JP2003524578A

JP2003524578A - 抗微生物性ペプチド

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Publication number: JP2003524578A
Application number: JP2000528598A
Authority: JP
Inventors: アリー・ファン・ニーウ・アメロンヘン; エンゲルムンドゥス・コルネリス・イグナティウス・フェールマン; ウィレム・ファント・ホフ; エーファ・ヨセフィーネ・ヘルメルホルスト
Original assignee: スティヒティング・フォール・デ・テヒニシェ・ウェテンシャペン
Priority date: 1998-01-27
Filing date: 1999-01-26
Publication date: 2003-08-19
Also published as: DE69920877T2; AU759026B2; NL1008139C2; WO1999037678A3; ATE278710T1; DE69920877D1; ES2229669T3; WO1999037678A2; EP1051433A2; AU2301499A; CA2319094A1; CA2319094C; US6638531B1; EP1051433B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、抗微生物活性を有する、１０から２５のアミノ酸のドメインを含有するアミノ酸からなるペプチドに関する。このドメインの半分についてのアミノ酸の過半数は正電荷アミノ酸であり、ドメインの残りの半分についてのアミノ酸の過半数は非電荷アミノ酸である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、抗微生物活性を有する新規のペプチドに関する。この抗微生物活性
が特に目標とするのは、細菌、真菌、酵母である。

【０００２】既知の抗生物質の使用において、感染の処置にもはや十分でない事例が増加し
ている。多くの細菌株が既知の類の抗生物質に対して耐性を有するようになり、
この３０年間に新しい類の抗生物質が見つかっていない。このことからして、新
しい類の抗微生物剤が非常に望まれるところである。アルカリ性のペプチドおよ
びタンパク質が、インビトロで殺菌および殺真菌の活性を有する唾液中に存在し
ている。ヒスタチンは、かかる唾液ペプチドの既知ファミリーを形成する。しか
し、臨床的に適用可能となるために望まれるのは、抗微生物活性がさらに高いこ
とである。高い活性は、多かれ少なかれ起きる薬剤のタンパク質分解性の減成を
償う。さらに、天然に生じるペプチドに関するタンパク質分解性減成の低下が望
ましい。最後に、ペプチドの生産に関する経済的観点からして、推奨されるのは
、抗微生物剤が比較的小さいことである。

【０００３】本発明の目的は、上記の欠点を有さないで、かつ推奨される必要条件をできる
だけ含有するような、アミノ酸鎖からなるペプチドの提供である。

【０００４】このような目的の本発明による達成は、１０から２５のアミノ酸のドメインか
らなるペプチドによりなされる。このドメインの半分についてのアミノ酸の過半
数は正電荷アミノ酸であり、残りの半分の過半数は非電荷アミノ酸である。

【０００５】これらのペプチドの構造は種々の変化を有する。第一に、ドメインはα−ヘリ
ックスを形成でき、その部位１、２、５、６、９（１２、１３，１６，１９、２
０、２３、２４）の少なくとも過半数が正電荷アミノ酸を含有し、部位８が正電
荷または非電荷のアミノ酸であり、部位３、４、７、１０（１１、１４、１５、
１７、１８、２１、２２、２５）の少なくとも過半数が非電荷アミノ酸である。
これらのペプチドは、片側両親媒性、すなわち１００°で最大疎水性モーメント
を有する。簡単に述べると、これらのペプチドは、左側が疎水性であり、右側が
親水性であり、またはその逆である。これらのペプチドを本明細書では“Ｉ型”
と呼ぶ。

【０００６】ドメインは別のα−ヘリックスを形成でき、その部位１、２、５、６、９（１
２、１３，１６，１９、２０、２３、２４）の少なくとも過半数が非電荷アミノ
酸を含有し、部位８が正電荷または非電荷のアミノ酸であり、部位３、４、７、
１０（１１、１４、１５、１７、１８、２１、２２、２５）の少なくとも過半数
が正電荷アミノ酸である。これらのペプチドは、片側両親媒性、すなわち１００
°で最大疎水性モーメントを有する。簡単に述べると、これらのペプチドは、右
側が疎水性であり、左側が親水性であり、またはその逆である。これらのペプチ
ドは、本明細書では“II型”と呼び、原則的にＩ型ペプチドに対し鏡対称形であ
る。

