JP2003524578A5 - - Google Patents
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Description
【特許請求の範囲】
【請求項１】 抗微生物活性を有する、１０から２５のアミノ酸のドメインを含有するアミノ酸からなるペプチド（このドメインの半分についてのアミノ酸の過半数は正電荷アミノ酸であり、ドメインの残りの半分についてのアミノ酸の過半数は非電荷アミノ酸である）であって、ペプチドが下記配列：
ＫＲＬＦＫＥＬＫＫＳＬＲＫＹ （ペプチド５）
ＫＲＬＦＫＥＬＬＫＳＬＲＫＹ （ペプチド６）
ＯＯＬＦＯＥＬＯＯＳＬＯＯＹ （ペプチド７）
ＯＯＬＦＯＥＬＬＯＳＬＯＯＹ （ペプチド８）
ＫＲＬＦＫＫＬＫＦＳＬＲＫＹ （ペプチド９）
ＫＲＬＦＫＫＬＬＦＳＬＲＫＹ （ペプチド１０）
ＬＬＬＦＬＬＫＫＲＫＫＲＫＹ （ペプチド１１）
から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とするペプチド。
【請求項２】 Ｎ末端がアミド化された、請求項１の前文のペプチド。
【請求項３】 Ｎ末端がアミド化された、請求項１のペプチド。
【請求項４】 下記配列：
ＫＲＬＦＫＥＬＫＦＳＬＲＫＹ−アミド （ペプチド１２）
ＫＲＬＦＫＥＬＬＦＳＬＲＫＹ−アミド （ペプチド１３）
から選択された、請求項２または３のペプチド。
【請求項５】 Ｃ末端カルボン酸基が、アミド、エステル、ケトン、アルデヒド、アルコール基で置換された、請求項１の前文のペプチド。
【請求項６】 Ｃ末端カルボン酸基が、アミド、エステル、ケトン、アルデヒド、アルコール基で置換された、請求項１−４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】 請求項１の前文の２以上のペプチドのオリゴマー。
【請求項８】 請求項１−６に記載の２以上のペプチドのオリゴマー。
【請求項９】 下記配列：
ＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹＣ−ＣＹＧＲＨＳＨＨＫＥＨＦＫＲＫ（ペプチド１４）
ＹＧＲＨＳＨＨＫＥＨＦＫＲＫＣ−ＣＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹ（ペプチド１５）
αＮ,εＮ−（ＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹ）2Ｋ−アミド（ペプチド１６）
αＮ,εＮ−（ＫＲＬＦＫＥＬＫＦＳＬＲＫＹ）2Ｋ−アミド（ペプチド１７）
αＮ,εＮ−（ＫＲＬＦＫＫＬＫＦＳＬＲＫＹ）2Ｋ−アミド（ペプチド１８）
から選択された、請求項７または８のオリゴマー。
【請求項１０】 抗細菌剤としての使用のための、請求項１−９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１１】 抗真菌剤としての使用のための、請求項１−９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１２】 抗糸状菌剤としての使用のための、請求項１−９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１３】 細菌感染を処置する医薬の製造のための、請求項１−９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１４】 真菌感染を処置する医薬の製造のための、請求項１−９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１５】 酵母感染を処置する医薬の製造のための、請求項１−９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１６】 請求項１−９に記載の１以上のペプチドおよび１以上の適当な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１７】 噴霧、軟膏、ゲルまたはロゼンジの形態における、請求項１６の医薬組成物。
【請求項１】 抗微生物活性を有する、１０から２５のアミノ酸のドメインを含有するアミノ酸からなるペプチド（このドメインの半分についてのアミノ酸の過半数は正電荷アミノ酸であり、ドメインの残りの半分についてのアミノ酸の過半数は非電荷アミノ酸である）であって、ペプチドが下記配列：
ＫＲＬＦＫＥＬＫＫＳＬＲＫＹ （ペプチド５）
ＫＲＬＦＫＥＬＬＫＳＬＲＫＹ （ペプチド６）
ＯＯＬＦＯＥＬＯＯＳＬＯＯＹ （ペプチド７）
ＯＯＬＦＯＥＬＬＯＳＬＯＯＹ （ペプチド８）
ＫＲＬＦＫＫＬＫＦＳＬＲＫＹ （ペプチド９）
ＫＲＬＦＫＫＬＬＦＳＬＲＫＹ （ペプチド１０）
ＬＬＬＦＬＬＫＫＲＫＫＲＫＹ （ペプチド１１）
から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とするペプチド。
【請求項２】 Ｎ末端がアミド化された、請求項１の前文のペプチド。
【請求項３】 Ｎ末端がアミド化された、請求項１のペプチド。
【請求項４】 下記配列：
