BRPI0708998A2 - anticorpo que se liga especificamente ao rage; anticorpo quimérico ou um fragmento de ligação rage do mesmo; anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação rage do mesmo; anticorpo humanizado que se liga especificamente ao rage ou um fragmento de ligação rage do mesmo; anticorpo que se liga especificamente ao rage e bloqueia a ligação de um parceiro corporal rage; ácido nucléico isolado; método de tratamento de um indivìduo que tem uma doença ou transtorno relacionado com rage; método de tratamento de sepse ou choque séptico em um indivìduo humano; método de tratamento de listeriose sistêmica em um indivìduo humano; e método de inibir a ligação de um parceiro de ligação rage (rage-bp), o rage em um indivìduo mamìfero - Google Patents

Abstract

ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO RAGE; ANTICORPO QUIMéRICO OU UM FRAGMENTO DE LIGAçãO RAGE DOMESMO; ANTICORPO HUMANIZADO OU UM FRAGMENTO DE LIGAçãO RAGE DO MESMO; ANTICORPO HUMANIZADO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO RAGE OU UM FRAGMENTO DE LIGAçãO RAGE DO MESMO; ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO RAGE E BLOQUEIA A LIGAçãO DE UM PARCEIRO CORPORAL RAGE; áCIDO NUCLéICO ISOLADO; MéTODO DE TRATAMENTO DE UM INDIVìDUO QUE TEM UMA DOENçA OU TRANSTORNO RELACIONADO COM RAGE; MéTODO DE TRATAMENTO DE SEPSE OUCHOQUE SéPTICO EM UM INDIVìDUO HUMANO; MéTODO DE TRATAMENTO DE LISTERIOSE SISTêMICA EM UM INDIVìDUO HUMANO; E MéTODO DE INIBIR A LIGAçãO DE UM PARCEIRO DE LIGAçãO RAGE (RAGE-BP), O RAGE EM UM INDIVìDUO MAMìFERO Trata-se de anticorpos que se ligam especificamente ao receptor para produtos finais de glicação avançada(RAGE) e fragmentos de ligação RAGE do mesmo. Também se descreveram composições farmacêuticas que compreendem tais anticorpos anti-RAGE e fragmentos de anticorpo de ligação RAGE do mesmo e seu uso para o tratamento de doenças relacionadas com RAGE.

Description

"ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO RAGE;ANTICORPO QUIMÉRICO OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO RAGE DOMESMO; ANTICORPO HUMANIZADO OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO RAGEDO MESMO; ANTICORPO HUMANIZADO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTEAO RAGE OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO RAGE DO MESMO; ANTICORPOQUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO RAGE E BLOQUEIA A LIGAÇÃO DEUM PARCEIRO CORPORAL RAGE; ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO; MÉTODO DETRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO QUE TEM UMA DOENÇA OU TRANSTORNORELACIONADO COM RAGE; MÉTODO DE TRATAMENTO DE SEPSE OUCHOQUE SÉPTICO EM UM INDIVÍDUO HUMANO; MÉTODO DE TRATAMENTODE LISTERIOSE SISTÊMICA EM UM INDIVÍDUO HUMANO; E MÉTODO DEINIBIR A LIGAÇÃO DE UM PARCEIRO DE LIGAÇÃO RAGE (RAGE-BP) , ORAGE EM UM INDIVÍDUO MAMÍFERO"

REFERÊNCIAS REMISSIVAS AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS

A prioridade é reivindicada nos termos do Titulo35 do Código dos Estados Unidos § 119 (e), do Pedido dePatente Provisório U.S. N2 60/895.303, depositado em 16 demarço de 2007 e do Pedido de Patente Provisório U.S. N-60/784.575, depositado em 21 de março de 2006, sendo que oconteúdo de ambos está aqui incorporado integralmente atitulo de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se, em geral, aanticorpos e fragmentos dos mesmos que se ligam, de maneiraespecifica, a um receptor para produtos finais de glicaçãoavançada (RAGE), a métodos em que esses anticorpos efragmentos dos mesmos são administrados a pacientes humanose a mamíferos não-humanos para tratar ou prevenir doenças edistúrbios relacionados ao RAGE.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

0 receptor para produtos finais de glicaçãoavançada (RAGE) é um membro multi-ligante da membranacelular da superfamíla das imunoglobulinas. 0 RAGE consisteem um domínio extracelular, um único domínio que atravessa amembrana e uma cauda citosólica. 0 domínio extracelular doreceptor consiste em um domínio de imunoglobulina do tipo Vseguido por dois domínios de imunoglobulina do tipo C. 0RAGE também existe sob uma forma solúvel (sRAGE). 0 RAGE éexpresso por muitos tipos de célula, por exemplo, célulasendoteliais e musculares lisas, macrófagos e linfócitos, emmuitos tecidos diferentes, incluindo pulmão, coração, rim,músculo esquelético e cérebro. A expressão é elevada emestados inflamatórios crônicos, como artrite reumatóide enefropatia diabética. Muito embora sua função fisiológicanão seja evidente, ela está envolvida na respostainflamatória e pode ser um papel em diversos processosdesenvolvidos, incluindo a diferenciação dos mioblastos edesenvolvimento neural.

0 RAGE é um receptor de reconhecimento de padrãopouco comum que liga diversas classes diferentes demoléculas endógenas que conduzem a várias respostascelulares, incluindo secreção de citocinas, elevado estresseoxidativo celular, crescimento de neuritos e migraçãocelular. Os ligantes de RAGE incluem produtos finais deglicação avançada (AGE's), que se formam em estadoshiperglicêmicos prolongados. No entanto, os AGE's podem serapenas ligantes patogênicos incidentais. Além dos AGES, osligantes conhecidos de RAGE incluem proteínas tendo fibrilasβ-folha que são característica de depósitos de amilóide emediadores pró-inflamatórios, que incluem SlOO/calgranulinas(por exemplo, S100A12, S100B, S100A8-A9), amilóide sérica(SAA) (forma fibrilar), proteína beta-Amilóide (Αβ), eproteína cromossômica 1 de alta mobilidade do grupo box-1(HMGBl, também conhecida como anfoterina). A HMGB-1 tem semostrado um novo mediador de letalidade em dois modelos desepse em murídeos, e acredita-se que a interação entre oRAGE e os ligantes, como HMGBl desempenhe um papelimportante na patogênese de sepse e outras doençasinflamatórias.

Uma série de distúrbios humanos significativosestá associada a uma produção elevada de ligantes para RAGEou à produção elevada do próprio RAGE. Estudos terapêuticosconsistentemente eficazes não estão disponíveis para muitosdesses distúrbios. Esses distúrbios incluem, por exemplo,muitas doenças inflamatórias crônicas, inclusive a artritereumatóide e psoriática e doença do cólon intestinal,cânceres, diabetes e nefropatia diabética, amiloidoses,doenças cardiovasculares e sepse. Seria benéfico se tertratamentos seguros e eficazes para tais distúrbiosrelacionados ao RAGE.

A sepse é uma resposta inflamatória sistêmica(SIRS) à infecção, e deixa uma séria conseqüência até mesmoem pacientes anteriormente normais. A sepse é definida pelapresença de ao menos 2 dos 4 sinais clínicos: hipo- ouhipertermia, taquicardia, taquipnéia, hiperventilação ouleucograma anormal. A sepse com uma disfunção/falha orgânicaé definida como sepse grave, e a sepse grave com hipertensãointratável é definida como choque séptico. Outros tipos desepse incluem septicemia e sepse neonatal. Mais de 2 milhõesde casos de sepse ocorrem a cada ano nos Estados Unidos, naEuropa e no Japão, tendo custos anuais estimados de 17bilhões de dólares e taxas de mortalidades variando de 20 a50%. Nos pacientes que sobrevivem à sepse, a permanência naunidade de terapia intensiva (UTI) é prolongada, em média,em 65% comparando-se aos pacientes de UTI que não sofreramde sepse.

Apesar dos recentes lançamentos no mercado e docontínuo melhoramento em tratamentos hospitalares, a sepsecontinua sendo uma significativa necessidade médicainsatisfeita. O tratamento de pacientes sépticos demandatempo e recursos. Os agentes mais recentes, incluindo ainteração de XIGRIS®, têm um efeito modesto nos resultados.

A síndrome continua a exibir uma taxa de mortalidade de 20 a50%. Os agentes terapêuticos seguros e bem-tolerados quepoderiam reduzir o progresso da sepse precoce em sepse graveou choque séptico, e, desse modo, melhora a taxa desobrevivência, poderiam oferecer um avanço no tratamento dasepse.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona novos reagentesimunológicos, em particular, reagentes de anticorposterapêuticos que se ligam ao RAGE, para a prevenção etratamento de doenças e distúrbios relacionados ao RAGE, porexemplo, sepse, diabetes e patologias associadas aodiabetes, doenças cardiovasculares e câncer.

Os anticorpos representativos da invenção incluemos anticorpos que se ligam, de maneira especifica, ao RAGE(isto é, anticorpos anti-RAGE), que competem pela ligação aoRAGE com um anticorpo XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 ouXT-M4, ou que se ligam a um epitopo de ligação RAGE por . umanticorpo XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 ou XT-M4. Osanticorpos anti-RAGE adicionais representativos da invençãopodem compreende uma ou mais regiões determinantes decomplementaridade (CDRs) de uma cadeia leve ou cadeia pesadade um anticorpo selecionado do grupo que consiste em XT-Hl,XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4. Proporcionam-se, ainda,fragmentos de ligação RAGE dos anticorpos mencionadosanteriormente. Os anticorpos anti-RAGE da invenção podembloquear a ligação de um parceiro de corpo RAGE.

Por exemplo, um anticorpo anti-RAGE da invençãopode compreender (a) uma região variável de cadeia leve deXT-H 1_VL (SEQ ID NO: 19), XT-H2_VL (SEQ ID NO: 22), XT-H3_VL(SEQ ID NO: 25), XT-H5_VL (SEQ ID NO: 23), XT-H7_VL (SEQ IDNO: 27) ou XT-M4_VL (SEQ ID NO: 17); (b) uma região variávelde cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidos que sejapelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácidos deSEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23,SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 17; ou (c) um fragmento deligação RAGE de um anticorpo de acordo com (a) ou (b) . Comooutro exemplo, um anticorpo anti-RAGE da invenção podecompreender (a) uma região variável de cadeia pesada de IXT-H1_VH (SEQ ID NO: 18), XT-H2_VH (SEQ ID NO: 21), XT-H3_VH(SEQ ID NO: 24), XT-H5_VH (SEQ ID NO: 20), XT-H7_VH (SEQ IDNO: 26) ou XT-M4_VH (SEQ ID NO: 16); (b) uma região variávelde cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácidos que sejapelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácidos deSEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 16; ou (c) um fragmento deligação RAGE de um anticorpo de acordo com (a) ou (b).

A presente invenção proporciona, ainda, anticorposanti-RAGE que tenham qualquer uma das regiões variáveis decadeia leve supramencionadas e qualquer uma das regiõesvariáveis de cadeia pesada supramencionadas. Por exemplo, umanticorpo anti-RAGE da invenção pode ser um anticorpoquimérico, ou um fragmento de ligação RAGE do mesmo, tendouma seqüência de aminoácidos de região variável de cadeialeve que seja pelo menos 90% idêntica à seqüência deaminoácidos de região variável de cadeia leve XT-M4 (SEQ IDNO: 17), uma seqüência de aminoácidos de região variável decadeia pesada que seja pelo menos 90% idêntica à seqüênciade aminoácidos de região variável de cadeia pesada XT-M4(SEQ ID NO: 16), e regiões constantes derivadas de regiõesconstantes humanas, como um anticorpo tendo uma regiãovariável de cadeia leve que por sua vez tem a seqüência deaminoácidos da região variável de cadeia leve XT-M4 (SEQ IDNO: 17), uma região variável pesada que tem a seqüência deaminoácidos da seqüência de região variável de cadeia pesadaΧΤ-Μ4 (SEQ ID NO: 16) , uma região constante de cadeia levekappa humana, e uma região constante de cadeia pesada IgGlhumana.

Os anticorpos anti-RAGE adicionais representativosda invenção incluem, por exemplo, anticorpos humanizados eanticorpos tendo uma região variável de cadeia levehumanizada que seja pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácidos XT-H2_hVL_V2.0 (SEQ ID NO:32), XT-H2_hVL_V3.0(SEQ ID NO: 33), XT-H2_hVL_V4.0 (SEQ ID NO: 34), XT-H2_hVL_V4. 1 (SEQ ID NO: 35), XT-M4_hVL_V2.4 (SEQ ID NO: 39),XT-M4_hVL_V2 . 5 (SEQ ID NO: 40), XT-M4_hVL_V2. 6 (SEQ ID NO:41), XT-M4_hVL_V2. 7 (SEQ ID NO: 42), XT-M4_hVL_V2. 8 (SEQ IDNO: 43), XT-M4_hVL_V2. 9 (SEQ ID NO: 44), XT-M4_hVL_V2.10(SEQ ID NO: 45), XT-M4_hVL_V2. 11 (SEQ ID NO: 46), XT-M4_hVL_V2 . 12 (SEQ ID NO: 47), XT-M4_hVL_V2.13 (SEQ ID NO:48) ou XT-M4_hVL_V2. 14 (SEQ ID NO: 49). Como outro exemplo,um anticorpo anti-RAGE humanizado compreende uma regiãovariável de cadeia pesada humanizada que seja pelo menos 90%idêntica a uma seqüência de aminoácidos de XT-H2_hVH_V2.0(SEQ ID NO: 28), XT-H2_hVH_V2.7 (SEQ ID NO: 29), XT-H2_hVH_V4 (SEQ ID NO: 30), XT-H2_hVH_V4.1 (SEQ ID NO: 31),XT-M4_hVH_Vl. 0 (SEQ ID NO: 36), XT-M4_hVH_Vl. 1 (SEQ ID NO:37) ou XT-M4_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 38). Os anticorposhumanizados podem ser semi-humanos (isto é, onde apenas umadas regiões variáveis de cadeia leve e pesada é humanizada) ,ou completamente humanizados (isto é, onde ambas as regiõesvariáveis de cadeia leve e pesada são humanizadas). Osanticorpos anti-RAGE humanizados adicionais representativosaqui descritos incluem um anticorpo XT-M4 humanizado e umanticorpo XT-H2 humanizado.

Proporcionam-se, ainda, anticorpos anti-RAGE tendoCDRs com pelo menos 8 das seguintes características: (a)seqüência de aminoácidos Y-X-M (Y32; X33; M34) em VH CDR1,onde X é, de preferência, W ou N; (b) seqüência deaminoácidos I-N-X-S (151; N52; X53 e S54) em VH CDR2, onde Xé P ou N; (c) o aminoácido na posição 58 em CDR2 de VH éTreonina; (d) o aminoácido na posição 60 em CDR2 de VH éTirosina; (e) o aminoácido na posição 103 em CDR3 de VH éTreonina; (f) um ou mais resíduos de Tirosina em CDR3 de VH;(g) resíduo positivamente carregado (Arg ou Lys) na posição24 em CDRl de VL; (h) resíduo hidrofílico (Thr ou Ser) naposição 26 em CDRl de VL; (i) pequeno resíduo Ser ou Ala naposição 25 em CDRl de VL; (j) resíduo negativamentecarregado (Asp ou Glu) na posição 33 em CDRl de VL; (k)resíduo aromático (Phe ou Tyr ou Trp) na posição 37 em CDRlde VL; (1) resíduo hidrofílico (Ser ou Thr) na posição 57 emCDR2 de VL ; (m) seqüência P-X-T na extremidade de CDR3 de VLonde X poderia ser um resíduo hidrofóbico Leu ou Trp; onde aposição do aminoácido é conforme mostrado nas seqüências deaminoácidos de cadeia leve e pesada em SEQ ID NO:22 e SEQ IDNO:16, respectivamente.

Proporcionam-se, também, ácidos nucléicos isoladosque codificam quaisquer anticorpos anti-RAGE ou regiõesvariáveis de anticorpo descritas, e ácidos nucléicosisolados que se hibridizam, de maneira específica, em umácido nucléico tendo uma seqüência nucleotídica que é ocomplemento de uma seqüência nucleotidica que codificaquaisquer anticorpos anti-RAGE ou regiões variáveis deanticorpos descritos sob limitadas condições dehibridização.

Os ácidos nucléicos isolados da invenção incluem,ainda, (a) ácidos nucléicos que codificam uma proteína RAGEem babuínos, macacos ou coelhos tendo uma seqüência deaminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 13; ácidosnucléicos que se hibridizam, de maneira específica, nocomplemento de (a); e (c) ácidos nucléicos tendo umaseqüência nucleotidica que seja 95% idêntica a uma seqüêncianucleotidica que codifica o RAGE em babuínos, macacos oucoelhos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12, quando acobertura de pesquisa for de 100%.

A invenção inclui, também, métodos para prevenir etratar doenças ou distúrbios relacionados ao RAGE em umindivíduo que apresenta tal doença ou distúrbio, quecompreendem administrar ao indivíduo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-RAGE ou de umfragmento de ligação RAGE do mesmo da invenção.

A invenção inclui um método para prevenir outratar uma doença ou distúrbio relacionados ao RAGEselecionados do grupo que consiste em sepse, choque séptico,incluindo condições como a pneumonia adquirida nacomunidade, que resulta em sepse ou choque séptico,listeriose, doenças inflamatórias, cânceres, artrite, doençade Crohn, doenças inflamatórias agudas crônicas, doençascardiovasculares, disfunção erétil, diabetes, complicaçõesde diabetes, vasculite, nefropatias, retinopatias eneuropatias. Esse método da invenção pode compreenderadministrar uma composição que inclui um anticorpo anti-RAGEou um fragmento de ligação RAGE do mesmo da invenção emcombinação com um ou mais agentes úteis no tratamento dadoença ou distúrbio relacionados ao ElAGE que devem sertratados. Esses agentes da invenção incluem antibióticos,agentes antiinflamatórios, antioxidantes, β-bloqueadores,agentes antiplaquetas, inibidores de ACE, agentes redutoresde lipideos, agentes antiangiogênicos e quimioterapias.

A invenção proporciona um método para tratarsepse, choque séptico ou listeriose (por exemplo, listeriosesistêmica) em um indivíduo humano que compreende administraruma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-RAGE quimérico, ou um fragmento de ligação RAGE do mesmo quecompreende uma região variável de cadeia leve tendo aseqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leveXT-M4 (SEQ ID NO: 17), uma região variável de cadeia pesadatendo a seqüência de aminoácidos da seqüência de regiãovariável de cadeia pesada XT-M4 (SEQ ID NO: 16), uma regiãoconstante de cadeia leve kappa humana e uma região constantede cadeia pesada IgGl humana.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras IA a IC mostram seqüências alinhadas deaminoácidos de RAGE em camundongos, ratos, coelhos (2isoformas), babuinos, macacos-caranguejeiros e seres humanos(SEQ ID NOs: 3, 14, 11, 13, 7, 9, 1).

Δ Figura 2 é um gráfico de dados provenientes daanálise ELISA de ligação direta demonstrando a ligação deXT-H2 ao hRAGE com EC50 de 90 pM e a ligação de XT-M4 aohRAGE-Fc com EC50 de 300 pM.

A Figura 3 é um gráfico de dados provenientes daanálise ELISA de ligação direta demonstrando a ligação deanticorpos XT-M4 e XT-H2 ao hRAGE V-dominio-Fc com EC50 de100 pM.

A Figura 4 é um gráfico de dados provenientes dosensaios de ligação ELISA por competição ligante mostrando acapacidade de XT-H2 e XT-M4 em bloquear a ligação de HMGl aohRAGE-Fc.

A Figura 5 é um gráfico de dados provenientes dosensaios de ligação ELISA por competição de anticorposmostrando que o XT-H2 e XT-M4 compartilham um epitoposimilar e se ligam para sobrepor os locais em RAGE humano.

A Figura mostra seqüências alinhadas deaminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada deanticorpos anti-RAGE de murideos XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5e XT-H7, e um anticorpo anti-RAGE em ratos XT-M4 (SEQ IDNOs: 18, 21, 24, 20, 26, 16).

A Figura 7 mostra seqüências alinhadas deaminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve deanticorpos anti-RAGE de murideos XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5e XT-H7, e de anticorpo anti-RAGE em ratos XT-M4 (SEQ IDNOs: 19, 22, 25, 23, 27, 17).A Figura 8 mostra uma seqüência nucleotidica decDNA que codifica o RAGE em babuinos (SEQ ID NO: 6).

A Figura 9 mostra uma seqüência nucleotidica decDNA que codifica o RAGE em macacos-caranguejeiros (SEQ ID NO: 8).

A Figura 10 mostra a seqüência nucleotidica decDNA que codifica a isoforma 1 de RAGE em coelhos (SEQ ID NO:10).

A Figura 11 mostra a seqüência nucleotidica decDNA que codifica a isoforma 2 de RAGE em coelhos (SEQ ID NO: 12).

As Figuras 12A a 12E mostram a seqüêncianucleotidica de DNA genômico clonado de babuinos quecodifica o RAGE em babuinos (clone 18.2) (SEQ ID NO: 15).

A Figura 13 apresenta quatro gráficos que mostrama capacidade do anticorpo XT-M4 quimérico e do anticorpo deratos XT-M4 em bloquear a ligação de ligantes RAGE HMGBl,peptideo β amilóide 1-42, S100-A e S100-B para hRAGE-Fc,conforme determinado pelo ensaio de ligação ELISA porcompetição.

A Figura 14 apresenta gráficos que mostram acapacidade do XT-M4 para competir pela ligação em hRAGE-Fccom anticorpos XT-M4 e XT-H2, conforme determinado peloensaio de ligação ELISA por competição de anticorpos.

A Figura 15 representa a coloração imunoistoquimicade tecidos pulmonares de macacos-caranguejeiros, coelhos ebabuinos, mostrando que o XT-M4 se liga ao RAGE de membranacelular endógena nesses tecidos. As amostras de controle sãocélulas CHO que expressam o hRAGE em contatado pelo XT-M4,células NGBCHO que não expressam RAGE e células CHO queexpressam hRAGE em contato por um anticorpo IgG de controle.

A Figura 16 mostra que o anticorpo de ratos XT-M4se liga ao RAGE em pulmões normais de humanos e pulmões deum humano com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).

A Figura 17 mostra seqüências de aminoácidos daregião humanizada XT-H2 HV de murideos.

A Figura 18 mostra seqüências de aminoácidos daregião humanizada de XT-H2 HL de murideos.

A Figura 19 mostra seqüências de aminoácidos daregião humanizada de XT-M4 HV de ratos.

As Figuras 20A a 20B mostram seqüências deaminoácidos da região humanizada de XT-H2 HL de ratos.

A Figura 21 representa vetores de expressão usadospara produzir polipeptideos humanizados de cadeia leve epesada.

A Figura 22 mostra valores ED50 para a ligação deanticorpos XT-H2 humanizados ao RAGE-Fc humano, conformedeterminado pela ELISA por competição.

A Figura 23 mostra as constantes de taxa cinética(ka e kd) e as constantes de associação e dissociação (Ka eKd) para ligação de XT-M4 e anticorpos humanizados XT-M4-VlO, XT-M4-Vl1 e XT-M4-V14 ao hRAGE-SA, conforme determinadopelo ensaio de ligação BIAC0RE™.

A Figura 24 mostra as constantes de taxa cinética(ka e kd) e as constantes de associação e dissociação (Ka eKd) para ligação de XT-M4 e anticorpos humanizados XT-M4-VlO, ΧΤ-Μ4-Vl1 e XT-M4-V14 ao mRAGE-SA, conforme determinadopelo ensaio de ligação BIACORE™.

A Figura 25 mostra a seqüência nucleotidica de umaconstrução XT-H2 VL-VH ScFv de murideos (SEQ ID NO:51).

A Figura 26 mostra a seqüência nucleotidica de umaconstrução XT-H2 VH-VL ScFv de murideos (SEQ ID NO: 52).

A Figura 27 mostra a seqüência nucleotidica de umaconstrução de XT-M4 VL-VH ScFv de ratos (SEQ ID NO: 54).

A Figura 28 mostra a seqüência nucleotidica de umaconstrução XT-M4 VH-VL ScFv de ratos (SEQ ID NO: 53).

A Figura 29 é um gráfico de dados ELISA que mostraa ligação ao RAGE-Fc humano por construções ScFv do XT-H2 edos anticorpos anti-RAGE XT-M4 na configuração VL/VH ouVH/VL.

A Figura 30 é um gráfico de dados ELISA que mostraa ligação ao RAGE-Fc humano e BSA por construções ScFv dosanticorpos anti-RAGE XT-H2 e XT-M4 na configuração VL/VH ouVH/VL expressa como proteína solúvel em Escherichia coli. AActRIIb é uma proteína não-aglutinante expressa a partir domesmo vetor de um controle negativo.

A Figura 31 representa esquematicamente o uso dePCR para introduzir mutações reforçadas com um CDR de XT-M4.

A Figura 32 mostra a seqüência nucleotidica daextremidade terminal C da construção XT-M4 VL-VH ScFv (SEQID NO: 56). O VH-CDR3 está sublinhado. Também são mostradosdois oligonucleotídeos reforçados (SEQ ID NOs: 57-58) com umnúmero em cada local de mutação que identifica a razão dereforço usada para mutação naquele local. As composiçõesnucleotidicas das razões de reforço correspondentes aosnúmeros também são identificadas.

A Figura 33 representa esquematicamente o vetor deexibição de ribossomo pWRIL-3. "T7" denota o promotor T7promotor, "RBS" é o local de ligação de ribossomos,"polipeptídeo espaçador" é um polipeptideo espaçador queconecta a proteína revestida ao ribossomo, "marcador Flag" éo marcador Flag de epítopo para detecção de proteínas.

A Figura 34 representa esquematicamente o vetor deexibição de fagos pWRIL-1.

A Figura 35 representa esquematicamente a montagemcombinatória de bibliotecas reforçadas VL e VH que usam ovetor de exibição Fab pWRIL-6.

A Figura 36 é um gráfico de dados ELISA porcompetição de anticorpos mostrando a afinidade elevada doanticorpo XT-M4 para hRAGE seguindo a mutação que remove olocal de glicosilação na posição 52.

A Figura 37 é um gráfico de sobrevivência quemostra uma vantagem de sobrevivência seguindo o CLP paracamundongos nocaute RAGE homozigoto e heterozigoto e paracamundongos com anticorpo anti-RAGE comparados aos animaisde controle selvagens.

A Figura 38 é um gráfico que mostra contagens decolônias em tecidos para bactérias entéricas seguindo o CLP.

A Figura 39 é um gráfico de sobrevivência quemostra os efeitos das duas doses diferentes de anticorposanti-RAGE na sobrevivência do camundongo seguindo o CLP.A Figura 40 é um gráfico de sobrevivência quemostra os efeitos de retardar uma única dose de anticorpoanti-RAGE em até 36 horas seguindo o CLP.

A Figura 41 mostra os níveis de L. monocytogenesisolados do fígado e baço de camundongos nocaute RAGEhomozigoto e heterozigoto infectados e camundongos infectadoscom anti-RAGE mAb comparados aos animais de controleselvagens.

A Figura 42 é um gráfico que mostra os níveissérico de interferon γ de camundongos nocaute RAGE homozigotoe heterozigoto infectados e camundongos infectados com anti-RAGE comparados aos animais de controle selvagens.

A Figura 43 é um gráfico de sobrevivência quemostra uma vantagem de sobrevivência seguindo o CLP paracamundongos nocaute RAGE homozigoto e heterozigoto comparadosaos animais de controle selvagens.

A Figura 44 é um gráfico de sobrevivência quemostra uma vantagem de sobrevivência seguindo o CLP paracamundongos com uma única injeção de anticorpos anti-RAGEcomparados aos animais de controle selvagens.

A Figura 45 é um gráfico de sobrevivência quemostra os efeitos de retardar uma única dose de anticorpoanti-RAGE durante 6 ou 12 horas seguindo o CLP.

A Figura 46 é um gráfico mostrando que o camundongocom anticorpo anti-RAGE tem classificações de patologiaaperfeiçoadas comparadas aos animais de controle.A Figura 47 é um gráfico de sobrevivência quemostra a sobrevivência seguindo o CLP de camundongos comanticorpo anti-RAGE em combinação com um antibiótico.

A Figura 4 8 é um gráfico de sobrevivência quemostra a sobrevivência seguindo o CLP de camundongos apenascom antibióticos.

A Figura 50 é um gráfico que mostra L.monocytogenes no fígado e baço de camundongos nocaute RAGEhomozigoto e heterozigoto infectados e camundongos comanticorpo anti-RAGE.

A Figura 51 é um gráfico que mostra a concentraçãosérica de XT-M4 quimérico seguindo uma única administraçãoiv aos camundongos.

A Figura 52 mostra que o anticorpo XT-M4 quiméricoé protetor em um modelo CLP.

A Figura 53 mostra que o anticorpo XT-M4 quiméricoé protetor em um modelo CLP até 24 horas após a cirurgia.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Anticorpos Anti-RAGE

A presente invenção proporciona anticorpos que seligam, de maneira específica, ao RAGE, incluindo RAGEsolúvel e RAGE secretório endógeno, conforme descrito nopresente documento. Os anticorpos anti-RAGE representativospodem compreender ao menos um das seqüências de aminoácidosde região variável de anticorpos em SEQ ID NOs: 16-49.

Os anticorpos anti-RAGE da invenção incluemanticorpos que se ligam, de maneira especificam ao RAGE têmuma seqüência de aminoácidos que seja idêntica ousubstancialmente idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 16-49. Uma seqüência de aminoácidos de um anticorpo anti-RAGEque seja substancialmente idêntica é uma das que tem aomenos 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ou 99,9% de identidade de qualqueruma das SEQ ID NOs: 16-4 9.

Um anticorpo que se liga, de maneira especifica,ai RAGE está incluso nos anticorpos anti-RAGE da invenção, e(a) compreende uma região variável de cadeia leveselecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:19, 22, 25, 23, 27 e 17, ou (b) compreende uma regiãovariável de cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidosque seja pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ IDNOs: 19, 22, 25, 23, 27 e 17, ou seja um fragmento deligação RAGE de um anticorpo de acordo com (a) ou (b) .

Um anticorpo que se liga, de maneira especifica,ao RAGE também está incluso nos anticorpos anti-RAGE dainvenção, e (a) compreende uma região variável de cadeiapesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ IDNOs: 18, 21, 24, 20, 26, e 16, ou (b) compreende uma regiãovariável .de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácidosque seja pelo menos 90% idêntica a qualquer uma das SEQ IDNOs: 18, 21, 24, 20, 26, e 16, ou seja um fragmento deligação RAGE de um anticorpo de acordo com (a) ou (b) .

Encontra-se incluído na invenção um anticorpoanti-RAGE que se liga, de maneira específica, ao RAGE e:(a) compete pela ligação ao RAGE com um anticorposelecionado a partir do grupo que consiste em XT-H1, XT-H2,XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;

(b) se liga a um epitopo de RAGE que seja ligadopor um anticorpo selecionado a partir do grupo que consisteem XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;

(c) compreende uma ou mais regiões determinantesde complementaridade (CDRs) de uma cadeia leve ou pesada deum anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste emXT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4; ou

(d) consiste em um fragmento de ligação RAGE deum anticorpo de acordo com (a), (b) ou (c).

A invenção inclui anticorpos anti-RAGE que seligam, de maneira especifica, às células de expressão RAGEin vitro e in vivo, e anticorpos que se ligam ao RAGE humanocom uma constante de dissociação (Kd) na faixa de ao menoscerca de 1 χ IO-7 M a cerca de 1 χ IO-10 Μ. Também estãoincluídos anticorpos anti-RAGE da invenção que se ligam, demaneira específica, ao domínio V de RAGE humano, eanticorpos anti-RAGE que bloqueiam a ligação de RAGE a umparceiro de ligação RAGE (RAGE-BP).

Um anticorpo que se liga, de maneira especifica,ao RAGE e bloqueia a ligação de RAGE a um parceiro deligação RAGE, por exemplo, um ligante, como HMGBl, AGE, Αβ,SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A (incluindo S100A8 eS100A9), S100A4, CRP, 62-integrina, Mac-1, e pl50,95, epossui CDRs tendo 4 ou mais das seguintes características (anumeração de posição está de acordo com as posições deaminoácidos mostradas para as seqüências VH e VL nas Figuras 6 e 7) :

I. Seqüência de aminoácidos Y-X-M (Y32; X33;M34) em VH CDR1, onde X é, de preferência, W ou N;

2. Seqüência de aminoácidos I-N-X-S (151; N52;

X53 e S54) em VH CDR2, onde X é P ou N;

3. O aminoácido na posição 58 em CDR2 de VH éTreonina;

4. O aminoácido na posição 60 em CDR2 de VH éTirosina;

5. O aminoácido na posição 103 em CDR3 de VH éTreonina;

6. Um ou mais resíduos de Tirosina em CDR3 de VH;

7. Resíduo positivamente carregado (Arg ou Lys)na posição 24 em CDRl de VL;

8. Resíduo hidrofílico (Thr ou Ser) na posição26 em CDRl de VL;

9. Pequeno resíduo Ser ou Ala na posição 25 emCDRl de VL;

10. Resíduo negativamente carregado (Asp ou Glu)na posição 33 em CDRl de VL;

II. Resíduo aromático (Phe ou Tyr ou Trp) naposição 37 em CDRl de VL;

12. Resíduo hidrofílico (Ser ou Thr) na posição57 em CDR2 de VL;

13. Seqüência P-X-T na extremidade de CDR3 de VLonde X poderia ser um resíduo hidrofílico Leu ou Trp.Os anticorpos anti-RAGE da invenção incluem osanticorpos que se ligam, de maneira especifica, ao domínio Vde RAGE humano e bloqueia a ligação de RAGE a seus ligantes,e possuem CDRs tendo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ou todas as13 características.

Os anticorpos anti-RAGE da invenção incluem umanticorpo anti-RAGE conforme descrito anteriormente, ou umfragmento de ligação RAGE que é selecionado a partir dogrupo que consiste em um anticorpo quimérico, um anticorpohumanizado, um anticorpo de cadeia única, um anticorpotetramérico, um anticorpo tetravalente, um anticorpomultiespecífico, um anticorpo com domínio específico, umanticorpo com domínio excluído, uma proteína de fusão, umfragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2/ umfragmento Fv, um fragmento ScFv, um fragmento Fd, umanticorpo de domínio único, um fragmento dAb e uma proteínade fusão Fc (isto é, um domínio de ligação de antígenofundido a uma região constante de imunoglobulina). Essesanticorpos podem ser acoplados a um agente citotóxico,agente radioterapêutico ou a um rótulo detectável.

Por exemplo, um anticorpo ScFv (SEQ ID NO: 63) quecompreende os domínios VH e VL do anticorpo XT-M4 de ratosfoi preparado e mostrado pela análise ELISA baseada emcélulas por ter afinidades de ligação para RAGE em babuínos,camundongos, coelhos e humanos comparável às afinidades dosanticorpos quiméricos e XT-M4 selvagens.

Pretende-se que os anticorpos da presente invençãoincluam, ainda, moléculas heteroconjugadas, biespecíficas,de cadeia única, quiméricas e humanizadas tendo afinidadepara um dos polipeptideos sujeitos, conferidos por ao menosuma região CDR do anticorpo.

Os anticorpos da invenção que se ligam, de maneiraespecifica, ao RAGE também incluem variantes de qualquer umdos anticorpos aqui descritos, que podem ser prontamentepreparados através do uso de técnicas biológicas e clonagemmolecular. Consulte, por exemplo, os Pedidos de PatentePublicados U.S. Nos. 2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970,2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028,2005/0202534 e 2005/0238646, e os membros da família depatentes relacionados dos mesmos, sendo que todos estão aquiincorporados em sua totalidade a título de referência. Porexemplo, um anticorpo variante da invenção também podecompreende uma proteína de fusão de imunoglobulina comdomínio de ligação que inclui um polipeptídeo de domínio deligação (por exemplo, scFv) que é fundido ou, de outraforma, conectado a uma articulação de imunoglobulina oupolipeptídeo de região atuante de articulação, que é,sucessivamente, fundida ou, de outra forma, conectada a umaregião que compreende uma ou mais regiões constantes nativasou criadas por engenharia genética a partir de uma cadeiapesada de imunoglobulina, que não seja CHI, por exemplo, asregiões CH2 e CH3 de IgG e IgA, ou as regiões CH3 e CH4 deIgE (consulte, por exemplo, U.S. 2005/0136049 por Ledbetter,J. et al., que está aqui incorporado a título de referência,para uma descrição mais completa). A proteína de fusão deimunoglobulina com domínio de ligação pode incluir, ainda,uma região que inclua um polipeptídeo de região constanteCH2 de cadeia pesada de imunoglobulina nativa ou criada porengenharia genética (ou CH3 no caso de uma construçãoderivada totalmente ou em parte a partir do IgE) que éfundida ou, de outra forma, conectado ao polipeptídeo deregião de articulação e um polipeptídeo de região constanteCH3 de cadeia pesada de imunoglobulina nativa ou criada porengenharia genética (ou CH4 no caso de uma construçãoderivada totalmente ou em parte a partir do IgE) que éfundido ou, de outra forma, conectado ao polipeptídeo deregião constante CH2 (ou CH3 no caso de uma construçãoderivada totalmente ou em parte a partir do IgE) .

Tipicamente, essas proteínas de fusão de imunoglobulina comdomínio de ligação são capazes de pelo menos uma atividadeimunológica, por exemplo, ligação específica ao RAGE,inibição da interação entre RAGE e um parceiro de ligaçãoRAGE, indução de citotoxidade mediada por célulasdependentes de anticorpos, indução de fixação complementar,etc.

Os anticorpos da invenção podem compreender,também, um rótulo fixado a eles e capaz de ser detectado,(por exemplo, o rótulo pode ser um radioisótopo, compostofluorescente, enzima ou co-fator de enzima).

Polipeptídeos RAGE

A invenção proporciona, também, proteínas RAGEisoladas de babuínos, macacos-caranguejeiros e coelhos,tendo as seqüências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs:7, 9, 11 ou 13, e incluem, ainda, proteínas RAGE tendo umaseqüência de aminoácidos que é substancialmente idêntica àsseqüências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 7, 9, 11ou 13, sendo que são pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idênticas naseqüência de aminoácidos a qualquer uma das SEQ ID NOs: 7,9, 11 ou 13.

Também se encontram incluídos na invenção métodospara produção de anticorpos anti-RAGE e fragmentos deligação RAGE dos mesmos da invenção através de quaisquermeios conhecidos na técnica.

Também se encontra incluída na invenção umapreparação purificada de anticorpos monoclonais que seligam, de maneira específica, a um ou mais epítopos daseqüência de aminoácidos RAGE conforme apresentado emqualquer SEQ ID N0s:l, 3, 7, 9, 11 ou 13.

Definições

Por fins de conveniência, certos termos empregadosno relatório descritivo, exemplos e as reivindicações emanexo são coletados aqui. Exceto onde definido em contrário,todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm omesmo significado conforme comumente compreendido peloselementos versados na técnica aos quais esta invençãopertence.

Conforme o uso em questão, os artigos "um" e "uma"referem-se a um ou mais de um (isto é, até ao menos um)objeto gramático do artigo. A título de exemplo, "umelemento" significa um ou mais de um elemento.Conforme o uso em questão o termo "ou" significa,e é usado de maneira intercambiável com, o termo "e/ou",exceto onde o contexto indica claramente o contrário.

Um polipeptideo ou proteína "isolada" ou"purificada", por exemplo, um "anticorpo isolado", épurificado até um estado além do qual ele existe nanatureza. Por exemplo, o polipeptideo ou proteína "isolada"ou "purificada", por exemplo, um "anticorpo isolado", podeser substancialmente livre de material celular ou outrasproteínas contaminantes a partir da fonte de célula outecido do qual a proteína é derivada, ou substancialmentelivre de precursores químicos ou outros elementos químicosquando quimicamente sintetizados. A preparação de proteínaanticorpos tendo menos que cerca de 50% de proteína não-anticorpos (também aqui denominada como uma " proteínacontaminante"), ou de precursores químicos, é consideradacomo "substancialmente livre", 40%, 30%, 20%, 10% e, commais preferência, 5% (em peso seco) de proteína não-anticorpo, ou de precursores químicos é consideradasubstancialmente livre. Quando a proteína anticorpo ou umaporção biologicamente ativa desta for produzida de maneirarecombinante, ela também é, de preferência, substancialmentelivre de meio de cultura, isto é, o meio de culturarepresenta menos que cerca de 30%, de preferência, menos quecerca de 20%, com mais preferência, menos que cerca de 10%,e, com a máxima preferência, menos que cerca de 5% do volumeou massa da preparação da proteína. Conforme o uso emquestão, as proteínas ou polipeptídeos denominados como"recombinantes" são proteínas e polipeptideos produzidospela expressão de ácidos nucléicos recombinantes.

0 termo "anticorpo" é usado, de maneiraintercambiável, junto ao termo "imunoglobulina", e incluianticorpos intactos, fragmentos de anticorpos, por exemplo,fragmentos Fab, F(ab')2, e anticorpos e fragmentos intactosque sofreram mutação em sua região constante e/ou variável(por exemplo, mutações para produzir anticorpos quiméricos,parcialmente humanizados ou completamente humanizados, bemcomo para produzir anticorpos com um traço desejado, porexemplo, ligação IL 13 elevada e/ou ligação FcR reduzida). 0termo "fragmento" refere-se a uma parte ou porção de umanticorpo ou cadeia de anticorpos que compreende menosresíduos de aminoácidos do que um anticorpo ou cadeia deanticorpos intacto ou completo. Os fragmentos podem serobtidos através de tratamento químico ou enzimático de umanticorpo ou cadeia de anticorpos intacto ou completo. Osfragmentos também podem ser obtidos por meios recombinantes.

Os fragmentos exemplares incluem fragmentos Fab, Fab',F (ab') 2r Fabc, Fd, dAb e scFv e/ou fragmentos Fv. 0 termo"fragmento de ligação de antígeno" refere-se a um fragmentode polipeptídeo de uma imunoglobulina ou anticorpo que ligao antígeno ou compete pelo anticorpo intacto (isto é, peloanticorpo intacto a partir do qual eles são derivados) paraligação de antígeno (isto é, ligação específica). Como tais,esses anticorpos ou fragmentos dos mesmos estão inclusos noescopo da invenção, ficando estabelecido que o anticorpo oufragmento se liga, de maneira específica, ao RAGE, eneutraliza ou inibe uma ou mais atividades associadas aoRAGE (por exemplo, inibe a ligação de parceiros de ligaçãoRAGE (RAGE-BPs) ao RAGE).

O anticorpo inclui uma estrutura molecularcompreendida por quatro cadeias de polipeptideos, duascadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadaspor ligações dissulfidicas. Cada cadeia pesada écompreendida por uma região variável de cadeia pesada (aquiabreviada como HCVR ou VH) e por uma região constante decadeia pesada. A região constante de cadeia pesada écompreendida por três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeialeve é compreendida por uma região variável de cadeia leve(aqui abreviada como LCVR ou VL) e por uma região constantede cadeia leve. A região constante de cadeia leve écompreendida por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem,ainda, ser subdividas em regiões de hipervariabilidade,designadas regiões determinantes de complementaridade(CDRs), intercaladas por regiões que são mais conservadas,designadas regiões de estrutura (FR). Cada região VH e VL écomposta por três CDRs e quatro FRs, dispostas emterminações amino até terminações carbóxi na seguinte ordem:FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Pretende-se que o termo "anticorpo" abranjaqualquer classe Ig ou qualquer subclasse Ig (por exemplo, assubclasses IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4 de IgG) obtidas a partirde qualquer fonte (por exemplo, humanos e primatas não-humanos, e em roedores, lagomorfos, caprinos, bovinos,eqüinos, ovinos, etc.).O termo "classe Ig" ou "classe de imunoglobulina",conforme o uso em questão, refere-se a cinco classes deimunoglobulina que foram identificadas em humanos emamíferos superiores, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. 0 termo"subclasse Ig" refere-se a duas subclasses de IgM (H e L) ,três subclasses de IgA (IgAl, IgA2, e IGA secretório) , equatro subclasses de IgG (IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4) que foramidentificadas em humanos e mamíferos superiores. Osanticorpos podem estar presentes sob a forma monomérica oupolimérica; por exemplo, existem anticorpos IgM sob a formapentamérica, e anticorpos IgA sob a forma monomérica,dimérica ou multimérica.

