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CN102628049B - 二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR及其编码的蛋白和应用 Download PDF

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CN102628049B CN 201210097943 CN201210097943A CN102628049B CN 102628049 B CN102628049 B CN 102628049B CN 201210097943 CN201210097943 CN 201210097943 CN 201210097943 A CN201210097943 A CN 201210097943A CN 102628049 B CN102628049 B CN 102628049B
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Abstract

本发明公开了一种二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR，其编码具有二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR的核苷酸序列，核苷酸序列与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性。本发明还同时公开了上述二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。本发明的二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的用途为：用来筛选和/或评价调控鱼尼丁受体活性的物质。

Description

二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR及其编码的蛋白和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学、细胞生物学以及农药学领域，主要是一种在二化螟中表达的鱼尼丁受体基因(核酸序列)及其编码蛋白。本发明还涉及该蛋白和受体基因(核酸序列)的制备方法和用途。
背景技术
鱼尼丁受体(RyR)的命名来自于从南美的一种大风子科的豆科植物Ryania speciosa中分离出来的植物碱杀虫剂鱼尼丁(ryanodine)。研究证明，鱼尼丁是通过作用于RyR而产生杀虫效果的(Fill and Copello，2002)。但由于其结构复杂，难于改造，成本高和毒性高等因素，因而限制了其作为杀虫剂的使用。经过长期研究，日本农药终于(Nihon Nohyaku)发现了邻苯二甲酰胺类化合物(phthalic diamides)的杀虫活性，并从中商品化了氟虫酰胺(Tohnishi et al.，2005)。几乎同时美国杜邦对也该类化合物做了较大结构改变和修饰，发现了一类新的邻甲酰氨基苯甲酰胺类(anthranilic diamides)杀虫剂，并从中商品化了氯虫酰胺(Lahm et al.，2005)。该化合物不仅在结构上与氟虫酰胺相似，即都具有二酰胺基元，故称它们为二酰胺类杀虫剂，而且都作用于RyR。这类杀虫剂是一类对鳞翅目等害虫高效，对哺乳动物低毒、安全，作用机理独特，无交互抗性和对环境友好的新型杀虫剂。在农药发展史上，该类杀虫剂是继以吡虫啉为代表的新烟碱类杀虫剂后的又一个新的突破(Nauen，2006)。所以目前包括杜邦、拜耳等在内的农化巨头们正在继续加紧开发二酰胺类杀虫剂，同时试图筛选更多作用于RyR的新颖化学结构的杀虫活性物质(Lahm et al.，2009)。
细胞内游离Ca2+浓度的改变是细胞生理功能的重要物质基础，它的变化是Ca2+跨膜转运和细胞内钙库释放、摄取Ca2+等动态平衡的结果。RyR和三磷酸肌醇受体(IP3R)(Berridge，1993)共同组成了两类主要的位于细胞内质网/肌浆网(SR/ER)上的调节胞内钙库释放Ca2+的通道蛋白(Berridge et al.，2000)。哺乳动物体内共有三种不同基因编码的RyR：RyR1主要在骨骼肌中表达，参与骨骼肌的兴奋-收缩，中枢神经中也有少量表达；RyR2主要表达于心肌中，是心肌收缩偶联不可或缺的成分；RyR3表达于一些特定的肌肉及非肌肉组织中，包括脑、神经等组织。RyR由4个分子量约为560kD的相同亚单位组成，是分子量很大的膜蛋白，包含了大量伸入胞浆的决定其特性的N末端结构域，这些结构域分布着通道调节物的结合位点(Fill and Copello，2002)。
虽然人们很早就通过生理生化等方法等发现昆虫的肌肉细胞中存在着大量的RyR位点(Vazquez-Martinez et al.，2003)，但是相对于哺乳动物RyR较为系统完整的研究，昆虫RyR分子水平的研究在很长时间内几乎是一篇空白，只有果蝇(Drosophila melanogaster)的RyR基因全长cDNA被克隆(Takeshima et al.，1994)并且进行了通道动力学的研究(Xu etal.，2000)。随着二酰胺类杀虫剂的发现和上市，昆虫RyR也逐渐成为研究热点。杜邦公司在Sf9细胞系中对不同种属昆虫的功能性RyR的全长基因进行了克隆与表达并申请了专利(WO2004027042)，这些昆虫包括鳞翅目烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、同翅目桃蚜(Myzuspersicae)、棉蚜(Aphis gossypii)和玉米飞虱(Peregrinus maidis)。京都大学和日本农药公司克隆了家蚕(Bombyx mori)的RyR基因并且成功在HEK293细胞系获得稳定高效表达(WO2007094408)。这些被注册专利的基因序列具有广泛的用途，如可用于大量化合物杀虫活性筛选方法的建立，用于该受体蛋白抗体的制备，用于生物农药的开发以及用于转基因作物研究等。
参考文献具体如下：
1、Berridge MJ.1993.Inositol trisphosphate and calcium signalling.Nature 361：315-325(磷酸肌醇和钙信号，《自然》)。
2、Berridge MJ，Lipp P，Bootman MD.2000.The versatility and universality of calciumsignalling.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1：11-21(钙信号的多样性和普遍性，《自然分子生物学综述》)。
3、Fill M，Copello JA.2002.Ryanodine receptor calcium release channels.Physiol.Rev.82：893-922(钙离子释放的鱼尼丁受体通道，《生理学综述》)。
