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JP2014221763A - ヘプシジン及びヘプシジン抗体 - Google Patents

ヘプシジン及びヘプシジン抗体 Download PDF

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Abstract

【課題】精製され、正しく折り畳まれたヘプシジン、ヘプシジンを結合するモノクローナル抗体の提供。
【解決手段】ヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、前記ヒトヘプシジンが特定のアミノ酸配列からなり、並びに特定の配列中に位置している残基７と２３、１０と１３、１１と１９及び１４から２２の間で形成された４つのジスルフィド結合ループを含む立体構造を有する、単離されたモノクローナル抗体。
【選択図】図１１

Description

関連出願に対する相互参照
本願は、２００７年２月２日に出願された米国仮出願６０／８８８，０５９号及び２００７年１２月１９日に出願された米国仮出願６１／０１５，１３８号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）の利益を主張する。
発明の分野
本発明は、ヘプシジン、ヘプシジンアンタゴニスト（ヘプシジンを結合する抗体を含む。）及びヘプシジン活性を調節するこれらの能力に関する。
鉄は、全ての生物の成長及び発達のために必要とされる必須微量元素である。哺乳動物中の鉄含量は、鉄吸収、鉄の再利用及び鉄がその中に貯蔵されている細胞からの鉄の放出を調節することによって制御される。鉄は、腸細胞によって、主に、十二指腸及び空腸上部中において吸収される。鉄が欠乏している個体中での鉄吸収を強化し、鉄の過剰負荷を有する個体中での鉄吸収を低下させるフィードバック機構が存在する（Ａｎｄｒｅｗｓ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１：７５（２０００）；Ｐｈｉｌｐｏｔｔ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３５：９９３（２００２）；Ｂｅｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ−Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２９：４９５（２００１））。鉄は、骨髄、肝臓クッパー細胞及び脾臓中の細網内皮マクロファージによって、分解された赤血球から再利用される。鉄の放出は、フェロポーティン（鉄を血漿中へ放出することができる主な細胞である腸細胞、マクロファージ及び肝細胞の細胞表面上に位置する主要な鉄排出タンパク質）によって調節される。ヘプシジンはフェロポーティンへ結合し、細胞表面からフェロポーティンを内部に取り込ませて、分解することによって、フェロポーティンの機能的活性を減少させる（Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６：２０９０−３，２００４；Ｄｅ ｄｏｍｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．，８：２５６９−２５７８，２００７）。
ヘプシジンは、鉄の恒常性を制御する中心的なシグナルである（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３５：９９３（２００２）；Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：４３９６（２００２））。ヒトヘプシジンの高いレベルは低下した鉄レベルをもたらし、逆も同様である。ヘプシジン活性の欠如をもたらすヘプシジン遺伝子中の変異は、重篤な鉄過剰負荷疾患である若年性ヘモクロマトーシスと関連する（Ｒｏｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３３：２１−２２，２００３）。マウスでの研究は、正常な鉄恒常性の調節におけるヘプシジンの役割を示した（Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３４：９７−１０１，２００３；Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：４５９６−４６０１，２００２；Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：８７８０−８７８５，２００１）。
さらに、炎症の間の鉄の封鎖にヘプシジンが関与することを示唆するデータが蓄積している（例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１００：３７７６−３６７８１，２００２；Ｋｅｍｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０６：１８６４−１８６６，２００５；Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１０：１０３７−１０４４，２００２；Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：１２７１−１２７６，２００４；Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：２４６１−２４６３，２００３及びＲｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５：１７９７−１８０２，２００５）。ヘプシジン遺伝子発現は、脊椎動物の自然免疫系の急性期応答を誘導する炎症性刺激（感染症など）後に、強固に上方制御されることが観察されている。マウスでは、ヘプシジン遺伝子発現は、リポ多糖（ＬＰＳ）、ターペンタイン、フロイントの完全アジュバント及びアデノウイルス感染によって上方制御されることが示された。ヘプシジン発現は、炎症性サイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）によって誘導される。細菌、真菌及びウイルス感染症などの慢性炎症性疾患を有する患者において、ヘプシジン発現と炎症の貧血の間にも強い相関が見出された。
ヒトヘプシジン（抗微生物活性及び鉄制御活性を有する２５アミノ酸のペプチド）は、新規抗微生物ペプチドを調査する２つのグループによって、独立に発見された（Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４８０：１４７（２０００）；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７８０６（２００１））。ヘプシジンは、ＬＥＡＰ−１（肝臓発現抗菌ペプチド；ｌｉｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）とも称される。その後、マウス中で８３アミノ酸プレプロペプチドをコードし、ラット及びヒト中で８４アミノ酸のプレプロペプチドをコードするヘプシジンｃＤＡＮが、鉄によって制御される肝臓特異的遺伝子の探索中に同定された（Ｐｉｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７８１１（２００１））。まず、２４残基のＮ末端シグナルペプチドは切断されて、プロヘプシジンを生成し、次いで、プロヘプシジンはさらなるプロセッシングを受けて、成熟ヘプシジンを生成する（血中及び尿中の両方に見出される。）。ヒトの尿中において、主要な形態は２５アミノ酸を含有するが、より短い２２アミノ酸ペプチド及び２２アミノ酸ペプチドも存在する。
成熟ペプチドは、４つのジスルフィド架橋として連結された８つのシステイン残基を含有する点が注目される。ヘプシジンの構造は、尿から精製された固有状態のヘプシジンと同一のＨＰＬＣ保持時間を有する化学的に合成されたヘプシジンを使用して、ＮＭＲにより、「Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３７５９７−３７６０３（２００２）」によって研究された。Ｈｕｎｔｅｒ他は、ヘプシジンは隣接するジスルフィド結合（Ｃ１−Ｃ８、Ｃ２−Ｃ７、Ｃ３−Ｃ６、Ｃ４−Ｃ５）を含有するヘアピンループ構造へ折り畳まれるという彼らの測定を報告した。より最近になって、同一のジスルフィド結合性の割り当てを推定するために、Ｈｕｎｔｅｒ他の構造情報及び推測的ＮＭＲデータを用いて、バスのヘプシジンの構造の決定も報告された（Ｌａｕｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：９２７２−９２８２（２００５）。しかしながら、本発明者らによって本明細書中に発見され、及び開示されているように、ヘプシジンの構造は、従来技術によって教示されたものと異なるジスルフィド結合の結合性を有することが決定された。
米国特許公開第２００３／０１８７２２８号、第２００４／００９６９８７号、第２００４／００９６９９０号、第２００５／０１４８０２５号、第２００６／００１９３３９号、第２００５／００３７９７１号及び第２００７／０２２４１８６号；米国特許第７，２３２，８９２号及び同第７，２９４，６９０号並びに国際公開ＷＯ０２／９８４４４号は、ヘプシジン抗体について考察しているが、本明細書中に開示されているヘプシジンの構造的な立体構造を開示又は示唆していない。
米国特許出願公開第２００３／０１８７２２８号明細書 米国特許出願公開第２００４／００９６９８７号明細書 米国特許出願公開第２００４／００９６９９０号明細書 米国特許出願公開第２００５／０１４８０２５号明細書 米国特許出願公開第２００６／００１９３３９号明細書 米国特許出願公開第２００５／００３７９７１号明細書 米国特許出願公開第２００７／０２２４１８６号明細書 米国特許第７，２３２，８９２号明細書 米国特許第７，２９４，６９０号明細書 国際公開第０２／９８４４４号パンフレット
Ａｎｄｒｅｗｓ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１：７５（２０００） Ｐｈｉｌｐｏｔｔ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３５：９９３（２００２） Ｂｅｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ−Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２９：４９５（２００１） Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６：２０９０−３，２００４ Ｄｅ ｄｏｍｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．，８、２００７年、ｐｐ．２５６９−２５７８ Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：４３９６（２００２） Ｒｏｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３３：２１−２２，２００３ Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３４：９７−１０１，２００３ Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：４５９６−４６０１，２００２ Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：８７８０−８７８５，２００１ Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１００：３７７６−３６７８１，２００２ Ｋｅｍｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０６：１８６４−１８６６，２００５ Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１０：１０３７−１０４４，２００２ Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：１２７１−１２７６，２００４ Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：２４６１−２４６３，２００３ Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５：１７９７−１８０２，２００５ Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４８０：１４７（２０００） Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７８０６（２００１） Ｐｉｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７８１１（２００１） Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３７５９７−３７６０３（２００２） Ｌａｕｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：９２７２−９２８２（２００５）
従って、本明細書は、ヘプシジンの構造の決定並びに鉄制御における及び感染に対する自然免疫応答におけるヘプシジンの中心的役割及びその中心的機能を説明する。さらに、本願は、とりわけ、生物活性ヘプシジン、生物活性ヘプシジンに対するモノクローナル抗体、これらを生産するための方法、生物活性ヘプシジンを測定するための方法、及びヘプシジン活性又はヘプシジンの発現を調節するための方法、及び鉄恒常性の障害を治療する方法並びにヘプシジンアンタゴニスト及びヘプシジンアゴニストを提供する。
本発明の様々な実施形態は、全般には、精製され、正しく折り畳まれたヒトヘプシジン、これに対するモノクローナル抗体、適切に折り畳まれたヒトヘプシジンのジスルフィド結合の１つ又はそれ以上を保持するヘプシジン変形物、このような物質を生産するための方法及びヘプシジンを検出するために又はヘプシジン活性を調節するために、このような物質を使用する方法に関する。
本願は、その中においてＣ１−Ｃ８、Ｃ２−Ｃ４、Ｃ３−Ｃ６及びＣ５−Ｃ７の間でジスルフィド結合が形成されており、コンパクトで緊密に折り畳まれた分子を予測する生物活性ヒトヘプシジンジスルフィド結合性の最初の報告であると考えられる。幾つかの実施形態において、本発明は、固有状態の物質と同一のジスルフィド結合性及び等しい生物活性を有する、組み換え的に発現され又は合成的に作製されたヘプシジンの大規模な生産を提供する。このような組換え又は合成物質は、さらなるヘプシジンを必要とする対象の治療並びに検出法及びキットにおける公知のヘプシジン標準の調製のために有用である。正しく折り畳まれたヒトヘプシジンの巨大バッチの作製は、ヘプシジンへ結合するモノクローナル抗体、特に、高い親和性及び又は特異性のモノクローナル抗体の作製及び検査も可能とする。このようなモノクローナル抗体は、例えば、ヘプシジン検出法並びに診断及び治療法において有用である。
一態様において、ヘプシジン活性アンタゴニストは、正しく折り畳まれた成熟生物活性ヒトヘプシジン（配列番号９）へ、所望の親和性で結合するモノクローナル抗体である。ヘプシジン（配列番号９）を結合し、ヘプシジンの鉄制御活性を阻害するモノクローナル抗体も提供される。一実施形態において、約１０−８Ｍ又はそれ以下のＥＣ５０で、モノクローナル抗体は細胞内鉄濃度を減少させ、及び／又は循環鉄濃度を増加させる。他の実施形態において、モノクローナル抗体は、赤血球数（数）若しくはヘモグロビン若しくはヘマトクリットレベルを増加させ、及び／又は網状赤血球数、網状赤血球平均細胞容積及び／又は網状赤血球ヘモグロビン含量を正常化させるという特性を哺乳動物中において示す。
様々な実施形態において、モノクローナル抗体は、ヘプシジンの立体構造エピトープへ結合し、立体構造エピトープは配列番号９のアミノ酸１から５（例えば、アミノ酸１、２、３、４又は５）の何れか１つ及び／又は配列番号９のアミノ酸１０から１３（例えば、アミノ酸１０、１１、１２又は１３）の何れか１つ及び／又は配列番号９のアミノ酸１４から２２（例えば、アミノ酸１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２）の何れか１つを含む。関連する態様において、モノクローナル抗体は、配列番号９の１０位のＣｙｓ及び１３位のＣｙｓを含む立体構造ループ及び／又は配列番号９の１４位のＣｙｓ及び２２位のＣｙｓを含む立体構造ループに結合する。
様々な実施形態において、モノクローナル抗体には、抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９、１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｄ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１の何れか、又はこのような抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２若しくはＣＤＲＬ３の何れか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つを保持する抗体（このようなＣＤＲ中に、１つ又は２つの変異を場合によって含む。）、又はこのような抗体の何れかの軽鎖若しくは重鎖可変領域を保持する抗体、又は抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９、１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｄ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１と同じ、ヒトヘプシジン上のエピトープへ結合し、若しくはヒトヘプシジンへの結合に関して、少なくとも７５％、このような抗体と競合する抗体が含まれ得る。このような競合的結合は、競合的ＥＬＩＳＡによって、又は実施例１７においてエピトープ特異性を評価するために記載されている方法によって、又は本明細書に記載されている若しくは本分野において公知の他の方法によって評価され得る。
様々な実施形態は、本明細書に記載されているモノクローナル抗体の何れかをコードする核酸、このような核酸配列を含むベクター及びこのような核酸又はベクターを含む宿主細胞も提供する。関連する態様において、核酸が発現されて抗体を生産するように先述の宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞又は培地から抗体を場合によって回収することを含む、このようなモノクローナル抗体の組換え生産のための方法が提供される。関連する実施形態において、先述の方法によって生産された、単離された抗体又は因子が提供される。
別の態様において、ヒトヘプシジンへの抗体の結合を可能とする条件下で、ヒトから得た試料を先述の抗体の何れかと接触させること、及び結合された抗体を検出することを含む、試料中のヒトヘプシジンを検出する方法が提供される。一実施形態において、ヘプシジンに対する第一の抗体が、固体支持体上へ、捕捉試薬として固定化され、ヘプシジンに対する第二の抗体が検出試薬として使用される。関連する態様において、試料中のヘプシジンの量は、結合された抗体の量を測定することによって定量される。検出方法は、ヘプシジン関連疾患を診断する方法、炎症性疾患を非炎症性疾患から識別する方法及びヘプシジンアンタゴニストを用いて治療法を監視する方法など、様々な診断、予後診断及び監視方法において使用することができる。このような方法において、ある閾値を上回るヘプシジンのレベルは、ヘプシジン関連貧血などのヘプシジン関連疾患の存在と相関するのに対して、前記閾値を下回るレベルは、患者がヘプシジン関連疾患を有する可能性が少ないことを示唆する。同様に、ある閾値を上回るヘプシジンのレベルは炎症性疾患の存在と相関するのに対して、前記閾値を下回るレベルは、患者が炎症性疾患を有する可能性が少ないことを示唆する。幾つかの実施形態において、このような方法は、鉄欠乏性貧血、炎症の貧血又は混合型貧血を有する患者を診断する。ヘプシジンレベルを抑制することを目的とした治療法の監視の場合、ある閾値を下回るヘプシジンのレベルは、ヘプシジンアンタゴニストの用量が治療的に有効であることを示唆し、前記閾値を上回るレベルは、ヘプシジンアンタゴニストの用量が治療的に有効でないことを示唆する。
別の態様において、本明細書に記載されている抗体の何れかの治療的有効量と及び医薬として許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。ヘプシジンの上昇したレベル、ヘプシジン関連疾患、鉄恒常性の障害又は貧血を有するヒトを治療するための医薬の調製におけるこのような抗体の使用も提供される。本明細書に記載されているように、抗体を第二の治療剤とともに投与することを含む同時投与法は、第二の治療剤とともに同時投与するための医薬の調製において抗体を使用することのみならず、抗体とともに同時投与するための医薬の調製において第二の治療剤を使用することも包含する。
様々な実施形態は、このような抗体の治療的有効量を投与することによって、例えば、ヘプシジンの上昇したレベル若しくはヘプシジン関連疾患若しくは鉄恒常性の障害を有する哺乳動物又は貧血を有する哺乳動物を治療するためにこのような抗体を使用する方法をさらに提供する。典型的な実施形態において、哺乳動物は、アフリカ鉄過剰症、アルファサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌の貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、動脈硬化又はアテローム性動脈硬化（冠動脈疾患、脳血管疾患又は末梢閉塞性動脈疾患を含む。）、運動失調、鉄に関連する運動失調、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠乏症、化学療法によって誘発された貧血、慢性腎／腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）（終末段階の腎臓病又は慢性腎／腎臓不全を含む。）、肝硬変、古典的ヘモクロマトーシス、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、ヘプシジン過剰を有する症状（上昇したヘプシジン）、先天性赤血球異形成性貧血、うっ血性心不全、クローン病、糖尿病、鉄体内分布の異常、鉄恒常性の異常、鉄代謝の異常、フェロポーティン病、フェロポーティン変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ失調症、索性脊髄症、グラシール症候群（ｇｒａｃｉｌｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｅｌｏｒｉ）感染症又はその他の細菌感染症、ハラーホルデン（Ｈａｌｌｅｒｖｏｒｄａｎ）・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２中の変異に起因するヘモクロマトーシス、異常ヘモグロビン症、肝炎、肝炎（Ｂｒｏｃｋ）、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、遺伝性ヘモクロマトーシス、ＨＩＶ又は他のウイルス病、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インシュリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏性疾患、鉄過剰負荷疾患、ヘプシジン過剰を伴う鉄欠乏性症状、若年性ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ２）、多発性硬化症、トランスフェリン受容体２、ＨＦＥ、ヘモジュベリン、フェロポーティン又は鉄代謝の他の遺伝子中の変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症、膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、偽脳炎、肺血鉄症、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性紅斑性狼瘡、サラセミア、中間型サラセミア、輸血性鉄過剰症、腫瘍、脈管炎、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症及び／又はウィルソン病からなる群から選択される症状に罹患しているヒトである。
さらに別の態様において、治療的有効量で、（ａ）ヘプシジン活性アンタゴニスト又はヘプシジン発現阻害剤及び（ｂ）赤血球新生刺激物質を投与することによって、貧血を有する哺乳動物を治療する方法が提供される。典型的なヘプシジン活性アンタゴニストには、ヒトヘプシジンを結合する抗体が含まれる。典型的なヘプシジン発現阻害剤には、ヒトヘプシジン核酸を結合するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが含まれる。典型的な赤血球新生刺激物質には、エリスロポエチン、エリスロポエチンアゴニスト変形物及びエリスロポエチン受容体を結合及び活性化するペプチド又は抗体が含まれる。赤血球新生刺激物質には、エポエチンα、エポエチンβ、エポエチンδ、エポエチンω、エポエチンι、エポエチンζ及びこれらの類縁体、模倣ペプチド、模倣抗体及びＨＩＦ阻害剤（米国特許公開２００５／００２０４８７号（その開示全体が、参照により、組み込まれる。）参照）が含まれるが、これらに限定されない。特に、エリスロポエチンには、エリスロポエチン分子又は以下の特許若しくは特許出願（それぞれ、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に開示されているようなその変形物若しくは類縁体が含まれるが、これらに限定されない。米国特許第４，７０３，００８号；米国特許第５，４４１，８６８号；米国特許第５，５４７，９３３号；米国特許第５，６１８，６９８号；米国特許第５，６２１，０８０号；米国特許第５，７５６，３４９号；米国特許第５，９５５，４２２号及び米国特許第５，８５６，２９８号；並びにＷＯ９１／０５８６７号；ＷＯ９５／０５４６５号；ＷＯ００／２４８９３号及びＷＯ０１／８１４０５号。ある種の典型的な実施形態において、赤血球新生刺激物質は、ヒトエリスロポエチン（配列番号７２）及びダルベポエチンα（配列番号７３）からなる群から選択される。このような方法に従って治療され得る貧血の典型的な形態には、炎症の貧血、癌の貧血、化学療法によって誘導された貧血、鉄欠乏性貧血、鉄恒常性の障害、フェロポーティン疾患又は腎臓病に起因する貧血が含まれる。ヘプシジン活性アンタゴニストの治療的有効量、あるいはヘプシジン発現阻害剤の治療的有効量を投与することを含む、赤血球新生刺激物質を用いた治療に対して低応答性である、又は抵抗性でさえある貧血を有する哺乳動物を治療する方法も提供される。
別の関連する態様において、上昇したヘプシジンレベルを伴う疾患又はヘプシジン関連疾患又は鉄恒常性の障害又は貧血を有する哺乳動物を治療するためのキットも提供される。典型的な一実施形態において、キットは、（ａ）ヘプシジン活性アンタゴニスト又はヘプシジン発現阻害剤及び（ｂ）赤血球新生刺激物質を含み、場合によって鉄を含む。別の典型的な実施形態において、キットは、ヘプシジン活性アンタゴニスト又はヘプシジン発現阻害剤及び容器に付着された又は容器とともに包装されたラベルを含み、該ラベルは、赤血球新生刺激物質との、ヘプシジン活性アンタゴニスト又はヘプシジン発現阻害剤の使用を記載する。さらに別の典型的な実施形態において、キットは、赤血球新生刺激物質及び容器に付着された又は容器とともに包装されたラベルを含み、該ラベルは、ヘプシジン活性アンタゴニスト又はヘプシジン発現阻害剤との、赤血球新生刺激物質の使用を記載する。赤血球新生刺激物質とともに投与するための医薬の調製におけるヘプシジン活性アンタゴニスト又はヘプシジン発現阻害剤の使用及びヘプシジン活性アンタゴニスト又はヘプシジン発現阻害剤とともに投与するための医薬の調製における赤血球新生刺激物質の使用も提供される。これらのキット又は使用の何れにおいても、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）及び赤血球新生刺激物質は、別個の容器中に存在することができ、又は単一の医薬組成物中へ一緒に組み合わせることができる。さらに別の実施形態において、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）又は赤血球新生刺激物質又は両者は、単一の医薬組成物中において鉄と組み合わせることが可能であり、又は別個の容器中に入れることができる。
異なる態様において、組成物中のヒトヘプシジンの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％がＣ２−Ｃ４−ジスルフィド結合、Ｃ５−Ｃ７ジスルフィド結合、Ｃ１−Ｃ８ジスルフィド結合及びＣ３−Ｃ６ジスルフィド結合を有する、配列番号９６を含む、精製され、生物活性を有し、正しく折り畳まれた、非尿性のヒトヘプシジンの組成物が提供される。幾つかの実施形態において、ヒトヘプシジンは、化学的に合成され、又は細菌若しくは他の非哺乳動物細胞中で生産される。溶液中の適切に折り畳まれたタンパク質の量は、本分野で公知の方法（ヘテロ核単一量子相関（ＨＳＱＣ；ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２（６），１２１６−１２２１（２００３）を含む。）によって定量することができる。関連する実施形態において、例えば、モノクローナル抗体を作製し、若しくはスクリーニングするために、ヘプシジン結合対を同定するために、又はヒトヘプシジンを結合する能力に関して、抗体又は特異的結合剤を含む組成物を検査するために、このような精製されたヒトヘプシジン組成物を使用する方法が提供される。抗体の作製は、例えば、免疫グロブリン産生細胞を精製されたヒトヘプシジン組成物と接触させること及び前記細胞によって産生された免疫グロブリンを単離することを含む。抗体又は特異的結合剤に対するスクリーニングは、例えば、候補ヘプシジン結合対を精製されたヘプシジン組成物と接触させること及び候補ヘプシジン結合対と組成物中のヒトヘプシジンとの間で形成された複合体を検出することを一般に含む。別の関連する実施形態において、前記方法は、候補ヘプシジン結合対を哺乳動物に投与することをさらに含む。ヒトヘプシジンを結合する能力に関して、抗体又は特異的結合剤を検査することは、例えば、抗体又は特異的結合剤を、適切な折り畳みを保持する精製されたヒトヘプシジン組成物又はその断片と接触させること、及びヒトヘプシジンと抗体又は特異的結合剤との間で形成された複合体を検出することを含む。
関連する態様において、（ａ）変性を促進する条件下で、ヒトヘプシジンポリペプチドをカオトロピック剤へ曝露させること、及び（ｂ）適切に折り畳まれた生物活性形態への再生を促進する条件下で、（ａ）の産物を酸化剤へ曝露すること、及び（ｃ）生物活性ヒトヘプシジンポリペプチドを含む溶液を回収することを含み、ヒトヘプシジンポリペプチドの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％又はそれ以上がＣ２−Ｃ４ジスルフィド結合及びＣ５−Ｃ７ジスルフィド結合を有する、配列番号９６を含むヒトヘプシジンポリペプチドを、正しく折り畳まれた生物活性形態へと再折り畳みする方法が提供される。溶液中の適切に折り畳まれたタンパク質の量は、本分野で公知の方法（ヘテロ核単一量子相関（ＨＳＱＣ）、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２（６），１２１６−１２２１（２００３）を含む。）によって定量することができる。一実施形態において、正しく折り畳まれた生物活性ヘプシジンは、細胞をベースとするアッセイにおいて、１００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。別の実施形態において、正しく折り畳まれた生物活性ヘプシジンは、細胞をベースとするアッセイにおいて、３０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。関連する実施形態において、（ｂ）は、ヒトヘプシジンポリペプチドを空気以外の酸化剤と接触させることをさらに含む。別の実施形態において、酸化は、８より大きいｐＨ及び０．１％未満の酢酸を含有する溶液中で起こる。
異なる態様において、同一若しくは類似のジスルフィド結合性及び／又は同一若しくは類似の予想される三次元構造を保持するヒトヘプシジンの変形物が提供される。典型的な実施形態において、変形物は、８つのシステイン残基の全てを保持し、Ｃ２−Ｃ４ジスルフィド結合及び／又はＣ５−Ｃ７ジスルフィド結合をさらに保持する。このような変形物は、アゴニスト又はアンタゴニスト活性を示し得る。すなわち、ヘプシジンの生物活性（抗微生物又は鉄制御活性）を保持又は阻害する。典型的な実施形態において、その長さにわたって、配列番号９６と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むヘプシジン類縁体ペプチドが提供される。ヘプシジン変形物は、以下の１つ又はそれ以上を示し得る。フェロポーティン結合活性を保持し（すなわち、フェロポーティンを活性化し、又はフェロポーティン鉄輸送を阻害する。）、成熟ヒトヘプシジン（配列番号９）の鉄制御活性を促進若しくは阻害し、及び／又は循環鉄レベルをインビボで減少若しくは増加させる。
別の態様において、還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって測定された場合に、６ｋｄ未満（例えば、３ｋｄ±２）のおよその分子量を有する主バンドとして、配列番号９の精製された成熟ヒトヘプシジンを検出する抗体が提供される。
先述の要約は、本発明の全ての態様を確定することを意図するものではなく、詳細な説明などの他の節に、さらなる態様が記載されている。文書全体が統一された開示として関連するものであり、特徴の組み合わせが本文書の同じ文又はパラグラフ又は節内に一緒に見出されない場合でさえ、本明細書に記載されている特徴の全ての組み合わせが想定されることを理解すべきである。
先述されているものに加えて、本発明は、本明細書中の具体的なパラグラフによって規定される変形より何らかの様式で範囲がより狭い本発明の全ての実施形態をさらなる態様として含むことができる。たとえば、属として記載されている本発明のある態様は、属のあらゆる要素が個別的に本発明の態様であるものと理解すべきである。また、属として記載された又は属の要素を選択する態様は、属の２つ又はそれ以上の要素の組み合わせを包含するものと理解すべきである。
明細書中の様々な実施形態が、「含む」という言語を用いて表されているのに対して、様々な状況下では、関連する実施形態が、「からなる」又は「から実質的になる」という言語を用いても記載され得る。「１つ」という用語は、１つ又はそれ以上を表すことに注意すべきであり、例えば、「１つの免疫グロブリン」とは、１つ又はそれ以上の免疫グロブリン分子を表すものと理解される。従って、本明細書において、「１つ」、「１つ又はそれ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、互換的に使用され得る。
値の範囲を記載する場合、記載されている特徴は範囲内に見出される個々の値であり得ることも理解すべきである。例えば、「約ｐＨ４から約ｐＨ６のｐＨ」は、ｐＨ４、４．２、４．６、５．１、５．５などであり得るが、これらに限定されるものではなく、このような値の間のあらゆる値であり得る。さらに、「約ｐＨ４から約ｐＨ６のｐＨ」は、保存中に、問題の製剤のｐＨがｐＨ４からｐＨ６の範囲内を２ｐＨ単位変動することを意味すると解釈すべきではなく、溶液のｐＨに対してその範囲内で値を選択することができ、ｐＨが概ねそのｐＨに緩衝化された状態を保つものと解釈すべきである。幾つかの実施形態において、「約」という用語が使用される場合、この用語は、表記数字プラス又はマイナス表記数字の５％、１０％、１５％又はそれ以上を意味する。意図される実際の変形が文脈から決定できる。出願人は本明細書に記載されている発明の範囲全体を発明したが、出願人は他者の従来技術中に記載されている主題について権利を請求することを意図するものではない。従って、米国特許庁又は他の団体若しくは個人によって、特許請求の範囲に属する法定の従来技術が出願人の知るところとなった場合には、出願人は、このような特許請求の範囲の主題を確定し直して、このような法定の従来技術又は法定の従来技術の明白な変形物をこのような特許請求の範囲から明確に除外するために、適用される特許法に基づいて、補正を行う権利を留保する。このような補正された特許請求の範囲によって定義された本発明の変形も、本発明の態様として予定される。
図１は、３つの合成調製物及び組換え調製物が全て尿性ヘプシジンと等しいことを示す、ヒトヘプシジンの４つの全ての調製物のＩＲＭＰＤＦＴＭＳスペクトルを示している。 図２は、３つの合成調製物及び組換え調製物が尿性ヘプシジンと等しいことを示す、ヒトヘプシジンの４つの調製物のＩＤ１ＨＮＭＲスペクトルを示している。 図３Ａは、ｐＨ２で部分的に還元され、及びアルキル化されたヘプシジンのＨＰＬＣ分析を示している。 図３Ｂは、ｐＨ３で部分的に還元され、及びアルキル化されたヘプシジンのＨＰＬＣ分析を示している。 図４は、バックボーン共鳴帰属を示す組換えヒトヘプシジンのバックボーンフィンガープリント領域の二次元ＮＯＥＳＹ（暗）−ＴＯＣＳＹ（明）オーバーレイを示している。 図５は、実施例８に論述されているように、ω１デカップリングされた２ＤＴＯＣＳＹ及びω１デカップリングされた２ＤＴＯＣＳＹ−ＮＯＥＳＹ実験のオーバーレイを示している。Ｈαプロトンの共鳴位置には、破線矢印が付されている。アスタリスクは、折り畳みの人為現象を表している。 図６は、２つの部分的アルキル化還元技術によって測定され、ＮＭＲによって確認された様々なジスルフィド結合を示すヒトヘプシジンポリペプチドの模式図である。 図７は、Ｈｕｎｅｔｅｒ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３７５９７−６０３，２００２）（左）によって得られ、実施例８（右）において決定されたヒトヘプシジンの平均骨格構造を示している。 図８は、β−ラクタマーゼ鉄応答アッセイにおいて、細胞内鉄濃度を降下させるマウス抗ヘプシジン抗体Ａｂ４３の機能的能力を示している。 図９は、β−ラクタマーゼ鉄応答アッセイにおいて、細胞内鉄濃度を降下させるマウス抗ヘプシジン抗体２．７の機能的能力を示している。 図１０は、β−ラクタマーゼ鉄応答アッセイにおいて、細胞内鉄濃度を降下させるマウス抗ヘプシジン抗体２．４１の機能的能力を示している。 図１１は、抗ヘプシジン抗体がマウス中に注入されたヒトヘプシジンを中和することを示している。 図１２は、ウイルスによってマウス中に発現されたヒトヘプシジンの抗体中和が正常な早期の赤血球の特徴を回復することを示している。 図１３Ａは、ヘプシジンのウイルスによる過剰発現がエリスロポエチンに対する低応答性を引き起こすことを示す。図１３Ｂは、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）によって媒介されるヘプシジン発現の滴定及びその結果得られた血清鉄濃度を示している。 図１４は、炎症性貧血モデルにおいて、ヘプシジンの抑制がＡｒａｎｅｓｐ（Ｒ）（ダルベポエチンα）に対する応答性を回復させることを示している。 図１５Ａは、実施例２２の実験操作の模式図を示している。図１５ＢからＥは、抗ヘプシジン抗体がウイルスによってヘプシジンを過剰発現しているマウス中でのエリスロポエチンに対する応答性を回復させることを示している。 図１６は、炎症の貧血を有するヒトヘプシジンノックインマウスにおいて、抗ヘプシジン抗体処理によるヘプシジンの中和がエリスロポエチンに対する応答性を回復させることを示している。 図１７Ａは、ヘプシジン測定の不存在下で、患者を評価するための鉄指数及び病状の決定木を示している。 図１７Ｂは、ヘプシジンレベルの測定を用いて、患者を評価するための理論的決定木を示している。 図１８は、癌患者の貧血（ＡｏＣ）中において、ヘプシジンレベルが上昇しており、通常の患者において上昇していないことを示している。 図１９は、ヘプシジンレベルが炎症性貧血の診断と相関し、鉄欠乏性貧血と相関しないことを示している。 図２０は、市販のＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡが成熟ヘプシジンを検出できないことを示している。 図２１は、サンドイッチイムノアッセイによって測定されたプロヘプシジン濃度を示しており、プロヘプシジンが血清中に検出できないことを示している。 図２２は、フューリン阻害剤の存在によって保護されなければ、プロヘプシジンが血清中で分解されることを示唆するプロヘプシジンのウェスタンブロットを示している。 図２３は、ヘプシジン及びプロヘプシジンレベル（市販のＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡによって測定された。）が患者の試料中において相関しないことを示している。 図２４ＡからＢは、ヘプシジンレベルはＣ反応性タンパク質（Ａ）によって評価された炎症状態と関連し、プロヘプシジンレベルは関連しない（Ｂ）ことを示している。 図２５ＡからＢは、ヘプシジンレベルが炎症の貧血の診断を補助し（Ａ）、プロヘプシジンレベルは補助しない（Ｂ）ことを示している。 図２６ＡからＢは、ヘプシジンレベルが炎症性貧血の診断と相関し（Ａ）、プロヘプシジンレベルは相関しない（Ｂ）ことを示している。 図２７は、成熟ヘプシジンに対して産生されたポリクローナル抗体がサンドイッチＥＬＩＳＡを構築するために使用できることを示している。 図２８は、２つのモノクローナル抗体が直ちにヘプシジンへ結合できることを示すＢｉａｃｏｒｅ実験を示している。 図２９は、サンドイッチＥＬＩＳＡが成熟ヘプシジンに対して産生されたモノクローナル抗体を用いて構築できることを示している。 図３０は、競合的結合アッセイによって測定された緩衝液、ウサギ血清及びプールされたヒト血清中に存在するヘプシジンの濃度を示している。 図３１は、ヒト血清中でのヘプシジンの測定を示している。 図３２は、競合的結合アッセイを用いた、正常なヒト血清中に存在するヘプシジンの濃度を示している。 サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ及び質量分析技術を用いて測定された無作為のヒトドナー中に検出されたヘプシジンレベルの比較。 図３４は、上昇したヘプシジンレベルを有するＡｏＣ患者が上昇したＣ反応性タンパク質（ＣＲＰレベル）も有していることを示している。
ヒトヘプシジン遺伝子は、８４残基のプレプロペプチド（配列番号８）をコードする。対応するｃＤＮＡ及びゲノム配列が、それぞれ、配列番号７及び１００に記載されている。まず、２４残基のＮ末端シグナルペプチド（配列番号８の残基１から２４）が切断されてプロヘプシジンを生成し、次いで、プロヘプジンが、プロドメイン（配列番号８の残基２５から５９）の切断によるさらなるプロセッシングを受けて、２５残基の成熟ヘプシジン（配列番号９に記載されている配列番号８の残基６０から８４）を生成する。主要な２５アミノ酸形態に加えて、２０アミノ酸又は２２アミノ酸長であるさらなるＮ末端切断形態が尿中に同定され得る（２０アミノ酸、配列番号９６；及び２２アミノ酸、配列番号９８）。成熟ヒトヘプシジンは、８つのシステイン残基（本明細書において、順に（Ｎ末端からＣ末端へ付番された）Ｃ１からＣ８と称される。）を含有する。
本明細書中に報告されている新規ジスルフィド結合性及び対応するモデル化されたヘプシジンの三次元構造は、同一の又は類似のジスルフィド接合性を保持し、ヘプシジン生物活性の調節物質として有用であるヘプシジン変形物の産生も可能とする。例えば、ヘプシジン受容体に結合し、ヘプシジン受容体を活性化する分子、フェロポーティンに結合し、フェロポーティンの内部取り込みを引き起こす分子又はヘプシジンに対して競合的阻害剤として作用する分子を設計し、作製することが可能である。
Ｉ．精製され、正しく折り畳まれたヒトヘプシジン組成物
生物的に活性を有するためには、ヘプシジンポリペプチドは、「再折り畳みされ」、適切な三次構造へ酸化され、ジスルフィド結合を生成する必要があり得る。再折り畳みは、本明細書に記載されている手順及び本分野において周知のその他の手順を用いて達成することができる。このような方法は、例えば、カオトロピック剤の存在下で、通常、７を上回るｐＨへ、可溶化されたポリペプチド剤を曝露することを含む。カオトロピック剤は、塩酸グアニジン（塩酸グアニジニウム、ＧｄｎＨＣｌ）、硫酸グアニジン、尿素、チオシアン酸ナトリウム、サルコシル、ドデシル硫酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウム及び／又はタンパク質内の非共有分子間結合を崩壊させ、ポリペプチド鎖が実質的にランダムな立体構造を採ることを可能にする他の化合物など（これらに限定されない。）の化合物である。
多くの事例において、再折り畳み／酸化溶液は、システイン架橋の形成のためにジスルフィドシャフリングが起こるようにする特定の酸化還元電位を生成させるために、特定の比率で、還元剤に加えて、その酸化された形態も含有する。還元剤は、電子を伝達することができ、これにより、様々な原子間の結合を「還元する」ことができる。本発明の様々な実施形態において、還元剤は、分子内及び分子間相互作用、特に、ジスルフィド架橋を伴う相互作用を破壊する。本発明の様々な実施形態に従えば、典型的な還元剤には、ジチオスレイトール、グルタチオン、ジチオエリスリトール又はβ−メルカプトエタノールが含まれる。幾つかの一般的に使用される酸化還元対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化（第二）銅、ジチオスレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ及び２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが含まれる。多くの事例において、再折り畳みの効率を増加させるために、共溶媒を使用し得る。一般的に使用される共溶媒には、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール及びアルギニンが含まれる。
再折り畳みされると、ヘプシジンポリペプチドのジスルフィド結合性は、本分野において公知の様々な技術によって評価することができる。一態様において、前記技術は、ＮＥＭ部分的還元的アルキル化である。別の態様において、技術は、フーリエ変換質量分光法（ＦＴ−ＭＳ）である。ＮＥＭ部分的還元的アルキル化及びＦＴ−ＭＳは、実施例１及び４において、さらに詳しく論述されている。
ＦＴ−ＭＳ（フーリエ変換質量スペクトル）は、ジスルフィド結合性を評価するために使用することができる。本分野において公知であるように、ＦＴ−ＭＳは、強力で、安定な磁場中で軌道を描く帯電粒子の原理に基づいている。軌道を描くイオンによって生成された電流を検出することによって、イオンのｍ／ｚを測定するために、フーリエ変換が使用され得る。有利なことに、この手法は、極めて高い質量分離を可能とし、便利なタンデム型質量分光法実験の実施を可能とする。両者を合わせて、分析下にあるタンパク分解断片の明確な割り当てが可能となる（例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１７：１−３５，１９９８；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，９５：８５９６−６０１，１９９８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，６６：２０７７−８３，１９９４）。ＦＴ−ＭＳは、実施例１及び４において、さらに詳しく論述されている。
溶液中の適切に折り畳まれたタンパク質の量は、本分野で公知の方法（異核単一量子相関（ＨＳＱＣ）、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２（６），１２１６−１２２１（２００３）を含む。）によって定量することができる。ヘプシジンなどの誤って折り畳まれたタンパク質は、ＨＳＱＣスペクトル中で特有のクロスピークを有する。これらのピークを積算することよって、原理的に、誤った折り畳みのパーセントが定量される。
ＩＩ．ヘプシジンアンタゴニスト
本発明の様々な実施形態は、（ａ）ヘプシジン活性アンタゴニスト又は（ｂ）ヘプシジン発現阻害剤というヘプシジンアンタゴニストの２つの異なるカテゴリーの生産及び使用を提供する。
本明細書において使用される「ヘプシジン活性アンタゴニスト」は、ヒトヘプシジンの鉄制御活性を阻害するが、ヘプシジン遺伝子又はヘプシジンｍＲＮＡの発現を阻害しない物質を意味する。
本明細書において使用される「ヘプシジン発現阻害剤」とは、ヘプシジン遺伝子又はヘプシジンｍＲＮＡの発現を阻害する物質を意味する。
ヘプシジン活性アンタゴニスト及びヘプシジン発現阻害剤は相互に排他的なカテゴリーであるが、何れも、「ヘプシジンアンタゴニスト」という一般的なカテゴリーに属する。
一態様において、ヘプシジン活性アンタゴニストは、例えば、ヘプシジンとフェロポーティンの間での結合を阻害することによって、ヘプシジンによって調節される細胞の鉄保持を阻害することによって、又はフェロポーティン依存性鉄輸送を促進することによって、ヘプシジンの機能を阻害する物質であり得る。このカテゴリーにおけるヘプシジン活性アンタゴニストには、ヘプシジンを結合し、その活性を阻害する抗体又はペプチドをベースとする特異的結合剤（本明細書に記載されている抗体の全てを含む。）；フェロポーティンへ結合するが、フェロポーティン鉄輸送を活性化しないヘプシジン変形物及びその誘導体；並びにヘプシジンを結合し、その活性を阻害する、場合によって約１０００ダルトン未満の分子量の小さな有機化学化合物が含まれる。
ヘプシジン発現阻害剤には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、阻害的ＲＮＡ、ＤＮＡ酵素、リボザイム、アプタマー又はヘプシジンの発現を阻害する医薬として許容されるこれらの塩を含む、ヘプシジンＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合し、ヘプシジン発現を阻害するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが含まれる。
Ａ．抗ヘプシジン抗体及び特異的結合剤
本発明の様々な実施形態は、ヒトヘプシジンを結合する抗体（モノクローナル抗体を含む。）、このような抗体を生産する方法、ヘプシジンを検出するためにこのような抗体を使用する方法、このような抗体を含む医薬製剤、医薬製剤を調製する方法及び以下に記載されているような赤血球新生刺激物質との組み合わせ療法を含む、医薬製剤を用いて患者を治療する方法を提供する。このような抗体をコードする核酸、ベクター及びこのような核酸を含む組み換え宿主細胞及びこのような抗体を生産する方法も提供される。
「抗体」という用語は、最も広義において使用され、完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（二重特異的抗体を含む。）、抗原を結合することができる抗体断片（Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディを含む。）、及び所望の生物活性を示す限りにおいて前述のものを含む組み換えペプチドが含まれる。完全な状態の分子及び／又は断片の多量体又は凝集物（化学的に誘導された抗体を含む。）が想定される。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２又はあらゆるアロタイプを含むあらゆるイソタイプクラス又はサブクラスの抗体が想定される。異なるイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３イソタイプは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。
幾つかの実施形態において、抗体は、ヘプシジンに対するＫＤ（平衡解離定数）によって測定された、１×１０−６Ｍ若しくはそれ以下の範囲の、又は１０−１６Ｍ又はそれ以下の範囲の（例えば、約１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、１０−１４、１０−１５、１０−１６Ｍ又はそれ以下）結合親和性などの望ましい特徴を示す。平衡解離定数は、実施例１３及び１４に記載されているような、ＢＩＡｃｏｒｅ及び／又はＫｉｎＥｘＡを使用する溶液平衡アッセイにおいて測定することができる。
他の実施形態において、抗体はヘプシジンに対して特異性を示す。本明細書において使用される場合、抗体が、異なるファミリー中の他の無関係なタンパク質と比べて、ヒトヘプシジンに対して有意により高い結合親和性を有し、その結果、識別が可能となる場合に、抗体は、ヒトヘプシジンに「対して特異的」である。幾つかの実施形態において、このような抗体は、マウス、ラット又は霊長類ヘプシジンなどの他の種のヘプシジンとも交叉反応し得るのに対して、他の実施形態では、抗体は、ヒト又は霊長類ヘプシジンのみに結合し、げっ歯類のヘプシジンには有意に結合しない。典型的な実施形態において、抗体は、ヒト及びカニクイザルヘプシジンに結合するが、げっ歯類ヘプシジンには有意に結合しない。幾つかの実施形態において、ヘプシジンに対して特異的な抗体は同じファミリー中の他のタンパク質と交叉反応するのに対して、他の実施形態では、抗体は、他の関連するファミリーの一員（デフェンシン又はマウスｈｅｐｃ２を含む。）からヘプシジンを識別する。
さらに別の実施形態において、モノクローナル抗体は、インビトロにおいて、好ましくはインビボにおいても、ヘプシジンの鉄制御活性を阻害（又は中和）する。このようなヘプシジン中和抗体は、ヘプシジン関連疾患又は鉄恒常性の障害に対して治療的に有用である。ヘプシジン中和活性は、多数のマーカー、例えば、フェリチン／鉄レベル、赤血球数、赤血球の特徴（ヘモグロビン含量及び／又は細胞容積）、早期赤血球の特徴（網状赤血球数、ヘモグロビン含量又は細胞容積）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ；ｅｄｉｔｏｒ Ｍａｒｙ Ｌ．Ｔｕｒｇｅｏｎ，１９９９）、フェロポーティン内部取り込み又は鉄輸送を通じて測定することができる。典型的な実施形態において、モノクローナル抗体は、約１０−８Ｍ又はそれ以下のＥＣ５０で細胞内鉄濃度を減少させ、及び／又は循環鉄濃度を増加させる。
幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されているモノクローナル抗体は、ヒトヘプシジンの効果を拮抗し、又はヘプシジンの鉄制御活性を阻害する。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されているモノクローナル抗体は、約１×１０−８Ｍ若しくはそれ以下又は約１×１０−７Ｍ若しくはそれ以下のＥＣ５０で効果を発揮する。例えば、抗体は、約１×１０−８Ｍ若しくはそれ以下のＥＣ５０で細胞中の細胞内鉄レベルを減少させ得、又はフェリチンアッセイによって測定された場合に、約１×１０−８Ｍ若しくはそれ以下のＥＣ５０でフェリチン発現を低下させ得る。他の実施形態において、本明細書に記載されているモノクローナル抗体は、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％、遊離血清ヘプシジンレベルを低下させ得る。他の実施形態において、本明細書に記載されているモノクローナル抗体は、赤血球カウント（数）、赤血球の平均細胞容積又は赤血球のヘモグロビン含量を増加させ、ヘモグロビンを増加させ、ヘマトクリットを増加させ、Ｔｓａｔを増加させ、循環（又は血清）鉄レベルを増加させ、及び／又は網状赤血球数、網状赤血球平均細胞容積、網状赤血球ヘモグロビン含量又は網状赤血球数を増加若しくは正常化させ得る。
特定の典型的な実施形態において、本発明は、以下のものを想定する。
１）抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９；１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｄ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１のいずれかのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを保持するモノクローナル抗体（このようなＣＤＲ中には、１つ又は２つの変異を場合によって含む。）、
２）抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９；１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｄ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１のいずれかのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３又は重鎖可変領域の全部を保持するモノクローナル抗体（このようなＣＤＲ中には、１つ又は２つの変異を場合によって含む。）、
３）抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９；１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｄ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１のいずれかのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３又は軽鎖可変領域の全てを保持するモノクローナル抗体（このようなＣＤＲ中には、１つ又は２つの変異を場合によって含む。）、
４）例えば、Ｘ線結晶解析学を通じて測定された場合に、抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９；１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｄ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１と同じ成熟ヒトヘプシジンのエピトープに結合し、又は配列番号９のアミノ酸１から５内のアミノ酸及び／又は配列番号９のアミノ酸１０から１３によって形成されるループ内のアミノ酸及び／又は配列番号９のアミノ酸１４から２２によって形成されるループ内のアミノ酸を含む立体構造エピトープに結合するモノクローナル抗体；並びに
５）成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、約７５％超、約８０％超、又は約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％若しくは９５％超、抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９；１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｄ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１と競合するモノクローナル抗体。
一実施形態において、抗体は、配列番号１６から２１からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２８から３３（２．７ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号４０から４５（２．４１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号５２から５７（Ｒ９ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１１１から１１６（１Ｃ９ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１２１から１２６（３Ｂ３ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号１３１から１３６（４Ｅ１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１４１から１４６（７Ａ３ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１５１から１５６（９Ｄ１２ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１６１から１６６（１２Ｂ９ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。さらに実施形態において、抗体は、配列番号１７１から１７６（１５Ｅ１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３１４から３１９（１８Ｄ８ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３２４から３２９（１９Ｃ１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号２９４から２９９（Ｒ１９Ｄ１２ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３０４から３０９（１９Ｈ６ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号１８１から１８６（２３Ｆ１１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１９１から１９６（２６Ｆ１１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２０３から２０５及び１３１から１３３（１Ｓ１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２１４から２１６及び１４４から１４６（１Ｓ２ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号２２５から２２７及び１６４から１６６（１Ｓ３ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２３６から２３８及び１７４から１７６（１Ｓ４ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２４７から２４９及び１８４から１８６（１Ｓ５ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。
幾つかの実施形態において、抗体は、３つの軽鎖ＣＤＲ全て、３つの重鎖ＣＤＲ全て又は６つのＣＤＲ全てを含む。幾つかの典型的な実施形態において、ある抗体由来の２つの軽鎖ＣＤＲは、異なる抗体由来の第三の軽鎖ＣＤＲと組み合わされ得る。あるいは、特にＣＤＲが高度に相同的である場合に、ある抗体由来のＣＤＲＬ１は、異なる抗体由来のＣＤＲＬ２及びさらに別の抗体由来のＣＤＲＬ３と組み合わせることができる。同様に、特に、ＣＤＲが高度に相同的である場合に、ある抗体由来の２つの重鎖ＣＤＲは、異なる抗体由来の第三の重鎖ＣＤＲと組み合わされ得る。すなわち、ある抗体由来のＣＤＲＨ１は、異なる抗体由来のＣＤＲＨ２及びさらに別の抗体由来のＣＤＲＨ３と組み合わせることができる。
コンセンサスＣＤＲも使用され得る。典型的な実施形態において、抗体は、配列番号７４（ＸＡＳＮＬＥＳ）、配列番号７５（ＸＱＳＮＥＥ）及び配列番号７６（ＱＱＸＮＥＸ）、配列番号２８（ＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨ）、配列番号７７（ＷＩＮＴＸＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＸＧ）、配列番号７８（ＸＸＹＹＧＸ＊Ａ＊Ｙ）、配列番号１９（ＴＹＧＭＳ）、配列番号２８４（ＶＩＸＹＸＸＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ）、配列番号２８５（ＷＩＸＡＸＮＧＸＸＸＸＡＸＸＸＱＸ）、配列番号２８６（ＡＱＥＧＸＡＰＤＡＦＤＩ）、配列番号２８７（ＱＡＷＹＳＳＴＮＶＸ）、配列番号２８８（ＱＡＷＤＳＳＴＡＸＸ）、配列番号２８９（ＱＳＤＹＳＳＸＸＸ＊＊）に記載されているアミノ酸配列の１つ又はそれ以上を含む（Ｘは任意のアミノ酸であり、＊は不存在又は任意のアミノ酸であり得る。）。
さらに別の典型的な実施形態において、抗体は、抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域、例えば、配列番号１５（Ａｂ４３重鎖可変領域）及び／又は配列番号１３（Ａｂ４３軽鎖可変領域）；配列番号２７（２．７重鎖可変領域）及び／又は配列番号２５（２．７軽鎖可変領域）；配列番号３９（２．４１重鎖可変領域）及び／又は配列番号３７（２．４１軽鎖可変領域）；又は配列番号５１（Ｒ９重鎖可変領域）及び／又は配列番号４９（Ｒ９軽鎖可変領域）、配列番号１１０（１Ｃ９重鎖可変領域）及び／又は配列番号１０８（１Ｃ９軽鎖可変領域）；又は配列番号１２０（３Ｂ３重鎖可変領域）及び／又は配列番号１１８（３Ｂ３軽鎖可変領域）；配列番号１３０（４Ｅｌ重鎖可変領域）及び／又は配列番号１２８（４Ｅ１軽鎖可変領域）；又は配列番号１４０（７Ａ３重鎖可変領域）及び／又は配列番号１３８（７Ａ３軽鎖可変領域）；又は配列番号１５０（９Ｄ１２重鎖可変領域）及び／又は配列番号１４８（９Ｄ１２軽鎖可変領域）；配列番号１６０（１２Ｂ９重鎖可変領域）及び／又は配列番号１５８（１２Ｂ９軽鎖可変領域）；配列番号１７０（１５Ｅ１重鎖可変領域）及び／又は配列番号１６８（１５Ｅ１軽鎖可変領域）；配列番号３１３（１８Ｄ８重鎖可変領域）及び／又は配列番号３１１（１８Ｄ８軽鎖可変領域）；配列番号３２３（１９Ｃ１重鎖可変領域）及び／又は配列番号３２１（１９Ｃ１軽鎖可変領域）；配列番号２９３（１９Ｄ１２重鎖可変領域）及び／又は配列番号２９１（１９Ｄ１２軽鎖可変領域）；配列番号３０３（１９Ｈ６重鎖可変領域）及び／又は配列番号３０１（１９Ｈ６軽鎖可変領域）；配列番号１８０（２３Ｆ１１重鎖可変領域）及び／又は配列番号１７８（２３Ｆ１１軽鎖可変領域）；配列番号１９０（２６Ｆ１１重鎖可変領域）及び／又は配列番号１８８（２６Ｆ１１軽鎖可変領域）；又は配列番号２０２（１Ｓ１重鎖可変領域）及び／又は配列番号１２８（１Ｓ１軽鎖可変領域）；配列番号２１３（１Ｓ２軽鎖可変領域）及び／又は配列番号１４０（１Ｓ２重鎖可変領域）；配列番号２２４（１Ｓ３軽鎖可変領域）及び／又は配列番号１６０（１Ｓ３重鎖可変領域）；配列番号２３５（１Ｓ４軽鎖可変領域）及び／又は配列番号１７０（１Ｓ４重鎖可変領域；又は配列番号２４６（１Ｓ５軽鎖可変領域）及び／又は配列番号１９０（１Ｓ５重鎖可変領域）を含む。
