ES2936317T3 - Anticuerpos contra OX40 y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

En el presente documento se proporcionan anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen a OX40. También se proporcionan usos de estas proteínas en aplicaciones terapéuticas, como en el tratamiento del cáncer. Además se proporcionan células que producen los anticuerpos, polinucleótidos que codifican la región variable de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos y vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican la región variable de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DES

Anticuerpos contra OX40 y usos de los mismos

Lista de secuencias

La presente solicitud contiene una lista de secuencias qu

se incorpora al presente documento por referencia en s

2016, se denomina MXI_543PC_Sequence_Listing.txt. y

Antecedentes

OX40 (TNFRSF4), también conocida como ACT35, IMD

tipo I de 50 kD de la familia TNFSFR de receptores coe

contexto del cáncer, las células T activadas que expresa

y su ligando, OX40-L, desempeñan un papel crucial en la

T. Estudios recientes han demostrado la utilidad de mej

cáncer, con componentes clave de una respuesta eficaz

de señales de supervivencia a través de las células T e

las estrategias para el tratamiento de enfermedades co

como las de las células T, sería terapéuticamente benefic

de las células T, como las dirigidas contra OX40, así

agentes.

En el documento WO200907935 se describen molécula

de ácido nucleico que codifican una secuencia de amino

las moléculas de ácido nucleico, células hospedador

moléculas de unión, composiciones farmacéuticas que

composiciones o moléculas de unión.

Sumario

En el presente documento se proporcionan anticuerpos,

específicamente a OX40 y que tienen propiedades funci

afinidad a OX40 de ser humano y a OX40 de macaco ca

de células T específicas de antígeno, p. ej., en sujetos

proporcionan métodos para detectar OX40 en una mues

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos mo

las . En otros aspectos, la invención proporciona ácidos

comprenden estos ácidos nucleicos. En un aspecto adic

. La invención también proporciona, en otro aspecto, c

aspecto adicional, la invención proporciona anticuerpos

tratamiento del cáncer, como se define en las .

Los anticuerpos se unen específicamente a OX40 y pres

(1) se unen a OX40 humana soluble, p. ej., con un

medida con Biacore;

(2) se unen a OX40 humana unida a membrana, p. e

p. ej., medida por FACS.

(3) se unen a OX40 de macaco cangrejero, p. ej., s

ej., con una CE50 de 10 nM o menor (p. ej., de 0,01 n

(4) inducen o mejoran la activación de células T, co

IL-2 y/o de IFN-y en células T que expresan OX40 y/

(5) inhiben la unión del ligando OX40 a OX40, p. ej.,

un ensayo con células 293-hOX40;

(6) se unen a un epítopo en la parte extracelular de O

de la región DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID N

LAGK (SEQ ID NO: 179);

(7) compiten por la unión a OX40 humana con 3F4,

(8) compiten por la unión a OX40 humana con 6E1-1

Los anticuerpos anti-OX40 estimulan una respuesta in

específica de antígeno. En determinadas realizaciones,

IL-2 y/o IFN-^y) en células T que expresan OX40 y/o CIÓN

ha presentado electrónicamente en formato ASCII y que talidad. Dicha copia en ASCII, creada el 26 de mayo de e un tamaño 417.528 bytes.

XGP1L y CD134, es una glucoproteína transmembrana ladores expresados en células T CD4+ activadas. En el 40 se encuentran en linfocitos infiltrantes de tumor. OX40 cción y el mantenimiento de las respuestas de las células la función de las células T antitumorales para combatir el luida la activación de las células T CD4+ y la promoción ras y de memoria. Dada la necesidad actual de mejorar l cáncer, p. ej., potenciando las respuestas inmunitarias disponer de nuevos agentes que modulen las respuestas de terapias (p. ej., combiterapias) que utilicen dichos

unión aisladas que se unen a OX40 humana, moléculas os de las moléculas de unión, vectores que comprenden ue contienen los vectores, métodos para preparar las ienen las moléculas de unión, y métodos de uso de las

como anticuerpos monoclonales humanos, que se unen s deseables. Estas propiedades incluyen la unión de alta ero (Cynomolgus) y la capacidad de estimular respuestas adores de tumor. En el presente documento también se

onales aislados que se unen a OX40, como se define en icos como se define en las y vectores de expresión que l, la invención proporciona células como se define en las osiciones farmacéuticas como se define en las . En un mposiciones farmacéuticas para su uso en métodos de

n al menos una de las siguientes propiedades:

de 10 nM o menor (p. ej., de 0,01 nM a 10 nM), p. ej.,

n una CE50 de 1 nM o menor (p. ej., de 0,01 nM a 1 nM),

n a OX40 de macaco cangrejero unida a membrana, p.

10 nM), p. ej., medida por FAC^s .

demuestra mediante (i) el aumento de la producción de el aumento de la proliferación de células T;

una CE50 de 1 nM o menor medida por FACS, p. ej., en

humana madura (SEQ ID NO: 2), p. ej., un epítopo dentro 8) o DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCT-

-1, 14B6-2, 23H3, 18E9, 8B11,20B3 y 20C1;

-2, 14A2-1 y 14A2-2.

aria antitumoral, por ejemplo, una respuesta de célula T anticuerpos aumentan la producción de citocinas (p. ej., entan la proliferación de células T. En determinadas realizaciones, los anticuerpos se unen al componente C1

los anticuerpos inducen la lisis mediada por células NK

el anticuerpo promueve la fagocitosis mediada por ma

realizaciones, el anticuerpo inhibe la supresión mediad

CD4+.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX

activadores. En determinadas realizaciones, los anticuer

del entrecruzamiento multivalente.

Los anticuerpos monoclonales aislados se unen espec

pesada variable y las tres CDR de cadena ligera variable

la cadena ligera variable de las SEQ ID NO: 318 y 94.

Los anticuerpos monoclonales reivindicados se unen a

secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena p

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y CDR

respectivamente. Los aspectos no reivindicados de la di

(a) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de ca

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y C

16, respectivamente;

(b) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de ca

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y C

24, respectivamente;

(c) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de ca

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y C

27, respectivamente;

(d) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de ca

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y C

36, respectivamente;

(e) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de ca

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y C

44, respectivamente;

(f) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de ca

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y C

47, respectivamente;

(g) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de ca

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y C

56, respectivamente;

(h) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de ca

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y C

64, respectivamente;

(i) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de ca

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y C

72, respectivamente;

(j) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de ca

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y C

80, respectivamente;

(k) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de ca

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y C

83, respectivamente; o

(l) secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de ca

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y C

92, respectivamente.

En el presente documento se proporcionan anticuerpos

de los mismos, que se unen a OX40 y que comprenden

donde la región variable de cadena pesada comprende

96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia

SEQ ID NO: 17, 28, 37, 48, 57, 65, 73, 84, y 93.

En el presente documento se proporcionan anticuerpos

antígeno de los mismos, que se unen a OX40 y que co

ligera, en donde la región variable de cadena ligera comp

95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la sec complemento humano. En determinadas realizaciones, ulas T CD4+ activadas. En determinadas realizaciones, gos de células que expresan OX40. En determinadas células T reguladoras de la proliferación de células T

unen a receptores de Fc, tales como uno o más FcyR nducen o mejoran la activación de las células T a través

ente a OX40 y comprenden las tres CDR de cadena están en el par de la cadena pesada variable y en el de

y comprenden:

que comprenden las SEQ ID NO: 87, 317 y 89, cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 90-92, ión también incluyen anticuerpos que comprenden;

pesada que comprenden las SEQ ID NO: 11-13, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 14­

pesada que comprenden las SEQ ID NO: 19-21, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 22­

pesada que comprenden las SEQ ID NO: 19-21, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 25­

pesada que comprenden las SEQ ID NO: 31-33, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 34­

pesada que comprenden las SEQ ID NO: 39-41, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 42­

pesada que comprenden las SEQ ID NO: 39-41, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 45­

pesada que comprenden las SEQ ID NO: 51-53, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 54­

pesada que comprenden las SEQ ID NO: 59-61, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 62­

pesada que comprenden las SEQ ID NO: 67-69, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 70­

pesada que comprenden las SEQ ID NO: 75-77, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 78­

pesada que comprenden las SEQ ID NO: 75-77, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 81­

pesada que comprenden las SEQ ID NO: 87-89, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 90­

clonales no reivindicados, o partes de unión a antígeno nes variables de cadena pesada y de cadena ligera, en ecuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 95 %, minoácidos seleccionada del grupo que consiste en las

clonales aislados no reivindicados, o partes de unión a den regiones variables de cadena pesada y de cadena una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, ia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 29, 30, 38, 49, 50, 58, 66, 74, 85

En el presente documento se proporcionan anticuerpos

antígeno de los mismos, que se unen a OX40 y que co

y de cadena ligera idénticas al menos en un 85 %, por eje

a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grup

48 y 50; 57 y 58; 65 y 66; 73 y 74; 84 y 85; 84 y 86; 93 y

En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonal

secuencias de cadenas pesadas y cadenas ligeras al me

idénticas a las secuencias de aminoácidos seleccionad

En determinadas realizaciones, los anticuerpos monoclo

OX40 que 20C1, y (b) inhiben la unión de 20C1 con OX

80 % o 90 % medida, p. ej., por FACS (siglas del inglés

activadas por fluorescencia^.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX

(SEQ ID NO: 178) o DSYKPGVDCAPCPPGHFSPG

extracelular madura de OX40 humana (SEQ ID NO: 2).

en el presente documento, se unen a OX40 tanto

realizaciones, los anticuerpos anti-OX40, descritos en el

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX

de los mismos. En determinadas realizaciones, los anti

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-O

FcyR activador.

En el presente documento se proporcionan anticuerpos

una región constante de la cadena pesada modificada

dominios CH1, CH2 y CH3 que no es del isotipo IgG2.

En determinadas realizaciones, la cadena pesada d

secuencia de aminoácidos que consiste en el SEQ ID

sumo en 10 aminoácidos o es al menos 95 %, 96 %, 97

SEQ ID NO: 124.

En determinadas realizaciones, la cadena ligera de los a

de aminoácidos que consiste en el SEQ ID NO: 116, o

aminoácidos o es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 9

116.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX4

isomerización. Por ejemplo, si la secuencia de aminoác

cadena pesada y/o ligera del anticuerpo, la secuenci

experimente isomerización. El anticuerpo comprende la

expuesta en el SEQ ID NO: 88, pero en donde la Gly en

88) está reemplazada por una secuencia de aminoácido

En algunas realizaciones, los anticuerpos reivindicados

grupo que consiste en las SEQ ID NO: 294-296. Los as

presente documento son anticuerpos que se unen a O

que consiste en las SEQ ID NO: 282-293. Dichos antic

secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que

En el presente documento se proporcionan moléculas bi

una molécula que tiene una segunda especificidad de u

En el presente documento se proporcionan ácidos nucl

y/o ligera de los anticuerpos anti-OX40, vectores de exp

células transformadas con los vectores de expresión.

En el presente documento se proporcionan inmunoconj

en el presente documento, unidos a un agente.

y 94.

oclonales aislados no reivindicados, o partes de unión a den secuencias de regiones variables de cadena pesada , 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas, e consiste en: 17 y 18; 28 y 29; 28 y 30; 37 y 38; 48 y 49;

islados reivindicados se unen a OX40 y comprenden 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 99 % o 100 % l grupo que consiste en las SEQ ID NO: 124 y 116.

s aislados reivindicados (a) se unen al mismo epítopo en n células T activadas en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, rescence-Activated Cell Sorting, clasificación de células

unen dentro de las regiones DVVSSKPCKPCTWCNLR ACKPWTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179) de la parte gunas realizaciones, los anticuerpos anti-OX40, descritos er humano como de macaco cangrejero. En algunas ente documento, no se une a OX40 de ratón y/o rata.

on anticuerpos de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, o variantes os anti-OX40 son anticuerpos humanos o humanizados. omprenden un Fc que tiene una unión potenciada a un

oclonales aislados que se unen a OX40 que comprenden comprende una bisagra de IgG2 y al menos uno de los

anticuerpos anti-OX40 reivindicados comprende una 124, o una cadena pesada que difiere de la misma a lo 8 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de

erpos anti-OX40 reivindicados comprende una secuencia cadena ligera que difiere de la misma a lo sumo en 10 idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

son inmunogénicos.

recen de una secuencia de aminoácidos que experimente Asp-Gly está presente en las secuencias de CDR de la sustituye por una secuencia de aminoácidos que no encia de CDR2 de la región variable de la cadena pesada cuencia Asp-Gly (AIDTDGSNKYYPDSVKG; SEQ ID NO: e no experimenta isomerización, es decir, Asp-Ala.

renden una secuencia de aminoácidos seleccionada del s no reivindicados de la divulgación proporcionada en el que comprenden un aminoácido seleccionado del grupo s comprenden una cadena pesada que consiste en una iste en las SEQ ID NO: 282-293.

cíficas que comprenden el anticuerpo anti-OX40 unido a

que codifican las regiones variables de cadena pesada n que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos, y

os que comprenden los anticuerpos anti-OX40 descritos En el presente documento se proporcionan composicione

En el presente documento se proporcionan kits que comp

determinados casos, los kits comprenden además un anti

En el presente documento se proporciona un método de

expresar un anticuerpo anti-OX40 en una célula y aislar e

En el presente documento se proporciona el anticuerpo

respuesta de células T específica de antígeno que comp

OX40 de modo que se estimule una respuesta de células

En el presente documento se proporciona el anticuerp

coestimulación de una célula T, p. ej., una célula T efecto

célula T efectora, con un anticuerpo anti-OX40, y CD3, e

En el presente documento se proporciona el anticuerp

producción de IL-2 y/o IFN-^y y/o la proliferación de una cé

cantidad eficaz de un anticuerpo anti-OX40.

En el presente documento se proporciona el anticuerp

producción de IL-2 y/o IFN-^y en células T en un sujeto que

anti-OX40, de una molécula biespecífica o de un conj

composición que comprende el anticuerpo anti-OX40, p

células T.

En el presente documento se proporciona el anticuerpo a

número de células T reguladoras en un tumor de un sujet

eficaz de un anticuerpo anti-OX40, de una molécula bies

de unión a antígeno del mismo, tiene una función efectora

células T reguladoras en el tumor.

En el presente documento se proporciona el anticuerpo

respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende adm

OX40, de una molécula biespecífica o de un conjugado

sujeto. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene un t

En el presente documento se proporciona el anticuerpo a

de células tumorales en un sujeto que comprende ad

biespecífica o un conjugado de manera que se inhiba el c

En el presente documento se proporciona el anticuerpo

método de tratamiento de un cáncer, p. ej., por inmunoter

una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo

que comprende el anticuerpo anti-OX40, o la composici

cáncer. En determinadas realizaciones, el cáncer se sel

de mama, cáncer uterino/cervicouterino, cáncer ovárico,

cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer color

cuello, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer

cáncer de tiroides, cáncer de piel, neoplasia del sistem

cáncer relacionado con virus. En determinadas realizacion

o un cáncer recurrente.

En determinadas realizaciones, los métodos descrit

administración de una o más terapias adicionales con un

un anticuerpo LAG-3, un anticuerpo de CTLA-4 (siglas d

linfocito T citotóxico) y/o un anticuerpo de PD-L1 (siglas

programada).

En el presente documento se proporciona un método n

muestra, que comprende poner en contacto la muestra c

del mismo, en condiciones que permitan la formación de u

del mismo, y OX40, y detectar la formación de un complej

En el presente documento se proporcionan los anticuerpo ue comprenden los anticuerpos anti-OX40 y un vehículo.

den los anticuerpos anti-OX40 e instrucciones de uso. En erpo anti-CTLA4, anti-PD-1 o anti-PD-LI.

eparación de los anticuerpos anti-OX40, que comprende nticuerpo de la célula.

nti-OX40 para su uso en un método para estimular una de poner en contacto la célula T con un anticuerpo antiespecífica de antígeno.

anti-OX40 para su uso en un método de activación o que comprende poner en contacto una célula, p. ej., una onde la célula T efectora se activa o coestimula.

nti-OX40 para su uso en un método para aumentar la a T que comprende poner en contacto la célula T con una

nti-OX40 para su uso en un método para aumentar la mprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo do que comprende el anticuerpo anti-OX40, o de una aumentar la producción de IL-2 y/o IFN-^y a partir de las

-OX40 para su uso en un método para reducir o agotar el que lo necesite, que comprende administrar una cantidad cífica o de un conjugado en donde el anticuerpo, o parte una función efectora mejorada, para reducir el número de

nti-OX40 para su uso en un método para estimular una trar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo antimanera que se estimule una respuesta inmunitaria en el or y se estimula una respuesta inmunitaria contra el tumor.

X40 para su uso en un método para inhibir el crecimiento istrar al sujeto un anticuerpo anti-OX40, una molécula imiento del tumor en el sujeto.

i-OX40 o la composición farmacéutica para su uso en un a, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite -OX40, de una molécula biespecífica o de un conjugado que comprende el anticuerpo anti-OX40, para tratar el iona del grupo que consiste en: cáncer de vejiga, cáncer áncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de esófago, tal, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y células germinales, cáncer de hueso, cáncer de hígado, ervioso central, linfoma, leucemia, mieloma, sarcoma y , el cáncer es un cáncer metastásico, un cáncer refractario

en el presente documento comprenden además la ticuerpo anti-OX40, por ejemplo, un anticuerpo anti-PDl, inglés Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4, antígeno 4 del inglés Programmed Death-ligand 1, ligando 1 de muerte

eivindicado para detectar la presencia de OX40 en una un anticuerpo anti-OX40, o una parte de unión a antígeno omplejo entre el anticuerpo, o la parte de unión al antígeno

nti-OX40 descritos en el presente documento para su uso en el tratamiento del cáncer, estimulando una respuesta i

T específica de antígeno, activando o coestimulando una

IL-2 y/o

IFN-^y, y/o la proliferación de una célula T, reduciendo o a

inhibiendo el crecimiento de células tumorales. En el pr

anti-OX40 descritos en el presente documento para su u

respuesta inmunitaria en un sujeto, estimulando una r

coestimulando una célula T, aumentando la producció

reduciendo o agotando el número de células T regulad

tumorales.

En el presente documento se proporciona el anticuerpo

método para tratar un tumor sólido en un sujeto humano,

eficaz de un anticuerpo anti-OX40 que comprende los do

pesada que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID

variable de cadena ligera que tiene la secuencia expues

menos un ciclo de administración, en donde el ciclo es un

menos uno de los ciclos, se administra una dosis del anti

una dosis fija de 20, 40, 80, 160 o 320 mg; una dosis de

de aproximadamente 20, 40, 80, 160 o 320 mg.

En una realización, el método comprende administrar ad

CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pe

y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable

ID NO: 302, en donde el método comprende al menos u

dos, tres o cuatro semanas, en donde para cada uno de

anticuerpo anti-OX40 a una dosis de 1 mg/kg de peso co

de aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal; o una do

dosis del anticuerpo anti-PD-1 se administra a una dosis

360 o 480 mg.

En otra realización, el método comprende administrar ade

CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pe

y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable

ID NO: 310, en donde el método comprende al menos u

tres semanas, en donde para cada uno de los al menos u

OX40 a una dosis de 1 mg/kg de peso corporal; un

aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal; o una dosi

administra una dosis del anticuerpo anti-CTLA-4 a una d

en donde el anticuerpo anti-OX40 se administra junto con

de monoterapia con anticuerpos anti-OX40 durante al me

en 8 ciclos. En una realización, el anticuerpo anti-OX40 s

4 primeros ciclos, seguido de monoterapia con anticuerp

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40 compr

expuestas en las SEQ ID NO: 124 y 116, respectivament

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40,

CTLA-4, están formulados para administración intraven

anti-PD-1 o anti-CTLA-4 se formulan conjuntamente. En

anti-CTLA-4 se formulan por separado.

En algunas realizaciones, el tratamiento consiste en 8

anticuerpo anti-OX40 y el anticuerpo anti-PD-1 o anti-CT

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

PD-1 o anti-CTLA-4. En una realización, el anticuerpo anti

la administración del anticuerpo anti-PD-1 o anti-CTLA-4.

después de la administración del anticuerpo anti-PD-1 o

OX40 se administra simultáneamente con el anticuerpo a

En determinadas realizaciones, el tratamiento produce al

del tamaño de un tumor, una reducción del número de

completa, una respuesta parcial y enfermedad estable. E

seleccionado del grupo que consiste en: cáncer cervicout unitaria en un sujeto, estimulando una respuesta de célula lula T, aumentando la producción de citocinas, tales como

tando el número de células T reguladoras en un tumor y/o nte documento también se proporcionan los anticuerpos en la preparación de un medicamento para estimular una uesta de célula T específica de antígeno, activando o de IL-2 y/o IFN-^y y/o la proliferación de una célula T, s en un tumor y/o inhibiendo el crecimiento de células

i-OX40 o la composición farmacéutica para su uso en un mprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad ios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena : 318, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región en el SEQ ID NO: 94, en donde el método comprende al ríodo de dos semanas, en donde para cada uno de los al erpo anti-OX40 a una dosis de 1 mg/kg de peso corporal; oximadamente 1 mg/kg de peso corporal; o una dosis fija

ás un anticuerpo anti-PD-1 que comprende los dominios a que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 301, cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en el SEQ clo de administración, en donde el ciclo es un período de al menos uno de los ciclos, se administra una dosis del ral; una dosis fija de 20, 40, 80, 160 o 320 mg; una dosis fija de aproximadamente 20, 40, 80, 160 o 320 mg, y una 240, 360 o 480 mg o una dosis de aproximadamente 240,

s un anticuerpo anti-CTLA-4 que comprende los dominios a que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 309, cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en el SEQ clo de administración, en donde el ciclo es un período de de los ciclos, se administra una dosis del anticuerpo antiosis fija de 20, 40, 80, 160 o 320 mg; una dosis de ija de aproximadamente 20, 40, 80, 160 o 320 mg, y se is de 1 mg/kg o una dosis de aproximadamente 1 mg/kg, nticuerpo anti-CTLA-4 durante al menos un ciclo, seguido un ciclo. En algunas realizaciones, el tratamiento consiste dministra junto con el anticuerpo anti-CTLA-4 durante los anti-OX40 durante los 4 últimos ciclos.

de las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera

el anticuerpo anti-OX40 y el anticuerpo anti-PD-1 o anti-. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-OX40 y as realizaciones, los anticuerpos anti-OX40 y anti-PD-1 o

clos. En una realización, el anticuerpo anti-OX40, o el 4, se administra el día 1 de cada ciclo.

administra antes de la administración del anticuerpo anti-X40 se administra aproximadamente 30 minutos antes de otras realizaciones, el anticuerpo anti-OX40 se administra ti-CTLA-4. Aún en otras realizaciones, el anticuerpo anti--PD-1 o anti-CTLA-4.

nos un efecto terapéutico seleccionado de una reducción iones metastásicas a lo largo del tiempo, una respuesta lgunas realizaciones, el tumor está asociado a un cáncer no, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal y cáncer ovárico.

Otras características y ventajas de la presente divulgación

y de los ejemplos, que no deben interpretarse como limita

Breve descripción de las figuras

Los anticuerpos de la invención reivindicada se denomin

continuación se desvelan anticuerpos distintos de l

completamente la invención.

La figura 1A muestra la secuencia de nucleótidos (SE

17) de la región variable de cadena pesada del anticue

(SEQ ID NO: 11), CDR2 (SEQ ID NO: 12) y CDR3

germinal V, D y J.

La figura 1B muestra la secuencia de nucleótidos (SE

18) de la región variable de cadena ligera kappa del a

CDR1 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 15) y CD

germinal V y J.

La figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos (SE

28) de la región variable de cadena pesada del anticuer

las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 19), CDR2 (SEQ ID n

de la línea germinal V, D y J.

La figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos (SE

29) de la región variable de cadena ligera kappa d

regiones CDR1 (SEQ ID NO: 22), CDR2 (SEQ ID NO:

de la línea germinal V y J.

La figura 2C muestra la secuencia de nucleótidos (SE

30) de la región variable de cadena ligera kappa d

regiones CDR1 (SEQ ID NO: 26), CDR2 (SEQ ID NO:

de la línea germinal V y J.

La figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos (SE

37) de la región variable de cadena pesada del anti

CDR1 (SEQ ID NO: 31), CDR2 (SEQ ID NO: 32) y CD

germinal V, D y J.

La figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos (SE

38) de la región variable de cadena ligera kappa del an

CDR1 (SEQ ID NO: 34), CDR2 (SEQ ID NO: 35) y CD

germinal V y J.

La figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SE

48) de la región variable de cadena pesada del anticu

las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 39), CDR2 (SEQ ID N

de la línea germinal V, D y J.

La figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SE

49) de la región variable de cadena ligera kappa del an

CDR1 (SEQ ID NO: 42), CDR2 (SEQ ID NO: 43) y CD

germinal V y J.

La figura 4C muestra la secuencia de nucleótidos (SE

50) de la región variable de cadena ligera kappa del an

CDR1 (SEQ ID NO: 45), CDR2 (SEQ ID NO: 46) y CD

germinal V y J.

La figura 5A muestra la secuencia de nucleótidos (SE

57) de la región variable de cadena pesada del anti

CDR1 (SEQ ID NO: 51), CDR2 (SEQ ID NO: 52) y CD

germinal V, D y J.

La figura 5B muestra la secuencia de nucleótidos (SE

58) de la región variable de cadena ligera kappa del a

CDR1 (SEQ ID NO: 54), CDR2 (SEQ ID NO: 55) y CD

germinal V y J.

La figura 6A muestra la secuencia de nucleótidos (SE

65) de la región variable de cadena pesada del anti

CDR1 (SEQ ID NO: 59), CDR2 (SEQ ID NO: 60) y CD

germinal V, D y J.

La figura 6B muestra la secuencia de nucleótidos (SE

66) de la región variable de cadena ligera kappa del a

CDR1 (SEQ ID NO: 62), CDR2 (SEQ ID NO: 63) y CD

germinal V y J.

án evidentes a partir de la siguiente descripción detallada s.

"OX40.21" en la siguiente descripción de las figuras. A reivindicados como referencia y para comprender

D NO: 126) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: monoclonal humano 3F4. Se definen las regiones CDR1 Q ID NO: 13) y se indican las derivaciones de la línea

D NO: 127) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: uerpo monoclonal humano 3F4. Se definen las regiones (SEQ ID NO: 16) y se indican las derivaciones de la línea

D NO: 128) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: monoclonal humano 14B6 (14B6-1 y 14B6-2). Se definen 0) y CDR3 (SEQ ID NO: 21) y se indican las derivaciones

D NO: 129) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: nticuerpo monoclonal humano 14B6-1. Se definen las ) y Cd R3 (SEQ ID NO: 24) y se indican las derivaciones

D NO: 130) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: nticuerpo monoclonal humano 14B6-2. Se definen las ) y C^d R3 (SEQ ID NO: 28) y se indican las derivaciones

D NO: 131) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: rpo monoclonal humano 23H3. Se definen las regiones (SEQ ID NO: 33) y se indican las derivaciones de la línea

D NO: 132) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: erpo monoclonal humano 23H3. Se definen las regiones (SEQ ID NO: 36) y se indican las derivaciones de la línea

D NO: 133) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: o monoclonal humano 6E1 (6E1-1 y 6E1-2). Se definen 0) y CDR3 (SEQ ID NO: 41) y se indican las derivaciones

D NO: 134) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: erpo monoclonal humano 6E1-1. Se definen las regiones (SEQ ID NO: 44) y se indican las derivaciones de la línea

D NO: 135) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: erpo monoclonal humano 6E1-2. Se definen las regiones (SEQ ID NO: 47) y se indican las derivaciones de la línea

D NO: 136) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: rpo monoclonal humano 18E9. Se definen las regiones (SEQ ID NO: 53) y se indican las derivaciones de la línea

D NO: 137) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: erpo monoclonal humano 18E9. Se definen las regiones (SEQ ID NO: 56) y se indican las derivaciones de la línea

D NO: 138) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: rpo monoclonal humano 8B11. Se definen las regiones (SEQ ID NO: 61) y se indican las derivaciones de la línea

D NO: 139) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: erpo monoclonal humano 8B11. Se definen las regiones (SEQ ID NO: 64) y se indican las derivaciones de la línea La figura 7A muestra la secuencia de nucleótidos (SE

73) de la región variable de cadena pesada del antic

CDR1 (SEQ ID NO: 67), CDR2 (SEQ ID NO: 68) y CD

germinal V, D y J.

La figura 7B muestra la secuencia de nucleótidos (SE

74) de la región variable de cadena ligera kappa del an

CDR1 (SEQ ID NO: 70), CDR2 (SEQ ID NO: 71) y CD

germinal V y J.

La figura 8A muestra la secuencia de nucleótidos (SE

84) de la región variable de cadena pesada del anticuer

las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 75), CDR2 (SEQ ID n

de la línea germinal V, D y J.

La figura 8B muestra la secuencia de nucleótidos (SE

85) de la región variable de cadena ligera kappa d

regiones CDR1 (SEQ ID NO: 78), CDR2 (SEQ ID NO:

de la línea germinal V y J.

La figura 8C muestra la secuencia de nucleótidos (SE

86) de la región variable de cadena ligera kappa d

regiones CDR1 (SEQ ID NO: 81), CDR2 (SEQ ID NO:

de la línea germinal V y J.

La figura 9A muestra la secuencia de nucleótidos (SE

93) de la región variable de cadena pesada del antic

CDR1 (SEQ ID NO: 87), CDR2 (SEQ ID NO: 88) y CD

germinal V, D y J.

La figura 9B muestra la secuencia de nucleótidos (SE

94) de la región variable de cadena ligera kappa del an

CDR1 (SEQ ID NO: 90), CDR2 (SEQ ID NO: 91) y CD

germinal V y J.

La figura 10A muestra la secuencia de nucleótidos (S

124) de la región variable de cadena pesada del anti

muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 16

cadena ligera.

Las figuras 11A-11D muestran curvas de unión y valo

células T humanas activadas, actuando como controle

FACS.

Las figuras 12A-12C muestran curvas de unión y valo

células T activadas de macaco cangrejero, actuando c

evaluado por FACS.

Las figuras 13A-13C muestran curvas de unión y valo

humanas activadas, células HEK293 que sobreexpres

de macaco cangrejero, según lo evaluado por análisis

La figura 14A muestra la tinción inmunohistológica de

con acetona con los anticuerpos anti-OX40, OX40.8,

representativa, a una concentración de anticuerpo de

tejidos, con excepción de OX40.16 a 10 pg/ml en e

positivamente un pequeño subconjunto de linfocitos e

miofilamentos en el corazón y OX40.6 tiñó los músculo

pequeñas en la amígdala, y el endocardio y válvulas e

La figura 14B muestra la inmunotinción de diversas s

con el anticuerpo anti-OX40 OX40.21 (una varia

representativa a una concentración de anticuerpo

subconjunto de linfocitos en la amígdala y el timo. Las

germinal, en la zona del manto y en la región inter

localizaron principalmente en la médula. No se obser

CG, centro germinal; Me, médula; ZM, zona del manto

La figura 15A muestra la distribución de linfocitos infilt

carcinoma colorrectal (CCR), carcinoma epidermoide

una puntuación manual de 12 a 20 casos de cada tipo

objetivo 20x de un microscopio. Mínima, < 1 célula por

de objetivo de 20x; Moderada, 10 ~ < 50 células por c

objetivo de 20x; Intensa, > 200 células por campo de

Las figuras 15B y 15C muestran la tinción inmunohist

del inglésFormalin-Fixed Paraffin-Embedded, fijadas e

carcinoma colorrectal (CCR) y de carcinoma epiderm

de baja potencia, que muestra que los LIT tanto OX4

se distribuyen principalmente en el estroma tumoral. L NO: 140) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: o monoclonal humano 20B3. Se definen las regiones EQ ID NO: 69) y se indican las derivaciones de la línea

NO: 141) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: rpo monoclonal humano 20B3. Se definen las regiones EQ ID NO: 72) y se indican las derivaciones de la línea

NO: 142) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: onoclonal humano 14A2 (14A2-1 y 14A2-2). Se definen ) y CDR3 (SEQ ID NO: 77) y se indican las derivaciones

NO: 143) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: ticuerpo monoclonal humano 14A2-1. Se definen las Cd R3 (SEQ ID NO: 80) y se indican las derivaciones

NO: 144) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: ticuerpo monoclonal humano 14A2-2. Se definen las C^d R3 (SEQ ID NO: 83) y se indican las derivaciones

NO: 145) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: o monoclonal humano 20C1. Se definen las regiones EQ ID NO: 89) y se indican las derivaciones de la línea

NO: 146) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: rpo monoclonal humano 20C1. Se definen las regiones EQ ID NO: 92) y se indican las derivaciones de la línea

NO: 176) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: o monoclonal humano OX40.21. En la figura 10B se la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 116) de la

e CE50 (en nM) de diversos anticuerpos anti-OX40 de IgG1 y anticuerpos secundarios, según lo evaluado por

e CE50 (en nM) de diversos anticuerpos anti-OX40 de controles la hIgG1 y anticuerpos secundarios, según lo

e K^d del anticuerpo anti-OX40, OX40.21, de células T X40 humana y células CHO que sobreexpresan OX40 catchard.

rsas secciones de tejido humano congeladas y fijadas 0.6 y OX40.16. Las imágenes muestran una tinción /ml, de la amígdala hiperplásica y de 5 pg/ml de otros rdio y válvulas. Aunque los tres anticuerpos tiñeron amígdala, OX40.8 también tiñó estructuras similares a díacos, la matriz del endotelio/subendotelio en arterias orazón. CG, centro germinal; ZM, zona del manto. nes de tejido humano congeladas fijadas con acetona e OX40.16). Las imágenes muestran una tinción pg/ml. El anticuerpo tiñó positivamente un pequeño s positivas en la amígdala se distribuyeron en el centro lar, mientras que las células positivas en el timo se ción específica en el corazón, hígado, riñón y pulmón.

s de tumor OX40+ en carcinoma hepatocelular (CHC), abeza y cuello (CEcyc) y melanoma (Mel). Se realizó mor, calculando el número de células positivas con el o de objetivo de 20x; Leve, 1 ~ < 10 células por campo de objetivo de 20x; Acentuada, 50 ~ < 200 células por o de 20x.

a de CD3, FoxP3 y OX40 en secciones FFPE (siglas ol e incluidas en parafina) adyacentes de muestras de e cabeza y cuello (CEcyc). La figura 15B es una vista mo FoxP3+ son una pequeña fracción de LIT CD3+ y ra 15C es una vista de mayor potencia que muestra la posible ubicación conjunta parcial de los LIT (Treg) O

La figura 16 muestra la capacidad de diversos anticuer

L) con células 293 transfectadas con OX40 humana ("

La figura 17 resume las relaciones de bloqueo de OX

La figura 18 muestra la capacidad de diversos anti

anticuerpo anti-OX40 con células 293-hOX40, según

marcada con PE y células no teñidas como controles.

Las figuras 19A-19C muestran la capacidad de divers

OX40.1 conjugado con aloficocianina (APC), con célul

19C), según lo evaluado por FACS. hIgG1 y/o hIgG4

Las figuras 19D-19G muestran la capacidad de divers

OX40.4 u OX40.5 conjugado con biotina, con células

controles.

La figura 19H resume los grupos de epítopos en relac

las figuras 19A-19C.

La figura 19I resume los grupos de epítopos en rel

mostrados en las figuras 19D-19G.

La figura 20A muestra que OX40.21 se une solo a OX4

de azúcares unidos a N.

Las figuras 20B y 20C muestran dos N-glucopéptidos

la desglucosilación: ocupación del 60 % tanto para As

La figura 20D representa las regiones en OX40 unida

La figura 20E muestra la identificación de los péptidos

EM (cromatografía líquida-espectrometría de masas).

Las figuras 21A-21D muestran los efectos de diverso

CD4+ primarias humanas cuando se cultivan conjunta

solo con células T, como controles se utilizaron célula

Las figuras 22A-22D muestran los efectos de divers

gamma (IFN-y) de células T CD4+ primarias humana

Solo con células CHO, solo con células T, como contr

con células T y hIgG1.

Las figuras 23A-23F muestran los efectos de diversos

de IL-2 a partir de células T primarias en cultivos de c

activadas con enterotoxina B estafilocócica (EBE), qu

La figura 24 muestra los efectos de diversos anticue

células CD4+ activadas.

Las figuras 25A y 25B muestran los efectos de divers

NK primarias de células T CD4+ activadas aisladas d

La figura 26 muestra los efectos de diversos anticuerp

macrófagos humanos primarios.

La figura 27 muestra el nivel de unión del compon

controles se utilizaron IgG1 e IgG1.1.

Las figuras 28A-28C muestran que OX40 se expresa e

limitado a células CD4+ con expresión mínima en cél

La figura 28D muestra que las células T CD4+ y las c

ratón.

La figura 28E muestra que las células T CD4+, las cél

tumores MC38 de ratón.

La figura 29 muestra la capacidad de diversos anticuer

T reguladoras (Treg) de células T CD4+ humanas.

anticuerpos anti-OX40 aumentaron la proliferación d

control de isotipo IgG1.

Las figuras 30A y 30B muestran el aclaramiento en mo

Dos de los monos mostraron aclaramiento acelerado

fármaco.

La figura 31 es un gráfico que representa los resulta

de antigenicidad de diversos anticuerpos anti-OX40,

CC-3.

Las figuras 32A-32C muestran los efectos de diferente

tiene las regiones variables de rata de OX86 y la reg

OX40 y OX40-L, es decir, un anticuerpo no bloqueant

volúmenes tumorales en ratones individuales tratados

de adenocarcinoma de colon MC38: (figura 32A) a

anticuerpo OX86 mIgG1 ("OX-40 mIgG1"), (figura 32

Las figuras 33A-33C muestran los efectos de diferent

número de células T reguladoras CD4+ en tumores y y FoxP3+ en CCR.

nti-OX40 para inhibir la unión del ligando OX40 (OX40-as 293-hOX40"), con hIgG1 como control.

ntre diversos anticuerpos anti-OX40.

os anti-OX40 para inhibir la unión del clon L106 del lúa por FACS, solo con L106 marcado con PE, mIgG1

ticuerpos anti-OX40 para inhibir la unión del anticuerpo 3-hOX40 (figuras 19A y 19B) o HT1080-hOX40 (figura lizaron como controles.

ticuerpos anti-OX40 para inhibir la unión del anticuerpo OX40. hIgG1 y estreptavidina-APC se utilizaron como

on OX40.1 basándose en los resultados mostrados en

con OX40.5 u OX40.4 basándose en los resultados

ana no reducida, independientemente de la presencia

se identificaron mediante mapeo peptídico después de 8 (figura 20B) como para AspN12 (figura 20C).

OX40.16, OX40.21 y OX40.8.

ocidos por OX40.16, OX40.21 y OX40.8 mediante CL-

icuerpos anti-OX40 sobre la proliferación de células T con células CHO-CD3-CD32A. solo con células CHO, cultivadas conjuntamente solo con células T y hIgG1. ticuerpos anti-OX40 sobre la secreción de interferón tivadas conjuntamente con células CHO-CD3-CD32A. e utilizaron células CHO cultivadas conjuntamente solo

uerpos anti-OX40 sobre la estimulación de la secreción mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana islaron de diferentes donantes.

anti-OX40 sobre la lisis inducida por células NK92 de

ticuerpos anti-OX40 sobre la lisis mediada por células donantes por proporciones de células NK:diana.

ti-OX40 sobre la fagocitosis de células 293-hOX40 por

C1q del complemento humano con OX40.21. Como

ocitos infiltrantes de tumor, con un patrón generalmente D8+.

s T reguladoras, expresan OX40 en tumores Sa1N de

CD8+ y las células T reguladoras, expresan OX40 en

nti-OX40 para invertir la supresión mediada por células en presencia como en ausencia de células Treg, los ulas T respondedoras (Tresp) en comparación con el

el anticuerpo OX40.6 administrado por vía intravenosa. se correlacionó con la formación de anticuerpos anti­

e proliferación de células T con respecto al porcentaje omo de muestras de control de calidad CC-1, CC-2 y

ipos del anticuerpo quimérico OX86 (un anticuerpo que onstante de ratón que no bloquea la interacción entre bre la actividad antitumoral medida por cambios en los estos isotipos (isotipos mIgG1 y mIgG2) en un modelo rpo IgG1 de ratón de control ("control"), (figura 32B) icuerpo OX86 mIgG2 ("OX-40 mIgG2a").

tipos (mIgG1 y mIgG2a) del anticuerpo OX86 sobre el iferia, y sobre el número de células en el bazo.

Las figuras 34A-34C muestran los efectos de los a

actividad antitumoral medida por cambios en los vo

anticuerpos indicados en el modelo de adenocarcin

humana ("Isotipo"), (figura 34B) anticuerpo quiméric

hIgG1-S267E ("OX86-hG1-S267E"). La sustitución

unión a los FcR (CD32A y CD32B). OX86-hIgG1 mo

Las figuras 35A-35D muestran los efectos del anticu

T reguladoras.

Las figuras 36A-36E muestran los efectos de un anti

decir, bloquea la interacción entre OX40 y el ligan

mediante cambios en los volúmenes tumorales en r

el modelo de tumor subcutáneo CT-26 de ratón. (

10 mg/kg, (Figura 36C) 8E5 a 3 mg/kg, (Figura 36D)

Las figuras 37A-37D muestran los efectos de la com

sobre la actividad antitumoral medida por cambios

con los anticuerpos indicados y la combinación en

control de isotipo, (Figura 37B) anticuerpo anti-PDI, (

anticuerpo anti-PDI ("anti-OX40 anti-PD1").

Las figuras 38A y 38B muestran la respuesta de rec

CD69+ los días 22 y 41, respectivamente. Los anim

de datos representan resultados de animales individ

CD4+CD8-. Las barras horizontales representan las

La figura 39 muestra la unión del anticuerpo con pro

de unión se representan gráficamente como un porc

unión mAb:FcYR de 1:1. Las barras de cada anticuer

color en la parte inferior de la diapositiva.

La figura 40 muestra la unión del anticuerpo con pro

de unión se representan gráficamente como un porc

unión mAb:FcYR de 1:1. Las barras de cada anticuer

color en la parte inferior de la diapositiva.

Las figuras 41A-41D muestran los efectos de la com

un anticuerpo anti-CTLA-4 (9D9-mG2b) sobre la a

tumorales en ratones individuales tratados. con lo

adenocarcinoma de colon CT26: (Figura 41A) control

OX86-rG1, (Figura 41D) OX86-rG1 anticuerpo anti

La figura 42 es un esquema del protocolo de ensayo

La figura 43 es un esquema del programa de visitas

Descripción detallada

En el presente documento se describen anticuerpos

anticuerpos monoclonales humanos, que se unen esp

posterior de OX40 ("anticuerpos anti-OX40 agonistas"

caracterizan por características funcionales particulare

tales como regiones CDR que comprenden secuencias

proporcionan anticuerpos aislados, métodos para pr

moléculas biespecíficas que comprenden dichos anti

contener los anticuerpos. En el presente documento tam

mejorar la respuesta inmunitaria, solos o junto con otros

contra el cáncer. Por consiguiente, los anticuerpos antien un tratamiento en una amplia diversidad de aplicaci

crecimiento tumoral y el tratamiento de infecciones vírica

Definiciones

Para que la presente descripción pueda entenderse

términos. A lo largo de la descripción detallada se expon

El término "OX40", como se usa en el presente documen

de receptores de TNF, que se une al ligando OX40 (OX4

necrosis tumoral, miembro 4 (TNFRSF4, por las siglas

"OX40" incluye cualquier variante o isoforma de OX40

los anticuerpos descritos en el presente documento pu

distintas a la humana (por ejemplo OX40 de macaco

específicos para OX40 humana y no presentar ninguna r

sus variantes e isoformas, puede aislarse de células o rpos quiméricos OX86 con una IgG1 humana sobre la nes tumorales en ratones individuales tratados con los de colon MC38: (figura 34A) control de isotipo de IgG1 86-hIgG1 ("OX86-hG1"), (figura 34C) anticuerpo OX86-en hIgG1 aumenta su función efectora al aumentar la uerte actividad antitumoral.

quimérico OX86 hIgG1 sobre el agotamiento de células

po de hámster anti-OX40 de ratón (8E5) bloqueante (es X40) a diferentes dosis sobre la actividad antitumoral s individuales tratados con los anticuerpos indicados en a 36A) control de Ig de hámster, (Figura 36B) 8E5 a a 1 mg/kg, (Figura 36E) 8E5 a 0,3 mg/kg.

pia con el anticuerpo OX86-rG1 y un anticuerpo anti-PDI volúmenes tumorales en ratones individuales tratados delo de adenocarcinoma de colon MC38: (Figura 37A) a 37C) OX86-rG1 ("anti-OX40"), (Figura 36D) OX86-rG1

ex vivo contra KLH, células T CD4+CD8- que expresan e inmunizaron con KLH el día 1 del estudio. Los puntos (machos y hembras) como un porcentaje de células T as de los grupos.

s FcYR-his capturadas por anti-his Fab. Las respuestas e de la Rmáx teórica suponiendo una estequiometría de muestran en el orden proporcionado por las leyendas a

s FcgR-his capturadas por anti-his Fab. Las respuestas e de la Rmáx teórica suponiendo una estequiometría de muestran en el orden proporcionado por las leyendas a

pia con un anticuerpo anti-OX40 agonista (OX86-rG1) y ad antitumoral medida por cambios en los volúmenes icuerpos indicados y la combinación en el modelo de otipo, (Figura 41B) anticuerpo anti-CTLA-4, (Figura 41C) A-4.

o en fase 1/2a.

studio del ensayo clínico en fase 1/2a.

os, particularmente anticuerpos monoclonales, p. ej., amente a OX40 y, por lo tanto, activan la señalización s anticuerpos descritos en el presente documento se comprenden características estructurales particulares, aminoácidos específicas. En el presente documento se r dichos anticuerpos anti-OX40, inmunoconjugados y os, y composiciones farmacéuticas formuladas para se proporcionan métodos de uso de los anticuerpos para es inmunoestimuladores (p. ej., anticuerpos) y/o terapias 0 descritos en el presente documento pueden utilizarse terapéuticas, incluyendo, por ejemplo, la inhibición del

fácilmente, en primer lugar, se definen determinados efiniciones adicionales.

refiere a un receptor que es miembro de la superfamilia El OX40 también se conoce como receptor del factor de inglés), ACT35, IMD16, TXGP1L y c D134. El término as células expresen de forma natural. Por consiguiente, reaccionar de manera cruzada con OX40 de especies rejero). Como alternativa, los anticuerpos pueden ser vidad cruzada con otras especies. OX40 o cualquiera de os que los expresen de forma natural o producirse de manera recombinante utilizando técnicas bien conoci

documento.

En el SEQ ID NO: 1 se expone la secuencia de a

NP_003318.1). En el SEQ ID NO: 2 se expone la secuen

madura. En el SEQ ID NO: 3 se expone la secuencia d

NO: 4 se expone la secuencia de aminoácidos de OX40

Las expresiones "muerte programada 1", "muerte celul

"hPD1" y "hPD-I", como se usan en el presente docume

homólogos de especie de PD-1 humana, y análogos qu

completa de PD-1 puede encontrarse en el GenBank co

Las expresiones "antígeno 4 asociado a linfocitos T cit

(véase, p. ej., Murata (1999) Am. J. Pathol. 155:453-4

homólogos de especie de CTLA-4 humano, y análogos

Balzano (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:28-32). En el n.

completa del CTLA-4 humano.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente

fragmento de unión a antígeno (es decir, la "parte de u

realización, un "anticuerpo" se refiere, a una glucoproteí

y dos cadenas ligeras (L, light) interconectadas por enla

Cada cadena pesada comprende una región variable d

Vh) y una región constante de cadena pesada. En dete

región constante de cadena pesada comprende tres d

origen natural, cada cadena ligera comprende una r

documento como V^l) y una región constante de caden

dominio, CL. Las regiones V^h y V^l pueden subdividir

regiones determinantes de la complementariedad (

intercaladas con regiones que están más conservadas

"framework regions"). Cada Vh y Vl está compuesta p

extremo carboxílico en el siguiente orden: FR1, CDR1,

cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de uni

de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la

incluyendo diversas células del sistema inmunitario (p.

complemento clásico (C1q).

Los anticuerpos normalmente se unen específicamente

de disociación (Kd) de 10'7 a 10'11 M o menor. En

aproximadamente 10'6 M, indica unión no específica. C

une específicamente" a un antígeno, se refiere a un anti

idénticos con alta afinidad, lo que significa que tiene un

incluso más preferentemente de 5 x 10'9 M y lo más pr

une con alta afinidad a antígenos no relacionados. Un a

caso de que muestre un alto grado de identidad de secu

un 80 %, al menos un 90 %, preferentemente al menos

más preferentemente al menos un 99 % de identidad de

un anticuerpo que se une específicamente a OX40 hum

de determinadas especies de primates no humanos (

manera cruzada con OX40 de otras especies (p. ej., OX

Una inmunoglobulina puede ser de cualquiera de los iso

IgA, IgA secretora, IgG e IgM. El isotipo IgG se divide

IgG4 en seres humanos, e IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3

anti-OX40 descritos en el presente documento son del s

en diversos alotipos, que difieren entre sí a lo sumo e

ejemplo, anticuerpos tanto de origen natural como de

anticuerpos quiméricos y humanizados; anticuerpos hu

y anticuerpos monocatenarios.

