３．０μｇ／ｍＬの培養物；およびＴＳＣ０２１では３．２μｇ／ｍＬの培養物が生成された。

ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＲＯＮ＋）乳癌細胞、Ｒｅｃ１（ＣＤ１９^＋、ＣＤ２０^＋）マントル細胞リンパ腫細胞、およびＪｕｒｋａｔ（ＣＤ３^＋）Ｔ細胞白血病細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、提供されたプロトコルに従い培養した。Ｔ細胞を、ドナーＰＢＭＣから、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ（ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）社製のＰａｎＴ細胞単離キットＩＩを用いて単離した。非Ｔ細胞をＰＢＭＣから、ビオチン結合モノクローナル抗体および抗ビオチン磁性ミクロビーズで間接的に磁気標識させることにより分離した。これらの細胞をその後、磁場で囲まれたカラム内で保持することにより激減させた。Ｔ細胞はカラム内に保持されず、フロースルー中で回収された。

５×１０^５Ｔ細胞または標的（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、Ｒｅｃ１、Ｊｕｒｋａｔ）細胞を３０分間４℃で、１００ｎＭ〜０．１ｎＭの濃度で、連続希釈させた二特異性分子Ｓ０２６６（αＲＯＮ×αＣＤ３ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）タンパク質）またはＳ０２６８（αＲＯＮ×αＣＤ３ポリペプチドヘテロダイマー）（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３および単離されたＴ細胞に対し）；またはＲｅｃ１およびＪｕｒｋａＴ細胞に対しＴＳＣ０２０（αＣＤ１９ｘαＣＤ３）もしくはＴＳＣ０２１（αＣＤ２０ｘαＣＤ３）と共にインキュベートすることにより、結合を評価した。細胞を３度洗浄し、その後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：２００希釈）と共にさらに３０分間４℃でインキュベートした。細胞をその後再び３度洗浄し、１％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ機器で読み取った。

ＦｌｏｗＪｏｖ７．５（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ｉｎｃ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）におけるＦＳＣ高、ＳＳＣ高サブセットの分析は二特異性分子Ｓ０２６６およびＳ０２６８のＭＤＡ−ＭＢ−４５３および単離されたＴ細胞の両方に対する用量依存的結合を示した（図８Ａおよび８Ｂ）。予想外に、Ｓ０２６８ポリペプチドヘテロダイマーは、比較ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）分子（Ｓ０２６６）と同様の親和性でＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞およびＴ細胞の両方上で結合したが、いずれの結合活性に対する可能性も欠如した。両方の標的細胞型でのより高い飽和がポリペプチドヘテロダイマーで観察され、これは、ポリペプチドヘテロダイマーが等価のＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）（二価ＳＣＯＲＰＩＯＮ対表面抗原の潜在的１：２結合）よりも高い化学両論（ポリペプチドヘテロダイマー対表面抗原の１：１結合）で結合している場合であろう。Ｒｅｃ１およびＪｕｒｋａＴ細胞上でのＣＤ１９−ターゲティング二特異性ヘテロダイマー（ＴＳＣ０２０；ＨＤ３７およびＧ１９−４結合ドメイン）およびＣＤ２０−ターゲティング二特異性ヘテロダイマー（ＴＳＣ０２１；２Ｈ７およびＧ１９−４結合ドメイン）の比較により、ＴＳＣ０２０ヘテロダイマーが、Ｒｅｃ１細胞に対し、ＴＳＣ０２１ヘテロダイマーよりも高い親和性を有することが明らかになった（図９Ａ）。しかしながら、ＴＳＣ０２０およびＴＳＣ０２１ヘテロダイマーはどちらも、ＣＤ３^＋ＪｕｒｋａＴ細胞に対し同様の結合を示し、これは、どちらのヘテロダイマーも同じ抗ＣＤ３結合ドメイン（Ｇ１９−４）を有するので予測される（図９Ｂ）。
実施例６
単一のヘテロ二量化ドメイン対を用いた追加の二価＆三価ポリペプチドヘテロダイマー
追加の多特異的ヘテロダイマーを作製した：ＴＳＣ０４６、ＴＳＣ０４７、ＴＳＣ０４８、ＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０５５、ＴＳＣ０５６、ＴＳＣ０５７、ＴＳＣ０７８、ＴＳＣ０７９、ＴＳＣ０８０、ＴＳＣ０９９、ＴＳＣ１００、ＴＳＣ１０１、およびＴＳＣ１０２。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０４６は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００１（ＨＤ３７ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０３９（ＢＭＡ０３１ＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００１は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ００１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３４および５４で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０３９は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＢＭＡ０３１（抗ＴＣＲ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ０３９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号７９３および８１１で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０４７は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００１（ＨＤ３７ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０４１（ＣＲＩＳ７ＣＨ２ＣＨ３
Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４１は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＣＲＩＳ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ０４１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号７９４および８１２で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０４８は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００１（ＨＤ３７ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０４３（ＯＫＴ３−ＭＣＨ２ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４３は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＯＫＴ３−Ｍ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ変異抗ＣＤ３、米国特許第７，６３５，４７２号も参照されたい）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ０４３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号７９５および８１３で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０５４は、一本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９（ＨＤ３７ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０５３（Ｇ１９−４ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）（すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１ＣＨ２）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ０４９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号７９６および８１４で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０５３は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｇ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）（すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１ＣＨ２）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ０５３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８００および８１８で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０５５は１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０５０（２Ｈ７ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０５３（Ｇ１９−４ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０５０は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：２Ｈ７（抗ＣＤ２０）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ０５０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号７９７および８１５で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０５６は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０５１（Ｐ２Ｃ２ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０５３（Ｇ１９−４ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０５１はそのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｐ２Ｃ２（抗ＣＤ７９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ０５１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号７９８および８１６で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０５７は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０５２（５Ｄ５ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０５３（Ｇ１９−４ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０５２は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：５Ｄ５（抗ｃＭｅｔ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ０５２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号７９９および８１７で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０７８は１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９（ＨＤ３７ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０７６（ＯＫＴ３ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０７６は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＯＫＴ３（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ０７６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８０２および８２０で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０７９は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９（ＨＤ３７ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０７７（ＮｕｖｉｏｎＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０７７は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｎｕｖｉｏｎ（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ０７７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８０３および８２１で示される。