幾つかの実施形態において、配列番号１５（Ａｂ４３重鎖可変領域）、２７（２．７重鎖可変領域）、３９（２．４１重鎖可変領域）、５１（Ｒ９重鎖可変領域）、１１０（１Ｃ９重鎖可変領域）、１２０（３Ｂ３重鎖可変領域）、１３０（４Ｅｌ重鎖可変領域）、１４０（７Ａ３重鎖可変領域）、１５０（９Ｄ１２重鎖可変領域）、１６０（１２Ｂ９重鎖可変領域）、１７０（１５Ｅ１重鎖可変領域）、３１３（１８Ｄ８重鎖可変領域）、３２３（１９Ｃ１重鎖可変領域）、２９３（１９Ｄ１２重鎖可変領域）、３０３（１９Ｈ６重鎖可変領域）、１８０（２３Ｆ１１重鎖可変領域）、１９０（２６Ｆ１１重鎖可変領域）、２０２（１Ｓ１重鎖可変領域）、１３（Ａｂ４３軽鎖可変領域）、２５（２．７軽鎖可変領域）、３７（２．４１軽鎖可変領域）、４９（Ｒ９軽鎖可変領域）、１０８（１Ｃ９軽鎖可変領域）、１１８（３Ｂ３軽鎖可変領域）、１２８（４Ｅ１軽鎖可変領域）、１３８（７Ａ３軽鎖可変領域）、１４８（９Ｄ１２軽鎖可変領域）、１５８（１２Ｂ９軽鎖可変領域）、１６８（１５Ｅ１軽鎖可変領域）、３１１（１８Ｄ８軽鎖可変領域）、３２１（１９Ｃ１軽鎖可変領域）、２９１（１９Ｄ１２軽鎖可変領域）、３０１（１９Ｈ６軽鎖可変領域）、１７８（２３Ｆ１１軽鎖可変領域）、１８８（２６Ｆ１１軽鎖可変領域）、２１３（１Ｓ２軽鎖可変領域）、２２４（１Ｓ３軽鎖可変領域）、２３５（１Ｓ４軽鎖可変領域）及び２４６（１Ｓ５軽鎖可変領域）からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供され、前記ポリペプチドは、配列番号１６から２１（Ａｂ４３ＣＤＲ）、２８から３３（２．７ＣＤＲ）、４０から４５（２．４１ＣＤＲ）、５２から５７（Ｒ９ＣＤＲ）、１１１から１１６（１Ｃ９ＣＤＲ）、１２１から１２６（３Ｂ３ＣＤＲ）、１３１から１３６（４ＥｌＣＤＲ）、１４１から１４６（７Ａ３ＣＤＲ）、１５１から１５６（９Ｄ１２ＣＤＲ）、１６１から１６６（１２Ｂ９ＣＤＲ）、１７１から１７６（１５Ｅ１ＣＤＲ）、３１４から３１９（１８Ｄ８ＣＤＲ）、３２４から３２９（１９Ｃ１ＣＤＲ）、２９４から２９９（１９Ｄ１２ＣＤＲ）、３０４から３０９（１９Ｈ６ＣＤＲ）、１８１から１８６（２３Ｆ１１ＣＤＲ）、１９１から１９６（２６Ｆ１１ＣＤＲ）、２０３から２０５及び１３１から１３３（１Ｓ１重鎖ＣＤＲ）、２１４から２１６及び１４４から１４６（１Ｓ２軽鎖ＣＤＲ）、２２５から２２７及び１６４から１６６（１Ｓ３軽鎖ＣＤＲ）、２３６から２３８及び１７４から１７６（１Ｓ４軽鎖ＣＤＲ）並びに２４７から２４９及び１８４から１８６（１Ｓ５軽鎖ＣＤＲ）に記載されているアミノ酸配列の少なくとも１つ又はそれ以上をさらに含む。先述されている実施形態の何れかにおいて、ポリペプチドは、配列番号：１６から２１（Ａｂ４３ＣＤＲ）、２８から３３（２．７ＣＤＲ）、４０から４５（２．４１ＣＤＲ）、５２から５７（Ｒ９ＣＤＲ）、１１１から１１６（１Ｃ９ＣＤＲ）、１２１から１２６（３Ｂ３ＣＤＲ）、１３１から１３６（４ＥｌＣＤＲ）、１４１から１４６（７Ａ３ＣＤＲ）、１５１から１５６（９Ｄ１２ＣＤＲ）、１６１から１６６（１２Ｂ９ＣＤＲ）、１７１から１７６（１５Ｅ１ＣＤＲ）、３１４から３１９（１８Ｄ８ＣＤＲ）、３２４から３２９（１９Ｃ１ＣＤＲ）、２９４から２９９（１９Ｄ１２ＣＤＲ）、３０４から３０９（１９Ｈ６ＣＤＲ）、１８１から１８６（２３Ｆ１１ＣＤＲ）、１９１から１９６（２６Ｆ１１ＣＤＲ）、２０３から２０５及び１３１から１３３（１Ｓ１重鎖ＣＤＲ）、２１４から２１６及び１４４から１４６（１Ｓ２軽鎖ＣＤＲ）、２２５から２２７及び１６４から１６６（１Ｓ３軽鎖ＣＤＲ）、２３６から２３８及び１７４から１７６（１Ｓ４軽鎖ＣＤＲ）並びに２４７から２４９及び１８４から１８６（１Ｓ５軽鎖ＣＤＲ）に記載されているアミノ酸配列の何れかに対して１つ又は２つの修飾を含む配列を含む。
抗体１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１のそれぞれの完全長軽鎖及び重鎖に対するｃＤＮＡ及びアミノ酸配列も提供される。抗体１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、２３Ｆ１１、２６Ｆ１１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４及び１Ｓ５の完全長軽鎖（定常領域を含む。）をコードするｃＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号１９７、２０８、２１９、２３０、２４１、２５２、２５６、２６０、２６４、２１７、２２８、２３９及び２５０に記載されている。抗体１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、２３Ｆ１１、２６Ｆ１１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４及び１Ｓ５の完全長軽鎖（定常領域を含む。）のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１９８（その残基１から２０はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２０９（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２２０（その残基１から２０はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２３１（その残基１から２０はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２４２（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２５３（その残基１から２０はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２５７（その残基１から２０はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２６１（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２６５（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２１８（その残基１から２２はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２２９（その残基１から２２はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２４０（その残基１から２２はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）及び２５１（その残基１から２２はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）に記載されている。
抗体１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、２３Ｆ１１、２６Ｆ１１及び１Ｓ１の完全長重鎖（定常領域を含む。）をコードするｃＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号１９９、２１０、２２１、２３２、２４３、２５４、２５８、２６２、２６６及び２０６に記載されている。抗体１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、２３Ｆ１１、２６Ｆ１１及び１Ｓ１の完全長重鎖（定常領域を含む。）のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２００（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２１１（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２２２（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２３３（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２４４（シグナルペプチドなし）、２５５（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２５９（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２６３（その残基１から２０はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２６７（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）及び２０７（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）に記載されている。
本発明の幾つかの実施形態において、抗体は、配列番号２０７のアミノ酸２０から４６７（１Ｓ１重鎖）及び配列番号２２０のアミノ酸２１から２３４（１Ｓ１１軽鎖）又は配列番号２３３のアミノ酸２０から４６６（１Ｓ２重鎖）及び配列番号２１８のアミノ酸２３から２３４（１Ｓ２軽鎖）又は配列番号２５５のアミノ酸２０から４６６（１Ｓ３重鎖）及び配列番号２２９のアミノ酸２３から２３４（１Ｓ３軽鎖）又は配列番号２５９のアミノ酸２０から４６６（１Ｓ４重鎖）及び配列番号２４０のアミノ酸２３から２３４（１Ｓ４軽鎖）又は配列番号２６７のアミノ酸２０から４６６（１Ｓ５重鎖）及び配列番号２５１のアミノ酸２３から２３４（１Ｓ５軽鎖）を含む。
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体（抗体という用語は、本明細書に定義されているとおりである。）を表す。すなわち、該集団を構成する各抗体は、ハイブリドーマから産生されたか、又は組換えＤＮＡ技術から産生されたかを問わず、僅かな量で存在し得る可能性がある天然に存在する変異あるいは翻訳後修飾を除いて同一である。モノクローナル抗体の非限定的な例には、マウス、ウサギ、ラット、ニワトリ、キメラ、ヒト化又はヒト抗体、完全に組み立てられた抗体、多重特異的抗体（二重特異的抗体を含む。）、抗原を結合することができる抗体断片（Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディを含む。）、マキシボディ、ナノボディ及び所望の生物活性を示す限りにおいて前述のものを含む組換えペプチド又はこれらの変形物若しくは誘導体が含まれる。抗体配列をよりヒト様であるようにヒト化又は修飾することは、例えば、「Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２ ５２５ （１９８６）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１ ６８５５ （１９８４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５ ９２ （１９８８）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ １５３６ （１９８８）； Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎ． ２８：４８９ ４９８ （１９９１）； Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９ ２１７ （１９９４）； ａｎｄ Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，ＣＡ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３ ８３ （１９９１）； Ｃｏ，Ｍ． Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５−８１４ （１９９４）；」（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。ヒトモノクローナル抗体を単離するための１つの方法は、ファージディスプレイ技術の使用である。ファージディスプレイは、例えば、「Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７，ａｎｄ Ｃａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）」（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。ヒトモノクローナル抗体を単離するための別の方法は、内在的な免疫グロブリン産生を有さず、ヒト免疫グロブリン遺伝子坐を含有するように操作されたトランスジェニック動物を使用する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８ （１９９３）； Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３ （１９９３）；ＷＯ９１／１０７４１，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９８／２４８９３又は米国特許出願公開２００３０１９４４０４号、２００３００３１６６７号又は２００２０１９９２１３号（各々、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から同定され、及び分離されている抗体（抗体という用語は本明細書に定義されているとおりである。）を表す。その天然環境の夾雑成分は、抗体に対する診断又は治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン及びその他のタンパク質又は非タンパク質性溶質が含まれ得る。ある種の実施形態において、抗体は、（１）抗体の９５重量％超まで、最も好ましくは、９９重量％超まで、（２）Ｎ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クマシーブルー又は好ましくは、銀染色を用いた、還元若しくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一状態まで精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離された天然に存在する抗体には、組換え細胞内のインシチュ抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
「免疫グロブリン」又は「固有抗体」は、四量体の糖タンパク質である。天然に存在する免疫グロブリンにおいて、各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０から７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に必要とされる、約１００から１１０又はそれ以上のアミノ酸の「可変」（「Ｖ」）領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主として、エフェクター機能のために必要とされる定常領域を規定する。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスへ割り当てることができる。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）及びイプシロン（ε）として分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして、抗体イソタイプを規定する。これらの幾つかは、サブクラス又はイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２へさらに分割され得る。異なるイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３イソタイプは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖として分類される。軽鎖及び重鎖内において、可変及び定常領域は、約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって（重鎖は、約１０より多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。）連結されている。一般に、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））」を参照されたい。
アロタイプは、免疫原性であり得及びヒトでは特定の対立遺伝子によってコードされる抗体配列中の（しばしば、定常領域中の）変動である。アロタイプは、ヒトＩＧＨＣ遺伝子、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＡ２及びＩＧＨＥ遺伝子の５つに対して同定されており、それぞれ、Ｇ１ｍ、Ｇ２ｍ、Ｇ３ｍ、Ａ２ｍ及びＥｍアロタイプと表記される。少なくとも１８のＧｍアロタイプが知られている。ｎＧ１ｍ（１）、ｎＧ１ｍ（２）、Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）又はＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）。Ａ２ｍ（１）及びＡ２ｍ（２）という２つのＡ２ｍアロタイプが存在する。
抗体の構造及び作製の詳しい説明に関しては、「Ｒｏｔｈ，Ｄ．Ｂ．，ａｎｄＣｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．，Ｃｅｌｌ，９４：４１１−４１４（１９９８）」（参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。要約すれば、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡを作製するための過程は、主として、発達しているＢ細胞中で起こる。様々な免疫グロブリン遺伝子セグメントの再配置および連結の前に、Ｖ、Ｄ、Ｊ及び定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、一般に、単一の染色体上に相対的に極めて近接して見出される。Ｂ細胞の分化の間、Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントの（又は軽鎖遺伝子の場合には、Ｖ及びＪのみ）適切なファミリーメンバーのそれぞれの一つは、重及び軽免疫グロブリン遺伝子の機能的に再配置された可変領域を形成するために組み換えられる。この遺伝子セグメントの再配置過程は、逐次的であるようである。まず、重鎖ＤからＪへの連結が行われ、続いて、重鎖ＶからＤＪへの連結及び軽鎖ＶからＪへの連結が行われる。Ｖ、Ｄ及びＪセグメントの再配置の他に、軽鎖中のＶ及びＪセグメントが連結され、並びに重鎖のＤ及びＪセグメントが連結されている位置での可変的組み換えによって、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の一次レパートリー中にさらなる多様性が生成される。軽鎖中のこのような変動は、Ｖ遺伝子セグメントの最後のコドン及びＪセグメントの最初のコドン内で典型的に起こる。連結における同様の不正確さは、ＤとＪＨセグメントの間で重鎖染色体上において起こり、最大１０ヌクレオチドにわたって伸展し得る。さらに、ＤとＪＨの間に、及びＶＨとＤ遺伝子セグメントの間に、ゲノムＤＮＡによってコードされていない幾つかのヌクレオチドが挿入され得る。これらのヌクレオチドの付加は、Ｎ領域多様性として知られている。このような連結の間に起こり得る可変領域遺伝子セグメント中のこのような再配置及び可変的組み換えの正味の効果は、一次抗体レパートリーの産生である。
「超可変」領域という用語は、軽鎖可変ドメイン中の相補性決定領域又はＣＤＲ（すなわち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）によって記載されているように、残基２４から３４（Ｌ１）、５０から５６（Ｌ２）及び８９から９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の３１から３５（Ｈ１）、５０から６５（Ｈ２）及び９５から１０２（Ｈ３））から得られるアミノ酸残基を表す。単一のＣＤＲさえ、抗原を認識及び結合し得るが、ＣＤＲの全てを含有する抗原結合部位全体より低い親和性で結合する。
超可変「ループ」から得られる残基の別の定義が、軽鎖可変ドメイン中の残基２６から３２（Ｌ１）、５０から５２（Ｌ２）及び９１から９６（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の２６から３２（Ｈ１）、５３から５５（Ｈ２）及び９６から１０１（Ｈ３）として、「Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）」によって記載されている。
「フレームワーク」又はＦＲ残基は、超可変領域残基以外の可変領域残基である。
「抗体断片」は、完全な状態の免疫グロブリン、好ましくは、完全な状態の抗原結合又は可変領域の一部を含み、抗体断片から形成された多重特異的（二重特異的、三重特異的など）抗体が含まれる。免疫グロブリンの断片は、組換えＤＮＡ技術によって、又は完全な状態の抗体の酵素的若しくは化学的切断によって作製され得る。
抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ（可変領域）、ドメイン抗体（ｄＡｂ、ＶＨドメインを含有する。）（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６，１９８９）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ、単一のポリペプチド鎖上にＶＨ及びＶＬドメインを含有し（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６，１９８８，ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３，１９８８、ポリペプチドリンカーを場合によって含み、場合によって多重特異的、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４））、一本鎖抗体断片、ダイアボディ（別の鎖の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと対を形成する単一のポリペプチド鎖上のＶＨ及びＶＬドメイン）（ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３））、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ（ペプチドリンカー（ヒンジなし）を介して、又はＩｇＧヒンジを介して、ＣＨ３に融合されたｓｃＦｖ）（Ｏｌａｆｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｃｉ．２００４ Ａｐｒ；１７（４）：３１５−２３）、直鎖抗体（直列Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；キレート化組換え抗体（ｃｒＡｂ、同じ抗原上の２つの隣接するエピトープへ結合することができる。）（Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５）、バイボディ（二重特異的Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）又はトリボディ（三重特異的Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２））（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−５７，２０００；Ｗｉｌｌｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７８６：１６１−７６，２００３）、抗体を細胞内に保持又は誘導する細胞シグナル配列も含み得る（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ １４：１５４２−５１，１９９５；Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７：１７３３−５，２００３）イントラボディ（Ｂｉｏｃｃａ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．９：１０１−１０８，１９９０；Ｃｏｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ ＳｃｉＵＳＡ．１０１：１７６１６−２１，２００４）、トランスボディ（ｓｃＦｖへ融合されたタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含有する細胞透過性抗体（Ｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５−８，２００５）、ナノボディ（重鎖の約１５ｋＤａ可変ドメイン）（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４：２８５３−５７，２００４）、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ；ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＷＯ０３／０４１６００、米国特許公開２００３０１３３９３９号及び米国特許公開２００３０１１８５９２）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、（ＶＨが、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する定常領域と再結合している）ラクダ化された（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０，２００１；Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：３６２８−３６，２００２；米国特許公開２００５０１３６０４９号及び２００５００３７４２１号）、ＶＨＨ含有抗体、重鎖抗体（ＨＣＡｂｓ、構造Ｈ２Ｌ２を有する２つの重鎖のホモ二量体）又はこれらの変形物若しくは誘導体及び抗体が所望の生物活性を保持している限り、ＣＤＲ配列などの、ポリペプチドへの特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが含まれる。
抗体とともに使用される「変形物」という用語は、可変領域中又は可変領域と同等の部分中に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は挿入を含有する抗体のポリペプチド配列を表す（但し、変形物は所望の結合親和性又は生物活性を保持する。）。さらに、本明細書に記載されている抗体は、半減期又はクリアランス、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を含む、抗体のエフェクター機能を修飾するために、定常領域中にアミノ酸修飾を有し得る。このような修飾は、例えば、薬物動態を強化し、又は癌を治療する上での抗体の有効性を強化することができる。「Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）」（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。ＩｇＧ１の場合には、定常領域、特に、ヒンジ又はＣＨ２領域に対する修飾は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を含むエフェクター機能を増加又は減少させ得る。他の実施形態において、ＩｇＧ２定常領域は、抗体抗原凝集物の形成を減少させるために修飾される。ＩｇＧ４の場合には、定常領域、特に、ヒンジ領域に対する修飾は、半抗体の形成を低減させ得る。
本明細書に記載されている抗体又はポリペプチドに関連して使用される「修飾」という用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸の変化（置換、挿入又は欠失を含む。）、ヘプシジン結合活性を妨害しない化学的修飾、治療剤又は診断剤への連結による共有結合的修飾、（例えば、放射性核種又は様々な酵素での）標識、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールでの誘導化）などの共有的ポリマー付着及び非天然アミノ酸の化学的合成による挿入又は置換を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本発明の修飾されたポリペプチド（抗体を含む。）は、本発明の修飾されていない分子の結合特性を保持する。
本発明の抗体又はポリペプチドに関連して使用される「誘導体」という用語は、治療剤又は診断剤への連結、（例えば、放射性核種又は様々な酵素での）標識、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールでの誘導化）などの共有的ポリマー付着及び非天然アミノ酸の化学的合成による挿入又は置換によって共有的に修飾された抗体又はポリペプチドを表す。幾つかの実施形態において、本発明の誘導体は、本発明の誘導化されていない分子の結合特性を保持する。
二重特異的抗体又は他の多重特異的抗体を作製するための方法は本分野において公知であり、化学的架橋、ロイシンジッパーの使用［Ｋｏｓｔｅｉｎｙ ｅｌ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３，１９９２］；ダイアボディ技術［Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−４８，１９９３］；ｓｃＦｖ二量体［Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８，１９９４］、直鎖抗体［Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７−６２，１９９５］；及びキレート化組換え抗体［Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＭｏｌＢｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５］が含まれる。
従って、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の１つ、２つ及び／又は３つのＣＤＲを含む様々な組成物は、本分野において公知の技術によって作製され得る。
抗体の組換え生産
宿主細胞によって認識される調節配列へ場合によって作用可能に連結された、本明細書に記載されているモノクローナル抗体をコードする単離された核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、並びに核酸が発現されるように宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞培養又は培地から場合によって抗体を回収することを含み得る、抗体を生産するための組換え技術も提供される。
目的の免疫グロブリンから得られる適切なアミノ酸配列は、直接的なタンパク質の配列決定によって決定され得、汎用コドン表に従って、適切なコードヌクレオチド配列を設計することができる。あるいは、モノクローナル抗体をコードするゲノム又はｃＤＮＡは、慣用の手法を用いて、（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子へ特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）このような抗体を産生する細胞から単離及び配列決定され得る。
クローニングは、標準的な技術を用いて実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（参照により、本明細書に組み込まれる。）参照）。例えば、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは膜に会合したｍＲＮＡの逆転写によって、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に対して特異的なプローブを用いてライブラリーをスクリーニングし得る。しかしながら、一実施形態において、目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖又は重鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（又は完全長ｃＤＮＡの一部）を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用される。増幅された配列は、あらゆる適切なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター又はファージディスプレイベクター中へ容易にクローニングすることができる。目的の免疫グロブリンポリペプチドのある一部の配列を決定することが可能であれば、使用される具体的なクローニングの方法は重要ではないことが理解される。
１つの抗体核酸源は、目的の抗原で免疫化された動物からＢ細胞を取得し、これを不死化細胞へ融合することによって産生されたハイブリドーマである。あるいは、免疫化された動物のＢ細胞（又は脾臓全体）から、核酸を単離することができる。抗体をコードする核酸のさらに別の源は、例えば、ファージディスプレイ技術を通じて作製されたこのような核酸のライブラリーである。目的のペプチド（例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、パニングなどの標準的な技術によって同定することができる。
免疫グロブリンポリペプチドの可変領域全体をコードする配列を決定し得る。しかしながら、時には、可変領域の一部、例えば、ＣＤＲをコードする部分のみを配列決定することが十分である。配列決定は、標準的な技術を用いて実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ及びＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７（参照により、本明細書に組み込まれる。）参照）。クローニングされた核酸の配列をヒト免疫グロブリン遺伝子及びｃＤＮＡの公表された配列と比較することによって、配列決定される領域に応じて、当業者は、（ｉ）（重鎖のイソタイプを含む）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチドの生殖系列セグメントの使用並びに（ｉｉ）Ｎ領域の付加及び体細胞変異の過程に起因する配列を含む（重鎖及び軽鎖可変領域の配列）を容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの入手源は、「ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ」である。
本明細書において使用される「単離された」核酸分子又は「単離された」核酸配列は、（１）同定され、当該核酸の天然源中で通常付随している少なくとも１つのきょう雑核酸分子から分離されている核酸分子、又は（２）目的の核酸の配列が決定できるように、クローニングされ、増幅され、タグ付加され、又はその他バックグラウンド核酸から区別されている核酸分子の何れかである。単離された核酸分子は、天然に見出される形態又は状況以外の形態又は状況である。しかしながら、単離された核酸分子には、抗体を通常発現する細胞中に含有され、例えば、天然の細胞の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が含まれる。
一旦単離されたら、ＤＮＡは、発現調節配列へ作用可能に連結され又は発現ベクター中に配置され得、次いで、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を誘導するために、形質移入がなされなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞中に発現調節配列又は発現ベクターが形質移入される。抗体の組換え生産は、本分野において周知である。
発現調節配列は、特定の宿主生物中での作用可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を表す。原核生物に適した調節配列には、例えば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを使用することが知られている。
核酸が、別の核酸配列と、機能的な関連状態に置かれたときに、核酸は作用可能に連結されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーに対するＤＮＡがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されれば、プレ配列若しくは分泌リーダーに対するＤＮＡはポリペプチドに対するＤＮＡへ作用可能に連結されており、プロモーター若しくはエンハンサーが配列の転写に影響を与えれば、プロモーター又はエンハンサーはコード配列へ作用可能に連結されており、又はリボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置されていれば、リボソーム結合部位はコード配列へ作用可能に連結されている。一般に、作用可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを意味し、分泌性リーダーの場合には、連続しており及びリーディングフェーズ中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続しなければならない必要はない。連結は、都合のよい制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合には、慣用の手技に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
多くのベクターが、本分野において公知である。ベクター成分は、以下の１つ又はそれ以上を含み得る。（例えば、抗体の分泌を誘導し得る）シグナル配列、複製起点、（例えば、抗生物質若しくは他の薬物耐性を付与し、栄養要求性の欠乏を補完し、又は培地中で利用できない不可欠な栄養素を供給し得る）１つ又はそれ以上の選択的マーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列（これらの全てが、本分野において周知である。）。
細胞、細胞株及び細胞培養は、しばしば、互換的に使用され、本明細書では、このような表記の全てが子孫を含む。形質転換体及び形質転換された細胞には、一次対象細胞及びこれから誘導された培養（移植の数に関わらない。）が含まれる。故意の変異又は偶発的な変異のために、全ての子孫のＤＮＡ含量が正確に同一であるわけではないことも理解される。当初に形質転換された細胞中でスクリーニングされたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。
典型的な宿主細胞には、原核細胞、酵母又はより高等な真核細胞（すなわち、多細胞生物）が含まれる。原核宿主細胞には、真正細菌（グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（例えば、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などの腸内細菌科並びにＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）及びＢ．リシェニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの桿菌が含まれる。糸状菌又は酵母などの真核微生物は、組換えポリペプチド又は抗体に対する適切なクローニング又は発現宿主である。下等真核宿主微生物のうち、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち、一般的なパン酵母が最も一般的に使用されている。しかしながら、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、例えば、ピー・パストリス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）、スキゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リイシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；及び、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びエー・ニーヂュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びエー・ニガーなどのアスペルギルス宿主などの糸状菌などの、数多くの他の属、種及び系統が一般的に利用可能であり、本発明において有用である。
グリコシル化されたポリペプチド又は抗体を発現させるための宿主細胞は、多細胞生物に由来し得る。無脊椎生物の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変形物並びにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫））、イーデス・アエジプチ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、イーデス・アルボピクタス（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、ドロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）及びボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主から対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。このような細胞の形質移入のための様々なウイルス系統、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変形物及びボンビックス・モリＮＰＶのＢｍ−５系統が公に入手可能である。
脊椎動物宿主細胞も適切な宿主であり、このような細胞からポリペプチド又は抗体を組換え生産することも、定型的な手法となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））などのチャイニーズハムスター卵巣細胞；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児由来腎臓株（懸濁培養中での増殖に関してサブクローニングされた２９３又は２９３細胞［Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）］；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞種細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞若しくはＦＳ４細胞；又は哺乳動物骨髄腫細胞である。
宿主細胞は、抗体産生のために上記核酸又はベクターで形質転換又は形質移入され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切なように改変された旧来の栄養素培地中で培養される。さらに、選択的マーカーによって隔てられた転写単位の複数コピーを有する新規ベクター及び形質移入された細胞株は、抗体を発現するのに特に有用である。
本明細書中に記載されている抗体を生産するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、「Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；米国特許第４，６５７，８６６号；米国特許第４，９２７，７６２号；米国特許第４，５６０，６５５号；又は米国特許第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０１０３４３０号；ＷＯ８７／００１９５号；又は米国特許再審査３０，９８５号に記載されている培地の何れもが、宿主細胞に対する培地として使用され得る。必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（インシュリン、トランスフェリン又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧｅｎｔａｍｙｃｉｎＴＭ薬など）、微量元素（μＭ域の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される。）及びグルコース又は等価なエネルギー源を、これらの培地の何れにも補充し得る。他のあらゆる必要な補充物も、当業者に公知の適切な濃度で含め得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に使用されていたものであり、当業者に自明である。
宿主細胞を培養すると、抗体は、細胞内に、細胞膜周辺腔中に産生され得、又は培地中へ直接分泌され得る。第一の工程として、抗体が細胞内に産生される場合、例えば、遠心又は限外ろ過によって、粒状の破砕物（宿主細胞又は溶解された断片の何れか）が除去される。
例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、陽イオン若しくは陰イオン交換クロマトグラフィー、又は好ましくは、アフィニティーリガンドとして、目的の抗原若しくはプロテインＡ若しくはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーを用いて、抗体を精製することができる。ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖を基礎とする抗体を精製するために、プロテインＡを使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドに付着されたマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。制御されたポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの力学的に安定なマトリックスは、アガロースで達成されるより速い流速及び短い処理時間を可能とする。抗体はＣＨ３ドメインを含む場合には、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ．）が精製のために有用である。回収されるべき抗体に応じて、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術も可能である。
キメラ及びヒト化抗体
キメラ又はヒト化は、親げっ歯類モノクローナル抗体より、ヒトにおいてより低免疫原性であり、ずっと低いアナフィラキシーのリスクで、ヒトの治療のために使用することができる。従って、ヒトへのインビボ投与を含む治療的用途において、これらの抗体が想定される。
例えば、単独で、又は連結体として、ヒトにインビボ反復投与されると、マウス抗体は、レシピエント中に免疫応答をもたらす（ＨＡＭＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）応答と称される場合がある。）。反復投薬が必要な場合、ＨＡＭＡ応答は、医薬の有効性を制限し得る。ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマーでの抗体の化学的修飾によって、又は抗体結合構造をよりヒト様にするために、遺伝子工学の方法を使用することによって、抗体の免疫原性を低下させ得る。
本明細書において使用される「キメラ抗体」という用語は、通例、異なる種を起源とする２つの異なる抗体に由来する配列を含有する抗体を表す。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒト定常Ｉｇドメインに融合されたげっ歯類モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインを含む。このような抗体は、本分野において公知の標準的な手法を用いて作製することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１，６８４１−６８５５；及びＢｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６４３−６４６（１９８４）参照）。幾つかのキメラモノクローナル抗体は、ヒトにおいてより低い免疫原性を示すことが明らかとなっているが、げっ歯類の可変Ｉｇドメインは、なお、著しいヒト抗げっ歯類応答をもたらし得る。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト抗体、典型的には、げっ歯類モノクローナル抗体に由来する抗体を表す。あるいは、ヒト化抗体は、キメラ抗体から誘導され得る。
例えば、（１）ヒトフレームワーク及び定常領域上に非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植する（本分野において、「ＣＤＲ移植」を通じたヒト化と称される工程）、あるいは（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様表面でこれを「覆い隠す」（本分野において「ベニアリングと称される工程」）など、様々な方法によって、ヒト化抗体を達成し得る。これらの方法は、例えば、「Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２ ５２５（１９８６）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１ ６８５５（１９８４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５ ９２（１９８８）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ １５３６（１９８８）； Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９ ４９８（１９９１）； Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９ ２１７（１９９４）； ａｎｄ Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３ ８３（１９９１）」（これらの各々の全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）中に開示されている。
ＣＤＲ移植は、ヒト可変Ｉｇドメインの適切なフレームワーク領域中にマウス重鎖及び軽鎖可変Ｉｇドメイン由来の６つのＣＤＲの１つ又はそれ以上を導入することを含む。この技術（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３（１９８８））は、抗原との主要な接触であるＣＤＲループを支える足場として、保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１−ＦＲ４）を使用する。しかしながら、フレームワーク領域のアミノ酸は抗原結合に寄与することができ、ＣＤＲループのアミノ酸が２つの可変Ｉｇドメインの会合に影響を与えることができるので、ＣＤＲ移植の著しい欠点は、元のマウス抗体より大幅に低い結合親和性を有するヒト化抗体をもたらし得ることである。ヒト化されたモノクローナル抗体の親和性を維持するために、元のマウス抗体のフレームワーク領域に最も似たヒトフレームワーク領域を選択することによって、及び抗原結合部位のコンピュータモデル化による補助を受けた、フレームワーク又はＣＤＲ内の単一のアミノ酸の位置指定突然変異誘発によって、ＣＤＲ移植技術を改善することができる（例えば、Ｃｏ，Ｍ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６）。
ヒト化抗体の１つの方法は、ヒト重鎖及び軽鎖配列へ非ヒト重鎖及び軽鎖配列を並置すること、このような並置に基づいて、非ヒトフレームワークを選択し、ヒトフレームワークで置換すること、ヒト化された配列の立体構造を予測するために分子モデル化を行うこと、並びに親抗体の立体構造を比較することを含む。この工程に続いて、ヒト化された配列モデルの予想される立体構造が親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲの立体構造に密接に近似されるまで、ＣＤＲの構造を妨害するＣＤＲ領域中の残基を繰り返し逆変異する。このようなヒト化抗体は、例えば、Ａｓｈｗｅｌｌ受容体を介した、取り込み及びクリアランスを促進させるために、さらに誘導化され得る（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号及び米国特許第５，５８５，０８９号参照）。
合理的設計によるマウスモノクローナル抗体の多数のヒト化が報告されている（例えば、２００２年７月１１日に公開された２００２００９１２４０、ＷＯ９２／１１０１８及び米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，７６６，８６６号参照）。
Ｈｕｍａｎ ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体
「Ｈｕｍａｎ ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体」という用語は、非ヒト抗体、典型的には、げっ歯類モノクローナル抗体又は可能であればキメラ抗体に由来する抗体を表す。抗体可変ドメインのＨｕｍａｎ ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴＭが、抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を低下させるための方法として、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ［例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，７６６，８８６号；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７：８０５−８１４（１９９４）参照］によって記載されている。この方法に従えば、各可変領域アミノ酸に、置換のリスクが割り当てられる。アミノ酸置換は、３つのリスクカテゴリーの１つによって区別される。（１）低リスク変化は、免疫原性を低下させる可能性が最も大きく、抗原結合を崩壊させる確率が最も低い変化であり、（２）中リスク変化は、免疫原性をさらに低下させるが、抗原結合又はタンパク質の折り畳みに影響を及ぼす確率がより大きい変化であり、（３）高リスク残基は、結合のために又は抗体構造を維持するために重要であり、抗原結合又はタンパク質の折り畳みが影響を受ける最も高いリスクを有する残基である。プロリンの三次元構造における役割のために、その位置が、典型的には低リスク位置である場合でさえ、プロリンの修飾は、少なくとも中リスク変化であると一般に考えられる。
抗原結合又はタンパク質の折りたたみの何れかに悪影響を及ぼす可能性が少ないが、ヒト環境中での免疫原性を低下させる可能性があることが決定された位置のヒトアミノ酸を置換することによって、げっ歯類抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域をＨｕｍａｎ ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭとすることができる。個別のＶＨ若しくはＶＬ配列又はヒトコンセンサスＶＨ若しくはＶＬ配列又は個別の若しくはコンセンサスヒト生殖系列配列を含むあらゆるヒト可変領域を使用することができるが、置換の数を最小限に抑えるために、げっ歯類配列に対して最も高い同一性又は相同性を有するヒト配列が一般に使用される。低リスク位置のあらゆる数のアミノ酸残基又は低リスク位置の全てのアミノ酸残基を変化させることができる。例えば、並置されたマウス及びヒトアミノ酸残基が異なる各低リスク位置において、げっ歯類残基をヒト残基と置換するアミノ酸修飾が導入される。さらに、中リスク位置のあらゆる数の又は全てのアミノ酸残基を変化させることができる。典型的な実施形態において、低及び中リスク位置の全てが、げっ歯類配列からヒト配列へ変化される。
修飾された重鎖及び／又は軽鎖可変領域を含有する合成遺伝子が構築され、ヒトγ重鎖及び／又はκ軽鎖定常領域へ連結される。あらゆるクラス又はサブクラスのあらゆるヒト重鎖及び軽鎖定常領域を、Ｈｕｍａｎ ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体可変領域と組み合わせて使用し得る。
ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように操作されたトランスジェニック動物から得た抗体
ヘプシジンに対する抗体は、内在性免疫グロブリン産生を有さず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように操作されたトランスジェニック動物を用いて生産することも可能である。例えば、ＷＯ９８／２４８９３号は、内在性重鎖及び軽鎖遺伝子座の不活化のために、動物が機能的な内在性免疫グロブリンを産生しないヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示する。ＷＯ９１／７４１は、抗体が霊長類定常及び／又は可変領域を有し、並びに内在性免疫グロブリンをコードする遺伝子座が置換又は不活化されている、免疫原に対する免疫応答を引き起こすことができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主も開示している。ＷＯ９６／３０４９８号は、定常又は可変領域の全部又は一部を置換して修飾された抗体分子を形成するためなど、哺乳動物中免疫グロブリン遺伝子座を修飾するためにＣｒｅ／Ｌｏｘ系を使用することを開示している。ＷＯ９４／０２６０２号は、不活化された内在性Ｉｇ遺伝子座及び機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示している。米国特許第５，９３９，５９８号は、マウスが内在性の重鎖を欠如し、及び１つ又はそれ以上の異種性定常領域を含む外来性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを作製する方法を開示している。
上記トランスジェニック動物を使用して、選択された抗原性分子に対して免疫応答を生産することができ、抗体産生細胞を動物から取り出し、ヒト由来のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するために使用することができる。免疫化プロトコール、アジュバントなどが本分野において公知であり、例えば、ＷＯ９６／３３７３５号に記載されているように、トランスジェニックマウスの免疫化において使用されている。対応するタンパク質の生物活性又は生理的効果を阻害又は中和する能力に関して、モノクローナル抗体を検査することができる。
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）； Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；並びに米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号；及び米国特許出願２００２０１９９２１３号も参照されたい。米国特許出願２００３００９２１２５号は、動物の免疫応答を所望のエピトープに偏らせる方法を記載している。ヒト抗体は、インビトロ活性化されたＢ細胞によっても作製され得る（米国特許第５，５６７，６１０号及び米国特許第５，２２９，２７５号参照）。
ファージディスプレイ技術による抗体作製
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製し、糸状バクテリオファージの表面上に、コードされている抗体断片をディスプレイするための技術の発達は、ヒト由来の抗体を作製するための別の手段を提供してきた。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７、及び「Ｃａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）」（これらの各々の全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。ファージ技術によって作製される抗体は、通常、抗原結合断片（例えば、Ｆｖ又はＦａｂ断片）として、細菌中で生産され、従って、エフェクター機能を欠如する。エフェクター機能は、２つの戦略のうちの１つによって導入することができる。哺乳動物細胞中での発現のための完全な抗体へと、又はエフェクター機能の引き金を引くことができる第二の結合部位を有する二重特異的抗体断片へと断片を操作することができる。
典型的には、ＰＣＲによって、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）を別々にクローニングし、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリー中でランダムに再結合し、次いで、特定の抗原への結合に関してこれを選択することができる。抗体断片をファージ表面上に発現し、抗原結合及び再増幅の数巡（パニングと称される操作）を通じて、抗原結合によるＦｖ又はＦａｂ（従って、抗体断片をコードするＤＮＡを含有するファージ）の選択が達成される。抗原に対して特異的な抗体断片が濃縮され、最終的に単離される。
ファージディスプレイ技術は、「ガイドされた選択」と称される、げっ歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチにおいても使用することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２，８９９−９０３（１９９４）参照）。このために、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片をディスプレイすることが可能であり、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーは、次いで、抗原を用いて選択され得る。これによって、マウスＦｄ断片は、選択を誘導するための鋳型を提供する。その後、選択されたヒト軽鎖は、ヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わされる。得られたライブラリーの選択は、完全なヒトＦａｂを与える。
ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を得るための様々な手法が記載されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）；米国特許第５，５６５，３３２号及び米国特許第５，５７３，９０５号；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ＴＩＢＴＥＣＨ １２，１７３−１８４（１９９４）参照）。特に、ファージディスプレイライブラリーから得られた抗体のインビトロでの選択及び進化は、強力なツールとなっている（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ ＢａｒｂａｓＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７，１９１−２８０（１９９４）；及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３−４５５（１９９４）；米国特許出願第２００２０００４２１５号及びＷＯ９２／０１０４７号；２００３年１０月９日に公開された米国特許出願第２００３０１９０３１７号及び米国特許第６，０５４，２８７号；米国特許第５，８７７，２９３号参照）。
「Ｗａｔｋｉｎｓ，“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｌｉｆｔ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １７８：１８７−１９３」及び２００３年３月６日に公開された米国特許出願公開２００３００４４７７２号は、キャプチャーリフト（ｃａｐｔｕｒｅ ｌｉｆｔ）（固体支持体上への候補結合分子の固定化を含む方法）によって、ファージによって発現された抗体ライブラリー又はその他の結合分子をスクリーニングするための方法を記載している。
抗体断片
上述されているように、抗体断片は、完全な状態の完全長抗体の一部、好ましくは、完全な状態の抗体の抗原結合又は可変領域を含み、抗体断片には、抗体断片から形成された直鎖抗体及び多重特異的抗体が含まれる。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、直鎖抗体、キレート化組換え抗体、トリボディ又はバイボディ、イントラボディ、ナノボディ、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化された抗体、ＶＨＨ含有抗体、又は変異タンパク質若しくはその誘導体、又は抗体が所望の生物活性を保持している限り、ＣＤＲ配列など、ポリペプチドへの特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが含まれる。このような抗原断片は、完全な抗体の修飾によって作製することができ、又は組換えＤＮＡ技術若しくはペプチド合成を用いて、新規に合成することができる。
