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JP2005502337A - 融合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、機能性IL−6分子および機能性DS−sIL−6R分子を含む融合タンパク質に関する。本発明は、融合タンパク質をコードする核酸、融合タンパク質の産生方法、ならびに感染性疾患そして炎症性および免疫学的障害の治療における融合タンパク質の使用にも関する。

Description

【技術分野】
【0001】
本発明は、機能性IL−6分子および機能性DS−sIL−6R分子を含む融合タンパク質に関する。本発明は、融合タンパク質をコードする核酸、融合タンパク質の生産方法、ならびに感染性疾患そして炎症性および免疫学的障害の治療における融合タンパク質の使用にも関する。
【0002】
インターロイキン−6(IL−6)は、増殖/分化、造血ならびに免疫応答の調節を含めた種々の細胞事象を調節するのに関与する主要炎症性サイトカインである。これらの過程の活性化は、ある種の細胞の表面に見出される特異的受容体(IL−6R)とのIL−6の結合により調節される。IL−6Rの存在は少数の細胞型にのみ限定されるため、IL−6自体の活性は制限される。しかしながら、可溶性形態のIL−6R(sIL6R)との結合は、IL−6の生物学的活性を調整し得る。sIL−6Rは種々の体液中で同定されており、多数の疾患において増加する。sIL−6RはIL−6を結合し、正常ではIL−6単独には応答しない細胞型の活性化を促し得る。したがって、sIL−6R放出の制御はIL−6活性の調節における重要な過程である。
【0003】
可溶性サイトカイン受容体は、典型的にはタンパク質分解性切断(PC)または示差的mRNAスプライシング(DS)により生成される。sIL−6Rの場合、両メカニズムが利用されて、本明細書中でPC−sIL−6RおよびDS−sIL−6Rと呼ばれる2つのアイソフォームが結果として生成される。両形態は構造的に関連しているが、その近位COOH末端尾での10個の特有のアミノ酸の付加により、DS−sIL−6RはPC−sIL−6Rの形態とは区別される。その結果として、sIL−6Rの2つの別個の形態はこの可溶性受容体の全体的特性を制御する。
【0004】
上記のように、インターロイキン−6(IL−6)に割り当てられる生物学的活性の多くは、sIL−6Rを結合するその能力により媒介される(Jones et al., FASEB. J. 15, 43-58, 2001)。実際、sIL−6R/IL−6複合体の形成は、細胞の増殖、分化および炎症性事象の調節を含めた種々の細胞性応答を刺激することが示されている。これらの過程の活性化は、全てのIL−6関連サイトカインに関する全般的シグナル伝達サブユニットとして作用する普遍的に発現される膜結合gp130の刺激複合体の相互作用により達成される(Heinrich et al., Eur. J. Biochem. 236, 837-842, 1998)。その結果、sIL−6R−IL−6複合体は、gp130を発現するが、IL−6自体に対して本来応答しない細胞型のアゴニストとして作用する。コグネイトIL−6Rの細胞性発現が肝細胞および白血球亜集団に主として限定されるとすると、sIL−6Rは、IL−6に対して応答性である細胞型の範囲を広げる能力を有する。
【0005】
多数の臨床状態におけるsIL−6Rレベル増大の確認は、この可溶性受容体が局所性および全身性IL−6媒介性応答の両方を調節する可能性を強調する(Jones et al., 2001(上記))。その結果、IL−6自体により制御される細胞事象がsIL−6R/IL−6複合体により媒介されるものと区別されることが不可欠である。この問題点にとって重要なのは、sIL−6R放出がどのようにin vivoで調節されるかを確かめる必要性であった。しかしながら、sIL−6Rレベルを制御するメカニズムを理解しようとすると、2つのアイソフォームPC−sIL−6RまたはDS−sIL−6Rの存在により混乱を生じる。両形態は構造的に関連するが、示差的にスプライシングされた変異体は、スプライシング過程の結果として導入される新規の近位COOH末端配列(GSRRRGSCGL)によりシェッドアイソフォームと区別され得る(Horiuchi et al., Immunology 95, 360-369, 1998)。今日までのところ、sIL−6Rの活性を制御するために2つのアイソフォームが存在する理由は明らかでない。
【0006】
PC−およびDS−sIL−6Rはそれぞれ、in vivoでのsIL−6Rの全体的特性を調和させ得るため、個々の細胞事象を引き出すそれらの能力も評価しながら、炎症性事象の進行中のそれらの時間的関係を考察することが不可欠である。種々の疾患状態からの臨床試料の検査により、各アイソフォームの放出が示差的に調節され、個体の年齢、研究される疾患状態および疾患進行の段階に応じることがこれまでに確証されてきた(Jones et al., 2001(上記), Horiuchi et al., 1998(上記)およびMuller-Newen et al., Eur. J. Biochem. 236, 837-842, 1996)。
【0007】
ここ4〜5年で、細胞表面タンパク質CD4、ならびにCXCR4(HIVのT栄養株に関して)およびCCR5(HIVのM栄養株に関して)として同定された2つの別個の補助受容体の1つを利用することにより、HIVが細胞に進入することが示された。これらの補助受容体の本来の機能は、ケモカイン受容体として作用することであり、MIP−1α、MIP−1βおよびRANTESはすべて、CCR5と結合する。実際、これらのケモカインの循環レベルの有意の上昇を示すHIV患者は、より低レベルのMIP−1α、MIP−1βおよびRANTESを有する個体より十分発達した(blown)AIDSを発症する可能性は低い。3つのケモカインのすべて、ならびにHIVのM栄養株はCCR5を結合するため、高レベルのMIP−1α、MIP−1βおよびRANTESはCCR5結合に関してウイルスと競合し、HIV進入を有効に抑制する。その結果として、ケモカインに有利にこの競合の平衡を再調整し得る任意の因子は、HIV療法として有用であり得る。
【0008】
Fischer他(Nat. Biotechnol., 15, 142-5, 1997)には、リンカーによりPC−sIL−6Rに連結されたIL−6を含む融合タンパク質は初期造血前駆体の強力な刺激剤であることが示されている。融合タンパク質は、ハイパーIL−6(H−IL−6)と当業者に呼ばれている。H−IL−6の使用は、Jostock et al.,(J. Immunol. Methods, 223, 171-183, 1999)、Kollet他(Blood, 94, 923-931, 1999)およびChebath他(Eur. Cytokine. Netw., 8, 359-65, 1997)に記載されている。WO 00/01731号およびWO 99/02552号では、PC−sIL−6Rに連結されたIL−6を含む融合タンパク質が開示されている。
【0009】
米国特許US−A−5,919,763号では、H−IL−6は、肝臓およびその機能の再生を促すことにより肝臓損傷の治療に用いられてきたと述べられている。
【0010】
従来技術文書で、IL−6およびDS−sIL−6Rを含むタンパク質を開示または示唆するものはない。
【0011】
本発明は、機能性IL−6分子および機能性DS−sIL−6R分子を含む融合タンパク質であって、MIP−1α、MIP−1β、RANTESおよびIP−10のうちの1つまたはそれ以上の発現を増大するタンパク質を提供する。
【0012】
MIP−1αは、CCL3とも呼ばれ、MIP−1βは、CCL4とも呼ばれ、RANTESはCCLSとも呼ばれ、そしてIP−10はCXCL10とも呼ばれる。
【0013】
本発明は、機能性IL−6分子および機能性DS−sIL−6R分子を含む融合タンパク質が1つまたはそれ以上のMIP−1α、MIP−1β、RANTESおよびIP−10の発現増大を生じるという予期せぬ知見に基づいている。機能性IL−6分子およびPC−sIL−6R機能性分子(即ちH−IL−6)を含む融合タンパク質は、MIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10の発現増大を生じない。したがって、本発明の融合タンパク質は、その機能においてH−IL−6とは実質的に異なる。本発明の融合タンパク質およびH−IL−6はともにMCP−1の発現を増大することが見出されているが、本発明の融合タンパク質のみは、MIP−1α、MIP−1β、RANTESおよびIP−10のうちの1つまたはそれ以上の発現を増大する。本発明の融合タンパク質は、その他のケモカイン、例えばMIG(CXCL9)またはITAC(CXCL11)の発現も増大する。
