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JP2002345484A - ヘリオティスビレッセンス(Heliothisvirescens)のウルトラスピクラル(USP)タンパク質 - Google Patents

ヘリオティスビレッセンス(Heliothisvirescens)のウルトラスピクラル(USP)タンパク質

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Publication number
JP2002345484A
JP2002345484A JP2001218081A JP2001218081A JP2002345484A JP 2002345484 A JP2002345484 A JP 2002345484A JP 2001218081 A JP2001218081 A JP 2001218081A JP 2001218081 A JP2001218081 A JP 2001218081A JP 2002345484 A JP2002345484 A JP 2002345484A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
nucleic acid
host cell
leu
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001218081A
Other languages
English (en)
Inventor
Werner Zitzmann
ベルナー・ツイツマン
Eva-Maria Franken
エバ−マリア・フランケン
Martina Janssen
マルテイナ・ヤンセン
Thomas Dr Schulte
トマス・シユルテ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Publication of JP2002345484A publication Critical patent/JP2002345484A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00Genetically modified animals
    • A01K2217/05Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 USPはそのリガンドが未だに知られていない
オーファン受容体であるので、この受容体は後にとりわ
け殺虫剤として使用することができる新規リガンドを調
査するためのスクリーニング系を確立するために実際に
大変重要である。USPのリガンドが利用できれば、この
核内受容体は標的遺伝子の制御された発現のための系で
使用することができる(ジーンスイッチ)。 【解決手段】 本発明は、ウルトラスピラクル タンパ
ク質の生物活性を有するポリペプチドをコードする核
酸、およびそのようなポリペプチド自体に関する。さら
に本発明は、殺虫活性化合物を見いだす方法、および標
的遺伝子の制御された発現(ジーン スイッチ)の方法
に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術】本発明は、ウルトラスピラクル
(ultraspiracle)タンパク質の生物活性を持つポリペ
プチドをコードする核酸、およびそのようなポリペプチ
ドそれ自体に関する。さらに本発明は、殺虫性の活性化
合物を見いだす方法、および標的遺伝子の制御された発
現法(ジーン スイッチ:gene switch)に関する。
【0002】
【従来の技術】ウルトラスピラクル タンパク質(以後、
USPと呼ぶ)は、脊椎動物のレチノイドX受容体(RXR)の
昆虫オーソログ(ortholog)である。RXRのように、こ
れは核内受容体のファミリーに属する。このような核内
受容体は、細胞の内側に位置する。それらはホモダイマ
ーまたはヘテロダイマーとしてDNA上の応答配列に結合
し、そして遺伝子の発現を調節する。活性となるために
は、それらは特異的な小さい疎水性のリガンドに結合し
なければならない(例えばステロイド、レチノイド、ビ
タミンD)。核内受容体はトランス活性化、DNA結合およ
びリガンド結合に関する機能的ドメインを持つモジュー
ル構造を有する。DNA結合ドメインは多数のシステイン
残基を含み、そしてジンクフィンガーと名付けられた特
徴のある構造を形成する。
【0003】それらの構造的および機能的特性(特異的
配列へのDNA結合、下流遺伝子の活性化)により、核内
受容体は調節できる発現系のための成分として適する
(ジーンスイッチ)。そのような核内受容体(例えばRX
R、EcR)はすでに誘導可能な真核発現系で使用されてい
る(インビトロゲン コーポレーション:Invitrogen Cor
poration、カールスバルド、カリフォルニア州、米
国)。
【0004】例えば昆虫では、幼虫から成虫への発育は
核内受容体を介して制御され、ステロイドホルモンのエ
クジソンおよびイソプレノイド幼若ホルモンが関与する
(1;2;3;4)。2つの異なるサブユニット、EcR
およびUSPから成る核内受容体であるエクジソン受容体
が鍵となる役目を果たす(5;6;7)。ホルモンのエ
クジソン(その活性状態は20-ヒドロキシエクジソン)
は長い間、EcRサブユニットのリガンドであると知られ
て来たが、USPは未だにリガンドが同定できないオーフ
ァン受容体である。
【0005】エクジソン受容体は重要な殺虫剤標的を構
成する。昆虫の発育中に発育目的に提供される時間枠の
外でのその活性化は、昆虫を重大な破壊または死へも導
く。この作用機作は殺虫性のエクジソン アゴニストに
関する基礎を形成する(8;9)。これらは鱗翅目に特
異的に作用するEcRサブユニットの非ステロイド系リガ
ンドである(10)。エクジソン/幼若−ホルモンが制御
