JP2003519162A - Ｐｐ１４融合蛋白質並びに該蛋白質の製造及び使用方法 - Google Patents
Ｐｐ１４融合蛋白質並びに該蛋白質の製造及び使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】
【解決手段】 ＰＰ１４を含む新規な融合蛋白質を開示する。融合蛋白質は、野生型ＰＰ１４の免疫制御機能を保持しているが、多くの利点を提供する。融合蛋白質及びそれをエンコードしている配列を免疫系疾患及び障害の治療に使用する方法も、この融合蛋白質の組み換え型を生成する方法と同様に開示する。
Description
【０００１】
本出願は、２０００年１月３日に出願された米国特許仮出願６０／１７４,２
８７号を優先権主張する。
８７号を優先権主張する。
【０００２】
本発明は、胎盤蛋白質１４(ＰＰ１４)を含む新規な融合蛋白質と、これらの融
合蛋白質の生成及び使用方法に関する。融合蛋白質は、免疫細胞の増殖及び機能
に有用である。
合蛋白質の生成及び使用方法に関する。融合蛋白質は、免疫細胞の増殖及び機能
に有用である。
【０００３】
ヒト免疫系は、感染症及び異種抗原に対し、細胞と体液の機構とによって生体
を保護するために機能する。免疫系は細胞と分子で構成されており、それらは組
織的に機能して体内の異物を検出し除去する。ウイルス、バクテリア、寄生虫、
菌類のような感染媒介物は免疫系の主要ターゲットであるが、感染細胞、移植細
胞、癌細胞のような患者体内の他の異常細胞も、付加的な免疫ターゲットである
。免疫系のこれらの様々な細胞及び無細胞ターゲットに関する異常分子は、大抵
は大きな蛋白質であるが、抗原と呼ばれることが一般的である。免疫系には、抗
原を発見し破壊する能力が与えられている。免疫系の本質的な動作特徴は、極め
て多種多様な一連の抗原を認識する能力、非常に明確に一抗原を他の抗原から識
別する能力及び、同一の抗原との出会いが一回目以降は、より激しく応答する能
力である。
を保護するために機能する。免疫系は細胞と分子で構成されており、それらは組
織的に機能して体内の異物を検出し除去する。ウイルス、バクテリア、寄生虫、
菌類のような感染媒介物は免疫系の主要ターゲットであるが、感染細胞、移植細
胞、癌細胞のような患者体内の他の異常細胞も、付加的な免疫ターゲットである
。免疫系のこれらの様々な細胞及び無細胞ターゲットに関する異常分子は、大抵
は大きな蛋白質であるが、抗原と呼ばれることが一般的である。免疫系には、抗
原を発見し破壊する能力が与えられている。免疫系の本質的な動作特徴は、極め
て多種多様な一連の抗原を認識する能力、非常に明確に一抗原を他の抗原から識
別する能力及び、同一の抗原との出会いが一回目以降は、より激しく応答する能
力である。
【０００４】
免疫系は二部門に大別されており、これらはＢリンパ球及びＴリンパ球(Ｂ細
胞及びＴ細胞)と呼ばれる異なった種類の細胞によって支えられている。Ｂ細胞
は、、抗原に出会うと抗体を作り、殆どの場合、これらの抗体は保護用である。
しかしながら、自己免疫性疾患の場合には、抗体の中には個々の組織と反応する
ものもある。抗体が組織内に存在する場合、それらは炎症反応及び組織損傷を生
じる。Ｔ細胞も、Ｂ細胞と同様に、抗原に出会うと活性化される。Ｔ細胞は発達
すると、「胸腺教育(thymic education)」と呼ばれるプロセスを経る。胸腺の教
育の間、９５％以上のＴ細胞が死滅する。個々の自己組織(自己抗原)を認識しそ
れと反応できるＴ細胞受容体を有するＴ細胞は、明確に除去される。しかし、自
己反応性のＴ細胞の中には除去プロセスを免れるものもあって、それは、免疫応
答を開始し、自己免疫性疾患を惹き起すことがある。
胞及びＴ細胞)と呼ばれる異なった種類の細胞によって支えられている。Ｂ細胞
は、、抗原に出会うと抗体を作り、殆どの場合、これらの抗体は保護用である。
しかしながら、自己免疫性疾患の場合には、抗体の中には個々の組織と反応する
ものもある。抗体が組織内に存在する場合、それらは炎症反応及び組織損傷を生
じる。Ｔ細胞も、Ｂ細胞と同様に、抗原に出会うと活性化される。Ｔ細胞は発達
すると、「胸腺教育(thymic education)」と呼ばれるプロセスを経る。胸腺の教
育の間、９５％以上のＴ細胞が死滅する。個々の自己組織(自己抗原)を認識しそ
れと反応できるＴ細胞受容体を有するＴ細胞は、明確に除去される。しかし、自
己反応性のＴ細胞の中には除去プロセスを免れるものもあって、それは、免疫応
答を開始し、自己免疫性疾患を惹き起すことがある。
【０００５】
自己免疫性疾患は、免疫系の不適切な応答から生じると一般的に考えられてい
る。多くの自己免疫性疾患において、Ｔ細胞は迷い込んで体の健康な組織を攻撃
する。これらのＴ細胞は、特定の組織内に存在する抗原物質を標的にするように
見える。抗原物質は、疾患によって異なり、疾患の過程で変化する可能性がある
。自己免疫性疾患においては、免疫系はその正常のコントロールを外れている様
に見え、結果的に組織損傷という結果になる一連の免疫反応が起こる。自己免疫
性疾患は一般的に慢性であり、長期間の治療が要求される。これらの治療は、傾
向として２つのカテゴリーに分けられる。第１カテゴリーは、抗炎症性剤や鎮痛
剤のような理学療法のための化合物を含んでおり、第２カテゴリーは、免疫系の
多数の部位を無差別にシャットダウンする非特異性免疫抑制剤の投与を含んでい
る。これらの免疫抑制剤は、一般的に毒性が強く、長期使用による副作用の問題
があり、感染症と闘うための免疫系の能力を抑圧してしまう。
る。多くの自己免疫性疾患において、Ｔ細胞は迷い込んで体の健康な組織を攻撃
する。これらのＴ細胞は、特定の組織内に存在する抗原物質を標的にするように
見える。抗原物質は、疾患によって異なり、疾患の過程で変化する可能性がある
。自己免疫性疾患においては、免疫系はその正常のコントロールを外れている様
に見え、結果的に組織損傷という結果になる一連の免疫反応が起こる。自己免疫
性疾患は一般的に慢性であり、長期間の治療が要求される。これらの治療は、傾
向として２つのカテゴリーに分けられる。第１カテゴリーは、抗炎症性剤や鎮痛
剤のような理学療法のための化合物を含んでおり、第２カテゴリーは、免疫系の
多数の部位を無差別にシャットダウンする非特異性免疫抑制剤の投与を含んでい
る。これらの免疫抑制剤は、一般的に毒性が強く、長期使用による副作用の問題
があり、感染症と闘うための免疫系の能力を抑圧してしまう。
【０００６】
したがって、アレルギー及び自己免疫性疾患の治療は、免疫細胞に毒性である
理学療法、抗体の生成を阻害する療法又は、免疫応答の仲介機能を阻害する療法
に基づいていた。免疫系を調整する可溶性リンフォカインのマニピュレーション
を可能にする薬剤は、自己免疫性疾患及び免疫細胞の無制限の増殖によって生じ
た疾患の治療に役立つ。ＰＰ１４は、注目されるその様な薬剤の一つである。
理学療法、抗体の生成を阻害する療法又は、免疫応答の仲介機能を阻害する療法
に基づいていた。免疫系を調整する可溶性リンフォカインのマニピュレーション
を可能にする薬剤は、自己免疫性疾患及び免疫細胞の無制限の増殖によって生じ
た疾患の治療に役立つ。ＰＰ１４は、注目されるその様な薬剤の一つである。
【０００７】
妊娠とは、免疫応答の様相即ち異種抗原に対する応答が少なくとも一つの中、
胎児によって表される父系抗原に関しては抑制されているという正常状態のこと
である。一世紀前に作成された報告書は、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、そ
の他の自己免疫性疾患を有する女性の可成りの割合で、疾患の徴候は分娩後に繰
り返されるけれども、妊娠に伴って疾患の症状を完全に又は部分的に回復を経験
すると示している。妊娠中にはＰＰ１４を含めて、多種の蛋白質の発現が、妊娠
中に高いレベルで誘発される。ＰＰ１４は、脱落膜組織の主要な分泌蛋白質であ
って、そこに全可溶性蛋白質の約１０％を含んでいる。ＰＰ１４は、自然に発現
する蛋白質であって、これは、男性の精液中と同様に、妊娠中の女性の羊水及び
血液中でも特に高いレベルで検出される蛋白質である。ＰＰ１４は、妊娠による
免疫抑制現象の少なくとも幾つか原を説明する。
胎児によって表される父系抗原に関しては抑制されているという正常状態のこと
である。一世紀前に作成された報告書は、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、そ
の他の自己免疫性疾患を有する女性の可成りの割合で、疾患の徴候は分娩後に繰
り返されるけれども、妊娠に伴って疾患の症状を完全に又は部分的に回復を経験
すると示している。妊娠中にはＰＰ１４を含めて、多種の蛋白質の発現が、妊娠
中に高いレベルで誘発される。ＰＰ１４は、脱落膜組織の主要な分泌蛋白質であ
って、そこに全可溶性蛋白質の約１０％を含んでいる。ＰＰ１４は、自然に発現
する蛋白質であって、これは、男性の精液中と同様に、妊娠中の女性の羊水及び
血液中でも特に高いレベルで検出される蛋白質である。ＰＰ１４は、妊娠による
免疫抑制現象の少なくとも幾つか原を説明する。
【０００８】
米国特許第５,０３９,５２１号及び第５,２５６,４１１号は、ＰＰ１４、誘導
体、フラグメント又はそのサブユニット或いはそのモノクローナル抗体の投与に
よって、ヒトの免疫系障害(immune system disorder)を治療する方法を開示して
いる。インターロイキン−１を阻害する方法も開示されている。'４１１特許は
、ＰＰ１４の一形態を示しており、２つの非共有結合蛋白質サブユニットの二量
体である。何れの特許も、この明細書において説明されるＰＰ１４融合蛋白質を
開示していない。
体、フラグメント又はそのサブユニット或いはそのモノクローナル抗体の投与に
よって、ヒトの免疫系障害(immune system disorder)を治療する方法を開示して
いる。インターロイキン−１を阻害する方法も開示されている。'４１１特許は
、ＰＰ１４の一形態を示しており、２つの非共有結合蛋白質サブユニットの二量
体である。何れの特許も、この明細書において説明されるＰＰ１４融合蛋白質を
開示していない。
【０００９】
ＰＰ１４は、インビトロでは、炎症性サイトカイン(ＩＬ−１及びＩＬ−２)の
生成及びＴ細胞の増殖について効果があることが示されている。これらの免疫制
御活動は、妊娠中の女性の血清に見られるのと同様な蛋白質濃度のときに顕著で
あることが明らかである。ＰＰ１４の免疫学的機能及び調節に関する調査は、Ｔ
細胞の機能を阻害するための能力を示す組み換え型ＰＰ１４誘導体が不足してい
ることによって妨げられてきた。ＰＰ１４が有する免疫阻害能力によって、免疫
系障害の治療において、安定し、より効果的な形態のＰＰ１４が所望されている
。
生成及びＴ細胞の増殖について効果があることが示されている。これらの免疫制
御活動は、妊娠中の女性の血清に見られるのと同様な蛋白質濃度のときに顕著で
あることが明らかである。ＰＰ１４の免疫学的機能及び調節に関する調査は、Ｔ
細胞の機能を阻害するための能力を示す組み換え型ＰＰ１４誘導体が不足してい
ることによって妨げられてきた。ＰＰ１４が有する免疫阻害能力によって、免疫
系障害の治療において、安定し、より効果的な形態のＰＰ１４が所望されている
。
【００１０】
本発明は、免疫系障害の治療のためのＰＰ１４融合蛋白質に関する。より具体
的には、本発明は、１又は２以上のＰＰ１４配列から成る第１領域と、免疫グロ
ブリンＩｇＧ１のような免疫グロブリン蛋白質のＦｃ部の配列を１又は２以上含
む第２領域とを含む、融合蛋白質に関するものである。この融合蛋白質の望まし
