JP2006516884A - リアノジン受容体の単離および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号2、4、6、8、10、128、130、144、および146と他のイオンチャンネルおよび受容体ポリペプチド配列とを比較し;
(b)工程aにおいて得られる4もしくはそれ以上のアミノ酸の保存配列を同定し;
(c)工程bにおいて同定される保存配列に基づいて縮重オリゴマーを設計し;そして
(d)工程cの縮重オリゴマーを使用して、配列依存的プロトコルによって、リアノジン受容体活性を有するポリペプチドをコードする配列を単離する
ことを含んでなる、リアノジン受容体および関連ポリペプチドをコードする核酸フラグメントを単離するための方法に関する。
(a)上記の組換え構築物のいずれか1つで宿主細胞を形質転換し;
(b)組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主細胞を増殖させ、ここで、組換え構築物の発現はカルシウムホメオスタシスの変更を生じ;
(c)試験しようとする化合物で、工程(a)の形質転換された宿主細胞を処置し、そして
(d)カルシウム放出を変更する能力を有する化合物を選択するために、試験化合物による細胞内ホメオスタシスの変化を測定する
ことを含んでなる。
(a)少なくとも1つの化合物と上記の単離された核酸フラグメントのいずれか1つによりコードされるポリペプチドとを接触させ;そして
(b)前記ポリペプチドを化合物と接触させた後、(a)のポリペプチドのリアノジン受容体活性を評価する
ことを含んでなる。
a)少なくとも100アミノ酸を有する第1のポリペプチドをコードする単離された核酸配列を得て;
b)第1のポリペプチド配列と、配列番号63〜119よりなる群から選択される比較ポリペプチド配列とを比較して、第1のポリペプチドと比較ポリペプチドとの間で100%の配列同一性を有する領域を同定し、ここで、前記領域は比較ポリペプチドと同じ長さであり;そして
c)異なる比較ポリペプチド配列で工程(b)を反復し、ここで、前記異なる比較ポリペプチド配列は、100%の配列同一性を有する第2の領域が見出されるまで、配列番号63〜119よりなる群から選択され、ここで、前記第2の領域は異なる比較ポリペプチドと同じ長さである
ことを含んでなる、昆虫イオンチャンネルをコードする核酸配列を同定するための方法であり得る。該方法は、100〜6,000アミノ酸の長さを有する第1のポリペプチドの長さによってさらに特徴付けられ得る。
a)毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを5’から3’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメント、および/またはインフレーム翻訳停止コドンを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメント、および/またはインフレーム翻訳停止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも1つの核酸配列によって各末端上において隣接され;そして
b)組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法であり得る。削除可能な配列は、lox部位などであるがこれに限定されない組換え酵素によって認識される任意の配列であってもよい。
a)毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを5’から3’方向で含んでなる組換え発現構築物で宿主を形質転換し、ここで、前記フラグメントはまた、前記フラグメントの発現を妨害するイントロンを含んでなり、そして
b)組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法であり得る。
本発明は、本出願の一部をなす下記の詳細な説明ならびに添付の図面および配列表によりさらに完全に理解することができる。
(a)本明細書に記載の組換え構築物で宿主細胞を形質転換し;
(b)組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主細胞を増殖させ、ここで、組換え構築物の発現はカルシウムホメオスタシスの変更を生じ;
(c)試験しようとする化合物で、工程(a)の形質転換された宿主細胞を処置し、そして
(d)カルシウム放出を変更する能力を有する化合物を選択するために、試験化合物による細胞内カルシウムホメオスタシスの変化を測定する
ことを含んでなる。
(a)少なくとも1つの化合物と本発明の単離された核酸フラグメントによりコードされるポリペプチドとを接触させ;そして
(b)前記ポリペプチドを化合物と接触させた後、(a)のポリペプチドのリアノジン受容体活性を評価する
ことを含んでなる。
(a)配列番号2、4、6、8、10、128、130、144、および146と他のイオンチャンネルおよび受容体ポリペプチド配列とを比較し;
(b)工程aにおいて得られる4もしくはそれ以上のアミノ酸の保存配列を同定し;
(c)工程bにおいて同定される保存配列に基づいて縮重オリゴマーを設計し;そして
(d)工程cの縮重オリゴマーを使用して、配列依存的プロトコルによって、リアノジン受容体活性を有するポリペプチドをコードする配列を単離する
