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JP2009530423A - アミロイド生成性疾患を予防および処置するための方法 - Google Patents

アミロイド生成性疾患を予防および処置するための方法 Download PDF

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Abstract

ＲＡＧＥに特異的に結合し、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体（すなわち、抗ＲＡＧＥ抗体）の治療有効量を被験体に投与する工程が含まれている、Ａβのアミロイド沈着を特徴とする疾患または障害を処置するための方法が提供される。抗ＲＡＧＥ抗体は、被験体の中でのＡβのアミロイド沈着の蓄積を阻害または軽減するために、被験体の神経変性を阻害または軽減するために、被験体の認識衰退を阻害または軽減するために、そして／あるいは、被験体の認識を改善するためにも使用することができる。

Description

関連する出願への相互参照
２００７年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／８９５，３０３号および２００６年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／７８４，５７５の、米国特許法§１１９（ｅ）のもとでの優先権が主張され、米国仮特許出願第６０／８９５，３０３号および同第６０／７８４，５７５の両方の内容は、その全体が、本明細書において参考として援用される。
発明の分野
本発明は、一般的には、ＲＡＧＥ関連疾患および障害を処置または予防するための、糖化最終産物の受容体（ＲＡＧＥ）の特異的に結合する抗体とその断片、そのような抗体とその断片がヒト患者およびヒト以外の哺乳動物に投与される方法に関する。
発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は進行性であり、最終的には命にかかわる、主に高齢者が罹患する神経変性疾患である。これは認知症の最も一般的な形態であり、通常は、認識（記憶、推論、適応、および判断）が徐々に失われること、および多数の行動障害の進行が伴う。この疾患は、２つのカテゴリーに分けられる。すなわち、高齢（６５＋歳）で起こる後期発症型と、老年期よりもはるかに前（すなわち、３５歳から６０歳の間）に発症する早期発症型である。いずれのタイプの疾患においても病状は同じであるが、より若い年齢で発症する場合には、異常性がより重症化し、そして広範囲に広がる傾向がある。この疾患は、脳の中の少なくとも２つのタイプの病変（神経原繊維のもつれと老人斑）を特徴とする。神経線維のもつれは２つ一組で互いにより合わさった２つの繊維からなる微小管結合ｔａｕタンパク質の細胞内沈着である。老人斑（すなわち、アミロイド斑）は、脳組織の切片の顕微鏡分析によって見ることができる、中心の細胞外アミロイドの沈着を有している１５０μｍの直径までのまとまりのない神経網の糸の領域である。脳の中でのアミロイド斑の蓄積は、ダウン症や他の認識障害（例えば、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）アミロイドーシスおよび海綿状脳症）にも関係している。
β−アミロイドペプチドまたはＡβとも呼ばれるペプチドはアミロイド斑の主成分であり、ＡＤの発症において欠かせない役割を担っていると考えられる。Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる大きな膜貫通糖タンパク質の３９〜４３アミノ酸残基の、疎水性の４ｋＤａの内部断片である。β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼによるＡＰＰのタンパク質分解的プロセシングの結果として、Ａβは、主に、４０アミノ酸の長さの短い形態と、４２〜４３アミノ酸の長さの範囲の長い形態の両方で見られる。脳の中でのアミロイド斑の蓄積は、最終的には神経細胞の死を導く。アルツハイマー病（ＡＤ）の特徴である欠損症状や身体症状は、少なくとも一部、Ａβの神経毒性作用によって引き起こされた神経の損傷による結果と考えられる。Ａβの生産の阻害またはＡβのクリアランスの増大によるＡβレベルの低下は、アルツハイマー病の疾患を調節するストラテジーとして広く認識されている。
ＡＰＰタンパク質の中のいくつかの変異は、アルツハイマー病の存在と相関関係がある。そのような変異の例としては、バリン７１７からイソロイシンへ、グリシンからフェニルアラニンへの変異、そしてリジン５９５−メチオニン５９６からアスパラギン５９５−ロイシン５９６への二重変異が挙げられる。このような変異は、ＡＰＰのＡβへのプロセシングの増大または変化（特に、長期にわたるＡβの量の増加を生じるＡＰＰのプロセシング（すなわち、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３））により、アルツハイマーを引き起こすと考えられる。他の遺伝子（例えば、プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２）の中での変異は、長い形態のＡβの増量を生じるようにＡＰＰのプロセシングに間接的に影響を与えると考えられる。
アルツハイマーにおけるアミロイド斑の重要性を決定するためには、マウスモデルがうまく使用されてきた（非特許文献１；非特許文献２）。具体的には、ヒトＡＰＰの変異体形態を発現し、若い年齢でアルツハイマー病を発症するＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスにＡβの長い形態を注射すると、彼らは、アルツハイマー病の進行の緩和と、Ａβペプチドに対する抗体力価の増大の両方を示す（非特許文献３）。上記で議論した観察は、Ａβ（特に、その長い形態）がアルツハイマー病の原因となる要素であることを示している。
Ａβペプチドは、溶液中に存在することができ、そしてＣＮＳ（例えば、ＣＳＦ）と血漿の中で検出することができる。特定の条件下では、可溶性Ａβは、ＡＤ患者の老人斑および脳血管の中で見られる、繊維性の毒性のあるβ−シートの形態に変換される。Ａβに対するモノクローナル抗体での免疫化を含む処置が研究されている。能動免疫法と受動免疫法はいずれも、ＡＤのマウスモデルで試験されている。能動免疫法によっては、脳の中のプラーク負荷のいくらかの軽減が生じるが、鼻から投与された場合に限られる。ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスの受動免疫法もまた研究されている（非特許文献４）。２つの機構（即ち、中心での分解と末梢での分解）が、効果的なクリアランスについて提案されている、中心での分解の機構は、血液−脳関門を通過してプラークに結合し、すでに存在しているプラークのクリアランスを誘導することができる抗体に依存する。クリアランスは、Ｆｃ受容体によって媒介される食作用によって促進されることが示されている（Ｂａｒｄら、前出）。Ａβのクリアランスの末梢での分解機構は、抗体の投与の際の脳、ＣＳＦ、および血漿の間でのＡβの動的平衡の崩壊に依存し、これによって１つの区画から別の区画へのＡβの輸送が生じる。中心に位置しているＡβはＣＳＦと血漿に輸送され、ここで分解される。最近の研究では、脳の中でのアミロイドの沈着が減少しない場合にもなお、可溶性の結合していないＡβが、ＡＤに伴う記憶障害に関係していることが示唆されている（非特許文献５）。
糖化最終産物の受容体（ＲＡＧＥ）は、複数のリガンドを有している、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面メンバーである。ＲＡＧＥは、１つの細胞外ドメイン、１つの膜貫通ドメインと、１つの細胞質末端から構成されている。この受容体の細胞外ドメインは、１つのＶ型の免疫グロブリンドメインと、後に続く２つのＣ型免疫グロブリンドメインから構成されている。ＲＡＧＥはまた、可溶性形態（ｓＲＡＧＥ）でも存在する。ＲＡＧＥは、多くの様々な組織（肺、心臓、腎臓、骨格筋、および脳を含む）の中の多くの細胞のタイプ（例えば、内皮細胞および平滑筋細胞、マクロファージおよびリンパ球）によって発現される。発現は、慢性の炎症の状態（例えば、間接リウマチおよび糖尿病性腎症）においては増大する。この生理学的機能は不明確であるが、これは炎症応答に関係しており、そして、筋芽細胞の分化および神経の発達を含む多様な発達プロセスにおいて役割を有している可能性がある。
ＲＡＧＥは、いくつかの様々なクラスの内因性の分子に結合して、様々な細胞性の応答（サイトカインの分泌、細胞性の酸化的ストレスの増大、神経突起の伸張、および細胞の移動を含む）を導く、特殊なパターンの認識受容体である。ＲＡＧＥは、広範囲のアミロイド生成性の疾患および障害において活発な病原性役割を有していることが示されている。
アルツハイマー病と他のアミロイド生成性疾患の処置のための新規の治療および試薬が必要である。
Ｇａｍｅｓら、１９９５，Ｎａｔｕｒｅ，３７３：５２３ Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１５５０ Ｓｃｈｅｎｋら、１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４００：１７３ Ｂａｒｄら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，６：９１６−１９ Ｄｏｄｅｌら、２００３，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，２：２１５
発明の要旨
本発明により、ＲＡＧＥに特異的に結合し、そしてＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体（すなわち、抗ＲＡＧＥ抗体）の治療有効量を投与することによる、Ａβのアミロイド沈着を特徴とする疾患または障害を有している被験体を処置する方法が提供される。開示される方法によって処置することができる疾患または障害は、例えば、アルツハイマー病において起こる、脳の中でのＡβのアミロイド沈着を特徴とし得る。抗ＲＡＧＥ抗体は、本明細書中に記載される場合にはまた、被験体の中でのＡβのアミロイド沈着の蓄積を阻害または軽減するために、被験体の神経変性を阻害または軽減するために、被験体の認識衰退を阻害または軽減するために、そして／あるいは、被験体の認識を改善するためにも使用することができる。
発明の詳細な説明
抗ＲＡＧＥ抗体
本発明により、本明細書中に記載されるように、ＲＡＧＥ（可溶性ＲＡＧＥと内因性の分泌型ＲＡＧＥを含む）に特異的に結合する抗体が提供される。代表的な抗ＲＡＧＥ抗体には、配列番号１６〜４９に示される抗体可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つが含まれ得る。
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体には、ＲＡＧＥに特異的に結合し、配列番号１６〜４９のいずれか１つと同じまたは実質的に同じであるアミノ酸配列を有している抗体が含まれる。実質的に同じ抗ＲＡＧＥ抗体のアミノ酸配列は、配列番号１６〜４９のいずれか１つに対して少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列である。
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体には、ＲＡＧＥに特異的に結合し、そして（ａ）配列番号１９、２２、２５、２３、２７、および１７からなる群より選択される軽鎖可変領域を含むか、または（ｂ）配列番号１９、２２、２５、２３、２７、および１７のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有している軽鎖可変領域を含む抗体、あるいは、（ａ）または（ｂ）の抗体のＲＡＧＥ結合断片が含まれる。
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体にはまた、ＲＡＧＥに特異的に結合し、そして（ａ）配列番号１８、２１、２４、２０、２６、および１６からなる群より選択される重鎖可変領域を含むか、または（ｂ）配列番号１８、２１、２４、２０、２６、および１６のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有している重鎖可変領域を含む抗体、あるいは、（ａ）または（ｂ）の抗体のＲＡＧＥ結合断片も含まれる。
本発明には、ＲＡＧＥに特異的に結合し、そして以下である、抗ＲＡＧＥ抗体が含まれ、さらに
（ａ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体と、ＲＡＧＥへの結合について競合する、
（ｂ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体が結合したＲＡＧＥのエピトープに結合する、
（ｃ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、あるいは、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の抗体のＲＡＧＥ結合断片である。
本発明には、インビトロおよびインビボでＲＡＧＥを発現する細胞に特異的に結合する抗ＲＡＧＥ抗体、および少なくとも約１×１０−７Ｍから約１×１０−１０Ｍまでの範囲の解離定数（Ｋｄ）でヒトＲＡＧＥに結合する抗体が含まれる。ヒトＲＡＧＥのＶドメインに特異的に結合する本発明の抗ＲＡＧＥ抗体、およびＲＡＧＥ結合パートナーに対するＲＡＧＥの結合をブロックする抗ＲＡＧＥ抗体（ＲＡＧＥ−ＢＰ）もまた含まれる。
本発明にはＲＡＧＥに特異的に結合して、ＲＡＧＥのＲａｇｅ結合パートナー（例えば、ＨＭＧＢ１、ＡＧＥ、Ａβ、ＳＡＡ、Ｓ１００、アンフォテリン、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ａ（Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９を含む）、Ｓ１００Ａ４、ＣＲＰ、β２−インテグリン、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０，９５のようなリガンド）に対する結合をブロックし、そして以下の特性のうちの４つ以上を有しているＣＤＲを有している抗体も含まれる（位置の番号付けは、図６および７のＶＨおよびＶＬの配列について示されたものと同じアミノ酸位置に関する）。すなわち、
１．ＶＨ ＣＤＲ１の中にアミノ酸配列Ｙ−Ｘ−Ｍ（Ｙ３２；Ｘ３３；Ｍ３４）があり、式中、ＸはＷまたはＮであることが好ましい。
２．ＶＨ ＣＤＲ２の中にアミノ酸配列Ｉ−Ｎ−Ｘ−Ｓ（Ｉ５１；Ｎ５２；Ｘ５３；およびＳ５４）があり、式中、ＸはＰまたはＮである。
３．ＶＨのＣＤＲ２の中の５８位のアミノ酸がスレオニンである。
４．ＶＨのＣＤＲ２の中の６０位のアミノ酸がチロシンである。
５．ＶＨのＣＤＲ３の中の１０３位のアミノ酸がスレオニンである。
６．ＶＨのＣＤＲ３の中に１つ以上のチロシン残基がある。
７．ＶＬのＣＤＲ１の中の２４位に正電荷を有している残基（ＡｒｇまたはＬｙｓ）がある。
８．ＶＬのＣＤＲ１の中の２６位に親水性残基（ＴｈｒまたはＳｅｒ）がある。
９．ＶＬのＣＤＲ１の中の２５位に小さい残基ＳｅｒまたはＡｌａがある。
１０．ＶＬのＣＤＲ１の中の３３位に負電荷を有している残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）がある。
１１．ＶＬのＣＤＲ１の中の３７位に芳香族残基（ＰｈｅまたはＴｙｒまたはＴｒｐ）がある。
１２．ＶＬのＣＤＲ２の中の５７位に親水性残基（ＳｅｒまたはＴｈｒ）がある。
１３．ＶＬのＣＤＲ３の末端がＰ−Ｘ−Ｔ配列であり、式中、Ｘは疎水性残基ＬｅｕまたはＴｒｐであり得る。
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体には、ヒトＲＡＧＥのＶドメインに特異的に結合して、ＲＡＧＥのそのリガンドへの結合をブロックする、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の特性の全てを有しているＣＤＲを有している抗体が挙げられる。
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体には、上記のような抗ＲＡＧＥ抗体、またはキメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、四量体抗体、４価抗体、多特異的抗体、ドメイン特異的抗体、ドメイン欠失抗体、融合タンパク質、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ＳｃＦｖ断片、Ｆｄ断片、単一ドメイン抗体、ｄＡｂ断片、およびＦｃ融合タンパク質（すなわち、免疫グロブリン定常領域に融合させられた抗原結合ドメイン）からなる群より選択されるＲＡＧＥ結合断片が含まれる。これらの抗体は、細胞傷害性物質、放射線治療薬、または検出標識と連結させることができる。
例えば、ＸＴ−Ｍ４抗体のＶＨおよびＶＬドメインが含まれているＳｃＦｖ抗体（配列番号６３）が調製されており、細胞をベースとするＥＬＩＳＡ分析によって、ヒヒ、マウス、ウサギ、およびヒトのＲＡＧＥに対して、キメラおよび野生型のＸＴ−Ｍ４抗体の結合親和性に匹敵する結合親和性を有していることが示されている。
本発明の抗体はさらに、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与された目的のポリペプチドの１つに対する親和性を有している、ヘテロ結合体、二重特異的、単鎖、およびキメラおよびヒト化された分子を含むように意図される。
ＲＡＧＥに特異的に結合する本発明の抗体にはまた、本明細書中に記載される任意の抗体の変異体も含まれる。これらは、公知の分子生物学とクローニング技術を使用して容易に調製することができる。例えば、米国特許出願公開番号２００３／０１１８５９２、同２００３／０１３３９３９、同２００４／００５８４４５、同２００５／０１３６０４９、同２００５／０１７５６１４、同２００５／０１８０９７０、同２００５／０１８６２１６、同２００５／０２０２０１２、同２００５／０２０２０２３、同２００５／０２０２０２８、同２００５／０２０２５３４、および同２００５／０２３８６４６と、それらの関連する特許ファミリーのメンバーを参照のこと。これらは全て、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。例えば、本発明の変異体抗体にはまた、結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質も含まれ得る。これは、免疫グロブリンヒンジまたはヒンジ作用領域ポリペプチドに融合させられたか、または別の方法で連結させられた結合ドメインポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）が含まれ、これは次いで、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖（例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２およびＣＨ３領域、またはＩｇＥのＣＨ３およびＣＨ４領域）に由来する１つ以上の野生型または操作された定常領域を含む領域に融合させられるか、あるいは別の方法で連結させられる（例えば、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．ら、によるＵ．Ｓ．２００５／０１３６０４９、これは、さらに完全な記述のために引用により本明細書中に組み入れられる）。結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質にはさらに、ヒンジ領域ポリペプチドに融合または別の方法で連結させられた野生型または操作された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチド（またはＩｇＥ全体またはＩｇＥの一部の中で誘導された構築物の場合にはＣＨ３）、あるいは、ＣＨ２定常領域ポリペプチド（またはＩｇＥ全体またはＩｇＥの一部の中で誘導された構築物の場合にはＣＨ３）に融合または別の方法で連結させられた野生型または操作された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチドを含む領域が含まれ得る。通常は、このような結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質は、少なくとも１つの免疫学的活性（例えば、ＲＡＧＥに対する特異的結合、ＲＡＧＥとＲＡＧＥ結合パートナーとの間での相互作用の阻害、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性の誘導、補体結合の誘導など）が可能である。
本発明の抗体にはまた、それに結合させられた、検出することができる標識が含まれ得る（例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。
ＲＡＧＥポリペプチド
本発明によってはまた、配列番号７、９、１１、または１３に示されるアミノ酸配列を有している、ヒヒ、カニクイザル、およびウサギの単離されたＲＡＧＥタンパク質が提供され、さらに、配列番号７、９、１１、または１３に示されるアミノ酸配列と実質的に同じであり、配列番号７、９、１１、または１３のいずれか１つに対してアミノ酸配列において少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一であるアミノ酸配列を有しているＲＡＧＥタンパク質も含まれる。
本発明にはまた、当該分野で公知の任意の手段により、本発明の抗ＲＡＧＥ抗体とそのＲＡＧＥ結合断片を産生するための方法も含まれる。
本発明にはまた、配列番号１、３、７、９、１１、または１３のいずれかに示されるＲＡＧＥアミノ酸配列の１つ以上のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体の精製された調製物も含まれる。
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語がここに集められる。他の場所に定義されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。
用語「ａ」と「ａｎ」は、本明細書中で使用される場合は、１つまたは１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の文法上の目的物をいう。例として、「１つのエレメント（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つのエレメントまたは１つ以上のエレメントを意味する。
用語「または（ｏｒ）」は、状況が他の場所に明記されない限りは、用語「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するように使用され、これと互換的に使用される。
「単離された」もしくは「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、「単離された抗体」）は、それが自然界に存在している状態を超える状態にまで精製される。例えば、「単離された」もしくは「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、単離された抗体）は、タンパク質が由来する細胞または組織の供給源に由来する細胞性の材料または他の混入しているタンパク質が実質的に含まれないようにすることができ、あるいは、化学合成される場合には化学的前駆体または他の化合物が実質的に含まれてないようにすることもできる。抗体以外のタンパク質（本明細書中では「混入しているタンパク質」とも呼ばれる）または化学的前駆体が約５０％未満含まれている抗体タンパク質の調製物は、「実質的に含まれていない」と考えられる。４０％、３０％、２０％、１０％、およびさらに好ましくは５％（乾燥重量で）の抗体以外のタンパク質または化学的前駆体は、実質的に含まれていないと考えられる。抗体タンパク質またはその生物学的活性のある部分が組み換えによって生産される場合には、これもまた、培養培地が実質的に含まれないこと、すなわち、培養培地が、タンパク質調製物の容積または質量の約３０％未満、好ましくは約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を占めることが好ましい。「組み換え体」として本明細書中に記載されるタンパク質またはポリペプチドは、組み換え体核酸の発現によって生産されるタンパク質またはポリペプチドである。
用語「抗体」は、本明細書中では用語「免疫グロブリン」と互換的に使用され、これには、完全な抗体、抗体の断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２断片）、そしてそれらの定常領域および／または可変領域のいずれかが変異（例えば、キメラ抗体、部分的にヒト化された抗体、または完全なヒト化抗体を生じるような変異、ならびに、高いＩＬ１３結合および／または低いＦｃＲ結合のような所望される形質を有する抗体を生じるような変異）している完全な抗体と断片が含まれる。用語「断片」は、完全な抗体もしくは抗体全体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基が含まれている、抗体または抗体鎖の一部あるいは部分をいう。断片は、完全な抗体または抗体全体または抗体鎖の化学的あるいは酵素的処理によって得ることができる。断片はまた、組み換え手段によって得ることもできる。例示的な断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ならびに、ｓｃＦｖおよび／またはＦｖ断片が挙げられる。用語「抗原結合断片」は、抗原に結合するか、または完全な抗体（すなわち、それらが由来する完全な抗体）と、抗原結合（すなわち、特異的結合）について競合する、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片をいう。このように、これらの抗体またはそれらの断片は、抗体または断片がＲＡＧＥに特異的に結合し、１つ以上のＲＡＧＥが関係している活性を中和するかまたは阻害する（例えば、ＲＡＧＥに対するＲＡＧＥ結合パートナー（ＲＡＧＥ−ＢＰｓ）の結合を阻害する）との条件で、本発明の範囲に含まれる。
抗体には、ジスルフィド結合によって互いに連結された４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖）から構成される分子構造が含まれる。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と重鎖定常領域から構成されている。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から構成されている。個々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と軽鎖定常領域から構成されている。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成されている。ＶＨ領域とＶＬ領域は、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が間に散りばめられている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に分けることができる。ＶＨとＶＬはそれぞれ、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に向かって配置された３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成されている。すなわち、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４である。
用語「抗体」には、任意の供給源（例えば、ヒトとヒト以外の霊長類、および齧歯類、ウサギ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなど）から得られた任意のＩｇクラスまたは任意のＩｇサブクラス（例えば、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブクラス）が含まれる。
用語「Ｉｇクラス」または「免疫グロブリンクラス」は、本明細書中で使用される場合は、ヒトまたは高等哺乳動物において同定されている５つの免疫グロブリンのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）をいう。用語「Ｉｇサブクラス」は、ヒトおよび高等哺乳動物において同定されているＩｇＭの２つのサブクラス（ＨとＬ）、ＩｇＡの３つのサブクラス（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、および分泌型ＩｇＡ）、およびＩｇＧの４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）をいう。抗体は、単量体形態で存在することができ、また、多量体形態でも存在することができる。例えば、ＩｇＭ抗体は五量体形態で存在し、そしてＩｇＡ抗体は単量体、二量体、または多量体形態で存在する。
用語「ＩｇＧサブクラス」は、免疫グロブリンのγ重鎖によってそれぞれγ１〜γ４としてヒトおよび高等哺乳動物において同定されている免疫グロブリンクラスＩｇＧの４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）をいう。
用語「単鎖免疫グロブリン」または「単鎖抗体」（本明細書中では互換的に使用される）は、抗原に特異的に結合する能力を有している、重鎖と軽鎖からなる２−ポリペプチド鎖構造を有しているタンパク質をいい、上記鎖は、例えば、鎖間ペプチドリンカーによって安定化させられている。用語「ドメイン」は、例えば、β−プリーツシートおよび／または鎖間ジスルフィド結合によって安定化させられたペプチドループを含む（例えば、３個から４個のペプチドループを含む）、重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域をいう。ドメインはさらに、本明細書中では、「定常」ドメインの場合には、様々なクラスのメンバーのドメインの中の配列のバリエーションが比較的少ないことに基づいて、「可変」ドメインの場合には、様々なクラスのメンバーのドメインの中での有意なバリエーションに基づいて、「定常」または「可変」と呼ばれる。抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、多くの場合は、当該分野において抗体またはポリペプチド「領域」と互換的に言われる。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域、または「ＣＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域、または「ＣＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域、または「ＶＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＶＨ」領域、または「ＶＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。
用語「領域」はまた、抗体鎖または抗体鎖ドメインの一部または部分（例えば、本明細書中で定義されるような、重鎖または軽鎖の一部もしくは部分、あるいは定常ドメインもしくは可変ドメインの一部または部分）、ならびに、上記鎖もしくはドメインのさらに放れている複数の一部分または部分をもいうことができる。例えば、軽鎖と重鎖、または軽鎖と重鎖の可変ドメインには、本明細書中で定義される場合には、「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」が間に散りばめられている「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」が含まれる。
用語「立体構造」は、タンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体、抗体鎖、ドメイン、またはその領域）の三次構造をいう。例えば、表現「軽鎖（または重鎖）立体構造」は、軽鎖（または重鎖）の可変領域の三次構造をいい、そして表現「抗体の立体構造」または「抗体断片の立体構造」は、抗体またはその断片の三次構造をいう。
抗体の「特異的結合」は、抗体が、特定の抗原またはエピトープに対して相当の親和性を示し、通常は、有意な交差反応性を示さないことを意味する。用語「抗ＲＡＧＥ抗体」は、本明細書中で使用される場合は、ＲＡＧＥに特異的に結合する抗体をいう。抗体は、交差反応性は示さない場合があり、例えば、ＲＡＧＥ以外のペプチドと、またはＲＡＧＥ上の離れたエピトープとは交差反応しない。「相当の」結合には、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１の親和性での結合が含まれる。１０７Ｍ−１または１０８Ｍ−１より大きい親和性を有している抗体は、通常、対応してより大きな特異性で結合する。本明細書中に示した値の間の値もまた本発明の範囲に入るように意図され、本発明の抗体は、例えば、１０６から１０１０Ｍ−１、または１０７から１０１０Ｍ−１、または１０８から１０１０Ｍ−１の範囲の親和性でＲＡＧＥに結合する。「有意な交差反応性を示さない」抗体は、その標的以外の物質（例えば、異なるエピトープまたは異なる分子）には感知できるほどには結合しないであろう抗体である。例えば、ＲＡＧＥに特異的に結合する抗体はＲＡＧＥに相当に結合するであろうが、ＲＡＧＥ以外のタンパク質またはペプチドとは有意には反応しないであろう。特定のエピトープに特異的な抗体は、例えば、同じタンパク質またはペプチド上の離れたエピトープとは有意には交差反応しないであろう。特異的結合は、そのような結合を決定するための任意の当該分野で理解されている手段にしたがって決定することができる。好ましくは、特異的結合は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析および／または競合結合アッセイにしたがって決定される。
本明細書中で使用される場合は、用語「親和性」は、１つの抗原結合部位の抗原決定基との結合の強さをいう。親和性は、抗体結合部位と抗原決定基との間での立体化学的適合の緊密さ、それらの間での接触面積の大きさ、電荷を有している基と疎水基の分布などによって様々である。抗体の親和性は、平衡透析によって、または動的ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）法によって測定することができる。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の現象による。この現象は、表面プラズモン波が金属／液体界面で励起されると起こる。光が、試料と接触していない表面の側から当てられるかまたは反射され、そしてＳＰＲが角度と波長の特異的な組み合わせで反射された光の強度の減少を生じる。二分子結合事象は、表面層の屈折率の変化を引き起こし、これがＳＰＲシグナルの変化として検出される。
解離定数Ｋｄと結合定数Ｋａは、親和性の量的測定値である。平衡状態では、遊離の抗原（Ａｇ）と遊離の抗体（Ａｂ）は、抗原−抗体複合体（Ａｇ−Ａｂ）とともに平衡状態にあり、速度定数（ｋａとｋｄ）は個々の反応の速度の量を表す。
Ａｂ＋Ａｇ → Ａｂ−Ａｇ および Ａｂ−Ａｇ → Ａｂ＋Ａｇ
平衡状態では、ｋａ［Ａｂ］［Ａｇ］＝ｋｄ［Ａｇ−Ａｂ］である。解離定数Ｋｄは、Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａ＝［Ａｇ］［Ａｂ］／［Ａｇ−Ａｂ］によって与えられる。Ｋｄは濃度の単位であり、最も一般的には、Ｍ、ｍＭ、μＭ、ｎＭ、ｐＭなどである。Ｋｄとして表された抗体親和性を比較する場合には、ＲＡＧＥに対してより大きな親和性を有していることはより低い値によって示される。結合定数Ｋａは、Ｋａ＝ｋａ／ｋｄ＝［Ａｇ−Ａｂ］／［Ａｇ］［Ａｂ］によって与えられる。Ｋａは濃度に反比例する単位であり、最も典型的には、Ｍ−１、ｍＭ−１、μＭ−１、ｎＭ−１、ｐＭ１などである。本明細書中で使用される場合は、用語「親和力」は、可逆的な複合体の形成後の抗原−抗体結合の強さをいう。抗ＲＡＧＥ抗体は、「約（より低いＫｄ値）から約（より高いＫｄ値）までの範囲の解離定数（Ｋｄ）での結合として、ＲＡＧＥタンパク質へのそれらの結合についてのＫｄに関して特性決定することができる。この状況では、用語「約」は、示されるＫｄ値±２０％、すなわち、約１のＫｄ＝０．８から１．２までの範囲のＫｄを意味するように意図される。