【0014】
「機能性IL−6分子」という用語は、MIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10の発現を増大するためにDS−sIL−6Rとの組み合わせにおいて機能する任意のIL−6分子を指す。候補分子が機能性IL−6分子であるか否かを決定するために、候補分子は、MIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10の発現の増大が認められるか否かを決定するためにDS−sIL−6Rとの組み合わせで試験され得る。このような機能を確定するための適切な方法は、本明細書中の実施例1に記載されている。好ましくは機能性IL−6分子は、図3の残基29〜212、あるいはその機能性相同体を含む。機能性IL−6分子が図3に示された配列またはその機能性相同体を含むことがさらに好ましい。「機能性相同体」という用語は、機能性IL−6分子の活性を保有し、好ましくは少なくとも60%の配列相同性を有するタンパク質を指す。相同性は、好ましくはBLAST解析を用いて確定される。相同体は図3の残基29〜212との少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは95%の配列相同性を有することがさらに好ましい。好ましくはこのような機能性相同体は、図3の残基29〜212とは約1〜10アミノ酸が異なっている。
【0015】
任意のアミノ酸変化が保存性であることがさらに好ましい。保存性変化は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリーからの1つで1つのアミノ酸を置換するものである。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの、およびグルタミン酸に代わるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの単離置換、あるいは構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の同様の保存的置換はタンパク質の生物学的活性に大きな影響を及ぼさないと予測するのは理にかなっている。タンパク質中の他のアミノ酸とのジスルフィド結合を形成し得るアミノ酸の数を増大する突然変異は、タンパク質の安定性を増大するために特に好ましい。タンパク質の機能を増大するその他の突然変異も作製され得る。
【0016】
「機能性DS−sIL−6R分子」という用語は、MIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10の発現を増大するためにIL−6との組み合わせにおいて機能する任意のDS−sIL−6R分子を指す。候補分子が機能性DS−sIL−6R分子であるか否かを決定するために、候補分子は、MIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10における増大が認められるか否かを決定するためのIL−6との組み合わせで試験され得る。このような機能を確定するための適切な方法は、本明細書中の実施例1に記載されている。好ましくは機能性DS−sIL−6R分子は、図4の残基113〜364、あるいはその機能相同体を含む。機能性DS−sIL−6R分子が図4に示された配列またはその機能相同体を含むことがさらに好ましい。
【0017】
「その機能相同体」という用語は、相同体が機能性DS−sIL−6Rの活性を保持しなければならないこと、および配列の相同性が図4に示された配列の残基113〜364に対して判定されるべきものであることを除いて、上記と同様である。
【0018】
図4中のDS−sIL−6R分子のC末端の10個のアミノ酸はDS−sIL−6RおよびPC−sIL−6R間の主な差異であるので、C末端の10個のアミノ酸または機能的に等価の配列が機能性DS−sIL−6R分子中に存在することが不可欠である。機能的に等価の配列としては、IL−6と組み合わせた場合に、MIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10の発現のレベルをDS−sIL−6R分子が増大するのを可能にする配列が挙げられる。例えばC末端の10個のアミノ酸は、上記のように保存的アミノ酸変化により修飾され得る。さらに、図4に示された配列を有するDS−sIL−6R分子を用いた場合に達成される上記のDS−sIL−6R機能性分子の機能を増大する(すなわちMIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10の発現のレベルを増大する)修飾がなされ得る。適切な修飾は、C末端の10個のアミノ酸中のアルギニンの一続きの長さを増大することを包含し得る。その他の適切な修飾は、無作為アミノ酸置換、特にアラニン置換、ならびにC末端の10個のアミノ酸の切断であり得る。このような修飾は、本明細書中に記載された方法を用いて試験され得る。特にRT−PCRは、DS−sIL−6RをコードするcDNAを生成した。このcDNA分子は、GSRRRGSCGL配列またはDS−sIL−6Rの任意のその他の配列を修飾するための鋳型として用いられ得る。この配列を基礎にしたオリゴヌクレオチドプライマーは、近位DS−sIL−6R配列内に新規のコドンを導入するためのPCRアプローチに用いられ得る。これは、発現されるとDS−sIL−6RCOOH末端の連続切断ならびにPC−sIL−6RへのDS−sIL−6R配列の段階的変換を生じるcDNA断片の生成を可能にする。突然変異誘発キット(Stratagene)に向けられるクイックチェンジ(QuickChange)TM部位も、GSRRRGSCGL配列内の個々の残基を修飾するために用いられて、DS−sIL−6R活性の媒介を担うアミノ酸を指摘し得る。すべての変異体がシーケンシングされ、適切なベクター、例えばSF9細胞中でのバキュロウイルス発現のためのpVL1393(Horiuchi, 1998(上記))およびCOS−7細胞中での一過性/安定発現のためのpcDNA−3(Elson et al., 2000, Nature Neuroscience, 3: 867-872)中でクローン化される。DS−sIL−6Rの機能を増大するその他の突然変異も作製され得る。
【0019】
受容体機能性を保証するために、そして各DS−sIL−6R突然変異体の結合動態を評価するために、表面プラズモン共鳴技法が、CM5カルボキシメチルデキストランのようなマトリックスに固定されたIL−6または可溶性gp130(sgp130)(例えば10mg/mlコーティングストック中)とともに用いられ得る。示差的DS−sIL−6R活性を引き出すための重要な残基を同定するために、ヒト腹膜中皮細胞(HPMC)によるケモカイン発現(MIP−1α、MIP−1β、RANTESおよびIP−10)がELISAを用いてモニタリングされる(Hurst et al., Immunity, 14, 705-714, 2001)。ルシフェラーゼレポーターアッセイも、下記の材料と方法に記載するように、修飾がDS−sIL−6RによるRANTESプロモーターの活性化を中断させるか否かを確定するために用いられ得る。
【0020】
機能性IL−6分子および機能性DS−sIL−6R分子は、リンカーを介して一緒に連結され得るか、あるいは共有結合により互いに直接結合され得る。適切なフレキシブルリンカーは、当業者に既知である。好ましくはフレキシブルリンカーは、配列GGGGSGGGGSLEを有する。あるいはリンカーは、ロイシンジッパーの形態であり得る。
【0021】
機能性DS−sIL−6R分子に機能性IL−6分子を直接結合する方法は、PC−sIL−6Rに直接融合されたIL−6を含む融合タンパク質が開示されている国際特許出願WO 00/01731における以下の教示の結果から容易に確定され得る。
【0022】
本発明の融合タンパク質は、1つより多い機能性IL−6分子および1つより多い機能性DS−sIL−6R分子を含み得る。IL−6分子対DS−sIL−6R分子の比は1:1でなければならないというわけではないが、好ましくは1:1である。好ましくは本発明の融合タンパク質は、1つの機能性IL−6分子および1つの機能性DS−sIL−6R分子を含む。
【0023】