い例は、ＰＰ１４−Ｆｃγ1である。この融合蛋白質は、組み換え型誘導体であ
って、Ｔ細胞の活動を阻害し、下記で説明するように、他の形態のＰＰ１４より
優れた様相で機能するものである。融合蛋白質の生成及び使用方法も、本願の範
疇に入っている。
的には、本発明は、１又は２以上のＰＰ１４配列から成る第１領域と、免疫グロ
ブリンＩｇＧ１のような免疫グロブリン蛋白質のＦｃ部の配列を１又は２以上含
む第２領域とを含む、融合蛋白質に関するものである。この融合蛋白質の望まし
い例は、ＰＰ１４−Ｆｃγ1である。この融合蛋白質は、組み換え型誘導体であ
って、Ｔ細胞の活動を阻害し、下記で説明するように、他の形態のＰＰ１４より
優れた様相で機能するものである。融合蛋白質の生成及び使用方法も、本願の範
疇に入っている。
【００１１】
この説明で開示し権利を請求するＰＰ１４融合蛋白質は、前例のない免疫制御
能力を有していることが明らかとなった。ＰＰ１４及びその融合蛋白質は、免疫
系のＴ細胞の活動を直接的に阻害するだけでなはく、独特の「抵抗(rheostatic)
」機構によっても阻害することにより、Ｔ細胞受容体を通じてシグナリングの感
度を減じる。その結果、該蛋白質は、自己免疫性疾患及び同種免疫性疾患の調整
と治療に効果的である。これは、少なくとも部分的に、Ｔ細胞の応答を歪めてＴ
Ｈ２サイトカイン応答へ向い、そしてＴＨ１サイトカイン応答から離れる該蛋白
質の能力に由来している。ＰＰ１４は妊娠中の女性の血液及び羊水中に高いレベ
ルで存在しており、胎児はいささかも害されず羊水中で文字どおり水浴している
から、ＰＰ１４及びその融合蛋白質には、毒性や大きな副作用があるとは考えら
れない。
能力を有していることが明らかとなった。ＰＰ１４及びその融合蛋白質は、免疫
系のＴ細胞の活動を直接的に阻害するだけでなはく、独特の「抵抗(rheostatic)
」機構によっても阻害することにより、Ｔ細胞受容体を通じてシグナリングの感
度を減じる。その結果、該蛋白質は、自己免疫性疾患及び同種免疫性疾患の調整
と治療に効果的である。これは、少なくとも部分的に、Ｔ細胞の応答を歪めてＴ
Ｈ２サイトカイン応答へ向い、そしてＴＨ１サイトカイン応答から離れる該蛋白
質の能力に由来している。ＰＰ１４は妊娠中の女性の血液及び羊水中に高いレベ
ルで存在しており、胎児はいささかも害されず羊水中で文字どおり水浴している
から、ＰＰ１４及びその融合蛋白質には、毒性や大きな副作用があるとは考えら
れない。
【００１２】
このＰＰ１４融合蛋白質及びそれをエンコードする遺伝子配列は、多種の免疫
と炎症性の疾患及び症状を治療するのに有用である。発明者はこの点に限定する
ことを望んでいないが、それら自己免疫性疾患の中核たる病因機構に向かうこと
により、ＰＰ１４融合蛋白質の汎用性は、多くの自己免疫性及び同種免疫性疾患
に向かうと確信されている。注目に値すべきなのは、このＰＰ１４融合蛋白質は
、体の免疫応答を、現在の自己免疫性及び同種免疫性(alloimmune)疾患の薬が行
う様にシャットダウンするのではなく、調整することである。これにより、体の
免疫系が、それ自体を日和見疾患及び感染から守り続けることができる。従って
本発明は、不適当なことだが免疫系に健全な細胞を攻撃せしめている。キトカイ
シンの再生を低下させる必要に応じて、Ｔ細胞受容体の応答を調節し、一方では
同時に免疫系が感染媒介物に対して十分な程度の免疫保護を維持し、免疫系が個
体を保護することを明らかにする。
と炎症性の疾患及び症状を治療するのに有用である。発明者はこの点に限定する
ことを望んでいないが、それら自己免疫性疾患の中核たる病因機構に向かうこと
により、ＰＰ１４融合蛋白質の汎用性は、多くの自己免疫性及び同種免疫性疾患
に向かうと確信されている。注目に値すべきなのは、このＰＰ１４融合蛋白質は
、体の免疫応答を、現在の自己免疫性及び同種免疫性(alloimmune)疾患の薬が行
う様にシャットダウンするのではなく、調整することである。これにより、体の
免疫系が、それ自体を日和見疾患及び感染から守り続けることができる。従って
本発明は、不適当なことだが免疫系に健全な細胞を攻撃せしめている。キトカイ
シンの再生を低下させる必要に応じて、Ｔ細胞受容体の応答を調節し、一方では
同時に免疫系が感染媒介物に対して十分な程度の免疫保護を維持し、免疫系が個
体を保護することを明らかにする。
【００１３】
したがって、本発明の一つの様相は、融合蛋白質の形態をとったＰＰ１４を提
供することである。 本発明の他の様相は、免疫系疾患の治療に用いられる上記蛋白質を提供するこ
とである。 本発明のこれらの及び他の様相は、下記の説明と添付の請求の範囲によって明
らかとなるであろう。
供することである。 本発明の他の様相は、免疫系疾患の治療に用いられる上記蛋白質を提供するこ
とである。 本発明のこれらの及び他の様相は、下記の説明と添付の請求の範囲によって明
らかとなるであろう。
【００１４】
本発明は、組み換え型ＰＰ４融合蛋白質に関する。より具体的には、本発明は
、ＰＰ１４ポリペプチド配列を含む第１ドメインと、ポリペプチド配列のＦｃ部
又は免疫グロブリン蛋白質ユニットを含む第２ドメインとを含む、組み換え融合
蛋白質に関している。
、ＰＰ１４ポリペプチド配列を含む第１ドメインと、ポリペプチド配列のＦｃ部
又は免疫グロブリン蛋白質ユニットを含む第２ドメインとを含む、組み換え融合
蛋白質に関している。
【００１５】
胎盤蛋白質１４(ＰＰ１４)は、Ｔ細胞阻害特性を示す２８ｋＤａ糖蛋白質であ
って、グリコデリン(glycodelin)又はプロゲステロン関連の子宮内膜蛋白質とし
ても知られている。ＰＰ１４の主要な供給源は、分泌性及び脱落した子宮内膜の
腺細胞であって、これは、妊娠中の女性の血清と羊水の両方から発見されており
、そこでは高いレベルまで堆積している。ＰＰ１４は、精液、血小板及び巨核球
、及び胸部、卵巣及び造血系統からの腫瘍細胞株においても検出された。ＰＰ１
４は、免疫抑制機能を有することは周知である。殆どの他の免疫抑制蛋白質とは
対照的に、ＰＰ１４は、アクセサリー細胞と無関係な機構を通じてＴ細胞を直接
的に阻害する。さらに、ＰＰ１４は、Ｔ細胞受容体の仲介によるＴ細胞の初期活
動に影響を与えると考えられており、故に、ＰＰ１４は、他のＴ細胞抑制因子と
異なる、活動の特異な機構を有している。
って、グリコデリン(glycodelin)又はプロゲステロン関連の子宮内膜蛋白質とし
ても知られている。ＰＰ１４の主要な供給源は、分泌性及び脱落した子宮内膜の
腺細胞であって、これは、妊娠中の女性の血清と羊水の両方から発見されており
、そこでは高いレベルまで堆積している。ＰＰ１４は、精液、血小板及び巨核球
、及び胸部、卵巣及び造血系統からの腫瘍細胞株においても検出された。ＰＰ１
４は、免疫抑制機能を有することは周知である。殆どの他の免疫抑制蛋白質とは
対照的に、ＰＰ１４は、アクセサリー細胞と無関係な機構を通じてＴ細胞を直接
的に阻害する。さらに、ＰＰ１４は、Ｔ細胞受容体の仲介によるＴ細胞の初期活
動に影響を与えると考えられており、故に、ＰＰ１４は、他のＴ細胞抑制因子と
異なる、活動の特異な機構を有している。
【００１６】
ＰＰ１４自体は、哺乳類の胎盤、哺乳類の血液、羊水、精漿、細胞と組織の培
養物、脱落膜細胞、脱落膜器官、子宮内膜細胞、子宮内膜器官及び組み換え蛋白
質供給源を含めて、様々な供給源から得られる。ヒトＰＰ１４ ｃＤＮＡを含め
てＰＰ１４ ｃＤＮＡは、ヌクレオチド配列のレポジトリ(repository)から商業
的に入手できる、或いはＲＴ−ＰＣＲによって容易にクローン化できる。ＰＰ１
４の配列リストは、米国特許第５,２５６,４１１号によって開示されており、該
特許は参照を以て本願に組み入れられる。「ＰＰ１４ポリペプチド配列」は、こ
の配列又は、ＰＰ１４の生物学的活動を保有する任意の誘導体、フラグメント若
しくはそのサブユニットを意味する。したがって、治療的活動を保有しているす
べてのＰＰ１４ポリペプチド配列は本発明の範疇に入ると考えられ、そのような
配列をエンコードするドメインは、この融合蛋白質において利用されることがで
きる。
養物、脱落膜細胞、脱落膜器官、子宮内膜細胞、子宮内膜器官及び組み換え蛋白
質供給源を含めて、様々な供給源から得られる。ヒトＰＰ１４ ｃＤＮＡを含め
てＰＰ１４ ｃＤＮＡは、ヌクレオチド配列のレポジトリ(repository)から商業
的に入手できる、或いはＲＴ−ＰＣＲによって容易にクローン化できる。ＰＰ１
４の配列リストは、米国特許第５,２５６,４１１号によって開示されており、該
特許は参照を以て本願に組み入れられる。「ＰＰ１４ポリペプチド配列」は、こ
の配列又は、ＰＰ１４の生物学的活動を保有する任意の誘導体、フラグメント若
しくはそのサブユニットを意味する。したがって、治療的活動を保有しているす
べてのＰＰ１４ポリペプチド配列は本発明の範疇に入ると考えられ、そのような
配列をエンコードするドメインは、この融合蛋白質において利用されることがで
きる。
【００１７】
任意の適当なＦｃユニットを、この融合蛋白質において使用することができる
。さらに、Ｆｃユニットの任意の誘導体、フラグメント又はサブユニットは、野
生型(wild)Ｆｃユニットの生物学的活動を保持しているのであれば、それの使用
も可能である。Ｆｃユニットは、ヒトＩｇＧ１(Ｆｃγ1)のＦｃユニットである
ことが望ましい。このドメインは、バージニア州マナサスの米国微生物系統保存
機関(American Type Culture Collection)から商業的に入手可能であり、ヒトＩ
ｇＧ１定常部に関する配列リストは、エリソン氏等の「核酸リサーチ」[Ellison
, et al., "Nucleic Acids Research, 10(13):4071-4079(1982)]において見るこ
とができる。これら全体を、参照を以て本願に組み入れられる。他の適当なＦｃ
ユニットには、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ
及びＩｇＥが含まれる。
。さらに、Ｆｃユニットの任意の誘導体、フラグメント又はサブユニットは、野
生型(wild)Ｆｃユニットの生物学的活動を保持しているのであれば、それの使用
も可能である。Ｆｃユニットは、ヒトＩｇＧ１(Ｆｃγ1)のＦｃユニットである
ことが望ましい。このドメインは、バージニア州マナサスの米国微生物系統保存
機関(American Type Culture Collection)から商業的に入手可能であり、ヒトＩ
ｇＧ１定常部に関する配列リストは、エリソン氏等の「核酸リサーチ」[Ellison
, et al., "Nucleic Acids Research, 10(13):4071-4079(1982)]において見るこ
とができる。これら全体を、参照を以て本願に組み入れられる。他の適当なＦｃ
ユニットには、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ
及びＩｇＥが含まれる。
【００１８】
ＰＰ１４のポリペプチド配列及び／又はＦｃユニットと関連してこの説明中に
用いられる「誘導体」なる用語は、１又は２以上のアミノ酸残基が付加され或い
は除去されたＰＰ１４又はＦｃユニットを意味しており、そのような誘導体は、
それらの生物学的機能を保有しているから、本発明に有用であると理解されるで
あろう。ここで用いるＰＰ１４又はＦｃユニット誘導体の用語には、当業者で知
られている酸化、還元又は他の誘導体化プロセスによるＰＰ１４又はＦｃユニッ
トの１以上のアミノ酸残基の実施例も含まれる。
用いられる「誘導体」なる用語は、１又は２以上のアミノ酸残基が付加され或い