【０００７】ドメインはさらに別のα−ヘリックスを形成でき、その部位１から６（または
７または８または９または１０または１１または１２）の少なくとも過半数が非
電荷アミノ酸を含有し、正電荷アミノ酸が部位７（または８または９または１０
または１１または１２または１３）から２５に存在する。これらのペプチドは、
縦の片側両親媒性、すなわち１００°で最小疎水性モーメントを有する。これら
のペプチドは、その“上部”で疎水性であり、その“下部”で親水性である。こ
れらのペプチドを“III型”と名付ける。

【０００８】逆に、ドメインはα−ヘリックスを形成でき、その部位１から６（または７ま
たは８または９または１０または１１または１２）の少なくとも過半数が正電荷
アミノ酸を含有し、非電荷アミノ酸が部位７（または８または９または１０また
は１１または１２または１３）から２５に存在する。これらのペプチドは同様に
、縦の片側両親媒性、すなわち１００°で最小疎水性モーメントを有する。これ
らのペプチドは、その“上部”で親水性であり、その“下部”で疎水性である。
これらのペプチドを“IV型”と名付ける。

【０００９】最後に、ドメインは、いわゆるβ鎖を形成し、正電荷アミノ酸を部位１、３、
５、７、９（１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５）の少なくとも
過半数に、および非電荷アミノ酸を部位２，４、６、８、１０（１２、１４、１
６、１８、２０、２２、２４）の少なくとも過半数に含有できる。このようなβ
鎖は、片側両親媒性であり、１８０°で最大疎水性モーメントを有する。β鎖構
造は、αヘリックスよりも平面的であり、簡単に言うと、左側が疎水性であり、
右側が親水性であり、またはその逆である。これらは“Ｖ型”である。

【００１０】正電荷アミノ酸の好ましい選択は、オルニチン（Ｏ）、リシン（Ｋ）、アルギ
ニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）よりなる群からなされ、一方、非電荷アミノ
酸の好ましい選択は、脂肪族アミノ酸、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリ
ン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、両極側鎖を有するアミノ酸、
メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、ト
レオニン（Ｔ）、芳香族側鎖を有するアミノ酸、フェニルアラニン（Ｆ）、チロ
シン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）よりなる群からなされる。親油性と親水性と
の境界上のアミノ酸の選択は、両群から、または残りのアミノ酸からできる。

【００１１】活性の相違が原則的にほとんど検出できないのは、正電荷アミノ酸の１つおよ
び／または非電荷アミノ酸の１つがランダムアミノ酸で置換されているときであ
る。従って、正電荷アミノ酸の過半数は、好ましくは正電荷アミノ酸の全数から
引く１であり、非電荷アミノ酸の過半数は、好ましくは非電荷アミノ酸の全数か
ら引く１である。

【００１２】ドメインは、より大きいペプチドの一部分であり得るが、それ自体で全ペプチ
ドを形成することもできる。ドメインがより大きいペプチド部分を形成している
とき、Ｃ末端および／またはＮ末端のアミノ酸が追加的に存在してランダムアミ
ノ酸となり得る。

【００１３】Ｉ型について次のペプチドが特に推奨される。ＫＲＬＦＫＥＬＫＦＳＬＲＫＹ（ペプチド３）ＫＲＬＦＫＥＬＬＦＳＬＲＫＹ（ペプチド４）ＫＲＬＦＫＥＬＫＫＳＬＲＫＹ（ペプチド５）ＫＲＬＦＫＥＬＬＫＳＬＲＫＹ（ペプチド６）ＯＯＬＦＯＥＬＯＯＳＬＯＯＹ（ペプチド７）ＯＯＬＦＯＥＬＬＯＳＬＯＯＹ（ペプチド８）ＫＲＬＦＫＫＬＫＦＳＬＲＫＹ（ペプチド９）ＫＲＬＦＫＫＬＬＦＳＬＲＫＹ（ペプチド１０）