「ダイアボディ」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を表す。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合が不可能であるほど短いリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；及び「Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）」中に、より完全に記載されている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在し、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする、ポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメインの間に場合によって含む（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３，１９８８）。Ｆｄ断片は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる。
さらなる抗体断片には、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片が含まれる（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９）。
「直鎖抗体」は、抗原結合領域の一対を形成する直列Ｆｄセグメントの一対を含む（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖抗体は、二重特異的又は単一特異的であり得る（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７−６２（１９９５））。
ペプチドリンカー（ヒンジなし）を介して、又はＩｇＧヒンジを介してＣＨ３へ融合されたｓｃＦｖからなる「ミニボディ」が、「Ｏｌａｆｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｃｉ．２００４ Ａｐｒ；１７（４）：３１５−２３」に記載されている。
「マキシボディ」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域に共有結合された二価のｓｃＦｖを表し、例えば、「Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１７：９５−１０６（２００４）及びＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５１：１２３−１３５（２００１）」を参照されたい。
軽鎖を欠いた機能的重鎖抗体は、テンジクザメ（ｎｕｒｓｅ ｓｈａｒｋ）、テンジクザメ（ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ ｓｈａｒｋ）並びにラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びラマなどのラクダ科の動物など、動物のある種の中に天然に存在する。抗原結合部位は、これらの動物中において、単一のドメイン、ＶＨＨドメインへ還元される。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成する。すなわち、これらの機能的抗体は、構造Ｈ２Ｌ２のみを有する重鎖のホモ二量体である）（「重鎖抗体」又は「ＨＣＡｂ」と称される。）。報告によれば、ラクダ化されたＶＨＨは、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有し、ＣＨ１ドメインを欠如するＩｇＧ２及びＩｇＧ３定常領域と再結合する。古典的なＶＨのみの断片は可溶性形態で作製することが困難であるが、フレームワーク残基がよりＶＨＨ様であるように変化を受けている場合には、溶解度及び特異的結合の改善を得ることができる（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９９，２３１：２５−３８参照）。ラクダ化されたＶＨＨドメインは、高い親和性で抗原に結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０，２００１）、溶液中で高い安定性（Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：３６２８−３６，２００２）を有することが見出されている。ラクダ化された重鎖を有する抗体を作製する方法は、例えば、米国特許公開第２００５０１３６０４９号及び第２００５００３７４２１号に記載されている。別の足場は、サメのＶ−ＮＡＲ足場とより密接に合致するヒト可変様ドメインから作製することが可能であり、長い貫通するループ構造に対してフレームワークを与え得る。
重鎖抗体の可変ドメインは僅か１５ｋＤａの分子量を有する最も小さな、完全に機能的な抗原結合断片であるので、この実体はナノボディと称されている（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４：２８５３−５７，２００４）。ナノボディライブラリーは、「Ｃｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４５：２８０７−１２，２００１）」に記載されているような免疫化されたヒトコブラクダから作製され得る。
イントラボディは、細胞内発現を示す一本鎖抗体であり、細胞内タンパク質機能を操作することができる（Ｂｉｏｃｃａ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．９：１０１−１０８，１９９０；Ｃｏｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１０１：１７６１６−２１，２００４）。細胞内領域中に抗体構築物を保持する細胞シグナル配列を含むイントラボディは、「Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ ｅｔ ａｌ（ＥＭＢＯ Ｊ１４：１５４２−５１，１９９５）」及び「Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７：１７３３−５．２００３）」に記載されているように作製され得る。トランスボディは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）が一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体と融合されている細胞透過性抗体である（Ｈｅｎｇ他、（ＭｅｄＨｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５−８，２００５））。
さらに、ＳＭＩＰ、すなわち標的タンパク質に対して特異的な結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体が想定される。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を実施するために必要な免疫グロブリンドメインに融合された抗原結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである。例えば、ＷＯ０３／０４１６００、米国特許公開２００３０１３３９３９号及び米国特許公開２００３０１１８５９２号を参照されたい。
多価抗体
幾つかの実施形態において、多価又は多重特異的（例えば、二重特異的、三重特異的など）モノクローナル抗体さえ作製することが望ましい場合があり得る。このような抗体は、標的抗原の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有し得、あるいは、２つの異なる分子に、例えば、標的抗原に及び細胞表面タンパク質若しくは受容体に結合し得る。例えば、二重特異的抗体は、細胞の防御機構を標的発現細胞へ集中させるために、標的に結合するアーム並びにＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２又はＣＤ３）などの白血球上のトリガリング分子又はＦｃγＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などのＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）に結合する別のアームを含み得る。別の例として、標的抗原を発現する細胞へ細胞毒性因子を局在化させるために、二重特異的抗体を使用し得る。これらの抗体は、標的結合アーム及び細胞毒性因子（例えば、サポニン、抗インターフェロン−６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート又は放射性同位体ハプテン）を結合するアームを有する。多重特異的抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
さらに、結合親和性、特異性及び／又は増加した血中半減期を改善させ得る多価形態へ折り畳ませるために、本明細書に開示されている抗ヘプシジン抗体を構築することも可能である。抗ヘプシジン抗体の多価形態は、本分野において公知の技術によって調製することができる。
二重特異的又は多重特異的抗体には、架橋された又は「ヘテロ連結体」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ連結体中の抗体の一方をアビジンに連結し、他方をビオチンに連結させることができる。ヘテロ連結体抗体は、あらゆる都合よい架橋法を用いて作製することができる。適切な架橋剤は本分野において周知であり、多数の架橋技術とともに、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。ストレプトアビジンをコードする配列をｓｃＦｖのＣ末端に付加することによって、四量体を作製するために、別の方法が設計されている。ストレプトアビジンは４つのサブユニットから構成されているので、ｓｃＦｖ−ストレプトアビジンが折り畳まれると、４つのサブユニットは会合して四量体を形成する（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ６（３）：９３−１０１（１９９５）（その開示の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）。
二重特異的抗体を作製するための別のアプローチに従えば、組換え細胞培養から回収されたヘテロ二量体のパーセントを最大化するために、抗体分子の対間の界面を操作することができる。１つの界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一の抗体分子の界面から得られる１つ又はそれ以上の小さなアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）と置換することによって、第二の抗体分子の界面上に、大きな側鎖と同一又は類似の大きさの代償的「空洞」が作出される。これは、ホモ二量体などの望ましくない他の最終産物に比べてヘテロ二量体の収率を増加させる機序を与える。１９９６年９月６日に公開されたＷＯ９６／２７０１１号を参照されたい。
抗体断片から二重特異的又は多重特異的抗体を作製するための技術も、文献中に記載されている。例えば、化学的連結を用いて、二重特異的抗体又は三重特異的抗体を調製することができる。「Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：８１（１９８５）」は、Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するために、完全な状態の抗体がタンパク分解的に切断される手法を記載している。これらの断片は、近接するジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止するために、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。次いで、作製されたＦａｂ’断片はチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体へ転化される。次いで、メルカプトエチルアミンを用いた還元によって、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをＦａｂ’−チオールへ再度転化させ、二重特異的抗体を形成させるために、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合する。産生された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための因子として使用することができる。「Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）」は、細菌からの機能的抗体断片の分泌を開示している（例えば、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４１（１９８８）参照）。例えば、Ｆａｂ’―ＳＨ断片は、二重特異的抗体を形成するために、イー・コリから直接回収され、化学的に連結することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）；Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２））。
「Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）」は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製を記載する。各Ｆａｂ’断片は、イー・コリから別々に分泌され、二重特異的抗体を形成するために、インビトロでの誘導された化学的結合に供される。このようにして形成された二重特異的抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞及び正常なヒトＴ細胞に結合することができるとともに、ヒト乳癌標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性の引き金を引くことができた。
組換え細胞培養から直接二重特異的又は多重特異的抗体断片を作製及び単離するための様々な技術も記載されている。例えば、ロイシジンジッパーを用いて、二重特異的抗体、例えば、ＧＣＮ４が生産されてきた（全般的には、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２））。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。単量体を形成するために、ヒンジ領域において抗体ホモ二量体を還元し、次いで、抗体ヘテロ二量体を形成するために再酸化した。この方法は、抗体ホモ二量体の生産のためにも使用することができる。
上記されているダイアボディは、二重特異的抗体の一例である。例えば、「Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）」を参照されたい。二価のダイアボディは、ジスルフィド結合によって安定化することができる。
安定な単一特異的又は二重特異的Ｆｖ四量体は、（ｓｃＦｖ２）２立体配置での非共有的会合によって、又はビス−テトラボディとして作製することも可能である。あるいは、ビス−ｓｃＦｖを形成するために、２つの異なるｓｃＦｖを直列に連結することができる。
一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異的抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。「Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）」を参照されたい。１つのアプローチは、リンカー又はジスルフィド結合を用いて、２つのｓｃＦｖ抗体を連結することである（Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９９−２０６１９９４，ＷＯ９４／１３８０６及び米国特許第５，９８９，８３０号（これらの開示の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。）。
あるいは、二重特異的抗体は、「Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）」に記載されているように作製された「直鎖抗体」であり得る。簡潔に述べると、これらの抗体は、抗原結合領域の一対を形成する直列Ｆｄセグメントの一対を含む（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）。直鎖抗体は、二重特異的又は単一特異的であり得る。
３以上の価数を有する抗体も想定される。例えば、三重特異的抗体を調製することができる。（Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））。
「キレート化組換え抗体」は、標的抗原の隣接する重複していないエピトープを認識し、両エピトープへ同時に結合するのに十分な柔軟性を有する二重特異的抗体である（Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５）。
二重特異的Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「バイボディ」）及び三重特異的Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディ」）の作製は、「Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．（ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−５７，２０００）」及び「Ｗｉｌｌｅｍｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７８６：１６１−７６，２００３）」に記載されている。バイボディ又はトリボディに関して、ｓｃＦｖ分子は、ＶＬ−ＣＬ（Ｌ）及びＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖の一方又は両方に融合される。例えば、トリボディを作製するために、２つのｓｃＦｖはＦａｂのＣ末端に融合されるのに対して、バイボディにおいて、１つのｓｃＦｖはＦａｂのＣ末端に融合される。
さらに別の方法では、遊離のシステインが親タンパク質中に導入された後に、二量体、三量体及び四量体が作製される。目的のタンパク質を遊離のシステインに架橋するために、マレイミド基の可変数（２から４）を有する、ペプチドをベースとする架橋剤が用いられた（Ｃｏｃｈｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２（３）：２４１−５０（２０００）（その開示全体が、本明細書中に組み込まれる。）。
抗体スクリーニング法
ヘプシジンを結合し、本明細書中の典型的な抗体を交叉遮断し、及び／又はヘプシジン活性を阻害する抗体を同定する方法も提供される。このような方法は、本明細書中に挙げられている（化学的に合成され、又は細菌若しくは非哺乳動物細胞中で産生された）高度に精製され、生物活性を有し、正しく折り畳まれた非尿性ヒトヘプシジンの組成物を使用し得る。
抗体は、本分野において公知の方法によって、結合親和性に関してスクリーニングされ得る。例えば、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射性標識された競合アッセイ、クロマトグラフィーによる同時分画、同時沈殿、架橋、ＥＬＩＳＡなどを使用することができ、これらは、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ」（参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。）中に記載されている。
まず、標的抗原上の所望のエピトープに結合する抗体に関してスクリーニングするために、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）」中に記載されているような定型的な交叉遮断アッセイを行うことができる。本発明の標的特異的抗体への標的の結合を阻害する能力によって、未知の抗体が特徴付けられる定型的な競合結合アッセイも使用され得る。完全な状態の抗原、細胞外ドメインなどのその断片又は直鎖エピトープを使用することができる。エピトープマッピングは、「Ｃｈａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）」中に記載されている。
インビトロ結合アッセイの１つの変法において、（ａ）固定化されたヘプシジンを候補抗体と接触させること、及び（ｂ）ヘプシジンへの候補抗体の結合を検出することを含む方法が提供される。別の実施形態では、候補抗体が固定化され、ヘプシジンの結合が検出される。固定化は、支持体、ビーズ又はクロマトグラフィーの樹脂への共有結合、抗体結合などの非共有高親和性相互作用又は固定化された化合物がビオチン部分を含む、ストレプトアビジン／ビオチン結合の使用など、本分野において周知の方法の何れかを用いて達成される。結合の検出は、（ｉ）固定化されていない化合物上の放射性標識を用いて、（ｉｉ）固定化されていない化合物上の蛍光標識を用いて、（ｉｉｉ）固定化されていない化合物に対して免疫特異的な抗体を用いて、（ｉｖ）固定化された化合物が付着されている蛍光性支持体を励起させる固定化されていない化合物上の標識を用いて、並びに本分野において周知であり、日常的に実施されている他の技術を用いて達成することができる。
ヒトヘプシジン活性を阻害又は中和する抗体は、ヘプシジンを抗体と接触させること、被検抗体の存在下及び不存在下でヘプシジン活性を比較すること、並びに抗体の存在がヘプシジンの活性を減少させるかどうかを測定することによって同定され得る。特定の抗体又は抗体の組み合わせの生物活性は、適切な動物モデル（本明細書中に記載されている動物モデルの何れもが含まれる。）を用いて、インビボで評価され得る。
典型的な実施形態において、本発明は、標的抗原の生物活性と相互作用し、又は阻害する（すなわち、リン酸化、二量体化、リガンドによって誘導される受容体の活性化又は細胞内シグナル伝達などを阻害する）抗体を同定するために、高情報処理スクリーニング（ＨＴＳ；ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）アッセイを含む。ＨＴＳアッセイは、多数の化合物のスクリーニングを効率的な様式で可能とする。標的抗原とその結合対の間の相互作用を調べるために、細胞をベースとするＨＴＳシステムが想定される。所望の特性を有し、そこから所望の特性を改善するために修飾を設計することができる「ヒット」又は「リード化合物」を同定するためにＨＴＳアッセイが設計される。
本発明の別の実施形態において、標的抗原ポリペプチドへの適切な結合親和性を有するＣＤＲ内のアミノ酸に対する１、２、３又はそれ以上の修飾を有する抗体断片又はＣＤＲに対する高情報量スクリーニングが使用される。
特異的結合剤
他のヘプシジン特異的結合剤は、例えば、抗体由来のＣＤＲを基礎として、又はヒトヘプシジンに対する所望の結合特性を示すペプチド又は化合物に関して、多様なペプチド又は有機化学化合物のライブラリーをスクリーニングすることによって調製することができる。ヘプシジン特異的結合剤には、マウス抗体Ａｂ４３（配列番号１６から２１）；マウス抗体２．７（配列番号２８から３３）；マウス抗体２．４１（配列番号４０から４５）、ラット抗体Ｒ９（配列番号５２から５７）又はヒト抗体１Ｃ９（配列番号１１１から１１６）、ヒト抗体３Ｂ３（配列番号１２１から１２６）、ヒト抗体４Ｅ１（配列番号１３１から１３６）、ヒト抗体７Ａ３（配列番号１４１から４６）、ヒト抗体９Ｄ１２（配列番号１５１から１５６）、ヒト抗体１２Ｂ９（配列番号１６１から１６６）、ヒト抗体１５Ｅ１（配列番号１７１から１７６）、ヒト抗体１８Ｄ８（配列番号３１４から３１９）、ヒト抗体１９Ｃ１（配列番号３２４から３２９）、ヒト抗体１９Ｄ１２（配列番号２９４から２９９）、ヒト抗体１９Ｈ６（配列番号３０４から３０９）、ヒト抗体２３Ｆ１１（配列番号１８１から１８６）、ヒト抗体２６Ｆ１１（配列番号１９１から１９６）又はヒト抗体１Ｓ１（配列番号２０３から２０５及び１３１から１３３）又はヒト抗体１Ｓ２（配列番号２１４から２１６及び１４４から１４６）又はヒト抗体１Ｓ３（配列番号２２５から２２７及び１６４から１６６）又はヒト抗体１Ｓ４（配列番号２３６から２３８及び１７４から１７６）又はヒト抗体１Ｓ５（配列番号２４７から２４９及び１８４から１８６）の１つ又はそれ以上のＣＤＲと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を含有するペプチドが含まれる。
ヘプシジン特異的結合剤には、ペプチボディも含まれる。「ペプチボディ」という用語は、少なくとも１つのペプチドに付着された抗体Ｆｃドメインを含む分子を表す。ペプチボディの作製は、２０００年５月４日に公開されたＰＣＴ公報ＷＯ００／２４７８２中に、一般的に記載されている。これらのペプチドの何れもが、リンカーを用いて又は用いずに、直列に（すなわち、連続的に）連結され得る。システイン残基を含有するペプチドは、別のＣｙｓ含有ペプチドと架橋され得、これらの一方又は両方がビヒクルに連結され得る。２以上のＣｙｓ残基を有するあらゆるペプチドは、ペプチド内ジスルフィド結合も形成し得る。これらのペプチドの何れもが誘導体化され得る。例えば、カルボキシル末端をアミノ基でキャップすることができ、システインをキャップすることができ、又はアミノ酸残基以外の部分によって、アミノ酸残基を置換し得る（例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９（１９９６）及びＣｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２８７６−８２（１９９７）（これらの全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。）。ペプチド配列は、抗体に対する親和性成熟と同様にして最適化され得、又はアラニンスキャニング若しくは無作為若しくは位置指定突然変異誘発後に、最良の結合物質を同定するためにスクリーニングすることによって、その他改変され得る。Ｌｏｗｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４（１９９７）。特異的結合剤の所望の活性を保持しながら、特異的結合剤構造中に（例えば、ペプチド部分そのものの中に、又はペプチドと特異的結合剤のビヒクル部分との間に）、様々な分子を挿入することができる。例えば、Ｆｃドメイン又はその断片などの分子、ポリエチレングリコール又はデキストランなどの他の関連分子、脂肪酸、脂質、コレステロール基、小炭水化物、ペプチド、本明細書に記載されているような検出可能な部分（蛍光因子、放射性同位体などの放射性標識を含む。）、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、干渉（又はその他の）ＲＮＡ、酵素、ホルモンなどを容易に挿入することができる。この様式での挿入に適した他の分子は当業者によって理解され、本発明の範囲内に包含される。これには、例えば、適切なリンカーにより場合によって連結された２つの連続するアミノ酸の間に所望の分子を挿入することが含まれる。
ヘプシジンペプチボディの開発も想定される。その受容体とのタンパク質リガンドの相互作用は、しばしば、相対的に大きな界面において起こる。しかしながら、ヒト成長ホルモンとその受容体に関して示されたように、界面における２、３の中心的な残基のみが、結合エネルギーの殆どに寄与している。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：３８３−６（１９９５）。タンパク質リガンドの大部分は、結合エピトープを正しい幾何学で提示し、又は結合と無関係な機能を果たすに過ぎない。従って、「ペプチド」長（一般に、２から４０アミノ酸）を有するに過ぎない分子が、ある巨大タンパク質リガンドの受容体タンパク質に結合することができる。このようなペプチドは、巨大なタンパク質リガント（「ペプチドアゴニスト」）の生物活性を模倣し得、又は競合的結合を通じて、巨大なタンパク質リガント（「ペプチドアンタゴニスト」）の生物活性を阻害し得る。
ファージディスプレイ技術は、このようなペプチドアゴニスト及びアンタゴニストを同定する上での強力な方法として登場した。例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４（１９９０）；１９９３年６月２９日に付与された米国特許第５，２２３，４０９号；１９９８年３月３１日に付与された米国特許第５，７３３，７３１号；１９９６年３月１２日に付与された米国特許第５，４９８，５３０号；１９９５年７月１１日に付与された米国特許第５，４３２，０１８号；１９９４年８月１６日に付与された米国特許第５，３３８，６６５号；１９９９年７月１３日に付与された米国特許第５，９２２，５４５号；１９９６年１２月１９日に公開されたＷＯ９６／４０９８７号；及び１９９８年４月１６日に公開されたＷＯ９８／１５８３３号（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。ペプチドファージディスプレイライブラリーにおいて、糸状ファージの外被タンパク質との融合によって、無作為なペプチド配列をディスプレイすることができる。ディスプレイされたペプチドは、所望であれば、抗体によって固定化された、受容体の細胞外ドメインに対してアフィニティー溶出することができる。保持されたファージは、アフィニティー精製と再増殖を連続して繰り返すことにょって濃縮され得る。最も優れた結合ペプチドは、ペプチドの構造的に関連する１つ又はそれ以上のファミリー内の中心的残基を同定するために配列決定され得る。２つの異なるファミリーが同定された、例えば、「Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：１６９６−９（１９９７）」を参照されたい。ペプチド配列は、アラニンスキャニング又はＤＮＡレベルでの突然変異誘発によって、何れの残基が安全に置換され得るかについても示唆し得る。最も優れた結合物質の配列をさらに最適化するために、突然変異誘発ライブラリーを作製し、スクリーニングし得る。Ｌｏｗｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４（１９９７）。
巨大なタンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを推定するために、タンパク質−タンパク質相互作用の構造的分析も使用し得る。このような分析では、結晶構造が、ペプチドがそこから設計され得る巨大なタンパク質リガンドの重要な残基の種類及び相対的配位を示唆し得る。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５：１２６６−７０（１９９７）を参照されたい。これらの分析法は、受容体タンパク質とファージディスプレイによって選択されたペプチドとの間の相互作用を調べるためにも使用され得、結合親和性を増加させるためのペプチドのさらなる修飾を示唆し得る。
他の方法は、ペプチド研究におけるファージディスプレイと競合する。ペプチドライブラリーは、ｌａｃレプレッサーのカルボキシル末端に融合し、イー・コリ中で発現させることができる。イー・コリをベースとする別の方法は、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合によって、細胞の外膜上へのディスプレイを可能とする。以下、これらの方法及び関連する方法は、「イー・コリディスプレイ」と総称される。別の方法では、リボソーム放出の前に、ランダムなＲＮＡの翻訳が停止され、会合されたそれらのＲＮＡがまだ付着されたままのポリペプチドのライブラリーがもたらされる。以下、これらの方法及び関連する方法は、「リボソームディスプレイ」と総称される。他の方法は、ＲＮＡへのペプチドの化学的連結を使用する。例えば、「Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１２２９７−３０３（１９９７）」を参照されたい。以下、この方法及び関連する方法は、「ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング」と総称される。ポリエチレンの棹又は溶媒透過性樹脂などの安定な非生物材料上にペプチドが固定化された、化学的に誘導されたペプチドライブラリーが開発されている。化学的に誘導された別のペプチドライブラリーは、ガラススライド上に固定化されたペプチドを走査するためにフォトリソグラフィーを使用する。以下、これらの方法及び関連する方法は、「化学的ペプチドスクリーニング」と総称される。化学的ペプチドのスクリーニングは、Ｄ−アミノ酸及び他の非天然類縁体並びに非ペプチド要素の使用を可能とする点で有利であり得る。生物学的方法と化学的方法の両方が、「Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：３５５−６２（１９９２）」中に概説されている。
概念的には、ファージディスプレイと上述されている他の方法を用いて、あらゆるタンパク質のペプチド模倣物を発見し得る。これらの方法は、エピトープマッピングのために、タンパク質−タンパク質相互作用中の重要なアミノ酸の同定のために、及び新規治療剤を発見するためのリードとして使用されてきた。例えば、「Ｃｏｒｔｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：６１６−２１（１９９６）」を参照されたい。ペプチドライブラリーは、現在、エピトープマッピングなどの免疫学的研究において、最も頻繁に使用されている。「Ｋｒｅｅｇｅｒ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ１０（１３）：１９−２０（１９９６）」を参照されたい。
本明細書中に記載されているヘプシジンポリペプチドに結合し、又はその活性を調節する（すなわち、増加又は減少させる）能力に関してスクリーニングされ得る化合物の採取源には、（１）無機及び有機化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー並びに（３）無作為ペプチド又は模倣ペプチド、オリゴヌクレオチド又は有機分子の何れかから構成されるコンビナトリアルライブラリーが含まれる。
化学的ライブラリーは、容易に合成し、又は多数の市販先から購入することができ、公知の化合物の構造的類縁体又は天然産物のスクリーニングを介した「ヒット」又「リード」として同定された化合物が含まれ得る。
天然産物ライブラリーの源は、微生物（細菌及び真菌を含む。）、動物、植物又は他の草木又は海洋生物であり、スクリーニングのための混合物のライブラリーは、（１）土壌から得たブロス、植物又は海洋微生物の発酵及び抽出又は（２）生物そのものの抽出によって作製され得る。天然産物ライブラリーには、ポリペプチド（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）、非リボソーム性ペプチド及び（天然に存在しない）これらの変形物が含まれる。概説として、「Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：６３−６８（１９９８）」を参照されたい。
コンビナトリアルライブラリーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチド又は有機化合物から構成され、伝統的な自動化された合成法、ＰＣＲ、クローニング又は独自の合成法によって容易に調製することが可能である。特に興味深いのは、ペプチド及びオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーである。興味深いさらに別のライブラリーには、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、多重平行合成集合物、組換え及びポリペプチドライブラリーが含まれる。コンビナトリアル化学及びそこから作製されたライブラリーの概説として、「Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）」を参照されたい。ペプチド模倣ライブラリーの概説及び例として、「Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９（３）：２０５−２３（１９９８）；Ｈｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，１（１）：１１４−１９（１９９７）；Ｄｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，４（５）：７０９−１５（１９９６）」（アルキル化されたジペプチド）を参照されたい。
ヘプシジン特異的結合剤には、「Ｈａｙｓ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３（１０）：５１４−５２２（２００５）」（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）によって記載されているような足場タンパク質並びに米国公報２００６−０２８６６０３号及び２００６−０２２３１１４号に記載されているような（何れも、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているようなＡｖｉｍｅｒタンパク質技術も含まれる。
抗体又は特異的結合剤に対するスクリーニング法
ヘプシジンを結合し、及び／又は本明細書中に記載されている典型的な抗体を交叉遮断し、及び／又はヘプシジン活性を阻害する抗体又は特異的結合剤を同定する方法も提供される。このような方法は、本明細書中に挙げられている（化学的に合成され、又は細菌若しくは非哺乳動物細胞中で産生された）高度に精製され、生物活性を有し、正しく折り畳まれた非尿性ヒトヘプシジンの組成物を使用し得る。
抗体又は特異的結合剤は、本分野において公知の方法によって、結合親和性に関してスクリーニングされ得る。例えば、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射線標識された競合アッセイ、クロマトグラフィーによる同時分画、同時沈殿、架橋、ＥＬＩＳＡなどを使用することができ、これらは、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ」（参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。）中に記載されている。
まず、標的抗原上の所望のエピトープに結合する抗体又は特異的結合剤に関してスクリーニングするために、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）」中に記載されているような定型的な交叉遮断アッセイを行うことができる。本発明の標的特異的抗体への標的の結合を阻害する能力によって、未知の抗体が特徴付けられる定型的な競合結合アッセイも使用され得る。完全な状態の抗原、細胞外ドメインなどのその断片又は直鎖エピトープを使用することができる。エピトープマッピングは、「Ｃｈａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）」中に記載されている。
インビトロ結合アッセイの１つの変形において、本発明は、（ａ）固定化されたヘプシジンを候補抗体又は特異的結合剤と接触させること、及び（ｂ）ヘプシジンへの候補抗体又は特異的な結合剤の結合を検出することを含む方法を提供する。別の実施形態では、候補抗体又は特異的結合剤が固定化され、ヘプシジンの結合が検出される。固定化は、支持体、ビーズ又はクロマトグラフィーの樹脂への共有結合、及び抗体結合などの非共有高親和性相互作用又は固定化された化合物がビオチン部分を含む、ストレプトアビジン／ビオチン結合の使用など、本分野において周知の方法の何れかを用いて達成される。結合の検出は、（ｉ）固定化されていない化合物上の放射性標識を用いて、（ｉｉ）固定化されていない化合物上の蛍光標識を用いて、（ｉｉｉ）固定化されていない化合物に対して免疫特異的な抗体を用いて、（ｉｖ）固定化された化合物が付着されている蛍光性支持体を励起させる固定化されていない化合物上の標識を用いて、並びに本分野において周知であり、日常的に実施されている他の技術を用いて達成することができる。
幾つかの実施形態において、ヒトヘプシジン活性を阻害又は中和する抗体又は特異的結合剤は、ヘプシジンを抗体（又は特異的結合剤）と接触すること、検査抗体（又は特異的結合剤）の存在下及び不存在下でヘプシジン活性を比較すること、及び抗体（又は特異的結合剤）の存在がヘプシジンの活性を減少させるかどうかを決定することによって同定され得る。特定の抗体又は特異的結合剤又は抗体若しくは特異的結合剤の組み合わせの生物活性は、適切な動物モデル（本明細書中に記載されている動物モデルの何れもが含まれる。）を用いて、インビボで評価され得る。
幾つかの実施形態において、本発明は、標的抗原の生物活性と相互作用し、又は阻害する（すなわち、リン酸化、二量体化、リガンドによって誘導される受容体の活性化又は細胞内シグナル伝達などを阻害する）抗体を同定するために、高情報処理スクリーニング（ＨＴＳ；ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）アッセイも想定する。ＨＴＳアッセイは、多数の化合物のスクリーニングを効率的な様式で可能とする。標的抗原とその結合対の間の相互作用を調べるために、細胞をベースとするＨＴＳシステムが想定される。所望の特性を有し、そこから所望の特性を改善するために修飾を設計することができる「ヒット」又は「リード化合物」を同定するためにＨＴＳアッセイが設計される。
別の実施形態において、標的抗原ポリペプチドへの適切な結合親和性を有するＣＤＲ内のアミノ酸に対する１、２、３又はそれ以上の修飾を有する抗体断片又はＣＤＲに対する高情報量スクリーニングが使用される。
Ｂ．阻害的オリゴヌクレオチド
本明細書中に記載されている方法に従って使用され得るヘプシジン発現阻害剤には、阻害剤オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド（医薬として許容されるその塩、例えば、ナトリウム塩を含む。）が含まれる。非限定的な例には、アンチセンスオリゴヌクレオチド［Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１０：１１７−１２１（２０００）；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，３１３：３−４５（２０００）；Ｇｕｖａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：２６２０−２６２７（１９９５）；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８９：１１７−１３０（１９９９）；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７２：１１９９４−１２０００（１９９７）；Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１６２８−１６４４（２００３）；Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１２８４０−１２８４４（１９９６）；Ｍａｒｗｉｃｋ，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２８０：８７１（１９９８）；Ｔｏｍｉｔａ ａｎｄ Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，１０：７９７−８０３（２００４）；Ｇｌｅａｖｅ ａｎｄ Ｍｏｎｉａ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，５：４６８−４７９（２００５）ａｎｄ Ｐａｔｉｌ，ＡＡＰＳＪ．７：Ｅ６１− Ｅ７７（２００５］、三重鎖オリゴヌクレオチド［Ｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：１１４３１−１１４４０（１９８８）及びＭｏｓｅｒ ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：６４５−６５０（１９８７）］、リボザイム／デオキシリボザイム（ＤＮＡザイム）［Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ．Ｃｅｌｌ，３１：１４７−１５７（１９８２）；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：５９６−６００（１９８７）；Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１３ ２８６−２８９（１９９５）；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１２：１４８６−１４９３（２００５）；Ｂｒｅａｋｅｒ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ，１：２２３−２２９（１９９４）；Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，５：３３７−３３９（２００４）；Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６８：１０２３−１０２５（２００４）ａｎｄ Ｔｒｕｌｚｓｃｈ ａｎｄ Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，８８：２５７−２６５（２００４）］、低分子干渉ＲＮＡ／ＲＮＡｉ［Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６−８１１（１９９８）；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：１５５０２−１５５０７（１９９８）；Ｃｕｌｌｅｎ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，３：５９７−５９９（２００２）；Ｈａｎｎｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２４４−２５１（２００２）；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３−３６６（２００１）；Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，１０７：３０９−３２１（２００１）；Ｇｉｌｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ，１２：３１５−３４０（２００４）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２６−３３０（２００４）；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４３２１７３−１７８（２００４）；Ｒａｌｐｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１１：４２９−４３３（２００５）；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１０８１６−８２０（２００４）及びＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３２：６６１−６６８（２００４）］、アプタマー［Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８−８２２（１９９０）；Ｄｏｕｄｎａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２：２３５５−２３５９（１９９５）；Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５−５１０（１９９０）；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，４：５６７−５７３（２００１）；Ｒｕｓｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４１９：９０−９４（２００２）；Ｎｉｍｊｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１４：４０８−４１５（２００６）；Ｇｒａｇｏｕｄａｓ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５１：３８０５−２８１６（２００４）；Ｖｉｎｏｒｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５６７３−６７９（２００３）及びＫｏｕｒｌａｓ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．，２８，３６−４４（２００６）］又は囮（ｄｅｃｏｙ）オリゴヌクレオチド［Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２：５８５５−５８５９（１９９５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２９４：２４４６−２４５４（２００５）；Ｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｚａｕ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０６：１０７１−１０７５（２０００）ａｎｄ Ｎｉｍｊｅｅ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，５６：５５５−５８３（２００５）。先述の文献の全体が、参照により、本明細書中に組み込まれ、阻害性オリゴヌクレオチドを設計、製造及び使用する方法に関連する文献の節が特に強調される。
Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）、Ｄａｒｍａｃｏｎ Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ， ＣＯ）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＬＬＣ（Ｈｅｒｎｄｏｎ， ＶＡ）などの業者が、特別注文のｓｉＲＮＡ分子を作製している。さらに、特別に調製されたｓｉＲＮＡ分子を作製するために、ＳＩＬＥＮＣＥＲＴＭｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．， Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）又はｐｓｉＲＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などの市販のキットを利用することができる。
阻害性オリゴヌクレオチドヌクレオチドは、標的遺伝子のコード部分、３’若しくは５’非翻訳領域又は遺伝子中のイントロン配列、あるいは標的ｍＲＮＡ中のコード又はイントロン配列に対して相補的であり得る。イントロン配列は、一般に、保存されている程度がより低く、従って、より大きな特異性を与え得る。一実施形態において、阻害性オリゴヌクレオチドは、ある種の遺伝子産物の発現を阻害するが、別の種におけるその相同体を阻害しない。別の実施形態において、阻害性オリゴヌクレオチドは、２つの種（たとえば、ヒト及び霊長類又はヒト及びマウス）において、遺伝子の発現を阻害する。
ある種の実施形態において、阻害性オリゴヌクレオチドは、ヘプシジン遺伝子又はｍＲＮＡ（配列番号（マウス）又は配列番号１００（ヒト）又はそのリバース鎖）の少なくとも８、９、１０、１１又は１２の連続する塩基へ、中程度又は高い厳密性条件下でハイブリッド形成することができる。幾つかの事例において、相補的領域の長さに応じて、阻害的機能に影響を与えずに、１つ、２つ又はそれ以上の不適合塩基対が許容され得る。ある種の実施形態において、阻害的オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、阻害的ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ又はｓｈＲＮＡを含む。）、ＤＮＡ酵素、リボザイム（場合によって、ハンマーヘッドリボザイム）、アプタマー又は医薬として許容されるこれらの塩である。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０４の少なくとも１０の塩基に対して相補的である。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ヘプシジンｍＲＮＡの３’非翻訳領域の近くに位置するヌクレオチドを標的とする。
阻害的オリゴヌクレオチドで標的化するためのｍＲＮＡ部位の選択
オリゴヌクレオチドの設計において使用される特異的配列は、標的の発現された遺伝子メッセージ内に含有されるヌクレオチドのあらゆる連続する配列であり得る。適切な標的配列を選択するために、本分野において公知のプログラム及びアルゴリズムを使用し得る。さらに、特定の一本鎖核酸配列の二次構造を予測するように設計され、折り畳まれたｍＲＮＡの露出された一本鎖領域中で、配列の選択が行われ得るようにするプログラムを用いて、最適な配列を選択し得る。適切なオリゴヌクレオチドを設計するための方法及び組成物は、例えば、米国特許第６，２５１，５８８号（その内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）中に見出され得る。
殆どのｍＲＮＡは、多数の二次及び三次構造を含有することが示されている。ＲＮＡ中の二次構造要素は、概ね、同じＲＮＡ分子の異なる領域間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型相互作用によって形成される。重要な二次構造要素には、細胞内二本鎖領域、ヘアピンループ、二重鎖ＲＮＡ中の隆起及び内部ループが含まれる。三次構造要素は、二次構造要素が互いに又は一本鎖領域と接触して、より複雑な三次元構造を生成したときに形成される。多数の研究者が、ＲＮＡ二重鎖構造の結合エネルギーを測定し、ＲＮＡの二次構造を予測するために使用できる一群の規則を導いている（例えば、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６； ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１７：１６７参照）。この規則は、ＲＮＡ構造要素の同定おいて、特に、ｓｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス技術に対する標的とするためのｍＲＮＡのセグメントに相当し得る一本鎖ＲＮＡ領域を同定するのに有用である。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
細胞中でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの恒常的発現は、おそらく翻訳の遮断又はスプライシングの抑制を介して、遺伝子発現を阻害することが示されている。適切な阻害性オリゴヌクレオチドは、一本鎖であり得、ｍＲＮＡ又はＤＮＡ分子にハイブリッド形成し、転写、スプライシング又は翻訳を阻害するように、ｍＲＮＡ又はＤＮＡ分子に対して十分に相補的であり、及びｍＲＮＡ又はＤＮＡ分子に対して十分に特異的である、例えば、少なくとも１２、１５又は１８塩基長のセグメントを含有し得る。一般に、３０塩基未満の長さにわたる相補性が十分すぎるほどである。
阻害性オリゴヌクレオチド配列に対する標的部位を支配する要因には、オリゴヌクレオチドの長さ、結合親和性及び標的配列の接近可能性が含まれる。標的タンパク質翻訳及び標的関連表現型の阻害、例えば、培養中の細胞中での細胞増殖の阻害を測定することによって、配列の阻害活性の効力に関して、配列をインビトロでスクリーニングし得る。一般に、ＲＮＡ（５’及び３’非翻訳領域、ＡＵＧ開始、コーディング、スプライス連結及びイントロン）の多くの領域は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて標的化できることが公知である。
ホスホロチオアートアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し得る。ホスホジエステル連結及び複素環又は糖の修飾は、効率性の増加を与え得る。ホスホロチオアートは、ホスホジエステル連結を修飾するために使用される。Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミダート連結は、ヌクレアーゼに対してオリゴヌクレオチドを安定化させ、ＲＮＡへの結合を増加させると記載されている。ペプチド核酸（ＰＮＡ）連結は、リボース及びホスホジエステル骨格の完全な置換であり、ヌクレアーゼに対して安定であり、ＲＮＡに対する結合親和性を増加させ、ＲＮＡｓｅＨによる切断を行わせない。その基本構造は、アンチセンス成分としての最適化を可能にし得る修飾にも適している。複素環の修飾に関して、ある種の複素環修飾は、ＲＮＡｓｅＨ活性を妨害することなく、アンチセンス効果を増強させることが明らかとなっている。このような修飾の例は、Ｃ−５チアゾール修飾である。最後に、糖の修飾も検討し得る。２’−Ｏ−プロピル及び２’−メトキシエトキシリボース修飾は、細胞培養において及びインビボにおいて、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対して安定化させる。
安定であり、ヌクレアーゼに対して高い耐性を有し、無毒な用量で標的組織部位へ阻害性オリゴヌクレオチドを輸送させる適切な薬物動態を有し、形質膜を横切る能力を有する阻害性オリゴヌクレオチドは、治療剤としての使用が想定される。
低分子干渉ＲＮＡ
低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ技術（ＲＮＡｉとしても知られる。）は、ある配列に対して相同的である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導されるある配列のｍＲＮＡの分解を一般に含み、これにより、対応する遺伝子の発現を「妨害する」。選択された遺伝子に対するｍＲＮＡの全部又は大部分に対応するｄｓＲＮＡを導入することによって、あらゆる選択された遺伝子を抑制し得る。長いｄｓＲＮＡが発現されると、長いｄｓＲＮＡは、まず、リボヌクレアーゼＩＩＩによって、２１から２２塩基対の長さのより短いｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドへと加工されるようである。従って、ｓｉＲＮＡは、相対的に短い相同的ｄｓＲＮＡの導入又は発現によって実施され得る。典型的なｓｉＲＮＡは、各３’末端に２つのヌクレオチドの突出を有する二本鎖ＲＮＡの約１９ヌクレオチドを形成する約２１ヌクレオチドのセンス及びアンチセンス鎖を有する。実際に、相対的に短い相同的ｄｓＲＮＡの使用は、ある種の利点を有し得る。
哺乳動物細胞は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって影響を受ける少なくとも２つの経路を有する。配列特異的なｓｉＲＮＡ経路において、まず、開始ｄｓＲＮＡは、上述のように、低分子干渉ＲＮＡへ分解される。低分子干渉ＲＮＡは、特異的なメッセンジャーＲＮＡを分解のために標的誘導させる配列情報を与えると考えられている。これに対して、非特異的な経路は、少なくとも約３０塩基対の長さである限り、あらゆる配列のｄｓＲＮＡによって引き金を引かれる。
ｄｓＲＮＡは２つの酵素：ＰＫＲ（その活性形態において、翻訳開始因子ｅＩＦ２をリン酸化して、全てのタンパク質合成を停止させる。）及び２’，５’オリゴアデニル酸合成酵素（２’，５’−ＡＳ）（全てのｍＲＮＡを標的とする非特異的酵素であるＲＮアーゼＬを活性化する分子を合成する。）を活性化するので、非特異的な効果が生じる。非特異的な経路は、ストレス又はウイルス感染に対する宿主応答に相当し得、一般に、非特異的な経路の効果は、好ましくは、最小限に抑えられる。重要なことに、非特異的経路を誘導するために、より長いｄｓＲＮＡが必要であるようであり、従って、ＲＮＡｉによる遺伝子抑制を実施するためには、約３０塩基対より短いｄｓＲＮＡが想定される（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４０９−１７；Ｍａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５２３９−４８；Ｍｉｎｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：１０１８０−３；及びＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４−８参照）。
ｓｉＲＮＡは、様々な細胞の種類において遺伝子発現を減少させる効果的な手段であることが明らかとなっている。ｓｉＲＮＡは、典型的には、アンチセンス技術を用いて達成されるレベルより低いレベルまで、遺伝子の発現を減少させ、しばしば、発現を完全に除去する（Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ４１１：４２８−９参照）。哺乳動物細胞において、ｓｉＲＮＡは、アンチセンス実験において典型的に使用される濃度を数桁下回る規模の濃度で有効である（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−８）。
ＲＮＡｉを実施するために使用される二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは、長さ３０塩基対未満、例えば、長さ約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８又は１７塩基対又はそれ以下であり、標的ｍＲＮＡへのハイブリッド形成を可能とするために、標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的なセグメントを含有する。場合によって、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３’突出末端を含み得る。典型的な２ヌクレオチドの３’突出は、あらゆる種類のリボヌクレオチド残基から構成され得、及び２’−デオキシチミジン残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）から構成される場合さえあり得る（これは、ＲＮＡ合成のコストを低下させ、細胞培地中及び被形質移入細胞内でのｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増強させ得る。）（Ｅｌｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−８参照）。典型的なｄｓＲＮＡは、化学的に合成され得、又は適切な発現ベクターを用いてインビトロ若しくはインビボで産生され得る（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８−２００参照）。本分野において公知のプロモーター（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなど）から、より長いＲＮＡが転写され得る。
５０、７５、１００又は５００塩基対又はそれ以上のより長いｄｓＲＮＡも、本発明のある種の実施形態において使用され得る。ＲＮＡｉを実施するためのｄｓＲＮＡの典型的な濃度は約０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、１．５ｎＭ、２５ｎＭ又は１００ｎＭであるが、処理される細胞の性質、遺伝子標的及び当業者にとって容易に識別可能な他の因子に応じて、他の濃度を使用し得る。
ｓｉＲＮＡ技術のさらなる組成物、方法及び用途が、米国特許出願第６，２７８，０３９号、５，７２３，７５０号及び５，２４４，８０５号（これらの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に挙げられている。
短いヘアピンＲＮＡ
ｓｉＲＮＡと比べて、ｓｈＲＮＡは、発現停止の寿命及び送達の選択肢において利点を与える。例えば、概説のために、「Ｈａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３１：３７１−３７８，２００４」を参照されたい。ｓｈＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ様特性を有する短い二重鎖ＲＮＡへ細胞内でプロセッシングされる。）を産生するベクターが報告されている（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６，５５０−５５３，２０００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６，９４８−９５８（２００２））。このようなベクターは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定な組み込み後に、持続的な遺伝子発現停止を媒介することができる遺伝子発現停止試薬の再生可能な源を与える。さらに、コア発現停止「ヘアピン」カセットは、レトロウイルス、レンチウイルス又はアデノウイルスベクター中へ容易に挿入することが可能であり、異所性ｍＲＮＡ発現を可能とするＤＮＡ構築物の送達のために考案されてきた多数の方法の何れかで、細胞種の幅広い範囲中へのｓｈＲＮＡの送達を促進する（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ２：２４３−２４７，２００２；Ｄｉｒａｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１１７３１−１１７３４，２００３；Ｍｉｃｈｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１１５４−１１５７，２００２；Ｓｔｅｇｍｅｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１３２１２−１３２１７，２００５；Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１５：２０９−２１６（２００３）。