は除去されたＰＰ１４又はＦｃユニットを意味しており、そのような誘導体は、
それらの生物学的機能を保有しているから、本発明に有用であると理解されるで
あろう。ここで用いるＰＰ１４又はＦｃユニット誘導体の用語には、当業者で知
られている酸化、還元又は他の誘導体化プロセスによるＰＰ１４又はＦｃユニッ
トの１以上のアミノ酸残基の実施例も含まれる。
【００１９】
同様に、ＰＰ１４のフラグメント及びサブユニットは、そのような部分が治療
的活動を保有していれば、ヒトの免疫系障害の治療に有用である。Ｆｃユニット
のフラグメント及びサブユニットも、二量化及び／又は蛋白質Ａ或いは蛋白質Ｇ
の結合のような機能上の特性を１以上保持していれば、本発明に有用である。当
業者であれば、ポリペプチド配列の「フラグメント」及び「サブユニット」は、
１又は複数の機能上の特性又は構造上の特性を有する蛋白質の不連続部分を意味
している、と理解するであろう。例えば、アミノ酸残基６３乃至１６０によって
規定されるＰＰ１４蛋白質のフラグメントはまた、本発明の目的のために、ＰＰ
１４の治療的に活性なフラグメントであると考えられている。このフラグメント
は、生物学的な活動を有すると思われているシステインアミノ酸を４個含有して
いる。アミノ酸残基８０乃至１０５によって規定されるフラグメントはまた、本
発明の目的のために、治療的に活性であると考えられている。残基８０乃至１０
５によって規定されるフラグメントが治療的に活性であると思われているのは、
該フラグメントはジスルフィド架橋を含まない線形配列であること、該フラグメ
ントはグリコシル化部位(残基８５乃至８７)を含むこと、該フラグメントは、フ
ェニール側鎖のために受容体相互作用に含まれる２個のチロシン残基を有するこ
と及び、残基８０乃至８１における二重リジン配列は、二重アミノ酸基の活動を
有しており、潜在的な受容体活動を示唆していることによる。
的活動を保有していれば、ヒトの免疫系障害の治療に有用である。Ｆｃユニット
のフラグメント及びサブユニットも、二量化及び／又は蛋白質Ａ或いは蛋白質Ｇ
の結合のような機能上の特性を１以上保持していれば、本発明に有用である。当
業者であれば、ポリペプチド配列の「フラグメント」及び「サブユニット」は、
１又は複数の機能上の特性又は構造上の特性を有する蛋白質の不連続部分を意味
している、と理解するであろう。例えば、アミノ酸残基６３乃至１６０によって
規定されるＰＰ１４蛋白質のフラグメントはまた、本発明の目的のために、ＰＰ
１４の治療的に活性なフラグメントであると考えられている。このフラグメント
は、生物学的な活動を有すると思われているシステインアミノ酸を４個含有して
いる。アミノ酸残基８０乃至１０５によって規定されるフラグメントはまた、本
発明の目的のために、治療的に活性であると考えられている。残基８０乃至１０
５によって規定されるフラグメントが治療的に活性であると思われているのは、
該フラグメントはジスルフィド架橋を含まない線形配列であること、該フラグメ
ントはグリコシル化部位(残基８５乃至８７)を含むこと、該フラグメントは、フ
ェニール側鎖のために受容体相互作用に含まれる２個のチロシン残基を有するこ
と及び、残基８０乃至８１における二重リジン配列は、二重アミノ酸基の活動を
有しており、潜在的な受容体活動を示唆していることによる。
【００２０】
ＰＰ１４の誘導体、フラグメント又はサブユニットの治療的活動は、Rachmite
witz氏等のCellular Immunology, 191:26(1999)によって示される検査のような
標準的な機能検査において、Ｔ細胞の応答を阻害するための、その能力によって
決定される。野生型ＰＰ１４の生理学的機能を保持しており、生物学的に活性で
あるＰＰ１４の誘導体、フラグメント又はサブユニットは、本発明の範囲に含ま
れる。Ｆｃユニットの誘導体、フラグメント又はサブユニットを二量化する能力
は、電気泳動分析によって決定されることができ、蛋白質Ａ又は蛋白質Ｇと結び
つける能力は、アフィニティークロマトグラフィによって決定されることができ
、Ｆｃユニットのそのような誘導体、フラグメント又はサブユニットは、本発明
の範囲内である。したがって、「ＰＰ１４配列」、「ＰＰ１４ポリペプチド配列
」及び「ポリペプチド配列」、免疫グロブリン蛋白質のＦｃ部分の「配列」は、
野生型のＰＰ１４及びＦｃ配列の両方を、その生理学的に活性の誘導体、フラグ
メント又はサブユニットと同様に、意味している。
witz氏等のCellular Immunology, 191:26(1999)によって示される検査のような
標準的な機能検査において、Ｔ細胞の応答を阻害するための、その能力によって
決定される。野生型ＰＰ１４の生理学的機能を保持しており、生物学的に活性で
あるＰＰ１４の誘導体、フラグメント又はサブユニットは、本発明の範囲に含ま
れる。Ｆｃユニットの誘導体、フラグメント又はサブユニットを二量化する能力
は、電気泳動分析によって決定されることができ、蛋白質Ａ又は蛋白質Ｇと結び
つける能力は、アフィニティークロマトグラフィによって決定されることができ
、Ｆｃユニットのそのような誘導体、フラグメント又はサブユニットは、本発明
の範囲内である。したがって、「ＰＰ１４配列」、「ＰＰ１４ポリペプチド配列
」及び「ポリペプチド配列」、免疫グロブリン蛋白質のＦｃ部分の「配列」は、
野生型のＰＰ１４及びＦｃ配列の両方を、その生理学的に活性の誘導体、フラグ
メント又はサブユニットと同様に、意味している。
【００２１】
この説明中で使用される「組み換え型」なる用語は、組み換えＤＮＡ技術によ
って生成された本発明のＰＰ１４融合蛋白質を意味する。ここでＰＰ１４の遺伝
子コード化及びＦｃユニットの遺伝子コード化は、組み換えＤＮＡ技術によって
クローン化される。故に、本発明による組み換え型融合蛋白質を産生する方法の
１つは、ＰＰ１４蛋白質又は誘導体、そのフラグメント又はサブユニットをエン
コードする第１ポリヌクレオチド配列を、Ｆｃポリペプチド配列をエンコードす
る第２ポリヌクレオチドへ結合して、キメラのコード配列を生成すること、キメ
ラのコード配列を発現ベクターへサブクローン化すること、発現ベクターを有す
る細胞をトランスフェクトすること(transfecting)及び、トランスフェクトされ
た細胞により発現した融合蛋白質を精製する(purifying)ことを含む。
って生成された本発明のＰＰ１４融合蛋白質を意味する。ここでＰＰ１４の遺伝
子コード化及びＦｃユニットの遺伝子コード化は、組み換えＤＮＡ技術によって
クローン化される。故に、本発明による組み換え型融合蛋白質を産生する方法の
１つは、ＰＰ１４蛋白質又は誘導体、そのフラグメント又はサブユニットをエン
コードする第１ポリヌクレオチド配列を、Ｆｃポリペプチド配列をエンコードす
る第２ポリヌクレオチドへ結合して、キメラのコード配列を生成すること、キメ
ラのコード配列を発現ベクターへサブクローン化すること、発現ベクターを有す
る細胞をトランスフェクトすること(transfecting)及び、トランスフェクトされ
た細胞により発現した融合蛋白質を精製する(purifying)ことを含む。
【００２２】
ＰＰ１４配列及びＦｃユニット配列は上記の通りである。任意の適当な発現ベ
クターの使用が可能であって、それにはウイルス又は非ウイルスベクターが含ま
れる。適当な非ウイルスベクターは、例えばプラスミドを含んでおり、プラスミ
ドには、例としてｐＲＥＰ７βがあるエプスタイン−バールウイルスエピソーム
型複製要素を組み込んだ自己複製型プラスミドが含まれる。適当なウイルスベク
ターは、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及び単
純ヘルペスウイルスベクターが含まれる。当該分野で知られている任意のトラン
スフェクション手段であれば、リポフェクション、電気穿孔(エレクトロポレー
ション)及びリン酸カルシウム共沈法を含む非ウイルスベクターのために用いる
ことができる。トランスフェクトされた細胞により産生した融合蛋白質は、当該
分野において周知の手段によって細胞媒体から集められ精製される。特に望まし
いのは、蛋白質Ａアフィニティークロマトグラフィであって、ここでは商業的に
入手可能な蛋白質Ａセファロースのような固相マトリックスがＦｃ融合蛋白質を
固定化するために使用される。このように生成された組み換え型融合蛋白質は、
次にこの明細書中に説明されたような治療方法に使用することができる。
クターの使用が可能であって、それにはウイルス又は非ウイルスベクターが含ま
れる。適当な非ウイルスベクターは、例えばプラスミドを含んでおり、プラスミ
ドには、例としてｐＲＥＰ７βがあるエプスタイン−バールウイルスエピソーム
型複製要素を組み込んだ自己複製型プラスミドが含まれる。適当なウイルスベク
ターは、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及び単
純ヘルペスウイルスベクターが含まれる。当該分野で知られている任意のトラン
スフェクション手段であれば、リポフェクション、電気穿孔(エレクトロポレー
ション)及びリン酸カルシウム共沈法を含む非ウイルスベクターのために用いる
ことができる。トランスフェクトされた細胞により産生した融合蛋白質は、当該
分野において周知の手段によって細胞媒体から集められ精製される。特に望まし
いのは、蛋白質Ａアフィニティークロマトグラフィであって、ここでは商業的に
入手可能な蛋白質Ａセファロースのような固相マトリックスがＦｃ融合蛋白質を
固定化するために使用される。このように生成された組み換え型融合蛋白質は、
次にこの明細書中に説明されたような治療方法に使用することができる。
【００２３】
この融合蛋白質は、キメラ蛋白質の実用性を、特に免疫学的研究、動物モデル
、診断及び治療の領域において増大させる、１又は２以上の多くの他の構成要素
を含有することもできる。例えば、蛋白質は、エピトーグタグを含むように作ら
れることができる。エピトーグタグは、該プロテインの精製を容易にするため、
細胞上又は細胞の集団内での蛋白質の局在化に従うため、及び／又は蛋白質の生
物学的活動を増すために、研究室でのセッティングにおいて特に有用である。例
えば、第１又は第２蛋白質の何れかの一次配列は、エピトープタグを組み入れ、
これにより様々な蛋白質の生物学的単離を容易にするために、遺伝工学的手法に
よって変えられることができる。特に有用な変更は、２以上の隣接ヒスチジン残
基を挿入することである。この挿入は、例えば、ペプチドのアミノ末端又はカル
ボキシ末端へ行われることができる。ヒスチジン残基の挿入は、スプライス・バ
イ・オーバーラップ・エクステンション方法によって、ヒスチジンをエンコード
するＣＡＴ及びＣＡＣのトリプレットコドンを、ＰＣＲプライマーのコード配列
の適当な位置において、組み入れることにより容易に達成される。ヒスチジン修
飾蛋白質は、ニッケル−セファロースクロマトグラフィー法によって効果的且つ
定量的に単離されることができる。ヒスチジン−ニッケルの相互作用は、プロト
ン付加に基づいており、故に、ペプチド溶出のために、単純なｐＨのシフトを通
じて、逆向きにされることができる。特定の化学結合試薬のために反応性アミノ
酸を挿入することのような、他の一次配列変更もまた行なうことができる。或い
は、免疫アフィニティに基づいた方法を含む、より通常の生物学的単離法を使用
することもできる。他の手法にはＦｌａｇエピトープが含まれており、それは蛋
白質の架橋結合、マーカー配列及び視覚化配列を許容する。例えば、二量体又は
三量体錯体を安定化させるために、レシチンジッパーを蛋白質へ組み入れること