La expresión "parte de unión a antígeno" de un anticuer

más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capa

de ser humano). Se ha demostrado que la función de

fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Com

"parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, p. ej., un en el campo técnico y/o las descritas en el presente

cidos del precursor de OX40 humana (n.° de registro e aminoácidos del dominio extracelular de OX40 humana noácidos de OX40 de macaco cangrejero. En el SEQ ID mano.

gramada 1", "proteína PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", se usan indistintamente e incluyen variantes, isoformas, en al menos un epítopo común con PD-1. La secuencia n.° de registro U64863.

os", "CTLA-4", "CTLA4", "antígeno CTLA-4" y "CD152" e usan indistintamente, e incluyen variantes, isoformas, tienen al menos un epítopo como CTLA-4 (véase, p. ej., registro LI 5006 del GenBank se expone una secuencia

ento, puede incluir anticuerpos completos y cualquier antígeno") o cadenas sencillas de los mismos. En una e comprende al menos dos cadenas pesadas (H, heavy) isulfuro, o una parte de unión a antígeno de las mismas. ena pesada (abreviada en el presente documento como dos anticuerpos de IgG, IgD e IgA de origen natural, la os, CH1, CH2 y CH3. En determinados anticuerpos de variable de cadena ligera (abreviada en el presente ra. La región constante de cadena ligera comprende un demás en regiones de hipervariabilidad, denominadas , del inglés "complementarity determining regions"), ominadas regiones marco conservadas (FR, del inglés s CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amínico al CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las e interacciona con un antígeno. Las regiones constantes noglobulina con los tejidos o factores del hospedador, lulas efectoras) y el primer componente del sistema del

ntígeno afín con alta afinidad, reflejada por una constante al, se considera que cualquier Kd que sea mayor de se usa en el presente documento, un anticuerpo que "se o que se une al antígeno y a antígenos sustancialmente de 10'7 M o menor, preferentemente de 10'8M o menor, temente entre 10'8M y 10'1°M o menor, pero que no se no es "sustancialmente idéntico" a un antígeno dado en con el antígeno dado, por ejemplo, si presenta al menos 5 %, más preferentemente al menos un 97 % o incluso ncia con la secuencia del antígeno dado. Como ejemplo, ambién puede reaccionar de manera cruzada con OX40 de macaco cangrejero), pero no puede reaccionar de urina) o con un antígeno distinto a OX40.

comúnmente conocidos, incluyendo, pero sin limitación, bclases en determinadas especies: IgG1, IgG2, IgG3 e atones. En determinadas realizaciones, los anticuerpos IgG1 o IgG2. Las inmunoglobulinas, p. ej., IgG1, existen unos aminoácidos. Un "anticuerpo" puede incluir, como n no natural; anticuerpos monoclonales y policlonales; s y no humanos; anticuerpos completamente sintéticos;

mo se usa en el presente documento, se refiere a uno o de unirse específicamente a un antígeno (p. ej., a OX40 a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante mplos de fragmentos de unión incluidos en la expresión uerpo anti-OX40 descrito en el presente documento, se incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalen

fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprend

región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los

dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v)

que consiste en un dominio V^h; y (vi) una región deter

combinación de dos o más CDR aisladas que opcionalm

Asimismo, aunque los dos dominios del fragmento Fv,

pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, medi

una sola cadena de proteína en la cual las regiones V

(conocidas como Fv monocatenaria (scFv, single chainF

Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5

monocatenarios se incluyan en la expresión "parte de

construcciones se describen en Chan & Carter (2010) Na

obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas p

para determinar su utilidad del mismo modo que los anti

producir mediante técnicas de ADN recombinante, o m

intactas.

Un "anticuerpo bifuncional" o "biespecífico" es un anti

pesadas/ligeras diferentes y dos sitios de unión diferentes

una diversidad de métodos que incluyen la fusión de

Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321

La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el

una única afinidad y especificidad de unión por un epítopo

los anticuerpos muestran una única afinidad y especificid

anticuerpos monoclonales procederán de una sola célu

propagarán sin introducir de manera intencionada ningun

"anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticu

opcionales procedentes de secuencias de inmunoglobu

hibridoma produce anticuerpos monoclonales humanos,

un animal transgénico o transcromosómico no humano

comprenda un transgén de cadena pesada humana y un

La expresión "anticuerpo humano recombinante", co

anticuerpos humanos que se preparan, expresan, cr

anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón)

inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a

hospedadora transformada para expresar el anticuerpo, p

una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos r

creados o aislados por cualquier otro medio que i

inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN.

regiones variables y constantes que utilizan secuencias p

que están codificadas por genes de línea germinal, pero

se producen, por ejemplo, durante la maduración del anti

(2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125), la región var

codificado por diversos genes que se reordenan para f

Además del reordenamiento, adicionalmente, la región v

aminoácido (conocidos como mutación o hipermutación

antígeno extraño. La región constante cambiará en resp

Por lo tanto, las secuencias de ácidos nucleicos reo

polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada de inmu

idénticas a las secuencias de la línea germinal original, si

tendrán una identidad de al menos 80 %).

Un anticuerpo "humano" (HuMAb) se refiere a un anticuer

marco conservadas como las CDR proceden de secu

Asimismo, si el anticuerpo contiene una región constant

inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los antic

restos de aminoácido no codificados por secuencias

mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o esp

embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se us

en los que las secuencias de CDR procedentes de la lí

ratón, se hayan injertado en secuencias estructurales

"completamente humanos" se usan indistintamente.

que consiste en los dominios Vl, Vh, CL y CH1; (ii) un dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la inios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), ante de la complementariedad (CDR) aislada o (vii) una te pueden estar unidas mediante un enlazador sintético. y V^h, estén codificados por genes independientes, estos e un enlazador sintético que les permite formarse como V^h se emparejan para formar moléculas monovalentes véase, p. ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y 9-5883). También se pretende que dichos anticuerpos ón a antígeno" de un anticuerpo. Estas y otras posible ev. Immunol. 10:301. Estos fragmentos de anticuerpo se los expertos en la materia y los fragmentos se exploran rpos intactos. Las partes de unión a antígeno se pueden nte escisión enzimática o química de inmunoglobulinas

erpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas os anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante ridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, p. ej., 90); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

sente documento, ser refiere a un anticuerpo que muestra rticular o una composición de anticuerpos en la que todos de unión por un epítopo particular. Normalmente, dichos o de un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, y se lteración en la secuencia. Por consiguiente, la expresión o monoclonal que tiene regiones variables y constantes a de la línea germinal humana. En una realización, un r ejemplo, obtenido fusionando una célula B, obtenida de . ej., un ratón transgénico que tenga un genoma que adena ligera), con una célula inmortalizada.

se usa en el presente documento, incluye todos los o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) e es transgénico o transcromosómico para genes de rtir del mismo, (b) anticuerpos aislados de una célula j., a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de ombinantes y (d) anticuerpos preparados, expresados, ique el corte y empalme de secuencias génicas de chos anticuerpos humanos recombinantes comprenden iculares de inmunoglobulina de la línea germinal humana incluyen reordenamientos y mutaciones posteriores que erpo. Como se sabe en la técnica (véase, p. ej., Lonberg le contiene el dominio de unión a antígeno, que está ar un anticuerpo específico para un antígeno extraño. ble puede modificarse con múltiples cambios de un solo mática) para aumentar la afinidad del anticuerpo por el ta adicional a un antígeno (es decir, cambio de isotipo). anizadas y somáticamente mutadas que codifican los lobulina en respuesta a un antígeno, puede que no sean que serán sustancialmente idénticas o similares (es decir,

que tiene regiones variables en las que tanto las regiones cias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. la región constante también procede de secuencias de rpos descritos en el presente documento pueden incluir inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej., ífica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin n el presente documento, no pretende incluir anticuerpos germinal de otra especie de mamífero, tal como de un Las expresiones anticuerpos "humanos" y anticuerpos Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo

de los dominios CDR de un anticuerpo no humano, se r

inmunoglobulinas humanas. En una realización de una

todos los aminoácidos fuera de los dominios CDR,

humanas, mientras que algunos, la mayoría o todos los

sin cambios. Pequeñas adiciones, deleciones, inserci

permitidas siempre que no anulen la capacidad del a

"humanizado" conserva una especificidad antigénica si

Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en

regiones constantes proceden de otra especie, tal com

un anticuerpo de ratón y las regiones constantes proced

Como se usa en el presente documento, "isotipo" se re

IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE) que codifican los genes de l

"Alotipo" se refiere a variantes de origen natural dentro

unos pocos aminoácidos (véase, p. ej., Jefferis et al.

documento pueden ser de cualquier alotipo. Como se

como de isotipo "IgG1f" o "IgG1.1f" son anticuerpos de

decir, que tienen 214R, 356E y 358M según el índice

(véanse los restos subrayados en el SEQ ID NO: 5 de l

En el presente documento, las expresiones "un anticue

para un antígeno", se usan indistintamente con la expres

Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente

sustancialmente de otros anticuerpos que tienen difere

que se une específicamente a OX40 carece sustancialm

distintos de OX40). Sin embargo, un anticuerpo aislad

tener reactividad cruzada con otras proteínas OX40 de

Como se usa en el presente documento, un anticuerp

anticuerpo que inhibe la unión de OX40-L con OX40, p.

una CE50 de aproximadamente 1 pg/ml o menor, tal co

0,85 pg/ml o menor, aproximadamente 0,8 pg/ml o men

0,7 pg/ml o menor, aproximadamente 0,65 pg/ml o me

0,55 pg/ml o menor, aproximadamente 0,5 pg/ml o men

0,4 pg/ml o menor, aproximadamente 0,35 pg/ml o me

0,25 pg/ml o menor, aproximadamente 0,2 pg/ml

aproximadamente 0,1 pg/ml o menor, en métodos reco

en FACS descritos en el presente documento.

Una "función efectora" se refiere a la interacción de una

acontecimiento bioquímico que resulte de la misma. La

citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unió

como ADCC (siglas del inglés antibody-dependent cellu

de anticuerpos) y fagocitosis mediada por células de

dependent cell mediatedphagocytosis) y regulación ne

de células B; RCB). Dichas funciones efectoras general

de unión (p. ej., un dominio variable de anticuerpo).

Un "receptor de Fc" o "FcR" es un receptor que se une

a anticuerpo de IgG comprenden receptores de la famili

y empalme alternativas de estos receptores. La familia

F^cyRIV en ratones; F^cyRIA, F^cyRIIA y F^cyRIIIA en sere

resumen diversas propiedades de F^cyR humanos. La

uno o más FcyR activadores y el inhibidor FcyRIIB,

selectivamente un receptor Fc activador (F^cyRIII en rato

en ratones y seres humanos. La IgG1 humana se une

que es equivalente a la IgG2a murina con respecto a lo que algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera lazan por aminoácidos correspondientes procedentes de a humanizada de un anticuerpo, algunos, la mayoría o n reemplazado por aminoácidos de inmunoglobulinas ácidos dentro de una o más regiones CDR permanecen sustituciones o modificaciones de aminoácidos, están rpo para unirse a un antígeno concreto. Un anticuerpo la del anticuerpo original.

e las regiones variables proceden de una especie y las nticuerpo en el que las regiones variables proceden de un anticuerpo humano.

a la clase de anticuerpo (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ón constante de la cadena pesada.

grupo de isotipo específico, cuyas variantes difieren en ) mAbs 1:1). Los anticuerpos descritos en el presente n el presente documento, los anticuerpos denominados e IgG1.1 sin efector, respectivamente, del alotipo "f", es e Kabat, como se muestra, p. ej., en el SEQ I^d NO: 5 23).

ue reconoce a un antígeno" y "un anticuerpo específico n anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".

mento, pretende referirse a un anticuerpo que carece specificidades antigénicas (p. ej., un anticuerpo aislado e anticuerpos que se unen específicamente a antígenos se une específicamente a un epítopo de OX40 puede ntes especies.

"inhibe la unión de OX40-L con OX40" se refiere a un n ensayos de unión que utilizan células 293-hOX40, con aproximadamente 0,9 pg/ml o menor, aproximadamente roximadamente 0,75 pg/ml o menor, aproximadamente proximadamente 0,6 pg/ml o menor, aproximadamente roximadamente 0,45 pg/ml o menor, aproximadamente proximadamente 0,3 pg/ml o menor, aproximadamente enor, aproximadamente 0,15 pg/ml o menor, o de s en la materia, p. ej., en los ensayos de unión basados

n Fc de anticuerpo con un receptor o ligando de Fc, o un ciones efectoras" ilustrativas incluyen la unión del C1q, ceptor Fc, funciones efectoras mediadas por F^cyR, tales totoxicity, citotoxicidad mediada por células dependiente ente de anticuerpos (ADCP, siglas del inglés antibody de un receptor de la superficie celular (p. ej., el receptor requieren que la región Fc se combine con un dominio

egión Fc de una inmunoglobulina. Los FcR que se unen R, incluyendo las variantes alélicas y las formas de corte consiste en tres receptores activadores (FcyRI, FcyRIII y anos) y un receptor inhibidor (F^cyRIIB). En la tabla 1 se ía de los tipos de células efectoras innatas coexpresan s que los linfocitos citolíticos naturales (NK) expresan F^cyRIIIA en seres humanos) pero no el F^cyRIIB inhibidor ayoría de los receptores de Fc humanos y se considera de receptores de Fc activadores a los que se unen.

Tabla 1. Pro iedade e los FcR humanos

Una "región Fc" (región de fragmento cristalizable) o "do

pesada de un anticuerpo que media en la unión de la i

incluyendo la unión con receptores Fc ubicados en diver

o con el primer componente del sistema del complemento

constante de un anticuerpo excluyendo el primer dominio

En los isotipos de los anticuerpos de IgG, IgA e IgD, la r

cada una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo;

constantes de cadena pesada (dominios Ch 2-4) en cada

dominios Cy2 y Cy3 de inmunoglobulina y la bisagra entre

pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc d

como un tramo desde un resto de aminoácido en la

aminoácidos) hasta el extremo carboxílico de la cadena

Kabat. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Im

MD; véanse también las figuras 3C-3F de la publicación d

El dominio C^h2 de una región Fc de la IgG humana se

aproximadamente el aminoácido 340, mientras que el do

una región Fc, es decir, se extiende desde aproximadame

447 de una IgG. Como se usa en el presente docume

incluyendo cualquier variante alotípica, o una Fc varian

referirse a esta región de forma aislada o en el contexto

"proteína de unión que comprende una región Fc", tambi

o una inmunoadhesina).

Una "bisagra", un "dominio bisagra" o una "región bisagra

de una región constante de cadena pesada que une el do

media e inferior de la bisagra (Roux et al. J. Immunol. 1

flexibilidad entre las regiones de unión y efectoras de

disulfuro, intermolecular, entre las dos regiones const

documento, en todos los isotipos de IgG, una bisagra co

Immunol 161:4083). En las tablas 2 y 23 se muestran las

_______________________________ Tabla 2. Aminoácid

Tipo de Ig Ch1* C-terminal Bisagra superior

IgG1 VDKRV (SEQ ID EPKSCDKTHT

NO: 186) (SEQ ID NO: 1 o Fc" o "Fc" se refiere a la región C-terminal de la cadena unoglobulina con los tejidos o factores del hospedador, células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) ásico (C1q). Por tanto, una región Fc comprende la región inmunoglobulina de región constante (p. ej., CH1 o CL). ión Fc comprende los dominios constantes C^h2 y C^h3 en s regiones Fc de IgM e IgE comprenden tres dominios dena polipeptídica. En la IgG, la región Fc comprende los 1 y Cy2. Aunque los límites de la región Fc de una cadena adena pesada de la IgG humana generalmente se define ición C226 o P230 (o un aminoácido entre estos dos sada, en donde la numeración es según el índice EU de ological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, olicitud de patente de Estados Unidos n.° 2008/0248028. iende desde aproximadamente el aminoácido 231 hasta io C^h3 se sitúa en el lado C-terminal de un dominio C^h2 en el aminoácido 341 hasta aproximadamente el aminoácido , la región Fc puede ser una Fc de secuencia nativa, (p. ej., una Fc de origen no natural). Fc también puede un polipéptido de proteína que comprende Fc, como una denominada "proteína de fusión Fc" (p. ej., un anticuerpo

una "región bisagra de anticuerpo", se refiere al dominio nio CH1 con el dominio CH2 e incluye las partes superior, 161:4083). La bisagra proporciona niveles variables de anticuerpo y también proporciona sitios para el enlace tes de cadena pesada. Como se usa en el presente nza en Glu216 y termina en Gly237 (Roux et al., 1998 J cuencias de las bisagras de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

de la región bisagra_______________________________ Bisagra central Bisagra inferior

CPPCP (SEQ ID NO: 192) APELLGG

(SEQ ID NO:

200⁾

(EPKSCDTPPPCPRCP)3 ⁾ (SEQ ID NO: 194)

___________________________________________ (cont

Tipo de Ig C^h1* C-terminal Bisagra superior

lgG3 VDKRV (SEQ ID ELKTPLGDTT

(17-15-15) NO; 186) (SEQ ID NO:

IgG3 (17­ ELKTPLGDTT

15)

(SEQ ID NO:

IgG3

(15-15-15)

IgG3 (15) VDKRV (SEQ ID EPKS (SEQ ID

NO: 190)

186)

IgG4 VDKRV (SEQ ID ESKYGPP (SE

NO: 186) NO: 191)

secuencias de aminoácidos en C-terminal de los domi

El término "bisagra" incluye bisagras de tipo silvestre (tal

las mismas (p. ej., bisagras de no origen natural o bisagr

incluye la bisagra de IgG2 de tipo silvestre, como se mu

3, 1-5, 3-5 y/o, como mucho, 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones

bisagra de IgG2 ilustrativas incluyen bisagras de IgG2 e

se cambian por otro aminoácido. En una realización e

determinadas realizaciones, una bisagra es una bisagr

isotipos. Por ejemplo, una bisagra puede comprender la

resto de la bisagra de uno u más isotipos distintos. Por

puede comprender, p. ej., las bisagras superior y centr

tener función efectora o puede estar desprovista de fun

silvestre proporciona función efectora.

La expresión "dominio CH1" se refiere a la región const

bisagra en un dominio constante de la cadena pesada.

comienza en A118 y termina en V215. La expresión "do

que tienen el SEQ ID NO: 202 para la IgG1 y el SEQ ID

ej., dominios CH1 de origen no natural o dominios CH1

dominios CH1 de tipo silvestre y variantes que tienen

mutaciones, p. ej., sustituciones, deleciones o adicion

mutaciones que modifican una actividad biológica de un

presente documento se proporcionan modificaciones en

anticuerpo.

La expresión "dominio CH2" se refiere a la región const

CH3 en un dominio constante de la cadena pesada. Com

en P238 y termina en K340. La expresión "dominio CH2"

el SEQ ID NO: 204 para la IgG1 y el SEQ ID NO: 205 pa

CH2 de origen no natural o dominios CH2 modificados)

CH2 de tipo silvestre y variantes que tienen 1, 2, 3, 4, 5,

ej., sustituciones, deleciones o adiciones. Dominios C

modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal

realizaciones, un dominio CH2 comprende las sustituci

presente documento se proporcionan otras modificacion

un anticuerpo.

ción)_______________________________________ Bisagra central Bisagra inferior

CPRCP

(EPKSCDTPPPCPRCP)2

(SEQ ID NO: 195)

CPRCP

(EPKSCDTPPPCPRCP)i

(SEQ ID NO: 196)

CDTPPPCPRCP

(EPKSCDTPPPCPRCP)2

(SEQ ID NO: 197)

CDTPPPCPRCP (SEQ ID NO: APELLGG

198) (SEQ ID NO:

200⁾

CPSCP (SEQ ID NO: 199) APEFLGG

(SEQ ID NO 200⁾

CH1.

mo las expuestas en la tabla 23), así como variantes de odificadas). Por ejemplo, la expresión "bisagra de IgG2" en la tabla 23, y las variantes que tienen 1,2, 3, 4, 5, 1­ ej., sustituciones, deleciones o adiciones. Variantes de que 1,2, 3 o las 4 cisteínas (C219, C220, C226 y C229) ífica, una IgG2 comprende una sustitución C219S. En brida que comprende las secuencias de al menos dos gra superior, bisagra central o inferior de un isotipo y el plo, una bisagra puede ser una bisagra de IgG2/IgG1, y IgG2 y la bisagra inferior de IgG1. Una bisagra puede efectora. Por ejemplo, una bisagra inferior de IgG1 tipo

de la cadena pesada que une el dominio variable con la mo se usa en el presente documento, el dominio CH1 CH1" incluye dominios CH1 de tipo silvestre (como los 203 para la IgG2; tabla 23), así como sus variantes (p. icados). Por ejemplo, la expresión "dominio CH1" incluye 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o, como mucho, 5, 4, 3, 2, o 1 Dominios CH1 ilustrativos incluyen dominios CH1 con cuerpo, tal como la ADCC, la CDC o la semivida. En el ominio CH1 que afectan a una actividad biológica de un

de la cadena pesada que une la bisagra con el dominio usa en el presente documento, el dominio CH2 comienza uye dominios CH2 de tipo silvestre (como los que tienen IgG2; Tabla 23), así como sus variantes (p. ej., dominios r ejemplo, la expresión "dominio CH2" incluye dominios 1-5, 3-5 y/o, como mucho, 5, 4, 3, 2, o 1 mutaciones, p. ustrativos incluyen dominios CH2 con mutaciones que o la ADCC, la CDC o la semivida. En determinadas A330S/P331S que reducen la función efectora. En el l dominio CH2 que afectan a una actividad biológica de La expresión "dominio CH3" se refiere a la región constan

respecto al dominio CH2 en un dominio constante de la

dominio CH3 comienza en G341 y termina en K447. La ex

(como los que tienen el SEQ ID NO: 206 para la IgG1 y

variantes (p. ej., dominios CH3 de origen no natural o do

CH3" incluye dominios CH3 de tipo silvestre y variantes

3, 2, o 1 mutaciones, p. ej., sustituciones, deleciones o

con mutaciones que modifican una actividad biológica de

el presente documento se proporcionan modificaciones

un anticuerpo.

Una "región Fc de secuencia nativa" o "Fc de secuencia

idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc

secuencia nativa incluyen una región Fc de IgG1 huma

secuencia nativa; una región Fc de IgG3 humana de secu

nativa así como variantes de las mismas de origen natur

de las Fc (véase, p. ej., Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1).

El término "epítopo"o la expresión "determinante antigé

que se une específicamente una inmunoglobulina o un an

proteicos a partir de aminoácidos tanto contiguos (nor

yuxtapuestos, a través de un plegamiento terciario de

epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos,

exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que l

se pierden al tratarlos con disolventes desnaturalizantes.

10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación

determinar qué epítopos se unen a través de un anticuer

ensayos de inmunotransferencia e inmunoprecipitación, e

se analizan con respecto a su reactividad con un anticuer

determinar la conformación espacial de epítopos incluyen

documento, por ejemplo, cristalografía por rayos X, reso

siglas del inglés Hydrogen Deuterium Exchange Mass

hidrógeno/deuterio) (véase, p. ej., Epitope Mapping Prot

Ed. (1996)).

La expresión "mapeo epitópico" se refiere al proceso d

antígeno implicado en el reconocimiento de anticuerpo-a

La expresión "se une al mismo epítopo" en referencia a d

al mismo grupo de restos de aminoácido, como se determ

anticuerpos se unen al "mismo epítopo en OX40" con lo

métodos de mapeo epitópico reconocidos en la técnica, antígeno:anticuerpo que proporcionan resolución atómica hidrógeno/deuterio (HDX-MS). Otros métodos monitoriza

fragmentos proteolíticos) o con variaciones mutadas del a

de un resto de aminoácido dentro de la secuencia del

componente epitópico (p. ej., mutagénesis de rastreo co

Además, para el mapeo epitópico, también pueden utiliza

se basan en la capacidad del anticuerpo de interés para

combinatorias de péptidos de presentación en fagos. Es

VL, o estrechamente relacionadas, o las mismas secuen

Anticuerpos que "compiten con otro anticuerpo por la unió

o completamente) la unión del otro anticuerpo con la dian

diana, es decir, si un anticuerpo inhibe la unión del otro ant

utilizando experimentos de competición conocidos. En

diana e inhibe la unión de otro anticuerpo con una diana,

80 %, 90 % o 100 %. El nivel de inhibición o competición

"anticuerpo bloqueante" (es decir, el anticuerpo sensible

competición se pueden realizar como se describe, por eje

2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 o en el capítulo 11 of "

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1

a un epítopo solapante o a epítopos adyacentes (p. ej., c

Otros ensayos de unión competitiva reconocidos en la té de la cadena pesada que está en posición C-terminal con ena pesada. Como se usa en el presente documento, el sión "dominio CH3" incluye dominios CH3 de tipo silvestre SEQ ID NO: 207 para la IgG2; Tabla 23), así como sus ios CH3 modificados). Por ejemplo, la expresión "dominio tienen 1,2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o, como mucho, 5, 4, iones. Dominios CH3 ilustrativos incluyen dominios CH3 anticuerpo, tal como la ADCC, la CDC o la semivida. En el dominio CH3 que afectan a una actividad biológica de

ativa" comprende una secuencia de aminoácidos que es contrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de de secuencia nativa; una región Fc de IgG2 humana de cia nativa; y una región Fc de IgG4 humana de secuencia Las Fc de secuencia nativa incluyen los diversos alotipos

o" se refieren a un lugar en un antígeno (p. ej., OX40) al erpo. Se pueden formar epítopos dentro de los antígenos lmente un epítopo lineal) o aminoácidos no contiguos proteína (normalmente un epítopo conformacional). Los rmalmente, aunque no siempre, se conservan tras su epítopos formados por plegamiento terciario normalmente epítopo normalmente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, pacial única. En la técnica se conocen métodos bien para dado (es decir, mapeo epitópico) e incluyen, por ejemplo, onde los péptidos solapantes o contiguos (p. ej., de OX40) dado (p. ej., un anticuerpo anti-OX40). Los métodos para técnicas en la especialidad y las descritas en el presente cia magnética nuclear bidimensional y HDX-MS (por las ctrometry, espectrometría de masas con intercambio de ls in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris,

dentificación de los determinantes moleculares sobre el eno.

o más anticuerpos, significa que los anticuerpos se unen por un método dado. Las técnicas para determinar si los nticuerpos descritos en el presente documento incluyen les como análisis de rayos X de cristales de complejos el epítopo y espectrometría de masas con intercambio de unión del anticuerpo con fragmentos de antígeno (p. ej., eno donde la pérdida de unión debida a una modificación tígeno se considera a menudo como un indicio de un lanina - Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081). métodos combinatorios computacionales. Estos métodos lar por afinidad péptidos cortos específicos de bibliotecas esperar que los anticuerpos que tengan la misma VH y ^c DR1, 2 y 3 se unan al mismo epítopo.

on una diana" se refiere a anticuerpos que inhiben (parcial Si dos anticuerpos compiten entre sí por la unión con una erpo con una diana y en qué medida, puede determinarse rminadas realizaciones, un anticuerpo compite con una al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, ede ser diferente dependiendo de qué anticuerpo sea el río que se incube primero con la diana). Los ensayos de lo, en Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harb Protoc; ng Antibodies" de Ed Harlow y David Lane, Cold Spring . Los anticuerpos competidores se unen al mismo epítopo, o se demuestra mediante impedimento estérico).

ca incluyen: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (IEE) directo o

(véase Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (19

Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensayo de

marcaje directo en fase sólida (véase Harlow y Lane,

(1988)); RIA de marcaje directo en fase sólida utilizando

(1988)); IEE directo con biotina-avidina en fase sólida (

directo. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1

Como se usa en el presente documento, las expresiones

y "se une específicamente", se refieren a la unión del a

pero no con otros antígenos. Habitualmente, el anticuer

(Kd) de aproximadamente menor de 10'7 M, tal como a

inferior cuando se determina, p. ej., mediante tecnología

de resonancia de plasmón superficial (RPS) de BIACO

humana recombinante, como analito y el anticuerpo co

afinidad que es al menos dos veces mayor que su afi

caseína) distinto del antígeno predeterminado o un a

anticuerpo que "se une específicamente a OX40 humana

o unida a célula con una K^d de 10'7 M o menor, tal como

inferior. Un anticuerpo que "reacciona de manera cruzad

que se une a OX40 de macaco cangrejero con una K^d

8M, 10'9M o 10'10M o incluso inferior. En determinadas

cruzada con OX40 de una especie no humana (p. ej., OX

a estas proteínas en ensayos de unión convencionales.

El término "kasoc" o "ka", como se usa en el presente do

asociación de una interacción anticuerpo-antígeno partic

presente documento, pretende referirse a la constante

antígeno particular. El término "Kd", como se usa en el

disociación en equilibrio, que se obtiene de la relación de

concentración molar (M). Utilizando métodos bien establ

de los anticuerpos. Un método preferido para determinar

plasmón superficial, preferentemente utilizando un siste

citometría de flujo y análisis de Scatchard.

Como se usa en el presente documento, la expresión "alt

que tiene una K^d de 10‘8 M o menor, más preferentemen

10 M o menor por un antígeno diana. Sin embargo, la

anticuerpo. Por ejemplo, la unión de "alta afinidad" para

10‘7M o menor, más preferentemente de 10‘8 M o menor.

El término "CE50", en el contexto de un ensayo in vitro

antígeno del mismo, se refiere a la concentración de un

que induce una respuesta que es el 50 % de la respuest

de la situación inicial.

La expresión "se une a OX40 inmovilizada", se refiere

documento para unirse a OX40, por ejemplo, expresado

La expresión "reacciona de manera cruzada" como se u

anticuerpo descrito en el presente documento para unirse

descrito en el presente documento que se une a OX40 h

OX40 de macaco cangrejero). Como se usa en el pr

detectando una reactividad específica con el antígeno p

a, o la interacción funcional con, células que expresa

reactividad cruzada incluyen ensayos de unión conven

ejemplo, mediante análisis por resonancia de plasmón s

BIACORE® 2000 (Biacore A^b , Uppsala, Suecia) o técnic

La expresión "de origen natural", como se usa en el pres

que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por

está presente en un organismo (incluyendo virus) que

humano no ha modificado intencionadamente en el labor

Un "polipéptido" se refiere a una cadena que comprende

sin límite superior en la longitud de la cadena. Uno o má ecto en fase sólida, ensayo de competición en sándwich IEE directo con biotina-avidina en fase sólida (véase, caje directo en fase sólida, ensayo de tipo sándwich de dies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press arcador I-125 (véase Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 ng et al., Virology 176:546 (1990)); y RIA de marcaje ).

n específica", "unión selectiva", "se une selectivamente", erpo con un epítopo o con un antígeno predeterminado ) se une con una constante de disociación en equilibrio adamente menor de 10'8M, 10'9M o 10'1°M o incluso resonancia de plasmón superficial (RPS) en un equipo 00° utilizando el antígeno predeterminado, p. ej., OX40 ando, y (ii) se une al antígeno predeterminado con una para unirse a un antígeno no específico (p. ej., BSA, no estrechamente relacionado. Por consiguiente, un efiere a un anticuerpo que se une OX40 humana soluble imadamente menor de 10'8 M, 10'9 M o 10'10 M o incluso OX40 de macaco cangrejero" se refiere a un anticuerpo '7M o menor, tal como aproximadamente menor de 10' aciones, los anticuerpos que no reaccionan de manera urina) presentan básicamente unión no detectable frente

ento, pretende referirse a la constante de velocidad de mientras que el término "kdis" o "kd", como se usa en el elocidad de disociación de una interacción anticuerposente documento, pretende referirse a la constante de on respecto a ka (es decir, kd/ka) y se expresa como una s en la técnica pueden determinarse los valores de Kd ^d de un anticuerpo es mediante el uso de resonancia de e biodetección, tal como el sistema de RPS Biacore® o

idad" por un anticuerpo de IgG se refiere a un anticuerpo e 10‘9 M o menor e incluso más preferentemente de 10 de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de otipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de

vivo que utiliza un anticuerpo o fragmento de unión a cuerpo, o de una parte de unión a antígeno del mismo, xima, es decir, la mitad entre la respuesta máxima y la

a capacidad de un anticuerpo descrito en el presente e la superficie de una célula o unido a un soporte sólido.

el presente documento, se refiere a la capacidad de un 40 de una especie diferente. Por ejemplo, un anticuerpo na también puede unirse a OX40 de otra especie (p. ej. te documento, la reactividad cruzada puede medirse do en ensayos de unión (p. ej., RPS, ELISA) o la unión iológicamente OX40. Los métodos para determinar la les como los descritos en el presente documento, por icial (RPS) BIACORE® utilizando un equipo de RPS de e citometría de flujo.

documento, aplicada a un objeto, se refiere al hecho de plo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que e aislarse de una fuente en la naturaleza y que el ser o, es de origen natural.

nos dos restos de aminoácido unidos consecutivamente, tos de aminoácido en la proteína pueden contener una modificación, tal como, aunque sin limitación, glucosilaci

comprender uno o más polipéptidos.

La expresión "molécula de ácido nucleico", como se usa

y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico pu

También se proporcionan "modificaciones de secuencia

documento, p. ej., en la tabla 23, es decir, modificacion

anulan la unión del anticuerpo, codificado por la secuenci

con el antígeno. Dichas modificaciones de secuenci

nucleótidos y aminoácidos, así como, adiciones y deleci

introducir modificaciones en una secuencia de la tabla 2

tales como mutagénesis dirigida a sitio y mutagéne

conservativas incluyen sustituciones de aminoácidos co

por un resto de aminoácido que tiene una cadena latera

aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas

(p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácida

polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutam

laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isole

ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadena

histidina). Por tanto, un resto de aminoácido no ese

preferentemente por otro resto de aminoácido de la mis

métodos para identificar sustituciones conservativas de n

(véase, p. ej., Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1

Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (19

pueden introducirse de manera aleatoria a lo largo de tod

anti-OX40, tal como por mutagénesis de saturación, y l

seleccionar en función de su actividad de unión mejorad

En el caso de los ácidos nucleicos, la expresión "homol

secuencias designadas de los mismos, se alinean forma

deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos apr

menos aproximadamente de un 90 % a un 95 % y más p

99,5 % de los nucleótidos. Como alternativa, existe un

condiciones de hibridación selectivas, con el complemen

En el caso de los polipéptidos, la expresión "homología

designadas de los mismos, se alinean de forma óptima y

aminoácidos apropiadas, en al menos aproximadame

aproximadamente de un 90 % a un 95 % y más preferent

de los aminoácidos.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias depen

secuencias cuando las secuencias se alinean de for

idénticas/n.° total de posiciones x 100), determinándose l

y la longitud de cada hueco, que se requiere introdu

comparación de secuencias y la determinación del porc

utilizando un algoritmo matemático, como se describe en

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucl

paquete informático GCG (disponible en http://www.

ponderación de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y una p

determinarse el porcentaje de identidad entre dos secue

E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que se h

una tabla de ponderación de restos PAM120, una penal

hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre do

el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):

del paquete informático GCG (disponible en http://ww

PAM250 y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10,

Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas descrita

una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda f

secuencias relacionadas. Estas búsquedas pueden reali

2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. La

programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabr

las de las moléculas de ácidos nucleicos descritas en e osforilación o un enlace disulfuro. Una "proteína" puede

presente documento, pretende incluir moléculas de ADN ser monocatenaria o bicatenaria, y puede ser ADNc.

servativas" de las secuencias expuestas en el presente la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos que no nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos, onservativas incluyen sustituciones conservativas de de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, se pueden diante técnicas convencionales conocidas en la materia, ediada por PCR. Las modificaciones de secuencia ativas, en las que el resto de aminoácido se reemplaza ilar. En la técnica se han definido familias de restos de ilias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas a, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales prales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, l previsto en un anticuerpo anti-OX40 se reemplaza amilia de cadena lateral. En la técnica se conocen bien tidos y aminoácidos que no eliminan la unión a antígeno ; Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); y Como alternativa, en otra realización, las mutaciones en una parte, de la secuencia codificante del anticuerpo ticuerpos anti-OX40 modificados resultantes se pueden

sustancial" indica que cuando dos ácidos nucleicos, o ma y se comparan, son idénticos, con las inserciones o adamente un 80 % de los nucleótidos, normalmente al entemente al menos aproximadamente de un 98 % a un mología sustancial cuando los segmentos hibriden en la cadena.

ncial" indica que cuando dos polipéptidos, o secuencias omparan, son idénticos, con inserciones o deleciones de n 80 % de los aminoácidos, normalmente al menos nte al menos aproximadamente de un 98 % a un 99,5 %

el número de posiciones idénticas compartidas con las ptima (es decir, % de homología = n.° de posiciones eación óptima teniendo en cuenta el número de huecos ara una alineación óptima de las dos secuencias. La je de identidad entre dos secuencias pueden realizarse ejemplos no limitativos mostrados más adelante.

os puede determinarse utilizando el programa GAP del om), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y una ación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. También puede de nucleótidos o aminoácidos utilizando el algoritmo de orporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando ón por longitud de hueco de 12 y una penalización por cuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando 53 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP .com), utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

el presente documento pueden utilizarse además como a bases de datos públicas para identificar, por ejemplo, e utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión squedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a sente documento. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuació

aminoácidos homólogas a las de las moléculas prot

alineamientos con huecos con fines comparativos, pued

al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuand

utilizarse los parámetros por defecto de los respe www.ncbi.nlm.nih.gov.

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en célula

purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se

de otros componentes celulares o de otros contaminan

partes del cromosoma) o proteínas, mediante técnicas c

de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel

Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology

Los ácidos nucleicos, p. ej., ADNc, se pueden mutar,

secuencias génicas. Para las secuencias codificante

aminoácidos según se desee. En particular, se conte

procedentes de secuencias nativas V, D, J, constantes,

presente documento.

El término "vector", como se usa en el presente docu

nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que s

a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden

un vector vírico, en donde pueden unirse segmentos d

son capaces de replicación autónoma en una célula hosp

que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores

episómicos de mamífero) pueden integrarse en el genom

hospedadora y de este modo pueden replicarse junto c

vectores son capaces de dirigir la expresión de gene

documento dichos vectores reciben el nombre de "vecto

de expresión"). En general, los vectores de expresión útil

en forma de plásmidos. En la presente memoria descrip

dado que el plásmido es la forma de vector más común

de vectores de expresión, tales como vectores víricos (p

virus adenoasociados), que tienen funciones equivalente

La expresión "célula hospedadora recombinante" (o sim

documento, pretende referirse a una célula que compren

en la célula, y puede ser una célula en la que se ha introd

que dichas expresiones pretenden referirse no solo a la

célula. Dado que en generaciones sucesivas pueden p

influencias ambientales, dicha descendencia puede, de h

en el alcance de la expresión "célula hospedadora", com

Como se usa en el presente documento, el término "antí

sintética, tal como una proteína, un péptido un o hapteno

Un antígeno también puede ser un antígeno tumoral, co

terapéuticas, p. ej., antígenos expresados por una cél

administrar junto con un anticuerpo anti-OX40). Los a

prevención o el tratamiento de cánceres. Los ejemplos d

secuencias que comprenden todas, o una parte de, la

mesotelina, CEA, gp100, MARTI, TRP-2, melan-A, NY-MAGE-3, MAGE-A3, Tirosinasa, Telomerasa, antígenos

germinales. Los antígenos asociados a tumores también

los antígenos Lea, Leb, LeX, LeY, H-2, B-1, B-2. Como

antígeno. Por ejemplo, un antígeno MAGE puede combi

y gp100 junto con adyuvantes tales como GM-CSF o IL-

Las secuencias de los antígenos anteriores son bien

6.235.525 (Ludwig Institute for Cancer Research) se pro

en los documentos US 5.804.381 y US 6.069.233 (Lud

de secuencias de proteínas y ácidos nucleicos de NY-(Ludwig Institute for Cancer Research) se proporcionan

Melan-A; en los documentos US 6.774.226 y US 6.911.

ejemplos de secuencias de proteína y ácido nucleico de

for Cancer Research) se proporcionan ejemplos de secu 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de as descritas en el presente documento. Para obtener tilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden vos programas (p. ej., XBLAST y NBLAST). Véase

nteras, en un lisado celular o en una forma parcialmente la" o "se vuelve sustancialmente puro" cuando se purifica , p. ej., otros ácidos nucleicos celulares (p. ej., las otras encionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, bandeo agarosa y otras bien conocidas en la técnica. Véanse, F. reene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York (1987).

acuerdo con técnicas convencionales para proporcionar estas mutaciones, pueden afectar a la secuencia de an secuencias de ADN sustancialmente homólogas a o erruptoras y otras secuencias de este tipo descritas en el

nto, pretende hacer referencia a una molécula de ácido a unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere irse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es DN adicionales al genoma vírico. Determinados vectores adora en la cual se introducen (p. ej., vectores bacterianos isómicos de mamífero). Otros vectores (p. ej., vectores no e una célula hospedadora tras su introducción en la célula el genoma del hospedador. Por otra parte, determinados los que están unidos operativamente. En el presente de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores en las técnicas de ADN recombinante están con frecuencia a, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse indistintamente, te usada. Sin embargo, también se incluyen otras formas j., retrovirus defectuosos para la replicación, adenovirus y

mente "célula hospedadora"), como se usa en el presente un ácido nucleico que no está presente de manera natural do un vector de expresión recombinante. Debe entenderse lula en cuestión sino también a la descendencia de dicha ucirse algunas modificaciones debido a mutaciones o a ho, ser idéntica a la célula original, pero aun así se incluye e usa en el presente documento.

no" se refiere a cualquier sustancia inmunógena natural o n antígeno puede ser OX40 o un fragmento de la misma. el cual se desean respuestas inmunitarias protectoras o tumoral (p. ej., para su uso como vacuna tumoral para genos incluyen antígenos asociados a tumores para la ntígenos asociados a tumores incluyen, pero sin limitación, ecuencias de phCG, gp100 o Pmel17, HER2/neu, WT1, O-1, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), idiotipo, MAGE-1, 2 y MUC-1, y antígenos tumorales procedentes de células cluyen los antígenos de grupos sanguíneos, por ejemplo, ernativa, en una construcción puede incluirse más de un se con otros antígenos tales como melanina A, tirosinasa y unirse a un anticuerpo anti-APC.

ocidas en la técnica. Por ejemplo, en el documento US ciona un ejemplo de una secuencia de ADNc de MAGE-3; Institute for Cancer Research) se proporcionan ejemplos O-1; en los documentos US 5.620.886 y US 5.854.203 mplos de secuencias de proteínas y ácidos nucleicos de 9 (Ludwig Institute for Cancer Research) se proporcionan -BR-1 y en el documento WO 02/90986 (Ludwig Institute ias de proteína y ácido nucleico de NY-CO-58; un ejemplo de una secuencia de aminoácidos para la proteína HER

AAA58637; y una secuencia de nucleótidos (ARNm) p

disponible en GENBANK® con el n.° de registro NM020

Una "respuesta inmunitaria" se refiere una respuesta

respuesta protege al organismo frente a estos agentes

inmunitaria está mediada por la acción de una célula

linfocito citolítico natural (Nk), macrófago, eosinófilo, m

solubles producidas por cualquiera de estas células o

que da como resultado el direccionamiento selectivo, la

cuerpo del vertebrado de los patógenos invasores, célu

otras anómalas, o, en casos de autoinmunidad o infla

reacción inmunitaria incluye, p. ej., la activación o inhibi

célula Th, tal como de una célula T CD4+ o CD8+, o la i

Un "inmunomodulador" o "inmunorregulador" se refiere a

que puede estar implicado en la modulación, regulació

"regulación", o "modificación" de una respuesta inmunita

inmunitario o de la actividad de dicha célula (p. ej., una

supresión del sistema inmunitario que se puede mani

diversos tipos de células, un aumento o una disminución

pueda producirse en el sistema inmunitario. Se ha

estimuladores, algunos de los cuales pueden potencia

preferidas, el inmunomodulador se localiza en la superfi inmunorreguladora" es un inmunomodulador que está di

de, una sustancia, agente, residuo, compuesto o molé

receptores sobre la superficie de una célula ("receptor inmunomoduladores").

"Inmunoterapia" se refiere al tratamiento de un sujeto afe

de, una enfermedad mediante un método que compren

respuesta inmunitaria.

"Terapia inmunoestimulante" o "terapia inmunoestimul

aumento (inducción o mejora) de una respuesta inmunit

"Potenciar una respuesta inmunitaria endógena" quie

inmunitaria existente en un sujeto. Este aumento de e

mecanismos que supriman la respuesta inmunitaria hos

la respuesta inmunitaria hospedadora endógena.

Células "T efectoras" ("Tef") se refiere a células T (p. ej.,

a células T auxiliares (Th, helper), que secretan citocinas

células T reguladoras (células Treg). Los anticuerpos a

Tef, p. ej., células Tef CD4+ y CD8+.

Un aumento de la capacidad para estimular una respu

resultado una actividad agonista mejorada de receptore

mejorada de receptores inhibidores. Un aumento de l

sistema inmunitario, puede reflejarse con un aumento m

que mida una respuesta inmunitaria, p. ej., un ensayo q

la actividad citolítica (determinada directamente en célul

y la proliferación. La capacidad para estimular una res

puede aumentar en al menos un 10 %, 30 %, 50 %, 75

Como se usa en el presente documento, el término "u

enlace puede ser covalente o no covalente. El enlace

recombinante). Dichos enlaces se pueden conseguir utili

campo, tales como la conjugación química y la producci

Como se usa en el presente documento, "administra

composición que comprende un agente terapéutico, u

suministro conocidos por los expertos en la materia.

descritos en el presente documento incluyen la intraveno

vías de administración parenteral, por ejemplo, me

parenteral", como se usa en el presente documento u, está disponible en GENBANK® con el n.° de registro l antígeno carcinoembrionario humano 1 (CEA-1), está

gica en un vertebrado frente a agentes extraños, dicha nfermedades causadas por los mismos. Una respuesta stema inmunitario (por ejemplo, un célula T, linfocito B, ito, célula dendrítica o neutrófilo) y de macromoléculas ado (incluyendo anticuerpos, citocinas y complemento) n con, el daño a, la destrucción de, y/o la eliminación del tejidos infectados por patógenos, células cancerosas u n patológica, células o tejidos humanos normales. Una de una célula T, p. ej., de una célula T efectora o de una ción de una célula Treg.

gente, p. ej., un componente de una ruta de señalización, odificación de una respuesta inmunitaria. "Modulación", e refiere a cualquier alteración de una célula del sistema a T efectora). Dichas modulación incluye estimulación o r por un aumento o una disminución en el número de la actividad de estas células, o cualquier otro cambio que ntificado inmunomoduladores tanto inhibidores como función en un microambiente tumoral. En realizaciones e una célula T. Una "diana inmunomoduladora" o "diana para la unión por, y cuya actividad se altera por la unión Las dianas inmunomoduladoras incluyen, por ejemplo, munomoduladores") y ligandos de receptores ("ligandos

o por, o en riesgo de, contraer o padecer una recurrencia ducir, potenciar, suprimir o modificar de otro modo una

a" se refiere a una terapia que da como resultado el n un sujeto para, p. ej., tratar un cáncer.

ecir aumentar la eficacia o fuerza de una respuesta ia y fuerza puede alcanzarse, por ejemplo, dominando dora endógena o estimulando mecanismos que mejoren

las T CD4+ y CD8+) con actividades citolíticas así como tivan y dirigen otras células inmunitarias, pero no incluyen X40 descritos en el presente documento activan células

inmunitaria, o del sistema inmunitario, puede dar como estimuladores de célula T y/o una actividad antagonista acidad para estimular una respuesta inmunitaria, o del de la CE50 o del nivel máximo de actividad en un ensayo ida los cambios de liberación de citocinas o quimiocinas, iana o indirectamente detectando CD107a o granzimas) ta inmunitaria o la actividad del sistema inmunitario se veces, 3 veces, 5 veces o más.

se refiere a la asociación de dos o más moléculas. El ién puede ser genético (es decir, fusionado de manera o una amplia diversidad de técnicas reconocidas en este combinante de proteínas.

refiere a la introducción física en un sujeto de una ndo cualquiera de los diversos métodos y sistemas de vías de administración preferidas para los anticuerpos ntraperitoneal, intramuscular, subcutánea, espinal u otras e inyección o infusión. La expresión "administración nifica modos de administración distintos a los de la administración enteral y tópica, normalmente, medi

intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intratecal

intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutánea,

intraespinal, epidural e intraesternal e infusión, así co

descrito en el presente documento puede administrarse

tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, por vía intrana

también se puede realizar, por ejemplo, una vez, una plur

Como se usa en el presente documento, la expresión "r

mediada por células T, incluyendo células T efectoras (p.

Las respuestas mediadas por célula T incluyen, por ejem

Como se usa en el presente documento, la expresión

respuesta inmunitaria inducida por células T citotóxicas.

Como se usa en el presente documento, los términos "in

de la unión de OX40-L con OX40 en las células) se utiliz

como total. En determinadas realizaciones, el anticuerpo

aproximadamente un 50%, por ejemplo, aproximada

determinada, p. ej., como se describe adicionalmente e

anticuerpo anti-OX40 inhibe la unión de OX40-L con O

40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 %, determinada, p. ej.,

Como se usa en el presente documento, la expresión "inh

medible en el crecimiento de un tumor, p. ej., la inhibición

10 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 20 %, al

40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos apr

menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadame

Como se usa en el presente documento, "cáncer" se ref

el crecimiento incontrolado de células anómalas en el cue

la formación de tumores o células malignas que invade

distantes del cuerpo a través del sistema linfático o del to

Los términos "tratar" "que trata", y "tratamiento", como s

de intervención o proceso realizado en el sujeto, o a la

de invertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o impedir

síntoma, una complicación, una afección o indicios bioqu

administración a un sujeto que no tiene una enfermedad

sus efectos, en caso de que los haya.

Una "neoplasia maligna hemática" incluye un linfoma, le

un cáncer de bazo y de ganglios linfáticos. Como ejem

cáncer hemático de células B) como linfomas de célula

Hodgkin como la mayoría de los linfomas no hodgkinian

se incluyen linfoma difuso de células B grandes, linfo

linfoma linfocítico de células pequeñas (se solapa con l

(LCM), linfoma de Burkitt, linfoma mediastínico de célul

ganglionar de células B de la zona marginal, linfoma espl

grandes, el linfoma de derrame primario, granulomatosi

células T se incluyen linfoma extraganglionar de células T

grandes y linfoma angioinmunoblástico de células T. La

tal como, aunque sin limitación, leucemia secundaria,

leucemia mielógena crónica y leucemia linfoblástica ag

mielomas, tal como, aunque sin limitación, mieloma

hemáticos asociados a células B o a células T se incluye

La expresión "dosis eficaz" o "dosificación eficaz" se defi

al menos parcialmente un efecto deseado. Una "cantida

eficaz" de un fármaco o agente terapéutico es cualquier

con otro agente terapéutico, promueve la regresión de la

los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuen

o una prevención del deterioro o discapacidad debidos al

En referencia a los tumores sólidos, una cantidad eficaz

se contraiga y/o disminuya la velocidad de crecimiento inyección, e incluyen, sin limitación, intravenosa, ntralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, bcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, lectroporación in vivo. Como alternativa, un anticuerpo na vía no parenteral, tal como una vía de administración oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica. La administración d de veces y/o durante uno o más períodos prolongados.

uesta mediada por célula T" se refiere a una respuesta células CD8+) y células T auxiliares (p. ej., células CD4+). citotoxicidad y proliferación de célula T.

puesta de linfocito T citotóxico (CTL)" se refiere a una respuestas CTL están mediadas por células T CD8+.