本発明の融合タンパク質は、少なくとも5倍、好ましくは少なくとも10倍、さらに好ましくは少なくとも15倍、最も好ましくは少なくとも25倍、MIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10の発現を増大することが特に好ましい。MIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10の発現の増大は、in vivoまたはin vitroで測定され得る。好ましくは増大は、適切な細胞系で、例えばin vitroで成長されたヒト腹膜中皮細胞(HPMC)で測定される。MIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10における増大を測定するための適切な方法は、本明細書中に開示されている。
【0024】
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は図5に示された配列を有する。図5に示された融合タンパク質は、C末端c−mycタグ(下線を施されている)を有するフレキシブルリンカーにより一緒に連結された機能性IL−6分子および機能性DS−sIL−6R分子をコードする。c−mycタグは、融合タンパク質の精製を手助けするために用いられ、特に融合タンパク質がスクリーニングまたは医学的情況で用いられる場合には、好ましくは本発明の融合タンパク質の一部でない。
【0025】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【0026】
本発明の核酸は、当業界で既知の方法により得られる。例えば天然に存在する配列は、適切な細胞系からのゲノムクローニングまたはcDNAクローニングにより、あるいはヒトまたはマウスのような生物体の組織に直接由来するDNAまたはcDNAから得られる。あるいは配列は、標準合成方法、例えばホスホアミダイト法を用いて合成され得る。
【0027】
多数の技法が、合成またはクローニング手法により得られる核酸配列を変えるために用いられ得る。このような技法は、当業者に既知である。例えば部位特異的突然変異誘発またはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発およびPCR技法は、DNA配列を変更するために用いられ得る。このような技法は当業者には既知であり、当業者に既知の膨大な文献本体に記載されている。
【0028】
本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクターも提供する。発現ベクターは、種々の異なる生物体、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌および例えば酵母のような真核微生物における核酸の発現に関して既知である。このような発現ベクターはすべて当業者に既知であり、核酸配列を発現するための発現ベクターの使用は、当業者に既知の標準技法である。好ましくは発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。
【0029】
好ましくは本発明の発現ベクターは、プロモーターおよび本発明の核酸分子を含む。ベクターは、本発明の融合タンパク質を産生させる。ベクターは、核酸分子の発現を得るのに必要とされる任意のその他の調節配列を含むことがさらに好ましい。
【0030】
本発明の核酸分子は、適切な宿主細胞において細胞内に発現され得る。プロモーター配列は本発明の核酸分子に直接連結され得るが、この場合、コードタンパク質のN末端のアミノ酸は、開始ATGコドンによりコードされるメチオニンである。
【0031】
あるいは、本発明の核酸分子によりコードされる融合タンパク質は、本発明の核酸分子にリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を連結することにより、適切な宿主細胞から分泌され得る。コードタンパク質は、リーダー配列断片ならびに本発明の核酸分子によりコードされる融合タンパク質を含む。リーダー配列は、細胞からの融合タンパク質の分泌を引き起こす。好ましくは、リーダー配列と本発明の核酸分子によりコードされる融合タンパク質との間にプロセシング部位が存在して、リーダー配列を酵素的または化学的に切断させる。このようなリーダー配列の一例は、アデノウイルストリパライト(triparite)リーダーである。
【0032】
好ましくは、本発明のベクターは、本発明の核酸分子の望ましい発現を得るために必要なプロモーターおよびその他の調節配列を含む。
【0033】
本発明はまた、本発明のベクターで形質転換される宿主細胞を提供する。
【0034】
「形質転換」という用語は、挿入のために用いられる方法、例えば直接取り込み、形質導入、f−交配または電気穿孔とは関係なく、宿主細胞中への外生核酸分子の挿入を指す。外生核酸は非組込みベクター(エピソーム)として得られるか、あるいは宿主ゲノム中に組み込まれ得る。
【0035】
好ましくは宿主細胞は真核生物細胞、さらに好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HPMC、HeLa細胞、仔ハムスター腎(BKH)細胞、肝臓起源の細胞、例えばHepG2細胞、ならびに骨髄腫またはハイブリドーマ細胞系である。あるいは宿主細胞は、原核生物細胞、例えば大腸菌である。
【0036】
本発明はさらに、本発明の融合タンパク質の産生方法であって、本発明のベクターで宿主細胞をトランスフェクトすること、およびトランスフェクトした宿主細胞を適切な条件下で培養することであって、それにより核酸分子の発現および本発明の融合タンパク質の産生を引き起こす、培養することを包含する方法を提供する。次に、融合タンパク質は標準技法を用いて、融合タンパク質が分泌されるか否かに応じて、トランスフェクトした細胞から、または細胞成長培地から収集され得る。
【0037】
本発明は、本発明の融合タンパク質のアンタゴニストまたはアゴニストを同定するスクリーニング方法も提供する。スクリーニング方法は好ましくは、候補分子の存在が本発明の融合タンパク質の機能に影響を及ぼすか否かを確定するために候補分子を試験することを包含する。例えば候補分子は、ケモカイン、例えばMIP−1α、MIP−β、RANTESまたはIP−10の産生を増大または低減し得るか、あるいは融合タンパク質により影響されるケモカインの範囲を変更し得る。
【0038】
候補分子は、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーまたは天然生成物ミックスから単離され得る。候補分子は、天然または修飾基質、リガンド、酵素、受容体、抗体分子、あるいは構造的または機能的模倣物であり得る。適切なスクリーニング技法の概説に関しては、Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1(2):Chapter 5, (1991)を参照されたい。
【0039】
本発明は、本発明の融合タンパク質の阻害形態であって、gp130と結合し、本発明の融合タンパク質およびH−IL−6の両方の作用を阻害する阻害形態にも関する。好ましくは本発明の融合タンパク質の阻害形態は、本発明の融合タンパク質により引き起こされるMIP−1α、MIP−β、RANTESまたはIP−10の発現を阻害し、H−IL−6により引き起こされるMCP−1の発現を阻害する。このような阻害形態は、機能性相同体の生成に関して上記されたように本発明の融合タンパク質を突然変異させることにより生成され得る。さらに阻害形態の機能は、機能性相同体の試験に関して上記されたような同一の方法を用いて確定され得る。融合タンパク質の阻害形態は、好ましくは本発明の融合タンパク質およびH−IL−6の作用を妨げるかまたは実質的に低減する(すなわち少なくとも50%、好ましくは少なくとも75%)。好ましくは本発明の融合タンパク質の阻害形態は、本発明の融合タンパク質の作用を阻害するだけであって、この場合、融合タンパク質の阻害形態はH−IL−6ではない。
【0040】
本発明は、細胞系中のシグナル伝達経路の調整方法における本発明の融合タンパク質または融合タンパク質の阻害形態の使用も提供する。細胞系におけるシグナル伝達の調整により、シグナル伝達経路に関する情報が得られ、これが、標的化され得る経路の他の部分の同定をもたらして、所望の結果を達成し得る。細胞系は、in vitro細胞系、例えば細胞培養、またはin vivo細胞系、例えば生物体であり得る。
【0041】
本発明はまた、薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは賦形剤とともに、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸または本発明の発現ベクターを含む薬学的組成物を提供する。
【0042】
適切な薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは賦形剤は以下で論考される。
【0043】
本発明はまた、治療に用いるための本発明の融合タンパク質、本発明の核酸あるいは本発明の発現ベクターを提供する。