ことを含んでなる、リアノジン受容体および関連ポリペプチドをコードする核酸フラグメントを単離するための方法に関する。
(a)上記の組換え構築物のいずれか1つか、または配列番号56〜62のいずれか1つを含有する任意の組換え構築物で宿主細胞を形質転換し;
(b)組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主細胞を増殖させ、ここで、組換え構築物の発現はカルシウムホメオスタシスの変更を生じ;
(c)試験しようとする化合物で、工程(a)の形質転換された宿主細胞を処置し、そして
(d)カルシウム放出を変更する能力を有する化合物を選択するために、試験化合物による細胞内カルシウムホメオスタシスの変化を測定する
ことを含んでなる。
(a)少なくとも1つの化合物と上記の単離された核酸フラグメントのいずれか1つによりコードされるポリペプチドとを接触させ;そして
(b)前記ポリペプチドを化合物と接触させた後、(a)のポリペプチドのリアノジン受容体活性を評価する
ことを含んでなる。
a)少なくとも100アミノ酸を有する第1のポリペプチドをコードする単離された核酸配列を得て;
b)第1のポリペプチド配列と、配列番号63〜119よりなる群から選択される比較ポリペプチド配列とを比較して、第1のポリペプチドと比較ポリペプチドとの間で100%の配列同一性を有する領域を同定し、ここで、前記領域は比較ポリペプチドと同じ長さであり;そして
c)異なる比較ポリペプチド配列で工程(b)を反復し、ここで、前記異なる比較ポリペプチド配列は、100%の配列同一性を有する第2の領域が見出されるまで、配列番号63〜119よりなる群から選択され、ここで、前記第2の領域は異なる比較ポリペプチドと同じ長さである
ことを含んでなる、昆虫イオンチャンネルをコードする核酸配列を同定するための方法であり得る。該方法は、100〜6,000アミノ酸の長さを有する第1のポリペプチドの長さによってさらに特徴付けられ得る。
a)毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを5’から3’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメント、および/またはインフレーム翻訳停止コドンを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメント、および/またはインフレーム翻訳停止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも1つの核酸配列によって各末端上において隣接され;そして
b)組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法であり得る。削除可能な配列は、lox部位などであるがこれに限定されない組換え酵素によって認識される任意の配列であってもよい。
a)毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを5’から3’方向で含んでなる組換え発現構築物で宿主を形質転換し、ここで、前記フラグメントはまた、前記フラグメントの発現を妨害するイントロンを含んでなり、そして
b)組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法であり得る。
タバコガからのリアノジン受容体核酸フラグメントの単離
液体N2中で新鮮凍結し、冷却モーターにおいて粉体に粉砕した2gの4齢および5齢タバコガ幼虫から全RNAを抽出した。粉体を20mlのトリゾル(TriZOL)TMで、15秒間激しく振盪し、次いで、サンプルを30℃で3分間インキュベーションすることによって、抽出した。2mlのクロロホルムを添加し、振盪およびインキュベーション処置を反復した。サンプルを12,000gで10分間、8℃でスピンし、水相を新しいチューブに移した。5mlのイソプロピルアルコールおよび1.2M NaClを含有する5mlの0.8Mクエン酸ナトリウムを水性画分と混合し、室温で10分間後、サンプルに二度目の遠心分離を行った。ペレットを10mlの70%EtOHで洗浄し、懸濁液を7500gで5分間、再度遠心分離し、2mlの水に溶解する前に、得られたペレットを乾燥させた。オリゴTプライム化cDNA合成では、テンプレートとしてこの全RNA、および添付されているプロトコルに従って、インビトロゲン(Invitrogen)TMから購入したcDNA合成キットを使用した。
A−F1:CCTGARGCNYTNAAYATGAT (配列番号11)
A−F2:GATCCTAARGTNYTNGAYGT (配列番号12)
A−F3:AAGTGGTAYTTYGARTTYGA (配列番号13)
A−R1:TCGAAYTCRAARTACCAYTTNCC (配列番号14)
A−R2:AATGGYTCRTANCCYTCYTG (配列番号15)。
D−F1:GAGCAGGAYGAYGTNWSNTT (配列番号16)
D−F2:GCTGCTGARGGNTTYGGNAA (配列番号17)
D−F3:GGTGARGCNTGYTGGTGGAC (配列番号18)
D−R1:GTCCACCARCANGCYTCNCC (配列番号19)
D−R2:ACTCKTACYTTYTCNCCYTC (配列番号20)
D−R3:GGTATTGTTARRCAYTCRTC (配列番号21)