" o "bloquea" (p. ej., en referencia a la inhibición/bloqueo ndistintamente y abarcan inhibición/bloqueo tanto parcial -OX40 inhibe la unión de OX40-L con OX40 en al menos te 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100%, presente documento. En determinadas realizaciones, el en no más de un 50 %, por ejemplo, aproximadamente o se describe adicionalmente en el presente documento.

el crecimiento" de un tumor incluye cualquier disminución crecimiento de un tumor en al menos aproximadamente os aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente adamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al 90 %, al menos aproximadamente 99 % o 100 %.

a un amplio grupo de enfermedades caracterizadas por La división celular no regulada puede dar como resultado jidos contiguos y también pueden metastatizar a partes te sanguíneo.

n en el presente documento, se refieren a cualquier tipo inistración de un agente activo al mismo, con el objetivo ance, el desarrollo, la gravedad o la recurrencia de un os asociados a una enfermedad. Profilaxis se refiere a la ra prevenir que se produzca la enfermedad o minimizar

ia, mieloma o una neoplasia maligna linfoide, así como de linfomas se incluyen tanto linfomas de células B (un Los linfomas de linfocitos B incluyen tanto linfomas de Como ejemplos no limitativos de linfomas de linfocitos B licular, linfoma de tejido linfático asociado a mucosas, cemia linfocítica crónica), linfoma de células del manto grandes, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma o de la zona marginal, linfoma intravascular de células B fomatoide. Como ejemplos no limitativos de linfomas de foma cutáneo de células T, linfoma anaplásico de células plasias malignas hemáticas también incluyen leucemia, cemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, . Las neoplasias malignas hemáticas también incluyen iple y mieloma múltiple asintomático. Otros cánceres la expresión neoplasia maligna hemática.

omo una cantidad suficiente para conseguir o conseguir rapéuticamente eficaz" o "dosificación terapéuticamente idad del fármaco que, cuando se usa en solitario o junto rmedad evidenciada por un descenso en la gravedad de duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, rimiento de la enfermedad.

prende una cantidad suficiente para hacer que un tumor mor (tal como para suprimir el crecimiento del tumor) o para prevenir o retrasar otra proliferación celular no dese

una cantidad suficiente para retrasar el desarrollo del tu

cantidad suficiente para prevenir o retrasar la recurrencia

o más administraciones. La cantidad eficaz del fárma

cancerosas; (ii) reducir el tamaño del tumor; (iii) inhibir,

infiltración de células cancerosas en los órganos periféric

detener la metástasis tumoral; (v) inhibir el crecimiento d

del tumor; y/o (vii) aliviar hasta cierto punto uno o más

"cantidad eficaz" es la cantidad de anticuerpo anti-OX40

anticuerpo anti-CTLA-4 (p. ej., ipilimumab), en combinac

significativa del cáncer o a la ralentización de su progres

presente documento, las expresiones "dosis fija", "dosis

y se refieren a una dosis que se administra a un paciente

paciente. Por lo tanto, la dosis fija o constante no se pro

cantidad absoluta del agente.

Como se usa en el presente documento, una "dosis bas

se ajusta a la superficie corporal (SC) del paciente individ

mg/kg de peso corporal. Se han publicado diversos cál

directas, el más utilizado la fórmula de Du Bois (véase

Medicine 17 (6): 863-71; y Verbraecken, J. et al. (abril d

24). Otros ejemplos de fórmulas para obtener la SC incl

1987; 317:1098), la fórmula de Haycock (Haycock GB, et

(Gehan EA, George SL, Cancer Chemother Rep 1970,

Internet Journal of Anesthesiology 2 (2); y Boyd, Edith (1

Monograph Series, No. x. Londres: Oxford University

Eiseigaku Zasshi 1968;5:443-50), la fórmula de Takahira

y la fórmula de Schlich (Schlich E, et al., Ernahrungs Um

Una "cantidad profilácticamente eficaz" o una "dosificaci

del fármaco que, cuando se administra sola o junto con

una enfermedad o de padecer una recurrencia de la enfer

La capacidad de un agente terapéutico o profiláctico para

o recurrencia de la enfermedad, puede evaluarse utilizand

cualificados, tal como en sujetos humanos durante ensa

la eficacia en seres humanos o ensayando la actividad d

Como ejemplo, un agente contra el cáncer es un fármac

regresión del cáncer en un sujeto. En realizaciones pr

promueve la regresión del cáncer hasta el punto de elimi

que la administración de una cantidad eficaz del fárm

resultado una reducción en el crecimiento o el tamaño de

de al menos un síntoma de la enfermedad, un aumento e

la enfermedad, una prevención del deterioro o discapacid

la mejoría de los síntomas de la enfermedad en el pacie

fármaco para promover la regresión del cáncer en

aceptablemente bajo de toxicidad, u otros efectos fisioló

(efectos adversos) resultantes de la administración del fá

A modo de ejemplo para el tratamiento de tumores, una

inhibe preferentemente el crecimiento celular o el crecim

preferentemente en al menos aproximadamente un 40 %,

un 60 %, y todavía más preferentemente en al menos

tratados. En las realizaciones más preferidas, una cantid

completamente el crecimiento celular o el crecimiento tu

o el crecimiento tumoral en un 100 %. Utilizando los ens

de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral.

composición examinando la capacidad del compuesto

medirse in vitro mediante ensayos conocidos por los p

descritas en el presente documento, se puede observar l

al menos aproximadamente 20 días, más preferenteme

preferentemente de al menos aproximadamente 60 días.

Los términos "paciente" y "sujeto" se refieren a cualq

profiláctico o terapéutico. Por ejemplo, los métodos y c

utilizarse para tratar a un sujeto o a un paciente con cánc En determinadas realizaciones, una cantidad eficaz es En algunas realizaciones, una cantidad eficaz es una tumor. Una cantidad eficaz puede administrarse en una composición puede: (i) reducir el número de células rdar, ralentizar hasta cierto punto y puede detener la iv) inhibir, es decir, ralentizar hasta cierto punto y puede mor; (vi) prevenir o retrasar la aparición y/o recurrencia los síntomas asociados al cáncer. En un ejemplo, una cantidad de anticuerpo anti-PD-1 (p. ej., nivolumab) o clínicamente demostrada que afecta a una disminución tal como un tumor sólido avanzado. Como se usa en el tante" y "dosis fija constante" se utilizan indistintamente tener en cuenta el peso o la superficie corporal (SC) del ona como una dosis en mg/kg, sino más bien como una

n la superficie corporal (SC)" se refiere a una dosis que e puede proporcionar una dosis basada en la SC como para llegar a la SC sin tener que realizar mediciones ois D, Du Bois EF (junio de 1916) Archives of Internal 6). Metabolism - Clinical and Experimental 55 (4): 515­ la fórmula de Mosteller (Mosteller RD. N Engl J Med., Pediatr 1978, 93:62-66), la fórmula de Gehan y George 25-235), la fórmula de Boyd (Current, JD (1998), The , University of Minnesota. The Institute of Child Welfare, s), la fórmula de Fujimoto (Fujimoto S, et al., Nippon imoto S, et al., Nippon Eiseigaku Zasshi 1968;5:443-50) u 2010;57:178-183).

rofilácticamente eficaz" de un fármaco, es una cantidad agente terapéutico a un sujeto en riesgo de desarrollar d, inhibe el desarrollo o la recurrencia de la enfermedad. over la regresión de la enfermedad o inhibir el desarrollo a diversidad de métodos conocidos por los profesionales línicos, en sistemas de modelos animales que predicen ente en ensayos in vitro.

e ralentiza la progresión del cáncer o que promueve la as, una cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco l cáncer. "Promover la regresión de un cáncer" significa sola o junto con un agente anti-neoplásico, da como or, la necrosis del tumor, una reducción en la gravedad frecuencia y la duración de los periodos sin síntomas de ebidos al sufrimiento de la enfermedad, o de otro modo, La eficacia farmacológica se refiere a la capacidad del aciente. Seguridad fisiológica se refiere a un nivel s adversos a nivel celular, de órgano y/o de organismo o.

idad o dosificación terapéuticamente eficaz del fármaco tumoral en al menos aproximadamente un 20 %, más so más preferentemente en al menos aproximadamente ximadamente un 80 % con respecto a los sujetos no dosificación terapéuticamente eficaz del fármaco inhibe l, es decir, inhibe preferentemente el crecimiento celular descritos más adelante puede evaluarse la capacidad alternativa, puede evaluarse esta propiedad de una inhibir el crecimiento tumoral, dicha inhibición puede ionales cualificados. En otras realizaciones preferidas resión tumoral y puede continuar durante un período de de al menos aproximadamente 40 días o incluso más

animal humano o no humano que reciba tratamiento osiciones descritos en el presente documento pueden l como un tumor sólido avanzado. La expresión "animal no humano" incluye todos los vertebrados, p. ej., mamífe

perro, vaca, pollos, anfibios, reptiles, etc.

En los siguientes subapartados se describen con más d

I. Anticuerpos anti-OX40

En el presente documento se describen anticuerpos, p.

por características o propiedades funcionales particular

OX40 humana. Además, los anticuerpos pueden reacci

humanos, tal como OX40 de macaco cangrejero. Dicho

se usan como monoterapia o cuando se usan junto con

1 (p. ej., nivolumab) o un anticuerpo anti-CTLA-4 (p. ej.,

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente

propiedades funcionales:

(1) se unen a OX40 humana soluble, p. ej., con un

medida con análisis de RPS de BIACORE®;

(2) se unen a OX40 humana unida a membrana, p.

p. ej., medida por FACS.

(3) se unen a OX40 de macaco cangrejero, p. ej., s

ej., con una CE50 de 10 nM o menor (p. ej., de 0,01

(4) inducen o mejoran la activación de células T, co

IL-2 y/o de IFN-y en células T que expresan OX40 y/

(5) inhiben la unión del ligando OX40 a OX40, p. ej.,

un ensayo con células 293-hOX40;

(6) se unen a un epítopo en la parte extracelular de O

de la región DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID N

LAGK (SEQ ID NO: 179);

(7) compiten por la unión a OX40 humana con 3F4,

(8) compiten por la unión a OX40 humana con 6E1-

Preferentemente, los anticuerpos se unen a OX40 con

8 M o menor, 10'9 M o menor, 10'10 M o menor, 10'11 M

7 M, de 10'10 M a 10'7M o de 10'9 M a 10'7 M. En determi

humana soluble, p. ej., como se determina mediante an

10'8 M o menor, 10'9 M (1 nM) o menor, 10'10M o menor

de 10'9 M a 10'7 M o de 10'8 M a 10'7M. En determinadas

unida (p. ej., unida a la membrana celular), tal como

mediante citometría de flujo, con una K^d de 10'7M o me

de 10'12M a 10'7 M, de 10'11 M a 10'8 M, de 10'10M a 10'

En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-OX4

celular), tal como en células T humanas activadas, p. ej.

7 M o menor, 10'8 M o menor, 10'9 M (1 nM) o menor, 10

10 M a 10'8 M, de 10'9M a 10'8 M, de 10'11M a 10'9

anticuerpo anti-OX40 se une a OX40 humana soluble c

menor, 10'10 M o menor, de 10'12M a 10'7 M, de 10'11 M

7 M, y a OX40 humana unida a la membrana celular c

(1 nM) o menor, 10'10 M o menor, de 10'12M a 10'7M, d

10'11 M a 10'9M o de 10'10M a 10'9M.

Los anticuerpos anti~OX40 descritos en el presente doc

unirse a OX40 de macaco cangrejero unida a membran

o menor, de 100 nM a 0,01 nM, de 100 nM a 0,1 nM, d

(p. ej., como se describe en los Ejemplos).

Los anticuerpos anti~OX40 descritos en el presente doc

p. ej., activando células Tef, limitando la supresión de cél

las células Treg tumorales y/o activando las células N

pueden activar o coestimular células Tef como se evid

citocinas (p. ej., IL~2 e IFN~y). En determinadas reali

determinadas realizaciones, el anticuerpo OX40 aument

2 veces), 3 veces, 4 veces, 5 veces o más, opcionalme

como se mide, p. ej., en células T humanas primarias o c

adicionalmente en los Ejemplos). En determinadas reali no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas,

diversos aspectos descritos en el presente documento.

ticuerpos completamente humanos, que se caracterizan or ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a e manera cruzada con OX40 de uno o más primates no cuerpos son útiles en el tratamiento del cáncer cuando ente inmunooncológico, tal como un anticuerpo anti-PD-umab).

mento presentan una o más o todas las siguientes

de 10 nM o menor (p. ej., de 0,01 nM a 10 nM), p. ej.,

una CE50 de 1 nM o menor (p. ej., de 0,01 nM a 1 nM),

n a OX40 de macaco cangrejero unida a membrana, p.

0 nM), p. ej., medida por FAC^s .

demuestra mediante (i) el aumento de la producción de el aumento de la proliferación de células T;

una CE50 de 1 nM o menor medida por FACS, p. ej., en

umana madura (SEQ ID NO: 2), p. ej., un epítopo dentro ) o DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCT

1, 14B6-2, 23H3, 18E9, 8B11,20B3 y 20C1;

-2, 14A2-1 y 14A2-2.

inidad, por ejemplo, con una Kd de 10'7 M o menor, 10' r, 10'12 M o menor, de 10'12M a 10'7M, de 10'11 M a 10' realizaciones, un anticuerpo anti-OX40 se une a OX40 de RPS de BIACORE®, con una K^d de 10'7 M o menor, 0'12M a 10'7 M, de 10'11 M a 10'7 M, de 10'10M a 10'7 M, aciones, el anticuerpo anti-OX40 se une a OX40 humana lulas T humanas activadas, p. ej., como se determina 0'8 M o menor, 10'9 M (1 nM) o menor, 10'10 M o menor, e 10'9M a 10'8 M, 10'11 M a 10'9 M o de 10'10M a 10'9M. une a OX40 humana unida (p. ej., unida a la membrana omo se determina mediante FAC^s , con una CE50 de 10' o menor, de 10'12 M a 10'7 M, de 10'11 M a 10'8 M, de 10' 10'10M a 10'9M. En determinadas realizaciones, un Kd de 10'7M o menor, 10'8 M o menor, 10'9 M (1 nM) o M, de 10'10M a 10'7 M, 10'9 M a 10'7M o de 10'8 M a 10' K^d o CE50 de 10'7M o menor, 10'8 M o menor, 10'9 M 1 M a 10'8 M, de 10'10M a 10'8 M, de 10'9M a 10'8M, de

to pueden unirse a OX40 de macaco cangrejero, p. ej., j., preferentemente una CI50 de 100 nM o menor, 10 nM nM a 1 nM o de 10 nM a 1 nM; p. ej., medida por FACS

pueden estimular o mejorar una respuesta inmunitaria, efectoras por las células Treg, agotando y/o inhibiendo j., en el tumor. Por ejemplo, los anticuerpos anti~OX40 , p. ej., por la secreción y/o proliferación mejorada de es, también se proporciona estimulación de CD3. En ecreción de IL~2 en un factor del 50 %, 100 % (es decir, n un máximo de hasta 10 veces, 30 veces, 100 veces, T que expresan OX40 humana (p. ej., como se describe nes, el anticuerpo OX40 aumenta la secreción de IFN~y en un factor del 50 %, 100 % (es decir, 2 veces), 3 vece

hasta 10 veces, 30 veces, 100 veces, como se mide, p.

OX40 humana (p. ej., como se describe adicionalmente

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente doc

humana en las células, p. ej., en células 293 que expr

una CE50 de 10 nM o menor, 1 nM o menor, de 0,01 n

Ejemplo 6).

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente do

por ejemplo, por la unión con fragmentos de OX40 hum

se une a toda, o a una parte de, la secuencia DVVSSK

ID NO: 2) según se determina, por ejemplo, por HDX o

seguido de escisión enzimática (véase el Ejemplo 11).

parte de, la secuencia DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGD

(SEQ ID NO: 2).

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX

parte de, la secuencia SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSK

En otras realizaciones, los anticuerpos anti-OX40 desc

de, la secuencia PCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 183).

Aún en otras realizaciones, los anticuerpos anti-OX DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178), se

QLCTATQDTVCR (SEQ ID NO: 184).

En realizaciones adicionales, los anticuerpos anti-OX40

parte de, la secuencia SQNTVCRPCGPGFYN (SEQ ID

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente doc

unión de) anticuerpos anti-OX40 que comprenden CDR

ej., 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1,6E1-2, 18E9,

realizaciones, los anticuerpos anti-OX40 inhiben la unió

20B3, 14A2-1, 14A2-2 y/o 20C1 con OX40 humana al

90% o 100%. En determinadas realizaciones no reivi

8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2, y 20C1 inhiben la unión d

20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 10

En determinadas realizaciones, los anticuerpos inducen

multivalente a través de, p. ej., la unión con FcR. En det

ej., bivalentes. En determinadas realizaciones, los antic

En determinadas realizaciones, los anticuerpos tienen

(1) se unen a OX40 humana soluble, p. ej., con u

medida con análisis de RPS de BIACORE®;

(2) se unen a OX40 humana unida a membrana, p.

p. ej., medida por FACS.

(3) se unen a OX40 de macaco cangrejero, p. ej.,

ej., con una CE50 de 10 nM o menor (p. ej., de 0,01

(4) inducen o mejoran la activación de células T, co

IL-2 y/o de IFN-y en células T que expresan OX40 y

(5) inhiben la unión del ligando OX40 a OX40, p. ej.

un ensayo con células 293-hOX40;

(6) se unen a un epítopo en la parte extracelular de O

de la región DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID N

LAGK (SEQ ID NO: 179);

(7) compiten por la unión a OX40 humana con 3F4,

(8) compiten por la unión a OX40 humana con 6E1

Por consiguiente, un anticuerpo que presenta una o

inmunoquímicas, celulares, fisiológicas u otras acti

metodologías conocidas en la técnica y descritas en

diferencia estadísticamente significativa en la actividad p

(p. ej., o cuando un anticuerpo control de especificidad i veces, 5 veces o más, opcionalmente con un máximo de n células T humanas primarias o células T que expresan s Ejemplos).

to pueden inhibir la unión de OX40L humana con OX40 OX40 humana (es decir, células 293-hOX40), p. ej., con 0 nM, de 0,1 nM a 10 nM o de 0,1 nM a 1 nM (véase el

nto se unen a un epítopo en OX40, como se determina, or ejemplo, en determinadas realizaciones, el anticuerpo PCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) de OX40 humana (SEQ nión de los anticuerpos a fragmentos de OX40 humana, tras realizaciones, el anticuerpo se une a toda, o a una CKPWTNCT-LAGK (SEQ ID NO: 179) de OX40 humana

scritos en el presente documento se unen a toda, o a una CTWCNLR (SEQ ID NO: 182).

en el presente documento se unen a toda, o a una parte

ue se unen a toda, o a una parte de, la secuencia además a toda, o a una parte de, la secuencia

ritos en el presente documento se unen a toda, o a una 185).

to pueden competir por la unión a OX40 con (o inhibir la giones variables descritas en el presente documento, p.

1,20B3, 14A2-1, 14A2-2 y/o 20C1. En determinadas 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23^h 3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, s un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, das, 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, cuerpos anti-OX40 con OX40 humana al menos un 10 %,

joran la activación de las células T con entrecruzamiento adas realizaciones, los anticuerpos son multivalentes, p. s no son monovalentes.

, 4, 5 o 6 de las siguientes características:

de 10 nM o menor (p. ej., de 0,01 nM a 10 nM), p. ej.,

n una CE50 de 1 nM o menor (p. ej., de 0,01 nM a 1 nM),

en a OX40 de macaco cangrejero unida a membrana, p.

10 nM), p. ej., medida por FAC^s .

demuestra mediante (i) el aumento de la producción de el aumento de la proliferación de células T;

una CE50 de 1 nM o menor medida por FACS, p. ej., en

humana madura (SEQ ID NO: 2), p. ej., un epítopo dentro 8) o DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCT-

6-1, 14B6-2, 23H3, 18E9, 8B11,20B3 y 20C1;

1-2, 14A2-1 y 14A2-2.

de estas propiedades funcionales (p. ej., bioquímicas, es biológicas, o similares) determinadas según las esente documento, se entenderá que se refiere a una lar en relación a la observada en ausencia del anticuerpo ante está presente). Preferentemente, el anticuerpo anti-OX40 aumenta un parámetro medido (p. ej., proliferació

del parámetro medido, más preferentemente en al meno

100 % (es decir, 2 veces), 3 veces, 5 veces o 10 veces.

(p. ej., volumen tumoral, unión de OX40-L a OX40, canti

10 % del parámetro medido, más preferentemente en al

95 % o 99 %.

En la técnica se conocen ensayos convencionales para

de diversas especies, incluyendo, por ejemplo, ensa

Ejemplos se describen con detalle ensayos adecuados

anticuerpos también se pueden evaluar mediante en

mediante análisis de RPS de BIACORE®. Los ensa

propiedades funcionales de OX40 (p. ej., la unión al lig

se describen más adelante con más detalle y en los Eje

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX

natural, p. ej., anticuerpos anti-OX40 con modificaciones

producen de manera natural, como por ejemplo po

postraducción.

II. Anticuerpos anti-OX40 ilustrativos

Los anticuerpos reivindicados tienen una secuencia Vh

En el presente documento también se describen anticue

las secuencias de CDR y/o de la región variable de los

8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2 y 20C1, aislados y caract

así como anticuerpos que tienen una identidad de al me

95 % o una identidad de al menos 99 %) con las secuen

1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1,6E1-2, 18E9, 8B11,20B3, 14A

3F4, 14B6 (14B6-1 y 14B6-2), 23H3, 6E1 (6E1-1 y 6E

exponen en las SEQ ID NO: 17, 28, 37, 48, 57, 65, 73,

V^l de 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1,6E1-2, 18E9,

ID NO: 18, 29, 30, 38, 49, 50, 58, 66, 74, 85, 86 y 94, re

Por consiguiente, en el presente documento se prop

antígeno de los mismos, que comprenden regiones var

región variable de la cadena pesada comprende una se

en las SEQ ID NO: 17, 28, 37, 48, 57, 65, 73, 84, y 93.

También se proporcionan anticuerpos no reivindicados,

regiones variables de la cadena pesada y la cadena lige

una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo

74, 85 y 86.

En el presente documento se proporcionan anticuerpos

comprenden: las secuencias de la región variable de la

ID NO: 17 y 18; 28 y 29; 28 y 30; 37 y 38; 48 y 49; 48 y

Los anticuerpos anti-OX40 no reivindicados, descritos

CDR2 y CDR3 de 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E

combinaciones de los mismos. Las secuencias de ami

23H3, 6E1 (6E1-1 y 6E1-2), 18E9, 8B11, 20B3, 14A2 (1

19, 31, 39, 51, 59, 67, 75 y 87, respectivamente. Las sec

1 y 14B6-2), 23H3, 6E1 (6E1-1 y 6E1-2), 18E9, 8B11,2

ID NO: 12, 20, 32, 40, 52, 60, 68, 76 y 88, respectivame

14B6 (14B6-1 y 14B6-2), 23H3, 6E1 (6E1-1 y 6E1-2), 18

en las SEQ ID NO: 13, 21, 33, 41,53, 61,69, 77 y 89. La

1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1,6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A

34, 42, 45, 54, 62, 70, 78, 81 y 90, respectivamente. La

1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1,6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2

35, 43, 46, 55, 63, 71,79, 82 y 91, respectivamente. Las

14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-36, 44, 47, 56, 64, 72, 80, 83 y 92, respectivamente.

(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Im

and Human Services, publicación NIH n.° 91-3242).

élulas T, producción de citocinas) en al menos un 10 % 0 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, bio, el anticuerpo puede disminuir un parámetro medido e células T reguladoras en los tumores) en al menos un s un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %,

ar la capacidad de unión de los anticuerpos con OX40 LISA, transferencias Western y ensayos RIA. En los cinéticas de unión (p. ej., la afinidad de unión) de los convencionales conocidos en la técnica, tales como ara evaluar los efectos de los anticuerpos sobre las la proliferación de células T, la producción de citocinas) .

son anticuerpos nativos o no son anticuerpos de origen raduccionales diferentes a las de los anticuerpos que se r más, menos, o un tipo diferente de modificación

xpuesta en las SEQ ID NO: 318 y 94 respectivamente. articulares, p. ej., anticuerpos monoclonales, que tienen erpos 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, os estructuralmente como se describe en el Ejemplo 1, 0 % (p. ej., de al menos 85 %, al menos 90 %, al menos la región variable o CDR de los anticuerpos 3F4, 14B6-4A2-2 y 20C1. Las secuencias de aminoácidos de Vh de 8E9, 8B11, 20B3, 14A2 (14A2-1 y 14A2-2) y 20C1, se 3, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de ,20B3, 14A2-1, 14A2-2 y 20C1, se exponen en las SEQ ivamente.

an anticuerpos no reivindicados, o partes de unión a de la cadena pesada y la cadena ligera, en donde la ia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste

es de unión a antígeno de los mismos, que comprenden donde la región variable de la cadena ligera comprende nsiste en las SEQ ID NO: 18, 29, 30, 38, 49, 50, 58, 66,

os, o una parte de unión a antígeno de los mismos, que na pesada y la cadena ligera que comprenden las SEQ y 58; 65 y 66; 73 y 74; 84 y 85; 84 y 86; 93 y 94.

l presente documento, pueden comprender las CDR1, 1-2, 18E9, 8B11,20B3, 14A2-1, 14A2-2 y 20C1, o os de las CDR1 Vh de 3F4, 14B6 (14B6-1 y 14B6-2), y 14A2-2) y 20C1, se exponen en las SEQ ID NO: 11, s de aminoácidos de las C^d R2 V^h de 3F4, 14B6 (14B6-4A2 (14A2-1 y 14A2-2) y 20C1 se exponen en las SEQ as secuencias de aminoácidos de las CDR3 V^h de 3F4, B11,20B3, 14A2 (14A2-1 y 14A2-2) y 20C1 se exponen uencias de aminoácidos de las CDR1 V^l de 3F4, 14B6-4A2-2 y 20C1 se exponen en las SEQ ID NO: 14, 22, 25, uencias de aminoácidos de las CDR2 Vl de 3F4, 14B6-A2-2 y 20C1 se exponen en las SEQ ID NO: 15, 23, 26, encias de aminoácidos de las CDR3 V^l de 3F4, 14B6-1, 2-2 y 20C1 se exponen en las SEQ ID NO: 16, 24, 27, giones CDR se definen utilizando el sistema de Kabat gical Interest, quinta edición, U.S. Department of Health Dado que cada uno de estos anticuerpos se une a OX4

principalmente las regiones CDR1, 2 y 3, las secuencias

se pueden "mezclar y emparejar" (es decir, las CDR de d

cada anticuerpo debe contener una CDR1,2 y 3 de V^h y

a anti-OX40. La unión a OX40 de dichos anticuerpos

ensayos de unión descritos anteriormente y en los Eje

secuencias de CDR de V^h se mezclan y emparejan, la

particular se reemplaza por una o más secuencias de C

secuencias de CDR de V^l se mezclan y emparejan, la s

particular se reemplaza por una o más secuencias de C

experto familiarizado con la materia que pueden cre

secuencias de la región CDR Vh y/o Vl con secuencias

en el presente documento para los anticuerpos mono

8B11,20B3, 14A2-1, 14A2-2, y 20C1. Los anticuerpos "

bioactividad y/o las otras propiedades equivalentes o su

presente documento, pueden seleccionarse para su uso

En el presente documento se proporcionan anticuerpos

mismos, que comprenden:

(a) una CDR1 de la región variable de la caden

seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID

(b) una CDR2 de la región variable de la caden

seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID

(c) una CDR3 de la región variable de la caden

seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID

(d) una CDR1 de la región variable de la cadena liger

del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 22, 2

(e) una CDR2 de la región variable de la cadena liger

del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 23, 2

(f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera

del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 24, 2

en donde el anticuerpo se une específicamente a OX40

El anticuerpo reivindicado comprende regiones variab

anticuerpo comprende:

secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena

respectivamente, y secuencias de CDR1, CDR2 y c

92, respectivamente;

en donde el anticuerpo se une específicamente a O

Un dominio VH, o una o más CDR del mismo, descrito

constante para formar una cadena pesada, p. ej., una

dominio VL, o una o más CDR del mismo, descritos e

constante para formar una cadena ligera, p. ej., una

longitud completa (con la excepción de la lisina (K) C-terminal, que puede estar ausente) y la cadena ligera d

de longitud completa. Los restos de glutamina y gluta

piroglutamato tanto en la cadena ligera como en la pesa

Un dominio VH descrito en el presente documento pued

ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que son de origen natural

presente documento. Por ejemplo, una cadena pesada

dominio VH descrito en el presente documento fusion

expuesta en el SEQ ID NO: 5.

El dominio constante de la IgG1 humana también pued

alotípica de IgG1 comprende un R107K, E189D y M19

SEQ ID NO: 6). Dentro de la región pesada de longitu

R214K, E356D y M358L.

Un dominio VL descrito en el presente documento pue

kappa o lambda humana. Por ejemplo, una cadena ligera

dominio VL descrito en el presente documento fusionad ue la especificidad de unión a antígeno la proporcionan DR1,2 y 3 de V^h y las secuencias de CDR1, 2 y 3 de V^l ntes anticuerpos se pueden mezclar y emparejar, aunque CDR1,2 y 3 de V^l) para crear otros anticuerpos de unión clados y emparejados" puede analizarse utilizando los s (p. ej., ensayos ELISA). Preferentemente, cuando las encia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia V^h structuralmente similares. Del mismo modo, cuando las ncia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de V^l structuralmente similares. Será fácilmente obvio para el nuevas secuencias Vh y Vl sustituyendo una o más turalmente similares de las secuencias CDR desveladas les 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, lados y emparejados" que tienen la afinidad de unión, la res a las de los anticuerpos específicos desvelados en el os métodos de la presente invención.

dos no reivindicados, o parte de unión a antígeno de los

sada que comprende una secuencia de aminoácidos 1, 19, 31, 39, 51, 59, 67, 75, y 87;

sada que comprende una secuencia de aminoácidos 2, 20, 32, 40, 52, 60, 68, 76, y 88;

sada que comprende una secuencia de aminoácidos 3, 21, 33, 41, 53, 61, 69, 77, y 89;

comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada 42, 45, 54, 62, 70, 78, 81, y 90;

comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada 43, 46, 55, 63, 71, 79, 82, y 91; y

comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada 44, 47, 56, 64, 72, 80, 83, y 92;

ana.

e la cadena pesada y la cadena ligera, en donde el

da que comprenden las SEQ ID NO: 87, 317 y 89, de cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 90­

umana.

presente documento, pueden estar unidos a un dominio na pesada de longitud completa. De manera similar, un resente documento, pueden estar unidos a un dominio a ligera de longitud completa. Una cadena pesada de nal o con la excepción de la glicina y la lisina (GK) C-gitud completa, se combinan para formar un anticuerpo N-terminales también se pueden convertir en restos de

ionarse con el dominio constante de una IgG humana, p. dificadas, p. ej., como se describe adicionalmente en el e comprender la secuencia de aminoácidos de cualquier con la secuencia de aminoácidos de la IgG1 humana

r el de una variante alotípica. Por ejemplo, una variante ubrayados anteriormente, con numeración según la del pleta, estas sustituciones de aminoácidos se numeran

ionarse con el dominio constante de una cadena ligera e comprender la secuencia de aminoácidos de cualquier la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera kappa de IgG1 humana expuesta en el SEQ ID NO: 7.

En determinadas realizaciones, la región constante de l

el extremo carboxílico, p. ej., comprende los últimos am

pesada. En determinadas realizaciones, la región const

en el extremo carboxílico y tiene, p. ej., la secuencia LS

Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada

se exponen en la tabla 23 y corresponden a las SEQ ID

119, 121, 123, 124 y 125 para las cadenas pesadas y

114, 116, 118, 120 y 122 para las cadenas ligeras.

Las cadenas pesadas y ligeras comprenden una secuen

95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % o 70 % idéntica a cualq

23 (o sus regiones variables), p. ej., las SEQ ID NO: 95

y 108; 109 y 110; 111 y 112; 113 y 114; 115 y 116; 117

116 pueden utilizarse para formar anticuerpos anti-OX40

que adicionalmente se describen en el presente docum

variación alotípica, p. ej., en el dominio constante, y/o un

las mutaciones desveladas en el presente documento. L

de aminoácidos que difiere como máximo en 1-30, 1-2

sustitución, adición o deleción) de cualquiera de las cade

variables) pueden utilizarse para formar anticuerpos ant

ej., las que adicionalmente se describen en el presente

En diversas realizaciones, los anticuerpos anteriormente

o más, cinco o más, seis, o todas las siguientes propied

(1) se unen a OX40 humana soluble, p. ej., con un

medida con Biacore;

(2) se unen a OX40 humana unida a membrana, p. e

p. ej., medida por FACS.

(3) se unen a OX40 de macaco cangrejero, p. ej., s

ej., con una CE50 de 10 nM o menor (p. ej., de 0,01

(4) inducen o mejoran la activación de células T, co

IL-2 y/o de IFN-^y en células T que expresan OX40 y/

(5) inhiben la unión del ligando OX40 a OX40, p. ej.,

un ensayo con células 293-hOX40;

(6) se unen a un epítopo en la parte extracelular de O

de la región DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID N

LAGK (SEQ ID NO: 179);

(7) compiten por la unión a OX40 humana con 3F4,

(8) compiten por la unión a OX40 humana con 6E1-

Dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos h

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX

aminoácido dentro de la siguiente región de OX40 huma DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178),

correspondientes a los restos de aminoácido 46-62 de

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX

aminoácido dentro de la siguiente región de OX40 huma DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAG

aminoácido 89-124 de OX40 humana madura (SEQ ID

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX

a una parte de, la secuencia DVVSSKPCKPCTWCNL

secuencia SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWC

En otras realizaciones, los anticuerpos anti-OX40 descr

parte de, la secuencia DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ

PCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 183).

Aún en otras realizaciones, los anticuerpos anti-OX4 DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178), se ena pesada comprende una lisina u otro aminoácido en idos siguientes: LSPGK (SEQ ID NO: 8) para la cadena e la cadena pesada carece de uno o más aminoácidos EQ ID NO: 9) o LSP C-terminal.

eras de los anticuerpos reivindicados y no reivindicados 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, EQ ID NO: 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112,

aminoácidos que es al menos 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, de las cadenas pesadas o ligeras expuestas en la tabla 97 y 98; 99 y 100; 101 y 102; 103 y 104; 105 y 106; 107 8; 119 y 120; 121 y 122; 123 y 116; 124 y 116; y 125 y anos que tengan las características deseadas, p. ej., las ariantes ilustrativas son aquellas que comprenden una ación en las regiones variables o constantes, tales como enas pesadas y ligeras que comprenden una secuencia 0, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 o 1 aminoácidos (por esadas o ligeras expuestas en la tabla 23 (o sus regiones 0 humanos que tengan las características deseadas, p. ento.

ritos presentan una o más, dos o más, tres o más, cuatro funcionales:

de 10 nM o menor (p. ej., de 0,01 nM a 10 nM), p. ej., una CE50 de 1 nM o menor (p. ej., de 0,01 nM a 1 nM), n a OX40 de macaco cangrejero unida a membrana, p.

0 nM), p. ej., medida por FAC^s .

demuestra mediante (i) el aumento de la producción de el aumento de la proliferación de células T;

una CE50 de 1 nM o menor medida por FACS, p. ej., en umana madura (SEQ ID NO: 2), p. ej., un epítopo dentro ) o DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCT-1, 14B6-2, 23H3, 18E9, 8B11,20B3 y 20C1;

-2, 14A2-1 y 14A2-2.

os, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos. scritos en el presente documento se unen a restos de adura (SEQ ID NO: 2):

humana madura (SEQ ID NO: 2).

scritos en el presente documento se unen a restos de adura (SEQ ID NO: 2):

Q ID NO: 179), correspondiente a los restos de .

scritos en el presente documento que se unen a toda, o Q ID NO: 178) se unen a toda, o a una parte de, la (SEQ ID NO: 182).

n el presente documento que se unen a toda, o a una O: 178), se unen a toda, o a una parte de, la secuencia

e se unen a toda, o a una parte de, la secuencia además a toda, o a una parte de, la secuencia QLCTATQDTVCR (SEQ ID NO: 184).

En realizaciones adicionales, los anticuerpos anti-OX40

una parte de, la secuencia DVVSSKPCKPCTWCNLR (

secuencia SQNTVCRPCGPGFYN (SEQ ID NO: 185).

Dominios constantes de cadena pesada modificada

La región constante de cadena pesada de los anticuer

de cualquier isotipo, p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4 o co

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-O

modificada que altera las propiedades del anticuerpo.

Como se indica más adelante en el presente document

OX40 con regiones constantes hIgG1 no modificadas (

y promueve la activación de células T, y promueve esp

Y y de IL-2. El entrecruzamiento puede producirse, p.

humanos expresados en la superficie de células CHO

CHO-CD3-CD32A y células T CD4 primarias humanas.

la adición de un anticuerpo anti-FcY humano policlon

periférica (CMSP) humanas activadas con enterotoxina

Los anticuerpos anti-OX40 con regiones constantes de

IgG1 en donde la región CHI/bisagra se reemplaza por

de alterar las actividades de los anticuerpos en relación

totalmente IgG1. Actividades ilustrativas que pueden mo

T en presencia o ausencia de entrecruzamiento, (2

entrecruzamiento y/o (3) secreción de citocinas (p. ej. e

Los métodos descritos en los Ejemplos pueden utilizar

constantes de cadena pesada modificadas presentan

realizaciones preferidas, estas actividades alteradas no

de los anticuerpos, que se puede evaluar utilizando, p.

Por consiguiente, en el presente documento se proporci

OX40 que comprenden, proporcionar un anticuerpo anti

la bisagra que no es de IgG2 por una bisagra de IgG2

cadena pesada modificada comprende una bisagra del i

CH3. En determinadas realizaciones, una región consta

IgG2 y un dominio CH1, CH2 y CH3, en donde al menos

bisagra de IgG2 puede ser una bisagra de IgG2 tipo silv

ej., ERKCCVECPPCPAPPVAG; SEQ ID NO: 2O8) o

conserve la capacidad de conferir al anticuerpo una

comprende una bisagra que no es de IgG2. En determin

una rigidez o una dureza similar a la de la bisagra

determinarse, p. ej., mediante modelado computarizado,

Magnética Nuclear (RMN), cristalografía por rayos X, (f

de sedimentación para medir o comparar los radios de g

puede tener una rigidez similar o superior en relación co

un valor obtenido de uno de los ensayos descritos en l

una bisagra diferente, p. ej., una bisagra de IgG1, en m

ensayos, un experto en la materia podría determinar s

bisagra interpretando los resultados de los mismos. Una

de IgG2 que comprende una sustitución de uno o más

C229). Una cisteína puede reemplazarse por una seri

humana que comprende una mutación C219S (p. ej., E

de bisagra de IgG2 que pueden utilizarse incluyen bisa

C226 y/o C229, p. ej., una mutación C220S, C226S o C

bisagra de IgG2 también puede ser una bisagra de Ig

decir, es una bisagra quimérica), siempre que la rigid

bisagra de IgG2 de tipo silvestre. Por ejemplo, una bisag

inferior (como se define en la tabla 2) es de un isotipo I

Otras mutaciones de bisagra de IgG2 que pueden util

(S267E), SELF (S267E/L328F), SDIE (S239D/I332E), S

Se dice que una bisagra "híbrida" o "quimérica" es de

consecutivos de la bisagra son de ese isotipo. Por ej critos en el presente documento que se unen a toda, o a ID NO: 178), se unen además a toda, o a una parte de, la

nti-OX40 descritos en el presente documento puede ser aciones de los mismos y/o modificaciones de los mismos. comprenden una región constante de la cadena pesada

n los Ejemplos, el entrecruzamiento de anticuerpos antiuerpos de isotipo hIgG1) induce la señalización de OX40 amente la proliferación de células T, la secreción de IFN-través de la unión a receptores F^cy (F^cyR^s) de CD32A sfectadas en un ensayo que utiliza cocultivos de células bién puede producirse entrecruzamiento, p. ej., mediante luble en cultivos de células mononucleares de sangre estafilococo (EBE).

ena pesada modificadas (p. ej., una región constante de región Chl/bisagra de hIgG2), pueden tener la capacidad anticuerpos con una región constante de cadena pesada arse incluyen, pero sin limitación, (1) activación de células oliferación de células T en presencia o ausencia de N-y, IL-2) en presencia o ausencia de entrecruzamiento. ra determinar si los anticuerpos anti-OX40 con regiones actividades alteradas (véase, p. ej., el Ejemplo 27). En tan notablemente a las propiedades de unión al antígeno ACS, RPS).

métodos para alterar la actividad de los anticuerpos anti-40 que tiene una bisagra que no es de IgG2 y reemplazar determinadas realizaciones, una región constante de la o IgG2 (una "bisagra de IgG2") y un dominio CH1, CH2 y de cadena pesada modificada comprende una bisagra de del dominios CH1, CH2 y CH3 no es del isotipo IgG2. La , p. ej., una bisagra de IgG2 humana de tipo silvestre (p. variante de la misma, siempre que la bisagra de IgG2 idad alterada en relación con el mismo anticuerpo que realizaciones, una variante de bisagra de IgG2 conserva G2 de tipo silvestre. La rigidez de una bisagra puede roscopía electrónica, espectroscopia tal como Resonancia res B), o ultracentrifugación analítica (UCA) de velocidad e los anticuerpos que comprende la bisagra. Una bisagra a bisagra si un anticuerpo que comprende la bisagra tiene e anterior que difiere del valor del mismo anticuerpo con del 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o 100 %. A partir de los a bisagra tiene una rigidez al menos similar a la de otra nte de bisagra de IgG2 humana ilustrativa es una bisagra s cuatro restos de cisteína (es decir, C219, C220, C226 y Una bisagra de IgG2 ilustrativa es una bisagra de IgG2 CVECPPCPAPPVAG; SEQ ID NO: 209). Otras variantes de IgG2 humana que comprenden una sustitución C220, (que puede combinarse con una mutación C219S). Una n la que una parte de la bisagra es la de otro isotipo (es la bisagra quimérica sea al menos similar a la de una IgG2 puede ser una bisagra de IgG2 en la que la bisagra y es, p. ej., una bisagra inferior de IgG1 de tipo silvestre. e en una bisagra de IgG2 incluyen las mutaciones SE y GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E).

sotipo específico si más de la mitad de los aminoácidos o, se considera que una bisagra que tiene una bisagra superior y central de IgG2 y la bisagra inferior de IgG1

En determinadas realizaciones, un anticuerpo de OX40

comprende una bisagra de IgG2 que comprende una d

ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 208);

ERKSCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 209);

ERKCSVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 210);

ERKXCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 211);

ERKCXVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 212);

ERKCCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 213);

ERKSCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 214);

ERKCSVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 215);

ERKXCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 216);

ERKCXVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 217);

ERKCCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 218);

ERKSCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 219);

ERKCCSVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 220);

ERKXCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 221);

ERKCXVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 222);

ERKCCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 223);

ERKSCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 224);

ERKCCSVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 225);

ERKXCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 226);

ERKCXVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 227);

ERKCCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 228);

ERKSCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 229);

ERKCSVECPPCPAP (SEQ ID NO: 230);

ERKXCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 231); o

ERKCXVECPPCPAP (SEQ ID NO: 232),

en donde X es cualquier aminoácido, excepto una cisteí

o cualquiera de las secuencias anteriores, en las que

aminoácido CVE y CPP. En determinadas realizaciones,

la bisagra y el dominio CH2 se insertan 1, 1-2 o 1-3 am

puede insertar una glicina.

En determinadas realizaciones, la bisagra comprende l

los 4 aminoácidos P233, V234, A235 y G237 (correspo

NO: 233), están delecionados o sustituidos por otro ami

bisagra de IgG1 (ELLG (SEQ ID NO: 234) o ELLGG (

comprende las s Eq ID NO: 208, 209, 210, 211 o 212, e

por otro aminoácido. En determinadas realizaciones, la

en donde A235 y G237 están delecionados o sustitui

bisagra comprende las SEQ ID NO: 208, 209, 210, 211

aminoácido. En determinadas realizaciones, la bisagra c

V234 y A235 están delecionados o sustituidos por otro a

IgG2 con los correspondientes aminoácidos de una bi

(SEQ ID NO: 235)) para obtener una bisagra híbrida, p.

tiene las ventajas de una bisagra de IgG2 y la función e

En determinadas realizaciones, una región constante d

consiste esencialmente en una de las secuencias mostr

208-232, y en determinadas realizaciones, no compren

En determinadas realizaciones, una región constante d

que es un domino CH1 de tipo silvestre del isotipo IgG

respectivamente). También pueden utilizarse dominios

"dominio CH1 de IgG2", respectivamente). Un dominio

tipo silvestre, p. ej., una variante de un dominio CH1 d

ilustrativas de dominios CH1 se incluyen A114C y T173

En determinadas realizaciones, una región constante d

que es un dominio CH2 tipo silvestre del isotipo IgG1,

IgG2", "dominio CH2 de IgG3", o "dominio CH2 de IgG4

variante de un dominio CH2 de tipo silvestre, p. ej., una bisagra de IgG2.

prende una región constante de la cadena pesada que iguientes secuencias:

1-3, 1-2 o 1 aminoácido se inserta entre los restos de serta THT o GGG. En determinadas realizaciones, entre idos. Por ejemplo, entre la bisagra y el dominio CH2 se

Q ID NO: 208, 209, 210, 211 o 212, en donde 1, 2, 3 o tes a los 4 aminoácidos C-terminales "PVAG" (SEQ ID do, p. ej., los aminoácidos del extremo carboxílico de la D NO: 235). En determinadas realizaciones, la bisagra de V234, A235 y G237 están delecionados o sustituidos a comprende las SEQ ID NO: 208, 209, 210, 211 o 212, or otro aminoácido. En determinadas realizaciones, la , en donde G237 está delecionado o sustituido por otro nde las SEQ ID NO: 447, 448, 449, 450 o 451, en donde cido. La sustitución de PVAG (SEQ ID NO: 233) en una de IgG1, es decir, (ELLG (SEQ ID NO: 234) o ELLGG ostrado anteriormente, que proporciona una bisagra que de las bisagras de IgG1.

adena pesada modificada comprende una bisagra que anteriormente, p. ej., una cualquiera de las SEQ ID NO: tos de aminoácido adicionales en la bisagra.

adena pesada modificada comprende un dominio CH1 G2 ("dominio CH1 de IgG1" o "dominio CH1 de IgG2", de los isotipos IgG3 e IgG4 ("dominio CH1 de IgG3 y también puede ser una variante de un dominio CH1 de 1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre. Como variantes C131, p. ej., C131S.

adena pesada modificada comprende un dominio CH2 IgG3 o IgG4 ("domino CH2 de IgG1", "dominio CH2 de pectivamente). Un dominio CH2 también puede ser una nte de un dominio CH2 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre. Como variantes ilustrativas de dominios C

de la región Fc de un anticuerpo, tal como ADCC o CD

una realización, el dominio CH2 es un dominio CH2 de I

CH2 tiene función efectora reducida en relación con el mi

del presente documento también se exponen otras muta

En determinadas realizaciones, una región constante d

que es un dominio CH3 tipo silvestre del isotipo IgG1, I

IgG2", "dominio CH3 de IgG3", o "dominio CH3 de IgG4"

variante de un dominio CH3 de tipo silvestre, p. ej., una

tipo silvestre. Como variantes ilustrativas de dominios C

de la región Fc de un anticuerpo, tal como ADCC o CDC

Generalmente, las variantes de los dominios CH1, bisagr

o más mutaciones, y/o como mucho 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4,

una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproxi

o 99% idéntica a la del correspondiente dominio

respectivamente), siempre que la región constante de

conserve la actividad biológica necesaria.

En la tabla 3 se exponen regiones constantes de la cade

CH1, bisagra, CH2 y/o CH3, en donde cada dominio e

proporciona la actividad biológica deseada a la región c

indica que el dominio está o no presente, y si lo está, pu

Por ejemplo, un anticuerpo que comprende la región con

que comprende una región constante de la cadena pe

también puede comprender un dominio CH1, CH2 y/o C

un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Como otro ejemplo

región constante de la cadena pesada 8 es un anticuerp

que comprende un dominio de CH1 de IgG1, y una bisagr

comprender también un dominio CH3, que si está prese

Tabla 3. nfi r i n il r iv r i

incluyen variantes que modulan una actividad biológica modulan la semivida del anticuerpo o su estabilidad. En con una mutación A330S y P331S, en donde el dominio dominio CH2 sin las mutaciones. En cualquier otra parte s.

cadena pesada modificada comprende un dominio CH3 IgG3 o IgG4 ("domino CH3 de IgG1", "dominio CH3 de pectivamente). Un dominio CH3 también puede ser una nte de un dominio CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de incluyen variantes que modulan una actividad biológica odulan la semivida del anticuerpo o su estabilidad.