【0044】
本発明はまた、感染性疾患、炎症性障害もしくは免疫学的障害の治療または予防のための薬剤の製造における、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸あるいは本発明の発現ベクターの使用を提供する。
【0045】
本発明はまた、免疫応答を増大または回復させるのが望ましい場合、感染性疾患、炎症性障害もしくは免疫学的障害の治療または予防における、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸あるいは本発明の発現ベクターの使用を提供する。
【0046】
本発明はまた、感染性疾患、炎症性障害もしくは免疫学的障害の治療または予防方法であって、免疫応答を増大または回復させるのが望ましい場合、有効用量の本発明の融合タンパク質、本発明の核酸あるいは本発明の発現ベクターをこのような治療を必要とする個体に投与することを包含する方法を提供する。
【0047】
感染性疾患は、感染作用因子がCCR5受容体を用いて結合する任意の疾患であり得る。感染性疾患はHIVのM栄養株により引き起こされるAIDSであることが特に好ましい。
【0048】
融合タンパク質は、ケモカインMIP−1α、MIP−β、RANTESまたはIP−10、ならびにその他のケモカインのレベルを増大するので、融合タンパク質が炎症性応答を増大または回復させ得るのと同様に、免疫応答を増大または回復させるのが望ましい場合、融合タンパク質は炎症性障害の治療または予防に用途を有すると考えられ得る。適切な炎症性障害としては、細菌性腹膜炎およびクローン病が挙げられる。本発明の融合タンパク質は特に、細菌性腹膜炎の治療に有用である(実施例7参照)。本発明の融合タンパク質は、免疫学的障害、例えば自己免疫疾患の治療または予防にも用いられ得る。
【0049】
本発明は、高レベルのIL−6に関連した免疫学的障害、例えば関節リウマチの治療または予防における本発明による融合タンパク質の阻害形態の使用も提供する。
【0050】
本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物のいずれか一つ(すなわち本発明の融合タンパク質、本発明の核酸分子または本発明の発現ベクター)を、任意の薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは賦形剤とともに含む。本発明の薬学的組成物中に用いられ得る薬学的に許容可能な担体、アジュバントおよび賦形剤としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝剤物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【0051】
本発明の薬学的組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、または埋没レザーバによって投与され得る。好ましくは薬学的組成物は、経口的にまたは注射により投与される。本発明の薬学的組成物は、任意の慣用的非毒性の薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは賦形剤を含有し得る。非経口的という用語は、本明細書中で用いられる場合、皮下、皮内、静脈内、筋内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内および頭蓋内注射または注入技法を包含する。
【0052】
薬学的組成物は、滅菌注射用製剤の形態、例えば滅菌注射用水性または油性懸濁液であり得る。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤(例えばTween80など)および沈殿防止剤を用いて、当業界で既知の技法にしたがって配合され得る。滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液、例えば1,3−ブタンジオール中の溶液でもあり得る。用いられ得る許容可能な賦形剤および溶媒としては、マンニトール、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌性不揮発性油は、溶媒または懸濁媒質として慣用的に用いられる。この目的のために、任意の無刺激性不揮発性油、例えば合成モノまたはジグリセリドが用いられ得る。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、天然の薬学的に許容可能な油、例えばオリーブ油またはヒマシ油と同様に、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンで、注射液の製剤中で有用である。これらの油溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えばPh.Helvまたは同様のアルコールも含有し得る。
【0053】
本発明の薬学的組成物は、任意の経口的に許容可能な投薬形態で、例えばカプセル、錠剤および水性懸濁液および溶液(これらに限定されない)で、経口的に投与され得る。経口的使用のための錠剤の場合、一般的に用いられる担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムも典型的に添加される。カプセル形態での経口投与のためには、有用な希釈剤としてはラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液が経口的に投与される場合、活性成分は、乳化剤および沈殿防止剤と組み合わせられる。所望により、ある種の甘味剤および/または風味剤および/または着色剤が添加され得る。
【0054】
本発明の薬学的組成物は、経鼻エーロゾルまたは吸入により投与され得る。このような組成物は、薬学的配合物の業界で既知の技法により調製され、ベンジルアルコールまたはその他の適切な防腐剤、生物学的利用能を強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および/または当業界で既知のその他の可溶化剤または分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【0055】
ここで、以下の図面を参照しながら、下記の実施例において本発明を例証する。
【実施例】
【0056】
材料および方法
試薬
バキュロウイルス発現sIL−6Rアイソフォームを、上記のようにして得た(Horicuhi et al., Immunology 95, 360-369, 1994)。モノクローナル抗IL−6および抗sIL−6R(それぞれmAb−226およびmAb−227)は、R & D systemsから購入した。抗DS−sIL−6R(mAb−2F3)を、DS−sIL−6Rの特有のCOOH末端配列に対して産生した(Horiuchi et al.,(上記))。
【0057】
ヒト腹膜中皮細胞の単離および培養
待機腹腔手術を受けている同意患者からの大網組織の連続トリプシン(0.1%w/vトリプシン:0.02%w/vEDTA)消化により、ヒト腹膜中皮細胞(HPMC)を単離した(Topley et al., American. J. Pathology, 142, 1876-1886, 1993)。湿潤5%CO大気中で37℃で、10%(v/v)ウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、5μg/mlのトランスフェリン、5μg/mlのインスリンおよび0.4μg/mlのヒドロコルチゾン(Life TechnologiesまたはSigma)を含有するアール緩衝化199培地中で、細胞を培養した。実験前に、HPMC単層を成長させ、血清の非存在下で停止させた。これらの条件下で、HPMCは96時間もの間、生育可能および静止状態のままであった(Topley et al., 1993(上記))。血清の非存在下で、第二継代より古くない細胞で、刺激を実施した。
【0058】
炎症媒介物質濃度の確定
サンドイッチELISA技法を用いて、炎症媒介物質濃度を定量化した。対応抗体対OptEIAキット(Pharmingen, Becton-Dickinson)を用いて、ヒトMCP−1レベルを確定した。適切な対応抗体対(mAb678/NAF278)(R & D Systems)を用いてヒトRANTESを定量化し、一方、アマーシャムバイオトラック(Amersham BIOTRAK)ELISAキットを用いてヒトMIP−1α、MIP−1βおよびエオタキシンを解析した。
【0059】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