【００１４】 III型についての好ましいペプチドは、次のアミノ酸配列を有す。ＬＬＬＦＬＬＫＫＲＫＫＲＫＹ（ペプチド１１）

【００１５】本発明のペプチドはさらに修飾を含有し得る。この修飾は、例えば、Ｎ末端ア
ミド環、酢酸無水物の保持、Ｃ末端が修飾される合成樹脂の代替開裂などである
。後者については、Ｃ末端のカルボン酸がアミド、エステル、ケトン、アルデヒ
ド、アルコール基で置換される。このような修飾を有するペプチドは、例えば、
次の通りである。ＫＲＬＦＫＥＬＫＦＳＬＲＫＹ−アミド（ペプチド１２）ＫＲＬＦＫＥＬＬＦＳＬＲＫＹ−アミド（ペプチド１３）

【００１６】単一のペプチドに加えて、オリゴマーもつくることができる。好ましくは、本
発明のペプチドについては直線状のオリゴマーである。カップリングを、ヘッド
とヘッド、テイルとテイル、ヘッドとテイルで、直接合成的または合成後酵素的
になすことができる。膜貫通性細孔の形成について、最小ペプチド長を必要とす
る。本発明のペプチドのオリゴマーは、２倍の長さであることにより、細菌細胞
膜の全リン脂質二重層に原則的にうまく及び得る。このためにペプチドの活性が
さらに改善される。追加的に、ペプチドの伸張がヘリックスの立体配座を安定に
する。スペーサーを通常は挿入する。ヘッドとテイルでの結合オリゴマーの直接
合成において、スペーサーを挿入して、適正な長さの非天然型アミノ酸、例えば
、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸などの鎖を使用して大
きさを調整できる。ヘテロ２機能カップリング試薬は、担体タンパク質にペプチ
ド抗体をカップリングするために市販されており（例えば、１−エチル−３−［
３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）、ｍ−マレイミドベン
ゾイル）−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド・エステル（ＭＢＳ）、Ｎ−サクシニミ
ジル−３−［ピリジルジチオ］プロピオネート（ＳＰＤＤ）など）、これらを用
いて直線オリゴマーを挿入スペーサーでつくる。ヘッドとヘッドおよびテイルと
テイルのカップリングには３価アミノ酸、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）、グル
タミン酸（Ｅ）、オルニチン（Ｏ）、リシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、システイン
が使用される。オリゴマーの例は次の通りである。

【００１７】ＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹＣ−ＣＹＧＲＨＳＨＨＫＥＨＦＫＲＫ（ペプチ
ド１４）ＹＧＲＨＳＨＨＫＥＨＦＫＲＫＣ−ＣＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹ（ペプチ
ド１５） ^αＮ,^εＮ−（ＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹ）₂Ｋ−アミド（ペプチド１６） ^αＮ,^εＮ−（ＫＲＬＦＫＥＬＫＦＳＬＲＫＹ）₂Ｋ−アミド（ペプチド１７） ^αＮ,^εＮ−（ＫＲＬＦＫＫＬＫＦＳＬＲＫＹ）₂Ｋ−アミド（ペプチド１８）

【００１８】ペプチド１４および１５は、ペプチド２の追加Ｃ末端毎Ｎ末端システインとの
合成によって得られ、その後にオリゴマーが空気酸化で得られる。ペプチド１６
、１７および１８は、多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）方式を用いて得られ、α−お
よびε−アミノ酸の両方上にＦｍｏｃ保護を有するリシンを合成樹脂上の第１ア
ミノ酸として用い、それによって２つの同一のアミノ酸鎖（ペプチド２、３、９
）が１つのリシン分子上に自動的に合成された。

【００１９】本明細書に記載のペプチドは、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）などの緩衝液中で溶血
活性をほとんどまたはまったく有さない。ヒト臓器の赤血球に対する低い活性は
毒性が低いことの指標である。この選択性は、これらのペプチドを抗生物質とし
て使用するのに必須である。

【００２０】本発明のペプチドは、抗細菌剤においてまたは抗細菌剤として、抗真菌剤にお
いてまたは抗真菌剤として、または酵母感染に対する薬剤として使用できる。そ
の活性は添付の実施例にさらに示す。

【００２１】従って、本発明はさらに、抗細菌剤としての使用、抗真菌剤としての使用およ
び抗糸状菌剤としての使用のためのペプチドに関する。

【００２２】また、本発明は、細菌感染の処置のための医薬の製造、および真菌感染および
／または酵母感染の処置のための医薬の製造にペプチドを使用することに関する
。

【００２３】本発明のペプチドは、種々の医薬形態での投与に使用できる。特に推奨される
のは、噴霧、軟膏、ゲル、ロゼンジである。これらの投与形態を用いて、口腔や
皮膚または家畜や食品におけるカンジダなどの酵母、細菌および真菌を制御する
のに使用できる。