ＫＲＬＦＫＥＬＫＦＳＬＲＫＹ−アミド （ペプチド１２）
ＫＲＬＦＫＥＬＬＦＳＬＲＫＹ−アミド （ペプチド１３）
から選択された、請求項２または３のペプチド。
【請求項５】 Ｃ末端カルボン酸基が、アミド、エステル、ケトン、アルデヒド、アルコール基で置換された、請求項１の前文のペプチド。
【請求項６】 Ｃ末端カルボン酸基が、アミド、エステル、ケトン、アルデヒド、アルコール基で置換された、請求項１−４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】 請求項１の前文の２以上のペプチドのオリゴマー。
【請求項８】 請求項１−６に記載の２以上のペプチドのオリゴマー。
【請求項９】 下記配列：
ＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹＣ−ＣＹＧＲＨＳＨＨＫＥＨＦＫＲＫ（ペプチド１４）
ＹＧＲＨＳＨＨＫＥＨＦＫＲＫＣ−ＣＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹ（ペプチド１５）
αＮ,εＮ−（ＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹ）2Ｋ−アミド（ペプチド１６）
αＮ,εＮ−（ＫＲＬＦＫＥＬＫＦＳＬＲＫＹ）2Ｋ−アミド（ペプチド１７）
αＮ,εＮ−（ＫＲＬＦＫＫＬＫＦＳＬＲＫＹ）2Ｋ−アミド（ペプチド１８）
から選択された、請求項７または８のオリゴマー。
【請求項１０】 抗細菌剤としての使用のための、請求項１−９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１１】 抗真菌剤としての使用のための、請求項１−９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１２】 抗糸状菌剤としての使用のための、請求項１−９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１３】 細菌感染を処置する医薬の製造のための、請求項１−９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１４】 真菌感染を処置する医薬の製造のための、請求項１−９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１５】 酵母感染を処置する医薬の製造のための、請求項１−９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１６】 請求項１−９に記載の１以上のペプチドおよび１以上の適当な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１７】 噴霧、軟膏、ゲルまたはロゼンジの形態における、請求項１６の医薬組成物。
本発明の目的は、上記の欠点を有さないで、かつ推奨される必要条件をできるだけ含有するような、新規抗菌剤および抗真菌剤の提供である。
ペプチド１４および１５は、ペプチド２の追加Ｃ末端毎Ｎ末端システインとの合成によって得られ、その後にオリゴマーが空気酸化で得られる。ペプチド１６、１７および１８は、多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）方式を用いて得られ、α−およびε−アミノ酸の両方上にＦｍｏｃ保護を有するリシンを合成樹脂上の第１アミノ酸として用い、それによって２つの同一のアミノ酸鎖（ペプチド２、３、９）が１つのリシン分子上で同時に合成された。
本明細書に記載のペプチドは、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）などの生理学的緩衝液中で溶血活性をほとんどまたはまったく有さない。ヒト臓器の赤血球に対する低い活性は毒性が低いことの指標である。この選択性は、これらのペプチドを抗生物質として使用するのに必須である。
表１は、上記の方法で生成したペプチド２〜１３の全体像である。この表においてペプチド１および２は、それぞれヒスタチン５およびそのＣ−末端部を示している。太字のアミノ酸はペプチド２と対比したときの変化である。
実施例 ２
インビトロ単独培養に対する抗菌活性
ストレプトコッカス・ミュータント(Streptococcus mutants)(R9)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguis)(SB179)、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)(SS196)、アクチノミセス・ネスルンド(Actinomyces naeslundii)(WVU627)、フソバクテリウム・ヌクレアツム(Fusobacterium nucleatum)(ATCC 10953)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)(T588)、ベイヨネラ・パルブラ(Veillonella parvula)(ATCC 17745)等の単独培養菌を、脳心臓浸出液（ＢＨＩ）（Difco）中で後期対数期間培養し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＰＢ）中で３度洗って、懸濁度を１０6ＣＦＵ／ｍｌまでに希釈した。この懸濁液２５０μｌをポリプロピレン Eppendorf cups(Costar)中に混合し、その混合液を本発明の抗微生物性ペプチド溶液２５０μｌと混合して２倍にし（最終ペプチド濃度は１００μg/ｍｌであった）、好気性環境下、３０分間、３７℃で培養した。対照の処置はペプチドのない１０ｍＭＰＰＢで実行した。