既知の転写因子結合モチーフ内に完全プロモーター配列または突然変異を保有するルシフェラーゼ連結RANTESプロモーター構築物を、長崎大学のH. Moriuchi教授から入手した(Moriuchi et al., J. Immunol. 159, 5441-5449, 1997)。簡潔には、10%FCSを含有するM199培地中で、HPMC(1x10細胞/6ウエルマイクロタイタープレート)を、それらが60〜70%の集密に達するまで培養した。単層を洗浄し、個々のルシフェラーゼ連結プロモーター構築物(0.5〜1.0μg)で一晩、細胞をトランスフェクトした。標準リン酸カルシウム沈殿技法を用いて、一過性トランスフェクションを実施した(Graham and van de Eb, Virology, 52, 456-458, 1973)。一旦HPMCを回収したら、実施例4に示したように、細胞を24時間刺激した。細胞溶解物を調製し、市販のルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を用いて発光測定によりルシフェラーゼ活性を確定した。
【0060】
核抽出物の調製
DNA結合タンパク質の抽出のために、迅速技法を用いてHPMCから核抽出物を調製した。簡潔には、氷冷PBS(pH7.4)中に細胞を収集し、遠心分離によりペレット化した。冷緩衝液A(10mMのHEPES−KOH(pH7.9)、1.5mMのMgCl、0.2mMのEDTA、0.3mMのDTT、0.2mMのPMSF)中に細胞を再懸濁し、氷上でさらに20分間インキュベートした。遠心分離により細胞砕片をペレット化し、必要になるまで上清を−80℃で保存した。
【0061】
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)およびスーパーシフト
前に記載されたように、EMSAを実施した(Zhang et al., J. Biol. Chem. 272, 30607-30609, 1997)。NF−kB(5’−GATCCATGGGGAATTCCCC−3’&5’−CATGGGGAATTCCCCATGGA−3’)、STAT−3(SIE−m67 5’CGACATTTCCCGTAAATCG−3’&5’−CGACGATTTACGGGAAATG−3’)およびC/EBP(5’GACGTCACATTGCACAATCTTAA−3’&5’−TATTAAGATTGTGCAATGTGACG−3’)結合に関するコンセンサスモチーフを含有するオリゴヌクレオチドを、EMSAで用いるためにアニーリングした。これらの二本鎖断片を、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片を用いて[α32P]−dTTPで放射能標識した。核抽出物を標識コンセンサス配列とともにインキュベートし、6%ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によりDNAタンパク質相互作用を解明した。
【0062】
実施例1
CCR5−リガンドの示差的誘導
ヒト腹膜中皮細胞を48時間成長を停止させた後、種々の濃度(0−50ng/ml)のDS−sIL−6R(●)またはPC−sIL−6R(○)を10ng/mlのヒトIL−6と組み合わせて用いて刺激した。一晩インキュベートした後、無細胞上清を収集し、特異的ELISAを用いてケモカイン産生を測定した。値は、4つの個々の実験からの平均±SEMを表す。データは、DS−sIL−6Rが、IL−6の存在下で、CCL3(MIP−1α)、CCL4(MIP−1β)、CCL5(RANTES)およびCXCL10(IP−10)の発現を誘導し、一方、PC−sIL−6Rは影響を及ぼさないことを示す(図6参照)。CCL2(MCP−1)およびCCL11(エオタキシン)の誘導を、それぞれ陽性および陰性対照として示す。
【0063】
実施例2
DS−sIL−6R媒介性ケモカイン放出の阻害
30ng/mlのDS−sIL−6Rを10ng/mlのIL−6と組み合わせて用いて、成長停止ヒト腹膜中皮細胞を刺激した(24時間)。ELISAを用いて、CCL2およびCCL5の放出を定量化した。図7Aは、ヒト腹膜中皮細胞を処理前に48時間成長停止したことを示す。10ng/mlのIL−6+20ng/mlのDS−sIL−6Rの存在下(中黒記号)または非存在下(中白記号)で、種々のモノクローナル抗体(0−50μg/ml)を用いて細胞を処理した。MAb206(抗IL−6)で処理した細胞を、中黒正方形として示す。MAb227(抗可溶性IL−6)で処理した細胞を、中黒円形として示す。(DS−sIL−6Rのカルボキシ末端に対する)MAb2F3で処理した細胞を、中黒菱形として示す。馴化培地を24時間後に収集し、ELISAを用いてCCL2/MCP−1およびCCL5/RANTESレベルを定量化した。値は、4つの個々の実験からの平均±SEMを表す。
【0064】
図7Bは、PC−sIL−6RによるRANTES産生の特異的遮断を示す。漸増濃度のPC−sIL−6R(0〜50ng/ml)の存在下で、DS−sIL−6R媒介性RANTES放出をモニタリングした(●)。PC−sIL−6Rおよび10ng/mlのIL−6に応答するRANTESの分泌を、対照として示す(○)。値は、4つの個々の実験からの平均±SEMを表す。他の実験では、可溶性gp130、ハイパー−IL−6の封入により、RANTES放出を遮断した。
【0065】
実施例3
ケモカイン誘導に関する時間経過
10ng/mlのIL−6の存在下で、50ng/mlのDS−sIL−6R(●)またはPC−sIL−6R(○)で成長停止HPMCを刺激した。比較のために、非刺激細胞を示す(中白矩形)。設定時間間隔で無細胞上清を収集し、CCL2(MCP−1)およびCCL5(RANTES)の放出を測定した。値は、4つの個々の実験からの平均±SEMを表す。データは、CCL2産生がsIL−6Rによる3〜4時間の刺激後に検出可能であるが、CCL5のDS−sIL−6R媒介性放出は、初期刺激後15時間まで観察されないことを示す(図8参照)。これらの所見は、CCL5の発現の調節がCCL2の場合と異なることを示唆する。
【0066】
実施例4
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
1.4kbのRANTESプロモーター断片(RANTES−1.4)を含有するルシフェラーゼレポーター構築物または既知の転写因子コンセンサス配列内の種々の突然変異(△NF−kB、△STATおよび△NF−IL−6)(Moriuchi et al., 1997 (上記))を、ヒト腹膜中皮細胞中に一過性にトランスフェクトした。回収後、100pg/mlのIL−1β、10ng/mlのIL−6単独または50ng/mlのPC−sIL−6R(PC)またはDS−sIL−6R(DS)との組み合わせを用いて、細胞を刺激した。24時間刺激した後、ルシフェラーゼ活性をモニタリングした。対照としてイオノマイシンを用いて△NF−IL−6構築物の活性を確証したが、イオノマイシンはルシフェラーゼ活性のおよそ40倍の増大を誘導した(データは示されていない)。値は、個々の一次中皮細胞単離物を用いて実施した実験から得られた誘導の倍数を表し、平均±SEM(n=4)を示す(図9参照)。これらのデータは、NF−IL−6の崩壊がルシフェラーゼ活性のDS−sIL−6R媒介性誘導を大幅に遮断したが、一方、PC−sIL−6RおよびIL−6単独は対照レベルを上回る構築物のいずれかによる増大を示さなかったことを示す。
【0067】
実施例5
EMSA解析
10pg/mlのIL−βまたは10ng/mlのIL−6を50ng/mlのPC−sIL−6R(PC)またはDS−sIL−6R(DS)と組み合わせて用いて、30分間刺激したHPMCから核抽出物を単離した。NF−κB、STAT−3(SIE m67)およびC/EBP(NF−IL−6)に関するコンセンサス配列を放射能標識し、核抽出物とともにインキュベートした。電気泳動による6%ポリアクリルアミドゲル上での分離によりタンパク質−DNA相互作用を解析し、オートラジオグラフィーによりバンドを可視化した(図10参照)。NF−κBおよびSTAT−3の活性化を対照として用いた。これらの初期実験は、DS−sIL−6RがC/EBPコンセンサス配列との結合強化を誘導することを重視する。このコンセンサスオリゴヌクレオチドは個々のC/EBPファミリー成員が区別されるようできないため、特異的抗体を用いる競合EMSAおよびスーパーシフトアプローチを一般的に用いて、NF−IL−6α(C/EBPβ)またはNF−IL−6β(C/EBPδ)の関与を確証する。
【0068】
実施例6
ハイパーDS−sIL−6Rの発現および機能的特性化