本明細書中で使用される場合は、用語「モノクローナル抗体」は、構造および抗原特異性が均一である、抗体を生産する細胞（例えば、Ｂリンパ球またはＢ細胞）のクローン集団に由来する抗体をいう。用語「ポリクローナル抗体」は、それらの構造およびエピトープ特異性は不均一であるが、共通の抗原を認識する、抗体を生産する細胞の様々なクローン集団に起源する複数の抗体をいう。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、体液の中に粗調製物として存在する場合も、また、本明細書中に記載されるように精製される場合もある。
用語抗体の「結合部分」（または「抗体部分」）には、１つ以上の完全なドメイン（例えば、完全なドメインの対）、ならびに、ＲＡＧＥに特異的に結合する能力を保持している抗体の断片が含まれる。抗体の結合機能は、全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。結合断片は組み換えＤＮＡ技術によって、あるいは完全な免疫グロブリンの酵素的または化学的切断によって生産される。結合断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｖ、単鎖、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖおよび単鎖ドメイン抗体）（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１，２６：２３０−５）、ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる１価の断片である。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片が含まれている２価の断片である。Ｆｄ断片は、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなり、Ｆｖ断片は、抗体の１つのアームのＶＬドメインとＶＨドメインからなる。ｄＡｂ断片はＶＨドメインからなる（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）。Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬとＶＨ）は、別の遺伝子によってコードされるが、これらは、組み換え方法を使用してそれらを、ＶＬ領域とＶＨ領域の対が１価の分子を形成する１つのタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）とすることができる合成リンカーによって連結させることができる（Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）。そのような単鎖抗体もまた、用語抗体の「結合部分」に含まれるように意図される。単鎖抗体の他の形態（例えば、ダイアボディー）もまた含まれる。ダイアボディーは、２価の二重特異的抗体である。ここでは、ＶＨドメインとＶＬドメインが１つのポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖の上にある２つのドメインの間での対合を可能にするには短すぎるリンカーが使用され、それによって、ドメインを別の鎖の相補ドメインと対合させて、２つの抗原結合部位が作成される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８を参照のこと）。抗体またはその結合部分もまた、抗体または抗体部分の、１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合によって形成されるより大きな免疫接着分子の一部であり得る。そのような免疫接着分子の例としては、４量体ｓｃＦｖ分子を作成するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら、（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３−１０１）、ならびに、２化のビオチニル化ｓｃＦｖ分子を作成するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が挙げられる。結合断片（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片）は、従来技術（例えば、それぞれ、完全な抗体のパパインまたはペプシン消化）を使用して、完全な抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分、および免疫接着分子は、本明細書中に記載され、そして当該分野で公知であるような標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる。「二重特異的」または「二官能性」抗体以外の抗体は、それぞれが同一のその結合部位を有すると理解される。「二重特異的」または「二官能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖の対と２つの異なる結合部位を有している人工的なハイブリッド抗体である。二重特異的抗体にはまた、定常領域が間に介在している２つの抗原結合領域も含まれ得る。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合、またはＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法によって生産することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１，１９９０；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３を参照のこと。
用語「逆変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎ）」は、ヒト抗体の体細胞変異したアミノ酸のいくつかまたは全てが、均一な生殖細胞系列抗体配列に由来する対応する生殖細胞系列の残基で置き換えられるプロセスをいう。本発明のヒト抗体の重鎖および軽鎖配列は、最も高い相同性を有している配列を同定するために、ＶＢＡＳＥデータベースの生殖細胞系列の配列と別々にアラインメントされる。本発明のヒト抗体における相違は、そのような異なるアミノ酸をコードする定義されたヌクレオチド位置を変異させることによって、生殖細胞系列の配列に戻される。最終的なヒト抗体に含まれるべきではないヒト抗体の任意の所望される特性に影響を与える変異の後に見られる抗原結合と任意のアミノ酸における直接的または間接的役割について、このように骨格の候補として同定された個々のアミノ酸の役割が研究されるはずである。一例として、選択的突然変異誘発のアプローチによって同定された活性を高めるアミノ酸は、逆変異の対象ではないであろう。逆変異の対象となるアミノ酸の数を最少にするためには、最も近い生殖細胞系列の配列とは異なるが、第２の生殖細胞系列の配列の対応するアミノ酸と同じであることが明らかなこれらのアミノ酸の位置を、第２の生殖細胞系列の配列が本発明のヒト抗体の配列と、少なくとも１０、好ましくは１２個のアミノ酸について、目的のアミノ酸のいずれの側においても同じであり同一鎖上にあるとの条件で、残すことができる。逆変異は、抗体の最適化の任意の段階で行うことができる。好ましくは、逆変異は、選択的突然変異誘発のアプローチの直前、または直後に行われる。さらに好ましくは、逆変異は、選択的突然変異誘発のアプローチの直前に行われる。
完全な抗体（免疫グロブリンとしても知られている）は、典型的には、それぞれがおよそ２５ｋＤａの２つの軽（Ｌ）鎖と、それぞれがおよそ５０ｋＤａの２つの重（Ｈ）鎖から構成されている四量体グリコシル化タンパク質である。λとκと呼ばれる２つのタイプの軽鎖が抗体の中で見られる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、５つの主要なクラス（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭ）に割り当てることができ、これらのいくつかは、サブクラス（イソ型）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）にさらに分けることができる。個々の軽鎖は、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）と定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）から構成されている。個々の重鎖は、Ｎ末端のＶドメイン（ＶＨ）、３個または４個のＣドメイン（ＣＨ）、そしてヒンジ領域から構成されている。ＶＨに最も近いＣＨドメインは、ＣＨ１と命名されている。ＶＨドメインとＶＬドメインは、フレームワーク領域と呼ばれる比較的保存されている配列の４つの領域からなる（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）。これらは、超可変配列の３つの領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）についての足場を形成する。ＣＤＲには、抗体の抗原との特異的相互作用を担っている残基のほとんどが含まれる。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。したがって、重鎖上のＣＤＲ構成成分は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と呼ばれ、一方、軽鎖上のＣＤＲ構成成分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と呼ばれる。ＣＤＲ３は、抗体結合部位の分子多様性の最大の供給源である。例えば、Ｈ３は、２つのアミノ酸残基のような短いものであっても、また、２６個よりも多いアミノ酸であってもよい。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造と三次元立体配置は当該分野で周知である。抗体構造の概要については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈａｒｌｏｗら編、１９８８を参照のこと。当業者は、個々のサブユニット構造（例えば、ＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、ＦＲ構造）に、Ｆｃ受容体および／または補体に結合し、そして／またはそれを活性化させる抗原（すなわち、結合断片）または例えば、ＣＨサブユニットの一部に結合する、活性のある断片（例えば、ＶＨ、ＶＬ、またはＣＤＲサブユニットの一部）が含まれることを理解するであろう。
抗体の多様性は、可変領域をコードする複数の生殖細胞系列の遺伝子と様々な体細胞事象の使用によって作成される。体細胞事象としては、完全なＶＨ領域を作成するための、多様性（Ｄ）および連結（Ｊ）遺伝子セグメントでの可変遺伝子セグメントの組み換えと、完全なＶＬ領域を作成するための可変遺伝子セグメントと連結遺伝子セグメントの組み換えが含まれる。組み換えプロセス自体は不明確であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部位でアミノ酸の欠失または付加が生じる。多様性のこれらの機構は、抗原暴露前の発達中のＢ細胞において起こる。抗原性刺激の後、Ｂ細胞中で発現された抗体遺伝子は体細胞変異を受ける。生殖細胞系列の遺伝子セグメントの数の概算、これらのセグメントのランダムな組み換え、およびランダムなＶＨ−ＶＬ対合に基づくと、１．６×１０７種類までの様々な抗体を産生することができる（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版（１９９３），Ｐａｕｌ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ編，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。抗体の多様性に関係している他のプロセス（例えば、体細胞変異）を考慮すると、１×１０１０種類を超える様々な抗体を作成することができると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，第２版，（１９９５）Ｊｏｎｉｏら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。多くのプロセスが抗体多様性を生じることに関係しているとの理由から、同じ抗原特異性を有している個別に導かれたモノクローナル抗体が同じアミノ酸配列を有していることはありそうにない。
用語「二量体化ポリペプチド」または「二量体化ドメイン」には、別のポリペプチドと二量体（またはさらに高次の複合体、例えば、三量体、四量体など）を形成する任意のポリペプチドが含まれる。状況に応じて、二量体化ポリペプチドは互いに同じ二量体化ポリペプチドと会合し、それによりホモ多量体を形成する。ＩｇＧ Ｆｃエレメントは、ホモ多量体を形成する傾向がある二量体化ドメインの一例である。状況に応じて、二量体化ポリペプチドは他のさまざまな二量体化ポリペプチドと会合し、それによってヘテロ多量体を形成する。ＪｕｎロイシンジッパードメインはＦｏｓロイシンジッパードメインとともに二量体を形成し、したがって、これはヘテロ多量体を形成する傾向がある二量体化ドメインの一例である。二量体化ドメインは、２５のヘテロ多量体およびホモ多量体の両方を形成することができる。
用語「ヒト抗体」には、Ｋａｂａｔらに記載されているヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域と定常領域を有している抗体が含まれる（Ｋａｂａｔら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照のこと）。本発明のヒト抗体には、例えば、ＣＤＲの中、および特定のＣＤＲ３の中の、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされるアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムなもしくは部位特異的突然変異誘発、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）が含まれ得る。変異は、好ましくは、本明細書中に記載される「選択的突然変異誘発アプローチ」を使用して導入される。ヒト抗体は、ヒトの生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基（例えば、活性を増大させるアミノ酸残基）で置き換えられた少なくとも１つの位置を有し得る。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列の一部ではないアミノ酸残基で置き換えられた２０個までの位置を有することができる。さらに、１０個まで、５個まで、３個まで、または２個までの位置が置き換えられる。これらの置換は、以下に詳細に記載されるようにＣＤＲ領域に含まれ得る。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用される場合は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲが、ヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むようには意図されない。
表現「組み換え体ヒト抗体」には、組み換え手段によって調製された、発現させられた、作成された、または単離されたヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え体発現ベクターを使用して発現させられた抗体（以下のセクションＩＩにさらに記載される）、組み換え体である組み合わせヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（以下のセクションＩＩＩにさらに記載される）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら、（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列になるようにスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製された、発現させられた、作成された、もしくは単離された抗体が含まれる。そのような組み換え体ヒト抗体は、ヒトの生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域を有している（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照のこと）。しかし、そのような組み換え体ヒト抗体は、インビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物が使用される場合には、インビボでの体細胞突然変異誘発）に供することができ、したがって、組み換え体抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関係するが、インビボでヒト抗体の生殖細胞系列レパートリーにおいては自然界には存在しない可能性がある配列である。しかし、特定の実施形態においては、そのような組み換え体抗体は、選択的突然変異誘発アプローチまたは逆変異、あるいはそれらの両方の結果であり得る。
「単離された抗体」には、様々な抗原特異性を有している他の抗体を実質的に含まない抗体が含まれる（例えば、ＲＡＧＥに特異的に結合する単離された抗体には、ｈＲＡＧＥ以外のＲＡＧＥに特異的に結合する抗体は実質的に含まれない）。ＲＡＧＥに特異的に結合する単離された抗体は、他の種に由来するＲＡＧＥ分子に結合する可能性がある。さらに、単離された抗体には、他の細胞性の物質および／または化合物は実質的には含まれない場合がある。
「中和抗体」（または「ＲＡＧＥ活性を中和する抗体」）には、ｈＲＡＧＥへのその結合によってｈＲＡＧＥの生物学的活性の調節が生じる抗体が含まれる。ｈＲＡＧＥの生物学的に活性のこの調節は、ｈＲＡＧＥの生物学的活性の１つ以上の指標（例えば、ヒトＲＡＧＥ受容体結合アッセイにおける受容体への結合の阻害）を測定することによって評価することができる（例えば、実施例６および７を参照のこと）。ｈＲＡＧＥの生物学的活性についてのこれらの指標は、当該分野で公知のインビトロまたはインビボでのアッセイにおいていくつかの基準のうちの１つ以上によって評価することができる（例えば、実施例６および７を参照のこと）。
ヒト以外（例えば、マウス）の抗体の「ヒト化」形態は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小配列が含まれているキメラ抗体である。ほとんどの部分については、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、その中では、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望される特異性、親和性、および能力を有している、マウス、ラット、ウサギ、またはヒト以外の霊長類のようなヒト以外の種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基によって置き換えられている。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応するヒト以外の残基によって置き換えられる。さらに、ヒト抗体には、レシピエント抗体の中、またはドナー抗体の中には見られない残基が含まれる場合もある。これらの修飾は、抗体の能力をさらに高めるために行われる。一般的には、ヒト化抗体には、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てが含まれるであろう。その中では、ヒト以外の免疫グロブリンの超可変領域に対応する超可変領域の全てまたは実質的に全てと、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体には、状況に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域）の少なくとも一部も含まれるであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
用語「活性」には、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性（例えば、ＲＡＧＥに結合する抗ＲＡＧＥ抗体）、および／または抗体の中和能力（例えば、ｈＲＡＧＥへのその結合によって、ヒトＲＡＧＥ受容体結合アッセイにおける受容体結合の阻害のようにＲＡＧＥの生物学的活性を阻害する抗ｈＲＡＧＥ抗体）のような活性が含まれる。
「発現構築物」は、適切な宿主細胞の中で発現させることができる核酸タンパク質またはポリペプチドの発現を媒介するために十分な、発現させることができる核酸と調節エレメントが含まれている任意の組み換え体核酸である。
用語「融合タンパク質」および「キメラタンパク質」は互いに置き換えることができ、そして、２つ以上のタンパク質に由来するアミノ酸配列に対応する部分を有しているアミノ酸配列を有するタンパク質あるいはポリペプチドをいう。２つ以上のタンパク質に由来する配列は、タンパク質全体であっても、またタンパク質の一部（すなわち、断片）であってもよい。融合タンパク質はまた、タンパク質のアミノ酸に対応する部分の間に、アミノ酸の連結領域を有している場合もある。そのような融合タンパク質は、組み換え方法によって調製することができる。この場合、対応する複数の核酸がヌクレアーゼとリガーゼでの処理によって連結され、発現ベクターに組み込まれる。融合タンパク質の調製は、一般的には、当業者に理解されている。
用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、そして適切な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドをいう。この用語にはまた、等価物、ヌクレオチドアナログから作成されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのアナログも含まれ、さらに、記載される一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドである実施形態にも同様に適用することができると理解されるはずである。
用語「同一である割合（％）」または「パーセント同一性」は、２つのアミノ酸配列の間、または２つのヌクレオチド配列の間での配列同一性をいう。パーセント同一性は、比較の目的のためにアラインメントすることができるそれぞれの配列の中の位置を比較することによって決定することができる。同一性の割合（％）としての表現は、比較される配列によって共有される位置にある同じアミノ酸または核酸の数の関数をいう。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＥＮＴＲＥＺを含む様々なアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを使用することができる。ＦＡＳＴＡとＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の一部として利用でき、そして例えば、デフォルト設定で使用することができる。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．から入手することができる。２つの配列のパーセント同一性は、１のギャップ重量を用いてＧＣＧプログラムによって決定することができる。例えば、個々のアミノ酸ギャップは、２つの配列の間に１つのアミノ酸またはヌクレオチドの不適合が存在しているかのように計算され得る。
アラインメントのための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第２６６巻：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．編，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡに記載されている。配列の中にギャップを許容するアラインメントプログラムが、配列をアラインメントするために使用されることが好ましい。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントの中にギャップを許容するアルゴリズムのうちの１タイプである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｖｉｏｌｓ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照のこと。また、Ｎｅｅｄｌｅｎａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアラインメント法を使用するＧＡＰ Ｉプログラムも、配列をアラインメントするために利用することができる。別の検索ストラテジーでは、ＭＰＳＲＣＨソフトウェアが使用される。これは、ＭＡＳＰＡＲコンピューター上で実行される。ＭＰＳＲＣＨは、大量の並列するコンピューター上で配列５をスコアするためにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する。このアプローチにより、遠い関係にある適合を拾い上げる能力が改善され、これは、小さいギャップ、およびヌクレオチド配列の誤りに特に寛容である。核酸によってコードされるアミノ酸配列は、タンパク質とＤＮＡデータベースの両方を検索するために使用することができる。
用語「ポリペプチド」と「タンパク質」は、本明細書中では互換的に使用される。
「ＲＡＧＥ」タンパク質は、当該分野で公知であるように、「糖化最終産物の受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」である。代表的なＲＡＧＥタンパク質は図１Ａ〜１Ｃに示される。ＲＡＧＥタンパク質には、可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）と内因性の分泌型ＲＡＧＥ（ｅｓＲＡＧＥ）が含まれる。内因性の分泌型ＲＡＧＥは、細胞の外側に放出され、ここでＡＧＥリガンドに結合してＡＧＥ作用を中和することができる、ＲＡＧＥスプライシング変異体である。例えば、Ｋｏｙａｍａら、ＡＴＶＥ，２００５；２５：２５８７−２５９３を参照のこと。逆相関が、ヒトの血漿ｅｓＲＡＧＥとメタボリックシンドロームのいくつかの構成要素（ＢＭＩ、インシュリン抵抗性、ＢＰ、高トリグリセリド血症、およびＩＧＴ）との間で観察されている。血漿ｅｓＲＡＧＥレベルはまた、糖尿病の被験体または糖尿病ではない被験体において、頚動脈と大腿動脈のアテローム性動脈硬化症（超音波によって定量される）とも逆相間している。さらに、血漿ｅｓＲＡＧＥレベルは、年齢が一致している健常な対照よりも、血管造影法によって冠動脈疾患が証明されている糖尿病ではない患者においては優位に低い。
「糖化最終産物の受容体のリガンド結合エレメント」または「ＲＡＧＥ−ＬＢＥ」（本明細書中では、「ＲＡＧＥ−Ｆｃ」および「ＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐ」とも呼ばれる）には、ＲＡＧＥリガンドに結合する能力を維持している膜貫通ＲＡＧＥポリペプチドの任意の細胞外部分およびその断片が含まれる。この用語にはまた、ＲＡＧＥポリペプチドと少なくとも８５％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％の同一性、または、さらに好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有しているポリペプチド、例えば、それに対してＲＡＧＥリガンドまたはＲＡＧＥ−ＢＰが結合するであろうヒトまたはマウスのポリペプチドも含まれる。
「糖化最終産物の受容体結合パートナー」または「ＲＡＧＥ−ＢＰ」には、ＲＡＧＥタンパク質の細胞外部分（例えば、ＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ−ＬＢＥのような受容体ポリペプチド）に対して生理学的設定において結合する任意の物質（例えば、ポリペプチド、低分子、炭水化物構造など）が含まれる。
「ＲＡＧＥ関連障害」または「ＲＡＧＥが関係している障害」には、罹患した細胞または組織が、ＲＡＧＥもしくは１つ以上のＲＡＧＥリガンドの発現および／または活性の増大あるいは低下を示す任意の障害が含まれる。ＲＡＧＥ関連障害にはまた、ＲＡＧＥ機能の低下（例えば、ＲＡＧＥ：ＲＡＧＥ−ＢＰ相互作用を破壊する物質の投与を含む）によって処置することができる（すなわち、１つ以上の兆候を排除するかまたは緩和することができる）任意の障害が含まれる。
「ＲＡＧＥのＶドメイン」は、Ｎｅｅｐｅｒら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＲＡＧＥ：ａ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４９９８−１５００４（１９９２）（その内容は引用により本明細書中に組み入れられる）の図５に示されているような、免疫グロブリン様可変ドメインをいう。Ｖドメインには、配列番号１および配列番号３に示される１位から１２０位までのアミノ酸が含まれる。
ヒトＲＡＧＥのｃＤＮＡは１４０６塩基対であり、４０４アミノ酸の成熟タンパク質をコードする。Ｎｅｅｐｅｒら、１９９２の図３を参照のこと。
用語「組み換え体核酸」には、自然界においては一緒には存在しない少なくとも２つの配列が含まれている任意の核酸が含まれる。組み換え体核酸は、例えば、分子生物学の方法を使用することによってインビトロで、または例えば、相同組み換えもしくは非相同組み換えによる新規の染色体位置での核酸の挿入によってインビボで作成することができる。
被験体に関する用語「処置する」は、被験体の疾患または障害の少なくとも１つの兆候を改善させることをいう。処置は、疾患もしくは症状の治癒である場合も、また、その改善である場合もある。
用語「ベクター」はそれに対して連結させられている別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。ベクターの１つのタイプはエピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。ベクターの別のタイプは、宿主細胞の遺伝的材料と組代わるように設計された組み込みベクターである。ベクターは、自律複製するもの、および組み込み型のもののいずれでもあり得、そしてベクターのレパートリーは細胞の状況に応じて様々であり得る（すなわち、ベクターは、１つの宿主細胞のタイプの中では自律複製することができ、そして別の宿主細胞のタイプの中では純粋な組み込み型であり得る）。それらが動作可能であるように連結させられる発現可能な核酸の発現を指示することができるベクターは、本明細書中では「発現ベクター」と呼ばれる。
「特異的免疫反応性」は、抗体が特異的なペプチド配列と相互作用する場合の、特定のペプチド配列に対する化合物［抗体］の優先的結合をいう。
表現「有効量」は、本明細書中で使用される場合は、動物においていくらかの所望される効果を生じるために有効である、１つ以上の薬剤、物質、または本発明の１つ以上の薬剤が含まれている組成物の量を意味する。薬剤が治療効果を得るために使用される場合には、「有効量」を含む実際の用量は、処置される特定の症状、疾患の重篤度、患者の大きさおよび健康状態、投与経路等多数の条件に応じて変化するであろう。熟練した医師であれば、医学の分野で周知である方法を使用して適切な用量を容易に決定できる。
表現「薬学的に許容される」は、本明細書中では、合理的な利点／リスク比に見合う、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなくヒトおよび動物の組織と接触させる使用に適している、適正な医学的判断の範囲である、そのような化合物、材料、組成物、および／または投薬形態をいうように使用される。
表現「薬学的に許容される担体」は、本明細書中で使用される場合は、１つの臓器または体の一部から、別の臓器または体の部分への本発明の物質の保持または輸送に関係している、薬学的に許容される物質、組成物、または媒体（例えば、液体もしくは固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料）を意味する。個々の担体は、処方物の他の成分と適合する意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体となり得る物質のいくつかの例としては以下が挙げられる。（１）糖（例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース）；（２）デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、およびジャガイモデンプン）；（３）セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース）；（４）粉末状トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤（例えば、ココアバター、および坐剤用ワックス）；（９）油（例えば、ピーナッツ油、菜種油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油）；（１０）グリコール（例えば、プロピレングリコール）；（１１）ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール）；（１２）エステル（例えば、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル）；（１３）寒天；（１４）緩衝剤（例えば、水酸化マグネシウム、および水酸化アルミニウム）；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質が含まれていない水；（１７）等張性生理食塩水、（１８）Ｒｉｎｇｅｒ溶液、（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；ならびに、（２１）薬学的処方物において使用される他の毒性がない適合性の物質。
モノクローナル抗体の調製
哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、またはウサギ）は、全長のタンパク質もしくはその断片、または、全長のタンパク質もしくはその断片をコードするｃＤＮＡ、ペプチドの免疫原性の形態で免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技術としては、担体への結合、または当該分野で周知の他の技術が挙げられる。ポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニターすることができる。標準的なＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイを、抗体のレベルを評価するための抗原としての免疫原とともに使用することができる。
本発明のポリペプチドの抗原性調製物での動物の免疫化の後、抗血清を得ることができ、所望される場合には、血清からポリクローナル抗体が単離される。モノクローナル抗体を産生するためには、抗体を生産する細胞（リンパ球）を免疫化した動物から回収し、そして骨髄腫細胞のような不死化細胞を用いる標準的な体細胞融合手順によって融合させて、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。そのような技術は当該分野で周知であり、これには例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７によって最初に開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）が含まれる。ハイブリドーマ細胞は、ＲＡＧＥポリペプチドのエピトープと特異的に反応する抗体の生産のために、免疫化学的にスクリーニングすることができ、そのようなハイブリドーマ細胞が含まれている培養物からモノクローナル抗体が単離される。
ヒト化