O termo "subclasse IgG" refere-se a quatrosubclasses de IgG-IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4 da classeimunoglobulina que foram identificadas em humanos emamíferos superiores pelas cadeias pesadas γ dasimunoglobulinas, γι-γ4, respectivamente.

O termo "imunoglobulina de cadeia única" ou"anticorpo de cadeia única" (usados de maneira intercambiável)referem-se a uma proteína tendo uma estrutura de cadeia comdois polipeptídeos que consiste em uma cadeia pesada e emuma cadeia leve, sendo que as ditas cadeias sãoestabilizadas, por exemplo, através de ligadores depeptídeos de cadeia intermediária, que têm a capacidade deligar, de maneira específica, o antígeno.O termo "domínio"refere-se a uma região globular de um polipeptídeo de cadeiapesada ou leve que compreende laços peptídicos (por exemplo,compreendendo 3 a 4 laços peptídicos) estabilizados, porexemplo, através de folha beta dobrada e/ou ligaçãodissulfidica de cadeia intermediária. Conforme o uso emquestão, os domínios são, ainda, referidos como "constante"ou "variável", com base na carência relativa de variaçãoseqüencial dentro dos domínios de vários membros de classeno caso de um domínio "constante", ou a variação significantedentro domínio de vários membros de classe no caso de umdomínio "variável". Os "domínios" de anticorpos ou peptídeossão, geralmente, denominados, de maneira intercambiável, natécnica como "regiões" de anticorpos ou polipeptídeo. Osdomínios "constantes" de uma cadeia leve de anticorpos sãodenominados, de maneira intercambiável, como "regiõesconstantes de cadeia leve", "domínios constantes de cadeialeve", regiões "CL" ou domínios "CL". Os domínios"constantes" de uma cadeia pesada de anticorpos sãodenominados, de maneira intercambiável, como "regiõesconstante de cadeia pesada", "domínios constantes de cadeiapesada", regiões "CH" ou domínios "CH". Os domínios"variáveis" de uma cadeia leve de anticorpos sãodenominados, de maneira intercambiável, como "regiõesvariáveis de cadeia leve", "domínios variáveis de cadeialeve", regiões "VL" ou domínios "VL". Os domínios"variáveis" de uma cadeia pesada de anticorpos sãodenominados, de maneira intercambiável, como "regiõesconstantes de cadeia pesada", "domínios constantes de cadeiapesada", regiões "VH" ou domínios "VH".

0 termo "região" pode referir-se, também, a umaparte ou porção de uma cadeia de anticorpos ou domínio decadeia de anticorpos (por exemplo, uma parte ou porção deuma cadeia pesada ou leve ou uma parte ou porção de umdomínio constante ou variável, conforme aqui definido) , bemcomo partes ou porções mais discretas das ditas cadeias oudomínios. Por exemplo, as cadeias leves e pesadas oudomínios variáveis leves ou pesados incluem "regiõesdeterminantes de complementaridade" ou "CDRs" intercaladasentre "regiões de estrutura" ou "FRs", conforme aquidefinido.

O termo "conformação" refere-se à estruturaterciária de uma proteína ou polipeptídeo (por exemplo, umanticorpo, cadeia de anticorpo, domínio ou região destes).Por exemplo, a frase "conformação de cadeia leve (oupesada)" refere-se à estrutura terciária de uma regiãovariável de cadeia leve (ou pesada), e a frase "conformaçãode anticorpos" ou "conformação de fragmento de anticorpos"refere-se à estrutura terciária de um anticorpo ou fragmentodeste.

A "ligação específica" de um anticorpo significaque o anticorpo exibe uma afinidade notável por um antígenoou epítopo particular e, em geral, não exibe reatividadecruzada significativa. 0 termo "anticorpo anti-RAGE" conformeo uso em questão refere-se a um anticorpo que se liga, demaneira específica, a um RAGE. 0 anticorpo pode não exibirnenhuma reatividade cruzada (por exemplo, não reagecruzadamente com peptídeos não-RAGE ou com epítopos remotosno RAGE). A ligação "notável" inclui uma ligação com umaafinidade de ao menos 10^6, 10^7, 10^8, 10^9 M"1 ou 10^10 M"1. Osanticorpos com afinidades maiores que IO7 M"1 ou IO8 M"1tipicamente se ligam com especificação analogamente maior.

Os valores intermediários aqui apresentados também sãodestinados a estarem no escopo da presente invenção e osanticorpos da invenção se ligam ao RAGE com uma faixa deafinidades, por exemplo, IO6 a IO10 M"1, IO7 a IO10 M"1 ou IO8a IO10 M"1. Um anticorpo que "não exibe uma reatividadecruzada significativa" é o anticorpo que não se ligará, demaneira notável, a uma entidade que não seja seu alvo (porexemplo, um epitopo diferente ou uma molécula diferente).

Por exemplo, um anticorpo que se liga, de maneira especifica,ao RAGE se ligará, de maneira notável, ao RAGE, mas nãoreagirá, de maneira significativa, com proteínas oupeptídeos não-RAGE. Um anticorpo específico para um epitopoparticular, por exemplo, não reagirá cruzadamente, de maneirasignificativa, com epítopos remotos na mesma proteína oupeptídeo. A ligação específica pode ser determinada deacordo com quaisquer meios reconhecidos pela técnica paradeterminar tal ligação. De preferência, a ligação específicaé determinada de acordo com a análise Scatchard e/ou ensaioscompetitivos de ligação.

Conforme o uso em questão, o termo "afinidade"refere-se à resistência da ligação de um único sítiocombinante de antígeno a um determinante antigênico. Aafinidade depende da proximidade do ajuste estereoquímicoentre os sitos de combinação de anticorpos e osdeterminantes antigênicos, do tamanho da área de contatoentre eles, da distribuição de grupos carregados ehidrofóbicos, etc. A afinidade de anticorpos pode ser medidapor diálise de equilíbrio ou pelo método cinético BIACORE™.O método BIACORE™ depende do fenômeno de ressonânciaplasmônica superficial (SPR), que ocorre quando as ondasplasmônicas superficiais são excitadas em uma interfacemetal/liquido. A luz e direcionada e refletida no lado dasuperfície que não está em contato com a amostra, e a SPRcausa uma redução na intensidade da luz refletida em umacombinação específica de ângulo e comprimento de onda. Oseventos de ligação bimolecular causam alterações no índicerefrativo na camada superficial, que são detectadas comoalterações no sinal de SPR.

A constante de dissociação, Kd, e a constante deassociação, Ka, são medidas quantitativas de afinidade. Emequilíbrio, o antígeno livre (Ag) e o anticorpo livre (Ab)encontram-se em equilíbrio com o complexo atígeno-anticorpo(Ag-Ab) , e as constantes de taxa, ka e kd, quantificam astaxas das reações individuais:

<formula>formula see original document page 33</formula>

Em equilíbrio, ka [Ab][Ag]=kd [Ag-Ab]. A constantede dissociação, Kd, é dada por: Kd = kd/ka = [Ag] [Ab] / [Ag-Ab] . A Kd tem unidades de concentração, mais tipicamente M,mM, μΜ, nM, pM, etc. A comparação das afinidades deanticorpos expressa como Kd, tendo uma afinidade maior paraRAGE é indicada por um valor menor. A constante de associação,Ka, é dada por: Ka = ka/kd = [Ag-Ab] / [Ag] [Ab] . Ka temunidades de concentração inversa, mais tipicamente M"1, mM"1,μΜ"1, nM"1, pM"1, etc. Conforme o uso em questão, o termo"avidez" refere-se à resistência da ligação antígeno-anticorpo após a formação de complexos reversíveis. Osanticorpos anti-RAGE podem ser caracterizados em termos daKd para sua ligação a uma proteína RAGE, como ligação "comuma constante de dissociação (Kd) na faixa de cerca de(valor Kd inferior) a cerca de (valor Kd superior)." Nestecontexto, pretende-se que o termo "cerca de" signifique ovalor Kd indicado ± 20%; isto é, Kd de cerca de 1 = Kd nafaixa de 0,8 a 1,2.

Conforme o uso em questão, o termo "anticorpomonoclonal" refere-se a um anticorpo derivado de umapopulação clonal de células produtoras de anticorpos (porexemplo, linfócitos B ou células B) que é homogênea emestrutura e especificidade de antígeno. O termo "anticorpopoliclonal" refere-se a uma pluralidade de anticorpos que seoriginam a partir de diferentes populações clonais decélulas produtoras de anticorpos que são heterogêneas em suaestrutura e especificidade de epítopo, porém, reconhecidocomo um antígeno comum. Os anticorpos monoclonais epoliclonais podem existir em fluidos corpóreos, comopreparações brutas, ou podem ser purificados, conforme aquidescrito.

O termo "porção de ligação" de um anticorpo (ou"porção de anticorpo") inclui um ou mais domínios completos,por exemplo, um par de domínios completos, bem comofragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de seligar, de maneira especifica, ao RAGE. Mostrou-se que afunção de ligação de um anticorpo pode ser realizada porfragmentos de um anticorpo de comprimento total. Osfragmentos de ligação são produzidos por técnicas de DNArecombinante, ou por clivagem enzimática ou química deimunoglobulinas intactas. Os fragmentos de ligação incluemFab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fd, dAb, Fv, cadeias única,anticorpos de cadeia única, por exemplo, scFv, e anticorposde domínio único (Muyldermans et al., 2001, 26:230-5), e umaregião determinante de complementaridade (CDR) isolada. 0fragmento Fab é um fragmento monovalente que consiste nosdomínios VL, VH, CL e CHI. 0 fragmento F(ab')2 é umfragmento bivalente que consiste em dois fragmentos Fabligados por uma ponte dissulfídica na região de articulação.

O fragmento Fd consiste nos domínios VH e CHI, e o fragmentoFv consiste nos domínios VL e VH de um único braço de umanticorpo. Um fragmento dAb consiste em um domínio VH (Wardet al., (1989) Nature 341:544 a 546). Embora os doisdomínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados porgenes separados, eles podem ser unidos, utilizando-semétodos recombinantes, por um ligador sintético que ospermite fazer como uma cadeia de proteína única na qual opar de regiões VL e VH serve para formar moléculasmonovalentes (conhecido como Fv de cadeia única Fv (scFv)(Bird et al., 1988, Science 242:423 a 426). Pretende-se queesses anticorpos de cadeia única também sejam abrangidospelo termo "porção de ligação" de um anticorpo. Outrasformas de anticorpos de cadeia única, como "diacorpos"também são abrangidos. Os "diacorpos" são anticorposbivalentes e biespecificos em que os domínios VH e VL sãoexpressos em uma única cadeia de polipeptídeo, porém,utiliza um ligador que é muito curto para permitir uma uniãoentre os dois domínios na mesma cadeia, forçando-os, assim,a se unirem com domínios complementários de outra cadeia ecriando dois sítios de ligação de antígenos (consulte, porexemplo, Holliger, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA90:6444 a 6448). Um anticorpo ou porção de ligação do mesmotambém pode ser parte de uma molécula com maior imunoadesãoformada por associação covalente ou não-covalente doanticorpo ou porção de anticorpo com uma ou mais proteínasou peptídeos. Exemplos dessas moléculas de imunoadesãoincluem o uso da região de núcleo de estreptavidina paraconstituir uma molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M.,et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93 a 101) euso de um resíduo de cistina, um peptídeo marcador e umacauda de poli-histidina de terminal C para constituir asmoléculas scFv bivalentes e biotinilado (Kipriyanov, S. M.,et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047 a 1058). Os fragmentosde ligação, como os fragmentos Fab e F(ab')2/ podem serpreparados a partir de anticorpos completos utilizando-setécnicas convencionais, como digestão de papaína ou pepsina,respectivamente, de anticorpos completos. Além disso, osanticorpos, as porções de anticorpos e as moléculas deimunoadesão podem ser obtidos através do uso de técnicaspadrão de DNA recombinante, conforme aqui descrito econhecido na técnica. A não ser os anticorpos "biespecificos"ou "bifuncionais", compreende-se que um anticorpo tem cadaum de seus sitios de ligação idênticos. Um anticorpo"biespecifico" ou "bifuncional" é um anticorpo híbridoartificial tendo dois pares diferentes de cadeias pesadas/leve e dois sítios de ligação diferentes. Um anticorpobiespecífico pode incluir, também, duas regiões de ligaçãode antígenos com uma região constante de intercalação. Osanticorpos biespecíficos podem ser produzidos por umavariedade de métodos que incluem fusão de hibridomas ouligação de fragmentos Fab'. Consulte, por exemplo,Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79:315 a 321, 1990.;Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148, 1547 a 1553.

O termo "mutação reversa" refere-se a um processono qual alguns ou todos os aminoácidos somaticamente mutadosde um anticorpo humano são substituídos pelos resíduos dalinha germinativa correspondentes a partir de uma seqüênciade anticorpo da linha germinativa homóloga. As seqüências decadeia pesada e leve do anticorpo humano da invenção sãoalinhadas separadamente às seqüências da linha germinativano banco de dados VBASE de modo a identificar as seqüênciascom a homologia mais alta. As diferenças no anticorpo humanoda invenção são retornadas à seqüência da linha germinativapela mutação das posições nucleotídicas definidas quecodificam tal aminoácido diferente. O papel de cadaaminoácido identificado como candidato para mutação reversadeve ser verificado como um papel direto ou indireto naligação de antígenos e qualquer aminoácido encontrado após amutação para afetar qualquer característica desejável doanticorpo humano não deve ser incluído no anticorpo humanofinal;; como um exemplo, os aminoácidos intensificadores deatividade identificados pela abordagem de mutagêneseseletiva não serão submetidos à mutação reversa. Com afinalidade de minimizar o número de aminoácidos submetidos àmutação reversa, as posições de aminoácidos que foramidentificadas como sendo diferentes da seqüência de linhagerminativa mais próxima, porém, idênticas ao aminoácidocorrespondente em uma segunda linha germinativa podempermanecer, ficando estabelecido que a segunda seqüênciagerminativa é idêntica e colinear à seqüência do anticorpohumano da invenção em pelo menos 10, de preferência, 12aminoácidos, em ambos os lados do aminoácido em questão. Amutação reversa pode ocorrer em qualquer estágio deotimização de anticorpos; de preferência, a mutação reversaocorre diretamente antes ou após a abordagem de mutagêneseseletiva. Com mais preferência, a mutação reversa ocorrediretamente antes da abordagem de mutagênese seletiva.

Os anticorpos intactos, também conhecidos comoimunoglobulinas, são tipicamente proteínas glicosiladascompostas por duas cadeias leves (L) de aproximadamente 25kDa cada e duas cadeias pesadas (H) de aproximadamente 50kDa cada. Dois tipos de cadeia leve, com terminações lambdae kappa, foram encontrados nos anticorpos. Dependendo daseqüência de aminoácidos do domínio constante de cadeiaspesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a cincoclasses principais: A, D, E, GeM, e diversas delas podem,ainda,ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo,IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Cada cadeia leve écomposta por um domínio (VL) variável (V) de terminal N epor um domínio (CL) constante (C). Cada cadeia pesada écomposta por um domínio (VH) V de terminal N, três ou quatrodomínios C (CHs), e uma região articulada. 0 domínio CH maispróximo ao VH é designado como CHI. Os domínios VH e VLconsistem em quatro regiões de seqüências relativamenteconservadas denominadas regiões de estrutura (FR1, FR2, FR3e FR4), que formam um arcabouço para três regiões deseqüências hipervariáveis (regiões determinantes decomplementaridade, CDRs). As CDRs contêm a maioria dosresíduos responsáveis pelas interações específicas doanticorpo com o antígeno. As CDRs são denominadas como CDRl,CDR2 e CDR3. Conseqüentemente, os constituintes de CDR CNAcadeia pesada são denominados como Hl, H2 e H3, enquanto queos constituintes de CDR na cadeia leve são denominados comoLI, L2 e L3. A CDR3 é a maior fonte de diversidade no sítiode ligação de anticorpos. O H3, por exemplo, pode ser tãocurto quanto dois resíduos de aminoácidos ou maior que 26aminoácidos. As estruturas de subunidade e as configuraçõestridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas sãobem conhecidas na técnica. Para uma revisão sobre aestrutura de anticorpos, consulte Antibodies: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al.,1988. Os elementos versados na técnica reconhecerão que cadaestrutura de subunidade, por exemplo, uma estrutura CH, VH,CL, VL, CDR, FR, compreende fragmentos ativos, por exemplo,a porção da subunidade VH, VL ou CDR que se liga aoantigeno, isto é, o fragmento de ligação, ou, por exemplo, aporção da subunidade CH que liga e/ou ativa, por exemplo, umreceptor e/ou complemento Fc.

A diversidade de anticorpos é criada através douso de múltiplas regiões variáveis codificadoras de genes dalinha germinativa e uma variedade de eventos somáticos. Oseventos somáticos incluem a recombinação de segmentos degene variável com segmentos de gene de diversidade (D) eunião (J) para constituir uma região VH completa, e arecombinação dos segmentos de gene variável e união paraconstituir uma região VL completa. 0 próprio processo derecombinação é impreciso, resultando na perda ou adição deaminoácidos nas junções V(D)J. Esses mecanismos dediversidade ocorrem no desenvolvimento da célula B antes daexposição do antigeno. Após a estimulação antigênica, osgenes de anticorpos expressos em células B são submetidos àmutação somática.

Com base no número estimado de segmentosde gene da linha germinativa, a recombinação aleatóriadesses segmentos, e a união aleatória VH-VL, até 1,6 χ 107anticorpos diferentes podem ser produzidos (FundamentalImmunology, 3a ed. (1993), ed. Paul, Raven Press, Nova York,NY, EUA). Quando outros processos que contribuem paradiversidade de anticorpos (como a mutação somática) sãolevados em consideração, imagina-se que mais de 1x1010anticorpos diferentes podem ser gerados (ImmunoglobulinGenes, 2a ed. (1995), eds. Jonio et al., Academic Press, SãoDiego, CA, EUA) . Por causa dos muitos processos envolvidosna geração da diversidade de anticorpos, é improvável queanticorpos monoclonais independentemente derivados com amesma especificação de antigenos tenham seqüências deaminoácidos idênticas.

O termo "polipeptídeo de dimerização" ou "domíniode dimerização" inclui qualquer polipeptídeo que forme umdímero (ou complexo de ordem maior, como um trímero,tetrâmero, etc.) com outro polipeptídeo. Opcionalmente, opolipeptídeo de dimerização se associa a outros polipeptídeosde dimerização idênticos, formando, assim, homomultímeros.

Um elemento IgG Fc é um exemplo de um domínio de dimerizaçãoque tende a formar homomultímeros. Opcionalmente, opolipeptídeo de dimerização se associa a outros polipeptídeosde dimerização diferentes, formando, assim, heteromultímeros.

O domínio de zíper de leucina Jun forma um dímero com odomínio de zíper de leucina Fos, e, portanto, é um exemplode um domínio de dimerização que tende a formarheteromultímeros. Os domínios de dimerização podem formar 25hetero- e homomultímeros.

0 termo "anticorpo humano" inclui anticorpos tendoregiões variáveis e constantes correspondentes às seqüênciasde imunoglobulina da linha germinativa humana conformedescrito por Kabat . et al. (consulte Kabat, et al. (1991)Sequences of proteins of Immunological Interest, QuintaEdição, Departamento Norte-Americano de Saúde de ServiçosSociais, NIH Publicação No. 91-3242). Os anticorpos humanosda invenção podem incluir resíduos de aminoácidos nãocodificados por seqüências de imunoglobulina da linhagerminativa humana (por exemplo, mutações introduzidas pormutagênese aleatória ou de sítio específico in vitro ou pormutação somática in vivo) , por exemplo, nas CDRs e na CDR3particular. De preferência, as mutações são introduzidasatravés do uso da "abordagem de mutagênse seletiva" aquidescrita. O anticorpo humano pode ter ao menos uma posiçãosubstituída por um resíduo de aminoácido, por exemplo, umresíduo de aminoácido intensificador de atividade, que não écodificado pela seqüência de imunoglobulina da linhagerminativa humana. O anticorpo humano pode ter até vinteposições substituídas por resíduos de aminoácidos que nãofazem parte da seqüência de imunoglobulina da linhagerminativa humana. Além disso, até dez, cinco, três ou atéduas posições são substituídas. Essas substituições podemestar inclusas nas regiões CDR conforme descrito em maioresdetalhes abaixo. No entanto, o termo "anticorpo humano",conforme o uso em questão, não se pretende incluir osanticorpos em que as seqüências CDR derivadas da linhagerminativa de outras espécies de mamíferos, como umcamundongo, foram enxertadas nas seqüências de estruturahumana.

A frase "anticorpo humano recombinante" incluianticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ouisolados por meios recombinantes, como anticorpos expressosque utilizam um vetor de expressão recombinante transfectadaem uma célula hospedeira (descrita mais adiante na SeçãoII) , os anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória erecombinante de anticorpos humanos (descrita mais adiante naSeção III), os anticorpos isolados de um animal (porexemplo, um camundongo) que seja transgênico para genes deimunoglobulina humana (consulte, por exemplo, Taylor, L. D.,et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287 a 6295) ou osanticorpos preparados, criados ou isolados por quaisqueroutros meios que envolvam a ligação de seqüências de gene deimunoglobulina humana a outras seqüências de DNA. Essesanticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis econstantes derivadas a partir de seqüências de imunoglobulinada linha germinativa humana (consulte Kabat, Ε. A., et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,Quinta edição, Departamento Norte-Americano de Saúde eServiços Públicos, NIH Publicação No. 91-3242). No entanto,esses anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidosà mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico paraseqüências Ig humanas for usado, mutagênese somática invivo) e, portanto, as seqüências de aminoácidos das regiõesVH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências que,enquanto derivadas e relacionadas às seqüências VH e VL dalinha germinativa humana, podem não existir naturalmente norepertório da linha germinativa de anticorpos humanos invivo. Em certas modalidades, no entanto, esses anticorposrecombinantes podem ser o resultado da abordagem de mutagêneseou mutação reversa ou ambas.

Um "anticorpo isolado" inclui um anticorpo que ésubstancialmente isento de outros anticorpos tendo diferentesespecificações antigênicas (por exemplo, um anticorpoisolado que se liga, de maneira especifica, ao RAGE ésubstancialmente isento de anticorpos que se ligam, demaneira especifica, ao RAGE que não seja o hRAGE) . Umanticorpo isolado que se liga, de maneira especifica, aoRAGE pode se ligar às moléculas RAGE de outras espécies.Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmenteisento de outros materiais celulares e/ou elementosquímicos.

Um "anticorpo de neutralização" (ou um "anticorpoque neutraliza a atividade RAGE") inclui um anticorpo cujaligação ao hRAGE resulta na modulação da atividade biológicade hRAGE. Esta modulação da atividade biológica de hRAGEpode ser avaliada medindo-se um ou mais indicadores daatividade biológica hRAGE, como a inibição de uma ligação dereceptor em um ensaio de ligação de receptor RAGE humano(consulte, por exemplo, os Exemplos 6 e 7). Esses indicadoresde atividade biológica hRAGE podem ser avaliados por um oumais dos diversos ensaios padrão in vitro ou in vivoconhecidos na técnica (consulte, por exemplo, os Exemplos 6 e 7).

As formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos(por exemplo, murídeos) são anticorpos quiméricos que contêmuma seqüência mínima derivada da imunoglobulina não-humana.

Na maioria, os anticorpos humanizados consistem emimunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) em que osresíduos de uma região hipervariável do recipiente sãosubstituídos por resíduos de uma região hipervariável de umaespécie não-humana (anticorpo doador) , como camundongos,ratos, coelhos ou primatas não-humanos tendo a especificação,afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, osresíduos FR da imunoglobulina humana são substituídos porresíduos não-humanos correspondentes. Além disso, osanticorpos humanizados podem compreender resíduos que nãosão encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpodoador. Essas modificações são feitas para refinaradicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, oanticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos ouao menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em quetodas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveiscorrespondem às regiões de uma imunoglobulina não-humana etodas ou substancialmente todas as regiões FR são as regiõesde uma seqüência de imunoglobulina humana. Opcionalmente, oanticorpo humanizado também compreenderá ao menos uma porçãode uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamentea de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais,consulte Jones et al., Nature 321:522 a 525 (1986);Riechmann et al., Nature 332:323 a 329 (1988); e Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 a 596 (1992).

O termo "atividade" inclui atividades como aespecificação/afinidade de ligação de um anticorpo para umantígeno, por exemplo, um anticorpo anti-hRAGE que se ligaao RAGE e/ou a potência de neutralização de um anticorpo,por exemplo, um anticorpo anti-hRAGE cuja ligação ao hRAGEinibe a atividade biológica de RAGE, por exemplo, inibiçãode ligação de receptor em um ensaio de ligação de receptorRAGE humano.

Uma "construção de expressão" é qualquer ácidonucléico recombinante que inclui um ácido nucléicoexpressível e elementos regulatórios suficientes para mediara expressão da proteina ou polipeptideo de ácido nucléicoexpressível em uma célula hospedeira adequada.

Os termos "proteína de fusão" e "proteína quimérica"são intercambiáveis e se referem a uma proteína oupolipeptideo que possui uma seqüência de aminoácidos tendoporções correspondentes às seqüências de aminoácidos de duasou mais proteínas. As seqüências de duas ou mais proteínaspodem ser completas ou parciais (isto é, fragmentos) dasproteínas. As proteínas de fusão também podem ter regiões deligação de aminoácidos entre as porções correspondentesàquelas das proteínas. Essas proteínas de fusão podem serpreparadas por métodos recombinantes, onde os ácidosnucléicos correspondentes são unidos através de tratamentocom nucleases e ligases e incorporados em um vetor deexpressão. A preparação de proteínas de fusão é,genericamente, compreendida pelos elementos versados natécnica.

O termo "ácido nucléico" refere-se a poli-nucleotídeos, como o ácido desoxirribonucléico (DNA), e,onde apropriado, o ácido ribonucléico (RNA). 0 termo tambémdeve ser entendido por incluir, tanto equivalentes, análogosde RNA ou DNA feitos a partir de análogos nucleotídicos, e,como aplicáveis à modalidade em questão, polinucleotídeos defita única (sentido ou anti-sentido) e dupla.

O termo "porcentagem idêntica" ou "identidadepercentual" refere-se à identidade seqüencial entre duasseqüências de aminoácidos ou entre duas seqüênciasnucleotidicas. Δ identidade percentual pode ser determinadacomparando-se uma posição em cada seqüência que possa seralinhada por propósitos de comparação. A expressão como umaporcentagem de identidade refere-se a uma função di númerode aminoácidos ou ácidos nucléicos idênticos nas posiçõescompartilhadas pelas seqüências comparadas. Vários algoritmose/ou programas de alinhamento podem ser usados, incluindoFASTA, BLAST ou ENTREZ. 0 FASTA e o BLAST estão disponíveiscomo uma parte do pacote de análise seqüencial GCG(Universidade de Wisconsin, Madison, Wis, EUA), e podem serusados, por exemplo, com predefinições. 0 ENTREZ estádisponível junto ao Centro Nacional de InformaçõesBiotecnológicas, Biblioteca Nacional de Medicina, InstitutosNacionais de Saúde, Bethesda, Md, EUA. A identidadepercentual das duas seqüências pode ser determinada peloprograma GCG com um peso de lacuna igual a 1, por exemplo,cada lacuna de aminoácidos é pesada como se tivesse umadivergência de aminoácido ou nucleotídeo único entre as duas seqüências.

Outras técnicas para alinhamento são descritas nosMétodos em Enzymology, vol. 266: Computer Methods forMacromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle,Academic Press, Inc., uma divisão de Harcourt Brace & Co.,São Diego, Califórnia, EUA. De preferência, utiliza-se umprograma de alinhamento que permite lacunas na seqüênciapara alinhar as seqüências. O Smith-Waterman é um tipo dealgoritmo que permite lacunas em alinhamentos de seqüências.Consulte Meth. Mol. Vols. 70:. 173 a 187 (1997). Da mesmaforma, pode-se utilizar o programa GAP I que usa o método dealinhamento Needlenan and Wunsch para alinhar as seqüências.Uma estratégia de busca alternativa usa o software MPSRCH,que é executado em um computador MASPAR. 0 MPSRCH usa oalgoritmo Smith-Waterman para classificar as seqüências 5 emum computador massivamente paralelo. Esta abordagem aprimoraa capacidade de escolher compatibilidades afastadamenteremotas, e é especialmente tolerante com erros de pequenaslacunas e seqüência nucleotidica. As seqüências de amino-ácidos codificadas por ácido nucléico podem ser usadas parabuscas de bancos de dados de proteínas e DNA.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são aquiusados de maneira intercambiável.

Uma proteína "RAGE" é um "Receptor para ProdutosFinais de Glicação Avançada", conforme conhecido na técnica.As proteínas RAGE representativas são apresentadas nasFiguras IA a IC. As proteínas RAGE incluem RAGE solúvel(sRAGE) e RAGE secretório endógeno (esRAGE). 0 RAGEsecretório endógeno é uma variante de ligação de RAGE que éliberada fora das células, onde ele é capaz de ligarligantes de AGE e neutralizar as ações de AGE. Consulte, porexemplo, Koyama et al., ATVEr 2005; 25:2587 a 2593. Aassociação inversa tem sido observada entre o esRAGE noplasma humano e vários componentes de síndrome metabólica(BMI, resistência à insulina, BP, hipertrigliceridemia eIGT) . Os níveis de esRAGE em plasma também foram inversamenteassociados à arteriosclerose de carótida e femoral(quantificadas por ultra-som) em indivíduos com ou semdiabetes. Além disso, os níveis de esRAGE em plasma sãosignificantemente menores em pacientes não-diabéticos comdoença arterial coronariana angiograficamente provada do queem indivíduos de controle saudáveis da mesma idade.

Um "Elemento de Ligação ao Ligante do Receptorpara Produtos Finais de Glicação Avançada" ou "RAGE-LBE"(também aqui denominado como "RAGE-Fe" e "RAGE-strep")inclui qualquer porção extracelular de um polipeptídeo RAGEcom transmembrana e fragmentos do mesmo que retém acapacidade de se ligar a um ligante RAGE. Este termo tambémabrange polipeptídeos tendo ao menos 85% de identidade, depreferência, ao menos 90% de identidade ou, com maispreferência, ao menos 95% de identidade em relação a umpolipeptídeo RAGE, por exemplo, o polipeptídeo humano ou murídeo ao qual um ligante RAGE ou RAGE-BP irá se ligar.

Um "Parceiro de Ligação Receptor para ProdutosFinais de Glicação Avançada" ou "RAGE-BP" inclui qualquersubstância (por exemplo, polipeptídeo, pequena molécula,estrutura de carboidrato, etc.) que se liga em umaconfiguração fisiológica a uma porção extracelular de umaproteína RAGE (um polipeptídeo receptor como, por exemplo,RAGE ou RAGE-LBE).

Os "distúrbios relacionados ao RAGE" ou "distúrbiosassociados ao RAGE" incluem qualquer distúrbio em que umacélula ou tecido afetado exibe um aumento ou redução naexpressão e/ou atividade de RAGE ou um ou mais ligantesRAGE. Os distúrbios relacionados ao RAGE incluem, também,qualquer distúrbio que seja tratável (isto é, um ou maissintomas podem ser eliminados ou melhorados) por uma reduçãona função RAGE (incluindo, por exemplo, a administração deum agente que rompa as interações RAGErRAGE-BP).

0 "domínio V de RAGE" refere-se ao domíniovariável tipo imunoglobulina conforme mostrado na Figura 5de Neeper, et al, "Cloning and expression of RAGE: a cellsurface receptor for advanced glycosylation end products ofproteins," J. Biol. Chem. 267:14998 a 15004 (1992), sendoque os conteúdos deste estão aqui incorporados a título dereferência. O domínio V inclui aminoácidos da posição 1 àposição 120 conforme mostrado na SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO: 3.

0 cDNA humano de RAGE consiste em 1406 pares debases e codifica uma proteína madura de 404 aminoácidos.Consulte a Figura 3 de Neeper et al. 1992.

O termo "ácido nucléico recombinante" incluiqualquer ácido nucléico compreendendo ao menos duasseqüências que não estejam presentes juntamente na natureza.Um ácido nucléico recombinante pode ser gerado in vitro, porexemplo, utilizando-se métodos de biologia molecular, ou invivo, por exemplo, mediante a inserção de um ácido nucléicoem um novo local cromossômico por recombinação homóloga ounão-homóloga.

0 termo "tratamento" em relação a um indivíduorefere-se ao melhoramento de ao menos um sintoma da doençaou distúrbio do indivíduo. 0 tratamento pode curar a doençaou condição ou melhorá-la.

0 termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácidonucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qualela foi ligada. Um tipo de vetor é um episoma, isto é, umácido nucléico capaz de replicação extracromossômica. Outrotipo de vetor consiste em um vetor integrativo que édesignado para se recombinar com o material genético de umacélula hospedeira. Os vetores podem ser, de formaindependente, tanto replicativos como integrativos, e aspropriedades de um vetor podem ser diferentes dependendo docontexto celular (isto é, um vetor pode ser, de formaindependente, replicativo em um tipo de célula hospedeira epuramente integrativo em outro tipo de célula hospedeira).Os vetores capazes de controlar a expressão de ácidosnucléicos expressiveis aos quais eles são operacionalmenteligados são aqui denominados como "vetores de expressão".

O termo "especificamente imunoreativo" refere-se àligação preferencial de compostos [um anticorpo] a umaseqüência peptidica particular, quando um anticorpointeragir com uma seqüência peptidica especifica.

Conforme o uso em questão, a frase "quantidadeeficaz" significa que a quantidade de um ou mais agente,material ou composição compreendendo um ou mais agentes dapresente invenção que sejam eficazes para produção de algumefeito desejado em um animal. Sabe-se que quando um agenteestá sendo usado para se obter um efeito terapêutico, a dosereal que compreende a "quantidade eficaz" irá variardependendo de uma série de condições incluindo a condiçãoparticular a ser tratada, a gravidade da doença, o tamanho esaúde do paciente, a rota de administração, etc. um médicoversado na técnica pode prontamente determinar a doseapropriada através do uso de métodos bem conhecidos nastécnicas médicas.

A frase "farmaceuticamente aceitável" é aquiempregada para fazer referência aos compostos, materiais,composições e/ou formas de dosagem que são, mo escopo dodiscernimento médico, adequadas ao uso em contato com ostecidos de seres humanos e animais sem toxidade excessiva,irritação, resposta alérgica, ou outro problema oucomplicação, proporcional a uma relação razoável beneficio/risco.

Conforme o uso em questão, a frase "veiculofarmaceuticamente aceitável" significa um material,composição ou veiculo farmaceuticamente aceitável, como umacarga liquida ou sólida, diluente, excipiente, solvente oumaterial de encapsulação, envolvidos em transmitir outransportar os agentes sujeitos de um órgão, ou porção docorpo, para outro órgão, ou porção do corpo. Cada veiculodeve ser "aceitável" no sentido de ser compatível aos outrosingredientes da formulação. Alguns exemplos de materiais quepodem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveisincluem: (1) açúcares, como lactose, glucose e sucrose; (2)amidos, como amido de milho e amido de batata; (3) celulose,e seus derivados, como sódio carboximetil celulose, etilcelulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5)malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, comomanteiga de cacau e ceras de candeia; (9) óleos, como óleode amendoim, óleo de algodão em rama, óleo de açafroa, óleode gergelim, azeite de oliva, óleo de milho e óleo de soja;(10) glicóis, como propileno glicol; (11) polióis, comoglicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; (12)ésteres, como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar;(14) agentes de tamponamento, como hidróxido de magnésio ehidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água isentade pirogênio; (17) isotônico salino, (18) solução de Ringer,(19) álcool etílico; (20) soluções tampão de fosfato; e (21)outras substâncias compatíveis não-tóxicas empregadas nas formulações farmacêuticas.

Preparação de Anticorpos MonoclonaisUm mamífero, como um camundongo, um rato, umhamster ou um coelho pode ser imunizados com a proteína decomprimento total ou fragmentos desta, ou o cDNA codifica aproteína de comprimento total ou um fragmento da mesma umaforma imunogênica do peptídeo. As técnicas para conferirimunogenicidade a uma proteína ou peptídeo incluem aconjugação aos veículos ou outras técnicas bem conhecidas natécnica. Uma porção imunogênica de um polipeptídeo pode seradministrada na presença de um adjuvante. 0 progresso daimunização pode ser monitorado pela detecção de titulação deanticorpos no plasma ou soro. Pode-se usar ELISA padrão ououtros imunoensaios com o imunógeno como antígeno para seavaliar os níveis de anticorpos.

Seguindo a imunização de um animal com umapreparação antigênica dos polipeptídeos sujeitos, pode-seobter o anti-soro e, se desejado, anticorpos policlonaisisolados do soro. Com a finalidade de produzir anticorposmonoclonais, as células produtoras de anticorpos(linfócitos) podem ser colhidas de um animal imunizado efundidas por quaisquer procedimentos padrão de fusão decélulas somáticas com células imortalizadas, como células demieloma para produzir células hibridomas. Essas técnicas sãobem conhecidas na técnica, e incluem, por exemplo, a técnicade obtenção de hibridomas (originalmente desenvolvida porKohler e Milstein, (1975) Nature, 256: 495 a 497), the humanB cell hybridoma technique (Kozbar et al. (1983) ImmunologyToday, 4: 72), and the EBV- hybridoma technique to producehuman monoclonal antibodies (Cole et al., (1985) MonoclonalAntibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77 a96). As células hibridomas podem ser tríadas, de maneiraimunoquímica, para produção de anticorpos especificamentereativos com um epítopo do polipeptídeo RAGE e anticorposmonoclonais isolados de uma cultura que compreende essascélulas hibridomas.

Humanização

Os anticorpos quiméricos compreendem seqüências deao menos duas espécies diferentes. Como um exemplo, pode-seutilizar técnicas de clonagem recombinante para incluir asregiões variáveis, que contêm os sítios de ligação deantígenos, a partir de um anticorpo não-humano (isto é, umanticorpo preparado em uma espécie não-humana imunizada como antígeno) e regiões constantes derivadas a partir de umaimunoglobulina humana.

Os anticorpos humanizados são um tipo de anticorpoquimérico onde os resíduos da região variável responsáveispela ligação de antígenos (isto é, os resíduos de uma regiãodeterminante de complementaridade, abreviada regiãodeterminante de complementaridade, ou quaisquer outrosresíduos que participam da ligação de antígenos) sãoderivados de uma espécie não-humana, enquanto os resíduosrestantes da região variável (isto é, os resíduos dasregiões de estrutura) e as regiões constantes são derivados,pelo menos em parte, a partir de seqüências de anticorposhumanos. Um subsistema de resíduos da região de estrutura eresíduos da região constante de um anticorpo humanizado podeser derivado a partir de fontes não-humanas. As regiõesvariáveis de um anticorpo humanizado também são descritascomo humanizadas (isto é, uma região variável humanizada decadeia pesada ou pesada). Tipicamente, a espécie não-humanaé aquela usada para imunização com antígenos, comocamundongos, ratos, coelhos, primatas não-humanos, ou outrasespécies de mamíferos não-humanos. Os anticorpos humanizadossão, tipicamente, menos imunológicos do que os anticorposquiméricos tradicionais e apresentam uma estabilidadeaperfeiçoada seguindo a administração em humanos. Consulte,por exemplo, Benincosa et al. (2000) J. Pharmacol. Exp.Ther. 292:810-6; Kalofonos et al. (1994) Eur. J. Câncer30A:1842-50; Subramanian et al. (1998) Pediatr. Infect. Dis.J. 17:110-5.

As regiões determinantes de complementaridade(CDRs) são resíduos de regiões variáveis, de anticorpos quefazem parte da ligação de antígenos. Diversos sistemas denumeração para identificação de CDRs são de uso comum. Adefinição Kabat é baseada na variabilidade seqüencial, e adefinição Chothia é baseada na localização das regiões delaços estruturais. A definição AbM é um acordo entre asabordagens Kabat e Chothia. As CDRs da região variável decadeia leve são ligadas pelos resíduos nas posições 24 e 34(CDRl-L), 50 e 56 (CDR2-L), e 89 e 97 (CDR3-L) de acordo como algoritmo Kabat, Chothia ou AbM. De acordo com a definiçãoKabat, as CDRs da região variável de cadeia pesada sãoligadas pelos resíduos nas posições 31 e 35B (CDRl-H), 50 e65 (CDR2-H) , e 95 e 102 (CDR3-H) (numeração de acordo comKabat). De acordo com a definição Chothia, as CDRs da regiãovariável de cadeia pesada são ligadas pelos resíduos nasposições 26 e 32 (CDRl-H) , 52 e 56 (CDR2-H) , e 95 e 102(CDR3-H) (numeração de acordo com Chothia). De acordo com adefinição AbM, as CDRs da região variável de cadeia pesadasão ligadas pelos resíduos nas posições 26 e 35B (CDRl-H),50 e 58 (CDR2-H), e 95 e 102 (CDR3-H) (numeração de acordocom Kabat). Consulte Martin et al. (1989) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 86: 9268 a 9272; Martin et al. (1991) MethodsEnzymol. 203: 121 a 153; Pedersen et al. (1992)Immunomethods 1: 126; and Rees et al. (1996) In SternbergM.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, OxfordUniversity Press, Oxford, pp. 141 a 172.

Conforme o uso em questão, o termo "CDR" refere-seàs CDRs conforme definido por Kabat ou por Chothia; alémdisso, uma variável de anticorpos humanizados da invençãopode ser construída de modo a compreender uma ou mais CDRsconforme definido por Kabat, e de modo a compreender,também, uma ou mais CDRs conforme definido por Chothia.As regiões determinantes de especificação (SDRs)são resíduos dentro das CDRs que interagem diretamente comos antígenos. As SDRs correspondem aos resíduoshipervariáveis. Consulte (Padlan et al. (1995) FASEB J. 9:133 a 139).

Os resíduos estruturais são os resíduos de regiõesvariáveis de anticorpos exceto os resíduos hipervariáveis ouCDR. Os resíduos estruturais podem ser derivados a partir deum anticorpo humano de ocorrência natural, como umaestrutura humana que é substancialmente similar a uma regiãode estrutura do anticorpo anti-RAGE da invenção. Asseqüências estruturais artificiais que representam umconsenso entre as seqüências individuais também podem serusadas. Ao selecionar uma região estrutural parahumanização, as seqüências que são amplamente representadasem humanos podem ser preferenciais em relação às seqüênciasmenos numerosas. Podem-se fazer mutações adicionais dasseqüências aceptoras estruturais humanas para restaurar osresíduos de murídeos acreditados que estejam envolvidos emcontatos e/ou resíduos de antígenos envolvidos naintegridade estrutural do sítio de ligação de antígenos, oupara melhorar a expressão de anticorpos. Pode-se usar umaprevisão de estrutura peptídica para analisar as seqüênciasde região pesada e leve variável humanizada de modo aidentificar e evitar sítios de modificação de proteínas pós-tradução introduzidos pelo projeto de humanização.

Os anticorpos humanizados podem ser preparadosatravés do uso de uma variedade de métodos, inclusiverevestimento, enxerto de regiões determinantes decomplementaridade (CDRs), enxerto de CDRs abreviadas,enxerto de regiões determinantes de especificação (SDRs), emontagem de Frankenstein, conforme descrito abaixo. Osanticorpos humanizados também incluem anticorpos super-humanizados, e quem uma ou mais alterações são introduzidasnas CDRs. Por exemplo, os resíduos humanos podem sersubstituídos por resíduos não-humanos nas CDRs. Essasabordagens gerais podem ser combinadas com técnicas padrãode mutagênese e síntese para produzir um anticorpo anti-RAGEde qualquer seqüência desejada.

O revestimento é baseado no conceito no conceitode reduzir potencialmente as seqüências de aminoácidosimunogênicas em um anticorpo de roedor ou outro anticorponão-humano revestindo-se a parte externa acessível dosolvente do anticorpo com seqüências de aminoácidos humanos.Portanto, os anticorpos revestidos aparentam ser menosestranhos às células humanas do que o anticorpo não-humanonão-modifiçado. Consulte Padlan (1991) Mol. Immunol. 28:489-98. Um anticorpo não-humano é revestido identificando-se osresíduos de região estrutural expostos no anticorpo não-humano, que são diferentes dos que estão nas mesmas posiçõesnas regiões estruturais de um anticorpo humano, e pelasubstituição dos resíduos identificados por aminoácidos quetipicamente ocupam estas mesmas posições nos anticorpos humanos.