無血清条件下でpcDNA−3(モック(Mock))またはpcDNA−3/ハイパーDS−sIL−6R(ハイパーDS−sIL−6R)を用いて、COS−7細胞を一過性にトランスフェクトした。37℃で24時間インキュベートした後、馴化培地を収集し、特異的ELISAを用いてヒトIL−6およびsIL−6Rの濃度を定量化した(図11A参照)。この馴化培地をさらに、血清不足ヒト滑膜繊維芽細胞に添加した。37℃で24時間インキュベートした後、馴化培地を収集し、特異的ELISAを用いてヒトCCL2/MCP−1およびCCL5/RANTESの濃度を定量化した(図9B参照)。値は、単一実験からの平均±SDを表す。
【0069】
実施例7
炎症能力
表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)から調製された無細胞上清(SESと呼ばれる)を用いて、野生型およびIL−6欠損(IL−6 -/-)マウスの両方における腹膜炎症モデルの特性化を、本発明者等は以前報告した(Hurst et al., Immunity, 14, 705-714, 2001)。このモデルを用いて、IL−6 -/-マウスにおけるDS−およびPC−sIL−6Rの炎症能力を調べた。マウスに滅菌PBS(対照)、100ng/マウスのDS−sIL−6Rおよび25ng/マウスのヒトIL−6(DS−sIL−6R)、100ng/マウスのPC−sIL−6Rおよび25ng/マウスのヒトIL−6(PC−sIL−6R)、SES単独(SES)あるいはDS−sIL−6RおよびIL−6またはPC−sIL−6RおよびIL−6と組み合わせて(それぞれSES+DS−sIL−6RまたはSES+PC−sIL−6R)、腹腔内投与した。3時間刺激した後、腹腔を洗浄し、炎症パラメーターを確定した。PC−sIL−6Rに関して前に報告されたように(Hurst et al., Immunity, 14, 705-714, 2001)、両アイソフォームは、SESへの曝露後、好中球の浸潤を阻害した(図12A参照)。CCL5/RANTESのレベルを洗浄液中でも測定し、それはDS−sIL−6R+IL−6の作用により優先的に誘導されることが判明した本発明者等のin vitroデータと一致した(図12B参照)。値は、平均±SEMを表す(n=3〜4匹の動物/条件=p<0.05;**=p<0.001)。
【0070】
実施例8
野生型(IL−6+/+)およびIL−6欠損(IL−6−/−)マウスにおけるCCL5およびCXCL10の発現
DS−sIL−6Rによる受容体CCR5(CCL3、CCL4、CCL5)およびCXCR3(CXCL10)に特異的なケモカインの選択的誘導は、このアイソフォームが炎症の部位にTリンパ球および単球を誘引するのに重要であり得ることを示唆する。これを試験するために、腹膜炎症の最近特性化されたモデルを用いて、IL−6+/+およびIL−6−/−マウスにおけるCCL5およびCXCL10(CRG−2、IP−10のネズミ相同体)の一過性発現を確定した。このモデルは、腹膜透析患者が通常遭遇する細菌性腹膜炎エピソードに非常によく似ており、表皮ブドウ球菌から得られる無細菌細胞上清(SESと呼ばれる)の腹腔内投与に基づいている(Hurst et al., 2001)。図13Aに示したように、SES曝露IL−6−/−マウスにおいて観察されたCCL5およびCXCL10発現に関するプロフィールは、IL−6+/+マウスにおいて遭遇するものとはかなり変更されていた。可溶性gp130(sgp130)によるIL−6+/+マウスにおけるsIL−6R活性の遮断は、SES処理IL−6+/+マウスで観察されるCCL5およびCXCL10放出のプロフィールを、IL−6−/−マウスにおいて観察されるものに変換するため、発現のこれらの修飾パターンは、sIL−6Rシグナル伝達の結果であった(図13B)。
【0071】
実施例9
IL−6−/−マウスにおけるDS−sIL−6R活性の機能的特性化
IL−6−/−マウスにおけるCCL5およびCXCL10放出の修飾パターンが白血球漸増に直接影響を及ぼすか否かを調べるために、IL−6+/+およびIL−6−/−マウスをSESで曝露し、ネズミCCR5およびCXCR3に対する抗体を用いて腹腔から洗浄した細胞にFACS染色を施した(図14)。SESによるIL−6+/+マウスの処理は、CCR5およびCXCR3を保有する細胞型における増大を誘導したが、しかしながらこの浸潤はSES処理IL−6−/−マウスにおいては減損された(図14)。CCR5/CXCR3細胞の浸潤は、DS−sIL−6RおよびIL−6の存在下でSESで曝露しておいたIL−6−/−マウスでも評価した(図15A)。ケモカインデータにより予測されるように、DS−sIL−6RによるIL−6シグナル伝達の再構築は、CCR5/CXCR3陽性細胞の流入をIL−6+/+マウスにおいて遭遇するレベルに回復させた。これらの白血球の漸増増大はDS−sIL−6Rに特異的であり、sgp130により遮断された(図15A)。抗CD3および抗CCR5で二重標識された細胞集団に関して、同様のデータを得た(図15B)。これらの応答はDS−sIL−6Rに特異的であり、PC−sIL−6Rによって誘導されなかった(図15AおよびB)。すべての場合に、IL−6−/−マウスへのSESの投与は、腹腔に補充された白血球の総数における有意の増大を誘導した(図15B)。その結果として、IL−6はDS−sIL−6R結合によりCXCR3およびCCR5を発現する白血球の誘引に影響を及ぼすと思われ、DS−sIL−6Rの生物学的特性がPC−sIL−6Rの場合と明らかに異なっていることに重点を置く。
【0072】
インターロイキン−6(IL−6)は、炎症誘発性作用および抗炎症作用の両方を有すると記載されている。その防御特性に関しては、IL−6は、炎症誘発性サイトカイン発現を遮断するその能力により、そしてIL−1受容体アンタゴニストおよび可溶性p55TNFα−受容体の放出を促進することにより、炎症性応答の程度を調整すると考えられる(Schindler et al., Blood 75, 40-44, 1990; Tilg et al., Blood, 83, 113-118, 1994およびXing et al., J. Clin. Invest. 101, 311-320, 1998)。インターロイキン−6は、感染または炎症の部位での好中球の蓄積がその作用により抑制されるため、白血球漸増にも影響を及ぼし得る(Ulich et al., Am. Pathol. 138, 1097-1102, 1991; Barton et al., Infect. Immunol. 61, 1496-1500, 1993およびXing et al., J. Clin. Invest. 101, 311-320, 1998)。実際、内毒素エーロゾルへのIL6欠損(IL6−/−)マウスの曝露は、野生型(IL−6+/+)動物より極めて多数の気管支肺胞洗浄液中の好中球を生じる(Xing et al., J. Clin. Invest. 101, 311-320, 1998)。
【0073】
IL−6媒介性応答の主要な調節は、コグネイトIL−6受容体(IL−6R)の発現を欠く細胞型におけるIL−6応答性を可能にするリガンド−受容体複合体を形成する可溶性IL6受容体(sIL−6R)の存在である(Jones et al., FASEB. J. 15, 43-58, 2001)。この[sIL6R/IL6]複合体は、サイトカインのIL−6ファミリーに関して普遍的に発現されるシグナル伝達要素gp130との相互作用により普通はIL−6に応答しない細胞を活性化する能力を有する(Jones et al., FASEB. J. 15, 43-58, 2001)。sIL−6Rがある種のケモカイン(IL−8、MCP−1、MCP−3)および接着分子(ICAM−1およびVCAM−1)の発現を誘導し得るというのは、このメカニズムによる(Romano et al., Immunity 6, 315-325, 1997; Modur et al., J. Clin. Invest. 100, 2752-2756, 1997およびKlouche et al., J. Immunol. 163, 4583-4589, 2000)。近年、sIL−6R放出は炎症の消散における重要な媒介物として作用し、感染の急性かつ優勢な好中球段階とより持続性の単核球流入との間の移行を支持することを本発明者等は提唱した。その結果として、sIL−6R媒介性シグナル伝達は、白血球漸増に及ぼすIL−6の上記の作用に寄与し得る。
【0074】