【００２４】本発明はさらに添付の実施例に示す。実施例は単に説明のために提示されるの
であって、いかなる場合でも本発明を限定するものでない。

【００２５】実施例実施例１ペプチドの合成本発明によるペプチドを、Van 't Hof et al. (1991) およびHelmerhorst et
al.(1997) らの記述にしたがって化学合成した。ペプチドはＴバッグ法を使用し
て、ｐ−フルオレニルメトキシカルボニル（（Fmoc）chemistry）に適合させて
合成した。ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂は、Ｎ−Ｆｍｏｃ保護ア
ミノ酸との結合を最初にすませておき、Ｔ−バッグ中で調整した。カップリング
反応をN，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で行った。アミノ酸連鎖の完成の後に、
それを樹脂から開裂せしめて、同時に側鎖保護基を５％のチオアニソール、５％
のフェノール、５％の水、８５％のトリフルオロ酢酸の混合液で除去した。純度
分析は、逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して行った。わずかの数種の汚
染物質（５％以下）を含むにすぎない１つの単一ピークがあった。

【００２６】すべてのペプチドを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＰＢ）、ｐＨ7.0に
濃度２ｍｇ／ｍｌまで溶解し、−８０℃で貯蔵した。貯蔵液の最終ｐＨは6.0で
あった。抗菌性検定において使用する厳密なペプチド濃度は、アミノ酸分析によ
って測定した。

【００２７】表１は、上記の方法で生成したペプチド２〜１３の全体像である。この表にお
いてペプチド１および２は、それぞれヒスタチン５およびそのＣ−末端部を示し
ている。ゴシック体文字のアミノ酸はペプチド２と対比したときの変化である。

【００２８】実施例２インビトロ単独培養に対する抗菌活性ストレプトコッカス・ミュータント(Streptococcus mutants)(R9)、ストレプ
トコッカス・サンギス(Streptococcus sanguis)(SB179)、ストレプトコッカス・
サリバリウス(Streptococcus salivarius)(SS196)、アクチノミセス・ネスルン
ド(Actinomyces naeslundii)(WVU627)、フソバクテリウム・ヌクレアツム(Fusob
acterium nucleatum)(ATCC 10953)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella
intermedia)(T588)、ベイヨネラ・パルブラ(Veillonella parvula)(ATCC 17745
)等の単独培養菌を、脳心臓浸出液（ＢＨＩ）（Difco）中で後期対数期間培養し
、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＰＢ）中で３度洗って、懸濁度を１０⁶
ＣＦＵ／ｍｌまでに希釈した。この懸濁液２５０ｍｌをポリプロピレン Eppendo
rf cups(Costar)中に混合し、その混合液を本発明の抗微生物性ペプチド溶液２
５０μlと混合して２倍にし（最終ペプチド濃度は１００μlであった）、好気性
環境下、３０分間、３７℃で培養した。対照の処置はペプチドのない１０ｍＭＰ
ＰＢで実行した。

【００２９】培養の終了後、標本を遠心分離して上澄み液４００μlを除去し、それにＰＢ
Ｓ４００μl（９ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ7.0、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液）
をペプチド不活性の状態で加えた。標本をさらにＰＢＳ中で希釈して、１０倍希
釈液50μlおよび1000倍希釈液50μlを血液寒天培養地（Difco）上で平板培養し
て、生存能を計数した。

【００３０】試験の結果を表２に示す。この表によると、本発明のペプチドは、天然に生じ
るヒスタチン５より明らかに高い活性を有する。

【表１】

【表２】 ¹ 緩衝液による処理は、殺菌率0.00％で正常とした。平均値からの標準偏差はカ
ッコ内の数字で表わす。^* 投与緩衝液のみの標本より有意に高い殺菌力。

【００３１】実施例３増殖の抑制カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)およびトルロプシス・グラブラー
タ(Torulopsis glabrata)等の酵母菌、およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（m
ethicillin-resistant Staphylococcus aureus）(MRSA) を寒天の上で増殖させ
て試験した。本発明の各ペプチド10μlを寒天の上に斑点状に置いた。表３はそ
の結果を示す。「＋」は増殖を完全に抑制、「＋／−」は部分的に抑制、「−」
は抑制なしを示す。