する発育は無脊椎動物にのみ見いだされ、そして脊椎動
物では起こらないので、使用者には安全な殺虫性の作用
機作を構成する。
【0006】多数の昆虫USPのタンパク質配列は、すで
に知られている。すなわち例えばキイロショウジョウバ
エ(Drosophila melanogaster)、タバコスズメガ(Mand
ucasexta)、コリストニューラ フミフェラーナ(Choris
toneura fumiferana)およびカイコガ(Bombyx mori)
の配列が記載された(11)。
【0007】
【解決すべき課題】USPはそのリガンドが未だに知られ
ていないオーファン受容体であるので、この受容体は後
にとりわけ殺虫剤として使用することができる新規リガ
ンドを調査するためのスクリーニング系を確立するため
に実際に大変重要である。USPのリガンドが利用できれ
ば、この核内受容体は標的遺伝子の制御された発現のた
めの系で使用することができる(ジーンスイッチ)。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明は、 a)配列番号1の配列、 b)少なくとも600個の連続するヌクレオチド長にわた
り、そして好ましくはそれらの全長にわたり配列番号1
の配列と少なくとも85%の同一性、好ましくは少なくと
も90%同一性、特に好ましくは少なくとも95%の同一性
を有する配列、 c)遺伝子暗号の縮重により、(a)および(b)で定
めた配列と同じアミノ酸配列をコードする配列、 d)配列番号2のアミノ酸配列を持つポリペプチドと本
質的に同じ生物活性を有するポリペプチドをコードする
(a)、(b)および(c)で定めた配列の部分、から
選択される配列を含んで成るUSPの生物活性を持つポリ
ペプチドをコードする核酸に関する。
【0009】核酸配列の同一性の程度は、好ましくは標
準的設定を使用したプログラム パッケージGCG、バージ
ョン9.1からのプログラムGAPを使用して決定される。
【0010】本発明はさらに、本発明の少なくとも1つ
の核酸を含むベクターに関する。使用できるベクターは
分子生物学研究室で使用されるすべてのプラスミド、フ
ァジェミド、コスミド、YACまたは人工染色体である。
本発明の核酸を発現させるために、核酸は通例の調節配
列に連結される。そのような調節配列の選択は、発現に
原−または真核細胞あるいは細胞または無細胞系を使用
するかどうかに依存する。発現制御配列として特に好適
であるのは、例えばSV40またはアデノウイルスまたはサ
イトメガロウイルスの初期または後期プロモーター、Ac
MNPV前初期プロモーター、lac系、trp系、ファージ ラ
ムダの主オペレーターおよびプロモーター領域、fdコー
ト タンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナ
ーゼプロモーター、酸性ホスファターゼプロモーター、
酵母α-接合因子プロモーターおよびカリフラワーモザ
イクウイルス35Sプロモーターである。本明細書の内容
で使用する用語「プロモーター」は、一般に発現制御配
列を称する。
【0011】本発明の核酸を発現させるために、核酸を
宿主細胞に導入することができる。本発明に関して使用
する用語「宿主細胞」は、本発明の核酸を自然には含ま
ない細胞を称する。適当な宿主細胞は原核細胞、好まし
くは大腸菌(E.coli)および哺乳動物、昆虫および植物
細胞のような真核細胞である。適当な単一−細胞(sing
le-celled)宿主細胞は;シュードモナス(Pseudomona
s)、バシルス(Bacillus)、ストレプトミセス(Strep
tomyces)、酵母、HEK-293、シュナイダー S2、Sf9、CH
O、COS1、COS7細胞である。しかし複雑系(例えば全植
物または動物)の成分である細胞も適当である。したが
って本発明はまた、本発明による核酸を含む例えば植物
および動物のようなトランスジェニック生物(ヒトを除
く)に関する。本発明に関して使用する用語「トランス
ジェニック」は、本発明の核酸が組換え法により生物に
導入されたことを意味する。
【0012】また本発明は、本発明による核酸によりコ
ードされるポリペプチド、およびそれらから成り、そし
てEcRサブユニットおよび本発明によるポリペプチドか
ら成る受容体に関する。
【0013】本発明に関して使用する用語「ポリペプチ
ド」は通常、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマ
ーを呼ばれる短いアミノ酸鎖および通常、タンパク質と
呼ばれる長いアミノ酸鎖を称する。ポリペプチドは、翻
訳後プロセッシングのような自然なプロセスにより、あ
るいは化学的な従来技術の方法のいずれかにより修飾さ
れ得るアミノ酸鎖を含んで成る。そのような修飾は種々
の部位およびポリペプチド中、例えばペプチド骨格で、
アミノ酸側鎖で、アミノ末端および/またはカルボキシ
末端で繰り返して起こることができる。それらは例えば
アセチル化、アシル化、ADPリボシレーション、アミド
化、フラビン、ヘム部分、ヌクレオチドもしくはヌクレ
オチド誘導体、脂質もしくは脂質誘導体またはホスファ
チジルイノシトールに対する共有結合、環化、ジスルフ
ィド架橋の形成、ジメチル化、シスチンの形成、ホルミ
ル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロ
キシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸
化、タンパク質溶解プロセッシング、リン酸化、セレノ
イレーション(selenoylation)およびtRNAが媒介するア
ミノ酸の付加を含んで成る。
【0014】本発明のポリペプチドは、「成熟」タンパ
ク質またはより大きなタンパク質の部分の状態、例えば
融合タンパク質として存在することができる。ポリペプ
チドはさらに分泌もしくは「リーダー」配列、プロ−配