ができる。また、本発明の融合蛋白質の機能へ付加することができるものとして
当該分野で公知の他の部位(moieties)への組入れも可能である。
、診断及び治療の領域において増大させる、１又は２以上の多くの他の構成要素
を含有することもできる。例えば、蛋白質は、エピトーグタグを含むように作ら
れることができる。エピトーグタグは、該プロテインの精製を容易にするため、
細胞上又は細胞の集団内での蛋白質の局在化に従うため、及び／又は蛋白質の生
物学的活動を増すために、研究室でのセッティングにおいて特に有用である。例
えば、第１又は第２蛋白質の何れかの一次配列は、エピトープタグを組み入れ、
これにより様々な蛋白質の生物学的単離を容易にするために、遺伝工学的手法に
よって変えられることができる。特に有用な変更は、２以上の隣接ヒスチジン残
基を挿入することである。この挿入は、例えば、ペプチドのアミノ末端又はカル
ボキシ末端へ行われることができる。ヒスチジン残基の挿入は、スプライス・バ
イ・オーバーラップ・エクステンション方法によって、ヒスチジンをエンコード
するＣＡＴ及びＣＡＣのトリプレットコドンを、ＰＣＲプライマーのコード配列
の適当な位置において、組み入れることにより容易に達成される。ヒスチジン修
飾蛋白質は、ニッケル−セファロースクロマトグラフィー法によって効果的且つ
定量的に単離されることができる。ヒスチジン−ニッケルの相互作用は、プロト
ン付加に基づいており、故に、ペプチド溶出のために、単純なｐＨのシフトを通
じて、逆向きにされることができる。特定の化学結合試薬のために反応性アミノ
酸を挿入することのような、他の一次配列変更もまた行なうことができる。或い
は、免疫アフィニティに基づいた方法を含む、より通常の生物学的単離法を使用
することもできる。他の手法にはＦｌａｇエピトープが含まれており、それは蛋
白質の架橋結合、マーカー配列及び視覚化配列を許容する。例えば、二量体又は
三量体錯体を安定化させるために、レシチンジッパーを蛋白質へ組み入れること
ができる。また、本発明の融合蛋白質の機能へ付加することができるものとして
当該分野で公知の他の部位(moieties)への組入れも可能である。
【００２４】
本発明は、本発明の組み換え融合蛋白質を効果的な量で患者へ投与することに
よって、患者の免疫系障害を治療する方法にも関する。「患者」は、動物界の全
てを意味し、ヒトを含むが、それに限定されていない。この説明中に使用される
「免疫系障害又は疾患」は、自己免疫性、同種免疫性、アレルギー性、炎症性又
はリンパ滲出性障害又は疾患を意味する。「自己免疫性疾患」なる用語は、より
具体的には、神経、胃腸、骨格筋、心臓血管及び内分泌系などのヒト臓器系に影
響を及ぼす８０以上の慢性的疾患の異種グループを意味する。自己免疫性疾患は
、身体障害を生じたり死に至るものもあり、組織や臓器を事実上襲う可能性があ
る。この方法によって治療される特定の免疫系障害の例として、リウマチ様関節
炎、変形性関節症、喘息、移植片対宿主疾患、臓器拒絶反応、全身性紅斑性狼瘡
、アトピー性アレルギー、多発性硬化症、アレルギー性皮膚炎、炎症性腸疾患、
乾癬、全身性硬化症、サルコイドーシス及びその他の炎症性障害が挙げられる。
リンパ滲出性疾患には、悪性非ホジキンリンパ腫、ホジキン病又は悪性組織球増
殖症が含まれるが、これらに限定されるものではない。不妊症により顕在化する
自己免疫性疾患も、この方法によって治療することができる。免疫系障害は、白
血病のような腫瘍性疾患でもあり得る。治療を施すことのできる自己免疫性障害
は、多くの移植片対宿主反応及び宿主対移植片反応のうちの何れかである。主要
な炎症伝達物質(inflammatory mediator)であるＩＬ−、の阻害もまた、本発明
の治療方法の範囲内である。
よって、患者の免疫系障害を治療する方法にも関する。「患者」は、動物界の全
てを意味し、ヒトを含むが、それに限定されていない。この説明中に使用される
「免疫系障害又は疾患」は、自己免疫性、同種免疫性、アレルギー性、炎症性又
はリンパ滲出性障害又は疾患を意味する。「自己免疫性疾患」なる用語は、より
具体的には、神経、胃腸、骨格筋、心臓血管及び内分泌系などのヒト臓器系に影
響を及ぼす８０以上の慢性的疾患の異種グループを意味する。自己免疫性疾患は
、身体障害を生じたり死に至るものもあり、組織や臓器を事実上襲う可能性があ
る。この方法によって治療される特定の免疫系障害の例として、リウマチ様関節
炎、変形性関節症、喘息、移植片対宿主疾患、臓器拒絶反応、全身性紅斑性狼瘡
、アトピー性アレルギー、多発性硬化症、アレルギー性皮膚炎、炎症性腸疾患、
乾癬、全身性硬化症、サルコイドーシス及びその他の炎症性障害が挙げられる。
リンパ滲出性疾患には、悪性非ホジキンリンパ腫、ホジキン病又は悪性組織球増
殖症が含まれるが、これらに限定されるものではない。不妊症により顕在化する
自己免疫性疾患も、この方法によって治療することができる。免疫系障害は、白
血病のような腫瘍性疾患でもあり得る。治療を施すことのできる自己免疫性障害
は、多くの移植片対宿主反応及び宿主対移植片反応のうちの何れかである。主要
な炎症伝達物質(inflammatory mediator)であるＩＬ−、の阻害もまた、本発明
の治療方法の範囲内である。
【００２５】
この組み換え融合蛋白質は、効果的な量で患者へ投与されなければならない。
「効果的な量」なる用語は、所望の応答をもたらすのに必要な融合蛋白質の量を
意味する。この応答とは、一般的に、治療される免疫系障害の１又は２以上の症
状が、たとえなくならないまでも軽減されることを意味し、サイトカイン生成が
阻害されることを意味する。患者のために必要とされる効果的な量は、患者の大
きさと、免疫応答を行うための患者の免疫系の状態及び患者の能力と、病気の種
類及び重症度などの要因によって異なることは理解されるであろう。各患者に適
切で効果的な量は、当該分野の専門家であれば決定できるものであるが、一般的
には、少なくとも野生型(native)ＰＰ１４へ同等な免疫阻害(immunohibition)を
もたらす量であって、それは妊娠中の女性の血液中に一般的に存在している量(
０.１−１０μＭ／Ｌ)である。
「効果的な量」なる用語は、所望の応答をもたらすのに必要な融合蛋白質の量を
意味する。この応答とは、一般的に、治療される免疫系障害の１又は２以上の症
状が、たとえなくならないまでも軽減されることを意味し、サイトカイン生成が
阻害されることを意味する。患者のために必要とされる効果的な量は、患者の大
きさと、免疫応答を行うための患者の免疫系の状態及び患者の能力と、病気の種
類及び重症度などの要因によって異なることは理解されるであろう。各患者に適
切で効果的な量は、当該分野の専門家であれば決定できるものであるが、一般的
には、少なくとも野生型(native)ＰＰ１４へ同等な免疫阻害(immunohibition)を
もたらす量であって、それは妊娠中の女性の血液中に一般的に存在している量(
０.１−１０μＭ／Ｌ)である。
【００２６】
投与は、蛋白質医薬品に適しているものとして当該分野で知られている任意の
方法によって行われることができ、例えば、静脈注射、筋肉注射、局所投与、経
口摂取、直腸投与及び吸入がある。或いは、この融合蛋白質は、炎症部位へ直接
的に送達されることができ、例えば炎症を起こした関節へ関節内注射されること
ができる。ＰＰ１４融合蛋白質は、薬学的に許容される坦体と混合して投与され
る。そのような坦体は、適合性の問題が生じない限り、本発明に使用することが
できる。薬学的に許容される坦体としてＰＢＳがある。
方法によって行われることができ、例えば、静脈注射、筋肉注射、局所投与、経
口摂取、直腸投与及び吸入がある。或いは、この融合蛋白質は、炎症部位へ直接
的に送達されることができ、例えば炎症を起こした関節へ関節内注射されること
ができる。ＰＰ１４融合蛋白質は、薬学的に許容される坦体と混合して投与され
る。そのような坦体は、適合性の問題が生じない限り、本発明に使用することが
できる。薬学的に許容される坦体としてＰＢＳがある。
【００２７】
本発明のＰＰ１４融合蛋白質は、野生型のＰＰ１４の免疫制御特性を、幾つか
の注目すべき点で維持している。例えば、ＰＰ１４融合蛋白質は、Ｔ細胞増殖、
特に抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体に関するＴ細胞の活動を阻害す
る能力を保持している。このＰＰ１４融合蛋白質は、インターロイキン−２(Ｉ
Ｌ−２)及び間接的にインターロイキン−１(ＩＬ−１)を含めてサイトカインの
分泌を阻害する能力も保持している。
の注目すべき点で維持している。例えば、ＰＰ１４融合蛋白質は、Ｔ細胞増殖、
特に抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体に関するＴ細胞の活動を阻害す
る能力を保持している。このＰＰ１４融合蛋白質は、インターロイキン−２(Ｉ
Ｌ−２)及び間接的にインターロイキン−１(ＩＬ−１)を含めてサイトカインの
分泌を阻害する能力も保持している。
【００２８】
インターロイキン−１(ＩＬ−１)は、様々な種類の細胞によって分泌されたペ
プチドサイトカインであって、免疫系Ｔ細胞の活性化への関与を含む様々な機能
を有している。ＩＬ−１はまた、軟骨損傷を引き起こし、軟骨からのプロテオグ
リカンの損失を招き、骨吸収を誘発し、炎症性であり、リンパ球の増殖因子とし
て作用し、走化因子(chemotactic factor)であり、多形核白血球の活性化可能物
質である。十分な密度で存在する場合、ＩＬ−１は、発熱、筋肉衰弱及び眠気を
生じる。ＩＬ−１は、炎症反応の中心的な伝達物質であり、例えばリウマチ様関
節炎(ＲＡ)のような慢性的炎症疾患の病原において重要である。
プチドサイトカインであって、免疫系Ｔ細胞の活性化への関与を含む様々な機能
を有している。ＩＬ−１はまた、軟骨損傷を引き起こし、軟骨からのプロテオグ
リカンの損失を招き、骨吸収を誘発し、炎症性であり、リンパ球の増殖因子とし
て作用し、走化因子(chemotactic factor)であり、多形核白血球の活性化可能物
質である。十分な密度で存在する場合、ＩＬ−１は、発熱、筋肉衰弱及び眠気を
生じる。ＩＬ−１は、炎症反応の中心的な伝達物質であり、例えばリウマチ様関
節炎(ＲＡ)のような慢性的炎症疾患の病原において重要である。
【００２９】
この融合蛋白質は、野生型ＰＰ１４と比べて顕著な向上をもたらすものであっ
て、この融合蛋白質は、野生型ＰＰ１４と異なり、それらの免疫阻害機能のため
にはα2−マクログロブリン(α2Ｍ)に依存しない。α2Ｍは、ＰＰ１４の主要な
血清坦体である。ＰＰ１４が最良の免疫学的機能を得るためにα2-Ｍの存在を必
要とするが、該融合蛋白質はα2-Ｍとは無関係に機能するから、例えば血清の存
在しない媒体の中でも機能する。従って、この融合蛋白質は、実験用ツールとし
て及び治療剤として、野生型ＰＰ１４よりも魅力がある。さらに、該融合蛋白質
は、α2Ｍが欠乏している炎症部位、例として炎症を起こした関節へ注射される
場合、野生型ＰＰ１４よりも治療用蛋白質として適している。
て、この融合蛋白質は、野生型ＰＰ１４と異なり、それらの免疫阻害機能のため
にはα2−マクログロブリン(α2Ｍ)に依存しない。α2Ｍは、ＰＰ１４の主要な
血清坦体である。ＰＰ１４が最良の免疫学的機能を得るためにα2-Ｍの存在を必
要とするが、該融合蛋白質はα2-Ｍとは無関係に機能するから、例えば血清の存
在しない媒体の中でも機能する。従って、この融合蛋白質は、実験用ツールとし
て及び治療剤として、野生型ＰＰ１４よりも魅力がある。さらに、該融合蛋白質