H2 o CH3 pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 1 mutaciones, o 1-10 o 1-5 mutaciones, o comprender mente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % tipo silvestre (dominio CH1, bisagra, CH2 o CH3, cadena pesada que comprenda la variante específica

esada humana ilustrativas que comprenden los dominios dominio de tipo silvestre o una variante del mismo que nte de la cadena pesada. En la tabla 3 una celda vacía ser de cualquier isotipo, p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. te de la cadena pesada 1 en la tabla 3, es un anticuerpo que comprende al menos una bisagra de IgG2, y que si está presente, dicho dominio CH1, CH2 y CH3 es de entender la tabla 3, un anticuerpo que comprende una e comprende una región constante de la cadena pesada IgG2, un dominio CH2 de IgG1, y que puede o no puede uede ser de un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

n n n humanas

n i n

En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-O

mostrada en la tabla 3 y puede tener una actividad alter

región constante de cadena pesada que no comprend

determinadas realizaciones, un anticuerpo que compren

tabla 3 o 4 puede tener una actividad alterada en rel

constante de cadena pesada que no comprende una bi

realizaciones, un anticuerpo que comprende una región

tener una actividad alterada en relación con el mismo

pesada que comprende una bisagra que no es de IgG2

determinadas realizaciones, un anticuerpo que compren

tabla 3 o 4 puede tener una actividad alterada en rel

constante de cadena pesada que no comprende uno o m

ejemplo, en determinadas realizaciones, un anticuerpo

mostrada en la tabla 3 o 4 puede tener una actividad al

una región constante de cadena pesada que no compre

isotipo específico. Por ejemplo, un anticuerpo que comp

en la tabla 3, puede tener una actividad alterada en rela

constante de cadena pesada que no comprende una bis

ej., una bisagra de IgG1, IgG3 o IgG4); (ii) el mismo a

pesada que no comprende una bisagra de IgG2 y un C

un CH1 no de IgG1; (iii) el mismo anticuerpo que co

comprende una bisagra de IgG2 y un CH2 de IgG2, y c

IgG2; (iv) el mismo anticuerpo que comprende una región

de IgG2 y un CH3 de IgG1, y comprende, p. ej., una bisag

que comprende una región constante de cadena pesada

un CH2 de CH2, y comprende, p. ej., una bisagra no de

mismo anticuerpo que comprende una región constante

un CH1 de IgG1 y un CH3 de IgG1, y comprende, p. ej.,

no de IgG1; (vii) el mismo anticuerpo que comprende un

bisagra de IgG2, un CH2 de IgG2 y un CH3 de IgG1, y

IgG2 y/o un CH3 no de IgG1; (viii) o el mismo anticuerpo

no comprende una bisagra de IgG2, un CH1 de IgG1, u

bisagra no de IgG2 y/o un CH1 no de IgG1 y/o un CH2 n

En la tabla 4 se proporcionan regiones constantes de c

regiones variables anti-OX40, p. ej., las regiones vari

identidad de cada uno de los dominios.

comprende una región constante de cadena pesada en relación con el mismo anticuerpo que comprende una a región constante de la cadena pesada específica. En una región constante de cadena pesada mostrada en la n con el mismo anticuerpo que comprende una región a de IgG2 o la misma bisagra de IgG2. En determinadas tante de cadena pesada mostrada en la tabla 3 o 4 puede uerpo que comprende una región constante de cadena omprende, p. ej., una bisagra de IgG1, IgG3 o IgG4. En una región constante de cadena pesada mostrada en la n con el mismo anticuerpo que comprende una región e los mismos dominios CH1, bisagra de IgG2 o CH3. Por e comprende una región constante de cadena pesada da en relación con el mismo anticuerpo que comprende una bisagra de IgG2 y un dominio CH1, CH2 y/o CH3 del e una región constante de cadena pesada 22 mostrada con (i) el mismo anticuerpo que comprende una región de IgG2 y comprende, p. ej., una bisagra no de IgG2 (p. uerpo que comprende una región constante de cadena e IgG1, y comprende, p. ej., una bisagra no de IgG2 y/o ende una región constante de cadena pesada que no rende, p. ej., una bisagra no de IgG2 y/o un CH2 no de stante de cadena pesada que no comprende una bisagra o de IgG2 y/o un CH3 no de IgG1; (v) el mismo anticuerpo no comprende una bisagra de IgG2, un CH1 de IgG1 y 2 y/o un CH1 no de IgG1 y/o un CH2 no de IgG2; (vi) el cadena pesada que no comprende una bisagra de IgG2, bisagra no de IgG2 y/o un CH1 no de IgG1 y/o un CH3 ión constante de cadena pesada que no comprende una prende, p. ej., una bisagra no de IgG2 y/o un CH no de comprende una región constante de cadena pesada que H2 de IgG2 y un CH3 de IgG1, y comprende, p. ej., una IgG2 y/o un CH3 no de IgG1.

na pesada modificadas ilustrativas que pueden unirse a s descritas en el presente documento, que expone la ^

En la tabla 5 se proporcionan regiones constantes de ca

T a pesada modificadas ilustrativas adicionales. .

n i n

En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-OX

modificada que comprende una bisagra de IgG2 que c

241 y 208-232 o una variante de las mismas, tal co

aminoácidos que (i) difiere de cualquiera de las SEQ ID

adiciones o deleciones de aminoácidos; (ii) difiere de un

a lo sumo en 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones o del

SEQ ID NO: 238, 239, 240, 241 y 208-232 en 1-5, 1

aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de amino

90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una cu

donde en uno cualquiera de los puntos (i)-(iv), una sustit

conservativa o una sustitución de aminoácido no cons

modificada proporciona una actividad alterada a un an

cadena pesada, p. ej., una región constante de cadena

con la misma región constante de cadena pesada modifi

En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-OX

modificada que comprende un dominio CH1 de IgG1 qu

comprendel SEQ ID NO: 203, o una variante del SEQ I

o 203 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o deleci

lo sumo en 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones o dele

en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o del

aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %,

el SEQ ID NO: 202 o 203, en donde en uno cualquiera d

una sustitución de aminoácido conservativa o una sustitu

anti-OX40 que comprende una región constante de la c

en relación con la del anticuerpo anti-OX40 pero con

constante de cadena pesada que comprende una bisagr

cadena pesada modificada que comprende una bisagra

En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-OX4

comprende un dominio CH2 de IgG1 que comprendel S

298, cuya variante (i) difiere del SEQ ID NO: 204 o 29

aminoácidos; (ii) difiere del SEQ ID NO: 204 o 298 a lo s

aminoácidos; (iii) difiere del SEQ ID NO: 204 o 298 en 1-aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de amino

90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a el SEQ

(i)-(iv), una sustitución de aminoácido puede ser una

aminoácido no conservativa; y en donde la región cons

actividad alterada a un anticuerpo anti-OX40 en relación

región constante de cadena pesada que comprende omprende una región constante de la cadena pesada nde una cualquiera de las SEQ ID NO: 238, 239, 240, a bisagra de IgG2 que comprende una secuencia de 8, 239, 240, 241 y 208-232 en 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones, lquiera de las SEQ ID NO: 238, 239, 240, 241 y 208-232 es de aminoácidos; (iii) difiere de una cualquiera de las -2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o deleciones de s que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, ra de las SEQ ID NO: 238, 239, 240, 241 y 208-232, en de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácido va; y en donde la región constante de cadena pesada po anti-OX40 en relación con otra región constante de a que comprende una bisagra no de IgG2 o en relación que comprende una bisagra no de IgG2.

omprende una región constante de la cadena pesada prendel SEQ ID NO: 202 o un dominio CH1 de IgG2 que 202 o 203, cuya variante (i) difiere del SEQ ID NO: 202 de aminoácidos; (ii) difiere del SEQ ID NO: 202 o 203 a s de aminoácidos; (iii) difiere del SEQ ID NO: 202 o 203 s de aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a puntos (i)-(iv), una sustitución de aminoácido puede ser de aminoácido no conservativa; y en donde el anticuerpo pesada modificada puede tener una actividad alterada región constante de cadena pesada, p. ej., una región de IgG2 o en relación con la misma región constante de IgG2.

prende una región constante de la cadena pesada que D NO: 204 o 298, o una variante del SEQ iD NO: 204 o 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o deleciones de en 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones o deleciones de , 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o deleciones de s que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, O: 204 o 298, en donde en uno cualquiera de los puntos ción de aminoácido conservativa o una sustitución de de cadena pesada modificada puede proporcionar una a de otra región constante de cadena pesada, p. ej., una isagra no de IgG2 o en relación con la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende

En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-OX40

comprende un dominio CH3 de IgG1 que comprendel

variante (i) difiere del SEQ ID NO: 206 en 1, 2, 3, 4 o 5 su

del SEQ ID NO: 206 a lo sumo en 5, 4, 3, 2 o 1 sustituci

SEQ ID NO: 206 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustitucione

una secuencia de aminoácidos que es al menos aproxim

o 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 206, en donde en uno c

puede ser una sustitución de aminoácido conservativa o

la región constante de cadena pesada modificada puede

región constante de cadena pesada, p. ej., una región c

de IgG2 o en relación con la misma región constante de

de IgG2.

Las regiones constantes de cadena pesada modifica

dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3 descritos anteriorme

En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-OX

modificada que comprende una cualquiera de las SEQ I

ID NO: 244-281, cuya variante (i) difiere de una cualquier

más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácido

lo sumo en 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones,

cualquiera de las SEQ ID NO: 244-281 en 1-5, 1-3, 1-2,

aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de amino

90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una

cualquiera de los puntos (i)-(iv), una sustitución de amin

o una sustitución de aminoácido no conservativa; y en do

proporcionar una actividad alterada en relación con la d

constante de cadena pesada que comprende una bisagr

cadena pesada modificada que comprende una bisagra

Las regiones constantes de cadena pesada modificada

aumentada (p. ej., unión a un F^cyR) en relación con una

una semivida similar, reducida o aumentada(o unión al r

pesada de tipo silvestre.

111. Anticuerpos que tiene secuencias de la línea ger

Como se ha indicado en los Ejemplos de la presente div

de OX40 que comprenden una región variable de caden

gen VH 5-51, gen VH 3-9, gen VH DP44, gen VH 3-30,3,

o proceden de estos. Por consiguiente, en el presente do

específicos de OX40 humana, que comprenden una regi

de VH de la línea germinal humana seleccionado del gru

51, gen VH 3-9, gen VH DP44, gen VH 3-30,3, gen VH 3

Se han preparado anticuerpos humanos específicos de

que es el producto de un gen VK L5, gen V^k L6, gen V

humana, o proceden de estos. Por consiguiente, en el pre

aislados que comprenden una región variable de cadena

humana seleccionado del grupo que consiste en: un gen

o proceden de estos.

Los anticuerpos preferidos no reivindicados descritos e

región variable de cadena variable que es el producto de

huma anteriormente enumerados y que también compre

de, o procede de, uno de los genes de VK de la línea ge

Como se usa en el presente documento, un anticuerpo

ligera que son "el producto de" o "proceden de" una se

del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa gen

sistemas incluyen la inmunización de un ratón transgén

antígeno de interés o la exploración de una genoteca de i

de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto d

la línea germinal humana puede identificarse tal como bisagra no de IgG2.

prende una región constante de la cadena pesada que ID NO: 206, o una variante de SEQ ID NO: 206, cuya iones, adiciones o deleciones de aminoácidos; (ii) difiere , adiciones o deleciones de aminoácidos; (iii) difiere del ciones o deleciones de aminoácidos y/o (iv) comprende ente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % iera de los puntos (i)-(iv), una sustitución de aminoácido sustitución de aminoácido no conservativa; y en donde orcionar una actividad alterada en relación con la de otra nte de cadena pesada que comprende una bisagra no ena pesada modificada que comprende una bisagra no

ambién pueden comprender una combinación de los

mprende una región constante de la cadena pesada : 244-281, o una variante de una cualquiera de las SEQ las SEQ ID NO: 244-281 en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o ) difiere de una cualquiera de las SEQ ID NO: 244-281 a iones o deleciones de aminoácidos; (iii) difiere de una -5, 1-10 o 5-10 sustituciones, adiciones o deleciones de s que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, uiera de las SEQ ID NO: 244-281, en donde en uno puede ser una sustitución de aminoácido conservativa la región constante de cadena pesada modificada puede región constante de cadena pesada, p. ej., una región de IgG2 o en relación con la misma región constante de IgG2.

eden tener (i) una función efectora similar, reducida o ón constante de cadena pesada de tipo silvestre y/o (ii) or FcRn) en relación con la región constante de cadena

l particulares

ión, se han preparado anticuerpos humanos específicos ada que es el producto de un gen VH 1-08, gen VH 6-6, VH 3-10 y/o gen VH 3-13 de la línea germinal humana, nto se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados ariable de cadena pesada que es el producto de un gen ue consiste en: un gen VH 1-08, gen VH 6-6, gen VH 5­ gen VH 3-13, o proceden de estos.

que comprenden una región variable de cadena ligera , gen VK A27 y/o gen VK O14/O4 de la línea germinal documento se proporcionan anticuerpos monoclonales que es el producto de un gen de VK de la línea germinal , gen VK L6, gen VK L15, gen VK A27 y gen VK O14/O4,

resente documento son aquellos que comprenden una rocede de, uno de los genes de VH de la línea germinal una región variable de cadena ligera que es el producto l humana anteriormente enumerados.

no comprende regiones variables de cadena pesada o ia de línea germinal particular si las regiones variables inmunoglobulina de la línea germinal humana. Dichos ue lleva de genes de inmunoglobulina humana con el oglobulina humana expresada en fagos con el antígeno ue "procede de" una secuencia de inmunoglobulina de parando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de las inm

secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal hum

de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. U

de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea

aminoácido en comparación con la secuencia de la lín

origen natural o a la introducción intencional de mut

seleccionado normalmente es al menos 90 % idéntic

aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina

que identifican el anticuerpo humano como de ser huma

de inmunoglobulina de la línea germinal de otras es

determinados casos, un anticuerpo humano puede ser

idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia

la línea germinal. Habitualmente, un anticuerpo human

particular mostrará no más de 10 diferencias de amino

de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En d

más de 5 o incluso no más 4, 3, 2 o 1 aminoácido de dif

de inmunoglobulina de la línea germinal.

IV. Anticuerpos homólogos

En el presente documento se proporcionan anticuerpo

pesada y de cadena ligera que comprenden secuenci

aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en

las propiedades funcionales deseadas de los anticuerp

El anticuerpo no reivindicado puede ser, por ejempl

anticuerpo quimérico.

El anticuerpo anti-OX40 no reivindicado, o parte de u

pesada y una cadena ligera, en donde:

(a) la cadena pesada comprende una secuencia de

97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de ami

2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25 o 1

o deleciones de aminoácidos) relativas a una secue

(b) la cadena ligera comprende una secuencia de a

97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de ami

2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25 o 1

o deleciones de aminoácidos) relativas a una secue

(c) el anticuerpos se une específicamente a OX40 y

(d) el anticuerpo presenta 1, 2, 3, 4, 5, 6 o todas las

(1) se unen a OX40 humana soluble, p. ej., con

medida con Biacore;

(2) se unen a OX40 humana unida a membrana

1 nM), p. ej., medida por FACS.

(3) se unen a OX40 de macaco cangrejero, p. ej

p. ej., con una CE50 de 10 nM o menor (p. ej., de

(4) inducen o mejoran la activación de células T,

de IL-2 y/o de IFN-y en células T que expresan

(5) inhiben la unión del ligando OX40 a OX40, p.

en un ensayo con células 293-hOX40;

(6) se unen a un epítopo en la parte extracelular

dentro de la región DVVSSKPCKPCTWCNLR (S

WTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179);

(7) compiten por la unión a OX40 humana con 3

(8) compiten por la unión a OX40 humana con 6

Los anticuerpos no reivindicados, que tienen secuencia

ID NO: 124 y 116, o las CDR, pueden obtenerse median

por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican

del anticuerpo alterado codificado para determinar la fun

(1) a (7) anteriores utilizando los ensayos funcionales d

V. Anticuerpos con modificaciones conservativas bulinas de la línea germinal humana y seleccionando la ue es más parecida en secuencia (es decir, el mayor % uerpo humano que es "el producto de" o que "procede al humana particular puede contener diferencias de minal, debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas de dirigida a sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano las secuencias de aminoácidos a una secuencia de línea germinal humana y contiene restos de aminoácido ando se comparada con las secuencias de aminoácidos (p. ej., secuencias de la línea germinal murina). En nos 95 % o incluso al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 % inoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de edente de una secuencia de la línea germinal humana de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen inados casos, el anticuerpo humano puede mostrar no ia de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen

reivindicados que tienen regiones variables de cadena aminoácidos que son homólogas a las secuencias de sente documento, y en donde los anticuerpos conservan i-OX40 descritos en el presente documento.

anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un

antígeno del mismo, puede comprender una cadena

ácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, os que consiste en el SEQ ID NO: 124, o comprende 1, mbios de aminoácidos (es decir, sustituciones, adiciones e aminoácidos que consiste en el SEQ ID NO: 124; cidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, os que consiste en el SEQ ID NO: 116, o comprende 1, mbios de aminoácidos (es decir, sustituciones, adiciones e aminoácidos que consiste en el SEQ ID NO: 116;

ntes propiedades funcionales:

^d de 10 nM o menor (p. ej., de 0,01 nM a 10 nM), p. ej.,

j., con una CE50 de 1 nM o menor (p. ej., de 0,01 nM a

nen a OX40 de macaco cangrejero unida a membrana, nM a 10 nM), p. ej., medida por FACS.

se demuestra mediante (i) el aumento de la producción y/o (ii) el aumento de la proliferación de células T;

on una CE50 de 1 nM o menor medida por FACS, p. ej.,

X40 humana madura (SEQ ID NO: 2), p. ej., un epítopo NO: 178) o DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKP-

B6-1, 14B6-2, 23H3, 18E9, 8B11,20B3 y 20C1;

E1-2, 14A2-1 y 14A2-2.

homología respecto a las regiones Vh y Vl de las SEQ tagénesis (p. ej., mutagénesis dirigida al sitio o mediada ID NO: 124 y/o el SEQ ID NO: 116, seguido de análisis etenida (es decir, las funciones expuestas en los puntos s en el presente documento.

En la región Fc pueden realizarse sustituciones conse

anticuerpo anti-OX40 comprende una combinación de

VI. Anticuerpos competitivos y anticuerpos de unió

En el presente documento también se proporcionan anti

anti-OX40 descritos en el presente documento (p. ej.,

8B11,20B3, 14A2-1, 14A2-2 y 20C1). Dichos anticuerpo

para inhibir competitivamente la unión a OX40 de uno o

23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2 -1, 14A2

ejemplo, pueden utilizarse ensayos ELISA convencion

OX40 humana recombinante se inmoviliza en una plac

no marcado, la placa se lava, se añade el segundo anti

unido. Si el aumento de la concentración del (primer

bloqueante") inhibe la unión del (segundo) anticuerpo

segundo anticuerpo con la diana en la placa, o se

Adicionalmente o como alternativa, para evaluar la capac

de RPS BIACORE®. La capacidad de un anticuerpo

descrito en el presente documento con OX40, demu

anticuerpo por la unión a OX40.

Por consiguiente, en el presente documento se propo

anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente docum

menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 6

95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, utilizando, p. ej

En el presente documento se proporcionan anticuerpos

uno o más de los anticuerpos anti-OX40 descritos en el

2, 23H3, 6E1-1,6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A

epitópico reconocidas en la materia, tales como las des

Las técnicas de mapeo epitópico reconocidas en la mat

determinación de la estructura cristalina por rayos X (

espectroscopia por resonancia magnética nuclear (R

intercambio de H-D de hidrógenos de amida lábiles en O

con un anticuerpo de interés (Zinn-Justin et al. Bioc

1993;32,6884-91).

Para la cristalografía de rayos X, la cristalización se pu

(p. ej., Giege et al. Acta Crystallogr 1994;D50:339-50; Mc

(p. ej., Chayen, Structure 19976;5:1269-74), difusión

1976;251:6300-3), siembra y diálisis. Es deseable utiliz

de al menos aproximadamente 1 mg/ml y preferente

20 mg/ml. La cristalización puede lograrse mejor en u

20.000 (PEG; peso molecular medio que varía de

preferentemente de aproximadamente 5.000 a

aproximadamente 6.000 Da, variando las concentracion

También puede ser deseable incluir un agente estabiliza

entre aproximadamente el 0,5 % y aproximadamente el

de litio o citrato de sodio, también puede ser dese

concentración que varíe de aproximadamente 1 mM

preferentemente a un pH de aproximadamente 3,0 a a

4,0. Los tampones específicos útiles en la solución pr

(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice,

ejemplos de dichos tampones se incluyen, pero sin li

crecer a una amplia variedad de temperaturas,

anticuerpo:antígeno pueden estudiarse utilizando técnic

utilizando un programa informático tal como X-PLOR (Un

Inc.; véase, p. ej., Blundell y Johnson, Meth. Enzymol.

publicación de solicitud de patente de Estados Unidos

Bricogne, Meth Enzymol 1997;276A:361-423; Carter y

Otros métodos de mapero epitópico monitorizan la uni

mutadas del antígeno, donde la pérdida de unión debid

secuencia del antígeno, se considera con frecuencia

métodos es la mutagénesis de barrido con alanina, as de aminoácidos. En determinadas realizaciones, el ación de aminoácido conservativa o no conservativa.

ismo epítopo

os que compiten por la unión a OX40 con los anticuerpos erpos 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1,6E1-2, 18E9, petitivos pueden identificarse en función de su capacidad de los anticuerpos monoclonales 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 0C1 en ensayos convencionales de unión a OX40. Por ensayos ELISA competitivos en los que una proteína añaden diversas concentraciones del primer anticuerpo o marcado, se lava, y se mide la cantidad de marcador cuerpo no marcado (denominado también "anticuerpo do, se dice que el primer anticuerpo inhibe la unión del que compite por la unión del segundo anticuerpo. de los anticuerpos para competir puede utilizarse análisis sayo para inhibir la unión de un anticuerpo anti-OX40 que el anticuerpo de ensayo puede competir con el

an anticuerpos anti-OX40 que inhiben la unión de los con OX40 en células, p. ej., células T activadas, en al 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, S como se describe en los Ejemplos.

X40 no reivindicados que se unen al mismo epítopo que ente documento (p. ej., anticuerpos 3F4, 14B6-1, 14B6-20C1), según se determina utilizando técnicas de mapeo a continuación.

ncluyen, por ejemplo, métodos estructurales, tales como , documento WO2005/044853), modelado molecular y incluyendo determinación por RMN de las tasas de uando están libres y cuando están unidos en un complejo try 1992;31:11335-47; Zinn-Justin et al. Biochemistry

grar utilizando cualquier método conocido en la técnica on, Eur J Biochem 1990;189:1-23), incluyendo microlote por de gota colgante (p. ej., McPherson, J Biol Chem preparación de proteínas que tenga una concentración de aproximadamente 10mg/ml a aproximadamente lución precipitante que contenga polietilenglicol 1000­ ximadamente 1000 a aproximadamente 20.000 Da), ximadamente 7.000 Da, más preferentemente de aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 % (p/v). e proteínas, p. ej., glicerol a una concentración que varíe . Una sal adecuada, tal como cloruro de sodio, cloruro en la solución precipitante, preferentemente en una roximadamente 1000 mM. El precipitado se tampona madamente 5,0, preferentemente de aproximadamente ante pueden variar y son muy conocidos en la técnica era ed., (1994) Springer-Verlag, Nueva York). Como n, HEPES, Tris, MES y acetato. Los cristales pueden endo 2 °C, 4 °C, 8 °C y 26 °C. Los cristales de difracción de rayos X bien conocidas y pueden refinarse dad de Yale, 1992, distribuido por Molecular Simulations, 114 y 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press; 004/0014194) y (Bricogne, Acta Cryst 1993;D49:37-60; , eds.; Roversi et al., Acta Cryst. 2000;D56:1313-23).

l anticuerpo a fragmentos de antígeno o a variaciones na modificación de un resto de aminoácido dentro de la un indicio de un componente epitópico. Uno de estos omo describen, p. ej., Cunningham y Wells, Science 1989;244:1081-5. Otro método adecuado es el barrid

Biotechnology 2011;29:435-42; Forsyth et al., mAbs 20

Adicionalmente o como alternativa, para el ma

computacionales, incluyendo el mapeo de epítopos con

Adicionalmente o como alternativa, el mapeo epitópico s

que comprendan fragmentos de OX40, p. ej., fragmento

una serie de péptidos solapantes que abarcan la secue

en un ELISA directo, un ELISA competitivo (donde se

anticuerpo con OX40 unido a un pocillo de una placa d

capacidad de un anticuerpo de interés para aislar por

nativa o en forma desnaturalizada) de peptidotecas co

que los péptidos son guías para la definición del epít

peptidoteca.

Los epítopos también pueden identificarse mediante hu

masas con intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-M

Photochemical Oxidation of Proteins). Puede realizarse

presente documento y en Wei et al., Drug Discovery Tod

se describe en Hambley et al. (J American Soc Mass S

Los anticuerpos que compiten por la unión con los antic

producirse e identificarse utilizando métodos conocidos

OX40 humana como se describe en el presente docum

resultantes se examinan para comprobar su capacid

documento para unirse a OX40 utilizando los métodos

Los anticuerpos que se unen al mismo epítopo que los

pueden producir inmunizando ratones con un fragment

una el anticuerpo. El epítopo, o la región que compr

descritos anteriormente. Como alternativa, puede utiliz

para guiar la selección de anticuerpos que reconozca

similares a las de los anticuerpos anti-OX40 descritos e

en fagos, en primer lugar, la cadena pesada del antic

ligeras (preferentemente humanas) para seleccionar un

ligera se empareja con un repertorio de cadenas pesad

de unión a OX40 (preferentemente humano) que recon

anticuerpo anti-OX40 descrito en el presente document

descrito en el presente documento mediante mutagén

anticuerpo.

En algunas realizaciones, en el presente documento se

de, la secuencia DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID N

OX40 humana madura (SEQ ID NO: 2), según se deter

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX

parte de, la secuencia SQNTVCRPCGPGFYNDVVSS

mediante los métodos de los Ejemplos.

En otras realizaciones, los anticuerpos anti-OX40 desc

de, la secuencia PCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 183), s

Aún en otras realizaciones, los anticuerpos anti-OX

DVVSSKPCK-PCTWCNLR (SEQ ID NO: 178), se

QLCTATQDTVCR (SEQ ID NO: 184), según se determi

En realizaciones adicionales, los anticuerpos anti-OX40

parte de, la secuencia SQNTVCRPCGp GfYN (SEQ I

Ejemplos.

En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-OX40 NQACKPWTNCTLAGK (SEQ ID NO: 179), correspon

madura (SEQ ID NO: 2), según se determina mediante

VII. Anticuerpos genomodificados y modificados acional profundo (véase, p. ej., Araya et al., Trends in 23-32).

epitópico pueden utilizarse métodos combinatorios cionales discontinuos.

de lograr analizando la unión de un anticuerpo a péptidos desnaturalizados o desnaturalizados. Se puede sintetizar e OX40 (p. ej., OX40 humana) y explorar su unión, p. ej., a la capacidad del péptido para impedir la unión de un rotitulación) o en un chip. Otros métodos se basan en la ad péptidos cortos específicos (en forma tridimensional torias de presentación en fagos. Por tanto, se considera reconocido por el anticuerpo utilizado para explorar la

e proteínas basadas en EM, tal como espectrometría de oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP, Fast -MS, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos del 14; 19:95. La FPOP puede realizarse, por ejemplo, como metry 2005;16:2057).

s anti-OX40 descritos en el presente documento pueden técnica. Por ejemplo, se pueden inmunizar ratones con se producen hibridomas y los anticuerpos monoclonales e competir con un anticuerpo descrito en el presente tos anteriormente.

erpos anti-OX40 descritos en el presente documento se s pequeño de OX40 que contenga el epítopo al que se el epítopo, puede identificarse utilizando los métodos l método de Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899 mismo epítopo y, por lo tanto, presenten propiedades resente documento. Por ejemplo, utilizando presentación anti-OX40 se empareja con un repertorio de cadenas erpo de unión a OX40, y a continuación, la nueva cadena eferentemente humanas) para seleccionar un anticuerpo el mismo epítopo o la región de epítopo en OX40 que un pueden obtener variantes alternativas de un anticuerpo e ADNc que codifica las cadenas pesadas y ligera del

orcionan anticuerpos que se unen a toda, o a una parte 8), correspondiente a los restos de aminoácido 46-62 de mediante los métodos de los Ejemplos.

scritos en el presente documento se unen a toda, o a una PCTWCNLR (SEQ ID NO: 182), según se determina

n el presente documento se unen a toda, o a una parte se determina mediante los métodos de los Ejemplos.

e se unen a toda, o a una parte de, la secuencia además a toda, o a una parte de, la secuencia ediante los métodos de los ejemplos.

ritos en el presente documento se unen a toda, o a una 185), según se determina mediante los métodos de los

e dentro de la región DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGD-a los restos de aminoácido 89-124 de OX40 humana étodos de los Ejemplos.

Unión a antígeno dirigida

En diversas realizaciones, los anticuerpos descritos

selectivamente la unión al antígeno en tejidos y ambient

permiten la unión al antígeno donde ésta sería beneficio

bloqueante que se une específicamente a la superficie d

antígeno, dicha máscara se une a cada uno de los braz

peptidasa. Véanse, p.ej., el documento de Patente

construcciones son útiles para el tratamiento de cánceres

en el microambiente tumoral en comparación con los

escindible en el microambiente tumoral permite la disoci

unión a antígeno selectivamente en el tumor, en lugar de

ocasionar efectos secundarios no deseados.

Como alternativa, en una realización relacionada, se enmascaramiento") que comprende dos dominios de un

antígeno del anticuerpo (bivalente) e interfiere con la unió

unión se unen entre sí (pero no al anticuerpo) por un enla

Véase, p. ej., la publicación de solicitud de patente int

ligandos de enmascaramiento pueden comprender el an

se una el anticuerpo, o pueden generarse independiente

tratamiento de cánceres en los que los niveles de protea

comparación con los tejidos no tumorales. La escisión sel

permite la disociación de los dos dominios de unión entr

de unión a antígeno. La disociación resultante del ligan

antígeno selectivamente en el tumor, en lugar de en lo

ocasionar efectos secundarios no deseados.

Regiones Fc y Fc modificadas

Además de la actividad de un anticuerpo terapéutico qu

antígeno (p. ej., bloqueo de un ligando o proteína receptor

inducida en el caso de anticuerpos agonistas), la parte

generalmente de manera compleja para suscitar cualqui

como la región Fc de una inmunoglobulina, son respons

tales como la citotoxicidad celular dependiente de antíg

(CDC) y la fagocitosis mediada por célula dependiente d

de células diana, aunque mediante diferentes mecanis

constante de cadena pesada (IgA, IgG, IgD, IgE o

Adicionalmente, estos isotipos pueden subdividirse en s

conocidas como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las molécula

(FcyR) específicos de la clase de anticuerpo IgG, a saber,

importantes para la unión de la IgG a los receptores Fcy

en suero de un anticuerpo está influenciada por la capa

(FcRn).

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente do

invención combinados con dominios constantes que co

en las actividades biológicas (si las hay) del anticuerpo p

Las IgG humanas, por ejemplo, pueden clasificarse en cu

comprende una región Fc que tiene un perfil único de unió

FcyR i (CD64), FcyRIIA, FcyRIIC (CD32); FcyRIIIA y Fcy

componente del complemento (C1q). Las IgG1 y IgG3 h

une a F^cyRIIA^hi3ⁱ , y con menor afinidad a F^cyRIIA^ri3ⁱ F^c

y F^cyRIIIA^vi58; y el receptor inhibidor F^cyRIIB tiene m

receptores de Fcy. Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716.

que F^cyRIIIB no se une a IgG2 o IgG4. Id. En general, c

IgG4 > IgG2. Como consecuencia, podría elegirse, por

IgG4, para su uso en un fármaco en el que se desee AD

NK, monocitos o macrófagos que expresan FcyRIIIA; y

desensibilizar a pacientes alérgicos. La IgG4 también po

cualquier función efectora.

Por consiguiente, las regiones variables de anti-OX40 des

o fusionarse de manera covalente) a una región Fc, p. ej.

el presente documento, se modifican para bloquear en donde la unión con el antígeno sería perjudicial, pero En una realización, se genera una "máscara" de péptido nión a antígeno del anticuerpo e interfiere con la unión a de unión del anticuerpo por un enlazador escindible por Estados Unidos N.° 8.518.404 de CytomoX. Dichas los que los niveles de proteasa aumentan enormemente idos no tumorales. La escisión selectiva del enlazador ón del péptido enmascarador/bloqueante, permitiendo la los tejidos periféricos en los que la unión a antígeno podría

sarrolla un compuesto de unión bivalente ("ligando de a antígeno que se une a ambas superficies de unión a antígeno, en el que las dos máscaras de los dominios de dor escindible, por ejemplo, escindible por una peptidasa. acional n.° WO 2010/077643 de Tegopharm Corp. Los no, o proceder del antígeno con el que se pretende que nte. Dichos ligandos enmascaradores son útiles para el aumentan enormemente en el microambiente tumoral en tiva del enlazador escindible en el microambiente tumoral í, reduciendo la avidez del anticuerpo por las superficies de enmascaramiento del anticuerpo posibilita la unión a ejidos periféricos en los que la unión a antígeno podría

urge de la unión del dominio de unión a antígeno con el fín en el caso de anticuerpos antagonistas, o señalización c del anticuerpo interacciona con el sistema inmunitario úmero de efectos biológicos. Las funciones efectoras, tal es de muchas funciones importantes de los anticuerpos, (ADCC), la citotoxicidad dependiente de complemento nticuerpo (ADCP), dando como resultado la destrucción s. Hay cinco clases, o isotipos, principales, de región ), cada uno con funciones efectoras características. clases, por ejemplo, IgG se separa en cuatro subclases e IgG interaccionan con tres clases de receptores de F^cy yRI, FcyRII y FcyRIII. Se ha informado que las secuencias están ubicadas en los dominios CH2 y CH3. La semivida d de ese anticuerpo para unirse al receptor Fc neonatal

ento pueden comprender los dominios variables de la enden diferentes regiones Fc, seleccionados basándose el uso previsto. Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25:1369. subclases, IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4 y cada una de estas uno o más de los receptores F^cy (receptores activadores (CD16) y el receptor inhibidor FcyRIiB), y para el primer anas se unen a todos los receptores de Fcy; la IgG2 se IA^vi5^s; la IgG4 se une a F^cyRI, F^cyRIIA, F^cyRⁱIB, F^cyRIIC r afinidad por IgG1, IgG2 y IgG3 que todos los demás estudios han demostrado que FcyRi no se une a IgG2 y respecto a la actividad ADCC, la IgG1 humana > IgG3 >> plo, un dominio constante de IgG1, en lugar de IgG2 o podría elegirse IgG3 si se desea la activación de células dría elegirse IgG4 si el anticuerpo se va a utilizar para seleccionarse si se desea que el anticuerpo carezca de

tas en el presente documento pueden unirse (p. ej., unirse na región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que puede ser de cualquier alotipo o isoalotipo, p. ej., para IgG1: G1

G2m23(n); para IgG3: G3m, G3m21(gl), G3m28(g5),

G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u)

selección de alotipo puede estar influenciada por posib

formación de anticuerpos anti-fármaco.

En determinadas realizaciones, las regiones variables

una región Fc que se une a uno o más receptores Fc a

tanto, estimulan la ADCC y pueden ocasionar el agotam

variables anti-OX40 descritas en el presente document

En otras realizaciones, las regiones variables anti-OX4

de IgG1 o IgG3 humana, es decir, los anticuerpos son d

anti-OX40 son anticuerpos que ocasionan agotamiento.

que se encuentran en el microambiente tumoral (y, por

significativamente el agotamiento de células Tef que

mediadoras del efecto antitumoral, y/o no ocasionan sig

fuera del tumor, p. ej., en la periferia. En otras realizaci

origen natural o no natural (p. ej., incluyendo una o más

eliminación de células Tef en el sitio del tumor y la activ

anticuerpos anti-OX40 crean una relación elevada de c

indicativo de una fuerte actividad antitumoral, y prefere

células Treg y Tef que están fuera del tumor, p. ej., en la

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX

otras realizaciones, los anticuerpos anti-OX40 tienen un

reducida a FcR activadores. En determinadas realizaci

FcRIIb, o tienen una unión mejorada a FcRIIb, que p

documento WO 2012/087928; Li y Ravetch (2011) Scie

et al. (2011) J. Immunol. 187:1754.

Las regiones variables anti-OX40 descritas en el presen

no natural, p. ej., una Fc sin efector o mayoritariamente

una Fc con unión mejorada a uno o más receptores Fc

agotamiento de células Treg en el entorno tumoral.

Las regiones variables descritas en el presente docu

modificaciones, normalmente para alterar una o más pr

en suero, la fijación del complemento, la unión al rece

Asimismo, un anticuerpo descrito en el presente docu

uno o más residuos químicos al anticuerpo) o puede m

propiedades del anticuerpo. Cada una de estas real

numeración de los restos en la región Fc es la del índi

descritas en el presente documento en referencia al nú

en lugar del aminoácido de origen natural, opcionalme

Cuando en una posición determinada puede haber vari

de origen natural, o si en la posición se pueden sustituir

(p. ej., "X/Y/Z").

Por ejemplo, se pueden realizar modificaciones en la re

citotoxicidad mediada por células dependientes de antic

complemento (CDC), (c) mayor o menor afinidad por

relación con el Fc original. Generalmente, dichas varian

de aminoácidos en la región Fc. Se considera qu

particularmente deseable. Por ejemplo, la región Fc var

en la misma, por ejemplo, de las posiciones de la región

presente documento se desvelan variantes de la sec

documentos de patente de Estados Unidos n.° 5.624.82

la publicaciones de patente PCT WO 00/42072; WO 01/

04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070

Reducción de la función efectora

La actividad de ADCC se puede reducir modificando la

sitios que afectan a la unión a receptores Fc, preferen

reciclaje. En otras realizaciones, se puede modificar una

son conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Sarm m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); para IgG2: G2m, 1(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), 27(v). Véase, p. ej., Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). La uestiones de inmunogenicidad, p. ej., para minimizar la

X40 descritas en el presente documento están unidas a ores (FcyI/CD64, FcYlIa/CD32 o FcYlIIa/CD16) y, por lo de células T. En realizaciones particulares, las regiones n unidas a una región Fc que ocasiona el agotamiento. critas en el presente documento están unidas a una Fc tipo IgG1 o IgG3. En otras realizaciones, los anticuerpos jemplo, pueden ocasionar el agotamiento de células Treg to, mejorar la actividad antitumoral), pero no ocasionar cuentran en el microambiente tumoral y actúan como tivamente el agotamiento de células Treg y Tef que están los anticuerpos anti-OX40 son de un isotipo, (ya sea de ciones) que estimula el agotamiento de células Treg o la concomitante de células Tef. En otras realizaciones, los s Tef con respecto a Treg en el sitio del tumor, lo que es ente sin ocasionar significativamente el agotamiento de ria.

quean la actividad inmunosupresora de células Treg. En tor Fc con unión a FcR reducida o eliminada, p. ej., unión los anticuerpos anti-OX40 tienen una Fc que se une a proporcionar un agonismo mejorado. Véase, p. ej., el 33:1030; Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101; White

cumento pueden estar unidas a una región Fc de origen fector (p. ej., IgG2 o IgG4 humana) o, alternativamente, dores (F^cyI, FcYlIa o FcYlIIa), tal como para potenciar el

pueden unirse a una Fc que comprenda una o más ades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida c y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. puede modificarse químicamente (p. ej., pueden unirse rse para alterar su glucosilación, para alterar una o más nes se describe con más detalle a continuación. La de Kabat. Se proporcionan las variantes de secuencia de resto seguido por el aminoácido que está sustituido recedido por el resto de origen natural en esa posición. inoácidos, p. ej., si las secuencias difieren entre isotipos ples mutaciones, se separan mediante barras inclinadas

Fc para generar una variante Fc con (a) mayor o menor s (ADCC), (b) mayor o menor citotoxicidad mediada por o (d) mayor o menor afinidad por un receptor de Fc en e la región Fc comprenderán al menos una modificación combinación de modificaciones de aminoácidos es puede incluir dos, tres, cuatro, cinco, etc. sustituciones specíficas identificadas en el presente documento. En el a de Fc ilustrativas y también se proporcionan en los 77.375; 6.737.056; 6.194.551; 7.317.091; 8.101.720; en 7; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO WO 05/040217, WO 05/092925 y WO 06/020114.

Fc. En determinadas realizaciones, se pueden eliminar nte sitios distintos de los sitios de unión al receptor de n Fc para eliminar un sitio de ADCC. Los sitios de ADCC al. (1992) Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 con respecto a los sitios ADCC en IgG1. En una realización, la variant

unión a FcyR. Horton et al. (2011) J. Immunol. 186:

realizaciones, la Fc que tiene unión reducida a los FcyR

y G237A. Gross et al. (2001) Immunity 15:289.

La actividad de CDC también se puede reducir modific

D270, K322, P329 y P331, específicamente mutacio

significativamente la capacidad del correspondiente a

Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178; document

posición 331 de la IgG1 (por ejemplo, P331S) reduce la

y Canfield y Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483. En o

de aminoácidos 231 a 239 se alteran para reducir de es

Documento WO 94/29351.

En algunas realizaciones, la Fc con fijación reducida al

P331S. Gross et al. (2001) Immunity 15:289.

Para usos en los que la función efectora debe evitarse

suficiente para generar el beneficio terapéutico deseado,

efectos secundarios no deseados, pueden utilizarse ant

que carezcan de la región Fc o de una parte sustan

glucosilación por completo (p. ej., N297A). Como alternat

(dominio Ch1 y región bisagra) y de IgG4 humana (dom

que carece de la capacidad de unirse a los FcyR (tipo I

Rother et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:1256. Véase ta

(2008) Curr. Op. Immunol. 20:479 (análisis sobre modifi

En otras realizaciones, la región Fc se altera reempl

aminoácido diferente para reducir todas las funciones e

seleccionados de los restos de aminoácido 234, 235,

resto de aminoácido diferente de manera que el antic

conserve la capacidad de unión a antígeno del anticuer

puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc (restos 234,

(restos 297, 318, 320, 322). Patentes de Estados Unido

Una de las primeras solicitudes de patente proponía m

F^cyRI para disminuir la ADCC (234A; 235E; 236A; G23

para eliminar la CDC (E318A o V/K320A y K322A/Q).

(1988) Nature 332:563; Chappel et al. (1991) Proc. Nat'l

406:267 (análisis de los efectos de estas mutaciones so

Las modificaciones en Fc que reducen la función efector

las posiciones 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325 y 328

328R. Una variante de Fc puede comprender 236R/328

y del complemento incluyen las sustituciones 297A, 234

220S, 226^s , 229S, 238S, 233P y 234V. Estas y otras

Biotechnology 20:685-691. Las funciones efectoras (tan

reducir, mientras que se mantiene la unión de FcR neon

o más posiciones 233 - 236 y 327 - 331, tales como E2

P331S en IgG1; E233P, F234V, L235A, opcionalmente

al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613; Documento WO

incluyen L234A y L235A en IgG1 (Alegre et al. (1994) T

(1997) J. Immunol. 159:3613; véase también el docume

L235E en el caso de IgG4 (Reddy et al. (2000) J. Immu

la función efectora en una IgG1 humana incluye L234F,

Biol. Crystallogr. 64:700. Véase, en líneas generales

mutaciones encontradas que disminuyen la función ef

(abatacept) son C226S, C229S y P238S (numeración d

Otras variantes de Fc que tienen ADCC y/o CDC reducid

Rev. 26:287 (F234A y L235A que disminuyen la ADCC

Sci. (USA) 92:11980 (F234A, G237Ay E318A en una Ig

patente de Estados Unidos 2007/0148167 (H268Q, V3

Blood 109:1185 (C226S, C229S, E233P, L234V, L235

G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331S en una I 6R y L328R de la IgG1 humana elimina eficazmente la y Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926. En otras rendía las sustituciones de aminoácidos L234A, L235E

la región Fc. Las mutaciones en la posiciones de IgG1, e alanina D270A, K322A, P329A y P331A, reducen po para unirse a C1q y para activar el complemento.

99/51642. Se ha demostrado que la modificación de la al complemento. Tao et al. (1993) J. Exp. Med. 178:661 mplo, uno o más restos de aminoácido en las posiciones o la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento.

emento tiene las sustituciones de aminoácidos A330S y

mpleto, p. ej., cuando la unión al antígeno por sí sola es unción efectora solo conduce a (o aumenta el riesgo de) os IgG4, o pueden diseñarse anticuerpos o fragmentos e la misma, o se puede mutar la Fc para eliminar la ha generado una construcción híbrida de IgG2 humana h2 y Ch3 ) que está desprovista de la función efectora, que es incapaz de activar el complemento (tipo IgG4). Mueller et al. (1997) Mol. Immunol. 34:441; Labrijn et al. es de Fc para reducir la función efectora generalmente).

o al menos un resto de aminoácido por un resto de as del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos 37, 297, 318, 320 y 322 se pueden reemplazar por un tenga una menor afinidad por un ligando efector pero ginal. El ligando efector para el que se altera la afinidad 236, 237, 297) o el componente C1 del complemento .624.821 y 5.648.260, ambas de Winter et al.

ciones en la región Fc de IgG para disminuir la unión a bloquear la unión al componente del complemento C1q ento WO 88/007089. Véase también Duncan y Winter Sci. (USA) 88:9036; y Sondermann et al. (2000) Nature unión de F^cyRIII).

bién incluyen sustituciones, inserciones y deleciones en como 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L y s modificaciones para reducir las interacciones de FcyR 5A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331S, aciones se revisan en Strohl (2009) Current Opinion in ADCC como de activación del complemento) se pueden e mantiene la semivida), mutando restos de IgG en una 234V, L235A, opcionalmente G236A, A327G, A330S y A en IgG4; y A330S y P331S en IgG2. Véase Armour et 72. Otras mutaciones que reducen la función efectora lantation 57:1537); V234A y G237A en IgG2 (Cole et al. e patente de Estados Unidos N.° 5.834.597); y S228P y 64:1925). Otra combinación de mutaciones para reducir y P331S. Oganesyan et al. (2008) Acta Crystallogr. D. rijn et al., (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479. Otras en el contexto de una proteína de fusión Fc (IgG1) s de EU). Davis et al. (2007) J. Immunol. 34:2204.

esvelan en Glaesner et al. (2010) Diabetes Metab. Res. P en una IgG4); Hutchins et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. n et al. (2009) MAbs 1:572 y publicación de solicitud de 330S y P331S en una IgG2); McEarchern et al. (2007) una IgG1); Vafa et al. (2014) Methods 65:114 (V234V, En determinadas realizaciones, se elige una Fc que e

reducida a los F^cyR y fijación reducida al complement

comprende las siguientes mutaciones: L234A, L235E,

En la lista de secuencias se exponen cadenas pesadas i

en la tabla 23 (p. ej., SEQ ID NO: 11). Estas cinco sustit

la glucosilación.

Mejora de la función efectora

Como alternativa, la actividad de ADCC puede aumen

ADCC, puede elegirse IgG1 ^ IgG3 » IgG4 ^ IgG2 hu

o IgG4, para su uso en un fármaco en el que se desea

para aumentar la citotoxicidad celular dependiente de an

de Fcy modificando uno o más aminoácidos en las sigui

245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263,

286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 325,326,327,329,330,331,332,333,334,335,337,338,34

433, 434, 435, 436, 437, 438 o 439. Véase el docu

00/42072. Como sustituciones ilustrativas se incluyen

332E. Como variantes ilustrativas se incluyen 239D/3

267E/324T y 267E/268F/324T. Por ejemplo, se ha demo

la variante G236A, pueden combinarse opcionalmente

de afinidad de unión de FcyIIA/FcyIIB. Richards et al. (

2:181. Otras modificaciones para mejorar las interaccio

las sustituciones 298A, 333A, 334A, 326A, 2471, 339

3051 y 396L. Estas y otras modificaciones se revisan e

Específicamente, tanto la ADCC como la CDC pueden

p. ej., E333A. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6

la función efectora en una IgG1, se desvela en el docu

desvela en el documento WO2004/074455. Se ha de

función efectora en la IgG1 humana y que E333S lo hac

Específicamente, los sitios de unión sobre la IgG1 hum

se han descrito variantes con unión mejorada. Shields

que mutaciones específicas en las posiciones 256, 290

los mutantes de combinación T256A/S298A, S298A/E3

FcYRIIIa mejorada y actividad ADCC). Se han identifica

aumentada, incluyendo variantes con mutaciones S

aumento de afinidad por FcYRIIIa, una disminución en

cangrejeros. Lazar et al.(2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (U

Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278. La introduc

alemtuzumab (específico de CD52), trastuzumab (e

cetuximab (específico de EGFR), se tradujo en activid

mostró una capacidad mejorada para causar el agota

Acad Sci. (USA) 103:4005. Además, se han identificado

R292P, Y300L, V305I y P396L que presentaron una

concomitantemente en ratones transgénicos que expre

de células B y cáncer de mama. Stavenhagen et al.

n.° 8.652.466; Nordstrom et al. (2011) Breast Cancer R

Isotipos de IgG diferentes también presentan actividad

EMBO J. 7:1989. Para usos en los que se desea una

aumenten la unión a C1q. La capacidad de reclutar co

K326 y/o E333 en una IgG2, tal como K326W (que redu

el primer componente de la cascada del complemento.

de S267E / H268F / S324T (sola o en cualquier combin

(2010) mAbs 2:181. La región Fc del anticuerpo de isoti

Res. 68:3863 (figura 1 del mismo) también confiere un

Scand. J. Immunol. 70:553 y Redpath et al. (1998) Imm

Otras mutaciones adicionales que pueden aumentar o

(2006) J. Immunol. 177:1129. Véase también Carter

Immunol. 20:460.

También pueden utilizarse variantes de Fc que mejoren l

la actividad inductora de apoptosis o adyuvante. Li y lmente no tiene función efectora, es decir, tiene unión a Fc ilustrativa, p. ej., Fc de IgG1, que no es efectora , A330S y P331S. Gross et al. (2001) Immunity 15:289. ivas que comprenden estas mutaciones, como se detalla s se pueden combinar con N297A para eliminar también

modificando la región Fc. Con respecto a la actividad r tanto, un dominio constante de IgG1, en lugar de IgG2 DCC. Como alternativa, la región Fc se puede modificar po (ADCC) y/o para aumentar la afinidad por un receptor posiciones: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241,243, 244, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 373,376,378,382,388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, WO 2012/142515; véase también el documento WO 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D y 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, que las regiones Fc de IgG1 humana, que comprenden 32E y aumentan aproximadamente 15 veces la relación Mol. Cancer Therap. 7:2517; Moore et al. (2010) mAbs on FcyR y el complemento incluyen, pero sin limitación, Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, hl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691. rse realizando cambios en la posición E333 de la IgG1, l uso de las mutaciones P247I y A339D/Q para mejorar WO2006/020114, y el de D280H, K290S ± S298D/V se do que las variantes K326A/W y E333A/S aumentan la la IgG2. Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571.

ra el F^cyR1, F^cyRII, F^cyRIII y FcRn se han mapeado, y 2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604. Se ha demostrado 333, 334 y 339 mejoran la unión a FcyRIII, incluyendo 298A/K224^a y S298^a /E333A/K334A (que tiene unión a ras variantes de IgG1 con unión a FcYRIIIa fuertemente 332E y S239D/I332E/A330L que muestran el mayor ión a FcYRIIb, y fuerte actividad citotóxica en macacos 3:4005; Awan et al. (2010) Blood 115:1204; Desjarlais y e las mutaciones triples en anticuerpos tales como ico de HER2/neu), ituximab (específico de CD20) y CC muy mejorada in vitro, y la variante S239D/I332E de células B en monos. Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l ntes de IgG1 que contienen mutaciones L235V, F243L, mejorada a FcYRIIIa y una actividad ADCC mejorada FcYRIIIa humano en modelos de neoplasias malignas 7) Cancer Res. 67:8882; patente de Estados Unidos :R123.

iferencial (IgG3>IgG1>>IgG2“ IgG4). Dangl et al. (1988) or CDC, también es posible introducir mutaciones que nto (CDC) puede aumentarse mediante mutaciones en ctividad a Dc C) y E333S, para aumentar la unión a C1q, gie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571. La introducción en la IgG1 humana mejora la unión a C1q. Moore et al. rido IgG1/IgG3 "113F" de Natsume et al. (2008) Cancer ra de la CDC. Véase también Michaelsen et al. (2009) y 93:595.

uir la función efectora se desvelan en Dall'Acqua et al. ) Nat. Rev. Immunol. 6:343; Presta (2008) Curr. Op.

idad por el receptor inhibidor FcYRIIb, p. ej., para mejorar h (2011) Science 333:1030; Li y Ravetch (2012) Proc.

Nat'lAcad. Sci (USA) 109:10966; publicación de solic

variantes pueden proporcionar un anticuerpo con

FcYR11b+, incluyendo, por ejemplo, células B y mono

afinidad aumentada selectivamente a FcYRIIb con resp

para alterar la unión a FcYR11b incluyen una o más

consiste en 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 3

sustituciones ilustrativas para mejorar la afinidad por

234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 23

328F, 328W, 328Y y 332E. Como sustituciones ilustrati

328F, 328W y 328Y. Otras variantes de Fc para pot

239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E y 267E

L328F y I332E, incluyendo la variante doble S267E

específicamente la afinidad por el receptor FcYR11b in

de solicitud de patente de Estados Unidos 2006/0242

P238D, puede obtenerse una especificidad mejorada p

Protein. Eng. Des. & Selection 26:589; documento w O

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se modific

estrategias. Por ejemplo, esto puede realizarse aument

realización, en la región CH1 o CL se altera el anticuerpo

tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región

Unidos n.° 5.869.046 y 6.121.022 de Presta et al. Otras

mejoran las propiedades farmacocinéticas incluyen las s

ejemplo, 2591, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434P, 4

FcRn incluyen: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (H

al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272

et al. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):659

434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H (Dall

Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemist

n.° 8.367.805.