三価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０８０は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ００１（ＨＤ３７ＣＨ２ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０６４（Ｇ１９−４ＣＨ２ＣＨ３
Ｃｋ（ＹＡＥ）Ｈ７５Ｍｅｔ０２１）を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０６４は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：Ｇ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、ヒトＣｋ（ＹＡＥ）、Ｈ７５リンカー、およびＭｅｔ０２１（抗ｃ−Ｍｅｔ）ｓｃＦｖ（Ｃ末端の３つのセリン残基欠失）。ＴＳＣ０６４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８０１および８１９で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ０９９は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９（ＨＤ３７ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０９７（４Ｃ０４ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０９７は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：４Ｃ０４（抗ＲＯＮ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ０９７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８０８および８２６で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ１００は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９（ＨＤ３７ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０９３（ＣＲＩＳ７ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０９３はそのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＣＲＩＳ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ０９３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８０４および８２２で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ１０１は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９（ＨＤ３７ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０９４（ＯＫＴ３−ＭＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０９４は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＯＫＴ３−Ｍ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ変異抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、ヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ０９４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８０５および８２３で示される。

二価ポリペプチドヘテロダイマーＴＳＣ１０２は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９（ＨＤ３７ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０９５（ＢＭＡ０３１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０９５は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＢＭＡ０３１（抗ＴＣＲ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、ヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ０９５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８０６および８２４で示される。

ポリペプチドヘテロダイマー分子を、実施例１に従い、発現させ、精製した。
実施例７
ポリペプチドヘテロダイマーによる標的依存性Ｔ細胞増殖
標的依存性Ｔ細胞活性化および増殖の誘導での異なる二特異性ポリペプチドヘテロダイマー分子の有効性を比較するために、共通の抗ＣＤ１９結合ドメイン（ＨＤ３７）および３つの異なる抗ＣＤ３結合ドメイン（ＴＳＣ０５４ではＧ１９−４、ＴＳＣ０７８ではＯＫＴ３、ＴＳＣ０７９ではＨｕＭ２９１）を有する３つの異なる二特異性分子（実施例６で記載されるＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０７８、およびＴＳＣ０７９）を比較した。陽性対照として、ｂｓｃ１９ｘ３として知られている二特異性Ｔ細胞結合分子（ＢｉＴＥ）を調製した（米国特許第７，６３５，４７２号を参照されたい）。ｂｓｃ１９ｘ３に対するヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８０９および８２７で示される。ヒト２９３細胞における一過性トランスフェクションにより、ＴＳＣ０５４では２．３３μｇ／ｍＬタンパク質、ＴＳＣ０７８では０．６７μｇ／ｍＬタンパク質、およびＴＳＣ０７９では３．５μｇ／ｍＬが生成した。

ＤａｕｄｉＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞（ＣＤ１９^＋）およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＣＤ１９⁻）乳癌細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、提供されたプロトコルに従い培養した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト血から標準フィコール勾配を用いて単離した。単離された細胞を、生理食塩水緩衝剤中で洗浄した。Ｔ細胞をさらに、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ（ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＰａｎＴ細胞単離キットＩＩを用い、製造者プロトコルを使用して単離した（詳しくは実施例５も参照されたい）。

増殖を、単離されたＰＢＭＣおよびＴ細胞集団をカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識することにより評価した。ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣまたはＴ細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート中にそれぞれ、１５０，０００または１００，０００細胞／ウェルで、様々な数の腫瘍細胞と共に蒔き、１０：１〜３：１のＴ細胞対腫瘍細胞比を達成した。８ｎＭ〜０．０８ｐＭの範囲の濃度の試験分子を細胞混合物に添加し、１０％ヒトまたはウシ血清、ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中、総計、２００μｌ／ウェルとした。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で、加湿インキュベーター中でインキュベートした。３日後、細胞をフローサイトメトリー分析のために、抗体で標識した。細胞をそれらの元のプレート中で標識し、洗浄し、移動中の細胞損失を最小に抑え、全てのラベリングは、０．２％ウシ血清アルブミンを有する生理食塩水緩衝剤中で実施した。最初に、細胞を１００μｇ／ｍｌヒトＩｇＧと共に、室温で１５分間プレインキュベートした。その後、細胞を下記染料標識抗体の混合物（総体積５０μｌ）と共に４０分間インキュベートした：ＣＤ５−ＰＥ、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ８−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７、ならびに７−アミノアクチノマイシンＤ（以後、７ＡＡＤ）。プレートを２度洗浄し、８０〜１２０μｌ体積中に再懸濁させ、ＢＤＬＳＲＩＩフローサイトメーター中に直ちに流し、各ウェルの内容物の８０％を獲得した。試料ファイルをＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析し、それらのＣＦＳＥプロファイルに従い、活性化された、生存ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞（それぞれ、７ＡＡＤ−、ＣＤ５＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋または７ＡＡＤ− ＣＤ５＋
ＣＤ２５＋ＣＤ８＋）に対して連続してゲーティングすることにより、少なくとも１回の細胞分裂を受けた細胞のパーセンテージおよび数を計算した。平均値および標準偏差をＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌソフトウェアを用いて計算した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ
ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍを用いてグラフをプロットした。

全ＰＢＭＣで処理されたＤａｕｄｉ細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞由来の生存ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団の分析（図１０Ａ〜１０Ｄ）は、標的ＣＤ１９抗原を表示するＤａｕｄｉ細胞の存在下では細胞の総数および％増殖細胞の両方が著しく増加したが（図１０Ａ、１０Ｂ）、ＣＤ１９抗原を欠如するＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の存在下では著しい増殖が欠如した（図１０Ｃ、１０Ｄ）ことを明らかにした。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞および全ＰＢＭＣを用いると、より低いレベルで、いくらかの増殖が観察されたが、ＰＢＭＣ中にＢ細胞（ＣＤ１９＋）が存在したからであり、比較すると、全体の増殖は著しく減少された。この選択性は、同様に単離されたＴ細胞を用いた場合に観察された。増殖は、ＰＢＭＣで処理されたＤａｕｄｉ細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の存在下、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞で高く（図１０Ａ〜１０Ｄ）、ＴＳＣ０７８（ＨＤ３７ｘＯＫＴ３）により誘導される増殖は、ＴＳＣ０５４（ＨＤ３７ｘＧ１９−４）またはＴＳＣ０７９（ＨＤ３７ｘＨｕＭ２９１）により誘導される応答よりも全ての濃度において一般に高かった（図１０Ａ〜１０Ｄ）。誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖はＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０７８、およびＴＳＣ０７９に対する全ての場合において、ＢｉＴＥｂｓｃ１９ｘ３よりも低かった（図１０Ａ）が、ＴＳＣ０７８およびＴＳＣ０７９は、ＢｉＴＥ分子よりも低い濃度（例えば、５ｐＭ）でのＣＤ８＋細胞の増殖の優れた誘導を示した（図１０Ｂ）。
実施例８
ポリペプチドヘテロダイマーによる再指向Ｔ細胞細胞毒性
標的依存性Ｔ細胞細胞毒性の誘導での異なる二特異性ポリペプチドヘテロダイマー分子の有効性を比較するために、４つの異なる二特異性分子をクロム（^５１Ｃｒ）放出アッセイにおいて比較した。共通の抗ＣＤ１９結合ドメイン（ＨＤ３７）および３つの異なる抗ＣＤ３結合ドメイン（ＴＳＣ０５４ではＧ１９−４、ＴＳＣ０７８ではＯＫＴ３、ＴＳＣ０７９ではＨｕＭ２９１）を有する３つの異なる二特異性分子（ＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０７８、ＴＳＣ０７９、実施例６で記載）を、抗ＲＯＮ結合ドメイン（４Ｃ０４）および抗ＣＤ３結合ドメイン（Ｇ１９−４）を有する第４の二特異性分子（Ｓ０２６８、実施例４で記載）と共に試験した。ヒト２９３細胞における一過性トランスフェクションにより、ＴＳＣ０５４では約２．３３μｇ／ｍＬタンパク質、ＴＳＣ０７８では約０．６７μｇ／ｍＬタンパク質、ＴＳＣ０７９では約３．５μｇ／ｍＬタンパク質が生成した。

ＤａｕｄｉＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞（ＣＤ１９＋、ＲＯＮ−）およびＢｘＰＣ−３細胞（ＣＤ１９−、ＲＯＮ＋）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、提供されたプロトコルに従い培養した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト血から標準フィコール勾配を用いて単離した。単離された細胞を、生理食塩水緩衝剤中で洗浄した。Ｔ細胞をさらに、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ（ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＰａｎＴ細胞単離キットＩＩを用い、製造者プロトコルを使用して単離した（詳しくは実施例５も参照されたい）。

細胞毒性を^５１Ｃｒ放出アッセイにより評価した。約５×１０^６のＤａｕｄｉまたはＢｘＰＣ−３細胞を０．３ｍＣｉの^５１Ｃｒで処理し、７５分間３７℃でインキュベートした。７５分後、細胞を３度培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）で洗浄し、１１．５ｍＬの培地に再懸濁させた。この懸濁液から、１ウェルあたり５０μＬを、９６ウェルＵ底プレートに（約２０，０００細胞／ウェル）分注させた。１０ｎＭ〜０．１ｐＭの範囲の濃度の二特異性分子を標的（Ｄａｕｄｉ、ＢｘＰＣ−３）細胞に添加し、総体積を１００μＬ／ウェルとした。標的細胞を室温で１５分間インキュベートした。その後、１００μＬの単離されたＴ細胞（約２００，０００）を添加し、Ｔ細胞対標的細胞比を１０：１とした。５０μＬの０．８％ＮＰ−４０を標的細胞を含む対照ウェルに添加し、１５分間放置し、その後、１００μＬの培地を添加し、総溶解対照を提供した。

プレートを４時間インキュベートさせ、１５００ｒｐｍで３分間回転させ、２５μＬの上清を各ウェルから９６ウェルＬｕｍａ試料プレートの対応するウェルに移した。試料プレートを化学安全フード内で１８時間空気乾燥させ、その後、放射活性を、Ｔｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンター上で標準プロトコルを用いて読み取った。