4、Lahm GP，Cordova D，Barry JD.2009.New and selective ryanodine receptor activatorsfor insect control.Bioorg.Med.Chem.17：4127-4133(新型用于害虫控制的选择性鱼尼丁激活剂，《生物有机和医学化学》)。
5、Lahm GP，Selby TP，Freudenberger JH，Stevenson TM，Myers BJ，Seburyamo G，SmithBK，Flexner L，Clark CE，Cordova D.2005.Insecticidal anthranilic diamides：a new class ofpotent ryanodine receptor activators.Bioorg.Med.Chem.Lett.15：4898-4906(邻甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂：一类新的潜在鱼尼丁受体激活剂，《生物有机和医学化学》)。
6、Nauen R.2006.Insecticide mode of action：return of the ryanodine receptor.PestManag.Sci.62：690-692(杀虫剂作用机理：鱼尼丁受体的回归，《有害生物治理科学》)。
7、Takeshima H，Nishi M，Iwabe N，Miyata T，Hosoya T，Masai I，Hotta Y.1994.Isolationand characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophilamelanogaster.FEBS Lett.337：81-87(分离和解析一种果蝇的鱼尼丁受体/钙离子释放通道，《欧洲生物化学学会通信》)。
8、Tohnishi M，Nakao H，Furuya T，Seo A，Kodama H，Tsubata K，Fujioka S，Kodama H，Hirooka T，Nishimatsu T.2005.Flubendiamide，a novel insecticide highly active againstlepidopterous insect pests.J.Pestic.Sci.30：354-360(氟虫苯甲酰胺，一种新型针对鳞翅目害虫的高效杀虫剂，《农药科学杂志》)。
9、Vazquez-Martinez O，Canedo-Merino R，Diaz-Munoz M，Riesgo-Escovar JR.2003.Biochemical characterization，distribution and phylogenetic analysis of Drosophilamelanogaster ryanodine and IP3 receptors，and thapsigargin-sensitive Ca2+ ATPase.J.Cell Sci.116：2483-2494(对果蝇鱼尼丁受体、三磷酸肌醇受体和毒胡萝卜素敏感型钙泵的生化，分布和系统发育分析，《细胞科学杂志》)。
10、Xu X，Bhat MB，Nishi M，Takeshima H，Ma J.2000.Molecular cloning of cDNAencoding a drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminalcalcium release channel.Biophys.J.78：1270-1281(分子克隆一种果蝇鱼尼丁受体并对其羧基端的钙释放通道的功能研究，《生物物理杂志》)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鱼尼丁受体蛋白CsRyR及其编码的基因，以及利用该受体表达细胞系进行杀虫活性物质筛选的技术。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR，编码具有二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性。
作为本发明的二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的改进：该二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明还同时提供了上述二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
本发明还同时提供了一种重组载体，该重组载体包含上述二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR。
本发明还同时提供了用上述重组载体转染的宿主细胞，宿主细胞为HEK-293，CHO，COS，Sf9，S2或Sf21。
本发明还同时提供了上述二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的用途：用来筛选和/或评价调控鱼尼丁受体活性的物质。
作为本发明的二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的用途的改进：用来筛选和/或评价调控鱼尼丁受体活性的物质的方法包括如下步骤：
1)、将上述重组载体转染宿主细胞系；
2)、用候选物质处理步骤1)所得的细胞；
3)、检测步骤2)所得的细胞内钙离子浓度的变化；当钙离子浓度出现变化时，说明候选物质能调控鱼尼丁受体活性。
一般而言：只要和对照(如只加入溶剂时)的反应相比有显著差异即可，即，只要确认有钙离子浓度的信号变化即可。
在本发明中，发明人在二化螟中克隆到鱼尼丁受体基因CsRyR。在本发明之前，尚未有任何公开或报道过本发明中提及的二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR序列及其编码的基因(核酸序列)。
本发明的目的在于提供二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR及其编码的基因(核酸序列)，并可以用该序列来转染构建稳定表达该受体的细胞系，通过该细胞系可以对针对该受体靶标的杀虫活性物质进行筛选。
在本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸第1-15387位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55摄氏度条件下与SEQ IDNO：1中从核苷酸第1-15387位的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ IDNO：1中从核苷酸第1-15387位的核苷酸序列。备注说明：在SEQ ID NO：1的末尾含有终止码。
本发明分离出的二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2序列的多肽。