D−R4:TTTAGTACNCCYTCYTCYTGRAA (配列番号22)
WL3:CACACACTGCGACAGATCAGGCGG (配列番号23)
WL4:GCAATATTCTCCAGGAAGCAGTGCCG (配列番号24)
pHVN3−PacI:GCCAAGTTAATTAACCATGGCGGAAGCAGAGGGGGGAG (配列番号25)
pRhC1−PmeI:GGACTCGTTTAAACGATTCTCCCATGAGGTCTTCGTATTGC (配列番号26)
モモアカアブラムシ由来のリアノジン受容体の単離された核酸フラグメントの再構築
液体N2中で新鮮凍結し、冷却モーターにおいて粉体に粉砕した0.5gのモモアカアブラムシ(Myzus persicae)または任意の同翅目種から、全RNAを抽出した。粉体を20mlのトリゾル(TriZOL)(登録商標)で、15秒間激しく振盪し、次いで、サンプルを30℃で3分間インキュベーションすることによって、抽出した。2mlのクロロホルムを添加し、振盪およびインキュベーション処置を反復した。サンプルを12,000gで10分間、8℃でスピンし、水相を新しいチューブに移した。5mlのイソプロピルアルコールおよび1.2M NaClを含有する5mlの0.8Mクエン酸ナトリウムを水性画分と混合し、室温で10分間後、サンプルに二度目の遠心分離を行った。ペレットを10mlの70%EtOHで洗浄し、懸濁液を7500gで5分間、再度遠心分離し、2mlの水に溶解する前に、得られたペレットを乾燥させた。
E−F1 GGAGGTGGNATHGGNGAYGA (配列番号27)
E−F2 ATCATCGAYGCNTTYGGNGA (配列番号28)
E−R1 AARCARTCNCCNACNGGRAA (配列番号29)
E−R2 ACNGGRAARAARTCCCARCA (配列番号30)
F−R1:CCCTCTTGAGAACTTGCAGCTGTCAC (配列番号31)
F−R2:CGTCCGGTGTCCAGATCCAGTTCCGCC(配列番号32)
F−R3:GATGAACAGTCCACCAACAAGCTTCAC(配列番号33)
および3’RACEプライマー
G−F1:GCTGGAAAGCGTCAAGGAAGACATGG (配列番号34)
G−F2:GCGGTATCGGCAAAGATTATTTCGAC (配列番号35)
G−F3:GTGCCGCATGGTTTCGACACTCACG (配列番号36)
を用いる実施例1に記載のようなRACE手順を使用して得られる。
pRgN−PacI:GCCAAGTTAATTAACGATGGCCGACAGCGAGGGCAGTTCG (配列番号37)
pRgC−PmeI:GGACTCGTTTAAACGAGACGCCTCCTCCGCCGCCGAGC (配列番号38)
であった。
従って、遺伝子の全長cDNAを、それぞれ5’および3’末端のPacIおよびPmeI部位で単離した。
ワタアブラムシおよびトウモロコシウンカ由来のリアノジン受容体の単離された核酸フラグメントの再構築
ワタアブラムシおよびトウモロコシウンカ由来のリアノジン受容体コーディング領域のcDNAは、本質的に実施例2に記載の通りに得た。実施例1において使用した同じDプライマーの組および実施例2において使用したEプライマーの組は、2種の同翅目種に対するほぼ全長配列を生成した。以下のプライマーを、RACEシリーズの実験に使用して、リアノジン受容体コーディング領域の5’および3’末端の配列を生成した。ワタアブラムシについて、使用した5’RACEプライマーは、
CMA−DR1:GCTGGATGCACAGTCCACCAACAAGCTTC (配列番号40)
CMA−DR2:CAATGTTCGGTGTCCAGATCCAGTTCC (配列番号41)
CMA−DR3:GACGGGTACACACTGAGACAAGTCGGGTGG(配列番号42)
であり、3’RACEプライマーは、
CMA−EF1:CTGCGGCATCGGCAAAGATTATTTCG(配列番号43)
CMA−EF2:CCGCACGGTTTTGACACGCACGTTC (配列番号44)
CMA−EF3:CCGGCCAAGAAACGTACGTCTGGAAC(配列番号45)
であった。
トウモロコシウンカについて、5’RACEプライマーは、
CPH−DR1:CCGAAGCACATCGCCACCAAACAC (配列番号46)
CPH−DR2:CCTGTGCCATAAGGCTGAACGGACC (配列番号47)
CPH−DR3:CGTCACCAACTCGCACCTTCTCACCCTCC(配列番号48)
であり、3’ RACEプライマーは、
CPH−EF1:GGAAGACATGGAGTCCAACTGTTTCATTTGTGGC (配列番号49)
CPH−EF2:GTGCCGCATGGTTTCGATACTCATGTGCAGC (配列番号50)
CPH−EF3:GCATAATCTCGCTAATTACATGTTCTTCCTCATGC(配列番号51)
であった。
pRCMAN−PacI:GCCAAGTTAATTAACGATGGCCGACAGCGAGGGAAGTTCG (配列番号52)
pRCMAC−PmeI:GAACTCGTTTAAACGAGACGCCTCCTCCGCCGCCAAGC (配列番号53)
であり、トウモロコシウンカのリアノジン受容体コーディング領域の末端にPacIおよびPme部位を組み入れるために設計したそれらは以下の通りである:
pRCPHN−PacI:GCCAAGTTAATTAACAATGGCGGATAGTGAGGGTGGATCTG (配列番号54)
pRCPHC−PmeI:GAAGTCGTTTAAACGAGCCACCACCGCCTCCTAACTCATC (配列番号55)。
リアノジン受容体をコードするcDNAクローンの特徴付け
表3に列挙したクローンからのEST配列を使用するBLASTX検索は、当該cDNAによりコードされるポリペプチドの、Drosophila(Drosophila melanogaster)(NCBI一般識別番号(GeneralIdentifier)gi17352471、[配列番号56]由来のリアノジン受容体タンパク質に対する類似性を示した。個々のESTについてのBLASTの結果(「EST」)、示されたcDNAクローンを含んでなるcDNA挿入物全体の配列(「FIS」)、2種もしくはそれ以上のESTから集成されたコンティグの配列(「Contig」)、FISおよび1種もしくはそれ以上のESTから集成されたコンティグの配列(「Contig*」)、またはFIS、コンティグもしくはFISおよびPCR由来のタンパク質全体をコードする配列(「CGS」)を表3に示す。
昆虫細胞株におけるリアノジン組換え構築物の一過的発現
異なる昆虫由来のリアノジン受容体をコードするcDNAを、それぞれ、実施例2に記載のように、pIBV5HisまたはpFASTBacにクローニングした。しかし、当業者であれば、真核細胞に感染させるための他の多様なベクターおよび手段が存在することを理解するであろう。特に、昆虫細胞インフェクションのためのバキュロウイルスに基づく系は有用であり、いずれの系も活性型の受容体タンパク質の完全な発現および修飾を可能にする。
微生物細胞におけるキメラ遺伝子の発現
本ポリペプチドをコードするcDNAをT7大腸菌(E.coli)発現ベクターpBT430に挿入することが可能である。本ベクターは、バクテリオファージT7RNAポリメラーゼ/T7プロモーター系を使用するpET−3a(ローゼンベルグ(Rosenberg)ら(1987)Gene 56:125−135)の一誘導体である。プラスミドpBT430は、最初に、それらの元の位置のpET−3a中のEcoR IおよびHind III部位を破壊することにより構築した。EcoR IおよびHind III部位を含有するオリゴヌクレオチドアダプターをpET−3aのBamH I部位に挿入した。これは、該発現ベクターへの遺伝子の挿入のための付加的な独特なクローニング部位を持つpET−3aMを創製した。次いで、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用して、翻訳開始の位置のNdeI部位をNcoI部位に変換した。この領域中のpET−3aMのDNA配列5’−CATATGGを、pBT430中の5’−CCCATGGに変換した。
昆虫細胞におけるHeliothis virescens、および他のRyr cDNAは、昆虫発現ベクター(例えば、pIB/V5−His、インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ(Invitrogen Life Technologies)TM、カリフォルニア州カールズバッド(Carlsbad,CA))の制御下でベクター内に設置した場合、大腸菌(Escherichia coli)に対し、かなり毒性であるようである。これらの条件下、細胞は極めて緩徐に増殖し、フレームシフト変異が自発的に導入される。大腸菌(E.coli)におけるRyr遺伝子の任意の発現を完全に除去する2つのクローニングストラテジーは、増殖の問題を回避し得る。
すべての試薬、実験着衣および技術は、トランスフェクションの間中、無菌のものであった。プラスミドは、キアゲン(Qiagen)TMプラスミド・ミディ・プレップ・キット(キアゲン(Qiagen)TM、カリフォルニア州バレンシア(Valencia,CA)、カタログ番号12143)
昆虫細胞におけるRyr cDNAの発現
Drosophila melanogaster(pIB43D、配列番号9)、モモアカアブラムシ(Myzus persicae)(pIB−GAP7−1、配列番号3)、ワタアブラムシ(Aphis gossypii)(pIB−CMA4−3、配列番号5)、およびトウモロコシウンカ(Peregrinus maidis)(pXL−CPH9、配列番号7)由来のRyr cDNAを、実施例7に記載のHeliothis virescens由来のcDNAと同じ方法で、Cre−Lox発現系に導入する。cDNAは、PacIおよびPmeIでの消化によって、ベクターから放出させる。場合により、cDNAに内部PmeIが存在し、これらの場合、部分的PmeIおよび完全PacI消化を実施して、全長cDNAに対応するフラグメントをゲル精製する。pENTR2B/PvuIをPvuIで部分消化し(pEntr2B/PvuIには第2の部位が存在する)、EcoRVで完全に消化し、正確なフラグメントをゲル精製した。RyrフラグメントのPacI粘着末端は、PvuI粘着末端に適合し、PmeIおよびEcoRV末端は、両方とも平滑である。次いで、Ryr遺伝子を、pENTR2B/PvuIに連結して、pENTR2B/PvuIにそれぞれのcDNAを挿入する。
カルシウム放出アッセイ
主な昆虫細胞を使用するカルシウム画像化および取り込みプロトコル:
ビードル(Beadle)およびリーズ(Lees)(1988)(Cell Culture Approaches to Invertebrate Neuroscience、アカデミックプレス(Academic Press)、ニューヨーク(New York)、123−127頁)の方法に従い、若干の変更を加えて、ワモンゴキブリ(Periplaneta americana)の胚ニューロン培養を確立した。簡単に説明すると、26〜27齢の卵鞘を回収し、表面を滅菌し、背中線の下から3分の1の距離から線に沿って切開した。頭部を取り出し、シュナイダー(Schneider)のDrosophila培地(インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ(Invitrogen Life Technologies)TM、カリフォルニア州カールズバッド(Carlsbad,CA))に配置した。精巧なピンセットを使用して、40個の脳を個々に取り出し、700μlの「5+4」培地(「5+4」培地は5部のシュナイダー(Schneider)のDrosophila培地+4部のゴキブリ規定培地イーグル(Basal Medium Eagle)(アール(Earle)の塩を有する)(BME、シグマ(Sigma)TM、ミズーリ州セントルイス(St.Louis,MO)を含有した)を含有する小さなガラスバイアルに配置した。ローチBME(Roach BME)(アール(Earle)の塩を有する)は、5部のヘペス(Hepes)(1M)、1部のペニシリン/ストレプトマイシンおよび44部のBME(アール(Earle)の塩を有する)を含有した。「5+4」培地を新たに作製し、使用前に滅菌濾過(0.2μmフィルター)した。脳は、連続粉砕装置により以下のように分離した:1)脳を標準的なパスツール(Pasteur)ピペットで10回通過させた;2)得られた組織懸濁液を、本来の直径の約半分にまで先端を火炎加工したパスツール(Pasteur)ピペットでさらに5回通過させた;3)最後の5回は、本来の直径の半分よりわずかに小さくなるように先端を火炎加工したパスツール(Pasteur)ピペットを使用して、実施した。反復ピペッターを使用して、得られた懸濁液の5μl容積を、予めポリ−L−リジン(0.2mg/ml溶液)で被覆した96ウェルガラス底プレートの各ウェルの中心に分配した。27〜29℃で50分間のインキュベーション中にウェルの底に細胞を付着させた。レイボビッツ(Leibovitz)のL−15培地およびユンケル(Yunker)の改変グレース(Grace)の培地の1:1混合物の150μlを添加し、使用するまでプレートを湿式インキュベーター中、27〜29℃で維持した。細胞を付着させた後、ウェルをレイボビッツ(Leibovitz)のL−15培地およびユンケル(Yunker)の改変グレース(Grace)の培地の1:1混合物で満たした(レイボビッツ(Leibovitz)のL−15培地およびグレース(Grace)の培地は、インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ(Invitrogen Life Technologies)TM、カリフォルニア州カールズバッド(Carlsbad,CA)から得、ユンケル(Yunker)の改変グレース(Grace)の培地は、5mgのL−メチオニン、10mgのL−アラニン、182mgのMgCl2・6H2O、1gのアルブミン画分V、7mlのウシ胎児血清、10mlのニワトリ胚抽出物、2mlのペニシリン/ストレプトマイシン、および2mgの20−ヒドロキシエクジソン(添加前にエタノール中で調製)を100mlの最終容積で添加し、滅菌濾過(0.2μmフィルター)することによって改変したグレース(Grace)の培地によって作製した)。細胞は、試験時まで、高湿度インキュベーター中、29℃で維持した。
細胞を、次の組成(mM):NaCl 190;CaCl2 9;KCl 3.1;プロベネシッド 1;トリス(Tris)緩衝液 10;pH7.2を有する標準的な生理食塩水で濯いだ。次いで、細胞を、カルシウム感受性フルオロプローブFluo−4AM(fluoroprobe Fluo−4 AM)(2μM)およびプルロニック(Pluronic)F127(0.002%)を含有する標準的な生理食塩水中、45分間、浴槽に置いた。次いで、細胞は試験前の少なくとも15分間、標準的な生理食塩水で濯いだ。試験前の時間内に、標準的な生理食塩水を、有機カチオンチャンネルブロッカーのピモジド(10μM)を含有する標準的な生理食塩水で置き換えて、電位依存性カルシウムチャンネルを介する外部カルシウムのカルシウムの流入を阻害した。96ウェルプレートを、ニコン・ディアフォト(Nikon Diaphot)顕微鏡上に装架したプライアー(Prior)TM電動ステージ上に配置し、20×フルオアー(Fluor)対物レンズ(NA 0.75)を使用して、画像撮影した。96ウェルプレート由来の個々のウェルを、連続的に495nmの光で励起し、530nmで放射した蛍光を、2ピクセルビニング(画像サイズ672×512ピクセル)を有するハママツ(Hamamatsu)ORCA ERデジタルカメラを使用して、検出した。