は、α2Ｍが欠乏している炎症部位、例として炎症を起こした関節へ注射される
場合、野生型ＰＰ１４よりも治療用蛋白質として適している。
【００３０】
本発明の望ましい実施例では、治療用融合蛋白質を、その蛋白質が必要な患者
へ投与することを含むが、別の理学治療では、本発明の融合蛋白質をエンコード
する遺伝子配列を、患者へ投与することを含む。「遺伝子配列」は、規定された
蛋白質及び関連する調節コード配列並びに他の非コード配列を含むポリヌクレオ
チドを意味する。ｃＤＮＡクローンの形態をした遺伝子配列は、遺伝子の多様な
配列について商業的に入手可能である。さらに、商業的及び他の供給源から容易
に入手できないｃＤＮＡクローンに関しては、それらのヌクレオチド配列の知識
を用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法により、適切な遺伝子配列をプラ
イマーへ組み入れて、それらのｃＤＮＡを再生産することは容易になし得る。こ
の遺伝子治療法が、治療薬を繰り返して投与することが必要な患者に対して特に
適しているのは、外因性(exogenous)遺伝子配列を患者の細胞へ組み込むことが
でき、それは次に蛋白質を内生的に生産するからである。
へ投与することを含むが、別の理学治療では、本発明の融合蛋白質をエンコード
する遺伝子配列を、患者へ投与することを含む。「遺伝子配列」は、規定された
蛋白質及び関連する調節コード配列並びに他の非コード配列を含むポリヌクレオ
チドを意味する。ｃＤＮＡクローンの形態をした遺伝子配列は、遺伝子の多様な
配列について商業的に入手可能である。さらに、商業的及び他の供給源から容易
に入手できないｃＤＮＡクローンに関しては、それらのヌクレオチド配列の知識
を用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法により、適切な遺伝子配列をプラ
イマーへ組み入れて、それらのｃＤＮＡを再生産することは容易になし得る。こ
の遺伝子治療法が、治療薬を繰り返して投与することが必要な患者に対して特に
適しているのは、外因性(exogenous)遺伝子配列を患者の細胞へ組み込むことが
でき、それは次に蛋白質を内生的に生産するからである。
【００３１】
当該分野において、治療薬を患者へ投与する方法は当業者にとって周知である
。これらの方法には、治療的遺伝子を送達するベクターの宿主、当該遺伝子へ添
付されることができる転写及び翻訳調節要素の宿主、これらベクターの生産及び
使用方法、遺伝子及びベクターを患者へ投与する方法及び、治療的遺伝子の有効
性及び毒性をモニターする方法が含まれる。望ましい実施例は、本発明のキメラ
蛋白質をエンコードする遺伝子配列の筋肉注射を含む。一旦、患者の筋肉細胞に
組み入れられると、エンコードされた蛋白質は生産され、全身に分泌される。自
己免疫治療のために、この様に筋肉内遺伝子治療を使用すことは、次の文献に記
載されている [Chang, "J.Gene Medicine", 1:415-423(1999) and Piccirillo,
"J.Immunology", 161:3950-3956(1998)]。他の実施例は、キメラ蛋白質をエンコ
ードする遺伝子配列を、病気の部位、例えば炎症を起こした関節のような炎症部
位へ直接的に注射することを含む。文献[Lubberts, "J.Immunology", 163:4546-
4556(1999)] には、実験動物のコラーゲン誘発性関節炎を治療するために、治療
的遺伝子を膝関節へ直接に関節内注射することを示している。
。これらの方法には、治療的遺伝子を送達するベクターの宿主、当該遺伝子へ添
付されることができる転写及び翻訳調節要素の宿主、これらベクターの生産及び
使用方法、遺伝子及びベクターを患者へ投与する方法及び、治療的遺伝子の有効
性及び毒性をモニターする方法が含まれる。望ましい実施例は、本発明のキメラ
蛋白質をエンコードする遺伝子配列の筋肉注射を含む。一旦、患者の筋肉細胞に
組み入れられると、エンコードされた蛋白質は生産され、全身に分泌される。自
己免疫治療のために、この様に筋肉内遺伝子治療を使用すことは、次の文献に記
載されている [Chang, "J.Gene Medicine", 1:415-423(1999) and Piccirillo,
"J.Immunology", 161:3950-3956(1998)]。他の実施例は、キメラ蛋白質をエンコ
ードする遺伝子配列を、病気の部位、例えば炎症を起こした関節のような炎症部
位へ直接的に注射することを含む。文献[Lubberts, "J.Immunology", 163:4546-
4556(1999)] には、実験動物のコラーゲン誘発性関節炎を治療するために、治療
的遺伝子を膝関節へ直接に関節内注射することを示している。
【００３２】
特に、トランスフェクトされた遺伝子の発現を調節するための誘導プロモータ
は、当該分野において知られており、これにより、エンコードされた蛋白質のレ
ベルを調節することができる。それらの誘導プロモータは、経口投与薬剤で調節
することができるので、本発明において特に有用である。本発明の遺伝子配列は
、肝臓、肺及び皮膚を含む他の器官へ送達されることができる。或いは、遺伝子
配列を、多くのトランスフェクション様式の中の任意の一つによって、エクスビ
ボで細胞内へ導入することもでき、これらのトランスフェクトされた細胞を、文
献[Tykocinski, "American Journal of Pathology", 148:1-16(1996)]で示され
るような当該分野で周知の方法によって、治療細胞として患者へ投与することが
できる。実験的変形性関節症を治療するために、この方法で治療的細胞としてト
ランスフェクトされた細胞を使用する方法は、文献[Pelletier, "Arthritis and
Rheumatism", 40:1012-1019(1997)]に記載されており、該文献では、トランス
フェクトされた滑膜細胞は患部の関節へ再び注入される 。これについては、文
献[Yasuda, "J. of Clinical Investigation", 102:1807-1814(1998)]の中でも
、トランスフェクトされた島細胞を用いた自己免疫性糖尿病の治療について記載
されている。
は、当該分野において知られており、これにより、エンコードされた蛋白質のレ
ベルを調節することができる。それらの誘導プロモータは、経口投与薬剤で調節
することができるので、本発明において特に有用である。本発明の遺伝子配列は
、肝臓、肺及び皮膚を含む他の器官へ送達されることができる。或いは、遺伝子
配列を、多くのトランスフェクション様式の中の任意の一つによって、エクスビ
ボで細胞内へ導入することもでき、これらのトランスフェクトされた細胞を、文
献[Tykocinski, "American Journal of Pathology", 148:1-16(1996)]で示され
るような当該分野で周知の方法によって、治療細胞として患者へ投与することが
できる。実験的変形性関節症を治療するために、この方法で治療的細胞としてト
ランスフェクトされた細胞を使用する方法は、文献[Pelletier, "Arthritis and
Rheumatism", 40:1012-1019(1997)]に記載されており、該文献では、トランス
フェクトされた滑膜細胞は患部の関節へ再び注入される 。これについては、文
献[Yasuda, "J. of Clinical Investigation", 102:1807-1814(1998)]の中でも
、トランスフェクトされた島細胞を用いた自己免疫性糖尿病の治療について記載
されている。
【００３３】
下記の実施例は、本発明を具体的に説明するためのものであって、決して、発
明を限定するものと解するべきでない。
明を限定するものと解するべきでない。
【００３４】実験１
ＰＰ１４・Ｆｃγ1融合蛋白質は、キメラｃＤＮＡ発現構造体を用いて生成さ
れたものであって、該構造体には、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３であるヒン
ジ(hinge)をエンコードする配列にフレーム結合された完全ヒトＰＰ１４コード
配列が組み入れられている。より具体的には、ヒトＰＰ１４ｃＤＮＡは、ポリメ
ラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、５'プライマー(５'−ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＴ
ＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣ−３')及び３'プライマー(５'−ＡＡＧＣＴＴＧＴ
ＧＡＡＡＣＧＧＣＡＣＧＧＣＴＣ−3')を用いて増幅された。５'プライマーは、
ＰＰ１４コード配列上流にＨｉｎｄIIIサイトを導入したが、一方、３'プライマ
ーは、停止コドンを消去し、下流端部にＨｉｎｄIIIサイトを導入した。ＰＰ１
４ＰＣＲフラグメントは、文献 [Brunschwig, et al. "Journal of Immunology"
, 155:5498(1995)] の方法によって、ｐＩｇＧ／ＲＥＰ７βベクターのＨｉｎｄ
IIIサイトへ結合され、発現プラスミドｐＰＰ１４・Ｆｃγ1／ＲＥＰ７βを生
成した。ヒト２９３胚腎臓細胞(American Type Culture Collection, Manassas,
VA)は、製造業者のプロトコルに従い、リポフェクチン(Gibco-BRL, Gaithersbu
rg, MD)を使用して、ｐＰＰ１４・Ｆｃγ1／ＲＥＰ７βでトランスフェクトされ
た。２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ(Calbiochem, La Jolla, CA)の中で
選択後、個々のコロニーを単離した。ハイグロマイシンＢ耐性クローンの調整済
み媒体(conditined media)について、ヒトＩｇＧ１に特異性のサンドイッチＥＬ
ＩＳＡ(The Binding Site Ltd., Birmighan, UK)により、キメラ蛋白質の分泌を
調べた。ｐＰＰ１４・Ｆｃγ1／ＲＥＰ７βでトランスフェクト施された２９３
細胞からの調整済みの媒体を用いて、蛋白質Ａアフィニティークロマトグラフィ
ーによる融合蛋白質の精製を行なった。ｐＰＰ１４・Ｆｃγ1の生産をスケール
アップするために、高レベルのＰＰ１４・Ｆｃγ1を発現するクローンを、２０
０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含有するウルトラカルチャー(Bio Whitake
r, Walkersville, MD)の中で増殖させた。ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、文献[Bauer, e
t al., "European Journal of Immunology", 27:1366(1977)]によって記載され
た他のＦｃ融合蛋白質のために使用された工程に従って、調整済み媒体から精製
した。簡単に説明すると、調整済み媒体及び同量のＦｃ結合緩衝液(３.０Ｍ塩化
ナトリウム、１.５Ｍグリシン、ｐＨ８.６)を、蛋白質Ａセファロース(Sigma)と
混合した。４℃で一晩中混合した後、マトリックスを収集し、１０カラム体積の
１００ｍＭクエン酸塩(ｐＨ５.０)で洗浄した。ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、ｐＨ３.