ヘアピンは、左巻きのヘアピン（すなわち、５’−アンチセンス−ループ−センス−３’）又は右巻きのヘアピン（すなわち、５’−センス−ループ−アンチセンス−３’）の何れかで構築され得る。ｓｉＲＮＡは、ヘアピンの組織化に応じて、センス鎖又はアンチセンス鎖の何れかの５’又は３’末端の何れかに突出も含有し得る。好ましくは、何れかの突出が存在する場合には、突出はヘアピンの３’末端上に存在し、１から６塩基の間を含む。突出は非修飾であり得、又は２’位のハロゲン若しくはＯ−アルキル修飾、又はホスホロチオアート、ホスホロジチオアート若しくはメチルホスホナート修飾などのヌクレオチド間修飾などの１つ若しくはそれ以上の特異性若しくは安定化修飾を含有することができる。突出は、リボ核酸、デオキシリボ核酸又はリボ核酸とデオキシリボ核酸の組み合わせであり得る。
さらに、ヘアピンは、最も５’末端にあるヌクレオチド上にホスファート基をさらに含むことができる。最も５’側のヌクレオチドのリン酸化は、５’末端のヌクレオチドの糖部分の５’炭素に付着された１つ又はそれ以上のホスファート基の存在を表す。好ましくは、ダイサープロセッシング後にアンチセンス鎖を形成する領域の５’末端上にただ１つのホスファート基が存在する。１つの典型的な実施形態において、右巻きのヘアピンは、５’ホスファート基を有さない５’末端（すなわち、センス領域の遊離の５’末端）を含むことができ、又はリン酸化を抑制するように修飾されているセンス領域の最も５’側の遊離のヌクレオチドの５’炭素を有することができる。これは、リン酸化ブロッキング基（例えば、５’−Ｏ−アルキル基）の付加又は５’−ＯＨ官能基（例えば、最も５’側のヌクレオチドが、５’−デオキシヌクレオチドである。）の除去を含む（但し、これらに限定されない。）様々な方法によって達成することができる。ヘアピンが左巻きのヘアピンである場合には、好ましくは、最も５’側のヌクレオチドの５’炭素位置はリン酸化されている。
２６塩基対より長いステム長を有するヘアピンは、幾つかの部分がｍＲＮＡ分解を促進する得られたｓｉＲＮＡの一部でないように、ダイサーによって加工され得る。従って、センスヌクレオチドを含み得る第一の領域とアンチセンスヌクレオチドを含み得る第二の領域は、相補的である（又は、少なくとも実質的に互いに相補的である）ヌクレオチドの伸展も含有し得るが、標的ｍＲＮＡと同じ若しくは相補的であり、又は同じ若しくは相補的でない。ｓｈＮＲＡのステムは、突出を除いて、相補的な、又は部分的に相補的なアンチセンス及びセンス鎖から構成され得るのに対して、ｓｈＲＮＡは以下のものを含み得る。（１）最終的なダイサー切断部位に対して遠位である分子の一部は、標的ｍＲＮＡと実質的に相補的／相同である領域を含有し、及び（２）ダイサー切断部位に対して近位であるステムの領域（すなわち、ループに隣接する領域）は、標的ｍＲＮＡと無関係であり、又は部分的に関連する（例えば、相補的／相同）に過ぎない。この第二の領域のヌクレオチド含量は、熱力学的形質又は特性などの（但し、これらに限定されない。）多数のパラメータに基づいて選択することが可能である。
修飾されたｓｈＲＮＡは、ダイサーによって加工された後の二重鎖中に修飾を保持することができる。典型的な実施形態において、ヘアピンが、分子の３’末端上に２から６ヌクレオチドの突出を含有する右巻きのヘアピン（例えば、５’−Ｓ−ループ−ＡＳ−３’）である場合には、ヘアピンの５’末端の位置２、位置１及び２又は位置１、２及び３のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾を付加することができる。また、この立体配置を有するヘアピンのダイサープロセッシングは、センス鎖の５’末端を完全な状態に保持することができるので、ダイサーによる加工後の二重鎖中の化学的修飾のパターンが保持される。２’修飾を有するヌクレオチドが除去されるように、所定の修飾パターンを含有する平滑末端化された分子を、ダイサーによってさらにプロセッシングすることができるので、この立体配置の３’突出の存在は特に有利であり得る。３’突出が存在し／保持される場合には、センス修飾されたヌクレオチドを担持する得られた二重鎖は、発現停止の特異性及び機能性に関して高度に好ましい形質を有することができる。典型的な修飾パターンの例は、米国特許出願公開２００５／０２２３４２７号、国際公開ＷＯ２００４／０９０１０５及びＷＯ／２００５／０７８０９４に詳しく記載されている（これらの各々の開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）。
ｓｈＲＮＡは、無作為に又は何らかの合理的な設計選択手法に従って選択された配列を含み得る。例えば、合理的設計アルゴリズムは、国際公開ＷＯ２００４／０４５５４３Ａ２、米国特許出願公開２００５／０２５５４８７号（これらの開示の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。さらに、完全に又は部分的に平均内部安定性特性（「ＡＩＳＰ（ａｖｅｒａｇｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅ）」）又は局所的内部安定性特性（「ＲＩＳＰ」（ｒｅｇｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅ））を基礎として、細胞機構によるアクセス又はプロセッシングを促進し得る配列を選択することが望ましい場合があり得る。
リボザイム
リボザイムは、ｍＲＮＡの特異的な切断を触媒することができ、従って翻訳を妨げることができる酵素的ＲＮＡ分子である（概説として、Ｒｏｓｓｉ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ４：４６９−４７１を参照されたい。）。リボザイムの作用機序は、相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的なハイブリッド形成、これに続く、核内溶解切断現象を含む。リボザイム分子は、好ましくは、（１）標的ｍＲＮＡに対して相補的な１つ又はそれ以上の配列及び（２）ｍＲＮＡ切断のために必要とされる周知の触媒配列又は機能的に等価な配列を含む（例えば、米国特許第５，０９３，２４６号参照（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。））。
標的ｍＲＮＡを破壊するために、部位特異的認識配列においてｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用することができるが、これに代えて、ハンマーヘッドリボザイムを使用し得る。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって支配される位置においてｍＲＮＡを切断する。好ましくは、標的ｍＲＮＡは、２塩基の以下の配列を有する。５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び作製は、本分野において周知であり、「Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ３３４：５８５−５９１」及びＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５８５２号（これらの内容の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）により完全に記載されている。
遺伝子標的化リボザイムは、その各々が少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の連続するヌクレオチドである（但し、両者は同じ長さである必要はない。）標的ｍＲＮＡの２つの領域に対して相補的なハイブリッド形成領域を含有し得る。
ハンマーヘッドリボザイム配列は、インビボでの切断効率を増大させるために、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの安定なＲＮＡ中に埋め込むことができる（Ｐｅｒｒｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６１７５−７９；ｄｅ Ｆｅｙｔｅｒ，ａｎｄ Ｇａｕｄｒｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７４，Ｃｈａｐｔｅｒ ４３，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ”，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．Ｃ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。特に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって媒介されるｔＲＮＡ融合リボザイムの発現は、本分野において周知である（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ３９３：２８４−９；Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９６１−５；ａｎｄ Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ１２：６１７−２７；Ｋｏｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７３：１８６８−７７；Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：１８８６−９１；Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０６：４７３−４参照）。典型的には、ある標的ｃＤＮＡ配列内に、ハンマーヘッドリボザイム切断部位となる可能性を秘めた部位が数多く存在する。効率を増加させ、非機能的なｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小限に抑えるために、好ましくは、標的ｍＲＮＡの５’末端付近に切断認識部位が位置するように、リボザイムは操作される。さらに、標的ｍＲＮＡの異なる部分をコードする標的配列中に位置する何れの切断認識部位の使用も、一方又は他方の標的遺伝子の選択的な標的化を可能とする。
本発明のリボザイムには、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）中に天然に存在し（ＩＶＳ又はＬ−１９ＩＶＳＲＮＡとして知られる。）、「Ｚａｕｇ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：５７４−５７８；Ｚａｕｇ，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３１：４７０−４７５；Ｚａｕｇ，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ３２４：４２９−４３３；公開された国際特許出願ＷＯ８８／０４３００号及びＢｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４７：２０７−２１６）に詳しく記載されているものなどのＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）も含まれる。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列へハイブリッド形成する８塩基対の活性部位を有しており、その後、標的ＲＮＡの切断が起こる。本発明は、標的遺伝子又は核酸配列中に存在する８塩基対の活性部位配列を標的とするＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。
リボザイムは、（例えば、改善された安定性、標的化などのために）修飾されたオリゴヌクレオチドから構成されることができ、化学的に合成され、又は発現ベクターを通じて産生されることが可能であるべきである。アンチセンス分子と異なり、リボザイムは触媒性であり、効率のために、より低い細胞内濃度が必要とされる。
ある種の実施形態において、リボザイムは、ＲＮＡｉによる効果的なノックダウンを引き起こすのに十分な配列部分をまず同定することによって設計され得る。次いで、同じ配列の部分をリボザイム中に取り込ませ得る。
三重らせんの形成
あるいは、体内の標的細胞中での遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させるために、遺伝子の制御領域（すなわち、プロモーター及び／又はエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的誘導することによって、標的遺伝子の発現を低下させることができる（全般に、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ，１９９１，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．，６：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：２７−３６；及びＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．，１９９２，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ１４：８０７−１５参照）。
転写の阻害のために、三重らせんの形成において使用されるべき核酸分子は、好ましくは、一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成される。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対形成規則を介した三重らせんの形成を促進すべきであり、一般に、二重鎖の一方の鎖の上にプリン又はピリミジンのかなり大きな伸展が存在することを必要とする。ヌクレオチド配列はピリミジンベースであり得、これは、生じた三重らせんの会合した３つの鎖を横切るＴＡＴ及びＣＧＣトリプレットをもたらす。ピリミジンに富む分子は、二重鎖の単一の鎖に対して平行な配位で、その鎖のプリンに富む領域に対して塩基相補性を与える。さらに、プリンに富む（例えば、Ｇ残基の伸展を含有する）核酸分子を選択し得る。これらの分子は、ＧＣ対に富むＤＮＡ二重鎖とともに三重らせんを形成し、三重らせん中において、プリン残基の過半数は標的とされる二重鎖の一本鎖上に位置しており、三重らせん中の３つの鎖を横切るＣＧＣトリプレットがもたらされる。
あるいは、三重らせん形成のために標的とされ得る標的配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増加させ得る。スイッチバック分子は、二重鎖の第一の一方の鎖と、次いで、他方の鎖と塩基対を形成し、二重鎖の一方の鎖上にプリン又はピリミジンのかなり大きな伸展が存在することが不要となるように、交互に生じる５’−３’、３’−５’様式で合成される。
ＤＮＡ酵素
あるいは、標的遺伝子の発現を阻害するために、ＤＮＡ酵素を使用し得る。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスとリボザイム技術の両者の機構的な特徴の幾つかを取り込んでいる。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとほぼ同様に特定の標的核酸配列を認識するように設計される。しかしながら、ＤＮＡ酵素は、触媒作用も有しており、標的核酸を特異的に切断する。
現在、ＤＮＡ酵素の２つの基本的なタイプが存在し、何れも、Ｓａｎｔｏｒｏ及びＪｏｙｃｅによって同定された（例えば、米国特許第６，１１０，４６２号参照）。１０−２３ＤＮＡ酵素は、２つのアームを接続するループ構造を含む。２つのアームは、特定の標的核酸配列を認識することによって特異性を与えるのに対して、ループ構造は、生理的な条件下で触媒機能を与える。
好ましくは、特有の又は実質的に特有の配列は、約１８から２２のヌクレオチドを有し、Ｇ／Ｃに富む。高いＧ／Ｃ含量は、ＤＮＡ酵素と標的配列の間でのより強い相互作用を確保させるのに役立つ。酵素をメッセージへ標的誘導する特異的なアンチセンス認識配列は、ＤＮＡ酵素の２つのアーム間に分割させ得る。
ＤＮＡ酵素を作製し、投与する方法は、例えば、米国特許第６，１１０，４６２号に見出すことができる。さらに、当業者は、安定性を向上させるために及び分解に対する抵抗性を向上させるために、ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様、場合によって修飾できることを認識する。
阻害性オリゴヌクレオチドの送達
所望の細胞中で阻害性オリゴヌクレオチドの発現をもたらすために、適切な制御配列（プロモーターを含む。）とともに、阻害性オリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡがその中に配置されたベクター（ウイルスベクター又はプラスミドなど）を介した形質転換又は形質移入によって、阻害性オリゴヌクレオチドを細胞へ直接的に投与し、又は細胞に送達することができる。公知の方法には、レトロウイルスからアデノウイルスにわたるウイルスを使用する、標準的な一過性形質移入、安定な形質移入及び送達が含まれる。複製ベクター又は複製欠損ベクターによる核酸阻害剤の送達が想定される。発現は、恒常的又は誘導性プロモーター系の何れかによっても誘導され得る（Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６５：８５−１００，２００４）。他の実施形態において、発現は、組織又は発達特異的なプロモーターの調節下にあり得る。
例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの担体組成物を用いた形質移入によって、ベクターを導入し得る。形質移入の効率は、ｈＧＦＰをコードするｐＡＤ３の同時形質移入後に、哺乳動物細胞株に対する蛍光顕微鏡を用いてチェックし得る（Ｋｅｈｌｅｎｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４１：８６３−７４）。
送達経路は、上記の基準に従って測定された場合に、最良の阻害効果を与えるものである。陽イオン性リポソームによって媒介される送達、レトロウイルスベクターによる送達及び直接的送達が効率的である。
他の公知の送達方法が、以下において、「遺伝子治療」という表題の節に記載されている。
逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応又は存在するヒトヘプシジンｍＲＮＡのレベルを測定するためのノーザンブロット分析又はヒトヘプシジンタンパク質を認識する抗体を使用するウェスタンブロット分析などの多数のアッセイの何れかによって、新たなタンパク質合成が抑制された後に、内在性プールが代謝回転されるのに十分な時間の後に、阻害性オリゴヌクレオチドの有効性を評価し得る。ヘプシジンレベルの「正常な」範囲は約２５ｎｇ／ｍＬ未満であり、約１０ｎｇ／ｍＬを下回る測定値は、ヘプシジンの抑制を示唆し得る。別の実施形態において、ヘプシジンレベルの「正常な」範囲は、（質量分析によって評価された場合に）約１０ｎｇｍ／ｍＬ未満であり、（質量分析によって評価された場合に）約２．５ｎｇ／ｍＬを下回る測定値はヘプシジンの抑制を示唆し得る。
Ｃ．アンタゴニスト活性を有するヘプシジンポリペプチド変形物
ヒトヘプシジンポリペプチドに関して、固有の成熟ヒトヘプシジン配列に比べて、１つ又はそれ以上の置換、挿入又は欠失を含むが、８つのシステイン全てを保持し及びヘプシジンの生物活性（例えば、抗微生物及び／又は鉄制御活性）を阻害するアンタゴニスト変形物が想定される。変形物は、Ｃ２−Ｃ４及び／又はＣ５−Ｃ７ジスルフィド結合を維持し、場合によって、Ｃ１−Ｃ８及びＣ３−Ｃ６ジスルフィド結合も維持し得る。フェロポーティン結合活性を保持するが、フェロポーティンの内部取り込み又は分解を引き起こさないヘプシジン変形物並びにヘプシジン受容体結合活性を保持するが、フェロポーティン受容体を活性化しないヘプシジン変形物も想定される。
アンタゴニスト変形物は、ＩＶ節（ポリペプチド変形物の作製）に記載されているようにして容易に調製され、本明細書に記載されているインビトロ又はインビボアッセイの何れかにおいて、ヘプシジン鉄制御活性を阻害する能力に関してスクリーニングすることができる。
ＩＩＩ．アゴニスト活性を有するヘプシジンポリペプチド変形物
固有の成熟ヒトヘプシジン配列に比べて、１つ又はそれ以上の置換、挿入又は欠失を含むが、８つのシステイン全てを保持し及びヘプシジンの生物活性（例えば、抗微生物及び／又は鉄制御活性）を保持するヒトヘプシジンポリペプチドのアゴニスト変形物も想定される。変形物は、Ｃ２−Ｃ４及び／又はＣ５−Ｃ７ジスルフィド結合を維持し、場合によって、Ｃ１−Ｃ８及びＣ３−Ｃ６ジスルフィド結合も維持し得る。フェロポーティン結合活性を保持する及び／又はヘプシジン受容体結合活性を保持するヘプシジン変形物も想定される。
アゴニスト変形物は、ＩＶ節（ポリペプチド変形物の作製）に記載されているようにして容易に調製され、本明細書に記載されているインビトロ又はインビボアッセイの何れかにおいて、ヘプシジン鉄制御活性の保持に関してスクリーニングすることができる。
ＩＶ．ポリペプチド変形物及び誘導体の作製
本発明のヘプシジンポリペプチド（ヘプシジン変形物を含む。）又は本発明の抗ヘプシジン抗体は、当業者に周知の技術によって容易に修飾することができる。想定可能な変異には、１つ又はそれ以上の残基の挿入、欠失又は置換が含まれる。挿入又は欠失は、好ましくは、約１から５個のアミノ酸、より好ましくは１から３個、最も好ましくは１又は２個のアミノ酸の範囲である。
欠失変形物とは、何れかのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されているポリペプチドである。欠失は、タンパク質の一端若しくは両端に実施することが可能であり、又はポリペプチド内（すなわち、内部）の１つ若しくはそれ以上の残基の除去によって実施することが可能である。欠失変形物の調製方法は、本分野において一般的である。例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ」（その開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
アミノ酸配列の挿入には、一残基の長さから数百又はそれ以上の残基を含有するポリペプチドにわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端の融合並びに１つ又はそれ以上のアミノ酸の内部配列挿入が含まれる。本明細書に記載されている様々な変形物の種類の何れとも同様に、挿入変形物は、得られるポリペプチドが同じ生物学的特性を保持し、又は当該挿入変形物を与えた親ポリペプチドに伴わない新しい物理的、化学的及び／又は生物的特性を示すように設計することができる。挿入変形物の調製方法も、本分野において一般的であり、周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記）。
本発明のポリペプチド（ヘプシジン変形物を含む。）又は本発明の抗体と異種のポリペプチドとを含む融合タンパク質は、本発明によって想定される挿入変形物の具体的な種類である。目的のポリペプチドに融合することができる異種のポリペプチドの非限定的な例には、免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）などの（但し、これに限定されない。）長い循環半減期を有するタンパク質、目的のポリペプチドの同定を可能とするマーカー配列、目的のポリペプチドの精製を容易にする配列及び多量体タンパク質の形成を促進する配列が含まれる。
抗体融合タンパク質の作製方法は、本分野において周知である。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号（その開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。本発明のある種の実施形態において、キメラｓｃＦｖ抗体を異種のタンパク質部分に接続する柔軟なリンカーを含み得る融合タンパク質が作製される。適切なリンカー配列は、得られた融合タンパク質が認識される能力に影響を及ぼさず、該タンパク質のＶドメインによって特異的に結合されるエピトープを結合するリンカー配列である（例えば、ＷＯ９８／２５９６５号（その開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。）。
置換変形物は、ポリペプチドアミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその位置に挿入されている変形物である。ポリペプチド又は抗体の生物学的特性の修飾は、（ａ）置換の領域中のポリペプチド骨格の構造、例えば、シート又はらせん立体構造など、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性又は（ｃ）側鎖の嵩を維持する上での効果が著しく異なる置換を選択することによって達成される。本発明のある実施形態において、置換変形物が設計される。すなわち、１つ又はそれ以上の特異的な（無作為でない）アミノ酸残基が、特異的なアミノ酸残基と置換される。これらの種類の典型的な変化には、保存的な置換及び／又は固有の残基及び置換する残基の類似の特性を基礎とした、ある残基の別の残基での置換が含まれる。
保存的置換は、表１に示されている。多くの保存的置換は、「好ましい置換」という表題下に見出される。このような置換は生物活性の変化をもたらさず、従って、より実質的な変化を導入し得、産物をスクリーニングし得る。
Figure 2014221763
共通の側鎖特性を有するアミノ酸残基は、しばしば、以下のようにグループ分けされる。
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の方向性に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
抗体変形物
ある種の事例では、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基を修飾することを意図して、抗体変形物が調製される。別の実施形態において、エピトープ結合に直接関与していない残基又はいかなる様式でもエピトープ結合に関与していない残基の修飾が、本明細書中に論述されている目的のために望ましい。ＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域の何れかの中での突然変異誘発が想定される。
何れの抗体アミノ酸残基がエピトープ認識及び結合のために重要であるかを決定するためには、置換変形物を作製するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施することができる。例えば、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）」（その開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。この方法では、各アミノ酸残基は、一度に１個、アラニン残基で置換され、得られた抗ヘプシジン抗体は、修飾されていない抗体との対比において、その特異的エピトープを結合する能力に関してスクリーニングされる。何れの残基が変化を受けたかを決定するために、低下した結合能を有する被修飾抗体を配列決定し、結合又は生物学的特性におけるその重要性を推測する。
抗体の置換変形物は、ランダムなアミノ酸変化が親抗体配列中に導入されるアフィニティー成熟によって調製することが可能である。例えば、「Ｏｕｗｅｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ７４（Ｓｕｐｐｌ２）：２２３−２３２，１９９８；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：８９１０−８９１５，１９９８；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：４４３−４５０，１９９８」（これらの開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。アフィニティー成熟は、抗ヘプシジン抗体又はその変形物を調製及びスクリーニングすること、並びに親抗ヘプシジン抗体と比べて増加した結合親和性などの、修飾された生物学的特性を有する変形物を、得られた変形物から選択することを含む。置換変形物を作製するための便利な方法は、ファージディスプレイを使用するアフィニティー成熟である。簡潔に述べると、各部位に全ての可能なアミノ酸置換を生成させるために、幾つかの超可変領域部位を変異させる。このようにして生成された変形物は、各粒子内に封入されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として、糸状ファージ粒子の表面上へ、一価様式で発現される。次いで、ファージディスプレイが行われた変形物は、その生物活性（例えば、結合親和性）に関してスクリーニングされる。例えば、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９３／１１２３６６、ＷＯ９５／１５３８８及びＷＯ９３／１９１７２を参照されたい。
現在の抗体アフィニティー成熟法は、確率論的及び非確率論的という２つの突然変異誘発カテゴリーに属する。エラープローンＰＣＲ、変異生成細菌株（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０，３５９−６８，１９９６）及び飽和突然変異誘発（Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２８１３−２０，２０００；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８，２６９−８５，２００２）が、ストキャスティックな突然変異誘発法（Ｒａｊｐａｌ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１０２：８４６６−７１，２００５）の典型的な例である。ノンストキャスティック技術は、特異的な変異タンパク質の限定された集合物を作製するために、アラニンスキャニング又は位置指定突然変異誘発をしばしば使用する。幾つかの方法は、以下でさらに詳しく記載されている。
パニング法を介したアフィニティー成熟−一般に、組換え抗体のアフィニティー成熟は、抗原の減少する量の存在下で、候補抗体のパニングを数巡繰り返すことによって行われる。一巡毎に抗原の量を減少させることは、抗原に対して最も高い親和性を有する抗体を選択し、これにより、出発材料の巨大なプールから高親和性の抗体が生成される。パニングを介したアフィニティー成熟は本分野において周知であり、例えば、Ｈｕｌｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：１６３−７１，２００１）に記載されている。ファージディスプレイ技術を用いたアフィニティー成熟の方法は、本明細書の他の箇所に記載されており、本分野において公知である（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．９７：２０２９−３４，２０００参照）。
ルックスルー突然変異誘発−ルックスルー突然変異誘発（ＬＴＭ；ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｒａｊｐａｌ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１０２：８４６６−７１，２００５）は、抗体結合部位を素早くマッピングするための方法を提供する。ＬＴＭでは、抗体の全ての６つのＣＤＲ中のあらゆる位置において、結合に寄与する機能的側鎖を詳細に調べるために、２０の天然アミノ酸によって与えられる主要な側鎖化学を代表する９つのアミノ酸が選択される。ＬＴＭは、９つの選択されたアミノ酸の１つによって各「野生型」残基が系統的に置換されている、単一変異の位置的系列をＣＤＲ内に生成する。変異を受けたＣＤＲは、全ての変異タンパク質の定量的ディスプレイに対して抑制的となることなく、複雑性とサイズが増大したコンビナトリアル一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ライブラリーを作製するために組み合わされる。陽性選択後に、改善された結合を有するクローンが配列決定され、有益な変異がマッピングされる。
エラープローンＰＣＲ−エラープローンＰＣＲでは、異なる選択のラウンド間で、核酸の無作為化を行う。使用されるポリメラーゼの固有のエラー率によって、無作為化は低い割合で起こるが、転写の間に、高い固有のエラー率を有するポリメラーゼを用いるエラープローンＰＣＲ（Ｚａｃｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：７７５−７８３，１９９９）によって増大させることができる（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２２６：８８９−９６，１９９２）。変異サイクルの後、本分野において定型的な方法を用いて、抗原に対して改善された親和性を有するクローンが選択される。
所望の活性に関して、抗ヘプシジン抗体又はその変形物を調製及びスクリーニングするために、遺伝子シャッフリング及び誘導された進化を用いる技術も使用し得る。例えば、「Ｊｅｒｍｕｔｕｓ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．，９８（１）：７５−８０（２００１）」は、ｓｃＦｖのｏｆｆ速度又は熱力学的な安定性を進化させるために、リボソームディスプレイを基礎とする目的に合わせた（ｔａｉｌｏｅｒｅｄ）インビトロ選択戦略がＤＮＡシャッフリングによるインビトロでの多様化と組み合わされることを示した。「Ｆｅｒｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２００４ Ｊａｎ−Ａｐｒ；２５（１−２）：７−１３」は、ＤＮＡシャッフリングと組み合わせたファージディスプレイの使用がほぼ三桁の規模で親和性を上昇させることを報告した。「Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０００Ｆｅｂ．２９；９７（５）：２０２９−２０３４」は、（ｉ）高変異ライブラリー中に、予想外に高い頻度で機能的クローンが出現すること、（ｉｉ）機能獲得変異体が、このようなライブラリー中に良好に提示されること、及び（ｉｉｉ）より高い親和性をもたらすｓｃＦｖ変異の大半は結合部位から離れた残基に対応していることを報告した。
これに代えて又はこれに加えて、抗体と抗原間の接触点を特定するために、抗原抗体複合体の結晶構造を解析すること、又はこのような接触点をモデル化するためにコンピュータソフトウェアを使用することが有益であり得る。このような接触残基及び隣接する残基は、本明細書に詳述されている技術に従った置換の候補である。一旦、このような変形物が作製されたら、このような変形物を本明細書中に記載されているスクリーニングに供し、１つ又はそれ以上の適切なアッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択し得る。
修飾された炭水化物を有する抗体
例えば、特異的結合剤若しくは抗体へ結合された炭水化物部分の１つ若しくはそれ以上を付加若しくは欠失させて、及び／又は特異的結合剤若しくは抗体中の１つ若しくはそれ以上のグリコシル化部位を付加若しくは欠失させて、親抗体に比べて修飾されたグリコシル化パターンを有する抗体変形物も作製することができる。
抗体を含むポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型又はＯ結合型の何れかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を表す。トリペプチド配列：アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。ポリペプチド中におけるこれらのトリペプチド配列の何れかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作出する。従って、Ｎ結合型グリコシル化部位は、特異的結合剤又は抗体がこれらのトリペプチド配列の１つ又はそれ以上を含有するようにアミノ酸配列を変化させることによって、特異的結合剤又は抗体に付加され得る。Ｏ結合型グリコシル化は、糖：Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的には、セリン又はスレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用し得る。）への付着を表す。元の特異的結合剤又は抗体の配列へ、１つ又はそれ以上のセリン又はスレオニン残基を挿入又は置換することによって、特異的結合剤又は抗体にＯ結合型グリコシル化部位を付加し得る。
改変されたエフェクター機能
抗体又はＦｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域中において、システイン残基を除去し又は導入することにより、この領域中の鎖間ジスルフィド結合の形成を除去又は増加させ得る。このようにして作製されたホモ二量体の特異的結合剤又は抗体は、改善された内部取り込み能力及び／又は増大された補体媒介性細胞死滅及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。「Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）」及び「Ｓｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）」を参照されたい。ホモ二量体の特異的結合剤又は抗体は、「Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：２５６０−２５６５（１９９３）」に記載されているように、ヘテロ二機能性架橋剤を用いても調製され得る。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、これにより増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有し得る特異的結合剤又は抗体を改作することができる。「Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９−２３０（１９８９）」を参照されたい。
ＣＤＲ内の配列は抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させ、望ましくないヘルパーＴ細胞応答の引き金を引かせ得ることが示されている。保存的置換は、特異的結合剤又は抗体に結合活性を保持させつつ、望ましくないＴ細胞応答の引き金を引く能力を低下させることができる。重鎖又は軽鎖のＮ末端の２０アミノ酸の１つ又はそれ以上を除去することも想定される。
幾つかの実施形態において、本発明は、改善されたＡＤＣＣ活性を示す、フコシル化が存在しない又は低下した抗体分子など、改変されたエフェクター活性をもたらす改変された炭水化物構造を有する抗体分子の作製も想定する。様々な方法が、これを達成するために本分野において公知である。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、ＦｃγＲＩＩＩ受容体への抗体分子の結合によって媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７におけるＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。フコシル化されていない抗体は、増大した親和性でこの受容体を結合し、固有のフコシル化された抗体より効率的に、ＦｃγＲＩＩＩによって媒介されるエフェクター機能の引き金を引く。例えば、α−１，６−フコシル転移酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞中での非フコシル化された抗体の組換え生産は、１００倍増加したＡＤＣＣ活性を有する抗体をもたらす（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００４ Ｓｅｐ ５；８７（５）：６１４−２２）。類似の効果は、フコシル化経路中のこの酵素又は他の酵素の活性を減少させることを通じて（例えば、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ処理を通じて）、酵素をノックアウトするために細胞株を操作することを通じて、又は選択的なグリコシル化阻害剤とともに培養することを通じて達成することが可能である（Ｒｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．１９８９Ｄｅｃ；２６（１２）：１１１３−２３）。幾つかの宿主細胞系統、例えば、Ｌｅｃ１３又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、より低いフコシル化レベルを有する抗体を天然に産生する。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２Ｊｕｌ２６；２７７（３０）：２６７３３−４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｊａｎ ３１；２７８（５）：３４６６−７３。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞中で抗体を組換え的に生産することを通じて、二つに分岐された炭水化物のレベルを増加させることも、ＡＤＣＣ活性を増加させることが決定されている。Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９ Ｆｅｂ；１７（２）：１７６−８０。２つのフコース残基の１つのみが存在しないことが、ＡＤＣＣ活性を増加させるのに十分であり得ることが予測されている（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｄｅｃ ５）。
他の共有結合的修飾
ポリペプチド又は抗体の共有結合的修飾も、本発明の範囲内に含められる。共有結合的修飾は、適宜、化学的合成によって、又はポリペプチド若しくは抗体の酵素的若しくは化学的切断によって作製され得る。選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応することができる有機性誘導化剤と、標的とされるアミノ酸残基を反応させることによって、共有結合的修飾の他の種類を導入することができる。
システイン残基は、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を与えるために、最も一般的には、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドなどのα−ハロアセタート（及び対応するアミン）と反応される。システイン残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスファート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル−２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾアート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導化される。
ジエチルピロカルボナートはヒスチジン側鎖に対して比較的特異的であるので、ヒスチジン残基は、ｐＨ５．５から７．０でこの試薬と反応させることによって誘導化される。ｐ−ブロモフェナシルブロミドも有用である。反応は、好ましくは、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中において、ｐＨ６．０で行われる。
リジン及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸の無水物と反応させる。これらの薬剤での誘導化は、リジン残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノを含有する残基を誘導化するための他の適切な試薬には、メチルピコリンイミダートなどのイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロ水素化ホウ素、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン及びトランスアミナーゼによって触媒されるグリオキシラートとの反応が含まれる。
アルギニン残基は、１つ又は数個の慣用の試薬、とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応によって修飾される。グアニジン官能基の高いｐＫａのために、アルギニン残基の誘導化は、アルカリ条件で反応が実施されることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジンの基及びアルギニンのε−アミノ基と反応し得る。
チロシン残基の特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によって、チロシン残基中にスペクトル標識を導入することに特に興味を持って行い得る。最も一般的には、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシン種及び３−ニトロ誘導体を形成するために、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンが使用される。放射性イムノアッセイにおいて使用するために標識されたタンパク質を調製するために、１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いて、チロシン残基がヨウ素化される。
カルボキシ側鎖基（アスパラギン又はグルタミン）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｎ−Ｒ’）（Ｒ及びＲ’は、異なるアルキル基である。）との反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギン及びグルタミン残基へ転化される。
グルタミン及びアスパラギン残基は、しばしば、それぞれ、対応するグルタミン酸及びアスパラギン酸残基へと脱アミド化される。これらの残基は、中性又は塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化された形態は、本発明の範囲に属する。
他の修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリン又はスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化及びあらゆるＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
共有結合的修飾の別の種類には、特異的結合剤又は抗体へ、化学的又は酵素的にグリコシドを連結することが含まれる。これらの操作は、Ｎ又はＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞中でポリペプチド又は抗体を作製する必要がないという点で有利である。使用されるカップリングの様式に応じて、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離のスルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン若しくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離のヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンのものなどの芳香族残基又は（ｆ）グルタミンのアミド基に糖を付着させ得る。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０号に、及び「Ａｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）」に記載されている。
ポリペプチド又は抗体上に存在するあらゆる炭水化物部分の除去が、化学的に又は酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は同等の化合物へ特異的結合剤又は抗体を曝露させることを必要とする。この処理は、特異的結合剤又は抗体を完全な状態に保ちながら、結合している糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）以外の殆ど又は全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、「Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）」によって、及び「Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）」によって記載されている。特異的結合剤又は抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、「Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）」によって記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。
本発明のヘプシジン活性アンタゴニスト（抗ヘプシジン抗体又はヘプシジン変形物を含む。）の共有結合的修飾の別の種類は、様々な非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化されたポリオール、ポリオキシエチル化されたソルビトール、ポリオキシエチル化されたグルコース、ポリオキシエチル化されたグリセロール、ポリオキシアルキレン又はデキストランなどの多糖ポリマー）の１つへ、ポリペプチド、特異的結合剤又は抗体を連結することを含む。このような方法は本分野において公知であり、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；米国特許第４，４９６，６８９号；米国特許第４，３０１，１４４号；米国特許第４，６７０，４１７号；米国特許第４，７９１，１９２号、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，７６６，１０６号、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，４９５，２８５号、米国特許第４，６０９，５４６号又は欧州特許第３１５４５６号を参照されたい。
Ｖ．遺伝子治療
適切な細胞へのヘプシジンアゴニスト又はアンタゴニストの送達は、本分野において公知のあらゆる適切なアプローチの使用によって、エキソビボ、インサイチュ又はインビボでの遺伝子治療を介して実施することができる。例えば、インビボ治療の場合、所望のヘプシジン活性アンタゴニスト又はヘプシジン発現阻害剤をコードする核酸は、単独で、又はベクター、リポソーム若しくは沈殿物と組み合わせて、対象中へ直接注射され得、幾つかの実施形態では、ヘプシジン活性アンタゴニスト又はヘプシジン発現阻害剤の発現が望まれる部位へ注射され得る。エキソビボ治療の場合、対象の細胞を取り出し、これらの細胞中に核酸を導入し、修飾された細胞を直接対象に戻し、又は、例えば、患者中に移植される多孔性膜内に封入されて対象に戻される。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号及び米国特許第５，２８３，１８７号を参照されたい。
生きた細胞中に核酸を導入するために利用できる様々な技術が存在する。技術は、核酸が培養された細胞中へインビトロで転移されるか、又は予定される宿主の細胞中にインビボで転移されるかに応じて変動する。哺乳動物の細胞中へのインビトロでの核酸の転移に適した技術には、リポソーム、電気穿孔、微小注入、細胞融合、化学的処理、ＤＥＡＥ−デキストラン及びリン酸カルシウム沈殿の使用が含まれる。他のインビボ核酸転移技術には、ウイルスベクター（アデノイルス、単純ヘルペスＩ型ウイルス、アデノ随伴ウイルス又はレトロウイルスなど）及び脂質をベースとする系を用いた形質移入が含まれる。核酸及び形質移入剤は、場合によって、微粒子を伴う。典型的な形質移入剤には、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム同時沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介される形質移入、四級アンモニウム両親媒性物質ＤＯＴＭＡ（（ジオレオイルオキシプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬによってＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎとして市販されている。））（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，７４１３−７４１７；Ｍａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，６０７７−６０８１）；懸垂トリメチルアンモニウム頭部を有する親油性グルタミン酸ジエステル（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０２３，１２４−１３２）；陽イオン性脂質ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）などの代謝可能な親脂質）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）（Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒ（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２７，５８６１−５８６４；Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，６９８２−６９８６）；代謝可能な四級アンモニウム塩（ＤＯＴＢ、Ｎ−（１−［２，３−ジオレオイルオキシ］プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジオレオイルエステル、ＣｈｏＴＢ、ＣｈｏＳＣ、ＤＯＳＣ）（Ｌｅｖｅｎｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｉｎｔｅｒ．２２，２３５−２４１）；３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｉ）、１対１混合物中のジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０６５，８−１４）、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミン（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ，１９９４，５：３８２−３８９）、親油性ポリリジン（ＬＰＬＬ）（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ９３９，８−１８）、過剰のホスファチジルコリン／コレステロール（Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ９３９，８−１８）［［（１，１，３，３−テトラメチルブチル）クレゾキシ］エトキシ］エチル］ジメチルベンジルアンモニウム水酸化物（ＤＥＢＤＡ水酸化物）セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）／ＤＯＰＥ混合物（Ｐｉｎｎａｄｕｗａｇｅ ｅｔ ａｌ，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ９８５，３３−３７）、ＤＯＰＥ、ＣＴＡＢ、ＤＥＢＤＡ、ジドデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）を加えたグルタミン酸の親油性ジエステル（ＴＭＡＧ）並びにホスファチジルエタノールアミンと混合されたステアリルアミン（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ１０，５２０−５２５）、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（ＴｒａｎｓｆｅｃｔＡＣＥ、ＧＩＢＣＯＢＲＬ）及び脂質を有するオリゴガラクトースが含まれる。転移の効率性を増加させる典型的な形質移入増強剤には、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、リソゾーム破壊性ペプチド（Ｏｈｍｏｒｉ Ｎ Ｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｊｕｎ．２７，１９９７；２３５（３）：７２６−９）、コンドロイタンをベースとするプロテオグリカン、硫酸化されたプロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリジン（Ｐｏｌｌａｒｄ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９８ ２７３（１３）：７５０７−１１）、インテグリン結合ペプチドＣＹＧＧＲＧＤＴＰ、直鎖デキストラン九糖、グリセロール、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシド間結合に係留されたコレステロール基（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．１９８９ ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ ８６：（１７）：６５５３−６）、リゾホスファチド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン及び１−オレオイルリゾホスファチジルコリンが含まれる。
幾つかの状況では、核酸含有ベクターを標的細胞へ誘導する薬剤を用いて核酸を送達することが望ましい場合があり得る。このような「標的化」分子には、標的細胞上の細胞表面膜タンパク質に対して特異的な抗体又は標的細胞上の受容体に対するリガンドが含まれる。リポソームが使用される場合には、標的に誘導するために及び／又は取り込みを促進するために、エンドサイトーシスと関連する細胞表面膜タンパク質へ結合するタンパク質を使用し得る。このようなタンパク質の例には、特定の細胞種に対する指向性を有するキャプシドタンパク質及びその断片、循環して内部移行を行うタンパク質に対する抗体並びに細胞内局所化を標的化し、細胞内半減期を増大させるタンパク質が含まれる。他の実施形態において、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを使用することができる。このような方法は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７又はＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０に記載されている。現在公知の遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコールの概説に関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ１９９２を参照されたい。ＷＯ９３／２５６７３号及びその中に引用されている参考文献も参照されたい。遺伝子治療技術のさらなる概説に関しては、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１（１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ｖｏｌ．３９２，ｎｏ６６７９，ｐｐ．２５−３０（１９９８）；Ｖｅｒｍａ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ：６８−８４（１９９０）；及びＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５４６０（１９９２）を参照されたい。
ＶＩ．ヘプシジンアンタゴニストを用いたヘプシジン関連疾患に対する診断方法及び治療の監視
ヘプシジン関連貧血又はヘプシジン過剰又はヘプシジン欠乏の他の疾患などのヘプシジン関連疾患を診断するための方法及びヘプシジン活性アンタゴニスト又はヘプシジン発現阻害剤を用いた治療法を含むこのような疾病に対する治療の有効性を監視する方法も提供される。ヘプシジン関連貧血の存在又は不存在を決定するために、免疫複合体の形成が可能となるのに十分な条件下及び時間にわたって、患者から得られた生物試料を本明細書に開示されている抗ヘプシジン抗体の１つ又はそれ以上と接触させる。次いで、生物試料中の抗ヘプシジン抗体とヘプシジン間で形成された免疫複合体が検出される。試料中のヘプシジンの量は、抗体とヘプシジンの間で形成された免疫複合体の量を測定することによって定量される。ある種の方法の中で、生物試料は患者から単離され、本明細書中に開示されている抗ヘプシジン抗体の１つ又はそれ以上とともに温置され、ある閾値を上回る抗体−ヘプシジン複合体のレベルはヘプシジン関連貧血の存在と相関付けられ、前記閾値を下回るレベルは患者がヘプシジン関連貧血を有する可能性が少ないことを示唆する。例えば、正常な範囲内のレベルは、患者がヘプシジン関連貧血を有する可能性が少ないことを示唆する。血清ヘプシジンの正常な範囲は、ある種のアッセイ、すなわち、共有された米国特許出願１１／８８０，３１３号及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６４７７号（これらの開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている質量分析技術によって測定された場合、一般に１０ｎｇ／ｍＬ未満であるが、アッセイに応じて、及び検査されている集団の亜集団に応じて変動する。
炎症性疾患を非炎症性疾患から識別する方法も提供される。炎症性疾患の存在又は不存在を決定するために、免疫複合体の形成が可能となるのに十分な条件下及び時間にわたって、患者から得られた生物試料を本明細書に開示されている抗ヘプシジン抗体の１つ又はそれ以上と接触させる。ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノ放射性測定アッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、（例えば、コロイド金、酵素又は放射性同位体標識を使用する）インサイチュイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ及び免疫電気泳動アッセイなどの技術を使用する競合及び非競合アッセイ系を含む（但し、これらに限定されない。）、本分野において公知の様々なイムノアッセイを使用することができる。一実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態において、一次抗体は、一次抗体への二次抗体又は試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、二次抗体は標識されている。イムノアッセイにおける結合を検出するための多くの手段が本分野において公知であり、本発明の範囲に属する。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）ｂｙ Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ若しくはより最近の版；Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｇｏｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｐ．（ｅｄ．）（２００１）若しくはより最近の版；及び／又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）（定期的に新版が発行されている。）。このようなアッセイの例は、表面又はマトリックスに付着された抗体、添加される患者の血清及び複合体が形成される時間、結合されていない複合体を除去するための適切な洗浄操作、この後に行われる、複合体の検出を可能とするための第二の抗体（サンドイッチＥＬＩＳＡ）又は抗体表面（競合ＥＬＩＳＡ）上の遊離のヘプシジン結合部位を検出するためのヘプシジンの検出可能な様式の添加を通常含む。先述の方法によって検出された、ある閾値を上回るヘプシジンのレベルは、炎症性疾患の存在と相関付けられ、前記閾値を下回るレベルは、患者が炎症性疾患を有する可能性が少ないことを示唆する。患者は、ヘプシジンレベルが正常な範囲内にある場合には、炎症性疾患を有する可能性が少ない。ヘプシジンレベルが正常な範囲、例えば、２０ｎｇ／ｍＬを超える場合、特に、レベルが２０と１０００ｎｇ／ｍＬの間にある場合には、患者は、炎症性疾患を有する可能性が高い。典型的なヘプシジン関連炎症性疾患には、癌の貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、化学療法によって誘発された貧血、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、終末段階の腎臓病、慢性腎不全、うっ血性心不全、癌、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、Ｈ．ピロリ感染又は他の細菌感染症、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ及び他のウイルス疾患、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、膵炎、敗血症、脈管炎、鉄欠乏症、低色素性小球性貧血及びヘプシジン過剰を伴う症状が含まれる。