インビトロ単独培養に対する抗菌活性
ストレプトコッカス・ミュータント(Streptococcus mutants)(R9)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguis)(SB179)、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)(SS196)、アクチノミセス・ネスルンド(Actinomyces naeslundii)(WVU627)、フソバクテリウム・ヌクレアツム(Fusobacterium nucleatum)(ATCC 10953)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)(T588)、ベイヨネラ・パルブラ(Veillonella parvula)(ATCC 17745)等の単独培養菌を、脳心臓浸出液（ＢＨＩ）（Difco）中で後期対数期間培養し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＰＢ）中で３度洗って、懸濁度を１０6ＣＦＵ／ｍｌまでに希釈した。この懸濁液２５０μｌをポリプロピレン Eppendorf cups(Costar)中に混合し、その混合液を本発明の抗微生物性ペプチド溶液２５０μｌと混合して２倍にし（最終ペプチド濃度は１００μg/ｍｌであった）、好気性環境下、３０分間、３７℃で培養した。対照の処置はペプチドのない１０ｍＭＰＰＢで実行した。
実施例 ３
増殖の抑制
カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)およびトルロプシス・グラブラータ(Torulopsis glabrata)等の酵母菌、およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus）(MRSA) を寒天の上で増殖させて試験した。本発明の各ペプチド10μgを寒天の上に斑点状に置いた。表３はその結果を示す。「＋」は増殖を完全に抑制、「＋／−」は部分的に抑制、「−」は抑制なしを示す。
増殖の抑制
カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)およびトルロプシス・グラブラータ(Torulopsis glabrata)等の酵母菌、およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus）(MRSA) を寒天の上で増殖させて試験した。本発明の各ペプチド10μgを寒天の上に斑点状に置いた。表３はその結果を示す。「＋」は増殖を完全に抑制、「＋／−」は部分的に抑制、「−」は抑制なしを示す。
実施例 ５
酵母の殺菌
５＊１０6のカンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans) １０２３１、クリプトコックス・ネオホルマンス(Cryptococcus neoformans)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans) ３２３５４および、そのエルゴステロール欠損変異体を、リン酸カリウム緩衝液１ｍＭ、ｐＨ7.0中の、本発明のペプチドの希釈系の存在下あるいは抗真菌抗生物質アンフォテリシンＢの存在下で、３０分、３７℃で培養した。生存能力を平板培養で確認した。正対照として使用したのは、合成ＰＧＬａ(“Protein beginning with Glycine and ending with Leucin-amide”、アミノ酸配列ＧＭＡＳＫＧＡＩＡＧＫＩＡＫＶＡＬＫＡＬ−アミドを有する）であった。負対照は、合成シスタチンＳ（ＳＳＳＫＥＥＮＲＩＩＰＧＧＩ）の残基１〜１４を含むペプチドであった。アンフォテリシンＢは既知の抗真菌剤である。しかし、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の変異体（菌種 ３２３５４）はその細胞膜にエルゴステロールを有せず、アンホテルシン Ｂに対して耐性を有するものがある。ＩＣ50値は、接種材料の５０％が殺されるペプチド濃度である。表５はその結果を示す。
酵母の殺菌