キメラ抗体には、少なくとも２つの異なる種に由来する配列が含まれる。一例として、組み換えクローニング技術を使用して、様々な領域（ヒト以外の抗体、すなわち抗原で免疫化されたヒト以外の種の中で調製された抗体に由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリン由来の定常領域を含む）を含めることができる。
ヒト化抗体はキメラ抗体の１つのタイプである。ここでは、抗原結合を担う可変領域の残基（すなわち、相補性決定領域の残基（相補性決定領域と略される）、または抗原結合に関与している任意の他の残基）はヒト以外の種に由来し、一方、残りの可変領域の残基（すなわち、フレームワーク領域の残基）と定常領域は、少なくとも一部、ヒト抗体の配列に由来する。ヒト化抗体のフレームワーク領域の残基と定常領域の残基のサブセットは、ヒト以外の供給源に由来する場合もある。ヒト化抗体の可変領域はまた、ヒト化（すなわち、ヒト化された軽鎖または重鎖可変領域）とも記載される。ヒト以外の種は、通常、抗原での免疫化に使用されるものであり、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト以外の霊長類、または他のヒト以外の哺乳動物種である。ヒト化抗体は、通常は、伝統的なキメラ抗体よりも免疫原性が低く、ヒトへの投与後に改善された安定性を示す。例えば、Ｂｅｎｉｎｃｏｓａら、（２０００）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９２：８１０−６；Ｋａｌｏｆｏｎｏｓら、（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３０Ａ：１８４２−５０；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１７：１１０−５を参照のこと。
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原結合に関与している抗体の可変領域の残基である。ＣＤＲを特定するためのいくつかの番号付けシステムが一般的に使用されている。Ｋａｂａｔの定義は、配列の可変性に基づき、そしてＣｈｏｔｈｉａの定義は、構造上のループ領域の位置に基づく。ＡｂＭの定義は、ＫａｂｏｔとＣｈｏｔｈｉａのアプローチの間の妥協案である。軽鎖可変領域のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｂＭアルゴリズムにしたがうと、２４位から３４位（ＣＤＲ１−Ｌ）、５０位から５６位（ＣＤＲ２−Ｌ）、そして８９位から９７位（ＣＤＲ３−Ｌ）の残基に結合される。Ｋａｂａｔの定義に従うと、重鎖可変領域のＣＤＲは、３１位から３５Ｂ位（ＣＤＲ１−Ｈ）、５０位から６５位（ＣＤＲ２−Ｈ）、そして９５位から１０２位（ＣＤＲ３−Ｈ）（Ｋａｂａｔの番号付け）の残基に結合される。Ｃｈｏｔｈｉａの定義にしたがうと、重鎖可変領域のＣＤＲは、２６位から３２位（ＣＤＲ１−Ｈ）、５２位から５６位（ＣＤＲ２−Ｈ）、そして９５位から１０２位（ＣＤＲ３−Ｈ）（Ｃｈｏｔｈｉａの番号付け）の残基によって結合される。ＡｂＭの定義にしたがうと、重鎖可変領域のＣＤＲは、２６位から３５Ｂ位（ＣＤＲ１−Ｈ）、５０位から５８位（ＣＤＲ２−Ｈ）、そして９５位から１０２位（ＣＤＲ３−Ｈ）（Ｋａｂａｔの番号付け）の残基によって結合される。Ｍａｒｔｉｎら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９２６８−９２７２；Ｍａｒｔｉｎら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１−１５３；Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ １：１２６；およびＲｅｅｓら、（１９９６）Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（編），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１４１−１７２頁を参照のこと。
本明細書中で使用される場合には、用語「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔによる、またはＣｈｏｔｈｉａによるかのいずれかで定義されたＣＤＲをいう。さらに、本発明のヒト化抗体可変性は、Ｋａｂａｔによって定義される１つ以上のＣＤＲを含み、そしてＣｈｏｔｈｉｃによって定義される１つ以上のＣＤＲをも含むように構築することができる。
特異性決定領域（ＳＤＲ）は、抗原と直接相互作用するＣＤＲの中の残基である。ＳＤＲは、超可変性の残基に対応する。（Ｐａｄｌａｎら、（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−１３９）を参照のこと。
フレームワーク残基は、超可変性残基またはＣＤＲ残基以外の抗体の可変性領域の残基である。フレームワーク残基は、自然界に存在しているヒト抗体に由来し得、例えば、本発明の抗ＲＡＧＥ抗体のフレームワーク領域と実質的に類似しているヒトフレームワークである。個々の配列の間でコンセンサスを示す人工的なフレームワーク配列もまた使用することができる。ヒト化のためにフレームワーク領域が選択される場合には、ヒトにおいて広く示される配列が、あまり多くない配列よりも好ましいであろう。ヒトフレームワークアクセプター配列のさらなる変異を、抗原の接触に関係していると考えられるマウス残基、および／または抗原結合部位の構造的完全性に関係している残基を回復させるために、あるいは抗体発現を改善するために作成することができる。ペプチド構造の予想を、ヒト化設計によって導入された翻訳後タンパク質修飾部位を特定し、回避するために、ヒト化された可変性の重鎖および軽鎖領域配列を分析するために使用することができる。
ヒト化抗体は、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）の移植、短縮型ＣＤＲの移植、特異性決定領域（ＳＤＲ）の移植、およびＦｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎアセンブリを含む様々な方法のうちの任意の１つを使用して、以下に記載されるように調製することができる。ヒト化抗体にはまた、１つ以上の変化がＣＤＲの中に導入されている超ヒト化抗体も含まれる。例えば、ヒト残基で、ＣＤＲの中のヒト以外の残基を置換することができる。これらの一般的なアプローチは、任意の所望される配列の抗ＲＡＧＥ抗体を産生するために、標準的な突然変異誘発および合成技術と組み合わせることができる。
ベニヤリングは、ヒトアミノ酸配列で抗体の溶媒と接触することができる外側に再度表面をつくることによって、齧歯類または他のヒト以外の抗体の中の潜在的な免疫原性アミノ酸配列を減らすという概念に基づく。したがって、ベニヤリングされた抗体（ｖｅｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、修飾されていないヒト以外の抗体よりもヒト細胞に対して異質性が低い（ｌｅｓｓ ｆｏｒｅｉｇｎ）ようである。Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−９８を参照のこと。ヒト以外の抗体は、ヒト抗体のフレームワーク領域の中の同じ位置の残基とは異なるヒト以外の抗体の中の露呈している外部フレームワーク領域の残基を特定すること、およびヒト抗体の中のこれらの同じ位置を通常占めているアミノ酸での特定された残基の置き換えによってベニヤリングされる。
ＣＤＲの移植は、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体または所望されるフレームワーク残基を含む他の抗体）の１つ以上のＣＤＲを、ドナー抗体（例えば、ヒト以外の抗体）のＣＤＲで置き換えることによって行われる。アクセプター抗体は候補のアクセプター抗体とドナー抗体の間でのフレームワーク残基の類似性に基づいて選択することができる。例えば、Ｆｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎのアプローチにしたがうと、ヒトフレームワーク領域は、関連するヒト以外の抗体の個々のフレームワーク領域に対して実質的な配列相同性を有しているとして同定され、そしてヒト以外の抗体のＣＤＲは、異なるヒトフレームワーク領域の構成材料の上に移植される。本発明の抗体の調製に有用な関連する方法はまた、米国特許出願公開番号２００３／００４０６０６にも記載されている。
短縮型ＣＤＲの移植は関連するアプローチである。短縮型ＣＤＲには、特異性決定残基と隣接するアミノ酸が含まれ、これには、軽鎖の２７ｄ〜３４位、５０〜５５位、および８９〜９６位と、重鎖の３１〜３５ｂ位、５０〜５８位、および９５〜１０１位の残基が含まれる（Ｋａｂａｔら、（１９８７）の番号付けの慣習））。（Ｐａｄｌａｎら、（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−９）を参照のこと。特異性決定残基（ＳＤＲ）の移植は、抗体結合部位の結合特異性と親和性が、個々の相補性決定領域（ＣＤＲ）の中の最も高度に可変性である残基によって決定されるとの理解を前提とする。利用することができるアミノ酸配列のデータの分析と組み合わせた抗体−抗原複合体の三次元構造の分析を、ＣＤＲの中の個々の位置で起こるアミノ酸残基の構造的相違に基づいて配列可変性をモデル化するために使用することができる。ＳＤＲは、接触残基からなる最も小さい免疫原性ポリペプチド配列として同定される。Ｐａｄｌａｎら、（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−１３９を参照のこと。
ＣＤＲまたは短縮型ＣＤＲの移植のためのアクセプターフレームワークは、所望される残基を導入するためにさらに修飾することができる。例えば、アクセプターフレームワークには、ヒトサブグループＩのコンセンサス配列の重鎖可変領域が、状況に応じて、１、２８、４８、６７、６９、７１、および９３位の１つ以上にあるヒト以外のドナー残基とともに含まれ得る。別の例としては、ヒトアクセプターフレームワークには、ヒトサブグループＩコンセンサス配列の軽鎖可変領域が、状況に応じて、２、３、４、３７、３８、４５、および６０位の１つ以上にあるヒト以外のドナー残基とともに含まれ得る。移植後、さらなる変化を、抗体結合と機能性を最適化させるために、ドナー配列および／またはアクセプター配列の中に作成することができる。例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９１／０９９６７を参照のこと。
ヒト化抗ＲＡＧＥ抗体を調製するために使用することができる重鎖可変領域のヒトフレームワークとしては、ＤＰ−７５、ＤＰ５４、ＤＰ−５４、ＦＷ ＶＨ ３ ＪＨ４、ＤＰ−５４ ＶＨ３ ３−０７、ＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７（ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３、ならびにＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）のフレームワーク残基が挙げられる。
ヒト化抗ＲＡＧＥ抗体を調製するために使用することができる軽鎖可変領域のヒトフレームワークとしては、ヒト生殖細胞系列クローンＤＰＫ２４、ＤＰＫ−１２、ＤＰＫ−９、Ｖｋ１、ＤＰＫ−９ Ｊｋ４、ＤＰＫ９ Ｖｋ１ ０２、ならびに生殖細胞系列クローンのサブグループＶκＩＩＩおよびＶκＩのフレームワーク残基が挙げられる。ＤＰＫ２４生殖細胞系列の以下の変異によっては、抗体の発現が増大し得る。すなわちＦ１０Ｓ、Ｔ４５Ｋ、Ｉ６３Ｓ、Ｙ６７Ｓ、Ｆ７３Ｌ、およびＴ７７Ｓである。
本発明の代表的なヒト化抗ＲＡＧＥ抗体としては、配列番号１６〜２７から選択される可変領域アミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲを有している抗体が挙げられる。例えば、ヒト化ＲＡＧＥ抗体には、配列番号１６、１８、２１、２４、２０、および２６のいずれか１つの重鎖可変領域、あるいは、配列番号１７、１９、２２、２５、２３、および２７のいずれか１つの軽鎖可変領域のＣＤＲから選択される２つ以上のＣＤＲが含まれ得る。ヒト化抗ＲＡＧＥ抗体にはまた、配列番号１６、１８、２１、２４、２０、および２６のいずれか１つの２つまたは３つのＣＤＲを有している可変領域が含まれている重鎖と、配列番号１７、１９、２２、２５、２３、および２７のいずれか１つの２つまたは３つのＣＤＲを有している可変領域が含まれている軽鎖もまた含まれ得る。
本発明のヒト化抗ＲＡＧＥ抗体は、第１の鎖の可変領域（すなわち、軽鎖可変領域または重鎖可変領域）がヒト化されており、そして第２の鎖の可変領域はヒト化されていない（すなわち、ヒト以外の種において生産される抗体の可変領域）状態で構築することができる。ここでは、これらの抗体は、半ヒト化抗体と呼ばれるヒト化抗体の１つのタイプである。
キメラおよびヒト化抗ＲＡＧＥ抗体の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびそれらの任意のイソ型（例えば、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４イソ型）のいずれか１つの定常領域に由来し得る。多くの抗体定常領域のアミノ酸配列が公知である。ヒトイソ型の選択と、そのイソ型の中の特定のアミノ酸の修飾によって、宿主防御機構の活性化を促進または排除することができ、そして抗体の生体内分布を変化させることができる。（Ｒｅｆｆら、（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ９：１５２−６６）を参照のこと。免疫グロブリン定常領域をコードする配列のクローニングのためには、イントロン配列が欠失させられる場合がある。
キメラおよびヒト化抗ＲＡＧＥ抗体は、当該分野で公知の標準的な技術を使用して構築することができる。例えば、可変領域は、可変領域をコードする重複しているオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングさせること、そしてヒト抗体定常領域を含む発現ベクターの中にそれらを連結させることによって調製することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、および米国特許第４，１９６，２６５号；同第４，９４６，７７８号；同第５，０９１，５１３号；同第５，１３２，４０５号；同第５，２６０，２０３号；同第５，６７７，４２７号；同第５，８９２，０１９号；同第５，９８５，２７９号；同第６，０５４，５６１号を参照のこと。ホモ二量体とヘテロ二量体を含む２つの完全な四量体抗体が含まれている４価抗体（Ｈ４Ｌ４）は、例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０２／０９６９４８に記載されているように調製することができる。抗体二量体はまた、ヘテロ二官能性架橋リンカーの使用によって（Ｗｏｌｆｆら、（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−５）、または二重定常領域を含めるための組み換え生産によって（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、（１９８９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．３：２１９−３０）、抗体定常領域の中へのシステイン残基（単数または複数）の導入によって（これは、鎖間ジスルフィド結合の形成を促進する）調製することもできる。本発明の抗体の抗原結合断片は、例えば、短縮型の抗体配列の発現によって、または全長の抗体の翻訳後消化によって、調製することができる。
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体の変異体は、様々な変化、置換、挿入、および欠失を含むように容易に調製することができる。例えば、抗体配列は、抗体の発現のために使用される細胞タイプの中でのコドン使用頻度について最適化することができる。抗体の血清半減期を増大させるためには、サルベージ受容体結合エピトープ（ｓａｌｖａｇｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ）を、まだ存在していない場合には、抗体重鎖配列の中に取り込ませることができる。米国特許第５，７３９，２７７号を参照のこと。抗体の安定性を高めるためのさらなる修飾には２４１位にあるセリンをプロリンで置き換えるＩｇＧ４の修飾が含まれる。Ａｎｇａｌら、（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８を参照のこと。他の有用な変化としては、抗体を薬物と結合させることにおける効率を最適化させるために必要な置換が挙げられる。例えば、抗体は、薬物の結合のためのアミノ酸を含めるために、そのカルボキシル末端で修飾することができる。例えば、１つ以上のシステイン残基を付加することができる。定常領域は、炭水化物または他の部分の結合のための部位を導入するように修飾することができる。
さらなる抗体変異体には機能的特性の改善を生じるグリコシル化イソ型が含まれる。例えば、Ｆｃグリコシル化の修飾によっては、エフェクター機能の変化（例えば、Ｆｃγ受容体に対する結合の増大、およびＡＤＣＣの改善）を生じさせることができ、そして／あるいは、Ｃ１ｑ結合およびＣＤＣを減少させることができる（例えば、複合体形態から高マンノース型またはハイブリッド型へのＦｃオリゴ糖の変化により、Ｃ１ｑ結合およびＣＤＣが減少し得る（例えば、Ｋａｎｄａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７：１７：１０４−１１８を参照のこと））。修飾は、細菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を生体操作することによって行うことができる。これはまた、遺伝子操作された生物のタンパク質または自然界に存在している産物のグリコシル化経路を操作することによって行うこともできる。グリコシル化はまた、糖−結合酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）が広範囲の様々な物質を寛容化するライブラリーを開発することによっても変化させることができる。最後に、当業者は、様々な化学的アプローチによって、低分子、酵素、タンパク質の連結、代謝生体工学、または完全な合成を用いて、タンパク質および自然界に存在している産物をグリコシル化することができる。Ｎ−グリカンのプロセシングの適切な低分子阻害剤の例としては、カスタノスペルミン（Ｃａｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）（ＣＳ）、キフネンシン（Ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ）（ＫＦ）、デオキシマンノジリマイシン（Ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）（ＤＭＪ）、スワインソニン（Ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ）（Ｓｗ）、モネンシン（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）（Ｍｎ）が挙げられる。
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体の変異体は、部位特異的突然変異誘発または組み換えクローニングを含む標準的な組み換え技術を使用して生産することができる。抗ＲＡＧＥ抗体の多様化したレパートリーは、ヒト以外のトランスジェニック動物において、遺伝子の配置および遺伝子の変換の方法によって調製することができる（米国特許公開番号２００３／００１７５３４）。これは次いで、機能的アッセイを使用して関連する活性について試験される。本発明の特定の実施形態においては、変異体は、ＣＤＲを変異させるための親和性成熟プロトコール（Ｙａｎｇら、（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３）、鎖のシャッフリング（Ｍａｒｋｓら、（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１０：７７９−７８３）、大腸菌の突然変異誘発因子株の使用（Ｌｏｗら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０：３５９−３６８）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら、（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−７３３）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：７７−８８）、およびセクシュアルＰＣＲ（ｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ）（Ｃｒａｍｅｒｉら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１）を使用して得られる。免疫療法での適用のためには、関連する機能アッセイには、本明細書中で以下に記載されるように、ヒトＲＡＧＥ抗原への特異的結合、抗体のインターナライゼーション、そして、腫瘍を有している動物に投与される場合には腫瘍部位（単数または複数）への標的化が含まれる。
本発明によってはさらに、本発明の抗ＲＡＧＥ抗体を発現する細胞および細胞株が提供される。代表的な宿主細胞としては、哺乳動物およびヒトの細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。異種構築物の宿主細胞への形質転換後に安定な細胞株を作成するための方法は当該分野で公知である。代表的な哺乳動物以外の宿主細胞としては昆虫細胞が挙げられる（Ｐｏｔｔｅｒら、（１９９３）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２−３）：１０３−１１２）。抗体はまた、トランスジェニック動物の中で（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（６）：６２５−６２９）、およびトランスジェニック植物の中で（Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇら、（２００３）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０（３）：４３３−４５）生産させることもできる。
上記で議論されたように、例えば、抗体の他の部分（例えば、定常領域）が欠失させられる、付加される、または置換されることにより修飾されているモノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体もまた、本発明の範囲に含まれる。例えば、抗体は以下のように修飾することができる。すなわち、（ｉ）定常領域を欠失させること、（ｉｉ）定常領域を別の定常領域（例えば、生存期間、抗体の安定性もしくは親和性を増大させることを意図する定常領域、または別の種もしくは抗体のクラスに由来する定常領域）で置き換えること、あるいは（ｉｉｉ）例えば、グリコシル化部位の数、エフェクター細胞機能、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、補体結合などを変化させるために定常領域の中の１つ以上のアミノ酸を修飾することによる。
抗体の定常領域を変化させるための方法は当該分野で公知である。機能が変化した（例えば、細胞上のＦｃＲまたは補体のＣ１構成成分のようなエフェクターリガンドに対する親和性が変化した）抗体は、様々な残基で抗体の定常部分の少なくとも１つのアミノ酸残基を置き換えることによって産生することができる（例えば、ＥＰ３８８，１５１ Ａ１；ＵＳ５，６２４，８２１、およびＵＳ５，６４８，２６０を参照のこと。これらの全ての内容は引用により本明細書中に組み入れられる）。同様のタイプの変更は、マウスまたは他の種に対して適用された場合には、免疫グロブリンがこれらの機能を低下させるかまたは排除することが記載され得る。
例えば、特定の残基（単数または複数）を、その側鎖上に適切な機能性を有している残基（単数または複数）で置き換えることによって、あるいは、電荷を有している官能基（例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸）またはおそらくは、芳香族非極性残基（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、もしくはアラニン）を導入することによって、ＦｃＲ（例えば、ＦｃγＲ１）に対する、またはＣ１ｑの結合に対する、抗体（例えば、ヒトＩｇＧのようなＩｇＧ）のＦｃ領域の親和性を変化させることが可能である（例えば、ＵＳ５，６２４，８２１を参照のこと）。
抗体またはその結合断片は、細胞毒素、治療薬、または放射活性金属イオンと結合させることができる。１つの実施形態においては、結合されるタンパク質は抗体またはその断片である。細胞毒素または細胞傷害性物質には、細胞に対して有害である任意の物質が含まれる。限定ではない例としては以下が挙げられる。すなわち、カリカエミシン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、およびそれらのアナログまたはホモログである。治療薬としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、および５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−白金ジクロロジアミン（ＩＩ）（ｃｉｓ−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉａｍｉｎｅ ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ））（ＤＤＰ）、シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン）、ならびに抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）である。そのような部分をタンパク質に結合させるための技術は当該分野で周知である。
あるいは、免疫化されると、内因性の免疫グロブリンの生産がない状態で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作成することが、現在可能である。例えば、キメラである生殖細胞系列変異体マウスでの抗体重鎖結合領域（ＪＭ）遺伝子の相同欠失によって、内因性の抗体の生産の完全な阻害が生じることが記載されている。ヒトの生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子アレイのそのような生殖細胞系列変異体マウスへの導入によっては、抗原でチャレンジされると、ヒト抗体の生産が生じるであろう。例えば、Ｊａｃｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｅ，７：３３（１９８３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８（１９９２）を参照のこと。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから誘導することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３０９（１９９６））。
特定の実施形態においては、本発明の抗体は、併用療法の一部として他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、炎症症状の場合には、本発明の抗体は、炎症性疾患または症状の処置において有用な１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。実質的な炎症性の構成成分を有していると考えられる心臓血管疾患の症状、そして特に、アテローム斑によって生じる心臓血管疾患の症状の場合には、本発明の抗体は、心臓血管疾患の処置に有用な１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。ガンの場合には、本発明の抗体は、１つ以上の抗血管形成因子、化学療法薬と組み合わせて、または放射線治療に対するアジュバントとして投与することができる。本発明の抗体の投与が、多くの様々なガン治療薬を組み合わせることができるガンの処置レジュメの一部となるであろうことがさらに予想される。ＩＢＤの場合には、本発明の抗体は、１つ以上の抗炎症薬とともに投与することができ、そしてさらに、改良された食事療法のレジュメと組み合わせられる場合もある。
ＲＡＧＥ−ＬＢＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を阻害するための方法
本発明には、ＲＡＧＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を阻害するか、またはＲＡＧＥ活性を調節するための方法が含まれる。好ましくは、そのような方法は、ＲＡＧＥが関係している障害を処置するために使用される。
そのような方法には、本明細書中に開示されるような、ＲＡＧＥに対して惹起させられた抗体を投与する工程が含まれ得る。そのような方法には、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有しているＲＡＧＥタンパク質の１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗体を投与する工程が含まれる。なお別の実施形態においては、そのような方法には、１つ以上のＲＡＧＥ−ＢＰに対するＲＡＧＥの結合を阻害する化合物を投与する工程が含まれる。そのような化合物を同定するための例示的な方法が以下で議論される。
特定の実施形態においては、相互作用は、インビトロで、例えば、精製されたタンパク質、細胞、生物学的試料、組織、人工組織などが含まれている反応混合物の中で阻害される。特定の実施形態においては、相互作用は、インビボで、例えば、ＲＡＧＥまたはそのＲＡＧＥ結合断片に結合する抗体を投与することによって阻害される。抗体またはその断片は、ＲＡＧＥに結合し、ＲＡＧＥ−ＢＰの結合を阻害する。
本発明には、ＲＡＧＥとＲＡＧＥ−ＢＰとの間の相互作用を阻害すること、またはＲＡＧＥ活性を調節することによって、ＲＡＧＥ関連障害を予防あるいは処置するための方法が含まれる。そのような方法には、相互作用を阻害するために有効な量で、そして上記障害を予防または処置するために十分な時間の間、ＲＡＧＥに対する抗体を投与する工程が含まれる。
核酸
核酸は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および１本鎖、２本鎖、または３本鎖の形態のそれらのポリマーである。具体的に限定されない限りは、核酸には、参照の自然界に存在している核酸と類似する特性を有している自然界に存在しているヌクレオチドの公知のアナログが含まれ得る。核酸には、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＲＮＡが含まれる。核酸は合成される場合も、また、任意の生物を含む任意の生物学的供給源から導かれる場合もある。
本発明の代表的な核酸には、ヒヒ、カニクイザル、およびウサギのＲＡＧＥをコードする開示されているｃＤＮＡに対応する配列番号６、８、１０、１２のいずれか１つに示されているか、あるいは、ヒヒＲＡＧＥをコードするゲノムＤＮＡ配列に対応する配列番号１５に示されている、ＲＡＧＥをコードするヌクレオチド配列が含まれる。本発明の核酸にはまた、配列番号１６〜４９に示される抗体可変領域のアミノ酸配列のうちのいずれかをコードするヌクレオチド配列も含まれる。
本発明の核酸にはまた、配列番号６、８、１０、１２、および１５のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一であるヌクレオチド配列を含む、配列番号６、８、１０、１２、および１５のいずれか１つと実質的に同じであるヌクレオチド配列も含まれ得る。
本発明の核酸にはまた、配列番号７、９、１１、および１３のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一であるヌクレオチド配列を含む、配列番号７、９、１１、および１３に示されるアミノ酸配列のうちのいずれかと実質的に同じであるアミノ酸配列を有しているＲＡＧＥタンパク質をコードするヌクレオチド配列も含まれ得る。
本発明の核酸にはまた、配列番号１６〜４９のいずれか１つに対して少なくとも８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、配列番号１６〜４９に示されるアミノ酸配列のうちのいずれかと実質的に同じであるアミノ酸配列を有している抗ＲＡＧＥ抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列も含まれ得る。
配列は、本明細書中で以下に記載されるように、配列番号１６〜４９のいずれか１つの配列をコードする全長の可変領域、配列番号１６〜４９に示される配列のいずれか１つを有している全長の可変領域をコードするヌクレオチド配列を検索配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として使用する配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査により、最大の一致のために比較される。
実質的に同じ配列は多形配列、すなわち、集団の中の別の配列または対立遺伝子であり得る。対立遺伝子の相違は、１塩基対程度の少ない数であり得る。実質的に同じ配列にはまた、サイレント変異が含まれている配列を含む、変異誘発された配列も含まれ得る。変異には、１つ以上の残基の変化、１つ以上の残基の欠失、または１つ以上のさらなる残基の挿入が含まれ得る。
実質的に同じ核酸はまた、配列番号６、８、１０、１２、または１５のいずれか１つの全長に対して、あるいは、配列番号７，９、１１、および１３に示されるＲＡＧＥアミノ酸配列をコードするかまたは配列番号１６〜４９に示される抗体可変領域のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列の全長に対して、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするか、あるいは実質的にハイブリダイズする核酸としても同定される。核酸のハイブリダイゼーションの状況においては、比較される２つの核酸配列は、指定されたプローブおよび標的であり得る。プローブは参照核酸分子であり、そして標的は、核酸分子の不均一な集団の中で頻繁に見られる試験核酸分子である。標的配列は、試験配列と同義である。
ハイブリダイゼーション実験については、有用なプローブは、本発明の核酸分子の少なくとも約１４から４０ヌクレオチドの配列に相補的であるか、またはそのようなヌクレオチド配列を模倣する。好ましくは、プローブには、配列番号６、８、１０、１２、または１５のいずれか１つの、１４から２０ヌクレオチド、または所望される場合にはさらに長い、例えば、３０、４０、５０、６０、１００、２００、３００、もしくは５００ヌクレオチド、または全長まで、あるいは、配列番号７、９、１１、および１３に示されるＲＡＧＥアミノ酸配列をコードするかまたは配列番号１６〜４９に示される抗体可変領域のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列の全長までが含まれる。そのような断片は、例えば、断片の化学合成によって、核酸増幅技術の適用によって、または組み換え生産のための組み換えベクターへの選択された配列の導入によって、容易に調製することができる。
特異的ハイブリダイゼーションは、その配列が複雑な核酸混合物（例えば、全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ）の中に存在する場合の、ストリンジェントな条件下での特定のヌクレオチド配列だけに対する分子の結合、二本鎖形成、またはハイブリダイゼーションをいう。特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブと標的配列との間での不適合を許容することができる。