他の方法において、患者から得られた生物試料は、ヘプシジンのレベルに関して検査される。生物試料は、免疫複合体の形成を可能とするのに十分な条件下及び時間にわたって、本明細書に開示されている抗ヘプシジン抗体の１つ又はそれ以上とともに温置される。次いで、ヘプシジンとヘプシジンに特異的に結合する生物試料中の抗体との間で形成される免疫複合体が検出される。このような方法において使用するための生物試料は、ヘプシジンを含有することが予想される患者から得られたあらゆる試料であり得る。適切な生物試料には、血液、血清、血漿、尿及び骨髄が含まれる。適切な抗体には、ヒト細胞、げっ歯類、ウサギ、ヤギ、ラクダ又は他のあらゆる種から得られる抗体が含まれる。
生物試料は、ヘプシジンとヘプシジンに対して免疫特異的である抗体との間で免疫複合体が形成するのに十分な条件及び時間で、反応混合物中において抗体とともに温置される。例えば、生物試料及び１つ又はそれ以上の抗ヘプシジン抗体は、４℃で、２４から４８時間温置され得る。
温置後、反応混合物は、免疫複合体の存在に関して検査される。抗ヘプシジン抗体と生物試料中に存在するヘプシジン間で形成される免疫複合体の検出は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの様々な公知の技術によって達成され得る。適切なアッセイは本分野において周知であり、科学文献及び特許文献中に多数記載されている（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８）。使用され得るアッセイには、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ技術（米国特許第４，３７６、１１０号）；モノクローナル−ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Ｗｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９７０）；「ウェスタンブロット」法（米国特許第４，４５２，９０１号）；標識されたリガンドの免疫沈降（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０）；酵素連結免疫吸着検定法（Ｒａｉｎｅｓ ａｎｄ Ｒｏｓｓ，１９８２）；蛍光色素の使用を含む免疫細胞化学的技術（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９８０）；及び活性の中和（Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４）が含まれるが、これらに限定されない。他のイムノアッセイには、米国特許第３，８１７，８２７号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，９０１，６５４号；米国特許第３，９３５，０７４号；米国特許第３，９８４，５３３号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，０３４，０７４号及び米国特許第４，０９８，８７６号に記載されているものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
検出のために、抗ヘプシジン抗体は標識され得、又は非標識とされ得る。非標識抗体は、凝集アッセイにおいて又は免疫複合体に結合する標識された検出試薬（例えば、ヘプシジンに特異的に結合する抗体に結合することができる、抗免疫グロブリン、プロテインＧ，プロテインＡ又はレクチン及び二次抗体又はその抗原結合断片）と組み合わせて使用され得る。抗ヘプシジン抗体が標識されている場合、レポーター基は、放射性同位体、蛍光性の基（例えば、フルオレセイン又はローダミン）、発光性の基、酵素、ビオチン及び色素粒子などの、本分野において公知のあらゆる適切なレポーター基であり得る。それ自体を直接検出できる標識には、蛍光性又は発光性色素、金属又は金属キレート物質、電気化学的標識、放射性核種（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ又は１３１Ｉ）、磁気標識又はビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）、常磁性標識又は比色分析標識（例えば、コロイド金、着色されたガラス又はプラスチックビーズ）が含まれる。このような検出可能な標識は、抗ヘプシジン抗体若しくは検出試薬へ直接連結され得、又は抗ヘプシジン抗体若しくは検出試薬へ付着されたビーズ若しくは粒子と結合され得る。標識された特異的な結合対の結合を通じて検出可能な標識には、ビオチン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルヒ酸、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡが含まれる。検出可能な反応産物の産生によって間接的に検出することができる間接的標識には、適切な基質を切断して着色された又は蛍光性の反応産物を形成する、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ若しくは他の糖オキシダーゼ又はルシフェラーゼなど、本分野において周知の様々な酵素が含まれる。
ある種のアッセイにおいて、生物試料中のヘプシジンを捕捉する「捕捉剤」（又は試薬）として使用するために、非標識抗ヘプシジン抗体は固体支持体上に固定化される。固体支持体は、抗体を付着させ得る、当業者に公知のあらゆる材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレート又はニトロセルロース又は他の適切な膜中の検査ウェルであり得る。あるいは、支持体は、ガラス、繊維ガラス、ラテックス又はポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン若しくはポリ塩化ビニルなどのプラスチック材料又は多孔性マトリックスなどの、チューブ、ビーズ、粒子又は円板であり得る。他の材料には、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ナイロン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、セルロース又は多糖が含まれる。支持体は、例えば米国特許第５，３５９，６８１号に開示されているものなどの、磁気粒子又は光ファイバーセンサーでもあり得る。固定化された抗ヘプシジン抗体は、ポリクローナル抗体、又は本明細書中に記載されているものなどの１つ若しくはそれ以上のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体と１つ若しくはそれ以上のモノクローナル抗体の組み合わせであり得る。抗体は、特許文献及び科学文献中に多数記載されている当業者に公知の様々な技術を用いて、固体支持体上に固定化され得る。本発明において、「固定化」という用語は、吸着などの非共有的会合及び共有的付着（抗原と支持体上の官能基の間の直接的結合であり得、又は架橋剤を介した連結であり得る。）の両方を表す。マクロタイタープレート中のウェルへの又は膜への吸着による固定化が想定される。このような事例では、吸着は、適切な時間にわたって、適切な緩衝液中で、抗ヘプシジン抗体を固体支持体と接触させることによって達成され得る。接触時間は温度とともに変動するが、典型的には、約１時間と約１日の間である。一般に、約１０ｎｇから約１０μｇ、好ましくは約１００ｎｇから約１μｇの範囲のペプチドの量と、プラスチックマイクロタイタープレート（ポリスチレン又はポリ塩化ビニルを含む。）のウェルを接触させることが、ペプチドの十分な量を固定化するのに十分である。
固定化の後、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的には、封鎖される。ウシ血清アルブミン、ＴｗｅｅｎＴＭ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、熱不活化された正常ヤギ血清（ＮＧＳ；ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）又はＢＬＯＴＴＯ（防腐剤、塩及び消泡剤も含有する無脂肪ドライミルクの緩衝化された溶液）などの、当業者に公知のあらゆる適切なブロッキング剤を使用することができる。次いで、支持体は、ヘプシジンを含有すると疑われる生物試料とともに温置される。試料は、希釈せずに適用することが可能であり、又は、より頻繁には、ＢＳＡ、ＮＧＳ又はＢＬＯＴＴＯなどの、タンパク質の少量（０．１重量％から５．０重量％）を含有する緩衝化された溶液中に、通常希釈するすることができる。一般に、適切な接触時間（すなわち、温置時間）は、ヘプシジンを含有する試料内のヘプシジンに対して免疫特異的である抗体又は抗原結合断片の存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、接触時間は、結合された抗体と結合されていない抗体又は抗体断片との間の平衡において達成される結合レベルの少なくとも約９５％である結合レベルを達成するのに十分である。当業者は、平衡状態を達成するのに必要な時間は、ある期間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを認識する。室温では、約３０分の温置時間が一般に十分である。
次いで、０．１％ＴｗｅｅｎＴＭ２０を含有するＰＢＳなどの適切な緩衝液で固体支持体を洗浄することによって、結合されていない試料を除去し得る。次いで、（捕捉剤と試料からのヘプシジンの結合によって形成された）免疫複合体中のヘプシジンへ結合する検出試薬を添加し得る。このような検出試薬は、ポリクローナル抗体又は本明細書中に記載されているものなどの１つ若しくはそれ以上のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体と本明細書に記載されているものなどの１つ若しくはそれ以上のモノクローナル抗体との組み合わせ又はあらゆる抗体のＦａｂ画分であり得る。検出試薬は、直接標識され得る、すなわち、少なくとも第一の検出可能な標識又は「レポーター」分子を含む。あるいは、検出試薬は、非標識抗ヘプシジン抗体であり得る。この非標識抗ヘプシジン（一次）抗体は、次いで、一次抗体への標識された二次抗体又は試薬の結合によって検出される。例えば、一次抗体がマウス免疫グロブリンである場合には、二次抗体は、標識された抗マウス免疫グロブリン抗体であり得る。同様に、一次抗体がウサギ免疫グロブリンである場合には、二次抗体は、標識された抗ウサギ免疫グロブリン抗体であり得る。
検出試薬は、結合された抗体又はその抗原結合断片を検出するのに十分な時間にわたって、免疫複合体とともに温置される。一般に、適切な時間の長さは、ある期間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、結合されていない標識又は検出試薬は除去され、適切なアッセイ又は分析装置を用いて、結合された標識又は検出試薬が検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性標識に関しては、シンチレーションカウンティング又はオートラジオグラフィー法が一般に適切である。色素、発光性又は化学発光性部分及び様々な色素原、蛍光標識などを検出するために、分光学的方法が使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基（一般に、放射性若しくは蛍光性の基又は酵素）に結合されたアビジンを用いて検出され得る。（西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びグルコースオキシダーゼを含む）酵素レポーター基は、（一般に、特定の時間にわたる）基質の添加後における反応産物の分光学的又は他の分析によって一般に検出され得る。使用される具体的な方法に関わらず、バックグラウンド（すなわち、ヘプシジンの正常なレベルを有する個体から得られた生物試料に対して観察されるレベル）より少なくとも２倍大きな結合された検出試薬のレベルは、ヘプシジンの発現と関連する疾患の存在を示唆する。
別の実施形態において、試料と検出試薬は、逐次的に添加されるのではなく、捕捉剤と同時に接触され得る。さらに別の選択肢において、試料と検出試薬は、予め一緒に温置され、次いで、捕捉剤へ添加され得る。他の変形が、当業者に自明である。
別の実施形態において、試料中に存在するヘプシジンの量は、競合的結合アッセイによって測定される。競合的結合アッセイは、抗ヘプシジン抗体の限定された量との結合に関して、検査試料分析物（ヘプシジンポリペプチド）と競合する標識された標準物質（例えば、ヘプシジンポリペプチド又は免疫学的に反応性を有するその一部）の能力に依存する。遊離の及び結合されたヘプシジンの分離後に、公知の標準物質に対して結合／非結合ヘプシジンの比を関連付けることによって、ヘプシジンが定量される。検査試料中のヘプシジンポリペプチドの量は、抗体に結合された状態となった標準物質の量と反比例する。結合された状態となった標準物質の量の測定を促進するために、抗体に結合された標準物質と分析物質が、結合されていないままの標準物質及び分析物から都合よく分離され得るように、典型的には、抗体は、固体支持体上に固定化される。従って、このような実施形態において、本発明は、標識された成熟ヘプシジン（又はヘプシジンの抗原性を保持する標識されたその断片）及び成熟ヘプシジンへ結合する抗体と生物試料を接触させること、並びに形成された、抗体標識されたヘプシジン複合体の量を検出することを想定する。
固体支持体又は検出可能な標識への連結物の調製は、しばしば、化学的架橋剤の使用を含む。架橋試薬は少なくとも２つの反応性の基を含有し、一般に、ホモ官能性架橋剤（同一の反応性基を含有する。）及びヘテロ官能性架橋剤（同一でない反応性基を含有する。）に分けられる。アミン、スルフヒドリルを通じて連結する又は非特異的に反応するホモ二官能性架橋剤は、多くの市販先から入手可能である。マレイミド、ハロゲン化アルキル及びアリール、α−ハロアシル並びにピリジルジスルフィドは、チオール反応性の基である。マレイミド、ハロゲン化アルキル及びアリール並びにα−ハロアシルは、スルフヒドリルと反応して、チオールエーテル結合を形成するのに対して、ピリジルジスルフィドはスルフヒドリルと反応して、混合されたジスルフィドを産生する。ピリジルジスルフィド産物は、切断可能である。イミドエステルは、タンパク質−タンパク質架橋に対しても極めて有用である。
ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質の特定の基との逐次的連結を可能とする２つ又はそれ以上の異なる反応性基を有しており、望ましくない重合又は自己連結を最小限に抑える。アミンの修飾が困難である場合にも、ヘテロ二官能性試薬が使用される。アミンは、時には、高分子の活性部位において見出され得、これらの修飾は活性の喪失をもたらし得る。スルフヒドリル、カルボキシル、フェノール及び炭水化物などの他の部分は、より適切な標的であり得る。二段階戦略は、他の接近可能な基を有するタンパク質へのタンパク質のアミンの修飾を耐容することができるタンパク質の結合を可能とする。各々が首尾よい連結のための異なる属性を組み合わせている様々なヘテロ二官能性架橋剤は、市販されている。一端がアミン反応性であり、他端がスルフヒドリル反応性である架橋剤は、極めて一般的である。ヘテロ二官能性試薬を使用するのであれば、効果的な架橋を確保し、望ましくない重合を避けるために、典型的には、最も不安定な基を最初に反応させる。
本明細書中の実施例２７から２８に示されているように、炎症の貧血及び癌の貧血など、ある種の病状に対する診断となるのは、プロヘプシジン（配列番号８のアミノ酸２５から８４）のレベルではなく、成熟ヘプシジン（配列番号８のアミノ酸６０から８４）のレベルである。従って、好ましい一実施形態において、成熟した、適切に折り畳まれたヘプシジン（配列番号９）に結合する抗体は、捕捉剤と検出試薬の何れとしても使用される。天然に存在するＮ末端切断された様式（例えば、成熟ヘプシジンのＮ末端アミノ酸の最大２個又は最大５個を欠如する。）に結合する抗体も使用され得る。捕捉剤及び検出試薬の様々な組み合わせが想定される。例えば、捕捉剤は、成熟ヘプシジンの第一のエピトープに結合するモノクローナル抗体であり得、検出試薬は、成熟ヘプシジンの第二のエピトープに結合する異なるモノクローナル抗体であり得る。好ましくは、捕捉剤と検出試薬間での競合又は干渉を最小限に抑えるために、ヘプシジンの異なるエピトープに対して特異的な抗体が使用される。あるいは、捕捉剤は成熟ヘプシジンに結合するポリクローナル抗体であり得、検出試薬はモノクローナル抗体であり得る。さらに別の選択肢として、捕捉剤は成熟ヘプシジンに結合するモノクローナル抗体であり得、検出試薬はポリクローナル抗体であり得る。前記実施形態の何れにおいても、捕捉剤又は検出試薬の何れもが、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の組み合わせであり得る。
幾つかの実施形態において、成熟ヘプシジン特異的モノクローナル抗体は、捕捉剤若しくは検出試薬又は両者として、使用される。成熟ヘプシジン特異的抗体は、プロヘプシジンを全く結合せず、又は抗体が成熟ヘプシジンをプロヘプシジンから識別できるほど低い親和性でプロヘプシジンに結合する。例えば、このようなモノクローナル抗体は、成熟ヘプシジンのＮ末端に結合し得、又は（例えば、プロドメインによる遮蔽のために）プロヘプシジン中には検出できない成熟ヘプシジンのエピトープを結合し得る。
成熟ヘプシジンとプロヘプシジンの両方に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体を使用する実施形態において、さらなる精緻化が場合によって想定される。成熟ヘプシジン単独の量は、同じ試料中に存在する総ヘプシジン（プロヘプシジン＋成熟ヘプシジン）の量から試料中に存在するプロヘプシジンの量を差し引くことによって測定される。プロヘプシジンの量は、上記されているような技術において、プロヘプシジン特異的ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を使用することによって求めることができる。プロヘプシジン特異的抗体は、成熟ヘプシジンを全く結合せず、又は抗体がプロヘプシジンを成熟ヘプシジンから識別できるほど低い親和性で成熟ヘプシジンに結合する。例えば、このような抗体は、ヘプシジンのプロドメイン（配列番号８のアミノ酸２５から５９）中のみに存在する直鎖又は立体的エピトープに結合し得る。このような実施形態において、総ヘプシジン及びプロヘプシジンの量は、逐次的に又は同時に測定され得る。血清中において、プロヘプシジンは素早くヘプシジンへ分解されるので、幾つかの実施形態において、プロヘプシジンの分解を抑制又は低減するために、フューリン阻害剤が生物試料に添加される。
２５アミノ酸の成熟ヘプシジンに結合するモノクローナル抗体を使用する幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、分解産物（すなわち、ヘプシジン−２２及びヘプシジン−２０）を結合しない。
総ヘプシジン及びプロヘプシジンを検出するための同時アッセイの一実施形態において、捕捉剤は、成熟ヘプシジンとプロヘプシジンの両方に存在するエピトープに結合する抗体であり、２つの検出試薬は同時に適用される。第一の検出試薬は、成熟ヘプシジンとのプロヘプシジンの両方に存在するエピトープに結合する標識された抗体であり、第二の検出試薬は、異なって標識されたプロヘプシジン特異的抗体である。例えば、第一の検出試薬は第一の波長で検出可能な蛍光色素で標識されているのに対して、第二の検出試薬は第二の波長で検出可能な蛍光色素で標識されている。従って、このような例では、捕捉剤は、試料中の総ヘプシジン（成熟ヘプシジン＋プロヘプシジン）を結合し、第一の検出試薬は総ヘプシジンの量を検出し、第二の検出試薬はプロヘプシジンの量を検出する。総ヘプシジンの量からプロヘプシジンの量を差し引くことによって、成熟ヘプシジンの量が得られる。他の別の実施形態において、２つの異なる捕捉剤（成熟ヘプシジンとプロヘプシジンの両者に存在するエピトープに結合する第一の捕捉剤及びプロヘプシジン特異的抗体である第二の捕捉剤）は、場合によって、成熟ヘプシジンとプロヘプシジンの両者に存在するエピトープを結合する検出試薬とともに使用し得る。
例えば、「Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３（１）４５−５２（Ｊａｎ．２００６）」に記載されている、蛍光性マイクロビーズの異なるコードが与えられた組を用いる多重系など、同時アッセイを実施するための他の実施形態が本分野において周知である。単一の表面に対する多重同時アッセイを実施するための他の実施形態には、複数の異なる分析物を検出するために、複数の分離された指定可能な位置を有する表面が含まれる。このような規格には、タンパク質マイクロアレイ又は「タンパク質チップ」（例えば、Ｎｇ ａｎｄ Ｉｌａｇ，Ｊ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｍｅｄ．６：３２９−３４０（２００２）参照）及びキャピラリー装置（例えば、米国特許第６，０１９，９４４号を参照されたい。）が含まれる。これらの実施形態において、それぞれの分離された表面位置は、各位置における検出のために異なる分析物を固定化する異なる抗体を有する。あるいは、表面は、表面の分離した位置に固定化された１つ又はそれ以上の分離した粒子（例えば、微粒子又はナノ粒子）を有することができ、粒子の各組は、異なる分析物に対する異なる捕捉剤を含有する。
相補的な抗体対（対がサンドイッチアッセイにおいて使用するのに適するように、ヘプシジン上の異なるエピトープに結合する抗体）は、同定するのが困難であった。競合又は干渉を最小限に抑える相補対の使用は、アッセイの感度を２０倍から５０倍増加させることができる。幾つかの実施形態において、本発明のイムノアッセイは、０．０１ｎｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲のヘプシジンレベルを測定することができる。
サンドイッチイムノアッセイにおける使用に適した抗体対には、以下のものが含まれる。
（１）前記対の１つの抗体が抗体１Ｓ１と同じエピトープに結合する抗体である場合、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１Ｓ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する場合には、適切な第二の抗体は、以下の抗体であり得る。
（ａ）抗体２３Ｆ１１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体２３Ｆ１１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は
（ｂ）抗体１５Ｅ１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１５Ｅ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は
（ｃ）抗体１２Ｂ９と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１２Ｂ９と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；
（２）前記対の１つの抗体が抗体１２Ｂ９と同じエピトープに結合する抗体である場合、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１２Ｂ９と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する場合には、適切な第二の抗体は、以下の抗体であり得る。
（ａ）抗体１８Ｄ８と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１８Ｄ８と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は
（ｂ）抗体１９Ｃ１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１９Ｃ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は
（ｃ）抗体１９Ｄ１２と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１９Ｄ１２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は
（ｄ）抗体１９Ｈ６と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１９Ｈ６と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は
（ｅ）抗体１Ｓ１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１Ｓ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は
（３）前記対の１つの抗体が抗体２３Ｆ１１と同じエピトープに結合する抗体である場合、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体２３Ｆ１１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する場合には、適切な第二の抗体は、以下の抗体であり得る。
（ａ）抗体１８Ｄ８と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１８Ｄ８と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は
（ｂ）抗体１９Ｃ１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１９Ｃ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は
（ｃ）抗体１９Ｄ１２と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１９Ｄ１２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は
（ｄ）抗体１９Ｈ６と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１９Ｈ６と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は
（ｅ）抗体１Ｓ１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体４Ｅ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は
（ｆ）抗体３Ｂ３と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体３Ｂ３と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；
（４）前記対の１つの抗体が抗体１５Ｅ１と同じエピトープに結合する抗体である場合、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１５Ｅ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する場合には、適切な第二の抗体は、以下の抗体であり得る。
（ａ）抗体１Ｓ１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１Ｓ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体。
幾つかの実施形態において、ヘプシジンアンタゴニストを用いた治療法の有効性を監視するための方法は、試料中の又はヒト患者などの動物中のヘプシジンレベルの変化を監視することを含む。ヘプシジンレベルが監視される方法は、（ａ）本明細書に開示されている抗ヘプシジン抗体の１つ又はそれ以上を用いた治療法の前に患者から得られた第一の生物試料を温置すること（温置は、免疫複合体の形成を可能とするのに十分な条件下及び時間にわたって行われる。）；（ｂ）生物試料中のヘプシジンとヘプシジンを特異的に結合する抗体又は抗原結合断片の間で形成された免疫複合体を検出すること；並びに（ｃ）後に、例えば、本明細書中に開示されている抗ヘプシジン抗体の１つ又はそれ以上を用いた治療法の後などに患者から採取された第二の生物試料を用いて工程（ａ）及び（ｂ）を場合によって繰り返すこと；並びに（ｄ）第一及び第二の生物試料中に検出される免疫複合体の数を比較することを含み得る。
他の監視法は、（ａ）ヘプシジンと治療剤との間の複合体の血液（例えば、血清又は血漿）循環レベルを測定すること、及び（ｂ）循環中に存在する遊離のヘプシジンの量を場合によって測定することを含む。例えば、ヘプシジンと治療用抗体の間の複合体は、複合体の治療用抗体部分に結合する抗ヒトＦｃ抗体及び前記複合体のヘプシジン部分に結合する「対を成す」抗ヘプシジン抗体のＦａｂ断片を用いて検出することができる。あるいは、抗ヒトＦｃ抗体の代わりに、抗イディオタイプ抗体を使用することができる。別の可能性として、非ヒトＦｃを含有する抗ヘプシジン抗体（例えば、ヒトＦｃがマウスＦｃと置換されている。）を、Ｆａｂ断片の代わりに使用することができる。
別の例として、生物試料からヘプシジン−治療用抗体複合体を除去した後、固体支持体上に固定化された抗ヒトＦｃ抗体又は抗イディオタイプ抗体の何れかを用いて、遊離のヘプシジンを検出することができる。次いで、固体支持体に結合されていない状態を保つ遊離のヘプシジンの量が測定される。遊離のヘプシジンのこのレベルは、利用可能な循環ヘプシジンを除去する上で、治療用抗体の有効性を反映し得る。
このような方法において使用するための生物試料は、ヘプシジンを含有することが予想される患者から得られたあらゆる試料であり得る。典型的な生物試料には、血液、血漿、血清、尿及び骨髄が含まれる。第一の生物試料は、治療の開始前に、又は治療計画を通じて途中まで、取得され得る。第二の生物試料は、同様の様式で、但し、追加治療の後に取得されるべきである。第二の生物試料は、治療の少なくとも一部が第一及び第二の生物試料の単離の間に行われる限り、治療の完了時に又は治療の途中に取得され得る。
両試料に対する温置及び検出操作は、一般に、上述のように実施され得る。第一の試料と比べた第二の試料中の免疫複合体の数の減少は、ヘプシジンレベルの減少を示唆しており、治療の成功を反映する。遊離の血清ヘプシジンも同様にして分析され得、遊離の血清ヘプシジンの減少は治療の成功を示唆する。
診断又は監視法が有用であり得るヘプシジン関連疾患、炎症性疾患及び鉄恒常性の疾病又は疾患には、アフリカ鉄過剰症、アルファサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌の貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、動脈硬化又はアテローム性動脈硬化（冠動脈疾患、脳血管疾患又は末梢閉塞性動脈疾患を含む。）、運動失調、鉄に関連する運動失調、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠乏症、化学療法によって誘発された貧血、慢性腎／腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）（終末段階の腎臓病又は慢性腎／腎臓不全を含む。）、肝硬変、古典的ヘモクロマトーシス、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、ヘプシジン過剰を有する症状（上昇したヘプシジン）、先天性赤血球異形成性貧血、うっ血性心不全、クローン病、糖尿病、鉄体内分布の異常、鉄恒常性の異常、鉄代謝の異常、フェロポーティン病、フェロポーティン変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ失調症、索性脊髄症、グラシール症候群（ｇｒａｃｉｌｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｅｌｏｒｉ）感染症又はその他の細菌感染症、ハラーホルデン・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２中の変異に起因するヘモクロマトーシス、異常ヘモグロビン症、肝炎、肝炎（Ｂｒｏｃｋ）、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、ヘプシジン欠乏、遺伝性ヘモクロマトーシス、ＨＩＶ又は他のウイルス病、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インシュリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏性疾患、鉄過剰負荷疾患、ヘプシジン過剰を伴う鉄欠乏性症状、若年性ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ２）、多発性硬化症、トランスフェリン受容体２、ＨＦＥ、ヘモジュベリン、フェロポーティン又は鉄代謝の他の遺伝子中の変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症、膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、偽脳炎、肺血鉄症、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性紅斑性狼瘡、サラセミア、中間型サラセミア、輸血性鉄過剰症、腫瘍、脈管炎、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症及び／又はウィルソン病が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されている病状の診断及び本明細書に記載されている予後の監視に対して適切な閾値を設定する方法は、本分野において周知である。例として、正常対象（例えば、検出されるべき症状を持たない健康な集団）の十分な代表数から得られた流体試料中のヘプシジンのレベルは、同じプロトコールを用いて、罹病対象（例えば、疾病又は症状を有することが確認された集団）の十分な代表数から得られるヘプシジンレベルと比較して分析される。正常な集団の殆どを罹病集団の殆どから識別する閾値カットオフを決定することができる。あるいは、陰性の結果、不明確な結果及び陽性の結果に対する有用な評価項目値をデータから決定することができる。例えば、正常集団の殆どのヘプシジンを含むが、罹病集団の殆ど全てを除外する正常な範囲（陰性結果の指標となる）を決定することができる。対応して、例えば、罹病集団の殆どのヘプシジンを含むが、正常集団の殆ど全てを除外する陽性結果の指標となる範囲を決定することができる。同様に、炎症の貧血に罹患している集団中のヘプシジンレベルを、鉄欠乏性貧血に罹患している集団中のヘプシジンレベルと識別する閾値を決定することが可能である。有用な評価項目の値は、患者が炎症の貧血、鉄欠乏性貧血又は混合型貧血に罹患していることを示唆し得る。閾値に対する適切な評価項目の値は、所望の特異性又は感受性を最適化するために決定することができ、全般的な医学及び疫学的因子も考慮に入れ得る。考慮すべき因子には、研究室検査の臨床的な目的及び高い陽性予測値又は高い陰性予測値を有する必要があるかどうか、並びに検査集団中の疾病の有病率が含まれる。
ＶＩＩ．ヘプシジン活性アンタゴニストに対する治療的用途
治療を必要としている対象を治療するために、ヒトヘプシジンを結合する本明細書中に記載されているモノクローナル抗体を含むヘプシジン活性アンタゴニストの使用も提供される。典型的な実施形態において、対象は、ヘプシジンの上昇したレベル、ヘプシジン関連疾患、鉄恒常性の障害又は貧血のリスクがあり、又はこれらに罹患し得る。
本明細書において使用される「治療」又は「治療する」は、疾病若しくは疾患のリスクを有する又は疾病若しくは疾患に対する素因を有する対象の予防的処置及び疾病又は疾患に罹患している対象の治療的処置の両方を表す。
予防法における治療剤の投与は、疾病若しくは疾患が予防されるように、あるいは、その進行が遅延されるように、所望されない疾病又は疾患の症候が現れる前に行うことができる。従って、予防的方法と組み合わせて使用される場合、「治療的に有効」という用語は、処理後に、（平均して）対象のより少ない数が、望ましくない疾病若しくは疾患を発症し、症候の重篤度を進行させることを意味する。
対象が疾病又は疾患の症候を呈した後に、治療剤の投与を含む治療方法と組み合わせて使用される場合には、「治療的に有効」という用語は、処理後に、疾病又は疾患の１つ又はそれ以上の徴候又は症候が軽減又は除去されることを意味する。
治療における「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農場動物並びにイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの動物園、スポーツ又はペット動物を含む、哺乳動物として分類されるあらゆる動物を表す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
本明細書において使用される「ヘプシジン関連疾患」は、鉄恒常性を崩壊させるヘプシジンの異常なレベル（例えば、貧血又は貯蔵された鉄の程度と比べた、ヘプシジンの過剰又はヘプシジンの欠乏）によって引き起こされる、又はヘプシジンの異常なレベルと関連する症状を表す。鉄恒常性の崩壊は、次いで、貧血などの二次的疾病をもたらし得る。急性又は慢性の炎症症状は、貧血を引き起こし得る又は既存の貧血を悪化させ得る減少した循環鉄レベルをもたらし得るヘプシジン発現の上方制御をもたらし得る。典型的なヘプシジン関連炎症性疾患には、癌の貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、化学療法によって誘発された貧血、慢性炎症性貧血、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、終末段階の腎臓病、慢性腎不全、うっ血性心不全、癌、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、Ｈ．ピロリ感染又は他の細菌感染症、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ及び他のウイルス疾患、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、膵炎、敗血症、脈管炎、鉄欠乏症、低色素性小球性貧血及びヘプシジン過剰を伴う症状が含まれる。
本明細書において使用される、「鉄恒常性の疾病（又は障害）」という用語は、対象の鉄レベルが調節を必要とする症状を表す。「鉄恒常性の疾病（又は障害）」という用語には、ヘプシジン関連疾患；ヘプシジンによって引き起こされたものではない鉄恒常性の崩壊など、ヘプシジンの上昇したレベルを伴わないが、ヘプシジン活性の阻害が有益である症状；異常な鉄吸収、再利用、代謝又は排出が正常な鉄血液レベル又は組織分布の崩壊を引き起こす疾病；炎症、癌又は化学療法など、鉄の調節不全が別の疾病又は症状の結果である疾病；異常な鉄血液レベル又は組織分布から生じた疾病又は疾患；及び鉄レベル又は分布を調節することによって処理することができる疾病又は疾患が含まれる。鉄恒常性のこのような疾病又は疾患、ヘプシジン関連疾患及びヘプシジン過剰をもたらし得る炎症性症状の非限定的な例には、アフリカ鉄過剰症、アルファサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌の貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、動脈硬化又はアテローム性動脈硬化（冠動脈疾患、脳血管疾患又は末梢閉塞性動脈疾患を含む。）、運動失調、鉄に関連する運動失調、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠乏症、化学療法によって誘発された貧血、慢性腎／腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）（終末段階の腎臓病又は慢性腎／腎臓不全を含む。）、肝硬変、古典的ヘモクロマトーシス、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、ヘプシジン過剰を有する症状（上昇したヘプシジン）、先天性赤血球異形成性貧血、うっ血性心不全、クローン病、糖尿病、鉄体内分布の異常、鉄恒常性の異常、鉄代謝の異常、フェロポーティン病、フェロポーティン変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ失調症、索性脊髄症、グラシール症候群、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｅｌｏｒｉ）感染症又はその他の細菌感染症、ハラーホルデン・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２中の変異に起因するヘモクロマトーシス、異常ヘモグロビン症、肝炎、肝炎（Ｂｒｏｃｋ）、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、遺伝性ヘモクロマトーシス、ＨＩＶ又は他のウイルス病、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インシュリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏性疾患、鉄過剰負荷疾患、ヘプシジン過剰を伴う鉄欠乏性症状、若年性ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ２）、多発性硬化症、トランスフェリン受容体２、ＨＦＥ、ヘモジュベリン、フェロポーティン又は鉄代謝の他の遺伝子中の変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症、膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、偽脳炎、肺血鉄症、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性紅斑性狼瘡、サラセミア、中間型サラセミア、輸血性鉄過剰症、腫瘍、脈管炎、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症及び／又はウィルソン病が含まれる。
鉄制御の崩壊に関連することが推定されている非炎症性症状には、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ペラグラ、索性脊髄症、偽脳炎、パーキンソン病（Ｆａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９６：９０９（２００６）ａｎｄ Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｅｉｎｇ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，３：３２７（２００４））、アルツハイマー病、冠状動脈性心臓病、骨減少症及び骨粗しょう症（Ｇｕｇｇｅｎｂｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．１６：１８０９（２００５））、異常ヘモグロビン症及び赤血球代謝の他の疾患（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０５：４１０３（２００５）及び末梢閉塞性動脈疾患が含まれるが、これらに限定されない。
様々な他の鉄指数及びその正常な濃度範囲が表２に列記されている。
Figure 2014221763
表２に列記されている正常な範囲外にある患者の鉄指数レベルは、当該患者にとって、ヘプシジン活性アンタゴニストを用いた治療が有益であり得ることを示す。ヘプシジンは鉄恒常性において中心的な役割を果たしているので、ヘプシジンレベル及び活性は、鉄恒常性及び／又は鉄指数の崩壊に相関する。上昇したヘプシジンレベルは、表２に示されている正常範囲を下回る血清鉄レベル、低ヘモグロビン及びヘマトクリット、低下した又は正常なＴｓａｔ及び高い又は正常なフェリチン値及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）上昇又は炎症の他のマーカーによって測定される上昇した炎症状態と相関する。
本明細書において使用されるヘプシジン活性アンタゴニストの「治療的有効量」という用語は、所望の治療効果をもたらす（すなわち、「治療的効力」を与える）量を表す。典型的な治療的効果には、増加した循環鉄レベル又は増加した鉄の利用可能性、増加した赤血球数、増加した赤血球平均細胞容積、増加した赤血球ヘモグロビン含量、増加したヘモグロビン（例えば、０．５ｇ／ｄＬ以上の増加）、増加したヘマトクリット、増加したＴｓａｔ、増加した網状赤血球数、増加した又は正常化された網状赤血球平均細胞容積、増加した網状赤血球ヘモグロビン含量又は血清若しくは血漿中の低下した遊離ヘプシジンレベル又は上記パラメータの何れかの正常化が含まれる。治療的効果のためには、このようなパラメータの正常な範囲への復帰は必要とされない。例えば、正常な方向への測定可能な変化（増加又は低下）は、臨床医による所望の治療効果であると考えることができる。単独で投与された各活性成分に対して適用された場合、この用語はその単独成分を表す。組み合わせに対して適用される場合、この用語は、組み合わせて、連続して又は同時に投与されたかどうかを問わず、治療的効果をもたらす活性成分の組み合わされた量を表す。例えば、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）が赤血球新生刺激物質と組み合わせて投与される態様において、治療的有効量は、上記パラメータの何れかを増加させ又は正常化する組み合わされた量を表すものとする。
患者の診断を促進するために、図９Ｂのような決定木を使用して、ヘプシジンのレベルを解釈することができ、これは、治療の過程及び濃度読み取りの重要性を決定する上で使用者又は解釈者を補助するために使用される。ヘプシジン値は、炎症鉄過剰症及びフェロポーティン病を有する患者中で上昇すると予測され、ヘモクロマトーシス、異常ヘモグロビン症および他の赤血球疾患を有する患者中で抑制すると予測される。図９Ｂの決定木は、ヘプシジンレベルの測定が、鉄代謝疾患を有すると疑われる患者の診断及び／又は評価をどのように簡略化するかを示している。図９Ａは、ヘプシジンレベルの測定を行わない決定木評価を示している。
本明細書中に記載されている治療用組成物および治療の方法は、単独で、又は所望の効果を達成するために他の治療剤と組み合わせて使用される１つ又はそれ以上のヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）を使用し得る。
組み合わせ療法
さらに改善された効力を与えるために、（同じ又は異なる標的抗原に結合する）２つ若しくはそれ以上の抗体を一緒に混合すること、又は本発明の抗体を第二の治療剤とともに同時投与することがさらに有利であり得る。薬剤が治療効果を発揮している期間に重複が存在する限り、２つの治療剤の同時投与は、薬剤が同時に又は同じ経路によって投与されることを要しない。異なる日又は週に投与されるような、同時又は逐次投与が想定される。
典型的な実施形態において、本発明の方法は、単一の抗体及び異なる抗体の組み合わせ又は「カクテル」の投与を含む。異なるエフェクター機構を活用する抗体を含有するので、このような抗体カクテルは、ある種の利点を有し得る。組み合わせたこのような抗体は、相乗的治療効果を示し得る。
ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）及び赤血球造血刺激物質を使用する組み合わせ療法が具体的に想定される。様々な実施形態において、貧血を有する患者の治療を改善するために、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）及び赤血球造血刺激物質を使用することができる。とりわけ、エリスロポエチン又はその類縁体（エポエチンα、エポエチンβ、ダルベポエチンα）などの赤血球新生刺激物質療法に対して低応答性）（非応答性を含む。）である患者には、ヘプシジン活性アンタゴニスト又はヘプシジン発現阻害剤を用いた同時治療が有益である。一実施形態において、組み合わせ療法には、ヒトヘプシジンに結合する少なくとも１つの抗体及び少なくとも１つの赤血球新生刺激物質を用いた治療が含まれる。
体内の鉄貯蔵を再分配するために、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）及び鉄キレート物質を用いる組み合わせ療法も想定される。鉄キレート物質は、鉄を結合することができ、組織から又は循環から鉄を除去することができる物質である。例には、デフェロキサミン（Ｄｅｓｆｅｒａｌ（Ｒ））及びデフェラシロックス（Ｅｘｊａｄｅ（Ｒ））及びデフェリプロン（１，２−ジメチル−３−ヒドロキシピリジン−４−オン）が含まれる。幾つかの実施形態において、輸血依存性鉄過剰症に続発する鉄過剰疾患を有する又はフリードライヒ失調症などの鉄の分布不良疾患を有する患者の治療を改善するために、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）及び赤血球新生刺激物質を使用することができる。
本明細書において使用される「赤血球新生刺激物質」は、例えば、受容体に結合し、受容体の二量体化を引き起こすことによって、又は内在性エリスロポエチン発現を刺激することによって、エリスロポエチン受容体の活性化を直接又は間接的に引き起こす化学的化合物を意味する。赤血球新生刺激物質には、エリスロポエチン受容体に結合し、これを活性化させるエリスロポエチン及びその変形物、類縁体又は誘導体；エリスロポエチン受容体に結合し、受容体を活性化する抗体；又はエリスロポエチン受容体に結合し、活性化するペプチド；又はエリスロポエチン受容体に結合し、エリスロポエチン受容体を活性化する、（場合によって約１０００ダルトン未満の分子量の）小有機化学的化合物が含まれる。赤血球造血刺激物質には、エポエチンα、エポエチンβ、エポエチンδ、エポエチンω、エポエチンι、エポエチンζ及びこれらの類縁体、ＰＥＧ化されたエリスロポエチン、カルバミル化されたエリスロポエチン、模倣ペプチド（ＥＭＰ１／ヘマチドを含む。）、模倣抗体及びＨＩＦ阻害剤（米国特許公開第２００５／００２０４８７号（その開示全体が、参照により、組み込まれる。）参照）が含まれるが、これらに限定されない。典型的な赤血球新生刺激物質には、エリスロポエチン、ダルベポエチン、エリスロポエチンアゴニスト変形物及びエリスロポエチン受容体を結合し、活性化するペプチド又は抗体（及び米国特許出願公開２００３／０２１５４４４号及び２００６／００４０８５８号（それぞれの開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に報告されている化合物が含まれる。）並びに以下の特許又は特許出願（それぞれ、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているエリスロポエチン分子又はその変形物若しくは類縁体が含まれる。米国特許第４，７０３，００８号；米国特許第５，４４１，８６８号；米国特許第５，５４７，９３３号；米国特許第５，６１８，６９８号；米国特許第５，６２１，０８０号；米国特許第５，７５６，３４９号；米国特許第５，７６７，０７８号；米国特許第５，７７３，５６９号；米国特許第５，９５５，４２２号；米国特許第５，８３０，８５１号；米国特許第５，８５６，２９８号；米国特許第５，９８６，０４７号；米国特許第６，０３０，０８６号；米国特許第６，３１０，０７８号；米国特許第６，３９１，６３３号；米国特許第６，５８３，２７２号；米国特許第６，５８６，３９８号；米国特許第６，９００，２９２号；米国特許第６，７５０，３６９号；米国特許第７，０３０，２２６号；米国特許第７，０８４，２４５号；米国特許第７，２１７，６８９；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５８６７；ＷＯ９５／０５４６５；ＷＯ９９／６６０５４；ＷＯ００／２４８９３；ＷＯ０１／８１４０５；ＷＯ００／６１６３７；ＷＯ０１／３６４８９；ＷＯ０２／０１４３５６；ＷＯ０２／１９９６３；ＷＯ０２／２００３４；ＷＯ０２／４９６７３；ＷＯ０２／０８５９４０；ＷＯ０３／０２９２９１；ＷＯ２００３／０５５５２６；ＷＯ２００３／０８４４７７；ＷＯ２００３／０９４８５８；ＷＯ２００４／００２４１７；ＷＯ２００４／００２４２４；ＷＯ２００４／００９６２７；ＷＯ２００４／０２４７６１；ＷＯ２００４／０３３６５１；ＷＯ２００４／０３５６０３；ＷＯ２００４／０４３３８２；ＷＯ２００４／１０１６００；ＷＯ２００４／１０１６０６；ＷＯ２００４／１０１６１１；ＷＯ２００４／１０６３７３；ＷＯ２００４／０１８６６７；ＷＯ２００５／００１０２５；ＷＯ２００５／００１１３６；ＷＯ２００５／０２１５７９；ＷＯ２００５／０２５６０６；ＷＯ２００５／０３２４６０；ＷＯ２００５／０５１３２７；ＷＯ２００５／０６３８０８；ＷＯ２００５／０６３８０９；ＷＯ２００５／０７０４５１；ＷＯ２００５／０８１６８７；ＷＯ２００５／０８４７１１；ＷＯ２００５／１０３０７６；ＷＯ２００５／１００４０３；ＷＯ２００５／０９２３６９；ＷＯ２００６／５０９５９；ＷＯ２００６／０２６４６；ＷＯ２００６／２９０９４；及び米国特許公開２００２／０１５５９９８号；米国特許公開２００３／００７７７５３号；米国特許公開２００３／００８２７４９号；米国特許公開２００３／０１４３２０２号；米国特許公開２００４／０００９９０２号；米国特許公開２００４／００７１６９４号；米国特許公開２００４／００９１９６１号；米国特許公開２００４／０１４３８５７号；米国特許公開２００４／０１５７２９３号；米国特許公開２００４／０１７５３７９号；米国特許公開２００４／０１７５８２４号；米国特許公開２００４／０２２９３１８号；米国特許公開２００４／０２４８８１５号；米国特許公開２００４／０２６６６９０号；米国特許公開２００５／００１９９１４号；米国特許公開２００５／００２６８３４号；米国特許公開２００５／００９６４６１号；米国特許公開２００５／０１０７２９７号；米国特許公開２００５／０１０７５９１号；米国特許公開２００５／０１２４０４５号；米国特許公開２００５／０１２４５６４号；米国特許公開２００５／０１３７３２９号；米国特許公開２００５／０１４２６４２号；米国特許公開２００５／０１４３２９２号；米国特許公開２００５／０１５３８７９号；米国特許公開２００５／０１５８８２２号；米国特許公開２００５／０１５８８３２号；米国特許公開２００５／０１７０４５７号；米国特許公開２００５／０１８１３５９号；米国特許公開２００５／０１８１４８２号；米国特許公開２００５／０１９２２１１号；米国特許公開２００５／０２０２５３８号；米国特許公開２００５／０２２７２８９号；米国特許公開２００５／０２４４４０９号；米国特許公開２００６／００８８９０６号；米国特許公開２００６／０１１１２７９。
エリスロポエチンには、配列番号７２に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。配列番号７２のアミノ酸１から１６５は、エポエチンと表記されるあらゆる分子（例えば、エポエチンα、エポエチンβ、エポエチンδ、エポエチンω、エポエチンι、エポエチンγ、エポエチンζなど）の成熟タンパク質を構成する。さらに、エポエチンには、例えば、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＥＰＯ−βを含む。）などの１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーで化学的に修飾された前記エポエチンの何れもが含まれる。赤血球新生活性をなお保持する、配列番号７２に対して６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するエリスロポエチンの類縁体も想定される。
組換えヒトエリスロポエチンの典型的な配列、製造、精製及び使用は、Ｌｉｎの米国特許第４，７０３，００８号及びＬａｉ他の米国特許第４，６６７，０１６号（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を含む（但し、これらに限定されない。）多数の特許公報中に記載されている。ダルベポエチンは、２つのさらなる炭水化物鎖を与える５つの変化をｒＨｕＥＰのアミノ酸配列中に有する高グリコシル化されたエリスロポエチン類縁体である。より具体的には、ダルベポエチンαは、配列番号７２のアミノ酸残基３０及び８８に、２つのさらなるＮ結合型炭水化物鎖を含有する。ダルベポエチン及び他のエリスロポエチン類縁体の典型的な配列、製造、精製及び使用は、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，９１／０５８６７，Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９５／０５４６５，Ｅｇｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ００／２４８９３及びＥｇｒｉｅ ｅｔ ａｌ．ＷＯ０１／８１４０５（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を含む多数の特許公報に記載されている。天然に存在するポリペプチド又は類縁体ポリペプチドの誘導体には、例えば、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ化）、放射性核種又は他の診断若しくは標的化若しくは治療用部分を付着するように化学的に修飾された誘導体が含まれる。
「赤血球新生活性」という用語は、インビボアッセイ、例えば、エクスハイポキシック多血球血症（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ）マウスアッセイにおいて示される、赤血球新生を刺激する活性を意味する。例えば、「Ｃｏｔｅｓ ａｎｄ Ｂａｎｇｈａｍ，Ｎａｔｕｒｅ １９１：１０６５（１９６１）」を参照されたい。
医薬製剤の投与及び調製
幾つかの実施形態において、本発明の方法の実施において使用されるヘプシジン活性アンタゴニスト又は抗体は、所望の送達方法に適した担体を含む医薬組成物中に調合され得る。適切な担体には、ヘプシジン活性アンタゴニスト又は抗体と組み合わされた場合に、ヘプシジンの高親和性結合を保持し、対象の免疫系と非反応性であるあらゆる材料が含まれる。例には、無菌のリン酸緩衝化された生理的食塩水溶液、静菌水などの多数の標準的な医薬担体の全てが含まれるが、これらに限定されない。様々な水性担体（例えば、水、緩衝化された水、０．４％生理的食塩水、０．３％グリシンなど）が使用され得、穏やかな化学的修飾などに供される、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの増強された安定性のための他のタンパク質を含み得る。
製剤中の典型的な抗体濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１８０ｍｇ／ｍＬ又は約０．１ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬ又は約０．５ｍｇ／ｍＬから約２５ｍｇ／ｍＬ、あるいは約２ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。抗体の水性製剤は、例えば、約４．５から約６．５又は約４．８から約５．５の範囲あるいは約５．０のｐＨで、ｐＨ緩衝化された溶液中に調製され得る。この範囲内のｐＨに対して適している緩衝液の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸緩衝液が含まれる。緩衝液濃度は、例えば、製剤の緩衝液及び所望の浸透圧に応じて、約１ｍＭから約２００ｍＭ又は約１０ｍＭから約６０ｍＭであり得る。
抗体を安定化することもできる等張剤を製剤中に含めることができる。典型的な等張剤には、マニトールなどのポリオール、スクロース又はトレハロースが含まれる。好ましくは、水性製剤は等張であるが、高張又は低張溶液が適切である場合もあり得る。製剤中のポリオールの典型的な濃度は、約１％から約１５％ｗ／ｖの範囲であり得る。
製剤化された抗体の凝集を低下させ、及び／又は製剤中の粒状物の形成を最小限に抑え、及び／又は吸着を低下させるために、界面活性剤も抗体製剤に添加され得る。典型的な界面活性剤には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０）又はポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。界面活性剤の典型的な濃度は、約０．００１％から約０．５％又は約０．００５％から約０．２％あるいは約０．００４％から約０．０１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
一実施形態において、製剤は、上記の物質（すなわち、抗体、緩衝液、ポリオール及び界面活性剤）を含有し、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール及びベンゾエトニウムＣｌなどの１つ又はそれ以上の防腐剤を実質的に含まない。別の実施形態において、防腐剤は、例えば、約０．１％から約２％の範囲あるいは約０．５％から約１％の範囲の濃度で、製剤中に含まれ得る。製剤の所望の特徴に悪影響を及ぼさなければ、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）」中に記載されているような、医薬として許容される１つ又はそれ以上の他の担体、賦形剤又は安定化剤を製剤中に含め得る。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、使用される投薬量及び濃度においてレシピエントに対して無毒であり、さらなる緩衝化剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ポリエステルなどの生物分解可能なポリマー及び／又はナトリウムなどの塩形成カウンターイオンが含まれる。
ヘプシジン活性アンタゴニスト又は抗体の治療用製剤は、場合によって使用される、生理的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と、純度の所望の程度を有する抗体を混合することによって、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態で、保存のために調製される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、使用される投薬量及び濃度においてレシピエントに対して無毒であり、ホスファート、シトラート及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンゾアルコニウムクロリド、ベンゾエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、マルトース又はデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
一実施形態において、適切な製剤は、等張化し、安定化させるポリオール、ソルビトール、スクロース又は塩化ナトリウムなどの等張剤と組み合わせて、ホスファート、アセタート又はＴＲＩＳ緩衝液などの等張性緩衝液を含有する。このような等張剤の一例は、５％ソルビトール又はスクロースである。さらに、製剤は、０．０１から０．０２％ｗｔ／容量で、凝集を抑制するため及び安定化などのために、界面活性剤を場合によって含み得る。製剤のｐＨは、４．５から６．５又は４．５から５．５の範囲であり得る。抗体のための医薬製剤の他の典型的な記述は、米国特許公開２００３／０１１３３１６号及び米国特許第６，１７１，５８６号（それぞれ、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に見出され得る。
本明細書中の製剤は、治療されている具体的な適応症に対して必要とされる２以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する２以上の活性化合物も含有し得る。例えば、免疫抑制剤を提供することがさらに望ましい場合があり得る。このような分子は、好適には、意図される目的のために有効な量で組み合わせて存在する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合、例えば、コロイド上薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン、小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中の又はマクロエマルジョン中の、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンミクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリラート）ミクロカプセルによって調製されたミクロカプセル中に封入させることもできる。このような技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）」中に開示されている。
抗体の懸濁物及び結晶形態も想定される。懸濁物及び結晶形態を作製するための方法は、当業者に公知である。
インビボ投与のために使用されるべき製剤は、無菌でなければならない。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、旧来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。例えば、滅菌は、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成される。得られた溶液は、使用のために梱包され、又は無菌条件下でろ過され、及び凍結乾燥され得る（凍結乾燥された調製物は、投与の前に、無菌溶液と組み合わされる。）。