昆虫リアノジン受容体を一過的に発現する組換え体Spodopterafrugiperda細胞株、Sf9の懸濁液の数滴を、ポリ−L−リジン被覆カバースリップ上に配置し、付着させた。次いで、細胞を、次の組成(mM):NaCl 130;KCl 5.4;MgCl2 1.2;CaCl2 1.0;NaHCO3 4.2;NaH2PO4 7.3;グルコース 10;スクロース 63;MES 20;pH6.3を有する標準的な生理食塩水で濯いだ。次いで、細胞を、カルシウム感受性フルオロプローブフラ−2 AM(fluoroprobe Fura−2 AM)(2μM)、およびプルロニック(Pluronic)F127(0.002%)を含有する標準的な生理食塩水中、30分間、浴槽に置いた。細胞は試験前の少なくとも15分間、標準的な生理食塩水で濯いだ。細胞株は機能的な電位依存性カルシウムチャンネルを欠くため、試験は標準的な生理食塩水中で行った。
ゴキブリ筋膜の調製
放射性リガンド結合研究のためのゴキブリ大体筋由来の膜の調製のための手順については、本質的に、シュミット(Schmitt)ら(1996)Pesticide Science 48:375−385に記載の通りである。関与する工程の簡単な説明は以下の通りである:
放射性リガンド結合アッセイ
使用したリアノジンは、シグマ(Sigma)(ミズーリ州セントルイス)から得た。
飽和結合アッセイのために、アッセイ混合物(200μl全容積/ウェル;96ウェル、U底、ポリプロピレンプレート)は、163μlの緩衝液B(0.375M KCL、0.3Mスクロース、0.0005M CaCl2、0.020M Tris−HCl、pH8.0)、DMSO中多様な濃度のCpd1の10μl、および2μlのDMSOを含有した。「非特異的結合」の決定のために、DMSOを、対応する「全」結合チューブにおける0.001Mリアノジン+Cpd1の濃度の1,000倍濃厚な濃度のCpd5を組み合わせた溶液(DMSO中)の2μlで、置き換えた。アッセイは、2μg/μlのゴキブリ筋膜(解凍および等容積の緩衝液Bの添加によって調製した)の25μlの添加で開始し、インキュベーションを60分間、32℃で行った。アッセイは、3回の反復測定で行った。
飽和結合アッセイのために、アッセイ混合物(200μl全容積/ウェル;96ウェル、U底、ポリプロピレンプレート)は、155μlの緩衝液A(1.5M KCL、0.3Mスクロース、0.0005M CaCl2、0.020M Tris−HCl、pH8.0)、エタノール中多様な濃度の[3H]−リアノジンの10μl、および10μlのDMSOを含有した。「非特異的結合」の決定のために、DMSOを、対応する全結合チューブにおける[3H]−リアノジンの濃度の1,000倍濃厚な濃度の10μlのリアノジン(DMSO中)の10μlのリアノジンで、置き換えた。アッセイは、2μg/μlのゴキブリ筋膜(解凍および等容積の緩衝液Aの添加によって調製した)の25μlの添加で開始し、インキュベーションを60分間、32℃で行った。アッセイは、3回の反復測定で行った。
Drosophila melanogasterリアノジン受容体遺伝子のための発現ベクター
公開されたDrosophila melanogasterのリアノジン受容体遺伝子配列(NCBI受託番号D17389)に基づいて、2つのプライマー(配列番号141、5’−accaccttaattaattccgatttggaggcgctgcg−3’;および配列番号142、5’−gcctccgtttaaacgaccgtccagtgccagtgtgaag−3’)を設計した。これらのプライマーは、実施例1の条件に従い、成虫Drosophila melanogaster(クロンテック(Clontech))をテンプレートとして使用するロングPCR反応に使用した。全長リアノジン受容体遺伝子をpCR−XL−TOPO(登録商標)ベクター(インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ(Invitrogen Life Technologies)TM、カリフォルニア州カールズバッド(Carlsbad,CA))にクローニングし、その後、全長遺伝子を、実施例2に記載のように、改変されたpIBV5HisまたはpFASTBacへサブクローニングした。
Claims (33)
- (a)配列番号2、4、6、8、128、130、144、および146よりなる群から選択されるポリペプチドと比較する場合、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するリアノジン受容体をコードする核酸配列;または
(b)(a)の相補体
を含んでなる単離されたヌクレオチドフラグメント。 - 配列同一性が少なくとも85%である請求項1に記載の単離された核酸フラグメント。
- 配列同一性が少なくとも90%である請求項1に記載の単離された核酸フラグメント。
- 配列同一性が少なくとも95%である請求項1に記載の単離された核酸フラグメント。
- ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号2、4、6、8、10、128、130、144、または146のアミノ酸配列を含んでなる請求項1に記載の単離された核酸フラグメント。
- 配列番号1、3、5、7、9、127、129、143、または145のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸フラグメント。
- 少なくとも1つの調節配列に操作可能に連結された請求項1または5に記載の単離された核酸フラグメントを含んでなる組換え構築物。