O enxerto de CDRs é realizado substituindo-se umaou mais CDRs de um anticorpo aceptor (por exemplo, umanticorpo humano ou outro anticorpo que compreende resíduosestruturais desejados) por CDRs de um anticorpo doador (porexemplo, um anticorpo não-humano). Os anticorpos aceptorespodem ser selecionados com base na semelhança de resíduosestruturais entre um anticorpo aceptor candidato e umanticorpo doador. Por exemplo, de acordo com a abordagemFrankenstein, as regiões estruturais humanas sãoidentificadas por terem homologia seqüencial substancial àcada região estrutural do anticorpo não-humano relevante, eas CDRs do anticorpo não-humano são enxertadas sobre ocompósito das regiões estruturais humanas diferentes. Ummétodo relacionado também útil para a preparação deanticorpos da invenção é descrito na Publicação de Pedido dePatente U.S No. 2003/0040606.

O enxerto de CDRs abreviadas é uma abordagemrelacionada. As CDRs abreviadas incluem os resíduosdeterminantes de especificação e os aminoácidos adjacentes,incluindo os que estão nas posições 27d a 34, 50 a 55 e 89 a96 na cadeia leve, e nas posições 31 a 35b, 50 a 58, e 95 a101 na cadeia pesada (conversão de numeração de (Kabat etal. (1987)). Consulte (Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-9). Supõe-se que o enxerto de resíduos determinantes deespecificação (SDRs) é baseado no entendimento de que aespecificação e afinidade de ligação de um sítio combinantede anticorpos é determinada pelos resíduos mais altamentevariáveis em cada uma das regiões determinantes decomplementaridade (CDRs). A análise das estruturastridimensionais de complexos de anticorpo-antígeno combinadacom a análise dos dados seqüência de aminoácidos disponíveispode ser usada para variabilidade seqüencial de modelobaseada na desigualdade de resíduos de aminoácidos queocorrem em cada posição no CDR. Os SDRs são identificadoscomo seqüências de polipeptídeo minimamente imunogênicas queconsistem em resíduos de contato. Consulte Padlan et al.(1995) FASEB J. 9: 133-139.

As estruturas aceptoras para o enxerto de CDRs ouCDRs abreviadas podem ser adicionalmente modificadas para aintrodução de resíduos desejados. Por exemplo, as estruturasaceptoras podem compreender uma região variável de cadeiapesada de uma seqüência consensual de subgrupo I humano,opcionalmente com resíduos doadores não-humanos em uma oumais posições 1, 28, 48, 67, 69, 71 e 93. Como outroexemplo, uma estrutura aceptora humana pode compreender umaregião variável de cadeia leve de uma seqüência consensualde subgrupo I humano, opcionalmente com resíduos doadoresnão-humanos em uma ou mais posições 2, 3, 4, 37, 38, 45 e60. Seguindo o enxerto, as alterações adicionais podem serfeitas nas seqüências doadoras e/ou aceptoras para otimizara ligação e funcionalidade de anticorpos. Consulte, porexemplo, a Publicação Internacional PCT No. WO 91/09967.

As estruturas humanas de uma região variável de cadeia pesada que podem ser usadas para preparar anticorposanti-RAGE humanizados incluem resíduos estruturais includede DP-75, DP54, DP-54 FW VH 3 JH4, DP-54 VH 3 3-07, DP-8(VH1-2), DP-25, VI-2b e VI-3 (VH1-03), DP-15 e Vl-8 (VH1-08), DP-14 e Vl-18 (VHl-18), DP-5 e V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45),DP-7 (VH1-46) , DP-IO, DA-6 e YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VHl-e),DP-3, e DA-8 (VHl-f).

As estruturas humanas de uma região variável decadeia leve que pode ser usada para preparar anticorposanti-RAGE humanizados incluem resíduos estruturais de clonena linha germinativa humana DPK24, DPK-12, DPK-9 Vkl, DPK-9Jk4, DPK9 Vkl 02, e subgrupos VkIII e VkI de clone na linhagerminativa. As seguintes mutações de uma linha germinativaDPK24 pode aumentar a expressão de anticorpos: FIOS, T45K,I63S, Y67S, F73L e T77S.

Os anticorpos anti-RAGE humanizados representativosda invenção incluem anticorpos tenso uma ou mais CDRs de umaseqüência de aminoácidos de região variável selecionada deSEQ ID NOs:16-27. Por exemplo, os anticorpos anti-RAGEhumanizados podem compreender duas ou mais CDRs selecionadasde CDRs de uma região variável de cadeia pesada de qualqueruma das SEQ ID N0s:16, 18, 21, 24, 20 e 26, ou uma regiãovariável de cadeia leve de qualquer uma das SEQ ID NOs: 17,19, 22, 25, 23 e 27. Os anticorpos anti-RAGE humanizadospodem compreender, também, uma cadeia pesada que compreendeuma região variável tendo duas ou três CDRs de qualquer umadas SEQ ID N0s:16, 18, 21, 24, 20 e 26, e uma cadeia leveque compreende uma região variável tendo duas ou três CDRsde qualquer uma das SEQ ID NOs: 17, 19, 22, 25, 23 e 27.

Os anticorpos anti-RAGE humanizados da invençãopodem ser construídos onde a região variável de uma primeiracadeia (isto é, a região variável de cadeia leve ou a regiãovariável de cadeia pesada) é humanizada, e onde a regiãovanavel da segunda cadeia não e humanizada (isto e, umaregião variável de um anticorpo produzido em uma espécienão-humana). Esses anticorpos consistem em um tipo deanticorpo humanizado denominado como anticorpos semi-humanizados.

As regiões constantes de anticorpos anti-RAGEquiméricos e humanizados podem ser derivadas de regiõesconstantes de qualquer um dos IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, equaisquer isotipos dos mesmos (por exemplo, isotipos IgGl,IgG2, IgG3 ou IgG4 de IgG). As seqüências de aminoácidos demuitas regiões constantes de anticorpos são conhecidas. Aescolha de um isotipo humano e a modificação de aminoácidosparticulares no isotipo podem melhorar ou eliminar aativação de mecanismos de defesa hospedeiro e alterar abiodistribuição de anticorpos. Consulte (Reff et al. (2002)Câncer Control 9: 152-66). Para clonagem de seqüênciascodificadoras de regiões constantes de imunoglobulina, asseqüências intrônicas podem ser excluídas.

Os anticorpos anti-RAGE quiméricos e humanizadospodem ser construídos através do uso de técnicas padrãoconhecidas na técnica. Por exemplo, as regiões variáveispodem ser preparadas fixando-se juntamente os oligo-nucleotídeos sobrepostos que codificam as regiões variáveise os ligando em um vetor de expressão que contém uma regiãoconstante de anticorpo humano. Consulte, por exemplo, Harlow& Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, EUAe as Patentes U.S. Nos. 4.196.265; 4.946.778; 5.091.513;5.132.405; 5.260.203; 5.677.427; 5.892.019; 5.985.279;6.054.561. Os anticorpos tetravalentes (H4L4) quecompreendem dois anticorpos tetraméricos intactos, incluindohomodimeros e heterodimeros, podem ser preparados, porexemplo, conforme descrito na Publicação Internacional PCTNo. WO 02/096948. Os dimeros de anticorpos também podem serpreparados através da introdução de resíduo(s) de cistina naregião constante de anticorpo, que promove a formação deligação dissulfídica de cadeia intermediária, através do usode reticulação heterobifuncional (Wolff et al. (1993) CâncerRes. 53: 2560-5) , ou pela produção recombinante para incluiruma região constante dupla (Stevenson et al. (1989)Anticancer Drug Des. 3: 219-30). Os fragmentos de ligação deantígenos de anticorpos da invenção podem ser preparados,por exemplo, pela expressão de seqüências truncadas deanticorpos, ou por digestão de pós-tradução de anticorpos decomprimento total.

As variantes de anticorpos anti-RAGE da invençãopodem ser prontamente preparados para incluir váriasalterações, substituições, inserções e exclusões. Porexemplo, as seqüências de anticorpos podem ser otimizadaspor uso de códon no tipo de célula usada para expressão deanticorpo. Com a finalidade de aumentar a meia-vida do sorodo anticorpo, um epítopo de ligação receptor de salvamentopode ser incorporado, se ainda não estiver presente, naseqüência de cadeia pesada de anticorpo. Consulte a patenteU.S. No. 5.739.277. As modificações adicionais para aumentara estabilidade de anticorpo incluem a modificação de IgG4para substituir a serina no resíduo 241 por prolina.Consulte Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 105-108.Outras alterações úteis incluem substituições conforme anecessidade de modo a otimizar a eficiência em conjugar oanticorpo a uma droga. Por exemplo, um anticorpo pode sermodificado em sua terminação carboxila para incluiraminoácidos para fixação da droga, por exemplo, um ou maisresíduos de cistina podem ser adicionados. As regiõesconstantes podem ser modificadas de modo a introduzir sítios para ligação de carboidratos ou outras porções.

As variantes adicionais de anticorpos incluemisoformas de glicosilação que resultam em propriedadesfuncionais aprimoradas. Por exemplo, a modificação deglicosilação Fc pode resultar em funções executorasalteradas, por exemplo, ligação elevada a receptores Fcgamma e ADCC aprimorado e/ou pode reduzir a ligação Clq eCDC (por exemplo, a alteração de oligossacarídeos Fc daforma complexa no tipo alta-manose ou híbrido pode diminuira ligação Clq e CDC (consulte, por exemplo, Kanda et al.,Glycobiology, 2007:17:104-118)). A modificação pode serrealizada por bactérias, fermento, células vegetais, célulasde insetos e células de mamíferos modificadas porbioengenharia; tal modificação também pode ser realizadamanipulando-se as séries de reações químicas de glicosilaçãode proteína ou produto natural em organismos modificados porengenharia genética. A glicosilação também pode ser alteradaexplorando-se a tolerância com a qual as enzimas fixadorasde açúcar (glicosil transferases) toleram uma ampla faixa desubstratos diferentes. Finalmente, os elementos versados natécnica podem glicosilar proteínas e produtos naturaisatravés de uma variedade de abordagens químicas: compequenas moléculas, enzimas, ligação de proteína,bioengenharia metabólica, ou síntese total. Exemplos deinibidores moleculares pequenos adequados de processamentode N-glicanos incluem, Castanospermina (CS), Quifunensina(KF), Deoximanojirimicina (DMJ), Esvainsonina (Sw),Monensina (Mn).

As variantes de anticorpos anti-RAGE da invençãopodem ser produzidas utilizando-se técnicas recombinantespadrão, incluindo mutagênese sítio-dirigida, ou clonagem porrecombinação. Um repertório diversificado de anticorposanti-RAGE pode ser preparado através de métodos dedisposição de genes e conversão de genes em animais não-humanos transgênicos (Publicação de Patente U.S. No.2003/0017534), que são, então, testados por atividadesrelevantes que usam ensaios funcionais. Em modalidadesparticulares da invenção, as variantes são obtidas atravésdo uso de um protocolo de maturação por afinidade para CDRsmutadas (Yang et al. (1995) J. Mol. Biol. 254: 392-403),embaralhamento de cadeia (Marks et al. (1992) Biotechnology(NY) 10: 779-783), uso de cepas causadores de mutação de E.coli (Low et al. (1996) J. Mol. Biol. 260: 359-368),embaralhamento de DNA (Patten et al. (1997) Curr. Opin.Biotechnol. 8: 724-733), exibição de fagos (Thompson et al.(1996) J. Mol. Biol. 256: 77-88), e PCR sexual (Crameri etal. (1998) Nature 391: 288-291). Para aplicaçõesimunoterápicas, os ensaios funcionais relevantes incluemligação especifica ao antigeno RAGE humano, introversão deanticorpos, e direcionamento a um local(is) de tumor quandoadministrados a um animal portador de tumor, conformedescrito mais adiante.

A presente invenção proporciona, ainda, células elinhagens celulares que expressam os anticorpos anti-RAGE dainvenção. As células hospedeiras representativas incluemcélulas de mamíferos ou humanas, como células CHO, célulasHEK-293, células HeLa, células CV-I e células COS. Métodospara gerar uma linhagem celular estável seguindo atransformação de uma construção heteróloga em uma célulahospedeira são conhecidos na técnica. As células hospedeirasrepresentativas de não-mamíferos incluem células de insetos(Potter et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3):103-112).

Os anticorpos também podem ser . produzidos em animaistransgênicos (Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol.13(6):625-629) e vegetais transgênicos (Schillberg et al.(2003) Cell Mol. Life Sei. 60(3) :433-45).

Conforme discutido anteriormente, os anticorposmonoclonais, quiméricos e humanizados que foram modificados,por exemplo, por exclusão, adição ou substituição de outrasporções do anticorpo, por exemplo, a região constante,também estão inclusos no escopo da invenção. Por exemplo, umanticorpo pode ser modificado da seguinte forma: (i)excluindo-se a região constante; (ii) substituindo-se aregião constante por outra região constante, por exemplo,uma região constante destina-se a aumentar a meia-vida,estabilidade ou afinidade do anticorpo, ou uma regiãoconstante de outra espécie ou classe de anticorpo; ou (iii)modificando-se um ou mais aminoácidos na região constantepara alterar, por exemplo, o número de sítios deglicosilação, função de célula executora, ligação doreceptor Fc (FcR), fixação complementar, entre outros.

Os métodos para alternar uma região constante deanticorpos são conhecidos na técnica. Os anticorpos comfunção alterada, por exemplo, afinidade alterada para umligante executor, como FcR em uma célula, ou o componente Clde complemento pode ser produzido substituindo-se ao menosum resíduo de aminoácido na porção constante do anticorpopor um resíduo diferente (consulte, por exemplo, EP 388.151Al, US 5.624.821 e US 5.648.260, sendo que os conteúdosdestes estão aqui incorporados a título de referência). Otipo semelhante de alterações poderia ser descrito seaplicado aos murídeos, ou imunoglobulina de outras espéciesreduzida ou eliminaria essas funções.

Por exemplo, é possível alterar a afinidade de umaregião Fc de um anticorpo (por exemplo, uma IgG, como umaIgG humana) para um FcR (por exemplo, Fcy.RI), ou paraligação Clq substituindo-se o(s) resíduo(s) específico(s)por resíduo(s) tendo uma funcionalidade apropriada em suacadeia lateral, ou introduzindo-se um grupo funcionalcarregado, como glutamato ou aspartato, ou, talvez, umresíduo não-polar aromático, como fenilalanina, tirosina,triptofano ou alanina (consulte, por exemplo, US 5.624.821).O anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo podeser conjugado a uma citotoxina, um agente terapêutico, ou umion de metal radioativo. Em uma modalidade, a proteína que éconjugada consiste em um anticorpo ou fragmento do mesmo. Umagente de citotoxina ou citotóxico inclui qualquer agenteque seja prejudicial às células. Exemplos não-limitadoresincluem, caliqueamicina, taxol, citocalasina B, gramicidinaD, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida,tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina,doxorubicina, daunorubicina, diidróxi antracina diona,mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D,1-diidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína,lidocaína, propranolol, puromicina, e análogos, ou homólogosdos mesmos. Os agentes terapêuticos incluem, mas não selimitam a, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, β-tioguanina, citarabina, e 5-fluorouracildecarbazina), agente de alquilação (por exemplo,mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalano, carmustina(BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfano,dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina de platina (II) (DDP), cisplatina) ,antraciclinas (por exemplo, daunorubicina e doxorubicina) ,antibióticos (por exemplo, dactinomicina, bleomicina,mitramicina e antramicina), e agentes antimitóticos (porexemplo, vincristina e vinblastina). As técnicas paraconjugar tais porções em proteínas são bem conhecidas natécnica.Alternativamente, agora é possível produzir animaistransgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes,mediante imunização, de produzir um repertório completo deanticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinaendógena. Por exemplo, foi descrito que a exclusão homogêneados genes da região de união de cadeia pesada de anticorpos(JM) em camundongos mutantes quiméricos e linha germinativaresulta na inibição completa da produção de anticorposendógenos.

A transferência da disposição de genes deimunoglobulina de linha germinativa humana em taiscamundongos mutantes de linha germinativa resulta naprodução de anticorpos humanos mediante desafio comantígenos. Consulte, por exemplo, Jackobovits et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al.,Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year inImmune, 7:33 (1983); e Duchosal et al. Nature 355:258(1992). Os anticorpos humanos também podem ser derivados debibliotecas de exibição de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol.Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)).

Em certas modalidades, os anticorpos da presenteinvenção podem ser administrados em combinação com outrosagentes como parte de uma terapia combinatória. Por exemplo,no caso de condições inflamatórias, os anticorpos sujeitospodem ser administrados em combinação com um ou mais outrosagentes úteis no tratamento de doenças ou condiçõesinflamatórias. No caso de condições de doença cardiovascular,e, particularmente, as que surgem a partir de placasarterioscleróticas, que se imaginam ter um componenteinflamatório substancial, os anticorpos sujeitos podem seradministrados em combinação com um ou mais outros agentesúteis no tratamento de doenças cardiovasculares. No caso decâncer, os anticorpos sujeitos podem ser administrados emcombinação com um ou mais fatores anti-angiogênicos,quimioterapias, ou como um adjuvante à radioterapia. Prevê-se, ainda, que a administração dos anticorpos sujeitosservirá como parte de um regime de tratamento de câncer quepode combinar muitos agentes terapêuticos de câncerdiferentes. No caso de IBD, os anticorpos sujeitos podem seradministrados com um ou mais agentes antiinflamatórios, e,podem adicionalmente ser combinados com um regime dietético modificado.

Métodos para Inibir a Interação Entre RAGE-LBE e o RAGE-BP

A invenção inclui métodos para inibir a interaçãoentre RAGE e RAGE-BP, ou para modular a atividade de RAGE.De preferência, tais métodos são usados para tratartranstornos associados ao RAGE.

Tais métodos podem compreender administrar umanticorpo elevado para RAGE como descrito aqui. Tais métodoscompreendem administrar um anticorpo que se liga especifica-mente a um ou mais epitopos de uma proteína RAGE que possuiuma seqüência de aminoácido conforme apresentada na SEQ IDNO: 1, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:9, SEQ ID NOrll,ou SEQ ID NO:13. Ainda em outra modalidade, tais métodoscompreendem administrar um composto que inibe a ligação deRAGE a um ou mais RAGE-BPs. Os métodos exemplif icativos paraa identificação de tais compostos são discutidos abaixo.

Em certas modalidades, a interação é inibida invitro, tal como, em uma mistura de reação que compreendeproteínas purificadas, células, amostras biológicas,tecidos, tecidos artificiais, etc. Em certas modalidades, ainteração é inibida in vivo, por exemplo, ao administrar umanticorpo que se liga ao RAGE ou um fragmento de ligação aoRAGE desse. 0 anticorpo ou fragmento desse se liga ao RAGE einibe a ligação de um RAGE-BP.

A invenção inclui métodos para prevenir ou tratarum transtorno relacionado ao RAGE ao inibir a interaçãoentre RAGE e RAGE-BP, ou modular a atividade de RAGE. Taismétodos incluem administrar um anticorpo no RAGE em umaquantidade eficaz para inibir a interação e durante um temposuficiente prevenir ou tratar o dito transtorno.

Ácidos Nucléicos

Os ácidos nucléicos são desoxiribonucleotídeos ouribonucleotideos e polímeros desses em forma de cadeiasimples, cadeia dupla, ou cadeia tripla. Exceto ondeespecificamente limitado, os ácidos nucléicos podem conteranálogos conhecidos de nucleotídeos naturais que possuempropriedades similares às do ácido nucléico natural dereferência. Os ácidos nucléicos incluem genes, cDNAs, mRNAs,e cRNAs. Os ácidos nucléicos podem ser sintetizados, oupodem ser derivados de qualquer fonte biológica, que incluiqualquer organismo.Os ácidos nucléicos representativos da invençãocompreendem uma seqüência de nucleotideo codificadora RAGEmostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, quecorrespondem aos cDNAs mostrados que codificam RAGE embabuinos, macacos-caranquejeiros, e coelhos, ou mostrada naSEQ ID NO: 15, que corresponde a uma seqüência de DNAgenômico que codifica RAGE em babuinos. Os ácidos nucléicosda invenção também compreendem uma seqüência de nucleotideoque codifica qualquer seqüência de aminoácido de regiãovariável de anticorpo mostrada na SEQ ID NOs: .16 a 49.

Os ácidos nucléicos da invenção também compreendemuma seqüência de nucleotideo que é substancialmente idênticaa quaisquer SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, e 15, inclusive asseqüências de nucleotideo que são ao menos 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, ou 99,9% idênticasa quaisquer SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, e 15.

Os ácidos nucléicos da invenção também podemcompreender uma seqüência de nucleotideo que codifica umaproteína RAGE possuindo uma seqüência de aminoácido que ésubstancialmente idêntica a quaisquer seqüências deaminoácido mostradas na SEQ ID NOs: 7, 9, 11, e 13,inclusive as seqüências de nucleotideo que são ao menos 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, ou 99,9%idênticas a quaisquer SEQ ID NOs: 7, 9, 11, e 13.

Os ácidos nucléicos da invenção também podemcompreender uma seqüência de nucleotideo que codifica umaregião variável de anticorpo anti-RAGE que possui umaseqüência de aminoácido que é substancialmente idêntica aqualquer uma das seqüências de aminoácido mostradas na SEQID NOs: 16 a 49, inclusive uma seqüência de nucleotideo quecodifica uma seqüência de aminoácido que é ao menos 85%,86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, 99%, 99,5%, ou 99,9% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 49.

As seqüências são comparadas para correspondênciamáxima utilizando um algoritmo de comparação de seqüênciaque utiliza a seqüência de codificação de região variável decomprimento total de qualquer uma das SEQ ID NOs: 16 a 49,uma seqüência de nucleotideo que codifica uma regiãovariável de comprimento total que possui qualquer uma dasseqüências mostradas na SEQ ID N2: 16 a 49 como a seqüênciade busca, como descrito abaixo no presente documento, ou por inspeção visual.

As seqüências substancialmente idênticas podem serseqüências polimórficas, ou seja, seqüências alternativas oualelos em uma população. Uma diferença alélica pode ser dotamanho de um par de bases. As seqüências substancialmenteidênticas também podem compreender seqüências mutagenizadas,inclusive seqüências que compreendem mutações silenciosas.Uma mutação pode compreender uma ou mais alterações deresíduo, a deleção de um ou mais resíduos, ou a inserção deum ou mais resíduos adicionais.

Os ácidos nucléicos substancialmente idênticostambém são identificados como ácidos nucléicos que sehibridizam especificamente ou se hibridizam substancialmenteno comprimento total de qualquer SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12,ou 15, ou no comprimento total de qualquer seqüência denucleotideo que codifica uma seqüência de aminoácido RAGEmostrada na SEQ ID NOs: 7, 9, 11 e 13, ou que codifica umaseqüência de aminoácido de região variável de anticorpomostrada na SEQ ID Nos: 16 a 49, sob condições severas. Nocontexto de hibridização de ácido nucléico, duas seqüênciasde ácido nucléico que são comparadas podem ser designadasuma sonda e um alvo. Uma sonda é uma molécula de ácidonucléico de referência, e um alvo é uma molécula de ácidonucléico de teste, geralmente encontrada dentro de umapopulação heterogênea de moléculas de ácido nucléico. Umaseqüência alvo é idêntica a uma seqüência de teste.

Para estudos de hibridização, as sondas úteis sãocomplementares ou imitam ao menos 14 a 40 seqüências denucleotideo de uma molécula de ácido nucléico da presenteinvenção. De preferência, as sondas compreendem 14 a 20nucleotideos, ou ainda mais, se desejado, tal como, 30, 40,50, 60, 100, 200, 300, ou 500 nucleotideos ou até ocomprimento total de qualquer uma das SEQ ID NOs: 6, 8, 10,12, ou 15, ou o comprimento total de qualquer seqüência denucleotideo que codifica uma seqüência de aminoácido RAGEmostrada na SEQ ID NOs: 7, 9, 11 e 13, ou que codifica umaseqüência de aminoácido de região variável de anticorpomostrada na SEQ ID NOs: 16 a 49. Tais fragmentos podem serfacilmente preparados, por exemplo, por síntese química dofragmento, mediante a aplicação da tecnologia deamplificação de ácido nucléico, ou mediante a introdução deseqüências selecionadas em vetores recombinantes paraprodução recombinante.

A hibridização especifica se refere à ligação,duplexação ou hibridização de uma molécula apenas em umaseqüência de nucleotideo particular sob condições severasquando aquela seqüência estiver presente em uma mistura deácido nucléico complexa (por exemplo, DNA ou RNA celulartotal). A hibridização especifica pode conciliardisparidades entre a sonda e a seqüência alvo dependendo daseveridade das condições de hibridização.

As condições de hibridização severas e condiçõesde lavagem e hibridização severas no contexto deexperimentos de hibridização de ácido nucléico, tais como,análise Southern e Northern blot, são dependentes tanto daseqüência como do ambiente. As seqüências mais longas sehibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Umguia abrangente para a hibridização de ácidos nucléicos éencontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes, parte I capitulo 2, Elsevier, New York,New York. Geralmente, as condições de lavagem e hibridizaçãoaltamente severas são selecionadas para serem cerca de 5°Cabaixo do ponto de fusão térmica (Tm) para a seqüênciaespecifica em uma resistência iônica e pH definidos.Tipicamente, sob condições severas uma sonda irá sehibridizar especificamente em sua subseqüência alvo, porémnão em outras seqüências.O Tm é a temperatura (sob resistência iônica e pHdefinidos) na qual 50% da seqüência alvo se hibridiza em umasonda perfeitamente compatível. As condições muito severassão selecionadas para serem iguais ao Tm de uma sondaparticular. Um exemplo de condições de hibridização severaspara análise Southern ou Northern Blot de ácidos nucléicoscomplementares que possuem mais de cerca de 100 resíduoscomplementares é a hibridização noturna em 50% de formamidacom 1 mg de heparina a 42 °C. Um exemplo de condições delavagem altamente severas é 15 minutos em 0,1X SSC a 65°C.

Um exemplo de condições de lavagem severas é 15 minutos emtampão 0,2X SSC a 65°C. Veja Sambrook et al., eds (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, para umadescrição de tampão SSC. Geralmente, a lavagem de altaseveridade é precedida por uma lavagem de baixa severidadepara remover o sinal da sonda de fundo. Um exemplo decondições de lavagem de severidade média para um dúplex demais de cerca de 100 nucleotídeos, é 15 minutos em IX SSC a45°C. Um exemplo de lavagem de baixa severidade de um dúplexde mais de cerca de 100 nucleotídeos, é 15 minutos em 4X SSCa 6X a 40°C. Para sondas curtas (por exemplo, cerca de 10 a50 nucleotídeos), as condições severas envolvem tipicamenteconcentrações de sal menores que cerca de IM de íon Na+,tipicamente, cerca de 0,01 a IM de concentrações de íon Na+(ou outros sais) em pH de 7,0 a 8,3, e a temperatura étipicamente ao menos cerca de 30°C. As condições severastambém podem ser obtidas com a adição de agentesdesestabilizantes, tal como, formamida. Em geral, uma razãode sinal para ruído de 2 vezes (ou mais) aquela observada emuma sonda não-relacionada na análise de hibridizaçãoparticular indica a detecção de uma hibridização específica.

A seguinte descrição são exemplos de condições dehibridização e lavagem que podem ser usadas para identificaras seqüências de nucleotídeo que são substancialmenteidênticas às seqüências de nucleotídeo de referência dapresente invenção: uma seqüência de nucleotídeo de sonda sehibridiza, de preferência, em uma seqüência de nucleotídeoalvo em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5M de NaPO4,ImM de EDTA a 50°C seguido por lavagem em 2X SSC, 0,1% deSDS a 50°C; com mais preferência, uma seqüência de sonda ealvo se hibridiza em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS) ,0, 5M de NaPO4, ImM de EDTA a 50°C seguido por lavagem em IXSSC, 0,1% de SDS a 50°C; com mais preferência, uma seqüênciade sonda e alvo se hibridiza em 7% de dodecil sulfato desódio (SDS) , 0, 5M de NaPO4, ImM de EDTA a 50°C seguido porlavagem em 0,5X SSC, 0,1% de SDS a 50°C; com maispreferência, uma seqüência de sonda e alvo se hibridiza em7% de dodecil sulfato de sódio (SDS) , 0,5M de NaPO4, ImM deEDTA a 50°C seguido por lavagem em 0,1X SSC, 0,1% de SDS a50°C; com mais preferência, uma seqüência de sonda e alvo sehibridiza em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS) , 0,5M deNaPO4, ImM de EDTA a 50°C seguido por lavagem em 0,1X SSC,0,1% de SDS a 65°C.

Uma indicação adicional para que duas seqüênciasde ácido nucléico sejam substancialmente idênticas é que asproteínas codificadas pelos ácidos nucléicos sãosubstancialmente idênticas, compartilham uma estruturatridimensional total, ou são equivalentes biologicamentefuncionais. Esses termos são adicionalmente definidos abaixono presente documento. As moléculas de ácido nucléico quenão se hibridizam uma com a outra sob condições severasainda são substancialmente idênticas se as proteínascorrespondentes forem substancialmente idênticas. Isso podeocorrer, por exemplo, quando duas seqüências de nucleotídeocompreendem variantes moderadamente substituídas comopermitido pelo código genético.

As variantes moderadamente substituídas sãoseqüências de ácido nucléico que possuem substituições decódon degenerado quando a terceira posição de um ou maiscódons selecionados (ou todas) for substituída por resíduosde base misturada e/ou desoxiinosina. Veja, Batzer et al.(1991) Nucleic Acids Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J.Biol. Chem. 260:2605-2608; and Rossolini et al. (1994) Mol.Cell Probes 8:91-98.

Os ácidos nucléicos da invenção também compreendemácidos nucléicos complementares a qualquer uma das SEQ IDNOs: 6, 8, 10, 12, ou 15, ou as seqüências de nucleotídeoque codificam uma seqüência de aminoácido RAGE mostrada naSEQ ID NOs: 7, 9, 11 e 13, ou que codificam uma seqüência deaminoácido de região variável de anticorpo mostrada na SEQID NOs: 16 a 49, e seqüências complementares desses. Asseqüências complementares são duas seqüências de nucleotídeoque compreendem seqüências de nucleotídeo antiparalelascapazes de emparelhamento umas com as outras mediante aformação de ligações de hidrogênio entre pares de bases.Como usado aqui, o termo seqüências complementares significaseqüências de nucleotideo que são substancialmentecomplementares, como pode ser avaliado pelos mesmos métodosde comparação de nucleotideo descritos abaixo, ou é definidocomo capaz de se hibridizar no segmento de ácido nucléico emquestão sob condições relativamente severas, tais como,aquelas descritas aqui. Um exemplo particular de um segmentode ácido nucléico complementar é um oligonucleotideo anti-senso.

Uma subseqüência é uma seqüência de ácidosnucléicos que compreende uma parte de uma seqüência de ácidonucléico mais longa. Uma subseqüência exemplificativa é umasonda, descrita acima no presente documento, ou uminiciador. 0 termo iniciador, como usado aqui, se refere auma seqüência contígua que compreende cerca de 8 ou maisdesoxiribonucleotídeos ou ribonucleotideos, de preferência,10 a 20 nucleotídeos, e com mais preferência, 20 a 30nucleotídeos de uma molécula de ácido nucléico selecionada.Os iniciadores da invenção incluem oligonucleotídeos decomprimento suficiente e seqüência apropriada paraproporcionar o início da polimerização sobre uma molécula deácido nucléico da presente invenção.

Uma seqüência alongada compreende nucleotídeosadicionais (ou outras moléculas análogas) incorporados noácido nucléico. Por exemplo, a polimerase (por exemplo, umaDNA polimerase) pode adicionar seqüências na terminação 3'da molécula de ácido nucléico. Ademais, a seqüência denucleotideo pode ser combinada com outras seqüências de DNA,tais como, promotores, regiões promotoras, intensificadores,sinais de poliadenilação, seqüências intrônicas, sítios deenzima de restrição adicionais, múltiplos sítios declonagem, e outros segmentos de codificação. Dessa maneira,a invenção também proporciona vetores que compreendem osácidos nucléicos descritos, inclusive vetores para expressãorecombinante, onde um ácido nucléico da invenção éoperativamente ligado a um promotor funcional. Quandooperativamente ligado a um ácido nucléico, um promotor estáem combinação funcional com o ácido nucléico de modo que atranscrição do ácido nucléico seja controlada e reguladapela região promotora. Os vetores se referem a ácidosnucléicos capazes de replicação em uma célula hospedeira,tal como, plasmídeos, cosmídeos e vetores virais.

Os ácidos nucléicos da presente invenção podem serclonados, sintetizados, alterados, mutagenizados, oucombinações desses. As técnicas de clonagem molecular e DNArecombinante padrão usadas para isolar os ácidos nucléicossão conhecidas. A mutagênese sítio-específica para criaralterações, deleções, ou pequenas inserções de pares debases também é conhecida na técnica. Veja, por exemplo,Sambrook et al. (eds.) (1989) Molecular Cloning: ALaboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York; Silhavy et al. (1984) Experimentswith Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York; Glover & Hames (1995) DNA Cloning:A Practical Approach, 2nd ed. IRL Press at Oxford UniversityPress, Oxford/New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocolsin Molecular Biology, 3rd ed. Wiley, New York.

Métodos de Tratamento

A invenção refere-se e incluir métodos para tratartranstornos relacionados com RAGE ou associados com RAGE. Ostranstornos relacionados com RAGE podem ser caracterizadosgeralmente incluindo qualquer transtorno em que uma célulaafetada exibe expressão elevada de RAGE ou um ou maisligantes de RAGE. Os transtornos relacionados com RAGEtambém podem ser caracterizados como qualquer transtorno queé tratável (ou seja, um ou mais sintomas podem sereliminados ou melhorados) por uma redução na função de RAGE.Por exemplo, a função de RAGE pode ser reduzida pelaadministração de um agente que interrompe a interação entreRAGE e RAGE-BP, tal como, um anticorpo com RAGE.

A expressão aumentada de RAGE está associada comdiversas condições patológicas, tais como, vasculopatia,nefropatia, retinopatia, neuropatia diabética, e outrostranstornos, inclusive, reações imunes/inflamatórias dasparedes de vasos sangüíneos e sepse. Os ligantes de RAGE sãoproduzidos no tecido afetado com muitos distúrbiosinflamatórios, inclusive artrite (tal como, artritereumatóide). Em tecidos diabéticos, acredita-se que aprodução de RAGE seja causada pela superprodução de produtosfinais de glicação avançada. Isso resulta em estresseoxidativo e disfunção celular endotelial que resulta emdoença vascular em diabéticos.A invenção inclui um método para tratar inflamaçãoe doenças e condições caracterizadas pela ativação dacascata de citocina inflamatória em um indivíduo, quecompreende administrar uma quantidade eficaz de um anticorpoanti-RAGE ou um fragmento de ligação a RAGE desse e/ou umacomposição (por exemplo, composição farmacêutica) quecompreende um anticorpo anti-RAGE ou um fragmento de ligaçãoa RAGE desse. Por exemplo, S100/calgranulinas forammostradas compreendendo uma família de polipeptídeos deligação de cálcio estreitamente relacionados caracterizadapor duas regiões EF-hand ligadas por um peptídeo de conexão(por exemplo, veja Schafer et al., 1996, TIBS, 21:134-140;Zimmer et al., 1995, Brain Res. Bull., 37:417-429; Rammes etal., 1997, J. Biol. Chem., 272:94 96-9502; Lugering etal.,1995, Eur. J. Clin. Invest., 25:659-664). Embora essessejam desprovidos de peptídeos-sinal, sabe-se que asS100/calgranulinas obtêm acesso ao espaço extracelular,especialmente em sítios de respostas imunes/inflamatóriascrônicas, como em fibrose cística e artrite reumatóide. RAGEé um receptor para diversos elementos da famíliaS100/calgranulina, que media seus efeitos pró-inflamatóriossobre as células, tais como, linfócitos e fagócitosmononucleares. Também, estudos sobre a resposta dehipersensibilidade tipo atrasada, colite em camundongos nulosIL-10, artrite induzida por colágeno e modelos de encefaliteauto-imune experimentais sugerem que a interação de ligante-RAGE (aparentemente com S-100/calgranulinas) possui umafunção proximal na cascata inflamatória. Uma condiçãoinflamatória que é adequada para os métodos de tratamentodescritos aqui pode ser uma em que a cascata de citocinainflamatória é ativada.

A cascata de citocina inflamatória pode causar umareação sistêmica, como ocorre com choque séptico. Osanticorpos anti-RAGE e fragmentos de ligação a RAGE dessesda invenção podem ser usados para tratar sepse, choqueséptico e listeriose sistêmica. A sepse é uma respostainflamatória sistêmica à infecção, e está associada com umadisfunção de órgão, hipoperfusão ou hipotensão. Em choqueséptico, uma forma grave de sepse, a hipotensão é induzidaapesar de ressuscitação de fluidos adequada. A listeriose éuma infecção grave causada por ingerir alimentoscontaminados a bactéria Listeria monocytogenes. 0 RAGE foimostrado para mediar os efeitos letais do choque séptico(Liliensek et al., 2004, 113:11641-50). A sepse possui umafisiologia complexa, definida por inflamação sistêmica edisfunção de órgão, inclusive anormalidades na temperaturacorporal; parâmetros cardiovasculares e contagem deleucócitos; enzimas do fígado elevadas e função cerebralalterada. A resposta em sepse é a uma infecção ou estimuloque aumentou e se desregulou.O modelo CLP murídeo de sepseresulta em uma infecção polimicrobiana, com abscessoabdominal e bacteremia, e cria novamente as faseshemodinâmicas e metabólicas observadas em doenças humanas.Os resultados experimentais obtidos com o modelo CLP murídeode sepse descritos aqui mostram que o RAGE exerce uma funçãoimportante na patogênese de sepse. Os dados também mostramque a administração de um anticorpo anti-RAGE que se ligaespecificamente ao RAGE no momento da cirurgia, bem como até36 horas após a cirurgia, fornece proteção terapêuticasignificativa aos camundongos, como provado pelos índices desobrevivência aumentados e de patologia aprimorados. Osanticorpos usados para o tratamento de sepse, listeriose, eoutras doenças relacionadas ao RAGE podem ser anticorpos quese ligam ao domínio V de RAGE e impedem que um ligante RAGEou parceiro de ligação se ligue à proteína RAGE.

A condição inflamatória que é tratada ou prevenidapelos anticorpos e métodos da invenção pode ser mediada poruma cascata de citocina inflamatória localizada, como emartrite reumatóide. Exemplos não-limitadores de condiçõesinflamatórias que podem ser tratadas de forma proveitosautilizando anticorpos anti-RAGE e fragmentos de ligação aoRAGE desses e/ou as composições da presente invençãoincluem, por exemplo, doenças que envolvem o tratogastrintestinal e tecidos associados (tais como, íleo,apendicite, úlceras pépticas, gástricas e duodenais,peritonite, pancreatite, colite ulcerativa, pseudomembranosa,aguda e isquêmica, diverticulite, epiglotite, acalasia,colangite, colecistite, doença celíaca, hepatite, doença deCrohn, enterite e doença de Whipple); doenças e condiçõesinflamatórias sistêmicas ou locais (tais como, asma,alergia, choque anafilático, doença do complexo imune,isquemia do órgão, lesão de reperfusão, necrose do órgão,febre do feno, sepse, septicemia, choque endotóxico,caquexia, hiperpirexia, granuloma eosinofílico, granulomatose,e sarcoidose); doenças que envolvem o sistema urogenital etecidos associados (tais como, aborto séptico, epididimite,vaginite, prostatite, e uretrite); doenças que envolvem osistema respiratório e tecidos associados (tais como,bronquite, enfisema, rinite, fibrose cística, pneumonite,sindrome da angústia respiratória aguda do adulto,pneumoultramicroscopicossilicovulcanoconiose, alvealite,bronquiolite, faringite, pleurisia, e sinusite); doenças quesurgem de infecção por vários virus (tais como, gripe, vírussincicial respiratório, HIV, vírus da hepatite B, vírus dahepatite C e herpes), bactérias (tais como, bacteremiadisseminada, dengue), fungos (tal como, candidíase) eparasitas protozoários e multicelulares (tais como, malária,filaríase, amebíase, e cistos hidáticos) ; doençasdermatológicas e condições da pele (tais como, queimaduras,dermatite, dermatomiosite, queimaduras do sol, urticária evergões); doenças que envolvem o sistema cardiovascular etecidos associados (tais como, estenose, restenose,vasulite, angiite, endocardite, arterite, aterosclerose,tromboflebite, pericardite, insuficiência cardíaca congestiva,miocardite, isquemia do miocárdio, periarterite nodosa, efebre reumática); doenças que envolvem o sistema nervosocentral ou periférico e tecidos associados (tais como,meningite, encefalite, esclerose múltipla, infarto cerebral,embolia cerebral, sindrome de Guillame-Barre, neurite,neuralgia, lesão da medula espinhal, paralisia, e uveíte) ;doenças dos ossos, articulações, músculos e tecidosconectivos (tais como, as várias artrites e artralgias,osteomielite, fasciite, doença de Paget, gota, doençaperiodontal, artrite reumatóide, e sinovite) ; outrostranstornos auto-imunes e inflamatórios (tais como,miastenia grave, trioidite, lúpus eritematoso sistêmico,sindrome de Goodpasture, sindrome de Behcets, rejeição aoaloenxerto, doença enxerto-versus-hospedeiro, diabetes TipoI, espondilite anquilosante, doença de Berger, e sindrome deRetier); bem como vários cânceres, tumores e transtornosproliferativos (tal como, doença de Hodgkins); e, emqualquer caso, a resposta inflamatória ou imune do hospedeiro Aqualquer doença primária.

Os anticorpos anti-RAGE e fragmentos de ligação aoRAGE desses da invenção podem ser usados para tratar câncer.As células tumorais revelam uma expressão aumentada de umligante RAGE, particularmente, anfoterina, uma proteína deligação de DNA cromossomal não-histona grupo I de altamobilidade (Rauvala et al., J. Biol. Chem., 262:16625-16635(1987); Parkikinen et al., J. Biol. Chem., 268:19726-19738(1993)) que foi mostrada para interagir com RAGE. Aanfoterina promove o crescimento de neurito, bem como servecomo uma superfície para montagem de complexos protease nosistema fibrinolítico (também conhecidos por contribuírempara a mobilidade celular), indicando que os cânceres tambémsão um distúrbio relacionado ao RAGE. Os efeitos oxidativose outros aspectos de inflamação crônica também possuem umefeito de contribuição para a origem de certos tumores. Porexemplo, além disso, um efeito inibidor de crescimento detumor local para bloqueio de RAGE foi observado em um modelode tumor primário (glioma C6), o modelo de metástasepulmonar de Lewis (Taguchi et al., 2000, Nature 405:354-360), e papilomas que surgem espontaneamente em camundongosque expressam a transgene v-Ha-ras (Leder et al. , 1990,Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9178-9182).

Os anticorpos ou fragmentos de ligação desses dainvenção podem ser usados para tratar ou prevenir diabetes,complicações de diabetes, e condições patológicas associadascom diabetes. Foi mostrado que a glicoxidação não-enzimáticade macromoléculas que resulta basicamente na formação deprodutos finais de glicação avançada (AGEs) é aumentada emsitios de inflamação, em insuficiência renal, na presença dehiperglicemia e outras condições associadas com estresseoxidante sistêmico ou local (Dyer et al., J. Clin. Invest.,91:2463-2469 (1993); Reddy et al. , Biochem., 34:10872-10878(1995); Dyer et al., J. Biol. Chem., 266:11654-11660 (1991);Degenhardt et al., Cell Mol. Biol., 44:1139-1145 (1998)). 0acúmulo de AGEs na vasculatura pode ocorrer em foco, como naamilóide articular composta de AGE-p2-microglobulinaencontrada em pacientes com amiloidose relacionada à diálise(Miyata et al., J. Clin. Invest., 92:1243-1252 (1993);Miyata et al., J. Clin. Invest., 98:1088-1094 (1996)), ougeralmente, como exemplificado pela vasculatura e tecidos depacientes com diabetes (Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995)). O acúmulo progressivo de AGEs ao longo dotempo em pacientes com diabetes sugere que os mecanismos dedepuração endógena não são capazes de funcionar de formaeficaz em sitios de depósito de AGE. Tais AGEs acumuladospossuem a capacidade de alterar as propriedades celularespor meio.de inúmeros mecanismos. Embora o RAGE seja expressoem baixos níveis em tecidos e vasculatura normais, em umambiente onde os ligantes do receptor se acumulam, foimostrado que o RAGE se tornou supra-regulado (Li et al. , J.Biol. Chem., 272:16498-16506 (1997); Li et al., J. BiolChem., 273:30870-30878 (1998); Tanaka et al., J. Biol.Chem., 275:25781-25790(2000)). A expressão de RAGE éaumentada no endotélio, células do tecido liso e fagócitosmononucleares de infiltração em vasculatura do diabético.Também, estudos em cultura celular demonstraram que ainteração de AGE-RAGE causou alterações em propriedadescelulares importantes em homeostase vascular.