細胞毒性データの分析は、抗ＲＯＮ指向二特異性分子Ｓ０２６８（図１１Ａ）由来のＤａｕｄｉ（ＲＯＮ−）細胞上のオフターゲット細胞毒性の欠如を示した。同様に、Ｔ細胞なしでＤａｕｄｉ細胞をＴＳＣ０５４で処理することから観察される直接細胞毒性はなかった（図１１Ａ）。しかしながら、強いＴ細胞指向細胞毒性がＴ細胞および抗ＣＤ１９指向二特異性分子（ＴＳＣ０５４）の存在下、Ｄａｕｄｉ細胞で観察され、１０〜１００ｐＭの間の濃度で最大溶解に到達した（図１１Ａ）。同様に、第２のＴ細胞ドナー（図１１Ｂ）を使用すると、ＢｘＰＣ−３（ＣＤ１９−）細胞のオフターゲット細胞毒性は、ＣＤ１９指向二特異性ＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０７８、もしくはＴＳＣ０７９、またはＣＤ１９指向ＢｉＴＥｂｓｃ１９ｘ３からは観察されなかった。ＢｘＰＣ−３（ＲＯＮ＋）細胞中での、抗ＲＯＮ指向Ｓ０２６８二特異性分子誘導細胞毒性は、１０と１００ｐＭの間で最大に到達した（図１１Ｂ）。
実施例９
変化ヒンジ配列を有するポリペプチドヘテロダイマーによる標的依存性Ｔ細胞増殖の調節
標的依存性Ｔ細胞活性化および増殖の誘導での変化ヒンジ配列を有する異なる二特異性ポリペプチドヘテロダイマー分子の有効性を比較するために、６つの異なる二特異性ヘテロダイマー（共通の抗ＣＤ１９結合ドメイン（ＨＤ３７）、共通の抗ＣＤ３結合ドメイン（Ｃｒｉｓ７）および５つの異なるヒンジコンストラクト（ＴＳＣ１００およびＴＳＣ１２７ではＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ＴＳＣ１６５ではヒトＩｇＧ１コアヒンジに結合された最初のＶａｌ残基がないＩｇＡ２ヒンジ、ＴＳＣ１６６ではヒトＩｇＧ１コアヒンジに結合されたＩｇＧ１ＳＳＳ−Ｐヒンジ、ＴＳＣ１６７ではＩｇＧ１コアヒンジに結合された変異ＩｇＧ３ヒンジの一部、ＴＳＣ１６８ではＩｇＧ１コアヒンジに結合された最初のＶａｌがないＩｇＭＣＨ２ドメイン）を有するＴＳＣ１００、ＴＳＣ１２７、ＴＳＣ１６５、ＴＳＣ１６６、ＴＳＣ１６７およびＴＳＣ１６８）を比較した。

より詳細には、二特異性ヘテロダイマーＴＳＣ１００は実施例６において記載される通りである。

二特異性ヘテロダイマーＴＳＣ１２７は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１２５（Ｃｒｉｓ７ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ０９６（ＨＤ３７
ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ）を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１２５は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ヒト化Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ１２５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８６５および８７４で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ０９６は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ０９６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８０７および８２５で示される。

二特異性ヘテロダイマーＴＳＣ１６５は１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１５７（Ｃｒｉｓ７
ＩｇＡ２ＵＨＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ１６１（ＨＤ３７ＩｇＡ２ＵＨＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１５７は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ヒト化Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１コアヒンジと結合された最初のＶａｌがないヒトＩｇＡ２ヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ１５７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８６６および８７５で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１６１は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１コアヒンジと結合された最初のＶａｌがないヒトＩｇＡ２ヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ１６１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８７０および８７９で示される。ＴＳＣ１５７およびＴＳＣ１６１で使用されるヒンジのアミノ酸配列は、配列番号７４８で示される。

二特異性ヘテロダイマーＴＳＣ１６６は１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１５８（Ｃｒｉｓ７
ＩｇＧ１ｍｉｎｉＵＨＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ１６２（ＨＤ３７ＩｇＧ１ｍｉｎｉＵＨＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１５８は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ヒト化Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１コアヒンジと結合されたヒトＩｇＧ１ＳＳＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ１５８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８６７および８７６で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１６２は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１コアヒンジ結合されたヒトＩｇＧ１ＳＳＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ１６２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８７１および８８０で示される。ＴＳＣ１５８およびＴＳＣ１６２で使用されるヒンジのアミノ酸配列は、配列番号７５０で示される。

二特異性ヘテロダイマーＴＳＣ１６７は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１５９（Ｃｒｉｓ７ＩｇＧ３ＵＨＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ１６３（ＨＤ３７ＩｇＧ３ＵＨＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１５９は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ヒト化Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１コアヒンジと結合された変異ヒトＩｇＧ３ヒンジの一部、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ１５９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８６８および８７７で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１６３は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１コアヒンジと結合された変異ヒトＩｇＧ３ヒンジの一部、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ１６３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８７２および８８１で示される。ＴＳＣ１５９およびＴＳＣ１６３で使用されるヒンジのアミノ酸配列は、配列番号７５１で示される。

二特異性ヘテロダイマーＴＳＣ１６８は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１６０（Ｃｒｉｓ７ＩｇＭＣＨ２ＵＨＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３ＣＨ１）およびＴＳＣ１６４（ＨＤ３７ＩｇＭＣＨ２ＵＨＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）ＣＨ３Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１６０はそのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ヒト化Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１コアヒンジと結合された最初のＶａｌがないヒトＩｇＭＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ＴＳＣ１６０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８６９および８７８で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１６３は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１コアヒンジと結合された最初のＶａｌがないヒトＩｇＭＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ＴＳＣ１６４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８７３および８８２で示される。ＴＳＣ１６０およびＴＳＣ１６４で使用されるヒンジのアミノ酸配列は、配列番号７５９で示される。