- 請求項7に記載の組換え構築物を含んでなる形質転換された宿主細胞。
- 前記細胞は大腸菌(E.coli)、酵母、Sf9、Sf21、S2、アフリカツメガエル卵母細胞(Xenopus oocytes)、HEK−293およびCHOよりなる群から選択される請求項8に記載の宿主細胞。
- (a)配列番号2、4、6、8、10、128、130、144、および146と他のイオンチャンネルおよび受容体ポリペプチド配列とを比較し;
(b)工程aにおいて得られる4もしくはそれ以上のアミノ酸の保存配列を同定し;
(c)工程bにおいて同定される保存配列に基づいて縮重オリゴマーを設計し;そして
(d)工程cの縮重オリゴマーを使用して、配列依存的プロトコルによって、リアノジン受容体活性を有するポリペプチドをコードする配列を単離する
ことを含んでなる、リアノジン受容体および関連ポリペプチドをコードする核酸フラグメントを単離するための方法。 - リアノジン受容体活性を有する単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号2、4、6、8、128、130、144、または146のアミノ酸配列とが少なくとも80%の同一性を有するポリペプチド。
- 該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号2、4、6、8、128、130、144、または146のアミノ酸配列とが少なくとも85%の同一性を有する請求項11に記載のポリペプチド。
- 該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号2、4、6、8、128、130、144、または146のアミノ酸配列とが少なくとも90%の同一性を有する請求項11に記載のポリペプチド。
- 該ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号2、4、6、8、128、130、144、または146のアミノ酸配列とが少なくとも95%の同一性を有する請求項11に記載のポリペプチド。
- 該ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号2、4、6、8、10、128、130、144、または146のアミノ酸配列を含んでなる請求項11に記載のポリペプチド。
- カルシウムホメオスタシスを調整する能力について、少なくとも1つの化合物を評価するための方法であって、以下の工程:
(a)請求項7に記載の組換え構築物で宿主細胞を形質転換し;
(b)組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主細胞を増殖させ、ここで、組換え構築物の発現はカルシウムホメオスタシスの変更を生じ;
(c)試験しようとする化合物で、工程(a)の形質転換された宿主細胞を処置し、そして
(d)カルシウム放出を変更する能力を有する化合物を選択するために、試験化合物による細胞内カルシウムホメオスタシスの変化を測定する
ことを含んでなる方法。 - リアノジン受容体活性を調整する少なくとも1つの化合物を評価するための方法であって、以下の工程:
(a)少なくとも1つの化合物と請求項1に記載の単離された核酸フラグメントによりコードされるポリペプチドとを接触させ;そして
(b)前記ポリペプチドを化合物と接触させた後、(a)のポリペプチドのリアノジン受容体活性を評価する
ことを含んでなる方法。 - 方法がリガンド結合アッセイである請求項16または17に記載の方法。
- 該方法が形質転換された宿主細胞の機能的活性に対する化合物の効果を検出することによって機能的活性を評価することに基づく請求項16に記載の方法。
- ポリペプチドが1つを超える化合物と接触される請求項19に記載の方法。
- 配列番号63〜119のいずれかに記載の少なくとも2つのポリペプチド配列を含んでなる昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントであるが、但し、前記ポリペプチド配列が配列番号56、120〜126のいずれをも含まない単離された核酸フラグメント。
- a)少なくとも100アミノ酸を有する第1のポリペプチドをコードする単離された核酸配列を得て;
b)第1のポリペプチド配列と、配列番号63〜119よりなる群から選択される比較ポリペプチド配列とを比較して、第1のポリペプチドと比較ポリペプチドとの間で100%の配列同一性を有する領域を同定し、ここで、前記領域は比較ポリペプチドと同じ長さであり;そして
c)異なる比較ポリペプチド配列で工程(b)を反復し、ここで、前記異なる比較ポリペプチド配列は、100%の配列同一性を有する第2の領域が見出されるまで、配列番号63〜119よりなる群から選択され、ここで、前記第2の領域は異なる比較ポリペプチドと同じ長さである
ことを含んでなる、昆虫イオンチャンネルをコードする核酸配列を同定するための方法。 - 第1のポリペプチドが100〜6,000アミノ酸の長さを有する請求項22に記載の方法。
- a)毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを5’から3’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメントは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも1つの核酸配列によって各末端上において隣接され;そして