La modificación de determinados restos conservados

variante N434A (Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:76

de FcRn, aumentando así la semivida del anticuerpo en

que la variante de Fc de combinación que comprende

la semivida en suero. Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotech

las modificaciones T307A, E380A y N434A también pr

(2006) Int. Immunol. 18:1759. Además, también se h

comprenden las variantes M252Y/M428L, M428

M428L/N434M y M428L/N434S prolongan la semivida.

Adicionalmente, una variante de Fc de combinación q

casi 4 veces. Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 28

que proporciona afinidad de FcRn aumentada pero dep

N434F) para crear una construcción de IgG1 ("MST-H

unión de otros anticuerpos a FcRn, dando como resulta

endógena (p. ej., en un contexto autoinmunitario) u

Biotechnol. 23:1283; Documento WO 2006/130834.

Se describen otras modificaciones para aumentar la uni

6.277.375; 6821505; documento WO 97/34631; docum

En determinadas realizaciones, pueden utilizarse iso

posiblemente aumentar la semivida. Por ejemplo, se pu

posiciones de IgG1 en la región CH2 y/o CH3 por amin

Por tanto, se puede construir un anticuerpo de IgG var

274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 39

presente documento, se puede construir una variante

región CH2 y/o CH3 por aminoácidos de IgG1 en pos

construir un anticuerpo de IgG variante híbrido que co

siguientes sustituciones de aminoácidos: 233E, 234L, 2

en la posición 236) y 327A. Véase la patente de Esta

secuencias IgG1/IgG2/IgG4 que supuestamente aumen

patente de Estados Unidos n.° 7.867.491 (número de s

La semivida en suero de los anticuerpos de la presente i e patente de Estados Unidos 2014/0010812. Dichas ades inmunomoduladoras relacionadas con células En una realización, las variantes de Fc proporcionan uno o más receptores activadores. Las modificaciones caciones en una posición seleccionada del grupo que 6, 327, 328 y 332, de acuerdo con el índice EU. Como 1b se incluyen, pero sin limitación 234D, 234E, 234F, 9D, 239E. 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, incluyen 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, la unión a FcYRllb incluyen 235Y/267E, 236D/267E, . Específicamente, las variantes S267E, G236D, S239D, , de la IgG1 humana son de particular valor mejorando r. Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926; publicación ocumento WO 2012/087928. Añadiendo la sustitución YRIIb (a diferencia de FcYRIIaR131). Mimoto et al. (2013) 15241.

aumentar su semivida biológica. Son posibles diversas a afinidad de unión de la región de Fc por FcRn. En una que contenga un receptor de rescate de unión al epítopo una IgG, como se describe en las patentes de Estados tes de Fc ilustrativas que aumentan la unión a FcRn y/o ciones en las posiciones 259, 308 y 434, incluyendo, por 434M. Otras variantes que aumentan la unión de Fc con et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et A, 307A, 311A, 312A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields ), 252F, 252Y, 252W, 254T, 256Q, 256E, 256D, 433R, et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, :23514-23524). Véase la patente de Estados Unidos

Fc de IgG (I253/H310/Q311/H433/N434), tal como la ha propuesto como un modo para aumentar la afinidad ulación. Documento WO 98/023289. Se ha demostrado y N434S aumenta hasta cinco veces la unión a FcRn y :157. La variante de Fc de combinación que comprende la semivida de los anticuerpos de IgG1. Petkova et al. ostrado que las variantes de Fc de combinación que 4H, M428L/N434F, M428L/N434Y, M428L/N434A, ento WO 2009/086320.

prende M252Y, S254T y T256E, aumenta la semivida 14. Se ha usado una modificación de IgG1 relacionada cia de pH reducida (M252Y / S254T / T256E / H433K / eg") para su uso como un competidor para impedir la mayor aclaramiento de ese otro anticuerpo, ya sea IgG Ab exógeno (terapéutico). Vaccaro et al. (2005) Nat.

cRn en Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671; O2002/060919.

de IgG híbridos para aumentar la unión de FcRn, y onstruir una variante híbrida de IgG1/IgG3 sustituyendo s de IgG3 en posiciones donde difieran los dos isotipos. híbrido que comprenda una o más sustituciones, p. ej., 21, 435R y 436F. En otras realizaciones descritas en el de IgG1/IgG2 sustituyendo posiciones de IgG2 en la s donde difieran los dos isotipos. Por tanto, se puede da una o más sustituciones, p. ej., una o más de las 36G (que hace referencia a una inserción de una glicina nidos n.° 8.629.113. Se ha generado un híbrido de las emivida en suero y mejora la expresión. Documento de ia 18 en el mismo).

ión también puede aumentarse mediante pegilación. Un anticuerpo puede pegilarse para, por ejemplo, aumentar

pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mi

polietilenglicol (PEG), tal como un éster o derivado alde

grupos de PEG comienzan a unirse al anticuerpo o al frag

a cabo mediante una reacción de acilación o una reacc

polímero reactivo análogo soluble en agua). Como se

pretende incluir cualquiera de las formas de PEG que se

alcoxi (C1-C10) alcoxi o ariloxi-polietilenglicol o poli

anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo agluco

proteínas y se pueden aplicar a los anticuerpos descritos

EP 0154316 de Nishimura et al., y el documento EP 040

Como alternativa, en algunas circunstancias puede ser

aumentarla. Modificaciones tales como I253A (Hornick e

(Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819) en la F

disminuyendo así la semivida (aumentando el aclaramien

imágenes médicas, en las que se prefiere un aclaramient

65:622. Otros medios para mejorar el aclaramiento incluy

invención como fragmentos de anticuerpo que carecen d

Dicha modificación puede reducir la semivida en circula

horas. A continuación, si fuera necesario, puede utilizar

para ajustar (aumentar) la semivida de los fragmentos d

Los fragmentos de anticuerpo también pueden fusionars

proteína de fusión, para aumentar la semivida. Yeh et al.

puede construir un anticuerpo biespecífico con un prime

segundo dominio de unión a antígeno que se une a la se

de patente internacional WO 2009/127691 y referencias

añadirse secuencias polipeptídicas especializadas a los

secuencias polipeptídicas "XTEN". Schellenberger et al.

patente internacional WO2010/091122.

Variantes de Fc adicionales

Cuando se usa un dominio constante de IgG4, es prefe

bisagra en IgG1 y de ese modo estabiliza las moléculas

anticuerpo terapéutico y la IgG4 endógena en el paciente

et al. (2000) J. Immunol. 164:1925.

A través de las modificaciones D221G y K222S, puede eli

de las construcciones de IgG1, aumentando la estabilida

Las afinidades y las propiedades de unión de una vari

determinar mediante una diversidad de métodos de ens

conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, m

a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA)), o farm

métodos tales como ensayos de unión indirecta, ensa

resonancia de fluorescencia (FRET), electroforesis y cr

métodos pueden utilizar un marcador o uno o más de

métodos de detección incluyendo, pero sin limitación,

isotópicos. Puede encontrarse una descripción detallada

ed., Fundamental Immunology, 4a Ed., Lippincott-Rave

anticuerpo-inmunógeno.

En otras realizaciones adicionales, la glucosilación de un

efectora. Por ejemplo, se puede producir un anticuerp

mutando el resto de asparagina conservado en la pos

complemento y de F^cyRI. Bolt et al. (1993) Eur. J. Immun

143:2595 (que utilizan N297Q en IgG1 para eliminar la gl

Aunque los anticuerpos aglucosilados generalmente car

para restaurar esa función. Adicionalmente, para re

aglucosilados, p. ej., los resultantes de mutaciones N29

glucosilan proteínas, p. ej., S298G y/o T299A/G/ o H (W

Nat'l Acad. Sci (USA) 107:604).

Además, alterando la glucosilación, puede producirse emivida biológica (p. ej., en suero) del anticuerpo. Para , normalmente se hacer reaccionar con un reactivo de reactivo de PEG, en condiciones en las que uno o más to de anticuerpo. Preferentemente, la pegilación se lleva e alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un en el presente documento, el término "polietilenglicol" usado para derivatizar otras proteínas, tales como mono glicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el o. En la técnica se conocen métodos de pegilación de presente documento. Véase, por ejemplo, el documento de Ishikawa et al.

ble disminuir la semivida de un anticuerpo, en lugar de 2000) J. Nucl. Med. 41:355) y H435A/R I253A o H310A la IgG1 humana pueden disminuir la unión a FcRn, ara su uso en situaciones tales como en la obtención de ido. Véase también Kenanova et al. (2005) Cancer Res. formateo de dominios de unión a antígeno de la presente apacidad de unirse a FcRn, tales como fragmentos Fab. de un anticuerpo de un par de semanas a cuestión de PEGilación selectiva de los fragmentos de anticuerpo icuerpo. Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780. la seroalbúmina humana, p. ej., en una construcción de 92) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904. Como alternativa, se inio de unión a antígeno de la presente invención y un úmina humana (HSA). Véase la publicación de solicitud atentes citadas en el mismo. Como alternativa, pueden entos de anticuerpo para aumentar la semivida, p. ej., 9) Nat. Biotechnol. 27:1186; publicación de solicitud de

incluir la sustitución S228P, la cual imita la secuencia G4, p. ej., reduciendo el intercambio Fab-brazo entre el tar. Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy

rse un posible sitio de escisión de proteasa en la bisagra anticuerpo. Documento WO 2014/043344.

de Fc para su ligando (receptores de Fc) se pueden n vitro (ensayos basados en bioquímica o inmunología) os de equilibrio (p. ej., ensayo inmunoabsorbente ligado inética (p. ej., análisis de RPS de BIACORE®), y otros e inhibición competitiva, transferencia de energía por tografía en gel (p. ej., filtración en gel). Estos y otros omponentes a examinar y/o emplear una variedad de cadores cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes o s afinidades de unión y farmacocinética en Paul, W. E., ladelfia (1999), que se centra en las interacciones de

cuerpo se modifica para aumentar o disminuir la función lucosilado que carezca de cualquier función efectora 297 (p. ej., N297A), anulando por tanto la unión del :403. Véase también Tao & Morrison (1989) J. Immunol. ilación en la posición 297).

de función efectora, se pueden introducir mutaciones ar la unión de FcyR, pueden mutarse anticuerpos /D/ o H o producidos en sistemas (p. ej., E. coli) que no 09/079242), o E382V y M428I (Jung et al. (2010) Proc.

anticuerpo con ADCC mejorada. Por ejemplo, se ha demostrado que la eliminación de la fucosa de los oligo

ADCC, basándose en la unión mejorada a FcYRIIIa. Shiel

Methods 306: 151; Cardarelli et al. (2009) Clin. Cance

Immunol. Immunotherap. 59:257 (MDX-1342). Dichos a

p. ej., en células de ovario de hámster chino (CHO) c

Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614), o en

Véase, p. ej., Zhang et al. (2011) mAbs 3:289 y Li et

producción de anticuerpos en Pichia pastoris gluco-gen

et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733; Shinkawa et al.

La ADCC también puede mejorarse como se describe en

de una línea celular CHO variante, Lec13, con capacid

Asn(297), lo que también da como resultado la hipofucosi

(véase también Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem.

de anticuerpos pueden añadirse análogos de fucosa al

hidrato de carbono sobre el anticuerpo (véase, p. ej., el

El aumento de estructuras GlcNac bisectantes en oligos

publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. se des glucosiltransferasas modificadoras de glucoproteínas (p.

manera que dichos anticuerpos expresados en las línea

de estructuras GlcNac bisectadas que dan como resultad

también Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180).

Se han desarrollado variantes de glucosilación adicional

y xilosa (denominadas glucoformas GNGN ), que prese

CDC, así como otras que carecen de ácido siálico, fucos

un aumento de ADCC, ADCP y CDC. Publicación de so

anticuerpos que tienen estos patrones de glucosilación

genéticamente modificadas en las que se han inactivado

La gluco-genomodificación también puede utilizarse

construcción de IgG cambiando el contenido de a2,6 sial

las regiones Fc, en donde una mayor proporción de form

antiinflamatorios. Véase Nimmerjahn et al. (2008) An

producción de anticuerpos que tienen hidratos de carbo

deseen propiedades antiinflamatorias. En la publicación

se proporcionan métodos de modificación del contenido

purificación selectiva de formas a2,6 sialidadas o m

secuencia de aminoácidos de la región Fc se puede

ejemplo, mediante la inclusión de una modificación F241

VIII. Propiedades físicas de los anticuerpos

Los anticuerpos descritos en el presente documento pu

variable de cadena ligera o pesada. Dichos sitios de

inmunogenicidad del anticuerpo o una alteración del pK

(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702;

(1988) J ExpMed 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiolo

et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Se sabe que

secuencia N-X-S/T. En algunas realizaciones, el anticuer

Esto se puede conseguir o bien seleccionando anticuer

variable o mutando los restos en la región de glucosilaci

En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos

de asparagina. La desamidación de la asparagina pue

resultado la creación de un resto de ácido isoaspártico

puede disminuir su estabilidad (efecto de ácido isoaspá

está presente en las secuencias de CDR de la cadena p

una secuencia de aminoácidos que no experimente iso

El anticuerpo comprende la secuencia de CDR2 de la r

NO: 88, pero en donde la Gly en la secuencia Asp-Gly (

por una secuencia de aminoácidos que no experimenta i

Cada anticuerpo tendrá un punto isoeléctrico (pI) único,

y 9,5. El pI de un anticuerpo IgG1 normalmente se encu ridos unidos a Asn297 en la cadena pesada, mejora la t al. (2002) JBC 277:26733; Niwa et al. (2005) J. Immunol. s. 15:3376 (MDX-1401); Cardarelli et al. (2010) Cancer erpos con bajo contenido en fucosa pueden producirse, gen de fucosiltransferasa (FUT8) inactivado (Yamanes células que generen estos anticuerpos afucosilados.

006) Nat. Biotechnol. 24:210 (en ambos se describe la ificada); Mossner et al. (2010) Blood 115:4393; Shields 3) J. Biol. Chem. 278:3466; documento EP 1176195B1. ublicación PCT WO 03/035835, donde se desvela el uso ducida para unir fucosa a hidratos de carbono unidos a n de anticuerpos expresados en esa célula hospedadora :26733-26740). Como alternativa, durante la producción o de cultivo para inhibir la incorporación de fucosa en el mento WO 2009/135181).

idos unidos a anticuerpo también mejora la ADCC. En la n líneas celulares genomodificadas para que expresen beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de lulares genomodificadas presentan mayores cantidades aumento de la actividad ADCC de los anticuerpos (véase

ue carecen de restos de galactosa, ácido siálico, fucosa un aumento de ADCC y ADCP pero una disminución de ilosa (denominadas glucoformas G1/G2 ), que presentan d de patente de Estados Unidos n.° 2013/0149300. Los ionalmente se producen en plantas de N. benthamiana genes de xiloxil y fucosil tranfesasa endógenos.

modificar las propiedades antiinflamatorias de una e las cadenas de hidrato de carbono unidas a Asn297 de 2,6 sialidadas da como resultado un aumento de efectos ev. Immunol. 26:513. En cambio, la reducción de la 2,6 sialidados puede ser útil en los casos en que no se olicitud de patente de Estados Unidos n.° 2008/0206246 2,6 sialilación de los anticuerpos, por ejemplo, mediante te modificación enzimática. En otras realizaciones, la icar para que imite el efecto de la a2,6 sialilación, por éase, p. ej., el documento WO 2013/095966).

contener uno o más sitios de glucosilación en la región silación pueden dar como resultado un aumento de la anticuerpo debido a una unión alterada con el antígeno y Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick et al :43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura lucosilación se produce en motivos que contienen una nti-OX40 no contiene glucosilación en la región variable. que no contienen el motivo de glucosilación en la región

l presente documento no contienen sitios de isomerismo roducirse en secuencias N-G o D-G y puede dar como puede introducir un pliegue en la cadena polipeptídica y ). Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos Asp-Gly a y/o ligera del anticuerpo, la secuencia se sustituye por ación.

n variable de la cadena pesada expuesta en el SEQ ID DGSNKYYPDSVKG; SEQ ID NO: 88) está reemplazada erización, es decir, Asp-Ala.

generalmente se encuentra en el intervalo de pH entre 6 a en el intervalo de pH de 7-9,5 y el pI de un anticuerpo IgG4 generalmente se encuentra en el intervalo de p

intervalo normal pueden tener algún desdoblamiento e in

un anticuerpo anti-OX40 que contenga un valor de pI que

o bien seleccionando anticuerpos con un pI en el interva

Cada anticuerpo tendrá una temperatura de fusión cara

mayor estabilidad global in vivo (Krishnamurthy R y

Generalmente, se prefiere que la T^m1 (la temperatura de

superior a 65 °C, incluso más preferentemente mayor q

utilizando calorimetría de barrido diferencial (Chen et al (

Lett 68:47-52) o dicroismo circular (Murray et al. (2002)

seleccionan anticuerpos que no se degraden rápidament

electroforesis capilar (EC) y MALDI-MS (mass

espectrometría de masas con desorción/ionización láser

Chem 67:3626-32). En determinadas realizaciones, los

(p. ej., el anticuerpo OX40.21) tienen mayor estabilidad.

Por consiguiente, en otras realizaciones, se seleccionan

pueden desencadenar una respuesta inmunitaria no

desfavorables. Generalmente, son aceptables los an

preferentemente del 20 % o menor, incluso más prefere

10 % o menor e incluso más preferentemente del 5 % o

incluyendo columna de exclusión por tamaño (SEC), cro

de luz.

IX. Métodos de genomodificación de anticuerpos

Como se indica en el presente documento, los anticuerp

anti-OX40 modificando la(s) región(es) constante(s)

características estructurales de los anticuerpos anti-OX

anticuerpos anti-OX40 estructuralmente relacionados

anticuerpos descritos en el presente documento, tal com

En la técnica se han descrito métodos mutacionales. Por

de Short se describen métodos para la creación y explor

saturación, ensamblaje de ligamiento sintético, o una co

de publicación PCT WO 03/074679 de Lazar et al.,

informatizados para optimizar las propiedades fisicoquí

X. Moléculas de ácido nucleico

En el presente documento también se proporcionan

descritos en el presente documento. Los ácidos nucleic

celular o en una forma parcialmente purificada o sust

sustancialmente puro" cuando se purifica de otros compo

nucleicos celulares (p. ej., otro ADN cromosómico, p.

naturaleza) o proteínas, mediante técnicas convencion

cromatografía en columna, enzimas de restricción, ele

técnica. Véase, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current

Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico puede ser,

intrónicas. En determinadas realizaciones, el ácido nucl

Los ácidos nucleicos proporcionados en el presente d

molecular convencionales. En el caso de anticuerpos exp

de ratones transgénicos que llevan genes de inmuno

adelante), se pueden obtener ADNc que codifican las

hibridoma mediante amplificación estándar por PCR o

obtenidos de una genoteca de inmunoglobulina (p. ej

recuperar de la genoteca el ácido nucleico que codifica e

de ADN ilustrativa que codifica la secuencia VH de los

una secuencia de ADN ilustrativa que codifica la secuen

Los métodos para preparar los anticuerpos anti-OX40

expresar las cadenas pesada y ligera en una línea celular

las cadenas pesada y ligera con un péptido señal. E

hospedadoras que comprenden estas secuencias de nu . Se especula que los anticuerpos con un pI fuera del bilidad en condiciones in vivo. Por tanto, se prefiere tener ncuentre en el intervalo normal. Esto se puede conseguir rmal o mutando restos de superficie cargados.

ística, indicando una elevada temperatura de fusión una nning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). legamiento inicial) sea mayor que 60 °C, preferentemente 0 °C. El punto de fusión de un anticuerpo puede medirse ) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol romatogr Sci 40:343-9). En una realización preferida, se a degradación de un anticuerpo puede medirse utilizando trometry, matrix-assisted laser desorption/ionization, tida por matriz) (Alexander A J y Hughes D E (1995) Anal uerpos anti-OX40 desvelados en el presente documento

icuerpos que tienen efectos de agregación mínimos, que seada y/o propiedades farmacocinéticas alteradas o rpos que tienen una agregación del 25 % o menor, ente del 15 % o menor, incluso más preferentemente del r. La agregación puede medirse mediante varias técnicas, grafía de líquidos de alta resolución (HPLC) y dispersión

ti-OX40 pueden utilizarse para crear nuevos anticuerpos los anticuerpos. Por tanto, en otra realización, las escritos en el presente documento se utilizan para crear conservan al menos una propiedad funcional de los ión a OX40 humana y OX40 de macaco cangrejero.

plo, en el documento de publicación PCT WO 02/092780 de mutaciones de anticuerpo utilizando mutagénesis de ación de los mismos. Como alternativa, en el documento escriben métodos de uso de métodos de exploración de los anticuerpos.

culas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos ueden estar presentes en células enteras, en un lisado lmente pura. Un ácido nucleico se "aísla" o "se vuelve es celulares o de otros contaminantes, p. ej., otros ácidos el ADN cromosómico que se une al ADN aislado en la incluyendo tratamiento alcalino/SDS, bandeo de CsCl, oresis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la tocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley ejemplo, ADN o ARN y puede contener o no secuencias es una molécula de ADNc.

ento pueden obtenerse utilizando técnicas de biología dos por hibridomas (p. ej., hibridomas preparados a partir lina humana, como se describe con más detalle más enas ligera y pesada del anticuerpo producidos por el icas de clonación de ADNc. En el caso de anticuerpos ilizando técnicas de presentación en fagos), se puede icuerpo. En el SEQ ID NO: 176 se expone una secuencia uerpos reivindicados. En el SEQ ID NO: 168 se expone e la cadena ligera de los anticuerpos reivindicados.

porcionados en el presente documento pueden incluir comprenda las secuencias de nucleótidos que codifiquen presente documento también se proporcionan células idos.

Una vez que se han obtenido los fragmentos de ADN qu

se pueden manipular además mediante técnicas de AD

los genes de la región variable en genes de la cadena d

Fab o en un gen scFv. En estas manipulaciones, un frag

a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, ta

flexible. La expresión "se une operativamente", como

fragmentos de ADN de manera que las secuencias de

lectura.

El ADN aislado que codifica la región VH se puede co

uniendo operativamente el ADN codificante de VH con o

la cadena pesada (bisagra, CH1, CH2 y/o CH3). En la t

constante de la cadena pesada (véase, p. ej., Kabat,

Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and H

de ADN que abarcan estas regiones pueden obteners

constante de la cadena pesada puede ser una región c

ejemplo, una región de IgG1. Para un gen de la cadena

unirse operativamente a otra molécula de ADN que co

pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL se puede con

como en un gen de cadena ligera de Fab) uniendo oper

que codifica la región constante de cadena ligera, Cl .

región constante de la cadena ligera (véase, p. ej., Kaba

Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and H

de ADN que abarcan estas regiones pueden obteners

constante de cadena ligera puede ser una región consta

Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN codific

que codifica un enlazador flexible, p. ej., que codifica la

secuencias VH y VL puedan expresarse como una prote

por el enlazador flexible (véase, p. ej., Bird et al., (1988)

Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature

En el presente documento también se proporcionan

secuencias de VH y VL que son homólogas a las de los

1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 2oB3, 14A2- 1, 14A2-2 y 20C

secuencias VH y VL que son al menos 70 %, por ejempl

90 %, al menos 95 % o al menos 99 % de idénticas, a m

VL de los anticuerpos monoclonales 3F4, 14B6-1, 14B6-20C1. En el presente documento también se prop

conservativas (es decir, sustituciones que no alteran la s

de la molécula de ácido nucleico), p. ej., para la optimiza

XI. Generación de anticuerpos

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente docu

conocidas, tales como la técnica de hibridación de célula

256: 495 (1975). Aunque se prefieren procedimientos

pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpo

linfocitos B, técnica de presentación en fagos utilizando

El sistema animal preferido para preparar hibridomas e

es un procedimiento muy bien establecido. En la técnic

aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión. T

mieloma murino) y procedimientos de fusión.

Los anticuerpos quiméricos o humanizados descritos en

secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparad

inmunoglobulinas de la cadena pesada y la cadena ligera

genomodificar para que contenga secuencias de inmun

biología molecular convencionales. Por ejemplo, para c

pueden unirse a regiones constantes humanas utilizando

Estados Unidos n.° 4.816.567 de Cabilly et al.). Para

pueden insertar en una región marco humana utilizando ifican los segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN combinante convencionales, por ejemplo, para convertir ticuerpo de longitud completa, en genes de fragmentos o de ADN codificante de VL o VH se une operativamente o una región constante de anticuerpo o un enlazador sa en este contexto, se refiere a la unión de los dos oácidos que codifican permanecen dentro del marco de

ir en un gen de la cadena pesada de longitud completa olécula de ADN que codifica las regiones constantes de a se conocen las secuencias de los genes de la región , et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Services, publicación NIH n.° 91-3242) y los fragmentos diante amplificación por PCR convencional. La región nte de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, por ada de fragmento Fab, el ADN codificante de VH puede e solamente la región constante de CH1 de la cadena

r en un gen de cadena ligera de longitud completa (así ente el ADN que codifica la VL a otra molécula de ADN técnica se conocen las secuencias de los genes de la A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Services, publicación NIH n.° 91-3242) y los fragmentos diante amplificación por PCR convencional. La región appa o lambda.

de VH y VL se unen operativamente a otro fragmento encia de aminoácidos (Gly4 - Ser)3, de manera que las onocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas nce 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. :552-554).

ulas de ácido nucleico no reivindicadas que codifican uerpos monoclonales 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-s moléculas de ácidos nucleicos ilustrativas codifican menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos las de ácido nucleico que codifican las secuencias VH y H3, 6E1-1,6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2 y nan moléculas de ácido nucleico con sustituciones ncia de aminoácidos resultante después de la traducción de codones.

o se pueden producir utilizando una variedad de técnicas ática convencional descrita por Kohler y Milstein, Nature ibridación de célula somática, en principio, también se noclonales, p. ej., transformación vírica u oncogénica de tecas de anticuerpos humanos.

istema murino. La producción de hibridomas en el ratón conocen protocolos de inmunización y técnicas para el én se conocen compañeros de fusión (p. ej., células de

resente documento pueden prepararse basándose en la mo se ha descrito anteriormente. El ADN que codifica las uede obtener del hibridoma murino de interés y se puede ulina no murina (p. ej., humana) utilizando técnicas de un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas odos conocidos en la técnica (véase, p. ej., la patente de un anticuerpo humano, las regiones CDR murinas se dos conocidos en la técnica (véase, p. ej., la patente de Estados Unidos n.° 5.225.539 de Winter, y las patente

6.180.370 de Queen et al.).

En una realización, los anticuerpos descritos en el pr

Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos co

o transcromosómicos que llevan partes del sistema inm

documento, estos ratones transgénicos y transcromos

ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y en

"ratones de Ig humana".

El HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contiene miniloci

inmunoglobulina de cadena pesada (m y y) y ligera k d

loci de la cadena p y k endógena (véase, p. ej., Lonber

los ratones presentan expresión reducida de IgM o k de

cadena pesada y la cadena ligera humanos introducidos

generar el monoclonal humano de IgGK de alta afinidad

Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmac

Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995)

ratones HuMab, y las modificaciones genómicas que ll

(1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J.

al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724;

(1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. I

Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. et al. (1996) Nat

de Estados Unidos n.° 5.545.806; 5.569.825; 5625126;

5.770.429; todas de Lonberg y Kay; la patente de Est

PCT n.° WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, W

y Kay; y la publicación PCT n.° WO 01/14424 de Korma

En determinadas realizaciones, los anticuerpos descrito

lleva secuencias de inmunoglobulina humana en tran

transgén de la cadena pesada humana y un trans

denominados en el presente documento "ratones KM", s

Ishida et al.

Aún más, en la técnica se dispone de sistemas a

inmunoglobulina humana y que pueden utilizarse para

documento. Por ejemplo, puede utilizarse un sistema tr

dichos ratones se describen, por ejemplo, en las pat

6.150.584 y 6.162.963 de Kucherlapati et al.

Por otra parte, en la técnica se dispone de sistemas ani

inmunoglobulina humana y pueden utilizarse para c

documento. Por ejemplo, pueden utilizarse ratones que l

como un transcromosoma de la cadena ligera humana,

Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:

llevan transcromosomas de la cadena pesada y la cade

20:889-894) y pueden utilizarse para cultivar los anticue

Los sistemas de ratón adicionales descritos en la técni

OX40 humanos, incluyen (i) el ratón VelocImmune®

variables endógenas de la cadena pesada y la cadena

homóloga, por regiones variables humanas de la cad

regiones endógenas constantes de ratón, de manera q

en los ratones, y a continuación se convierten posterior

técnicas de ADN recombinantes convencionales; y (iii) e

ratón contiene regiones variables desorganizadas de la

la cadena ligera común humana reorganizada. Dichos

por ejemplo, en los documentos WO 2009/15777, U

2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US

Los anticuerpos monoclonales humanos descritos en e

métodos de presentación en fagos para la exploración d

presentación en fagos para aislar los anticuerpos huma

patentes de Estados Unidos n.° 5.223.409; 5403484; y

n.°°5.427.908 y 5.580.717 de Dower et al.; las patentes

et al.; y las patentes de Estados Unidos n.° 5.885.793 Estados Unidos n.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y

documento son anticuerpos monoclonales humanos. X40 se pueden generar utilizando ratones transgénicos io humano en lugar del sistema de ratón. En el presente s incluyen ratones a los que se hace referencia como nto, en el presente documento reciben el nombre de

inmunoglobulina humana que codifica secuencias de nizadas, junto con mutaciones dirigidas que activan los l. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Por consiguiente, , y en respuesta a la inmunización, los transgenes de la meten a intercambio de clase y mutación somática para berg, N. et al. (1994), citado anteriormente; revisado en 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. .Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y el uso de dichos ratones, se describe además en Taylor, L. et al.

(1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et t al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. ol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International otechnology 14: 845-851. Véanse además, las patentes 25; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; y nidos n.° 5.545.807 de Surani et al.; las publicaciones 13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg l.

l presente documento se cultivan utilizando un ratón que y transcromosomas, tal como un ratón que lleva un soma de la cadena ligera humana. Dichos ratones, criben en detalle en la publicación PCT WO02/43478 de

s transgénicos alternativos que expresan genes de var los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente nico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix Inc.); de Estados Unidos n.° 5.939.598; 6075181; 6114598;

transcromosómicos alternativos que expresan genes de los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente tanto un transcromosoma de la cadena pesada humana minados "ratones TC"; dichos ratones se describen en 7. Asimismo, en la técnica se han descrito vacas que era humana (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology anti-OX40 descritos en el presente documento.

a cultivar anticuerpos humanos, p. ej., anticuerpos antineron Pharmaceuticals, Inc.), en el que las regiones a de ratón se han reemplazo, mediante recombinación esada y la cadena ligera, uniendo operativamente las ratones quiméricos (V humano/ C de ratón) se cultivan en anticuerpos completamente humanos utilizando las n MeMo® (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), en el que el a pesada y la cadena ligera pero una región variable de s, y su uso para cultivar los anticuerpos, se describen, 0/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 0070861 y US 2012/0073004.

ente documento también pueden prepararse utilizando otecas de inmunoglobulina humana. Dichos métodos de tán establecidos en la técnica. Véanse, por ejemplo: las .698 de Ladner et al.; las patentes de Estados Unidos stados Unidos n.° 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty 21.404; 6544731; 6555313; 6.582.915 y 6.593.081 deGriffiths et al.

Los anticuerpos monoclonales humanos descritos en

ratones SCID en los que las células inmunitarias human

respuesta de anticuerpo humano tras la inmunización.

Estados Unidos n.° 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson et

Inmunizaciones

Para generar anticuerpos OX40 completamente

transcromosómicos que contienen genes de inmunoglo

preparación purificada o enriquecida del antígeno OX4

como se describe para otros antígenos, por ejemplo, po

al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y en el do

inmunizarse con ADN que codifica OX40 humano o un f

6-16 semanas de vida después de la primera infusión

enriquecida (5-50 |jg) del antígeno OX40 recombinante

el caso de que las inmunizaciones que utilizan una pr

como resultado anticuerpos, los ratones también se p

línea celular, para promover respuestas inmunitarias. L

Raji estables que sobreexpresan OX40.

Las experiencia acumulada con diversos antígenos ha

mejor cuando se inmunizan inicialmente por vía intraper

Ribi, seguido de inmunizaciones IP/SC cada dos sema

Se puede monitorizar la respuesta inmunitaria durante

obtienen por sangrados retroorbitales. El plasma se pu

más adelante), y pueden utilizarse para las fusiones rat

OX40. Los ratones se pueden reforzar por vía intraven

bazo y los ganglios linfáticos. Se espera que pueda

Normalmente, para cada antígeno se inmunizan entre

HCo12 y KM. Además, tanto el transgén HCo7 como H

transgenes humanos diferentes de cadena pesada (HC

Generación de hibridomas que producen anticuerpos m

Para generar hibridomas que produzcan los anticuer

esplenocitos y/o células del ganglio linfático de raton

apropiada, tal como una línea celular de mieloma de

función de la producción de anticuerpos específicos a

células sueltas de linfocitos esplénicos de ratones inm

Sp2/0 (ATCC, CRL 1581) con PEG al 50 %. Las célula

microtitulación de fondo plano, seguido de dos semanas

fetal al 10 %, medio acondicionado "653" al 18 %, orige

HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidad

50 mg/ml y HAT 1X (Sigma). Después de aproximadam

el que HAT está reemplazado por HT. Después, los poci

para detectar anticuerpos IgM e IgG monoclonales hu

hibridoma, el medio puede observarse normalmente de

se pueden volver a colocar en placas, explorarse de

anticuerpos monoclonales se pueden subclonar al men

pueden cultivar los subclones estables in vitro para ge

tisular para la caracterización.

Para purificar los anticuerpos, se pueden cultivar hibrid

para la purificación de anticuerpo monoclonal. Los

cromatografía por afinidad con proteína A-sepharose (P

mediante electroforesis en gel y cromatografía de líqui

tampón se puede intercambiar en PBS y la concentraci

de extinción de 1,43. A continuación, los anticuerpos se

Generación de transfectomas que producen anticuerpo

Los anticuerpos se pueden producir en un transfect

combinación de técnicas de ^a Dⁿ recombinantes y méto

(Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

ente documento también pueden prepararse utilizando han reconstituido de manera que se puede generar una s ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de

os, se pueden inmunizar ratones transgénicos o humana (p. ej., ratones HCo12, HCo7 o KM) con una células que expresan OX40 o un fragmento del mismo, erg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et to WO 98/24884. Como alternativa, los ratones pueden nto del mismo. Preferentemente, los ratones tendrán de ejemplo, puede utilizarse una preparación purificada o inmunizar los ratones HuMab por vía intraperitoneal. En ción purificada o enriquecida del antígeno OX40 no de inmunizar con células que expresen OX40, p. ej., una as celulares ilustrativas incluyen líneas celulares CHO y

strado que los ratones transgénicos HuAmb responden l (IP) o subcutánea (SC) con antígeno en adyuvante de asta un total de 10) con antígeno en adyuvante de Ribi. tocolo de inmunización con muestras de plasma que se ometer a cribado por ELISA y FACS (como se describe on suficiente titulación de inmunoglobulina humana antin antígeno 3 días antes de sacrificio y la extirpación del cesario realizar 2-3 fusiones para cada inmunización.

4 ratones. Habitualmente, se utilizan las cepas HCo7, se pueden formar juntos en un único ratón teniendo dos o12).

onales contra OX40

escritos en el presente documento, se pueden aislar unizados y fusionar a una línea celular inmortalizada Los hibridomas resultantes se pueden seleccionar en no. Por ejemplo, se pueden fusionar suspensiones de dos con células de mieloma de ratón no secretoras de embraron a aproximadamente 2 x 105 en una placa de cubación en medio selectivo que contiene suero de clon % (IGEN), L-glutamina 4 mM, piruvato de sodio 1 mM, de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, gentamicina os semanas, las células se pueden cultivar en medio en dividuales se pueden someter a cribado mediante ELISA s. Una vez que se produce el crecimiento extenso del de 10-14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpo o y si siguen siendo positivos a la IgG humana, los s veces mediante dilución limitante. A continuación, se pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo

seleccionados en dos matraces giratorios de dos litros nadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida se puede examinar e alta resolución para asegurar la pureza. La solución puede determinar por DO280 utilizando un coeficiente en dividir en alícuotas y conservar a -80 °C.

oclonales contra OX40

e células hospedadoras utilizando, por ejemplo, una transfección génica como es bien conocido en la técnica Por ejemplo, para expresar anticuerpos, o fragmentos

ligeras y pesadas parciales o de longitud completa, s

convencionales (p. ej., amplificación por PCR o clonació

de interés) y los A d N se pueden insertar en vectores de

a secuencias de control transcripcional y traduccional. E

significar que un gen de anticuerpo se liga en un vect

traduccional dentro del vector cumplen con su función

anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de

con la célula de expresión hospedadora utilizada. El g

pesada de anticuerpo se pueden insertar en vectores

expresión. Los genes de anticuerpos se pueden ins

convencionales (p. ej., unión de sitios de restricción co

vector o unión de extremos romos si no hay sitios de r

de los anticuerpos descritos en el presente documento

completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertándo

constantes de cadena pesada y de cadena ligera de

operativamente al(a los) segmento(s) Ch dentro del vec

dentro del vector.

Adicionalmente o como alternativa, el vector de expre

facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una

puede clonar en el vector de tal manera que el péptido

del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal

señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una pr

para su uso en cadenas pesadas y ligeras de anticuer

en los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente d

Además de los genes de cadenas de anticuerpos, los ve

reguladoras que controlan la expresión de los genes

expresión "secuencia reguladora" pretende incluir pro

expresión (p. ej., señales de poliadenilación) que control

del anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se descri

Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Die

diseño del vector de expresión, incluyendo la selección

como la elección de la célula hospedadora a transfo

secuencias reguladoras preferidas para la expresión en

que dirigen altos niveles de expresión de proteína en cé

procedentes de citomegalovirus (CMV), Virus del Simio

adenovirus (AdMLP)) y polioma. Como alternativa, pued

promotor de ubiquitina o el promotor de p-globina. Aún

diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa,

repetición terminal larga del virus de la leucemia human

8:466-472).

Además de los genes de cadenas de anticuerpos y

recombinantes pueden llevar secuencias adicionales, ta

células hospedadoras (p. ej. orígenes de replicació

seleccionable facilita la selección de células hospedado

patentes de Estados Unidos n.° 4.399.216, 4.634.665, 5

seleccionable confiere normalmente resistencia a fármac

hospedadora en donde se ha introducido el vector. Los

de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso e

metotrexato) y el gen neo (para selección de G418).

Para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas, el o

y ligeras se transfectan en una célula hospedadora med

formas del término "transfección" abarquen una amplia v

de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota

de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares

descritos en el presente documento en células hospeda

en células eucariotas, y los más preferentemente en cél

que tales células eucariotas, y en particular las células d

ensamblar y secretar un anticuerpo adecuadamente

expresión procariota de los genes de anticuerpo es ine

activo (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunolog nticuerpo de los mismos, los ADN que codifican cadenas ueden obtener mediante técnicas de biología molecular e ADNc utilizando un hibridoma que expresa el anticuerpo resión de manera que los genes se unen operativamente te contexto, la expresión "unido operativamente" pretende e modo que las secuencias de control transcripcional y vista de regular la transcripción y traducción del gen del trol de la expresión se eligen para que sean compatibles de la cadena ligera de anticuerpo y el gen de la cadena intos o ambos genes se insertan en el mismo vector de r en el(los) vector(es) de expresión mediante métodos ementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y en el cción). Las regiones variables de cadena ligera y pesada den utilizarse para crear genes de anticuerpos de longitud en los vectores de expresión que ya codifican regiones otipo deseado de manera que el segmento Vh se une y el segmento Vl se une operativamente al segmento Cl

recombinante puede codificar un péptido de señal que lula hospedadora. El gen de la cadena del anticuerpo se al se una dentro del marco de lectura al extremo amínico e ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido na no de inmunoglobulina). Secuencias señal ilustrativas incluyen las secuencias señal encontradas originalmente ento.

res de expresión recombinantes pueden llevar secuencias cadenas de anticuerpos en una célula hospedadora. La ores, potenciadores y otros elementos de control de la la transcripción o la traducción de los genes de la cadena , por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. CA (1990)). Los expertos en la materia apreciarán que el ecuencias reguladoras, puede depender de factores tales r, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las las hospedadoras de mamífero incluyen elementos víricos s de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores (SV40), adenovirus, (p. ej., el promotor tardío principal de utilizarse secuencias reguladoras no víricas, tales como el los elementos reguladores compuestos de secuencias de e contienen secuencias del promotor temprano SV40 y la e células T tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol.

las secuencias reguladoras, los vectores de expresión como secuencias que regulan la replicación del vector en genes marcadores seleccionables. El gen marcador en las que se ha introducido el vector (véanse, p. ej., las 9.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, el gen marcador tales como G418, higromicina o metotrexato, a una célula es marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen lulas hospedadoras dhfr con selección/amplificación en

vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas te técnicas convencionales. Se pretende que las diversas dad de técnicas comúnmente usadas para la introducción eucariota, p. ej., electroporación, precipitación con fosfato unque es teóricamente posible expresar los anticuerpos s procariotas o eucariotas, la expresión de los anticuerpos hospedadoras de mamífero, es la más preferida debido a amífero, son más propensas que las células procariotas a ado e inmunitariamente activo. Se ha publicado que la z para la producción de altas producciones de anticuerpo day 6:12-13). Los anticuerpos desvelados en el presente documento también pueden producirse en cepas de lev

Nat. Biotechnol. 24:210.

Las células hospedadoras de mamífero preferidas para

presente documento incluyen Células de Ovario De Há

Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:

ej., como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1

COS y células SP2. En particular, para su uso con célul

sistema de expresión del gen GS descrito en los docum

introducen vectores de expresión recombinantes que

mamífero, los anticuerpos se producen mediante el culti

suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en la

del anticuerpo en el medio de cultivo en donde crecen la

del medio de cultivo utilizando métodos de purificación

Los extremos N y C de las cadenas polipeptídicas de l

secuencia esperada debido a las modificaciones postra

terminales con frecuencia están ausentes en las cadena

100:1132. Los restos de glutamina N-terminales, y re

convierten en restos de piroglutamato en tanto las cad

Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et

286:11211.

XII. Ensayos

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente do

por ejemplo, mediante ELISA convencional. Brevement

a 1-2 |jg/ml en PBS y, a continuación, se bloquean con

anticuerpo (p. ej., diluciones de plasma de ratones inm

horas a 37 °C. Las placas se lavan con PBS/Tween y, a

anticuerpos humanos, un reactivo policlonal específico

rábano picante (HRP, horseradish peroxidase) durante

sustrato ABTS (Moss Inc, product: ABTS-1000) y se ana

A continuación, además se investigan sueros de ratones

línea celular human que expresa OX40 humana, pero no

la unión de anticuerpos anti-OX40 se evalúa incubando

a dilución de 1:20. Las células se lavan y la unión se det

de citometría de flujo se realizan utilizando citometr

Preferentemente, los ratones que desarrollan los mayor

Puede utilizarse un ensayo ELISA como se ha descrito

hibridomas que producen anticuerpos que muestran re

que producen anticuerpos que se unen, preferentement

caracterizarse posteriormente. Un clon de cada hibrid

(mediante ELISA), puede seleccionarse después par

anticuerpos.

Para purificar anticuerpos anti-OX40, se pueden cultivar

litros para la purificación de anticuerpo monoclonal. L

cromatografía por afinidad con proteína A-sepharose (P

mediante electroforesis en gel y cromatografía de líqui

tampón se puede intercambiar en PBS y la concentració

extinción de 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pue

Para determinar si los anticuerpos anti-OX40 seleccion

someter a biotinilación utilizando reactivos disponibles

biotinilado se puede detectar con una sonda marcada

anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos

de ELISA recubiertas con OX40 como se ha descrito an

Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificad

reactivos específicos para los anticuerpos de un isoti

anticuerpo monoclonal humano, se pueden recubrir

inmunoglobulina humana durante una noche a 4 °C.

reaccionar con 1 jg/m l o menos de anticuerpos mo

temperatura ambiente durante una o dos horas. A Pichia pastoris gluco-genomodificadas. Li et al. (2006)

resión de los anticuerpos recombinantes descritos en el Chino (CHO) (incluyendo células dhfr-CHO, descritas en 4220, usadas con un marcador DHFR seleccionable, p. ol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338.841. Cuando se an genes de anticuerpos en células hospedadoras de las células hospedadoras durante un periodo de tiempo las hospedadoras o, más preferentemente, la secreción las hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse teínas convencionales.

ticuerpos de la presente invención pueden diferir de la ionales observadas. Por ejemplo, los restos de lisina C-adas de anticuerpo. Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. de glutamato a un alcance menor, con frecuencia se pesadas como ligeras de los anticuerpos terapéuticos.

011) JBC 28611211; Liu et al. (2011) J. Biol. Chem.

nto pueden analizarse con respecto a la unión a OX40, recubren placas de microtitulación con OX40 purificada lbúmina bovina al 5 % en PBS. Se añaden diluciones del dos con OX40) a cada pocillo y se incuban durante 1-2 nuación, se incuban con reactivo secundario (p. ej., para c de cabra anti-humano) conjugado con peroxidasa de a 37 °C. Después de lavar, las placas se revelaron con n mediante un espectrofotómetro a una DO de 415-495. nizados mediante citometría de flujo para la unión a una línea celular control que no expresa OX40. Brevemente, s CHO que expresan OX40 con el anticuerpo anti-OX40 on un Ab anti-IgG humana marcado con PE. Los análisis flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). los se utilizarán para las fusiones.

riormente para seleccionar anticuerpos y, por tanto, los dad positiva con el inmunógeno OX40. Los hibridomas alta afinidad, a OX40 pueden entonces subclonarse y que conserva la reactividad de las células originales parar un banco de células, y para la purificación de

domas seleccionados en dos matraces giratorios de dos brenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la acia, Piscataway, NJ). La IgG eluida se puede examinar e alta resolución para asegurar la pureza. La solución puede determinar por DO280 utilizando un coeficiente de ividir en alícuotas y conservar a -80 °C.

se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo se puede l comercio (Pierce, Rockford, IL). La unión de un mAb estreptavidina. Los estudios de competición que usan lonales biotinilados se pueden realizar utilizando placas mente.

e pueden realizar ensayos ELISA de isotipo utilizando rticular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un os de placas de microtitulación con 1 jg/m l de antiés de bloquear con BSA al 1 %, las placas se hacen nales de ensayo o controles de isotipo purificado, a uación, los pocillos se hacen reaccionar con sondas conjugadas a fosfatasa alcalina específicas a IgG1 hum

se ha descrito anteriormente.

Para ensayar la unión de los anticuerpos con células vi

como se describe en los ejemplos. Brevemente, las líne

en condiciones de crecimiento convencionales) se

monoclonales en PBS que contiene BSA al 0,1 % a 4 °

reaccionar con anticuerpo anti-IgG marcado con fluore

anticuerpo primario. Las muestras se pueden analizar c

de luz y lateral a puerto sobre célula únicas y se determi

ensayo alternativo que usa microscopia de fluorescencia

células pueden teñirse exactamente como se ha des

fluorescencia. El método permite la visualización de las

dependiendo de la densidad del antígeno.

Los anticuerpos anti-OX40 pueden analizarse además c

transferencia Western. Brevemente, pueden preparars

electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfat

transferirán a membranas de nitrocelulosa, bloqueadas

monoclonales a analizar. La unión a IgG puede detecta

comprimidos de sustrato BCIP/NBT. Co., St. Louis, MO).

Los métodos para analizar la afinidad de unión, la reactivi

conocidos en la técnica, por ejemplo, análisis de RPS B

(Biacore AB, Uppsala, Suecia).

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

humana. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse específ

dentro del dominio extracelular de OX40. En una realiz

en OX40 al que se une OX40-L. En otras realizaciones,

de OX40 humana y a la región extracelular de OX40 de

XIN. Inmunoconjugados, derivados de anticuerpo y d

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente doc

el ensayo de muestras y la realización de imágenes in

del mismo) se puede conjugar a un agente detectabl

diagnósticos, son agentes apropiados marcadores detec

todo el cuerpo, y radioisótopos, enzimas, marcadores fl

el ensayo de muestras.

Los marcadores detectables pueden ser de cualquiera

diagnóstico in vitro, incluidos marcadores de partículas

tales como I125 o Tc99 presentados por ejemplo con un a

incluyendo marcadores fluorescentes, biotina, marcador

como marcadores enzimáticos que convierten un s

polinucleótidos que se revelan después de la amplific

Entonces, un anticuerpo biotinilado será detectable por

adecuados incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfa

la enzima fosfatasa alcalina, detectada midiendo la pre

conversión de sustratos de 1,2 dioxetano tal como ada

3-(4-(metoxiespiro{1,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo{3.3

star® u otros sustratos luminiscentes bien conocidos p

lantánidos adecuados tales como Terbio(III) y Europio(III

aspecto del marcador o de sus productos de reacción

marcador esté en forma de partícula y se acumule

espectrofotómetro, un luminómetro, un fluorímetro, y sim

Preferentemente, los métodos de conjugación dan co

inmunogénicos, p. ej., enlaces de péptidos (es decir, ami

y éter. Estos enlaces son poco inmunógenos y muestra

Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 23

95/17886).

Dependiendo de la naturaleza bioquímica del residuo y

conjugación. En caso de que el residuo sea un polipé IgM humana. Las placas se revelan y se analizan como

ue expresan OX40, puede utilizarse citometría de flujo, elulares que expresan OX40 unida a membrana (cultivo zclan con diversas concentraciones de anticuerpos rante 1 hora. Después del lavado, las células se hacen a en las mismas condiciones que las de la tinción de l equipo FACScan utilizando propiedades de dispersión unión de los anticuerpos marcados. Puede utilizarse un emás o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las anteriormente y examinarse mediante microscopia de s individuales, pero puede tener sensibilidad disminuida

specto a su reactividad con el antígeno OX40 mediante tractos de células que expresen OX40 y someterse a sodio. Tras la electroforesis, los antígenos separados se suero de ratón al 20 %, y sondadas con los anticuerpos tilizando anti-IgG con fosfatasa alcalina y revelarse con

cruzada y la cinética de unión incluyen ensayos estándar RE® utilizando un equipo de RPS de BIACORE® 2000

ne específicamente a la región extracelular de la OX40 ente a un dominio particular (p. ej., un dominio funcional) particular, el anticuerpo se une específicamente al sitio ticuerpo se une específicamente a la región extracelular co cangrejero.