Os anticorpos anti-RAGE ou fragmentos de ligaçãodesses também podem ser usados para tratar disfunção erétil.A ativação de RAGE produz oxidantes através de uma enzimatipo NADH oxidase, portanto, suprimir a circulação de óxidonítrico, que é o estimulador principal de relaxamento domúsculo liso cavernoso que resulta em ereção peniana. Aoinibir a ativação de vias de sinalização de RAGE, a geraçãode oxidantes é atenuada.

Os anticorpos ou fragmentos de ligação desses dainvenção podem ser usados para tratar ou preveniraterosclerose. Foi mostrado que a incidência de doençacardíaca isquêmica é particularmente alta em pacientes comdiabetes (Robertson, et al., Lab Invest, 18:538-551 (1968);Kannel et al., J. Am. Med. Assoc., 241:2035-2038 (1979);Kannel et al., Diab. Care, 2:120-126 (1979)). Ademais,estudos mostraram que a aterosclerose em pacientes comdiabetes é mais acelerada e extensa do que em pacientes quenão sofrem de diabetes (veja, por exemplo, Waller et at.,Am. J Med. 69:498-506 (1980); Crall et. al., Am. J. Med.64:221-230 (1978); Hamby et. al., Chest. 2:251-257 (1976); ePyorala et al., Diaib. Metab. Rev., 3:463-524 (1987)).Embora as razões da aterosclerose acelerada no ambiente dadiabetes sejam muitas, foi mostrado que a redução de AGEspode reduzir a formação de placa.

Consequentemente, a lista de transtornosrelacionados ao RAGE que podem ser tratados ou prevenidoscom a composição inventiva inclui: doenças inflamatóriasagudas (tal como, sepse), choque (por exemplo, choqueséptico, choque hemorrágico), doenças inflamatórias crônicas(tais como, artrite reumatóide e psoriatica, osteoartrite,colite ulcerativa, doença do intestino irritável, esclerosemúltipla, psoriase, lúpus, nefrite por lúpus sistêmico, enefrito por lúpus inflamatória, e outras doenças auto-imunes), doenças cardiovasculares (por exemplo,aterosclerose, acidente vascular cerebral, distúrbioplaquetário frágil, angina e restenose), diabetes (eparticularmente, doenças cardiovasculares em diabéticos),complicações da diabetes, disfunção erétil, cânceres (porexemplo, câncer pulmonar, carcinoma celular escamoso, câncerde próstata, câncer pancreático humano, melanoma e carcinomacelular renal), vasculite e outras sindromes de vasculite,tais como, vasculite necrosante, nefropatias, retinopatias,e neuropatias.A invenção proporciona a administração deanticorpos anti-RAGE e fragmentos de ligação ao RAGE invivo. Os anticorpos em questão podem ser administrados comocomposições farmacêuticas, e também podem ser administradoscom um ou mais agentes adicionais. A administração dosanticorpos em questão pode ser parte de um regimeterapêutico para tratar uma condição particular. Ascondições que podem ser tratadas tanto pela administraçãodos anticorpos separados, como pela administração dosanticorpos, em questão, em combinação com outros agentes,incluem transtornos associados ao RAGE. A titulo de exemplo,os transtornos associados ao RAGE incluem, porém sem caráterlimitativo, artrite reumatóide, osteoartrite, doençainflamatória do intestino, aterosclerose, vasculite e outrassindromes de vasculite, tais como, vasculite necrosante,doença de Alzheimer, câncer, complicações da diabetes, taiscomo, retinopatia diabética, doenças auto-imunes, tais como,psoriase e lúpus. Os transtornos associados ao RAGE incluem,ainda, doenças inflamatórias agudas (por exemplo, sepse),doenças inflamatórias crônicas, e outras condições que sãoagravadas por inflamação (ou seja, os sintomas dessas podemser melhorados ao reduzir a inflamação).

Os métodos para administração das composições àbase de anticorpo podem ser qualquer um entre inúmerosmétodos bem conhecidos na técnica. Esses métodos incluemadministração local ou sistêmica e incluem, ainda, vias deadministração intradérmicas, intramusculares,

intraperitoniais, intravenosas, subcutâneas, orais, eintranasais, inclusive o uso de um nebulizador e inalação.

Além disso, pode ser desejado introduzir as composiçõesfarmacêuticas da invenção no sistema nervoso central pormeio de qualquer via adequada, inclusive injeçãointraventricular e intratecal. A injeção intraventricularpode ser facilitada por um cateter intraventricular, porexemplo, fixado a um reservatório, tal como, um reservatóriode Ommaya. Os métodos de introdução também podem serproporcionados por dispositivos recarregáveis oubiodegradáveis, por exemplo, depósitos. Ademais, contempla-se que a administração pode ocorrer ao cobrir umdispositivo, implante, stent, ou prótese.

Por exemplo, a cartilagem gravemente ferida porcondições das articulações, tais como, artrite reumatóide eosteoartrite pode ser substituída, completamente ou emparte, por várias próteses. Há uma variedade de materiaistransplantáveis adequados inclusive os baseados em modelosde colágeno e glicosaminoglicano (Stone et al. (1990) Clin.Orthop. Relat. Red. 252: 129), condrócitos isolados (Grandeet al. (1989) J Orthop Res 7: 208; e Taligawa et al. (1987)Bone Miner 2: 449), e condrócitos fixados a polímerosnaturais ou sintéticos (Walitani et al. (1989) J Bone JtSurg 7IB: 74; Vacanti et al. (1991) Plast Reconstr Surg 88:753; von Schroeder et al. (1991) J Biomed Mater Res 25:329;Freed et al. (1993) J Biomed Mater Res 27: 11; e Vacanti etal. Patente U.S. No. 5.041.138). Por exemplo, os condrócitospodem se desenvolver em cultura sobre arcabouços altamenteporosos biodegradáveis, bio-compatíveis formados depolímeros, tais como, ácido poliglicólico, ácido polilático,gel agarose, ou outros polímeros que se degradam ao longo dotempo como uma função de hidrólise da cadeia principal depolímero em monômeros inócuos. As matrizes são desenhadaspara permitir uma troca adequada de nutrientes e gás com ascélulas até que ocorra o enxerto. As células podem sercultivadas in vitro até o volume e densidade celularadequados que as células desenvolveram sejam implantados.Uma vantagem das matrizes é que essas podem ser fundidas oumoldadas em um formato desejado sobre uma base individual,de modo que o produto final se pareça muito com a orelha ounariz do paciente (a título de exemplo) , ou as matrizesflexíveis podem ser usadas para permitir a manipulação nomomento do implante, como em uma articulação.

Esses e outros implantes e próteses podem ser tratados eusados para administrar os anticorpos em questão oufragmentos de ligação desses. Por exemplo, uma composiçãoque inclui o anticorpo ou fragmento de ligação pode seraplicada ou revestida sobre o implante ou prótese. Dessamaneira, os anticorpos ou fragmentos desses podem serdiretamente administrados no tecido afetado (por exemplo, na articulação lesionada).

Os anticorpos em questão podem ser administradoscomo parte de uma terapia combinatória com outros agentes. Aterapia de combinação se refere a qualquer forma deadministração em combinação com dois ou mais compostosterapêuticos diferentes de modo que o segundo composto sejaadministrado enquanto o composto terapêutico anteriormenteadministrado ainda é eficaz no corpo (por exemplo, os doiscompostos são simultaneamente eficazes no paciente, podendoincluir efeitos sinérgicos dos dois compostos). Por exemplo,os compostos terapêuticos diferentes podem ser administradosna mesma formulação ou em uma formulação separada, tanto deforma concomitante como seqüencial. Assim, um indivíduo querecebe tal tratamento pode possuir um efeito combinado(associado) de compostos terapêuticos diferentes.

Por exemplo, no caso de condições inflamatórias,os anticorpos em questão podem ser administrados emcombinação com um ou mais outros agentes úteis no tratamentode doenças ou condições inflamatórias. Os agentes úteis notratamento de doenças ou condições inflamatórias incluem,porém sem caráter limitativo, agentes antiinflamatórios, ouantiflogísticos. Os antiflogísticos incluem, por exemplo,glucocorticóides, tais como, cortisona, hidrocortisona,prednisona, prednisolona, fluorcortolona, triamcinolona,metilprednisolona, prednilideno, parametasona, dexametasona,betametasona, beclometasona, fluprednilideno, desoximetasona,fluocinolona, flunetasona, diflucortolona, clocortolona,clobetasol e fluocortina butil éster; agentesimunossupressores, tais como, agentes anti-TNF (por exemplo,etanercepte, infliximab) e inibidores IL-1; penicilamina;fármacos antiinflamatórios não-esteroidais (NSAIDs) queincluem fármacos antiinflamatórios, analgésicos, eantipiréticos, tais como, ácido salicíclico, celecoxib,difunisal e de sais de ácido fenilacético substituídos ousais de ácido 2fenilpropiônicos, tais como, alclofenac,ibutenac, ibuprofeno, clindanac, fenclorac, cetoprofeno,fenoprofeno, indoprofeno, fenclofenac, diclofenac,flurbiprofeno, piprofeno, naproxeno, benoxaprofeno,carprofeno e cicloprofeno; derivados de doxican, tais como,piroxican; derivados de ácido antranilico, tais como, ácidomefenâmico, ácido flufenâmico, ácido tolfenâmico e ácidomeclofenâmico, derivados de ácido nicotinico substituído poranilino, tais como, os fenamatos, ácido niflúmico, clonixinae flunixina; ácidos heteroarilacéticos onde heteroarila é umgrupo 2-indol-3-il ou pirrol-2-il, tais como, indometacina,oxmetacina, intrazol, acemetazina, cinmetacina, zomepirac,tolmetina, colpirac e ácido tiaprofênico; ácido idenilacéticodo tipo sulindac; ácidos heteroariloxiacéticos analgesi-camente ativos, tais como, benzadac; fenilbutazona;etodolac; nabunetona; e fármacos anti-reumáticos modifi-cadores da doença (DMARDs), tais como, metotrexato, sais deouro, hidroxicloroquina, sulfasalazina, ciclosporina,azatioprina, e leflunomida.

Outros produtos terapêuticos úteis no tratamentode doenças ou condições inflamatórias incluem antioxidantes.Os antioxidantes podem ser naturais ou sintéticos. Osantioxidantes são, por exemplo, superóxido dismutase (SOD),21-aminoesteróides/aminocromanas, vitamina C ou E, etc.Muitos outros antioxidantes são bem conhecidos pelosversados na técnica.

Os anticorpos em questão podem servir como partede um regime de tratamento para uma condição inflamatória,que pode combinar muitos agentes antiinflamatóriosdiferentes. Por exemplo, os anticorpos em questão podem seradministrados em combinação com um ou mais NSAID, DMARD, ouimunossupressor. Em uma modalidade da aplicação, osanticorpos em questão ou fragmentos desses podem seradministrados em combinação com metotrexato. Em outramodalidade, os anticorpos em questão podem ser administradosem combinação com um inibidor TNF-a.

No caso de condições de doença cardiovascular, eparticularmente aquelas que surgem de placas ateroscleróticas,que acredita-se que possuam um componente inflamatóriosubstancial, os anticorpos em questão podem ser adminis-trados em combinação com um ou mais outros agentes úteis notratamento de doenças cardiovasculares. Os agentes úteis notratamento de doenças cardiovasculares incluem, porém semcaráter limitativo, β-bloqueadores, tais como, carvedilol,metoprolol, bucindolol, bisoprolol, atenolol, propranolol,nadolol, timolol, pindolol, e labetalol; agentesantiplaquetas, tais como, aspirina e ticlopidina; inibidoresde enzima de conversão da angiotensina (ACE), tais como,captopril, enalapril, lisinopril, benazopril, fosinopril,quinapril, ramipril, espirapril e moexipril; e agentesredutores de lipideos, tais como, mevastatina, lovastatina,sinvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina, erosuvastatina.

No caso de câncer, os anticorpos em questão podemser administrados em combinação com um ou mais fatoresantiangiogênicos, quimioterapêuticos, ou como um adjuvantepara radioterapia. Prevê-se adicionalmente que aadministração dos anticorpos em questão irá servir comoparte de um regime de tratamento de câncer, que podecombinar muitos agentes terapêuticos para câncer diferentes.

Os anticorpos ou fragmentos de ligação desses podem serligados ou acoplados a uma citotoxina ou radioterapêuticospara exterminar as células cancerígenas que expressam RAGE.Tais anticorpos ou fragmentos desses podem ser administradosem um paciente de modo que o anticorpo se ligue às célulascancerígenas que expressam RAGE. No caso de IBD, osanticorpos em questão podem ser administrados com um ou maisagentes antiinflamatórios, e podem ser adicionalmentecombinados com um regime alimentar modificado.

Para o tratamento de sepse e transtornos oucondições relacionados à sepse, tais como, choque séptico,bem como para o tratamento de listeriose sistêmica, osanticorpos anti-RAGE da invenção podem ser administrados emcombinação com outros agentes e regimes terapêuticos paratratar sepse e transtornos ou condições relacionados àsepse, ou para tratar listeriose sistêmica. Por exemplo, asepse ou listeriose pode ser tratada ao administrar osanticorpos em questão em combinação com antibióticos e/ououtras composições farmacêuticas que são o padrão detratamento dos sintomas particulares e a condição dopaciente.

Em um aspecto, a presente invenção tambémproporciona um método para inibir a interação de AGE comRAGE em um indivíduo que compreende administrar no indivíduouma quantidade terapeuticamente eficaz de um compostoidentificado pelos métodos da invenção. Uma quantidadeterapeuticamente eficaz é uma quantidade que é capaz deevitar a interação de AGE/RAGE em um indivíduo.

Consequentemente, a quantidade irá variar com o indivíduoque será tratado. A administração do composto pode ser feitade hora em hora, diariamente, semanalmente, mensalmente,anualmente ou um único evento. Por exemplo, a quantidadeeficaz do composto pode compreende de cerca de 1 pg/kg dopeso corporal a cerca de 100 mg/kg do peso corporal. Em umamodalidade, a quantidade eficaz do composto compreende decerca de 1 pg/kg do peso corporal a cerca de 50 mg/kg dopeso corporal. Em uma modalidade adicional, a quantidadeeficaz do composto compreende de cerca de 10 μg/kg do pesocorporal a cerca de 10 mg/kg do peso corporal. A quantidadeeficaz real será estabelecida por análises de dose/respostautilizando métodos padrão na técnica (Johnson et al.,Diabetes. 42:1179, (1993)). Assim, como conhecido natécnica, a quantidade eficaz dependerá da biodisponibilidade,bioatividade e biodegradabilidade do composto.

Por exemplo, os anticorpos anti-RAGE e composiçõesda invenção são administrados em um paciente necessitadodesses em uma quantidade suficiente para inibir a liberaçãode citocina pró-inflamatória de uma célula e/ou par trataruma condição inflamatória. A invenção inclui inibir aliberação de uma citocina pró-inflamatória em ao menos 10%,20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, ou 95%, como avaliadoutilizando os métodos descritos aqui ou outro métodosconhecidos na técnica.Em uma modalidade, o indivíduo é um animal. Em umamodalidade, o indivíduo é um humano. Em uma modalidade, oindivíduo sofre de uma doença relacionada a AGE, tal como,diabetes, amiloidoses, insuficiência renal, envelhecimento,ou inflamação. Em outra modalidade, o assunto compreende umindivíduo com doença de Alzheimer. Em uma modalidadealternativa, o assunto compreende um indivíduo com câncer.

Ainda em outra modalidade, o assunto compreende um indivíduocom lúpus eritematoso sistêmico, ou nefrite por lúpusinflamatório.

Os anticorpos em questão ou fragmentos de ligaçãodesses podem ser administrados em uma dose de cerca de 1pg/kg do peso corporal a cerca de 100 mg/kg do pesocorporal. Em uma modalidade, a quantidade eficaz do compostocompreende de cerca de 1 pg/kg do peso corporal a cerca de50 mg/kg do peso corporal. A freqüência de duração dotratamento irá depender inter alia da condição da doençaparticular bem como da condição do paciente.

Biomarcadores

Os biomarcadores que medem a atividade da doençasepse, tal como, CRP, IL-6, procalcitonina, proadrenomedulina,e parâmetros de coagulação (D-dímero, níveis PAI-1,proteína-C, fibrinogênio) podem ser monitorados paracaracterizar questões com relação à condição da doença eresposta potectial e real ao tratamento com anticorpos anti-RAGE da invenção.

Além disso, o RAGE solúvel (sRAGE) é encontrado noplasma tanto como uma forma secretada como uma forma clivadada membrana celular. Uma análise para medir os níveis deplasma de sRAGE foi desenvolvida e também pode ser usadapara caracterizar os indivíduos. Uma vez que os anticorposda invenção se ligam ao sRAGE, a presença de sRAGE no plasmado paciente pode influenciar a farmacodinâmica de tratamentocom anticorpos da invenção, se o sRAGE estiver presente emconcentrações próximas às concentrações do anticorpo.

Análises de Triagem de FármacosEm certas modalidades, a presente invençãoproporciona análises para identificar os anticorpos de testeque inibem a ligação de um RAGE-BP (por exemplo, HMGBl, AGE,Afi, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8,S100A9, CRP, fi2-integrina, Mac-1, e pl50,95) a um receptorde polipeptídeo (por exemplo, RAGE ou RAGE-LBE, como descrito acima).

Em certas modalidades, as análises detectam osanticorpos de teste que modulam as atividades de sinalizaçãodo receptor RAGE induzido por um RAGE-BP selecionado dogrupo que consiste em HMGBl, AGE, Afi, SAA, S100, anfoterina,S100P, SlOOA, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, fi2-integrina,Mac-I, e pl50,95. Tais atividades de sinalização incluem,porém sem caráter limitativo, ligação a outros componentescelulares, enzimas de ativação, tais como, proteínasquinases ativadas por mitógeno (MAPKs), ativação deatividade transcricional NF-κΒ, e similares.

As proteínas de ligação ao RAGE observadas acimasão relativas às vias de sinalização envolvidas nocrescimento e proliferação celular, inclusive crescimento decélula cancerosa. Por exemplo, SlOOP é um elemento dafamília SlOO de proteínas de ligação de cálcio (> 20elementos) e é uma proteína com 95 aminoácidos que é isoladada placenta primeiro. A S100P é expressa e secretada em >90%de todos os tumores pancreáticos e a expressão aumenta com oprogresso do câncer pancreático. A S100P também é expressaem câncer de pulmão, mama, próstata e cólon, a expressão emlinhagens de células do cólon está correlacionada com aresistência à quimioterapia e em câncer de pulmão, a altaexpressão de S100P indica prognóstico insatisfatório. Atransferência genética ou adição extracelular de S100Paumenta a proliferação de célula tumoral, motilidade,invasão e sobrevivência de células in vitro e crescimento detumor e metástase in vivo, enquanto o silenciamento daexpressão de S100P resulta em uma redução de proliferação emetástase.

O único receptor conhecido de S100P é RAGE, cujaexpressão é correlacionada com a invasão e metástase decarcinoma gástrico e glioma. Os inibidores de RAGE anulam osefeitos da interação de S100P-RAGE sobre a sinalização,proliferação e sobrevivência das células e uma proteínainibidora derivada de anfoterina atua como um antagonistapara a interação de S100P-RAGE. Os anticorpos anti-RAGE e aexpressão de RAGE negativo dominante inibem os efeitos deS100P.

Uma variedade de formatos de análises serásuficiente e, devido à presente descrição, aqueles nãoexpressamente descritos aqui serão, no entanto,compreendidos por um versado na técnica. Os formatos deanálises que aproximam tais condições como a formação decomplexos de proteína, atividade enzimática, podem sergerados de muitas formas diferentes, e incluem análises combase em sistemas isentos de célula, por exemplo, proteínaspurificas ou lisados de células, bem como análises baseadasem célula que utilizam células intactas. As análises deligação simples podem ser usadas para detectar compostos queinibem a interação entre um RAGE BP (por exemplo, HMGBl,AGE, Αβ, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4,A100A8, S100A9, CRP, fi2-integrina, Mac-I e nd pl50,95) e umreceptor de polipeptídeo (por exemplo, RAGE ou RAGE-LBE) . Oscompostos que serão testados podem ser produzidos, porexemplo, por bactérias, levedura ou outros organismos (porexemplo, produtos naturais), pequenas moléculas quimicamenteproduzidas (por exemplo, moléculas pequenas, inclusivepeptideomiméticos), ou produzidas de forma recombinante.

Em muitas modalidades, uma célula é manipuladaapós a incubação com um composto candidato e analisada paraatividades de sinalização do receptor RAGE induzidas por umRAGE-BP (por exemplo, HMGBl, AGE, Αβ, SAA, S100, anfoterina,S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, β2-integrina,Mac-1, e pl50,95). Em certas modalidades, as bioanálises detais atividades podem incluir análises de atividade de NF-kB(por exemplo, análises de gene repórter NF-κΒ luciferase ouGFP).

As análises de gene repórter NF-κΒ luciferase ouGFP podem ser realizadas como descrito por Shona et al.(2002) FEBS Letters. 515: 119- 126. Resumidamente, ascélulas que expressam o receptor RAGE ou uma variante dessesão transfectadas com um gene repórter NF-KB-Iuciferase. Ascélulas transfectadas são então incubadas com um compostocandidato. Subseqüentemente, a atividade da luciferaseestimulada por NF-κΒ é medida em células tratadas com ocomposto ou sem o composto. Alternativamente, as célulaspodem ser transfectadas com um gene repórter NF-kB-GFP(Stratagene). As células transfectadas são então incubadascom um composto candidato. Subseqüentemente, a atividade dogene estimulada por NF-κΒ é monitorada ao medir a expressãode GFP com uma configuração de microscópio defluorescência/luz visível ou por análise de FACS.

Em certas modalidades, a presente invençãoproporciona uma proteína reconstituída e então as preparaçõesque incluem um receptor de polipeptídeo (por exemplo, RAGEou RAGE-LBE) , e um ou mais RAGE-BPs (por exemplo, HMGBl,AGE, Αβ, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4,A100A8, S100A9, CRP, B2-integrina, Mac-1, e pl50,95). Asanálises da presente invenção incluem análises de ligaçãoproteína-proteína marcada in vitro, imunoensaios paraligação de proteína, e similares. A proteína purificadatambém pode ser usada para a determinação de uma estruturacristalina tridimensional, que pode ser usada para modelaras interações intermoleculares. 0 anticorpo purificadotambém pode ser usado para a determinação de uma estruturacristalina tridimensional, que pode ser usada para modelaras interações intermoleculares.Em certas modalidades das presentes análises, umpolipeptideo RAGE-BP (por exemplo, HMGBl, AGE, Afi, SAA,S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP,fi2-integrina, Mac-1, e pl50,95) ou um receptor depolipeptideo (por exemplo, RAGE) pode ser endógeno à célulaselecionada para sustentar as análises. Alternativamente, umpolipeptideo RAGE-BP ou um receptor de polipeptideo (porexemplo, RAGE ou RAGE-LBE) pode ser derivado de fontesexógenas. Por exemplo, os polipeptideo podem ser introduzidosna célula por técnicas recombinantes (tal como, através douso de um vetor de expressão), bem como por microinjeção dopróprio polipeptideo ou mRNA que codifica o polipeptideo.

Em modalidades adicionais das análises, umcomplexo entre um RAGE-BP e um receptor de polipeptideo podeser gerado em todas as células, tirando vantagem de técnicasde cultura celular para sustentar as análises em questão.

Por exemplo, como descrito abaixo, um complexo pode serconstituído em um sistema de cultura de célula eucariótica,inclusive células de mamíferos e levedura. As vantagens dese gerar as análises em questão em uma célula intactaincluem a capacidade de detectar compostos que sãofuncionais em um ambiente mais estreitamente análogo àquelepara uso terapêutico dos compostos. Ademais, certasmodalidades in vivo da análise, tais como os exemplos dadosabaixo, são receptivas a análises de alto rendimento decompostos candidatos.

Em certas modalidades in vitro da presenteanálise, um complexo reconstituído compreende uma misturareconstituída de ao menos proteínas semipurifiçadas. Porsemipurifiçadas, entende-se que as proteínas utilizadas namistura reconstituída foram anteriormente separadas deoutras proteínas celulares. Por exemplo, ao contrário delisados de células, as proteínas envolvidas na formação decomplexo estão presentes na mistura em ao menos 50% depureza com relação a todas as outras proteínas na mistura,em uma modalidade, estão presentes em 90 a 95% de pureza, eem uma modalidade adicional, estão presentes em 95 a 99% depureza. Em certas modalidades do método em questão, amistura de proteína reconstituída é derivada da mistura deproteínas altamente purificadas de modo que a misturareconstituída seja substancialmente desprovida de outrasproteínas (tais como, de origem celular) que podeminterferir ou de outra maneira alterar a capacidade de medira montagem e/ou desmontagem do complexo.

Em certas modalidades, a análise na presença eausência de um composto candidato, pode ser realizada emqualquer recipiente adequado para incluir os reagentes.Exemplos incluem placas microtiter, tubos de ensaio e tubosde tubos de microcentrífuga.

Em certas modalidades, as análises de seleção defármacos podem ser geradas para detectar anticorpos de testesobre a base de sua capacidade de interferir na montagem,estabilidade ou função de um complexo entre um RAGE-BP (porexemplo, HMGBl, AGE, Αβ, SAA, S100, anfoterina, S100P,S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, B2-integrina, Mac-1, epl50,95) e um receptor de polipeptídeo (por exemplo, RAGE ouRAGE-LBE). Em uma análise de ligação exemplificativa, ocomposto de interesse entra em contato com uma mistura quecompreende um polipeptideo RAGE-LBE e um RAGE-BP, tais como,HMGBl, AGE, Αβ, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4,A100A8, S100A9, CRP, B2-integrina, Mac-1, e p150,95. Adetecção e quantificação do complexo proporcionam um meiopara determinar a eficácia do composto ao inibir a interaçãoentre os dois componentes do complexo. A eficácia docomposto pode ser avaliada ao gerar curvas dose-resposta apartir de dados obtidos utilizando diversas concentrações doanticorpo de teste. Ademais, uma análise de controle tambémpode ser realizada para proporcionar uma linha de base paracomparação. Na análise de controle, a formação de complexosé quantificada na ausência do anticorpo de teste.

Em certas modalidades, a associação entre os doispolipeptideos em um complexo (por exemplo, um RAGE-BP e umreceptor de polipeptideo), pode ser detectada por umavariedade de técnicas, muitas dessas são efetivamentedescritas acima. Por exemplo, a modulação na formação decomplexos pode ser quantificada utilizando, por exemplo,proteínas detectavelmente marcadas (por exemplo,radiomarcadas, fluorescentemente marcadas, ou enzimaticamentemarcadas), por imunoensaio, por análise bi-híbrida, ou pordetecção cromatográfica. Os sistemas de ressonância deplásmon de superfície, tais como, aqueles disponíveis juntoà Biacore International AB (Uppsala, Sweden), também podemser usados para detectar a interação proteína-proteína.Em certas modalidades, um polipeptídeo em umcomplexo que compreende um RAGE BP e um receptor depolipeptídeo, pode ser imobilizado para facilitar aseparação do complexo das formas não-complexadas do outropolipeptídeo, bem como para acomodar a automação da análise.

Em uma modalidade ilustrativa, um anticorpo pode serproporcionado, esse auxilia um domínio que permite que oanticorpo seja ligado a uma matriz insolúvel. Por exemplo,um anticorpo pode ser absorvido em microesferas deglutationa sefarose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) ouplacas de microtiter de glutationa derivatizada, ou ligadode forma direta ou indireta a microesferas magnéticas, essassão então combinadas com uma proteína de interação potencial(por exemplo, um polipeptídeo SlOO marcado por 35S, ou outroRAGE-BP marcado), e o anticorpo de teste é incubado sobcondições propícias para formação de complexo. Após aincubação, as microesferas são lavadas para remover qualqueranticorpo de interação não-ligado, e o radiomarcador ligadoà microesfera de matriz é diretamente determinado (porexemplo, microesferas colocadas em cintilante), ou nosobrenadante após os complexos serem dissociados, porexemplo, quando a placa microtiter for usada. Alterna-tivamente, após a lavagem fora do anticorpo não-ligado, oscomplexos podem ser dissociados da matriz, separados por gelSDS-PAGE, e o nível de interação de polipeptídeo encontradona fração ligada por matriz quantificado a partir do gelutilizando técnicas eletroforéticas padrão.Em outra modalidade, uma análise bi-hibrida(também referida como uma análise de aprisionamento porinteração) pode ser usada para detectar a interação de doispolipeptideos no complexo de RAGE-LBE e RAGE-BP (vejatambém, Patente N- U.S.: 5.283.317; Zervos et al. (1993)Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924;and Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696), e paradetectar subseqüentemente os anticorpos de teste que inibema ligação entre um RAGE-LBE e um polipeptideo RAGE-BP. Essaanálise inclui proporcionar uma célula hospedeira, porexemplo, uma célula de levedura (preferida) , uma célula demamífero ou um tipo de célula bacteriana. A célulahospedeira contém um gene repórter que possui um sítio deligação para o domínio de ligação ao DNA de um ativadortranscricional usado na proteína de isca, de modo que o generepórter expresse um produto de gene detectável quando ogene for ativado de forma transcricional. Um primeiro genequimérico que é proporcionado é capaz de ser expresso nacélula hospedeira, e codifica um polipeptideo "isca". Umsegundo gene quimérico que também é proporcionado é capaz deser expresso na célula hospedeira, e codifica o polipeptideode "peixe". Em uma modalidade, tanto o primeiro como osegundo gene químico são introduzidos na célula hospedeirana forma de plasmídeos. De preferência, entretanto, oprimeiro gene quimérico está presente em um cromossoma dacélula hospedeira e o segundo gene quimérico é introduzidona célula hospedeira como parte de um plasmídeo.Em certas modalidades, a invenção proporciona umaanálise bi-hibrida para identificar os anticorpos de testeque inibem a ligação de um polipeptideo RAGE-BP (porexemplo, HMGBl, AGE, Αβ, SAA, S100, anfoterina, S100P,S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, Mac-1, epl50,95) e um receptor de polipeptideo (por exemplo, RAGE ouRAGE-LBE). Para ilustrar, um polipeptideo de "isca" quecompreende um receptor de polipeptideo e um polipeptideo de"peixe" que compreende um polipeptideo RAGE-BP (tal como,HMGBl, AGE, Αβ, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4,A100A8, S100A9, CRP, fi2-integrina, Mac-1, e pl50,95), sãointroduzidos na célula hospedeira. Em uma modalidade, a iscacompreende o dominio-V de RAGE humano ou murideo, ou umaseqüência com 80 a 99% de identidade com o dominio-V de RAGEhumano ou murideo que ainda pode ligar RAGE-BP. As célulassão submetidas a condições sob as quais os polipeptideos deisca e peixe são expressos em quantidade suficiente para queo gene repórter seja ativado.

A interação dos dois polipeptideos de fusãoresulta em um sinal detectável produzido pela expressão dogene repórter. Consequentemente, o nivel de interação entreos dois polipeptideos na presença de um anticorpo de testena ausência do anticorpo de teste pode ser avaliado aodetectar o nivel de expressão do gene repórter em cada caso.Várias construções de repórter podem ser usadas de acordocom os métodos da invenção e incluem, por exemplo, genesrepórter que produzem tais sinais detectáveis conformeselecionado a partir do grupo que consiste em um sinalenzimático, um sinal fluorescente, um sinal fosforescente eresistência ao fármaco.

Em muitos programas de seleção de fármacos quetestam as bibliotecas de compostos e extratos naturais,análises de alto rendimento são desejadas para aumentar onúmero de compostos avaliados em um determinado período detempo. As análises da presente invenção que são realizadasem sistemas isentos de células podem ser desenvolvidas comproteínas purificadas ou semipurifiçadas ou com lisados, sãogeralmente preparadas como telas "primárias" onde essaspodem ser geradas para permitir um desenvolvimento rápido edetecção relativamente fácil de uma alteração em um alvomolecular que é mediado por um anticorpo de teste. Ademais,os efeitos de toxicidade e/ou biodisponibilidade celular doanticorpo de teste podem ser geralmente ignorados no sistemain vitro, a análise é, de preferência, concentradaprincipalmente no efeito do fármaco sobre o alvo molecularconforme pode ser manifestado em uma alteração de afinidadede ligação com outras proteínas ou alterações naspropriedades enzimáticas do alvo molecular.

Em certas modalidades, a formação de complexoentre um RAGE-BP e um receptor pode ser avaliada porimunoprecipitação e análise de proteínas co-imunoprecipitadasou purificação por afinidade e análise de proteínas co-purificadas. A análise baseada em Transferência Ressonantede Energia de Fluorescência (FRET) também pode ser usadapara determinar tal formação de complexo. As moléculasfluorescentes que possuem a emissão apropriada e espectrosde excitação que são colocados em estreita proximidade unscom os outros podem exibir FRET. As moléculas fluorescentessão selecionadas de modo que o espectro de emissão de umadas moléculas (a molécula doadora) se sobreponha com oespectro de excitação da outra molécula (a moléculaaceitadora). A molécula doadora é excitada devido àintensidade apropriada dentro do espectro de excitação dodoador. 0 doador, então, emite a energia absorvida como luzfluorescente. A energia fluorescente que esse produz édissipada pela molécula aceitadora. A FRET pode sermanifestada como uma redução na intensidade do sinalfluorescente do doador, redução no tempo de vida de seuestado excitado, e/ou reemissão de luz fluorescente noscomprimentos de onda maiores (energias inferiores)característicos do aceitador. Quando as proteínasfluorescentes se separam fisicamente, os efeitos de FRET sãoreduzidos ou eliminados (veja, por exemplo, Patente N2 U.S.5.981.200).

A ocorrência de FRET também faz com que o tempo devida de fluorescência da porção fluorescente do doadordiminua. Essa alteração no tempo de vida de fluorescênciapode ser medida utilizando uma técnica chamada tecnologia detempo de vida de fluorescência (FLIM) (Verveer et al. (2000)Science 290: 1567-1570, Squire et al. (1999) J: Microsc.193: 36; Verveer et al. (2000) Biophys. J. 78: 2127).Técnicas de análise global para analisar dados de FLIM foramdesenvolvidas. Esses algoritmos utilizam o entendimento quehá a porção fluorescente de doador apenas em um númerolimitado de estados, cada um com um tempo de vidafluorescência distinto. Os mapas quantitativos de cadaestado podem ser gerados sobre uma base pixel-por-pixel.

Para realizar as análises baseadas em FRET, umpolipeptideo RAGE-BP (por exemplo, HMGBl, AGE, Αβ, SAA,S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP,β2-integrina, Mac-I e pl50,95) e um receptor de polipeptideo(por exemplo, RAGE ou RAGE-LBE) são fluorescentementemarcados. Os marcadores fluorescentes adequados são bemconhecidos na técnica. Exemplos São fornecidos abaixo, porémos marcadores fluorescentes adequados não especificamentediscutidos também estão disponíveis aos versados na técnicae podem ser usados. A marcação fluorescente pode serrealizada ao expressar um polipeptideo como um polipeptideocom uma proteína fluorescente, por exemplo, proteínasfluorescentes isoladas de água-viva, corais e outroscelenterados. As proteínas fluorescentes exemplificativasincluem as várias variantes da proteína verde fluorescente(GFP) de Aequoria victoria. As variantes podem ser maisbrilhantes, mais turvas, ou podem possuir espectros deexcitação e/ou emissão diferentes. Determinadas variantessão alteradas de tal modo que elas nunca mais pereçamverdes, e possam parecer azuis, ciano, amarelas ou vermelhas(chamadas de BFP, CFP, YFP, e REP, respectivamente) . Asproteínas fluorescentes podem ser adequadamente ligadas aospolipeptídeos através de uma variedade de ligaçõescovalentes e não-covalentes, inclusive, por exemplo,ligações peptídicas (por exemplo, expressão como umaproteína de fusão), reticulação química e acoplamento debiotina-estreptavidina. Para ver exemplos de proteínasfluorescentes, consulte Patente NOs U.S. 5.625.048,5.777.079, 6.066.476, e 6.124.128, Prasher et al. (1992)Gene, 111: 229-233; Reign et al. (1994) Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 91: 12501-04; Ward et al. (1982) Photochem.Photobiol., 35: 803-808; Levine et al. (1982) Comp. Biochem.Physiol., 72B: 77-g5; Tersikh et al. (2000) Science 290:1585-88.

A análise baseada em FRET pode ser usada emanálises baseadas em células e em análises isentas decélulas. As análises baseadas em FRET são receptivas amétodos de triagem de alto rendimento que incluem Separaçãode Células Ativadas por Fluorescência e triagem fluorescentede disposições de microtiter.

Em geral, quando uma análise de triagem for umaanálise de ligação (seja ligação proteína-proteína, ligaçãocomposto-proteína, etc.), uma ou mais moléculas podem seracopladas ou ligadas a um marcador, quando o marcador puderproporcionar de forma direta ou indireta um sinaldetectável.

Diversos marcadores incluem radioisótopos,fluorescedores, quimioluminescedores, enzimas, moléculas deligação específica, partículas, por exemplo, partículasmagnéticas, e similares. As moléculas de ligação específicaincluem pares, tais como, biotina e estreptavidina, digoxinae antidigoxina, etc. Para os elementos de ligaçãoespecífica, o elemento complementar poderia ser normalmentemarcado com uma molécula que proporciona detecção, de acordocom procedimentos conhecidos.

Uma variedade de outros reagentes pode serincluída na análise de triagem. Esses incluem reagentes comosais, proteínas neutras, por exemplo, albumina, detergentes,etc que são usados para facilitar a ligação proteína-proteína ótima e/ou reduzir as interações não-específicas oupor campo de batalha. Os reagentes que aprimoram aeficiência da análise, tais como, inibidores de protease,inibidores da nuclease, compostos antimicrobianos, etc.podem ser usados. A mistura de componentes é adicionada emqualquer ordem de modo a proporcionar a ligação necessária.As incubações são realizadas em qualquer temperaturaadequada, tipicamente entre 4°C e 40°C. Os períodos deincubação são selecionados para atividade ótima, porémtambém podem ser otimizados para facilitar a triagem de altorendimento.

Em certas modalidades, a invenção proporcionaanálises independentes de complexo. Tais análises compreendemidentificar um anticorpo de teste que é um inibidorcandidato da ligação de um RAGE-BP a um receptor depolipeptídeo (por exemplo, RAGE ou RAGE-LBE).

Em uma modalidade exemplificativa, um composto quese liga a um receptor de polipeptídeo pode ser identificadoutilizando um receptor RAGE-LBE de polipeptídeo. Em umamodalidade ilustrativa, um RAGE-LBE pode ser proporcionadopara auxiliar um domínio adicional que permite que aproteína seja ligada a uma matriz insolúvel. Por exemplo, umRAGE-LBE fundido com uma proteína GST pode ser absorvidosobre as microesferas de glutationa sefarose (SigmaChemical, St. Louis, MO) ou placas de microtiter deglutationa derivatizada, que são então combinadas com umcomposto de ligação marcado potencial e incubadas sobcondições propícias para ligação. Após a incubação, asmicroesferas são lavadas para remover qualquer composto não-ligado, e o marcador ligado à microesfera de matriz édiretamente determinado, ou no sobrenadante após o composto ligado ser dissociado.

Em certas modalidades, um marcador podeproporcionar de forma direta ou indireta um sinal detectável.Diversos marcadores incluem radioisótopos, fluorescedores,quimioluminescedores, enzimas, moléculas de ligaçãoespecífica, partículas, por exemplo, partículas magnéticas,e similares. As moléculas de ligação específica incluempares, tais como, biotina e estreptavidina, digoxina eantidigoxina, etc. Para os elementos de ligação específica,o elemento complementar poderia ser normalmente marcado comuma molécula que proporciona detecção, de acordo comprocedimentos conhecidos. Em certas modalidades, taismétodos compreender a formação da mistura in vitro. Emcertas modalidades, tais métodos compreendem análisesbaseadas em células mediante a formação da mistura in vivo.Em certas modalidades, os métodos compreendem entrar emcontato com uma célula que expressa um receptor depolipeptídeo (por exemplo, RAGE ou RAGE-LBE) ou uma variantedesse com o anticorpo de teste.Em certas modalidades, as análises estão baseadasem sistemas isentos de células, por exemplo, proteínaspurificadas ou lisados celulares, bem como análises baseadasem células que utilizam células intactas. Análises deligação simples podem ser usadas para detectar compostos queinteragem com o receptor de polipeptideo. Os compostos queserão tratados podem ser produzidos, por exemplo, porbactérias, levedura ou outros organismos (por exemplo,produtos naturais), quimicamente produzidos (por exemplo,pequenas moléculas, inclusive peptideomiméticos) , ouproduzidos de forma recombinante.

Opcionalmente, os anticorpos de teste identificadosa partir dessas análises podem ser usados para tratartranstornos associados ao RAGE.

Preparações Farmacêuticas

As proteínas ou ácidos nucléicos em questão dapresente invenção são, com mais preferência, administradosna forma de composições apropriadas. Como composiçõesapropriadas podem-se citar todas as composições geralmenteempregadas para administração sistêmica ou local defármacos. 0 veículo farmaceuticamente aceitável deve sersubstancialmente inerte, para não atuar com o componenteativo. Os veículos inertes adequados incluem água, álcool,polietileno glicol, óleo mineral ou gel de petróleo,propileno glicol, tampão fosfato salina (PBS)', águabacteriostática para injeção (BWFI), água estéril parainjeção (SWFI), e similares. As ditas preparaçõesfarmacêuticas (inclusive os anticorpos ou ácidos nucléicosem questão que codificam os anticorpos em questão) podem serformuladas para administração de qualquer maneira convenientepara uso em medicina humana ou veterinária.

Assim, outro aspecto da presente invençãoproporciona composições farmaceuticamente aceitáveis quecompreende uma quantidade eficaz de um anticorpo, formuladasjuntamente com um ou mais veículos farmaceuticamenteaceitáveis (aditivos) e/ou diluentes. Como descrito emdetalhe abaixo, as composições farmacêuticas da presenteinvenção podem ser especialmente formuladas paraadministração em forma sólida ou líquida, inclusive aquelasadaptadas para o seguinte: (1) administração oral, porexemplo, tragos (soluções ou suspensões aquosas ou não-aquosas), tabletes, bolos, pós, grânulos, pastas paraaplicação à língua; (2) administração parenteral, porexemplo, por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosacomo, por exemplo, uma solução ou suspensão estéril; (3)aplicação tópica, por exemplo, como um creme, pomada ouspray aplicado à pele; ou (4) de forma intravaginal ouintra-retal, por exemplo, como um pessário, creme ou espuma.Entretanto, em certas modalidades, os agentes em questãopodem ser simplesmente dissolvidos ou suspensos em águaestéril. Em certas modalidades, a preparação farmacêutica énão-pirogênica, ou seja, não eleva a temperatura do corpo dopaciente. A administração parenteral, em particular, injeçãosubcutânea e intravenosa, é a via de administração preferida.

Em certas modalidades, um ou mais agentes podemconter um grupo funcional básico, tal como, amino oualquilamino, e são, portanto, capazes de formar saisfarmaceuticamente aceitáveis com ácidos farmaceuticamenteaceitáveis. O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" comrelação a isso, se refere aos sais de adição de ácidoinorgânicos e orgânicos relativamente não-tóxicos decompostos da presente invenção. Esses sais podem serpreparados in situ durante o isolamento e purificação finaldos compostos da invenção, ou ao reagir separadamente umcomposto purificado da invenção em sua forma de base livrecom um ácido orgânico ou inorgânico adequado, e isolar osal, então, formado. Os sais representativos incluem os saisde hidrobrometo, hidrocloreto, sulfato, bissulfato, fosfato,nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato,laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato,maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftalato, mesilato,glucoeptonato, lactobionato, e lauril sulfonato e similares.(Veja, por exemplo, Berge et al. (1977) "PharmaceuticalSalts", J. Pharm. Sei. 66: 1-19).