列、多数のヒスチジン残基のような単純な精製を可能と
する配列、またはさらなる安定化アミノ酸を有すること
ができる。
【0015】本発明のポリペプチドの生物活性は、例え
ばトランス活性化アッセイにより検出することができ
る。このために、EcRサブユニットおよびEcR結合配列を
含むプロモーターおよびレポーター遺伝子から成るレポ
ーター構築物と組み合わせた試験ポリペプチドを、細胞
系で発現させる。エクジソンまたはエクジソン同族体が
存在する場合、レポーター遺伝子産物を例えば酵素アッ
セイにより検出することができ、これは試験したポリペ
プチドが本発明のポリペプチドの生物活性を有すること
を意味する。
【0016】適当なレポーター遺伝子および結合配列
は、例えば国際公開第97/45737号明細書に記載されてい
る。
【0017】本発明のポリペプチドは完全なUSPを構成
する必要はなく、配列番号2のアミノ酸配列を持つポリ
ペプチド(USP)の生物活性を少なくとも有するかぎり、
それらの単なるフラグメントでもよい。本発明のポリペ
プチドはヘリオティス ビレッセンス(Heliothis viresc
ens) のUSPから直接誘導することができる。
【0018】自然に存在するヘリオティス ビレッセン
ス(Heliothis virescens) のUSPに対応する領域と比較
して、本発明のポリペプチドはそれらが少なくともUSP
の生物活性を発揮するかぎり、欠失またはアミノ酸置換
を示してもよい。保存的置換が好適である。そのような
保存的置換は、1つのアミノ酸が以下の群からの別のア
ミノ酸に置き換えられる変異を包含する。 1.極性がほとんどない小さい脂肪族残基、非極性残基
(1つまたは複数):Ala、Ser、Thr、ProおよびGly; 2.極性の負に荷電した残基およびそれらのアミド:As
p、Asn、GluおよびGln; 3.極性の正に荷電した残基;His、ArgおよびLys; 4.大きな脂肪族の非極性残基:Met、Leu、Ile、Valお
よびCys;ならびに 5.芳香族残基;Phe、TyrおよびTrp。
【0019】好適な保存的置換は、以下のリストから理
解することができる:
【0020】
【表1】
【0021】本発明のポリペプチドの好適な態様は、配
列番号2のアミノ酸配列を有するヘリオティス ビレッ
センス(Heliothis virescens) のUSPである。
【0022】さらに本発明は、上記ポリペプチドまたは
受容体に特異的に結合する抗体に関する。そのような抗
体は、通常の様式で生成される。例えばそのような抗体
は、実質的にイムノコンピテントな宿主に、抗体生産の
ために効果的な量の本発明のポリペプチドまたはそれら
のフラグメントを注入することにより生じ、そしてその
後にこの抗体を得る。さらにモノクローナル抗体を生産
する不死化細胞系は、それ自体は既知の様式で得ること
ができる。適当ならば、抗体は検出試薬で標識すること
ができる。そのような検出試薬の好適な例は、酵素、放
射性標識元素、蛍光化学品またはビオチンである。完全
な抗体の代わりに、所望の特異的結合特性を有するフラ
グメントを使用してもよい。本発明に関して使用する用
語「抗体」は、したがって本発明のポリペプチドのエピ
トープに未だ結合することができるFa、F(ab')2またはF
vフラグメントのような完全な抗体の一部分にも広げ
る。
【0023】本発明の核酸によりコードされるポリペプ
チドを調製するために、本発明の少なくとも1つの核酸
を含む宿主細胞を適当な条件下で培養することができ
る。所望のポリペプチドは、細胞または培養基から常法
により単離することができる。
【0024】本発明の核酸を使用して宿主細胞により合
成された本発明のポリペプチドの迅速な単離法は、融合
タンパク質を発現させることから出発し、融合パートナ
ーを単純な様式でアフィニティ精製することが可能であ
る。融合パートナーは、例えばグルタチオンS-トラン
スフェラーゼでよい。次に融合タンパク質をグルタチオ
ンアフィニティカラムで精製することができる。融合パ
ートナーは例えば融合パートナーと精製すべき本発明の
ポリペプチドとの間のリンカーで部分的タンパク質溶解
により除去することができる。リンカーは、トリプシン
開裂のための部位を定めるアルギニンおよびリシン残基
のような標的アミノ酸を含むように設計することができ
る。オリゴヌクレオチドを使用した標準的なクローニン
グ法を、そのようなリンカーを生成するために使用する
ことができる。
【0025】可能な他の精製法は、調製用電気泳動、FP
LC、HPLC(例えばゲル濾過カラム、逆相カラムまたは中
程度に疎水性のカラムを使用する)、ゲル濾過、分別沈
殿、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティ
クロマトグラフィーに基づく。
【0026】本発明の核酸は常法により調製することが
できる。例えばこの核酸分子は全体を化学的に合成する
ことができる。あるいは本発明の配列の短い部分を化学
的に合成することができ、そのようなオリゴヌクレオチ
ドは放射性標識または蛍光色素で標識することができ
る。標識したオリゴヌクレオチドは、昆虫mRNAに基づき
作成したcDNAライブラリーのスクリーニングに使用する
ことができる。標識したオリゴヌクレオチドがハイブリ
ダイズするクローンを、目的のDNAを単離するために選
択する。単離したDNAの特性決定をした後、本発明によ
る核酸が簡単な様式で得られる。
【0027】さらに本発明の核酸は、化学的に合成した
オリゴヌクレオチドを使用してPCRにより調製すること
ができる。
【0028】本発明の核酸はコード領域付近に天然に存
在する調節領域を単離し、そして特性決定するために使
用することができる。
【0029】本発明の核酸はインビボ法により、エクジ
ソン受容体のUSPサブユニットの新規リガンドの同定を
可能にする。例えば本発明による少なくとも1つの核酸