特に、ポリペプチドが液体組成物中において相対的に不安定である場合に、ポリペプチドを長期間安定化するために、しばしば、凍結乾燥法が使用される。凍結乾燥サイクルは、通常、凍結、一次乾燥及び二次乾燥という３つの工程から構成される。Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｐｏｌｌｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ３８，Ｎｕｍｂｅｒ ２，ｐａｇｅｓ ４８−５９（１９８４）。凍結工程において、十分に凍結されるまで、溶液が冷却される。溶液中のバルク水は、この段階で氷を形成する。氷は一次乾燥段階において昇華し、一次乾燥段階は、真空を用いて、氷の蒸気圧を下回るようにチャンバー圧力を低下させることによって実施される。最後に、低下したチャンバー圧力及び上昇した棚温度下で、吸着された又は結合された水は二次乾燥段階において除去される。この工程は、凍結乾燥ケーキとして知られる物質を産生する。その後、使用前に、ケーキを再構成することができる。
凍結乾燥された物質に対する標準的な再構成の実施は、（典型的には、凍結乾燥の間に除去された容積と等しい）純水の容積を再び添加することであるが、非経口投与用医薬の産生において、抗菌剤の希釈溶液が時折使用される。Ｃｈｅｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １８，Ｎｕｍｂｅｒｓ １１ ａｎｄ １２，ｐａｇｅｓ １３１１−１３５４（１９９２）。
賦形剤は、幾つかの事例において、凍結乾燥された産物に対する安定化剤として作用することが注目されてきた。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ７４，ｐａｇｅｓ ２２５−２３９（１９９１）例えば、公知の賦形剤には、ポリオール（マニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む。）、糖（グルコース及びスクロースを含む。）及びアミノ酸（アラニン、グリシン及びグルタミン酸を含む。）が含まれる。
さらに、ポリオール及び糖は、凍結及び乾燥によって誘発される損傷からポリペプチドを保護し、乾燥された状態で保存している間に、安定性を増強させるためにも、しばしば使用される。一般に、糖、特に二糖は、凍結乾燥工程及び保存の間の両方において有効である。単糖及び二糖及びＰＶＰなどのポリマーを含む分子の他のクラスも凍結乾燥された産物の安定化剤として報告されている。
注射のために、医薬製剤及び／又は医薬は、上述されているような適切な溶液を用いた再構成に適した粉末であり得る。これらの例には、凍結乾燥された、回転乾燥された又は噴霧乾燥された粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物又は粒子物が含まれるが、これらに限定されない。注射のために、製剤は、安定化剤、ｐＨ修飾物質、界面活性剤、生物学的利用性修飾物質及びこれらの組み合わせを場合によって含有し得る。
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、マトリックスは成型された物品（例えば、フィルム又はミクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌグルタミン酸とＬ−グルタミン酸エチルの共重合体、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸共重合体（ＬｕｐｒｏｎＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸リュープロリドから構成される注射可能な小球体）など）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日超にわたって、分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルは、より短い期間にわたって、タンパク質を放出する。カプセル封入された抗体が体内に長期間留まると、３７℃で水分に曝露される結果、抗体は変性又は凝集し得、生物活性の喪失及び免疫原性の変化をもたらす可能性がある。関与する機序に応じて、安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集の機序が、チオ−ジスルフィド相互交換を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されれば、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適切な添加物を使用し、及び特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって、安定化が達成され得る。
幾つかの実施形態において、本発明の製剤は、本明細書中に記載されているように、短期作用、迅速放出、長期作用又は徐放であるように設計され得る。従って、医薬製剤は、制御された放出又は遅い放出のために調合することもできる。
組成物の治療的有効量は変動し、疾病の重度並びに治療されている対象の体重及び一般的な状態に依存するが、一般には、適用当り約１．０μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重又は約１０μｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ又は約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ又は約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与は、必要に応じて、疾患又は症状に対する応答及び対象の治療耐性に応じて、毎日、隔日、毎週、月に２回、毎月又はそれ以上若しくはそれ以下の頻度であり得る。疾患症候の所望される抑制が起こるまで、４、５、６、７、８、１０若しくは１２週又はそれより長期など、より長い期間にわたる維持投薬量が必要であり得、投薬量は必要に応じて調節され得る。この療法の進行は、慣用の技術及びアッセイによって、容易にモニターされる。
具体的な投薬量は、疾病の症状、対象の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事、投薬感覚、投与経路、排出速度及び薬物の組み合わせに応じて調整され得る。有効量を含有する上記剤形の何れもが、定型的実験操作の範囲内に十分含まれ、従って、本発明の範囲に属する。
ヘプシジン活性アンタゴニスト又は抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻内を介するなど、全身的に又は局所的に、所望であれば、局所的治療、病変内投与のためにあらゆる適切な手段によって投与される。非経口経路には、静脈内、動脈内、腹腔内、硬膜外、くも膜下腔内投与が含まれる。さらに、特異的結合剤又は抗体は、好適には、パルス注入によって、特に、特異的結合剤又は抗体の用量を低下させながら投与される。好ましくは、投薬は、１つには、投与が短期間であるか又は慢性であるかに応じて、注射によって、最も好ましくは、静脈内又は皮下注射によって与えられる。例えば、所望の部位に近接して配置されたカテーテルを通じて、局所、特に経皮、経粘膜、直腸、経口又は局所投与を含む他の投与法が想定される。幾つかの実施形態において、本発明の特異的結合剤又は抗体は、毎日から毎週、毎月の範囲にわたる頻度で（例えば、毎日、隔日、３日ごと、又は週当たり２、３、４、５若しくは６回）、０．０１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、好ましくは、週当たり２又は３回の頻度で、０．１から４５ｍｇ／ｋｇ、０．１から１５ｍｇ／ｋｇ又は０．１から１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、又は月に１回、最大４５ｍｇ／ｋｇで、生理的溶液中に入れて、静脈内に投与される。
ＶＩＩＩ．診断及び治療用キット
便宜のために、本明細書に開示されている抗体は、キット（すなわち、診断アッセイを実施するための指示書との、所定量の試薬の梱包された組み合わせ）中に提供することができる。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、酵素によって必要とされる基質及び補因子（例えば、検出可能な色素団又は蛍光団を与える基質前駆体）を含む。さらに、安定化剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液又は溶解緩衝液）などの他の添加物を含めることができる。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中における濃度を与えるために、幅広く変動され得る。特に、試薬は、溶解すると直ちに、適切な濃度を有する試薬溶液を与える賦形剤を含む乾燥した（通常、凍結乾燥された）粉末として提供され得る。
診断試薬及び例えば、ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ型又は競合的フォーマット）などのイムノアッセイなどの様々な診断アッセイにおいて使用するための１つ又はそれ以上のこのような試薬を含むキットも提供される。幾つかの実施形態において、このようなキットは、少なくとも第一のペプチド（場合によって、本明細書中に記載されているような適切に折り畳まれた成熟ヘプシジン標準物質）又は第一の抗体若しくは本発明の抗原結合断片、これらの機能的断片又はこれらのカクテル及びシグナル発生用の手段を含み得る。キットの成分は、固体支持体へ予め付着され得、又はキットが使用される時点で、固体支持体の表面へ適用され得る。幾つかの実施形態において、シグナル発生手段は、本発明の抗体と予め会合され得、又は使用前に、１つ若しくはそれ以上の成分、例えば、緩衝液、抗体−酵素連結体、酵素基質などと組み合わせる必要があり得る。キットは、さらなる試薬、例えば、固相表面への非特異的結合を低下させるためのブロッキング試薬、洗浄試薬、酵素基質なども含み得る。固相表面は、チューブ、ビーズ、ミクロタイタープレート、小球体又はタンパク質、ペプチド若しくはポリペプチドを固定化するのに適した他の材料の形態であり得る。好ましくは、化学発光性若しくは色素原性産物の形成又は化学発光性若しくは色素原性基質の減少を触媒する酵素が、シグナル発生手段の成分である。このような酵素は、本分野において周知である。キットは、本明細書に記載されている捕捉剤及び検出試薬の何れをも含み得る。場合によって、キットは、本発明の方法を実施するための指示書も含み得る。
バイアル又は瓶などの容器中に梱包されたヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）及び赤血球新生刺激物質を含み、容器に付着された又は容器とともに同封されたラベル（ラベルは、容器の内容を記載し、並びに本明細書に記載されている１つ又はそれ以上の病状を治療するための、容器の内容の使用に関する適応症及び／又は指示を与える）をさらに含むキットも提供される。
一態様において、キットは、上昇したヘプシジンレベルを伴う疾患を治療するためのキットであり、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）及び赤血球新生刺激物質を含む。キットは、経口又は非経口（例えば、静脈内）投与のための鉄を、場合によってさらに含み得る。別の態様において、キットは、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）及び容器に付着され又は容器と同封された、赤血球造血刺激物質との、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）の使用を記載したラベルを含む。さらに別の態様において、キットは、赤血球造血刺激物質と及び容器に付着された又は容器とともに同封された、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）との、赤血球造血刺激物質の使用を記載したラベルとを含む。ある種の実施形態において、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）及び赤血球造血刺激物質及び場合によって使用される鉄は、別個のバイアル中に存在し、又は同じ医薬組成物中に一緒に組み合わされる。さらに別の態様において、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）は、単一の医薬組成物中において、鉄と組み合わされる。さらに別の実施形態において、赤血球新生刺激物質は、単一の医薬組成物中において、鉄とともに組み合わされる。
組み合わせ療法の節において上述されているように、治療剤が治療効果を発揮している期間に重複が存在する限り、２つの治療剤の同時投与は、薬剤が同時に又は同じ経路によって投与されることを要しない。異なる日又は週に投与されるような、同時又は逐次投与が想定される。
本明細書に開示されている抗体、ペプチド、抗原結合断片又はポリヌクレオチドの少なくとも１つと及び組成物を診断試薬又は治療剤として使用するための指示書を含む、本明細書中に開示されている治療用及び診断用キットも調製され得る。このようなキットにおいて使用するための容器は、典型的には、診断用及び／又は治療用組成物の１つ又はそれ以上がその中に配置され、好ましくは適切に分取され得る少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器又は他の適切な容器を含み得る。第二の治療剤も提供される場合には、キットは、この第二の診断及び／又は治療用組成物をその中に配置し得る第二の異なる容器も含有し得る。あるいは、複数の化合物を単一の医薬組成物中で調製し得、バイアル、フラスコ、注射器、瓶又は他の適切な単一の容器など単一の容器手段中に梱包し得る。本発明のキットは、典型的には、例えば、その中に所望のバイアルが保持される射出又は中空成型されたプラスチック容器などの、商業的販売のために密封中にバイアルを含有するための手段も含む。検出可能な標識又は検出手段の放射性標識、発色原性、蛍光原性又は他の種類がキット内に含められる場合には、診断用又は治療用組成物そのものと同じ容器中に標識剤を与えることができ、あるいはこの第二の組成物をその中に配置し、好適には分取し得る第二の異なる容器手段中に配置され得る。あるいは、検出試薬及びラベルは、単一の容器手段中に調製され得、多くの場合には、キットは、典型的には、商業的販売及び／又は便利なパッケージング及び送達のための密封中にバイアルを含有するための手段を含む。
本明細書に記載されている診断又は監視法を実施するための機器又は装置も提供される。このような装置は、その中に試料を入れることができるチャンバー又はチューブ、機器を通じて試料の流れを誘導するためのバルブ又はポンプを場合によって含む流体取り扱いシステム、血漿又は血清を血液から分離するための場合によって使用されるフィルター、捕捉剤又は検出試薬を添加するための混合チャンバー及び捕捉剤免疫複合体に結合された検出可能な標識の量を検出するための場合によって使用される検出機器を含み得る。試料の流れは、（例えば、毛細管、静水圧又は試料が一旦適用されたら、機器のさらなる操作を必要としない他の力による）受動性であり得、又は（例えば、機械的ポンプを介して生成される力の付与、電気浸透圧ポンプ、遠心力又は増加した空気圧力による）能動性であり得、又は能動及び受動力の組み合わせにより得る。
関連する実施形態において、プロセッサー、コンピュータ読み取り可能なメモリー及び前記コンピュータ読み取り可能なメモリー上に格納され、並びに本明細書に記載されている方法の何れかを実行するために、及び／又は「正常な」範囲外のレベルが本明細書中に記載されている症状の１つ又はそれ以上と相関するように、ヘプシジンの検出されたレベル及び「正常」と考えられる閾値又は閾値レベルの範囲を出力として生成するためにプロセッサー上で実行されるように適合されたルーチンも提供される。幾つかの実施形態において、本発明は、プログラム又は類似の機能を実行するためのルーチンを含有するコンピュータ読み取り可能な媒体をさらに提供する。適切な演算系、環境及び／又は機器構成の例には、パーソナルコンピュータ、サーバーコンピュータ、携帯式又はラップトップ機器、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサをベースとするシステム、セットトップボックス、プログラム可能な消費者電子機器、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、上記システム若しくは機器の何れかを含む分散型演算環境又は本分野において公知のあらゆる他のシステムが含まれる。
ヘプシジン活性アンタゴニストに対する非治療的用途
本明細書に開示されている抗体は、標的抗原に対するアフィニティー精製剤として、又は標的抗原に対する診断用アッセイ（例えば、特異的な細胞、組織又は血清中における標的抗原の発現を検出する。）において使用され得る。抗体は、インビボ診断用アッセイにおいても使用され得る。一般に、これらの目的のために、イムノシンチオグラフィーを用いて部位を局在化することができるように、抗体は、放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ又は３５Ｓなど）で標識される。
本明細書中に開示されている抗体は、競合的結合アッセイ、直接及び間接的サンドイッチアッセイ（ＥＬＩＳＡなど）及び免疫沈降アッセイなどのあらゆる公知のアッセイ方法において使用され得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。抗体は、本分野において公知の方法を用いて細胞試料を標識するために、免疫組織化学に対しても使用され得る。
実施例
尿からのヘプシジンの精製
精製：敗血症患者の尿（Ｓ．オーレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＳ．ニューモニアエ（Ｓ．ｐｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染、商業的に入手され、「Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：７８０６−７８１０，２００１）」によって記載されている方法を用いて精製された。）から、ヒトヘプシジンを単離した。要約すれば、凍結された尿約２Ｌを融解し、０．４５及び０．２２μのフィルターを通してろ過し、１０ｍＬ床容積のＣＭｍａｃｒｏｐｒｅｐ（ＢｉｏＲａｄ）カラム上に搭載し、８０ｍＬ／時間の流速で、ＰＢＳで平衡化した。溶出液のＯＤ２８０が０．１未満になるまで、カラムをＰＢＳで洗浄した。水中の５％酢酸を用いて、ヘプシジンを溶出した。溶出液は数個の他のペプチドを含有しているので、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル対０．１％水性ＴＦＡの勾配を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８）によってさらにこの材料を精製した。質量分析によって、ヘプシジンを含有するＨＰＬＣ画分を分析した。
ペプチドの定量：Ａｎｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）１６から得たモデル７０００ＣＬＮＤ窒素特異的検出装置を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム上でＣＬＮＤ分析を行った。０．５ｍＬ／分の流速で、１４分にわたって０から８０％のＢになる緩衝液Ｂ対Ａの線形勾配（Ａ＝０．０４％水性ＴＦＡ；Ｂ＝０．０４％ＴＦＡを含有するＭｅＯＨ）を用いて、ＡｇｉｌｅｎｔＣ３逆相カラム（５μｍ、０．２ｃｍ×５ｃｍ）上で、クロマトグラフィー分離を行った。ＣＬＮＤの条件は、１０５０℃熱分解温度、ＰＭＴ電圧７００Ｖ，範囲２５Ｘ及び１Ｖの検出装置出力、２１４ｎｍでのＵＶ吸光度検出であった。ＤＭＳＯ中に溶解されたカフェイン標準物質（９９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、ＣＬＮＤ応答較正曲線を調製した（標準物質：窒素の８、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０、１９２０及び４４８０ナノグラム（ｎｇ）当量）。（５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）の公知の容量中にヘプシジン試料を溶解し、ＣＬＮＤ応答をヘプシジン注入容積及び窒素数と数学的に相関付けることによって濃度を測定した。全てのその後のヘプシジン調製法の定量のために、この方法を使用した。
ＣＨＯによって得られた組換えヒトヘプシジン（ｒｈＨｅｐｃ）発現及び精製
ヒトプロヘプシジン（配列番号１０２）をコードする配列番号１０１を含むＤＮＡで、ＡＭ−１／サイクリンＤチャイニーズハムスター卵巣（ＡＭ−１／ＤＣＨＯ）細胞（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１０，９２４号参照）を形質移入することによって、ヒトヘプシジンを安定に発現させた。製造業者の推奨に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００（ＬＦ２０００）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、形質移入を行った。要約すれば、５％ウシ胎児血清、１×ペニシリン−ストレプトマイシン及びグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ピルビン酸ナトリウム及びヒポキサンチンナトリウム／チミジン（ＨＴ）補充物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０ｍＬ中の１００ｍｍ直径のプラスチックＢＤ−ＦａｌｃｏｎＴＭペトリ皿（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）中に形質移入する２４時間前に、４×１０６個のＡＭ−１／ＤＣＨＯ細胞を播種した。制限酵素ＰｖｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、ヒトプロヘプシジンプラスミドＤＮＡ約３０μｇを直鎖化し、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の２ｍＬ中に希釈した。希釈されたＤＮＡをＯｐｔｉＭＥＭの２ｍＬ中に希釈されたＬＦ２０００の７５μＬと混合し、室温で２０分間、混合物を温置した。ＤＮＡ−ＬＦ２０００混合物を細胞に添加し、形質移入のために一晩温置した。翌日、新鮮な増殖培地を添加し、５％ＣＯ２とともに、３７℃で４８時間、細胞を培養し、次いで、１：２０と１：５０の希釈でＨＴ選択培地中に播種した。
形質移入から約２週後に、生存している細胞を、限界希釈によって、９６ウェルプレート中にクローニングされた単一細胞であった。抗プロヘプシジンポリクローナル抗体を用いて、クローンによるヘプシジンの発現を測定した。ウェスタン分析に基づいて、本発明者らは、大規模生産のために、クローン１１８−３４を増殖した。１つのＣｏｒｎｉｎｇ（Ｒ）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（Ｒ）８５０ｃｍ２ポリスチレンローラー瓶（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を播種するために、約２から３×１０７個の細胞を使用し、続いて、細胞を１：１０増殖させた。各ローラー瓶に、高グルコースＤＭＥＭの２５０ｍＬ、１０％の透析されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１×グルタミン、１×非必須アミノ酸及び１×ピルビン酸ナトリウム（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）を接種した。各ローラー瓶に蓋をする前に、２から３秒間、培地中に１０％ＣＯ２／残りは空気を培地中に通気した。０．７５回転／分（ｒｐｍ）で回転するローラー台上で、ローラビンを３７℃で温置した。（培養中で約５から６日後に）細胞が約８５から９０％の集密状態となった時点で、増殖培地を廃棄し、リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）１００ｍＬ及び５０％Ｄ−ＭＥＭ／５０％ＨａｍのＦ１２、１×グルタミン、１×非必須アミノ酸、１×ピルビン酸ナトリウム（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）及び１．５ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からなる生産培地２００ｍＬで細胞を洗浄した。
ヒトヘプシジンを含有する馴化培地を７日ごとに採集し、次いで、床容積１０ｍＬのＣＭｍａｃｒｏｐｒｅｐ（ＢｉｏＲａｄ）カラム上への０．４５／０．１μｍ酢酸セルロースフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を通してろ過され、８０ｍＬ／時間の流速で、ＰＢＳで平衡化した。溶出液のＯＤ２８０が０．１未満になるまで、カラムをＰＢＳで洗浄した。水中の５％酢酸を用いて、ヘプシジンを溶出した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム）によって、ＣＭ画分をアッセイした。１つの内部クリップを有するｒｈＨｅｐｃ２５、ｒｈＨｅｐｃ２４、ｒｈＨｅｐｃ２２、ｒｈＨｅｐｃ２１、ｒｈＨｅｐｃ２７及びｒｈＨｅｐｃ２４が検出された。ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐＣ４Ｖｙｄａｃカラム（１０×２５０ｍｍ）上に、ＣＭプールを搭載した。画分を集め、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＭＳによってアッセイした。適切な質量及び保持時間に従って、ｒｈＨｅｐｃ２５画分をプールした。
イー・コリ由来の組換えヒトヘプシジン発現及び再折り畳み
ヒトプロヘプシジン（配列番号１０２）をコードする配列番号１０１を含むＤＮＡをイー・コリ中で発現させた。培養後、遠心によって細胞を採集し、微小流体装置によって溶解し、洗浄した。室温で１時間、６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、６ｍＭＤＴＴ、ｐＨ８．５中に、１：１０の容量対重量比で、イー・コリのペーストから得た封入体を可溶化した。次いで、２Ｍ尿素、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１６０ｍＭアルギニン、３ｍＭシステイン中に、ｐＨ８．５、４℃で、混合物を１：２５希釈し、３から４日間撹拌した。０．４５μＭろ過によって、この溶液を清澄化し、濃ＨＣｌを用いて、３．０までｐＨを低下させる前に、５ｍＭシトラートに移した。３ＭＷＣＯ膜を用いて、１０倍濃縮を行い、２Ｍ尿素、５ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０と緩衝液交換した。遠心によって、再度、混合物を清澄化し、Ｓ−ＨＰカラムへの搭載の前に、ＮａＯＨを用いてｐＨ４．５になるように調整した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５０ｍＭＮａＣｌ、２Ｍ尿素、ｐＨ４．５中で、カラムを走行した。ＲＰ−ＭＳによって画分をアッセイしながら、７５０ｍＭＮａＣｌまでの勾配を実行し、予想される質量及び保持時間に従ってプールした。Ｋｅｘプロテアーゼとの温置によって、タンパク質のプロ領域を酵素的に切断し、３ｍＵプロテアーゼ／ｍｇプロヘプシンの添加によって実現した。３０ｍＭＴＲＩＳｐＨ７．０及び５ｍＭＣａＣｌ２を含む緩衝液中において、室温で１．５時間、混合物を温置した。逆相ＨＰＬＣを用いて、プールを再度精製した。
ヘプシジンの化学的合成、精製及び性質決定
Ｎ−メチル−ピロリジン（ＮＭＰ）中で１．０ＭＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）（１：１）カップリング化学を用いるＮα−Ｆｍｏｃ／側鎖ｔＢｕオルソゴナル保護戦略及び２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＮＭＰ脱保護化学（Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９）を使用し、ＡＢＩ４３３合成装置（（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、ヒトヘプシジンペプチド配列：水素−ＤＴＨＦＰＩＣＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣＧＭＣＣＫＴ−遊離の酸、配列番号９を化学的に合成した。合成のために、１ｍｍｏｌスケールでの単一のアミノ酸カップリングサイクルを使用し、このサイクルは、５８分のカップリング時間と３＋１５分のＦｍｏｃ脱保護時間からなった。合成のために、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂（０．１２ｍｍｏｌ当量の規模、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を使用した。Ｎα−Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）：Ａｓｐ（ｔＢｕ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）及びＬｙｓ（Ｂｏｃ）とともに、以下の側鎖保護戦略を使用した。樹脂上での鎖の組み立て及びＮ末端Ｆｍｏｃ基の除去後、側鎖を保護し、ジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いて、樹脂に結合されたヒトヘプシジンペプチド誘導体を洗浄し、乾燥させた。典型的には２から３時間、ゆっくり撹拌しながら、２０ｍＬの総容量中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／３，６−ジオキサ−１，８−オクタン−ジチオール（ＤＯＤＴ）（９２．５：２．５：２．５：２．５ｖ／ｖ）の調製直後の混合物で処理することによって、側鎖の脱保護及び固体支持体からの切断を達成した。ポリマー性の固体支持体を除去するために、溶液をろ過し、次いで、蒸発させた。氷冷したジエチルエーテル（５０ｍＬ）で残留物を処理し、沈殿したペプチドを遠心（２０００ｒｐｍで１０分）によって集め、次いで、容器を傾けてエーテル溶液を除去し、真空中でペプチドを乾燥させた。
撹拌及び音波処理を行いながら、非希釈ＴＦＡ（２ｍＬ）中に、乾燥されたペプチドを再構成し、次いで、６ＭグアニジンｐＨ４．５及び６Ｍグアニジン／０．５ＭＴｒｉｓ／２０ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．５の１：１の組み合わせによって調製された、新鮮な緩衝溶液（１００ｍＭ）中へ、撹拌しながら、滴下して希釈した。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、１ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、２時間撹拌した。次いで、調製的精製のために、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＪｕｐｉｔｅｒ１０μｍ３００ÅＣ１８２５０×２１．２ｍｍカラム上に、還元されたヒトヘプシジンを含有する溶液を搭載した。０．１％ＴＦＡ対０．１％ＴＦＡ水溶液を含有するアセトニトリルの線形勾配を用いて、クロマトグラフィー分離を達成した。溶出勾配法は、２０ｍＬ／分の流速で、１５分で１０から２５％Ｂ、続いて、３０分で２５から４０％Ｂであった。Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ−ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒシステム（飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計に連結されたＺ−スプレーイオン化；カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８２．１×５０ｍｍ，１．８μｍ）を使用するＬＣ／ＭＳ分析によって、還元されたヒトヘプシジンの予想分子量及びあらゆる他の質量の検出可能な不純物の３０％未満を含有する画分を同定し、プールした。保持時間（Ｒｔ）＝５．２７分、Ｃ１１３ＨＩ７８Ｎ３４Ｏ３１Ｓ９、計算された分子量＝２７９５．０９Ｄａ（モノアイソトピック）；観察された実験的分子量２７９５．７０Ｄａ。次いで、プールされた画分を１Ｌになるように水及びアセトニトリルで希釈して、２５％（ｖ／ｖ）のおよその最終アセトニトリル組成を得た。グルタチオン／グルタチオンジスルフィド（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）酸化還元系（ＧＳＳＧ３００ｍｇ及びＧＳＨ１５２ｍｇ）の存在下で、ｐＨ８．０から８．３（２８から３０％ＮＨ４ＯＨで調整された溶液、Ｂａｋｅｒ）で、５０から６０ＲＰＭの撹拌を行いながら、ジスルフィド結合形成を１６から２４時間行った。分析用ＬＣ／ＭＳによって、ジスルフィド結合形成の進行をモニターした。
折り畳みの１６から２４時間後に、次いで、非希釈ＴＦＡを用いて、ｐＨ２になるようにヒトヘプシジン含有溶液を調整し、アセトニトリル溶媒成分を蒸発させた。次いで、調製的精製のために、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＪｕｐｉｔｅｒ１０μｍ３００Å、Ｃ１８、２５０×２１．２ｍｍカラム上に、ヒトヘプシジンを含有する未精製折り畳み溶液を搭載した。溶出線形勾配法は、２０ｍＬ／分の流速で、１５分で１０から２５％の緩衝液Ｂ、続いて、４０分で２５から３５％の緩衝液Ｂであった。Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ−ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒシステム上でのＬＣ／ＭＳによって画分を分析し、９５％超のヒトヘプシジンを含有する画分をプールし、凍結乾燥した。折り畳まれたヒトヘプシジンに対応する分子量の物質を含有するが、乏しいＬＣ純度（５０から９５％）を有する画分をプールし、凍結乾燥され、無ＴＦＡ３０％アセトニトリル／水中に（約０．１ｍｇペプチド／ｍＬの濃度になるように）再懸濁し、飽和炭酸アンモニウムを用いてｐＨ７．５から８．０になるように調整し、２４時間放置した。この第二のヒトヘプシジンプールの半調製用規模の精製は、５ｍＬ／分で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ１０μｍ、３００Å、Ｃ１８、２５０×１０ｍｍカラムを用いて行い、９５％超のヒトヘプシジンを含有する画分をプールし、凍結乾燥された。ヒトヘプシジンの総収量は、３５ｍｇであった。保持時間（Ｒｔ）＝５．０５分、Ｃ１１３ＨＩ７０Ｎ３４Ｏ３１Ｓ９、計算された分子量＝２７８７．０３Ｄａ（モノアイソトピック）；観察された実験的分子量２７８７．７０Ｄａ。化学的に合成されたヒトヘプシジンのジスルフィド結合性は、還元的アルキル化ペプチドマッピング法及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析によって決定した。
合成、組換え及び尿性ヘプシジンの分析及び比較
天然、組換え及び合成物質の同等性を示すために、実施例１に記載されているように尿から精製されたヒトヘプシジンを、ＣＨＯ由来の組換え的に作製された物質（実施例２）、イー・コリに由来する組換え的に作製された物質（実施例３）及び化学的に合成された物質（実施例４）に対して比較した。ＩＲＭＰＤ断片化スペクトルを比較した（図１）。観察された断片の全てに対して、直接的な配列帰属は不可能であるが、全ての試料のＭＳ／ＭＳフィンガープリントは同一であった。衝突活性化解離（ＣＡＤ）によっても試料が解離され、ＥＣＤ及びスペクトルは全ての調製物に対して一貫していた。生物分子イオンの構造の小さな変化でさえ、直列の質量スペクトルを大幅に変化させることができる。従って、これらの異なる解離技術によって４つのヘプシジン調製物全てが同一であることは、分析されたヘプシジンの４つの形態全てに対して、ジスルフィド結合性が同一であることを示唆する。
４つのヘプシジン調製物全ての一次元１ＨＮＭＲスペクトルは図２においても比較され、全ての調製物が等価であることを支持した。使用された方法は、実施例２に記載されている。ｕｈＨｅｐｃのＩＤスペクトルの小さな差は、試料間の僅かなｐＨと塩のミスマッチによるものである。これは、ヒスチジン環プロトン共鳴に対する、及びカルボキシル基に近接し、異なる立体構造形態に関与する２つの隣接するスレオニン残基からの共鳴に対して最も顕著な効果を有している。幾つかの試料は、シス立体構造中にプロリン残基を有する微量の形態由来の小さなピークを示している。ＣＨＯ由来のｒｈＨｅｐｃは、精製過程の間に、Ｎ末端アスパラギン酸が酵素的に切断された２４残基のペプチドの少量（＜５％）を含有する。
合成の、組換え的に発現された、及び天然のヘプシジンの構造的な同定は、抗体作製及び検査のために、正しく折り畳まれ、製造された物質の巨大バッチの作製を可能とする。
インビトロヘプシジン活性フェリチンアッセイ
インビトロ細胞アッセイ中で、鉄制御生物活性に関して、実施例１、２、３及び４に従って精製又は作製されたヒトヘプシジンをアッセイした。２９３細胞中で誘導的に発現されたフェロポーティンは鉄の搬出を刺激し、細胞内の鉄を低下させ、従って、フェリチンレベルを低下させる（Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６：２０９０−２０９３，２００４）。フェローポーティンの作用は、ヘプシジン処理によって、用量依存的な様式で低下させることができる。この作用は、ヘプシジンによって誘導されたフェロポーティンの内部取り込み及び分解のために、並びにこれによる鉄搬出の低下によるものであることが示されている。
５％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン補充物（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）が補充されたＤＥＭＥ中、ポリーＤリジンが被覆された９６ウェルのＢｉｏＣｏａｔプレート中に、テトラサイクリン誘導性のフェロポーティン遺伝子を発現する２９３細胞を、５０，０００細胞／ウェル（７０から８０％の密度）で播種した。５％ＣＯ２とともに、３７℃で一晩温置した後、培地をアッセイ培地（上記と同様であるが、ヘプシジン誘導に対して２．５μｇ／ｍＬドキシサイクリンが補充され、鉄補充されたウェルに対して２．５μｇ／ｍＬクエン酸鉄が補充され、及びヘプシジン処理ウェルに対して１μｇ／ｍＬが補充されている。）と交換した。冷ＰＢＳ中でウェルを洗浄し、１５分間、氷上で１％Ｔｒｉｔｏｎ溶解緩衝液１２０μＬ中で溶解する前に、上述のように、プレートを１７から２０時間さらに温置した。フェリチン分析（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎａｌｙｚｅｒ）に対して、可溶化液１００μＬを使用し、ＢＡＣタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）に対して１０μＬを使用した。タンパク質含量に対して、フェリチンの結果を標準化した。
尿性組換え又は合成ヘプシジンで細胞を処理することによって、鉄保持の増加がもたらされ、３つの調製物が全て生物的に活性を有することを示唆した。３つの調製物は全て、同じジスルフィド結合性及び生物活性を示したので、これらは等しいものとみなすことが可能であり、抗体産生及び検査のために合成及び組換え調製物の使用を可能とする。
部分的な還元的アルキル化による尿性ヘプシジンのジスルフィドマッピング
２つの異なる技術、ＮＥＭ部分的還元的アルキル化及びフーリエ変換質量分析（ＦＴ−ＭＳ）を用いて、尿から精製された内在性ヒトヘプシジンペプチドのジスルフィド結合性を調べた。
簡潔に述べると、以下に記載されているようにして、敗血症患者の尿からヒトヘプシジンを精製した。３ｍＭＴＣＥＰでの部分的還元によって、ヘプシジン中のジスルフィドの経時的な段階的還元が可能となった。ＴＣＥＰ処理によって化学的に還元されたジスルフィドはＮＥＭによるアルキル化に対して感受性であり、ＮＥＭによってアルキル化されたシステインは、ペプチドの配列分析によって同定することができる。この技術は、ヘプシジンのジスルフィド結合性がＨｕｎｔｅｒ他、上記によって推測されたものとは異なることを示した。直接的に決定されたヘプシジンジスルフィドの結合性、Ｃ１−Ｃ８、Ｃ２−Ｃ４、Ｃ３−Ｃ６及びＣ５−Ｃ７は、コンパクトで、緊密に折り畳まれた分子を与える。
方法：０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．０又は０．１％ＴＦＡ（１００μｌ）（ｐＨ２．０）中に、精製されたヘプシジン（２０から３０μｇ）を溶解し、０．１Ｍトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）３μＬで処理した。ＴＣＥＰの最終濃度は３ｍＭであった。３７℃で８分間、還元を進行させた。０．５ＭＮＥＭの２０μＬで、部分的に還元されたヘプシジンを直ちに処理し、続いて１ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）の３０μＬ及び８Ｍ塩酸グアニジニウム１００μＬを添加した。ジスルフィドの再配置を抑制するために、溶液のｐＨを６未満に維持した。室温で２０分間、ＮＥＭ−アルキル化を行った。アルキル化されたペプチドを精製するために、ＶｙｄａｃＣ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ）を用いて、反応物を逆相ＨＰＬＣに直接供した。０．２５ｍＬ／分の流速で、溶媒Ａに対して０．１％ＴＦＡ及び溶媒Ｂに対しては９０％アセトニトリル−０．１％ＴＦＡを使用し、３０分にわたって２５％Ｂから５０％Ｂになる線形グラジエントを用いて、ＮＥＭによって修飾されたペプチドを溶出した。ＮＥＭ−誘導体を集め、乾燥させ、０．２％ＴＦＡ−５０％アセトニトリル１５μＬ中に溶解した後に、ＭＡＬＤＩ質量分析によって分析した。ステンレス鋼プレート又は金プレート上に、試料の１つの分割量を搭載し、マトリックスα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（４−ＨＣＣＡ）と共結晶化した。３３７ｎｍの窒素レーザーが搭載されたＶｏｙａｇｅｒＤＥ−ＳＴＲ飛行時間質量分析計（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）上で、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを取得した。加速電圧を通例２５０００Ｖ、グリッド電圧を９５％、ガイドワイヤを０．００５％及び抽出遅延時間を１５０ナノ秒に設定して、線形モードで測定を行った。酸化されたインシュリンＢ鎖の標準（ＭＨ＋＝３４９６．９６）を使用して、外部較正によって、飛行時間の質量への変換を行った。
優先的に還元されたシステインを測定するために、様々なＮＥＭ誘導体から、２−ＮＥＭ−Ｃｙｓ含有誘導体を選択し、さらに還元された試料に対して、以下のように配列分析を行った。０．０５％ＴＥＡの２０μＬ中に２−ＮＥＭ−誘導体を溶解し、４５℃で２０分間、２−メルカプトエタノールの０．５μＬを用いて還元した。試料をペプチド配列決定へ直接供した。ＮＥＭ標識されたシステインは、異性体形態のために、ＰＴＨ−ＰｒｏとＰＴＨ−Ｍｅｔの間に二重ピークとして現れた。ＮＥＭ−Ｃｙｓの定量のために、両ピークを積算した。ヘプシジンの４から６のＮＥＭ誘導体を含有する画分を合わせ、タンパク分解によって消化した。０．１ＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ６．６中に、乾燥された試料を再び再構成し、サーモリシン（１μｇ）で消化した。３７℃で一晩、消化を進行させた。試料を、ＶｙｄａｃＣ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ）を使用する逆相ＨＰＬＣに供した。３０分間で２％Ｂから３５％Ｂになる線形勾配を用いてペプチドを精製し、最後に６０％Ｂで洗浄した。熱分解性ペプチドを乾燥させ、０．２％ＴＦＡ−５０％アセトニトリル（１５μＬ）中に再構成した。試料の１つの分割量（１μＬ）をプレート上に搭載し、乾燥させた。マトリックス上に、４−ＨＣＣＡを添加し、ＭＡＬＤＩ質量分析のために結晶化した。ＮＥＭ標識の部位を決定するために、残りの試料を配列決定した。
タンデム型質量分析（ＦＴＭＳ）法：全てのＦＴＭＳ（フーリエ変換質量分析法）データは、７テスラで稼動する改変されたＢｒｕｋｅｒＱ−ＦＴＭＳ上で取得した。装置には、イオンセルのバックトラッピングプレートから約０．３ｍに位置する磁場のフリンジング領域中に配置された陰極電子フィラメントが搭載されていた。標準的なＦｒａｎｃｅｌ式を使用して、ＰＥＧ３００／６００溶液を用いて、装置を外部較正した。各較正イオンに対する計算された質量誤差は、測定された値から１．０ｐｐｍ未満であった。フロントエンド四極子を用いて、各イオンを単離した。アルゴンを衝突ガスとして用い、気体支援動的トラッピングを使用して、ＦＴＭＳセル中で、イオンを捕捉した。
ＩＲＭＰＤ（赤外多光子解離）実験のために、１５％から４０％のレーザー出力で２００ミリ秒間、ＳｙｎｒａｄＣＯ２レーザーを作動させた。９００ｋＨｚの獲得バンド幅での直接モード検出を用いてイオンを検出し、５１２０００のデータ点を集めた。時間領域シグナルを、一回、ゼロフィルし、マグニチュードモードフーリエ変換を実施する前にサインウィンドウを用いてアポダイズを行った。
ＥＣＤ（電子捕獲解離）タンデム型質量分析実験のために、１．８Ａ（８．５Ｖ）を用いて、電子フィラメントを加熱した。トラッピングプレートに対して電圧に対して、＋０．５Ｖのバイアスをフィラメントに適用した。ＭＳ３実験のために、ＩＲＭＰＤ後に、ＣＨＥＦチャープパルスを用いて目的の娘イオンを単離し、ＲＦ振幅におけるノッチは、目的のイオンのサイクロトロン周波数に対応する。「低エネルギー」ＥＣＤによって、単離された娘イオンをさらに断片化した。電子照射の開始時に、イオンセル中にアルゴン気体をパルスした。
結果：ｐＨ２でＴＣＥＰを用いて、ヘプシジンを部分的に還元し、１つのジスルフィド結合のみの一次還元（切断）がもたらされ、近接して溶出する２つのピーク（両者は、分子量の点で、２ＮＥＭアルキル化産物に対応する。）が形成された（図３Ａ、２ａ及び２ｂと表記）。ピーク２ａ及び２ｂ中のＮＥＭ標識部位を決定するために、エドマン分解によって、精製されたペプチドを配列決定した。位置Ｃ５におけるＰＴＨ−ＮＥＭ−システインの検出は、この残基が還元及びアルキル化されていることを示した。Ｃ７のアルキル化も見られたが、Ｃ８もアルキル化されているようであった。配列の持ち越し（（特に、配列決定されたより長い産物中の）標識された残基の後に、残基に対する偽陽性シグナルをしばしば付与する周知の現象）は、おそらくはヘプシジンの高いシステイン及びプロリン含量のために、この分析において顕著な障害であった（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｍｚｙｍｏｌ．，２８９：３９５−４１９，１９９７； Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｐｒｏｔｉｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；１９８２）。第二のＮＥＭ標識部位を確認するために、配列決定された試料を、ガラスファイバーフィルター上で、臭化シアン（ＣＮＢｒ）で処理し、再度配列決定した。結果は、Ｃ７がＮＥＭによって著しくアルキル化されている（Ｃ８はアルキル化されていない。）ことを示した。従って、Ｃ５及びＣ７は主要なアルキル化された種であり、従って、Ｃ５−Ｃ７結合は還元前に存在していたと結論付けられた。Ｃ４は、ピーク２ａ中では、完全に非標識であり、内在性ヒトヘプシジンの主要な種の中には、Ｃ４−Ｃ５結合が存在しないことを示唆している。
ピーク２ｂに対して、類似の分析を行った。Ｃ２は、第一のＮＥＭアルキル化部位として明確に同定され、Ｃ４及びＣ５は何れも、検出されたアルキル化産物の著しい量を有していた。Ｃ５位置中のアルキル化の存在は、上述した持ち越し現象によって引き起こされたものと判断した。Ｃ２−Ｃ５又はＣ４−Ｃ５結合が見られないことを示す以前のデータによって、Ｃ２−Ｃ５結合の可能性は除去された。これらの結果は、隣接するシステインＣ４及びＣ５間のジスルフィド結合が内在性ヘプシジン調製物中に存在すれば、検出不能なほど低い濃度で存在しなければならないという事実と合致する。このデータは、Ｃ２及びＣ４が主要なＮＥＭ−アルキル化された形態であることを示唆し、これにより、Ｃ２−Ｃ４ジスルフィド結合性を示唆する。
より多くのジスルフィド結合を還元するために、ｐＨ３で３ｍＭＴＣＥＰを用いて、試料をさらに処理した。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、クロマトグラム中の主要なピークが、それぞれ、４−、６−及び８−ＭＥＭアルキル化産物（図３Ｂ）に対応することを示唆した。部分的に還元され、アルキル化された４−及び６−ＮＥＭ産物は、完全な状態のジスルフィド結合をなお含有していたのに対して、８−ＮＥＭ産物は完全にアルキル化された形態であり、従って、分析に関して有用でなかった。残りのジスルフィドを測定するために、これらの４−及び６−ＮＥＭ誘導体を合わせて、ｐＨ６．６で、サーモリシンを用いてさらに消化した（ジスルフィド再配置を防ぐために、ｐＨ７を下回るように維持し、これにより、ジスルフィド結合をなお含有する断片又はジスルフィド結合によって一緒に連結されたペプチドの単離が可能となる。）。エドマン配列決定によって、部分的にアルキル化されたペプチド断片を同定した。ＮＥＭ標識されなかった単離されたペプチド断片中に同定されたシステイン対は、アルキル化の後もなお、ジスルフィド結合の形成に関与していた。ペプチドＴｈ−１は、ＩＣ（配列番号９の残基６−７）及びＧＭＣＣＫＴ（配列番号９の残基２０から２５）に対応する２つの配列を示した。残基２２（Ｃ７）は、ＮＥＭ標識されていることが示され、従って、両ペプチドを接続するジスルフィド架橋には関与していなかった。残基７及び２３（Ｃ１及びＣ８）は何れも非標識であり、２つのペプチド間の結合がＣ１−Ｃ８であることを示唆していた。ペプチドＴｈ−２は、残基１０、１３及び１４（Ｃ２、Ｃ４及びＣ５）がＮＥＭで修飾されており、従って、ジスルフィドによって結合されていない単一の配列（ＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣ；配列番号９の残基８から１９）を示した。残基１１及び１９（Ｃ３及びＣ６）は、修飾されていないシステインとして検出された。単量体ペプチドが単離されたので、ペプチド間ジスルフィド結合の可能性は除外され、Ｃ３−Ｃ６ジスルフィド結合の存在が示唆された。これらのペプチドのＭＡＬＤＩ分析は、これらの割り当てを支持した。
部分的な還元的アルキル化ペプチド産物のＦＴＭＳ分析もこのジスルフィド結合性を確認し、エドマン分解によって見られた持越し現象の影響を受けないことを確認した。
図６は、全てのＮＥＭ部分的アルキル化分析から作製されたジスルフィド結合性の複合的な割り当てを示しており、ヒト尿性ヘプシジンでは、固有のジスルフィド結合性はＣ１−Ｃ８、Ｃ２−Ｃ４、Ｃ３−Ｃ６及びＣ５−Ｃ７であることを示している。
ジスルフィド結合性を評価するために、ＦＴＭＳも使用した。得られたスペクトルは複雑であり、標準ｂ／ｙイオン系列が直接観察されなかったので、直接的な配列の割り当ては困難であった。これは、おそらく、ペプチドの中の４つの損傷されていないジスルフィド結合によるものであろう。正確な質量測定に基づいて、幾つかの割り当てを推測することができる。例えば、ｍ／ｚ６９８．７７９４に、二重に帯電されたイオンが観察され、１３９５．５４４３Ｄａの中性質量に対応している。この正確な質量は、この断片が単一のジスルフィド結合によって連結されたペプチド（ＤＴＨＦＰＩＣ、配列番号９の残基１から７及びＭＣＣＫＴ、配列番号９の残基２１から２５）の２つの内部断片を含有していることを示唆する。この断片の理論的なモノアイソトピック質量は、１３９５．５４４４（０．１ｐｐｍの質量一致）である。１０ｐｐｍより良好に、この質量と一致する他の断片イオンは（内部再配置なしに）推定できなかった。内部断片イオンの形成は、典型的には、ＩＲＭＰＤなどの低エネルギー断片化法を用いて観察されない。これらの内部断片の観察は、新しい断片化プロセスを引き起こすと思われる完全な状態の分子中の４つのジスルフィド結合によって誘導される環状構造によって、おそらく促進される。これらの内部断片は、完全にジスルフィド還元された材料のＩＲＭＰＤスペクトル中には観察されなかった。
その後の低エネルギーＥＣＤＭＳ３実験は、ｍ／ｚ６９８．７７９４の二重に帯電された娘イオンを示した。このＭＳ３スペクトル中に観察された一次断片は、それぞれ、２つの内部断片ＤＴＨＦＰＩＣ（配列番号９の残基１から７）及びＭＣＣＫＴ（配列番号９の残基２１から２５）に対応するｍ／ｚ８３１．３５８５及び５５０．２１２の単一に帯電された２つのイオンであった。ＳＨ基の喪失に対応するより低強度のイオンも観察された。これらの割り当ては、完全状態の構造中において、これらの２つのペプチド領域がジスルフィド結合によって接続されていることを示唆し、Ｃ１がＣ７又はＣ８の何れかに接続されていることを示唆する。
ＩＲＭＰＤスペクトル中の多くの複数帯電されたイオンの殆どに対して、類似のＭＳ３実験を行った。正確な質量測定から、ＭＳ３断片は内部ペプチドＣＨＲＳＫ（配列番号９の残基１４から１８）及びＭＣＣ（配列番号９の残基２１から２３）として割り当てられ、図６に示されているように、これらのペプチドは、完全な状態の分子中においてジスルフィドによって接続されていることを示唆している。
ジスルフィド結合性とともに、ヒトヘプシジンの三次元構造の提案されたモデルが、図７（右）に図示されている。
ヒトヘプシジンのＮＭＲジスルフィド結合及び構造分析
ヒトヘプシジンの構造は、ＮＲＭ分光法によっても決定された。ジスルフィド結合を形成する全てのシステイン残基のプロトン間で、ＮＯＥ（核オーバーハウザー効果）が直接観察されたこれらのデータによって、ジスルフィド結合性が以下のように明らかとなり（Ｃ７−Ｃ２３（Ｃ１−Ｃ８）、Ｃ１１−Ｃ１９（Ｃ３−Ｃ６）、Ｃ１０−Ｃ１３（Ｃ２−Ｃ４）及びＣ１４−Ｃ２２（Ｃ５−Ｃ７））、前述した部分的アルキル化還元の結果と一致していた。これらの実験的観察は、以前に公表された構造（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２）と著しく異なるヘプシジンの三次元構造の決定を可能にした。これらの実験中で使用された濃度及び温度条件下で、長期間にわたって、最も優れた安定性特性を示したので（高品質の溶液ＮＭＲ研究にとって重要である。）、ＣＨＯ由来の組換えヒトヘプシジンから結果を作製した。安定性を示唆するパラメータは、物質凝集のパーセント及び図２に示されているＮＲＭ１Ｈ線幅によって測定される、溶液中での分子の単分散の程度であった。
ＮＭＲ試料及び実験：最後の精製工程から得られたｕｈＨｅｐｃの水溶液中にＤ２Ｏの５％を添加することによって、ＮＭＲ試料を調製した。ＮＭＲ構造研究のために、９０％Ｈ２Ｏ／１０％Ｄ２Ｏ及び９９．９９９％Ｄ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中のＣＨＯ由来ｒｈヘプシジンの１ｍＭ溶液を調製した。調整されていないｐＨは、３に近かった。全ての実験は、ＴＸＩ凍結探針が搭載されたＢｒｕｋｅｒＤＲＸ−６００装置上で、３２５Ｋで実施した。スペクトルの帰属及びＮＯＥ拘束の大半は、標準的な２ＤＮＭＲ法によって取得した（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９８６）。α及びβ炭素の１３Ｃ化学シフトは、２Ｄ１３ＣＨＳＱＣスペクトルから取得された。これらのスペクトルの帰属をさらに確認し、立体特異的な帰属を２Ｄ１Ｈ−１３ＣＨＭＢＣ実験の分析によって取得した（Ｈａｎｓｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０４５７−６６，１９９１参照）。２ＤＮＯＥＳＹ又はハイブリッドＴＯＣＳＹ−ＮＯＥＳＹ実験の何れかから、システイン間ＮＯＥを得た（Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．ＥｄｎＥｎｇｌ．，２７：５６４，１９８８）。高いデジタル分解能（０．５Ｈｚ）で記録された２ＤＴＯＣＳＹ実験から、３ＪＨＮＨα（三結合Ｊカップリング）を得た。Ｃ２２を除く全ての残基に対する立体特異的なプロトンの帰属は、隣接するＨα−Ｈβ及びＣ−Ｈβ並びに二結合Ｃα―Ｈβ結合パターンに基づいて得られた。Ｃ２２は、縮重化学シフトを有するＨβプロトンを示し、これは、この残基の立体特異的な帰属を除外する。Ｈ２ＯからＤ２Ｏ溶液へのＣＨＯ由来のｒｈＨｅｐｃの再構成後に、ＩＤプロトンスペクトルを記録することによって、Ｈ−Ｄ交換を追跡した。水抑制は、励起スカルプティングパルス系列の使用によって達成した。全てのＮＭＲスペクトルは、０．０ｐｐｍにおいて、ＤＳＳ（２，２−ジメチル−２−シラペンタン−５−スルホナートナトリウム塩）に対して外部参照を行った。
ジスルフィド結合の結合性：ＣＨＯ由来のｒｈＨｅｐｃのプロトンスペクトルは、等核２ＤＴＯＣＳＹ及び２ＤＮＯＥＳＹ実験の組み合わせによって、完全に帰属が決定された。図４に示されている連続的な結合性の帰属。Ｃ１３及びＣ１４に属する共鳴（図２）は、化学的交換によって幅が広くなり、高温及び低ｐＨ値においてのみ容易に観察可能である。
ＮＯＥＳＹスペクトルはＮＭＲＰｉｐｅを用いて処理し、Ｓｐａｒｋｙソフトウェアパッケージを用いて分析した。二次元データは、各次元において、一回、ゼロフィルを行い、シフトしたサインベル二乗アポディゼーション関数を用いてフーリエ変換を行った。ＮＯＥＳＹピーク容積に基づき、及び「単離されたスピン対近似」を使用することによって、距離制限を較正した。タンブリング時間は、メチレンプロトン間の交差緩和速度から、２９３Ｋで約１．５ナノ秒及び３２５Ｋで約６５ナノ秒であると推定され、これは、ストークスの法則
Figure 2014221763
 と一致する。これらの相関時間は、水溶液中の単分子のタンブリングに対応しており、２スピン近似の正しさを示す。
Ｃ７−Ｃ２３（Ｃ１−Ｃ８）及びＣ１１−Ｃ１９（Ｃ３−Ｃ６）ジスルフィドに対するジスルフィド結合の結合性は、対応するＨαプロトン間の極めて強力な（２．１Å）ＮＯＥ相互作用として現れる。ペプチド中のβプロトン共鳴は高度に過密しているので、これらのプロトン間の直接的なＮＯＥ結合性を観察することはしばしば困難である。しかしながら、ＴＯＣＳＹ−ＮＯＥＳＹリレー実験において、Ｈβ−ＨβＮＯＥピークは対角から離れて出現し、明確に帰属を実施することができる。この実験で観察されたＣ１０（Ｈβ）−Ｃ１３（Ｈβ）（Ｃ２−Ｃ４）及びＣ１４（Ｈβ）−Ｃ２２（Ｈβ）（Ｃ５−Ｃ７）ＮＯＥ相互作用は、図５に示されている。ｐＨ約７及び３２１Ｋで記録された２ＤＮＯＥＳＹスペクトル中には、相対的に強い（約２．７Å）Ｃ１０（Ｈβ）−Ｃ１３（Ｈβ）（Ｃ２−Ｃ４）ＮＯＥ交差ピークも観察され、Ｈβ共鳴は十分に分離されている（約６０Ｈｚ）。Ｃ１４（Ｈβ）−Ｃ２２（Ｈβ）（Ｃ５−Ｃ７）リレーＮＯＥピークは、２ＤＮＯＥＳＹスペクトル中での短い混合時間で出現する弱い直接的Ｃ１４（Ｈα）−Ｃ２２（Ｈβ）（Ｃ５−Ｃ７）相互作用からの小さな寄与を有する。この寄与を除去するために、５００ミリ秒のＮＯＥＳＹ混合時間の間に、Ｈα共鳴の事前飽和を用いて、２ＤＴＯＣＳＹ−ＮＯＥＳＹ実験を取得した。この実験は、ほぼ同じＣ１４（Ｈβ）−Ｃ２２（Ｈβ）（Ｃ５−Ｃ７）交差ピーク強度を示し、これがＨβプロトン間の相互作用（＜３Å）から主に起因するものであることを確認する。さらなるＮＯＥ結合性は、異なるシステイン残基対間に観察されなかった。要約すると、これらの結果は、図６に開示されているジスルフィド結合性を支持し、以前に報告されたジスルフィド結合性（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２）と矛盾する。
ヘプシジンの溶液ＮＭＲ構造：三次元構造の計算は、ＴＡＬＯＳソフトウェアパッケージを用いて、Ｃα及びＣβ化学シフト値から得られた、プロトン間ＮＯＥ制約、φ角度に対する三結合Ｊカップリング定数（３ＪＨ Ｎ Ｈ α）及びψ角度に対する緩い角度制約に基づいた。構造は、拡張された形状から、ＣＹＡＮＡ２．１（Ｇｕｎｔｅｒｔ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：３５３−７８，２００４参照）によって計算され、捻転角力学をベースとするシミュレートされた徐冷の２０，０００段階に基づいて集約された。計算の最後の段階において、集約を達成した後、（２Ｈ交換実験から得られた）遅い交換であると決定されたアミドに基づいて、水素結合制約を取り込んだ。この点で、次いで、提案された結合性パターンに従って、ジスルフィド結合拘束を加えた。２０の最低エネルギー構造から計算されたヘプシジンの平均構造が、以前に公表された構造の集団から得られた平均構造（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，ｓｕｐｒａ）と、図７中で比較されている。両研究は、類似のβ−シート要素を示し、β−ヘアピンループを示している。両構造間の最も著しい差は、このループの湾曲であり、これは、我々の構造中では、Ｃ２−Ｃ４及びＣ５−Ｃ７ジスルフィド結合によって決定される可能性が最も高い。報告された構造とのこのような著しい構造の差は、分子に結合する抗体に対する劇的に異なるエピトープに相当する。
ヘプシジン変形物の合成及び活性
実施例４に記載されている一般的手順に従って、多数のヘプシジン変形物を化学的に合成した。Ｎ末端の５つのアミノ酸を欠如するヘプシジンの変形物（「ヘプシジン２０」又は「ｈｅｐｃ２０」と表記される。）を合成した。８つのシステイン残基全てが２−アミノ酪酸で置換され、従って、ジスルフィド結合を形成する能力を完全に失った直鎖ヘプシジン変形物も合成した。２つのジスルフィド結合（Ｃ１−Ｃ８及びＣ３−Ｃ６）のみの形成も可能とするために、システイン２、４、５及び７が２−アミノ酪酸で置換されたＣ１−Ｃ８、Ｃ３−Ｃ６ヘプシジン変形物も合成した。
公表された結果（Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０７：３２８−３３３，２００６）と一致して、Ｎ末端切断された変形物ｈｅｐｃ２０は、著しく減弱した生物活性を有していた。８つのシステイン残基全てが置換された直鎖ヘプシジン変形物も非活性であった。
分子が完全に還元された状態である場合（すなわち、ジスルフィド結合なし）、その固有状態のシステイン残基を含有するヘプシジンを用いて、類似の結果が得られた。この還元された物質は安定でなかったが、時間が経過するにつれて、生物活性を取り戻した。
ＫＬＨ連結された材料に対するマウス抗ヒトヘプシジンモノクローナル抗体の調製
以下のようにして、ヒトヘプシジン特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２．７及び２．４１をマウス中で作製した。動物に投与する前に、標準的なＥＤＣ化学を用いて、組換え的に発現され及び再折り畳みされたヒトヘプシジンを担体タンパク質ＫＬＨに連結した。簡潔に述べると、ヒトヘプシジン及びＫＬＨの等量を含有するＭＥＳ緩衝化された溶液へ、ＥＤＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）の４倍モル濃度過剰を直接添加した。室温で２時間、反応を進行させた。次いで、完全フロイントアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）又はＲＩＢＩ（Ｓｉｇｍａ）及びＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）の１：１比中で、ヒトヘプシジンーＫＬＨ連結体を乳化した。ＢＤＦ１マウス及びＣ５７ＢＬ／６の首筋及び後肢に、ヘプシジン−ＫＬＨ／アジュバント乳化の５０μｇで皮下に免疫を行った。１４日後に、ＲＩＢＩアジュバント中のヒトヘプシジン−ＫＬＨ２５μｇの第二の免疫化を皮下及び腹腔内に送達した。この免疫化から１０日後に、抗ヒトヘプシジン血清レベルを評価するために、採血を行った。
滴定採血から約２週後に、ＰＢＳ中に懸濁されたヒトヘプシジン７５μｇで、１Ｃ５７Ｂ１／６マウスを腹腔内に強化免疫した。この強化免疫から５日後に、脾臓を無菌的に取り出し、融合のための処理を行った。簡潔に述べれば、単一細胞懸濁物中に脾臓を破壊し、赤血球を溶解した。ＳＰ２／０：脾細胞の１：２．５の比で、ＳＰ２／０．ＡＧ１４骨髄腫細胞を脾細胞と混合した。次いで、電気融合技術を用いて、この細胞懸濁物を融合した。富成長培地を用いて、得られたハイブリドーマを９６ウェルプレート中に播種し、２回の完全な培地交換によって維持した。第二の培地交換から３日後に、ＥＬＩＳＡを介して、抗ヒトヘプシジン特異的ＩｇＧに関してハイブリドーマをスクリーニングした。簡潔に述べれば、標準的なＥＬＩＳＡプレート上にＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）の１００ｎｇ／ウェルを被覆した。これらのプレートを洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、１％ｇｔ血清、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液でブロッキングを行った。次いで、ビオチン化されたヒトヘプシジンの１ｎｇ／ウェルをプレートに添加し、１時間温置した。洗浄後、培養プレートから、適切なハイブリドーマ上清５０μＬをスクリーングプレート上に移し、これらを再度１時間温置した。洗浄後、マウスＩｇＧ−ヒトヘプシジン複合体を検出するために、ポリクローナルヤギ抗ｍｕＩｇＧＦｃ特異的ＨＲＰ標識されたＡｂを使用した。適切な洗浄後、複合体を可視化するためにＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用した。次いで、この方法によって同定された陽性クローンを、増殖のために、４８ウェルプレートに移した。
ウイルスの免疫化によるマウス抗ヒトヘプシジンモノクローナル抗体Ａｂ４３の調製