核酸のハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンおよびノーザンブロット分析）の状況におけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件は、配列依存性であり、かつ環境依存性である。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲の指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの中に見られる。一般的には、よりストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件と洗浄条件は、定義されるイオン強度とｐＨでの特異的配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。通常、ストリンジェントな条件下では、プローブは、その標的サブ配列に特異的にハイブリダイズするであろうが、他の配列にはハイブリダイズしないであろう。
Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に適合するプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度およびｐＨ下で）である。極めてストリンジェントである条件が、特定のプローブについてのＴｍと等しくなるように選択される。約１００個を超える相補性残基を有している相補性核酸のサザンまたはノーザンブロット分析についてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、１ｍｇのヘパリンを含む５０％のホルムアミドの中での、４２℃で一晩のハイブリダイゼーションである。より高ストリンジェントである洗浄条件の一例は、６５℃の０．１×ＳＳＣの中で１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、６５℃の０．２×ＳＳＣ緩衝液の中で１５分間である。ＳＳＣ緩衝液の記述については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。多くの場合は、高いストリンジェンシーの洗浄の前に、バックグラウンドのプローブシグナルを取り除くための低いストリンジェンシーでの洗浄が行われる。約１００ヌクレオチドを超える二本鎖についての中程度のストリンジェンシーの洗浄条件の一例は、４５℃の１×ＳＳＣの中で１５分間である。約１００を超えるヌクレオチドの二本鎖についての低いストリンジェンシーの洗浄の一例は、４０℃の４×から６×ＳＳＣの中で１５分間である。短いプローブ（例えば、約１０から５０ヌクレオチド）については、ストリンジェントな条件には通常、ｐＨ７．０〜８．３で、約１Ｍ未満のＮａ＋イオンの塩濃度、通常は、約０．０１から１ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）が含まれ、そして温度は通常は少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化物質の添加によって行うことができる。一般的には、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係なプローブについて観察されるよりも２倍大きい（または高い）シグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同じであるヌクレオチド配列を同定するために使用することができる、ハイブリダイゼーション条件と洗浄条件の例である。すなわち、プローブ核酸配列は、好ましくは、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中で、５０℃で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせられ、その後、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で、５０℃で洗浄される。より好ましくは、プローブ配列と標的配列は、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡの中で、５０℃でハイブリダイズさせられ、その後、１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの中で、５０℃で洗浄される。さらに好ましくは、プローブ配列と標的配列は、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡの中で、５０℃でハイブリダイズさせられ、その後、０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの中で、５０℃で洗浄される。さらに好ましくは、プローブ配列と標的配列は、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡの中で、５０℃でハイブリダイズさせられ、その後、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの中で、５０℃で洗浄される。より好ましくは、プローブ配列と標的配列は、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡの中で、５０℃でハイブリダイズさせられ、その後、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの中で、６５℃で洗浄される。
２つの核酸配列が実質的に同じであることをさらに示すものは、核酸によってコードされるタンパク質が実質的に同じであり、全体的な三次元構造を共有しているか、または生物学的機能が等しいことである。これらの用語は本明細書中以下でさらに定義される。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸分子もなお、対応するタンパク質が実質的に同じである場合には、実質的に同じである。これは、例えば、２つのヌクレオチド配列に、遺伝子コードによって許容される保存的に置換された変異体が含まれる場合に起こり得る。
保存的に置換された変異体は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が、混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された、縮重コドン置換を有している核酸配列である。Ｂａｔｚｅｒら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら、（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８を参照のこと。
本発明の核酸にはまた、配列番号６、８、１０、１２、もしくは１５のいずれか１つに相補的な核酸、あるいは、配列番号７、９、１１、および１３に示されるＲＡＧＥアミノ酸配列をコードするかまたは配列番号１６〜４９に示される抗体可変領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ならびに、それらの相補配列も含まれる。相補配列は、塩基対の間で水素結合が形成されると互いに対合することができる逆平行ヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチド配列である。本明細書中で使用される場合は、用語「相補配列」は、以下に示される同じヌクレオチド比較方法によって評価することができるか、または本明細書中に記載される条件のような比較的ストリンジェントな条件下で問題となっている核酸セグメントに対してハイブリダイズすることができると同定される場合には、実質的に相補的であるヌクレオチド配列を意味する。相補核酸セグメントの特定の例はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
サブ配列は、より長い核酸配列の一部を含む核酸の配列である。例示的なサブ配列は、本明細書中で上記に記載されたようなプローブ、またはプライマーである。用語「プライマー」は、本明細書中で使用される場合は、約８個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは、１０〜２０ヌクレオチド、さらに好ましくは、２０〜３０ヌクレオチドの選択された核酸分子を含む連続する配列をいう。本発明のプライマーには、本発明の核酸分子上での重合の開始を提供するために十分な長さであり、適切な配列であるオリゴヌクレオチドが含まれる。
伸張された配列には、核酸に取り込まれたさらなるヌクレオチド（または他の同様の分子）が含まれる。例えば、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、核酸分子の３’末端に配列を付加することができる。加えて、ヌクレオチド配列は、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、プロモーター領域、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、イントロン配列、さらに別の制限酵素部位、マルチクローニング部位、および他のコードセグメント）と結合させることもできる。したがって、本発明によってはまた、開示される核酸が含まれているベクター（組み換え発現のためのベクターが含まれる）も提供される。ここでは、本発明の核酸は機能性プロモーターに動作可能であるように連結させられる。核酸に動作可能であるように連結されると、プロモーターは、核酸との機能性の組み合わせとなり、結果、核酸の転写がプロモーター領域によって制御され、調節される。ベクターは、宿主細胞の中で複製することができる核酸、例えば、プラスミド、コスミド、およびウイルスベクターをいう。
本発明の核酸は、クローニングすることができるか、合成することができるか、変化させることができるか、突然変異させることができるか、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸を単離するために使用される標準的な組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該分野で公知である。塩基対の変化、欠失、または小さい挿入を作成するための部位特異的突然変異誘発もまた当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｉｌｈａｖｙら、（１９８４）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ ＆ Ｈａｍｅｓ（１９９５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第２版，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ（編）（１９９５）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
予防および治療方法
本発明により、Ａβのアミロイド沈着を特徴とする疾患または障害（例えば、アルツハイマー病）を有している被験体を処置するための方法が提供される。この方法には、ＲＡＧＥに特異的に結合し、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体の治療有効量を被験体に投与する工程が含まれる。
本発明によってはまた、被験体のＡβのアミロイド沈着の蓄積を阻害するまたは減少させる方法も提供される。この方法には、被験体に、ＲＡＧＥに特異的に結合し、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体の有効量を投与する工程が含まれる。被験体の神経変性を阻害するまたは少なくする方法もまた本発明に含まれる。この方法には、被験体に、ＲＡＧＥに特異的に結合し、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体の有効量を投与する工程が含まれる。本発明にはさらに、被験体の認識衰退を阻害するもしくは軽減する、または認識を改善する方法が含まれる。この方法には、被験体に、ＲＡＧＥに特異的に結合し、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体の有効量を投与する工程が含まれる。本発明によってはまた、アミロイド沈着を特徴とするアミロイド生成性の疾患または障害を有している被験体を処置するための方法も提供される。この方法には、ＲＡＧＥに特異的に結合し、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体の治療有効量を投与する工程が含まれる。
本発明により、Ａβのアミロイド沈着を特徴とする疾患または障害（例えば、アルツハイマー病）を有している被験体を処置するための方法が提供される。この方法には、患者である被験体において有用な治療応答（例えば、プラーク負荷の軽減、プラーク形成の阻害、神経ジストロフィーの軽減、および認識の迅速な改善、および／または認識衰退の回復、処置、もしくは予防のような認識機能の改善）を生じる条件下で、被験体に、ＲＡＧＥに特異的に結合し、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体の治療有効量を投与する工程が含まれる。
脳でのＡβのアミロイド沈着が関係している疾患としては、アルツハイマー病、ダウン症、および他の認識障害が挙げられる。後者は、アミロイド生成性疾患の他の特徴とともに起こる場合も、また他の特徴を伴わずに起こる場合もある。
長い高血糖性の状態において形成される糖化最終産物（ＡＧＥ）に加えて、ＲＡＧＥのリガンドには、アミロイドの沈着とプロ炎症性媒介因子の特徴であるβ−シート繊維状構造を有しているタンパク質（β−アミロイドタンパク質（Ａβ）、血清アミロイド（ＳＡＡ）（繊維状形態）、Ｓ１００／カルグラヌリン（例えば、Ｓ１００Ａ１２、Ｓ１００Ｂ、Ｓ１００Ａ８−Ａ９）、および高移動性グループボックス−１染色体タンパク質１（ＨＭＧＢ１、アンホテリンとしても知られている）を含む）が含まれる。アミロイド生成性の疾患の病理学的進行におけるＲＡＧＥの役割についての理解は深まりつつある。アルツハイマー病の病因に対するその関与に加えて、ＲＡＧＥは、細胞ストレスと、脾臓の中の血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の沈着に密接に関係していることが示されている（Ｙａｎら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，６：６４３−５１）。ＲＡＧＥは、腎臓の中でのアミロイドの蓄積と組織の崩壊に関係しており、家族性アミロイド・ポリニューロパシー（ＦＡＰ）の個体において腎不全を導く（Ｍａｔｓｕｎａｇａら、２００５，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．）。ＲＡＧＥリガンドアンホテリン（ＨＭＧＢ１）にはまた、アミロイド生成性ペプチド−アルツハイマー病のＡβペプチドに対して高度に相同であり、自然界に存在しているタンパク質から遊離されるとアミロイド様ペプチドを形成するものも含まれる（Ｋａｌｌｉｊａｒｖｉら、２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４０：１００３２−７）。
Ａβの血管壁の中のＲＡＧＥを有している細胞との相互作用によっては、脳−血液関門（ＢＢＢ）を通過するＡβの輸送と、プロ炎症性サイトカインとエンドセリン−１（ＥＴ−１）の発現が生じる。後者は、Ａβによって誘導される血管収縮を媒介する。したがって、本発明によってはまた、Ａβによって誘導される血管収縮を軽減するための方法も提供される。
ＲＡＧＥ−リガンド相互作用の阻害は、アルツハイマー様疾患についてのトランスジェニックマウスにおいて脳実質の中でのＡβの蓄積を抑制することが示されている（Ｄｅａｎｅら、２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：９０７−９１３）。広範囲のアミロイド生成性の疾患および障害におけるＲＡＧＥの活発な病原性の役割は、本発明の方法（これにより、ＲＡＧＥに特異的に結合して、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体が提供される）によるこれらのアミロイド生成性の障害を有している患者に対する治療的な有効な処置を提供することを可能にする。
本発明の方法は、無症候性の患者、および疾患の兆候を現在示している患者の両方に対して使用することができる。そのような方法において使用される抗体は、本明細書中に記載されるような、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または非ヒト抗体、あるいはそれらの断片（例えば、ＲＡＧＥ結合断片）であり得る。なお別の態様においては、本発明は、ヒトが抗体で処置することができる患者であり得る、Ａβペプチドで免疫化されたヒトから調製された抗体［本発明者らは、これはＲＡＧＥであるべきと考えているが、これはおそらくは単純に欠失させられるべきである］を投与することを特徴とする。本発明の治療方法は、以下の抗体を使用して行うことができる。すなわち、
（ａ）ＲＡＧＥに対する結合について、ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体と競合する抗体、
（ｂ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体が結合する、ＲＡＧＥのエピトープに結合する抗体、
（ｃ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体、あるいは、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の抗体のＲＡＧＥ結合断片、である。
例えば、本発明の方法は、ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域のＣＤＲを含む軽鎖可変領域（配列番号１７）、ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列のＣＤＲを含む重鎖可変領域（配列番号１６）、ヒトκ軽鎖定常領域、およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体あるいはＲＡＧＥ結合断片を被験体に投与することによって行うことができる。本発明の方法はまた、ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有している軽鎖可変領域（配列番号１７）、ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列のアミノ酸配列を有している重鎖可変領域（配列番号１６）、ヒトκ軽鎖定常領域、およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体あるいはそのＲＡＧＥ結合断片を使用して行うこともできる。これらの抗体、および本発明の方法においてうまく使用することができる多くの他の抗体についての詳細は本明細書中に記載される。
本発明の治療薬は、通常は、望ましくない混入物質を含まない実質的に純粋なものである。これは、物質が、通常は少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）純粋であり、さらに、干渉性のタンパク質と混入物質が実質的には含まれていないことを意味する。多くの場合には、物質は少なくとも約８０％ｗ／ｗ、より好ましくは、少なくとも９０％または約９５％ｗ／ｗ純粋である。しかし、従来のタンパク質精製技術を使用して、少なくとも９９％ｗ／ｗ純粋な均質なペプチドを得ることができる。
本発明には、薬学的組成物として、薬学的担体とともに抗体を投与することが含まれる。あるいは、抗体は、少なくとも１つの抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを投与することによって、患者に投与することができる。ポリヌクレオチドは患者の中で発現させられて、抗体鎖が生じる。ポリヌクレオチドは、抗体の重鎖と軽鎖をコードすることができる。ポリヌクレオチドは患者の中で発現させられて、重鎖と軽鎖が生じる。例示的な実施形態においては、患者は、患者の血液中の投与された抗体のレベルについてモニターされる。
このように、本発明は、神経病理学、そしていくつかの患者においては、アルツハイマー病に関係している認識障害を予防または緩和するための治療レジュメについての以前からの必要性を満たす。
認識衰退の軽減および／または認識の改善
本発明により、Ａβ関連疾患もしくは障害、またはアミロイド生成性の疾患もしくは障害（例えば、ＡＤ）を有しているか、あるいはそれらに罹患するリスクがある患者において、認識衰退を阻害もしくは軽減する、そして／また、認識を改善するための方法が提供される。この方法には、被験体に、ＲＡＧＥ位特異的に結合し、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体の有効量を投与する工程が含まれる。
これらの方法は、認識衰退を軽減する、そして／または認識の改善が得られるように本発明の抗体の有効用量を投与することを特徴とする。例えば、患者の認識障害（例えば、手続き学習、および／または記憶、欠損）の１つ以上の改善が得られる。認識障害は、記憶を明示することの障害であり得（「陳述」記憶または「作業」記憶としても知られている）、これは、自覚することができる特異的な情報を保存し、読み出し、したがって、言語によって表すことができる能力（例えば、特定の事実または事象を記憶する能力）として定義される。あるいは、認識障害は、手続き記憶（「潜在」記憶または「文脈」記憶としても知られている）の障害であり得る。これは、自覚することができない一般的な情報または知識を獲得する、維持する、および読み出す能力として定義され、これには、技能の習得、交際、習慣、または表現するための複雑な反射が必要であり、例えば、特定業務を遂行する方法を記憶する能力である。手続き記憶の障害に罹患している個体は、それらの能力が、正常に機能することができないほど多く損傷している。したがって、手続き記憶の障害を改善することにおいて有効である処置が非常に望まれており、有効である。
処置に適している患者
本発明による処置に適している患者としては、Ａβ関連疾患もしくは障害、またはアミロイド生成性疾患もしくは障害のリスクがあるが、兆候を示していない個体、ならびに、現在兆候を示している患者が挙げられる。アルツハイマー病の場合には、実質的に誰でも、十分に長く生きていればアルツハイマー病に罹患するリスクがある。したがって、本発明の方法は、目的の患者のリスクを評価する必要なく、一般的な集団に対して予防的に投与することができる。
本発明の方法は、ＡＤのリスクがある個体（例えば、ＡＤについてのリスクファクターを示す個体）に特に有用である。ＡＤについての主要なリスクファクターは、年齢の上昇である。集団が高齢になればなるほど、ＡＤの頻度は高まり続ける。現在の推定値は、６５歳を超える集団の１０％まで、そして８５歳を超える集団の５０％までがＡＤを有していることを示している。
まれではあるが、特定の個体は、若年で、ＡＤを発症する遺伝的素因があると特定することができる。ＡＤの遺伝性の形態（「家族性ＡＤ」または「早期発症型ＡＤ」として知られている）を有している個体は、変異するとＡＤを付与することが知られている遺伝子（例えば、ＡＰＰまたはプレセニリン遺伝子）の分析の、十分詳しく記録されたＡＤの家族歴から特定することができる。十分に特性決定されたＡＰＰ変異には、ＡＰＰ７７０のコドン７１６と７１７での「Ｈａｒｄｙ」変異（例えば、バリン．ｓｕｐ．７１７からイソロイシン（Ｇｏａｔｅら、（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７０４）；バリン．ｓｕｐ．７１７からグリシン（Ｃｈａｒｔｉｅｒら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８４４；Ｍｕｒｒｅｌｌら、（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：９７）；バリン．ｓｕｐ．７１７からフェニルアラニン（Ｍｕｌｌａｎら、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１：３４５−７））、ＡＰＰ７７０の、コドン６７０と６７１での「Ｓｗｅｄｉｓｈ」変異、およびＡＰＰ７７０のコドン６９２での「Ｆｌｅｍｉｓｈ」変異が含まれる。そのような変異は、ＡＰＰのＡβへのプロセシングの増加または変更、特に、多量のＡβの長い形態（すなわち、Ａβ１−４２、およびＡβ１−４３）を生じるＡＰＰのプロセシングによってアルツハイマー病を引き起こすと考えられる。他の遺伝子（例えば、プレセニリン遺伝子、ＰＳ１およびＰＳ２）における変異は、多量の長い形態のＡβを生じるようにＡＰＰのプロセシングに間接的に影響を与えると考えられる（Ｈａｒｄｙ，ＴＩＮＳ ２０：１５４（１９９７）；Ｋｏｗａｌｓｋａら、（２００４），Ｐｏｌｉｓｈ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５６：１７１−８を参照のこと）。ＡＤに加えて、ＡＰＰの７７０アミノ酸イソ型のアミノ酸６９２位または６９３位での変異は、オランダ型アミロイドーシスを伴う遺伝性大脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）と呼ばれる脳のアミロイド生成性障害に関係している。
より一般的には、ＡＤは患者によって遺伝的に受け継がれることはないが、様々な遺伝的要因の複雑な相互作用が原因で発症する。これらの個体は、「散発性ＡＤ」（「後期発症型ＡＤ」としても知られている）を有するといわれる。この形態は、診断することがさらに難しい。それにもかかわらず、患者の集団は、ＡＤを引き起こすことはないが、一般的な集団よりも高い頻度でＡＤを分離することが知られている、罹患しやすい対立遺伝子または形質（例えば、アポリポタンパク質Ｅのε２、ε３、およびε４対立遺伝子）の存在についてスクリーニングすることができる（Ｃｏｒｄｅｒら、（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：９２１−９２３）。特に、ε４対立遺伝子が欠失している患者は、ＡＤについてのいくつかのマーカーと共に、むしろＡＤの「リスクがある」と特定することができる。例えば、ＡＤを有しているか、または高コレステロール血症もしくはアテローム性動脈硬化症に罹患している親族がいる、ε４対立遺伝子が欠失している患者は、ＡＤの「リスクがある」と特定することができる。別の可能性のある生体マーカーは、脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ２４とｔａｕレベルの評価の組み合わせである。低いＡβ２４と高いｔａｕレベルは、ＡＤのリスクがある患者を特定することにおける予測値を有する。
ＡＤのリスクがある患者についての他の指標には、インビボでの動的な神経病理学的データ（例えば、脳のβアミロイドのインビボでの検出、脳の活性化のパターンなど）が含まれる。そのようなデータは、例えば、三次元核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放出型断像撮影法（ＰＥＴ）スキャン、および単光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を使用して得ることができる。ＡＤを有している可能性がある患者の指標としては、（１）認知症を有している患者、（２）４０〜９０歳の年齢の患者、（３）認識障害（例えば、２つ以上の認識領域）、（４）６ヶ月より長い障害の進行、（５）無意識の平穏（ｃｏｎｓｃｉｏｕｓｎｅｓｓ ｕｎｄｉｓｔｕｒｂｅｄ）、および／または（６）他の合理的な診断がないことが挙げられるが、これらに限定されない。
しかし、ＡＤの散発性の形態または家族性の形態のいずれかに罹患している個体は、通常、ＡＤの１つ以上の特徴的な兆候を示すことから診断される。ＡＤの共通の兆候としては、日常の機能または作業の能力に影響を与える認識障害、言語に伴う問題、時間もしくは場所に対する見当識障害、判断力の不足または低下、抽象的思考の欠如、運動の制御が失われること、気分または行動の変容、人格変化、または自発性が失われることが挙げられる。患者が示す障害の数または認識障害の程度は、通常、疾患が進行した程度を反映する。例えば、患者は、穏やかな認識障害しか示さない場合があり、結果として、患者は、記憶（例えば、文脈の記憶）に問題を示すが、他の機能は十分に行うことができる場合がある。
本発明の方法はまた、Ａβ関連認識障害（例えば、Ａβ関連認知症）を有している個体にも有用である。具体的には、本発明の方法は、中枢神経系（ＣＮＳ）の中の（例えば、脳またはＣＳＦの中の）可溶性オリゴマーＡβの存在によって引き起こされるか、または可溶性オリゴマーＡβの存在に起因すると考えられる認識障害あるいは異常を有している個体に特に有用である。Ａβによって引き起こされるか、またはＡβが関係している認識障害にはまた、以下によって引き起こされるか、または以下が関係しているものも含まれる。すなわち、（１）脳の中でのβ−アミロイド斑の発生、（２）異常なＡβ合成速度、プロセシング、分解、またはクリアランス、（３）（例えば、脳の中の）可溶性オリゴマーＡβ種の形成または活性、ならびに／あるいは、（４）異常な形態のＡβの形成である。実際の原因となる関連性が、特定の患者におけるＡβの異常性と認識障害との間で確立されることは必要ないが、関連性のいくらかは、例えば、Ａβ免疫治療薬での処置によって利点があるとは予想されない、非Ａβ関連認識障害に罹患している患者を区別するために、ＡＤについての上記マーカーのうちの１つによって示されるべきである。
ヒト被験体（例えば、認識障害（例えば、ＡＤ）の兆候または病状のリスクがあるか、その兆候または病状を有している被験体）において、認識技能または能力を評価するためのいくつかの試験が開発されている。認識障害は、これらの試験の能力の低下によって特定することができ、そしてこれらの試験において能力を改善するそれらの能力に基づいて、多くの処置が提案されている。解析方法のうちのいくつかは、被験体の行動または運動機能を評価するが、ほとんどの解析方法は、学習または記憶を試験するように設計されている。
ヒトの認識は、以下の試験を含むがこれらに限定されない多種多様の試験を使用して評価することができる。ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ−Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ）は、１１部の試験であり、完了するまでには３０分を要する。ＡＤＡＳ−Ｃｏｇは、言語学習と記憶能力についての好ましい簡単な試験である。Ｒｏｓｅｎら、（１９８４）Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．１４１（１１）：１３５６−６４；Ｉｈｌら、（２０００）Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌ．４１（２）：１０２−７；およびＷｅｙｅｒら、（１９９７）Ｉｎｔ Ｐｓｙｃｈｏｇｅｒｉａｔｒ．９（２）：１２３−３８を参照のこと。
Ｂｌｅｓｓｅｄ Ｔｅｓｔは、日常生活および記憶、集中力および方向感覚の活性を評価する、認識力についての別の迅速な（約１０分）試験である。Ｂｌｅｓｓｅｄら、（１９６８）Ｂｒ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １１４（５１２）：７９７−８１１を参照のこと。
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｓｔ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｂａｔｔｅｒｙ（ＣＡＮＴＡＢ）は、神経変性疾患または脳の損傷を有しているヒトの認識障害の評価に使用される。これは、記憶、注意、および管理能力についての、コンピューターによる、相互に関係している１３の試験から構成され、個人用コンピューターからのタッチセンサースクリーンによって行われる。試験は、言語であり、大部分はカルチャーフリー（ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｒｅｅ）であり、そしてアルツハイマー病の早期の検出および日常的なスクリーニングにおいて非常に感度が高いことが示されている。Ｓｗａｉｎｓｏｎら、（２００１）Ｄｅｍｅｎｔ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｃｏｇｎ Ｄｉｓｏｒｄ．；１２：２６５−２８０；およびＦｒａｙ ａｎｄ Ｒｏｂｂｉｎｓ（１９９６）Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌ Ｔｅｒａｔｏｌ．１８（４）４９９：５０４．Ｒｏｂｂｉｎｓら、（１９９４）Ｄｅｍｅｎｔｉａ ５（５）：２６６−８１を参照のこと。
Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｔｏ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＥＲＡＤ）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｓｔには、ｖｅｒｂａｌ ｆｌｕｅｎｃｙ試験、Ｂｏｓｔｏｎ Ｎａｍｉｎｇ Ｔｅｓｔ、Ｍｉｎｉ Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）、１０項目のｗｏｒｄ ｒｅｃａｌｌ、構造の実習（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ ｐｒａｘｉｓ）、および実習項目を後で思い出すこと（ｄｅｌａｙｅｄ ｒｅｃａｌｌ ｏｆ ｐｒａｘｉｓ ｉｔｅｍｓ）が含まれる。この試験には通常、２０〜３０分を要し、これは、認識の低下を評価し、そして追跡することにおいて便利であり、有効である。Ｍｏｒｒｉｓら、（１９８８）Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｕｌｌ．２４（４）：６４１−５２；Ｍｏｒｒｉｓら、（１９８９）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３９（９）：１１５９−６５；およびＷｅｌｓｈら、（１９９１）Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．４８（３）：２７８−８１を参照のこと。
Ｆｏｌｅｓｔｅｉｎらによって１８７５年に開発されたＭｉｎｉ Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）は、精神状態と認識機能の簡単な試験である。これは、他の精神的な表現形を測定することはできず、したがって、完全な精神状態の試験にとってかわることはできない。これは、認知症のスクリーニングに有用であり、そのスコアリングシステムは、長期にわたり進行を追跡することに役立つ。Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍｉｎａｎｉｏｎ ＭＭＳＥは、年齢と教養について調整された基準とともに、広く使用される。これは、認識障害をスクリーニングするため、任意の時点での認識障害の重篤度を推定するため、経時的に個体の認識力の変化の経過を追跡するため、そして処置に対する個体の応答を記録するために使用することができる。被験体の認識力の評価には、９ヶ月以上に分けられた追跡試験を伴う、公式の神経心理学的試験が必要な場合がある（ヒトにおいて）。Ｆｏｌｓｔｅｉｎら、（１９７５）Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｒｅｓ．１２：１９６−１９８；Ｃｏｃｋｒｅｌｌ ａｎｄ Ｆｏｌｓｔｅｉｎ（１９８８）Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ．２４（４）：６８９−６９２；およびＣｒｕｍら、（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ １８：２３８６−２３９１を参照のこと。
Ｓｅｖｅｎ−Ｍｉｎｕｔｅ Ｓｃｒｅｅｎは、アルツハイマー病について評価しなければならない患者の特定を助けるためのスクリーニングツールである。このスクリーニングツールは、様々なタイプの知的機能を評価するための一連の質問を使用する、ＡＤの初期の兆候に非常に敏感なツールである。この試験は、方向感覚、記憶力、空間認識力、および言語表現力に焦点があてられている、４セットの質問から構成されている。これにより、通常の加齢のプロセスが原因である認識力の変化と、認知症が原因である認識障害とを区別することができる。Ｓｏｌｏｍｏｎ ａｎｄ Ｐｅｎｄｌｅｂｕｒｙ（１９９８）Ｆａｍ Ｍｅｄ．３０（４）：２６５−７１，Ｓｏｌｏｍｏｎら、（１９９８）Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．５５（３）：３４９−５５を参照のこと。