óstico

to pueden utilizarse para fines diagnósticos, incluyendo y con estos fines el anticuerpo (o el fragmento de unión ropiado, para formar un inmunoconjugado. Para fines s que incluyen radioisótopos, para obtener imágenes de centes y otras etiquetas de anticuerpo adecuadas para

s diversos tipos utilizados actualmente en el campo del incluyen soles metálicos como el oro coloidal, isótopos e quelante peptídico del tipo N2S2, N3S o N4, cromóforos miniscentes, marcadores fosforescentes y similares, así to dado en un indicador detectable, y etiquetas de tal como por reacción en cadena de la polimerasa. a avidina o estreptavidina. Los marcadores enzimáticos alcalina y similares. Por ejemplo, el marcador puede ser ia o la formación de quimioluminiscencia después de la l metoxi fosforiloxi fenil dioxetano (AMPPD), fenil fosfato 3,7}decan}-4-il) disódico (CSPD), así como CDP y CDP-s expertos en la materia, por ejemplo, los quelatos de medio de detección lo determina el marcador elegido. El uede conseguir a simple vista, en el caso en el que el eles apropiados, o utilizando equipos tales como un s, todo ello de acuerdo con la práctica convencional.

esultado enlaces que son sustancialmente (o casi) no e sulfuro, (estéricamente impedido), disulfuro, hidrazona estabilidad razonable en el suero (véase, por ejemplo, ; el documento WO 2009/059278; el documento WO

nticuerpo, se pueden emplear diferentes estrategias de de origen natural o recombinante de entre 50 a 500 aminoácidos, existen procedimientos convencionales e

de conjugados proteicos, que pueden seguir fácilmente

R., y Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2

un residuo de maleinimido con un resto de cisteína dent

acoplamiento especialmente adecuada en caso de que s

Como alternativa, en una realización se realiza el acopl

La modificación C-terminal de una proteína, por ejemplo,

(Sunbul, M. y Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361

En general, la reacción específica de sitio y el acoplamie

natural en un aminoácido con una reactividad que es

funcionales presentes. Por ejemplo, una cisteína específi

enzimáticamente en un aldehído (véase Frese, M. A., y

posible obtener una modificación de aminoácidos d

determinadas enzimas con un aminoácido natural en un

Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Ch

catalizada por proteasa se describe en Bordusa, F., Hig

La reacción específica de sitio y el acoplamiento covalen

de aminoácidos terminales con reactivos de modificació

La reactividad de una cisteína N-terminal con benzonit

(2009) 9658-9662) puede utilizarse para conseguir un a

El ligamiento químico nativo también se puede basar en l

B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Prot

El documento EP 1074563 describe un método de conj

dentro de un tramo de aminoácidos negativamente carg

positivamente cargados.

El resto también puede ser un péptido sintético o un mi

químicamente, durante dicha síntesis pueden incorpora

ej., de Graaf et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-gran diversidad de grupos funcionales ortogonales en

enlazador es un proceso químico estándar.

Para obtener un polipéptido monomarcado, el conjugad

de otros productos secundarios de conjugación. Este p

de unión marcado con colorante y un enlazador cargad

muy cargado negativamente, los polipéptidos mono conj

polipéptidos que llevan más de un enlazador, puesto qu

la carga y al peso molecular. El colorante fluorescente

unidos, como un enlazador monovalente marcado.

En una realización, el residuo unido al anticuerpo antiunión, un residuo de marcaje y un residuo biológicamen

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente doc

para formar un inmunoconjugado tal como un conjugad

adecuados se incluyen antimetabolitos, agentes alquila

ADN, reticulantes de ADN, inhibidores de histona des

proteasoma, inhibidores de topoisomerasa I o II, inhibid

cinasa, antibióticos y agentes antimitóticos. En el

preferentemente mediante un enlazador escindible tal

preferentemente, el enlazador es un enlazador de pept

Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 180), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Ly

pueden prepararse como se describe en las patentes

publicaciones PCT WO 02/096910; WO 07/038658; WO

en las publicaciones de patente de Estados Unidos 200

De manera más específica, en un CAF, el anticuerpo s

agente de direccionamiento para dirigir el CAF a una

cancerosa. Preferentemente, el antígeno es un antígen

sobreexpresa la célula cancerosa. Una vez allí, el fárm

para actuar como un agente terapéutico. Para la revi libros de texto que describen la química para la síntesis xpertos en la materia (véase, p. ej., Hackenberger, C. P.

0030-10074). En una realización, se usa la reacción de l anticuerpo o se usa el residuo. Esta es una química de , por ejemplo, un fragmento Fab o Fab' de un anticuerpo. to en el extremo C-terminal del anticuerpo o del residuo. n fragmento Fab, se puede realizar tal como se describe ).

valente se basan en la transformación de un aminoácido onal con respecto a la reactividad de los otros grupos ntro de un contexto de secuencia raro se puede convertir ks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427). También es a utilizando la reactividad enzimática específica de xto de secuencia dado (véase, p. ej., Taki, M. et al., Prot. iol. 15 (2008) 128-136; y la formación de enlaces C--N s in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403).

bién se puede conseguir mediante la reacción selectiva opiados.

(véase, Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 miento covalente específico de sitio.

tos de cisteína C-terminales ((Taylor, E. Vogel; Imperiali, ngineering), 65-96).

n que se basa en la reacción más rápida de una cisteína que una cisteína localizada en un tramo de aminoácidos

peptídico. En el caso de que un polipéptido se sintetice minoácidos con reactividad química ortogonal (véase, p. Debido a que está en juego y se puede introducir una éptido sintético, la conjugación de tal péptido con un

estequiometría 1:1 puede separarse por cromatografía imiento se puede facilitar utilizando un miembro del par izando este tipo de miembro del par de unión marcado y os se separan fácilmente de polipéptidos no marcados y la separación puede utilizarse la diferencia en cuanto a e ser útil para purificar el complejo de componentes no

se selecciona del grupo que consiste en un residuo de ivo.

o también pueden conjugarse con un agente terapéutico nticuerpo y fármaco (CAF). Como agentes terapéuticos aglutinantes del surco menor del ADN, intercaladores de asa, inhibidores de exportación nuclear, inhibidores de de la proteína de choque térmico, inhibidores de tirosina el anticuerpo y el agente terapéutico se conjugan un enlazador de peptidilo, disulfuro o hidrazona. Más tal como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val--Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser o Glu. Los CAF Estados n.° 7.087.600; 6.989.452; y 7.129.261; en las 1081; WO 07/059404; WO 08/083312; y WO 08/103693; 317; 20060004081; y 20060247295.

juga a un fármaco, funcionando el anticuerpo como un a diana que expresa su antígeno, tal como una célula ciado a tumor, es decir, uno que únicamente expresa o libera, bien dentro de la célula diana o en su vecindad, obre el mecanismo de acción y el uso de los CAF en carcinoterapia, véase Schrama et al., Nature Rev. Drug

Para el tratamiento del cáncer, el fármaco es preferente

cancerosa diana. Los fármacos citotóxicos que pued

compuestos y sus análogos y derivados:

(a) enediinas tales como caliqueamicina (véase, p.

uncialmacina (véase, p. ej., Davies et al., WO 2007/0

(b) tubulisinas (véase, p. ej., Domling et al., US 7.778.

et al., US Ser. n.° 14/177376, presentada el 11 de fe

(c) CC-1065 y duocarmicina (véase, p. ej., Boger, do

8.461.117 B2 (2013); y Zhang et al., documento US

(d) epotilonas (véase, p. ej., Vite et al, documento U

(e) auristatinas (véase, p. ej., Senter et al., documen

7.498.298 B2 (2009));

(f) dímeros de pirrolobezodiazepina (PBD) (véase, p

documento US 2013/0028919 A1 (2013); y documen

(g) maitansinoides tales como DM1 y DM4 (véase, p.

et al., documento US 7.374.762 B2 (2008)).

En un CAF, un enlazador conecta de manera covalente

de fármaco unida a cada enlazador, pero el enlazador

de fárma

[Anticuerpo] -[En

en donde normalmente m es 1, 2, 3, 4, 5 o 6 (preferente

En algunas realizaciones, el enlazador contiene un grup

para liberar el fármaco. En otras realizaciones, el enlaz

se basa en el catabolismo del anticuerpo para liberar el f

Un tipo de grupo escindible es un grupo sensible al p

neutro, mientras que el pH dentro de un lisosoma, donde

en una célula diana, es ácido, de aproximadamente 5. P

ácido se escindirá a una velocidad varios órdenes de m

sanguíneo. Los ejemplos de grupos sensibles a ácidos s

et al., documento US 4.631.190 (1986); Shen et al., doc

Res. Commun. 1981, 102, 1048; y en Yang et al., Proc.

En otra realización, el grupo escindible es un disulfuro. L

intercambio de tiol-disulfuro, a una velocidad que d

concentración intracelular de glutatión y otros tioles es

escisión de un disulfuro será más alta intracelular

Adicionalmente, la velocidad de intercambio de tiol-disulf

estéricas y electrónicas del disulfuro (por ejemplo, un

sustitución en el anillo de arilo, etc.), lo que permite el

mejorada o una velocidad de escisión particular. Para di

de disulfuro en conjugados, véase, p. ej., Thorpe et al

7.541.530 B2 (2009); Ng et al., documento US 6.989.452

Boyd et al., documento US 7.691.962 B2 (2010); y Sufi

Un grupo escindible preferido es un péptido que escind 2006, 5, 147.

un fármaco citotóxico que causa la muerte de la célula tilizarse en los CAF incluyen los siguientes tipos de

e et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464 y 3466) y 8 A2 (2007) y Chowdari et al., US 8.709.431 b2 (2012)); 2 (2010); Cheng et al., US 8.394.922 B2 (2013); y Cong de 2014));

nto US 6.5458.530 B1 (2003); Sufi et al., documento US 0301490 A1 (2012));

7/0275904 A1 (2007) y US RE42930 E (2011));

6.844.869 B2 (2005) y Doronina et al., documento US

Howard et al., documento US 2013/0059800 A1(2013); 2013/041606 A1 (2013)); y

hari et al., documento US 5.208.020 (1993) y Amphlett

ticuerpo y el fármaco. Habitualmente, hay una molécula ede ramificar, permitiendo la unión de varias moléculas

or-(Fármaco)n]m

2, 3 o 4) y n es 1, 2 o 3.

indible que se escinde dentro o cerca de la célula diana, no contiene un grupo escindible sino, más bien, el CAF co.

pH en el plasma sanguíneo es ligeramente superior al an la mayoría de los CAF después de su internalización to, un grupo escindible cuya escisión es catalizada por ud más rápida dentro de un lisosoma que en el plasma -aconitilamidas e hidrazonas, como se describe en Shen to US 5.144.011 (1992); Shen et al., Biochem. Biophys. cad. Sci USA, 1988, 85, 1189.

sulfuros se pueden escindir mediante un mecanismo de de de la concentración de tiol ambiental. Como la alta que sus concentraciones séricas, la velocidad de , es decir, después de la internalización del CAF. puede modular mediante el ajuste de las características ro de alquil-arilo frente a un disulfuro de alquil-alquilo; de enlaces disulfuro que tienen una estabilidad sérica ciones adicionales relacionadas con grupos escindibles ncer Res. 1988, 48, 6396; Santi et al., documento US 006); Ng et al., documento WO 2002/096910 A1 (2002); documento US 2010/0145036 A1 (2010). ectivamente una proteasa dentro de la célula diana, en oposición a una proteasa en el suero. Habitualmente, un

preferentemente de 1 a 6 aminoácidos, más preferent

pueden ser a-aminoácidos naturales y/o no naturales.

genético, así como los aminoácidos derivados de los m

fosfoserina. En este contexto, el término "aminoácido"

análogos son compuestos que tienen la misma estru

excepto que el grupo R no se encuentra entre los

homoserina, norleucina, metionina-sulfóxido y metionina

que tiene una estructura diferente de la estructura quími

similar a uno. El aminoácido puede ser de la estereoqu

como de la estereoquímica enantiomérica "D".

Preferentemente, un grupo peptídico escindible contie

reconocimiento de escisión para una proteasa. En la té

escisión. Véase, p. ej., Matayoshi et al. Science 247: 95

et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth

595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994)

Más preferentemente, un grupo peptídico escindible co

escisión por una proteasa endosómica o lisosómica,

incluyen catepsinas B, C, D, H, L y S, especialmente

péptidos en una secuencia -AA2-AA1- donde AA1 es un

la lisina, arginina o citrulina) y AA2 es un aminoácid

isoleucina, por ejemplo Val-Cit (donde Cit indica citrulin

obtener información adicional sobre los grupos escindibl

Lett. 1998, 8, 3341; Dubowchik et al., Bioorg. Med. Che

2002, 13, 855. Otra enzima que puede utilizarse para e

proteasa lisosómica que se escinde preferentemente en

En una realización preferida, el enlazador en los

preferentemente por una proteasa ubicada dentro de la

por la catepsina B, más preferentemente un dipéptido V

También pueden utilizarse grupos peptídicos escindibles

documento US 2010/0113476 A1 (2010).

Para conjugados que no están destinados a ser interna

modo que sea escindido por una proteasa presente en

una proteasa liberada por células moribundas cercanas

extracelulares asociadas a tumores son las metaloprote

CD10. Véase, p. ej., Trouet et al., documentos US

documento US 7.425.541 B2 (2008); y Bebbington et al.

El enlazador puede realizar otras funciones además d

ejemplo, el enlazador puede contener grupos de poli(eti

realización de la química de conjugación o en el produc

El enlazador puede incluir además un residuo autoinm

autoinmolable actúa como un espaciador que impid

estéricamente con la escisión del grupo peptídico

espontáneamente (es decir, se autoinmola) para no int

Chem. 1981, 24 (3), 479; Carl et al., documento WO 81/

1999, 83, 67; Firestone et al., documento US 6.214.345

et al., Nature Biotechnology 2003, 21 (7), 778 ("errata en

et al., documento US 7.691.962 B2 (2010); Boyd et al., d

WO 2008/083312 A2 (2008); Feng, documento US 7.37

y Senter et al., documento US 2003/0096743 A1 (2003).

Un grupo autoinmolable preferido es un grupo p-amin

acción se representa a continuación:

o peptídico escindible comprende de 1 a 20 aminoácidos, te de 1 a 3 aminoácidos. El aminoácido o aminoácidos minoácidos naturales son los codificados por el código , p. ej., hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, citrulina y O-ién incluye miméticos y análogos de aminoácidos. Los general de H2N(R)CHCO2H de un aminoácido natural, ácidos naturales. Los ejemplos de análogos incluyen l sulfonio. Un mimético de aminoácidos es un compuesto neral de un a-aminoácido, pero que funciona de manera "L" de los aminoácidos codificados genéticamente, así

a secuencia de aminoácidos que es una secuencia de se conocen muchas secuencias de reconocimiento de 90); Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah ymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol. 244: ouvier et al. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995).

de una secuencia de aminoácidos seleccionada para la cialmente el último. Los ejemplos de dichas proteasas tepsina B. La catepsina B escinde preferentemente los oácido básico o con enlaces fuertes de hidrógeno (como rófobo (como la fenilalanina, valina, alanina, leucina o al-Lys, escrito en la dirección N a C convencional. Para r catepsina, véanse Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. t., 1998, 8, 3347; y Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. ir enlazadores de peptidilo es la legumaína, una cisteína Ala-Asn.

comprende un dipéptido o tripéptido que se escinde diana. Preferentemente, el di- o tripéptido es escindible t o Val-Lys.

n solo aminoácido, como se desvela en Chapman, et al.,

os por una célula, el grupo escindible puede elegirse de triz extracelular en la vecindad de la célula diana, p. ej., a proteasa asociada a un tumor. Ejemplos de proteasas de matriz (MMP), plasmina, timetoligopeptidasa (TOP) y .216(1999) y US 7.402.556 B2 (2008), Dubois et al., umento US 6.897.034 B2 (2005).

ir de manera covalente el anticuerpo y el fármaco. Por icol) (PEG), que mejoran la solubilidad ya sea durante la l de CAF.

ubicado junto a un grupo peptídico escindible. El grupo e el anticuerpo y/o el residuo de fármaco interfieran una proteasa, pero a partir de entonces se libera r con la acción del fármaco. Véanse Carl et al., J. Med. (1981); Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics 001); Toki et al., J. Org. Chem. 2002, 67, 1866; Doronina g. 941); de Groot et al., Org. Chem. 2001, 66, 8815; Boyd ento U^s 2008/0279868 A1 (2008); Sufi et al., documento B2 (2008); Jeffrey, documento US 8.039.273 B2 (2011);

iloxicarbonilo (PABC), cuya estructura y mecanismo de

Por tanto, en una realización preferida, un CAF tien

preferentemente escinde una proteasa ubicada dentro

autoinmolable. Preferentemente, el di- o tripéptido e

autoinmolable es un grupo PABC.

Para conjugar el anticuerpo y el fármaco pueden utilizar

en la cadena lateral de un resto de lisina en el anticuer

grupo tiol (-SH) libre. El grupo tiol puede reaccionar c

efectuar la conjugación, como se ilustra a continuación: n enlazador que comprende un di- o tripéptido que célula diana y, adyacente al di- o tripéptido, un grupo scindible por catepsina B. Preferiblemente, el grupo

umerosas técnicas. En una preferida, un grupo £-amino e hace reaccionar con 2-iminotiolano para introducir un na maleimida u otro grupo aceptor de nucleófilos para

oano

Anticuerpo

Habitualmente, se alcanza un nivel de tiolación de dos

representativo, véase Chowdari et al., US 8,709,431 B2

invención tiene uno o más restos de lisina (preferenteme

Una técnica de conjugación alternativa emplea la "quími

través del enlace alquino tenso de un ciclooctino, para f

Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046; Best, Biochemistry

la ciclooctina en el residuo del fármaco, o viceversa. Un

Diversos reactivos que tienen un grupo DIBO están disp

siguiente reacción ilustra la conjugación de la química

anticuerpo:

s tioles por anticuerpo. Para conocer un procedimiento 4). Por tanto, en una realización, un anticuerpo de esta dos o tres) modificados por reacción con iminotiolano.

e clic" sin cobre, en la que un grupo azida se añade a r un anillo de 1,2,3-triazol. Véase, p. ej., Agard et al., J.

9, 48, 6571. La azida puede ubicarse en el anticuerpo y po ciclooctino preferido es la dibenzociclooctina (DlBo). les en Invitrogen/Molecular Probes, Eugene, Oregón. La para el caso en el que el grupo DIBO esté unido al

Otra técnica de conjugación más implica la introducción d

el aminoácido no natural una funcionalidad para la co

fármaco. Por ejemplo, el aminoácido no natural p-ace

polipéptido, como se muestra en Tian et al., docum

acetilfenialanina puede ser un sitio de conjugación a trav

en el residuo enlazador-fármaco. Como alternativa, el a

en un anticuerpo para proporcionar un grupo funcional az

ha indicado anteriormente. También pueden incorporarse

utilizando métodos sin células, como se muestra en Goer

et al., Biotechnol. Bioeng. 2009, 102 (2), 400-416. Po

aminoácidos reemplazados por un aminoácido no

azidofenilalanina, más preferentemente p-acetilfenilalani

En otra técnica de conjugación adicional se utiliza la en

bacteriana o TGB), como enseñan Jeger et al., Angew. C

entre la carboxamida de cadena lateral de una glutamin

grupo £-amino de una lisina o un grupo 5-amino-n-pe

glutamina se ubica en el anticuerpo, mientras que el gru

como se muestra a continuación:

n aminoácido no natural en un anticuerpo, proporcionando gación con un grupo funcional reactivo en el residuo de enilalanina puede incorporarse en un anticuerpo u otro WO 2008/030612 A2 (2008). El grupo cetona en pde la formación de una oxima con un grupo hidroxilamino oácido no natural p-azidofenilalanina se puede incorporar para la conjugación mediante la química de clic, como se inoácidos no naturales en un anticuerpo u otro polipéptido et al., documento US 2010/0093024 A1 (2010) y en Goerke nto, en una realización, el anticuerpo tiene uno o más ural, que preferentemente es p-acetilfenilalanina o p-

a transglutaminasa (preferentemente la transglutaminasa m. Int. Ed. 2010, 49, 9995. La TGB forma un enlace amida y un grupo alquilenamino, que puede ser, por ejemplo, el . En una reacción de conjugación habitual, el resto de alquilenamino se ubica en el residuo enlazador-fármaco,

El posicionamiento de un resto de glutamina en una cade

a la transamidación mediada por TGB. Ninguno de los res

de TGB. Sin embargo, si el anticuerpo está desglucosila

, la glutamina 295 (Q295) cercana se vuelve susceptible

en la región constante, puede sintetizarse un anticuerp

Adicionalmente, se ha demostrado que una sustitución

que también introduce un segundo resto de glutamin

transamidación mediada por TGB. Por tanto, en una real

realización, el anticuerpo anti-OX40 tiene una sustituc

desglucosilación mediante modificación posterior a la sín

de glutamina reactivos a TGB por anticuerpo (uno por ca

con una sustitución N297Q tendrá cuatro restos de gl

posiciones 295 y 297).

Adicionalmente, en otra técnica de conjugación se utiliza

2011, 6(4), e18342; Proft, Biotechnol. Lett. 2010, 32, 1polipeptídica tiene un gran efecto sobre su susceptibilidad de glutamina en un anticuerpo son normalmente sustratos -siendo el sitio de glucosilación la asparagina 297 (N297)-GB. Como alternativa, introduciendo una mutación N297A in glucósido, para eliminar el sitio de glucosilación N297.

7Q en un anticuerpo no solo elimina la glucosilación, sino en la posición 297) que es demasiado susceptible a la ción, el anticuerpo anti-OX40 está desglucosilado. En otra N297Q. Los expertos en la técnica apreciarán que la is o introduciendo una mutación N297A, genera dos restos a pesada, en la posición 295), mientras que un anticuerpo mina reactivos a TGB (dos por cadena pesada, en las

enzima Sortasa A, como enseñan Levary et al., PLoS One Ploegh et al., documento WO 2010/087994 A2 (2010); y Mao et al., documento WO 2005/051976 A2 (2005). El

(SEQ ID NO: 181), donde X es cualquier aminoácido natu

(normalmente GGG) puede ubicarse en el residuo de fár

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente doc

como OX40 humana, p. ej., OX40 humana en tejidos o

en un ensayo ELISA o en citometría de flujo. En deter

contacto con las células, p. ej., células de un tejido, du

específica, y después se añade un reactivo, p. ej., un anti

se proporcionan ensayos ilustrativos. El anticuerpo antiser un anticuerpo quimérico, tal como un anticuerpo qu

murinas o una parte de las mismas. Los métodos ilustrativ

(muestra celular o tisular) comprenden (i) poner en cont

tiempo suficiente para permitir la unión específica del an

contacto la muestra con un reactivo de detección, p. ej., u

OX40, tal como la región Fc del anticuerpo anti-OX40, p

Pueden incluirse etapas de lavado después de la incuba

su uso en estos métodos, los anticuerpos anti-OX40 n

detección, ya que puede utilizarse un agente de detecció

XIV. Moléculas biespecíficas

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente docu

Por ejemplo, el anticuerpo, o partes de unión a antígen

funcional, p. ej., a otro péptido o proteína (p. ej., a otro ant

biespecífica que se una a al menos dos sitios de unión o

anti-OX40 puede unirse a un anticuerpo o a scFv que se u

como posible diana para tratamientos combinados, tales

ej., anticuerpos contra PD-1, PD-L1 o LAG-3). Como alter

otra molécula funcional para generar moléculas multie

moléculas diana diferentes. También se pretende que di

"molécula biespecífica" como se usa en el presente doc

presente documento, el anticuerpo anti-OX40 puede uni

fusión genética, asociación no covalente o de otra maner

anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético d

Por consiguiente, en el presente documento se proporcio

primera especificidad de unión por OX40 y una segunda

realización, la molécula biespecífica es multiespecífic

especificidad de unión.

En determinadas realizaciones, las moléculas multiespecí

anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, inclu

(scFv). El anticuerpo también puede ser un dímero de ca

del mismo tal como un Fv o una construcción monocatena

de Estados Unidos N.° 4.946.778.

Aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales hum

biespecíficas descritas en el presente documento, incluye

Las moléculas biespecíficas proporcionadas en el

especificidades de unión del constituyente utilizando méto

de unión de la molécula biespecífica puede generarse

especificidades de unión son proteínas o péptidos, pu

entrecruzamiento para la conjugación covalente. Como ej

A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (

fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio

ciclohexan-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (véase por ejempl

al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros m

Mitt. n.° 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:

Son agentes de conjugación preferidos SATA y sulfo-S

IL).

Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, se

bisagra del extremo carboxílico de las dos cadenas pesa

bisagra se modifica para que contenga un número im tivo de reconocimiento Sortasa A (normalmente LPXTG , puede unirse al anticuerpo y el motivo aceptor nucleófilo co, o viceversa.

ento también pueden utilizarse para detectar OX40, tal estras tisulares. Los anticuerpos pueden utilizarse, p. ej., adas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40 se pone en te un tiempo apropiado para que se produzca la unión rpo que detecte el anticuerpo anti-OX40. En los Ejemplos 40 puede ser un anticuerpo totalmente humano o puede nga regiones variables humanas y regiones constantes para detectar OX40, p. ej., OX40 humana, en una muestra o una muestra con un anticuerpo anti-OX40, durante un erpo anti-OX40 con OX40 en la muestra, y (2) poner en nticuerpo, que se una específicamente al anticuerpo antidetectar así la OX40 unida por el anticuerpo anti-OX40. n con el anticuerpo y/o con el reactivo de detección. Para ienen que estar unidos a una etiqueta o a agentes de dependiente.

to pueden utilizarse para formar moléculas biespecíficas. el mismo, puede derivatizarse o unirse a otra molécula erpo o ligando de un receptor) para generar una molécula léculas diana diferentes. En una realización, el anticuerpo específicamente a cualquier proteína que pueda utilizarse mo las proteínas descritas en el presente documento (p. tiva, un anticuerpo puede derivatizarse o unirse a más de cíficas que se unan a más de dos sitios de unión y/o s moléculas multiespecíficas se incluyan en la expresión ento. Para crear una molécula biespecífica descrita en el funcionalmente (p. ej., mediante acoplamiento químico, a una o más moléculas de unión diferentes, tal como otro nión, de manera que produzca una molécula biespecífica.

n moléculas biespecíficas que comprenden al menos una ecificidad de unión por un segundo epítopo diana. En una p. ej., la molécula puede incluir además una tercera

as comprenden como especificidad de unión al menos un do, p. ej., un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o un Fv monocatenario a ligera o cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo como describen Ladner et al., en el documento de patente

s, pueden emplearse otros anticuerpos en las moléculas o, p. ej., anticuerpos murinos, quiméricos y humanizados.

sente documento pueden prepararse conjugando las s conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad r separado y después conjugarse entre sí. Cuando las utilizarse una variedad de agentes de acoplamiento o plos de agentes de entrecruzamiento se incluyen proteína A), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTN^b ), oopionato (SPDP), y sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et dos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins.

83), y Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). , ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford,

den conjugar mediante enlaces sulfhidrilo de las regiones s. En una realización particularmente preferida, la región de restos sulfhidrilo, preferentemente uno, antes de la conjugación.

Como alternativa, ambas especificidades de unión puede

en la misma célula hospedadora. Este método es particul

de fusión mAb x mAb, mAb x Fab, mAb x (scFv)2, Fab

comprender un anticuerpo que comprende un scFv en el

biespecífica descrita en el presente documento puede ser

monocatenario y un determinante de unión, o una

determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pu

Se describen métodos para preparar moléculas biespecíf

5.260.203; patente de Estados Unidos número 5.455.030

Estados Unidos número 5.132.405; patente de Estados U

5.476.786; patente de Estados Unidos número 5.013.653;

Estados Unidos número 5.482.858.

La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas es

en la técnica, tales como ensayo inmunoabsorbente lig

FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimient

ensayos generalmente detecta la presencia de complej

reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico

XV. Composiciones

Además, se proporcionan composiciones, p. ej., una com

anti-OX40, solos o junto con anticuerpos contra otras d

aceptable. Dichas composiciones pueden incluir uno o u

0 inmunoconjugados o moléculas biespecíficas descrito

puede comprender una combinación de anticuerpos (o i

documento que se unen a diferentes epítopos en OX40 o

En determinadas realizaciones, la composición comprend

1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150

Las composiciones farmacéuticas descritas en el

combiterapias, es decir, combinadas con otros agentes.

de un anticuerpo anti-OX40 descrito en el presente docu

y/o estimulador (por ejemplo, activador) de células T. Ej

combiterapia se describen en mayor detalle a continuaci

presente documento.

En determinadas realizaciones, las composiciones terapé

otros compuestos, fármacos y/o agentes usados para el

agentes pueden incluir, por ejemplo, fármacos para quimi

estimulan la respuesta inmunitaria contra un cáncer dado

incluir, por ejemplo, uno o más de un anticuerpo anti-CT

anticuerpo anti-GITR, un anticuerpo anti-CD137 o un anti

Como se usa en el presente documento, los "vehículos fa

disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, ag

retardantes de la absorción, y similares, que sean fisio

adecuado para administración intravenosa, intramuscular

mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía d

inmunoconjugado o molécula biespecífica, se puede recu

de los ácidos y de otras condiciones naturales que puede

Las composiciones farmacéuticos descritas en el

farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticame

biológica deseada del compuesto precursor y no transmit

S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejemplos

de adición de bases. Las sales de adición de ácidos inclu

como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromh

orgánicos no tóxicos, tales como ácidos alifáticos mon

ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfó

de bases incluyen las procedentes de metales alcalinotérr

así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como

colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

odificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse ente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína (ab')2 o ligando x Fab. Un anticuerpo biespecífico puede tremo carboxílico de cada cadena pesada. Una molécula a molécula monocatenaria que comprenda un anticuerpo écula biespecífica monocatenaria que comprenda dos n comprender al menos dos moléculas monocatenarias. s, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos número atente de Estados Unidos número 4.881.175; patente de os número 5.091.513; patente de Estados Unidos número tente de Estados Unidos número 5.258.498; y patente de

íficas puede confirmarse utilizando métodos reconocidos a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis o ensayo de transferencia Western. Cada uno de estos proteína-anticuerpo de particular interés empleando un ra el complejo de interés.

sición farmacéutica, que contiene uno o más anticuerpos as, formulada junto con un vehículo farmacéuticamente combinación de (p. ej., dos o más diferentes) anticuerpos n el presente documento. Por ejemplo, la composición unoconjugados o biespecíficos) descritos en el presente e tienen actividades complementarias.

n anticuerpo anti-OX40 a una concentración de al menos l, 200 mg/ml, 1-300 mg/ml o 100-300 mg/ml.

sente documento también pueden administrarse en r ejemplo, la combiterapia puede incluir la administración nto combinado con al menos otro agente anticanceroso plos de agentes terapéuticos que pueden utilizarse en la en el apartado de usos de los anticuerpos descritos en el

cas desveladas en el presente documento pueden incluir atamiento del cáncer. Dichos compuestos, fármacos y/o rapia, fármacos de molécula pequeña o anticuerpos que n algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden 4, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDL-1, un rpo anti-LAG-3.

acéuticamente aceptables" incluyen cualquiera y todos de s antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y icamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es ubcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, dministración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, r con un material para proteger el compuesto de la acción nactivar el compuesto.

sente documento pueden incluir una o más sales aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad ingún efecto toxicológico indeseado (véase, p. ej., Berge, dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales n las procedentes de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales ico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, s alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición s, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, '-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, Las composiciones farmacéuticas descritas en el pre

farmacéuticamente aceptable. Como ejemplos de anti

antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico,

sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes lip

butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina,

quelantes metálicos, tales como ácido cítrico, ácido etile

fosfórico y similares.

Los ejemplos de vehículo acuosos y no acuosos a

farmacéuticas descritas en el presente documento incluy

polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mi

orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluid

uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, m

en caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactiv

Estas composiciones también pueden contener adyuvant

emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención

mediante procedimientos de esterilización, citados ant

antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clo

ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azú

Además, la absorción prolongada de la forma farmacéuti

agentes que retrasen la absorción, tales como monoeste

Los vehículo farmacéuticamente aceptables incluyen sol

para la preparación extemporánea de soluciones o dis

agentes para sustancias farmacéuticamente activas es co

agente o medio convencional sea incompatible con el co

farmacéuticas descritas en el presente documento. Una c

o puede carecer de conservante. Pueden incorporarse co

Normalmente, las composiciones terapéuticas deben s

almacenamiento. La composición se puede formular co

ordenada adecuada para una elevada concentración de

dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol

y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La flui

uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el m

de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. E

ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sor

absorción prolongada de las composiciones inyectable

absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatin

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse in

un disolvente adecuado con uno o una combinación d

necesario, seguido de esterilización por microfiltración.

compuesto activo en un vehículo estéril que contiene u

necesarios de los enumerados en el presente docume

soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos

(liofilización) que producen un polvo del principio activo

solución del mismo previamente esterilizada por filtración.

La cantidad de principio activo que se puede combin

farmacéutica variará dependiendo del sujeto que se va

de principio activo que se puede combinar con un mat

generalmente será la cantidad de la composición que pr

ciento, esta cantidad variará de aproximadamente el 0,01

del principio activo, preferentemente, de aproximadament

más preferentemente de aproximadamente el 1 por ciento

con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para propor

terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una sola

largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentars

la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso

farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la u

como se usa en el presente documento, se refiere a unida te documento también pueden incluir un antioxidante dantes farmacéuticamente aceptables se incluyen: (1) orhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de lubles, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol lato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes iaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido

uados que pueden emplearse en las composiciones agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, os, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el ante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario

tales como conservantes, agentes humectantes, agentes la presencia de microorganismos puede garantizarse ormente, y mediante la inclusión de diversos agentes utanol, fenol de ácido sórbico y similares. También puede res, cloruro de sodio y similares en las composiciones. inyectable se puede conseguir mediante la inclusión de to de aluminio y gelatina.

iones acuosas o dispersiones estériles y polvos estériles siones inyectables estériles. El uso de dichos medios y cido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier uesto activo, se contempla su uso en las composiciones posición farmacéutica puede comprender un conservante uestos activos complementarios en las composiciones.

estériles y estables en las condiciones de fabricación y una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura rmaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de or ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el tenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso uchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, por l o cloruro de sodio en la composición. Se puede lograr ncluyendo en la composición un agente que retarde la

rporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en los ingredientes enumerados anteriormente, según sea eralmente, las dispersiones se preparan incorporando el medio de dispersión básico y los restantes ingredientes En el caso de polvos estériles para la preparación de preparación son el secado al vacío y la criodesecación ás cualquier ingrediente adicional deseado a partir una

con un material vehículo para producir una sola forma atar y del modo de administración particular. La cantidad al vehículo para producir una sola forma farmacéutica, zca un efecto terapéutico. Generalmente, de un cien por r ciento a aproximadamente el noventa y nueve por ciento el 0,1 por ciento a aproximadamente el 70 por ciento, aún aproximadamente el 30 por ciento de principio activo junto

ar la respuesta óptima deseada (p. ej., una respuesta bolada, pueden administrarse varias dosis divididas a lo roporcionalmente según se indique por las exigencias de rmular las composiciones parenterales en una forma rmidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria, s físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que han de tratarse; cada unidad co

calculada para producir el efecto terapéutico deseado

especificación de las formas farmacéuticas unitarias desc

directamente de (a) las características únicas del compue

las limitaciones inherentes en la técnica de la composi

sensibilidad en individuos.

Para la administración del anticuerpo anti-OX40, la dosi aproximadamente entre 0,01 y 5 mg/kg, aproximadame

1 mg/kg, aproximadamente entre 0,1 y 0,5 g/kg, o entr

hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser

0,5 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3

de peso corporal o estar en el intervalo de 1-10 mg/kg.

algunas realizaciones, la dosis es de 0,25 mg/kg. En otr

tratamiento ilustrativo implica la administración una vez

semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes,

regímenes de dosificación ilustrativos de los anticuerpos d

corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administr

posológicas para el anticuerpo que se está administrando

tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso

tres semanas.

En determinadas realizaciones, para el tratamiento comb

1 o anti-CTLA-4, los anticuerpos se administran a una

anticuerpo anti-OX40 se administra a una dosis fija de apr

de aproximadamente 25 a aproximadamente 160 mg,

aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg, de

aproximadamente 40 a aproximadamente 160 mg, d

aproximadamente 80 a aproximadamente 320 mg, de

aproximadamente 160 a aproximadamente 320 mg. En u

dosis de 20 mg o de aproximadamente 20 mg. En otra re

de 40 mg o de aproximadamente 40 mg. En otra realiza

80 mg o de aproximadamente 80 mg. En otra realización,

o de aproximadamente 160 mg. En otra realización, el a

de aproximadamente 320 mg.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 se ad

por ejemplo, la dosificación del agente inmunooncológic

360 mg o de aproximadamente 360 mg o de 480 mg o d

la dosis del anticuerpo anti-PD1 varía entre aproximadam

5 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Por ejemplo

aproximadamente 0,3 mg/kg de peso corporal, de 1 mg/k

corporal, de 3 mg/kg de peso corporal o de aproximadam

o aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal o de 10

peso corporal, o pueden estar en el intervalo de 1-10 m

PD-1 es de 240 mg o de aproximadamente 240 mg ad

puede ajustar proporcionalmente (a 120 mg por semana

administrados una vez cada 3 semanas (C3S) o 480 mg

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 se

aproximadamente 10 mg/kg. Por ejemplo, las dosis pu

3 mg/kg o de aproximadamente 3 mg/kg, del peso corpor

Más adelante, en el apartado titulado "Usos y Métodos",

el tratamiento combinado con un anticuerpo anti-OX40 y

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 60 mi

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1

duración de infusión de aproximadamente 15 minu

aproximadamente 30 minutos, cuando se administra a

realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 se administra a un

45 minutos a 75 minutos, por ejemplo, de aproximada

10 mg/kg.

ne una cantidad predeterminada de compuesto activo asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La s en el presente documento viene dictada por y depende activo y el efecto terapéutico particular a conseguir, y (b) n de dicho compuesto activo para el tratamiento de la

ción varía entre aproximadamente 0,0001 y 100mg/kg, entre 0,01 y 10mg/kg, aproximadamente entre 0,1 y proximadamente 0,5 y 0,8 mg/kg del peso corporal del 0,2 mg/kg de peso corporal, 0,3 mg/kg de peso corporal, kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg determinadas realizaciones, la dosis es de 0,2 mg/kg. En realizaciones, la dosis es de 0,5 mg/kg. Un régimen de semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres na vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los critos en el presente documento incluyen 1 mg/kg de peso ión intravenosa, utilizando una de las siguientes pautas i) cada cuatro semanas durante seis dosis, después cada poral una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada

do con un anticuerpo anti-OX40 y un anticuerpo anti-PD-osis fija. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el imadamente 25 a aproximadamente 320 mg, por ejemplo, aproximadamente 25 a aproximadamente 80 mg, de proximadamente 40 a aproximadamente 320 mg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 mg, de proximadamente 30 a aproximadamente 160 mg o de realización, el anticuerpo anti-OX40 se administra a una ación, el anticuerpo anti-OX40 se administra a una dosis n, el anticuerpo anti-OX40 se administra a una dosis de anticuerpo anti-OX40 se administra a una dosis de 160 mg uerpo anti-OX40 se administra a una dosis de 320 mg o

istra a una dosis fija de aproximadamente 100 a 300 mg, uede ser de 240 mg o de aproximadamente 240 mg, de proximadamente 480 mg. En determinadas realizaciones, te 0,0001 y 100 mg/kg, y más habitualmente entre 0,01 y s dosis pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal o de e peso corporal o de aproximadamente 1 mg/kg de peso te 3 mg/kg de peso corporal, de 5 mg/kg de peso corporal g de peso corporal o de aproximadamente 10 mg/kg de g. En algunas realizaciones, la dosis del anticuerpo antiistrados una vez cada 2 semanas (C2S). Esta dosis se urante períodos más largos o más cortos, p. ej., 360 mg inistrados una vez cada 4 semanas (C4S).

ministra a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg a n ser de 1 mg/kg o de aproximadamente 1 mg/kg o de del hospedador.

proporcionan regímenes de dosificación ilustrativos para i-PD-1 o anti-CTLA-4.

administra a un paciente con una duración de infusión de s, por ejemplo, de aproximadamente 30 minutos.

. ej., nivolumab) se administra a un paciente con una a aproximadamente 60 minutos, por ejemplo, de na dosis de 3 mg/kg (0,1 mg/kg/min). En determinadas ciente con una duración de infusión de aproximadamente nte 60 minutos, cuando se administra a una dosis de En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CTL

duración de infusión de aproximadamente 15 minutos

cuando se administra a una dosis de 3 mg/kg. En determ

a un paciente con una duración de infusión de apro

90 minutos, cuando se administra a una dosis de 10 mg

En determinadas realizaciones, cuando se administra el

el anticuerpo anti-PD-1 o anti-CTLA-4. En determina

anticuerpo anti-OX40 se administra después del anticue

cuando se administra el mismo día, el anticuerpo anti-O

1 o anti-CTLA-4.

En determinadas realizaciones, cuando se administ

aproximadamente de 15 a 45 minutos (p. ej., aproximad

CTLA-4. En determinadas realizaciones, cuando se ad

aproximadamente de 15 a 45 minutos (p. ej., aproximad

CTLA-4.

Como alternativa, los anticuerpos anti-OX40 proporcion

dosis constante (régimen de dosis constante).

En algunos casos, se administran simultáneament

especificidades de unión, de manera que la dosis de

anteriores. Además, los anticuerpos generalmente se a

individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente,

también pueden ser irregulares, según se indique midi

diana en el paciente. En algunos métodos, la dosis se aj

de aproximadamente 1-1000 pg/ml y en algunos métod

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente doc

posológica del otro anticuerpo. Por ejemplo, el anticuer

1, tal como nivolumab (OPDIVO), cada dos semanas co

progresión de la enfermedad o toxicidad inaceptable. C

con pembrolizumab (KEYTRUDA) cada 3 semanas com

progresión de la enfermedad o toxicidad inaceptable.

Los anticuerpos pueden administrarse como una formul

administración menos frecuente. La dosificación y la fre

el paciente. En general, los anticuerpos humanos

humanizados, los anticuerpos quiméricos y los anti

administración pueden variar dependiendo de si el

profilácticas, se administra una dosificación relativame

periodo de tiempo prolongado. Algunos pacientes conti

aplicaciones terapéuticas, en ocasiones se requiere u

hasta que se reduzca o finalice el avance de la enferm

mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfer

régimen profiláctico.

Los niveles reales de dosificación de los principios activo

documento pueden modificarse para obtener una can

respuesta terapéutica deseada para un paciente, una c

sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificació

farmacocinéticos entre los que se incluyen la actividad

presente documento, o del éster, la sal o la amida d

administración, la tasa de excreción del compuesto pa

otros fármacos, compuestos y/o materiales usados junt

sexo, el peso, la afección, la salud general y los anteced

factores similares bien conocidos en las técnicas médic

"Dosis terapéuticamente eficaces" de los anticuerpos

preferentemente una disminución de la gravedad de lo

duración de los períodos sin síntomas de la enfermeda

sufrimiento de la enfermedad. En el contexto del cán

preferentemente una mayor supervivencia y/o prevenció

el cáncer. En la técnica se conocen bien los síntomas de

un cambio en el aspecto de un lunar, incluyendo su asi p. ej., ipilimumab) se administra a un paciente con una minutos, por ejemplo, de aproximadamente 30 minutos as realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 se administra damente 15 minutos a 120 minutos, por ejemplo, de

mo día, el anticuerpo anti-OX40 se administra antes que realizaciones, cuando se administra el mismo día, el anti-PD-1 o anti-CTLA-4. En determinadas realizaciones, e administra simultáneamente con el anticuerpo anti-PD-

l mismo día, el anticuerpo anti-OX40 se administra nte 30 minutos) antes que el anticuerpo anti-PD-1 o antitra el mismo día, el anticuerpo anti-OX40 se administra nte 30 minutos) después del anticuerpo anti-PD-1 o anti-

en el presente documento pueden administrarse a una

s o más anticuerpos monoclonales con diferentes anticuerpo administrado esté dentro de los intervalos istran en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis sualmente, cada tres meses o anuales. Los intervalos los niveles sanguíneos de anticuerpo para el antígeno para lograr una concentración de anticuerpos en plasma aproximadamente 25-300 pg/ml.

nto pueden administrarse con otro anticuerpo a la pauta ti-OX40 puede administrarse con un anticuerpo anti-PD-na infusión i.v. durante 60 minutos hasta que se produzca alternativa, el anticuerpo anti-OX40 puede administrarse a infusión i.v. durante 30 minutos hasta que se produzca

n de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una cia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en tran la mayor semivida, seguidos de los anticuerpos os no humanos. La dosificación y la frecuencia de miento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En osis relativamente alta a intervalos relativamente cortos , y preferentemente, hasta que el paciente muestre una d. En lo sucesivo, al paciente se le puede administrar un

las composiciones farmacéuticas descritas en el presente del principio activo que sea eficaz para conseguir la sición y un modo de administración particulares, sin que leccionado dependerá de una diversidad de factores s composiciones particulares descritas empleadas en el s mismas, la vía de administración, el momento de la lar que se esté empleando, la duración del tratamiento, n las composiciones particulares empleadas, la edad, el s médicos previos del paciente que se está tratando y de

critos en el presente documento dan como resultado tomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y una prevención del deterioro o discapacidad debidos al una dosis terapéuticamente eficaz da como resultado un mayor deterioro de los síntomas físicos asociados con cer e incluyen, por ejemplo, rasgos inusuales en lunares, , márgenes, color y/o diámetro, una zona cutánea recién pigmentada, un lunar anómalo, una zona oscurecida baj

mamarios, dolor mamario, muerte, pérdida de peso, debil

apetito, tos crónica, empeoramiento de la disnea, hem

vómitos, metástasis hepática, metástasis pulmonar, met

cavidad peritoneal, sangrado vaginal, estreñimiento, dis

(infección, fiebre, dolor), dolor, vómitos con sangre, sudo

ictericia, mareo, escalofríos, espasmos musculares, met

vejiga, metástasis hepática, metástasis ósea, metástasis r

Una dosis terapéuticamente eficaz puede evitar o retrasa

se presenten signos tempranos o preliminares de la

diagnóstico del cáncer incluyen análisis químicos (incluida

y radiología. Por consiguiente, cualquier ensayo clínico

utilizarse para determinar si un tratamiento concreto es

experto en la materia debe ser capaz de determinar dich

del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la co

Los anticuerpos y las composiciones que se describen e

una o más vías de administración utilizando uno o más

apreciará el experto en la materia, la vía y/o el modo

deseados. Las vías de administración preferidas para los

intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitone

parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión. L

presente documento, significa modos de administraci

normalmente, mediante inyección, e incluyen, sin limi

intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica,

intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, e

Como alternativa, el anticuerpo puede administrarse por

tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, por vía intrana

Los compuestos activos pueden prepararse con vehículo

tal como una formulación de liberación controlada, in

suministro microencapsulados. Pueden utilizarse políme

etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno,

preparación de dichas formulaciones están patentados o

Véase, p. ej., Sustained and Controlled Release Drug

Nueva York, 1978.

Las composiciones de anticuerpos pueden administrar

ejemplo, en una realización, la composición se administr

como los dispositivos desvelados en las patentes de Es

4941880; 4790824; o 4.596.556. Como ejemplos de impl

de anticuerpos se incluyen: los de la patente de Est

microinfusión implantable para dispensar un medicament

Unidos n.° 4.486.194, que desvela un dispositivo terapéuti

la patente de Estados Unidos n.° 4.447.233, que divulga

medicamento a una velocidad de infusión precisa; los de

aparato de infusión implantable de flujo variable para e

Estados Unidos n.° 4.439.196, que desvela un sistema de

multicámara; y los del documento de patente de Estados

osmótico de fármacos. Muchos otros de estos implantes

expertos en la materia.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-OX40

in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE

garantizar que los anticuerpos a traviesen la BHE (si

formularse, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos

Estados Unidos 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los

transportan selectivamente al interior de células u órga

dirigidos (véase, p. ej., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharm

se incluyen folato o biotina (véase, p. ej., la patente de Est

et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1

357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Che

et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier

Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FE^b S Lett. 346:123; J.

as uñas, bultos mamarios, cambios en el pezón, quistes d, cansancio excesivo, dificultad para comer, pérdida de isis, sangre en la orina, sangre en las heces, náuseas, asis ósea, llenado abdominal, meteorismo, líquido en la sión abdominal, perforación del colon, peritonitis aguda ión intensa, fiebre, hipertensión arterial, anemia, diarrea, tasis en el colon, metástasis pulmonar, metástasis en la al y metástasis pancreática, dificultad al tragar, y similares.

aparición del cáncer, lo cual puede ser deseable cuando fermedad. Las pruebas de laboratorio utilizadas en el medición de los niveles de OX40), hematología, serología bioquímico que controle cualquiera de lo anterior puede dosis terapéuticamente eficaz para tratar el cáncer. Un cantidades basándose en factores tales como el tamaño osición o vía de administración particular seleccionada.

l presente documento pueden administrarse a través de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como administración variarán dependiendo de los resultados ticuerpos descritos en el presente documento incluyen la subcutánea, espinal u otras vías de administración xpresión "administración parenteral", como se usa en el distintos a los de la administración enteral y tópica, ión, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, traperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, ural e intraesternal e infusión.

a vía no parenteral, tal como una vía de administración l, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

ue protegerán al compuesto frente a la liberación rápida, endo implantes, parches transdérmicos y sistemas de biocompatibles, biodegradables, tales como acetato de liortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la n generalmente conocidos por los expertos en la materia. ivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc.,

con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por on un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal os Unidos n.° 5.399.163; 5.383.851; 5312335; 5064413; tes y módulos famosos para su uso en la administración os Unidos n.° 4.487.603, que desvela una bomba de a una velocidad controlada; los de la patente de Estados para administrar medicamentos a través de la piel; los de bomba de infusión de medicamentos para suministrar un patente de Estados Unidos n.° 4.447.224, que divulga un uministro continuado de fármacos; los de la patente de ministro osmótico de fármacos que tiene compartimentos idos n.° 4.475.196, que desvela un sistema de suministro istemas de suministro y módulos son conocidos por los

tán formulados para garantizar una distribución adecuada xcluye muchos compuestos sumamente hidrófilos. Para desea, p. ej., para cánceres cerebrales), estos pueden fabricación de liposomas, véanse, p. ej., las patentes de osomas pueden comprender uno o más residuos que se s específicos, mejorando así el suministro de fármacos l. 29:685). Como residuos de direccionamiento ilustrativos os Unidos 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa ); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. her. 39:180); receptor de proteína tensioactiva A (Briscoe al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véase también K. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

XVI. Usos y Métodos

Los anticuerpos anti-OX40 y las composiciones que se

aplicaciones in vitro e in vivo que implican, por ejemplo, una

de la señalización de OX40 o la detección de OX40. En

humanos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-OX40 descrit

con células en cultivo, in vitro o ex vivo, o administrarse a

en una diversidad de enfermedades. Por consiguiente, e

para su uso en métodos para modificar una respuesta inm

un anticuerpo, o una parte de unión a antígeno del mis

modifique la respuesta inmunitaria en el sujeto. Preferen

positivamente.

Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos en los

Los métodos son particularmente adecuados para el trata

puede tratarse aumentando una respuesta inmunitaria (p.

una respuesta de células T específica de antígeno). En un

métodos para el tratamiento del cáncer in vivo. Para logr

anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente document

el antígeno puede estar ya presente en el sujeto a tratar (p

los anticuerpos anti-OX40 se administran junto con otr simultáneamente.

También se incluyen métodos para detectar la presencia d

cantidad de antígeno OX40 humano, que comprenden p

anticuerpos anti-OX40 (o partes de unión a antígeno

condiciones que permitan la formación de un complejo ent

la formación de un complejo, en donde una formación de

muestra control es indicativa de la presencia de antígeno

descritos en el presente documento pueden utilizarse

inmunoafinidad.

Dada la capacidad de los anticuerpos anti-OX40 descritos

respuestas de las células T, p. ej., respuestas de células T

se proporcionan métodos de uso in vitro e in vivo de los

respuestas de células T específicas de antígeno, p. ej.,

realizaciones, también se incluye la estimulación de CD3

CD3 de membrana), pudiendo proporcionarse la estimula

con un anticuerpo anti-OX40. En una realización, el métod

anti-OX40 descrito en el presente documento, y opcionalm

una respuesta de células T específica de antígeno. Pued

de células T específica de antígeno para medir la respues

limitativos de dichos indicadores adecuados se incluye

anticuerpo y/o una mayor producción de citocinas en p

estimula la producción de interleucina-2 y/o interferón-y po

Las células T que pueden potenciarse o coestimularse co

T CD8+. Las células T pueden ser células Tef, p. ej., cél

células T citotóxicas (Tc).

También se proporcionan anticuerpos para su uso en mé

una respuesta de célula T específica de antígeno) en un

terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-OX40 desc

en el sujeto una respuesta inmunitaria (p. ej., una respue

preferida, el sujeto es un sujeto portador de un tumor y

tumor puede ser un tumor sólido o un tumor líquido, p

realizaciones, un tumor es un tumor inmunogénico. En det

determinadas realizaciones, un tumor es positivo a PD-realizaciones, un tumor es negativo a PD-L1. Un sujeto ta

una respuesta inmunitaria contra el virus.

Además se proporcionan los anticuerpos para su uso en

un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una can

descrito en el presente documento de manera que se i

proporcionan los anticuerpos para su uso en métodos par scriben en el presente documento, tienen numerosas ejora de la respuesta inmunitaria a través de la activación a realización preferida, los anticuerpos son anticuerpos en el presente documento pueden ponerse en contacto jetos humanos, p. ej., in vivo, para mejorar la inmunidad l presente documento se proporcionan los anticuerpos itaria en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto descrito en el presente documento de manera que se ente, la respuesta se mejora, se estimula o se regula

sería deseable la mejora de una respuesta inmunitaria. ento de pacientes humanos que tienen un trastorno que una respuesta inmunitaria mediada por células T, p. ej., ealización particular, los anticuerpos son para su uso en una mejora de la inmunidad específica de antígeno, los ueden administrarse junto con un antígeno de interés o j., un sujeto portador de un tumor o de un virus). Cuando gente, los dos pueden administrarse por separado o

antígeno OX40 humano en una muestra, o para medir la r en contacto la muestra y una muestra de control, con los mismos) descritos en el presente documento, en el anticuerpo y OX40 humana. A continuación se detecta plejo diferente entre la muestra en comparación con la X40 humano en la muestra. Los anticuerpos anti-OX40 a purificar la OX40 humana mediante purificación por

el presente documento para estimular o coestimular las pecíficas de antígeno, en el presente documento también nticuerpos para estimular, mejorar o regular al alza las spuestas de células T antitumorales. En determinadas ej., mediante coincubación con una célula que expresa n al mismo tiempo, antes o después de la estimulación omprende poner en contacto células T con un anticuerpo e con un anticuerpo anti-CD3, de manera que se estimula tilizarse cualquier indicador adecuado de una respuesta de células T específica de antígeno. Como ejemplos no na mayor proliferación de células T en presencia del encia del anticuerpo. En una realización preferida, se arte de la célula T específica de antígeno.

nticuerpos anti-OX40 incluyen células T CD4+ y células s Tef ^c D4+, células Tef CD8+, células T auxiliares (Th) y

os de estimulación de una respuesta inmunitaria (p. ej., jeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad en el presente documento de manera que se estimula de célula T específica de antígeno). En una realización estimula una respuesta inmunitaria contra el tumor. Un j., una neoplasia maligna hemática. En determinadas inadas realizaciones, un tumor es no inmunogénico. En ((ligando 1 de muerte programada). En determinadas ién puede ser un sujeto portador de virus y se estimula

todos para inhibir el crecimiento de células tumorales en ad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-OX40 iba el crecimiento del tumor en el sujeto. También se ratar una infección vírica en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto un anticuerpo anti-OX40 descrito en

vírica en el sujeto.

En el presente documento también se incluyen los anticu

el agotamiento de células Treg del microambiente tumoral

que comprenden administrar al sujeto una cantidad terap

el presente documento que comprende una Fc que es

tumoral. Una Fc puede ser, p. ej., una Fc con función efec

mejorada a uno o más receptores de Fc activadores. En

produce sin agotamiento o inhibición significativo de cél

inhibición significativo de células Tef y Treg fuera del mic

realizaciones, el sujeto tiene niveles más altos de OX40

tumoral.

En determinadas realizaciones, el sujeto se trata con

agonismo, p. ej., que se une a o que tiene unión mejor

causar el agotamiento de células Treg en tumores y/o de

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

tratamientos de sujetos con cáncer con el anticuerpo anti

respuesta duradera a largo plazo en relación con el trat

3 meses, 6 meses, 9 meses, 1, 2, 3, 4, 5, 10 o más años,

9 meses, 1, 2, 3, 4, 5 o 10 o más años. En determinadas

con el anticuerpo anti-OX40 impide la recidiva del cánc

9 meses, 1, 2, 3, 4, 5 o 10 o más años. El tratamiento c

de primera, segunda o tercera línea.

En realizaciones preferidas, el anticuerpo anti-OX40 no e

significativamente tóxico para un órgano de un ser huma

corazón, como se determina, p. ej., en ensayos clínicos. E

significativamente una respuesta inmunitaria no deseable

En determinadas realizaciones, el tratamiento de u

sobreestimulación del sistema inmunitario hasta el punt

sujeto (p. ej., respuesta autoinmunitaria) o produce, p. ej

provocan anafilaxia.

En determinadas realizaciones, el tratamiento de un s

inflamatorias significativas, p. ej., neumonitis inmunom

nefritis inmunomediada o disfunción renal, hipofi

inmunomediados u otras reacciones adversas inmunome

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

terapia contra el cáncer, tal como un compuesto

inmunooncológico), p. ej., un compuesto descrito en el p

descrita en el presente documento.

Estos y otros métodos descritos en el presente document

Cáncer

La activación de OX40 mediante anticuerpos anti-OX40

cancerosas en el paciente. Por consiguiente, en el prese

en métodos de tratamiento de un sujeto con cáncer, qu

descrito en el presente documento, de tal forma que se t

crecimiento de tumores cancerosos y/o que los tumore

anticuerpo anti-OX40 puede utilizarse en solitario para inh

el anticuerpo anti-OX40 puede utilizarse junto con otro

estándar contra el cáncer, u otro anticuerpo, como se de

Por consiguiente, en el presente documento se proporcio

del cáncer, p. ej., inhibiendo el crecimiento de células tu

una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo

puede ser un anticuerpo humano. Adicionalmente o como

o humanizado.

presente documento de manera que se trate la infección

os reivindicados para su uso en métodos que ocasionan un sujeto que tiene un tumor, p. ej., un tumor canceroso, ticamente eficaz de un anticuerpo anti-OX40 descrito en ula el agotamiento de células Treg en el microambiente a o función efectora mejorada, tal como la unión o la unión a realización preferida, el agotamiento de células Treg se s Tef en el microambiente tumoral, y sin agotamiento o mbiente tumoral, p. ej., en la periferia. En determinadas células Treg que en células Tef, p. ej., en el microambiente

anticuerpo anti-OX40 que tiene una Fc que potencia el al FcRIIb inhibidor. Los anticuerpos anti-OX40 pueden lulas Treg en linfocitos infiltrantes de tumor (LIT).

administra a un sujeto como terapia complementaria. Los X40, pueden conducir a supervivencia prolongada, p. ej., iento de referencia; supervivencia duradera de al menos upervivencia sin recidiva de al menos 3 meses, 6 meses, alizaciones, el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer o retrasa su recidiva p. ej., al menos 3 meses, 6 meses, anticuerpos anti-OX40 puede utilizarse como tratamiento

ignificativamente tóxico. Por ejemplo, el anticuerpo no es p. ej., uno o más del hígado, riñón, cerebro, pulmones y eterminadas realizaciones, el anticuerpo no desencadena . ej., autoinmunidad o inflamación.

sujeto con el anticuerpo anti-OX40 no produce una e que el sistema inmunitario del sujeto ataque al propio nafilaxia. Por tanto, preferentemente, los anticuerpos no

to con el anticuerpo anti-OX40 no provoca reacciones iada, colitis inmunomediada, hepatitis inmunomediada, s inmunomediada, hipotiroidismo e hipertiroidismo das.

porciona efectos antitumorales sinérgicos junto con otra estimula el sistema inmunitario (p. ej., un agente ente documento o un compuesto que modula una diana

e tratan más adelante con más detalle.

bién puede mejorar la respuesta inmunitaria en células documento se proporcionan los anticuerpos para su uso omprenden administrar al sujeto el anticuerpo anti-OX40 e al sujeto, p. ej., de tal forma que se inhiba o reduzca el remitan y/o que se logre prolongar la supervivencia. El r el crecimiento de tumores cancerosos. Como alternativa, gente, p. ej., otro agente inmunogénico, un tratamiento be a continuación.

n los anticuerpos para su uso en métodos de tratamiento ales, en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto i-OX40 descrito en el presente documento. El anticuerpo ternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico En el presente documento también se proporcionan los a

administración de un anticuerpo anti-OX40 y de un antic

tumores (p. ej., tumores sólidos avanzados).

En determinadas realizaciones, en el presente document

de tratamiento de un cáncer en donde se administra un a

4 a un paciente con un tumor (p. ej., un tumor sólido avan

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

anti-PD-1 es BMS-936558 (nivolumab). En determinad

(Yervoy®). En determinadas realizaciones, las pautas p

óptima deseada (p. ej., una respuesta eficaz).

Como se usa en el presente documento, la administració

administración simultánea de los compuestos en la mism

separado de los compuestos (p. ej., administración secu

anticuerpo anti-CTLA-4 pueden administrarse simultán

anticuerpo anti-OX40 y anti-PD-1 o el anticuerpo anti-CT

se administran simultánea o secuencialmente (p. ej., un a

de la administración del segundo anticuerpo).

Por ejemplo, el anticuerpo anti-PD1 o el anticuerpo a

inmediatamente seguido) de la administración del anticu

el anticuerpo anti-PD-1 o el anticuerpo anti-CTLA-4 se ad

En otra realización, el anticuerpo anti-PD-1 o el anticuer

del anticuerpo anti-OX40. En otra realización, el anticuer

CTLA-4 se administran simultáneamente. Dicha administ

ambos anticuerpos estén presentes simultáneamente en

Cánceres cuyo crecimiento puede inhibirse con anticuerp

un anticuerpo anti-PD-1 o anti-CTLA-4, incluyen cáncere

normalmente no responden a la inmunoterapia. Los cánc

malignas sanguíneas (tumores líquidos). Como ejemplo

carcinoma epidermoide, cáncer de pulmón microcítico,

microcítico (CPNM) epidermoide, CPNM no epidermoi

carcinoma de células claras), cáncer ovárico, cáncer de

riñón (p. ej., carcinoma de células renales (CRR)), cánce

a hormonas), cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer

cervicouterino, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, h

carcinoma) de cabeza y cuello, cáncer gástrico, tumor d

de linfocitos citolíticos naturales, melanoma (p. ej., mel

cutáneo o intraocular), cáncer de hueso, cáncer de piel,

carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endo

carcinoma de la vulva, cáncer del esófago, cáncer del in

glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal,

pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer del uréter, c

central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tu

tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kap

células T, cánceres inducidos por el medio ambiente inclu

virus o cánceres de origen vírico (p. ej., virus del papiloma

del mismo)) y neoplasias malignas hemáticas proceden

sanguíneas, es decir, la línea celular mieloide (que pr

mastocitos) o la línea celular linfoide (que produce linfoci

de leucemias, linfomas, y mielomas, p. ej., leucemias a

aguda (LA), leucemia mielógena aguda (^l M^a ), leucemia li

LMA indiferenciada (M0), leucemia mieloblástica (M1), le

promielocítica (M3 o variante de M3 [M3V]), leucemia mi

leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leucemi

cloroma; linfomas, tales como linfoma de Hodgkin (LH),

linfocitos B, p. ej., linfomas de linfocitos B, linfomas de c

linfocitos B, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa (

linfoma/leucemia de células T en adultos, linfoma de cé

linfoma angiocéntrico, linfoma intestinal de células T, linf

de células T precursoras, linfoma linfoblástico de células

células T, linfoma linfoblástico, trastorno linfoproliferativo d

primario del sistema nervioso central, linfoma de derram

tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, leucemia linfo uerpos para su uso en combiterapias que comprenden la po anti-PD-1 o anti-CTLA-4 para tratar sujetos que tienen

se proporcionan los anticuerpos para su uso en métodos cuerpo anti-OX40 y un anticuerpo anti-PD-1 o anti-CTLA-do) de acuerdo con una pauta posológica clínica definida. OX40.21. En determinadas realizaciones, el anticuerpo realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 es ipilimumab ológicas se ajustan para que proporcionen la respuesta

omplementaria o combinada (coadministración) incluye la en diferente, forma farmacéutica, o la administración por cial). Por tanto, el anticuerpo anti-OX40 y anti-PD-1 o el mente en una sola formulación. Como alternativa, el 4 pueden formularse para administración por separado y cuerpo se administra aproximadamente 30 minutos antes

CTLA-4 puede administrarse primero y seguido (p. ej., o anti-OX40, o viceversa. En determinadas realizaciones, istra antes de la administración del anticuerpo anti-OX40. anti-CTLA-4 se administra después de la administración anti-OX40 y el anticuerpo anti-PD-1 o el anticuerpo antiión simultánea o secuencial hace que, preferentemente, pacientes tratados.

anti-OX40, o combiterapia con un anticuerpo anti-OX40 y ue normalmente responden a la inmunoterapia y los que s pueden ser cánceres con tumores sólidos o neoplasias o limitativos de cánceres para el tratamiento se incluyen áncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón no , glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal (p. ej., ado, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de e próstata (p. ej., adenocarcinoma de próstata refractario páncreas, glioblastoma (glioblastoma multiforme), cáncer toma, cáncer de mama, carcinoma de colon y cáncer (o lulas germinales, sarcoma pediátrico, linfoma senonasal oma maligno metastásico, tal como melanoma maligno cer de útero, cáncer de la región anal, cáncer testicular, trio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, tino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la arcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del inoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso ral, tumor del eje espinal, cáncer de cerebro, glioma del cáncer epidermoide, carcinoma epidermoide, linfoma de ndo los inducidos por amianto, cánceres relacionados con mano (tumores relacionados con el VPH o que se originan de cualquiera de los dos linajes principales de células uce granulocitos, eritrocitos, trombocitos, macrófagos y B, T, NK y células plasmáticas), tal como todos los tipos a, crónica, linfocítica y/o mielógena, tal como leucemia cítica crónica (LLC) y leucemia mielógena crónica (LMC), mia mieloblástica (M2; con maduración celular), leucemia monocítica (M4 o variante de M4 con eosinofilia [M4E]), egacarioblástica (M7), sarcoma granulocítico aislado y foma no Hodgkin (LNH), neoplasia maligna hemática de las T, linfoma linfoplasmocitoide, linfoma monocitoide de AM), linfoma anaplásico de células grandes (p. ej., Ki 1+), s del manto, linfoma angioinmunoblástico de células T, a mediastínico primario de células B, linfoma linfoblástico y linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL), linfoma periférico de pués del trasplante, linfoma histiocítico verdadero, linfoma rimario, linfoma de células B, linfoma linfoblástico (LLB), stica aguda, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linterna histiocítico difuso (

linfoblástico de células B precursoras, linfoma cutáneo d

síndrome de Sezary), y linfoma linfoplasmocitoide (LLP)

mieloma de IgG, mieloma de cadena ligera, mieloma n

indolente), plasmocitoma solitario, y mielomas múltiples, l

tumores hematopoyéticos del linaje mieloide, tumores rabdomioscarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumor

astrocitoma, schwanomas; tumores de origen mesen

osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, x

folicular de tiroides y teratocarcinoma, tumores hematop

y B, incluyendo, pero sin limitación, trastornos de célula

incluyendo del tipo microcítico y de células cerebrif

preferentemente del tipo de células T; linfoma hepatosp

(subtipos pleomórfico e inmunoblástico); linfoma angiocé

renal, cáncer rectal, cáncer de la glándula tiroides; linfom

cánceres. Los métodos descritos en el presente documen

metastáticos, cánceres irresecables y/o refractarios (p. e

un anticuerpo CTLA-4 o PD-1 bloqueante), y cánceres re

En determinadas realizaciones, el paciente en tratamien

anticuerpo anti-OX40 y anticuerpo anti-PD-1 o anti-CTL

realización, la paciente a tratar tiene cáncer cervicoute

colorrectal (CCR). En otra realización, el paciente a trata

o localmente avanzado irresecable). En otra realización,

metastásico o localmente avanzado irresecable).

En una realización, el paciente en tratamiento con el antic

OX40 y anticuerpo anti-PD-1 o anti-CTLA-4, tiene cánc

paciente a tratar padece carcinoma epidermoide de cab

tiene linfoma no Hodgkin de células B (LNH-B). En otr

realización, el paciente padece melanoma. En otra encar

grandes (LDCBG).

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

una respuesta inadecuada a un tratamiento anterior, p. ej

o pacientes que tienen un cáncer que es refractario o resi

refractario a un antagonista de la ruta de PD-1), o en d

ejemplo, sujetos que no respondan o que no respond

progresión de la enfermedad después del tratamiento, p.

la administración del anticuerpo anti-OX40 solo o junto c

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

(es decir, que no se han tratado con) un agente inmunoo

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

cirugía, radiación y quimioterapia). En otras realizaciones

de mantenimiento, p. ej., una terapia que pretende preve

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

cirugía o quimioterapia. Por ejemplo, puede administrase

existe un riesgo de que puedan presentarse micrometást

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

terapia inmunoestimulante. En otras realizaciones, el anti

inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos t

péptidos y moléculas de carbohidratos), células y

inmunoestimuladoras (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4

que pueden utilizarse se incluyen péptidos de antígeno

MAGE, Trp-2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales

con más detalle más adelante).

En seres humanos, se ha demostrado que algunos tu

disminuir el umbral de activación de las células T a travé

tumorales en el hospedador, permitiendo el tratamie

inmunogenicidad limitada.

), linfoma inmunoblástico de células grandes, linterna ulas T (LCCT) (también denominado micosis fungoide o acroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas, tal como cretor, mieloma latente (también denominado mieloma mia linfocítica crónica (LLC), linfoma de células pilosas; origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma y del sistema nervioso central y periférico, incluyendo atoso, incluyendo fibrosarcoma, rabdomioscaroma y erma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cáncer cos de linaje linfoide, por ejemplo, tumores de células T ales como leucemia prolinfocítica de células T (LPL-T), s; leucemia de linfocitos granulares grandes (LGG) o a/d T-LNH; linfoma de células T periférico/postímico (nasal) de células T; cáncer de cabeza o cuello, cáncer eloide agudo, así como cualquier combinación de dichos mbién pueden utilizarse para el tratamiento de cánceres nceres refractarios a inmunoterapia anterior, p. ej., con ntes.

on el anticuerpo anti-OX40, o con una combinación de tiene un tumor sólido avanzado. Por ejemplo, en una En otra realización, el paciente a tratar tiene cáncer e cáncer de vejiga (p. ej., cáncer de vejiga metastásico ciente a tratar tiene cáncer ovárico (p. ej., cáncer ovárico

o anti-OX40, o con una combinación de anticuerpo antipulmón no microcítico (CPNM). En otra realización, el cuello (CEcyc). En otra realización, el paciente a tratar lización, el paciente a tratar padece mieloma. En otra ón, el paciente a tratar tiene linfoma difuso de células B

dministra a pacientes que tienen un cáncer que mostró tratamiento anterior con un fármaco inmunooncológico, te, ya sea intrínsecamente refractario o resistente (p. ej., se adquiere el estado de resistencia o refractario. Por uficientemente a una primera terapia o que vean una un tratamiento con anti-PD-1, pueden tratarse mediante ra terapia (p. ej. ej., con una terapia anti-PD-1).

ministra a pacientes que no han recibido anteriormente gico, p. ej., un antagonista de la ruta de PD-1.

e administrarse con un tratamiento de referencia (p. ej., anticuerpo anti-OX40 puede administrarse como terapia aparición o recurrencia de tumores.

de administrarse con otro tratamiento, p. ej., radiación, pia complementaria con anticuerpos anti-OX40 cuando y/o para reducir el riesgo de una recidiva.

e administrarse como una monoterapia, o como la única po anti-OX40 también se puede combinar con un agente rales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, s transfectadas con genes que codifican citocinas 28). Como ejemplos no limitativos de vacunas tumorales melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos sfectadas para expresar la citocina GM-CSF (analizado

s, tales como los melanomas, son inmunogénicos. Al la inhibición de OX40, se pueden activar las respuestas de tumores no inmunogénicos o de los que tienen En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40 pued

ideado muchas estrategias experimentales de vacunació

of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60

300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Sprin

730-738; véase también Restifo, N. y Sznol, M., Cancer

1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, quin

tumorales autólogas o alogénicas se prepara una vacun

eficaces cuando las células tumorales se someten a tran

granulocitos y monocitos, GM-CSF (por sus siglas en ingl

de la presentación de antígenos para la vacunación contr

90: 3539-43).

El estudio de la expresión génica y los patrones de expre

a la definición de los denominados antígenos específicos

muchos casos, estos antígenos específicos de tumor son

la célula de la que se originó el tumor, por ejemplo, antíg

que es más importante, se puede demostrar que muchos

de tumor encontradas en el hospedador. La activación de

y/o péptidos recombinantes expresados en un tumor par

Normalmente, el sistema inmunitario considera a estas

antígeno tumoral puede incluir la proteína telomerasa,

cromosomas y que se expresa en más del 85 % de los

somáticos (Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013). L

expresados en las células cancerosas debido a mutacion

proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionada

de los tumores de células B.

Otras vacunas tumorales pueden incluir las proteínas de

del papiloma humano (VPH), virus de la hepatitis (VHB y

Otra forma de antígeno específico de tumor que puede uti

choque térmico (PCT) purificadas, aisladas del propio te

fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas

células presentadoras de antígeno para suscitar la inmu

1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120).

Las células dendríticas (CD) son fuertes células present

respuestas específicas de antígeno. Las CD pueden prod

peptídicos, así como con extractos de células tumorales

también pueden someterse a transducción por medios g

Las CD también se han fusionado directamente a célula

Nature Medicine 6:332-336). Como método de vacunaci

con la activación de OX40 para activar respuestas antitu

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente

quimioterapéuticos. En estos casos, puede ser posible r

(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Po

dacarbazina para tratar el melanoma. En otro ejempl

interleucina-2 (IL-2) para tratar el melanoma. El fundame

OX40 y quimioterapia es que la muerte celular, una c

compuestos quimioterapéuticos, debería dar lugar a may

de antígeno. Otras combiterapias que pueden dar como r

de la muerte celular son la radiación, la cirugía y privación

de antígeno tumoral en el hospedador. También pued

anticuerpo anti-OX40. La inhibición de la angiogénesis

introducir el antígeno tumoral en las vías de presentación

Los anticuerpos anti-OX40, descritos en el presente docu

que dirigen las células efectoras que expresan el receptor

de Estados Unidos n.° 5.922.845 y 5.837.243). Puede

antígenos distintos. Por ejemplo, se han utilizado anticue

(p. ej., Her-2/neu) para dirigir macrófagos a sitios de tumo

respuestas tumorales específicas. El grupo de células T

Como alternativa, el antígeno puede suministrarse direct

unen al antígeno tumoral y un marcador de superficie cel

Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del hospeda ilizarse junto con un protocolo de vacunación. Se han ntra tumores (véase Rosenberg, S., 2000, Development Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 14-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: cines, cap. 61, págs. 3023-3043 en DeVita et al. (eds.), dición). En una de estas estrategias, utilizando células e ha demostrado que estas vacunas celulares son más ción para expresar el factor estimulante de colonias de Se ha demostrado que el GM-CSF es un fuerte activador ores (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.

génica a gran escala en diversos tumores ha conducido tumor (Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7). En genos de diferenciación expresados en los tumores y en s de melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. Y lo estos antígenos son las dianas de células T específicas 40 puede utilizarse junto con una colección de proteínas nerar una respuesta inmunitaria contra estas proteínas. ínas como autoantígenos y, por lo tanto, las tolera. El se requiere para la síntesis de los telómeros de los eres humanos y solo en un número limitado de tejidos ntígenos tumorales también pueden ser "neoantígenos" omáticas que alteran la secuencia de la proteína o crean decir, bcr-abl en el cromosoma Filadelfia), o el idiotipo

s implicados en cánceres humanos tales como el virus ) y herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi (HVSK). rse junto con la activación de OX40 son las proteínas de tumoral. Estas proteínas de choque térmico contienen son sumamente eficientes en cuanto al suministro a las d tumoral (Suot y Srivastava (1995) Science 269:1585-

ras de antígeno que pueden utilizarse para sensibilizar e ex vivo y cargarse con diversos antígenos proteicos y stle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). Las CD icos para expresar también estos antígenos tumorales. orales con fines de inmunización (Kugler et al. (2000) a inmunización con CD puede combinarse eficazmente les más fuertes.

mento también se pueden combinar con regímenes cir la dosis administrada del reactivo quimioterapéutico mplo, el anticuerpo anti-OX40 puede utilizarse junto con l anticuerpo anti-OX40 puede utilizarse junto con la ientífico acerca del uso combinado de anticuerpos anticuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los niveles de antígeno tumoral en la ruta de presentación ado una sinergia con los anticuerpos anti-OX40 a través ormonas. Cada uno de estos protocolos crea una fuente utilizarse inhibidores de la angiogénesis junto con el duce a la muerte de células tumorales, lo que puede antígeno del hospedador.

to pueden utilizarse junto con anticuerpos biespecíficos o Fcy a las células tumorales (véanse, p. ej., las patentes ilizarse anticuerpos biespecíficos para dirigirse a dos biespecíficos anti-receptor de Fc/anti-antígeno tumoral ste direccionamiento puede activar más eficazmente las stas respuestas aumentaría con la activación de OX40. nte a las CD utilizando anticuerpos biespecíficos que se específico de células dendríticas.

través de una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la ina

inmunosupresoras. Estos incluyen entre otros el TGF-(Howard y O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-2

1365). Los anticuerpos para cada una de estas entida

contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y fa

hospedador.

Otros anticuerpos que activan la capacidad de respuest

anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente docume

dendríticas que activan la función CD y la presentació

sustituir eficazmente la actividad de las células T auxil

utilizarse junto con anticuerpos anti-OX40. Los anticuerp

T, tales como CTLA-4 (p. ej., los de la patente de Est

Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero et al. (1997) N

Nature 397: 262-266) también pueden proporcionar ma

PD1 o PD-L1 también pueden utilizarse junto con anticu

El trasplante de médula ósea se utiliza actualmente para

Mientras que la enfermedad del injerto contra huéspe

terapéutico puede obtenerse a partir de respuestas de

utilizarse para aumentar la eficacia de las células T espe

También hay varios protocolos de tratamiento experiment

T específicas de antígeno y la transferencia adoptiva

específicas de antígeno contra tumor (Greenberg y Ri

pueden utilizarse para activar las respuestas de las célula

ex vivo en presencia de anticuerpos anti-OX40 puede au

de manera adoptiva.

Enferm edades infecciosas

En el presente documento también se proporcionan los

pacientes que han estado expuestos a toxinas o a patóge

se proporcionan métodos para tratar una enfermedad in

los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente docu

sujeto.

Similar a su aplicación a los tumores como se ha indicad

en solitario, o como un adyuvante, junto con vacunas, par

y auto-antígenos. Los ejemplos de patógenos para los

incluyen patógenos para los que actualmente no existe

convencionales son menos que completamente eficaces.

gripe, herpes, giardia, paludismo, leishmania, Staphylo

anti-OX40 pueden ser útiles contra infecciones establec

alterados durante el curso de las infecciones. Estos nuev

la administración del anticuerpo anti-OX40, provocando

Algunos ejemplos de virus patógenos que causan infecc

presente documento incluyen VIH, hepatitis (A, B o C),

virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavi

respiratorio sincicial, virus de las paperas, rotavirus, v

variolovacunal, virus VLTH, virus del dengue, papilomavir

virus de la encefalitis arboviral.

Algunos ejemplos de bacterias patógenas que causan in

el presente documento incluyen bacterias de clamidi

neumonococos, meningococos y gonococos, klebsie

salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, carbunco,

Algunos ejemplos de hongos patógenos que causan infe

presente documento incluyen Candida (albicans, kru

Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), género Mucorales (

dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides i

Algunos ejemplos de parásitos patógenos que causan in

el presente documento incluyen Entamoeba histolytica, B ación de proteínas que expresan los tumores y que son Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 y el ligando Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363­ pueden utilizarse junto con anticuerpos anti-OX40 para recer las respuestas inmunitarias tumorales por parte del

munitaria del hospedador pueden utilizarse junto con los . Estos incluyen moléculas en la superficie de las células el antígeno. Los anticuerpos anti-CD40 son capaces de es (Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478) y pueden activadores contra moléculas coestimuladoras de células s Unidos n.° 5.811.097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) e Medicine 3: 682-685 (1997) e ICOS (Hutloff et al. (1999) es niveles de activación de células T. Los inhibidores de os anti-OX40.

tar una diversidad de tumores de origen hematopoyético. es una consecuencia de este tratamiento, el beneficio jerto frente a tumor. Los anticuerpos anti-OX40 pueden cas de tumor injertadas de donante.

s que implican la activación y expansión ex vivo de células estas células en receptores para estimular células T ll (1999) Science 285: 546-51). Estos métodos también contra agentes infecciosos tales como CMV. La activación tar la frecuencia y la actividad de las células T transferidas

cuerpos reivindicados para su uso en métodos para tratar s particulares. Por consiguiente, en el presente documento ciosa en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto nto, de manera que se trate la enfermedad infecciosa del

nteriormente, los anticuerpos anti-OX40 pueden utilizarse stimular la respuesta inmunitaria contra patógenos, toxinas este enfoque terapéutico puede ser particularmente útil, a vacuna eficaz, o patógenos para los que las vacunas stos incluyen, pero sin limitación, VIH, hepatitis (A, B y C), cus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Los anticuerpos s por agentes tales como VIH que presentan antígenos epítopos se reconocen como extraños en el momento de una fuerte respuesta de células T.

es que se pueden tratar con los métodos descritos en el s del herpes (p. ej., VVZ, HSV-1, HAV-6, HSV-II y CMV, s, echovirus, rinovirus, coxsackie virus, coronavirus, virus s del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus , virus del molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y

ciones que pueden tratarse con los métodos descritos en rickettsias, micobacterias, estafilococos, estreptococos, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, ste, leptospirosis y bacterias de la enfermedad de Lyme.

ones que pueden tratarse con los métodos descritos en el , glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, cor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces itis e Histoplasma capsulatum.

ciones que pueden tratarse con los métodos descritos en ntidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambía, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii,

Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma

En todos los métodos anteriores, los anticuerpos anti-O

tales como tratamiento con citocinas (p. ej., interferones,

que proporciona una presentación de antígenos tumoral

Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-

Reacciones auto inm unitarias

Los anticuerpos anti-OX40 pueden provocar y amplific

respuestas antitumorales utilizando células tumorale

antitumorales implican reactividades antiautorreactivas (

al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987; H

J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4).

con diversas proteínas propias para diseñar protocolos

inmunitarias contra estas proteínas propias para el trat

Alzheimer implica una acumulación inapropiada de pépt

de anticuerpos contra el amiloide son capaces de elimi

400: 173-177).

También pueden utilizarse otras proteínas propias como

y TNFc para la artritis reumatoide. Por último, utilizan

anticuerpos contra diversas hormonas. Para la anti

neutralizantes contra hormonas reproductivas. La respu

factores solubles que se requieren para el crecimiento

posibles dianas de vacunación.

Métodos análogos a los descritos anteriormente para

inducción de respuestas autoinmunitarias terapéuticas p

de otros autoantígenos, tales como depósitos amiloides,

como TNFa e IgE.

Vacunas

Los anticuerpos anti-OX40 reivindicados pueden utiliz

antígeno mediante la coadministración de los anticuer

consiguiente, en el presente documento se proporciona

mejorar una respuesta inmunitaria contra un antígeno

antígeno; y (ii) un anticuerpo anti-OX40 de modo que s

sujeto. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-OX40

humanos descritos en el presente documento). El antíge

vírico, un antígeno bacteriano o un antígeno de un pató

incluyen los indicados en los apartados anteriores, ta

indicados anteriormente, o antígenos de los virus, bacter

En la técnica se conocen bien vías adecuadas para adm

ej., anticuerpos monoclonales humanos, moléculas multi

el presente documento y los expertos en la materia

anticuerpo pueden administrarse mediante inyección (p.

moléculas utilizadas dependerán de la edad y el pes

composición de anticuerpo.

Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos

coadministrarse con uno u otros agentes terapéuticos, p

inmunosupresor. El anticuerpo puede unirse al agente (c

del agente. En el último caso (administración por sepa

simultáneamente con el agente o puede coadministrars

cáncer, p. ej., radiación. Dichos agentes terapéuticos

doxorrubicina (adriamicina), sulfato de cisplatino y bleomi

hidroxiurea que, por sí solos, son solamente eficaces

cisplatino se administra por vía intravenosa como un

adriamicina se administra por vía intravenosa como

coadministración de anticuerpos anti-OX40, o fragmento

documento, con agentes quimioterapéuticos, proporcio

diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxic odium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, i, Nippostrongylus brasiliensis.

pueden combinarse con otras formas de inmunoterapia SF, G-CSF, IL-2) o terapia de anticuerpos biespecíficos, mentada (véase, p. ej., Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. ).

spuestas autoinmunitarias. De hecho, la inducción de vacunas peptídicas revela que muchas respuestas lsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijk, et , (2000) anteriormente citado; Rosenberg y White (1996) tanto, los anticuerpos anti-OX40 pueden utilizarse junto vacunación para generar de manera eficaz respuestas nto de enfermedades. Por ejemplo, la enfermedad de p en depósitos amiloides en el cerebro; las respuestas stos depósitos amiloides (Schenk et al., (1999) Nature

as tales como IgE para el tratamiento de alergia y asma, nticuerpos anti-OX40 pueden inducirse respuestas de epción pueden utilizarse respuestas de anticuerpos de anticuerpos neutralizantes contra hormonas y otros mores particulares también pueden considerarse como

so de anticuerpos anti-OX40 pueden utilizarse para la atar a pacientes que tienen una acumulación inapropiada yendo Ap en la enfermedad de Alzheimer, citocinas tales

para estimular respuestas inmunitarias específicas de con un antígeno de interés (p. ej., una vacuna). Por anticuerpos reivindicados para su uso en métodos para un sujeto, que comprende administrar al sujeto: (i) el jore una respuesta inmunitaria contra el antígeno en el ano (tal como cualquiera de los anticuerpos anti-OX40 uede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno . Como ejemplos no limitativos de dichos antígenos se como los antígenos tumorales (o vacunas tumorales) otros patógenos descritos anteriormente.

ar in vivo e in vitro las composiciones de anticuerpos (p. cíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) descritas en en seleccionarlas. Por ejemplo, las composiciones de intravenosa o subcutánea). Las dosis adecuadas de las l sujeto y de la concentración y/o formulación de la

i-OX40 descritos en el presente documento pueden un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente un inmunocomplejo) o puede administrarse por separado ), el anticuerpo puede administrarse antes, después o n otras terapias conocidas, p. ej., una terapia contra el yen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como , carmustina, clorambucilo, dacarbacina y ciclofosfamida eles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El sis de 100 mg/ml una vez cada cuatro semanas y la dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente os agentes contra el cáncer que actúan a través de las células tumorales humanas. Dicha coadministración puede abordar problemas relacionados con el desarrol

antigenicidad de las células tumorales que las volverá no

En el presente documento también se proporcionan kits

anticuerpos anti-OX40 descritas en el presente documen

multiespecíficas, o inmunoconjugados) e instrucciones d

adicional, o uno o más anticuerpos humanos adicionales

humano que tiene una actividad complementaria que se

humano). Los kits suelen incluir una etiqueta que indica el

cualquier material escrito o grabado suministrado en o co

P rotocolos de tratam iento

Como protocolos adecuados, aunque no reivindicados, p

avanzado) en un paciente humano

se incluyen, por ejemplo, administrar al paciente una cant

dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de c

ID NO: 318, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de l

expuesta en el SEQ ID NO: 94, en donde el método compr

es un período de dos semanas (C2S), en donde para ca

menos una dosis del anticuerpo anti-OX40 a una dosis de

0 320 mg; una dosis de aproximadamente 1 mg/kg de pes

160 o 320 mg.

Otro protocolo adecuado para tratar un tumor sólido en

paciente una cantidad eficaz de cada uno de:

(a) un anticuerpo anti-OX40 que comprende los domi

pesada que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID

variable de cadena ligera que tiene la secuencia expu

(b) un anticuerpo anti-PD-1 que comprende los domin

pesada que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID

variable de cadena ligera que tiene la secuencia expu

en donde el método comprende al menos un ciclo de admi

en donde para cada uno de los al menos uno de los ciclos,

a una dosis de 1 mg/kg de peso corporal; una dosis fija d

1 mg/kg de peso corporal; o una dosis fija de aproximada

una dosis del anticuerpo anti-PD-1 a una dosis constante

240 mg. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1

fija de 360 mg, o una vez cada cuatro semanas (c4s) a un

Otro protocolo adecuado para tratar un tumor sólido en

paciente una cantidad eficaz de cada uno de:

(a) un anticuerpo anti-OX40 que comprende los domi

pesada que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID

variable de cadena ligera que tiene la secuencia expu

(b) un anticuerpo anti-CTLA-4 que comprende los dom

pesada que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID

variable de cadena ligera que tiene la secuencia expu

en donde el método comprende al menos un ciclo de admi

(c3s), en donde para cada uno de los al menos uno de l

anti-OX40 a una dosis de 1 mg/kg de peso corporal; u aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal; o una dosis

administra al menos una dosis del anticuerpo anti-CTLA-4

dosis constante de aproximadamente 1 mg/kg de peso

administra junto con el anticuerpo anti-CTLA-4 durante al

anti-OX40 durante al menos un ciclo. En determinadas re

ipilimumab durante los cuatro ciclos iniciales, seguido

posteriores.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40 y el ant de la resistencia a fármacos o con un cambio en la ctivas con el anticuerpo.

reivindicados que comprenden las composiciones de p. ej., anticuerpos humanos, moléculas biespecíficas o o. El kit puede contener además al menos un reactivo scritos en el presente documento (p. ej., un anticuerpo e a un epítopo en OX40 distinto del primer anticuerpo previsto del contenido del kit. El término etiqueta incluye kit, o que de otro modo acompaña al kit.

el tratamiento de un tumor sólido (p. ej., un tumor sólido

d eficaz de un anticuerpo anti-OX40 que comprenda los ena pesada que tiene la secuencia expuesta en el SEQ gión variable de cadena ligera que tiene la secuencia e al menos un ciclo de administración, en donde el ciclo uno de los al menos uno de los ciclos, se administra al g/kg de peso corporal; una dosis fija de 20, 40, 80, 160 orporal; o una dosis fija de aproximadamente 20, 40, 80,

paciente humano incluye, por ejemplo, administrar al

CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena : 318, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región en SEQ ID NO: 94, y

CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena : 301, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región en el SEQ ID NO: 302,

ración, en donde el ciclo es un período de dos semanas, administra al menos una dosis del anticuerpo anti-OX40 , 40, 80, 160 o 320 mg; una dosis de aproximadamente nte 20, 40, 80, 160 o 320 mg, y se administra al menos 240 mg o a una dosis constante de aproximadamente administra una vez cada tres semanas (c3s) a una dosis osis de 480 mg.

paciente humano incluye, por ejemplo, administrar al

CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena : 318, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región en SEQ ID NO: 94, y

s CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena : 309, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región en el SEQ ID NO: 310,

tración, en donde el ciclo es un período de tres semanas ciclos, se administra al menos una dosis del anticuerpo dosis fija de 20, 40, 80, 160 o 320 mg; una dosis de a de aproximadamente 20, 40, 80, 160 o 320 mg, y se na dosis constante de 1 mg/kg de peso corporal o a una poral. En una realización, el anticuerpo anti-OX40 se enos un ciclo, seguido de monoterapia con anticuerpos ciones, el anticuerpo anti-OX40 se administra junto con monoterapia con anticuerpos anti-OX40 para ciclos

rpo anti-PD-1 se administran a las siguientes dosis: (a) 1 mg/kg de anticuerpo anti-OX40 y 240 mg, 360 mg

(b) 20 mg de anticuerpo anti-OX40 y 240 mg, 360 mg o

(c) 40 mg de anticuerpo anti-OX40 y 240 mg, 360 mg o

(d) 80 mg de anticuerpo anti-OX40 y 240 mg, 360 mg o

(e) 160 mg de anticuerpo anti-OX40 y 240 mg, 360 mg

(f) 320 mg de anticuerpo anti-OX40 y 240 mg, 360 mg

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40 y el anti

(a) 1 mg/kg de anticuerpo anti-OX40 y 1 mg/kg de antic

(b) 20 mg de anticuerpo anti-OX40 y 1 mg/kg de anticu

(c) 40 mg de anticuerpo anti-OX40 y 1 mg/kg de anticu

(d) 80 mg de anticuerpo anti-OX40 y 1 mg/kg de anticu

(e) 160 mg de anticuerpo anti-OX40 y 1 mg/kg de antic

(f) 320 mg de anticuerpo anti-OX40 y 1 mg/kg de anticu

En una realización, la dosis del anticuerpo anti-OX40 y/o a

mg/kg de peso corporal. En otra realización, la dosis del

dosis constante-fija. En otra realización, la dosis del anticue

el tiempo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-OX40 y/o anti-P

dosis alta y puede reducirse con el tiempo. En otra realiza

se administra inicialmente a una dosis baja y se aumenta c

En otra realización, la cantidad del anticuerpo anti-OX40 y/

cada dosis. En otra realización, la cantidad de anticuerpo a

mantenimiento (o seguimiento) del anticuerpo puede ser m

En otra realización, la dosis de mantenimiento del anticuer

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40 y/o

intravenosa. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4, se administra el día 1 de cada ciclo.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40 y/o antivez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o

beneficio clínico o hasta que haya una respuesta co

inmanejable.

En una realización, un ciclo de administración es de dos se

realización, el ciclo es de tres semanas. En algunas realiza

realizaciones, el tratamiento consta de hasta 12 ciclos.

En una realización, se administra una dosis de cada uno

semanas. En otra realización, se administra una dosis de c

de tres semanas. En otra realización, se administra una d

por ciclo de cuatro semanas.

En una realización, se administra una dosis de cada uno d

semanas. En algunas realizaciones, se administra una do

4 por ciclo de tres semanas durante los cuatro primeros c

durante los ciclos quinto a octavo.

En otra realización, el anticuerpo anti-OX40 y el anticuerpo

línea de tratamiento (p. ej., el tratamiento inicial o primer tra

anticuerpo anti-PD-1 o anti-CTLA-4 se administran com

tratamiento inicial o primer tratamiento, incluso después

fracasado).

En otro aspecto, la invención presenta cualquiera de las r

PD-1 se reemplaza por, o se combina con, un anticuerpo a

En algunas realizaciones, el paciente humano tiene un

cervicouterino, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal y cánce

El anticuerpo anti-OX40 comprende regiones variables d

secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 318 y 94, resp

anti-OX40 comprende secuencias de cadena pesada y de 480 mg de anticuerpo anti-PD-1;

0 mg de anticuerpo anti-PD-1;

0 mg de anticuerpo anti-PD-1;

0 mg de anticuerpo anti-PD-1;

80 mg de anticuerpo anti-PD-1; o

80 mg de anticuerpo anti-PD-1.

rpo anti-CTLA-4 se administran a las siguientes dosis:

rpo anti-CTLA-4;

o anti-CTLA-4;

o anti-CTLA-4;

o anti-CTLA-4;

po anti-CTLA-4; o

o anti-CTLA-4.

PD-1 o anti-CTLA-4 se calcula por peso corporal, p. ej., ticuerpo anti-OX40 y/o anti-PD-1 o anti-CTLA-4 es una anti-OX40 y/o anti-PD-1 o anti-CTLA-4 se modifica con o anti-CTLA-4 puede administrarse inicialmente a una n, el anticuerpo anti-OX40 y/o anti-PD-1 o anti-CTLA-4 el tiempo.

nti-PD-1 o anti-CTLA-4 administrada es constante para inistrada varía con cada dosis. Por ejemplo, la dosis de r o igual que la dosis de carga que se administra primero. puede ser menor o igual que la dosis de carga.

i-PD-1 o anti-CTLA-4 se formula para administración 0 o el anticuerpo anti-OX40 y el anticuerpo anti-PD-1 o

1 o anti-CTLA-4 se administra una vez por semana, una vez cada cuatro semanas, o mientras se observe un leta, enfermedad progresiva confirmada o toxicidad

nas, que se puede repetir, según sea necesario. En otra nes, el tratamiento consta de hasta ocho ciclos. En otras

los anticuerpos anti-OX40 y anti-PD-1 por ciclo de dos uno de los anticuerpos anti-PD-1 y anti-OX40 por ciclo de cada uno de los anticuerpos anti-PD-1 y anti-OX40

s anticuerpos anti-OX40 y anti-CTLA-4 por ciclo de tres de cada uno de los anticuerpos anti-OX40 y anti-CTLA-s, seguido de monoterapia con anticuerpos anti-OX40

ti-PD-1 o anti-CTLA-4 se administran como una primera iento). En otra realización, el anticuerpo anti-OX40 y el na segunda línea de tratamiento (p. ej., después del una recidiva y/o cuando el primer tratamiento haya

zaciones ya mencionadas, en donde el anticuerpo anti--PD-L1 o un anticuerpo anti-PD-L2.

ncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer várico.

adena pesada y de cadena ligera que comprenden las vamente. En determinadas realizaciones, el anticuerpo dena ligera que comprenden las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 124 y 116, respectivamente.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1

CDR2 y CDR3 que comprende las secuencias expuesta

variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 que co

308, respectivamente. En determinadas realizaciones,

regiones variables de cadena pesada y de cadena liger

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1

ligera expuestas en las SEQ ID NO: 299 y 300, respecti

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA

CDR2 y CDR3 que comprende las secuencias expuesta

variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 que co

316, respectivamente. En determinadas realizaciones,

regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera

Resultados

Con respecto a las lesiones diana, las respuestas a la te omprende una región variable de cadena pesada CDR1, n las SEQ ID NO: 303-305, respectivamente, y una región rende las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 306 anticuerpo anti-PD-1 comprende las secuencias de las xpuestas en las SEQ ID NO: 301 y 302, respectivamente. mprende las secuencias de cadena pesada y de cadena ente.

comprende una región variable de cadena pesada CDR1, n las SEQ ID NO: 311-313, respectivamente, y una región rende las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 314 anticuerpo anti-CTLA-4 comprende las secuencias de las puestas en las SEQ ID NO: 309 y 310, respectivamente.

ia pueden incluir:

Con respecto a las lesiones no diana, las respuestas a la apia pueden incluir:

Los pacientes tratados de acuerdo con los métod

preferentemente, una mejora en al menos un signo de c

reducción de la cantidad y/o tamaño de las lesiones tumo

medirse en radiografías de tórax o en películas de TC

respuesta a una terapia puede utilizarse citología o histol

En una realización, el paciente tratado presenta una respu

estable (EE), respuesta completa inmunorelacionada (RCi

estable inmunorelacionada (EEir). En otra realización, el

y/o una disminución de la velocidad de crecimiento, es de

proliferación celular no deseada se reduce o se inhibe.

siguiente: se puede reducir el número de células cancero

células cancerosas en los órganos periféricos puede in

tumoral puede ralentizarse o inhibirse; el crecimiento

prevenirse o retrasarse; uno o más de los síntomas asoci

En otras realizaciones, la administración de cantidades e

o anti-CTLA-4 de acuerdo con cualquiera de los método

efecto terapéutico seleccionado del grupo que consiste en

de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo, remisión

realizaciones adicionales, los métodos de tratamiento pro

meses) comparable mejor que la que se logra con un antic

4 solo. En otras realizaciones, la mejora de la tasa de b

50 %, 60 %, 70 %, 80 % o más en comparación con un

CTLA-4 solo.