陽性対照として、ｂｓｃ１９ｘ３として知られている二特異性Ｔ細胞結合分子（ＢｉＴＥ）もまた調製した（米国特許第７，６３５，４７２号を参照されたい）。ｂｓｃ１９ｘ３に対するヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８０９および８２７で示される。

ヒト２９３細胞における一過性トランスフェクションにより、ＴＳＣ１００では３．２μｇタンパク質／ｍＬの培養物、ＴＳＣ１２７では６．１μｇタンパク質／ｍＬの培養物、ＴＳＣ１６５では４．８μｇタンパク質／ｍＬの培養物、ＴＳＣ１６６では６．２μｇタンパク質／ｍＬの培養物、ＴＳＣ１６７では６．４μｇタンパク質／ｍＬの培養物、およびＴＳＣ１６８では６．４μｇ／ｍＬタンパク質が生成された。

ＤａｕｄｉＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞（ＣＤ１９^＋）およびＣ４−２（ＣＤ１９⁻）前立腺細胞腫細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）およびＭＤＡｎｄｅｒｓｏｎ癌センター（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）から入手し、提供されたプロトコルに従い培養した。Ｔ細胞を、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ（ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＰａｎＴ細胞単離キットＩＩを用い、製造者プロトコルを使用して単離した（詳しくは実施例５も参照されたい）。

増殖を、単離されたＴ細胞集団をカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識することにより評価した。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート中に、１００，０００細胞／ウェル、１０，０００腫瘍細胞／ウェルで蒔き、１０：１のＴ細胞対腫瘍細胞比を達成した。５ｎＭ〜０．００５ｐＭの範囲の試験分子濃度を細胞混合物に添加し、１０％ヒトまたはウシ血清、ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中、総計、２００μｌ／ウェルとした。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で、加湿インキュベーター中でインキュベートした。３日後、細胞をフローサイトメトリー分析のために、抗体で標識した。細胞をそれらの元のプレート中で標識し、洗浄し、移動中の細胞損失を最小に抑え、全てのラベリングは、０．２％ウシ血清アルブミンを有する生理食塩水緩衝剤中で実施した。最初に、細胞を１００μｇ／ｍｌヒトＩｇＧと共に、室温で１５分間プレインキュベートした。その後、細胞を下記染料標識抗体の混合物（総体積５０μｌ）と共に４０分間インキュベートした：ＣＤ５−ＰＥ、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ８−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７、ならびに７−アミノアクチノマイシンＤ（以後、７ＡＡＤ）。プレートを２度洗浄し、８０〜１２０μｌ体積中に再懸濁させ、ＢＤＬＳＲＩＩフローサイトメーター中に直ちに流し、各ウェルの内容物の８０％を獲得した。試料ファイルをＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析し、それらのＣＦＳＥプロファイルに従い、活性化された、生存ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞（それぞれ、７ＡＡＤ−、ＣＤ５＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋または７ＡＡＤ− ＣＤ５＋ＣＤ２５＋ＣＤ８＋）に対して連続してゲーティングすることにより、少なくとも１回の細胞分裂を受けた細胞のパーセンテージおよび数を計算した。平均値および標準偏差をＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌソフトウェアを用いて計算した。ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓを用いてグラフをプロットした。

単離されたＴ細胞で処理されたＤａｕｄｉ細胞またはＣ４−２細胞由来の生存ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団の分析は、標的ＣＤ１９抗原を表示するＤａｕｄｉ細胞の存在下では、細胞の総数および％増殖細胞の両方が著しく増加したが、ＣＤ１９抗原を欠如するＣ４−２細胞の存在下では著しい増殖が欠如したことを明らかにした（図１２）。ＣＤ８＋細胞の増殖は、デフォルトＩｇＧ１ヒンジ（ＴＳＣ１００）を有する二特異性分子ならびにより長いヒンジを有するもの（ＴＳＣ１６６、ＴＳＣ１６７、ＴＳＣ１６８）で非常に類似した。より短いＩｇＡ２上部ヒンジ（ＴＳＣ１６５）を有する二特異性では、低い濃度でわずかに高いＣＤ８＋増殖が観察された。同様に、しかしより顕著な違いがＣＤ４＋細胞の増殖で観察され、この場合、より短いＩｇＡ２ヒンジを含む分子（ＴＳＣ１６５）は標準ＩｇＧ１ヒンジ（ＴＳＣ１００）よりもほとんどの濃度でより高い増殖を示し、より長いヒンジを有する分子（ＴＳＣ１６６、ＴＳＣ１６７、ＴＳＣ１６８）はより低い増殖を示した。