を含んで成る組換えDNA分子を、この目的のために適当
な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞は本発明
のポリペプチドの発現を可能にする条件下で、化学物質
または化学物質の混合物の存在下で培養される。受容体
の活性化または阻害は、適当なプロモーターの下流にUS
P結合配列と並べられたレポーター遺伝子(例えばルシ
フェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ)をトランス活
性化することにより検出可能にすることができる(1
2)。
【0030】本発明の核酸はインビトロ法により、本発
明によるポリペプチドに結合する化合物を見いだすこと
も可能とする。本発明のポリペプチドを、少なくとも1
つの化学物質と本発明のポリペプチドとの相互作用を可
能とする条件下で、化学物質または化学物質の混合物と
接触させることができる。化合物の本発明によるポリペ
プチドへの結合は、例えば放射性標識または蛍光−標識
したリガンドの置換により検出することができる。本発
明のポリペプチドはこの目的のために標識することもで
き、例えば蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)法を応用す
ることを可能にする。
【0031】この様式で見いだされたリガンドは、新規
な殺虫性物質として作物保護に使用することができる。
そのようなリガンドは小さいな有機化学分子、ペプチド
または抗体の形態を取ることができる。
【0032】これまでに記載した本発明の核酸、ベクタ
ーおよび調節領域のさらなる応用は、種々の標的遺伝子
用の化学的に誘導可能な発現系(ジーン スイッチ)と
してのそれらの使用である。このために、核酸を上記の
ように宿主細胞中で発現させることができる。標的遺伝
子は、調節配列を持つ適当なプロモーターが提供された
発現ベクター中でクローン化される。このような発現ベ
クターを次いで宿主細胞に導入する。標的遺伝子の転写
は、宿主細胞に上記のリガンドを加えることにより調節
することができる。植物は内因性の核内受容体を持たな
いので、しかも植物用の良く機能する化学的に誘導可能
な発現系が現在無いので、培養した細胞の使用に加えて
有利な使用は特に植物での使用である。植物中でのタン
パク質生産は大変有望である。しかしヒトを含む動物に
おける治療的応用もまた可能である。
【0033】配列表に関する情報 配列番号1は、ヘリオティス ビレッセンス(Heliothis
virescens) のUSPのヌクレオチド配列を表す。配列番
号2はヘリオティス ビレッセンス(Heliothisvirescen
s) のUSPのヌクレオチド配列から引き出されるアミノ酸
配列を表す。
【0034】
【実施例】実施例1 上記ポリヌクレオチドの単離 ポリヌクレオチドは、組換えDNA技法の標準法により操
作した(13)。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はプロ
グラム パッケージGCG バージョン9.1(GCG ジェネティ
ックス コンピューター グループ社:GCG Genetics Com
puter Group,Inc.、マジソン ウィスコンシン州、アメ
リカ合衆国)を使用してバイオインフォマティックスに
ついて処理した。
【0035】cDNAライブラリー用のRNAは、Trizol試薬
(ギブコ(Gibco)BRL、製造元の指示に従う)を使用して
ヘリオティス ビレッセンス(Heliothis virescens) の
全幼虫(第2および3齢)から単離した。このようなRN
Aから、次にポリA−含有RNAは、Dyna Beads 280(ダイ
ナル:Dynal)を使用した精製により単離した。5μgのこ
のようなポリA−含有RNAを後にベクターλ−ZAPExpres
s(cDNA合成キット、ZAP-cDNA合成キットおよびZAP-cDN
A Gigapack III Gold クローニングキット、すべてスト
ラタジーン:Stratageneから)を使用してcDNAライブラ
リーを構築するために使用した。製造元の指示から外れ
たのは、45℃の合成温度でcDNAを合成するためにRevers
e Transcriptase Superscript(ギブコ BRL)を使用し
た。また放射性標識したデオキシヌクレオチドは加えな
かった。さらに合成したcDNAはキットの一部であるゲル
濾過媒体を使用して分画しなかったが、Size Sep 400 S
punカラム(ファルマシア:Pharmacia)を使用して分画し
た。
【0036】すべてのスクリーニングはDIGシステムの
援助により行った(すべての試薬および消耗品はベーリ
ンガー マンハイム(Boehringer Mannheim)からであ
り、そして「フィルターハイブリダイゼーションのため
のDIGシステム ユーザー ガイド」 ベーリンガー マン
ハイムに従った)。使用したDNAプローブはジゴキシゲ
ニン−標識化dUTPを使用してPCRにより調製した。ハイ
ブリダイゼーションはDIGEasy Hyb(ベーリンガー マ
ンハイム)中で、40℃にて一晩行った。ナイロン膜上の
標識化DNAの検出は、X-線フィルム(Lumifilm、ベーリ
ンガー マンハイム)を使用して、化学発光(CDP-Sta
r、ベーリンガー マンハイム)によった。同定には遺
伝子ライブラリーから単離したプラスミドを、T3および
T7プライマーによるインシピエント シークエンシング
に供した(ABI Prism Dye TerminatorCycle Sequencing
Kit、ABI、ABI Prism 310 Genetic Analyzerを使用す
る)。完全なポリヌクレオチド配列は、サイクルシーク
エンシングによるプライマーウォーキングにより決定し
た;コントラクト シークエンシングはMediGene、マー