現在アルツハイマー病に罹患している個体は、特徴的な認知症、さらには、上記のリスクファクターの存在によって認識することができる。加えて、多数の診断試験を、ＡＤを有している個体を特定するために利用することができる。これらには、ＣＳＦ ｔａｕとＡβ４２レベルの測定が含まれる。高いｔａｕレベルと低いＡβ４２レベルは、ＡＤの存在を示す。アルツハイマー病に罹患している個体はまた、ＡＤＲＤＡ基準によっても診断することができる。
併用療法
本発明の抗ＲＡＧＥ抗体は、被験体に同時に、またはいずれかの順序で連続して投与することができる、１つ以上のさらに別の薬剤と組み合わせて使用される場合がある。開示される併用療法によっては、相乗的な治療効果、すなわち、いずれかの薬剤の単独による効果を上回る効果が誘発される場合がある。測定することができる治療効果は、本明細書中で上記に記載されている。例えば、相乗的な治療効果は、１つの薬剤によって誘発される治療効果よりも少なくとも約２倍大きい、または少なくとも約５倍大きい、または少なくとも約１０倍大きい、または少なくとも約２０倍大きい、または少なくとも約５０倍大きい、または少なくとも約１００倍大きい効果であり得る。
例えば、本発明には、ＲＡＧＥに特異的に結合し、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体の治療有効量を、Ａβに特異的に結合する別の抗体と組み合わせて投与する工程が含まれる。Ａβに結合する抗体は、全長のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）には結合することなくＡβペプチドに特異的に結合する抗体であり得る。あるいは、本発明の抗体は、可溶性Ａβに結合し、そして／またはこれを捕捉するか、あるいは、患者の中のアミロイド沈着に結合して、アミロイド沈着に対するクリアー応答（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘導する抗体と組み合わせて投与される場合もある。そのようなクリアー応答は、Ｆｃ受容体によって媒介される食作用により影響を受け得る。そのようなクリアー応答は、例えば、Ｆｃ受容体結合ドメイン（例えば、ＩｇＧ２定常領域）を含めることによって、抗体の中に入れるように操作することができる。本発明の抗体はまた、Ａβワクチンが投与されたか、またはＡβワクチンが投与されている患者に投与することもできる。脳の中にアミロイドの沈着が生じるアルツハイマー病およびダウン症の場合には、本発明の抗体はまた、本発明の薬剤の脳−血液関門を通過する移動を増大させる他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。本発明の抗体はまた、標的細胞または組織（例えば、リポソームなど）への治療薬の接近を促進する他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。そのような薬剤の同時投与によってはまた、所望される効果を得るために必要な治療薬（例えば、治療用抗体または抗体鎖）の投与量を少なくすることができる。
治療経過のモニタリング
本発明により、アルツハイマー病に罹患しているか、またはアルツハイマー病に罹患しやすい患者の処置をモニターする（例えば、患者に投与される処置の経過をモニターするための）方法が提供される。この方法は、症候性の患者についての治療的処置、および無症候性の患者についての予防的処置の両方をモニターするために使用することができる。具体的には、これらの方法は、受動免疫をモニターする（例えば、投与された抗体のレベルを測定する）ために有用である。
いくつかの方法には、薬剤の投与量の投与前の、例えば、患者の抗体レベルまたはプロフィールのベースライン値を決定する工程と、これらを処置後のプロフィールまたはレベルについての値と比較する工程が含まれる。レベルまたはプロフィール値の有意な増大（すなわち、そのような測定値の平均からの１標準偏差として表される、同じ試料の繰り返し測定における通常の大きさの実験誤差よりも大きい）は、ポジティブな処置結果（すなわち、薬剤の投与によって所望される応答が得られたこと）を示す。免疫応答についての値が有意には変化しないかまたは低下する場合には、ネガティブな処置結果が示される。
他の方法においては、レベルまたはプロフィールの対照の値（すなわち、平均と標準偏差）が、対照集団について決定される。通常、対照集団の個体には、前処置は投与されない。治療薬の投与後の、患者のレベルまたはプロフィールの測定値が、その後、対照の値と比較される。対照の値と比較した有意な増大（例えば、平均から１標準偏差よりも大きく上回る）は、ポジティブな、または十分な処置結果を示す。有意な増大または低下がないことは、ネガティブな、または不十分な処置結果を示す。薬剤の投与は、一般的には、レベルが対照値と比較して増大している間は続けられる。先と同様に、対照値と比較してプラトーに達したことは、処置の投与を中止できるか、または投与量および／もしくは頻度を少なくできることの指標である。
他の方法においては、レベルまたはプロフィールの対照値（例えば、平均と標準偏差）は、治療薬での処置を受けた、そのレベルまたはプロフィールが処置に応答してプラトーに達した個体の対照集団から決定される。患者におけるレベルまたはプロフィールの測定値は、対照値と比較される。患者において測定されたレベルが対照レベルと有意に（例えば、１標準偏差を上回る）は異ならない場合には、処置は中止することができる。患者におけるレベルが対照値を有意に下回る場合には、薬剤の投与の継続が妥当である。患者におけるレベルが対照値を下回り続ける場合には、処置における変化は示されない場合がある。
他の方法においては、現在処置を受けていないが、これまでに処置を受けていた患者が、処置の再開が必要であるかどうかを決定するために、抗体レベルまたはプロフィールについてモニターされる。患者において測定されたレベルまたはプロフィールは、以前の一連の処置の後に患者において以前に得られた値と比較することができる。以前の測定値と比較した有意な低下（すなわち、同じ試料の繰り返し測定における通常の誤差の大きさよりも大きい）は、処置が再開できることの指標である。あるいは、患者において測定された値は、一連の処置を受けた後の患者の集団において決定された対照値（平均＋標準偏差）と比較することができる。あるいは、患者において測定された値は、疾患の兆候が残っていない予防的に処置された患者の集団、または疾患の特徴の緩和を示す治療的に処置された患者の集団の対照値と比較することができる。これらの全ての場合において、対照レベルと比較した有意な低下（すなわち、標準偏差を上回らない）は、患者において処置を再開するべきであることの指標である。
分析される組織試料は、通常は、患者由来の血液、血漿、血清、粘膜液、または脳脊髄液である。試料は、例えば、ＲＡＧＥペプチドに対する抗体のレベルまたはプロフィール（例えば、ヒト化抗体のレベルまたはプロフィール）について分析される。ＲＡＧＥに特異的な抗体を検出するＥＬＩＳＡ方法は実施例に記載されている。いくつかの方法においては、投与された抗体のレベルまたはプロフィールが、クリアーアッセイを使用して、例えば、インビトロでの食作用アッセイにおいて、本明細書中に記載されるように決定される。このような方法においては、試験される患者に由来する組織試料は、アミロイドの沈着（例えば、ＰＤＡＰＰマウスに由来する）、およびＦｃ受容体を有している食作用細胞と接触させられる。続いて、アミロイドの沈着のクリアーが、その後にモニターされる。クリアー応答の存在および程度により、試験を受けた患者の組織試料中のＡβをクリアーするために有効な抗体の存在とレベルの指標が提供される。
受動免疫後の抗体プロフィールは、通常、すぐに抗体濃度のピークを示し、その後に指数関数的減衰が続く。さらに投与しなければ、減衰は、投与された抗体の半減期に応じて、数日間から数ヶ月の期間のうちに処置前のレベルに近づく。
いくつかの方法においては、患者の中のＲＡＧＥに対する抗体のベースライン測定が投与前に行われ、２回目の測定は、ピーク抗体レベルを決定するためにその直後に行われる。そして、１回以上のさらなる測定が、抗体レベルの減衰をモニターするために間隔をあけて行われる。抗体のレベルがベースラインまたはベースラインよりも低いピークの予め決定された割合（例えば、５０％、２５％、または１０％）にまで減衰すると、抗体のさらなる投与量の投与が行われる。いくつかの方法においては、ピーク、またはその後のバックグラウンド未満である測定されたレベルは、他の患者に有用な予防的処置または治療的処置のレジュメを構成するために以前に決定された参照レベルと比較される。測定された抗体レベルが参照レベルを有意に下回る（下回るとは、例えば、処置による恩恵を受ける患者の集団における参照値の−１標準偏差を意味する）場合には、抗体のさらなる投与量の投与が指示される。
処置の経過と患者の状態をモニターするための測定可能な指標には、患者の脳の中のＡβのレベルのモニタリング（レベルの低下）、アミロイドシンク（ａｍｙｌｏｉｄ ｓｉｎｋ）のモニタリング、および神経機能におけるＡβによって誘導される障害の緩和のモニタリングが含まれる。他の測定可能な指標としては、アルツハイマー病における脳アミロイド血管症（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｇｏｐｈｉｌｉｃ ａｍｙｌｏｉｄ ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）（ＣＡＡ）の病状の状態または変化のモニタリングが含まれ、そして患者のモニタリングには、Ａβによって媒介される細胞内シグナル伝達と炎症の変化が含まれる。後者は、多種多様なシグナル伝達経路とのそのリガンドによるＲＡＧＥの調節（例えば、転写因子ＮＦ−κＢの活性化）に関係する情報を提供し、ＲＡＧＥプロモーターを活性化させ、そして神経変性（ｎｅｕｒｏｘｉｃ）応答は、活性化細胞シグナル伝達（ＭＡＰキナーゼカスケード（ＭＡＰＫｓ）、ＥＲＫ１／２、Ａｋｔ、ＪＮＫ、ｐ３８）によって媒介され、そして抗ＲＡＧＥ Ｍａｂが、ＪＮＫ、ｐ３８、ＮＦκＢのリン酸化をブロックするであろう。有用な測定にはまた、ＲＡＧＥによって強められるＡβによって誘導されるシグナル伝達およびシナプスの柔軟性をモニタリングすることも含まれ、そして、ＲＡＧＥおよびＬＲＰによって媒介される、血液／脳関門を通過するＡβのディファレンシャルな脳への流入／流出は、血液脳関門を通過するＡβのディファレンシャルな脳への流入／流出を媒介する可能性がある。したがって、本発明により、細胞内シグナル伝達を減少させる（例えば、ＭＡＰＫカスケードを減少させる）ため、およびＡβが関係している炎症を軽減するための方法が提供される。
さらなる方法には、処置の経過全体を通じて、アミロイド生成性の疾患（例えば、アルツハイマー病）を診断またはモニターするために研究者または医師によって日常的に行われている、当該分野で認識されている任意の生理学的症状（例えば、身体症状または精神的症状）をモニタリングすることが含まれる。例えば、当業者は、認識障害をモニターすることができる。後者は、アルツハイマー病およびダウン症の兆候であるが、これらの疾患のいずれかの他の特徴は伴わずに起こる場合がある。例えば、認識障害は、処置の経過全体を通じて慣習にしたがってＭｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍで患者のスコアを決定することによってモニターすることができる。
薬学的調製物
本発明の目的のタンパク質または核酸は、適切な組成物の形態で投与されることが最も好ましい。必要に応じて、記載される全ての組成物であり得る組成物は、通常は、全身投与用の薬物または局所投与用の薬物に使用される。薬学的に許容される担体は、有効成分と一緒に作用しないように、実質的に不活性でなければならない。適切な不活性な担体としては、水、アルコール、ポリエチレングリコール、ミネラルオイル、またはｐｅｔｒｏｌｅｕｍゲル、プロピレングリコール、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）などが挙げられる。上記薬学的調製物（本発明の抗体または本発明の抗体をコードする核酸が含まれる）は、ヒトまたは家畜用の医薬品の中での使用のために、任意の従来の方法での投与のために処方することができる。
したがって、本発明の別の態様により、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）、および／または稀釈剤と一緒に処方された、有効量の抗体が含まれている薬学的に許容される組成物が提供される。以下に詳細に記載されるように、本発明の薬学的組成物は、固体の形態または液体の形態での投与のために特別に処方することができ、これには、以下のために適応させられたものが含まれる。すなわち、（１）経口投与、例えば、ドレンチ（ｄｒｅｎｃｈｅｓ）（水性もしくは非水性溶液または懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末剤、顆粒剤、舌への塗布のためのペースト；（２）非経口投与（例えば、滅菌溶液または懸濁液としての、皮下注射、筋肉内注射、または静脈内注射による）；（３）局所投与（例えば、皮膚に塗布されるクリーム剤、軟膏、または噴霧剤）；あるいは（４）膣内投与もしくは直腸内投与（例えば、ペッサリー、クリーム剤、または発泡剤として）である。しかし、特定の実施形態においては、本発明の薬剤は、単純に滅菌水の中に溶解させられる、または懸濁させられる場合もある。特定の実施形態においては、薬学的調製物は非発熱性であり、すなわち、患者の体温を上昇させることはない。非経口投与（具体的には、皮下注射および静脈内注射）が好ましい投与経路である。
特定の実施形態においては、１つ以上の薬剤には、塩基性官能基（例えば、アミノまたはアルキルアミノ）が含まれ得、したがって、これは、薬学的に許容される酸とともに薬学的に許容される塩を形成することができる。これに関して、用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の比較的毒性のない無機酸および有機酸付加塩をいう。これらの塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製の間にインサイチュで、または、その遊離の塩基の形態である本発明の精製された化合物を適切な有機酸もしくは無機酸と別々に反応させ、そしてそのように形成させられた塩を単離することによって、調製することができる。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトネート、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅら、（１９７７）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。
薬剤の薬学的に許容される塩には、化合物の従来の非毒性の塩、または四級アンモニウム塩（例えば、非毒性の有機酸または無機酸に由来する）が含まれる。例えば、そのような従来の非毒性の塩には、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など）から導かれたもの、および有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸（ｉｓｏｔｈｉｎｉｃ）など）から調製された塩が含まれる。
他の場合には、１つ以上の薬剤には、１つ以上の酸性官能基が含まれ得、したがって、これらは、薬学的に許容される塩基とともに薬学的に許容される塩を形成することができる。同様に、これらの塩は、化合物の最終的な単離と精製の間にインサイチュで、または、その遊離の酸の形態である精製された化合物を適切な塩基と（例えば、薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩、または重炭酸塩を、アンモニアと、または薬学的に許容される有機第１級、第２級、もしくは第３級アミンと）別々に反応させることによって、調製することができる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩などが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅら、前出を参照のこと）。
湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、さらには着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および香料、保存剤および抗酸化剤もまた、組成物の中に存在させることができる。
薬学的に許容される抗酸化剤の例としては以下が挙げられる。（１）水溶性抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）、（２）油溶性抗酸化剤（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど）、および（３）金属キレート化剤（例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）。
本発明の処方物には、経口投与、鼻腔投与、局所投与（口腔投与および舌下投与を含む）、直腸投与、膣投与、ならびに／または非経口投与に適している処方物が含まれる。処方物は、通常は、単位投薬形態で提示され得、そして製薬学の分野で周知の任意の方法によって調製することができる。担体材料とともに混合して１つの投薬形態とすることができる有効成分の量は、処置される宿主、特定の投与の態様などに応じて様々であろう。担体材料と混合して１つの投薬形態とすることができる有効成分の量は、一般的には、治療効果を生じる化合物の量であろう。一般的には、この量は、１００パーセントのうちの約１パーセントから約９９パーセントが有効成分であり、好ましくは、約５パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは、約１０パーセントから約３０パーセントの範囲であろう。
これらの処方物または組成物を調製する方法には、薬剤を担体と、および状況に応じて１つ以上の副成分と会合させる工程が含まれる。一般的には、処方物は、本発明の薬剤を液体の担体、または時間とともに分解される（ｔｉｍｅｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ）固体の担体、またはそれらの両方と均一に、そして親密に会合させること、そして必要であれば、生成物を成型することによって調製される。
経口投与に適している本発明の処方物は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、トローチ剤（風味のある基剤、通常は、スクロースとアカシアまたはトラガカントが使用される）、粉末剤、顆粒剤の形態である場合も、また、水性もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液として存在する場合も、また、油中水もしくは水中油液体エマルジョンとして存在する場合も、また、エリキシル剤もしくはシロップ剤として存在する場合も、また、トローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）（不活性な基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアが使用される）として存在する場合も、そして／また、歯磨き剤などとして存在する場合もある。これらにはそれぞれ、予め決定された量の本発明の化合物が有効成分として含まれる。本発明の化合物はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与される場合もある。
経口投与のための本発明の固体の投薬形態（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末剤、顆粒剤など）においては、有効成分は、１つ以上の薬学的に許容される担体（例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム）、および／または以下のうちの任意のものと混合される。（１）溶加剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸）；（２）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアカシア）；（３）保湿剤（例えば、グリセロール）；（４）崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）；（５）溶液緩染剤（例えば、パラフィン）；（６）吸収促進剤（例えば、四級アンモニウム化合物）；（７）湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）；（８）吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ）；（９）潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物）；ならびに（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合には、薬学的組成物にはまた、緩衝剤も含まれ得る。同様のタイプの固体の組成物はまた、ラクトースまたは乳糖、さらには、高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、ソフトおよびハードゼラチンカプセルの中の溶加剤として使用される場合もある。
錠剤は、状況に応じて１つ以上の副成分とともに、圧縮または成型によって作成され得る。圧縮された錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性な稀釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、グリコール酸ナトリウムデンプン、架橋されたカルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を使用して調製することができる。成型された錠剤は、適切な機械の中で、不活性な液体稀釈剤で湿らされた粉末状にされた化合物の混合物を成型することによって作成することができる。
本発明の薬学的組成物の錠剤、または他の固体の投薬形態（例えば、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤）は、状況に応じて、コーティングおよび殻（例えば、腸溶コーティングおよび薬学的処方の分野で周知の他のコーティング）を用いてスコアすることができるかまたは調製することができる。これらはまた、例えば、所望される放出プロフィールを提供するための様々な割合でのヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソーム、および／またはマイクロスフェアを使用して、その中の有効成分のゆっくりとした放出または徐放を提供するように処方される場合もある。これらはまた、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、または使用の直前に滅菌水もしくはいくつかの他の滅菌の注射可能な媒体の中に溶解させることができる滅菌の固体組成物の形態の中に滅菌剤を配合することによって、滅菌される場合もある。これらの組成物にはまた、状況に応じて、乳白剤が含まれる場合があり、そして、これは、有効成分（単数または複数）だけを放出するか、または消化管の特定の部分の中で優先的に、状況に応じて、遅延型の様式で有効成分（単数または複数）を放出する組成物であり得る。使用することができる埋め込み型の組成物の例としては、高分子物質およびワックスが挙げられる。有効成分はまた、適切である場合には、１つ以上の上記賦形剤とともに、マイクロカプセル化された形態でもあり得る。
本発明の化合物の経口投与のための液体の投薬形態としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられる。有効成分に加えて、液体の投薬形態には、当該分野で一般的に使用されている不活性な希釈剤（例えば、水、または他の溶媒）、可溶化剤および乳化剤（例えば、エチルアルコール、水、または他の溶媒）、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（具体的には、菜種油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物が含まれる場合がある。
不活性な稀釈剤に加えて、経口組成物にはまた、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色料、香料、および保存剤も含めることができる。
懸濁液には、有効成分に加えて、懸濁化剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、ならびにそれらの混合物）が含まれる場合がある。
直腸投与または膣投与のための本発明の薬学的組成物の処方物は、坐剤として提示される場合がある、これは、本発明の１つ以上の化合物を、１つ以上の適切な刺激性のない賦形剤または担体（例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤用ワックス、またはサリチル酸塩）と混合することによって調製することができる。これは、室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣の体腔の中で融解して成分を放出するであろう。
膣投与に適している本発明の処方物としては、また、適切であることが当該分野で公知であるそのような担体が含まれている、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、発泡剤、または噴霧剤処方物も挙げられる。
本発明の化合物の局所投与または経皮投与のための投薬形態としては、粉末剤、噴霧剤、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、ローション、ゲル剤、溶液剤、パッチ、および吸入薬が挙げられる。活性のある化合物は、滅菌条件下で薬学的に許容される担体と、そして必要に応じて任意の保存剤、緩衝液、または推進剤と混合される場合がある。
軟膏、ペースト剤、クリーム剤、およびゲル剤には、本発明の活性のある化合物に加えて、賦形剤（例えば、動物性脂肪および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物）が含まれる場合がある。
粉末剤および噴霧剤には、本発明の化合物に加えて、賦形剤（例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物）が含まれ得る。加えて、噴霧剤には、通例の推進剤（例えば、クロロフルオロヒドロカーボン、および揮発性の非置換炭化水素（例えば、ブタンおよびプロパン））が含まれ得る。
経皮パッチは、体への本発明の化合物の制御された放出を提供するさらなる利点を有している。そのような投薬形態は、適切な媒体の中に薬剤を溶解させるかまたは分散させることによって作成することができる。吸収促進剤もまた、スライン（ｓｌａｉｎ）を通過する薬剤の流入を増大させるために使用することができる。そのような流入速度は、速度制御膜を配置すること、またはポリマーマトリックスまたはゲルの中に化合物を分散させることのいずれかによって制御することができる。
眼科用処方物、眼用軟膏、粉末剤、溶液剤などもまた、本発明の範囲に含まれるように意図される。
非経口投与に適している本発明の薬学的組成物には、１つ以上の薬学的に許容される滅菌の等張性の水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液、またはエマルジョン、あるいは、使用の直前に滅菌の注射可能な溶液もしくは分散液になるように再構成することができる滅菌の粉末（これには、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、処方物を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質が含まれ得る）、あるいは、懸濁化剤または増粘剤と組み合わせて、本発明の１つ以上の化合物が含まれる。
本発明の薬学的組成物において使用することができる適切な水性および非水性の担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、植物性油（例えば、オリーブ油）、および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料（例えば、レシチン）の使用によって、分散液の場合には必要な粒子の大きさの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。
これらの組成物にはまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤のようなアジュバントも含まれ得る。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など）を含めることによって確保することができる。等張化剤（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）を組成物の中に含めることもまた所望される場合がある。加えて、注射可能な薬学的形態の長時間にわたる吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような、吸収を遅らせる薬剤を含めることによってもたらされ得る。
いくつかの場合には、薬剤の効果を持続させるためには、皮下注射または筋肉内注射により薬剤の吸収を遅らせることが所望される。これは、水溶性が低い結晶性の物質または不定形の物質の液体懸濁液の使用によってもたらされ得る。この場合、薬剤の吸収速度は、その溶解速度に依存し、これは次いで、結晶の大きさおよび結晶形態にも依存し得る。あるいは、非経口投与された薬剤の吸収の遅延は、油性の媒体の中に薬剤を溶解または懸濁させることによってももたらされる。
注射可能なデポー形態は、生体分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド）になるように目的の化合物のマイクロカプセル化マトリックスを形成させることによって作成される。ポリマーに対する薬剤の割合、および使用される特定のポリマーの性質に応じて、薬剤の放出速度を制御することができる。他の生体分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。注射可能なデポー処方物はまた、体の組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンの中に薬剤を捕捉することによっても調製される。
本発明の化合物が、ヒトおよび動物に医薬品として投与される場合には、それら自体を投与することができ、また、これらは薬学的に許容される担体と組み合わせられた、例えば、０．１から９９．５％（より好ましくは、０．５から９０％）の有効成分が含まれている薬学的組成物として投与することもできる。
上記組成物とは異なり、適切な量の治療薬が含まれている、カバー（例えば、こう薬、包帯、包帯剤、ガーゼパッドなど）が使用される場合がある。上記に詳細に記載されたように、治療用組成物は、ステム（ｓｔｅｍ）、デバイス、補綴物、および移植物の上に投与する／送達される場合がある。
分析される組織試料は、典型的には、患者由来の血液、血漿、血清、粘膜液、または脳脊髄液である。試料は、例えば、ＲＡＧＥペプチドに対する抗体のレベルまたはプロフィール（例えば、ヒト化抗体のレベルまたはプロフィール）について分析される。ＲＡＧＥに特異的な抗体を検出するＥＬＩＳＡ法は、実施例に記載される。
受動免疫後の抗体プロフィールは、通常、すぐに抗体濃度のピークを示し、その後に指数関数的減衰が続く。さらに投与しなければ、減衰は、投与された抗体の半減期に応じて、数日間から数ヶ月の期間のうちに処置前のレベルに近づく。
いくつかの方法においては、患者の中のＲＡＧＥに対する抗体のベースライン測定が投与前に行われ、２回目の測定は、ピーク抗体レベルを決定するためにその直後に行われる。そして、１回以上のさらなる測定が、抗体レベルの減衰をモニターするために間隔をあけて行われる。抗体のレベルがベースラインまたはベースラインよりも低いピークの予め決定された割合（例えば、５０％、２５％、または１０％）にまで減衰すると、抗体のさらなる投与量の投与が行われる。いくつかの方法においては、ピーク、またはその後のバックグラウンド未満である測定されたレベルは、他の患者に有用な予防的処置または治療的処置のレジュメを構成するために以前に決定された参照レベルと比較される。測定された抗体レベルが参照レベルを有意に下回る（下回るとは、例えば処置による恩恵を受ける患者の集団の参照値の−１標準偏差を意味する）場合には、抗体のさらなる投与量の投与が指示される。
本発明は、ここに一般的に記載され、これは、以下の実施例を参照すればさらに容易に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の特定の態様および実施形態の説明の目的のために含まれるにすぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
（実施例１）
ＲＡＧＥ構築物の調製
マウスＲＡＧＥのアミノ酸配列（ｍＲＡＧＥ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３１４５１；配列番号３）およびヒトＲＡＧＥのアミノ酸配列（ｈＲＡＧＥ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１２７．１；配列番号１）を図１Ａ〜１Ｃに示す。ｍＲＡＧＥをコードする全長のｃＤＮＡ（登録番号ＮＭ＿００７４２５．１；配列番号４）とｈＲＡＧＥをコードする全長のｃＤＮＡ（登録番号ＮＭ＿００１１３６；配列番号２）を、Ａｄｏｒｉ１−２発現ベクター（これには、ｃＤＮＡ配列の発現を駆動するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが含まれており、ウイルスの精製のためのアデノウイルスエレメントが含まれている）に挿入した。ヒトＲＡＧＥのアミノ酸１〜３４４をヒトＩｇＧのＦｃドメインに結合させることによって形成させたヒトＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を、Ａｄｏｒｉ発現ベクターを使用して、培養した細胞の中で融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を発現させることによって調製した。ヒトＩｇＧのＦｃドメインに対してヒトＲＡＧＥのアミノ酸１〜１１８を結合させることによって形成させたヒトＲＡＧＥ Ｖ−領域−Ｆｃ融合タンパク質を、同様に調製した。ヒトまたはマウスのＲＡＧＥのアミノ酸１〜３４４のそれぞれに対してストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐ）タグ配列（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）（配列番号５）を結合させることによって形成させた、ヒトＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐタグ融合タンパク質とマウスＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐタグ融合タンパク質を、これもまたＡｄｏｒｉ発現ベクターを使用して、ＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐタグ融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を発現させることによって調製した。全ての構築物を、大規模な制限消化分析によって、そしてプラスミドの中のｃＤＮＡ挿入断片の配列分析によって確認した。