ＩｇＡ２ヒンジの活性差を確認するために、第２の増殖実験を、より低いタンパク質濃度までの滴定を用いて実施し（図１３）、ＩｇＡ２ヒンジを特徴とする二特異性（ＴＳＣ１６５）を２つの異なる生成ロットの、デフォルトＩｇＧ１ヒンジ（ＴＳＣ１２７）を特徴とする二特異性およびｂｓｃ１９ｘ３ＢｉＴＥ分子と比較した。前の実験と同様に、ＣＤ８＋細胞の増殖についてより小さな変動が観察され、ＴＳＣ１６５は、ｂｓｃ１９ｘ３に匹敵する、またはそれ以上の増殖誘導を示し、これは、ＴＳＣ１２７よりわずかに高い、または匹敵する増殖を示した。また、前の実験と同様に、これらの傾向は、ＣＤ４＋細胞増殖では拡大された様式で反復され、ＴＳＣ１６５およびｂｓｃ１９ｘ３は匹敵する増殖を示し、これは、ＴＳＣ１２７よりも著しく大きかった。
実施例１０
変化ヒンジ配列を有するポリペプチドヘテロダイマーによる再指向されたＴ細胞細胞毒性の調節
標的依存性Ｔ細胞細胞毒性の誘導に関する二特異性ポリペプチドヘテロダイマー分子におけるヒンジ組成を変化させる有効性を比較するために、５つの異なる二特異性分子をクロム（^５１Ｃｒ）放出アッセイにおいて比較した。共通の抗ＣＤ１９結合ドメイン（ＨＤ３７）、共通の抗ＣＤ３結合ドメイン（Ｃｒｉｓ７）および５つの異なるヒンジコンストラクト（ＴＳＣ１００およびＴＳＣ１２７ではＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ＴＳＣ１６５ではヒトＩｇＧ１コアヒンジに結合された最初のＶａｌがないＩｇＡ２ヒンジ、ＴＳＣ１６６ではヒトＩｇＧ１コアヒンジに結合されたＩｇＧ１ＳＳＳ−Ｐヒンジ、ＴＳＣ１６７ではヒトＩｇＧ１コアヒンジに結合された変異ＩｇＧ３ヒンジの一部、ＴＳＣ１６８ではＩｇＧ１コアヒンジに結合された最初のＶａｌがないＩｇＭＣＨ２ドメイン）を有する５つの異なる二特異性分子（ＴＳＣ１００、ＴＳＣ１６５、ＴＳＣ１６６、ＴＳＣ１６７およびＴＳＣ１６８、実施例９に記載）を比較した。

ＤａｕｄｉＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞（ＣＤ１９＋、ＲＯＮ−）を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、提供されたプロトコルに従い培養した。Ｔ細胞を、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ（ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＰａｎＴ細胞単離キットＩＩを用い、製造者プロトコルを使用して単離した（詳しくは実施例５も参照されたい）。

細胞毒性を^５１Ｃｒ放出アッセイにより評価した。約５×１０^６のＤａｕｄｉ細胞を０．３ｍＣｉの^５１Ｃｒで処理し、７５分間３７℃でインキュベートした。７５分後、細胞を３度培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）で洗浄し、１１．５ｍＬの培地に再懸濁させた。この懸濁液から、１ウェルあたり５０μＬを、９６ウェルＵ底プレートに（約２０，０００細胞／ウェル）分注させた。１０ｎＭ〜０．１ｐＭの範囲の濃度の二特異性分子を標的（Ｄａｕｄｉ）細胞に添加し、総体積を１００μＬ／ウェルとした。標的細胞を室温で１５分間インキュベートした。その後、１００μＬの単離されたＴ細胞（約２００，０００）を添加し、Ｔ細胞対標的細胞比を１０：１とした。５０μＬの０．８％ＮＰ−４０を標的細胞を含む対照ウェルに添加し、１５分間放置し、その後、１００μＬの培地を添加し、総溶解対照を提供した。