【表３】

【００３２】実施例４乳酸産生の抑制本発明のすべてのペプチドについて、細菌の乳酸産生を抑制する能力を試験し
た。細菌は、ストレプトコックス・サンギス(Streptococcus sanguis)、ストレ
プトコックス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコックス・サ
リバリウス(Streptococcus salivarius)、ラクトバシルス・ラムノーサス(Lacto
basillus rhamnosus)である。乳酸形成は代謝活性の尺度である。

【００３３】この試験のために、菌細胞の培養基を0.5グルコースおよび種々の濃度ペプチ
ドを加えたＰＰＢ１０ｍＭ中で１時間培養した。乳酸の形成をスペクトル光度測
定法でモニターした。表４はその結果を示す。「＋」は４〜２０μg／mlペプチ
ドで完全に抑制したことを示し、「−」は１００μg／ml以下ペプチドで乳酸形
成の抑制が認められなかったことを表わす。

【表４】

【００３４】実施例５酵母の殺菌５＊１０⁶のカンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)、
カンジダ・アルビカンス(Candida albicans) １０２３１、クリプトコックス・
ネオホルマンス(Cryptococcus neoformans)、カンジダ・クルセイ(Candida krus
ei)、カジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・グラブラタ(
Candida glabrata)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans) ３２３５４お
よび、そのエルゴステロール欠損変異体を、リン酸カリウム緩衝液１ｍＭ、ｐＨ
7.0中の、本発明のペプチドの希釈系の存在下あるいは抗真菌抗生物質アンホテ
リシンＢの存在下で、１時間半、３７℃で培養した。生存能力を平板培養で確認
した。正対照として使用したのは、合成ＰＧＬａ(“Protein beginning with Gl
ycine and ending with Leucin-amide”、アミノ酸配列ＧＭＡＳＫＧＡＩＡＧＫ
ＩＡＫＶＡＬＫＡＬ−アミドを有する）であった。負対照は、合成シスタチンＳ
（ＳＳＳＫＥＥＮＲＩＩＰＧＧＩ）の残基１〜１４を含むペプチドであった。ア
ンホテリシンは既知の抗真菌剤である。しかし、カンジダ・アルビカンス(Candi
da albicans)の変異体（菌種３２３５４）はその細胞膜にエルゴステロールを
有せず、アンホテルシンＢに対して耐性を有するものがある。ＩＣ₅₀値は、接
種材料の５０％が殺されるペプチド濃度である。表５はその結果を示す。

【表５】

【００３５】実施例６人工口腔バイオフィルムにおける抗菌活性人工口腔バイオフィルムは、水酸化リン酸カルシウム板を５日間継続培養系に
入れて製造した。この系は、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus
mutans)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguis)、ストレプ
トコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)、アクティノミセス・ネ
スルンド(Actinomyces naeslundii)、ベイヨネラ・パルビュラ(Veillonella par
vula)、プリボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、フソバクテ
リウム・ヌクレアツム(Fusobacterium nucleatum)の７つの口腔好気性菌および
嫌気性菌を含む。

【００３６】次に、バイオフィルムの形成した板を、濃度の相異したペプチドを溶解した１
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ7.0の溶液中で30分間培養した。続いて、そ
のバイオフィルムを音波破砕して板から取りはずして、ＰＢＳ中で培養し、半選
択的細菌培養板上で平板培養した。全嫌気性菌計数を好気性培養血液寒天培地板
上で（連鎖球菌＋放線菌）、全グラム陰性計数をバンコマイシン含有板上で（Ve
illlonella, Fusobacterium, Prevotella）、および全計数を嫌気性培養血液寒
天培地上で行った。Von Ebner's Gland Protein(ＶＥＧｈ，3-21: LLASDEEIQDVS
GTWYLKA)の不活性ペプチドを負対照として使用した。