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos agentesincluem os sais não-tóxicos convencionais ou sais de amônioquaternário dos compostos, por exemplo, de ácidos orgânicosou inorgânicos não-tóxicos. Por exemplo, tais sais não-tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidosinorgânicos, tais como, hidrocloreto, ácido hidrobrômico,sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nitrico, e similares; e ossais preparados a partir de ácidos orgânicos, tais como,ácido acético, propiônico, succinico, glicólico, esteárico,láctico, málico, tartárico, citrico, ascórbico, palmitico,maléico, hidroximaléico, fenilacético, glutâmico, benzóico,salicíclico, sulfanílico, 2-acetoxibenzóico, fumárico,toluenossulfônico, metanossulfônico, etano dissulfônico,oxálico, isotiônico, e similares.

Em outros casos, um ou mais agentes podem conterum ou mais grupos funcionais acidicos e, assim, são capazesde formar sais farmaceuticamente aceitáveis com basesfarmaceuticamente aceitáveis. Esses sais também podem serpreparados in situ durante o isolamento e purificação finaldos compostos, ou ao reagir separadamente o compostopurificado em sua forma de ácido livre com uma baseadequada, tal como, hidróxido, carbonato ou bicarbonato deum cátion metálico farmaceuticamente aceitável, com amônia,ou com uma amina orgânica primaria, secundária ou terciáriafarmaceuticamente aceitável. Os sais álcali ou de terraalcalina incluem os sais de litio, sódio, potássio, cálcio,magnésio, e alumínio e similares. As aminas orgânicasrepresentativas úteis para a formação de sais de adição debase incluem etilamina, dietilamina, etilenodiamina,etanolamina, dietanolamina, piperazina e similares (veja,por exemplo, Berge et al., supra).

Os agentes umectantes, emulsificantes elubrificantes, tais como, lauril sulfato de sódio eestearato de magnésio, bem como os agentes de coloração,agentes de liberação, agentes de revestimento, adoçantes,flavorizantes e agentes de perfume, conservantes eantioxidantes também podem estar presentes nas composições.Exemplos de antioxidantes farmaceuticamenteaceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, taiscomo, ácido ascórbico, cisteina, hidrocloreto, bissulfato desódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio esimilares, (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como,ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado (BHA),hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil gaiato,alfa-tocoferol, e similares, e (3) agentes quelantes demetal, tais como, ácido citrico, ácido etilenodiaminatetracético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácidofosfórico, e similares.

As formulações da presente invenção incluem aquelasadequadas para administração-^oral, nasal, tópica (inclusivebucal e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. Asformulações podem ser convenientemente apresentadas em formaunitária de dosagem e podem ser preparadas por qualquermétodo bem conhecido na técnica de farmácia. A quantidade deingrediente ativo que pode ser combinada com um material deveiculo para produzir uma forma de dosagem única irá variardependendo do hospedeiro que será tratado, do modoparticular de administração, etc. A quantidade de ingredienteativo que pode ser combinada com um material de veiculo paraproduzir uma forma de dosagem única será geralmente aquelaquantidade do composto que produz um efeito terapêutico.

Geralmente, dentre cem por cento, essa quantidade irá variarde cerca de 1 por cento a cerca de noventa e nove por centode ingrediente ativo, de preferência, de cerca de 5 porcento a cerca de 70 por cento, com mais preferência, decerca de 10 por cento a cerca de 30 por cento.

Os métodos para preparar essas formulações oucomposições incluem a etapa de colocar um agente emassociação com o veiculo e, opcionalmente, um ou maisingredientes auxiliares. Em geral, as formulações sãopreparadas ao colocar um agente da presente invenção deforma uniforme e intima em associação com veículos líquidos,ou veículos sólidos convenientemente divididos, ou ambos, eentão, se necessário, modelar o produto.

As formulações da invenção adequadas paraadministração oral podem estar na forma de cápsulas,drágeas, pílulas, tabletes, comprimidos (utilizando uma baseflavorizada, geralmente, sucrose e acácia ou tragacanto) ,pós, grânulos, ou como uma solução ou uma suspensão em umlíquido aquoso ou não-aquoso, ou como uma emulsão líquida deóleo em água ou água em óleo ou como um elixir ou xarope, oucomo pastilhas (utilizando uma base inerte, tal como,gelatina e glicerina, ou sucrose e acácia) e/ou comoenxaguatórios bucais e similares, sendo que cada um contémuma quantidade predeterminada de um composto da presenteinvenção como um ingrediente ativo. Um composto da presenteinvenção também pode ser administrado como um bolo,eletuário ou pasta.

Em formas de dosagem sólidas da invenção paraadministração oral (cápsulas, tabletes, pílulas, drágeas,pós, grânulos e similares), o ingrediente ativo é misturadocom um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, taiscomo, citrato de sódio ou fosfato de dicálcio, e/ou qualquerum dos seguintes: (1) cargas ou extensores, tais como,amidos, lactose, sucrose, glucose, manitol, e/ou ácidosilícico; (2) aglutinantes, tais como, por exemplo,carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sucrose e/ou acácia; (3) solventes, tais como,glicerol; (4) agentes desintegrantes, tais como, agar-agar,carbonato de cálcio, batata ou amido de tapioca, ácidoalginico, certos silicatos, e carbonato de sódio; (5)agentes retardantes de solução, tais como, parafina; (6)aceleradores de absorção, tais como, compostos de amônioquaternário; (7) agentes umectantes, tais como, por exemplo,álcool cetilico e monoestearato de glicerol; (8)absorventes, tais como, caulim e argila bentonita; (9)lubrificantes, tais como, talco, estearato de cálcio,estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, laurilsulfato de sódio, e misturas desses; e (10) agentes decoloração. No caso de cápsulas, tabletes e pílulas, ascomposições farmacêuticas também podem compreender agentes20 tampão. As composições sólidas de um tipo similar tambémpodem ser empregadas como cargas em cápsulas de gelatinarecheadas macias e duras utilizando tais excipientes comolactose ou açúcares do leite, bem como, polietileno glicóisde alto peso molecular e similares.

Um tablete pode ser feito por compressão oumoldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientesauxiliares. Os tabletes comprimidos podem ser preparadosutilizando um aglutinante (por exemplo, gelatina ouhidroxipropilmetil celulose), lubrificante, diluente inerte,conservante, desintegrante (por exemplo, glicolato de amidosódico ou carboximetilcelulose sódica reticulada), agenteativo de superfície ou dispersante. Os tabletes moldadospodem ser feitos por moldagem em uma máquina adequada comuma mistura do composto em pó umedecido com um diluentelíquido inerte.

Os tabletes, e outras formas de dosagem sólidasdas composições farmacêuticas da presente invenção, taiscomo, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos, podem seropcionalmente marcados ou preparados com revestimentos einvólucros, tais como, revestimentos entéricos e outrosrevestimentos bem conhecidos na técnica de formulaçãofarmacêutica. Esses também podem ser formulados paraproporcionar uma liberação lenta ou controlada do ingredienteativo utilizando, por exemplo, hidroxipropilmetil celuloseem proporções variadas para proporcionar o perfil deliberação desejado, outras matrizes poliméricas, lipossomase/ou microesferas. Esses podem ser esterilizados, porexemplo, por filtração através de um filtro de retenção debactérias, ou ao incorporar agentes esterilizantes na formade composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas emágua estéril, ou algum outro meio injetável estérilimediatamente antes do uso. Essas composições também podemconter opcionalmente agentes opacificantes e podem ser deuma composição que as mesmas liberam o(s) ingrediente(s)ativo(s) apenas, ou de preferência, em uma certa parte dotrato gastrintestinal, opcionalmente, de maneira retardada.Exemplos de composições de combinação que podem ser usadasincluem substâncias poliméricas e ceras. 0 ingrediente ativotambém pode estar em forma microencapsulada, se apropriado,com um ou mais dos excipientes descritos acima.

As formas de dosagem líquidas para administraçãooral dos compostos da invenção incluem emulsões,microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixiresfarmaceuticamente aceitáveis. Além do ingrediente ativo, asformas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertescomumente usados na técnica, tais como, por exemplo, água ououtros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes,tais como, álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato deetila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoatobenzílico, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, óleos (emparticular, caroço de algodão, amendoim, milho, germe,oliva, óleos de mamona e gergelim), glicerol, álcooltetraidrofuril, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxode sorbitan, e misturas desses.

Além dos diluentes inertes, as composições oraistambém podem incluir adjuvantes, tais como, agentesumectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, adoçante,flavorizante, corante, agentes de perfume e conservantes.

As suspensões, além dos compostos ativos, podemconter agentes de suspensão como, por exemplo, álcooisisoestearílico etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteresde sorbitan, celulose microcristalina, metaidróxido dealumínio, bentonita, agar e tragacanto e misturas desses.As formulações das composições farmacêuticas dainvenção para administração retal ou vaginal podem serapresentadas como um supositório, que podem ser preparado aomisturar um ou mais compostos da invenção com um ou maisexcipientes ou veículos não-irritantes adequados quecompreendem, por exemplo, manteiga de cacau, polietilenoglicol, uma cera ou salicilato, e que é sólido emtemperatura ambiente, porém líquido em temperatura corporale, portanto, irá derreter na cavidade retal ou vaginal eliberar os agentes.

As formulações da presente invenção que sãoadequadas para administração vaginal também incluem pessários,tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações emspray que contêm tais veículos como conhecido na técnica queserá apropriada.

As formas de dosagem para a administração tópicaou transdérmica de um composto dessa invenção incluem pós,sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções,adesivos e inalantes. O composto ativo pode ser misturadosob condições estéreis com um veículo farmaceuticamenteaceitável, e com qualquer conservante, tampão, ou propelenteque pode ser requerido.

As pomadas, pastas, cremes e géis podem conter,além de um composto ativo dessa invenção, excipientes, taiscomo, gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas,amido, tragacanto, derivados de celulose, polietilenoglicóis, silicones, bentonitas, ácido silícico, talco eóxido de zinco ou misturas desses.Os pós e sprays podem conter, além de um compostodessa invenção, excipientes, tais como, lactose, talco,ácido silicico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio epó de poliamida, ou misturas dessas substâncias. Os sprayspodem conter adicionalmente propelentes comuns, tais como,clorofluoroidrocarbonetos e hidrocarbonetos não-substituidosvoláteis, tais como, butano e propano.

Os adesivos transdérmicos possuem a vantagemadicional de proporcionar entrega controlada de um compostoda presente invenção ao corpo. Tais formas de dosagem podemser feitas ao dissolver ou dispersar os agentes no meioapropriado. Os intensificadores de absorção também podem serusados para aumentar o fluxo dos agentes através de matança.A taxa de tal fluxo pode ser controlada tanto ao proporcio-nar uma taxa de controle de membrana ou ao dispersar ocomposto em uma matriz polimérica ou gel.

As formulações oftálmicas, pomadas oculares, pós,soluções e similares, também são contempladas dentro doescopo dessa invenção.

As composições farmacêuticas dessa invençãoadequadas para administração parenteral compreendem um oumais compostos da invenção em combinação com uma ou maissoluções, dispersões, suspensões ou emulsões, ou pósestéreis aquosos ou não-aquosos isotônicos estéreis farma-ceuticamente aceitáveis que podem ser reconstituídos emsoluções ou dispersões injetáveis estéreis antes do uso,essas podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos,solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue doreceptor destinado ou agentes de suspensão ou espessantes.

Exemplos de veículos aquosos e não-aquososadequados que podem ser empregados nas composiçõesfarmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis(tais como, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol,e similares), e misturas adequadas desses, óleos vegetais,tais como, óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis,tais como, oleato de etila. A fluidez apropriada pode sermantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento,tal como, lecitina, pela manutenção do tamanho de partícularequerido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.

Essas composições também podem conter adjuvantes,tais como, conservantes, agentes umectantes, agentesemulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da açãode microorganismos pode ser garantida pela inclusão devários agentes bactericidas e fungicidas, por exemplo,parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares.

Também pode ser desejado incluir agentes isotônicos, taiscomo, açúcares, cloreto de sódio, e similares nascomposições. Ademais, a absorção prolongada da formafarmacêutica injetável pode ser ocasionada pela inclusão deagentes que atrasam a absorção, tais como, monoestearato dealumínio e gelatina.

Em alguns casos, para prolongar o efeito de umagente, é desejado retardar a absorção do agente da injeçãosubcutânea ou intramuscular. Isso pode ser realizado pelouso de uma suspensão líquida de material cristalino ouamorfo que possui solubilidade em água insatisfatória. Ataxa de absorção do agente depende, então, de sua taxa dedissolução, que, sucessivamente, pode depender do tamanho docristal e forma cristalina. Alternativamente, a absorçãoretardada de um agente parenteralmente administrado érealizada ao dissolver ou suspender o agente em um veiculo oleoso.

As formas de depósito injetáveis são feitas aoformar matrizes microencapsuladas dos compostos em questãoem polímeros biodegradáveis, tais como, polilactida-poliglicolida. Dependendo da razão de agente para polímero,e da natureza do polímero particular empregado, a taxa deliberação de agente pode ser controlada. Exemplos de outrospolímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) epoli(anidridos). As formulações injetáveis também sãopreparadas ao capturar o agente em lipossomas ou micro-emulsões que são compatíveis com o tecido corporal.

Quando os compostos da presente invenção foremadministrados como composições farmacêuticas, em humanos eanimais, esses podem ser administrados pro si mesmos ou comouma composição farmacêutica que contém, por exemplo, 0,1 a99,5% (com mais preferência, 0,5 a 90%) de ingrediente ativoem combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Além das composições descritas acima, pode-sefazer uso de coberturas, por exemplo, emplastros, bandagens,curativos, gazes e similares, que contêm uma quantidadeapropriada de uma composição terapêutica. Como descrito emdetalhe acima, as composições terapêuticas podem seradministradas/entregues em hastes, dispositivos, próteses eimplantes.

A amostra de tecido para análise é tipicamentesangue, plasma, soro, fluido mucoso ou fluido cérebro-espinhal do paciente. A amostra é analisada, por exemplo, emniveis e perfis de anticorpos no peptideo RAGE, por exemplo,níveis ou perfis de anticorpos humanizados. Os métodos ELISApara detectar anticorpos específicos ao RAGE são descritos nos Exemplos.

O perfil de anticorpo após a imunização passivamostra tipicamente um pico imediato em concentração deanticorpo seguido por um declínio exponencial. Sem umadosagem adicional, o declínio se aproxima dos níveis de pré-tratamento dentro de um período de dias a meses dependendoda meia-vida do anticorpo administrado.

Em alguns métodos, uma medida de linha de base deanticorpo a RAGE no paciente é feita antes da administração,uma segunda medida é feita logo depois para determinar onível máximo de anticorpo, e uma ou mais medidas adicionaissão feitas em intervalos para monitorar o declínio dosníveis de anticorpo. Quando o nível de anticorpo cair para alinha de base ou uma porcentagem predeterminada da linha debase com pico inferior (por exemplo, 50%, 25% ou 10%), aadministração de uma dosagem adicional de anticorpo éadministrada. Em alguns métodos, o pico ou níveissubseqüentes medidos menos o anterior são comparados comníveis de referência anteriormente determinados paraconstituir um regime de tratamento profilático ou terapêuticobenéfico em outros pacientes. Se o nivel de anticorpo medidofor significativamente menor do que um nível de referência(por exemplo, menor que a média menos um desvio padrão dovalor de referência na população de pacientes que sebeneficiam do tratamento) a administração de uma dosagemadicional de anticorpo é indicada.

EXEMPLOS

A invenção será descrita agora de forma geral,essa será mais facilmente entendida a título de referênciaaos seguintes exemplos, que estão incluídos meramente parapropósitos ilustrativos de certos aspectos e modalidades dapresente invenção, e não pretendem limitar a invenção.

Exemplo 1

Preparação de Construções RAGE

As seqüências de aminoácido de RAGE murídeo(mRAGE, número de acesso no Genbank NP_031451; SEQ ID NO: 3)e RAGE humano (hRAGE, número de acesso no NP_00127.1; SEQ IDNO: 1) são mostradas na Figura Ia a IC. Os cDNAs decomprimento total que codificam mRAGE (número de acessoNM_007425.1; SEQ ID NO: 4) e hRAGE (número de acessoNM_0 01136; SEQ ID NO: 2) foram inseridos no vetor deexpressão Adoril-2, que compreende um promotor decitomegalovírus (CMV) que aciona a expressão das seqüênciasde cDNA, e contém elementos adenovírus para geração devírus. Uma proteína de fusão de RAGE-Fc humano formada aoligar os aminoácidos 1-34 4 do RAGE humano ao domínio Fc deIgG humana foi preparada ao expressar uma construção de DNAque codifica a proteína de fusão em células cultivadasutilizando o vetor de expressão Adori. Uma proteína de fusãode região V de RAGE humano formada ao ligar os aminoácidos1-118 de RAGE humano ao domínio Fc de IgG humana foisimilarmente preparada. As proteínas de fusão de marcadorstrep RAGE humano e murídeo formadas ao ligar uma seqüênciade marcador de estreptavidina (strep) (WSHPQFEK) (SEQ ID NO:5) aos aminoácidos 1-344 de RAGE humano ou murídeo,respectivamente, foram preparadas ao expressar construçõesde DNA que codificam as proteínas de fusão de marcador strepRAGE, que também utilizam vetores de expressão Adori. Todasas construções foram verificadas por análises de digestão derestrição abrangentes de insertos de cDNA dentro dosplasmídeos.

O adenovírus recombinante (Ad5 Ela/E3 deletado)que expressa o RAGE de comprimento total, hRAGE-Fc, e hRAGEV de domínio Fc foram gerados por recombinação homóloga emuma linhagem celular de rim embrionário 293 (HEK293) (ATCC,Rockland MD) . O vírus adenovírus recombinante foi isolado esubseqüentemente amplificado em células HEK293. O vírus foiliberado das células HEK293 infectadas por três ciclos decongelamento e descongelamento. O vírus foi adicionalmentepurificado por dois gradientes de centrifugação de cloretode césio e dialisado contra salina tamponada com fosfato(PBS) pH 7,2 a 4°C. Após a diálise, glicerol foi adicionadoa uma concentração de 10% e o vírus foi armazenado a -80°Caté o uso. As construções virais foram caracterizadas parainfecciosidade (unidades de formação de placa em células293), análise de PCR do vírus, análise de seqüência daregião de codificação, expressão do transgene, e medidas deendotoxina.

Os vetores de expressão Adori contendo DNA quecodifica RAGE-Fc humano, RAGE-V de região-Fc humano, e asproteínas de fusão de marcador strep de RAGE humano emurídeo foram transfectadas de forma estável em célulasovarianas de hamster chinês (CHO) utilizando lipofectina(Invitrogen). Os transfectantes estáveis foram selecionadosem 20 nM e 50 nM de metotrexato. Os meios condicionadosforam colhidos de clones individuais e analisados com o usode eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) e Western blotting paraconfirmar a expressão de RAGE. (Kaufman, R.J., 1990, Methodsin Enzymology, 185:537-66; Kaufman, R.J., 1990, Methods inEnzymology, 185:487-511; Pittman, D.D. et al., 1993, Methodsin Enzymology, 222: 236-237).

As células CHO ou HEK 293 transduzidas queexpressam as proteínas de fusão RAGE solúveis foramcultivadas para colher um meio condicionado para purificaçãode proteína. As proteínas foram purificadas com o uso demétodos de marcação por afinidade indicados. As proteínaspurificadas foram submetidas à redução de SDS-PAGE não-redutora, visualizadas por coloração com Coomassie Blue(Protocolos Atuais em Protein Sciences, Wiley Interscience),e se apresentaram nos pesos moleculares esperados.

Exemplo 2

Geração de anticorpos monoclonais anti-RAGE murídeosOs camundongos BALB/c de 6 a 8 semanas de idade (CharlesRiver, Andover, MA) foram imunizados de forma subcutânea como uso de um dispositivo GeneGun (BioRad, Hercules, CA). Ovetor de expressão pAdori contendo cDNA que codifica RAGEhumano de comprimento total foi pré-absorvido nas partículasde ouro coloidais (BioRad, Hercules, CA) antes daadministração subcutânea. Os camundongos foram imunizadoscom 3 ug de vetor duas vezes por semana, durante duassemanas. Os camundongos foram sangrados uma semana após aúltima imunização e os títulos de anticorpos foramavaliados. 0 camundongo com maior título de anticorpo RAGErecebeu uma injeção adicional de 10 pg de proteína strep deRAGE humana recombinante três dias antes de fusão celular.

Os esplenócitos foram misturados com células demieIoma do camundongo P3X63Ag8.653 (ATCC, Rockville, MD) emuma razão de 4:1 utilizando 50% de polietileno glicol (MW1500) (Roche Diagnostics Corp, Mannheim, Germany). Após afusão, as células foram semeadas e cultivadas em placas de96 poços em 1 χ IO5 células/poço no meio de seleçãoRPMI1640, contendo 20% de FBS, 5% de Origen (IGENInternational Inc. Gaithersburg, MD), 2 mM de L-glutamina,100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 10 mMde HEPES e Ix hipoxantina-aminopterina-timidina (Sigma, St.Louis, MO).

Exemplo 3

Geração de anticorpos monoclonais anti-RAGE de ratos

Os ratos LOU (Harlan, Harlan, MA) foram imunizadosde forma subcutânea com o uso de um GeneGun (BioRad,Hercules, CA). O vetor de expressão pAdori contendo cDNA quecodifica o RAGE murídeo de comprimento total foi pré-absorvido em partículas de ouro coloidais (BioRad, Hercules,CA) antes da administração subcutânea. Os ratos foramimunizados com 3 ug de vetor uma vez a cada duas semanas,quatro vezes. Os ratos foram sangrados uma semana após aúltima imunização e os títulos de anticorpo foram avaliados.O rato com maior título de anticorpo RAGE recebeu umainjeção adicional de 10 pg de proteína strep de RAGE murídeorecombinante três dias antes da fusão celular.

Os esplenócitos foram misturados com células demieIoma do camundongo P3X63Ag8.653 (ATCC, Rockville, MD) emuma razão de 4:1 utilizando 50% de polietileno glicol (MW1500) (Roche Diagnostics Corp, Mannheim, Germany). Após afusão, as células foram semeadas e cultivadas em placas de96 poços em 1 χ IO5 células/poço no meio de seleçãoRPMI1640, contendo 20% de FBS, 5% de Origen (IGENInternational Inc. Gaithersburg MD), 2 mM de L-glutamina,100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 10 mMde HEPES e Ix de hipoxantina-aminopterina-timidina (Sigma,St. Louis, MO).

Exemplo 4

Triagem de hibridoma

Os painéis de RAGE anti-murídeo de rato e RAGE dernAbs anti-humanos murídeo foram gerados por imunização porcDNA utilizando GeneGun, e os plasmídeos de expressão Adorique expressam a região de codificação de comprimento totalde RAGE murídeo ou humano. Os sobrenadantes de hibridomaforam avaliados para ligação a RAGE-Fc humano ou murideorecombinante por ELISA e por análise FACS em células do rimembriônico humanas (HEK-293) que expressam transitoriamenteRAGE. Os sobrenadantes positivos foram adicionalmentetestados por sua capacidade de neutralizar RAGE que se ligaao ligante HMGBl. Sete anticorpos monoclonais de rato (sérieXT-M) e sete anticorpos monoclonais de camundongo (série XT-H) foram identificados. Os hibridomas selecionados foramsubclonados quatro vezes por diluição serial e uma vez porseleção FACS. Os meios condicionados foram colhidos dasculturas de hibridoma estáveis e as imunoglobulinas forampurificadas utilizando as colunas de purificação deanticorpo utilizando a Proteína A (Millipore Billerica, MA).A classe de Ig de cada mAb foi determinada com um kit deisotipagem de mAb de camundongo ou kit de isotipagem de mAbde rato como indicado (IsoStrip; Boehringer Mannheim Corp.).Os isotipos dos anticorpos monoclonais de rato e camundongoselecionados são apresentados na Tabela 1 (abaixo).

TABELA 1

<table>table see original document page 134</column></row><table>Exemplo 5

Análise FACS

As células 293 humanas foram infectadas com oadenovirus de RAGE humano e murideo. As células infectadasforam suspensas em PBS contendo 1% de BSA em uma densidadede 4 χ IO4 células/ml. As células foram incubadas com 100 ulde amostra (soro imune diluído, sobrenadantes de hibridomaou anticorpos purificados) durante 30 min a 4 °C. Após alavagem, as células foram incubadas com cabra marcada comPE, anti-camundongo, IgG, F(ab')2 (DAKO CorporationGlostrupDenmark) durante 30 min a 4°C no escuro. Os sinaisde fluorescência associados com a célula foram medidos porum citofluorômetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson)utilizando 5000 células por tratamento. 0 iodeto de propídiofoi usado para identificar células mortas, que foramexcluídas da análise. Os sete anticorpos monoclonaismurídeos XT-Hl a XT-H7 e os sete anticorpos monoclonais derato XT-Ml a XT-M7 foram mostrados por análise FACS para seligarem ao hRAGE da superfície celular (Tabela 2).

Exemplo 6

Análise de Ligação ELISA

Os anticorpos foram purificados a partir desobrenadantes de hibridoma utilizando procedimentos padrão.Os anticorpos purificados foram avaliados para ligação aformas solúveis de RAGE com o uso de ELISA. As placas denoventa e seis poços (Corning, Corning, NY) foram cobertascom 100 ul de RAGE-Fc humano recombinante ou RAGE V-região-Fc humano recombinante (1 pg/ml) e incubadas durante a noitea 40C. Após a lavagem e bloqueio com PBS contendo 1% de BSAe 0,05% de Tween-20, 100 ul da amostra (as amostras seapresentaram de diversas formas: soro imune diluído,sobrenadantes de hibridoma, ou anticorpos purificados, comoindicado) foram adicionados e incubados durante 1 hora emtemperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS, pH7,2 e os anticorpos anti-RAGE ligados foram detectados com ouso de cabra conjugada por peroxidase, IgG anti-camundongo(H+L) (IgG) (Pierce, Rockford, IL) seguidos por incubaçãocom o substrato TMB (BioFX Laboratories Owings Mills, MDLaboratories).

Os valores de absorbância foram determinadosa 450 nm em um espectrofotômetro. As concentrações deanticorpos monoclonais foram determinadas com o uso de cabramarcada por peroxidase, IgG anti-camundongo (Fcy) (PierceRockford, IL) e uma curva padrão foi gerada por um IgG decamundongo combinado com isotipo purificado. Os resultadosdo teste ELISA sobre as capacidades de os sete anticorposmurídeos XT-Hl a XT-H7 e os sete anticorpos de rato XT-Ml aXT-M7 se ligarem a hRAGE-Fc, hRAGE V-região-Fc, mRAGE-Fc, emRAGE-strep, estão resumidos na Tabela 2. Como mostrado nasFiguras 2 e 3, o anticorpo de rato XT-M4 e anticorpo murídeoXT-H2 se ligam a RAGE-Fc humano e ao domínio-V de hRAGE. Osvalores EC50 da ligação de XT-M4 a RAGE humano e ao domínio-V de RAGE humano foram 300 pM e 100 pM, respectivamente. Osvalores EC50 da ligação de XT-H2 a RAGE humano e domínio-Vde RAGE humano foram 90 pM e 100 pM, respectivamente.TABELA 2

<table>table see original document page 137</column></row><table>

Exemplo 7

Análises de ligação ELISA por competição de ligante RAGE eanticorpo

Para determinar se os anticorpos monoclonais RAGEafetam a ligação de um ligante RAGE (HMGBl; Sigma, St.Louis, MO) ao RAGE, análises de ligação ELISA por competiçãoforam realizadas. As placas de noventa e seis poços foramcobertas com 1 μg/ml de HMGBl durante a noite a 4°C. Ospoços foram lavados e bloqueados como descrito acima eexpostos a 100 μl de misturas pré-incubadas de RAGE-Fc ouTrkB-Fc (um controle Fc não-especifica), em 0,1 pg/ml, maisdiversas formas da preparação de anticorpo indicada(diluições de soro imune, sobrenadantes de hibridoma ouanticorpos purificados) durante 1 hora em temperaturaambiente. As placas foram lavadas com PBS, pH 7,2 e o RAGE-Fc humano recombinante ligado por ligante foi detectado como uso de cabra conjugada por peroxidase, IgG anti-humana(Fcy) (Pierce, Rockford, IL), seguido por incubação com osubstrato TMB (B i o FX Laboratories Owings Mills, MDLaboratories Owings Mills, MD). A ligação de RAGE-Fc humanorecombinante ao ligante sem quaisquer anticorpos ou com soropré-imune diluído foi usada como um controle e definida como100% de ligação. As capacidades de os setes anticorposmurídeos XT-Hl a XT-H7 e os sete anticorpos de rato XT-Ml aXT-M7 bloquear a ligação de HMGBl ao h RAGE-Fc comodeterminado pela análise de ligação ELISA por competição sãomostradas na Tabela 3. A Tabela 3 também resume ascapacidades de os anticorpos murídeos XT-H1, XT-H2, e XT-H5bloquear a ligação ao RAGE de um ligante diferente de hRAGE,peptídeo β amilóide 1-42, e as capacidades de os anticorposde rato XT-Ml a XT-M7 bloquear a ligação de HMGBl ao RAGE-Fcmurídeo, como determinado por análises de ligação ELISA porcompetição similares. Como mostrado na Figura 4, o anticorpode rato XT-M4 e anticorpo murídeo XT-H2 bloqueiam a ligaçãode HMGBl ao RAGE humano.

TABELA 3

<table>table see original document page 138</column></row><table>TABELA 3 (continuação)

<table>table see original document page 139</column></row><table>

Uma abordagem competitiva similar foi usada paradeterminar as epitopes de ligação relativas entre os paresde anticorpos. Primeiro, 1 μς/πιΐ de RAGE-Fc recombinantehumano foi revestido em placas com noventa e seis cavidadesde um dia para o outro a 4 °C. Após a lavagem e o bloqueio(vide acima) as cavidades foram expostas a 100 μΐ demisturas pré-incubadas de anticorpo alvo biotinilado ediluições de um anticorpo concorrente durante 1 hora àtemperatura ambiente. O anticorpo biotinilado ligado foidetectado usando estreptavidina conjugada com peroxidase(Pierce, uma abordagem competitiva similar foi usada paradeterminar os -epitopes de ligação relativos entre os paresde anticorpos. Primeiro, 1 μς/πιΐ de RAGE-Fc recombinantehumano foi revestido em placas com noventa e seis cavidadesde um dia para o outro at 4°C. Após a lavagem e o bloqueio(vide acima) as cavidades foram expostas a 100 μl demisturas pré-incubadas de anticorpo alvo biotinilado ediluições de um anticorpo concorrente durante 1 hora àtemperatura ambiente. O anticorpo biotinilado ligado foidetectado usando estreptavidina conjugada com peroxidase(Pierce, Rockford, IL) seguido pela incubação com osubstrato TMB (BioFX Laboratories Owings Mills, MDLaboratories). A ligação de anticorpo biotinilado ao RAGE-Fcrecombinante humano sem quaisquer anticorpos concorrentesfoi usada como um controle e definida como 100%. Osresultados de ensaio de ligação de ELISA por competição queanalisa a competição entre anticorpos de rato e murideo paraligação ao hRAGE são mostrados na Tabela 3. A Figura 5apresenta um gráfico de um dado de ensaio de ligação deELISA por competição que analisa a competição entreanticorpos de rato XT-M4 e XT-H1, XT-H2, XT-H5, XT-M2, XT-M4, XT-M6 e XT-M7 para ligação ao hRAGE. Os dados de ligaçãode ELISA por competição mostrados na Figura 5 demonstram queXT-M4 e XT-H2 se ligam aos locais sobrepostos ao RAGEhumano.

Exemplo 8

Ensaios de ligação BIACORE™ de anticorpos anti-RAGE emmurideo e rato ao RAGE-Fc em humano e murideoA. Ligação ao RAGE em humano e murideoA ligação de anticorpos anti-RAGE selecionados demurideo e rato ao RAGE em humano e murideo e aos domínios Vde RAGE em humano e murideo foi analisada pelo ensaio deligação direta BIACORE®. Os ensaios foram realizados usandoRAGE-Fc em humano e murideo revestido com um chip CM5 emalta densidade (2000 RU) que usa acoplamento de amina padrão.A solução dos anticorpos anti-RAGE em duas concentrações, 50e 100 nm, foi realizada sobre as proteínas de RAGE-Fcmobilizadas em duplicata. A tecnologia BIACORE™ utilizaalterações no índice refrativo na camada de superfíciemediante a ligação dos anticorpos anti-RAGE ao antígeno RAGEimobilizado. A ligação é detectada pela ressonância deplásmon de superfície (SPR) de luz a laser que refrata apartir da superfície. Os resultados dos ensaios de ligaçãodireta BIACORE™ são resumidos na Tabela 4.

TABELA 4

<table>table see original document page 141</column></row><table>

As constantes de taxa cinética (ka e kd) e asconstantes de associação e dissociação (Ka e Ka) para aligação de anticorpos anti-RAGE em murideo e rato ao RAGE emhumanos e murideo foram determinadas pela ensaio de ligaçãodireta BIACORE™. A análise dos dados de cinética de sinalpara a taxa sobre a alíquota e a taxa fora da alíquotapermite a discriminação entre interações não especificas eespecificas. As constantes de taxa cinética e constantes deequilíbrio determinadas pelo ensaio de ligação diretaBIAÇORE™ para a ligação do anticorpo XT-H2 em murídeo e doanticorpo XT-M4 em rato ao hRAGE-Fc são mostradas na Tabela 5.

TABELA 5

<table>table see original document page 142</column></row><table>

B. Ligação ao domínio V de RAGE em humanos

As constantes de taxa cinética e constantes deassociação e dissociação para a ligação de anticorpos anti-RAGE em murídeo e rato ao domínio V de RAGE em humanostambém foram determinadas pelo ensaio de ligação diretaBIACORE™. 0 domínio V de RAGE-Fc em humanos foi capturadopor anticorpos anti-humanos Fc revestidos em um chip CM5 eos ensaios de ligação direta BIACORE™ da ligação deanticorpos anti-RAGE em murídeo e rato ao domínio V dehRAGE-Fc imobilizado foram realizados conforme descritoacima para os ensaios de ligação para RAGE-Fc de comprimentocompleto.

Exemplo 9

Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis deanticorpo anti-RAGEAs seqüências de DNA que codificam as regiõesvariáveis de cadeia leve e pesada de anticorpos anti-RAGE emmurideo XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5 e XT-H7, e de anticorpoanti-RAGE em rato XT-M4 foram clonadas e seqüenciadas, e asseqüências de aminoácidos das regiões variáveis foramdeterminadas. As seqüências de aminoácidos alinhadas dasregiões variáveis de cadeia pesada destes seis anticorpossão mostradas na Figura 6 e as seqüências de aminoácidosalinhadas das regiões variáveis de cadeia leve são mostradas na Figura 7.

Exemplo 10

Isolamento de seqüências de Cdna de coelho, babuino emacaco-caranguejeiro que codificam RAGEAs seqüências de cDNA que codificam RAGE foramisoladas e clonadas usando métodos de reação de cadeiatranscrição-polimerase inversa padrão (RT-PCR). O RNA foiextraído e purificado a partir do tecido pulmonar que usaTrizol (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA) através do protocolodo fabricante. 0 mRNA foi transcrito inverso para gerar cDNAque usa o Reagente de Transcrição Inversa TaqMan (RocheApplied Science Indianapolis, IN) e o protocolo dofabricante. As seqüências de RAGE em macaco-caranguejeiro(Macaca fascicularis) e babuino (Papio cyanocephalus) foramampliadas a partir do cDNA que usa polimerase de DNAInvitrogen Taq (Invitrogen, Carlsbad CA) e protocolo eoligonucleotídeos (5'-GACCCTGGAAGGAAGCAGGATG (SEQ ID NO: 59)e 5'-GGATCTGTCTGTGGGCCCCTCAAGGCC) (SEQ ID NO: 60) queadicionam locais de restrição de SpeI e EcoRV. Os produtosde ampliação PCR foram digeridos com SpeI/EcoRV e clonadosnos locais correspondentes no plasmideo pAdoril-3. O RAGE emcoelho foi clonado usando RT-PCR, conforme descrito acima,que usa os oligonucleotideos: 5'-ACTAGACTAGTCGGACCATGGCAGCAGGGGCAGCGGCCGGA (SEQ ID NO: 61) e 5' -ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCAGGGCTCTCCTGTACCGCTCTC (SEQ ID NO: 62) que adicionamlocais de SpeI e NotI, e clonados nos locais correspondentesno pAdoril-3. As seqüências de nucleotideos das seqüênciasde cDNA clonadas que codificam o RAGE em babuino, macaco eduas isoformas de coelho nos plasmideos resultantes foramdeterminadas. A seqüência de nucleotideo que codifica o RAGEem babuino é mostrada na Figura 8 (SEQ ID NO: 6), e aseqüência de nucleotideo que codifica o RAGE em macaco-caranguejeiro é mostrada na Figura 9 (SEQ ID NO: 8) . Asseqüências de nucleotideos que codificam duas isoformas deRAGE em coelho são mostradas na Figura 10 (SEQ ID NO: 10) ena Figura 11 (SEQ ID NO:12).

Exemplo 11

Isolamento de uma seqüência genômica do DNA que codifica oRAGE em babuino

Uma seqüência genômica do DNA de babuino quecodifica o RAGE foi isolada usando as técnicas de clonagemgenômica padrão (por exemplo, vide Sambrook, J. et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NovaYork). Uma biblioteca genômica lambda de babuino (Papiocyanocephalus) (Stratagene, La Jolla, CA) no vetor DASH IILambda foi visualizada usando RAGE cDNA humano com primeraleatório 32P. As placas bacteriófagas positivas foramisoladas e submetidas a duas séries de visualizaçãoadicionais para obter isolados únicos. O DNA Lambda foipreparado, digerido com NotI e o tamanho fracionados parainserir separadamente o DNA de suportes genômicos de Lambda,que usa o procedimento comum. Os fragmentos NotI foramligados ao pBluescript SK+ digeridos com NotI e a inserçãofoi seqüenciada usando primers específicos de RAGE. O cloneque foi obtido foi designado o clone 18.2. A seqüência denucleotídeo do DNA genômico de babuíno clonado que codificaum RAGE em babuíno é mostrada nas Figuras 12A-12-E (SEQ IDNO: 15).

Exemplo 12

Anticorpo XT-M4 Quimérico

Um XT-M4 quimérico foi gerado fundindo-se asregiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpo XT-M4RAGE de cadeia leve de kappa humano e regiões constantes decadeia pesada IgGl, respectivamente. Para reduzir aatividade efetora mediada por Fc potencial do anticorpo, asmutações quiméricas L234A e G237A foram introduzidas no XT-M4 na região IgGl Fc humana. O anticorpo quimérico éfornecido pelo número de molécula XT-M4-A-1. O anticorpo XT-M4 quimérico contém 93,83% de seqüência de aminoácidoshumanos e 6,18% seqüência de aminoácidos de ratos.

Exemplo 13

Avaliar a Ligação de XT-M4 Quimérico ao RAGE

As capacidades de o anticorpo quimérico XT-M4 e osanticorpos anti-RAGE de rato e murídeo selecionados seligarem ao RAGE humano e ao RAGE de outras espécies, e debloquear a ligação de ligantes de RAGE foram medidas porensaios de ligação de ELISA e BIAÇORE™.

A. Ligação ao RAGE de humanos solúvel medida porensaio de ligação BIAÇORE™

A ligação de anticorpo quimérico XT-M4, doanticorpo XT-M4 de rato parental e anticorpos XT-H2 e XT-H5murideo ao RAGE humano solúvel (hRAGE-SA) foi medido porensaio de ligação de captura BIACORE™. Os ensaios foramrealizados por anticorpos de revestimento sobre um chip CM5BIA com 5000-7000 RU. As soluções de um RAGE marcado comestreptavidina humana solúvel purificada (hRAGE-SA) emconcentrações de 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM,3,12 nM, 1,56 nM e 0 nM foram escoadas ao longo deanticorpos imobilizados em triplo e as constantes de taxacinética (ka e kd) e as constantes de associação edissociação (Ka e Kd) para ligação ao hRAGE-SA foramdeterminadas. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

TABELA 6

<table>table see original document page 146</column></row><table>

O anticorpo XT-M4 e o anticorpo quimérico XT-M4 seligam ao RAGE humano solúvel monomérico com cinética similar.A afinidade de XT-M4 quimérico para o RAGE monoméricosolúvel humano é de aproximadamente 5,5 nM.

B. Ensaio de Ligação de ELISA por Competição deLigante RAGE

As capacidades de o anticorpo quimérico XT-M4 e oanticorpo XT-M4 de rato bloquearem a ligação de ligantesRAGE HMGBl, peptídeo β 1-42 amilóide, SlOO-A e S100-B aohRAGE-Fc foram determinadas pelo ensaio de ligação de ELISApor competição de ligante, conforme descrito no Exemplo 7.

Conforme mostrado na Figura 13, o anticorpo quimérico XT-M4e XT-M4 são quase idênticos em suas capacidades debloquearem a ligação de HMGB1, peptideo β 1-42 amilóide,S100-A e SlOO-B ao RAGE humano.

C. Ensaio de Ligação de ELISA por Competição de

Anticorpo

A capacidade de o anticorpo quimérico XT-M4competir com o anticorpo XT-M4 de rato e o anticorpo XT-H2de murideo na ligação ao hRAGE-Fc foi determinada peloensaio de ligação de ELISA por competição d anticorpo,usando os anticorpos XT-M4 e XT-H2 ligados por biotina, damaneira descrita no Exemplo 7. Conforme mostrado na Figura14, o anticorpo quimérico XT-M4 compete com o anticorpo XT-M4 de rato e com o anticorpo XT-H2 de murideo na ligação aohRAGE-Fc.

Exemplo 14

Ligação de anticorpo ao RAGE de diferentes espécies foimedida por ELISA à base de célula

Transfecção de célulaAs células renais embriônicas humanas 293(American Tissue Type Culture, Manassas, VA) foramrevestidas em células de 5 χ IO6 por placa de cultura detecido com 10 cm2 e cultivadas de um dia para o outro a37°C. No dia seguinte as células foram transfectadas complasmideos de expressão RAGE (vetor pAdoril-3 que codificaRAGE em camundongo, humano, babuino, macaco-caranguejeiro oucoelho) usando o reagente LF2000 (Invitrogen, Carlsbad CA)em uma razão de reagente de 4:1 em DNA de plasmideo que usaos protocolos dos fabricantes. As células foram colhidas 48horas pós-transfecção usando tripsina, lavadas uma vez comfosfato tamponado salino (PBS), então, suspensas em meio decrescimento sem soro em uma concentração de 2 χ 10^6células/ml.

ELISA à base de célula

Os anticorpos primários em 1 μς/ml foram diluídosem série em 1:2 ou 1:3 em PBS que contém 1% de albumina desoro bovino (BSA) em uma placa com 96 cavidades. As célulasRAGE transfectadas 293 ou as células de controle parental293 (50 μΐ) com 2 χ 10^6 célula s/ml em meio de crescimentoisento de soro foram adicionadas à placa com 96 cavidades defundo em U para uma concentração final de 1 χ 10^5células/cavidade. As células foram centrifugadas a 1600 rpmdurante 2 minutos. Os sobrenadantes foram delicadamentedescartados com a mão com uma oscilação descartável e aplaca foi gentilmente batida para perder o pélete de célula.Os anticorpos anti-RAGE primários diluídos ou anticorpos decontrole de combinação de isotipo (100 μl) em PBS frio quecontém 10% de soro fetal de bezerro (FCS) foram adicionadosàs células e incubados em gelo durante 1 hora. As célulasforam manchadas com 100 μΐ conjugados de HRP de anticorpoanti-IgG secundário diluído (Pierce Biotechnology, Rockford,IL) em gelo durante 1 hora. Após cada etapa de incubação deanticorpo primário e anticorpo secundário, as células foramlavadas 3 vezes com PBS gelado. 100 μΐ de componente desubstrato TMBl (BI0 FX, TMBW -0100-01) foram adicionados àplaca e incubados por 5-30 minutos à temperatura ambiente. 0desenvolvimento de cor foi interrompido adicionando-se 100μl de H2SO4 0,18M. As células foram centrifugadas e ossobrenadantes transferidos para uma placa sem uso prévio elidas a 450 nm (Soft MAX pro 4.0, Molecular DevicesCorporation, Sunnyvale, CA).