全長ＲＡＧＥ、ｈＲＡＧＥ−Ｆｃ、およびｈＲＡＧＥ−Ｖ−ドメイン−Ｆｃを発現する組み換え体アデノウイルス（Ａｄ５ Ｅ１ａ／Ｅ３が欠失している）を、ヒト胚性腎臓細胞２９３株（ＨＥＫ２９３）（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ ＭＤ）の中での相同組み換えによって作成した。組み換え体アデノウイルスを単離し、その後、ＨＥＫ２９３細胞の中で増殖させた。ウイルスを、３サイクルの凍結解凍によって、感染させたＨＥＬ２９３細胞から放出させた。このウイルスを、２回の塩化セシウム濃度勾配遠心分離によってさらに精製し、ｐＨ７．２、４℃でリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。透析後、グリセロールを１０％の濃度になるように添加し、ウイルスを使用するまで−８０℃で保存した。ウイルス構築物を、感染性（２９３細胞上でのプラーク形成単位）、ウイルスのＰＣＲ分析、コード領域の配列分析、トランス遺伝子の発現、および内毒素の測定について特性決定した。
ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃ、ヒトＲＡＧＥ−Ｖ領域−Ｆｃ、ならびに、ヒトおよびマウスのＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐタグ融合タンパク質をコードするＤＮＡが含まれているＡｄｏｒｉ発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）（ＣＨＯ）細胞に、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して安定にトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントを、２０ｎＭおよび５０ｎＭのメトトレキセートの中で選択した。馴化培地を個々のクローンから回収し、ＲＡＧＥの発現を確認するためにドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロッティングを使用して分析した。（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５３７−６６；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：４８７−５１１；Ｐｉｔｔｍａｎ，Ｄ．Ｄ．ら、１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２２：２３６−２３７）。
可溶性ＲＡＧＥ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞またはトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を培養して、タンパク質精製のための馴化培地を回収した。タンパク質を、示したアフィニティータグ法を使用して精製した。精製したタンパク質について、還元性および非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色によって視覚化し（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、そして予想した分子量であることを示した。
（実施例２）
マウス抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体の作成
６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）を、ＧｅｎｅＧｕｎデバイス（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して皮下で免疫化した。全長のヒトＲＡＧＥをコードするｃＤＮＡが含まれているｐＡｄｏｒｉ発現ベクターを、コロイド状の金粒子（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に予め吸着させ、その後、皮下投与した。マウスを、２週間の間、１週間に２回、３μｇのベクターで免疫化した。マウスを、最後の免疫化の１週間後に採血し、抗体力価を評価した。最も高いＲＡＧＥ抗体力価を有していたマウスには、１０μｇの組み換え体ヒトＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐタンパク質のさらに１回の注射を、細胞融合の３日前に投与した。
脾細胞を、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）と４：１の割合で、５０％のポリエチレングリコール（ＭＷ１５００）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して融合させた。融合の後、細胞を播種し、そして９６ウェルプレートの中で、２０％のＦＢＳ、５％のＯｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１×ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０選択培地の中で１×１０５細胞／ウェルで培養した。
（実施例３）
ラット抗ＲＡＧＥモノクローナル抗体の作成
ＬＯＵラット（Ｈａｒｌａｎ，Ｈａｒｌａｎ，ＭＡ）ラットを、ＧｅｎｅＧｕｎ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して皮下で免疫化した。全長のマウスＲＡＧＥをコードするｃＤＮＡが含まれているｐＡｄｏｒｉ発現ベクターを、コロイド状の金粒子（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に吸着させ、その後、皮下投与した。ラットを、２週間おきに１回の３μｇのベクターで４回免疫化した。ラットを、最後の免疫化の１週間後に採血し、抗体力価を評価した。最も高いＲＡＧＥ抗体力価を有していたラットには、１０μｇの組み換え体マウスＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐタンパク質のさらに１回の注射を、細胞融合の３日前に投与した。
脾細胞を、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）と４：１の割合で、５０％のポリエチレングリコール（ＭＷ１５００）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して融合させた。融合の後、細胞を播種し、そして９６ウェルプレートの中で、２０％のＦＢＳ、５％のＯｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１×ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０選択培地の中で１×１０５細胞／ウェルで培養した。
（実施例４）
ハイブリドーマのスクリーニング
ラット抗マウスＲＡＧＥおよびマウス抗ヒトＲＡＧＥ ｍＡｂのパネルを、ＧｅｎｅＧｕｎと、マウスまたはヒトＲＡＧＥの全長のコード領域を発現するＡｄｏｒｉ発現プラスミドを使用して、ｃＲＮＡ免疫化によって作成した。ハイブリドーマの上清を、ＲＡＧＥを一時的に発現するヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＬ−２９３）上でのＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析によって、組み換え体ヒトまたはマウスＲＡＧＥ−Ｆｃに対する結合についてスクリーニングした。ポジティブな上清を、リガンドＨＭＧＢ１に対するＲＡＧＥの結合を中和するそれらの能力についてさらに試験した。７種類のラットモノクローナル抗体（ＸＴ−Ｍシリーズ）と７種類のマウスモノクローナル抗体（ＸＴ−Ｈシリーズ）を同定した。選択したハイブリドーマを、段階稀釈によって４回、そしてＦＡＣＳ選別によって１回サブクローニングした。馴化培地を安定なハイブリドーマ培養物から回収し、免疫グロブリンをプロテインＡ抗体精製カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して精製した。個々のｍＡｂのＩｇクラスを、マウスｍＡｂイソ型分類キット（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ）またはラットｍＡｂイソ型分類キットを用いて、示されているとおりに（ＩｓｏＳｔｒｉｐ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．）決定した。選択したラットおよびマウスのモノクローナル抗体のイソ型を表１（以下）に示す。
Figure 2009530423
 （実施例５）
ＦＡＣＳ分析
ヒト２９３細胞株を、ヒトおよびマウスのＲＡＧＥアデノウイルスに感染させた。感染させた細胞を、１％のＢＳＡを含むＰＢＳの中に、４×１０４細胞／ｍｌの密度で懸濁した。細胞を、１００μｌの試料（希釈した免疫血清、ハイブリドーマ上清または精製した抗体）とともに、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、ＰＥで標識したヤギ、抗マウス、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＧｌｏｓｔｒｕｐＤｅｎｍａｒｋ）とともに、暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。細胞に結合した蛍光シグナルを、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトフルオロメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって、１回の処理に５０００個の細胞を使用して測定した。ヨウ化プロピジウムを使用して、死亡した細胞を同定し、これを分析から排除した。７種類のマウスモノクローナル抗体ＸＴ−Ｈ１からＸＴ−Ｈ７と７種類のラットモノクローナル抗体ＸＴ−Ｍ１からＸＴ−Ｍ７が、細胞表面ｈＲＡＧＥに結合することがＦＡＣＳ分析によって示された（表２）。
（実施例６）
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
抗体を、標準的な手順を使用してハイブリドーマ上清から精製した。精製した抗体を、ＥＬＩＳＡを使用してＲＡＧＥの可溶性形態への結合について評価した。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、１００μｌの組み換え体ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃまたは組み換え体ヒトＲＡＧＥ Ｖ−領域−Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）でコーティングし、そして４℃で一晩インキュベートした。洗浄と、１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでのブロッキングの後、１００μｌの試料（示したように、試料はいくつかの形態、すなわち稀釈した免疫血清、ハイブリドーマ上清、または精製した抗体であった）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄し、結合した抗ＲＡＧＥ抗体を、ペルオキシダーゼ結合ヤギ、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＩｇＧ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、続いて基質ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともにインキュベーションすることによって検出した。吸光度を分光光度計において４５０ｎｍで決定した。モノクローナル抗体の濃度を、ペルオキシダーゼ標識ヤギ、抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して決定し、検量線を、精製したイソ型が適合するマウスＩｇＧによって作成した。７種類のマウス抗体ＸＴ−Ｈ１からＸＴ−Ｈ７、および７種類のラット抗体ＸＴ−Ｍ１からＸＴ−Ｍ７の、ｈＲＡＧＥ−Ｆｃ、ｈＲＡＧＥ Ｖ−領域−Ｆｃ、ｍＲＡＧＥ−Ｆｃ、およびｍＲＡＧＥ−ｓｔｒｅｐに結合する能力についてのＥＬＩＳＡの結果を、表２にまとめた。図２および３に示すように、ラット抗体ＸＴ−Ｍ４およびマウス抗体ＸＴ−Ｈ２はいずれも、ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃにも、そしてｈＲＡＧＥのＶドメインにも結合する。ヒトＲＡＧＥに対するＸＴ−Ｍ４の結合、およびヒトＲＡＧＥ Ｖドメインに対するＸＴ−Ｍ４の結合についてのＥＣ５０値は、それぞれ、３００ｐＭおよび１００ｐＭであった。ＸＴ−Ｈ２のヒトＲＡＧＥおよびヒトＲＡＧＥ Ｖドメインに対する結合についてのＥＣ５０値は、それぞれ、９０ｐＭおよび１００ｐＭであった。
Figure 2009530423
 （実施例７）
ＲＡＧＥリガンドおよび抗体競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
ＲＡＧＥモノクローナル抗体が、ＲＡＧＥに対するＲＡＧＥリガンド（ＨＭＧＢ１；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の結合に影響を与えるかどうかを決定するために、競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った。９６ウェルプレートを、１μｇ／ｍｌのＨＭＧＢ１で、４℃で一晩コーティングした。ウェルを洗浄し、上記のようにブロックし、そしてＲＡＧＥ−ＦｃまたはＴｒｋＢ−Ｆｃ（非特異的Ｆｃ対照）の１００μｌのプレインキュベート混合物（０．１μｇ／ｍｌ）と、様々な形態の示した抗体調製物（免疫血清の稀釈物、ハイブリドーマ上清、または精製した抗体）に対して、室温で１時間、曝した。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄し、リガンドが結合した組み換え体ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃを、ペルオキシダーゼ結合ヤギ、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、続いて基質ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）とともにインキュベーションすることによって検出した。いずれの抗体も伴わないか、または稀釈したプレ免疫血清を用いた、リガンドに対する組み換え体ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃの結合を対照として使用し、１００％の結合と定義した。競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって決定した、７種類のマウス抗体ＸＴ−Ｈ１からＸＴ−Ｈ７、および７種類のラット抗体ＸＴ−Ｍ１からＸＴ−Ｍ７の、ｈＲＡＧＥ−Ｆｃに対するＨＭＧＢ１の結合をブロックする能力を表３に示す。表３はまた、ｈＲＡＧＥの異なるリガンドであるアミロイドβ１−４２ペプチドのＲＡＧＥに対する結合をブロックするマウス抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、およびＸＴ−Ｈ５の能力、ならびに、同様の競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって決定した、マウスＲＡＧＥ−Ｆｃに対するＨＭＢＧ１の結合をブロックするラット抗体ＸＴ−Ｍ１からＸＴ−Ｍ７の能力をまとめている。図４に示すように、ラット抗体ＸＴ−Ｍ４およびマウス抗体ＸＴ−Ｈ２はいずれも、ヒトＲＡＧＥに対するＨＭＧＢ１の結合をブロックした。
Figure 2009530423
 同様の競合アプローチを使用して、抗体の対の間で関連する結合エピトープを決定した。最初に、１μｇ／ｍｌの組み換え体ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃを、９６ウェルプレート上に、４℃で一晩コーティングした。洗浄およびブロッキング（上記を参照のこと）の後、ウェルを、ビオチニル化標的抗体と競合抗体の稀釈物の１００μｌのプレインキュベート混合物に対して、室温で１時間暴露した。結合したビオチニル化抗体を、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出した。同様の競合アプローチを使用して、抗体の対の間での関係している結合エピトープを決定した。最初に、１μｇ／ｍｌの組み換え体ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃを、９６ウェルプレート上に、４℃で一晩コーティングした。洗浄およびブロッキング（上記を参照のこと）の後、ウェルを、ビオチニル化標的抗体と競合抗体の稀釈物の１００μｌのプレインキュベート混合物に対して、室温で１時間暴露した。結合したビオチニル化抗体を、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の使用、続く基質ＴＭＢ（ＢｉｏＦｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とのインキュベーションによって検出した。いずれの競合抗体も伴わない、組み換え体ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃに対するビオチニル化抗体の結合を対照として使用し、１００％と定義した。ｈＲＡＧＥに対する結合についてのラット抗体とマウス抗体との間での競合を分析した競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を表３に示す。図５は、ｈＲＡＧＥに対する結合についての、ラットＸＴ−Ｍ４と抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｍ２、ＸＴ−Ｍ４、ＸＴ−Ｍ６、およびＸＴ−Ｍ７との間での競合を分析した競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによるデータのグラフを示す。図５に示した競合ＥＬＩＳＡ結合データはＸＴ−Ｍ４とＸＴ−Ｈ２がヒトＲＡＧＥ上の重複する部位に結合することを明らかに示している。
（実施例８）
ヒトおよびマウスのＲＡＧＥ−Ｆｃに対するマウスとラットの抗ＲＡＧＥ抗体の結合についてのＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）結合アッセイ
Ａ．ヒトＲＡＧＥおよびマウスＲＡＧＥに対する結合
選択したマウス抗ＲＡＧＥ抗体とラット抗ＲＡＧＥ抗体の、ヒトＲＡＧＥおよびマウスＲＡＧＥ抗体に対する結合、ならびに、ヒトＲＡＧＥおよびマウスＲＡＧＥのＶドメインに対する結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）直接結合アッセイによって分析した。アッセイは、標準的なアミンカップリングを使用して、高密度（２０００ＲＵ）でＣＭチップ上にコーティングしたヒトＲＡＧＥ−ＦｃまたはマウスＲＡＧＥ−Ｆｃを使用して行った。２種類の濃度（５０ｎＭおよび１００ｎＭ）の抗ＲＡＧＥ抗体の溶液を、２連で、固定したＲＡＧＥ−Ｆｃタンパク質上に流した。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）技術は、固定したＲＡＧＥ抗原に対して抗ＲＡＧＥ抗体が結合した場合の表面層の屈折率の変化を利用する。結合を、表面から屈折するレーザー光線の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出した。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）直接結合アッセイの結果を表４にまとめる。
Figure 2009530423
 ヒトおよびマウスのＲＡＧＥに対するマウスおよびラットの抗ＲＡＧＥ抗体の結合についての動的速度定数（ｋａおよびｋｄ）と、結合定数および解離定数（ＫａおよびＫｄ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）直接結合アッセイによって決定した。結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）および解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）についてのシグナルの動的データの分析により、非特異的相互作用と特異的相互作用を区別することができる。マウスＸＴ−Ｈ２抗体とラットＸＴ−Ｍ４抗体のｈＲＡＧＥ−Ｆｃに対する結合についてのＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）直接結合アッセイによって決定した動的速度定数および平衡定数を表５に示す。
Figure 2009530423
 Ｂ．ヒトＲＡＧＥ Ｖドメインに対する結合
ヒトＲＡＧＥ Ｖドメインに対するマウスおよびラットの抗ＲＡＧＥ抗体の結合についての動的速度定数と、結合定数および解離定数もまた、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）直接結合アッセイによって決定した。ヒトＲＡＧＥ Ｖ−ドメイン−Ｆｃを、ＣＭ５チップ上にコーティングした抗ヒトＦｃ抗体によって捕捉し、そして固定したｈＲＡＧＥ Ｖドメイン−Ｆｃに対するマウスおよびラットの抗ＲＡＧＥ抗体の結合のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）直接結合アッセイを、全長のＲＡＧＥ−Ｆｃに対する結合のアッセイについて上記に記載したとおりに行った。
（実施例９）
抗ＲＡＧＥ抗体可変領域のアミノ酸配列
マウス抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、およびＸＴ−Ｈ７、ならびにラット抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｍ４の軽鎖および重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列をクローニングし、配列決定した。そして可変領域のアミノ酸配列を決定した。これらの６つの抗体のアラインメントした重鎖可変領域アミノ酸配列を図６に示し、そしてアラインメントした軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図７に示す。
（実施例１０）
ウサギ、ヒヒ、およびカニクイザルのＲＡＧＥをコードするｃＤＮＡ配列の単離
ＲＡＧＥをコードするｃＤＮＡ配列を、標準的な逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を使用して単離し、クローニングした。ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して製造業者のプロトコールにしたがって、肺組織から抽出し、精製した。ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と製造業者のプロトコールを使用して、ｍＲＮＡを逆転写させてｃＤＮＡを作成した。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）とヒヒ（Ｐａｐｉｏ ｃｙａｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ）のＲＡＧＥ配列を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）とプロトコール、オリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＡＴＧ（配列番号５９）および５’−ＧＧＡＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＧＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣ）（配列番号６０）（これらはＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＶ制限部位を付加する）を使用して、ｃＤＮＡから増幅させた。ＰＣＲ増幅産物を、ＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＶで消化し、プラスミドｐＡｄｏｒｉ１−３の中の対応する部位にクローニングした。ウサギＲＡＧＥを、オリゴヌクレオチド：５’−ＡＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＣＧＧＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＧＡ（配列番号６１）および５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＣＴＡＴＴＣＡＧＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＣＣＧＣＴＣＴＣ（配列番号６２）（これらはＳｐｅＩとＮｏｔＩ部位を付加する）を使用して上記のようにＲＴ−ＰＣＲを使用してクローニングし、ｐＡｒｏｄｉ１−３の中の対応する部位にクローニングした。得られたプラスミドの中のヒヒ、サルのＲＡＧＥ、およびウサギＲＡＧＥの２つの異性体をコードするクローニングしたｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を決定した。ヒヒＲＡＧＥをコードするヌクレオチド配列を図８に示し（配列番号６）、そしてカニクイザルＲＡＧＥをコードするヌクレオチド配列を図９（配列番号８）に示す。ウサギＲＡＧＥの２つの異性体をコードするヌクレオチド配列は、図１０（配列番号１０）と図１１（配列番号１２）に示す。
（実施例１１）
ヒヒＲＡＧＥをコードするゲノムＤＮＡ配列の単離
ＲＡＧＥをコードするヒヒのゲノムＤＮＡ配列を、標準的なゲノムクローニング技術を使用して単離した（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。λＤＡＳＨ ＩＩベクター中のヒヒ（Ｐａｐｉｏ ｃｙａｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ）のλゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ）を、３２ＰランダムプライムヒトＲＡＧＥ ｃＤＮＡを使用してスクリーニングした。ポジティブなファージプラークを単離し、単一の単離物を得るためのさらに２回のスクリーニングを行った。一般的な手順を使用して、λＤＮＡを調製し、ＮｏｔＩで消化し、そしてλゲノムアームから挿入断片であるＤＮＡを分離するために、サイズによって分画した。ＮｏｔＩ断片を、ＮｏｔＩで消化しておいたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋に連結させ、挿入断片を、ＲＡＧＥ特異的プライマーを使用して配列決定した。得られたクローンは、クローン１８．２と指定した。ヒヒＲＡＧＥをコードする、クローニングしたヒヒのゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列は、図１２Ａ〜１２Ｅに示す（配列番号１５）。
（実施例１２）
キメラＸＴ−Ｍ４抗体
キメラＸＴ−Ｍ４を、ヒトκ軽鎖定常領域およびＩｇＧ１重鎖定常領域に対して、それぞれ、ラット抗マウスＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｍ４の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を融合させることによって作成した。抗体のＦｃによって媒介されるエフェクター活性の可能性を低下させるために、キメラ変異Ｌ２３４ＡとＧ２３７Ａを、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＸＴ−Ｍ４に導入した。キメラ抗体には、分子番号ＸＴ−Ｍ４−Ａ−１を与えた。キメラＸＴ−Ｍ４抗体には、ヒトアミノ酸配列が９３．８３％、そしてラットのアミノ酸配列が６．１８％含まれている。
（実施例１３）
ＲＡＧＥに対するキメラＸＴ−Ｍ４の結合の評価
キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４と、選択したラットおよびマウスの抗ＲＡＧＥ抗体の、ヒトＲＡＧＥおよび他の種のＲＡＧＥに結合する能力、ならびに、ＲＡＧＥリガンドの結合をブロックする能力を、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）結合アッセイによって測定した。
Ａ．ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）結合アッセイによって測定した可溶性のヒトＲＡＧＥに対する結合
キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４、もとのラット抗体ＸＴ−Ｍ４、ならびに、マウス抗体ＸＴ−Ｈ２およびＸＴ−Ｈ５の可溶性のヒトＲＡＧＥ（ｈＲＡＧＥ−ＳＡ）に対する結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）捕捉結合アッセイによって測定した。アッセイは、５０００〜７０００ＲＵのＣＭ５ ＢＩＡチップ上に抗体をコーティングすることによって行った。精製した可溶性のヒトストレプトアビジンタグ化ＲＡＧＥ（ｈＲＡＧＥ−ＳＡ）の、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ，６．２５ｎＭ、３．１２ｎＭ、１．５６ｎＭ、および０ｎＭの濃度の溶液を３連で固定した抗体の上に流し、ｈＲＡＧＥ−ＳＡに対する結合について動的速度定数（ｋａおよびｋｄ）と、結合定数および解離定数（ＫａおよびＫｄ）を決定した。結果を表６に示す。
Figure 2009530423
 ＸＴ−Ｍ４抗体とキメラ抗体ＸＴ−Ｍ４は、同様の速度論で単量体の可溶性のヒトＲＡＧＥに結合する。ヒトの可溶性の単量体ＲＡＧＥに対するキメラＸＴ−Ｍ４の親和性は、およそ５．５ｎＭである。
Ｂ．ＲＡＧＥリガンド競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４抗体とラット抗体ＸＴ−Ｍ４が、ｈＲＡＧＥ−Ｆｃに対するＲＡＧＥリガンドＨＭＧＢ１、アミロイドβ１−４２ペプチド、Ｓ１００−Ａ、およびＳ１００−Ｂの結合をブロックする能力を、実施例７に記載したリガンド競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって決定した。図１３に示すように、キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４とＸＴ−Ｍ４は、ヒトＲＡＧＥに対するＨＭＢＧ１、アミロイドβ１−４２ペプチド、Ｓ１００−Ａ、およびＳ１００−Ｂの結合をブロックするそれらの能力はほぼ同じであった。
Ｃ．抗体競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
ｈＲＡＧＥ−Ｆｃに対する結合においてラット抗体ＸＴ−Ｍ４とマウス抗体ＸＴ−Ｈ２と競合するキメラ抗体ＸＴ−Ｍ４抗体の能力を、抗体競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって、ビオチン結合ＸＴ−Ｍ４抗体とＸＴ−Ｈ２抗体を使用して、実施例７に記載した様式で決定した。図１４に示すように、キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４は、ｈＲＡＧＥ−Ｆｃに対する結合において、ラット抗体ＸＴ−Ｍ４と、そしてマウス抗体ＸＴ−Ｈ２と競合する。
（実施例１４）
様々な種のＲＡＧＥに対する抗体の結合を、細胞をベースとするＥＬＩＳＡによって測定した
細胞のトランスフェクション
ヒト胚性腎臓２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｍａｎａｓｓａｎ，ＶＡ）細胞を、１０ｃｍ２の組織培養プレートあたり５×１０６細胞でプレートし、３７℃で一晩培養した。翌日、細胞を、ＬＦ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を使用して、製造業者のプロトコールを使用して４：１の試薬対プラスミドＤＮＡ比で、ＲＡＧＥ発現プラスミド（マウス、ヒト、ヒヒ、カニクイザル、またはウサギのＲＡＧＥをコードするｐＡｄｏｒｉ１−３ベクター）でトランスフェクトした。細胞を、トリプシンを使用してトランスフェクションの４８時間後に回収し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、その後、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で、無血清増殖培地の中に懸濁させた。
細胞をベースとするＥＬＩＳＡ
１μｇの一次抗体を、９６ウェルプレートの中の１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳの中に、１：２または１：３で段階稀釈した。無血清増殖培地の中の２×１０６細胞／ｍｌのＲＡＧＥでトランスフェクトした２９３細胞または対照であるもとの２９３細胞（５０μｌ）を、１×１０５細胞／ウェルの最終濃度となるようにＵ底９６ウェルプレートに添加した。細胞を、１６００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を、手で一度だけ振り回すことによって、穏やかに廃棄し、プレートを、細胞ペレットを緩ませるためにゆっくりとたたいた。１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む冷却したＰＢＳ中の稀釈した一次抗ＲＡＧＥ抗体またはイソ型適合対照抗体（１００μｌ）を細胞に添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞を、１００μｌの稀釈した二次抗ＩｇＧ抗体ＨＲＰ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で、氷上で１時間染色した。一次抗体とのインキュベーション、および二次抗体とのインキュベーションのそれぞれの工程のあと、細胞を、氷冷したＰＢＳで３回洗浄した。１００μｌの基質ＴＭＢ１成分（ＢＩＯ ＦＸ，ＴＭＢＷ−０１００−０１）をプレートに添加し、室温で５〜３０分間インキュベートした。発色を、１００μｌの０．１８ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって停止させた。細胞を遠心分離し、上清を新しいプレートに移し、４５０ｎｍで読み取った（Ｓｏｆｔ ＭＡＸ ｐｒｏ ４．０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）。
細胞をベースとするＥＬＩＳＡによって決定した、ヒトおよびヒヒのＲＡＧＥに結合する抗体キメラＸＴ−Ｍ４とＸＴ−Ｍ４の能力を図１４に示す。細胞をベースとするＥＬＩＳＡによって決定した、２９３細胞によって発現された細胞表面のヒト、ヒヒ、サル、マウス、またはウサギのＲＡＧＥに対するキメラ抗体ＸＴ−Ｍ４とＸＴ−Ｍ４の結合についてのＥＣ５０値を表７に示す。
Figure 2009530423
 （実施例１５）
様々な種のＲＡＧＥに対する結合−免疫組織化学染色によって決定した
キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４、ラットＸＴ−Ｍ４抗体と、マウス抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、およびＸＴ−Ｈ５の、ヒト、カニクイザル、ヒヒ、およびウサギの肺組織の中の内因性の細胞表面ＲＡＧＥに結合する能力を、肺組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によって決定した。
安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、マウスおよびヒトの全長のＲＡＧＥタンパク質を発現するように操作した。マウスおよびヒトのＲＡＧＥ ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターにクローニングし、直鎖状にし、そしてリポフェクチン法を使用してＣＨＯ細胞にトランスフェクトした（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：５３７−６６；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：４８７−５１１；Ｐｉｔｔｍａｎ，Ｄ．Ｄ．ら、１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２２２：２３６）。細胞を、２０ｎＭのメトトレキセートの中でさらに選択し、細胞抽出物を個々のクローンから回収し、発現を確認するためにＳＤＳドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とウェスタンブロッティングによって分析した。