チンスリード(Martinsried)により行った。
【0037】
【表2】
【0038】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Bayer Aktiengesellschaft <120> Ultraspiracle (USP) protein from Heliothis virescens <130> 200106056 <140> <141> <150> DE 100 36 469.1 <151> 2000-07-25 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1398 <212> DNA <213> Heliothis virescens <220> <221> CDS <222> (1)..(1398) <400> 1 atg tcc gtg gcg aag aaa gac aag ccg aca atg tcg gtg aca gca ctt 48 Met Ser Val Ala Lys Lys Asp Lys Pro Thr Met Ser Val Thr Ala Leu 1 5 10 15 atc aac tgg gct cga ccc ttg ccg ccg ggc caa cag cag cag ccg atg 96 Ile Asn Trp Ala Arg Pro Leu Pro Pro Gly Gln Gln Gln Gln Pro Met 20 25 30 acg cct acg tcg ccc gga aac atg ctt caa ccg atg gct acg ccg tct 144 Thr Pro Thr Ser Pro Gly Asn Met Leu Gln Pro Met Ala Thr Pro Ser 35 40 45 aac tta ccg act gtc gac tgc tca ctc gat att caa tgg cta aac ttg 192 Asn Leu Pro Thr Val Asp Cys Ser Leu Asp Ile Gln Trp Leu Asn Leu 50 55 60 gag gga ggt ttt atg tcg ccg atg tca ccg ccg gag atg aag cca gac 240 Glu Gly Gly Phe Met Ser Pro Met Ser Pro Pro Glu Met Lys Pro Asp 65 70 75 80 acg gcg atg cta gac ggc ctg cga gac gac tcc acc cca ccc cca gct 288 Thr Ala Met Leu Asp Gly Leu Arg Asp Asp Ser Thr Pro Pro Pro Ala 85 90 95 ttc aag aac tac ccc ccg aac cat ccc cta agt ggt tct aag cac ctc 336 Phe Lys Asn Tyr Pro Pro Asn His Pro Leu Ser Gly Ser Lys His Leu 100 105 110 tgt tct ata tgt gga gat aga gcg tcg ggg aaa cat tat gga gta tac 384 Cys Ser Ile Cys Gly Asp Arg Ala Ser Gly Lys His Tyr Gly Val Tyr 115 120 125 agt tgt gaa ggt tgc aaa ggt ttc ttc aaa agg acg gta aga aaa gac 432 Ser Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr Val Arg Lys Asp 130 135 140 tta acg tac gca tgc cgc gaa gaa cgt aac tgc atc ata gac aaa cgc 480 Leu Thr Tyr Ala Cys Arg Glu Glu Arg Asn Cys Ile Ile Asp Lys Arg 145 150 155 160 cag agg aac aga tgc cag tac tgt agg tac cag aaa tgt ctc gcg tgc 528 Gln Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Tyr Gln Lys Cys Leu Ala Cys 165 170 175 ggc atg aag agg gaa gcg gtg cag gag gag agg cag agg gcc gcc aga 576 Gly Met Lys Arg Glu Ala Val Gln Glu Glu Arg Gln Arg Ala Ala Arg 180 185 190 ggt acg gag gat gca cat ccg agc agc tcg gtg cag gta cag gag tta 624 Gly Thr Glu Asp Ala His Pro Ser Ser Ser Val Gln Val Gln Glu Leu 195 200 205 tca atc gag cgg ttg ctg gag atg gag tca ctg gta gct gac ccc agc 672 Ser Ile Glu Arg Leu Leu Glu Met Glu Ser Leu Val Ala Asp Pro Ser 210 215 220 gaa gag ttc cag ttc ctt cgt gtg gga ccc gac agt aat gtg ccg cct 720 Glu Glu Phe Gln Phe Leu Arg Val Gly Pro Asp Ser Asn Val Pro Pro 225 230 235 240 aag ttc cgc gcc cct gtc tcc agc ctt tgt caa ata ggc