As capacidades de os anticorpos quiméricos XT-M4 eXT-M4 se ligarem ao RAGE humano & babuíno, conformedeterminado por ELISA à base de célula são mostradas naFigura 14. Os valores EC50 para a ligação de anticorpoquimérico XT-M4 e XT-M4 ao RAGE de superfície célula humana,de babuíno, macaco, camundongo & coelho expressos porcélulas 293, conforme determinado por ELISA à base decélula, são mostrados na Tabela 7.

TABELA 7 Valores EC50 para ligação ao RAGE determinado por ELISA à base de célula

<table>table see original document page 149</column></row><table>TABELA 7 (continuação)

<table>table see original document page 150</column></row><table>

Exemplo 15

Ligação ao RAGE de diferentes espécies - determinada porcoloração imunoistoquímica

As capacidades de o anticorpo quimérico XT-M4, oanticorpo XT-M4 de rato e os anticorpos XT-H1, XT-H2 e XT-H5de murideo se ligarem ao RAGE de superfície célula endógenano tecido pulmonar de humano, macaco-caranguejeiro, babuínoe coelho foram determinadas por coloração imunoistoquímica(IHC) de cortes de tecido pulmonar.

As células de ovário de hamster chinês estavelmentetransfectadas (CHO) foram criadas para expressar asproteínas de comprimento total de RAGE em murideo e humano.Os cDNAs RAGE de murideo e humano foram clonados no vetor deexpressão de mamífero, linearizados e transfectados emcélulas CHO que usam lipofectina (Kaufman, R.J., 1990,Methods in Enzymology 185:537-66; Kaufman, R.J., 1990,Methods in Enzymology 185:487-511; Pittman, D. D. et al.,1993, Methods in Enzymology 222: 236). As células foramadicionalmente selecionadas em 20 nM de metotrexato e osextratos de célula foram colhidos a partir de clonesindividuais e analisados por eletroforese em gel de dodecilsulfato-poliacrilamida de sódio SDS (SDS-PAGE) e pelo métodoWestern blotting para confirmar a expressão.

A imunoistoquímica para tecidos pulmonares RAGEisolados de células de babuino, macaco-caranguejeiro, coelho ou de ovários de haraster chinês que sobre-expressam o FlAGEhumano ou as células CHO de controle foram realizadas usandotécnicas padrões. Os anticorpos RAGE e o controle de isotipoIgG2b de rato ou o controle de isotipo de camundongo foramusados em 1-15 mg. 0 XT-M4 quimérico, XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL- V2.10, XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.11, XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.14 foram biotinalizados e o anticorpo de controlebiotinalizado IgGl Sigma em 0,2, 1, 5 e 10 ug/ml foi usado.Após a detecção com HRP e Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 488ou anti-biotina conjugada com FITC, os cortes também foram manchados com 4'-6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI).

A Figura 15 mostra que o anticorpo quimérico XT-M4se liga ao RAGE nos tecidos pulmonares do macaco-carangue j eiro, coelho e babuino. Os padrões de coloração IHCpositivos são visíveis na amostras em que as células deprodução de RAGE são colocadas em contato com XT-M4quimérico, porém não em amostras nas quais o RAGE ou umanticorpo de ligação de RAGE é ausente. A Figura 16 mostraque o anticorpo XT-M4 de rato se liga ao RAGE no pulmãohumano normal e no pulmão de um humano com doença pulmonarobstrutiva crônica (COPD). A ligação de anticorpo XT-M4 derato e os anticorpos XT-Hl, XT-H2 e XT-H5 de murídeo ao RAGEde superfície de célula endógena no pulmão de babuinoséptico e no pulmão do macaco-caranguejeiro normal, conformedeterminado pela coloração de IHC de cortes de tecidopulmonar, é resumida na Tabela 8. As células CHO estáveistransfectadas com um vetor de expressão que expressa o DNAque codifica hRAGE são usadas como um controle positivo.

TABELA 8

<table>table see original document page 152</column></row><table>

Exemplo 16

Modelagem Molecular para humanizar anticorpo XT-H2 RAGEanti-humano de murideo

Modelagem Molecular de domino HV de anticorpo XT-H2 RAGEanti-humano de murideo

Os modelos de estrutura de anticorpo para modelara cadeia pesada XT-H2 de murideo foram selecionados com basena pesquisa BLASTP contra o banco de dados de seqüência doBanco de Dados de Proteína (PDB) . 0 modelo molecular de XT-H2 de murideo foi construído com base em 6 estruturas demolde, 1SY6 (anticorpo anti-CD3), IMRF (anticorpo anti-RNA)e IRIH (anticorpo anti-tumor) usando o módulo de Homologiade InsightII (Accelrys, San Diego). As regiões estruturalmenteconservadas (SCRs) dos moldes foram determinadas com base namatriz de distância Ca para cada molécula e as estruturas demoldes foram· sobrepostas com base no desvio de RMS mínimodos átomos correspondentes nos SCRs. A seqüência VH XT-H2 derato de proteína alvo foi alinhada com as seqüências dasproteínas de molde sobrepostas e as coordenadas atômicas dosSCRs foram designadas aos resíduos correspondentes daproteína alvo. Com base no grau de similaridade de seqüênciaentre o alvo e os moldes em cada um dos SCRs, as coordenadasde diferentes moldes foram usadas para diferentes SCRs. Ascoordenadas para laços e regiões variáveis não incluídas nosSCRs foram geradas por métodos de Search Loop ou GenerateLoop conforme implementados no módulo de Homologia.

Resumidamente, o método de Search Loop varre asestruturas de proteína que podem imitar a região entre 2SCRs comparando-se a matriz de distância Ca de resíduos SCRde flanco com uma matriz pré-calculada derivada dasestruturas de proteína que têm o mesmo número de resíduos deflanco e um segmento de peptídeo de intervenção com um dadocomprimento. A produção do método Search Loop foi avaliadapara encontrar primeiro uma combinação que tem desvios deRMS mínimos e identidade de seqüência máxima nos resíduos deSCR de flanco. Então, uma avaliação de similaridade deseqüência entre as combinações potenciais e a seqüência dolaço alvo foi tomada. O método Generate Loop geracoordenadas de átomo que foram usadas de novo naqueles casosonde Search Loops não encontraram combinações ótimas. Aconformação de cadeias laterais de aminoácidos foi mantida amesma que aquela no molde se o resíduo de aminoácidos foridêntico ao molde e ao alvo. Entretanto, uma pesquisaconformacional de rotâmeros foi realizada e a conformaçãoenergeticamente mais favorável foi retida para aquelesresíduos que não são idênticos ao molde e ao alvo. Paraotimizar as junções entre dois SCRs adjacentes, cujascoordenadas foram adaptadas a partir de diferentes moldes eaquelas entre os SCRs e laços, a função de Reparo de Junçãodo módulo de Homologia foi usada. O Reparo de Junçãoconfigura uma simulação de mecânica molecular para derivarcomprimentos de ligação ótimos e ângulos de ligação nasjunções entre 2 SCRs ou entre o SCR e uma região variável.Finalmente, o modelo foi submetido à minimização de energiausando o algoritmo Steepest Descent até um derivado máximo 5kcal/(mol Á) ou 500 ciclos e algoritmo de GradientesConjugados até um derivado máximo de 5 kcal/ (mol Â) ou 2000ciclos. A qualidade do modelo foi avaliada usando autilidade ProStat/Struct_Check do módulo de Homologia.Modelagem molecular de domínio HV XT-H2 anti-RAGE humanizadoUm modelo molecular da cadeia pesada XT-H2 deanticorpo anti-RAGE humanizado (CDR enxertado) foi construídocom Insight II seguindo o mesmo procedimento descrito para amodelagem da cadeia pesada de anticorpo XT H2 de camundongo,exceto pelo fato de que os moldes usados foram diferentes.Os moldes de estrutura usados neste caso foram 1L7I(anticorpo anti-Erb B2), IFGV (anticorpo anti-CD18), IJPS(anticorpo anti-fator tecidual) e 1N8Z (anticorpo anti-Her2) .Análise e previsão de modelo de humanização de mutaçõesreversas de estrutura

0 modelo de anticorpo de camundongo parental foicomparado como modelo da versão humanizada de CDR-enxertadocom relação às similaridades e diferenças em uma ou mais dasseguintes características: contatos de estrutura CDR,ligações de hidrogênio potenciais que influenciam aconformação de CDR e os desvios RMS nas diversas regiões detal estrutura 1, estrutura 2, estrutura 3, estrutura 4 e os 3 CDRs.

Previu-se que as mutações reversas seguintes demaneira única ou em combinações são importantes para ahumanização bem sucedida por enxerto de CDR: E4 6Y, R72A,N77S, N74K, R67K, K76S, A23K, F68A, R38K, A40R.

Exemplo 17

Modelagem molecular para humanizar anticorpo XT-M4 anti-RAGEem rato

Modelagem molecular de domínio HV RAGE de anticorpo XT-M4anti-murino em rato

Os moldes de estrutura de anticorpo para modelagemde cadeia pesada XT-M4 de rato foram selecionadas com basena pesquisa BLASTP contra o banco de dados de seqüência doBanco de Dados de Proteína (PDB). Os modelos moleculares deXT-M4 de rato foram construídos com base em 6 estruturas demoldes, IQKZ (anticorpo anti-peptídeo), IIGT (anticorpomonoclonal de linfoma anti-canino),.8FAB (anticorpo anti-p-azofenil arsonato), IMQK (anticorpo anti-citocromo C oxidase),1H0D (anticorpo anti-angiogenina) e IMHP (anticorpo anti-alfalbetal) que usa o módulo de Homologia de InsightII(Accelrys, San Diego). As regiões estruturalmente conservadas(SCRs) dos moldes foram determinadas com base na matriz dedistância Ca para cada molécula e as estruturas de moldesforam sobrepostas com base no desvio RMS minimo dos átomoscorrespondentes nos SCRs. A seqüência de VH XT-M4 de rato deproteína alvo foi alinhada com as seqüências das proteínasde molde sobrepostas e as coordenadas atômicas dos SCRsforam designadas aos resíduos correspondentes da proteínaalvo. Com base no grau de similaridade de seqüência entre oalvo e os moldes em cada um dos SCRs, coordenadas dediferentes moldes foram usadas para diferentes SCRs. Ascoordenadas para laços e regiões variáveis não incluídas nosSCRs foram geradas por métodos Search Loop ou Generate Loopconforme implementadas pelo módulo de Homologia.

Resumidamente, o método Search Loop varre asestruturas de proteína que podem imitar a região entre 2SCRs ao comparar a matriz de distância Ca dos resíduos SCRde flanco com uma matriz pré-calculada derivada dasestruturas de proteína que têm o mesmo número de resíduos deflanco e um segmento de peptídeo de intervenção com um dadocomprimento. A produção do método Search Loop foi avaliadapara encontrar primeiro uma combinação que tem desvios RMSmínimos e identidade de seqüência máxima nos resíduos SCR deflanco. Então, uma avaliação da similaridade de seqüênciaentre as combinações potenciais e a seqüência do laço alvoforam tomadas. O método Generate Loop gera as coordenadas deátomo que foram usadas de novo naqueles casos onde SearchLoops não encontraram combinações ótimas. A conformação decadeias laterais de aminoácidos foi mantida a mesma queaquela no molde se o resíduo de aminoácidos for idêntico aomolde e ao alvo. Entretanto, uma pesquisa conformacional derotâmeros foi realizada e a conformação energeticamente maisfavorável foi retida para aqueles resíduos que não sãoidênticos ao molde e ao alvo. Para otimizar as junções entredois SCRs adjacentes, cujas coordenadas foram adaptadas apartir de diferentes moldes e aquelas entre os SCRs e laços,a função de Reparo de Junção do módulo de Homologia foiusada. O Reparo de Junção configura uma simulação demecânica molecular para derivar comprimentos de ligaçãoótimos e ângulos de ligação nas junções entre 2 SCRs ouentre o SCR e uma região variável. Finalmente, o modelo foisubmetido à minimização de energia usando o algoritmoSteepest Descent até um derivado máximo 5 kcal/(mol Á) ou500 ciclos e algoritmo de Gradientes Conjugados até umderivado máximo de 5 kcal/(mol Â) ou 2000 ciclos. Aqualidade do modelo foi avaliada usando a utilidadeProStat/Struct_Check do módulo de Homologia.

Domínio variável de cadeia leve XT-M4

Os modelos estruturais para o domínio variável decadeia leve XT M4 foram gerados com Modeler 8v2 que usa 1K6Q(anticorpo de fator anti-tecido), 1WTL, 1D5B (anticorpo AZ-28) e IBOG (anticorpo anti-p24) como os moldes. Para cadaalvo, fora dos 100 modelos iniciais, um modelo com asviolações de restrições mais baixas, conforme definido pelafunção de densidade de probabilidade molecular, foiescolhido para a otimização adicional. Para a optimização demodelo, uma cascata de minimização de energia que consistenos métodos de Steepest Descent, Gradiente Conjugado eAdopted Basis Newton Raphson foi realizada até que umgradiente RMS de 0,01 ficar satisfeito usando o campo deforça Charmm 27 (Accelrys Software Inc.) e a solvataçãoimplícita Born Generalizada conforme implementada noDiscovery Studio 1.6 (Accelrys Software Inc.). Durante aminimização de energia, o movimento dos átomos de cadeiaprincipal foi contido usando uma restrição harmônica deforça de massa 10.

Modelagem molecular de domínio HV XT-M4 anti-RAGE humanizado

Um modelo molecular da cadeia pesada de anticorpoXT M4 anti-RAGE humanizado (CDR enxertado) foi construídocom Insight II seguindo o mesmo procedimento descrito para amodelagem de cadeia pesada de anticorpo XT M4 de rato,exceto pelo fato de que os moldes usados foram diferentes.

Os moldes de estrutura usados neste caso foram IMHP(anticorpo anti-alfalbetal), IIGT (anticorpo monoclonal delinfoma anti-canino), 8FAB (anticorpo anti-p-azofenilarsonato), IMQK (anticorpo anti-citocromo C oxidase) e 1H0D(anticorpo anti-angiogenina).

Domínio variável XT-M4 de cadeia leve humanizada

Um modelo molecular da cadeia leve de anticorpo XTM4 anti-RAGE humanizado (CDR enxertado) foi construído queusa um Modeler 8v2 seguindo o mesmo procedimento descritopara a modelagem da cadeia leve de anticorpo XT M4 de rato,exceto pelo fato de que os moldes usados foram diferentes.Os moldes de estrutura usados neste caso foram 1B6D,IFGV(anticorpo anti-CD18), 1UJ3 (anticorpo de fator anti-tecido)e IWTL como moldes.

Análise e previsão de modelo de humanização de mutaçõesreversas de estrutura

O modelo de anticorpo de rato parental foicomparado com o modelo da versão humanização enxertada comCDR com relação às similaridades e diferenças em uma ou maisdas seguintes características: contatos de estrutura CDR,ligações de hidrogênio potenciais que influenciam aconformação de CDR e os desvios RMS nas diversas regiões detal estrutura 1, estrutura 2, estrutura 3, estrutura 4 e os3 CDRs e as energias calculadas de interações de resíduo-resíduo. A(s) mutação(ões) reversa(s) potenciais identificadasforam incorporadas, de maneira única ou em combinações, emoutra série de modelos construídos usando Insight II ouModeler 8v2 e os modelos dos mutantes foram comparados com omodelo de anticorpo de rato parental para avaliar aadequabilidade de mutantes in silico.

As seguintes mutações reversas foram previstas demaneira única ou em combinações são importantes para ahumanização bem sucedida por enxerto de CDR:Cadeia pesada: L114M, T113V e A88S;Cadeia leve: K45R, L46R, L47M, D70I, G66R, T85D,Y87H, T69S, Y36F, F71Y.

Exemplo 18

Regiões variáveis humanizadas com os CDRs de anticorpos XT-H2 de murídeo e XT-M4 de ratoAs regiões variáveis de cadeia pesada humanizadasforam preparadas enxertando-se os CDRs dos anticorpos XT-H2de murideo e XT-M4 de rato nas seqüências de estrutura delinha germinativa humana mostrada na Tabela 9 e que introduzas mutações reversas selecionadas.

TABELA 9

<table>table see original document page 160</column></row><table>

As seqüências de aminoácidos de regiões variáveisde cadeia leve e pesada de XT-H2 de murideo humanizadas sãomostradas na Figura 17 (SEQ ID NOs: 28-31) e na Figura 18(SEQ ID NOs: 32-35), respectivamente.

As seqüências de aminoácidos de regiões variáveisde cadeia leve e pesada XT-M4 de rato humanizadas sãomostradas na Figura 19 (SEQ ID NOs: 36-38) e nas Figuras20A-20B (SEQ ID NOs: 39-49), respectivamente.

A seqüência de linha germinativa a partir da qualas seqüências de estrutura foram derivadas e as mutaçõesreversas especificas nas regiões variáveis humanizadas sãoidentificadas na Tabela 10.TABELA 10

<formula>formula see original document page 161</formula>

As seqüências de DNA que codificam as regiõesvariáveis humanizadas foram sub-clonadas em seqüências quecontêm vetores de expressão que codificam as regiõesconstantes de imunoglobulina humana e as seqüências de DNAque codificam as cadeias leve e pesada de comprimento totalforam expressas em células COS, que usam procedimentospadrões. Os DNAs que codificam as regiões variáveis decadeia pesada foram sub-clonados em um vetorpSMED2hIgGlm_(L234, L237)cDNA, que produz cadeias pesadas deanticorpo IgGl humanizado. Os DNAs que codificam as regiõesvariáveis de cadeia leve foram sub-clonados em um vetorpSMEN2 hkappa, que produz cadeias leves de anticorpo kappahumanizado. Consulte a Figura 21.

Exemplo 19

Protocolo de ELISA por competição

A ligação de anticorpos XT-H2 e XT-M4 humanizadose XT-M4 quimérico ao RAGE-Fc humano foi caracterizada peloensaio imunoabsorvente ligado à enzima por competição(ELISA). Para gerar um competidor, o anticorpo XT-M4 de ratoparental foi biotinilado. As placas de ELISA foram cobertasde um dia para o outro com lug/ml de RAGE-Fc humano. Asconcentrações de variação do XT-M4 biotinilado foramadicionadas em duplica nas cavidades (0, 11 - 250ng/ml) ,incubadas, lavadas e detectadas com estreptavidina-HRP. OED50 calculado do XT-M4 de rato parental foi de 5 ng/ml. OIC50 do anticorpo quimérico e de cada anticorpo XT-M4humanizado foi calculado quando competiu com 12,5 ng/ml deanticorpo XT-M4 parental biotinilado. Resumidamente, asplacas foram cobertas de um dia para o outro com lug/ml deRAGE-Fc humano. As concentrações de variação do anticorpoquimérico ou dos anticorpos humanizados misturados com12, 5ng/ml de XT-M4 de rato parental biotinilado foramadicionadas em duplicata às cavidades (na faixa de 9ng/ml a20ug/ml). Os anticorpos XT-M4 de rato parental biotiniladosforam detectados com estreptavidina-HRP e os valores C50foram calculados. Os valores IC50 determinados para osanticorpos humanizados por análise de ELISA por competiçãosão mostrados na Tabela 11.

TABELA 11

<table>table see original document page 163</column></row><table><table>table see original document page 164</column></row><table>

Os valores ED50 para a ligação de anticorpos XT-H2humanizados ao RAGE-Fc humano foram similarmente determinadosatravés de ELISA por competição e são mostrados na Figura 22 .

Exemplo 20

Reatividade cruzada de anticorpo XT-M4 quimérico ehumanizado para outros receptores de superfície de célula

Os anticorpos XT-M4 humanizados XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.10 e XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.11, foram testadoscom XT-M4 quimérico para reatividade cruzada com outrosreceptores do tipo RAGE. Estes receptores foram escolhidosporque eles são células-superfícies expressas, como RAGE esuas interações com o ligante são similarmente dependentesde carga. Os receptores testados foram rhVCAM-1, rhICAM-1-Fc, rhTLR4 (marcador His C-terminal), rhNCAM-1, rhB7-Hl-FcmLoxl-Fc, hLoxl-Fc e hRAGE-Fc (como um controle positivo).As placas de ELISA foram cobertas de um dia para o outro comlpg/ml das proteínas receptoras listadas. As concentraçõesde variação dos anticorpos XT-M4 quiméricos e humanizadoslistadas acima foram adicionadas em duplicata às cavidades(0,03 a 20 μg/ml), incubadas, lavadas e detectadas com IgGHRP anti-humano. A Tabela 12 mostra os resultados de análisede ELISA por ligação direta da ligação dos anticorpos XT-M4quiméricos e humanizados às proteinas de superfície decélula de humano e camundongo. Os dados mostrados são osvalores OD450 para a ligação detectada entre receptor e oanticorpo em 20 yg/ml (concentração mais alta testada).

TABELA 12 <table>table see original document page 165</column></row><table>

Exemplo 21

Ensaio de ligação BIACORE™ de ligação ao RAGE humanosolúvel

A ligação de anticorpo XT-M4 quimérico e dos XT-M4humanizados ao RAGE solúvel humano (hRAGE-SA) e ao RAGE demurídeo solúvel (mRAGE-SA) foi medida pelo ensaio de ligaçãode captura BIACORE™. 0 ensaio foi realizado cobrindo-se osanticorpos Fc anti-humanos sobre um chip CM5 BIA com 5000RU (pH 5.0, 7 min.) em células de fluxo 1-4. Cada anticorpofoi capturado escoando-se em 2,0 μg/ml ao longo dosanticorpos anti-Fc em células de fluxo 2-4 (a célula defluxo 1 foi usada como referência) . As soluções de um RAGEmarcado com estreptavidina humana solúvel purificada (hRAGE-SA) em concentrações de 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25nM, 3,125 nM, 1,25 nM e 0 nM foram escoadas ao longo dosanticorpos imobilizados em duplicata, com dissociação por 5minutes, e as constantes de taxa cinética (ka e kd) econstantes de associação e dissociação (Ka and Kd) para aligação ao hRAGE-SA foram determinadas. Os resultados para aligação de anticorpos XT-M4 quiméricos e humanizados XT-M4-V10, XT-M4-Vll, e XT-M4-V14 para a ligação ao hRAGE-SA e aomRAGE-SA são mostrados nas Figuras 23 e 24, respectivamente.

Exemplo 22

Otimização de reatividade cruzada de espécies do anticorpoXT-H2 principal

A reatividade cruzada de espécies é desenvolvidapor um processo de mutação aleatória do anticorpo XT-H2,gerando uma biblioteca de variações de proteína eenriquecendo de maneira seletiva aquelas moléculas queadquiriram as mutações que resultam na reatividade cruzadade RAGE em camundongo-humano. As tecnologias de exibição deribossomo (Hanes et al., 2000, Methods Enzymol., 328:404-30)e exibição de fago (McAfferty et al., 1989, Nature, 348:552-4) são usadas.

Preparação de anticorpos ScFv baseados em anticorpos XT-H2 eHT-M4

A. Anticorpos ScFv baseados em XT-H2

Duas construções de ScFv que compreendem asregiões V do XT-H2 foram sintetizadas no formato VH/VL ou noformato VL/VH conectadas por meio de um conector flexível deDGGGSGGGGSGGGGSS (SEQ ID NO: 50) . As seqüências dasconstruções configuradas como VL-VH e VH-VL são mostradas naFigura 25 (SEQ ID NO: 51) e nas Figura 26 (SEQ ID NO: 52),respectivamente.

B. Anticorpos ScFv baseados em XT-M4

Duas construções de que compreendem as regiões Vdo XT-M4 foram sintetizadas no formato VH/VL ou no formatoVL/VH conectadas por meio de um conector flexível deDGGGSGGGGSGGGGSS (SEQ ID NO: 50) . As seqüências dasconstruções configuradas como VL-VH e VH-VL são mostradas naFigura 27 (SEQ ID NO: 54) e na Figura 28 (SEQ ID NO: 53),respectivamente.

A Figura 2 9 mostra os dados de ELISA in vitro deconstruções M4 e H2 transcritas e traduzidas. As placas deELISA cobertas com RAGE-Fc humano (5ug/ml) ou BSA (200ug/ml)em tampão de bicarbonato de um dia para o outro a 4 °C,lavadas com 0,05% de PBS+tween e bloqueadas durante 1 hora àtemperatura ambiente com 2% de PBS de pó de leite. As placasforam incubadas in vitro com ScFv traduzido durante 2 horasà temperatura ambiente. As placas foram bloqueadas e adetecção com anticorpo anti-Flag (diluição de 1/1000)seguida por HRP anti-camudongo de coelho (diluição de1/1000). Os dados mostram que as construções ScFv dasregiões variáveis dos anticorpos anti-RAGE XT-H2 e XT-M4 naconfiguração VL/VH ou na configuração VH/VL pode produzir aproteína dobrada funcional que se liga especificamente aoRAGE humano. Os valores para Kd do ScFv em ambos os formatosdeterminados por BIACORE™ são usados para determinar asconcentrações de antigeno ótimas para os experimentos deseleção.

C. Estratégia de seleção e triagem para recuperarvariantes com reatividade cruzada de RAGE em camundongo/humano aprimorada

Uma biblioteca de variantes é criada por PCR deerro-propensão (Gram et al., 1992, PNAS 89:3576-80). Estaestratégia de mutagênese introduz mutações aleatórias alolongo de todo o comprimento do gene ScFv. A biblioteca é,então, transcrita e traduzida in vitro usando osprocedimentos estabelecidos (por exemplo, Hanes et al.,2000, Methods Enzymol., 328:404-30). Esta biblioteca ésubmetida à rodada 1 de seleção no RAGE-Fc humano, oscomplexos ribossômicos não ligados são lavados e oscomplexos ribossômicos ligados ao antigeno são eluidos. 0RNA é recuperado, convertido em cDNA por RT-PCR e submetidoà rodada 2 de seleção no RAGE-Fc de camundongo. Estaestratégia de seleção alternativa enriquece, de preferência,os clones que se ligam tanto ao RAGE-Fc humano como ao RAGE-Fc de camundongo. A produção desta seleção é, então,colocada em um segundo PCR de erro-propensão. A bibliotecagerada é, então, submetida à rodada 3 e as seleções derodada no RAGE-Fc humano e RAGE-Fc de camundongo,respectivamente. Este processo é repetido conforme requerido.

Os conjuntos de saida de RNA de cada etapa de seleção sãoconvertidos em cDNA e clonados em um vetor de expressão deproteína pWRIL-1 para avaliar a reatividade cruzada deespécies de ScFvs variantes. Os conjuntos de diversidadetambém são seqüenciados para avaliar a diversidade a fim dedeterminar se as seleções estão se movendo em direção aosclones dominantes que têm reatividade cruzada de espécies.

Exemplo 23

Maturação de afinidade de anticorpo XT-M4 principal

A afinidade aprimorada traduzida em um beneficiopotencial da dose reduzida ou freqüência de dose e/oupotência aumentada. A afinidade de hRAGE é aprimorada pormaturação de afinidade, usando um processo combinado demutagênese almejado para o VH-CDR3 acoplado a mutagênese PCRde erro-propensão aleatória (Gram et al. , 1992, PNAS89:3576-80). Isto gera uma biblioteca de variantes deanticorpo a partir da qual as moléculas que são recuperadastêm uma afinidade aprimorada para RAGE humano enquantomantêm reatividade cruzada de espécies para RAGE-Fc decamundongo. A tecnologia de exibição de ribossomo (Hanes etal, 1997, supra) e a tecnologia de exibição de fago(McAfferty et al., 1989, supra) são usadas.

A Figura 30 mostra os dados de ligação de ELISA deconstruções ScFv XT-M4 e XT-H2 em pWRIL-1 no formato VL-VH,expresso como proteína solúvel em Escherichia coli e testadapara ligação em RAGE-Fc humano e BSA. ActRIIb representa umaproteína de não-ligação expressa a partir do mesmo vetorcomo um controle negativo. As placas de ELISA foram cobertascom RAGE-Fc humano (5ug/ml) ou BSA (200ug/ml) em tampão debicarbonato de um dia para o outro a 4 °C, lavadas com 0,05%de PBS+tween e bloqueadas durante 1 hora à temperaturaambiente com 2% de PBS de pó de leite. As preparaçõesperiplásmicas com 20 ml de culturas de E.coli foramrealizadas usando procedimentos padrões. O volume final daspreparações periplásmicas de anticorpos ScFv não purificadosfoi de 1 ml do qual 50ul foi pré-incubado com anticorpoanti-His em uma diluição de 1/1000 durante 1 hora àtemperatura ambiente em um volume total de IOOul com 2% dePBS de pó de leite. As preparações periplásmicas reticuladasforam adicionadas à placa de ELISA e incubadas por 2 horasadicionais à temperatura ambiente. As placas foram lavadas 2vezes com 0,05% de PBS+tween e 2 vezes com PBS e incubadascom HRP anti-camundongo de coelho em uma diluição de 1/1000em 2% de PBS de pó de leite. Estas placas foram lavadasantes e a ligação foi detectada usando reagentes TMBpadrões. Os dados mostram que as construções ScFv deanticorpos XT-M4 e XT-H2 na configuração VL/VH podemproduzir proteína solúvel dobrada funcional em E. coli quese ligam especificamente ao RAGE humano. Os valores Kd departida do ScFv em ambos os formatos determinados porBIACORE™ são usados para determinar as concentrações deantígeno ótimas para as seleções por afinidade.

Exemplo 24

Estratégia de seleção e triagem para recuperar variantes comafinidade aprimorada para hRAGE-Fc enquanto mantêm areatividade cruzada de espéciesUma biblioteca de variantes é criada pelamutagênese reforçada do VH-CDR3 de XT-M4 que usa PCR. AFigura 31 representa esquematicamente como o PCR é usadopara introduzir as mutações reforçadas em um CDR de XT-M4.(1) Um oligonucleotídeo reforçado é designado paratransportar uma região de diversidade ao longo do comprimentodo laço CDR e suportado por regiões de homologia com o geneV alvo no FR3 e FR4 (2). O oligonucleotídeo é usado em umareação PCR com um primer específico que se fixa àextremidade 5' do gene V alvo e é homólogo à região FRl. AFigura 32 mostra a seqüência de nucleotídeo da extremidadeterminal C da construção ScFv VL-VH XT-M4 (SEQ ID NO: 56). OVH-CDR3 é sublinhado. Também são mostrados dois oligo-nucleotídeos de reforço (SEQ ID NOs:57-58) com um número emque o local de mutação que identifica a razão de reforçousada para. a mutação naquele local. As composições denucleotídeo das razões de reforço que correspondem aosnúmeros também são identificadas.

0 produto PCR reforçado XT-M4-VHCDR3 é clonado novetor de exibição de ribossomo pWRIL-3 como um fragmentoSfil para gerar uma biblioteca. Esta biblioteca é submetidaà seleção em RAGE biotinilado humano que usa exibição deribossomo (Hanes and Pluckthun., 2000). 0 antígenoclassificado de biotina é usado à medida que este permite asolução baseada na seleção que permite mais controlecinético ao longo do processo e aumenta a probabilidade deenriquecer preferencialmente os clones de afinidade maisalta. As seleções são realizadas ainda em um modo deequilíbrio em uma concentração de antígeno decrescente comrelação à afinidade inicial ou em um modo cinético onde ataxa fora da alíquota aprimorada é especificamenteselecionada para usar a competição com o antígeno nãoclassificado em um período empiricamente determinado. Oscomplexos ribossômicos não ligados são lavados, os complexosribossômicos de ligação de antígeno são eluídos, o RNA érecuperado, convertido em cDNA por RT-PCR e uma segundarodada de seleção de RAGE-Fc de camundongo biotinilado érealizada para manter a reatividade cruzada de espécies. Aprodução a partir desta etapa de seleção que contémvariantes ScFv com mutações no VH-CDR3 é, então, submetida auma etapa de 2 ciclos de mutagênese. Esta etapa demutagênese envolve a geração de mutações aleatórias que usamPCR de propensão de erro. A biblioteca gerada é, então,submetida às seleções em 3 rodadas em RAGE-Fc humanobiotinilado em uma concentração de antígeno inferior de 10dobras. Este processo é repetido conforme requerido. Ospools de saída de RNA de cada etapa de seleção sãoconvertidos em cDNA e clonados em um vetor de expressão deproteína pWRIL-1 para afinidade de classificação ereatividade cruzada de espécies do ScFv variante. Os poolsde diversidade também são seqüenciados para avaliar adiversidade a fim de determinar se as seleções estão semovendo em direção aos clones dominantes.

Exemplo 25

Maturação de afinidade de XT-M4 que uso exibição de fago

A biblioteca reforçada VH-CDR3 é clonada no vetorde exibição de fago pWRIL-1 mostrado na Figura 34 para aseleção em hRAGE biotinilado. 0 antígeno classificado debiotina que será usado neste formato é mais compatível comas seleções de acionamento de afinidade em solução. Asseleções são realizadas em um modo de equilíbrio em umaconcentração de antígeno decrescente com relação à afinidadeinicial ou em um modo cinético onde a taxa fora da alíquotaaprimorada é especificamente selecionada usando a competiçãocom antígeno não classificado em um período de tempoempiricamente determinado. Os procedimentos padrões para aexibição de fago são usados.

O ScFv pode dimerizar, o que complica osprocedimentos de seleção e triagem. O ScFv dimerizado mostrapotencialmente a ligação baseada em atividade e esteatividade de ligação aumentada pode dominar as seleções.Tais aprimoramentos na capacidade de o IScFv dimerizar emvez de em qualquer aprimoramento intrínseco na afinidade terpouca relevância no anticorpo terapêutico final, que égeralmente um IgG. Para evitar artefatos que resultam dealterações na capacidade de dimerizar, os formatos deanticorpo Fab são usados, à medida que os mesmos geralmentenão dimerizam. O XT-M4 foi reformado como um anticorpo Fab eclonado em um novo vetor de exibição de fago pWRIL-6. Estevetor tem locais de restrição que varrem tanto as regiões VHcomo as regiões VL e freqüentemente não cortam genes V delinha germinativa humana. Estes locais de restrição podemser usados para montagem embaralhada e combinatória derepertórios de VL e VH. Em uma estratégia, as bibliotecascom reforço VH-CDR3 e VL-CDR3 são montadas de maneiracombinatorial no vetor de exibição Fab conforme mostrado naFigura 34 e são selecionadas para afinidade aprimorada.Exemplo 26

Caracterização física de anticorpo quimérico XT-M4

A caracterização preliminar por análise demapeamento e subunidade de peptídeo por cromatografia líquida(HPLC)/espectrometria de massa de alto desempenho (MS) comdetecção MS on-line confirmou que a seqüência de aminoácidosé conforme a prevista a partir da seqüência de DNA XT-M4quimérico. Estes dados MS também indicaram que o localconsensual de seqüência de oligossacarídeo N-Iigado esperadono Asn299SerThr é ocupado e as duas espécies principais sãoglicanos fucosilados de núcleo biantenário N-Iigadoscomplexos que contêm zero ou um resíduo de galactoseterminal, respectivamente. Além disso, para o oligossacarídeoN-Iigado esperado situado na região Fc da molécula,observou-se um oligossacarídeo N-Iigado em um local deconsenso de seqüência (Asn52AsnSer) na região CDR2 da cadeiapesada de XT-M4 quimérico. O oligossacarídeo N-Iigado extraé primeiramente encontrado somente em uma das cadeiaspesadas e compreendem aproximadamente 38% das moléculasconforme determinadas pela análise CEX-HPLC (podem existiroutras espécies ácidas que não podem ser diferenciadas pelaestrutura primária, que podem contribuir com o percentualtotal de espécies ácidas). A espécie predominante é umaestrutura biantenária fucosilada de núcleo com dois ácidossiálicos. A absortividade é usada para calcular aconcentração medindo-se A2eo· A absortividade teórica do XT-M4 quimérico foi calculada em 1,35 mL mg"1 cm-1.O peso molecular aparente do XT-M4 quiméricoconforme determinado por não redução de SDS-PAGE é deaproximadamente 200 kDa. O anticorpo migra mais lentamenteque o esperado a partir de sua seqüência. Este fenômeno foiobservado em todos anticorpos recombinantes analisados até adata. Sob condições de redução, o XT-M4 quimérico tem umaúnica banda de cadeia pesada que migra em aproximadamente50 kDa e uma única cadeia leve que migra em aproximadamente25 kDa. Também existe uma banda adicional que migra logoacima da banda de cadeia pesada. Esta banda foi caracterizadapor degradação Edman automática e foi determinada para terum NH2-terminal que corresponde à cadeia pesada de XT-M4quimérico. Estes resultados, junto com o aumento no pesomolecular observado por SDS-PAGE, indicam que a bandaadicional é coerente com uma cadeia pesada que tem ooligossacarideo N-Iigado extra na região CDR2.

O ponto isoelétrico previsto (pi) do XT-M4quimérico baseado na seqüência de aminoácidos é 7,2 (sem LysCOOH-terminal na cadeia pesada).0 XT-M4 quimérico resolvidopor IEF em aproximadamente 10 bandas que migram dentro deuma faixa pi de aproximadamente 7,4-8,3 com uma bandadominante que migra com um pi de aproximadamente 7,8. 0 pideterminado por focalização isoelétrica de eletroforesecapilar foi de aproximadamente 7,7.

A análise do material de desenvolvimento atravésda cromatografia liquida de alto desempenho de troca decátion (CEX-HPLC) fornece a resolução adicional para espéciesde XT-M4 quimérico que se diferenciam na carga molecular. Amaior parte da heterogeneidade de carga observada é maisprovável devido às contribuições dos ácidos siálicos que sãoencontrados no oligossacarídeo N-Iigado situado na regiãoCDR2 da cadeia pesada. Uma parte menor da heterogeneidade decarga observada pode ser atribuída à heterogeneidade dalisina COOH-terminal.

Exemplo 27

Remoção do local de glicosilação

A mutação que converte asparagina (N) em ácidoaspártico (D) na posição 52 (por numeração Kabat) na regiãode cadeia pesada variável do anticorpo XT-M4 aprimora aligação do anticorpo XT-M4 ao RAGE humano conformedeterminado pela análise de ELISA de ligação direta com ohRAGE-Fc, conforme mostrado na Figura 36. A mutação N52Docorre no CDR2 da região de cadeia pesada variável doanticorpo XT-M4.

Exemplo 28

Tratamento de sepse e listeriose

Os anticorpos anti-RAGE foram mostrados parafornecer benefício terapêutico significativo em um modelo demurídeo padrão de sepse polimicrobiana, intra-abdominal. Osresultados também mostraram que a expressão RAGE é altamentenociva aos animais sistematicamente desafiados com Listeriamonocytogenes conforme evidenciado pelos benefícios desobrevivência acentuada observados em nocautes RAGEhomozigotos e heterozigotos comparados com animais deocorrência natural.

A. Materiais e métodosTodos os reagentes e produtos químicos foramadquiridos a partir de Sigma (St. Louis, MO) exceto ondeestabelecido em contrário. O anticorpo IgG XT-M4 monoclonalde rato, com uma afinidade constante de 0,3 nM para o RAGEdimérico de murídeo, é descrito acima. O anticorpo monoclonalde fator de necrose anti-tumoral alfa (TNF) TN3.1912 é umaanticorpo IgG de neutralização derivado de hamsters com altaligação por afinidade ao TNF de murídeo. A estirpedesafiante de Listeria monocytogenes foi adquirida a partirde American Type Cell Cultures (ATCC # 19115, Manassas, VA).Todas as estirpes de camundongo usadas nestes experimentostinham de 2 a 6 meses de idade e eram animais livres depatógeno específico mantidos sob condições de BiossegurançaNível 2. Os camundongos de ocorrência natural BALB/c(Charles River Laboratories, Inc, Wilmington, MA),camundongos machos RAGE~/_ 12 9SvEvBrd homozigotos,camundongos machos RAGE+/~ 129SvEvBrd heterozigotos ecamundongos machos de ocorrência natural 129SvEvBrd (criadosem uma casa em Wyeth). O camundongo nocaute RAGE foiprojetado em Wyeth Research como um camundongo inl29SvEv-Brdnocaute condicional de gene almejado no qual a Crerecombinase remove éxons 2, 3 e 4 (Lexicon Genetiçs, Inc,The Woodlands, TX). Os resultados de eliminação resulta notruncamento da proteína de RAGE e a proteína não éproduzida. O RAGE não é essencial para a viabilidade emcamundongos. Os camundongos nulos para RAGE não têm nenhumfenótipo óbvio e procriam normalmente. Os camundongos foramavaliados em sobrevivência até sete dias após o desafio CLPou L. monocytogenes.

A microbiologia quantitativa foi realizada apartir de amostras de órgãos obtidas na necropsia decamundongos após os experimentos de CLP e listeriose. Asamostras sangüíneas foram obtidas a partir de animais vivosno momento do sacrifício e o soro foi coletado eimediatamente colocado em gelo para determinação decitoquina. As citoquinas de soro foram medidas por um ensaiomultiplex de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima que usaas placas sob medida e o protocolo fornecido por Meso ScaleDelivery (Gaithersburg, MD) . A citoquinas analisadas foramMCP-1, IL-I beta, TNF alfa, Interferon γ e IL-6. As amostrasde tecido foram coletadas a partir de pulmão, fígado e baço.O fluido peritoneal foi obtido lavando-se a cavidadeperitoneal com 5 ml de solução salina estéril e retirando ofluido. Os tecidos Os tecidos de órgão foram pesados e,então, pulverizados para gerar uma suspensão de tecido emTSB. Os espécimes foram diluídos em série cultivados a 37°Caerobicamente em TSB (para bactéria gram-negativa e gram-positiva) e ágar MacConkey (para bactéria gram-negativa)para se obter as contagens bacterianas quantitativaspadronizadas por grama de peso de órgão ou fluido de lavagem peritoneal CFU/ml.

Os tecidos animais (pulmão, íleo distai) tambémforam histologicamente analisados por um patologista cego àatribuição de tratamento de cada animal e pontuou em umapontuação de patologia definida classificada a partir de O(normal) a 4 (necrose difusa e extensiva de tecido) . A águano pulmão total como uma medida de fluido de edema pulmonarfoi calculada a partir de razões molhado para seco do tecidopulmonar.

Projeto Estatístico e Análise de Dados. 0 pontofinal primário em cada experimento foi a sobrevivência. Osexperimentos animais foram realizados usando um sistema decódigo numérico que cegou os investigadores para o genótipodo animal ou tratamento com anticorpo (versus controle desoro) até a conclusão do estudo. Os dados numéricos foramapresentados como meio ( + /- SEM). As diferenças desobrevivência foram analisadas por um gráfico de sobrevivênciade Kaplan-Meier e pela estatística log-rank. A estatísticaANOVA em uma direção não-paramétrica Kruskal-Wallis (paramúltiplos grupos) ou o teste U Mann-Whitney (para doisgrupos) foi usada para analisar as diferenças entre osgrupos. 0 pós-teste de múltiplas comparações Dunn foiutilizado para confirmar as diferenças quando as comparaçõesde análise que envolvem múltiplos grupos. Um valor P comduas extremidades <.05 foi considerado significativo.

B. Modelo de ligação cecal e perfuração

0 procedimento CLP foi descrito previamente emdetalhes [Echtenacher et al., 1990, J. Immunol., 145:3762-6]. Resumidamente, os animais foram anestesiados com umainjeção intraperitoneal com 200 microlitros de umacombinação de cetamina (Bedford Co. Bedford, 0H) (9mg/ml) exilazina (Phoenix, St. Josephs, MO) (Img/ml). 0 ceco foiexteriorizado através de uma incisão abdominal de linhaintermediária de aproximadamente 1 cm de comprimento. O cecofoi, então, ligado com monofilamento 5,0 em um nivel apenasdistai à junção ileocecal (>90% do coco ligado). A lateralantimesentérica do ceco foi perfurada com uma agulha calibre23. Uma quantidade limitada de conteúdos luminais foi,então, expressa em ambos os locais de perfuração paraassegurar a desobstrução. O ceco foi recolocado na cavidadeabdominal e incisões fasciais e cutâneas foram fechadas commonofilamento 6,0 e grampos cirúrgicos, respectivamente. 1%de lidocaina e bacitracin tópico foram aplicados no localcirúrgico de maneira pós-operatória. Todos os animaisreceberam uma única injeção intramuscular de trovafloxacin(Pfizer, New York) em uma dose de 20 mg/kg de maneiraimediatamente pós-operatória e uma ressuscitação de fluidopadrão foi administrada com 1,0 ml de injeção subcutânea desolução salina normal. Os animais de teste foram, então,colocados de volta em suas caixas individuais e reaquecidosusando lâmpadas de calor até que eles recuperem a postura ea mobilidade normal.