本发明DNA分子转化的宿主细胞是真核细胞。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR编码的核酸序列指：编码具有二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1中第1-15387位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO：1序列编码框第1-15387位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密码的简并性，所以与SEQ ID NO：1中第1-15387位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：1所述的序列。
还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO：中从核苷酸第1-15387位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO：1中从核苷酸第1-15387位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR相同功能的蛋白的SEQ ID NO：1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR指：具有二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与天然二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地以5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又别如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR的活性片段和活性衍生物。
在本发明中二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR保守性变异多肽指：与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1
  最初的残基   代表性的取代   优选的取代
  Ala(A)   Val；Leu；Ile   Val
  Arg(R)   Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn(N)   Gln；His；Lys；Arg   Gln
  Asp(D)   Glu   Glu
  Cys(C)   Ser   Ser
  Gln(Q)   Asn   Asn
  Glu(E)   Asp   Asp
  Gly(G)   Pro；Ala   Ala
  His(H)   Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile(I)   Leu；Val；Met；Ala；Phe   Leu
  Leu(L)   Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile
  Lys(K)   Arg；Gln；Asn   Arg
  Met(M)   Leu；Phe；Ile   Leu
  Phe(F)   Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Leu
  Pro(P)   Ala   Ala
  Ser(S)   Thr   Thr
  Thr(T)   Ser   Ser
  Trp(W)   Tyr；Phe   Tyr
  Tyr(Y)   Trp；Phe；Thr；Ser   Phe
  Val(V)   Ile；Leu；Met；Phe；Ala   Leu
发明还包括二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR或多肽的类似物。这些类似物与天然抗菌多肽的差别可以是氨基酸序列上的诧异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR时，可以将二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR表达载体。
如本发明所用的“可操作地连于”指这样一种情况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能够翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中宿主细胞为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞核哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如HEK-293细胞、COS细胞等。
还可用Northern印迹法技术分析二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR基因产物的表达，即分析二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR核苷酸编码序列的8-66个连续氨基酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR的核酸分子。
本发明涉及检测样品中是否存在二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR同源基因或同源蛋白。
为了得到与二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR基因相关的二化螟cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选二化螟cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自二化螟的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clonetech，Stratagene，Palo Alto，这种筛选方法也可以识别与二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR的基因家族的核苷酸序列。
本发明的二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接产生全长的分子。利用本发明的二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR，通过各种常规筛选方法，可筛选出二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或抗拮剂等。