細胞毒性データの分析は、Ｔ細胞および抗ＣＤ１９再指向二特異性分子（ＴＳＣ１００−ＴＳＣ１６８）の存在下でＤａｕｄｉ細胞による強いＴ細胞指向細胞毒性を示し、５〜５０ｐＭの間の濃度で最大溶解を達成した（図１４）。実施例９で観察された傾向と同様に、より短いＩｇＡ２上部ヒンジ領域を有する二特異性分子（ＴＳＣ１６５）は、標準ＩｇＧ１上部ヒンジ領域を有する分子（ＴＳＣ１００）に匹敵する、またはそれ以上の細胞毒性を示し、より長い上部ヒンジ領域を有する分子（ＴＳＣ１６６、ＴＳＣ１６７、ＴＳＣ１６８）は、細胞毒性の誘導についてより強力ではなかった。
実施例１１
ＣＨ３−ＣＨ１およびＣＨ３−Ｃｋリンカー変化を有する二特異性ヘテロダイマー
下記ＣＨ３−ＣＨ１およびＣＨ３−Ｃｋリンカー変化を有する二特異性ヘテロダイマーを作製した：
二特異性ヘテロダイマーＴＳＣ１５１は１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１４５およびＴＳＣ１４８を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１４５は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ヒト化Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ヒトＣＨ３およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１は、配列ＧＧＧＳＳ（配列番号８４７）を有するリンカーにより結合される。ＴＳＣ１４５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８５３および８５９で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１４８は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１
ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ヒトＣＨ３およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）は、配列ＧＧＧＳＲ（配列番号８５０）（Ｒはまた、ヒトＣｋ（ＹＡＥ）の最初のアルギニンとして考えられ得る）を有するリンカーにより結合される。ＴＳＣ１４８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８５６および８６２で示される。

二特異性ヘテロダイマーＴＳＣ１５２は、１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１４６およびＴＳＣ１４９を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１４６は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ヒト化Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ヒトＣＨ３およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１は配列ＳＹＳＰＮＳ（配列番号８４８）を有するリンカーにより結合される。ＴＳＣ１４６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８５４および８６０で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１４９はそのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１
ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ヒトＣＨ３およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）は、配列ＳＹＳＰＮＳＲ（配列番号８５１）（Ｒはまた、ヒトＣｋ（ＹＡＥ）の最初のアルギニンとして考えられ得る）を有するリンカーにより結合される。ＴＳＣ１４９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８５７および８６３で示される。

二特異性ヘテロダイマーＴＳＣ１５３は１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１４７およびＴＳＣ１５０を含む。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１４７は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ヒト化Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１。ヒトＣＨ３およびヒトＩｇＧ１ＣＨ１は、配列ＳＳＬＮＴＰＮＳ（配列番号８４９）を有するリンカーにより結合される。ＴＳＣ１４７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８５５および８６１で示される。１本鎖ポリペプチドＴＳＣ１５０は、そのアミノからカルボキシル末端へ下記を含む：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ欠損）、ヒトＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）。ヒトＣＨ３およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）は、配列ＳＳＬＮＴＰＮＳＲ（配列番号８５２）（Ｒはまた、ヒトＣｋ（ＹＡＥ）の最初のアルギニンとして考えられ得る）を有するリンカーにより結合される。ＴＳＣ１５０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８５８および８６４で示される。

上記二特異性ヘテロダイマーを、実施例１に従い発現させた。下記発現レベルが得られた：ＴＳＣ１５１では９．２μｇタンパク質／ｍｌの培養物、ＴＳＣ１５２では１１．２μｇタンパク質／ｍｌの培養物、およびＴＳＣ１５３では１４．７μｇタンパク質／ｍｌの培養物。比較して、約６μｇタンパク質／ｍｌの培養物が、アミノ酸配列ＫＳＲ（配列番号８４６）を有するＣＨ３−ＣＨ１およびＣＨ３−Ｃｋリンカーを有するヘテロダイマーに対して得られた。

以上で記載した様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。この明細書で引用されおよび／または出願データシートで列挙された米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出版物は全て、本明細書に参照により、その全体が組み込まれる。実施形態の態様は、必要ならば様々な特許、出願および出版物の概念を採用してさらに別の実施形態を提供するように改変することができる。

上記詳細な説明を考慮すると、実施形態に対するこれらのおよび他の変更が可能である。一般に、下記特許請求の範囲では、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲で開示された特定の実施形態に制限するものと解釈すべきではなく、全ての可能な実施形態を、そのような特許請求の範囲が与えられる全ての範囲の等価物と共に含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により制限されない。

Claims

本明細書に記載の発明。