０の１００ｍＭクエン酸塩で、０.４体積の０.２Ｍリン酸ナトリウム(二塩基)に
溶出した。
れたものであって、該構造体には、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３であるヒン
ジ(hinge)をエンコードする配列にフレーム結合された完全ヒトＰＰ１４コード
配列が組み入れられている。より具体的には、ヒトＰＰ１４ｃＤＮＡは、ポリメ
ラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、５'プライマー(５'−ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＴ
ＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣ−３')及び３'プライマー(５'−ＡＡＧＣＴＴＧＴ
ＧＡＡＡＣＧＧＣＡＣＧＧＣＴＣ−3')を用いて増幅された。５'プライマーは、
ＰＰ１４コード配列上流にＨｉｎｄIIIサイトを導入したが、一方、３'プライマ
ーは、停止コドンを消去し、下流端部にＨｉｎｄIIIサイトを導入した。ＰＰ１
４ＰＣＲフラグメントは、文献 [Brunschwig, et al. "Journal of Immunology"
, 155:5498(1995)] の方法によって、ｐＩｇＧ／ＲＥＰ７βベクターのＨｉｎｄ
IIIサイトへ結合され、発現プラスミドｐＰＰ１４・Ｆｃγ1／ＲＥＰ７βを生
成した。ヒト２９３胚腎臓細胞(American Type Culture Collection, Manassas,
VA)は、製造業者のプロトコルに従い、リポフェクチン(Gibco-BRL, Gaithersbu
rg, MD)を使用して、ｐＰＰ１４・Ｆｃγ1／ＲＥＰ７βでトランスフェクトされ
た。２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ(Calbiochem, La Jolla, CA)の中で
選択後、個々のコロニーを単離した。ハイグロマイシンＢ耐性クローンの調整済
み媒体(conditined media)について、ヒトＩｇＧ１に特異性のサンドイッチＥＬ
ＩＳＡ(The Binding Site Ltd., Birmighan, UK)により、キメラ蛋白質の分泌を
調べた。ｐＰＰ１４・Ｆｃγ1／ＲＥＰ７βでトランスフェクト施された２９３
細胞からの調整済みの媒体を用いて、蛋白質Ａアフィニティークロマトグラフィ
ーによる融合蛋白質の精製を行なった。ｐＰＰ１４・Ｆｃγ1の生産をスケール
アップするために、高レベルのＰＰ１４・Ｆｃγ1を発現するクローンを、２０
０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含有するウルトラカルチャー(Bio Whitake
r, Walkersville, MD)の中で増殖させた。ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、文献[Bauer, e
t al., "European Journal of Immunology", 27:1366(1977)]によって記載され
た他のＦｃ融合蛋白質のために使用された工程に従って、調整済み媒体から精製
した。簡単に説明すると、調整済み媒体及び同量のＦｃ結合緩衝液(３.０Ｍ塩化
ナトリウム、１.５Ｍグリシン、ｐＨ８.６)を、蛋白質Ａセファロース(Sigma)と
混合した。４℃で一晩中混合した後、マトリックスを収集し、１０カラム体積の
１００ｍＭクエン酸塩(ｐＨ５.０)で洗浄した。ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、ｐＨ３.
０の１００ｍＭクエン酸塩で、０.４体積の０.２Ｍリン酸ナトリウム(二塩基)に
溶出した。
【００３５】ＰＰ１４・Ｆｃγ1の放射性ヨウ化(Radioiodination)
ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、ラクトペルオキシダーゼを触媒とするヨウ素化によっ
て、放射性同位体でラベル付けした。簡単に説明すると、１０μｇの蛋白質を、
１ｍＣｉのＮａ[125Ｉ](NEN Life Sciences,Boston,MA)及び３０ｍｕのラクトペ
ルオキシダーゼ(Calbiochem)と混合した。反応は、Ｈ2Ｏ2(４.２×１０-5％)を
添加することによって開始し、反応停止前の１５秒間、０.０５％アジ化ナトリ
ウムと５００ｍＭヨウ化カリウムで処理した。放射性同位体でラベル付けされた
蛋白質は、Ｇ−２５セファデックス(Pharmacia,Piscataway, NJ)にゲル濾過クロ
マトグラフィを行うことによって、遊離ヨウ素から分離した。カラム溶出緩衝液
は、０.０５％アジ化ナトリウム及び０.１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩
衝生理食塩水(ＰＢＳ)である。
て、放射性同位体でラベル付けした。簡単に説明すると、１０μｇの蛋白質を、
１ｍＣｉのＮａ[125Ｉ](NEN Life Sciences,Boston,MA)及び３０ｍｕのラクトペ
ルオキシダーゼ(Calbiochem)と混合した。反応は、Ｈ2Ｏ2(４.２×１０-5％)を
添加することによって開始し、反応停止前の１５秒間、０.０５％アジ化ナトリ
ウムと５００ｍＭヨウ化カリウムで処理した。放射性同位体でラベル付けされた
蛋白質は、Ｇ−２５セファデックス(Pharmacia,Piscataway, NJ)にゲル濾過クロ
マトグラフィを行うことによって、遊離ヨウ素から分離した。カラム溶出緩衝液
は、０.０５％アジ化ナトリウム及び０.１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩
衝生理食塩水(ＰＢＳ)である。
【００３６】免疫ブロット法
精製したＰＰ１４・Ｆｃγ1融合蛋白質と、ＰＰ１４及びヒトＩｇＧ１に特異
性のＡｂとの反応性を免疫ブロット法で試験した。蛋白質は、１０％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって分離して、文献[Fayen,et al., "International Immunology", 1
0:1347(1998)]に記載のとおり、ヒトＩｇＧ１及びｒＰＰ１４に特異性のＡｂで
プローブしたＰＶＤＦへ電気ブロッティングを行なった。免疫ブロット法は、Ｐ
ＢＳ−Ｔ(０.０５％トゥイーン２０が追加されたＰＢＳ)において、４％無脂肪
粉乳で一晩中ブロックした。Ｆｃドメインを検出するのに、ヒトＩｇＧ１(1:100
0; The Binding Site Ltd.)に特異性のホースラディシュペルオキシダーゼ(ＨＲ
Ｐ)で共役させた抗血清を使用した。ＰＰ１４の免疫ブロットは、ラビット抗Ｐ
Ｐ１４抗血清(1:3000)で実験し、次にＨＲＰで共役させたヤギの抗ラビットＡｂ
(1:3000; Bio-Rad, Hercus, CA)で実験した。ブロットは、増強された化学発光
分析試薬(DuPont-NEN, Boston, MA)により、像として現れた。
性のＡｂとの反応性を免疫ブロット法で試験した。蛋白質は、１０％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって分離して、文献[Fayen,et al., "International Immunology", 1
0:1347(1998)]に記載のとおり、ヒトＩｇＧ１及びｒＰＰ１４に特異性のＡｂで
プローブしたＰＶＤＦへ電気ブロッティングを行なった。免疫ブロット法は、Ｐ
ＢＳ−Ｔ(０.０５％トゥイーン２０が追加されたＰＢＳ)において、４％無脂肪
粉乳で一晩中ブロックした。Ｆｃドメインを検出するのに、ヒトＩｇＧ１(1:100
0; The Binding Site Ltd.)に特異性のホースラディシュペルオキシダーゼ(ＨＲ
Ｐ)で共役させた抗血清を使用した。ＰＰ１４の免疫ブロットは、ラビット抗Ｐ
Ｐ１４抗血清(1:3000)で実験し、次にＨＲＰで共役させたヤギの抗ラビットＡｂ
(1:3000; Bio-Rad, Hercus, CA)で実験した。ブロットは、増強された化学発光
分析試薬(DuPont-NEN, Boston, MA)により、像として現れた。
【００３７】
[125Ｉ]で標識された精製ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って分解し、オートラジオグラフィーによって検出した。図１Ａに示すように、
蛋白質製剤は、分子量約７０ｋＤａの単一の均質種で作られている。図１Ｂは、
精製されたＰＰ１４・Ｆｃγ1の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分解結果を示し
ており、レーン１及び３は、β−メルカプトエタノールと共にイモビロンＰ膜へ
移送されたもの、レーン２及び４は、β−メルカプトエタノールなしでイモビロ
ンＰ膜へ移送されたものである。膜は、ヒトＩｇＧ１に特異性のポリクローナル
Ａｂｓ(レーン１及び３)、又はＰＰ１４に特異的なポリクローナルＡｂｓ(レー
ン２及び４)でプローブし、次に化学発光によって検出した。図面に示すように
、Ａｂによる免疫反応は両方とも陽性であり、組換え蛋白質生成物のキメラ性質
が確認された。
って分解し、オートラジオグラフィーによって検出した。図１Ａに示すように、
蛋白質製剤は、分子量約７０ｋＤａの単一の均質種で作られている。図１Ｂは、
精製されたＰＰ１４・Ｆｃγ1の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分解結果を示し
ており、レーン１及び３は、β−メルカプトエタノールと共にイモビロンＰ膜へ
移送されたもの、レーン２及び４は、β−メルカプトエタノールなしでイモビロ
ンＰ膜へ移送されたものである。膜は、ヒトＩｇＧ１に特異性のポリクローナル
Ａｂｓ(レーン１及び３)、又はＰＰ１４に特異的なポリクローナルＡｂｓ(レー
ン２及び４)でプローブし、次に化学発光によって検出した。図面に示すように
、Ａｂによる免疫反応は両方とも陽性であり、組換え蛋白質生成物のキメラ性質
が確認された。
【００３８】
図２は、ＰＰ１４・Ｆｃγ1の精製の結果を示している。結果は、ＩｇＧ１ Ｅ
ＬＩＳＡユニット(ＯＤ450)としてプロットしている。点線と右側のＹ軸は、ス
ーパーデックス−２００ゲル濾過カラムで分離した後の、各フラクションで溶出
する分子の大きさを示す。球状蛋白質の分子量１４０−１６０ｋＤａに対応する
カラムフラクションで溶出したＰＰ１４・Ｆｃγ1は、２つの７０ｋＤａサブユ