ヒヒ、カニクイザル、ウサギから単離したＲＡＧＥ肺組織、あるいはヒトＲＡＧＥを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞、または対照のＣＨＯ細胞についての免疫組織化学を、標準的な技術を使用して行った。ＲＡＧＥ抗体とラットのＩｇＧ２ｂイソ型対照またはマウスのイソ型対照を、１〜１５ｍｇで使用した。キメラＸＴ−Ｍ４、ＸＴ−Ｍ４−ｈＶＨ−Ｖ２．０−２ｍ／ｈＶＬ−Ｖ２．１０、ＸＴ−Ｍ４−ｈＶＨ−Ｖ２．０−２ｍ／ｈＶＬ−Ｖ２．１１、ＸＴ−Ｍ４−ｈＶＨ−Ｖ２．０−２ｍ／ｈＶＬ−Ｖ２．１４をビオチニル化し、そしてＳｉｇｍａ ＩｇＧ１ビオチニル化対照抗体を、０．２、１、５、および１０μｇ／ｍｌで使用した。ＨＲＰおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、またはＦＩＴＣと結合させた抗ビオチンでの検出の後、切片をまた、４’−６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。
図１５は、キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４が、カニクイザル、ウサギ、およびヒヒの肺組織の中のＲＡＧＥに結合することを示す。ポジティブなＩＨＣ−染色パターンは、ＲＡＧＥを生産する細胞をキメラＸＴ−Ｍ４と接触させた試料の中で見ることができたが、ＲＡＧＥまたはＲＡＧＥ結合抗体のいずれかが存在しない試料の中では見ることはできなかった。図１６は、ラット抗体ＸＴ−Ｍ４が、正常なヒトの肺、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のヒトの肺の中のＲＡＧＥに結合することを示している。肺組織切片のＩＨＣ染色によって決定した、敗血症のヒヒの肺および正常なカニクイザルの肺の中の内因性の細胞表面ＲＡＧＥに対する、ラットＸＴ−Ｍ４抗体と、マウス抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、およびＸＴ−Ｈ５の結合を表８にまとめる。ｈＲＡＧＥをコードするＤＮＡを発現する発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、ポジティブ対照として使用する。
Figure 2009530423
 （実施例１６）
マウス抗ヒトＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｈ２をヒト化するための分子モデル化
マウス抗ヒトＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｈ２ ＨＶドメインの分子モデル化
マウスＸＴ−Ｈ２重鎖をモデル化するための抗体構造の鋳型を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）配列データベースについてのＢＬＡＳＴＰ検索に基づいて選択した。マウスＸＴ−Ｈ２の分子モデルを、６つの鋳型構造（１ＳＹ６（抗ＣＤ３抗体）、１ＭＲＦ（抗ＲＮＡ抗体）、および１ＲＩＨ（抗腫瘍抗体））に基づいて、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）のＨｏｍｏｌｏｇｙモジュールを使用して構築した。鋳型の構造的に保存されている領域（ＳＣＲ）を、それぞれの分子についてのＣα距離マトリックスに基づいて決定し、鋳型構造を、ＳＣＲの中の対応する原子の最小ＲＭＳ偏差に基づいて重ね合わせた。標的タンパク質であるラットＸＴ−Ｈ２ ＶＨの配列を、重ね合わせた鋳型タンパク質の配列に対してアラインメントし、ＳＣＲの原子座標を、標的タンパク質の対応する残基に割り当てた。個々のＳＣＲの中での標的と鋳型との間での配列類似性の程度に基づいて、様々な鋳型からの座標を、様々なＳＣＲに使用した。ＳＣＲに含まれないループと可変領域についての座標は、Ｈｏｍｏｌｏｇｙモジュールにおいて実行したＳｅａｒｃｈ Ｌｏｏｐ法またはＧｅｎｅｒａｔｅ Ｌｏｏｐ法によって作成した。
簡単に説明すると、Ｓｅａｒｃｈ Ｌｏｏｐ法は、隣接しているＳＣＲ残基のＣα距離マトリックスを、同じ数の隣接している残基と、所定の長さの介在するペプチドセグメントを有しているタンパク質構造に由来する予め計算したマトリックスと比較することによって、２つのＳＣＲの間の領域を模倣するタンパク質構造をスキャンする。Ｓｅａｒｃｈ Ｌｏｏｐ法による出力を、隣接するＳＣＲ残基において、最小ＲＭＳ偏差と最大の配列同一性を有している適合を最初に見出すために評価した。その後、一致の可能性と標的ループの配列との間での配列類似性の評価を行った。新しい原子座標を生じるＧｅｎｅｒａｔｅ Ｌｏｏｐ法は、Ｓｅａｒｃｈ Ｌｏｏｐによっては最適な一致を見出すことができなかった場合に使用した。アミノ酸側鎖の立体構造は、アミノ酸残基が鋳型と標的において同じである場合には、鋳型と同じに維持された。しかし、回転異性体の立体構造の検索を行い、そしてエネルギー的にもっとも好ましい立体構造を、鋳型と標的において同じではない残基について保持した。２つの隣接するＳＣＲの間でのスプライシング点（ｓｐｌｉｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を最適化するために、その座標を様々な鋳型、およびＳＣＲとループの間のものから適応させ、ＨｏｍｏｌｏｇｙモジュールのＳｐｌｉｃｅ Ｒｅｐａｉｒ機能を使用した。Ｓｐｌｉｃｅ Ｒｅｐａｉｒ分子機構のシミュレーションを、２つのＳＣＲの間、またはＳＣＲと可変領域の間の接点の最適な結合の長さと結合角に導くように設定した。最後に、モデルを、５ｋｃａｌ／（ｍｏｌÅ）または５００サイクルの最大偏差になるまでＳｔｅｅｐｅｓｔ Ｄｅｓｃｅｎｔｓアルゴリズムを使用して、そして５ｋｃａｌ／（ｍｏｌÅ）または２０００サイクルの最大偏差になるまでＧｒａｄｉｅｎｔｓアルゴリズムを使用して、エネルギーを最小化させた。このモデルの質を、ＨｏｍｏｌｏｇｙモジュールのＰｒｏＳｔａｔ／Ｓｔｒｕｃｔ＿Ｃｈｅｃｋ ｕｔｉｌｉｔｙを使用して評価した。
ヒト抗ＲＡＧＥ ＸＴ−Ｈ２ ＨＶドメインの分子モデル化
ヒト化（ＣＤＲ移植）抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｈ２重鎖の分子モデルを、使用した鋳型が異なることを除きマウスＸＴ−Ｈ２抗体重鎖のモデル化について記載したものと同じ手順にしたがって、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩを用いて構築した。この場合に使用した構造鋳型は、１Ｌ７Ｉ（抗Ｅｒｂ Ｂ２抗体）、１ＦＧＶ（抗ＣＤ１８抗体）、１ＪＰＳ（抗組織抗体）、および１Ｎ８Ｚ（抗Ｈｅｒ２抗体）であった。
モデルの分析とフレームワーク逆変異の予想−ヒト化
もとのマウス抗体モデルを、以下の特徴の１つ以上の類似性および相違に関して、ＣＤＲを移植したヒト化バージョンのモデルと比較した。すなわち、ＣＤＲ−フレームワークの接触、ＣＤＲの立体構造に影響を与える可能性がある水素結合、およびフレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、フレームワーク４、そして３つのＣＤＲのような様々な領域の中でのＲＭＳの偏差である。
以下の逆変異は、単独で、または組み合わせにおいて、ＣＤＲの移植による良好なヒト化に重要であると予想した。Ｅ４６Ｙ、Ｒ７２Ａ、Ｎ７７Ｓ、Ｎ７４Ｋ、Ｒ６７Ｋ、Ｋ７６Ｓ、Ａ２３Ｋ、Ｆ６８Ａ、Ｒ３８Ｋ、Ａ４０Ｒ。
（実施例１７）
ラット抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｍ４をヒト化するための分子モデル化
ラット抗マウスＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｍ４ ＨＶドメインの分子モデル化
ラットＸＴ−Ｍ４重鎖のモデル化のための抗体構造の鋳型を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）配列データベースについてのＢＬＡＳＴＰ検索に基づいて選択した。ラットＸＴ−Ｍ４の分子モデルを、６つの鋳型構造（１ＱＫＺ（抗ペプチド抗体）、１ＩＧＴ（抗イヌリンパ腫モノクローナル抗体）、８ＦＡＢ（抗−ｐ−アゾフェニルアルソナート抗体（ａｎｔｉ−ｐ−ａｚｏｐｈｅｎｙｌ ａｒｓｏｎａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ））、１ＭＱＫ（抗チトクロームＣオキシダーゼ抗体）、１Ｈ０Ｄ（抗アンジオゲニン抗体）、および１ＭＨＰ（抗α１β抗体）に基づいて、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）のＨｏｍｏｌｏｇｙモジュールを使用して構築した。鋳型の構造的に保存されている領域（ＳＣＲ）を、それぞれの分子についてのＣα距離マトリックスに基づいて決定し、鋳型構造を、ＳＣＲの中の対応する原子の最小ＲＭＳ偏差に基づいて重ね合わせた。標的タンパク質であるラットＸＴ−Ｍ４ ＶＨの配列を、重ね合わせた鋳型タンパク質の配列に対してアラインメントし、ＳＣＲの原子座標を、標的タンパク質の対応する残基に割り当てた。個々のＳＣＲの中での標的鋳型間の配列類似性の程度に基づいて、様々な鋳型からの座標を、様々なＳＣＲに使用した。ＳＣＲに含まれないループと可変領域についての座標は、Ｈｏｍｏｌｏｇｙモジュールにおいて実行したＳｅａｒｃｈ ＬｏｏｐまたはＧｅｎｅｒａｔｅ Ｌｏｏｐ法によって作成した。
簡単に説明すると、Ｓｅａｒｃｈ Ｌｏｏｐ法は、隣接しているＳＣＲ残基のＣα距離マトリックスを、同じ数の隣接している残基と、所定の長さの介在するペプチドセグメントを有しているタンパク質構造に由来する予め計算したマトリックスと比較することによって、２つのＳＣＲの間の領域を模倣するタンパク質構造をスキャンする。Ｓｅａｒｃｈ Ｌｏｏｐ法による出力を、隣接するＳＣＲ残基において、最小ＲＭＳ偏差と最大の配列同一性を有している適合を最初に見出すために評価した。その後、適合の可溶性と標的ループ配列との間での配列類似性の評価を行った。新しい原子座標を生じるＧｅｎｅｒａｔｅ Ｌｏｏｐ法は、Ｓｅａｒｃｈ Ｌｏｏｐを、最適な一致を見出すことができなかった場合に使用した。アミノ酸側鎖の立体構造は、アミノ酸残基が鋳型と標的において同じである場合には、鋳型と同じに維持される。しかし、回転異性体の立体構造の検索を行い、そしてエネルギー的にもっとも好ましい立体構造を、鋳型と標的において同じではない残基について保持した。２つの隣接するＳＣＲの間でのスプライシング点（ｓｐｌｉｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を最適化するために、その座標を様々な鋳型、およびＳＣＲとループの間のものから適応させ、ＨｏｍｏｌｏｇｙモジュールのＳｐｌｉｃｅ Ｒｅｐａｉｒ機能を使用した。Ｓｐｌｉｃｅ Ｒｅｐａｉｒの分子機構のシミュレーションを、２つのＳＣＲの間、またはＳＣＲと可変領域の間の接点の最適な結合の長さと結合角に導くように設定した。最後に、モデルを、５ｋｃａｌ（ｍｏｌÅ）または５００サイクルの最大偏差になるまでＳｔｅｅｐｅｓｔ Ｄｅｓｃｅｎｔｓアルゴリズムを使用して、そして５ｋｃａｌ／（ｍｏｌÅ）または２０００サイクルの最大偏差になるまでＧｒａｄｉｅｎｔｓアルゴリズムを使用して、エネルギーを最小化させた。このモデルの質を、 ＨｏｍｏｌｏｇｙモジュールのＰｒｏＳｔａｔ／Ｓｔｒｕｃｔ＿Ｃｈｅｃｋ ｕｔｉｌｉｔｙを使用して評価した。
ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変ドメイン
ＸＴ Ｍ４軽鎖可変ドメインの構造モデルを、Ｍｏｄｅｌｅｒ ８ｖ２を用いて、鋳型として１Ｋ６Ｑ（抗組織因子抗体）、１ＷＴＬ、１Ｄ５Ｂ（抗体ＡＺ−２８）、および１ＢＯＧ（抗ｐ２４抗体）を使用して作成した。それぞれの標的について、１００個の最初のモデルのうち、分子の確立密度関数（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）によって定義される制限違反が最も少ない１つのモデルを、さらなる最適化のために選択した。モデルの最適化のために、Ｓｔｅｅｐｓｅｔ Ｄｅｓｃｅｎｔ、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ、およびＡｄｏｐｔｅｄ Ｂａｓｉｓ Ｎｅｗｔｏｎ Ｒａｐｈｓｏｎ法からなるエネルギー最小化カスケードを、０．０１のＲＭＳ勾配が満たされるまで、Ｃｈａｒｍｍ ２７ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）とＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ １．６（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）において実行したＧｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎ ｉｍｐｌｉｃｉｔ ｓｏｌｖａｔｉｏｎを使用して行った。エネルギーの最小化の際には、骨格原子の運動は、１０のマスフォース（ｍａｓｓ ｆｏｒｃｅ）の高調波の拘束（ｈａｒｍｏｎｉｃ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）を使用して抑制した。
ヒト化抗ＲＡＧＥ ＸＴ−Ｍ４ ＶＨドメインの分子モデル化
ヒト化（ＣＤＲ移植）抗ＲＡＧＥ ＸＴ Ｍ４抗体重鎖の分子モデルを、使用した鋳型が異なることを除きラットＸＴ Ｍ４抗体重鎖のモデル化について記載したものと同じ手順にしたがって、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩを用いて構築した。この場合に使用した構造鋳型は、１ＭＨＰ（抗αβ１抗体）、１ＩＧＴ（抗イヌリンパ腫モノクローナル抗体）、８ＦＡＢ（抗−ｐ−アゾフェニルアルソナート抗体）、１ＭＱＫ（抗チトクロームＣオキシダーゼ抗体）、および１Ｈ０Ｄ（抗アンジオゲニン抗体）であった。
ヒト化ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変ドメイン
ヒト化（ＣＤＲ移植）抗ＲＡＧＥ ＸＴ Ｍ４抗体軽鎖の分子モデルを、使用した鋳型が異なることを除きラットＸＴ Ｍ４抗体重鎖のモデル化について記載したものと同じ手順にしたがって、Ｍｏｄｅｌｅｒ ８ｖ２を使用して構築した。この場合に使用した構造鋳型は、鋳型としての１Ｂ６Ｄ、１ＦＧＶ（抗ＣＤ１８抗体）、１ＵＪ３（抗組織因子抗体）、および１ＷＴＬであった。
モデルの分析とフレームワーク逆変異の予想−ヒト化
もとのラット抗体モデルを、以下の特徴の１つ以上の類似性および相違に関して、ＣＤＲを移植したヒト化バージョンのモデルと比較した。すなわち、ＣＤＲ−フレームワークの接触、ＣＤＲの立体構造に影響を与える可能性がある水素結合、フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、フレームワーク４、および３つのＣＤＲのような様々な領域の中でのＲＭＳの偏差、ならびに、計算した残基−残基相互作用のエネルギーである。同定した可能性のある逆変異（単数または複数）を、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩまたはＭｏｄｅｌｅｒ ８ｖ２のいずれかを使用して構築した別の回のモデルに、単独で、または組み合わせて組み込んだ。そして変異体のモデルを、コンピューターでの変異の妥当性を評価するために、もとのラット抗体モデルに対して比較した。
以下の骨格の変異は、単独で、または組み合わせにおいて、ＣＤＲの移植による良好なヒト化に重要であると予想した。
重鎖：Ｌ１１４Ｍ、Ｔ１１３Ｖ、およびＡ８８Ｓ
軽鎖：Ｋ４５Ｒ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｍ、Ｄ７０Ｉ、Ｇ６６Ｒ、Ｔ８５Ｄ、Ｙ８７Ｈ、Ｔ６９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ７１Ｙ。
（実施例１８）
マウスＸＴ−Ｈ２抗体とラットＸＴ−Ｍ４抗体のＣＤＲでヒト化した可変領域
ヒト化重鎖可変領域を、表９に示したヒト生殖細胞系列フレームワーク配列上にマウスＸＴ−Ｈ２抗体およびＸＴ−Ｍ４抗体のＣＤＲを移植し、そして選択した逆変異を導入することによって調製した。
Figure 2009530423
 ヒト化マウスＸＴ−Ｈ２重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ、図１７（配列番号２８〜３１）と図１８（配列番号３２〜３５）に示す。
ヒト化ラットＸＴ−Ｍ４重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ、図１９（配列番号３６〜３８）と図２０Ａ〜２０Ｂ（配列番号３９〜４９）に示す。
フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の配列と、ヒト化可変領域の中の特異的な逆変異を、表１０において特定した。
標準的な手順を使用して、ヒト化可変領域をコードするＤＮＡ配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域をコードする配列を含む発現ベクターにサブクローニングし、全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ配列を、ＣＯＳ細胞の中で発現させた。重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ｐＳＭＥＤ２ｈｌｇＧ１ｍ＿（Ｌ２３４，Ｌ２３７）ｃＤＮＡベクターにサブクローニングして、ヒト化ＩｇＧ抗体重鎖を生産させた。軽鎖可変領域をコードするＤＮＡをｐＳＭＥＮ２ ｈκベクターにサブクローニングして、ヒト化κ抗体軽鎖を生産させた。図２１を参照のこと。
Figure 2009530423
 （実施例１９）
競合ＥＬＩＳＡプロトコール
ヒト化ＸＴ−Ｈ２およびＸＴ−Ｍ４抗体とキメラＸＴ−Ｍ４の、ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃに対する結合を、競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって特性決定した。競合因子を生成するために、もとのラットＸＴ−Ｍ４抗体をビオチニル化した。ＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌのヒトＲＡＧＥ−Ｆｃで一晩コーティングした。様々な濃度のビオチニル化ＸＴ−Ｍ４（０．１１〜２５０ｎｇ／ｍｌ）を、ウェルに２連で添加し、これをインキュベートし、洗浄し、そしてストレプトアビジン−ＨＲＰで検出した。ビオチニル化したもとのラットＸＴ−Ｍ４について計算したＥＤ５０は５ｎｇ／ｍｌであった。キメラおよびそれぞれのヒト化ＸＴ−Ｍ４抗体のＩＣ５０を、１２．５ｎｇ／ｍｌのビオチニル化したもとのＸＴ−Ｍ４抗体と競合させた場合に計算した。簡単に説明すると、プレートを、１μｇ／ｍｌのヒトＲＡＧＥ−Ｆｃで一晩コーティングした。１２．５ｎｇ／ｍｌのビオチニル化したもとのラットＸＴ−Ｍ４と混合した様々な濃度のキメラ抗体またはヒト化抗体を、ウェルに２連で添加した（９ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの範囲）。ビオチニル化したもとのラットＸＴ−Ｍ４抗体を、ストレプトアビジン−ＨＲＰで検出し、ＩＣ５０値を計算した。競合ＥＬＩＳＡ分析によってヒト化抗体について決定したＩＣ５０値を表１１に示す。
Figure 2009530423
 （実施例２０）
他の細胞表面受容体に対するキメラおよびヒト化ＸＴ−Ｍ４抗体の交差反応性
ヒト化ＸＴ−Ｍ４抗体であるＸＴ−Ｍ４−ｈＶＨ−Ｖ２．０−２ｍ／ｈＶＬ−Ｖ２．１０とＸＴ−Ｍ４−ｈＶＨ−Ｖ２．０−２ｍ／ｈＶＬ−Ｖ２．１１を、他のＲＡＧＥ様受容体との交差反応性についてキメラＸＴ−Ｍ４とともに試験した。これらの受容体は、これらがＲＡＧＥと同様に細胞表面で発現され、そしてリガンドとのそれらの相互作用が同様に電荷に依存するとの理由から選択した。試験した受容体は、ｒｈＶＣＡＭ−１、ｒｈＩＣＡＭ−１−Ｆｃ、ｒｈＴＬＲ４（Ｃ末端Ｈｉｓタグ）、ｒｈＮＣＡＭ−１、ｒｈＢ７−Ｈ１−Ｆｃ ｍＬｏｘ１−Ｆｃ、ｈＬｏｘ１−Ｆｃ、およびｈＲＡＧＥ−Ｆｃ（ポジティブ対照として）であった。ＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌの列挙した受容体タンパク質で一晩コーティングした。様々な濃度（０．０３から２０μｇ／ｍｌ）の上記に列挙したヒト化およびキメラＸＴ−Ｍ４抗体を、ウェルに２連で添加し、インキュベートし、洗浄し、そして抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰで検出した。表１２は、ヒトおよびマウスの細胞表面タンパク質に対する、キメラおよびヒト化ＸＴ−Ｍ４抗体の結合の直接結合ＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。データは、受容体と２０μｇ／ｍｌ（試験した最も高い濃度）の抗体との間で検出した結合についてのＯＤ４５０値を示す。
Figure 2009530423
 （実施例２１）
可溶性ヒトＲＡＧＥに対する結合についてのＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）結合アッセイ
キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４とヒト化ＸＴ−Ｍ４抗体の、可溶性のヒトＲＡＧＥ（ｈＲＡＧＥ−ＳＡ）および可溶性のマウスＲＡＧＥ（ｍＲＡＧＥ−ＳＡ）に対する結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）捕捉結合アッセイによって測定した。アッセイを、フローセル１〜４の中で５０００ＲＵのＣＭ５ ＢＩＡチップ（ｐＨ５．０、７分）上に抗ヒトＦｃ抗体をコーティングすることによって行った。個々の抗体を、フローセル２〜４の中で抗Ｆｃ抗体上に２．０μｇ／ｍｌで流すことによって捕捉した（フローセル１を参照として使用した）。１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、および０ｎＭの濃度の精製した可溶性のヒトストレプトアビジンタグ化ＲＡＧＥ（ｈＲＡＧＥ−ＳＡ）の溶液を、２連で固定化した抗体上に流し、５分間解離させ、そしてｈＲＡＧＥ−ＳＡに対する結合についての動的速度定数（ｋａおよびｋｄ）と結合定数および解離定数（ＫａおよびＫｄ）を決定した。ｈＲＡＧＥ−ＳＡおよびｍＲＡＧＥ−ＳＡに対する結合についての、キメラＸＴ−Ｍ４およびヒト化抗体ＸＴ−Ｍ４−Ｖ１０、ＸＴ−Ｍ４−Ｖ１１、およびＸＴ−Ｍ４−Ｖ１４の結合結果を、それぞれ、図２３および２４に示す。
（実施例２２）
リード抗体ＸＴ−Ｈ２の種間交差反応性の最適化
種間交差反応性を、ＸＴ−Ｈ２抗体をランダムに変異させ、タンパク質変異体のライブラリーを作成し、そしてマウス−ヒトＲＡＧＥ交差反応性を生じる変異を獲得したこれらの分子を選択的に富化させるプロセスによって操作した。リボソームディスプレイ技術（Ｈａｎｅｓら、２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２８：４０４−３０）とファージディスプレイ技術（ＭｃＡｆｆｅｒｔｙら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−４）技術を使用した。
抗体ＸＴ−Ｈ２およびＨＴ−Ｍ４をベースとするＳｃＦｖ抗体の調製
Ａ．ＸＴ−Ｈ２をベースとするＳｃＦｖ抗体
ＸＴ−Ｈ２のＶ領域を含む２つのＳｃＦｖ構築物を、可撓性リンカーＤＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号５０）によって連結したＶＨ／ＶＬ形式またはＶＬ／ＶＨ形式のいずれかで合成した。ＶＬ−ＶＨおよびＶＨ−ＶＬとして立体配置したＳｃＦｖ構築物の配列を、それぞれ図２５（配列番号５１）と図２６（配列番号５２）に示す。
Ｂ．ＸＴ−Ｍ４をベースとするＳｃＦｖ抗体
ＸＴ−Ｍ４のＶ領域を含む２つのＳｃＦｖ構築物を、可撓性リンカーＤＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号５０）によって連結したＶＨ／ＶＬ形式またはＶＬ／ＶＨ形式のいずれかで合成した。ＶＬ−ＶＨおよびＶＨ−ＶＬとして立体配置したＳｃＦｖ構築物の配列を、それぞれ図２７（配列番号５４）と図２８（配列番号５３）に示す。
図２９は、インビトロで転写され、翻訳されたＭ４およびＨ２構築物についてのＥＬＩＳＡデータを示す。ＥＬＩＳＡプレートを、重炭酸緩衝液中のヒトＲＡＧＥ−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）またはＢＳＡ（２００μｇ／ｍｌ）で、４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で洗浄し、そして２％の粉乳ＰＢＳで、室温で１時間、ブロックした。プレートを、インビトロで翻訳されたＳｃＦｖとともに、室温で２時間インキュベートした。プレートをブロックし、抗Ｆｌａｇ抗体（１／１０００希釈）、その後にウサギ抗マウスＨＲＰ（１／１０００稀釈）で検出した。データは、ＶＬ／ＶＨまたはＶＨ／ＶＬのいずれの立体配置においても、ＸＴ−Ｈ２およびＸＴ−Ｍ４抗ＲＡＧＥ抗体の可変領域のＳｃＦｖ構築物が、ヒトＲＡＧＥに特異的に結合する機能性の折り畳まれたタンパク質を生産することができることを示している。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって決定した場合には、いずれの形式においても、ＳｃＦｖのＫｄの値を使用して、選択実験に最適な抗原濃度を決定した。
Ｃ．改善されたマウス／ヒトＲＡＧＥ交差反応性を有している変異体を回収するための選択およびスクリーニングストラテジー
変異体のライブラリーを、変異性ＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）によって作成した（Ｇｒａｍら、１９９２、ＰＮＡＳ ８９：３５７６−８０）。この突然変異誘発ストラテジーによって、ＳｃＦｖ遺伝子の長さ全体にわたってランダムな変異を導入した。その後、このライブラリーを、確立されている手順を使用して転写させ、翻訳させた（例えば、Ｈａｎｅｓら、２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｅｚｙｍｏｌ．，３２８：４０４−３０）。このライブラリーについて、ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃについての１回目の選択を行い、そして結合していないリボゾーム複合体を洗い流し、そして抗原が結合したリボソーム複合体を溶出させた。ＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡに変換させ、そしてマウスＲＡＧＥ−Ｆｃについての２回目の選択を行った。この別の選択ストラテジーによって、ヒトＲＡＧＥ−ＦｃとマウスＲＡＧＥ−Ｆｃの両方に結合するクローンを優先的に富化させた。この選択による出力について、その後、２回目の変異性ＰＣＲを行った。作成したライブラリーについては、その後、ヒトＲＡＧＥ−ＦｃとマウスＲＡＧＥ−Ｆｃについてそれぞれ３回目の選択を行った。このプロセスを必要に応じて繰り返した。それぞれの選択工程によるＲＮＡの出力プールをｃＤＮＡに変換し、そしてタンパク質発現ベクターｐＷＲＩＬ−１にクローニングして、変異体ＳｃＦｖの種間交差反応性を評価した。多様性のプールもまた配列決定して、選択が種間交差反応性を有している優性クローンに向かって動いているかどうかを決定するために多様性を評価した。
（実施例２３）
リード抗体ＸＴ−Ｍ４の親和性成熟
改善された親和性は投与回数もしくは投与頻度の減少、および／または高い効力という可能性のある利点になって現れる。ｈＲＡＧＥに対する親和性を、無作為な変異性ＰＣＲ突然変異誘発と組み合わせたＶＨ−ＣＤＲ３に対する標的化された突然変異誘発の組み合わせプロセスを使用して、親和性成熟によって改善した（Ｇｒａｍら、１９９２，ＰＮＡＳ ８９：３５７６−８０）。これによって抗体変異体のライブラリーを作成し、そこから、マウスＲＡＧＥ−Ｆｃについての種間交差反応性を維持したままヒトＲＡＧＥに対する親和性が改善された分子を回収した。リボソームディスプレイ技術（Ｈａｎｅｓら、１９９７，前出）とファージディスプレイ技術（ＭｃＡｆｆｅｒｔｙら、１９８９，前出）技術を使用した。
図３０は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の中で可溶性タンパク質として発現させ、そしてヒトＲＡＧＥ−ＦｃとＢＳＡに対する結合について試験した、ＶＬ−ＶＨ形式のｐＷＲＩＬ−１の中のＸＴ−Ｍ４およびＸＴ−Ｈ２ ＳｃＦｖ構築物についてのＥＬＩＳＡ結合データを示す。ＡｃｔＲＩＩｂは、ネガティブ対照として同じベクターから発現させた非結合タンパク質を示す。ＥＬＩＳＡプレートを、重炭酸緩衝液中のヒトＲＡＧＥ−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）またはＢＳＡ（２００μｇ／ｍｌ）で、４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で洗浄し、そして２％の粉乳ＰＢＳで、室温で１時間、ブロックした。２００ｍｌの大腸菌培養物のペリプラズムの調製を、標準的な手順を使用して行った。精製していないＳｃＦｖ抗体のペリプラズム調製物の最終容量は１ｍｌであり、そのうちの５０μｌを、２％の粉乳ＰＢＳを含む１００μｌの全量の中で、室温で１時間、１／１０００稀釈の抗Ｈｉｓ抗体とともにプレインキュベートした。架橋したペリプラズム調製物をＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温でさらに２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％のｔｗｅｅｎで２回、ＰＢＳで２回洗浄し、そして２％の粉乳ＰＢＳの中の１／１０００稀釈のウサギ抗マウスＨＲＰとともにインキュベートした。プレートを先と同様に洗浄し、結合を、標準的なＴＭＢ試薬を使用して検出した。データは、ＶＬ／ＶＨ立体構造のＸＴ−Ｍ４およびＸＴ−Ｈ２抗体のＳｃＦｖ構造が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で、ヒトＲＡＧＥに特異的に結合する、機能性の折り畳まれた可溶性タンパク質を生産することができることを示している。両方の形式において、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって決定したＳｃＦｖの出発時点のＫｄ値を使用して、親和性選択に最適な抗原濃度を決定した。
（実施例２４）
種間交差反応性を維持したままｈＲＡＧＥ−Ｆｃに対する親和性が改善された変異体を回収するための選択とスクリーニングストラテジー
変異体のライブラリーを、ＰＣＲを使用したＸＴ−Ｍ４のＶＨ−ＣＤＲ３のスパイク突然変異によって作成した。図３１は、ＰＣＲを使用してＸＴ−Ｍ４のＣＤＲにスパイク変異を導入する方法を模式的に示す。（１）ＣＤＲループの長さ全体にわたって多様性の領域を有しており、ＦＲ３とＦＲ４の中の標的Ｖ遺伝子の中に相同性の領域によってひとまとめにされた、スパイクされたオリゴヌクレオチドを設計した。（２）オリゴヌクレオチドを、標的Ｖ遺伝子の５’末端にアニーリングし、ＦＲ１領域と相同である特異的プライマーを用いたＰＣＲ反応において使用した。図３２は、ＸＴ−Ｍ４ ＶＬ−ＶＨ ＳｃＦｖ構築物のＣ末端のヌクレオチド配列（配列番号５６）を示す。ＶＨ−ＣＤＲ３に下線を付けた。また、その部位での変異のために使用したスパイク比を示す、個々の変異部位での数字とともに、２つのスパイクオリゴヌクレオチド（配列番号５７〜５８）を示す。数字に対応するスパイク比のヌクレオチド組成もまた特定した。
ＸＴ−Ｍ４−ＶＨＣＤＲ３でスパイクしたＰＣＲ産物を、ライブラリーを作成するためのＳｆｉ１断片として、リボソームディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−３にクローニングした。このライブラリーを、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ．，２０００）を使用してヒトビオチニル化ＲＡＧＥについて選択した。ビオチン標識した抗原を使用した。なぜなら、これにより、プロセス全体のさらなる速度制御が可能であり、親和性の高いクローンを優先的に富化させる可能性を高める、溶液ベースの選択が可能となるからである。選択は、最初の親和性と比較して抗原濃度を低下させる平衡様式において、または、改善された解離速度が、経験的に決定した時間枠全体にわたって、未標識の抗原との競合を使用するために特異的に選択される動的様式のいずれかで行った。結合していないリボソーム複合体を洗い流し、抗原が結合したリボソーム複合体を溶出させた。ＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡに変換させ、そして種間交差反応性を維持するためにビオチニル化マウスＲＡＧＥ−Ｆｃについての２回目の選択を行った。ＶＨ−ＣＤＲ３の中に変異を有しているＳｃＦｖ編異体が含まれている、この選択工程による出力について、その後、突然変異誘発の工程を２サイクル行った。この突然変異誘発工程には、変異性ＰＣＲを使用するランダム突然変異の作成を含めた。作成したライブラリーについては、その後、１０倍低い抗原濃度で、ビオチニル化ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃについて３回目の選択を行った。このプロセスを必要に応じて繰り返した。それぞれの選択工程によるＲＮＡの出力プールをｃＤＮＡに変換し、そしてタンパク質発現ベクターｐＷＲＩＬ−１にクローニングして、変異体ＳｃＦｖの親和性と種間交差反応性をランク付けした。多様性のプールもまた配列決定して、選択が優性クローンに向かって動いているかどうかを決定するために多様性を評価した。
（実施例２５）
ファージディスプレイを使用するＸＴ−Ｍ４の親和性成熟
ＶＨ−ＣＤＲ３でスパイクしたライブラリーを、ビオチニル化ｈＲＡＧＥの選択のために図３４に示したファージディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−１にクローニングした。ビオチン標識した抗原を使用した。なぜなら、この形式は、溶液中での親和性によって駆動される選択とさらに相性がいいからである。選択は、最初の親和性と比較して抗原濃度を低下させる平衡様式において、または、改善された解離速度が、経験的に決定した時間枠全体にわたって、未標識の抗原との競合を使用するために特異的に選択される動的様式のいずれかで行った。ファージディスプレイのための標準的な手順を使用した。
ＳｃＦｖは二量体化することができ、これにより、選択およびスクリーニングの手順は面倒なものになる。二量体化したＳｃＦｖは、親和力に基づく結合を示す可能性があり、この高い結合活性は選択を決定付けることができる。親和性における任意の固有の改善ではなく、ＳｃＦｖの二量体化する能力におけるそのような改善は、最終的な治療用抗体（これは、通常はＩｇＧである）にはほとんど関係がない。二量体化する能力の変化によって生じる不自然な結果（ａｒｔｉｆａｃｔ）を回避するために、Ｆａｂ抗体形式を使用した。なぜなら、これらは通常は二量体化しないからである。ＸＴ−Ｍ４を、Ｆａｂ抗体として再度変換させ、そして新しいファージディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−６にクローニングした。このベクターは、ＨＶ領域とＶＬ領域の両方に広がる制限部位を有しており、ヒトの生殖細胞系列Ｖ遺伝子の中では頻繁に切断されることはない。これらの制限部位は、ＶＬレパートリーとＶＨレパートリーのシャッフリングおよび組み合わせアセンブリのために使用することができる。１つのストラテジーにおいては、ＶＨ−ＣＤＲ３およびＶＬ−ＣＤＲ３でスパイクしたライブラリーを、いずれも、図３４に示すようにＦａｂディスプレイベクターに組み合わせてアセンブリさせ、そして親和性の改善について選択した。
（実施例２６）
キメラ抗体ＸＴ−Ｍ４の物理的特徴