【００３７】結果を表6に示す。その中で「*」は殺菌力が明らかに負対照（ｐ＜0.05）より
高いことを表わす。

【表６】

【００３８】実施例７口腔細菌に対する抗菌活性本発明によるペプチドが、口腔内細菌に対しても活性を示すかどうかを確認す
るために、唾液および歯垢から細菌を集めた。唾液をボルテックス・ミキサーで
振動させて遠心分離した。ペレットを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で洗い、30
分間３７℃で、緩衝液（正対照）、ペプチド１０（100μg／ｍl；本発明）、Ｐ
ＧＬａ（100μg／ｍ；正対照）、クロルヘキシジン（50ｐｐｍ）とともに培養し
た。表７にその結果を示す。

【表７】

【００３９】実施例８殺菌におけるペプチド１０およびヒスタチン５の比較クレブシエラ(Klebsiella)(ＡＴＣＣ４３１８６)およびシュードモナス・エ
ルキノーサ(Pseudomonas aeruqinosa)(PA01, 臨床単離)の１０⁶細菌を１時間３
７℃で、１％トリプシン・豆・肉汁培養基（ｐH7.4）を含む１０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液中で、25または50μg／mlのヒスタチン５、3.12、6.25、12.5、25
または50μg／mlのペプチド１０、10μg／ｍｌのプロテグリン（正対照）、50μ
g／mlのペプチド４またはペプチド非含有（両者は負対照）の存在下で培養した
。さらに含まれるのは、１時間、３７℃で培養されなかったブランクである（ｔ
＝０分）。次に、各標本のコロニー形成ユニットをＤＳＴ(診断感性試験)による
平板培養法によって確認した。

【００４０】図１Ａは、各標本のクレブシラ（Klebsiella）によるコロニー形成ユニット
（ＣＦＵ）の数をグラフ化したものである。図１Ｂは、プソイドモナス（Pseudo
monas ）についての結果を示す。

【００４１】実施例９カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)殺菌について相違培養時間におけ
るペプチド１０およびヒスタチン５の比較１０⁶カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を１時間あるいは３時間、
３７℃で、１％サブロー(Sabouraud)(ｐＨ7.4)の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液中で、25、50または100μ／mlのヒスタチン５、3.12、6.25、12.5、25、50ま
たは100μg／ｍｌのペプチド１０、10μg／mlのプロテグリン(正対照)、50μg／
mlのペプチド４またはペプチド非含有（両者は負対照）の存在下で培養した。さ
らに含まれるのは、１時間、３７℃で培養されなかったブランクである（ｔ＝０
分）。次に、各標本のコロニー形成ユニットを上記のサブロー平板培養で確認し
た。

【００４２】図２Ａは、培養１時間後の各標本のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の数をグ
ラフ化したものである。図２Ｂは、３時間培養の結果を示している。

【００４３】実施例１０ペプチド１０によるサルモネラ菌およびエルシニア菌種の殺菌ペプチド１０を50μg／mlの濃度で１０⁶サルモネラ・チフィムリウム菌(Salmo
nella typhimurium)の培養基に加えた。対照として、何も加えていない培養基を
ブランクとして用意した。ＣＦＵの値を０、１、２、３時間ごとに確認した。同
様な実験を腸炎エルシニア(Yersinia enterocolitica)(PYv+)についても行なっ
た。図３Ａおよび３Ｂによると、ペプチド１０を加えると、菌の数が検出限界以
下に下がる。

【００４４】上記の各実施例から、本発明のペプチドは、天然に生じるヒスタチン５よりか
なり高い抗菌性、抗真菌性、抗糸状菌性を有することが分かる。特定のペプチド
はまた、現在使用されている抗微生物剤に耐性を示す微生物に対しても殺作用を
有することがわかった。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、各標本のクレブシラ（Klebsiella）によるコロニ
ー形成ユニット（ＣＦＵ）の数をグラフ化したものである。