５＊１０6のカンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans) １０２３１、クリプトコックス・ネオホルマンス(Cryptococcus neoformans)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans) ３２３５４および、そのエルゴステロール欠損変異体を、リン酸カリウム緩衝液１ｍＭ、ｐＨ7.0中の、本発明のペプチドの希釈系の存在下あるいは抗真菌抗生物質アンフォテリシンＢの存在下で、３０分、３７℃で培養した。生存能力を平板培養で確認した。正対照として使用したのは、合成ＰＧＬａ(“Protein beginning with Glycine and ending with Leucin-amide”、アミノ酸配列ＧＭＡＳＫＧＡＩＡＧＫＩＡＫＶＡＬＫＡＬ−アミドを有する）であった。負対照は、合成シスタチンＳ（ＳＳＳＫＥＥＮＲＩＩＰＧＧＩ）の残基１〜１４を含むペプチドであった。アンフォテリシンＢは既知の抗真菌剤である。しかし、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の変異体（菌種 ３２３５４）はその細胞膜にエルゴステロールを有せず、アンホテルシン Ｂに対して耐性を有するものがある。ＩＣ50値は、接種材料の５０％が殺されるペプチド濃度である。表５はその結果を示す。
実施例 ８
殺菌におけるペプチド１０およびヒスタチン５の比較
クレブシエラ(Klebsiella)(ＡＴＣＣ ４３８１６)およびシュードモナス・エルキノーサ(Pseudomonas aeruqinosa)(PA01, 臨床単離)の１０6細菌を１時間３７℃で、１％トリプシン・豆・肉汁培養基（ｐH7.4）を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で、25または50μg／mlのヒスタチン５、3.12、6.25、12.5、25または50μg／mlのペプチド１０、10μg／ｍｌのプロテグリン（正対照）、50μg／mlのペプチド４またはペプチド非含有（両者は負対照）の存在下で培養した。さらに含まれるのは、１時間、３７℃で培養されなかったブランクである（ｔ＝０分）。次に、各標本のコロニー形成ユニットをＤＳＴ(診断感性試験)による平板培養法によって確認した。
殺菌におけるペプチド１０およびヒスタチン５の比較
クレブシエラ(Klebsiella)(ＡＴＣＣ ４３８１６)およびシュードモナス・エルキノーサ(Pseudomonas aeruqinosa)(PA01, 臨床単離)の１０6細菌を１時間３７℃で、１％トリプシン・豆・肉汁培養基（ｐH7.4）を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で、25または50μg／mlのヒスタチン５、3.12、6.25、12.5、25または50μg／mlのペプチド１０、10μg／ｍｌのプロテグリン（正対照）、50μg／mlのペプチド４またはペプチド非含有（両者は負対照）の存在下で培養した。さらに含まれるのは、１時間、３７℃で培養されなかったブランクである（ｔ＝０分）。次に、各標本のコロニー形成ユニットをＤＳＴ(診断感性試験)による平板培養法によって確認した。
実施例 ９
カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)殺菌について相違培養時間におけるペプチド１０およびヒスタチン５の比較
１０6カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を１時間あるいは３時間、３７℃で、１％サブロー(Sabouraud)(ｐＨ7.4)の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で、25、50または100μg／mlのヒスタチン５、3.12、6.25、12.5、25、50または100μg／ｍｌのペプチド１０、10μg／mlのプロテグリン(正対照)、50μg／mlのペプチド４またはペプチド非含有（両者は負対照）の存在下で培養した。さらに含まれるのは、１時間、３７℃で培養されなかったブランクである（ｔ＝０分）。次に、各標本のコロニー形成ユニットを上記のサブロー平板培養で確認した。
カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)殺菌について相違培養時間におけるペプチド１０およびヒスタチン５の比較
１０6カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を１時間あるいは３時間、３７℃で、１％サブロー(Sabouraud)(ｐＨ7.4)の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で、25、50または100μg／mlのヒスタチン５、3.12、6.25、12.5、25、50または100μg／ｍｌのペプチド１０、10μg／mlのプロテグリン(正対照)、50μg／mlのペプチド４またはペプチド非含有（両者は負対照）の存在下で培養した。さらに含まれるのは、１時間、３７℃で培養されなかったブランクである（ｔ＝０分）。次に、各標本のコロニー形成ユニットを上記のサブロー平板培養で確認した。
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