aac aaa caa 768 Lys Phe Arg Ala Pro Val Ser Ser Leu Cys Gln Ile Gly Asn Lys Gln 245 250 255 ata gcg gcg cta gtg gtg tgg gcg cgc gac atc ccg cac ttc agc cag 816 Ile Ala Ala Leu Val Val Trp Ala Arg Asp Ile Pro His Phe Ser Gln 260 265 270 ctt gag atg gaa gac cag atc ctg ctc atc aaa ggc tcc tgg aac gaa 864 Leu Glu Met Glu Asp Gln Ile Leu Leu Ile Lys Gly Ser Trp Asn Glu 275 280 285 ctg ctg ctc ttc gcc att gcg tgg cgg tct atg gag ttc ctg aca gaa 912 Leu Leu Leu Phe Ala Ile Ala Trp Arg Ser Met Glu Phe Leu Thr Glu 290 295 300 gag cga gac ggc gtg gac ggc act ggg aac aga acc aca tcg ccg cca 960 Glu Arg Asp Gly Val Asp Gly Thr Gly Asn Arg Thr Thr Ser Pro Pro 305 310 315 320 caa ctt atg tgt ctc atg cct ggc atg acg ctg cac cgc aac tca gcg 1008 Gln Leu Met Cys Leu Met Pro Gly Met Thr Leu His Arg Asn Ser Ala 325 330 335 ctg cag gcg ggc gtg ggg cag atc ttc gac cgc gtg ctg tcg gag ctg 1056 Leu Gln Ala Gly Val Gly Gln Ile Phe Asp Arg Val Leu Ser Glu Leu 340 345 350 tcg ctg aag atg cgc acc ctg cgc gtc gac cag gcc gag tac gtc gcg 1104 Ser Leu Lys Met Arg Thr Leu Arg Val Asp Gln Ala Glu Tyr Val Ala 355 360 365 ctc aag gcc atc ata ctg ctc aac cca gat gtg aag gga ctg aaa aac 1152 Leu Lys Ala Ile Ile Leu Leu Asn Pro Asp Val Lys Gly Leu Lys Asn 370 375 380 agg caa gaa gtg gaa gtt tta cga gaa aag atg ttc ctg tgc ctg gac 1200 Arg Gln Glu Val Glu Val Leu Arg Glu Lys Met Phe Leu Cys Leu Asp 385 390 395 400 gag tac tgc cgc cgc tcg cgc agt tcg gag gag ggt cgg ttc gcg gcg 1248 Glu Tyr Cys Arg Arg Ser Arg Ser Ser Glu Glu Gly Arg Phe Ala Ala 405 410 415 ctg ctg ctg cgc ctg ccc gcg tta cgt tcc att tca ctc aag agc ttc 1296 Leu Leu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Arg Ser Ile Ser Leu Lys Ser Phe 420 425 430 gag cac ctg ttc ttc ttc cac ctg gtg gcc gac acc agc atc gcc ggc 1344 Glu His Leu Phe Phe Phe His Leu Val Ala Asp Thr Ser Ile Ala Gly 435 440 445 tac atc cgc gac gcg ctg cgc aac cac gcg ccg ccc atc gac acc aac 1392 Tyr Ile Arg Asp Ala Leu Arg Asn His Ala Pro Pro Ile Asp Thr Asn 450 455 460 atg atg 1398 Met Met 465 <210> 2 <211> 466 <212> PRT <213> Heliothis virescens <400> 2 Met Ser Val Ala Lys Lys Asp Lys Pro Thr Met Ser Val Thr Ala Leu 1 5 10 15 Ile Asn Trp Ala Arg Pro Leu Pro Pro Gly Gln Gln Gln Gln Pro Met 20 25 30 Thr Pro Thr Ser Pro Gly Asn Met Leu Gln Pro Met Ala Thr Pro Ser 35 40 45 Asn Leu Pro Thr Val Asp Cys Ser Leu Asp Ile Gln Trp Leu Asn Leu 50 55 60 Glu Gly Gly Phe Met Ser Pro Met Ser Pro Pro Glu Met Lys Pro Asp 65 70 75 80 Thr Ala Met Leu Asp Gly Leu Arg Asp Asp Ser Thr Pro Pro Pro Ala 85 90 95 Phe Lys Asn Tyr Pro Pro Asn His Pro Leu Ser Gly Ser Lys His Leu 100 105 