【図１Ｂ】図１Ｂは、プソイドモナス（Pseudomonas ）についての結果を
示す。

【図２Ａ】図２Ａは、培養１時間後の各標本のコロニー形成ユニット（Ｃ
ＦＵ）の数をグラフ化したものである。

【図２Ｂ】図２Ｂは、３時間培養の結果を示している。

【図３Ａ】図３Ａは、ペプチド１０を加えると、菌の数が検出限界以下に
下がる。

【図３Ｂ】図３Ｂは、ペプチド１０を加えると、菌の数が検出限界以下に
下がる。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月２日（２０００．３．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/10 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者エンゲルムンドゥス・コルネリス・イグナティウス・フェールマンオランダ、エヌエル−1132テーゼット・フォレンダム、ウィレム・ファン・デン・ベルフストラート27番 (72)発明者ウィレム・ファント・ホフオランダ、エヌエル−2313ゼットゼット・レイデン、シェルペンカーデ61番 (72)発明者エーファ・ヨセフィーネ・ヘルメルホルストオランダ、エヌエル−1015エルエス・アムステルダム、エーヘランティエルスグラフト630番Ｆターム(参考） 4C076 AA06 AA09 AA24 CC31 DD26 FF15 4C084 AA02 AA07 BA02 BA17 BA18 BA19 CA59 DA41 NA14 ZB352 4H045 AA10 AA30 BA05 BA16 EA29 FA34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗微生物活性を有する、１０から２５のアミノ酸のドメイン
を含有するアミノ酸からなるペプチドであって、このドメインの半分についての
アミノ酸の過半数は正電荷アミノ酸であり、ドメインの残りの半分についてのア
ミノ酸の過半数は非電荷アミノ酸であるペプチド。
【請求項２】ドメインがα−ヘリックスを形成し、その部位１、２、５、
６、９（１２、１３，１６，１９、２０、２３、２４）の少なくとも過半数が正
電荷アミノ酸を含有し、部位８が正電荷または非電荷のアミノ酸であり、部位３
、４、７、１０（１１、１４、１５、１７、１８、２１、２２、２５）の少なく
とも過半数が非電荷アミノ酸であることを特徴とする、請求項１のペプチド。
【請求項３】正電荷アミノ酸の選択が、オルニチン（Ｏ）、リシン（Ｋ）
、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）よりなる群からなされることを特徴
とする、請求項２のペプチド。
【請求項４】非電荷アミノ酸の選択が、脂肪族アミノ酸、グリシン（Ｇ）
、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、両極
側鎖を有するアミノ酸、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（
Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、芳香族側鎖を有するアミノ酸、フェニ
ルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）よりなる群からなさ
れることを特徴とする、請求項２および３のペプチド。
【請求項５】正電荷アミノ酸の過半数が、好ましくは正電荷アミノ酸の全
数から引く１であることを特徴とする、請求項２−４のペプチド。
【請求項６】非電荷アミノ酸の過半数が、好ましくは非電荷アミノ酸の全
数から引く１であることを特徴とする、請求項２−５のペプチド。
【請求項７】ドメインが全ペプチドを形成することを特徴とする、請求項
２−６のペプチド。
【請求項８】ドメインが次のアミノ酸配列：ＫＲＬＦＫＥＬＫＦＳＬＲＫ
Ｙ（ペプチド３）を有する、請求項２−７のペプチド。
【請求項９】ドメインが次のアミノ酸配列：ＫＲＬＦＫＥＬＬＦＳＬＲＫ
Ｙ（ペプチド４）を有する、請求項２−７のペプチド。
【請求項１０】ドメインが次のアミノ酸配列：ＫＲＬＦＫＥＬＫＫＳＬＲ
ＫＹ（ペプチド５）を有する、請求項２−７のペプチド。
【請求項１１】ドメインが次のアミノ酸配列：ＫＲＬＦＫＥＬＬＫＳＬＲ
ＫＹ（ペプチド６）を有する、請求項２−７のペプチド。
【請求項１２】ドメインが次のアミノ酸配列：ＯＯＬＦＯＥＬＯＯＳＬＯ
ＯＹ（ペプチド７）を有する、請求項２−７のペプチド。
【請求項１３】ドメインが次のアミノ酸配列：ＯＯＬＦＯＥＬＬＯＳＬＯ
ＯＹ（ペプチド８）を有する、請求項２−７のペプチド。
【請求項１４】ドメインが次のアミノ酸配列：ＫＲＬＦＫＫＬＫＦＳＬＲ
ＫＹ（ペプチド９）を有する、請求項２−７のペプチド。
【請求項１５】ドメインが次のアミノ酸配列：ＫＲＬＦＫＫＬＬＦＳＬＲ
ＫＹ（ペプチド１０）を有する、請求項２−７のペプチド。
【請求項１６】ドメインが、α−ヘリックスを形成、部位１から６（また