O XT-M4 mAb anti-RAGE em doses de 7,5 mg/kg ou 15mg/kg (ou controle de soro) foi fornecido uma vez de maneiraintravenosa para os camundongos de ocorrência natural 30-60minutos antes do CLP ou em intervalos de tempo pós-CLP: 6,12, 24 ou 36 horas. Como um controle adicional, cincoanimais foram submetidos à cirurgia simulada (laparotomiacom mobilização e exteriorização do ceco, porém sem ligaçãoou perfuração).Resultados

A. Sobrevivência de animais nocaute RAGEhomozigoto, animais RAGE heterozigotos e animais deocorrência natural após CLP.

A Figura 37 mostra que existiu uma vantagem desobrevivência significativa tanto para animais nocaute RAGEhomozigotos (n=15) como para animais RAGE heterozigotos(n=23) comparada com os animais de controle de ocorrêncianatural (n=15) (P < .001). Os animais RAGE heterozigotosforam protegidos da sepse polimicrombiana quase letal bemcomo os nocautes RAGE homozigotos (RAGE"/_ vs. RAGE+/~, P =ns). Conforme esperado, todos os animais de cirurgiasimulada sobreviveram (n=5). Foi fornecido para um grupoadicional de 15 animais de ocorrência natural 129SvEvBrd mAbanti-RAGE 30 minutos antes do CLP e apresentou uma vantagemde sobrevivência similar ao nocautes RAGE quando comparadacom os animais de controle tratados com soro de ocorrêncianatural.

A Figura 38 mostra as contagens de colônia detecido para os organismos bacterianos entéricos gram-positivos e gram-negativos aeróbicos após o CLP. Asconcentrações de tecido no figado e os tecidos esplênicos eo fluido peritoneal foram similares em todos os três grupos(P = ns) porém foram todas significativamente mais altas quenos animais operados por simulação (P < .05). Os nocautesRAGE homozigotos tiveram a menor quantidade de água pulmonar(razão molhado para seco: 4,8 ± 0,2-RAGE_/" vs. 5,0 ± 0,4-RAGE+/" vs. 5,3 ± 0,3-wt; P= ns).A Figura 39 mostra que ocorreu uma diferençasignificativa na sobrevivência em animais BALB/c quereceberam soro de controle (n=15) e animais que receberamanticorpo anti-RAGE (grupo de 7,5 mg/kg [n=15] ou grupo de15 mg/kg [n=15]) 30-60 minutos antes do CLP. Os efeitosprotetores ótimos foram obtidos em 15 mg/kg de mAb anti-RAGE(P < .05 vs. grupo°7,5 mg/kg; P < .001 vs. controle de soro)e, portanto, esta dose foi empregada nos experimentossubseqüentes com tratamento de mAb que segue o CLP. Osanimais que receberam anticorpo anti-RAGE não apresentaramcargas bacterianas de órgão significativamente aumentadascomparadas com os animais de controle, porém ambos os gruposapresentaram significativamente mais unidades de formação decolônia (CFU) /gm de tecido de baço e tecido de fígado que osanimais de controle tratados por simulação (n=5). Consulte aTabela 1. A histopatologia do tecido pulmonar e da mucosa dointestino delgado em exame de necrópsia foi acentuadamenteanormal no grupo de controle de soro enquanto as descobertaspatológicas foram significativamente reduzidas no grupo mAbe no grupo de cirurgia simulada (Tabela 13).

TABELA 13 <table>table see original document page 182</column></row><table><table>table see original document page 183</column></row><table> A Figura 40 mostra os efeitos da administraçãoretardada de uma única dose de 15 mg/kg de anticorpo anti-RAGE em intervalos de tempo prolongados tão longos quanto 36horas após o CLP. O tratamento com anticorpo monoclonalretardado forneceu proteção significativa contra aletalidade até 24 horas após o CLP (P < .01). A administraçãode mAb retardada até 36 horas após o CLP mostrou umatendência de sobrevivência favorável, porém as diferençasnão foram tão significativas comparadas com o grupo decontrole tratado com soro (P = .12). As concentraçõesteciduais de bactéria gram-negativa e gram-positiva entéricaaeróbica não se diferenciaram entre os grupos de tratamento(P = ns) . A descoberta de um beneficio de sobrevivência apósa administração retardada de anticorpo anti-RAGE teveimportantes implicações clinicas, uma vez que umaintervenção tal como um tratamento com anticorpo anti-RAGEnão pode ser tipicamente fornecido imediatamente após oevento de incitação em pacientes sépticos. Estes dadosfornecem suporte para o uso de mAb anti-RAGE como umaterapia de recuperação para os pacientes com sepse severaestabilizada.

C. Modelo de desafio de listeriose em murideo

Os camundongos machos BALB/c de ocorrêncianatural, machos de ocorrência natural, machos RAGE+/~-129SvEvBrd heterozigotos e machos RAGE~/_ -129SvEvBrdhomozigotos foram usados nestes experimentos. Um inóculopadrão de L. monocytogenes foi preparado a partir decrescimento de culturas em 18 horas a 370C em caldo de sojatripticaseina (TSB) (BBL, Cockseyville, MD) . As bactériasforam centrifugadas a 10.000g durante 15 minutos a 4°C e re-suspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Asconcentrações bacterianas foram ajustadas espectrofotome-tricamente e verificadas por contagens de placa dilucionalquantitativa em placas de ágar de soja tripticaseina com 5%de RBCs de ovelha (BBL, Cockseyville, MD) . As diluições emsérie que variam de IO3-IO6 unidades de formação de colônia(CFU) L. monocytogenes foram administradas intravenosamentepara determinar o LD50 para os camundongos de ocorrêncianatural, nocautes RAGE_/" homozigotos, RAGE+/" heterozigotos ecamundongos de ocorrência natural que receberam 15 mg/kg demAb iv anti-RAGE uma hora antes do desafio bacteriano. Osanimais foram acompanhados por 7 dias após a administraçãodo desafio intravenoso com L. monocytogenes e ossobreviventes foram eutanizados para análises teciduais eestudo microbiológico.

Para as determinações microbiológicas e decitoquina quantitativas diferenciais detalhadas, um inóculopadrão de IO4 CFU foi fornecido intraperitonealmente umahora após uma infusão intravenosa do mAb anti-RAGE (15mg/kg), mAb anti-TNF (20mg/kg) ou volume igual com 1% desoro de murideo autológo como um controle. O RAGE+/" e oRAGE"/_ de ocorrência natural, também foram estudados após 48horas a partir deste inóculo padrão (n=5/grupo). Os animaisforam eutanizados 48 horas após o desafio L. monocytogenes ea microbiologia quantitativa foi realizada a partir detecidos do fígado e baço triturando-se as amostras teciduaise a diluição em série nas placas de ágar sangue.

Resultados

0 LD50 para camundongos de ocorrência natural foi(Iogi0) de 3,31 ±0,2 CFU, enquanto o LD50 para nocautes RAGEheterozigotos foi de 5,98 ± 0,39 e de 5,10 ± 0,47 para osnocautes RAGE homozigotos. Esta diferença de mais de duasordens de magnitude no LD50 da listeriose sistêmica foiestatisticamente significativa (P < .01) para ambos os RAGEheterozigotos e homozigotos comparada, com os camundongos deocorrência natural. A única dose de anticorpo XY-M4 anti-RAGE também foi fornecida para a proteção significativa decamundongos de ocorrência natural de listeriose sistemaletal com um LD50 de 4,69 ± 0,55 (P < .05 vs. controle deocorrência natural). 0 nível de proteção contra listerioseproporcionado pelo mAb anti-RAGE foi similar aqueleobservado em animais RAGE"7", porém não tão grande quantoaquele produzido pelos animais RAGE+/" (P < .05).

Não existiu diferença estatisticamente significativano nível quantitativo de L. monocytogenes isolado no tecidosdo fígado e baço seguindo um desafio sistêmico padrão de IO4CFU entre os grupos (n=10 /grupo) animais de controle deocorrência natural, os animais que receberam anticorposanti-RAGE, nocautes RAGE homozigotos ou RAGE heterozigotos.Consulte a Figura 41. Entretanto, existiu um aumentosignificativo estatisticamente alto nas concentraçõesbacterianas de órgão em animais que receberam o mesmoinóculo de L. monocytogenes seguindo a administração de umanticorpo anti-TNF (P <.001).

A Figura 42 mostra níveis de soro de interferon γapós o tratamento. As determinações de citoquina após odesafio de Listeria mostrou um nível significativamente maisbaixo de interferon γ nos nocautes RAGE comparados com osanimais BALB/c de controle. Os animais BALB/c que receberammAb anti-TNF tiveram um nível significativamente mais altode interferon γ comparado com os controles BALB/c,considerando que os animais que receberam mAb anti-RAGEtiveram níveis de interferon γ que não foram estatisticamentediferentes que aqueles dos animais de controle. Os resultadossimilares foram observados com IL-6 (grupo mAb anti-TNF-4591121 pg/ml vs. grupo de controle -38114 pg/ml; P<.01) eMCP-I (mAb anti-TNF-1363±480 pg/ml vs. grupo de controle566170 pg/ml; PC.05). Nenhuma diferença significativa foiencontrada nos níveis IL-6 ou MCP-I em animais deficientesRAGE ou no grupo tratado com anticorpo anti-RAGE comparadacom o grupo de controle. Outras determinações de citoquinanão mostraram diferenças significativas.O desafio de Listeria monocytogenes sistêmico é ummodelo clássico para o estudo da resposta imune inata ouadquirida em camundongos. Os experimentos de desafio deListeria mostram que os animais de nocaute RAGE homozigotose heterozigotos toleram esta infecção consideravelmentemelhor que os animais de ocorrência natural, que indicam queos efeitos deletérios de RAGE são vistos em um estadoinflamatório além daqueles que acompanham a sepsepolimicrobiana. Os animais de ocorrência natural quereceberam mAb anti-RAGE e os animais nocaute RAGE parecemlimpar L. monocytogenes bem como os animais de ocorrêncianatural. Isto é contrário ao animais que receberam anticorpoanti-TNF em que as contagens de colônia de L. monocytogenesnas amostras teciduais foram consideravelmente aumentadas.De maneira similar, os níveis de citoquina foram aumentadosapós o desafio de Listeria em animais que receberam mAbanti-TNF, porém os níveis foram similar aqueles doscontroles em animais que receberam mAb anti-RAGE.

Estas descobertas demonstram que o RAGE desempenhaum papel importante na patogênese da sepse. Em dois estudosde CLP separados, uma única dose (7,5 mg/kg 1-6 horas pós-CLP) de XT-M4 mostrou proteção significativa (65% desobrevivência) no sétimo dia quando comparada com oscamundongos injetados com 1,0% de soro de camundongoautólogo (20% de sobrevivência). Duas doses de XT-M4 (7mg/kg em 6 e 12 horas. pós-CLP) protegeram cerca de 85% doscamundongos no sétimo dia, comparadas com cerca de 25% desobrevivência entre os camundongos que receberam soro BALB/cdiluído. A administração de uma única dose de XT-M4 anti-RAGE 24 horas pós CLP também foi protetora comparada com osanimais de controle. Os experimentos precedentes demonstraramque o ElAGE desempenha um papel importante na patogênese desepse e sugere que os anticorpos anti-RAGE podem ser agentesterapêuticos úteis para o tratamento de sepse.

Exemplo 29

Avaliação adicional de anticorpos anti-RAGE no modelo CLP emmurídeo

O modelo CLP em murídeo de sepse resulta em umainfecção polimicrobiana, com abscessos abdominais e bacteremiae recria as fases hemodinâmicas e metabólicas observadas emdoenças humanas. Neste modelo, o ceco é exteriorizadoatravés de uma incisão abdominal de linha intermediária deaproximadamente um centímetro de comprimento, então, ligadoe a lateral antimesentérica do ceco é perfurada com umaagulha calibre 23. O ceco é recolocado na cavidade abdominale incisões fasciais e cutâneas são fechadas. Os animaisreceberam uma única injeção intramuscular de trovafloxacin(20 mg/kg) e a ressuscitação de fluido padrão foiadministrada com 1,0 ml de solução salina normal de maneiraintracutânea. Os animais foram observados durante 7 diasapós o CLP, com as mortes registradas à medida que forampercebidas em verificações de intervalo ao longo do dia.Como um controle adicional, os animais foram submetidos àcirurgia simulada que consiste em uma laparotomia commobilização e exteriorização do ceco, porém sem ligação ouperfuração. Os resultados de sobrevivência são comparadospor gráficos de sobrevivência Kaplan-Meier e analisados comum teste ANOVA não paramétrico. A eficácia dos anticorposRAGE nas dosagens profiláticas e terapêuticas e oscamundongos geneticamente modificados por RAGE foramavaliados no modelo CLP de murídeo.

Os camundongos nulos para RAGE homozigotos (RAGE-/-) mostraram um grau significativo de proteção contra .osefeitos letais de ligação e perfuração cecal, quandocomparados aos camundongos de ocorrência natural parentais,conforme mostrado na Figura 43. Em oito dias pós CLP, 80%dos camundongos RAGE-/- sobreviveram ao CLP, comparados com35% dos camundongos de ocorrência natural. Os animais RAGE-/+ se comportam de maneira similar aos animais RAGE-/-.Conforme visto na análise de tempo de sobrevivência, osanimais RAGE-/- tiveram uma vantagem de sobrevivênciasignificativa sobre os animais de ocorrência natural queseguem o CLP. Estas descobertas demonstram que o RAGEdesempenha um papel importante na patogênese da sepse. 0RAGE não é essencial para a viabilidade em camundongos.

Os RAGE homozigotos excluíram os camundongos quenão tem nenhum fenótipo óbvio. 0 RAGE-/-, RAGE+/- e RAGE+/+se encontram na estirpe anterior 129SvEvBrd.

A análise farmacodinâmica de XT-M4 rádio-rotuladoadministrada intraperitonealmente (IP) (4 mg/kg) mostrou umTi/2 de 73 h e um Tmax de 6 h. 0 XT-M4 também apresentoufarmacodinâmicas favoráveis em diversas estirpes decamundongo. A administração intravenosa de 5 mg/kg de XT-M4em camundongos BALB/c machos apresentou uma folga de soromuito baixa e Τχ/2 de 4-5 dias. A administraçãointraperitoneal de 5 mg/kg de XT-M4 em camundongos db/dbmachos também mostrou farmacodinâmicas similares.

Em dois estudos de CLP separados de camundongosBALB/c machos, uma única dose (7,5 mg/kg 0-6 horas pós-CLPdo XT-M4 mostrou uma proteção significativa (>50% desobrevivência) dos efeitos de CLP, quando comparada com oscamundongos injetados com 1,0% de soro de camundongoautólogo (15%-20% de sobrevivência), no sétimo dia. Consulteas Figuras 44 e 45. Duas doses de XT-M4 (7,5 mg/kg) em 6 e12 horas pós-CLP, na dose final de 15 mg/kg, (Figura 45)protegeu 90% dos camundongos no sétimo dia pós-CLPcomparadas com 15% de sobrevivência no grupo de controle. Aproteção ótima foi observada em 15 mg/kg de XT-M4.

Pontuações patológicas de camundongos com um CLP sãoreduzidas em animais tratados com anticorpo anti-RAGE

Todos os animais que sobreviveram no oitavo diaforam mortos e submetidos ao exame de necropsia paraevidência histológica de dano de órgão, bem como as pontuaçõespatológicas de pulmão e intestino delgado. Uma pontuaçãopatológica definida classificada de 0 (normal) a 4 (necrosedifusa e extensiva de tecido) foi aplicada. A histopatologiado tecido pulmonar e da mucosa do intestino delgado em examede necrópsia foi acentuadamente anormal no grupo de controlede soro enquanto as descobertas patológicas foramsignificativamente reduzidas no grupo tratado com XT-M4anti-RAGE (15 mg/kg) e no grupo de cirurgia simulada.Consulte a Figura 46. A redução na histopatologia é coerentecom a sobrevivência aumentada.

As concentrações teciduais de bactéria gram-negativa e gram-positiva entérica aeróbica não sediferenciaram entre os grupos de tratamento. A microbiologiaquantitativa foi realizada a partir de amostras de órgãosobtidas na necropsia de camundongos que sobreviveram após oCLP. As amostras de tecido foram coletadas a partir depulmão, fígado e baço. O fluido peritoneal foi obtidolavando-se a cavidade peritoneal. As contagens bacterianasquantitativas padronizadas por grama de peso de órgão ouunidades de formação de colônia (CFU)/ml de fluido delavagem peritoneal. Os animais que receberam anticorpo XT-M4ou RAGE-/- não aumentaram significativamente as cargasbacterianas de órgão comparadas com os animais de controle(p=ns) porém ambos os grupos tiveram significativamente maisunidades de formação de colônia (CFU)/gm de tecido de baço efígado que os animais de controle tratados por simulação(n=5) (p<0,05).

Anticorpos anti-RAGE são protetores em um modelo de CLP emmurídeo com antibióticos

A administração intravenosa de 30 mg/kg XT-M4 napresença ou ausência de antibióticos protegeu os animaiscontra os efeitos letais de CLP. Consulte a Figura 47. Oscamundongos foram submetidos ao CLP em 0 h. Os camundongosreceberam uma injeção intravenosa de 30 mg/kg de XT-M4 ou umvolume igual a 1% de soro de camundongo autólogo. Todos osgrupos receberam uma dose de trovafloxacin (20 mg/kg IM) noperíodo 0. Além disso, trovafloxacin (20 mg/kg intramuscular)fornecidos no período de 24 e 48 h, ou vancomicina (20 mg/kgIP) foram administrados nos períodos de 0, 12, 24, 36 e 24 hpós-CLP. A injeção somente de vancomicina resultou em umaredução no grau de sobrevivência. Consulte a Figura 48.Nenhum efeito aditivo foi observado quando foramadministrados vancomicina ou trovafloxacin.

Anticorpos anti-RAGE são protetores em um modelo de CLP emmurídeo com uma administração retardadaA análise de sobrevivência Kaplan-Meier que seguea ligação e perfuração cecal em animais com tratamentoretardado com mAb anti-RAGE versus tratamento de controle desoro fornecido em diversos intervalos de tempo após o CLP(Figura 4 9) . Uma administração intravenosa retardada do XT-M4 em camundongos BALB/c machos com uma dose de 15 mg/kg 6,12 ou 24 horas pós-CLP também resultou na sobrevivênciasignificativa dos animais (N=15, Controle; n=14). 0tratamento com anticorpo monoclonal retardado forneceuproteção significativa contra a letalidade até 24 horas apóso CLP (p<0,01) . A administração até 36 horas após o CLPmostrou uma tendência de sobrevivência favorável (9/15animais sobreviveram), porém as diferenças não foram tãosignificativas comparadas com o grupo de controle tratadocom soro (p=0,12). As concentrações teciduais de bactériagram-negativa e gram-positiva entérica aeróbica não sediferenciaram entre os grupos de tratamento (p=ns).Exemplo 30

Modulação RAGE não exacerba a infecção por

Listeria monocytogenes sistêmica

A inibição ou exclusão de RAGE não interrompe omecanismo hospedeiro ou uma folga de patógenos microbianos.

O desafio de Listeria monocytogenes é um modelo bemconhecido para estudo da resposta imune inata e adquirida emcamundongos. O LD50 para os camundongos de ocorrêncianatural foi de (log 10) 3,31±0,2 CFU, enquanto o LD50 para oRAGE+/- heterozigoto foi de 5,98±0,39 e 5,10+0,47 para RAGE-/- homozigoto. Esta diferença de mais de duas ordens demagnitude no LD50 da listeriose sistêmica foi estatisticamentesignificativa (p<0,01) para ambos os RAGE heterozigotos ehomozigotos comparada com os camundongos de ocorrêncianatural. Os camundongos foram desafiados com umaadministração sistêmica de Listeria monocytogenes (104unidades de formação de colônia (CFU) ) uma hora após aadministração de anticorpo ou soro de controle. Os animaisde ocorrência natural que receberam XT-M4 anti-RAGE e osanimais RAGE-/- parecem limpar L. monocytogenes bem como osanimais de ocorrência natural. Comparado com o grupo decontrole, o nivel quantitativo (CFU/gm) de L. monocytogenesem tecido hepático e tecido esplênico foi inalterado pelaadministração do anticorpo XT-M4 (15 mg/kg) ou nos animaisnulos para RAGE e animais RAGE heterozigotos. Emcontrapartida, os níveis foram aumentados com a administraçãode anticorpo anti-TNF-a (20 mg/kg de anticorpo TN3.1912monoclonal) . Consulte a Figura 50. Conforme esperado, oanticorpo anti-TNF monoclonal aumentou significativamente asuscetibilidade dos camundongos a listeriose. A exclusão ouinibição de RAGE não exacerba a infecção neste modelo.

Exemplo 31

Ensaio pré-clinico in vivo da eficácia de anticorpo anti-RAGE quimérico

A. Farmacodinâmica (PK)

A concentração de soro de anticorpo XT-M4 quiméricoque segue uma única dose IV de 5 mg/kg em camundongos BALB/cmachos (n=3) foi avaliada para a concentração anticorpo desoro de XT-M4 quimérico ao longo do tempo foi medida com umELISA IgG. A exposição ao soro média do XT-M4 quimérico foi(23,235 g«hr/mL) e a meia vida é de aproximadamente umasemana (152 horas). Consulte a Figura 51.

B. Avaliação do efeito protetor com diferentesdoses de XT-M4 quimérico após CLP

As capacidades de o anticorpo XT-M4 quimérico e oanticorpo XT-M4 de rato parental prolongar a sobrevivênciade camundongos BALB/c após o CLP foram determinadas seguindoa dosagem de 3,5 mg/kg, 7,5 mg/kg e 30 mg/kg de maneiraintravenosa no momento da cirurgia, em comparação com osanimais de controle de soro. O gráfico de sobrevivência émostrado na Figura 52. Uma única dose intravenosa (7,5 mg/kgO horas pós-CLP) de XT-M4 quimérico protegeu cerca de 90%dos camundongos no sétimo dia pós-CLP, quando comparada aocamundongos injetados com 1,0% de soro de camundongoautólogo (20% de sobrevivência), no sétimo dia (p<0,05).Doses de 3,5 mg/kg e 30 mg/kg do XT-M4 quimérico tambémforneceram proteção significativa (cerca de 70% comparadacom o controle, p<0,05) dos camundongos no sétimo dia pós-CLP.

C. Avaliação de proteção fornecida por XT-M4quimérico 24 horas após o CLP

As diferenças em sobrevivência foram analisadaspelo gráfico de sobrevivência Kaplan-Meier que segue aligação e perfuração cecal nos animais com tratamentoretardado (p<0,01 para ambos os grupos tratados comparadoscom o grupo de controle de soro). A comparabilidade de XT-M4quimérico com o XT-M4 anti-RAGE em rato quando administradosem uma dose de 15 mg/kg de maneira intravenosa 24 horas apóso modelo CLP é mostrada na Figura 53. O nivel de proteçãoproporcionado pelo XT-M4 quimérico no modelo CLP é similaraquele proporcionado pelo anticorpo XT-M4 de rato parentalquando terapeuticamente administrado 24 horas pós-CLP.

Sumário dos resultados

A ausência de RAGE protege os camundongos contraos efeitos letais da sepse induzida por CLP. Uma única dosede XT-M4 protege os camundongos contra os efeitos letais doCLP. Nenhuma diferença significativa na concentraçãotecidual de Listeria monocytogenes 48 horas o desafioListeria pós-sistêmico nos camundongos tratados com RAGE-/-ou anticorpo, sugere nenhuma imunossupressão incluída. Osdados mostram a substituição das regiões constantes deanticorpo XT-M4 de rato por regiões constantes humanas nãoafeta a atividade de ligação do anticorpo. Além disso, aeficácia no modelo CLP profilaticamente dosado com XT-M4quimérico mostrou que 90% dos animais foram protegidos comuma dose de 7,5 mg/kg. 0 anticorpo XT-M4 quimérico e oanticorpo XT-M4 parental fornecem níveis similares deproteção no modelo CLP quando terapeuticamente administrados24 horas pós-CLP.

Todas as publicações e patentes mencionadas nopresente documento são incorporada a título de referência emsua totalidade como se cada publicação ou patente individualfosse especifica e individualmente indicada para serincorporada por referência. Em caso de conflito, o presentepedido, incluindo quaisquer definições no mesmo, irácontrolar.

Embora as modalidades específicas da invençãotenham sido discutidas, a especificação acima é ilustrativae não restritiva. Muitas variações da invenção tornar-se-ãoaparentes para aqueles versados na técnica mediante arevisão desta especificação e das reivindicações abaixo. Oescopo completo da invenção pode ser determinado porreferência nas reivindicações, junto com seu escopo completode equivalentes, e a especificação juntamente com taisvariações.LISTAGEM DE SEQÜENCIAS

<110> Clancy, Brian

Paulsen, Janet

Piche-Nicholas, Nicole

Pittman, Debbie

Sreekumar, Kodangattil R.

Sun, Ying

Tan, Xiang-Yang

Tchistiakov, Lioudmila

Widom, Angel

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA ANTAGONISTAS DE RAGE

<130> 040000-0360533

<150> US 60/784,575

<151> 2006-03-21

<150> US 60/895,303

<151> 2007-03-16

<160>

64

<170> PatentIn versão 3.4

<210><211>

1

404<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Acesso Genbank No. NP 001127

<400> 1

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu

20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg

35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile

85 90 95

Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn

100 105 110

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp

115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys

130 135 140

Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln

165 170 175

Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu

180 185 190

Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro

210 215 220

Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu225 230 235 240

Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr

245 250 255

Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met

260 265 270

Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu

275 280 285

Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr

290 295 300

His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile305 310 315 320

Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser

325 330 335

Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly

340 345 350

Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg

355 360 365

Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu370 375 380Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser385 390 395 400

Thr Gly Gly Pro

<210> 2

<211> 1414

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<223> Acesso Genbank No. NM_001136

<400> 2

gccaggaccc tggaaggaag caggatggca gccggaacag cagttggagc ctgggtgctg 60

gtcctcagtc tgtggggggc agtagtaggt gctcaaaaca tcacagcccg gattggcgag 120ccactggtgc tgaagtgtaa gggggccccc aagaaaccac cccagcggct ggaatggaaa 180ctgaacacag gccggacaga agcttggaag gtcctgtctc cccagggagg aggcccctgg 240

gacagtgtgg ctcgtgtcct tcccaacggc tccctcttcc ttccggctgt cgggatccag 300

gatgagggga ttttccggtg ccaggcaatg aacaggaatg gaaaggagac caagtccaac 360

taccgagtcc gtgtctacca gattcctggg aagccagaaa ttgtagattc tgcctctgaa 420

ctcacggctg gtgttcccaa taaggtgggg acatgtgtgt cagagggaag ctaccctgca 480

gggactctta gctggcactt ggatgggaag cccctggtgc ctaatgagaa gggagtatct 540

gtgaaggaac agaccaggag acaccctgag acagggctct tcacactgca gtcggagcta 600

atggtgaccc cagcccgggg aggagatccc cgtcccacct tctcctgtag cttcagccca 660

ggccttcccc gacaccgggc cttgcgcaca gcccccatcc agccccgtgt ctgggagcct 720gtgcctctgg aggaggtcca attggtggtg gagccagaag gtggagcagt agctcctggt 780

ggaaccgtaa ccctgacctg tgaagtccct gcccagccct ctcctcaaat ccactggatg 840

aaggatggtg tgcccttgcc ccttcccccc agccctgtgc tgatcctccc tgagataggg 900

cctcaggacc agggaaccta cagctgtgtg gccacccatt ccagccacgg gccccaggaa 960

agccgtgctg tcagcatcag catcatcgaa ccaggcgagg aggggccaac tgcaggctct 1020

gtgggaggat cagggctggg aactctagcc ctggccctgg ggatcctggg aggcctgggg 1080

acagccgccc tgctcattgg ggtcatcttg tggcaaaggc ggcaacgccg aggagaggag 1140

aggaaggccc cagaaaacca ggaggaagag gaggagcgtg cagaactgaa tcagtcggag 1200

gaacctgagg caggcgagag tagtactgga gggccttgag gggcccacag acagatccca 1260

tccatcagct cccttttctt tttcccttga actgttctgg cctcagacca actctctcct 1320

gtataatctc tctcctgtat aaccccacct tgccaagctt tcttctacaa ccagagcccc 1380

ccacaatgat gattaaacac ctgacacatc ttga 1414

<210> 3

<211> 403

<212> PRT

<213> Murideo

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Acesso Genbank No. ΝΡ_031451

<4 00> 3

Met Pro Ala Gly Thr Ala Ala Arg Ala Trp Val Leu Val Leu Ala Leu1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Ala Gly Gly Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30Pro Leu Val Leu Ser Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Gln

35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Gln Ile Leu Pro Asn65 70 75 80

Gly Ser Leu Leu Leu Pro Ala Thr Gly Ile Val Asp Glu Gly Thr Phe

85 90 95

Arg Cys Arg Ala Thr Asn Arg Arg Gly Lys Glu Val Lys Ser Asn Tyr

100 105 110

Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Pro

115 120 125

Ala Ser Glu Leu Thr Ala Ser Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val

130 135 140

Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly145 150 155 160

Lys Leu Leu Ile Pro Asp Gly Lys Glu Thr Leu Val Lys Glu Glu Thr

165 170 175

Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr

180 185 190

Val Ile Pro Thr Gln Gly Gly Thr Thr His Pro Thr Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Phe Ser Leu Gly Leu Pro Arg Arg Arg Pro Leu Asn Thr Ala Pro Ile

210 215 220

Gln Leu Arg Val Arg Glu Pro Gly Pro Pro Glu Gly Ile Gln Leu Leu225 230 235 240

Val Glu Pro Glu Gly Gly Ile Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

245 250 255Thr Cys Ala Ile Ser Ala Gln Pro Pro Pro Gln Val His Trp Ile Lys

260 265 270

Asp Gly Ala Pro Leu Pro Leu Ala Pro Ser Pro Val Leu Leu Leu Pro

275 280 285

Glu Val Gly His Ala Asp Glu Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His

290 295 300

Pro Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Pro Pro Val Ser Ile Arg Val Thr305 310 315 320

Glu Thr Gly Asp Glu Gly Pro Ala Glu Gly Ser Val Gly Glu Ser Gly

325 330 335

Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly Val

340 345 350

Val Ala Leu Leu Val Gly Ala Ile Leu Trp Arg Lys Arg Gln Pro Arg

355 360 365

Arg Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Ser Gln Glu Asp Glu Glu Glu Arg

370 375 380

Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Ala Glu Met Pro Glu Asn Gly Ala385 390 395 400

Gly Gly Pro

<210> 4

<211> 1348

<212> DNA

<213> Murideo

<220><221> misc_feature

<223> Acesso Genbank No. ΝΜ_007425.1

<400> 4

gcaccatgcc agcggggaca gcagctagag cctgggtgct ggttcttgct ctatggggag 60

ctgtagctgg tggtcagaac atcacagccc ggattggaga gccacttgtg ctaagctgta 120

agggggcccc taagaagccg ccccagcagc tagaatggaa actgaacaca ggaagaactg 180

aagcttggaa ggtcctctct ccccagggag gcccctggga cagcgtggct caaatcctcc 240

ccaatggttc cctcctcctt ccagccactg gaattgtcga tgaggggacg ttccggtgtc 300

gggcaactaa caggcgaggg aaggaggtca agtccaacta ccgagtccga gtctaccaga 360

ttcctgggaa gccagaaatt gtggatcctg cctctgaact cacagccagt gtccctaata 420

aggtggggac atgtgtgtct gagggaagct accctgcagg gacccttagc tggcacttag 480

atgggaaact tctgattccc gatggcaaag aaacactcgt gaaggaagag accaggagac 540

accctgagac gggactcttt acactgcggt cagagctgac agtgatcccc acccaaggag 600

gaaccaccca tcctaccttc tcctgcagtt tcagcctggg ccttccccgg cgcagacccc 660

tgaacacagc ccctatccaa ctccgagtca gggagcctgg gcctccagag ggcattcagc 720

tgttggttga gcctgaaggt ggaatagtcg ctcctggtgg gactgtgacc ttgacctgtg 780

ccatctctgc ccagccccct cctcaggtcc actggataaa ggatggtgca cccttgcccc 840

tggctcccag ccctgtgctg ctcctccctg aggtggggca cgcggatgag ggcacctata 900

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência marcadora de estreptavidina

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<210> 6

<211> 1250

<212> DNA

<213> Babuino

<220>

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<222> (20) .. (1231)

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15 10ctg gtc ctc agt ctg tgg ggg gca gta gta ggt gct caa aac ate aca 100

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85

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170

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340 345 350

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9

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<400> 9

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130 135 140

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245 250 255

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355 360 365

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gat gag ggg act ttc cgg tgc cgg aca aca aac agg aat gga aag gag 338

Asp Glu Gly Thr Phe Arg Cys Arg Thr Thr Asn Arg Asn Gly Lys Glu95 100 105

acc aag tcc aat tac cga gtc cgg gtc tac cag att cct ggg aag cca 386

Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro110 115 120

gag ate ctg gat cct gcc tet gaa ctc acg gcc ggt ate ccc agt aag 434

Glu Ile Leu Asp Pro Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Ile Pro Ser Lys125 130 135

gtg ggg aca tgt gtg tet gat ggg gga tat cct ctg ggg act ctc age 482

Val Gly Thr Cys Val Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Leu Gly Thr Leu Ser140 145 150 155

tgg cac atg gat ggg aaa ctc ctg gta cct gac ggg aag gga gtg tet 530

Trp His Met Asp Gly Lys Leu Leu Val Pro Asp Gly Lys Gly Val Ser160 165 170

gtg aag gag cag acc agg agg cat cct gac acg ggg ctc ttc acc ctg 578

Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Asp Thr Gly Leu Phe Thr Leu175 180 185cag tca gag ctg atg gtg act cca gct ggg gga gga ggg cct ccc ccc 62 6

Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Gly Gly Gly Gly Pro Pro Pro190 195 200

acc ttc tcc tgt age ttc age ccc ggc cta ccc cgc cgc cgg gcc tca 674

Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg Arg Arg Ala Ser205 210 215

tac aca gcc ccc ate cag ccc agt gtc tgg gag cct ggg ccc ctg gag 722

Tyr Thr Ala Pro Ile Gln Pro Ser Val Trp Glu Pro Gly Pro Leu Glu220 225 230 235

gtt cgc ttg ctg gtg gag cca gaa ggt gga gea gta gct cct ggt gag 770

Val Arg Leu Leu Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Glu240 245 250

act gtg acc ctg acc tgt gaa gct cct gcc cag ccc cct cct caa ate 818

Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Ala Pro Ala Gln Pro Pro Pro Gln Ile255 260 265

cac tgg atg aag gat ggt atg tcc cta ccc ctg ccc ccc age ccc gtc 866

His Trp Met Lys Asp Gly Met Ser Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val270 275 280

ctg ctc ctc cct gag gtg ggg cct caa gat gag ggg act tac age tgc 914

Leu Leu Leu Pro Glu Val Gly Pro Gln Asp Glu Gly Thr Tyr Ser Cys285 290 295gtg gcc acc cat ccc aac cgt ggg ccc cag gaa age ctt ccc ate age 962

Val Ala Thr His Pro Asn Arg Gly Pro Gln Glu Ser Leu Pro Ile Ser300 305 310 315

ate agt gtc gag aca ggc gag gat ggg ccg act gea ggc tet gag ggt 1010

Ile Ser Val Glu Thr Gly Glu Asp Gly Pro Thr Ala Gly Ser Glu Gly320 325 330

ggc tca ggc ctg ggg act cta gct ctg gcc ctg ggg ate ctg gga ggc 1058

Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly335 340 345

ctg gga aca gct gcc ctg ctt gtc gga gtc ate ctg tgg cga agg cgg 1106

Leu Gly Thr Ala Ala Leu Leu Val Gly Val Ile Leu Trp Arg Arg Arg350 355 360

aaa cgc caa gga gag cag agg aaa gtc ccc gaa aac cag gag gac gag 1154

Lys Arg Gln Gly Glu Gln Arg Lys Val Pro Glu Asn Gln Glu Asp Glu365 370 375

gag gaa cgc aca gaa ctg cat cag tcg gag gct cgg gag gcg atg gag 1202

Glu Glu Arg Thr Glu Leu His Gln Ser Glu Ala Arg Glu Ala Met Glu380 385 390 395

age ggt aca gga gag ccc tga atagtttagc ggccgcattc ttatSer Gly Thr Gly Glu Pro400

1247<210> 13

<211> 401

<212> PRT

<213> Coelho

<400> 13

Met Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Trp Val Leu Val Phe Ser Leu1 5 10 15

Trp Gly Ala Ala Val Gly Gly Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu

20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Gln

35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Ser Trp Asp Ser Val Ala His Val Leu Pro Asn65 70 75 80

Gly Ser Leu Leu Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Thr Phe

85 90 95

Arg Cys Arg Thr Thr Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr

100 105 110

Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Leu Asp Pro

115 120 , 125

Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Ile Pro Ser Lys Val Gly Thr Cys Val

130 135 140

Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Leu Gly Thr Leu Ser Trp His Met Asp Gly145 150 155 160

Lys Leu Leu Val Pro Asp Gly Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr

165 170 175Arg Arg His Pro Asp Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met

180 185 190

Val Thr Pro Ala Gly Gly Gly Gly Pro Pro Pro Thr Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg Arg Arg Ala Ser Tyr Thr Ala Pro Ile

210 215 220

Gln Pro Ser Val Trp Glu Pro Gly Pro Leu Glu Val Arg Leu Leu Val225 230 235 240

Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr

245 250 255

Cys Glu Ala Pro Ala Gln Pro Pro Pro Gln Ile His Trp Met Lys Asp

260 265 270

Gly Met Ser Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Leu Leu Pro Glu

275 280 285

Val Gly Pro Gln Asp Glu Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Pro

290 295 300

Asn Arg Gly Pro Gln Glu Ser Leu Pro Ile Ser Ile Ser Val Glu Thr305 310 315 320

Gly Glu Asp Gly Pro Thr Ala Gly Ser Glu Gly Gly Ser Gly Leu Gly

325 330 335

Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly Thr Ala Ala

340 345 350

Leu Leu Val Gly Val Ile Leu Trp Arg Arg Arg Lys Arg Gln Gly Glu

355 360 365

Gln Arg Lys Val Pro Glu Asn Gln Glu Asp Glu Glu Glu Arg Thr Glu

370 375 380

Leu His Gln Ser Glu Ala Arg Glu Ala Met Glu Ser Gly Thr Gly Glu385 390 395 400Pro

<210> 14

<211> 402

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Genbank No. ΝΡ_445788

<4 00> 14

Met Pro Thr Gly Thr Val Ala Arg Ala Trp Val Leu Val Leu Ala Leu1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Ala Gly Gly Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu

20 25 30

Pro Leu Met Leu Ser Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Thr Gln Lys

35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Gly Asp Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Ile Leu Pro Asn65 70 75 80

Gly Ser Leu Leu Leu Pro Ala Ile Gly Ile Val Asp Glu Gly Thr Phe

85 90 95

Arg Cys Arg Ala Thr Asn Arg Leu Gly Lys Glu Val Lys Ser Asn Tyr100 105 110Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asn Pro

115 120 125

Ala Ser Glu Leu Thr Ala Asn Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val

130 135 140

Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly145 150 155 160

Lys Pro Leu Ile Pro Asp Gly Lys Gly Thr Val Val Lys Glu Glu Thr

165 170 175

Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr

180 185 190

Val Thr Pro Ala Gln Gly Gly Thr Thr Pro Thr Tyr Ser Cys Ser Phe

195 200 205

Ser Leu Gly Leu Pro Arg Arg Arg Pro Leu Asn Thr Ala Pro Ile Gln

210 215 220

Pro Arg Val Arg Glu Pro Leu Pro Pro Glu Gly Ile Gln Leu Leu Val225 230 235 240

Glu Pro Glu Gly Gly Thr Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr

245 250 255

Cys Ala Ile Ser Ala Glp Pro Pro Pro Gln Ile His Trp Ile Lys Asp

260 265 270

Gly Thr Pro Leu Pro Leu Ala Pro Ser Pro Val Leu Leu Leu Pro Glu

275 280 285

Val Gly His Glu Asp Glu Gly Ile Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Pro

290 295 300

Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Pro Pro Val Asn Ile Arg Val Thr Glu305 310 315 320

Thr Gly Asp Glu Gly Gln Ala Ala Gly Ser Val Asp Gly Ser Gly Leu

325 330 335Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly Ile Ala

340 345 350

Ala Leu Leu Ile Gly Ala Ile Leu Trp Arg Lys Arg Gln Pro Arg Leu

355 360 365

Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Ser Gln Glu Asp Glu Glu Glu Arg Ala

370 375 380

Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Ala Glu Met Pro Glu Asn Gly Ala Gly385 390 395 400