110 Cys Ser Ile Cys Gly Asp Arg Ala Ser Gly Lys His Tyr Gly Val Tyr 115 120 125 Ser Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr Val Arg Lys Asp 130 135 140 Leu Thr Tyr Ala Cys Arg Glu Glu Arg Asn Cys Ile Ile Asp Lys Arg 145 150 155 160 Gln Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Tyr Gln Lys Cys Leu Ala Cys 165 170 175 Gly Met Lys Arg Glu Ala Val Gln Glu Glu Arg Gln Arg Ala Ala Arg 180 185 190 Gly Thr Glu Asp Ala His Pro Ser Ser Ser Val Gln Val Gln Glu Leu 195 200 205 Ser Ile Glu Arg Leu Leu Glu Met Glu Ser Leu Val Ala Asp Pro Ser 210 215 220 Glu Glu Phe Gln Phe Leu Arg Val Gly Pro Asp Ser Asn Val Pro Pro 225 230 235 240 Lys Phe Arg Ala Pro Val Ser Ser Leu Cys Gln Ile Gly Asn Lys Gln 245 250 255 Ile Ala Ala Leu Val Val Trp Ala Arg Asp Ile Pro His Phe Ser Gln 260 265 270 Leu Glu Met Glu Asp Gln Ile Leu Leu Ile Lys Gly Ser Trp Asn Glu 275 280 285 Leu Leu Leu Phe Ala Ile Ala Trp Arg Ser Met Glu Phe Leu Thr Glu 290 295 300 Glu Arg Asp Gly Val Asp Gly Thr Gly Asn Arg Thr Thr Ser Pro Pro 305 310 315 320 Gln Leu Met Cys Leu Met Pro Gly Met Thr Leu His Arg Asn Ser Ala 325 330 335 Leu Gln Ala Gly Val Gly Gln Ile Phe Asp Arg Val Leu Ser Glu Leu 340 345 350 Ser Leu Lys Met Arg Thr Leu Arg Val Asp Gln Ala Glu Tyr Val Ala 355 360 365 Leu Lys Ala Ile Ile Leu Leu Asn Pro Asp Val Lys Gly Leu Lys Asn 370 375 380 Arg Gln Glu Val Glu Val Leu Arg Glu Lys Met Phe Leu Cys Leu Asp 385 390 395 400 Glu Tyr Cys Arg Arg Ser Arg Ser Ser Glu Glu Gly Arg Phe Ala Ala 405 410 415 Leu Leu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Arg Ser Ile Ser Leu Lys Ser Phe 420 425 430 Glu His Leu Phe Phe Phe His Leu Val Ala Asp Thr Ser Ile Ala Gly 435 440 445 Tyr Ile Arg Asp Ala Leu Arg Asn His Ala Pro Pro Ile Asp Thr Asn 450 455 460 Met Met 465
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 1/21 C12P 21/02 C 4H045 5/10 C12Q 1/02 C12P 21/02 1/68 A C12Q 1/02 G01N 33/15 Z 1/68 33/50 Z G01N 33/15 33/53 D 33/50 M 33/53 33/566 C12R 1:645 33/566 C12N 15/00 ZNAA //(C12N 1/19 5/00 B C12R 1:645) C (C12P 21/02 C12R 1:645) (C12Q 1/02 C12R 1:645) (C12Q 1/68 C12R 1:645) (72)発明者 エバ−マリア・フランケン ドイツ42799ライヒリンゲン・シユテルン シユトラーセ21 (72)発明者 マルテイナ・ヤンセン ドイツ53639ケーニヒスビンター・ロトド ルンシユトラーセ2 (72)発明者 トマス・シユルテ ドイツ51061ケルン・アンデアルートヘン 6 Fターム(参考) 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA07 AA11 BA63 CA04 DA01 DA02 DA06 DA12 EA04 GA11 HA12 HA15 4B063 QA20 QQ06 QQ08 QQ09 QQ43 QR08 QR32 QR42 QS25 QS34 QX02 4B064 AG20 CA02 CA10 CA19 CC24 DA12 DA13 4B065 AA26X AA90X AA90Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA48 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA51 DA50 DA75 EA06 EA50 FA72 FA74