オンラインＭＳ検出を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／質量スペクトル分析（ＭＳ）によるペプチドのマッピングおよびサブユニット分析による事前の特性決定によって、アミノ酸配列がキメラＸＴ−Ｍ４ ＤＮＡ配列から予想したとおりであることを確認した。これらのＭＳデータはまた、Ａｓｎ２９９ＳｅｒＴｈｒでの予想したＮ結合オリゴ糖配列のコンセンサス部位が占有されており、そして２つの主要な種が、それぞれ、０個または１個の末端ガラクトース残基を含む、複雑なＮ結合二分岐コアフコシル化グリカンであることも示していた。分子のＦｃ領域の中に存在している予想したＮ結合オリゴ糖に加えて、Ｎ結合オリゴ糖は、キメラＸＴ−Ｍ４の重鎖のＣＤＲ２領域の中に配列コンセンサス部位（Ａｓｎ５２ＡｓｎＳｅｒ）で観察された。別のＮ結合オリゴ糖は、重鎖のわずかに１つの上で主に見られ、これには、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析によって決定した分子のうちのおよそ３８％が含まれていた（一次構造によって区別することができない他の酸性種が存在する可能性があり、これは、全体的な酸性の種の割合に寄与する可能性がある）。優性の種は、２つのシアル酸とともにコアがフコシル化された二分岐構造である。Ａ２８０を測定することによって、吸光係数を使用して濃度を計算した。キメラＸＴ−Ｍ４についての理論上の吸光係数は、１．３５ｍＬ ｍｇ−１ｃｍ−１であると計算した。
非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定したキメラＸＴ−Ｍ４の見かけの分子量はおよそ２００ｋＤａであった。抗体は、その配列から予想したよりもゆっくりと移動した。この表現形は、今日までに分析した全ての組み換え体抗体について観察された。還元条件下では、キメラＸＴ−Ｍ４は、およそ５０ｋＤａで移動する１つの重鎖バンドと、およそ２５ｋＤａで移動する１つの軽鎖バンドを有している。重鎖のバンドのすぐ上に移動するさらに別のバンドもまた存在した。このバンドを自動Ｅｄｍａｎ分解によって特性決定し、キメラＸＴ−Ｍ４の重鎖に対応するＮＨ２末端を有していることを決定した。これらの結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察した分子量の増大と一緒に、さらに別のバンドが、ＣＤＲ２領域の中の別のＮ結合オリゴ糖を有している重鎖と一致することを示している。
アミノ酸配列に基づいてキメラＸＴ−Ｍ４について予想した等電点（ｐＩ）は７．２であった（重鎖の中にはＣＯＯＨ末端Ｌｙｓは含まれない）。ＩＥＦによって、キメラＸＴ−Ｍ４はおよそ７．４〜８．３のｐＩの範囲に移動するおよそ１０個のバンドに分解され、これには、およそ７．８のｐＩで移動する１つの優性なバンドが含まれていた。キャピラリー等電点電気泳動によって決定したｐＩは、およそ７．７であった。
陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によって現れた物質の分析により、分子電荷が異なるキメラＸＴ−Ｍ４種についての分析がさらにもたらされた。観察された電荷の不均質性の大部分は、ほぼおそらく、重鎖のＣＤＲ２の中に存在しているさらに別のＮ結合オリゴヌクレオチド上で見られるシアル酸の関与が原因である。観察された電荷の不均一性のごく一部は、ＣＯＯＨ末端リジンの不均一性が原因であり得る。
（実施例２７）
グリコシル化部位の除去
抗体ＸＴ−Ｍ４の重鎖可変領域の５２位（Ｋａｂａｔの番号付けによる）のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に変換する変異により、図３６に示すように、ｈＲＡＧＥ−Ｆｃに対する直接結合のＥＬＩＳＡ分析によって決定した、ヒトＲＡＧＥに対するＸＴ−Ｍ４抗体の結合が改善した。Ｎ５２Ｄ変異は、抗体ＸＴ−Ｍ４の重鎖可変領域のＣＤＲ２の中にある。
（実施例２８）
キメラ抗ＲＡＧＥ抗体の効力についてのインビボでの前臨床アッセイ
薬物動態（ＰＫ）
雄のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）への５ｍｇ／ｋｇの単回のＩＶ投与後のキメラ抗体キメラＸＴ−Ｍ４の血清濃度を、キメラＸＴ−Ｍ４について評価した。経時的な抗体の血清濃度を、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡで測定した。キメラＸＴ−Ｍ４の平均血清暴露は（２３，２３５ｇ・ｈｒ／ｍＬ）であり、半減期はおよそ１週間（１５２時間）であった。図３７を参照のこと。
（実施例２９）
記憶障害のＣＦＣモデル
文脈的恐怖条件付け（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ｆｅａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＣＦＣ））パラダイムを利用して、アミロイド沈着が原因である認識機能の低下の動物モデルにおける認識能力に対するキメララット抗体ＸＴ−Ｍ４（ＲＡＧＥに特異的に結合し、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する）の投与の効果を試験した。
Ｔｇ２５７６モデルマウスは、１８ヶ月までにアミロイドプラークを生じ、これには、生後６ヶ月までに、海馬ＣＡ１と歯状回の中でのＬＴＰ障害、改良型の水迷路における空間記憶障害、シナプス可塑性の機能障害、ならびに、Ａβ凝集物およびオリゴマーの増加が先行して起こる。Ａβは、若い、プラークを有していないＴｇ２５７６マウスにおいて、文脈的記憶の障害を誘導する。海馬に依存する学習および記憶についての試験である文脈的恐怖条件付け（ＣＦＣ）を、Ａβ形成およびアミロイド沈着についてのＴｇ２５７６トランスジェニックヒトＡＰＰマウスモデルにおいて行った。
状況学習（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ｌｅａｒｎｉｎｇ）には、ショックが起こった特異的なケージの環境（状況）を用いて嫌悪刺激（フットショック）の関連づけを含めた。状況についての記憶を、ショックを与えなかった場合の状況依存性のすくみ反応（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｒｅｅｚｉｎｇ）として表した。軽く肢で衝撃を与えた状況を対にすることによって、マウスを操作チャンバーの中に馴化させた。訓練は、その間に動物に２回の軽い衝撃を与える、操作チャンバーの中の５分間のセッションから構成した。記憶試験は、以前に衝撃を与えた環境に動物を再び入れた後、およそ２４時間後に行った。活動のレベルを、記憶試験の間に記録し、「すくんだ」状態ですごした時間を、全時間に対する割合として表し、処置グループ間でＡＮＯＶＡによって分析した。活動レベルの低下は、嫌悪事象についての完全な記憶を示す。トランスジェニックではない同腹子とは対照的に、Ｔｇ２５７６は、１４〜１６週齢の間には、状況記憶の障害を発症し、完全な欠損が２０週齢まで観察されたことを決定した。
抗体の投与
マウスＲＡＧＥに特異的なキメラＸＴ−Ｍ４抗体をＰＢＳの中に稀釈し、２０週齢のＴｇ２５７６と年齢が一致するトランスジェニックではない（野生型）同腹子に、１用量（１０ｍｇ／ｋｇ）で、１日目、４日目、７日目、および１０日目にｉｐ投与した。中性（不活性な）抗体（ｎｅｕｔｒａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を対照として投与した。マウスの訓練は、１１日目に、抗体の４回目の投与の２４時間後に開始し、試験は１２日目に行った。
記憶スコア（すくみ反応が増えること）を、１２日目の試験セッションの間に試験した。効力は、ＰＢＳで処置したトランスジェニック動物と比較して、記憶障害の撤回を明らかにすることによって決定した。最小有効用量（ＭＥＤ）を、０．１から３０ｍｇ／ｋｇまでの範囲の用量で用量応答曲線を作成することによって決定した。確立したＭＥＤでの１回の免疫化後の効力の持続期間を、時間的経過の分析、および認識の改善に対する訓練前の時間の間隔の延長を評価することによって決定した。
キメラＸＴ−Ｍ４抗体（κ、ＩｇＧ１）は、状況記憶障害の有意な撤回を示した。対照的に、無関係な抗体およびＰＢＳ対照を投与したマウスは、Ｔｇ２５７６マウスまたは野生型同腹子のＣＦＣに対しては効果を示さなかった。データは、マウスＲＧＥに対するキメラモノクローナルＸＴ−Ｍ４抗体の投与が、アルツハイマー病のＡＰＰトランスジェニックモデルにおいて認識を改善するために有効であることを示している（図３８を参照のこと）。
材料と方法
マウス
実験において使用したマウスは、ヒトＡＰＰタンパク質を発現するヘテロ接合型の雄のトランスジェニックＴｇ２５７６１８マウスであった。遺伝子型をＰＣＲによって確認し、Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｒｄ）変異についてホモ接合型である全ての動物は排除した。バックグラウンド株はＣ５７Ｂｌ６と１２９ＳＪＬの交配による。文脈的恐怖条件付け実験を、２０週齢のマウスについて行った（ｎ＝８〜１２／遺伝子型／年齢）
試験装置
文脈的恐怖条件付け（ＣＦＣ）を、アルミニウムの側壁とプレキシガラス製の天井、ドア、および後壁によって構築した６個の３０×２４×２１ｃｍの操作チャンバー（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ａｌｂａｎｓ，ＶＴ）の中で行った。それぞれのチャンバーには、肢で衝撃を与えることができる３６本のステンレス鋼製の棒からなる床を取り付けた。加えて、それぞれのチャンバーには、２つの刺激光線を設け、１つは家の電気およびソレノイドである。光、フットショック（ＵＳ）、およびソレノイド（ＣＳ）は全て、ＰＣによって実行するＭＥＤ−ＰＣソフトウェアによって制御した。チャンバーを、赤色光の存在下で音を隔離した部屋に入れた。
文脈的恐怖条件付け
Ｔｇ２５７６マウス、またはそれらの年齢が一致する野生型同腹子の訓練は１１日目に、そしてキメラＸＴ−Ｍ４抗ＲＡＧＥ抗体のそれらの４回目の用量をマウスに投与した１日後に開始した。
訓練は、操作チャンバーの中にマウスを入れること、刺激と家の光の両方を照射すること、およびそれらを２分間調査することからなる。２分間の最後に、聴覚による合図（ソレノイドによる２Ｈｚのクリック音；ＣＳ）を、１５秒間提示した。フットショック（ＵＳ；１．５ｍＡｍｐ）を、ＣＳの最後の２秒間に与え、ＣＳの提示と同時に終了した。この手順を繰り返し、３０秒後に、２回目のフットショックを与え、マウスをチャンバーから取り出し、それらのもとのケージ（ｈｏｍｅｃａｇｅ）に戻した。
訓練の２４時間後、動物を、先に訓練を行ったチャンバーに戻した。その後、衝撃を与えたものと同じ環境（Ｃｏｎｔｅｘｔ）下でのすくみ反応の行動を、５分間の間、１０秒間のビン（ｂｉｎｓ）のサンプリング時間を使用して、経験者によって記録させた（３０のサンプル点）。すくみ反応は、呼吸に必要な動きを除いて動きがないとして定義した。５分間の最後に、マウスを彼らのもとのケージに戻した。
Ｎｏｖｅｌ条件とＣｕｅ条件でのすくみ反応についてのデータを、Ｃｏｎｔｅｘｔにおいて全てのマウスを試験した（最初のＣｏｎｔｅｘｔ試験のおよそ６０分後）後で回収した。新しい環境は、後方の右側の角から前方左側への透明なプレキシガラス製の仕切り板、プレキシガラス製の床、さらには下げた照度（家の電気のみ）を含む改良された操作チャンバーから構成した。マウスを新しい（Ｎｏｖｅｌ）状況にいれ、時間サンプリングを使用して、３分間（１８のサンプル点）、すくみ反応についてのスコアを集めた。３分間の最後に、聴覚による合図（ＣＳ）を、すくみ反応を再びスコアした３分間（１８のサンプル点）に提示した。個々の動物についてのすくみ反応のスコアを、試験のそれぞれの部分についてのすくみ反応の割合（％）に変換した。個々の動物について、状況についての記憶（文脈的記憶）を、その状況において観察した新規の条件（定常活性の測定）におけるすくみ反応の割合（％）を引き算することによって得た。
抗体での処置
キメラＸＴ−Ｍ４抗体をＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）の中に稀釈し、２０週齢のＴｇ２５７６マウスまたはそれらの年齢が一致する野生型の同腹子に、１日目、４日目、７日目、および１０日目に単回用量としてｉｐ投与し、１１日目に訓練を行い、そして１２日目に試験した。
データの分析
文脈的記憶を、２元ＡＮＯＶＡを使用して分析し、ＳＡＳ統計ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）を使用してｐｏｓｔ ｈｏｔ Ｆｉｓｃｈｅｒの一対比較を行った。全てのデータを平均±ＳＥＭで表した。
マウス、ラット、ウサギ（２つの異性体）、ヒヒ、カニクイザル、およびヒトのＲＡＧＥのアミノ酸配列（配列番号３、１４、１１、１３、７、９、１）のアラインメントを示す。 マウス、ラット、ウサギ（２つの異性体）、ヒヒ、カニクイザル、およびヒトのＲＡＧＥのアミノ酸配列（配列番号３、１４、１１、１３、７、９、１）のアラインメントを示す。 マウス、ラット、ウサギ（２つの異性体）、ヒヒ、カニクイザル、およびヒトのＲＡＧＥのアミノ酸配列（配列番号３、１４、１１、１３、７、９、１）のアラインメントを示す。 ９０ｐＭのＥＣ５０でのｈＲＡＧＥに対するＸＴ−Ｈ２の結合と、３００ｐＭのＥＣ５０でのｈＲＡＧＥ−Ｆｃに対するＸＴ−Ｍ４の結合を示している、直接結合ＥＬＩＳＡによるデータのグラフである。 １００ｐＭのＥＣ５０でのｈＲＡＧＥ Ｖドメイン−Ｆｃに対する、抗体ＸＴ−Ｍ４とＸＴ−Ｈ２の結合を示している、直接結合ＥＬＩＳＡ分析によるデータのグラフである。 ｈＲＡＧＥ−Ｆｃに対するＨＭＧ１の結合をブロックするＸＴ−Ｈ２とＸＴ−Ｍ４の能力を示しているリガンド競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによるデータのグラフである。 ＸＴ−Ｈ２とＸＴ−Ｍ４が類似するエピトープを共有しており、ヒトＲＡＧＥ上の重複している部位に結合することを示している、抗体競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによるデータのグラフである。 マウス抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、およびＸＴ−Ｈ７と、ラット抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｍ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１８、２１、２４、２０、２６、１６）のアラインメントを示す。 マウス抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、およびＸＴ−Ｈ７と、ラット抗ＲＡＧＥ抗体ＸＴ−Ｍ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１９、２２、２５、２３、２７、１７）のアラインメントを示す。 ヒヒＲＡＧＥをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。 カニクイザルＲＡＧＥをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。 ウサギＲＡＧＥイソ型１をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す。 ウサギＲＡＧＥイソ型２をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。 ヒヒＲＡＧＥをコードする、クローニングされたヒヒのゲノムＤＮＡ（クローン１８．２）のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。 ヒヒＲＡＧＥをコードする、クローニングされたヒヒのゲノムＤＮＡ（クローン１８．２）のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。 ヒヒＲＡＧＥをコードする、クローニングされたヒヒのゲノムＤＮＡ（クローン１８．２）のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。 ヒヒＲＡＧＥをコードする、クローニングされたヒヒのゲノムＤＮＡ（クローン１８．２）のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。 ヒヒＲＡＧＥをコードする、クローニングされたヒヒのゲノムＤＮＡ（クローン１８．２）のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。 競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって決定した、ｈＲＡＧＥ−Ｆｃに対する、ＲＡＧＥリガンドＨＭＧＢ１、アミロイドβ１−４２ペプチド、Ｓ１００−Ａ、およびＳ１００−Ｂの結合をブロックする、キメラＸＴ−Ｍ４抗体とラット抗体ＸＴ−Ｍ４の能力を示している４つのグラフを示す。 抗体競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって決定した、抗体ＸＴ−Ｍ４とＸＴ−Ｈ２を用いたｈＲＡＧＥ−Ｆｃへの結合について競合する、キメラＸＴ−Ｍ４の能力を示しているグラフを示す。 カニクイザル、ウサギ、およびヒヒの肺組織のＩＨＣ染色を示し、これは、ＸＴ−Ｍ４がこれらの組織の中の内因性の細胞表面ＲＡＧＥに結合することを示している。対照試料は、ＸＴ−Ｍ４と接しているｈＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞、ＲＡＧＥを発現しないＮＧＢＣＨＯ細胞、そして対照ＩｇＧ抗体に接しているｈＲＡＧＥを発現するＣＨＯ細胞である。 ラット抗体ＸＴ−Ｍ４が、正常なヒトの肺と慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のヒトの肺の中のＲＡＧＥに結合することを示している。 ヒト化マウスＸＴ−Ｈ２ ＨＶ領域のアミノ酸配列を示す。 ヒト化マウスＸＴ−Ｈ２ ＨＬ領域のアミノ酸配列を示す。 ヒト化ラットＸＴ−Ｍ４ ＨＶ領域のアミノ酸配列を示す。 ヒト化ラットＸＴ−Ｈ２ ＨＬ領域のアミノ酸配列を示す。 ヒト化ラットＸＴ−Ｈ２ ＨＬ領域のアミノ酸配列を示す。 ヒト化軽鎖および重鎖ポリペプチドを作成するために使用した発現ベクターを示す。 競合ＥＬＩＳＡによって決定した、ヒトＲＡＧＥ−Ｆｃに対するヒト化ＸＴ−Ｈ２抗体の結合についてのＥＤ５０値を示す。 ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）結合アッセイによって決定した、ｈＲＡＧＥ−ＳＡに対する、ＸＴ−Ｍ４と、ヒト化抗体ＸＴ−Ｍ４−Ｖ１０、ＸＴ−Ｍ４−Ｖ１１、およびＸＴ−Ｍ４−Ｖ１４の結合についての運動速度定数（ｋｉｎｅｔｉｃ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）（ｋａおよびｋｄ）と、結合定数および解離定数（ＫａおよびＫｂ）を示す。 ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）結合アッセイによって決定した、ｍＲＡＧＥ−ＳＡに対する、ＸＴ−Ｍ４と、ヒト化抗体ＸＴ−Ｍ４−Ｖ１０、ＸＴ−Ｍ４−Ｖ１１、およびＸＴ−Ｍ４−Ｖ１４の結合についての運動速度定数（ｋｉｎｅｔｉｃ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）（ｋａおよびｋｄ）と、会合定数および解離定数（ＫａおよびＫｂ）を示す。 マウスＸＴ−Ｈ２ ＶＬ−ＶＨ ＳｃＦｖ構築物のヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す。 マウスＸＴ−Ｈ２ ＶＨ−ＶＬ ＳｃＦｖ構築物のヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す。 ラットＸＴ−Ｍ４ ＶＬ−ＶＨ ＳｃＦｖ構築物のヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す。 ラットＸＴ−Ｍ４ ＶＨ−ＶＬ ＳｃＦｖ構築物のヌクレオチド配列（配列番号５３）を示す。 ＶＬ／ＶＨまたはＶＨ／ＶＬ立体構造のいずれかの、ＸＴ−Ｈ２およびＸＴ−Ｍ４抗ＲＡＧＥ抗体のＳｃＦｖ構築物によるヒトＲＡＧＥ−Ｆｃに対する結合を示しているＥＬＩＳＡデータのグラフである。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の中で可溶性タンパク質として発現されるＶＬ／ＶＨまたはＶＨ／ＶＬ立体構造のＸＴ−Ｈ２およびＸＴ−Ｍ４抗ＲＡＧＥ抗体のＳｃＦｖ構築物による、ヒトＲＡＧＥ−ＦｃとＢＳＡに対する結合を示しているＥＬＩＳＡデータのグラフである。ＡｃｔＲＩＩｂは、ネガティブ対照として同じベクターから発現される非結合タンパク質である。 ＸＴ−Ｍ４のＣＤＲにスパイク変異（ｓｐｉｋｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を導入するためのＰＣＲの使用を模式的に示す。 ＸＴ−Ｍ４ ＶＬ−ＶＨ ＳｃＦｖ構築物のＣ末端のヌクレオチド配列（配列番号５６）を示す。ＶＨ−ＣＤＲ３に下線を付ける。２つのスパイクオリゴヌクレオチド（配列番号５７〜５８）はまた、その部位での変異について使用されるスパイク比（ｓｐｉｋｉｎｇ ｒａｔｉｏ）を特定する個々の変異部位での数字とともに示す。数字に対応しているスパイク比のヌクレオチド組成もまた特定した。 リボザイムディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−３を模式的に示す。「Ｔ７」はＴ７プロモーターを示し、「ＲＢＳ」はリボソーム結合部位であり、「スペーサーポリペプチド」は、リボソームに対して折り畳まれたタンパク質を連結するスペーサーポリペプチドであり、「Ｆｌａｇタグ」は、タンパク質の検出のためのＦｌａｇエピトープタグである。 ファージディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−１を模式的に示す。 ＦａｂディスプレイベクターｐＷＲＩＬ−６を使用したＶＬおよびＶＨスパイクライブラリーの組み合わせアセンブリを模式的に示す。 ５２位のグリコシル化部位を除去する変異の後の、ｈＲＡＧＥに対するＸＴ−Ｍ４抗体の親和性の増大を示している抗体競合ＥＬＩＳＡデータのグラフである。 マウスへの１回のｉｖ投与後のキメラＸＴ−Ｍ４の血清濃度を示しているグラフである。 Ｔｇ２５７６マウスモデルの記憶障害に対するキメラＸＴ−Ｍ４の効果を示しているグラフである。

Claims (43)

  1. Ａβのアミロイド沈着を特徴とする疾患または障害を有している被験体を処置するための方法であって、被験体に、ＲＡＧＥに特異的に結合して、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体の治療有効量を投与する工程が含まれる、方法。
  2. 前記被験体がヒト被験体である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記疾患または障害が、脳の中でのＡβのアミロイド沈着を特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 前記疾患または障害がアルツハイマー病である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記疾患または障害が、臨床前アルツハイマー病である、請求項３に記載の方法。
  6. 前記抗体が、
    （ａ）ＲＡＧＥに対する結合について、ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体と競合する、
    （ｂ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体が結合する、ＲＡＧＥのエピトープに結合する、
    （ｃ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、あるいは、
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の抗体のＲＡＧＥ結合断片である、
    請求項１に記載の方法。
  7. 前記抗体またはＲＡＧＥ結合抗体断片に、
    ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域のＣＤＲを含む軽鎖可変領域（配列番号１７）、
    ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列のＣＤＲを含む重鎖可変領域（配列番号１６）、
    ヒトκ軽鎖定常領域、および
    ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域
    が含まれている、請求項６に記載の方法。
  8. 前記抗体またはそのＲＡＧＥ結合断片に、
    ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有している軽鎖可変領域（配列番号１７）、
    ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列のアミノ酸配列を有している重鎖可変領域（配列番号１６）、
    ヒトκ軽鎖定常領域、および
    ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域
    が含まれている、請求項７に記載の方法。
  9. 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記キメラ抗体またはヒト化抗体に、ヒト定常領域またはそれらが由来する定常領域が含まれている、請求項９に記載の方法。
  11. 前記抗体またはそのＲＡＧＥ結合断片を、アルツハイマー病の処置に有用な１つ以上の薬剤と組み合わせて投与し、それにより相乗的な治療効果を誘発する工程が含まれる、請求項１に記載の方法。
  12. 被験体の中でのＡβのアミロイド沈着の蓄積を阻害または軽減する方法であって、被験体に、ＲＡＧＥに特異的に結合して、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体の有効量を投与する工程が含まれる、方法。
  13. 前記被験体がヒト被験体である、請求項１２に記載の方法。
  14. 脳の中でのＡβのアミロイド沈着の蓄積を阻害するまたは減少させる工程が含まれる、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記脳の中でのＡβのアミロイド沈着の蓄積がアルツハイマー病に関係している、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記脳の中でのＡβのアミロイド沈着の蓄積が臨床前アルツハイマー病に関係している、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記抗体が、
    （ａ）ＲＡＧＥに対する結合について、ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体と競合する、
    （ｂ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体が結合する、ＲＡＧＥのエピトープに結合する、
    （ｃ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、あるいは、
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の抗体のＲＡＧＥ結合断片である、
    請求項１２に記載の方法。
  18. 前記抗体またはＲＡＧＥ結合抗体断片に、
    ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域のＣＤＲを含む軽鎖可変領域（配列番号１７）、
    ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列のＣＤＲを含む重鎖可変領域（配列番号１６）、
    ヒトκ軽鎖定常領域、および
    ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域
    が含まれている、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記抗体またはそのＲＡＧＥ結合断片に、
    ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有している軽鎖可変領域（配列番号１７）、
    ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列のアミノ酸配列を有している重鎖可変領域（配列番号１６）、
    ヒトκ軽鎖定常領域、および
    ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域
    が含まれている、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１２に記載の方法。
  21. 前記キメラ抗体またはヒト化抗体に、ヒト定常領域またはそれらが由来する定常領域が含まれている、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記抗体またはそのＲＡＧＥ結合断片を、Ａβのアミロイド沈着を阻害するまたは軽減するために有用な１つ以上の薬剤と組み合わせて投与し、それにより相乗作用を誘発する工程が含まれる、請求項１２に記載の方法。
  23. 被験体の中での神経変性を阻害または軽減する方法であって、該被験体に、ＲＡＧＥに特異的に結合して、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体の有効量を投与する工程が含まれる、方法。
  24. 前記被験体がヒト被験体である、請求項２３に記載の方法。
  25. 脳の中での神経変性を阻害するまたは軽減する工程が含まれる、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記神経変性がアルツハイマー病に関係している、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記神経変性が臨床前アルツハイマー病に関係している、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記抗体が、
    （ａ）ＲＡＧＥに対する結合について、ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体と競合する、
    （ｂ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体が結合する、ＲＡＧＥのエピトープに結合する、
    （ｃ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、あるいは、
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の抗体のＲＡＧＥ結合断片である、
    請求項２３に記載の方法。
  29. 前記抗体またはＲＡＧＥ結合抗体断片に、
    ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域のＣＤＲを含む軽鎖可変領域（配列番号１７）、
    ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列のＣＤＲを含む重鎖可変領域（配列番号１６）、
    ヒトκ軽鎖定常領域、および
    ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域
    が含まれている、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記抗体またはそのＲＡＧＥ結合断片に、
    ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有している軽鎖可変領域（配列番号１７）、
    ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列のアミノ酸配列を有している重鎖可変領域（配列番号１６）、
    ヒトκ軽鎖定常領域、および
    ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域
    が含まれている、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項２３に記載の方法。
  32. 前記キメラ抗体またはヒト化抗体に、ヒト定常領域またはそれらが由来する定常領域が含まれている、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記抗体またはそのＲＡＧＥ結合断片を、神経変性を阻害するまたは軽減するために有用な１つ以上の薬剤と組み合わせて投与し、それにより相乗作用を誘発する工程が含まれる、請求項２３に記載の方法。
  34. 被験体の認識衰退を阻害もしくは軽減する、または認識を改善する方法であって、被験体に、ＲＡＧＥに特異的に結合して、ＲＡＧＥ結合パートナーの結合を阻害する抗体の有効量を投与する工程が含まれる、方法。
  35. 前記被験体がヒト被験体である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記認識衰退がアルツハイマー病に関係している、請求項３４に記載の方法。
  37. 前記認識衰退が臨床前アルツハイマー病に関係している、請求項３４に記載の方法。
  38. 前記抗体が、
    （ａ）ＲＡＧＥに対する結合について、ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体と競合する、
    （ｂ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体が結合する、ＲＡＧＥのエピトープに結合する、
    （ｃ）ＸＴ−Ｈ１、ＸＴ−Ｈ２、ＸＴ−Ｈ３、ＸＴ−Ｈ５、ＸＴ−Ｈ７、およびＸＴ−Ｍ４からなる群より選択される抗体の軽鎖または重鎖の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、あるいは、
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の抗体のＲＡＧＥ結合断片である、
    請求項３４に記載の方法。
  39. 前記抗体またはＲＡＧＥ結合抗体断片に
    ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域のＣＤＲを含む軽鎖可変領域（配列番号１７）、
    ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列のＣＤＲを含む重鎖可変領域（配列番号１６）、
    ヒトκ軽鎖定常領域、および
    ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域
    が含まれている、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記抗体またはそのＲＡＧＥ結合断片に、
    ＸＴ−Ｍ４軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有している軽鎖可変領域（配列番号１７）、
    ＸＴ−Ｍ４重鎖可変領域配列のアミノ酸配列を有している重鎖可変領域（配列番号１６）、
    ヒトκ軽鎖定常領域、および
    ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域
    が含まれている、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項３４に記載の方法。
  42. 前記キメラ抗体またはヒト化抗体に、ヒト定常領域またはそれらが由来する定常領域が含まれている、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記抗体またはそのＲＡＧＥ結合断片を、認識衰退を阻害もしくは軽減するか、または認識を改善するために有用な１つ以上の薬剤と組み合わせて投与し、それにより相乗作用を誘発する工程が含まれる、請求項３４に記載の方法。
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