ニットで構成される二量体錯体と一致する。
ＬＩＳＡユニット(ＯＤ450)としてプロットしている。点線と右側のＹ軸は、ス
ーパーデックス−２００ゲル濾過カラムで分離した後の、各フラクションで溶出
する分子の大きさを示す。球状蛋白質の分子量１４０−１６０ｋＤａに対応する
カラムフラクションで溶出したＰＰ１４・Ｆｃγ1は、２つの７０ｋＤａサブユ
ニットで構成される二量体錯体と一致する。
【００３９】Ｔ細胞増殖検定法
Ｔ細胞の増殖における組換え型ＰＰ１４・Ｆｃγ1と、野生型羊膜−ＰＰ１４
の効果を比較した。ヒトの末梢血幹単核球(ＰＢＭＣ)を、研究所の健康なボラン
ティアから入手し、フィコール−ヒパーク(Ficoll-Hypaque)密度勾配遠心法によ
って単離した。Ｔ細胞は、補体介在性欠乏(Complement-mediated depletion)(Ly
mpho-Kwik T. One Lambda, Canoga Park, CA)によって精製した。増殖を刺激す
るために、Ｔ細胞(１×１０5セル／μｌ well)は、異なる濃度の固相抗ＣＤ３ｍ
Ａｂ及び可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂの存在下、ＰＰ１４・Ｆｃγ1又はＡＦの存在
下又は不存在下で、完全なＲＰＭＩ又はＡＩＭ−Ｖ(Gibco-BRL)の中で培養した
。羊水中のＰＰ１４(ＡＦ)は、より高い刺激濃度での阻害は示さなかったが、用
量に依存する形でＴ細胞の増殖を阻害した。増殖を刺激するために、約１μｇ／
ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ(９.３；Bristol-Myers Squibbによって提供され
た)を加えた。蛋白質を、蛋白質Ａ−セファロース(Sigma Chemical Co., St. Lo
uis. MO)上に固定した。ＰＰ１４・Ｆｃγ1又はＡＦを下記のように添加した。
Ｔ細胞は、３７℃、５％ＣＯ2の加湿雰囲気の培養器内で、７２時間培養した。
細胞は、最後の１４乃至１８時間、[3Ｈ]−チミジン(２.５μＣｉ／ｍｌ)を用い
てパルスし、増殖を測定した。プレートを、ハーベスター９６(Tomtec,Orange,C
T)の中で採取し、取り込まれた[3Ｈ]を、１２０５ベータプレート(商標)(1205 B
etaplateTM)液体シンチレーションカウンタ (Wallac, Gaithesburg, MD)で分析
した。提示したデータは、少なくとも３つの実験を３回行なった代表例である。
の効果を比較した。ヒトの末梢血幹単核球(ＰＢＭＣ)を、研究所の健康なボラン
ティアから入手し、フィコール−ヒパーク(Ficoll-Hypaque)密度勾配遠心法によ
って単離した。Ｔ細胞は、補体介在性欠乏(Complement-mediated depletion)(Ly
mpho-Kwik T. One Lambda, Canoga Park, CA)によって精製した。増殖を刺激す
るために、Ｔ細胞(１×１０5セル／μｌ well)は、異なる濃度の固相抗ＣＤ３ｍ
Ａｂ及び可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂの存在下、ＰＰ１４・Ｆｃγ1又はＡＦの存在
下又は不存在下で、完全なＲＰＭＩ又はＡＩＭ−Ｖ(Gibco-BRL)の中で培養した
。羊水中のＰＰ１４(ＡＦ)は、より高い刺激濃度での阻害は示さなかったが、用
量に依存する形でＴ細胞の増殖を阻害した。増殖を刺激するために、約１μｇ／
ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ(９.３；Bristol-Myers Squibbによって提供され
た)を加えた。蛋白質を、蛋白質Ａ−セファロース(Sigma Chemical Co., St. Lo
uis. MO)上に固定した。ＰＰ１４・Ｆｃγ1又はＡＦを下記のように添加した。
Ｔ細胞は、３７℃、５％ＣＯ2の加湿雰囲気の培養器内で、７２時間培養した。
細胞は、最後の１４乃至１８時間、[3Ｈ]−チミジン(２.５μＣｉ／ｍｌ)を用い
てパルスし、増殖を測定した。プレートを、ハーベスター９６(Tomtec,Orange,C
T)の中で採取し、取り込まれた[3Ｈ]を、１２０５ベータプレート(商標)(1205 B
etaplateTM)液体シンチレーションカウンタ (Wallac, Gaithesburg, MD)で分析
した。提示したデータは、少なくとも３つの実験を３回行なった代表例である。
【００４０】
図３Ａ(上方の図)は、増量したＰＰ１４・Ｆｃγ1の存在下で、固相抗ＣＤ３
ｍＡｂ(４μｇ／ｍｌ)及び可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ(１μｇ／ｍｌ)を用いて、末
梢血Ｔ細胞を刺激した結果を示す。図３Ｂは、(下方の図)は、ＰＰ１４・Ｆｃγ 1 の増殖阻害(左の棒線)と、静脈ＣＴＬＡ−４・Ｆｃγ1の増殖阻害(右の棒線)と
を示す。[3Ｈ]−チミジンの取込み量によって増殖を評価し、蛋白質を加えなか
ったときのｃｐｍに対して、指示された蛋白質を加えた対照のｃｐｍを百分率(
％)で表している。ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、投与量に依存する形でＴ細胞の増殖を
阻害した。これに対し、同一のＦｃ配列を組み入れた対照融合蛋白質は、阻害効
果を示さなかった。これらのデータにより、ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、Ｔ細胞増殖
の陰性調節体として野生型ＰＰ１４を擬態することが確認された。
ｍＡｂ(４μｇ／ｍｌ)及び可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ(１μｇ／ｍｌ)を用いて、末
梢血Ｔ細胞を刺激した結果を示す。図３Ｂは、(下方の図)は、ＰＰ１４・Ｆｃγ 1 の増殖阻害(左の棒線)と、静脈ＣＴＬＡ−４・Ｆｃγ1の増殖阻害(右の棒線)と
を示す。[3Ｈ]−チミジンの取込み量によって増殖を評価し、蛋白質を加えなか
ったときのｃｐｍに対して、指示された蛋白質を加えた対照のｃｐｍを百分率(
％)で表している。ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、投与量に依存する形でＴ細胞の増殖を
阻害した。これに対し、同一のＦｃ配列を組み入れた対照融合蛋白質は、阻害効
果を示さなかった。これらのデータにより、ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、Ｔ細胞増殖
の陰性調節体として野生型ＰＰ１４を擬態することが確認された。
【００４１】実験２
α2−マクログロブリン調節に対するＰＰ１４・Ｆｃγ1の感受性の特徴付け
血清坦体蛋白質α2−マクログロブリン(α2Ｍ)は、プロテアーゼ阻害剤として
既に説明したが、ここでは、ＩＬ−２、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ及びＮＧＦなどの多
様な成長因子及びサイトカインを結合し活性化を調節する能力を調べるために用
いられる。α2Ｍは、野生型ＰＰ１４と結合し、それによってＰＰ１４の免疫阻
害活性化を可能にする。この実験では、α2Ｍもまた組換え型ＰＰ１４・Ｆｃγ1 に結合するかどうかを試験した。上記のように生成された125ＩラベルのＰＰ１
４・Ｆｃγ1を、精製されたヒトα2Ｍ(レーン２と３)又はメチレン活性化された
α2Ｍ(ＭＡ−α2Ｍ)(レーン５と６)の不存在下(図４、レーン１と４)又は存在下
で、３７℃にて３時間培養し、５％野生型ＰＡＧＥで分離した。ラベル付けされ
ていないＰＰ１４・Ｆｃγ1を過剰に加えても、移動パターンに影響を及ぼさな
かった(レーン３及び６)。図４に示すように、精製されたα2Ｍ或いはＭＡ−α2 Ｍのどちらに対しても、125Ｉ−ＰＰ１４・Ｆｃγ1の結合は検出されなかった。
矢印は、Coomassie Blue染色試薬によって決定されたα2Ｍの位置を示し、星印
は、遊離型ＰＰ１４・Ｆｃγ1の位置を示している。
既に説明したが、ここでは、ＩＬ−２、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ及びＮＧＦなどの多
様な成長因子及びサイトカインを結合し活性化を調節する能力を調べるために用
いられる。α2Ｍは、野生型ＰＰ１４と結合し、それによってＰＰ１４の免疫阻
害活性化を可能にする。この実験では、α2Ｍもまた組換え型ＰＰ１４・Ｆｃγ1 に結合するかどうかを試験した。上記のように生成された125ＩラベルのＰＰ１
４・Ｆｃγ1を、精製されたヒトα2Ｍ(レーン２と３)又はメチレン活性化された
α2Ｍ(ＭＡ−α2Ｍ)(レーン５と６)の不存在下(図４、レーン１と４)又は存在下
で、３７℃にて３時間培養し、５％野生型ＰＡＧＥで分離した。ラベル付けされ
ていないＰＰ１４・Ｆｃγ1を過剰に加えても、移動パターンに影響を及ぼさな
かった(レーン３及び６)。図４に示すように、精製されたα2Ｍ或いはＭＡ−α2 Ｍのどちらに対しても、125Ｉ−ＰＰ１４・Ｆｃγ1の結合は検出されなかった。
矢印は、Coomassie Blue染色試薬によって決定されたα2Ｍの位置を示し、星印
は、遊離型ＰＰ１４・Ｆｃγ1の位置を示している。
【００４２】実験３
ＰＰ１４・Ｆｃγ1のＴ細胞増殖阻害能力を、α2Ｍが存在しない条件で、直接
的に試験した。無血清状態の精製ヒトＴ細胞は、１２.５％羊水又は１２μｇＰ
Ｐ１４・Ｆｃγ1の存在下では、１０％ウシ胎仔血清を添加した場合と添加しな
かった場合のどちらの場合にも、固相抗ＣＤ３ｍＡｂ(２μｇ／ｍｌ)及び可溶性
抗ＣＤ２８ｍＡｂ(９.３、最終濃度１μｇ／ｍｌ)で刺激を示した。増殖は、実
験２に記載した要領で評価した。図５に示すように、(羊水中の)野生型ＰＰ１４
及びＰＰ１４・Ｆｃγ1は、血清存在中でＴ細胞の増殖を著しく阻害した。しか
しながら、血清が存在しない場合には、ＰＰ１４及びＰＰ１４・Ｆｃγ1の免疫
阻害能は様々であった。野生型ＰＰ１４のＴ細胞増殖阻害能力は、血清が存在し
ない場合飛躍的に減少する一方、ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、無血清状態、即ちα2Ｍ
が存在しない培養条件下でも、免疫阻害能力を保持した。総合すれば、これらの
データは、野生型ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、ＰＰ１４とは異なり、その免疫阻害機
能がα2Ｍに依存しないことを示す。データは、少なくとも３回の実験の代表例
であり、各実験はそれぞれ３回行なった。