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 (a)配列番号1の配列、(b)少なく
    とも600個の連続するヌクレオチド長にわたり配列番号
    1の配列と少なくとも85%の同一性を有する配列、
    (c)遺伝子暗号の縮重により、(a)および(b)で
    定めた配列と同じアミノ酸配列をコードする配列、
    (d)配列番号2のアミノ酸配列を持つポリペプチドと
    本質的に同じ生物活性を有するポリペプチドをコードす
    る(a)、(b)および(c)で定めた配列の部分、か
    ら選択される配列を含んで成るウルトラスピクラル タ
    ンパク質の生物活性を持つポリペプチドをコードする核
    酸。
  2. 【請求項2】 請求項1に記載の少なくとも1つの核酸
    を含んで成るベクター。
  3. 【請求項3】 核酸分子が原核または真核細胞中での核
    酸の発現を確実にする調節配列に機能的に連結されてい
    ることを特徴とする、請求項2に記載のベクター。
  4. 【請求項4】 請求項1に記載の核酸または請求項2ま
    たは3に記載のベクターを含む宿主細胞。
  5. 【請求項5】 原核または真核細胞であることを特徴と
    する、請求項4に記載の宿主細胞。
  6. 【請求項6】 原核細胞が大腸菌(E.coli)であること
    を特徴とする、請求項5に記載の宿主細胞。
  7. 【請求項7】 真核細胞が酵母細胞、哺乳動物細胞、昆
    虫細胞または植物細胞であることを特徴とする、請求項
    5に記載の宿主細胞。
  8. 【請求項8】 請求項1に記載の核酸または請求項2ま
    たは3に記載のベクターを含む、ヒトを除くトランスジ
    ェニック生物。
  9. 【請求項9】 請求項1に記載の核酸によりコードされ
    るポリペプチド。
  10. 【請求項10】 EcRサブユニットおよび請求項9に記
    載のポリペプチドを含んで成る受容体。
  11. 【請求項11】 請求項9に記載のポリペプチドに特異
    的に結合する抗体。
  12. 【請求項12】 以下の(a)請求項4ないし7のいず
    れか1項に記載の宿主細胞を、請求項1に記載の核酸の
    発現を確実にする条件下で培養し、そして(b)細胞ま
    たは培養基からポリペプチドを得る、工程を含んで成る
    請求項9に記載のポリペプチドの調製法。
  13. 【請求項13】 以下の(a)それ自体は既知の様式で
    の完全に化学的な合成、あるいは(b)オリゴヌクレオ
    チドを化学的に合成し、オリゴヌクレオチドを標識し、
    オリゴヌクレオチドを昆虫cDNAライブラリーのDNAとハ
    イブリダイズさせ、陽性のクローンを選択し、そして陽
    性クローンからハイブリダイズするDNAを単離するか、
    あるいは(c)オリゴヌクレオチドの化学合成、そして
    PCRによる標的DNAの増幅、工程を含んで成る請求項1に
    記載の核酸の調製法。
  14. 【請求項14】 昆虫細胞中で請求項1に記載の核酸の
    転写を自然に制御し、そして特異的発現を確実にする調
    節領域。
  15. 【請求項15】 作物を保護するための新規な活性化合
    物、特に請求項9に記載のポリペプチドまたは請求項1
    0に記載の受容体の活性化または阻害を引き起こす化合
    物を見いだす方法であって、以下の(a)請求項4ない
    し7の1項に記載の宿主細胞を提供し、(b)宿主細胞
    を化学物質または化学物質の混合物の存在下で培養し、
    そして(c)ポリペプチドまたは受容体の活性化または
    阻害を検出する、工程を含んで成る上記方法。
  16. 【請求項16】 以下の(a)請求項9に記載のポリペ
    プチドを、化合物または化合物の混合物に、化合物(1
    つまたは複数)とポリペプチドとの相互作用が可能とな
    る条件下で接触させ、そして(b)ポリペプチドに特異
    的にに結合する化合物を同定する、工程を含んで成る、
    請求項9に記載のポリペプチドに結合する化合物を見い
    だす方法。
  17. 【請求項17】 以下の(a)請求項1に記載の核酸の
    発現を確実とする条件下で、請求項4ないし7の1項に
    記載の宿主細胞を培養するか、または請求項8に記載の
    トランスジェニック生物を提供し、ここで宿主細胞また
    はトランスジェニック生物は安定な調節配列を持つ標的
    遺伝子を含み、そして(b)宿主細胞またはトランスジ
    ェニック生物を標的遺伝子の発現を誘導する化学物質と
    接触させる、工程を含んで成る、請求項9に記載のポリ
    ペプチドによる標的遺伝子を誘導的に発現する方法。
  18. 【請求項18】 作物保護用の新規な活性化合物を見い
    だすための、請求項1に記載の少なくとも1つの核酸、
    請求項2または3に記載のベクター、請求項4ないし7
    の1項に記載の宿主細胞、請求項8に記載のトランスジ
    ェニック生物、請求項9に記載のポリペプチド、請求項
    10に記載の受容体または請求項14に記載の調節領域
    の使用。
  19. 【請求項19】 宿主細胞または宿主生物の生物学的特
    性の方向つけられたモディフィケーションのための、請
    求項1に記載の少なくとも1つの核酸、請求項2または
    3に記載のベクター、請求項4ないし7の1項に記載の
    宿主細胞、請求項8に記載のトランスジェニック生物、
    請求項9に記載のポリペプチド、請求項10に記載の受
    容体、請求項14に記載の調節領域または請求項17に
    記載の方法の使用。
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