は７または８または９または１０または１１または１２）の少なくとも過半数で
非電荷アミノ酸を、および部位７（または８または９または１０または１１また
は１２または１３）から２５で正電荷アミノ酸を含有することを特徴とする、請
求項１のペプチド。
【請求項１７】ドメインが、α−ヘリックスを形成、部位１から６（また
は７または８または９または１０または１１または１２）の少なくとも過半数で
正電荷アミノ酸を、および部位７（または８または９または１０または１１また
は１２または１３）から２５で非電荷アミノ酸を含有することを特徴とする、請
求項１のペプチド。
【請求項１８】正電荷アミノ酸の選択が、オルニチン（Ｏ）、リシン（Ｋ
）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）よりなる群からなされることを特
徴とする、請求項１６または１７のペプチド。
【請求項１９】非電荷アミノ酸の選択が、脂肪族アミノ酸、グリシン（Ｇ
）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、両
極側鎖を有するアミノ酸、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン
（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、芳香族側鎖を有するアミノ酸、フェ
ニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）よりなる群からな
されることを特徴とする、請求項１６、１７または１８のペプチド。
【請求項２０】正電荷アミノ酸の過半数が、好ましくは正電荷アミノ酸の
全数から引く１であることを特徴とする、請求項１６−１９のペプチド。
【請求項２１】非電荷アミノ酸の過半数が、好ましくは非電荷アミノ酸の
全数から引く１であることを特徴とする、請求項１６−２０のペプチド。
【請求項２２】ドメインが全ペプチドを形成することを特徴とする、請求
項１６−２１のペプチド。
【請求項２３】ドメインが次のアミノ酸配列：ＬＬＬＦＬＬＫＫＲＫＫＲ
ＫＹ（ペプチド１１）を有する、請求項１６および１８−２２のペプチド。
【請求項２４】ドメインが、いわゆるβ鎖を形成し、正電荷アミノ酸を部
位１、３、５、７、９（１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５）の
少なくとも過半数で、および非電荷アミノ酸を部位２，４、６、８、１０（１２
、１４、１６、１８、２０、２２、２４）の少なくとも過半数で含有することを
特徴とする、請求項１のペプチド。
【請求項２５】正電荷アミノ酸の選択が、オルニチン（Ｏ）、リシン（Ｋ
）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）よりなる群からなされることを特
徴とする、請求項２４のペプチド。
【請求項２６】非電荷アミノ酸の選択が、脂肪族アミノ酸、グリシン（Ｇ
）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、両
極側鎖を有するアミノ酸、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン
（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、芳香族側鎖を有するアミノ酸、フェ
ニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）よりなる群からな
されることを特徴とする、請求項２４のペプチド。
【請求項２７】正電荷アミノ酸の過半数が、好ましくは正電荷アミノ酸の
全数から引く１であることを特徴とする、請求項２４−２６のペプチド。
【請求項２８】非電荷アミノ酸の過半数が、好ましくは非電荷アミノ酸の
全数から引く１であることを特徴とする、請求項２４−２７のペプチド。
【請求項２９】ドメインが全ペプチドを形成することを特徴とする、請求
項２４−２８のペプチド。
【請求項３０】Ｎ末端がアミド化された、請求項１−２９のペプチド。
【請求項３１】Ｃ末端カルボン酸基が、アミド、エステル、ケトン、アル
デヒド、アルコール基で置換された、請求項１−３０のペプチド。
【請求項３２】抗細菌剤としての使用のための、請求項１−３１のペプチ
ド。
【請求項３３】抗真菌剤としての使用のための、請求項１−３１のペプチ
ド。
【請求項３４】抗糸状菌剤としての使用のための、請求項１−３１のペプ
チド。
【請求項３５】細菌感染を処置する医薬の製造のための、請求項１−３１
のペプチド。
【請求項３６】真菌感染を処置する医薬の製造のための、請求項１−３１
のペプチド。
【請求項３７】酵母感染を処置する医薬の製造のための、請求項１−３１
のペプチド。
【請求項３８】請求項１−３１の１以上のペプチドおよび１以上の適当な
賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３９】噴霧、軟膏、ゲルまたはロゼンジの形態における、請求項
３８の医薬組成物。