本出願は、PC−sIL−6RおよびDS−sIL−6Rがある種のCC−ケモカインの発現を調節することを示す。両形態はMCP−1発現を活性化することが判明したが、CCR5リガンドRANTES、MIP−1αおよびMIP−1βの放出を引き出し得たのはDS−sIL−6Rだけであった。これは、DS−sIL−6Rが単核球(Tリンパ球および単球)漸増および活性化において顕著な役割を務め得ることを意味する(Moser & Loetscher, 2001)。実際、CCR5は、通常ある種の炎症性疾患に関連するTh1細胞性応答に関するマーカーである(Qin et al., J. Clin. Invest. 101: 746-754, 1998; Sallusto et al., J. Exp. Med. 187: 875-883, 1998)。DS−sIL−6RによるRANTES、MIP−1αおよびMIP−1βの特異的アップレギュレーションは、このsIL−6Rアイソフォームがこれらの部位へのこのT細胞サブセットのホーミングの制御に関与し得ることを示唆する。しかしながら、IL−6がT細胞に作用して、Th1細胞へのそれらの分化を阻害することが近年報告された(Diehl et al., Immunity 13, 805-815, 2000)。この点で、sIL−6Rは可溶性gp130の阻害能力を強化する拮抗性分子として作用することが示唆されている(Mueller-Newen et al., Eur. J. Biochem. 236, 837-842, 1998)ため、T細胞からのDS−sIL−6Rの放出(Horiuchi et al., Immunology 95, 360-369, 1994)は、Th1分極の制御における別の役割も務め得る。したがって、任意の遊離IL−6を片付けることにより、DS−sIL−6Rは、IL−6がT細胞サブセットに直接作用し、それらの表現型に影響を及ぼすのを防止し得る。
【0075】
今までのところ、NF−IL−6のIL−6媒介性活性化により制御される炎症性事象についてはほとんどわかっていない。概してIL−6は、転写因子のSTAT−3およびNF−IL−6ファミリーの活性化により2組の遺伝子を活性化すると考えられる。したがって急性期応答の場合、NF−IL−6はクラス1急性期タンパク質(例えば、C反応性タンパク質および血清アミロイド)の発現を調節することが報告されており、一方、クラス2急性期遺伝子、例えばフィブリノーゲンはSTAT−3により制御される(Zhang et al., J. Biol. Chem. 272, 30607-30609. 1997)。ここに提示された証拠は明らかに、sIL−6Rの両アイソフォームはSTAT−3を活性化し得るが、DS−sIL−6RはNF−IL−6トランス活性化を調節する特有の能力を保有することを示す。RANTESの発現を、そしておそらくはMIP−1αおよびMIP−1βの発現を調整すると考えられるのは、NFIL−6のこの示差的活性化である。この点で、MCP−1、RANTES、MIP−1αおよびMIP−1β発現の時間依存性解析は、MCP−1が、RANTES、MIP−1αおよびMIP−1βの場合よりかなり早期に誘導されることを明示した。CC−ケモカイン発現のこの見かけの示差的制御は、sIL−6RアイソフォームによるSTAT−3およびNF−IL−6トランス活性化の個々の調節に起因し得る。
【0076】
臨床試料の解析は、sIL−6Rレベルが、示差的mRNAスプライシングおよびタンパク質分解性(分断性)切断の両方により疾患進行中に独立して制御されることをすでに示している(Horiuchi et al., Immunology, 95, 360-369, 1998およびJones et al., FASEB. J. 15, 43-58, 2001)。したがってDS−sIL−6RおよびPC−sIL−6Rは、独立してこの可溶性サイトカイン受容体の全体的特性に寄与し得る。顕性臨床的腹膜炎を有する連続的携行式腹膜透析(CAPD)中の患者から得られた腹膜流出液中のsIL−6Rに関する発現プロフィールを、近年本発明者等は解析した。これらの試料の解析により、総sIL−6Rレベルは感染後最初の24〜48時間以内に上昇したが、DS−sIL−6R濃度は炎症の3日目に大幅に増大しただけであったことが示された。これは、疾患の後期段階中のDS−sIL−6Rに関する役割を暗示する。臨床的腹膜炎試料の解析により、RANTES、MIP−1αおよびMIP−1βの発現が、1日目にピークに達し、3日目にはベースラインに戻るMCP−1の場合(データは示されていない)より、感染経過中のより後期(4日目)に起こることが分かった。実際、DS−sIL−6RによるRANTES、MIP−1αおよびMIP−1βの特異的誘導は、これらのケモカインが炎症過程の後期に発現されるということを意味するだけでなく、それらの作用がMCP−1のようなその他のCCケモカインの場合とは異なることを意味する。この点で、すべてのCCR5−リガンドが樹状細胞によるIL−12産生を活性化し得るということが示されているが、一方、MCP−1〜4はγ−IFN活性化単核球によるIL−12産生を抑制することが報告されている(Aliberti et al., Nature Immunol. 1, 83-87, 2000; Braun et al., J. Immunol, 164, 3009-3017, 2000)。したがって、sIL−6RアイソフォームによるCCケモカインの示差的発現は、異なる単核球亜集団の漸増に寄与するだけでなく、炎症の消散に関与するその他の媒介物質の発現プロフィールにも影響し得る。
【0077】
3つのケモカインすべて、ならびにHIVのM栄養株はCCR5を結合するので、高レベルのMIP−1α、MIP−1βおよびRANTESがCCR5結合に関してウイルスと競合し、HIV進入を有効に抑制する。したがってケモカインを支持してこの競合の平衡を矯正し得る任意の因子が、HIV療法として有用であり得る。したがって本発明の融合タンパク質の使用は、感染性作用因子がCCR5に、特にHIVのM栄養株に結合する任意の疾患の治療に有用である。
【0078】
本明細書中に参照された科学文献、特許および特許出願はすべて、それらの記載内容が参照により本明細書中に援用される。
【0079】
本発明は単に例示として記載されたものであって、詳細の修正は添付の特許請求の範囲で定義されるような本発明の範囲内でなされ得る、と理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【0080】
【図1】H−IL−6の概略図を示す。
【図2】膜ボード形態、DS−sIL−6RおよびPC−sIL−6Rを含めた完全IL−6Rタンパク質配列を示す。推定膜貫通ドメインに下線を付す。
【図3】配列IL−6を示す。
【図4】配列DS−sIL−6Rを示す。
【図5】フレキシブルリンカーによりDS−sIL−6R(ハイパーDS−sIL−6R)に連結されたIL−6の配列を示す(この場合、リンカーおよびCOOH末端c−mycタグ配列に下線を付す)。
【図6】ヒトIL−6と組み合わせたDS−sIL−6R(●)またはPC−sIL−6R(○)によるCCR5リガンドの示差的誘導を示す。
【図7】(A)種々のモノクローナル抗体および(B)PC−sIL−6Rを用いたDS−sIL−6R媒介性ケモカイン放出の阻害を示す。
【図8】DS−sIL−6R(●)およびPC−sIL−6R(○)によるケモカイン誘導に関する時間経過を示す。
【図9】ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す。
【図10】EMSA解析の結果を示す。
【図11】ハイパーDS−sIL−6Rの発現および機能的特性化を示す。(A)は産生された媒介物質のレベル(グラフの上左手角参照)を示し、(B)は産生されたMCP−1およびRANTESのレベルを示す。
【図12】PC−sIL−6R、DS−sIL−6R、SES、SES+PC−sIL−6RおよびSES+DS−sIL−6Rの炎症性能力を示す。
【図13】IL−6+/+およびIL−6−/−マウスにおけるCCL5およびCXCL10の発現を示すが、この場合、(A)野生型C57BL/6J(IL−6+/+)およびIL−6−/−マウスにはSESまたはPBSを腹腔内投与し、指示間隔で腹腔を洗浄し;(B)IL−6+/+マウスにはPBS、150ng/マウスのsgp130単独、SESまたは150ng/マウスのsgp130と組み合わせたSESを投与した。指示時間間隔で、腹腔を洗浄した。両方の場合において、ELISAを用いて、洗浄液中の、CCL5およびCXCL10レベルを定量化した。値は平均±SEM(n=マウス6匹/条件)として表す。
【図14】IL−6+/+およびIL−6−/−マウスにおけるCCR5およびCXCR3を発現する細胞の漸増を示すが、この場合、IL−6+/+およびIL−6−/−マウスにはPBS(対照)またはSESを投与した。12時間後、腹腔を洗浄し、回収細胞をCCR5およびCXCR3に関して抗体で二重標識し、FACSにより解析した。対照抗体による自己蛍光により四分円を設定し、各条件に関する代表的散乱プロットと一緒に、上右セグメント中にある細胞のパーセンテージを提示する(マウス4〜6匹/実験条件からの平均±SEM)。値は、各条件に関してマウス4〜6匹からの平均(%)±SEMを表す。