以下のウイルス免疫化法によって、ヒトヘプシジン特異的モノクローナル抗体Ａｂ４３をマウス中で作製した。ヒトヘプシジンを発現するアデノウイルスを作製するために、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号Ｋ４９３０−００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用した。ヒトヘプシジンｃＤＮＡ（ｒＡｄ−ｈＨｅｐｃ）を担持する組換えアデノウイルスを以下のようにして構築した。簡潔に述べると、ｐＥＮＴＲ１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にヒトヘプシジン遺伝子を挿入することによって、ｐＥＮＴＲ−ｈＨｅｐｃを構築した。得られたヒトヘプシジン遺伝子は、ａｔｔＰＤＮＡ断片と隣接しており、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴ中のａｔｔＢＤＮＡ断片との組換えが可能である。ＬＲクロナーゼを用いて、ｐＥＮＴＲ−ｈＨｅｐｃとｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴの間の組換え反応によって、ＰＡｄ／ＣＭＶ−ｈＨｅｐｃを構築した。ｒＡｄ−ｈＨｅｐｃを作製するために、ＰａｃＩによってｐＡｄ／ＣＭＶ−ｈＨｅｐｃを直鎖化し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて２９３Ｔ細胞中に形質移入した。約８０％の細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されるまで、形質移入された２９３Ｔ細胞を培養した。形質移入された細胞は、膨張した丸型の形態、溶解された細胞及び可視的なプラークを示す。ＲＡｄ−ｈＨｅｐｃを含有する細胞を採集し、ｒＡｄ−ｈＨｅｐｃの増幅のために使用した。塩化セシウム勾配法によって、ＲＡｄ−ｈＨｅｐＣを精製し、Ａｄｅｎｏ−Ｘｒａｐｉｄ ｔｉｔｅｒ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて滴定した。
ｒＡｄ−ｈＨｅｐｃの１．２５×１０９感染単位（ｉ．ｆ．ｕ．）５０μＬで、両後肢の四頭筋中に、Ｃ５７Ｂ１／６マウスを免疫化した。脾臓を無菌的に取り出し、ｒＡｄ−ｈＨｅｐｃ免疫化から１０日後に、融合のための処理を行った。
抗ヒトヘプシジンモノクローナル抗体Ｒ９の作製
修飾を施したＲＩＭＭＳ法を用いて、ラット中でヒトヘプシジン特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製した。簡潔に述べると、２匹の８から１０週齢の雌Ｌｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のそれぞれに、１１日の期間にわたって、ヒトヘプシジンーＫＬＨ連結されたタンパク質での免疫化を５巡行った。各免疫化の前に、酸素及びイソフルランの気体混合物を用いて、ラットに麻酔をかけた。第０日目の第一の免疫化のために、６００μＬ容量のフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）中に抗原１０μｇを乳化し、ラットの背中に沿って、５０μＬ／部位で、流入領域リンパ節に対して近位の６つの部位（襟首の２箇所及び鼠径部及びふくらはぎに対して両側２箇所）に皮下投与した。腹部に沿って、６つの隣接部位（腋窩、太もも及びふくらはぎの両側２箇所）へ、さらに抗原混合物３００μＬを投与した。全体を通じてＲＩＢＩ（Ｃｏｒｉｘａ ＣＯＲＰ，ｃａｔ＃ Ｒ７００）アジュバントを使用したことを除き、類似の様式で、３日目、６日目、８日目及び１１日目に、強化免疫を与えた。
最終の免疫化から１日後に、二酸化炭素での窒息によって、ラットを安楽死させた。両側の膝窩、浅鼠径部、腋窩および鰓リンパ節を無菌的に単離し、２×ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）ＢＤ培地で２回洗浄した。リンパ節からリンパ球を放出させ、電気融合による、２．５：１の比率でのマウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５８１）との融合前に、単一細胞懸濁物を再度ＢＤ培地中で洗浄した。簡潔に述べると、細胞を洗浄し、１×１０７細胞／ｍＬで、ＣｙｔｏｆｕｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍＣ（Ｃｙｔｏｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）２ｍＬ中に再懸濁し、融合チャンバーに移した。Ｅｎｈａｎｃｅｒ４００（ＢＴＸＩｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を備えたＥＣＭ２００１を用いて、１５００Ｖで３０μ秒の３つのパルスを適用した後、６０Ｖ３秒間のパルスを適用することによって、電気融合を行った。穏やかに再懸濁し、１０％ＦＢＳ、５％Ｏｒｉｇｅｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（ＢｉｏＶｅｒｉｓＴＭ）、１×ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び１×ＯＰＩ（オキサロアセタート、ピルベート及びインシュリン）（Ｓｉｇｍａ）が補充されたＢＤ培地１００μＬ中に、３×１０４細胞／ウェルで、９６ウェルプレート中に播種する前に、室温で３０分間、細胞を回収した。培養中で２４時間後、２×ＨＡＴ（０．１ｍＭヒポキサンチン、０．１６ｍＭチミジン、４ｍＭアミノプテリン）（Ｓｉｇｍａ）１００μＬを各ウェルに添加した。５日後に培地を交換し、一次スクリーニングのために、温置の一週間後に、馴化培地を集めた。陽性クローンを増殖し、単一細胞をクローニングし、複数のアッセイによって確認した。
完全なヒト抗体の作製
標準的な方法を用いて、ＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭＩｇＧ２κλ及びＩｇＧ４κλマウスを、ＫＬＨ連結されたヒトヘプシジン（配列番号９）で免疫化した。プレートに固着された、ビオチン化されたヒトヘプシジンに対して、２３，０４０のＩｇＧ２上清及び１１，５２０ＩｇＧ４上清を単一の濃度でスクリーニングした。このスクリーニングから、上清間の濃度差の影響を最小限に抑えるために、捕捉された抗体の量を制限した抗体捕捉ＥＬＩＳＡを用いて、ヒト及びマウスのビオチン化されたヘプシジンの両方への結合に関して、６１７ＩｇＧ２及び１０１３ＩｇＧ４上清を検査した。抗体濃度のある範囲にわたって、溶液相ヘプシジン−抗体結合を測定する架橋ＥＬＩＳＡ中で、最上位ランクの試料（７０のＩｇＧ２及び１１０のＩｇＧ４）をさらに性質決定した。このアッセイによって、抗体結合の相対的な親和の順位が得られた。
ＩｇＧ２及びＩｇＧ４パネルのそれぞれから得られた上清は、以下のように表記した。１Ｃ９（配列番号１０７−１１６）、３Ｂ３（配列番号１１７−１２６）、４Ｅ１（配列番号１２７−１３６）、７Ａ３（配列番号１３７−１４６）、９Ｄ１２（配列番号１４７−１５６）、１２Ｂ９（配列番号１５７−１６６）、１５Ｅ１（配列番号１６７−１７６）、１８Ｄ８（配列番号３１０−３１９）、１９Ｃ１（配列番号３２０−３２９）、１９Ｄ１２（配列番号２９０−２９９）、１９Ｈ６（配列番号３００−３０９）、２３Ｆ１１（配列番号１７７−１８６）及び２６Ｆ１１（配列番号１８７−１９６）。
ヒトヘプシジンへのこれらの抗体の結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定され、次いで、ＢＩＡｃｏｒｅによって推定されたＫＤが１００ｐＭを下回れば、ＫｉｎＥｘＡによってこれを確認した。リード抗体に対するＫＤは、１ｐＭと４００ｐＭ超の間の範囲にあった。
競合ＥＬＩＳＡによって、相対的な種交叉反応性及びＨｅｐｃ２０（配列番号９６）への結合を測定した。ヒトヘプシジンと比較された相対的結合は、カニクイザルヘプシジン（配列番号６）に対して２倍低く、マウスヘプシジン（配列番号８０）に対して５００から１０００倍超低く、イヌヘプシジン（配列番号９２）に対して、１５０から１５００倍超、低かった。
ヒト及びマウスヘプシジンへの抗体の結合分析
Ｒ９、Ａｂ４３、２．７及び２．４１抗体の、組換えマウスヘプシジン（配列番号８０）及びヒトヘプシジン（配列番号９）との相互作用を研究するために、ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、溶液平衡結合分析を行った。
ＢＩＡｃｏｒｅチップ表面の調製：走行緩衝液（（ＤＰＢＳ：ダルベッコのリン酸緩衝液Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ１Ｘ、ＧＩＢＣＯ１４１９０、０．００５％Ｂｉａｃｏｒｅ界面活性剤Ｐ−２０あり）の流速１０μＬ／分で、製造業者の指示書に従って、ＢＩＡｃｏｒｅへのタンパク質の固定化を行った。まず、ＥＤＣ（水中のＮ−エチル−Ｎ−（ジメチルアミン−プロピル）カルボジイミド７５ｍｇ／ｍＬ、ＢＩＡｃｏｒｅから入手）及びＮＨＳ（水中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド１１．５ｍｇ／ｍＬ、Ｂｉａｃｏｒｅから入手）の１：１混合物の１００μＬ注射によって、センサーチップのカルボキシル化されたマトリックスを活性化した。センサーチップ上に固定化するために、組換えヒトヘプシジン又は組換えマウスヘプシジン（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中、約２０μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．０）１８０μＬを、３０μＬ／分で注入した。エタノールアミン１００μＬ（１．０Ｍ、Ｂｉａｃｏｒｅから入手）の注入により、センサーチップの過剰な反応性基を不活化した。
固定化されたヘプシジン表面上での抗体／ヘプシジン相互作用の平衡結合分析：固定化されたヘプシジン表面を通じて走行させる前に、室温で数時間、抗体の固定された濃度をヘプシジンの様々な濃度とともに温置した。各試料注入後、１０ｎＭグリシン、ｐＨ１．５の３０μＬを注入することによって、表面を再生した。得られた結合シグナルは、平衡状態の溶液中の遊離抗体に比例する。一重又は二重曲線一部位均一結合モデル（ＫｉｎＥｘＡＴＭソフトウェア、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，ＢｏｉｓｅＩＤ）を用いて、競合曲線の非線形回帰分析から平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。表３は、組換えマウス及びヒトヘプシジンへのＲ９、Ａｂ４３、２．７及び２．４１結合の結果を要約する。
Figure 2014221763
組換えカニクイザルヘプシジンへの抗ヒトヘプシジン抗体の結合
以下の実施例は、組換えカニクイザルヘプシジン（ｒｃｙｎｏ）への様々な抗体に対するＫｉｎＥｘＡ及びＢＩＡｃｏｒｅ結合分析を記載する。
Ａ）ｒｃｙｎｏＨｅｐｃへのｍＡｂ２．７及び２．４１の結合に対するＫｉｎＥｘＡ溶液平衡結合分析。Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ６ｘビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）は、製造業者の指示書に従って、ｒｃｙｎｏヘプシジン（配列番号６）で予め被覆し、ＢＳＡでブロックした。ｒｃｙｎｏヘプシジンによって被覆されたビーズを通じて走行させる前に、室温で８時間、抗体２．７及び２．４１の一定濃度をｒｃｙｎｏヘプシジンの様々な濃度とともに温置した。蛍光性（Ｃｙ５）標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）により、ビーズに結合された抗体の量を定量した。結合シグナルは、平衡状態において、遊離の抗体の濃度に比例する。二重曲線一部位均一結合モデル（ＫｉｎＥｘＡＴＭＰｒｏソフトウェア）を用いて、競合曲線の非線形回帰から解離平衡定数（ＫＤ）を得た。結果は、表４に示されている。
Figure 2014221763
Ｂ）ｒｃｙｎｏＨｅｐｃへのｍＡｂＲ９及びＡｂ４３の結合に対するＢＩＡｃｏｒｅ溶液平衡結合分析。抗体表面固定化：抗体Ｒ９及びＡｂ４３をＣＭ５チップ上に固定化した。製造業者の指示書に従って、走行緩衝液（ＤＰＢＳ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ１Ｘ，ＧＩＢＣＯ１４１９０、０．００５％ＢＩＡｃｏｒｅ界面活性剤Ｐ−２０あり）の流速１０μＬ／分で、固定化を行った。まず、ＥＤＣ（水中のＮ−エチル−Ｎ−（ジメチルアミン−プロピル）カルボジイミド７５ｍｇ／ｍＬ、ＢＩＡｃｏｒｅから入手）及びＮＨＳ（水中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド１１．５ｍｇ／ｍＬ、Ｂｉａｃｏｒｅから入手）の１：１混合物の１００μＬ注射によって、センサーチップのカルボキシル化されたマトリックスを活性化した。３０μＬ／分で、センサーチップ上に固定化するために、抗体１８０μＬ（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０中の約２０μｇ／ｍＬ）を注入した。エタノールアミン１００μＬ（１．０Ｍ、ＢＩＡｃｏｒｅから入手）の注入により、センサーチップの過剰な反応性基を不活化した。
ＢＩＡｃｏｒｅ分析：固定化された抗体表面を通して走行させる前に、室温で数時間、ｒｃｙｎｏＨｅｐｃの一定濃度をｍＡｂＲ９及びＡｂ４３の様々な濃度とともに温置した。得られた結合シグナルは、平衡状態の溶液中の遊離ｒｃｙｎｏＨｅｐｃに比例する。一曲線一部位均一結合モデル（ＫｉｎＥｘＴＭソフトウェア、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，ＢｏｉｓｅＩＤ）を用いて、競合曲線の非線形回帰分析から平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。Ｒ９及びＡｂ４３は何れも、ｒｃｙｎｏヘプシジンへの有意な結合親和性を示した。結果は、表５に示されている。
Figure 2014221763
酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）におけるヘプシジン特異的モノクローナル抗体結合活性の性質決定
４℃で一晩、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中において、１００から１０００ｎｇ／ｍＬのビオチン連結された組換えヒト又はビオチン連結されたマウスヘプシジンで、９６ウェルのＥ．Ｉ．Ａ．／Ｒ．Ｉ．Ａ．平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９）を被覆した。室温で１時間、２％ＢＳＡ及び０．２％ヤギ血清を含有するＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）でプレートをブロックした。プレートを洗浄した後、ハイブリドーマ馴化培地５０μＬを各ウェルに添加し、室温で２時間、振盪装置上で温置した。洗浄溶液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを３回洗浄し、室温で３０分間、西洋ワサビペルオキシダーゼが連結されたヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の５０μＬ／ウェルとともに温置した。プレートを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）の５０μＬ／ウェルを添加し、室温で５から１０分間温置した。０．５ＮＨ２ＳＯ４の５０μＬを添加して反応を停止させ、マイクロプレート読取装置中において、４５０ｎｍでプレートを読み取った。陽性対照抗体として、免疫されたラットの抗血清を使用し、バックグラウンド対照として、溶媒のみを使用した。
ラットモノクローナル抗体Ｒ９は、ヒト及びマウスヘプシジンの両方に対して特異的であることが同定された。サブクローニングのために、ウェル当り１つの細胞で、細胞分別装置（（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＦＡＣＳＤｉｖａ）を通して、ハイブリドーマ細胞株を分別した。
抗ヘプシジン抗体は、異なる構造的エピトープを認識する。
異なるヘプシジン変形物との前複合体形成の後に、抗体が成熟ヒトヘプシジン（配列番号９）へ結合する能力を評価することによって、抗ヒトヘプシジン抗体のエピトープ特異性を評価した。
製造業者の指示書に従って、走行緩衝液（ＤＰＢＳ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ１Ｘ，ＧＩＢＣＯ１４１９０、０．００５％ＢＩＡｃｏｒｅ界面活性剤Ｐ−２０あり）の流速１０μＬ／分で、ＣＭ５チップ上に、組換えヘプシジンを固定化した。まず、ＥＤＣ（水中のＮ−エチル−Ｎ−（ジメチルアミン−プロピル）カルボジイミド７５ｍｇ／ｍＬ、Ｂｉａｃｏｒｅから入手）及びＮＨＳ（水中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド１１．５ｍｇ／ｍＬ、Ｂｉａｃｏｒｅから入手）の１：１混合物の１００μＬ注射によって、センサーチップのカルボキシル化されたマトリックスを活性化した。３０μＬ／分で、センサーチップ上に固定化するために、ｒｈＨｅｐｃ１８０μＬ（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０中の約２０μｇ／ｍＬ）を注入した。エタノールアミン１００μＬ（１．０Ｍ、Ｂｉａｃｏｒｅから入手）の注入により、センサーチップの過剰な反応性基を不活化した。
前複合体に対して使用されたヘプシジンの形態は、陽性対照としての正しく折り畳まれたヘプシジン（Ｃ１−Ｃ８、Ｃ３−Ｃ６ヘプシジン変形物（実施例９参照））、ヘプシジン２０（Ｎ末端切断、実施例９参照）及び直鎖ヘプシジン（実施例９）であった。固定化されたヘプシジン表面を通して走行させる前に、室温で数時間、各抗原の１０ｎＭとともに、抗体（２．４１、２．７、４３及びＲ９）の１ｎＭ溶液を事前温置した。得られた結合シグナルは、平衡状態の溶液中の遊離抗体の濃度に比例した。結果は、表６に示されている。
Figure 2014221763
異なる抗ヘプシジン抗体が異なるエピトープに結合する能力を表す表６中のデータの解釈が、表７に記載されている。
Figure 2014221763
結合は、＋＋＋＋（ヘプシジン表面への０％抗体結合、従って、溶液中のヘプシジンによる１００％阻害）から−（ヘプシジン表面への１００％の抗体結合、従って、溶液中のヘプシジンによる阻害なし）にわたる。これらのデータは、抗原性のために、全ての抗体が折り畳まれたペプチドを必要とすることを示している。幾つかの抗体（例えば、Ａｂ４３、より少ない程度でＲ９）は、分子のＮ末端に５つのアミノ酸を必要とする。幾つかの抗体（例えば、Ｒ９）に関しては、Ｃ２−Ｃ４及びＣ５−Ｃ７ジスルフィド結合の除去は、ヘプシジン分子の抗体認識を大幅に低下させた。
鉄応答性β−ラクタマーゼアッセイ中でのインビトロヘプシジン活性は、抗ヘプシジン抗体によって中和することができる
ヘプシジンはフェロポーティンを内部に取り込ませ、細胞表面から取り除いて、鉄の放出を阻害し、細胞内鉄濃度を上昇させる。ヘプシジンによって媒介されたこの鉄の隔離に対する抗ヒトヘプシジン抗体の効果をインビトロで評価した。ドキシサイクリン誘導性フェロポーティン（Ｆｐｎ）発現構築物及び以下のヌクレオチド配列を有する、ｍＲＮＡの翻訳を制御するフェリチン由来の５’鉄応答要素（ＩＲＥ）の１コピーを含有するβ−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）発現構築物を含有する２９３細胞株を構築した（ｔｃｇｇｃｃｃｃｇｃｃｔｃｃｔｇｃｃａｃｃｇｃａｇａｔｔｇｇｃｃｇｃｔａｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇａｇｃｇｃｃｃｔｇｃｃｔｃｃｇａｇｇｇｃｃｇｇｃｇｃａｃｃａｔａａａａｇａａｇｃｃｇｃｃｃｔａｇｃｃａｃｇｔｃｃｃｃｔｃｇｃａｇｔｔｃｇｇｃｇｇｔｃｃｃｇｃｇｇｇｔｃｔｇｔｃｔｃｔｔｇｃｔｔｃａａｃａｇｔｇｔｔｔｇｇａｃｇｇａａｃａｇａｔｃｃｇｇｇｇａｃｔｃｔｃｔｔｃｃａｇｃｃｔｃｃｇａｃｃｇｃｃｃｔｃｃｇａｔｔｔｃｃｔｃｔｃｃｇｃｔｔｇｃａａｃｃｔｃｃｇｇｇａｃｃａｔｃｔｔｃｔｃｇｇｃｃａｔｃｔｃｃｔｇｃｔｔｃｔｇｇｇａｃｃｔｇｃｃａｇｃａｃｃｇｔｔｔｔｔｇｔｇｇｔｔａｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｇｃｃａａｃｃ）（配列番号１０３）。ＢｉｏＣｏａｔポリＤ−リジン被覆されたプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカタログ番号３５−６６４０）中に９０μＬ／ウェル（２５，０００細胞／ウェル）で、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５）、５％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１００９９−１４１）、ＰＳＱ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３７８−０１６）中に２．８×１０５細胞／ｍＬで、７０から８０％の集密状態の培養物から採取されたこれらの２９３／Ｆｐｎ／ＢＬＡ細胞を播種し、５％ＣＯ２とともに３７℃で温置した。同じ日の終わりに、１００μｇ／ｍＬドキシサイクリンを加えたアッセイ培地（ＤＭＥＭ５％ＦＢＳＰＳＱ）の溶液を作製し、その１０μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを一晩又は少なくとも２０時間温置した。翌日、ウェルから培地を除去し、ＤＭＥＭ５％ＦＢＳＰＳＱ、２．５μｇ／ｍＬクエン酸第二鉄、５０ｎｇ／ｍＬ合成ヒトヘプシジン及び抗体の系列希釈（以下の実施例８及び９に記載されているように作製された２．７、２．４１及びＡｂ４３）の予め作製された混合物と置き換えた（全て、アッセイプレートに添加する直前に、９６ウェルポリプロピレンディープウェルブロックプレート中で調製した。）。１００μＬ／ウェルで混合物を添加し、細胞培養温置装置中において、３７℃、５％ＣＯ２で一晩温置した。次いで、温置装置からプレートを取り出し、調製されたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＢｌａｚｅｒＣＣＦ４Ａ／Ｍ 展開試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｋｉｔ＃Ｋ１０８５）の２０μＬ／ウェルを添加し、暗所で９０分間温置する前に、室温で１０分間平衡化した。アッセイ培地１００μＬ（ＤＭＥＭ５％ＦＢＳＰＳＱ）を含有する、細胞なしの対照アッセイプレートの１６ウェルにも、展開試薬を添加し、同じ時間、温置した。次いで、４０９ｎｍで励起し、４４７ｎｍ（青）及び５２０ｎｍ（緑）での発光を読み取ることによって、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）上で、青及び緑色の蛍光シグナルを読み取った。結果は、図８から１０に図示されている。ｍＡＢ４３、２．７及び２．４１は、それぞれ、１．３８０×１０−８、１．７００×１０−８及び１．６３６×１０−８のＥＣ５０で、鉄の細胞内濃度を減少させた。
抗ヘプシジン抗体はヒトヘプシジンをマウス中で中和する
低鉄血症応答を生成するのに十分な量で、ヒトヘプシジンを投与されたマウス中で、抗ヒトヘプシジン抗体の活性をインビボにおいて評価した。０日目に、ヒトヘプシジンに対して誘導されたマウスモノクローナル（Ａｂ２．７）を雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。対照マウスには、イソタイプ対照としてマウスＩｇＧ１を与えた。３日目に、マウスに、イー・コリ由来の組換えヒトヘプシジン（ｒｈＨｅｐｃ）２５μｇの単回腹腔内注射を与えた。２時間後に、血清鉄レベルを分析した。生理的食塩水で処理された対照動物は正常な血清鉄レベルを有していたのに対して、ヘプシジン及びイソタイプ対照抗体で処理された動物は低鉄血症を示した。結果は、図１１に示されている。ｍＡｂ２．７の１ｍｇ及び０．５ｍｇは何れも、低鉄血症応答からの統計学的に有意な保護を与えた。Ａｂ２．７の０．２５ｍｇ用量で、低鉄血症の低下が観察されたが、より低い用量（０．２５及び０．１ｍｇ）が非中和用量と定義された。統計は、生理的食塩水対照に対して全ての群を比較するダネットの後知恵検定を用いたＡＮＯＶＡを表す。
ＡＡＶによって送達されたヘプシジンの抗体中和化は、正常な早期赤血球の特徴を回復する。
マウス中でのＡＡＶによって媒介されたヒトヘプシジン発現は、鉄の枯渇と合致する小球性、低色素性貧血をもたらす。ヒトヘプシジンを過剰発現しているこれらのマウス中で、抗ヒトヘプシジン抗体の活性をインビボにおいて評価した。ヒトヘプシジン又は陰性対照としてのβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）に対する発現カセットを含有するＡＡＶ（１．５×１０１２粒子／マウス、静脈内）を、雄のＣ５７Ｂ１／６マウスに注射した。図１２Ａに示されているように、様々な投薬頻度（週に１回、２回及び４回）で、Ａｂ２．７又はイソタイプ対照（ｍｕＩｇＧ１）の１ｍｇ／マウスで処理する前に、ｈｕＨｅｐｃの恒常的産生を可能とするために、マウスを２週間放置した。血清鉄レベル並びに早期赤血球（網状赤血球）の特徴（網状赤血球数、網状赤血球ヘモグロビン含量（ＣＨｒ）及び網状赤血球平均細胞容積（Ｒｅｔｉｃ．ＭＣＶ）の測定のために、第５日目に血液を採取した。
結果は、図１２Ｂから１２Ｅに示されている。Ａｂ２．７の投薬を４回受けたマウス中で、血清鉄レベルは正常に回復したが、イソタイプ対照では回復しなかった。Ａｂ２．７を与えた全てのマウスは、増加した網状赤血球産生を示す。Ａｂ２．７の４回及び２回投薬を与えたマウスでは、網状赤血球ヘモグロビン含量（ＣＨｒ）は正常であるが、１回の投薬を受けた群又はイソタイプ対照群では、低色素症がなお見られる。４回及び２回投薬したＡｂ２．７での処理は、網状赤血球の正常容積（ＲｅｔｉｃＭＣＶ）を回復させるが、１回及びイソタイプ対照群では、小赤血球症がなお存在する。正常な赤血球特性の回復を探すために、β−ｇａｌが注射された動物のイソタイプ対照処理との統計比較を決定した（ダネットの後知恵検定を用いたＡＮＯＶＡ）。
ウイルスヘプシジンの過剰発現は、エリスロポエチンへの低応答性をもたらす
以下の実施例は、エリスロポエチン低応答性マウス中で、ヘプシジン及びヘプシジン活性アンタゴニストの役割を調べた。
ＡＡＶによって媒介されるマウス中でのヒトヘプシジン発現の滴定は、図１３Ｂに示されているように、血清ヘプシジンレベル及び用量依存性の低鉄血症の増加をもたらす。エリスロポエチン耐性表現型を与え、及び以前の研究において（同時係属、共有の米国特許出願１１／８８０３１３号及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６４７７号（その開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているとおり）、癌患者の試料中に検出されたものと同様の範囲のヘプシジンのレベルを発現したＡＡＶ−ヒトヘプシジンの用量を選択した。ヒトヘプシジン又は発現対照としてのＧＦＰを発現しているＡＡＶを、雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した（ｎ＝４／群）。尾静脈を通じて、マウスに注射した（ヒトヘプシジン：１×１０１２から３×１０１２粒子／マウス；ＧＦＰ：３×１０１２粒子／マウス）。採集前の２週間、タンパク質発現を発達させた。２週の時点で、マウスから血清を集め、鉄及びヘプシジンレベルを測定した。結果は、図１３Ｂに報告されている。
エリスロポエチン耐性に対するヘプシジンの効果を評価するために、ヒトヘプシジン又は陰性対照としてのＧＦＰの何れかに対する発現カセットを含有するＡＡＶ（３×１０１２粒子／マウス、肝臓の門脈送達）を雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した。ヒトヘプシジンを恒常的に産生されるために、マウスを３週間放置し、次いで、ベースラインヘモグロビン（Ｈｂ）レベルを測定するために採血した。４週の時点で、ダルベポエチンα（１００μｇ／ｋｇ／マウス）又は陰性対照としての生理的食塩水でマウスを処理した。５週の時点で、ヘモグロビンレベルを再度測定した。結果は、図１３Ａに示されている。ヒトヘプシジンを過剰発現しているマウスは、ダルベポエチンαの高用量に対して耐性である。ダルベポエチンαに対する耐性は、エリスロポチンに対する低応答性を引き起こすのに、上昇したヘプシジンレベルが十分であることを示している。
ウイルスヘプシジン過剰発現モデルにおける、ヘプシジン活性アンタゴニストと赤血球新生刺激物質の組み合わせ療法
エリスロポエチン耐性表現型を有するマウスを抗ヘプシジン抗体で処理することによって、ダルベポエチンαでの処理に対する応答性が回復した。ヒトヘプシジン又は発現対照としてのＧＦＰをコードする遺伝子を含有するＡＡＶ（５×１０１２粒子／マウス、静脈内）を、雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した（ｎ＝５／群）。恒常的なタンパク質発現を２週間確立させた後、ベースラインヘモグロビン（Ｈｂ）レベルを測定するためにマウスを採血し、次いで、様々な投薬頻度で、Ａｂ２．７（１ｍｇ／マウス）又はイソタイプ対照で処理した。第一の投薬の翌日、マウスをダルベポエチンα（１００μｇ／ｋｇ、皮下）で処理した。投薬スケジュールの模式図が、図１５Ａ示されている。
ヘプシジンの中和は、ダルベポエチンαに対する応答性を回復させる。抗体を月曜、水曜、金曜に投薬することによって、Ｈｂレベルの増加によって測定されたところによると、ダルベポエチンα処理に対する部分的応答がもたらされた。ダルベポエチンα処理なしに同じ抗体を投薬したコホートは、Ｈｂレベルの上昇を示さなかった（図１５参照）。ダルベポエチンαに対する最大応答は、Ａｂ２．７の毎日（月曜から金曜まで）投薬を受けているマウス中において達成された（図１５Ｃ参照）。ダルベポエチンα処理と組み合わせた抗体の２回及び３回投薬は、Ｈｂレベルによって測定されたところによると、部分的な応答をもたらした（図１５Ｄ参照）。図１５Ｅに示されているように、抗体投薬及びダルベポエチンα処理に対する抗体投薬の近接性は、抗ヘプシジン抗体処理に対する全体的なＨｂ応答に影響を与えた（ダネットの後知恵検定を用いたＡＮＯＶＡによってｐ＜０．０１で対照から変動する結果は、二重アスタリスクで注記されている。）。従って、上昇したヘプシジンレベルによって引き起こされた貧血に対して、ヘプシジンの抗体媒介性中和は有効な処理であることが示された。
マウスヘプシジン１に対するｓｉＲＮＡの設計及び合成
マウスヘプシジン１ｓｉＲＮＡのインビボでのスクリーニング：ＣＨＯ−ｍヘプシジン安定細胞（ＨｅｌｅｎＫｉｍ）を、３０，０００細胞／ウェルで、９６ウェルプレート中に播種した。翌日、培地を除去し、形質移入複合体１００μＬを添加することによって、細胞を形質移入した。以下のようにして、形質移入複合体を作製した。チューブＡ中のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃３１９８５）１２５μＬに、１００μＭｓｉＲＮＡの１μＬを添加した。チューブＢには、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ形質移入試薬１５μＬ（Ｍｉｒｕｓ＃ＭＩＲ−２１５４）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ１２５μＬに添加した。室温で１２分間、両チューブを温置した。２つのチューブの内容を混合し、室温で１５分間温置し、次いで、細胞に添加した。形質移入から１８時間後に、培地を除去し、１×ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｌｙｓｉｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ ＃ＱＧ０５０２）の１００μＬを用いて、細胞を溶解した。分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ ＃ＱＧ０００３）を用いて、ｍヘプシジン及びｍシクロフィリンＡのｍＲＮＡレベルに関して、可溶化液を分析した。ＣＨＯ−ｍヘプシジン細胞中でのｓｉＲＮＡ配列及び％ｍＲＮＡノックダウンに関して、表８を参照されたい。
ｐＥＮＴＲ−Ｕ６−ｓｈＲＮＡ発現構築物へのｓｉＲＮＡ＃６及び＃１０の転化：二段階重複ＰＣＲによって、ｐＥＮＴＲ−Ｕ６−ｓｈＲＮＡ発現構築物を作製した。工程１は、５’−ＰＣＲ反応及び３’−ＰＣＲ反応を通じて、２つの重複する配列を生成する。５’−ＰＣＲ反応は、ａｔｔＢ１組換え部位、ｈＵ６プロモーター、ｓｉＲＮＡセンス配列、ループ及びｓｉＲＮＡアンチセンス配列を含有する配列を産生する。反応は、１０μＬの総容量で以下のとおりであった。１×ＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０５７２−０１４）、１μＭａｔｔＢ−１１１−Ｕ６フォワードプライマー（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＴＡＣＧＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＴＣ−３’、配列番号１０５）、０．１μＭＲＥＶ−Ｕ６−ｓｈＲＮＡプライマー（＃６：５’−ＣＴＴＴＴＣＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣ−３’（配列番号６３）及び＃１０：５’−ＴＡＣＡＴＣＴＣＡＴＧＡＡＴＧＴＡＧＴＣＴＧＴＣＴＣＡＴＣＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣ−３’（配列番号６７）に対して特有）及びｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒテンプレートプラスミド０．５ｎｇ（１μＬ）（ＩＭＧＥＮＥＸ＃ＩＭＧ−７００）。３’−ＰＣＲ反応は、ｓｈＲＮＡセンス、ループ及びアンチセンス配列、ＰｏｌＩＩＩターミネーター及びａｔｔＢ２組換え部位を含有する配列を産生する。反応は、１０μＬの総容量で以下のとおりであった。１×ＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０５７２−０１４）、１μＭＡｔｔＢ−２０２リバースプライマー（ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＡＡＡ、配列番号１０６）、０．１μＭＦＷ−Ｕ６−ｓｈＲＮＡプライマー（＃６：５’−ＣＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＧＣＴＴＴＴＴＡＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号６３）及び＃１０：５’−ＴＡＣＡＴＴＣＡＴＧＡＧＡＴＧＴＡＧＴＣＴＧＴＣＴＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＴＴＴＡＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号６７）に対して特有）。両反応に対するＰＣＲ条件は、以下のとおりであった。３分９５℃の１サイクル、９５℃４５秒、５２℃４５秒、７２℃４５秒の３０サイクル及び５分７２℃の１サイクル。ＰＣＲの工程２は、徐冷／充填反応のために、工程１から得られた５’及び３’ＰＣＲ産物を組み合わせて、完全長配列：ａａｔＢ１−ｈＵ６プロモーター−センス−ループ−アンチセンス−ターミネーター−ａｔｔＢ２を生成する。反応は、２０μＬの総容量で、以下のとおりであった。工程１：５’及び３’ＰＣＲ反応から得られたＰＣＲ産物を混合し、以下の条件を用いて、サーマルサイクラー中で実行した。９５℃２分、５２℃２分、７２℃２分（５サイクル）プラス７２℃１０分。
ｐＥＮＴＲ構築物を以下のように作製するために、ＧａｔｅｗａｙＢＰ組換えによって、ｐＤＯＮＲ２２１中にＰＣＲ産物を組み換えた。ｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１２５３６−０１７）７．５ｎｇ（１μＬ）、５×ＢＰ反応緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃５２８９１）１μＬ、ＢＰクロナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１７８９−０１３）１μＬ及び重複ＰＣＲ産物２．５μＬを一緒に混合し、室温で２時間温置した。次いで、プロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃５２８９５）１μＬを添加し、３７℃で１０分間温置した。６μＬの組み換え反応全体を、ＯｎｅＳｈｏｔＴｏｐ１０Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｃ４０４０−０３）中に形質転換し、ＬＢ−カナマイシンプレート上に播種した。コロニーを選択し、増幅した。Ｍ１３ＦＷ及びＭ１３ＲＥＶ配列決定プライマーを用いて、Ｕ６−ｓｈＲＮＡ領域のＤＮＡ配列決定によって、プラスミドＤＮＡを確認した。
Figure 2014221763
炎症性貧血のマウスモデルにおける、ヘプシジン発現阻害剤及び赤血球新生刺激物質を用いた組み合わせ療法
マウス炎症性貧血モデルにおいて、ヘプシジン発現阻害剤及び赤血球新生刺激物質を用いた組み合わせ療法を以下のように評価した。
マウスヘプシジンの抑制を引き起こすポリヌクレオチドヘプシジン発現阻害剤を以下のようにして調製した。インビトロでヘプシジンに対して特異的活性を有することが示されたｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ６ＣＵＡＣＡＧＡＧＣＵＧＣＡＧＣＣＵＵＵ（配列番号７０）；ｓｉＲＮＡ１０ＡＣＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＧＡＣＵＡＣＡ（配列番号７１））を、実施例２３に記載されているようなＡＡＶ発現系中でｓｈＲＮＡへ転化した。
陰性対照ｓｈＲＮＡ（抗ルシフェラーゼ、２×１０１２個の粒子／マウス）又は特異的抗ヘプシジンｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ６、５×１０１１個の粒子／マウス＝低用量；２×１０１２個の粒子／マウス＝中用量及びｓｈＲＮＡ１０、２×１０１２個の粒子／マウス＝高用量）を含有するＡＡＶウイルスを、マウスの門脈中に注射した。ブルセラ・アボルタス（ＢＡ；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）（５×１０８粒子／マウス、採集から７日前に与えた。）での処理によって、これらのマウス中に炎症を誘導した。非処理動物中での平均ヘプシジンレベルを測定するために、炎症誘導及びｓｈＲＮＡ処理を持たない対照マウスも評価した。
マウスヘプシジンレベルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いて測定した。マウス血清からヘプシジンを抽出するために、ＭＳＩＡ−ｔｉｐｓ（抗マウスヘプシジン抗体Ｒ９が固定化されたアフィニティーピペット）を使用した。飛行時間質量分析による検出のために、抽出されたヘプシジンをＭＡＬＤＩ標的上に溶出した。定量のために、ヒトヘプシジンを内部標準として使用した。
ｓｈＲＮＡ注射から２５日後に、血清ヘプシジン及び血清ヘモグロビンレベルを測定した。抗ヘプシジンｓｈＲＮＡで処理されたマウスは、ヘプシジンレベルの非炎症性レベルへの抑制を示した。図１４Ａを参照されたい。ヘプシジンｍＲＮＡレベルは、血清ヘプシジンのｍＲＮＡレベルと一致していた。
平行群中のマウスに、ウイルス（陰性対照又はヘプシジン特異的ｓｈＲＮＡの何れか）を上述のように注射し、炎症性貧血を誘導するために、１８日後に、ブルセラ・アボルタスで処理した。１９日目に、一週間後に（上記と同じ採集時点）測定される赤血球新生応答及びヘモグロビン（Ｈｂ）レベルを刺激するために、Ａｒａｎｅｓｐ１００μｇ／ｋｇを動物に注射した。図１４Ｂは、炎症性処理なしの対照動物が３から４ｇ／ｄＬのＨｂ上昇を伴って、Ａｒａｎｅｓｐに対して正常に応答したのに対して、ＢＡで処理された動物はＡｒａｎｅｓｐに対して鈍い応答を有していた。これに対して、ヘプシジン発現阻害剤を与えたＢＡ処理を有するマウスは、Ａｒａｎｅｓｐに対する応答を示した。従って、炎症前レベルまでヘプシジンを抑制するために、Ａｒａｎｅｓｐ処理と組み合わせて、ヘプシジン発現阻害剤で処理することによって、正常なヘモグロビンレベルがもたらされた。図１４Ｂを参照されたい。これらの結果は、ヘプシジン発現阻害剤での処理がＡｒａｎｅｓｐに対する応答性を回復することを示している。
炎症性貧血のマウスモデルにおける、抗ヘプシジン抗体及び赤血球新生刺激物質を用いた組み合わせ療法
マウス炎症性貧血モデルにおいて、ヘプシジン活性アンタゴニスト及び赤血球新生刺激物質を用いた組み合わせ療法も以下のように評価した。
マウスヘプシジン１がノックアウトされ、ヒトヘプシジンで置換されたマウスを作製した。第０日目に、雌のマウス（ヒトヘプシジン発現に対してホモ接合及び野生型同腹仔対照の両方）に、ブルセラ・アボルタス（２×１０８粒子／マウス、腹腔内）を注射し、次いで、第６日目に、ヘモグロビンレベルを評価するために採血した。次いで、第６から９日目に、抗体２．７又はイソタイプ対照抗体（１ｍｇ／マウス／日）でマウスを処理した。第７日目に、ダルベポエチンαを投与し（１００μｇ／ｋｇ／マウス）、第１３日目に、Ｈｂレベルを評価した。プロトコールの模式図が、図１６Ａ示されている。
マウスヘプシジン１遺伝子をなお有する野生型対照マウスは、Ａｂ２．７あり又はなしで、ダルベポチンαに対して応答しなかった（図１６Ｂ参照）。抗体２．７で処理されたヒトノックインマウスは、安定なヘモグロビンレベルの維持によって示されるように、ダルベポエチンα処理に対する回復された応答性を示した（図１６Ｃ参照）。
これらの結果は、ヘプシジン過剰の条件下で、ヘプシジンを中和し、炎症の貧血など、ヘプシジンによって媒介される貧血における赤血球新生剤に対する応答性を回復させるために、ヘプシジン活性アンタゴニストを使用できることを示している。
患者中のヘプシジンレベルの測定
ヒト患者中のヘプシジンのレベルは、同時係属、共有の米国特許出願１１／８８０，３１３号及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６４７７号（これらの開示全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に以前記載されたように測定された。この方法は、以下で再現される。
癌の貧血に罹患している患者から得た試料（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘから入手した。）又はボランティア（対照）から得た試料を集めた。ＯａｓｉｓＨＬＢｍＥｌｕｔｉｏｎ９６ウェルプレート（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用するＳＰＥによって、各試料、血清盲検及び２つ組みの７つの非ゼロ濃度からなる較正標準１００μＬ（１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００ｎｇ／ｍＬ）を抽出した。洗浄溶媒は、水酸化アンモニウムで調整された約１０のｐＨを有する３０％メタノール／水であった。溶出溶媒は、酢酸で調整された約５のｐＨを有する９０％メタノール／水溶液であった。ＳＰＥプレートをメタノール５００μＬで活性化し、水５００μＬで馴化し、次いで、血清試料１００μＬ及び内部標準２００μＬを溶出プレート上に搭載し、水３５０μＬ及び洗浄溶媒３５０μＬで洗浄した。溶出溶媒１００μＬを用いて溶出を行い、水１００μＬで希釈した。得られた溶出液２００μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
各抽出された試料２０μＬを、ＰｏｌａｒｉｓＣ１８Ａ、５μｍＨＰＬＣカラム（２．１×５０ｍｍ，Ｖａｒｉａｎ）上に注入した。ＬＣ流速は、３００μＬ／分に設定した。ＨＰＬＣ移動相Ａは５：９５メタノール／水であり、移動相Ｂは９５：５メタノール／水であった（何れも、０．１％ギ酸を含有する。）。勾配条件は、以下のようにして設定した。０から０．１分、均一濃度２％Ｂ／９８％Ａ；０．１から４．５分で２％Ｂから９５％Ｂ；４．５から４．９分で９５％Ｂ；４．９から５．０分で、９５％Ｂから２％Ｂ；５．０からら６．０分、均一濃度２％Ｂ。
ｍ／ｚ９３０．６０からｍ／ｚ１１０．１５へのイオン遷移を有するＭＲＭモードでのヘプシジン検出のために、ＴｕｒｂｏＥＩＳ源を備えたＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のＳｃｉｅｘＡＰＩ４０００三重四極子質力分析装置を使用した。ヘプシジン及び内部標準のＬＣピーク面積の比を、ヘプシジン及び内部標準の量が公知である標準物質の系列から得られた比と比較することによって、定量を行った。
この実験によって、健康な多数の個体を含有すると推測される対照集団中のヘプシジンの血清レベル及び癌の貧血（ＡｏＣ）に罹患している患者からのヘプシジンの血清レベルの測定が可能となった。結果は、図１８に示されている。
次いで、患者が炎症又は鉄欠乏性貧血を有するかどうかを決定するために、他の鉄指数濃度に関して、各患者の試料を分析した（図１９）。パラメータは、以下のようにして測定した。標準的な手法を使用して、ＯｌｙｍｐｕｓＡｕ４００臨床研究室分析装置上で、血清鉄、ＵＩＢＣ、フェリチン及びＣＲＰを測定した。ｓＴｆＲは、標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて測定した（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）。
市販のＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡは、成熟ヘプシジンを検出しない
以下の実施例は、市販のプロヘプシジンＥＬＩＳＡキット（ＤＲＧＩｎｔｌ．Ｉｎｃ．，ドイツ）は、試料中の成熟ヘプシジンを検出することができないことを示す。
組換えプロヘプシジンに対して比較したヘプシジンの各調製物の反応性を評価するために、（実施例３に記載されているように）合成的に作製されたヘプシジン、（実施例２に記載されているように）組換え的に作製されたヘプシジン、（実施例１に記載されているように）尿から単離されたヘプシジンを含む合成及び組換えヘプシジンの複数の調製物を作製した。ヘプシジン試料のそれぞれは、インビトロ及びインビボで生物学的活性を示した。市販のプロヘプシジンＥＬＩＳＡキット（ＤＲＧＩｎｔｌ．Ｉｎｃ．，ドイツ）は、組換えプロヘプシジン（図２０Ａ）を検出したが、成熟ヘプシジンの複数の調製物を検出しなかった（図２０Ｂ）。ｓｈＮｅｐｃ（合成的に作製され、折り畳まれたヒトヘプシジン）、ｒｈＨｅｐｃ（イー・コリ中で、プロペプチドとして組換え的に発現された後、折り畳まれ、切断された物質）、ｓｈＨｅｐｃ２０（Ｎ末端に５つのアミノ酸を欠くヘプシジンの変形物）、ｓｈＨｅｐｃＡＢＵ（ジスルフィド結合の形成を除去するために、システイン残基を５−アミノ酪酸（ＡＢＵ）に置換したヘプシジンの直鎖バージョン）、尿性ヘプシジン（敗血症患者の尿から精製された。）及びＣ１−Ｃ８、Ｃ３−Ｃ６（Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５及びＣ７のＡＢＵ置換のために、２つのジスルフィド接続を喪失した分子の形態）を含むヘプシジンのさらなる形態も、ＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡキットを用いて検査した。成熟ヘプシジンに対して観察された結果と同様に、ヘプシジンのこれらの形態は、ＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡによって検出されなかった。
上記データは、市販のＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡキットは成熟ヘプシジンを検出できないことを確認する。
ヘプシジンは、癌の貧血患者における炎症と関連するが、ＤＲＧプロヘプシジンとは関連しない
ヘプシジンを炎症状態と相関付けるために、ＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡキットを使用する試みを行った（例えば、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２４：３１１−１６，２００６；Ｋｅｍｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０６：１８６４−６６，２００５；Ｏｕｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｄｏｌｕ Ｋａｒｄｉｙｏｌｏｊｉ Ｄｅｒｇｉｓｉ，６：２３９−４２，２００６； Ｔａｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４２：３８７−８９，２００４；Ｔｈｅｕｒｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０７：４１４２−４８，２００６を参照されたい。）。この実施例は、しかしながら、ＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡキットを用いて測定されたプロヘプシジンレベルは、患者の成熟ヘプシジンレベルと相関しないのみならず、プロヘプシジンレベルは患者の炎症状態とも相関しないことを示している。
プロヘプシジン濃度を確実に評価するために、様々な異なる緩衝液又は血清中において、２５℃で６０分間温置した後、プロヘプシジン標準を測定した。捕捉のためにＡｂ２．７を用いるサンドイッチイムノアッセイ（Ａｂ２．７は、成熟ヘプシジン中のエピトープを検出する。）及び検出のためにビオチン化されたウサギ抗プロヘプシジンポリクローナル抗体（プロ領域中のエピトープを検出する。）によって、プロヘプシジン濃度を測定した。図２１に示されている結果は、血清中にプロヘプシジンを検出することができないことを示しており、プロヘプシジンが迅速に分解されることを示唆する。
ウェスタンブロッティング実験は、フューリン阻害剤が添加されなければ、プロヘプシンが血清中で分解されることを確認した（図２２）。プロヘプシジン（２ｍｇ）は、３７℃で１２時間温置し、又は培地単独若しくはフューリン阻害剤あり若しくはなしに、１０％ウシ胎児血清を含有する培地にゲルを走行させる直前に添加した。ＮｕＰａｇｅ４から１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用いて、非還元試料を分離し、ニトロセルロース膜上に吸収転移させ、ウサギ抗ヘプシジンポリクローナル抗血清後に、抗ウサギＨＲＰ連結二次抗体を用いて検出した。
血清中でのプロヘプシジンの不安定な性質に鑑みれば、ＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡキットを使用して患者試料中に検出されたプロヘプシジンの上昇したレベルは、プロヘプシジンの切断されたＮ末端の一部又は別のタンパク質を反映している可能性がある。血清プロヘプシジンレベルが血清ヘプシジンレベルと相関しているかどうかを決定するために、対照ドナー及び癌の貧血（ＡｏＣ）患者の血清中において、ヘプシジン及びプロヘプシジンレベルを測定した。ヘプシジン濃度は、同時係属、共有の米国特許出願１１／８８０，３１３号及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６４７７号（これらの開示全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されている質量分析法をベースとする定量法を用いて測定した。ＡｏＣ患者（ｒ＝０．１０１４；有意差なし）又は対照ドナー（ｒ＝−０．１１２８；有意差なし）中において、質量分析法をベースとする定量法によって測定されたヘプシジンレベルとＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡキットによって測定されたプロヘプシジンレベルの間には、有意な関係は見出されなかった（図１９）。従って、ＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡキットによって測定された上昇したプロヘプシジンレベルは、ヘプシジンレベルに対する代替として使用することはできない。
ＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡキットによって測定されたヘプシジン又はプロヘプシジンレベルが炎症を有する患者中で上昇したかどうかを測定するために、両指標を患者血清中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルと比較した。ＣＲＰは、炎症の十分に確立されたマーカーである。癌の貧血患者中のＣＲＰとヘプシジンレベルの間に強い関連性が観察された（図２４Ａ）が、患者中のＣＲＰとＤＲＧプロヘプシジンの間には、関連性が観察されなかった（図２４Ｂ）。正常なドナーは、ＣＲＰとヘプシジン又はＤＲＧプロヘプシジンの間に有意な関連性を示さなかったが、これらのドナーでは、ＣＲＰのレベルは顕著に上昇しておらず、関連性を検出することが困難であった。ヘプシジンは、癌の貧血患者中のＣＲＰと関連性を示すが、プロヘプシジンは示さず、従って、ヘプシジンは、炎症のマーカーとして使用することができる。
一般的に使用される研究室のパラメータの多くは急性期応答によって影響を受けるので、炎症の貧血（ＡＩ）を鉄欠乏性貧血（ＩＤＡ）及び混合型貧血（ＡＩ及びＩＤＡ両方の成分）と識別することは困難である。可溶性トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）及びフェリチン（Ｔｆ）値を使用する比が、より正確な診断を与えるための手段として文献中に記載されてきた。「Ｐｕｎｎｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ８９：１０５２−５７， １９９７」を参照されたい。炎症の貧血は、低いｓＴｆＲ／ｌｏｇＦｔ指数（１未満の値）によって特徴付けられるのに対して、高い比はＩＤＡの指標となる。従って、混合型貧血の絶対的ＩＤＡからの診断を補助するための炎症マーカーと組み合わせると、ｓＴｆＲ／ｌｏｇＦｔ比は、３つの症状の正確な予測因子としての役割を果たし得る。
この診断を補助する能力に関して、ＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡキットによって測定されたヘプシジン及びプロヘプシジンの両者を検査した。ｓＴｆＲ／ｌｏｇＦｔによって決定されたＡＩにおいて、ヘプシジンレベルは上昇する。ヘプシジンレベルは、ＡｏＣ患者中のｓＴｆＲ／ｌｏｇＦｔレベルと強く関係している（ｒ＝−０．６４０７；Ｐ＜０．０００１）。従って、ヘプシジンレベルは、ＡｏＣ患者中のｓＴｆＲ／ｌｏｇＦｔレベルと強く関係しており、明確な関係性を示し、患者の診断を補助する（図２５Ａ）。このような関係性は、ＤＲＧプロヘプシジンには見られなかった（図２５Ｂ）。
炎症のマーカーとしてのＣＲＰとｓＴｆＲ／ｌｏｇＦｔを組み合わせる決定木を用いて、ＡＩを有する患者、混合型貧血を有する患者、ＩＤＡを有する患者及び未知の起源の貧血を有する患者（「その他」と表記）へ癌の貧血患者をさらに分けることができた（図１７Ａ）。上昇したヘプシジンレベルを有する患者は全て、ＡＩ又は混合型貧血の何れかを有することが観察された（図２６）。低いヘプシジンレベル又は無ヘプシジンレベルを有する患者は、ＩＤＡ又は未知の起源の貧血を有することが観察された。同時係属、共有の米国特許出願１１／８８０，３１３号及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６４７７号（これらの開示全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されており、以下で詳しく論述されている質量分析法をベースとする定量法によって測定されたヘプシジンレベルは、炎症性貧血を診断するために使用することができる。
ヘプシジンに対するサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、免疫原に対する異なる抗体の複雑な複合体に相当するので、タンパク質中に存在する全ての可能性のあるエピトープを検出する１つの方法である。ヘプシジンに対するモノクローナル抗体サンドイッチＥＬＩＳＡが可能であるかどうかを決定するために、ＫＬＨ連結された成熟ヒトヘプシジンに対して産生されたポリクローナル抗体を用いて、予備的実験を行った。
ポリクローナルウサギ抗血清から得たＩｇＧをマイクロタイタープレート上に被覆し、成熟ヘプシジンを希釈し、プレートに添加し、結合されたヘプシジンを検出するために、同じ源から得たビオチン化されたＩｇＧを使用した。全ての抗体は、１０μｇ／ｍＬの濃度で使用した。図２７から明らかなように、この実験は、結合されたヘプシジンを検出することが可能であり、サンドイッチフォーマットでヘプシジンを測定することが可能であり得ることを示唆した。しかしながら、このアッセイの感度は低く、２つの抗体がヘプシジンへ同時に結合できるのは、稀な現象であり得ることを示唆した。
ヘプシジンに対するサンドイッチイムノアッセイにおけるモノクローナル抗体
以下の実施例は、試料中のヘプシジンレベルを測定するためのサンドイッチイムノアッセイを記載する。
Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて、ヘプシジン及び別の抗体の同時結合に関して、抗体１Ｓ１で被覆された表面を検査した（図２８）。センサーチップ表面への抗Ｈｅｐｃ抗体１Ｓ１の固定化は、０．００５％Ｐ−２０／ＰＢＳ緩衝液の連続流を用いて、製造業者の指示書に従って行った。簡潔に述べれば、０．２ＭＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．０５ＭＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含有する混合物６０μＬを注入することによって、センサーチップ表面上のカルボキシル基を活性化した。この後に、２０μｇ／ｍＬの間の濃度で、１０ｍＭアセタート、ｐＨ４．０中に希釈された１Ｓ１を注入した。１Ｍエタノールアミン６０μＬを注入することによって、表面上の過剰な反応性の基を不活化した。最終的な固定化レベルは、Ａｂ１Ｓ１表面に対して、５，０００から６，０００共鳴単位（ＲＵ）であった。盲検偽結合参照表面も、センサーチップ上に調製した。１Ｓ１抗体表面上に、２０ｎＭイー・コリ由来ヒトヘプシジンを注入し、１Ｓ１抗体表面上に結合させた。次いで、ヘプシジン／１Ｓ１表面上に、５０ｎＭ抗体２．７、２３Ｆ１１、２６Ｆ１１及び１Ｓ１を注入した。抗体注入後、１０ｍＭＨＣｌｐＨ２．０の３０μＬを注入することによって、表面を再生した。
複合体の形態において、結合の高い選択性が存在した。上記競合アッセイにおいて使用されたマウス抗体２．７は、１Ｓ１とサンドイッチ対を形成することができず、２６Ｆ１１は、２３Ｆ１１と比べて、１Ｓ１と同時にヘプシジンへ結合する顕著に低い能力を示した。
成熟ヘプシジンに対して産生されたモノクローナル抗体は、サンドイッチＥＬＩＳＡを構築するために使用することができる
実施例３０で得られたＢｉａｃｏｒｅの結果に従い、ヘプシジンとの反応性を有することが以前に示された１１００の抗体を、１Ｓ１と「対形成する」能力に関してスクリーニングした。適切である僅か１１の抗体（すなわち約１％）が同定された。従って、ヘプシジンに対するサンドイッチアッセイを開発する上で使用可能な「対」を形成できることは稀なようである。１Ｓ１及び２３Ｆ１１をサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットへ組み立てると、ヘプシジンレベルを検出するためのイムノアッセイの感度は５０倍向上した。図２９に示されているように、このアッセイは、５０倍の前希釈工程後に、正常な血清中のヘプシジンのレベルを測定できることが明らかとなった。軸は、希釈前ヘプシジンレベルを表している。
競合的結合アッセイ
以下の実施例は、ヘプシジンレベルを測定するための競合的結合アッセイを記載している。１つのプロトコールにおいて、血清中に存在する非標識ヘプシジンは、抗ヘプシジン抗体（例えば、抗体２．７）への結合に関して、ビオチン化されたヘプシジンと競合する。
緩衝液（５％ＢＳＡ：Ｉ−ブロック）、ウサギ血清又はプールされたヒト血清中に加えられた様々な濃度（１．４から３００ｎｇ／ｍＬ）のヘプシジン標準を用いて、ヘプシジンレベルを測定した。Ａｂ２．７の４０ｎｇ／ｍＬの等しい容量へ、ヘプシジンを添加し、１２０分間温置した。１から２μｇ／ｍＬＧｘＭ捕捉抗体で被覆されたＢｌａｃｋハーフエリアプレートに、混合された溶液の２５μＬ／ウェルを添加した。ビオチン化されたヘプシジンの２５μＬ／ウェルを０．２５ｎＭで添加した。プレートフィルム密封器を用いてプレートを覆い、約６０分間、約２００ＲＰＭ以下で、プレート振盪装置上にて、室温（２５℃）で温置した。プレートを洗浄し、次いで、１：２０００で、ポリ西洋ワサビペルオキシダーゼ増幅試薬の５０μＬ／ウェルを添加した。プレートを３０分間静置させ、次いで、ＰＢＳ又はＫＰＬ緩衝液を用いて、プレート洗浄装置で６回洗浄した。プレートを叩いて乾燥させ、発光性基質（Ｆｅｍｔｏ又はＰｉｃｏ）を素早く添加した。Ｆｅｍｔｏ又はＰｉｃｏ基質を用いて、光測定装置（励起：Ｌｍａｘ３４０）で、プレートを１秒間読み取った。結果は、ウサギ血清及び緩衝液の両者中で、１から１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲でヘプシジンを測定可能であることを示した（図３０）。
プールされたヒト血清は、２０ｎｇ／ｍＬより高い既存のヘプシジンレベルを有するように見受けられた。無作為に選択された様々な血清に関して、１から３０ｎｇ／ｍＬの範囲にわたり、ヘプシジンのレベルはヒト血清中において大幅に変動することが測定された（図３１）。
上で測定されたウサギ血清中でヘプシジン標準を使用して、正常なヒト対象から得られた２４の無作為な血清を検査した。ヘプシジンレベルは、検出不能から５０ｎｇ／ｍＬ超まで変動した。図３２を参照されたい。これらの値は、同時係属、共有の米国特許出願１１／８８０，３１３号及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６４７７号（これらの開示全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されている質量分析法をベースとする定量法（一般に、ずっと低い値を与えた。）を通じて測定されたヘプシジンのレベルから得られた結果と相違していた。
生物試料中のヘプシジン濃度を取得する様々な方法の比較結果
質量分析法（実施例２５）、競合的ＥＬＩＳＡ（実施例３２）及びサンドイッチＥＬＩＳＡ（実施例３０から３１）を含む様々な技術によって得られたヘプシジンのレベルを比較した。結果は、図３３に示されている。
開示を完全にするために、本明細書中に引用されている全ての特許文献及び論文の全体が、参照により、本明細書中に明示的に組み込まれる。
前記記述及び実施例は、本発明を例示するために記載されたものに過ぎず、限定を意図するものではない。当業者は本発明の精神及び本質を取り込む上記実施形態の修飾に想到することができるので、本発明は、添付の特許請求の範囲に属する全ての変更及びその均等物を含むように広く解釈されなければならない。

Claims (268)

  1. ヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、前記ヒトヘプシジンが配列番号９に記載されているアミノ酸配列からなり、並びに配列番号９中に位置している残基７と２３、１０と１３、１１と１９及び１４から２２の間で形成された４つのジスルフィド結合ループを含む立体構造を有する、単離されたモノクローナル抗体。