b)組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法。 - a)毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを5’から3’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された少なくとも1つのインフレーム翻訳終止コドンを含んでなる核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、翻訳終止コドンを含んでなる核酸フラグメントは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも1つの核酸配列によって各末端上において隣接され;そして
b)組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法。 - a)毒性昆虫イオンチャンネル核酸に操作可能に連結されたプロモーターを5’から3’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、プロモーターは、少なくとも1つの転写終止核酸フラグメントおよび前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された少なくとも1つのインフレーム翻訳終止コドンより本質的になる核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメントおよび翻訳終止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも1つの核酸配列によって各末端上において隣接され;そして
b)組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法。 - a)毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを5’から3’方向で含んでなる組換え構築物で宿主を形質転換し、
ここで、前記フラグメントはまた、前記フラグメントの発現を妨害するイントロンを含んでなり、そして
b)組換え構築物の発現に適切である条件下で形質転換された宿主を増殖させる
ことを含んでなる、毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントを発現させるための方法。 - 削除可能な配列はlox配列である請求項24、25または26のいずれか1項に記載の方法。
- 毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを5’から3’方向で含んでなる組換え構築物であって、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された転写終止核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメントは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも1つの核酸配列によって各末端上において隣接される組換え構築物。 - 毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを5’から3’方向で含んでなる組換え構築物であって、
ここで、プロモーターは前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された少なくとも1つのインフレーム翻訳終止コドンを含んでなる核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、翻訳終止コドンを含んでなる核酸フラグメントは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも1つの核酸配列によって各末端上において隣接される組換え構築物。 - 毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを5’から3’方向で含んでなる組換え構築物であって、
ここで、プロモーターは、少なくとも1つの転写終止核酸フラグメントおよび前記プロモーターと毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントとの間に設置された少なくとも1つのインフレーム翻訳終止コドンより本質的になる核酸フラグメントを含んでなり、
さらにここで、転写終止核酸フラグメントおよび翻訳終止コドンは、削除可能な配列より本質的になる少なくとも1つの核酸配列によって各末端上において隣接される組換え構築物。 - 削除可能な配列がlox配列である請求項29、30または31のいずれか1項に記載の組換え構築物。
- 毒性昆虫イオンチャンネルをコードする単離された核酸フラグメントに操作可能に連結されたプロモーターを5’から3’方向で含んでなる組換え構築物であって、
ここで、前記単離された核酸フラグメントはまた、毒性昆虫イオンチャンネルの発現を妨害するイントロンを含んでなる組換え構築物。
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