本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为加杀虫剂flubendiamide和chloranthraniliprole以及激动剂caffeine和ryanodine后的钙离子反应对比图；
图2是对比试验的反应对比图。
具体实施方式
实施例1：
二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的克隆
1.对4龄左右的二化螟幼虫用Trizol法匀浆提取总RNA并转录为cDNA：
使用TransScriptTM II Reverse Transcriptase进行反转录实验。
反应体系：
Figure BDA0000150519170000091
反应条件：65℃，5min立即冰上放置2分钟，然后加入下列组分：
Figure BDA0000150519170000092
反应条件：30℃，10min    42℃，30min    95℃，5min
2.PCR扩增全长基因序列
使用Roche的Expand Long Range dNTPack来PCR扩增
反应体系：
Figure BDA0000150519170000093
反应条件：
最后产物为两端含有Not1和Apa1限制性内切酶的全长序列(SEQ ID NO：1，即序列表1)。
实施例2：
二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR在HEK-293细胞系中表达
1.将克隆得到的二化螟CsRyR基因序列(SEQ ID NO：1)克隆到pcDNA3表达载体pcDNA3表达载体的准备Not I酶切反应
反应体系：
Figure BDA0000150519170000101
反应条件：37℃ 4hours
使用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit对上述酶切产物进行精制；得pCDNA3-NotI。
Apa I酶切反应
反应体系：
pCDNA3-Not I  42.5ul
10×L Buffer 5ul
Apa I(10U/ul) 2.5ul
反应条件：37℃ 4hours
使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit切胶回收上述酶切产物。
用连接酶将实施例1中得到的序列连接到上述的酶切载体中，得到表达载体pcDNA3-CsRyR。
2.转染HEK-293细胞系与单克隆细胞培养
将pcDNA3-CsRyR用lipofectamine2000脂质体转染试剂转染到HEK-293细胞系中，转染步骤和方法参照产品说明书。24h后加入终浓度为1mg/ml的G418进行筛选，一周后形成细胞群落后用克隆圆环挑取细胞簇后进行单克隆培养；得HEK-CsRyR细胞。
实施例3：
HEK-CsRyR细胞系对杀虫剂的钙离子反应
将表达的CsRyR细胞(HEK-CsRyR细胞)提前48h转到12mm盖玻片上，用DPBS清洗两遍后再用Fura-2AM(终浓度5M)与DMEM的混合液负载30min，然后用Ringerbuffer清洗两遍后在PTI公司的ERP钙离子成像系统上测定分别在340nm和380nm激发波长下的510nm发射波长的荧光强度，两者比值可以换算成细胞内钙离子的绝对浓度。
待检验细胞(HEK-CsRyR细胞)在缓冲液灌流下加入不同浓度的激动剂和杀虫剂等记录荧光强度比值的变化。具体如下：
1.室温下，用Ringer Buffer以1mL/min的速度灌流存放玻片的浴槽，然后用移液器加入40μL的1μM浓度的各种激动剂或杀虫剂，然后记录钙离子信号。
2.对于能够产生钙离子信号的药物，再逐步降低浓度以测定产生信号的最低浓度；对于没能产生信号的药物，则逐步增加浓度到1mM，还不能观察到反应就说明该药物对CsRyR没有作用。
图1即为分别加杀虫剂flubendiamide和chloranthraniliprole以及激动剂caffeine和ryanodine后的钙离子反应，可以看到1μM的杀虫剂即可引起非常大的信号反应，表明该受体表达细胞系可以用来筛选作用于鱼尼丁受体的杀虫活性物质。
对比实验：以转染pc-DNA3空载体的HEK-293细胞替代检验细胞(HEK-CsRyR细胞)，实验内容同上，结果为：无论是杀虫剂flubendiamide和chloranthraniliprole，还是激动剂caffeine和ryanodine，1mM的上述药物都对转染空载体细胞没有任何反应，100μMATP作为钙离子实验的阳性对照，具体如图2所示。
综上所述，普通HEK-293细胞不会对鱼尼丁受体激动剂(比如杀虫剂flubendiamide和chloranthraniliprole)有反应，而HEK-CsRyR细胞则会对鱼尼丁受体激动剂产生强烈的钙离子反应，所以可以用来进行筛选作用于鱼尼丁受体的杀虫活性物质。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
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Claims (6)

1.二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR，其特征在于：所述二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR编码的蛋白质，其特征在于：该蛋白质为SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
3. 一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包含权利要求1所述的二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR。
4. 用如权利要求3所述的重组载体转染的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为HEK-293，CHO，COS，Sf9，S2或Sf21。
5. 如权利要求1所述的二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的用途，其特征在于：用来筛选和/或评价调控鱼尼丁受体活性的物质。
6. 根据权利要求5所述的二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的用途，其特征在于：用来筛选和/或评价调控鱼尼丁受体活性的物质的方法包括如下步骤：
1）、将如权利要求4所述的重组载体转染宿主细胞系；
2）、用候选物质处理步骤1）所得的细胞；
3）、检测步骤2）所得的细胞内钙离子浓度的变化；当钙离子浓度出现变化时，说明候选物质能调控鱼尼丁受体活性。
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