【図15A】IL−6+/+およびIL−6−/−マウスにおけるCCR5およびCXCR3を発現する細胞の漸増を示す。IL−6−/−マウスを、SESの存在下または非存在下で、DS−sIL−6R(25ng/マウス)およびIL−6 (20ng/マウス)(DS/IL−6)の組み合わせで処理した。可溶性gp130(150ng/マウス)も指示通りに含まれた。対照抗体による自己蛍光により四分円を設定し、各条件に関する代表的散乱プロットと一緒に、上右セグメント中にある細胞のパーセンテージを提示する(マウス4〜6匹/実験条件からの平均±SEM)。
【図15B】回収細胞のパーセンテージをCCR5およびCD3に関して抗体で二重標識した(上グラフ)。値は、各条件に関してマウス4〜6匹からの平均(%)±SEMを表す。各実験条件に関する総白血球流入(下グラフ)。値は、各条件に関してマウス4〜6匹からの平均(%)±SEMを表す。

Claims (33)

  1. 機能性IL−6分子および機能性DS−sIL−6R分子を含む融合タンパク質であって、MIP−1α、MIP−1β、RANTESおよびIP−10のうちの1つまたはそれ以上の発現を増大するタンパク質。
  2. 前記機能性IL−6分子および前記機能性DS−sIL−6R分子はリンカーにより一緒に連結される請求項1記載の融合タンパク質。
  3. 前記リンカーは配列RGGGGSGGGGSVEを含む請求項2記載の融合タンパク質。
  4. 前記機能性IL−6分子は図3の残基29〜212またはその機能的に等価な相同体を含む請求項1ないし3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  5. 前記機能性IL−6分子は図3の配列またはその機能的に等価なものを含む請求項1ないし4のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  6. 前記機能性DS−sIL−6R分子は図4の残基113〜364またはその機能的に等価な相同体を含む請求項1ないし5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記機能性DS−sIL−6R分子は図4の配列またはその機能的に等価なものを含む請求項1ないし6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  8. 1つまたはそれ以上の機能性IL−6分子および1つまたはそれ以上の機能性DS−sIL−6R分子を含む請求項1ないし7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  9. 1つの機能性IL−6分子および1つの機能性DS−sIL−6R分子を含む請求項1ないし7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  10. MIP−1α、MIP−1βおよびRANTESの発現を増大する請求項1ないし9のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  11. MIP−1α、MIP−1β、RANTESおよびIP−10の発現を増大する請求項1ないし9のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  12. MIP−α、MIP−βまたはRANTESの発現を少なくとも5倍増大する請求項1ないし11のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  13. 請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
  14. 請求項13記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  15. 前記核酸分子の発現を得るためにプロモーターおよびその他の調節配列を含む請求項14記載のベクター。
  16. 請求項14または請求項15記載のベクターで形質転換される宿主細胞。
  17. 請求項1ないし11のいずれか1項に記載の融合タンパク質の産生方法であって、適切な宿主細胞中で請求項13記載の核酸分子を発現すること、および前記タンパク質を単離
    することを包含する融合タンパク質の生産方法。
  18. 請求項14または請求項15記載のベクターで宿主細胞を形質転換すること、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質の産生のための適切な条件下で宿主細胞を培養すること、および前記融合タンパク質を単離することを包含する請求項17記載の方法。
  19. 請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストを特定するスクリーニング方法であって、候補分子が前記融合タンパク質の機能に影響を及ぼすか否かを確定するために前記候補分子を試験することを包含する方法。
  20. gp130と結合し、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質とH−IL−6の両方の作用を阻害する請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質の阻害形態。
  21. 請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質により引き起こされるMIP−1α、MIP−1β、RANTESまたはIP−10の発現を阻害し、H−IL−6により引き起こされるMCP−1の発現を阻害する請求項20記載の融合タンパク質の阻害形態。
  22. gp130と結合し、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質の作用を阻害する請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質の阻害形態であって、H−IL−6ではない融合タンパク質の阻害形態。
  23. 細胞系中のシグナル伝達経路の調整方法における請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項20もしくは請求項21記載の阻害形態の使用。
  24. 請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物。
  25. 請求項14または15記載の発現ベクターの請求項13記載の核酸分子、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物。
  26. 治療に用いるための請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項12記載の核酸または請求項14もしくは請求項15記載の発現ベクター。
  27. 免疫応答を増大または回復させるのが望ましい場合、感染性疾患、炎症性障害または免疫学的障害の予防もしくは治療のための薬剤の製造における、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項13記載の核酸または請求項14もしくは請求項15記載の発現ベクターの使用。
  28. 免疫応答を増大または回復させるのが望ましい場合、感染性疾患の治療または予防における、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項13記載の核酸または請求項14もしくは請求項15記載の発現ベクターの使用。
  29. 感染性疾患の治療または予防の方法であって、免疫応答を増大または回復させるのが望ましい場合、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の有効用量の融合タンパク質、請求項13記載の核酸または請求項14もしくは請求項15記載の発現ベクターをこのような治療を必要とする個体に投与することを包含する方法。
  30. 前記感染性疾患はHIVのM栄養株により引き起こされるAIDSである請求項27もしくは請求項28記載の使用または請求項29記載の方法。
  31. 前記感染性疾患は細菌性腹膜炎である請求項27もしくは請求項28記載の使用または請求項29記載の方法。
  32. 高レベルのIL−6に関連した免疫学的障害の予防または治療のための薬剤の製造における請求項20ないし22のいずれか1項に記載の融合タンパク質の阻害形態の使用。
  33. 前記免疫学的障害が関節リウマチである請求項28記載の使用。
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