  2. 前記抗体が、ＢＩＡｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡによって測定された場合に、約１×１０−７Ｍ又はそれ以下のＫＤで前記ヒトヘプシジンへ結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  3. 前記抗体が、ＢＩＡｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡによって測定された場合に、約１×１０−８Ｍ又はそれ以下のＫＤで前記ヒトヘプシジンへ結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  4. 前記抗体が、ＢＩＡｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡによって測定された場合に、約１×１０−９Ｍ又はそれ以下のＫＤで前記ヒトヘプシジンへ結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  5. 前記抗体がさらにヒトヘプシジンの活性を拮抗する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  6. 前記抗体が、フェリチンアッセイによって測定された場合に、約１×１０−８Ｍ又はそれ以下のＥＣ５０でフェリチン発現のレベルを減少させる、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  7. 前記抗体が約１×１０−８Ｍ又はそれ以下のＥＣ５０で対象中の細胞内鉄レベルを減少させる、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  8. 前記抗体が対象中の循環鉄レベル又はＴｓａｔを増加させる、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  9. 前記抗体がヘモグロビン若しくはヘマトクリットの少なくとも１つ又は両方の、対象中におけるレベルを増加させる、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  10. 前記抗体が少なくとも赤血球数、赤血球ヘモグロビン含量若しくは赤血球数の赤血球平均細胞容積の少なくとも１つ又はこれらの何れかの組み合わせを対象中において増加させる、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  11. 前記抗体が網状赤血球数、網状赤血球ヘモグロビン含量又は網状赤血球数の網状赤血球平均細胞容積の少なくとも１つ又はこれらの何れかの組み合わせを対象中において増加させる、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  12. 前記抗体が対象の血清中の遊離ヘプシジンのレベルを低下させる、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  13. 前記レベルが前記対象中において少なくとも約２０％低下される、請求項１２に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  14. 前記対象が哺乳動物である、請求項７から１３の何れか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  15. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１４に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  16. 抗体が、配列番号９の位置１から５の中に位置する少なくとも１つのアミノ酸を含む前記ヒトヘプシジンのエピトープへ結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  17. 抗体が、配列番号９の位置１０から１３の中に位置する少なくとも１つのアミノ酸を含む前記ヒトヘプシジンのエピトープへ結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  18. 抗体が、配列番号９の位置１４から２２の中に位置する少なくとも１つのアミノ酸を含む前記ヒトヘプシジンのエピトープへ結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  19. 抗体が、配列番号９の位置６から２５の中に位置する少なくとも１つのアミノ酸を含む前記ヒトヘプシジンのエピトープへ結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  20. 抗体が、配列番号９の位置１０及び１３に位置するアミノ酸の間のジスルフィド結合によって形成されたループに結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  21. 抗体が、配列番号９の位置１４及び２２に位置するアミノ酸の間のジスルフィド結合によって形成されたループに結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  22. 抗体が少なくとも２つのループによって形成された前記ヒトヘプシジンのエピトープへ結合し、前記ループの第一が配列番号９の位置１０と１３に位置するアミノ酸の間のジスルフィド結合によって形成され、及び前記ループの第二が配列番号９の位置１４と２２に位置するアミノ酸の間のジスルフィド結合によって形成される、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  23. 配列番号９のヒトヘプシジンへ結合し、及びヘプシジンの鉄制御活性を阻害する単離されたモノクローナル抗体。
  24. 配列番号９のヒトヘプシジンへ結合し、及び循環鉄濃度又はＴｓａｔを増加させる、単離されたモノクローナル抗体。
  25. ヘプシジン（配列番号９）への結合に関して、Ａｂ４３、１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｄ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１からなる群から選択される抗体と少なくとも約７５％競合する、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  26. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１５又は配列番号１３と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１６から２１からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１６から２１の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  27. 抗体が配列番号１６から２１からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  28. 抗体が配列番号１６から２１からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  29. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号２７又は配列番号２５と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号２８から３３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号２８から３３の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  30. 配列番号２８から３３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  31. 配列番号２８から３３からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  32. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号３９又は配列番号３７と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号４０から４５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号４０から４５の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  33. 配列番号４０から４５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  34. 配列番号４０から４５からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  35. 配列番号７４（ＸＡＳＮＬＥＳ）（Ｘは、任意のアミノ酸である。）のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  36. 配列番号７５（ＸＱＳＮＥＥ）（Ｘは、任意のアミノ酸である。）のアミノ酸配列を含む、請求項１又は３５の単離されたモノクローナル抗体。
  37. 配列番号７６（ＱＱＸＮＥＸ）（Ｘは、任意のアミノ酸である。）のアミノ酸配列を含む、請求項１又は３６の単離されたモノクローナル抗体。
  38. 配列番号１６（ＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨ）のアミノ酸配列を含む、請求項１又は３５から３７の単離されたモノクローナル抗体。
  39. 配列番号７７（ＷＩＮＴＸＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＸＧ）（Ｘは、任意のアミノ酸である。）のアミノ酸配列を含む、請求項１又は３８の単離されたモノクローナル抗体。
  40. 配列番号７８（ＸＸＹＹＧＸ＊Ａ＊Ｙ）（Ｘは任意のアミノ酸であり、及び＊は不存在であり、又は任意のアミノ酸であり得る。）のアミノ酸配列を含む、請求項１又は３９の単離されたモノクローナル抗体。
  41. 配列番号４３（ＴＹＧＭＳ）のアミノ酸配列を含む、請求項１又は４０の単離されたモノクローナル抗体。
  42. 配列番号２８３（ＶＩＸＹＸＸＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ）（Ｘは、任意のアミノ酸である。）のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  43. 配列番号２８４（ＷＩＸＡＸＮＧＸＸＸＸＡＸＸＸＱＸ）（Ｘは、任意のアミノ酸である。）のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  44. 配列番号２８５（ＡＱＥＧＸＡＰＤＡＦＤＩ）（Ｘは、任意のアミノ酸である。）のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  45. 配列番号２８６（ＱＡＷＹＳＳＴＮＶＸ）（Ｘは、任意のアミノ酸である。）のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  46. 配列番号２８７（ＱＡＷＤＳＳＴＡＸＸ）（Ｘは、任意のアミノ酸である。）のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  47. 配列番号２８８（ＱＳＤＹＳＳＸＸＸ＊＊）（Ｘは任意のアミノ酸であり、及び＊は不存在であり、又は任意のアミノ酸であり得る。）のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  48. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号５１又は配列番号４９と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号５２から５７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号５２から５７の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  49. 配列番号５２から５７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  50. 配列番号５２から５７からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  51. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１１０又は配列番号１０８と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１１１から１１６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１１１から１１６の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  52. 配列番号１１１から１１６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  53. 配列番号１１１から１１６からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  54. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１２０又は配列番号１１８と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１２１から１２６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１２１から１２６の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  55. 配列番号１２１から１２６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  56. 配列番号１２１から１２６からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  57. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１３０又は配列番号１２８と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１３１から１４６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１３１から１３６の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  58. 配列番号１３１から１３６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  59. 配列番号１３１から１３６からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  60. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１４０又は配列番号１３８と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１４１から１４６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１４１から１４６の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  61. 配列番号１４１から１４６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  62. 配列番号１４１から１４６からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  63. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１５０又は配列番号１４８と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１５１から１５６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１５１から１５６の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  64. 配列番号１５１から１５６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  65. 配列番号１５１から１５６からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  66. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１６０又は配列番号１５８と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１６１から１６６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１６１から１６６の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  67. 配列番号１６１から１６６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  68. 配列番号１６１から１６６からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  69. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１７０又は配列番号１６８と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１７１から１７６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１７１から１７６の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  70. 配列番号１７１から１７６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  71. 配列番号１７１から１７６からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  72. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号３１３（Ａｂ１８Ｄ８重可変）又は配列番号３１１（１８Ｄ８軽可変）と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号３１４から３１９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３１４から３１９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  73. 配列番号３１４から３１９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  74. 配列番号３１４から３１９からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  75. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号３２３又は配列番号３２１と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号３２４から３２９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３２４から３２９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  76. 配列番号３２４から３２９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  77. 配列番号３２４から３２９からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  78. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号２９３又は配列番号２９１と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号２９４から２９９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号２９４から２９９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  79. 配列番号２９４から２９９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  80. 配列番号２９４から２９９からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  81. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号３０３又は配列番号３０１と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号３０４から３０９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３０４から３０９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  82. 配列番号３０４から３０９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  83. 配列番号３０４から３０９からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  84. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１８０又は配列番号１７８と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１８１から１８６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１８１から１８６の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  85. 配列番号１８１から１８６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  86. 配列番号１８１から１８６からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  87. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１９０又は配列番号１８８と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１９１から１９６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１９１から１９６の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  88. 配列番号１９１から１９６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  89. 配列番号１９１から１９６からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  90. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号２０２又は配列番号１２８と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１３１から１３３及び２０３から２０５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１３１から１３３及び２０３から２０５の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  91. 配列番号１３１から１３３及び２０３から２０５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  92. 配列番号１３１から１３３及び２０３から２０５からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  93. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１４０又は配列番号２１３と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１４４から１４６及び２１４から２１６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１４４から１４６及び２１４から２１６の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  94. 配列番号１４４から１４６及び２１４から２１６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  95. 配列番号１４４から１４６及び２１４から２１６からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  96. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１６０又は配列番号２２４と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１６４から１６６及び２２５から２２７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列並びに配列番号１６４から１６６及び２２５から２２７の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  97. 配列番号１６４から１６６及び２２５から２２７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  98. 配列番号１６４から１６６及び２２５から２２７からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  99. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１７０又は配列番号２３５と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１７４から１７６及び２３６から２３８からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列並びに配列番号１７４から１７６及び２３６から２３８の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  100. 配列番号１７４から１７６及び２３６から２３８からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  101. 配列番号１７４から１７６及び２３６から２３８からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  102. 配列番号９のヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１９０又は配列番号２４６と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが配列番号１９４から１９６及び２４７から２４９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列並びに配列番号１９４から１９６及び２４７から２４９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸の変化を含む何れかの配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  103. 配列番号１９４から１４６及び２４７から２４９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  104. 配列番号１９４から１９６及び２４７から２４９からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  105. 抗体が配列番号１６、２８、４０、５２、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２１４、２２５、２３６、２４７、２９４、３０４、３１４及び３２４からなる群から選択されるアミノ酸配列、配列番号１７、２９、４１、５３、１１２、１２２、１３２、１４２、１５２、１６２、１７２、１８２、１９２、２１５、２２６、２３７、２４８、２９５、３０５、３１５及び３２５からなる群から選択されるアミノ酸配列並びに配列番号１８、３０、４２、５４、１１３、１２３、１３３、１４３、１５３、１６３、１７３、１８３、１９３、２１６、２２７、２３８、２４９、２９６、３０６、３１６及び３２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  106. 抗体が配列番号１９、３１、４３、５５、１１４、１２４、１３４、１４４、１５４、１６４、１７４、１８４、１９４、２０３、２９７、３０７、３１７及び３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列、配列番号２０、３２、４４、５６、１１５、１２５、１３５、１４５、１５５、１６５、１７５、１８５、１９５、２０４、２９８、３０８、３１８及び３２８からなる群から選択されるアミノ酸配列並びに配列番号２１、３３、４５、５７、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０５、２９９、３０９、３１９及び３２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  107. 抗体が配列番号１５、配列番号１３、配列番号２７、配列番号２５、配列番号３９、配列番号３７、配列番号５１、配列番号４９、配列番号１１０、配列番号１０８、配列番号１２０、配列番号１１８、配列番号１３０、配列番号１２８、配列番号１４０、配列番号１３８、配列番号１５０、配列番号１４８、配列番号１６０、配列番号１５８、配列番号１７０、配列番号１６８、配列番号１８０、配列番号１７８、配列番号１９０、配列番号１８８、配列番号２０２、配列番号２１２、配列番号２１８、配列番号２２４、配列番号２３５、配列番号２４６、配列番号２９３、配列番号２９１、配列番号３０３、配列番号３０１、配列番号３１３、配列番号３１１、配列番号３２３及び配列番号３２１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  108. 重鎖及び軽鎖を含む単離されたモノクローナル抗体であって、重鎖が配列番号２０７のアミノ酸２０から４６７を含み、及び軽鎖が配列番号２２０のアミノ酸２１から２３４を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  109. 重鎖及び軽鎖を含む単離されたモノクローナル抗体であって、重鎖が配列番号２３３のアミノ酸２０から４６６を含み、及び軽鎖が配列番号２１８のアミノ酸２３から２３４を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  110. 重鎖及び軽鎖を含む単離されたモノクローナル抗体であって、重鎖が配列番号２５５のアミノ酸２０から４６６を含み、及び軽鎖が配列番号２２９のアミノ酸２３から２３４を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  111. 重鎖及び軽鎖を含む単離されたモノクローナル抗体であって、重鎖が配列番号２５９のアミノ酸２０から４６６を含み、及び軽鎖が配列番号２４０のアミノ酸２３から２３４を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  112. 重鎖及び軽鎖を含む単離されたモノクローナル抗体であって、重鎖が配列番号２６７のアミノ酸２０から４６６を含み、及び軽鎖が配列番号２５１のアミノ酸２３から２３４を含む、単離されたモノクローナル抗体。
  113. 前記抗体がキメラ、ヒト化又は完全なヒト抗体である、請求項１から１１２の何れか一項の単離されたモノクローナル抗体。
  114. 前記抗体がキメラ化されており、キメラ化がマウスとヒトの間であり、又はラクダとヒトの間である、請求項１１３の単離されたモノクローナル抗体。
  115. モノクローナル抗体がヒト化抗体である、請求項１から１１２の何れか一項の単離されたモノクローナル抗体。
  116. モノクローナル抗体が一本鎖Ｆｖ抗体断片である、請求項１から１１２の何れか一項の単離されたモノクローナル抗体。
  117. モノクローナル抗体がＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディ、マキシボディ又はナノボディである、請求項１から１１２の何れか一項の単離されたモノクローナル抗体。
  118. 抗体がヒト抗体である、請求項１から１１２の何れか一項の単離されたモノクローナル抗体。
  119. ヒトコンセンサス抗体配列、ヒト生殖系列抗体配列又はヒト生殖系列コンセンサス抗体配列であるフレームワークアミノ酸配列を含む、請求項１から１１２の何れか一項の単離されたモノクローナル抗体。
  120. 抗体がＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭイソタイプの抗体である、請求項１から１１２の何れか一項の単離されたモノクローナル抗体。
  121. 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４イソタイプの抗体である、請求項１から１１２の何れか一項の単離されたモノクローナル抗体。
  122. ヒトヘプシジン（配列番号９）及びカニクイザルヘプシジン（配列番号６）の両方を結合する、請求項１から１１２の何れか一項の単離されたモノクローナル抗体。
  123. ヒトヘプシジン（配列番号９）及びマウスヘプシジン（配列番号８０）の両方を結合する、請求項１から１１２の何れか一項の単離されたモノクローナル抗体。
  124. 配列番号９と少なくとも７０％同一であり、及び８つのシステイン残基を有する２５アミノ酸からなるポリペプチドへも結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  125. 前記ポリペプチドが配列番号２の位置５９から８３に位置するアミノ酸からなる、請求項１２４に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  126. 前記ポリペプチドが配列番号６に記載されているアミノ酸配列からなる、請求項１２５に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  127. 検出可能な標識を含む、請求項１から１２６の何れか一項の単離されたモノクローナル抗体。
  128. 請求項１から１２７の何れか一項の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
  129. 制御調節配列へ作用可能に連結された、請求項１２８の核酸分子を含む発現ベクター。
  130. 請求項１２９のベクター又は請求項１２８の核酸分子を含む宿主細胞。
  131. 抗体を生産するために請求項１３０の宿主細胞を使用する方法であって、抗体を生産するために核酸が発現されるような適切な条件下で、請求項１３０の宿主細胞を培養することを含む、方法。
  132. 宿主細胞培養物から抗体を回収することをさらに含む、請求項１３１の方法。
  133. 請求項１から１２６の何れか一項の抗体及び医薬として許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、組成物。
  134. 生物試料中のヒトヘプシジンの存在を検出する方法であって、配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへのモノクローナル抗体の結合を可能とする条件下で、請求項１から１２７の何れか一項に記載されているモノクローナル抗体の少なくとも１つとともに生物試料を温置すること、及び結合されたモノクローナル抗体又は結合されたヘプシジンを検出することを含む、方法。
  135. モノクローナル抗体が抗体１Ｓ１と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１Ｓ１と約７５％競合する、請求項１３４の方法。
  136. 配列番号９の成熟ヘプシジンを結合する第二のモノクローナル抗体とともに試料を温置することをさらに含む、請求項１３５の方法。
  137. 第二のモノクローナル抗体が抗体２３Ｆ１１と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体２３Ｆ１１と約７５％競合する、請求項１３６の方法。
  138. 第二のモノクローナル抗体が抗体１５Ｅ１と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１５Ｅ１と約７５％競合する、請求項１３６の方法。
  139. 第二のモノクローナル抗体が抗体１２Ｂ９と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１２Ｂ９と約７５％競合する、請求項１３６の方法。
  140. モノクローナル抗体が抗体１２Ｂ９と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１２Ｂ９と約７５％競合する、請求項１３４の方法。
  141. 配列番号９の成熟ヘプシジンを結合する第二のモノクローナル抗体とともに試料を温置することをさらに含む、請求項１４０の方法。
  142. 第二のモノクローナル抗体が抗体１８Ｄ８と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１８Ｄ８と約７５％競合する、請求項１４１の方法。
  143. 第二のモノクローナル抗体が抗体１９Ｃ１と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１９Ｃ１と約７５％競合する、請求項１４１の方法。
  144. 第二のモノクローナル抗体が抗体１９Ｄ１２と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１９Ｄ１２と約７５％競合する、請求項１４１の方法。
  145. 第二のモノクローナル抗体が抗体１９Ｈ６と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１９Ｈ６と約７５％競合する、請求項１４１の方法。
  146. 第二のモノクローナル抗体が抗体１Ｓ１と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１Ｓ１と約７５％競合する、請求項１４１の方法。
  147. モノクローナル抗体が抗体２３Ｆ１１と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体２３Ｆ１１と約７５％競合する、請求項１３４の方法。
  148. 配列番号９の成熟ヘプシジンを結合する第二のモノクローナル抗体とともに試料を温置することをさらに含む、請求項１４７の方法。
  149. 第二のモノクローナル抗体が抗体１８Ｄ８と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１８Ｄ８と約７５％競合する、請求項１４８の方法。
  150. 第二のモノクローナル抗体が抗体１９Ｃ１と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１９Ｃ１と約７５％競合する、請求項１４８の方法。
  151. 第二のモノクローナル抗体が抗体１９Ｄ１２と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１９Ｄ１２と約７５％競合する、請求項１４８の方法。
  152. 第二のモノクローナル抗体が抗体１９Ｈ６と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１９Ｈ６と約７５％競合する、請求項１４８の方法。
  153. 第二のモノクローナル抗体が抗体１５Ｅ１と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１Ｓ１と約７５％競合する、請求項１４８の方法。
  154. 第二のモノクローナル抗体が抗体３Ｂ３と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体３Ｂ３と約７５％競合する、請求項１４８の方法。
  155. モノクローナル抗体が抗体１５Ｅ１と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１５Ｅ１と約７５％競合する、請求項１３４の方法。
  156. 配列番号９の成熟ヘプシジンを結合する第二のモノクローナル抗体とともに試料を温置することをさらに含む、請求項１５５の方法。
  157. 第二のモノクローナル抗体が抗体１Ｓ１と同じエピトープに結合し、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体１Ｓ１と約７５％競合する、請求項１５６の方法。
  158. 配列番号９の成熟ヘプシジンを結合するポリクローナル抗体とともに試料を温置することをさらに含む、請求項１３４の方法。
  159. モノクローナル抗体が固体支持体上に固定化されている、請求項１５８に記載の方法。
  160. ポリクローナル抗体が標識されている、請求項１５９の方法。
  161. ポリクローナル抗体が固体支持体上に固定化されている、請求項１５８の方法。
  162. モノクローナル抗体が標識されている、請求項１６１の方法。
  163. 抗体が固体支持体上に固定化されており、及び結合されたヘプシジンを検出するために、請求項１から１２７に記載の何れか一項に記載の第二の抗体とヘプシジンを接触させることをさらに含む、請求項１３４の方法。
  164. 前記生物試料がヒトから単離される、請求項１３４に記載の方法。
  165. 前記生物試料が、血漿、血清、尿及びこれらから得られる何れかの画分からなる群から選択される、請求項１３４に記載の方法。
  166. 第二の抗体が固体支持体上に固定化された抗体によって認識されるものと異なるエピトープを認識する、請求項１６３に記載の方法。
  167. 第二の抗体が標識されている、請求項１６３に記載の方法。
  168. 試料中のヘプシジンの量を定量することを含む、請求項１６４に記載の方法。
  169. 既知量の精製されたヘプシジン標準を前記抗体とともに温置することを含む、請求項１３４に記載の方法。
  170. 既知量の複数のヘプシジン標準を用いて標準曲線を決定することを含む、請求項１６９に記載の方法。
  171. 前記方法が競合的酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である、請求項１３４に記載の方法。
  172. 生物試料中のヒトヘプシジンを検出するためのイムノアッセイキットであって、請求項１から１２７の何れか一項の１つ又はそれ以上の抗体、及び任意選択で標準としての精製されたヘプシジンを含む、イムノアッセイキット。
  173. 生物試料中のヒトヘプシジンを検出するためのイムノアッセイキットであって、
    （ａ）配列番号９に記載されているアミノ酸配列からなるヒトヘプシジンへ特異的に結合する抗体を含む捕捉剤、及び
    （ｂ）（ａ）における抗体によって認識されるものと異なるエピトープにおいて前記ヒトヘプシジンへ結合する請求項１から１２７の何れか一項の抗体を含む検出試薬、
    を含む、イムノアッセイキット。
  174. 捕捉剤がポリクローナル抗体である、請求項１７３のキット。
  175. 生物試料中のヒトヘプシジンを検出するためのイムノアッセイキットであって、
    （ａ）配列番号９に記載されているアミノ酸配列からなるヒトヘプシジンへ特異的に結合する抗体を含む検出試薬、及び
    （ｂ）（ａ）における抗体によって認識されるものと異なるエピトープにおいて前記ヒトヘプシジンへ結合する請求項１から１２７の何れか一項の抗体を含む捕捉試薬、
    を含む、イムノアッセイキット。
  176. 検出試薬がポリクローナル抗体である、請求項１７５のキット。
  177. 精製されたヘプシジンを標準としてさらに含む、請求項１７３又は１７５に記載のイムノアッセイキット。
  178. 捕捉剤がＡｂ４３、１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅｌ、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１８Ｄ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、１５Ｅ１、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１からなる群から選択される抗体を含む、請求項１７３に記載のイムノアッセイキット。
  179. ヘプシジン関連疾患を診断する方法であって、
    （ａ）ヒトヘプシジンへの抗体の結合を可能とする条件下で、請求項１から１２７の何れか一項に記載されている抗体の少なくとも１つと、ヘプシジン関連疾患を有することが疑われているヒトから得られた生物試料を接触させること、並びに
    （ｂ）前記抗体に結合されたヘプシジンを検出及び／又は定量すること
    を含み、（ｂ）において定量された、閾値レベルを上回る前記試料中のヘプシジンの量がヘプシジン関連疾患の存在を示唆し、閾値レベルを下回る前記試料中のヘプシジンの量がヘプシジン関連疾患の不存在を示唆する、方法。
  180. 抗体が固体支持体上に固定化されている、請求項１７９の方法。
  181. 前記疾患が、貧血、敗血症、炎症の貧血、癌の貧血、化学療法によって誘発される貧血、慢性炎症性貧血、うっ血性心不全、終末段階腎疾患、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、鉄欠乏性貧血、鉄恒常性の障害、フェロポーティン病、ヘモクロマトーシス、糖尿病、炎症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、腫瘍、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、異常ヘモグロビン症及び赤血球病からなる群から選択される、請求項１７９に記載の方法。
  182. 炎症性疾患を非炎症性疾患から識別する方法であって、
    （ａ）ヒトヘプシジンへの抗体の結合を可能とする条件下で、請求項１から１２７の何れか一項に記載されている抗体の少なくとも１つと、炎症性疾患を有することが疑われているヒトから得られた生物試料を接触させること、並びに
    （ｂ）抗体に結合されたヘプシジンへ検出及び又は定量すること、
    を含み、
    （ｂ）において定量された、閾値レベルを上回るヘプシジンの量が炎症性疾患の存在を示唆し、及び閾値レベルを下回るヘプシジンの量が炎症性疾患の不存在を示唆する、方法。
  183. 抗体が固体支持体上に固定化されている、請求項１８２の方法。
  184. 炎症性疾患が、癌の貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、化学療法によって誘発された貧血、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、終末段階の腎臓病、慢性腎不全、うっ血性心不全、癌、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、Ｈ．ピロリ感染又は他の細菌感染症、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ及び他のウイルス疾患、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、肝炎、膵炎、敗血症、脈管炎、鉄欠乏症、貧血、低色素性小球性貧血及びヘプシジン過剰を伴う症状である、請求項１８２に記載の方法。
  185. ヘプシジンアンタゴニストが投与されている治療を監視する方法であって、
    （ａ）ヒトヘプシジンへの抗体の結合を可能とする条件下で、請求項１から１２７の何れか一項に記載されている抗体の少なくとも１つと、ヘプシジンアンタゴニストを投与されたヒトから得られた生物試料を接触させること、並びに
    （ｂ）抗体に結合されたヘプシジンを検出及び／又は定量すること、
    を含み、
    （ｂ）において定量された、閾値レベルを上回るヘプシジンの量が、ヘプシジンアンタゴニストの用量が治療的に有効でないことを示唆し、前記閾値レベルを下回るヘプシジンの量が、ヘプシジンアンタゴニストの用量が治療的に有効であることを示唆する、方法。
  186. 抗体が固体支持体上に固定化されている、請求項１８５の方法。
  187. 鉄恒常性の障害の治療を必要としている対象における鉄恒常性の障害を治療する方法であって、請求項１から１２６の何れか一項のモノクローナル抗体を前記対象へ投与することを含む、方法。
  188. 鉄恒常性の障害が、貧血、敗血症、炎症の貧血、癌の貧血、化学療法によって誘発された貧血、慢性炎症性貧血、うっ血性心不全、終末段階腎疾患、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、鉄欠乏性貧血、鉄恒常性の障害、フェロポーティン病、ヘモクロマトーシス、糖尿病、炎症、関節リウマチ、動脈硬化症、腫瘍、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、異常ヘモグロビン症及び赤血球病からなる群から選択される、請求項１８７に記載の方法。
  189. 請求項１３３の組成物を投与することを含む、ヘプシジンの上昇したレベルを有する哺乳動物を治療する方法。
  190. 請求項１３３の組成物を投与することを含む、貧血を有する哺乳動物を治療する方法。
  191. 哺乳動物が、貧血、敗血症、炎症の貧血、癌の貧血、慢性炎症性貧血、うっ血性心不全、終末段階腎疾患、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、鉄欠乏性貧血、鉄恒常性の疾患、フェロポーティン病、ヘモクロマトーシス、糖尿病、炎症、関節リウマチ、動脈硬化症、腫瘍、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、異常ヘモグロビン症、赤血球病に罹患しているヒトである、請求項１９０の方法。
  192. 請求項１３３の組成物を含むバイアル又は予め充填された注射器。
  193. 治療を必要としている哺乳動物を治療する方法であって、前記哺乳動物に、（ａ）約１０−７Ｍ又はそれ以下のＫＤで、配列番号９からなるヒトヘプシジンを結合する抗体及び（ｂ）エリスロポエチン、エリスロポエチン変形物及びエリスロポエチンを結合する抗体からなる群から選択される赤血球新生刺激物質を投与することを含む、方法。
  194. ヒトヘプシジンを結合する抗体と赤血球新生刺激物質が同じ組成物中に存在する、請求項１９３の方法。
  195. 前記患者に鉄を投与することをさらに含む、請求項１９３又は１９４の方法。
  196. 鉄が経口又は全身投与される、請求項１９５の方法。
  197. 約１０−７Ｍ又はそれ以下のＫＤで、配列番号９からなるヒトヘプシジンを結合する抗体を投与することを含む、赤血球新生刺激物質での治療に対して低応答性である哺乳動物を治療する方法。
  198. 赤血球新生刺激物質を投与することをさらに含む、請求項１９７の方法。
  199. 哺乳動物が、敗血症、貧血、炎症の貧血、癌の貧血、化学療法によって誘発された貧血、うっ血性心不全、終末段階の腎疾患、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、鉄欠乏性貧血、鉄恒常性の障害、フェロポーティン病、ヘモクロマトーシス、糖尿病、関節リウマチ、動脈硬化症、腫瘍、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、異常ヘモグロビン症、赤血球病及び腎不全からなる群から選択される症状に罹患している、請求項１９３から１９８の何れか一項の方法。
  200. 哺乳動物が貧血に罹患している、請求項１９３から１９８の何れか一項の方法。
  201. 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体断片及び一本鎖抗体からなる群から選択される、請求項１９３から２００の何れか一項の方法。
  202. 哺乳動物がヒトである、請求項１９３から２０１の何れか一項の方法。
  203. 赤血球新生刺激物質が配列番号７２のヒトエリスロポエチンである、請求項１９３から１９６及び１９８から２０２の何れか一項の方法。
  204. 赤血球新生刺激物質が配列番号７３のダルベポエチンαである、請求項１９３から１９６及び１９８から２０２の何れか一項の方法。
  205. 請求項１から１２６の何れか一項の抗体と赤血球新生刺激物質を含む、上昇したヘプシジンレベルに関連する障害又は鉄恒常性の障害を伴う疾患を治療するためのキット。
  206. 抗体及び赤血球新生刺激物質が１つのバイアル中に存在する、請求項２０５のキット。
  207. 経口投与又は全身投与のための鉄をさらに含む、請求項２０６のキット。
  208. 鉄及び抗体が１つのバイアル中に存在する、請求項２０７のキット。
  209. 赤血球新生刺激物質及び鉄が１つのバイアル中に存在する、請求項２０７のキット。
  210. 上昇したヘプシジンレベルに関連する疾患又は鉄恒常性の障害を伴う疾患を治療するためのキットであって、請求項１から１２６の何れか一項の抗体及び容器に付着され又は同封されたラベルを含み、ラベルが赤血球新生刺激物質と一緒の前記抗体の使用を記載している、キット。
  211. 上昇したヘプシジンレベルに関連する疾患を治療するためのキットであって、赤血球新生刺激物質及び容器に付着され又は同封されたラベルとを含み、ラベルが請求項１から１２６の何れか一項の抗体と一緒の赤血球新生刺激物質の使用を記載している、キット。
  212. 鉄治療と一緒の抗体及び赤血球新生刺激物質の使用を記載したラベルをさらに含む、請求項２１０又は２１１のキット。
  213. 赤血球新生刺激物質がエリスロポエチン又はダルベポエチンである、請求項２０５又は２１１のキット。
  214. 配列番号９６に記載されているアミノ酸配列を含む、生物活性を有する、精製された、非尿性の、非哺乳動物のヒトヘプシジンの組成物であって、ヒトヘプシジンの少なくとも７５％がＣ２−Ｃ４ジスルフィド結合、Ｃ５−Ｃ７ジスルフィド結合、Ｃ１−Ｃ８ジスルフィド結合及びＣ３−Ｃ６ジスルフィド結合を有する、組成物。
  215. ヒトヘプシジンへ結合する化合物を同定する方法であって、
    請求項２１４の組成物と候補化合物を接触させること、及び
    候補化合物と組成物中のヒトヘプシジンの間の複合体を検出すること
    を含み、複合体の検出は、候補化合物がヒトヘプシジンへ結合することを示唆する、方法。
  216. ヒトヘプシジンへ結合する化合物を同定及び使用する方法であって、
    請求項２１４の組成物と候補化合物を接触させること、及び
    候補化合物と組成物中のヒトヘプシジンの間の複合体を検出すること（複合体の検出は、候補化合物がヒトヘプシジンへ結合することを示唆する。）、及び
    候補化合物を哺乳動物へ投与すること、
    を含む、方法。
  217. ヒトヘプシジンに対する抗体を作製する方法であって、
    免疫グロブリン産生細胞を請求項２１４の組成物と接触させること、及び
    前記細胞によって産生された免疫グロブリンを単離すること
    を含む、方法。
  218. ヒトヘプシジンを結合する能力に関して抗体を含む組成物を検査する方法であって、
    抗体を含む組成物を請求項２１４の組成物と接触させること、及び
    抗体とヒトヘプシジンの間の複合体を検出することを含み、複合体の検出は、抗体がヒトヘプシジンへ結合することを示唆する、方法。
  219. 配列番号９６に記載されているアミノ酸配列を含むヒトヘプシジンポリペプチドを、生物活性を有する形態へ再折り畳みする方法であって、
    （ａ）変性を促進する条件下で、カオトロピック剤へヒトヘプシジンポリペプチドを曝露すること、
    （ｂ）適切に折り畳まれた及び生物活性を有する形態への再生を促進する条件下で、酸化剤へ（ａ）の生成物を曝露すること、並びに
    （ｃ）ヒトヘプシジンポリペプチドの少なくとも７５％が少なくともＣ２−Ｃ４ジスルフィド結合とＣ５−Ｃ７ジスルフィド結合を有する、生物活性を有するヒトヘプシジンポリペプチドを含む溶液を回収すること、
    を含む、方法。
  220. （ｂ）がヒトヘプシジンポリペプチドを空気以外の酸化剤と接触させることを含む、請求項２１９の方法。
  221. 酸化剤がグルタチオンを含む、請求項２１９の方法。
  222. （ａ）が５未満のｐＨで行われる、請求項２１９の方法。
  223. （ｂ）が０．１％未満の酢酸を含有する溶液中で行われる、請求項２１９の方法。
  224. （ｂ）が８より大きなｐＨで行われる、請求項２１９の方法。
  225. カオトロピック剤がグアニジン又はその塩である、請求項２１９の方法。
  226. グアニジンが約４Ｍから約６Ｍの範囲の濃度で存在する、請求項２２５の方法。
  227. ヒトヘプシジンポリペプチドを精製することをさらに含む、請求項２１９から２２６の何れか一項の方法。
  228. ８つのシステイン全てを保持し、及びＣ２−Ｃ４ジスルフィド結合をさらに保持する配列番号９６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、ヘプシジンペプチド類縁体。
  229. ８つのシステイン全てを保持し、及びＣ５−Ｃ７ジスルフィド結合をさらに保持する配列番号９６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、ヘプシジンペプチド類縁体。
  230. Ｃ２−Ｃ４ジスルフィド結合をさらに保持する、請求項２２９のヘプシジン類縁体ペプチド。
  231. フェロポーティン結合活性を保持する請求項２２８から２３０の何れか一項のヘプシジン類縁体ペプチド。
  232. フェロポーティンを活性化する、請求項２３１のヘプシジン類縁体ペプチド。
  233. 循環鉄レベルをインビボで減少させる、請求項２２８から２３０の何れか一項のヘプシジン類縁体ペプチド。
  234. フェロポーティン鉄輸送を阻害する、請求項２３１のヘプシジン類縁体ペプチド。
  235. 配列番号９の成熟ヒトヘプシジンの鉄制御活性を阻害する、請求項２２８から２３０の何れか一項のヘプシジン類縁体ペプチド。
  236. 循環鉄レベルをインビボで増加させる、請求項２２８から２３０の何れか一項のヘプシジン類縁体ペプチド。
  237. ヒトヘプシジンへ特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、前記ヒトヘプシジンは、配列番号９に記載されたアミノ酸配列からなり、並びに配列番号９中に位置する残基１０と１３及び１４から２２の間に形成された少なくとも１つのジスルフィド結合ループを含む立体構造を有する、単離されたモノクローナル抗体。
  238. 抗体が配列番号１５、配列番号１３、配列番号２７、配列番号２５、配列番号３９、配列番号３７、配列番号５１、配列番号４９、配列番号１１０、配列番号１０８、配列番号１２０、配列番号１１８、配列番号１３０、配列番号１２８、配列番号１４０、配列番号１３８、配列番号１５０、配列番号１４８、配列番号１６０、配列番号１５８、配列番号１７０、配列番号１６８、配列番号１８０、配列番号１７８、配列番号１９０、配列番号１８８、配列番号２０２、配列番号２１２、配列番号２１８、配列番号２２４、配列番号２３５、配列番号２４６、配列番号２９３、配列番号２９１、配列番号３０３、配列番号３０１、配列番号３１３、配列番号３１１、配列番号３２３及び配列番号３２１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  239. １つ又は数個のアミノ酸置換、欠失又は付加によって、配列番号１５、配列番号１３、配列番号２７、配列番号２５、配列番号３９、配列番号３７、配列番号５１、配列番号４９、配列番号１１０、配列番号１０８、配列番号１２０、配列番号１１８、配列番号１３０、配列番号１２８、配列番号１４０、配列番号１３８、配列番号１５０、配列番号１４８、配列番号１６０、配列番号１５８、配列番号１７０、配列番号１６８、配列番号１８０、配列番号１７８、配列番号１９０、配列番号１８８、配列番号２０２、配列番号２１２、配列番号２１８、配列番号２２４、配列番号２３５、配列番号２４６、配列番号２９３、配列番号２９１、配列番号３０３、配列番号３０１、配列番号３１３、配列番号３１１、配列番号３２３及び配列番号３２１からなる群から選択されるアミノ酸配列から得られるアミノ酸配列を含み、並びに元のアミノ酸配列の生物活性を有する、請求項１の単離されたモノクローナル抗体。
  240. 前記抗体が、配列番号９と少なくとも８０％同一であり、及び８つのシステイン残基を有する２５アミノ酸からなるポリペプチドへも結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  241. 前記抗体が、配列番号９と少なくとも９０％同一であり、及び８つのシステイン残基を有する２５アミノ酸からなるポリペプチドへも結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  242. 前記抗体が、配列番号９と少なくとも９５％同一であり、及び８つのシステイン残基を有する２５アミノ酸からなるポリペプチドへも結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  243. 前記抗体が、１つ又は数個のアミノ酸置換、欠失又は付加によって、配列番号９のアミノ酸配列から誘導され及び配列番号９の生物活性を有し、並びに８つのシステイン残基を有する、２５のアミノ酸からなるポリペプチドにも結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  244. アミノ酸配列が配列番号９６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、請求項２２８から２３６のヘプシジンペプチド類縁体。
  245. アミノ酸配列が配列番号９６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項２２８から２３６のヘプシジンペプチド類縁体。
  246. アミノ酸配列が、１つ又は数個のアミノ酸置換、欠失又は付加によって、配列番号９６に記載されているアミノ酸配列から誘導され、及び配列番号９６の生物活性を有する、請求項２２８から２３６のヘプシジンペプチド類縁体。
  247. 請求項１から１２６の何れか一項のモノクローナル抗体を含む、鉄恒常性の障害の治療を必要としている対象における鉄恒常性の障害を治療するための組成物。
  248. 鉄恒常性の障害が、貧血、敗血症、炎症の貧血、癌の貧血、化学療法によって誘発された貧血、慢性炎症性貧血、うっ血性心不全、終末段階腎疾患、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、鉄欠乏性貧血、鉄恒常性の障害、フェロポーティン病、ヘモクロマトーシス、糖尿病、炎症、関節リウマチ、動脈硬化症、腫瘍、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、異常ヘモグロビン症及び赤血球病からなる群から選択される、請求項２４７に記載の組成物。
  249. ヘプシジンの上昇したレベルを有する哺乳動物を治療するための請求項１３３の組成物。
  250. 貧血を有する哺乳動物を治療するための、請求項１３３の組成物。
  251. 哺乳動物が、貧血、敗血症、炎症の貧血、癌の貧血、慢性炎症性貧血、うっ血性心不全、終末段階腎疾患、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、鉄欠乏性貧血、鉄恒常性の疾患、フェロポーティン病、ヘモクロマトーシス、糖尿病、炎症、関節リウマチ、動脈硬化症、腫瘍、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、異常ヘモグロビン症及び赤血球病に罹患しているヒトである、請求項２５０の組成物。
  252. 約１０−７Ｍ又はそれ以下のＫＤで、配列番号９からなるヒトヘプシジンを結合する抗体並びにエリスロポエチン、エリスロポエチン変形物及びエリスロポエチンを結合する抗体からなる群から選択される赤血球新生刺激物質を含む、治療を必要としている哺乳動物を治療するための組成物。
  253. ヒトヘプシジンを結合する抗体と赤血球新生刺激物質が同じ組成物中に存在する、請求項２５２の組成物。
  254. 方法が鉄をさらに含み、前記鉄は前記患者へ投与されるように調合されている請求項２５２又は２５３の組成物。
  255. 鉄が経口又は全身投与されるように調合されている、請求項２５４の組成物。
  256. 約１０−７Ｍ又はそれ以下のＫＤで、配列番号９からなるヒトヘプシジンを結合する抗体を含む、赤血球新生刺激物質での治療に対して低応答性である哺乳動物を治療するための組成物。
  257. 赤血球新生刺激物質をさらに含む、請求項２５６の組成物。
  258. 哺乳動物が、敗血症、貧血、炎症の貧血、癌の貧血、化学療法によって誘発された貧血、うっ血性心不全、終末段階の腎疾患、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、鉄欠乏性貧血、鉄恒常性の障害、フェロポーティン病、ヘモクロマトーシス、糖尿病、関節リウマチ、動脈硬化症、腫瘍、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、異常ヘモグロビン症、赤血球病及び腎不全からなる群から選択される症状に罹患している、請求項２５２から２５７の何れか一項の組成物。
  259. 哺乳動物が貧血に罹患している、請求項２５２から２５７の何れか一項の組成物。
  260. 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体断片及び一本鎖抗体からなる群から選択される、請求項２５２から２５９の何れか一項の組成物。
  261. 哺乳動物がヒトである、請求項２５２から２６０の何れか一項の組成物。
  262. 赤血球新生刺激物質が配列番号７２のヒトエリスロポエチンである、請求項２５２から２５５及び２５７から２６１の何れか一項の組成物。
  263. 赤血球新生刺激物質が配列番号７３のダルベポエチンαである、請求項２５２から２５５及び２５７から２６１の何れか一項の組成物。
  264. 前記抗体がＡｂ４３、２４１及び２．７から選択される抗体である、請求項２４７から２６３の何れか一項の組成物。
  265. 工程（ｃ）で回収されたヘプシジンの生物活性形態が、Ｃ２−Ｃ４又はＣ５−Ｃ７ジスルフィド結合の形成に関して、ＮＥＭ部分的還元的アルキル化又はフーリエ変換質量分析によって評価される、請求項２１９に記載の方法。
  266. 請求項２１９又は請求項２６５の方法によって取得可能な、生物活性を有する非尿性ヒトヘプシジン。
  267. 請求項２６６に記載のヒトヘプシジンへ特異的に結合するモノクローナル抗体。
  268. 請求項１から１１２の何れか一項の抗ヘプシジン抗体と同時投与するための医薬の製造における、赤血球新生刺激物質の使用。
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