Gly Pro

<210> 15

<211> 5301

<212> DNA

<213> babuino

<400> 15

ttttttaaaa actactattt gaaaattgga gggggaagag tgggaaggga gttattgcca 60

aatatgttaa atatgggttg gggtgcttgt atatgtatct tcctcaattt ccccagaaat 120

gaggtatctt tttgtcacac caaaatcaag tggtagggag agggaggagg ttgcaaaaag 180

ccaagtgtgg gggaaaagta aaatcaacac tgtcccatcc tcagccctaa accctaccat 240

ctgatcccct cagacattct caggattttg caagactgtc agagtgggga acccctccca 300

ttaaagatct gggcaggact ggggacaggt tggaagtgtg atgggtgggg gggtgggagg 360

catgggctgg gggcagttct ctcctcactt gtaaacttgt gtagtttcac agaaaaaaaa 420

caaaatgcag ttttaaataa agaagtttct ttttttcctg ggtttagttg agaatttttt 480

tcaaaaaaca tgagaaaccc cagaaaaaaa aatatatatt ttctttcacg aagctccaaa 540

caggtttctc tcctgtcccc cagccttgcc ttcacgatgc agtcccaatt gcacccttgc 600aaacaacagt ctggcctcaa cgctattgat gcaaccttgc ccagtcaaca tggggctcca 660

gtgggtcacc aggcagccct gatggactga tggaataaat aggatagggg gctctgaggg 720

aatgagaccc tagagggtac actccccatc ccccagggaa gtgactgtgt ccagaggctg 780

gtagtgccca ggggtggggt gataattatt tctctagtac ctgaaggact cttgtcccaa 840

aggcatgaat tcctagcatt ccctgtgaca agatgactga aagatggggg ctggagagag 900

ggtacaggcc ccacctaggg cggaggccac agcgcggaga ggggcagaca gagctatgag 960

cctggaagga agcaggatgg cagccggagc agcagttgga gcctgggtgc tggtcctcag 1020

tctgtggggt gagccactcc ccccacccac tgacccttcc tacagaaagc acttgaaccc 1080

cataccccaa ttgccctaga acttttccca gaacccaggg aactgctttt caaggtcccg 1140

cacgcaccct gtccaaattt tgttagccct cattaccttc ctgcccctct accacgatgc 1200

tgtctcccag gggcagtagt aggtgctcaa aacatcacag cccggatcgg tgagccactg 1260

gtgctgaagt gtaagggggc ccccaagaaa ccaccccagc agctggaatg gaaactggta 1320

agtggggatc ctgttgcagc ttcccaactt ccagggagac cagcaatgat tcggatcccc 1380

atcactctgc ctcacagtac tttcccaaag gccttgcact gtttaggccc tgcttctctg 1440

cttctagaat acaggccgga cagaagcttg gaaggtccta tctccccagg gaggcccctg 1500

ggatagtgtg gctcgtgtcc ttcccaacgg ctccctcttc cttccggctg tcgggatcca 1560

ggatgagggg attttccggt gccaggcaat gaacaggaat ggaaaggaga ccaagtccaa 1620

ctaccgagtc cgtgtctacc gtaagaattc cagggccttc tccaaggccc cctctcttat 1680

ctcagaaaaa gccttcaacc ctagccttgg cccatgaggg cctctgactt ccactggccc 1740

catttccaca cacagagttt gagaaccttc acaattacag cctctgattg gatttttcct 1800

tcttcagaga ttcctgggaa gccggaaatt atagattctg cctctgaact cacggctggt 1860

gttcccaaca aggtagtgaa agaaaggaga agtagaaaat ggtcctgtga acaggaggcg 1920

agtgtgtgtg ggtgtgtggc atctctcatt ttcaaaggat tctgaggtca ccactctttc 1980

cccaggtggg gacatgtgtg tcagagggaa gctaccctgc agggactctt agctggcact 2040

tggatgggaa gcccctggtg cctaatgaga agggtgagtc cgaaggtgcc cgccaagctg 2100

ccttctccct gatctcactc ccacacccac cctgggataa tttgtcttat cctcctacca 2160

taggagtatc tgtgaaggaa gagaccagga gacaccctga gacggggctc ttcacactgc 2220

agtcggagct aatggtgacc ccagcccggg gaggaaatcc ccatcccacc ttctcctgta 2280gcttcagccc aggccttccc cgacgccgggtctggggtga gcagaggtgg ggagggctccacccttaggg aaagagggag tcaagcccattccacctcat aacccttcca actcccagaggtagagccag aaggtggagc agtagctcctcctgcccagc cctctcctca gatccactgggctgggaggt agggtgaacc ataactagcaggcaggctag gagctgagga ggaagagagggagttttgaa atagtctcct ctccccttccccagccctgt gctgatcctc cctgagatagtggccaccca tcccagccac gggccccagggtgagacctc tctccaagcc ctacagaccctaatttcctg ccccattctg gccttacccccccacaccca aacctcccct gccccactcaccttcttccc tctgaactaa aaaaagggaaaatcccaaca ctttgggagg ctgaggccggagtctgacca acatggagga accccatttctggcacgtgc ctgtaatccc agctacttgggggaggcgta agttgcggtg agccaagatcagcgaaactc catctcaaaa aaaaaaaaaaactaaataac cctctctcaa cccgaagtctcagaaccagg cgaggagggg ccaactgcagaagatagccc ccaacacatg tgactgcggggcgcggtggc tcaagcctgt aatcccagcaggtcaggaga tcgagaccat cctggctaacatacaaaaaa ctagccgggc gacgtggcgggaggcaggag aatggtgtaa acccgggaggctgcactcca gcctgggcaa cagagccaga

ccttgcacac agcccctatc cagccccgtg 2340

aagctcatgt gagtgcattc tggaagtcgg 2400

ggccactggg atcactcaca agtgtaactc 2460

cctgtgcctc tggaggaggt ccaattggtg 2520

ggtggaaccg taaccctgac ctgtgaagtc 2580

atgaaggatg tgagtgacct ggagagaggg 2640

acagggaggg cagagggcta acgagggaaa 2700

gtatttgaag atgtggagac aaaaagataa 2760

cccaccaggg tgtgccctta cccctttccc 2820

ggcctcagga ccagggaacc tacaggtgtg 2880

aaagccgtgc tgtcagcatc agcatcatcg 2940

tggggctagg gtgcaggata gcacaggctc 3000

caagagccag cccacctctc cctccgtgca 3060

aattctgcca agagagcagc caagcctctc 3120

agacggctgg gcgcagtggc tcacgcctgt 3180

tggatcacct gaggttggga gttcaagacc 3240

tactaaaaat acaaaattag ccagttgtgg 3300

gaggctgaga caggaaaatc acttgaaccc 3360

ctgccattgc atgccagcct gggcaacaag 3420

aagaaaggga aagactccac tggagctccc 3480

tcctttctga ctggatccaa ctttgtcttc 3540

gtgaggggtt cgagaaagtc agggaagcag 3600

gatggtcaac aagaaaggaa tggtggccgg 3660

ctttgggagg ccgagatggg cggatcacga 3720

acagtaaaac cccatctcta ccaaaaaaaa 3780

gcgcctgtag tcccagctac tcgggaggct 3840

cggagcttgc agtgagctga gatccggcca 3900

ctccatctca aaaaaaaaaa aaaagaaaga 3960aaggaatggt gagtggtggg ggctgtgctc tcaattttcc ctgtctccct acaggctctg 4020

tgggaggatc agggccagga actctagccc tggccctggg gatcctggga ggcctgggga 4080

cagccgctct gctcattggg gtcatcttgt ggcaaaggcg gcgacgccaa cgagaggaga 4140

ggtgagtgga gaaagccaga ctcctcagac ctagggcttc caggcagcaa gtgaagaggg 4200

atggggggtg gaacgacaac gtgcagcatt ctccacaatc ttcctcctca ggaaggcctc 4260

agaaaaccag gaggaagagg aggagcgtgc agagctgaat cagtcggagg aacctgaggc 4 320

aggcgagagt ggtactggag ggccttgagg ggcccacaga gagatcccat ccatcagctc 4 380

ccttttcttc ttcccttgaa ctgttctggc cccagaccaa ctctctcctg tataacccca 4440

ccttgccaaa ctttcttcta caaccagagc cccccacaat gatgagtaaa cacctgacac 4500

atcttgctct tgtgtgtctg tgtatatgtg tgtgagacac aacctcaccc ctacaccctt 4560

gagggccctg aaggaaaggg actcaccccc acactgcacc aaacatctac tcaagttggg 4 620

gagaagatgc ttctgtcaag agagggaggg aggaaggtgg ggggcaaact tgggaagaga 4680

tcccatcaat acatttcacc ttttttattg aatttgtatt aaaggaggta gtaaggggga 4740

ggaagcactt aagagtcaga acccatatta gactctgggg agtgaaaaat taaattaaat 4800

caataagatg ggagtggggg aagagtcaga gggagctttg cccccctttc aagatcaaat 4860

caagaaatca gggaaagcaa agacttagaa gagaagaaag acattctctc aatccatcct 4 920

ccttccccag ggcagagaat tataatgtta ctgagtgagc ttctgagcag aaggctctcc 4980

catctatgca cagacttcac tcctcctccc caagctttcc tggagaatgt ccagggctgg 5040

ccttagccaa cagaaataga gaggtcaagg gggtccatga gtaaggaagg gtcagcaggg 5100

acccccaata ctgattctcc tctggctgga ggtgggcagg aaggagacat agctcaaata 5160

ctgagcagcc aaaaaaagaa gaagatggcg agaaacagga agagggaatc ctgccagctg 5220

gaggccgggt gaccctgtcc cagatccaca cctgtgggag agaggaaagc tgtggaagca 5280

tatgcttcta ggctgggagg g 5301

<210><211><212>

16

119

PRT<213> Rato<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> ΧΤ-Μ4 VH

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Região Variável Pesada

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Asn Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Gly Asp Ile Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Val Met Val Thr Val Ser Ser115<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> Rat

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> ΧΤ-Μ4 VL

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<223> Região Variável Leve

<4 00> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly15 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Arg Met Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Ile Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr His Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210> 18

<211> 119

<212> PRT

<213> Murideo

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> XT-Hl VH

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Região Variável Pesada

<400> 18

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Arg Thr Thr Tyr Asn Ser Thr Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg His Gly Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115

<210> 19

<211> 106<212> PRT

<213> Murídeo

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> XT-Hl VL

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Região Variável Leve

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Leu Gly15 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Phe

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln His Thr Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Phe Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Asn Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Met Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 20

<211> 119

<212> PRT

<213> Murideo

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> XT-H5 VH

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Região Variável Pesada

<400> 20

Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Lys Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr His Asp His Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115

<210> 21

<211> 117

<212> PRT

<213> Murideo

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> XT-H2_VH

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Região Variável Pesada

<4 00> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30Trp Ile

Lys Phe

Ala Tyr80Tyr Cys95

Thr Ser

Val Thr Val Ser Ser115

<210> 22<211> 112<212> PRT

<213> Murideo

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> XT-H2-VL

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Região Variável Leve

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Tyr

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr65 70 75

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

85 90

Ala Arg Trp Ala Gly Tyr Thr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 HO

<400> 22Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile Gly1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser

85 90 95

Asn Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110

<210> 23

<211> 111

<212> PRT

<213> Murídeo

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> XT-H5 VL

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Região Variável Leve<400> 23

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110

<210> 24

<211> 116

<212> PRT

<213> Murídeo

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> XT-H3 VH

<220>

<221> MISC FEATURE<223> Região Variável Pesada

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Leu Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Val Thr Leu Thr Glu Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met His Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Leu Arg Arg Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala115

<210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> Murideo

<220>

<221> MISC FEATURE<223> ΧΤ-Η3 VL<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Região Variável Leve

<400> 25

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Glu Tyr Met Ser Met Ser Phe Gly1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ser Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val Gln Ala65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Thr Tyr Thr Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 26

<211> 116

<212> PRT

<213> Murideo<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> ΧΤ-Η7 VH

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Região Variável Pesada

<400> 26

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln15 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85. 90 95

Arg Tyr Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser115

<210> 27<211> 106<212> PRT

<213> Murideo

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> ΧΤ-Η7 VL

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Região Variável Leve

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Tyr Lys Tyr

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Arg Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210> 28

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-H2_hVH_V2.O Humanizado

<220>

<221> ΜISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia pesada

<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Tyr Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Ala Gly Tyr Thr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ser115

<210> 29

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-H2_hVH_V2.7 Humanizado

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia pesada

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys. Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Ala Gly Tyr Thr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser115

<210><211><212><213>

30

117

PRT

Artificial

<220><223>

XT-H2 hVH V4.0

<220><221><223>

MISC_FEATURE

Seqüências de aminoácidos de regiões variáveishumanizadas de cadeia pesada

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Ala Gly Tyr Thr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser115

<210> 31

<211> 120<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-H2_hVH_V4.1 Humanizado

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia pesada

<4 00> 31

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Tyr Trp Val Ala Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn

50 55 60

Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ala Lys Ser65 70 75 80

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Gly Tyr Thr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-H2_hVL_V2.0 Humanizado<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüência de aminoácidos de regiões variáveishumanizadas de cadeia leve<400> 32

Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser

85 90 95

Asn Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110

<210> 33

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-H2_hVL_V3.0 Humanizado<220>

<221> MISC FEATURE<223> Seqüência de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia leve

<400> 33

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser

85 90 95

Asn Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110

<210> 34

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-H2 hVL V4.0 Humanizado<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüência de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia leve

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser

85 90 95

Asn Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110

<210> 35

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> XT-H2_hVL_V4.1 Humanizado

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüência de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia leve

<400> 35

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser

85 90 95

Asn Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110

<210> 36

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> XT-M4_hVH_V1.0 Humanizado

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia pesada

<400> 36

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Asn Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Ile Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115

<210>

37<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-M4_hVH_Vl.1 Humanizado

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia pesada

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asp Asn Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Ile Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115

<210> 38

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-M4_hVH_V2.O Humanizado

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia pesada

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asp Asn Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn

Ala Arg Gly Gly100

Thr Leu Val Thr115

Ser Leu Arg Ala85

Asp Ile Thr ThrVal Ser Ser

Glu Asp Thr Ala90

Gly Phe Asp Tyr105

Val Tyr Tyr Cys95

Trp Gly Gln Gly110

<210> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-M4_hVL_V2.4 Humanizado \ (G66R)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia leve

<400> 39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 40

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-M4_hVL_V2.5 Humanizado \ (D70I)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia leve

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr20 25 30Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ile Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210><211><212><213>

41

107

PRT

Artificial

<220><223>

XT-M4 hVL V2.6 Humanizado \ (T69S;

<220><221><223>

MISC_FEATURE

Seqüências de aminoácidos de regiões variáveishumanizadas de cadeia leve

<400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 42

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-M4_hVL_V2.7 Humanizado \ (L46R)<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveishumanizadas de cadeia leve

<4 00>

42Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 43

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-M4_hVL_V2.8 Humanizado<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveishumanizadas de cadeia leve<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 44

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-M4_hVL_V2.9 Humanizado \ (F71Y)<220>

<221> MISC FEATURE<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia leve

<400> 44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 45

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223>

XT-M4 hVL V2.10 Humanizado<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia leve

<400> 45

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 46

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> XT-M4_hVL_V2.11 Humanizado

<220>

<221> MIS C_FEAT U RE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia leve

<400> 46

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 47

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> XT-M4_hVL_V2.12 Humanizado

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia leve

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210><211><212>

48

107

PRT<213> Artificial<220>

<223> XT-M4_hVL_V2.13 Humanizado<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveishumanizadas de cadeia leve

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210>

49<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-M4_hVL_V2.14 Humanizado

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis

humanizadas de cadeia leve

<4 00> 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210> 50

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Ligador

<400> 50

Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser1 5 10 15

<210><211><212><213>

51

783

DNA

Artificial

<220>

<223> seqüência XT.H2_VL-VH (direta) ScFv

<4 00> 51

gtggcccagg cggccggcgc gcactccgac atccagatga cccagtcccc ctcctccctg 60tccgcctccg tgggcgaccg ggtgaccatc acctgcaagt ccaccaagtc cctgctgaac 120tccgacggct tcacctacct ggactggtat cagcagaagc ctggcaaggc ccctaagctg 180ctgatctacc tggtgtccga ccggttctcc ggcgtgcctt cccggttcag cggctccggc 240tccggcaccg acttcaccct gaccatctcc tccctccagc ctgaggactt cgccacctac 300tactgcttcc agtccaactc cctgcctctg acctttggcg gcggaacaaa ggtggaaatc 360aaagatggcg gtggatcggg cggtggtgga tctggaggag gtggaagctc tgaggtgcag 420

ctcgtggagt ctggcggcgg actggtgcag cctggcggct ccctgcggct gtcctgcgcc 480

gcctccggct acaccttcac cacctactgg atgcactggg tgcggcaggc ccctggcaag 540

ggcctggagt gggtcgccta catcaaccct tccaccggct ataccgagta caaccagaag 600

ttcaaggacc ggttcaccat ctcccgggac aacgccaaga actccctgta cctccagatg 660

aactccctgc gggccgagga caccgccgtg tactactgcg ccagatgggc tggctacacc 720

atcgactact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcct catctgatca ggcctcaggg 780

gcc 783

<210> 52

<211> 783

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência XT.H2_VH-VL (direta) ScFv

<400> 52

gtggcccagg cggccggcgc gcactccgag gtgcagctcg tggagtctgg cggcggactg 60

gtgcagcctg gcggctccct gcggctgtcc tgcgccgcct ccggctacac cttcaccacc 120

tactggatgc actgggtgcg gcaggcccct ggcaagggcc tggagtgggt cgcctacatc 180

aacccttcca ccggctatac cgagtacaac cagaagttca aggaccggtt caccatctcc 240

cgggacaacg ccaagaactc cctgtacctc cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc 300

gccgtgtact actgcgccag atgggctggc tacaccatcg actactgggg ccagggcacc 360

ctggtgaccg tgtcctcaga tggcggtgga tcgggcggtg gtggatctgg aggaggtgga 420

agctctgaca tccagatgac ccagtccccc tcctccctgt ccgcctccgt gggcgaccgg 480

gtgaccatca cctgcaagtc caccaagtcc ctgctgaact ccgacggctt cacctacctg 540gactggtatc agcagaagcc tggcaaggcc cctaagctgc tgatctacct ggtgtccgac 600cggttctccg gcgtgccttc ccggttcagc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 660accatctcct ccctccagcc tgaggacttc gccacctact actgcttcca gtccaactcc 720ctgcctctga cctttggcgg cggaacaaag gtggaaatca aatctgatca ggcctcaggg 780gcc 783<210> 53 <211> 774 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> seqüência XT.M4_VH_VL ScFv <400> 53 gtggcccagg cggccggcgc gcactccgag gtgcagctgg tggagtctgg cggcggactg 60gtgcagcctg gcggctctct gagactgtct tgtgccgcct ccggcttcac cttcaacaac 120tactggatga cctgggtgag gcaggcccct ggcaagggcc tggagtgggt ggcctccatc 180gacaactccg gcgacaacac ctactacccc gactccgtga aggaccggtt caccatctcc 240agggacaacg ccaagaactc cctgtacctc cagatgaact ccctgagggc cgaggatacc 300gccgtgtact actgtgccag aggcggcgat atcaccaccg gcttcgacta ctggggccag 360ggcaccctgg tgaccgtgtc ctctgatggc ggtggatcgg gcggtggtgg atctggagga 420ggtggaagct ctgacatcca gatgacccag tccccctctt ctctgtctgc ctctgtgggc 480gacagagtga ccatcacctg tcgggcctct caggatgtgg gcatctacgt gaactggttt 540cagcagaagc ctggcaaggc tcccaggcgc ctgatctacc gggccaccaa cctggccgat 600ggcgtgcctt ccagattctc cggctctcgc tctggcaccg atttcaccct gaccatctcc 660tccctccagc ctgaggattt cgccacctac tactgcctgg agttcgacga gcaccctctg 720acctttggcg gcggaacaaa ggtggagatc aagtctgatc aggcctcagg ggcc 774

<210> 54

<211> 774

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência XT.M4_VL_VH ScFv

<400> 54

gtggcccagg cggccggcgc gcactccgac atccagatga cccagtcccc ctcttctctg 60

tctgcctctg tgggcgacag agtgaccatc acctgtcggg cctctcagga tgtgggcatc 120

tacgtgaact ggtttcagca gaagcctggc aaggctccca ggcgcctgat ctaccgggcc 180

accaacctgg ccgatggcgt gccttccaga ttctccggct ctcgctctgg caccgatttc 240

accctgacca tctcctccct ccagcctgag gatttcgcca cctactactg cctggagttc 300

gacgagcacc ctctgacctt tggcggcgga acaaaggtgg agatcaagga tggcggtgga 360

tcgggcggtg gtggatctgg aggaggtgga agctctgagg tgcagctggt ggagtctggc 420

ggcggactgg tgcagcctgg cggctctctg agactgtctt gtgccgcctc cggcttcacc 480

ttcaacaact actggatgac ctgggtgagg caggcccctg gcaagggcct ggagtgggtg 540

gcctccatcg acaactccgg cgacaacacc tactaccccg actccgtgaa ggaccggttc 600

accatctcca gggacaacgc caagaactcc ctgtacctcc agatgaactc cctgagggcc 660

gaggataccg ccgtgtacta ctgtgccaga ggcggcgata tcaccaccgg cttcgactac 720

tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc tcttctgatc aggcctcagg ggcc 774

<210> 55<211> 41

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> extremidade C terminal de formato M4 ScFv - VL/VH

<400> 55

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp1 5 10 15

Ile Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

20 25 30

Ser Ser Ser Asp Gln Ala Ser Gly Ala35 40

<210> 56

<211> 123

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> extremidade C terminal de formato M4 ScFv VL/VH

<400> 56

ctgagggccg aggataccgc cgtgtactac tgtgccagag gcggcgatat caccaccggc 60

ttcgactact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcct cttctgatca ggcctcaggg 120gcc 123<210><211><212><213>

5786DNA

Artificial

<220><223>

oligonucleotideo traçador para mutagênese VH3-CDR3de M4 VL/VH

<220><221><222><223>

misc_feature(61)..(70)N is A, T, C or G

<4 00> 57

caggttgtcg gcccctgagg cctgatcaga ggacacggtc accagggtgc cctggccccannnnnnnnnn tctggcacag tagtac

60

<210><211><212><213>

5853DNA

Artificial

<220><223>

oligonucleotideo traçador para mutagênese VH3-CDR3de M4 VL/VH<220>

<221> misc_feature

<222> (28) .. (37)

<223> N is Α, Τ, C or G

<400> 58

caggttgtcc agggtgccct ggccccannn nnnnnnntct ggcacagtag tac 53

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência Artificial

<4 00> 59

gaccctggaa ggaagcagga tg 22

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência Artificial<400> 60

ggatctgtct gtgggcccct caaggcc 27

<210> 61

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência Artificial

<400> 61

actagactag tcggaccatg gcagcagggg cagcggccgg a

<210> 62

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência Artificial

<400> 62

ataagaatgc ggccgctaaa ctattcaggg ctctcctgta ccgctctc<210> 63

<211> 476

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> proteína de fusão anti-RAGE scFv-Fc

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> huXT-M4 V2.ll scFv-Fc com wt IgGl humano Fc VL-

ligador-VH

<400> 63

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

20 25 30

Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser100 105 110Gly Gly Gly Gly115

Glu Ser Gly Gly130

Cys Ala Ala Ser145

Arg Gln Ala Pro

Ser Gly Asp Asn180

Ile Ser Arg Asp195

Leu Arg Ala Glu210

Ile Thr Thr Gly225

Ser Ser Asp Gln

Pro Cys Pro Ala260

Pro Pro Lys Pro275

Thr Cys Val Val290

Asn Trp Tyr Val305

Arg Glu Glu Gln

Ser Gly Gly Gly120

Gly Leu Val Gln135

Gly Phe Thr Phe150

Gly Lys Gly Leu165

Thr Tyr Tyr Pro

Asn Ala Lys Asn200

Asp Thr Ala Val215

Phe Asp Tyr Trp230

Glu Pro Lys Ser245

Pro Glu Leu Leu

Lys Asp Thr Leu280

Val Asp Val Ser295

Asp Gly Val Glu310

Tyr Asn Ser Thr325

Gly Ser Ser Glu Val125

Pro Gly Gly Ser Leu140

Asn Asn Tyr Trp Met155

Glu Trp Val Ala Ser170

Asp Ser Val Lys Asp185

Ser Leu Tyr Leu Gln205

Tyr Tyr Cys Ala Arg220

Gly Gln Gly Thr Leu235

Ser Asp Lys Thr His250

Gly Gly Pro Ser Val265

Met Ile Ser Arg Thr

285

His Glu Asp Pro Glu300

Val His Asn Ala Lys315

Tyr Arg Val Val Ser330

Gln Leu Val

Arg Leu Ser

Thr Trp Val160

Ile Asp Asn

175Arg Phe Thr190

Met Asn Ser

Gly Gly Asp

Val Thr Val240

Thr Cys Pro

255Phe Leu Phe270

Pro Glu Val

Val Lys Phe

Thr Lys Pro320

Val Leu Thr335Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

340 345 350

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

355 360 365

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

370 375 380

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly385 390 395 400

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

405 410 415

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

420 425 430

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

435 440 445

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

450 455 460

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470 475

<210> 64

<211> 1428

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Codifica a proteína de fusão anti-RAGE scFv-Fc<220>

<221> misc_feature

<223> seqüência huXT-M4 VL V2.Il-VH V2.O wt-Fc

<400> 64

gacatccaga tgacccagtc cccctcttct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggcctctca ggatgtgggc atctacgtga actggtttca gcagaagcct 120

ggcaaggctc ccaggcgcct gatctaccgg gccaccaacc tggccgatgg cgtgccttcc 180

agattctccg gctctcgctc tggcaccgat ttcaccctga ccatctcctc cctccagcct 240

gaggatttcg ccacctacta ctgcctggag ttcgacgagc accctctgac ctttggcggc 300

ggaacaaagg tggagatcaa ggatggcggt ggatcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 360

gggagctctg aggtgcagct ggtggagtct ggcggcggac tggtgcagcc tggcggctct 420

ctgagactgt cttgtgccgc ctccggcttc accttcaaca actactggat gacctgggtg 480

aggcaggccc ctggcaaggg cctggagtgg gtggcctcca tcgacaactc cggcgacaac 540

acctactacc ccgactccgt gaaggaccgg ttcaccatct ccagggacaa cgccaagaac 600

tccctgtacc tccagatgaa ctccctgagg gccgaggata ccgccgtgta ctactgtgcc 660

agaggcggcg atatcaccac cggcttcgac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 720

tcctctgatc aggagcccaa atcttctgac aaaactcaca catgtccacc gtgcccagca 780

Ϊ cctgaactcc tgggtggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 840

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 900

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 960

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1020

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1080

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1140

cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1200

ttctatccaa gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1260

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1320

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1380

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1428

Claims (43)

1. Anticorpo que se liga especificamente aoRAGE, CARACTERIZADO pelo fato de que:(a) compete com a ligação do RAGE com umanticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(b) se liga um epitope do RAGE que é ligado porum anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste emXT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(c) compreende uma ou mais determinações decomplementaridade (CDRs) de uma cadeia leve ou cadeia pesadade um anticorpo selecionado a partir do grupo que consisteem XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4; ou(d) é um fragmento de ligação RAGE de umanticorpo de acordo com (a), (b) ou (c).

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma região decadeia leve variável que compreende pelo menos dois dos CDRsde uma região de cadeia leve variável de um anticorposelecionado a partir do grupo que consiste em XT-H1, XT-H2,XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma região decadeia leve variável que compreende três CDRs de uma regiãode cadeia leve variável de um anticorpo selecionado a partirdo grupo que consiste em XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 eXT-M4.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma região decadeia pesada variável que compreende pelo menos dois dosCDRs de uma região de cadeia pesada variável de um anticorposelecionado a partir do grupo que consiste em XT-H1, XT-H2,XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma região decadeia pesada variável que compreende três CDRs de umaregião de cadeia leve variável de um anticorpo selecionado apartir do grupo que consiste em XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5,XT-H7 e XT-M4.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que compreendeuma região de cadeia leve variável que compreendetrês CDRs de uma região de cadeia leve variável de umanticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4; anda região de cadeia pesada variável que compreendetrês CDRs de uma região de cadeia pesada variável de umanticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende regiões variáveisde cadeia leve e pesada que compreendem três CDRs de umaregião de cadeia leve variável e três CDRs de uma região decadeia pesada variável, respectivamente, de um anticorposelecionado a partir do grupo que consiste em XT-H1, XT-H2,XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga ao RAGEhumano com uma dissociação constante (Kd) na faixa de pelomenos cerca de 1 χ IO-7 M a cerca de 1 χ IO-10 Μ.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga aodomínio V do RAGE humano.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se ligaespecificamente às células de expressão RAGE in vitro.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se ligaespecificamente às células de expressão RAGE in vivo.

12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga ao RAGEe inibe a ligação de um parceiro de ligação RAGE (RAGE-BP)ao RAGE.

13. Anticorpo, que se liga especificamente aoRAGE, CARACTERIZADO pelo fato de que:(a) compreende uma região de cadeia leve variávelselecionada a partir do grupo que consiste em: XT-H1_VL (SEQID NO: 19), XT-H2_VL (SEQ ID NO: 22), XT-H3_VL (SEQ ID NO:-25), XT-H5_VL (SEQ ID NO: 23), XT-H7_VL (SEQ ID NO: 27) eXT-M4_VL (SEQ ID NO: 17), ou(b) compreende uma região de cadeia leve variávelque tem uma seqüência de aminoácidos que pelo menos 90%idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecionada a partirde SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:-23, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 17; ou(c) é um fragmento de ligação RAGE de umanticorpo de acordo com (a) ou (b) .

14. Anticorpo, que se liga especificamente aoRAGE, CARACTERIZADO pelo fato de que:(a) compreende a região de cadeia pesada variávelselecionado a partir do grupo que consiste em: 1XT-H1_VH(SEQ ID NO: 18), XT-H2_VH (SEQ ID NO: 21), XT-H3_VH (SEQ IDNO: 24), XT-H5_VH (SEQ ID NO: 20), XT-H7_VH (SEQ ID NO: 26)e XT-M4_VH (SEQ ID NO: 16), ou(b) compreende uma região de cadeia pesadavariável que tem uma seqüência de aminoácidos que é pelomenos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácidosselecionada a partir de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ IDNO: 24, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 16; ou(c) é um fragmento de ligação RAGE de umanticorpo de acordo com (a) ou (b).

15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADO pelo fato de que:(a) compreende adicionalmente uma região decadeia pesada variável selecionada a partir do grupo queconsiste em: XT-H1_VH (SEQ ID NO: 18), XT-H2_VH (SEQ ID NO:21), XT-H3_VH (SEQ ID NO: 24), XT-H5_VH (SEQ ID NO: 20), XT-H7_VH (SEQ ID NO: 26) e XT-M4_VH (SEQ ID NO: 16), ou(b) compreende uma região de cadeia pesadavariável que tem uma seqüência de aminoácidos que é pelomenos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácidosselecionada a partir de: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQID NO: 24, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 16; ou(c) é um fragmento de ligação RAGE de umanticorpo de acordo com (a) ou (b).

16. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende regiões variáveisde cadeia leve e pesada que têm seqüências de aminoácidosdas regiões variáveis de cadeia leve e pesada,respectivamente, de um anticorpo selecionado a partir dogrupo que consiste em XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 eXT-M4.

17. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que é selecionado a partir dogrupo que consiste em um anticorpo quimérico, um anticorpohumanizado, um anticorpo humano, uma única cadeia deanticorpo, um anticorpo tetramérico, um anticorpotetravalente, um anticorpo multiespecifico, um anticorpo dedomínio específico, um anticorpo excluído por domínio, umaproteína de fusão, um fragmento Fab, um fragmento Fab', umfragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um fragmento ScFv, umfragmento Fd, um único anticorpo de domínio e um fragmentodAb.

18. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos umamutação de um aminoácido em uma região de cadeia pesadavariável ou luminosa que remove um local de glicosilação.

19. Anticorpo quimérico ou um fragmento deligação RAGE do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende uma região de cadeia leve variável seqüência deaminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à seqüência deaminoácidos de região de cadeia leve variável XT-M4 (SEQ IDNO: 17) e uma região de cadeia pesada variável seqüência deaminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à seqüência deaminoácidos de região de cadeia pesada variável XT-M4 (SEQID NO: 16) e que compreende adicionalmente regiõesconstantes derivadas de regiões constantes humanas.

20. Anticorpo quimérico ou um fragmento deligação RAGE do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende:uma região de cadeia leve variável que tem aseqüência de aminoácidos da região de cadeia leve variávelXT-M4 (SEQ ID NO: 17),uma região de cadeia pesada variável que tem aseqüência de aminoácidos da seqüência de região de cadeiapesada variável XT-M4 (SEQ ID NO: 16),uma região constante de cadeia leve de kappahumano e uma região constante de cadeia pesada de IgGlhumano.

21. Anticorpo humanizado ou um fragmento deligação RAGE do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende pelo menos uma região de cadeia leve variávelhumanizada que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência deaminoácidos de uma região de cadeia leve variável humanizadaselecionada a partir do grupo que consiste em:XT-H2_hVL_V2.O (SEQ ID NO:32), XT-H2_hVL_V3.0 (SEQID NO: 33),XT-H2_hVL_V4.0 (SEQ ID NO: 34), XT-H2_hVL_V4. 1(SEQ ID NO: 35),XT-M4_hVL_V2.4 (SEQ ID NO:39 ), XT-M4_hVL_V2. 5(SEQ ID NO: 40),XT-M4_hVL_V2. 6 (SEQ ID NO: 41), XT-M4_hVL_V2.7(SEQ ID NO: 42),XT-M4_hVL_V2.8 (SEQ ID NO: 43), XT-M4_hVL_V2. 9(SEQ ID NO: 44),XT-M4_hVL_V2.10 (SEQ ID NO: 45), XT-M4_hVL_V2.11(SEQ ID NO: 46),XT-M4_hVL_V2.12 (SEQ ID NO: 47), XT-M4_hVL_V2. 13(SEQ ID NO: 48) eXT-M4_hVL__V2. 14 (SEQ ID NO: 49).

22. Anticorpo humanizado ou um fragmento deligação RAGE do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende região de cadeia pesada variável humanizada que épelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácidos deuma região de cadeia pesada variável humanizada selecionadaa partir do grupo que consiste em:XT-H2_hVH_V2. 0 (SEQ ID NO: 28), XT-H2_hVH_V2.7(SEQ ID NO: 29),XT-H2_hVH_V4 (SEQ ID NO: 30), XT-H2_hVH_V4. 1 (SEQID NO: 31),XT-M4_hVH_Vl. 0 (SEQ ID NO: 36), XT-M4_hVH_Vl. 1(SEQ ID NO: 37) eXT-M4 hVH V2.0 (SEQ ID NO: 38).

23. Anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo,de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende adicionalmente uma região de cadeia pesadavariável humanizada que é pelo menos 90% idêntica a umaseqüência de aminoácidos de uma região de cadeia pesadavariável humanizada selecionada a partir do grupo queconsiste em:XT-H2_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 28), XT-H2_hVH_V2. 7(SEQ ID NO: 29) ,XT-H2_hVH_V4 (SEQ ID NO: 30), XT-H2_hVH_V4.1 (SEQID NO: 31),XT-M4_hVH_Vl.0 (SEQ ID NO: 36), XT-M4_hVH_Vl.1(SEQ ID NO: 37) eXT-M4_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 38).

24. Anticorpo humanizado que se liga especifica-mente ao RAGE ou um fragmento de ligação RAGE do mesmo,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpoXT-M4 humanizado.

25. Anticorpo humanizado que se liga especifica-mente ao RAGE ou um fragmento de ligação FlAGE do mesmo,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpoXT-H2 humanizado.

26. Anticorpo que se liga especificamente ao RAGEe bloqueia a ligação de um parceiro corporal RAGE,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo tem CDRs que têmpelo menos 8 das seguintes características;a. uma seqüência de aminoácidos Y-X-M (Y32; X33;M34 ) no VH CDR1, onde X é preferencialmente W ou N;b. uma seqüência de aminoácidos I-N-X-S (151;N52; X53 e S54) no VH CDR2, onde X é P ou N;c. um aminoácido na posição 58 no CDR2 do VH éTreonina;d. um aminoácido na posição 60 no CDR2 do VH éTirosina;e. um aminoácido na posição 103 no CDR3 do VH éTreonina;f. um ou mais resíduos de Tirosina no CDR3 doVH;g. um resíduo positivamente carregado (Arg ouLys) na posição 24 no CDRl do VL;h. um resíduo hidrofílico (Thr ou Ser ) naposição 26 no CDRl do VL;i. um resíduo pequeno Ser ou Ala na posição 25no CDRl do VL;j. um resíduo negativamente carregado (Asp ouGlu) na posição 33 no CDRl do VL;k. o resíduo aromático (Phe ou Tyr ou Trp) naposição 37 no CDRl do VL;l. um resíduo hidrofílico (Ser ou Thr) naposição 57 no CDR2 do VL;m. uma seqüência P-X-T na extremidade do CDR3 doVL onde X pode ser o resíduo hidrofílico Leu ou Trp;sendo que a posição de aminoácido ocorre conformemostrado nas seqüências de aminoácidos de cadeia pesada eluminosa na SEQ ID NO:22 and SEQ ID NO:16, respectivamente.

27. Ácido nucléico isolado, CARACTERIZADO pelofato de que compreende uma seqüência de nucleotideo quecodifica uma região variável de anticorpo anti-RAGEselecionada a partir do grupo que consiste em:XT-H1_VL (SEQ ID NO: 19), XT-H2_VL (SEQ ID NO:- 22), XT-H3_VL (SEQ ID NO: 25), XT-H5_VL (SEQ ID NO: 23), XT-H7_VL (SEQ ID NO: 27), XT-M4_VL (SEQ ID NO: 17), XT-H1_VH(SEQ ID NO: 18), XT-H2_VH (SEQ ID NO: 21), XT-H3_VH (SEQ IDNO: 24), XT-H5_VH (SEQ ID NO: 20), XT-H7_VH (SEQ ID NO: 26)e XT-M4_VH (SEQ ID NO: 16).

28. Ácido nucléico isolado, CARACTERIZADO pelofato de que hibridiza especificamente em um ácido nucléicoque tem uma seqüência de nucleotideo que é o complemento deuma seqüência de nucleotideo que codifica uma regiãovariável de anticorpo anti-RAGE selecionada a partir dogrupo que consiste em:XT-H1_VL (SEQ ID NO: 19), XT-H2_VL (SEQ ID NO:22), XT-H3_VL (SEQ ID NO: 25), XT-H5_VL (SEQ ID NO: 23), XT-H7_VL (SEQ ID NO: 27), XT-M4_VL (SEQ ID NO: 17), XT-H1_VH(SEQ ID NO: 18), XT-H2_VH (SEQ ID NO: 21), XT-H3_VH (SEQ IDNO: 24), XT-H5_VH (SEQ ID NO: 20), XT-H7_VH (SEQ ID NO: 26)e XT-M4_VH (SEQ ID NO: 16), sob condições de hibridizaçãorigorosas.

29. Ácido nucléico isolado, CARACTERIZADO pelofato de que compreende uma seqüência de nucleotideo quecodifica uma região variável de anticorpo anti-RAGEselecionada a partir do grupo que consiste em:XT-H2_hVL_V2.O (SEQ ID NO:32), XT-H2_hVL_V3.0 (SEQID NO: 33) ,XT-H2_hVL_V4.0 (SEQ ID NO: 34), XT-H2_hVL_V4.1(SEQ ID NO: 35) ,XT-M4_hVL_V2.4 (SEQ ID NO:39 ), XT-M4_hVL_V2.5(SEQ ID NO: 40),XT-M4_hVL_V2. 6 (SEQ ID NO: 41), XT-M4_hVL_V2.7(SEQ ID NO: 42),XT-M4_hVL_V2.8 (SEQ ID NO: 43), XT-M4_hVL_V2. 9(SEQ ID NO: 44),XT-M4_hVL_V2.10 (SEQ ID NO: 45), XT-M4_hVL_V2. 11(SEQ ID NO: 4 6),XT-M4_hVL_V2. 12 (SEQ ID NO: 47), XT-M4_hVL_V2. 13(SEQ ID NO: 48) eXT-M4_hVL_V2. 14 (SEQ ID NO: 4 9), XT-H2_hVH_V2.0(SEQ ID NO: 28),XT-H2_hVH_V2.7 (SEQ ID NO: 29), XT-H2_hVH_V4 (SEQID NO: 30),XT-H2_hVH_V4 . 1 (SEQ ID NO: 31), XT-M4_hVH_Vl. 0(SEQ ID NO: 36),XT-M4_hVH_Vl.1 (SEQ ID NO: 37) e XT-M4_hVH_V2.0(SEQ ID NO: 38).

30. Ácido nucléico isolado, CARACTERIZADO pelofato de que hibridiza especificamente em um ácido nucléicoque tem uma seqüência de nucleotideo que é o complemento deuma seqüência de nucleotideo que codifica uma regiãovariável de anticorpo anti-RAGE selecionada a partir dogrupo que consiste em:XT-H2_hVL_V2.O (SEQ ID NO:32), XT-H2_hVL_V3.0 (SEQID NO: 33),XT-H2_hVL_V4.0 (SEQ ID NO: 34), XT-H2_hVL_V4.1(SEQ ID NO: 35),XT-M4_hVL_V2.4 (SEQ ID NO:39 ), XT-M4_hVL_V2.5(SEQ ID NO: 40),XT-M4_hVL_V2. 6 (SEQ ID NO: 41), XT-M4_hVL_V2.7(SEQ ID NO: 42),XT-M4_hVL_V2.8 (SEQ ID NO: 43), XT-M4_hVL_V2. 9(SEQ ID NO: 44),XT-M4_hVL_V2.10 (SEQ ID NO: 45), XT-M4_hVL_V2. 11(SEQ ID NO: 46),XT-M4_hVL_V2.12 (SEQ ID NO: 47), XT-M4_hVL_V2. 13(SEQ ID NO: 48) eXT-M4_hVL_V2.14 (SEQ ID NO: 4 9), XT-H2_hVH_V2.0(SEQ ID NO: 28),XT-H2_hVH_V2.7 (SEQ ID NO: 29), XT-H2_hVH_V4 (SEQID NO: 30),XT-H2_hVH_V4.1 (SEQ ID NO: 31), XT-M4_hVH_Vl.0(SEQ ID NO: 36),XT-M4_hVH_Vl.1 (SEQ ID NO: 37) e XT-M4_hVH_V2.0(SEQ ID NO: 38),sob condições de hibridização rigorosas.

31. Ácido nucléico isolado, CARACTERIZADO pelofato de que compreende:(a) uma seqüência de nucleotideo que codificaRAGE de babuino, macaco ou coelho que tem uma seqüência deaminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste emSEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 13;(b) um ácido nucléico que hibridizaespecificamente no complemento de (a): ou(c) uma seqüência de nucleotideo que é 95%idêntica à seqüência de nucleotideo que codifica RAGE debabuino, macaco ou coelho selecionado a partir do grupo queconsiste em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQID NO: 12, quando a cobertura de pergunta é de 100%;

32. Método de tratamento de um indivíduo que temuma doença ou transtorno relacionado com RAGE, CARACTERIZADOpelo fato de que compreende administrar ao indivíduo umaquantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo que:(a) compete com a ligação ao RAGE com umanticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(b) se liga a um epítope do RAGE que é ligado porum anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste emXT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(c) compreende uma ou mais determinações decomplementaridade (CDRs) de uma cadeia leve ou cadeia pesadade um anticorpo selecionado a partir do grupo que consisteem XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4; ou(d) é um fragmento de ligação RAGE de umanticorpo de acordo com (a), (b) ou (c) .

33. Método, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADO pelo fato de que a doença ou transtornorelacionado com RAGE é selecionada a partir do grupo queconsiste em sepse, choque séptico, listeriose, doençainflamatória, cânceres, artrites, doença de Crohn, doençasinflamatórias agudas crônicas, doenças cardiovasculares,disfunção erétil, diabetes, complicações de diabetes,vasculite, nefropatias, retinopatias e neuropatias.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar oanticorpo ou fragmento de ligação RAGE do mesmo emcombinação com um ou mais agentes úteis no tratamento dedoença ou transtorno relacionado com RAGE que será tratada.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente é selecionado apartir do grupo que consiste em: agentes antiinflamatórios,antioxidantes, bloqueadores β, agentes anti-plaquetas,inibidores ACE, agentes de redução de lipideo, agentes anti-angiogênicos e quimioterapêuticos.

36. Método de tratamento de sepse ou choqueséptico em um indivíduo humano, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende administrar ao indivíduo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-RAGE quiméricoou humanizado que compreende regiões constantes derivadas deregiões constantes humanas que:(a) compete com a ligação ao RAGE com umanticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(b) se liga a um epítope do RAGE que é ligado porum anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste emXT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(c) compreende uma ou mais determinações decomplementaridade (CDRs) de uma cadeia leve ou cadeia pesadade um anticorpo selecionado a partir do grupo que consisteem XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4; ou(d) é um fragmento de ligação RAGE de umanticorpo de acordo com (a), (b) ou (c).

37. Método de tratamento de sepse ou choqueséptico em um indivíduo humano, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende administrar ao indivíduo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-RAGE quiméricoou fragmento de ligação RAGE do mesmo, que compreende:uma região de cadeia leve variável que tem aseqüência de aminoácidos da região de cadeia leve variávelXT-M4 (SEQ ID NO: 17),uma região de cadeia pesada variável que tem aseqüência de aminoácidos da seqüência de região de cadeiapesada variável XT-M4 (SEQ ID NO: 16),uma região constante de cadeia leve de kappahumano e uma região constante de cadeia pesada de IgGlhumano.

38. Método de tratamento de listeriose sistêmicaem um indivíduo humano, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende administrar a indivíduo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-RAGE quiméricoou humanizado que compreende regiões constantes derivadas deregiões constantes humanas que:(a) compete com a ligaçao ao RAGE com umanticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(b) se liga um epitope do RAGE que é ligado porum anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste emXT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(c) compreende uma ou mais determinações decomplementaridade (CDRs) de uma cadeia leve ou cadeia pesadade um anticorpo selecionado a partir do grupo que consisteem XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4; ou(d) é um fragmento de ligação RAGE de umanticorpo de acordo com (a), (b) ou (c) .

39. Método de tratamento de listeriose sistêmicaem um indivíduo humano, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende administrar ao indivíduo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-RAGE quimérico,ou um fragmento de ligação RAGE do mesmo que compreende:uma região de cadeia leve variável que tem aseqüência de aminoácidos da região de cadeia leve variávelXT-M4 (SEQ ID NO: 17),uma região de cadeia pesada variável que tem aseqüência de aminoácidos da seqüência de região de cadeiapesada variável XT-M4 (SEQ ID NO: 16),uma região constante de cadeia leve de kappahumano e uma região constante de cadeia pesada de IgGlhumano.

40. Método de inibir a ligação de um parceiro deligação RAGE (RAGE-BP), o RAGE em um indivíduo mamífero,CARACTERIZADO pelo fato de administrar ao indivíduo umaquantidade inibitória de um anticorpo anti-RAGE quimérico ouhumanizado que compreende regiões constantes derivadas deregiões constantes humanas, e:(a) compete com a ligação ao RAGE com umanticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(b) se liga a um epítope do RAGE que é ligado porum anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste emXT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(c) compreende uma ou mais determinações decomplementaridade (CDRs) de uma cadeia leve ou cadeia pesadade um anticorpo selecionado a partir do grupo que consisteem XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4; ou(d) é um fragmento de ligação RAGE de umanticorpo de acordo com (a), (b) ou (c) .

41. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se ligaespecificamente ao RAGE solúvel (sRAGE).

42. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 41,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se ligaespecificamente ao sRAGE selecionado a partir do grupo queconsiste em sRAGE de murídeo e sRAGE humano.

43. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 42,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se ligaespecificamente ao sRAGE com uma dissociação constante (Kd)na faixa de cerca de 1 χ IO"9 M a cerca de 5 χ 10"9 Μ.