的に試験した。無血清状態の精製ヒトＴ細胞は、１２.５％羊水又は１２μｇＰ
Ｐ１４・Ｆｃγ1の存在下では、１０％ウシ胎仔血清を添加した場合と添加しな
かった場合のどちらの場合にも、固相抗ＣＤ３ｍＡｂ(２μｇ／ｍｌ)及び可溶性
抗ＣＤ２８ｍＡｂ(９.３、最終濃度１μｇ／ｍｌ)で刺激を示した。増殖は、実
験２に記載した要領で評価した。図５に示すように、(羊水中の)野生型ＰＰ１４
及びＰＰ１４・Ｆｃγ1は、血清存在中でＴ細胞の増殖を著しく阻害した。しか
しながら、血清が存在しない場合には、ＰＰ１４及びＰＰ１４・Ｆｃγ1の免疫
阻害能は様々であった。野生型ＰＰ１４のＴ細胞増殖阻害能力は、血清が存在し
ない場合飛躍的に減少する一方、ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、無血清状態、即ちα2Ｍ
が存在しない培養条件下でも、免疫阻害能力を保持した。総合すれば、これらの
データは、野生型ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、ＰＰ１４とは異なり、その免疫阻害機
能がα2Ｍに依存しないことを示す。データは、少なくとも３回の実験の代表例
であり、各実験はそれぞれ３回行なった。
【００４３】
上記実施例は、ＰＰ１４及びＦｃ領域を含む組み換え型融合蛋白質を生成する
本発明の方法を明らかにするものである。融合蛋白質は、野生型ＰＰ１４と同様
な免疫調整方法にて、機能を遺伝子組み換えにより発現したものであって、故に
、野生型ＰＰ１４について報告されているような全ての免疫系障害の治療に役立
つものである。このＰＰ１４融合蛋白質は、α2Ｍが存在しない時にも機能する
能力を有しているので、より一層魅力的である。
本発明の方法を明らかにするものである。融合蛋白質は、野生型ＰＰ１４と同様
な免疫調整方法にて、機能を遺伝子組み換えにより発現したものであって、故に
、野生型ＰＰ１４について報告されているような全ての免疫系障害の治療に役立
つものである。このＰＰ１４融合蛋白質は、α2Ｍが存在しない時にも機能する
能力を有しているので、より一層魅力的である。
【００４４】
本発明の特定の実施例を例示の目的で上記に説明してきたが、当該分野の専門
家であれば、添付の請求の範囲に規定される発明から逸脱することなく、本発明
の詳細について数多くの変更をなし得ることは明らかであろう。
家であれば、添付の請求の範囲に規定される発明から逸脱することなく、本発明
の詳細について数多くの変更をなし得ることは明らかであろう。
【図１】
図１Ａ乃至１Ｂを含む図１は、実施例１の方法によって決定された、ＰＰ１４
・Ｆｃγ1融合蛋白質の免疫化学的性質の結果を示す図である。
・Ｆｃγ1融合蛋白質の免疫化学的性質の結果を示す図である。
【図２】
実施例１の方法によって決定されたＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡユニット対、各フラ
クションにおいて溶出する分子のフラクション回数及び分子量のプロットである
。
クションにおいて溶出する分子のフラクション回数及び分子量のプロットである
。
【図３】
実施例１の方法によって決定された如く、μｇで表したＰＰ１４・Ｆｃγ1蛋
白質に対するＴ細胞の増殖のプロット(図３Ａ)、及びＰＰ１４・Ｆｃγ1とＣＴ
ＬＡ−４・Ｆｃγ1の存在中の増殖をグラフに示している(図３Ｂ)。
白質に対するＴ細胞の増殖のプロット(図３Ａ)、及びＰＰ１４・Ｆｃγ1とＣＴ
ＬＡ−４・Ｆｃγ1の存在中の増殖をグラフに示している(図３Ｂ)。
【図４】
実施例２の方法によって決定された如く、ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、α2Ｍ又はＭ
Ａ−α2Ｍの何れとも結合しないことを示す図である。
Ａ−α2Ｍの何れとも結合しないことを示す図である。
【図５】
実施例１の方法によって決定された如く、ＰＰ１４・Ｆｃγ1は、その免疫阻
害機能がα2Ｍには依存しないことを示す図である。
害機能がα2Ｍには依存しないことを示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 5/16 Ａ６１Ｐ 11/06
11/06 17/00
17/00 17/06
17/06 19/02
19/02 25/00
25/00 29/00
29/00 35/00
35/00 35/02
35/02 37/02
37/02 37/06
37/06 37/08
37/08 43/00 １１１
43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 1/22
Ｃ０７Ｋ 1/22 14/47
14/47 16/18
16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ライリー，グレゴリー ジェイ．
アメリカ合衆国 44106 オハイオ，クリ
ーブランド ハイツ，オーバールック ロ
ード 2489，アパートメント 201
Ｆターム(参考） 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CC24
DA01 DA05 DA08
4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 CA53
DC50 MA13 MA52 MA56 MA60
MA63 MA66 ZA022 ZA592
ZA662 ZA752 ZA892 ZA962
ZB072 ZB082 ZB132 ZB262
ZB272 ZC062
4C085 AA25 AA26 BB11 BB42 DD62
GG02 GG03 GG08 GG10
4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA41
CA40 DA76 EA22 EA28 FA74
GA26
Claims (26)
- 【請求項１】 ＰＰ１４ポリペプチド配列を含む第１ドメインと、免疫グロ
ブリン蛋白質のＦｃ領域のポリペプチド配列を含む第２ドメインとを含む組換え
融合蛋白質。 - 【請求項２】 Ｆｃ領域は免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ領域である請求項
１の融合蛋白質。 - 【請求項３】 Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４
、ＩｇＭ及びＩｇＡで構成される群から選択される請求項１の融合蛋白質。 - 【請求項４】 Ｆｃ領域は、ヒト免疫グロブリン蛋白質からのマルチドメイ
ンＦｃ領域である請求項２の融合蛋白質。 - 【請求項５】 １又は２以上のエピトープタグ又はロイシンジッパーをさら
に含む請求項１の融合蛋白質。 - 【請求項６】 エピトープタグはポリヒスチジンタグである請求項６の融合
蛋白質。 - 【請求項７】 ＰＰ１４ポリペプチド配列をエンコードする第１ポリヌクレ
オチド配列を、免疫グロブリン蛋白質のＦｃ領域のポリペプチド配列をエンコー
ドする第２ポリヌクレオチド配列へ結合して、キメラのコード配列を生成するこ
と、 キメラのコード配列を発現ベクターへサブクローン化すること、 該発現ベクターで細胞をトランスフェクトすること、 トランスフェクトされた細胞により発現した融合蛋白質を精製すること、 とを含む請求項１の組み換え融合蛋白質を生成する方法。 - 【請求項８】 第２ポリヌクレオチド配列は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１
のマルチドメインＦｃ領域をエンコードする請求項７の方法。 - 【請求項９】 発現ベクターは、ウイルスベクター及び非ウイルスベクター
で構成される群から選択される請求項７の方法。 - 【請求項１０】 非ウイルスベクターはプラスミドである請求項９の方法。
- 【請求項１１】 非ウイルスベクターは、エプスタイン−バールウイルスエ
ピソーム型複製要素である請求項９の方法。 - 【請求項１２】 発現ベクターはｐＲＥＰ７βである請求項１１の方法。
- 【請求項１３】 精製は、蛋白質Ａ又は蛋白質Ｇアフィニティークロマトグ
ラフィーによって行われる請求項５の方法。 - 【請求項１４】 請求項１の組み換え融合蛋白質又は、請求項１の融合蛋白
質をエンコードする遺伝子配列を効果的な量で患者へ投与することによって、患
者の免疫系障害を治療する方法。 - 【請求項１５】 免疫系障害は、自己免疫性、同種免疫性、アレルギー性、
炎症性及びリンパ滲出性障害からなる群から選択される請求項１４の方法。 - 【請求項１６】 投与は、静脈注射、筋肉注射、関節内投与、経口投与、局
所投与、直腸投与及び吸入からなる群から選択された方法によって行われる請求
項１４の方法。 - 【請求項１７】 免疫系障害は、関節炎、喘息、移植片対宿主疾患、臓器拒
絶反応、全身性紅斑性狼瘡、アトピー性アレルギー、炎症性腸疾患、多発性硬化
症、全身性硬化症、アレルギー性皮膚炎、乾癬、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫
性肝疾患及びサルコイドーシスで構成される群から選択される請求項１４の方法
。 - 【請求項１８】 免疫系障害は、リウマチ様関節炎である請求項１４の方法
。 - 【請求項１９】 免疫系障害は、リンパ滲出性障害である請求項１４の方法
。 - 【請求項２０】 リンパ滲出性障害は、悪性非ホジキンリンパ腫、ホジキン
病及び悪性組織球増殖症で構成される群から選択される請求項１９の方法。 - 【請求項２１】 免疫系障害は、腫瘍性疾患である請求項１４の方法。
- 【請求項２２】 腫瘍性疾患は、白血病である請求項２１の方法。
- 【請求項２３】 効果的な量は、血中のＰＰ１４濃度を少なくとも０.１μ
Ｍ／Ｌにするのに必要な量である請求項１４の方法。 - 【請求項２４】 融合蛋白質は、薬学的に許容される坦体と混合して投与さ
れる請求項１４の方法。 - 【請求項２５】 請求項１の組み換え融合蛋白質又は請求項１の融合蛋白質
をエンコードする遺伝子配列を、インターロイキン−１の生成を阻害するのに効
果的な量で、患者へ投与することを含む、患者体内におけるインターロイキン−
１の生成を阻害する方法。 - 【請求項２６】 請求項１の組み換え融合蛋白質又は、請求項１の融合蛋白
質をエンコードする遺伝子配列を、該応答を阻害するのに効果的な量で、患者へ
投与することを含む、患者体内におけるＴＨ１サイトカイン応答を阻害する方法
。
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-
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