Com biterapias

Además de las combiterapias desveladas anteriorme

documento pueden utilizarse en combiterapia, como se d

Los métodos de combiterapia incluyen aquellos en los que

anti-OX40 y anticuerpos anti-PD-1 o anti-CTLA-4, se coa

de molécula pequeña, anticuerpos o partes de unión a

respuestas inmunitarias para mejorar aún más, estimula

Por ejemplo, como se muestra en los ejemplos, la adm

antagonista anti-PD-1 a ratones, puede dar como resultad

El anticuerpo anti-OX40 se puede combinar con (i) un ag

(p. ej., receptor o ligando) y/o (ii) un antagonista de una

células inmunitarias, tales como células T, dando a

inmunitarias, tal como respuestas de células T es desvelados en el presente documento presentan, cer. En una realización, la mejora se mide mediante una es mensurables. En otra realización, las lesiones pueden RM. En otra realización, para evaluar la capacidad de a.

ta completa (RC), una respuesta parcial (RP), enfermedad respuesta parcial inmunorelacionada (RPir) o enfermedad iente tratado presenta una reducción del volumen tumoral supresión del crecimiento tumoral. En otra realización, la otra realización más, se puede producir uno o más de lo s; se puede reducir el tamaño del tumor; la infiltración de irse, retrasarse, ralentizarse o detenerse; la metástasis oral puede inhibirse; la recurrencia del tumor puede os al cáncer pueden aliviarse en cierta medida.

aces del anticuerpo anti-OX40 y del anticuerpo anti-PD-1 escritos en el presente documento, produce al menos un reducción del tamaño de un tumor, reducción del número mpleta, remisión parcial o enfermedad estable. En otras cen una tasa de beneficio clínico (TBC= RC+ RP+ DE > 6 rpo anti-OX40 o con un anticuerpo anti-PD-1 o anti-CTLA-eficio clínico es de aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, ticuerpo anti-OX40 o con un anticuerpo anti-PD-1 o anti-

, los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente ribe a continuación.

anticuerpo anti-OX40, o una combinación de anticuerpos nistra con uno o más agentes adicionales, p. ej., fármacos ígeno de los mismos, y que son eficaces para estimular regular al alza las respuestas inmunitarias en un sujeto. stración de un anticuerpo anti-OX40 y de un anticuerpo n efecto sinérgico en la inhibición del crecimiento tumoral.

sta de una molécula estimuladora (p. ej., coestimuladora) al o molécula inhibidora (p. ej., receptor o ligando) en las s como resultado la amplificación de las respuestas íficas de antígeno. En ciertos aspectos, un agente inmunooncologico es (i) un agonista de una molécula e

receptor o ligando) o (ii) un antagonista de una moléc

receptor o ligando) en las células implicadas en la i

inmunooncológico potencia la inmunidad innata. Dic

reguladores de puntos de control inmunitario, p. ej., inhi

de control inmunitario.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX4

estimuladora o inhibidora que es un miembro de la super

anti-OX40 puede administrarse a un sujeto con un agent

una respuesta inmunitaria. En otras realizaciones, el ant

dirige (o se une específicamente a) un miembro de la fa

B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-coestimulador o coinhibidor que se une específicamente

El anticuerpo anti-OX40 también puede administrarse

moléculas de TNF y TNFR (ligandos o receptores), tale

CD30L, 4-1BBL, CD137, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4

TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TA

TRAMP/DR3, EDA1, EDA2, TNFR1, Linfotoxina a/TNFp

DR6, TROY y NGFR (véase, p. ej., Tansey (2009) Drug

Las respuestas de las células T pueden estimularse me

de los siguientes agentes:

(1) Un antagonista (agente inhibidor o bloqueante)

inhibidores de puntos de control inmunitario), tales

descrito anteriormente, y cualquiera de las siguient

Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, B7-H3,

(2) Un agonista de una proteína que estimula la ac

(CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, GITR, GITR-L, CD

Como agentes ilustrativos que modulan una de las prot

anti-OX40 para tratar el cáncer, se incluyen: Yervoy™ (

B7.1), BMS-936558 (para PD-1), MK-3475 (para P

MPDL3280A (para B7-H1), MEDI-570 (para ICOS), AM

3), BMS-663513 (para CD137), PF-05082566 (para C

870893 (para c D40), Lucatumumab (para c D40),

Ipilumumab (para CTLA-4).

Los anticuerpos anti-OX40 también pueden administrar

Otras moléculas que pueden combinarse con el anti

antagonistas de receptores inhibidores en células NK

ejemplo, el anticuerpo anti-OX40 puede combinarse co

La activación de las células T también se puede regula

administrarse a un sujeto, p. ej., que tiene cáncer, con

T o agonistas de citocinas que estimulan la activación d

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-O

inhibidores o bloqueantes) de proteínas de la familia de

la activación de células T o antagonistas de citocinas qu

VEGF; "citocinas inmunosupresoras" y/o (ii) agonistas d

de B7 o la de familia de TNF o de citocinas que estimula

inmunitaria, p. ej., para tratar enfermedades proliferativa

Aún otros agentes de combiterapias incluyen agente

monocitos, incluyendo, pero sin limitación, antagonistas

incluyendo RG7155 (documentos WO11/70024, W

WO13/132044) o FPA-008 (documentos WO11/140249;

Los anticuerpos anti-OX40 también pueden administrar

Agentes adicionales que pueden combinarse con los

incluyen agentes que mejoran la presentación de antíg ladora (incluyendo una molécula coestimuladora) (p. ej., hibidora (incluyendo una molécula coinhibidora) (p. ej., idad innata, p. ej., células NK, y en donde el agente agentes inmunooncológicos a menudo se denominan de puntos de control inmunitario o estimulador del punto

administra con un agente que se dirige a una molécula ia de inmunoglobulinas (IgSF). Por ejemplo, el anticuerpo se dirige a un miembro de la familia IgSF para aumentar po anti-OX40 puede administrarse con un agente que se B7 de ligandos unidos a la membrana que incluye B7-1, 7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA) y B7-H6 o un receptor miembro de la familia B7.

un agente que se dirige a un miembro de la familia de o CD40 y CD40L, GITR, GITR-L, CD70, CD27L, CD30, AILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, PRIL, BCMA, LTpR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, FR2, TNFa, LTpR, Linfotoxina a ip2, FAS, FASL, RELT, overy Today 00:1).

una combinación de anticuerpos anti-OX40 y uno o más

na proteína que inhibe la activación de células T (p. ej., o CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 y LAG-3, como se ha roteínas: TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, 4, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 y TIM-4; y/o ión de las células T, tal como B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB D27, CD40, DR3 y CD28H.

anteriores y que pueden combinarse con el anticuerpo umab) o Tremelimumab (para CTLA-4), galiximab (para AMP224 (para B7DC), BMS-936559 (para B7-H1), (para B7H2), MGA271 (para B7H3), IMP321 (para LAG-), CDX-1127 (para CD27), Atacicept (para TACI), CP-tuzumab (para CD40), Muromonab-CD3 (para CD3),

n pidilizumab (CT-011).

po anti-OX40 para el tratamiento del cáncer incluyen gonistas de receptores activadores en células NK. Por gonistas de KIR (p. ej., lirilumab).

citocinas solubles, y los anticuerpos anti-OX40 pueden onistas de citocinas que inhiben la activación de células ulas T.

pueden utilizarse junto con (i) antagonistas (o agentes o de la familia de B7 o de la familia de TNF que inhiben iben la activación de células T (p. ej., IL-6, IL-10, TGF-B, eptores estimuladores de la familia de IgSF, de la familia activación de las células T, para estimular una respuesta les como cáncer.

e inhiben o causan el agotamiento de macrófagos o SF-1R, tales como anticuerpos antagonistas de CSF-1R, 07553, WO11/131407, WO13/87699, WO13/119716, 13169264; WO14/036357).

n agentes que inhiben la señalización de TGF-p.

uerpos anti-OX40 descritos en el presente documento tumoral, p. ej., vacunas de células dendríticas, vacunas celulares secretoras de GM-CSF, oligonucleótidos CpG

las células tumorales (p. ej., antraciclinas).

Otras terapias más que pueden combinarse con los

agotamiento de células Treg o las bloquean, p. ej., un ag

Otra terapia que puede combinarse con el anticuerpo ant

como indolamina dioxigenasa (IDO), dioxigenasa, argina

Otra clase de agentes que pueden utilizarse con los anti

de adenosina o inhiben el receptor A2A de adenosina.

Otras terapias que pueden combinarse con los anticuer

invierten/impiden la anergia o el agotamiento de células

innata y/o inflamación en un sitio tumoral.

El anticuerpo anti-OX40 puede combinarse con más de u

un enfoque combinatorio que se dirige a elementos mú

siguientes: una terapia que aumenta la presentación de

vacunas celulares secretoras de GM-CSF, oligonucleóti

inmunitaria negativa, p. ej., inhibiendo la ruta de CTLA-4

células Treg o de otras células supresoras inmunitaria

inmunitaria positiva, p. ej., con agonistas que estimulan

efectora de las células T; una terapia que aumenta sist

terapia que causa el agotamiento de células Treg o que

utilizando un antagonista de CD25 (p. ej., daclizumab) o p

afecta a la función de las células mieloides supresoras e

las células tumorales (p. ej., antraciclinas); transferenci

modificadas genéticamente, p. ej., células modificadas

CAR); una terapia que inhibe una enzima metabólica tal c

óxido nítrico sintasa; una terapia que invierte/impide l

desencadena la activación inmunitaria innata y/o la inf inmunoestimuladoras; o bloqueo de citocinas inmunorrep

Los anticuerpos anti-OX40 pueden utilizarse junto con

coestimulantes positivos, agentes bloqueantes que at

antagonistas y uno o más agentes que aumentan sistém

que superan distintas rutas inmunosupresoras dentro del

receptor inhibidor (p. ej., interacciones PD-L1/PD-1), cau

utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CD25 (p. ej., da

vivo), inhiben enzimas metabólicas tales como IDO o in

agentes que desencadenan activación inmunitaria innata

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40 s

sujeto es positivo para la mutación BRAF V600.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

En el presente documento se proporcionan los anticuerp

respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende a

anticuerpos inmunoestimuladores adicionales, tal como

antagonista anti-PD-Ll, p. ej., anticuerpo antagonista,

antagonista y/o un antagonista anti-LAG3, p. ej., un a

respuesta inmunitaria en el sujeto, por ejemplo, para in

antivírica. En una realización, al sujeto se le administra el

En una realización, al sujeto se le administra el anticuerp

realización, al sujeto se le administra el anticuerpo an

realización, el anticuerpo anti-OX40 es un anticuerpo hu

por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado. En u

adicional (p. ej., un anticuerpo anti-PD-1 antagonista, un

LAG3 antagonista) es un anticuerpo humano. Como

adicional puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quiméric

de ratón anti-PD-1, anti-PD-L1; anti-CTLA-4 y/o anti-LAG

En el presente documento se proporcionan los anticuer

enfermedad hiperproliferativa (p. ej., cáncer), que comp iquimod, o terapias que mejoran la inmunogenicidad de

ticuerpos anti-OX40 incluyen terapias que causan el e que se une específicamente a CD25.

X40 es una terapia que inhibe una enzima metabólica tal u óxido nítrico sintasa.

rpos anti-OX40 incluye agentes que inhiben la formación

s anti-OX40 para tratar el cáncer, incluyen terapias que y terapias que desencadenan una activación inmunitaria

gente inmunooncológico, y puede combinarse, p. ej., con les de la ruta inmunitaria, tales como uno o más de los tígenos tumorales (p. ej., vacunas de células dendríticas, CpG, imiquimod); una terapia que inhibe la regulación o PD1/PD-L1/PD-L2 y/o causando el agotamiento de las bloqueándolas; una terapia que estimula la regulación ruta de CD-137 y/o GITR y/o que estimulan la función icamente la frecuencia de células T antitumorales; una s inhibe, tales como las células Treg en el tumor, p. ej., agotamiento de perlas anti-CD25 ex vivo; una terapia que l tumor; una terapia que aumenta la inmunogenicidad de adoptiva de células T o células NK incluyendo células receptores quiméricos para el antígeno (terapia con T-o indolamina dioxigenasa (IDO), dioxigenasa, arginasa u nergia o el agotamiento de células T; una terapia que ación en un sitio tumoral; administración de citocinas oras.

no o más gentes agonistas que se ligan a receptores an la señalización a través de receptores inhibidores, mente la frecuencia de células T antitumorales, agentes croambiente tumoral (p. ej., bloqueando la interacción del do el agotamiento de células Treg o inhibiéndolas (p. ej., umab) o causando el agotamiento de perlas anti-CD25 ex rten/impiden la anergia o el agotamiento de células T) y inflamación en sitios tumorales.

dministra a un sujeto junto con un inhibidor de BRAF si el

dministra junto con otro anticuerpo inmunoestimulador.

reivindicados para su uso en métodos para estimular una inistrar al sujeto el anticuerpo anti-OX40 y uno o más antagonista anti-PD-1, p. ej., anticuerpo antagonista, un antagonista anti-CTLA-4 antagonista, p. ej., anticuerpo uerpo antagonista, de tal manera que se estimula una ir el crecimiento tumoral o para estimular una respuesta ticuerpo anti-OX40 y un anticuerpo anti-PD-1 antagonista. nti-OX40 y un anticuerpo anti-PD-LI antagonista. En una X40 y un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista. En una no. Como alternativa, el anticuerpo anti-OX40 puede ser, realización, el al menos un anticuerpo inmunoestimulador ti-PD-LI antagonista, un anti-CTLA-4 antagonista y/o antirnativa, el al menos un anticuerpo inmunoestimulador humanizado (p. ej., preparado a partir de un anticuerpo

reivindicados para su uso en métodos para tratar una de administrar al sujeto el anticuerpo anti-OX40 con un anticuerpo PD-1 antagonista, un anticuerpo PD-L1 anta

En determinadas realizaciones, uno o ambos anticuerp

documento también se proporcionan los anticuerpos pa

asociado al tratamiento de una enfermedad hiperproli

administrar al sujeto (p. ej., a un ser humano) el anticu

anti-PD-1, anti-PD-L1; anti-CTLA-4 o anti-LAG3. En det

las CDR o regiones variables de 3F4, 14B6-1, 14B6-2,

20C1, o es otro anticuerpo anti-OX40 agonista descrito

Los antagonistas de PD-1 adecuados para su uso en l

limitación, ligandos, anticuerpos (p. ej., anticuerpo

multivalentes. En una realización, el antagonista de PD-tal como AMP-244. En una realización, el antagonista d

Un anticuerpo anti-PD-1 ilustrativo es nivolumab (BMS-variables de uno de los anticuerpos 17D8, 2D3, 4H

2006/121168. En determinadas realizaciones, un antic

documento WO2012/145493; y AMP-514, descrito en el

inhibidores de PD-1 conocidos incluyen los descritos

2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699,

n.° 7.635.757 y 8.217.149 y en la publicación de pate

utilizarse cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 desve

PD-1 que compite por la unión con, y/o que se une al m

puede utilizarse en tratamiento combinados. Otro e

recombinante compuesta por el dominio extracelular d

denominada AMP-224. En determinadas realizaciones,

en la región variable de al menos aproximadamente 90

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX

pesadas y ligeras que comprenden las secuencias m

fragmentos de unión a antígeno y variantes de los mi

CDR o regiones variables de las cadenas pesada y li

anticuerpo comprende los dominios CDR1, CDR2 y C

en el SEQ ID NO: 301, y los dominios CDR1, CDR2 y

en SEQ ID NO: 302. En determinadas realizaciones, el

comprenden las secuencias expuestas en las SEQ ID

CDR3 que comprenden las secuencias expuestas en l

realizaciones, el anticuerpo comprende las regiones

expuestas en el SEQ ID NO: 301 y/o SEQ ID NO: 302, r

tiene una identidad de al menos aproximadamente 90

la región variable con el SEQ ID NO: 301 o SEQ ID NO:

Como anticuerpos anti-PD-LI ilustrativos se incluye

2007/005874 y en la patente de Estados Unidos n.° 7.9

variables de 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1

WO 07/005874 y en la patente de Estados Unidos n.°

PD-Ll es MEDI4736 (también conocido como Anti-MSB0010718C (documento WO2013/79174) o rHigM1

anti-PD-LI desvelados en los documentos WO2013/17

Estados Unidos n.° 7.635.757 y 8.217.149, y en la publi

Como anticuerpos anti-CTLA-4 ilustrativos se incluye

publicación PCT WO 01/14424), tremelimumab (anterio

4 descrito en cualquiera de las siguientes publicacione

n.° 6.207.156; Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. S

Oncology 22(145): Resumen n.° 2505 (anticuerpo CP-También puede utilizarse cualquiera de los anticuerpos

Como anticuerpos anti-LAG3 ilustrativos se incluyen a

los anticuerpos 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 o 17E

Unidos n.° US2011/0150892 y en los documentos WO1

anti-LAG-3 es BMS-986016. Otros anticuerpos anti-LA

IMP731 e IMP-321, descritos en los documentos US 20

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-O

realizaciones, el anticuerpo tiene las CDR o regiones , un anticuerpo anti-CTLA-4 o un anticuerpo anti-LAG3. administran a una dosis subterapéutica. En el presente uso en métodos para alterar un acontecimiento adverso a con un agente inmunoestimulador, que comprende anti-OX40 y una dosis subterapéutica de un anticuerpo adas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40 comprende 3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, 20B3, 14A2-1, 14A2-2 y presente documento.

todos descritos en el presente documento, incluyen, sin noclonales y anticuerpos biespecíficos), y agentes una proteína de fusión, p. ej., una proteína de fusión Fc, en un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-LI.

8) o un anticuerpo que comprende las CDR o regiones 4, 7D3, 5F4 y 4A11 descritos en el documento WO anti-PDI es MK-3475 (Lambrolizumab) descrito en el ento WO 2012/145493. Otros anticuerpos PD-1 y otros s documentos WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2012/145493, en las patentes de Estados Unidos e Estados Unidos n.° 2009/0317368. También pueden en el documento WO2013/173223. Un anticuerpo antiepítopo en PD-1 que uno de estos anticuerpos, también e para dirigirse al receptor de PD-1 es la proteína L2 (B7-DC) que se fusiona con la parte Fc de la IgG1, uerpo tiene una identidad de secuencia de aminoácidos n los anticuerpos mencionados anteriormente.

utiliza junto con nivolumab, que comprende cadenas as en las SEQ ID NO: 299 y 300, respectivamente, o En determinadas realizaciones, el anticuerpo tiene las de nivolumab. Por consiguiente, en una realización, el la VH de nivolumab que tienen la secuencia expuesta de la VL de nivolumab que tiene la secuencia expuesta rpo comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 que 3-305, respectivamente, y los dominios CDR1, CDR2 y Q ID NO: 306-308, respectivamente. En determinadas VL que comprenden las secuencias de aminoácidos tivamente. En determinadas realizaciones, el anticuerpo j., de al menos aproximadamente 90 %, 95 % o 99 % en

S-936559 (denominado 12A4 en el documento WO 3), o un anticuerpo que comprende las CDR o regiones , 12B7 y 13G4, que se describen en la publicación PCT 743. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-), MPDL3280A (también conocido como r G7446), ambién puede utilizarse cualquiera de los anticuerpos WO2011/066389, WO2012/145493, en las patentes de de Estados Unidos n.° 2009/145493.

voy™ (ipilimumab o anticuerpo 10D1, descrito en la e ticilimumab, CP-675.206), o un anticuerpo anti-CTLA-98/42752; WO 00/37504; patente de Estados Unidos A 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin.

6); y Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304. TLA-4 desvelados en el documento WO2013/173223.

pos que comprenden las CDR o regiones variables de se describen en la publicación de patente de Estados 0 y WO2014/008218. En una realización, un anticuerpo conocidos en la técnica que pueden utilizarse incluyen 023, WO08/132601 y WO09/44273.

e administra junto con ipilimumab. En determinadas les de las cadenas pesada y ligera de ipilimumab. Por consiguiente, en una realización, el anticuerpo compren

que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 309,

que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 310.

dominios CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden

respectivamente, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 q

314-316, respectivamente. En determinadas realizacio

comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas

En determinadas realizaciones, el anticuerpo tiene una

menos aproximadamente 90 %, 95 % o 99 % en la regió

La administración de anticuerpos anti-OX40 y antago

antígenos diana secundarios, tales como LAG-3 y/o

inmunitaria contra células cancerosas en el paciente.

anticuerpos anti-OX40 incluyen cánceres que normalme

no responden a la inmunoterapia. Como ejemplos repres

de la presente divulgación se incluyen los cánceres enu

En determinadas realizaciones, la combinación de los

puede administrarse simultáneamente como una sola

simultáneamente como composiciones separadas con c

En otra realización, la combinación de anticuerpos tera

se administra secuencialmente más de una dosis de la c

invertir o mantener en el mismo orden en cada moment

pueden combinar con administraciones simultáneas, o c

administración de una combinación de anticuerpo antianticuerpo anti-PD-L1 y/o anticuerpo anti-LAG-3) pu

secuencial con el primer anticuerpo anti-PD1 y el segun

secuencial con el primer anticuerpo anti-OX40 y el seg

representativo implica una primera administración que e

anticuerpo anti-PDI (y/o anticuerpo anti-CTLA-4 y/o

administraciones posteriores pueden ser simultáneas.

En cierta realización, un sujeto que tiene una enferme

inmunitario, p. ej., un cáncer o una enfermedad infeccios

anti-OX40 y un agente inmunooncológico. Como agente

137 (4-1^b B) (p. ej., un anticuerpo CD137 agonista tal

agonistas de G ^it R (p. ej., un anticuerpo anti-GITR agoni

antagonistas de CD40 (p. ej., un anticuerpo de CD40

(SGN-40), CP-870.893 o Chi Lob 7/4); agonistas de C

(c DX-1127)), MGA271 (para B7H3) (documento WO11/

de IDO (p. ej., INCB-024360 (documentos WO2006/122

NLG-919 (documentos WO09/73620, WO09/1156652,

receptores de tipo Toll (p. ej., agonistas de TLR2/4 (p.

Hiltonol o Imiquimod); agonistas de TLR7/8 (p. ej., Resiq

de TGF-p (p. ej., GC1008, LY2157299, TEW7197 o IMC

En una realización, el anticuerpo anti-OX40 se administr

agente inmunooncológico. En otra realización, el anticue

agente, p. ej., un agente inmunooncológico. En otra rea

de la administración del segundo agente. La administra

estén separados, p. ej., por 30 minutos, 60 minutos, 90

36 horas, 48 horas, 3 días, 5 días, 7 días, o una o má

comenzar, p. ej., 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos,

48 horas, 3 días, 5 días, 7 días, o una o más semanas,

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX40

administran simultáneamente, p. ej., se infusionan simul

un paciente. El anticuerpo anti-OX40 se puede formul

inmunooncológico.

Opcionalmente, el anticuerpo anti-OX40 como agente in

anti-OX40 y uno o más anticuerpos inmunoterapéuticos

PD-L1 y/o anti-LAG-3), puede combinarse además c

antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas,

células y células transfectadas con genes que codifican

173:4919-28). Como ejemplos no limitativos de vacun dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la VH de ipilimumab dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la VL de ipilimumab eterminadas realizaciones, el anticuerpo comprende los ecuencias expuestas en las SEQ Id NO: 311-313, mprenden las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: el anticuerpo comprende las regiones VH y/o VL que SEQ ID NO: 309 y/o SEQ ID NO: 310, respectivamente. idad de al menos aproximadamente 90%, p. ej., de al iable con el SEQ ID NO: 309 o SEQ ID NO: 310.

, p. ej., anticuerpos antagonistas, contra uno o más -4 y/o PD-1 y/o PD-L1, puede mejorar la respuesta cánceres cuyo crecimiento se puede inhibir utilizando sponden a la inmunoterapia y aquellos que normalmente ivos de cánceres para el tratamiento con la combiterapia os en el presente documento.

erpos terapéuticos indicados en el presente documento sición en un vehículo farmacéuticamente aceptable, o nticuerpo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. os puede administrarse secuencialmente. Asimismo, si rapia, el orden de la administración secuencial se puede administración, y las administraciones secuenciales se ier combinación de las mismas. Por ejemplo, la primera y anticuerpo anti-PDl (y/o anticuerpo anti-CTLA-4 y/o er simultánea, la segunda administración puede ser ticuerpo anti-OX40 y la tercera administración puede ser anticuerpo anti-PD1, etc. Otro esquema de dosificación uencial con el primer anticuerpo anti-OX40 y el segundo uerpo anti-PD-L1 y/o anticuerpo anti-LAG-3) y las

ue puede beneficiarse de la estimulación del sistema trata mediante la administración al sujeto del anticuerpo unooncológicos ilustrativos se incluyen agonistas de CD urelumab o PF-05082566 (documento WO12/32433)); gonistas de CD40 (p. ej., un anticuerpo CD40 agonista); onista tal como lucatumumab (HCD122), dacetuzumab . ej., un anticuerpo CD27 agonista tal como varlilumab 0)); antagonistas de KIR (p. ej., lirilumab); antagonistas WO07/75598, WO08/36653, WO08/36642), indoximod, 11/56652, WO12/142237) o F001287); agonistas de bacilo de Calmette-Guérin); agonistas de TLR7 (p. ej., ); o agonistas de TLR9 (p. ej., CpG7909)); e inhibidores .

es de la administración de un segundo agente, p. ej., un nti-OX40 se administra simultáneamente con el segundo n más, el anticuerpo anti-OX40 se administra después e los dos agentes puede comenzar en momentos que tos, 120 minutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, anas, o la administración del segundo agente puede inutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, és de la administración del primer agente.

segundo agente, p. ej., un agente inmunooncológico, se mente, p. ej., durante un periodo de 30 o 60 minutos, a njuntamente con el segundo agente, p. ej., un agente

terapéutico exclusivo, o una combinación del anticuerpo onales (p. ej., bloqueo de anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o agente inmunogénico, tal como células cancerosas, os recombinantes y moléculas de hidratos de carbono), inas inmunoestimuladoras (He et al. (2004) J. Immunol. orales que pueden utilizarse se incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp10

tumorales transfectadas para expresar la citocina

combinación del anticuerpo anti-OX40 y uno o más ant

PD-L1 y/o LAG-3), puede combinarse además con tra

combinación del anticuerpo anti-OX40 y uno o más ant

PD-L1 y/o LAG-3), puede combinarse eficazmente con r

reactivo quimioterapéutico administrado con la combin

58: 5301-5304). Por ejemplo, dicha combinación puede i

(p. ej., anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anticuerpos anti-P

adicionalmente junto con dacarbazina o interleucinacientífico detrás de la combinación de un anticuerpo ant

y/o LAG-3 con quimioterapia es que la muerte celular, q

de los compuestos quimioterapéuticos, debería dar l

presentación de antígeno. Otras combiterapias que pu

anticuerpo anti-OX40 con o sin bloqueo de CTLA-4 y/o P

la radiación, la cirugía o la privación de hormonas. Cada

en el hospedador. También pueden combinarse inhibid

anti-OX40 y bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o

de las células tumorales, que puede ser una fuente de

antígeno del hospedador.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX4

como una combinación del anticuerpo anti-OX40 y los

LAG-3, también pueden utilizarse junto con anticuerpos

el receptor Fca o F^cy contra células tumorales (véan

5.837.243). Pueden utilizarse anticuerpos biespecíficos

de estas respuestas aumentaría con el uso de una com

PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3.

En otro ejemplo, el anticuerpo anti-OX40 puede utiliz

combinación del anticuerpo anti-OX40 y un agente inm

el anticuerpo anti-PD-1 y/o el anticuerpo anti-PD-L1 y/o

un anticuerpo antineoplásico, tal como Rituxan® (ritu

Zevalin® (ibritumomab), Campath® (alemtuzumab), Ly

(erlotinib) y similares. A modo de ejemplo y sin el dese

anticuerpo contra el cáncer o un anticuerpo contra el cá

células cancerosas (p. ej., células tumorales), lo que

inmunoestimulante (p. ej., agente OX40, CTLA-4, PD

ilustrativa, un tratamiento de una enfermedad hiperproli

contra el cáncer(p. ej., un anticuerpo) junto con

inmunoestimulante adicional, p. ej., agente anti-CTLA-4

simultánea o secuencialmente, o cualquier combinación

antitumoral por el hospedador.

Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del hosped

de estos mecanismos pueden ser superados por la inac

son inmunosupresores. Estos incluyen, entre otros, TG

(Howard y O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-1365). Los anticuerpos de cada una de estas entidades

o sin un agente inmunoestimulante adicional, p. ej., un

3, tal como un anticuerpo, para contrarrestar los efectos

inmunitarias antitumorales por parte del hospedador.

Otros agentes (p. ej., anticuerpos) que pueden utiliza

hospedador pueden utilizarse además junto con el an

adicional, tal como, anticuerpo anti-CTLA-4 y/o anti-PD-la superficie de las células dendríticas que activan la fun

CD40 (Ridge et al., citados anteriormente) pueden utili

un agente inmunoestimulante adicional, p. ej., un agent

ej., anticuerpo. Otros anticuerpos activadores de molé

anteriormente, Melero et al., citados anteriormente, Hutl

mayores niveles de activación de células T.

Como se ha indicado anteriormente, el trasplante de mé

tumores de origen hematopoyético. La inmunoterapia c

PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3, puede utilizarse para aumen ntígenos MAGE, Trp-2, MARTI y/o tirosinasa, o células SF (analizado con más detalle más adelante). Una rpos adicionales (p.ej., bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o ientos convencionales para el cáncer. Por ejemplo, una rpos adicionales (p. ej., bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o enes quimioterapéuticos. En estos casos, la dosis de otro puede reducirse (Mokyr et al. (1998) Cancer Research ir el anticuerpo anti-OX40 con o sin un anticuerpo adicional y/o anticuerpos anti-PD-L1 y/o anticuerpos anti-LAG-3), -2) para el tratamiento del melanoma. El fundamento 40 agonista con bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 s una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría a mayores niveles de antígeno tumoral en la ruta de n dar como resultado sinergia con una combinación del y/o PD-L1 y/o LAG-3 a través de la muerte celular incluyen de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral de la angiogénesis con una combinación del anticuerpo -3. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte ada de antígeno tumoral en las rutas de presentación de

uede utilizarse como único agente inmunoterapéutico, o uerpos bloqueadores de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o pecíficos que se dirigen a células efectoras que expresan p. ej., las patentes de Estados Unidos n.° 5.922.845 y dirigirse a dos antígenos distintos. El grupo de células T ción del anticuerpo anti-OX40 y el bloqueo de CTLA-4 y/o

como el único agente inmunoterapéutico, o como una stimulante adicional, p. ej., el anticuerpo anti-CTLA-4 y/o ente LAG-3 (p. ej., anticuerpo) pueden utilizarse junto con b), Herceptin® (trastuzumab), Bexxar® (tositumomab), cide® (eprtuzumab), Avastin® (bevacizumab), Tarceva® quedar vinculados a teoría alguna, el tratamiento con un conjugado con una toxina, puede conducir a la muerte de ciaría una respuesta inmunitaria mediada por el agente PD-L1 o LAG-3, p. ej., anticuerpo). En una realización tiva (p. ej., un tumor canceroso) puede incluir un agente anticuerpo anti-OX40 y, opcionalmente, un agente nti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3 (p. ej., anticuerpo), s mismas, que puede potenciar una respuesta inmunitaria

a través de una gran diversidad de mecanismos. Muchos ción de proteínas, que se expresan por los tumores y que (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 y el ligando Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363­ den combinarse además con el anticuerpo anti-OX40 con te anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-los agentes inmunosupresores y favorecer las respuestas

para activar la capacidad de respuesta inmunitaria del erpo anti-OX40 con o sin un agente inmunoestimulante o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3. Estos incluyen moléculas en CD y la presentación del antígeno. Los anticuerpos antie junto con el anticuerpo anti-OX40 y opcionalmente con ti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3, p. s coestimuladoras de células T, Weinberg et al., citados t al., citados anteriormente, también pueden proporcionar

ósea se utiliza actualmente para tratar una diversidad de nti-OX40 sola o combinada con el bloqueo de CTLA-4 y/o la eficacia de las células T específicas de tumor injertadas de donante.

Varios protocolos de tratamiento experimental implican

de antígeno y la transferencia adoptiva de estas células

actúen contra tumores (Greenberg y Riddell, citados a

activar las respuestas de las células T contra agentes i

ex vivo en presencia del anticuerpo anti-OX40 con o si

anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LA

transferidas de manera adoptiva.

En el presente documento se proporcionan los anticuer

adverso asociado al tratamiento de una enferm

inmunoestimulador, que comprende administrar a un su

y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3 (p. ej., ant

documento proporcionan un método de reducción de l

terapéutico inmunoestimulador mediante la administraci

el presente documento, un "esteroide no absorbible" es

primer paso de manera que, después del metabolismo e

menor que aproximadamente un 20 %. En una realizaci

es un glucocorticosteroide de acción local, que se meta

la administración oral. ENTOCORT EC® (Astra-Zenec

tiempo y del pH desarrollada para optimizar el suministro

está aprobada en los Estados Unidos para el tratamient

íleon y/o al colon ascendente. La dosis oral habitual de

Crohn es de 6 a 9 mg/día. ENTOCORT EC® se libera

intestinal. Una vez que pasa a través del tejido dian

ampliamente por el sistema del citocromo P450 en

insignificante. Por lo tanto, la biodisponibilidad es baja (

budesonida da como resultado una relación terapéutica

metabolismo de primer paso menos extenso. La bude

supresión hipotalámica-hipofisaria, que los corticoster

crónica de ENTOCORT Ec ® puede producir efectos

supresión suprarrenal. Véase PDR 58a edi. 2004; 608-6

En otras realizaciones, el anticuerpo anti-OX40 con o si

anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-LI

combinarse además con un salicilato. Los salicilatos incl

sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn);

(COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); y mesalami

SA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.;

De acuerdo con los métodos descritos en el presente

anti-OX40 con o sin anticuerpos anti-CTLA-4 y/o antipuede incluir cualquier solapamiento o administración s

de disminuir la frecuencia de colitis inducida por los a

métodos para reducir la frecuencia de colitis inducida por

documento incluyen la administración de un salicilato y

(p. ej., un salicilato se administra 6 horas después de

mismos. Adicionalmente, un salicilato y un esteroide n

ej., ambos se administran por vía oral) o mediante vías

esteroide no absorbible se administra por vía rectal), q

anticuerpo anti-OX40 y los anticuerpos anti-CTLA-4 y/o

Los anticuerpos anti-OX40 y las combiterapias con lo

pueden utilizarse junto con otras terapias bien conoci

indicación que se vaya a tratar (p. ej., cáncer). Las c

presente documento pueden utilizarse secuencialmen

aceptables.

Por ejemplo, los anticuerpos anti-OX40 y las combitera

pueden utilizarse junto (p. ej., simultáneamente o por

quimioterapia (p. ej., utilizando camptotecina (CPT-11)

paclitaxel, gemcitabina, cisplatino, paclitaxel, carboplat

apo21/TRAIL (un combo 6X)), uno o más inhibidores

inhibidores de Bcl-2 (p. ej., BH3I-2' (inhibidor de bcl-xl

indoximod, NLG-919 o F001287), AT-101 (derivado d tivación y la expansión ex vivo de células T específicas eptores para que estas células T específicas de antígeno rmente). Estos métodos también pueden utilizarse para iosos tales como CMV. Cabe esperar, que la activación terapia inmunoestimulante adicional, p. ej., anticuerpos aumente la frecuencia y la actividad de las células T

para su uso en métodos para alterar un acontecimiento hiperproliferativa (p. ej., cáncer) con un agente l anticuerpo anti-OX40 con o sin un agente anti-CTLA-4 po). Por ejemplo, los métodos descritos en el presente cuencia de colitis o diarrea inducida por un anticuerpo un esteroide no absorbible al paciente. Como se usa en lucocorticoide que presenta un extenso metabolismo de ígado, la biodisponibilidad del esteroide es baja, es decir, l esteroide no absorbible es budesonida. La budesonida ampliamente, principalmente por el hígado, después de s una formulación oral de budesonida dependiente del ármacos al íleon y a lo largo del colon. ENTOCORT® EC la enfermedad de Crohn leve a moderada que afecta al TOCORT EC® para el tratamiento de la enfermedad de intestino antes de absorberse y retenerse en la mucosa la mucosa intestinal, ENTOCORT EC® se metaboliza gado a metabolitos con una actividad glucocorticoide roximadamente un 10 %). La baja biodisponibilidad de la rada en comparación con otros glucocorticoides con un a produce menos efectos adversos, incluyendo menor de acción sistémica. Sin embargo, la administración ocorticoides sistémicos tales como hipercorticalismo y

ueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 (es decir, nti-LAG-3) junto con un esteroide no absorbible, puede agentes 5-ASA tales como, por ejemplo:

zina (DIPENTUM®, Pharmacia & Upjohn); balsalazida SAc Ol®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTA-SA®, Solvay).

ento, un salicilato administrado junto con el anticuerpo y/o anti-PD-LI y/o LAG-3 y un esteroide no absorbible, ncial del salicilato y del esteroide no absorbible con el fin erpos inmunoestimuladores. Por tanto, por ejemplo, los nticuerpos inmunoestimuladores descritos en el presente n esteroide no absorbible simultánea o secuencialmente steroide no absorbible), o cualquier combinación de los orbible pueden administrarse mediante la misma vía (p. entes (p. ej., un salicilato se administra por vía oral y un uede diferir de la(s) ruta(s) usada(s) para administrar el D-1 y/o anti-PD-LI y/o anti-LAG-3.

ticuerpos descritos en el presente documento, también que se seleccionan por su particular utilidad contra la aciones con los anticuerpos anti-OX40 descritos en el on uno o más agentes conocidos farmacéuticamente

con los anticuerpos descritos en el presente documento, ado) con un tratamiento adicional, tal como irradiación, uorouracilo (5-FU), cisplatino, doxorrubicina, irinotecán, aclitaxel (Taxol), doxorrubicina, 5-fu o camptotecina proteasoma (p. ej., bortezomib o MG132), uno o más ibidor de indolamina dioxigenasa-1 (p. ej., INCB24360, (-)-gossipol), ABT-263 (molécula pequeña), GX-15-070 (obatoclax) o antagonistas de MCL-1 (proteína 1 de dife

(inhibidor de la proteína de apoptosis) (p. ej., smac7,

sintéticos (véase Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15), I

de HDAC (histona desacetilasa), anticuerpos anti-CD

bevacizumab), agentes anti-angiogénicos dirigidos a VE

Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808), mod

ej., ligandos naturales y sintéticos de PPARy (recept

5569100), inhibidores de cinasa (p. ej., Sorafenib), Trast

como rapamicina y temsirolimus, Bortezomib, inhibidor

lenalidomida, inhibidores de GSK3p, inhibidores de IAP

Los anticuerpos anti-OX40 y las combiterapias con l

utilizarse además junto con uno o más agentes citotóxi

utilizarse como agentes citotóxicos antiproliferativos incl

agentes alquilantes (incluyendo, sin limitación, mostaza

nitrosoureas y triazenos): mostaza de uracilo, clorm

pipobroman, trietilenomelamina, trietilenotiofosforamina,

y temozolomida.

Antimetabolitos (incluyendo, sin limitación, antagonistas

inhibidores de adenosina desaminasa): metotrexato,

tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina y gemcit

Agentes antiproliferativos adecuados para la combinació

(disponible en el comercio como ^t A^x OL™), docetax

epotilonas, epotilona A, epotilona B, epotilona C,

desoxiepotilona BI, [17]-deshidrodesoxiepotilona B, [1

epotilona A con puente C6-C8, trans-9,10-deshidroepoti

epotilona B10, discoderomolida, patupilona (EPO-9

(discodermolida), TZT-1027 (soblidotina), ILX-651 (clor

7389), hemiasterlina (HTI-286), E-7974, criptoficinas, L

ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (ispinesib

acetoxi-2-etoxi-6-oxo-B-homo-estra-1,3,5(10)-trien-3-ol,

14,16-didemetil-(+)-discodermolidas y criptotilona 1, a

conocidos en la técnica.

En los casos en que sea deseable hacer quiescentes la

con el anticuerpo anti-OX40 o antes del mismo, hormo

17a-etinilestradiol, dietilestilbestrol, testosterona, pre

testolactona, acetato de megestrol, metilprednisolona,

hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina,

toremifeno, ZOLADEX™, también pueden administr

composiciones descritos en el presente documento, ta

tales como antimiméticos, usados en la modulación del

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX4

nivolumab para tratar a un paciente con cáncer, por eje

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-OX4

ipilimumab para tratar a un paciente con cáncer, por eje

Los expertos en la materia conocen métodos para la a

Además, su administración se describe en la bibliografí

los agentes quimioterapéuticos se describe en el Physic

Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA

El o los agentes quimioterapéuticos y/o la radioterapia

bien conocidos en la técnica. Será evidente para los ex

agentes quimioterapéuticos y/o la radioterapia puede m

y de los efectos conocidos del o de los agentes qui

Asimismo, de acuerdo con el conocimiento del médico

dosis y los tiempos de administración) pueden modi

terapéuticos administrados en el paciente, y a la luz d

terapéuticos administrados.

La presente divulgación se ilustra además mediante

limitantes adicionales.

ación celular de leucemia mieloide), antagonistas de iAP , mimético smac de molécula pequeña, péptidos smac 722 (LY2181308) o AEG-35156 (GEM-640)), inhibidores . ej., rituximab), inhibidores de la angiogénesis (p. ej., ^v E^g FR (p. ej., Avastin), triterpenoides sintéticos (véase res de c-FLIP (proteína inhibidora de FLICE celular) (p. activado por proliferador de peroxisomas), 5809354 o ab, Cetuximab, Temsirolimus, inhibidores de mTOR tales JAK2, inhibidores de HSP90, inhibidores de PI3K-AKT, rmacos genotóxicos.

ticuerpos descritos en el presente documento, pueden ntiproliferativos. Las clases de compuestos que pueden pero sin limitación, las siguientes:

genadas, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, ciclofosfamida (CYTOXAN™), melfalán, clorambucilo, lfán, carmustina, lomustina, estreptozocina, dacarbazina

cido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e rouracilo, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6-.

anticuerpos anti-OX40, sin limitación, taxanos, paclitaxel codermolida (DDM), dictiostatina (DCT), pelorusida A, ona D, epotilona E, epotilona F, furanoepotilona D, hidrodesoxiepotilona B, C12,13-ciclopropil-epotilona A, D, cis-9,10-deshidroepotilona D, 16-desmetilepotilona B, KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A de tasidotina), halicondrina B, mesilato de eribulina (E-703, inmunoconjugados maitansinoides (DM-1), MKC-1, -743921, MK-0731, STA-5312, eleuterobina, 17betastreptina, isolaulimalida, laulimalida, 4-epi-7-deshidroxis de otros agentes estabilizadores de la microtubulina

las aberrantemente proliferativas junto con el tratamiento esteroides (incluyendo análogos sintéticos), tales como na, fluoximesterona, propionato de dromostanolona, stosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, tato de medroxiprogesterona, leuprolida, flutamida, al paciente. Cuando se emplean los métodos o las pueden administrarse, según se desee, otros agentes, miento o metástasis tumoral en un entorno clínico.

administra (simultáneamente o por separado) junto con cáncer colorrectal o de vejiga.

administra (simultáneamente o por separado) junto con cáncer ovárico, de vejiga o de próstata.

stración segura y eficaz de agentes quimioterapéuticos. vencional. Por ejemplo, la administración de muchos de Desk Reference" (PDR), p. ej., edición de 1996 (Medical

n administrarse de acuerdo con protocolos terapéuticos s en la técnica que la administración del agente o de los arse dependiendo de la enfermedad que se vaya a tratar apéuticos y/o la radioterapia sobre dicha enfermedad. rto, los protocolos terapéuticos (p. ej., las cantidades de e a la luz de los efectos observados de los agentes respuestas observadas de la enfermedad a los agentes

iguientes ejemplos, que no deben considerarse como XVII. Kits y formas farmacéuticas unitarias

En el presente documento también se proporcionan, a

farmacéutica que contiene un anticuerpo anti-OX40 y un

CTLA-4 (ipilimumab), y un vehículo farmacéuticamente

para su uso en los métodos anteriores. Opcionalmente, l

p. ej., programas de administración, para permitir que u

administre la composición que contiene en su interior pa

un tumor sólido). El kit también puede incluir una jeringa

Opcionalmente, los kits incluyen envases múltiples de la

una de ellas una cantidad eficaz del anticuerpo antiadministración de acuerdo con los métodos proporcio

equipos o dispositivos necesarios para administrar la(s)

proporcionar una o más jeringas precargadas que conte

PD-1 o anti-CTLA-4.

En un caso, la presente divulgación proporciona un

comprendiendo el kit una dosis de un anticuerpo anti-O

región variable de cadena pesada que tiene la secuencia

y CDR3 de la región variable de cadena ligera que tiene

de uso según los métodos descritos en el presente d

además (a) una dosis de un anticuerpo anti-PD-1 que

variable de cadena pesada que tiene la secuencia exp

CDR3 de la región variable de cadena ligera que tiene l

de un anticuerpo anti-CTLA-4 que comprende los domi

pesada que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID

variable de cadena ligera que tiene la secuencia expues

Ejemplos

Los anticuerpos de la invención reivindicada se denomi

adelante, como referencia y para comprender mejor la in

Ejem plo 1: G eneración de anticuerpos anti-O X40

Los anticuerpos monoclonales anti-OX40 humanos se

ratones transgénicos Hu-MAb® ("HuMAb" es una marc

ratones KM (la cepa KM Mouse® contiene el transcro

02/43478) utilizando el antígeno hexahistidina-OX40 rec

Un total de 52 ratones, incluyendo 5 genotipos de rat

inmunizaron con diferentes estrategias de inmunización.

utilizado a 2,0 mg/ml para una dosis total de 20 |jg por

base de la cola, inmunización en el corvejón, inyección

n.° S6322, Sigma). Se realizaron y examinaron 27 fusio

para antígeno ELISA a partir de estas 27 fusiones, y la c

de particular interés, incluidos los anticuerpos denomin

20B3 (también llamados OX40.17), 14A2-1, 14A2-2 y 2

isotipo se exponen en las figuras 1-9. Las regiones va

secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 17 y 18.

consisten en las secuencias de aminoácidos de las SE

pesada de 14B6-2 consisten en las secuencias de amin

cadena ligera y pesada de 23H3 consisten en las secuen

variables de cadena ligera y pesada de 6E1-1 consiste

49. Las regiones variables de cadena ligera y pesada

SEQ ID NO: 48 y 50. Las regiones variables de cade

aminoácidos de las SEQ ID NO: 57 y 58. Las regiones v

secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 65 y 66

consisten en las secuencias de aminoácidos de las SE

pesada de 14A2-1 consisten en las secuencias de amin

cadena ligera y pesada de 14A2-2 consisten en las s

regiones variables de cadena ligera y pesada de 20C1

NO: 93 y 94.

e no se reivindican, kits que incluyen una composición cuerpo anti-PD-1 (p. ej., nivolumab) o un anticuerpo antitable, en una cantidad terapéuticamente eficaz adaptada s también pueden incluir instrucciones, que comprenden, fesional (p. ej., un médico, un enfermero o un paciente) ministrar la composición a un paciente con cáncer (p. ej.,

posiciones farmacéuticas monodosis, conteniendo cada o anticuerpo anti-PD-1 o anti-CTLA-4 para una sola s anteriormente. También pueden incluirse en los kits posición(es) farmacéutica(s). Por ejemplo, un kit puede una cantidad del anticuerpo anti-OX40 o anticuerpo anti-

para tratar un tumor sólido en un paciente humano, ue comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la esta en el SEQ ID NO: 318, y los dominios CDR1, CDR2 ecuencia expuesta en el SEQ ID NO: 94, e instrucciones ento. En determinadas realizaciones, el kit comprende rende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región en el SEQ ID NO: 301, y los dominios CDR1, CDR2 y uencia expuesta en el SEQ ID NO: 302, o (b) una dosis CDR1, c DR2 y CDR3 de la región variable de cadena 309, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región el ^s E^q ID NO: 310.

OX40.21" en la siguiente descripción de las figuras. Más ión, se desvelan anticuerpos que no son los reivindicados

eraron en las cepas Hco7, Hco12, Hco17 y Hco38 de ercial de Medarex, Inc., Princeton, Nueva Jersey) y de ma SC20 como se describe en la publicación p Ct WO inante.

transgénicos (KM, Hco7, Hco12, Hco17 y Hco38) se munógeno era huOX40-6xhis preparado internamente y . Las vías de administración incluyeron: inyección en la peritoneal (ip) y subcutánea (sc) y adyuvante (Ribi, Cat. e 30 ratones. Se identificaron 541 anticuerpos positivos erización adicional condujo al aislamiento de anticuerpos 3F4, 14B6-1, 14B6-2, 23H3, 6E1-1, 6E1-2, 18E9, 8B11, Sus secuencias de aminoácidos de región variable y su es de cadena ligera y pesada de 3F4 consisten en las regiones variables de cadena ligera y pesada de 14B6-1 NO: 28 y 29. Las regiones variables de cadena ligera y os de las SEQ ID NO: 28 y 30. Las regiones variables de de aminoácidos de las SEQ ID NO: 37 y 38. Las regiones las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 48 y 1-2 consisten en las secuencias de aminoácidos de las era y pesada de 18E9 consisten en las secuencias de les de cadena ligera y pesada de 8B11 consisten en las regiones variables de cadena ligera y pesada de 20B3 NO: 73 y 74. Las regiones variables de cadena ligera y os de las SEQ ID NO: 84 y 85. Las regiones variables de cias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 84 y 86. Las isten en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID La secuenciación del ADNc identificó una cadena pesa

18E9, 8B11, 20B3 (también denominados OX40.17) y

ligera 1 o "L1 " y cadena ligera 2 o "L2") de cada uno de

se identificó una sola cadena ligera de los anticuerp

determinación del peso molecular indicaron que era la c

Los anticuerpos 14B6-1 y 14B6-2 corresponden al antic

Los anticuerpos 14A2-1 y 14A2-2 corresponden al antic

Los anticuerpos 6E1-1 y 6E1-2 corresponden al anticuer

secuencias de aminoácidos y nucleótidos de cada una

en la tabla 23.

Para algunos de los anticuerpos anteriores, se realiza

eliminar la presencia de un sitio de isomerización (DG), y

derivación de la línea germinal DP44) para que la reg

expresado. Para anticuerpos basados en 20C1, tres rest

la línea germinal (A2V, D24G y G82bS). La reversió

desamidación (NG). En la tabla 6 se proporciona un

secuencias del clon híbrido original.

T una ligera de cada uno de los anticuerpos 3F4, 23H3, y una cadena pesada y dos cadenas ligeras (cadena nticuerpos 14B6, 14A2 y 6E1. Por análisis de proteínas, B6, 6E1 y 14A2, y la secuenciación N-terminal y la ligera L1 de 14B6 y 14A2 y la cadena ligera L2 de 6E1.

14B6 con una cadena ligera L1 y L2, respectivamente.

14A2 con una cadena ligera L1 y L2, respectivamente.

1 con una cadena ligera L1 y L2, respectivamente. Las cadenas ligeras de los 3 anticuerpos se proporcionan

ustituciones en el anticuerpo original en HCDR2 para trodujeron sustituciones en la región marco (debido a la arco se pareciera más a un anticuerpo comúnmente icionales e inusuales de la región marco se revirtieron a la región marco G82bS también elimina un sitio de en de las diversas sustituciones introducidas en las

.

Ejem plo 2: Unión de anticuerpos anti-OX40 a las cél

Los anticuerpos anti-OX40 monoclonales humanos gene

de unirse a células T humanas primarias activadas.

Para inducir la expresión de OX40, las células se activar

Brevemente, durante tres o cuatro días, se cultivaron C

y anti-CD28 humano, en presencia de IL-2 humana re

células se tiñeron con una valoración de cada anticuer

anticuerpo secundario policlonal anti-IgG humana conjug hum anas p rim arias activadas

en el Ejemplo 1 se analizaron en cuanto a la capacidad

urante varios días antes de realizar el ensayo de unión. on perlas magnéticas recubiertas con anti-CD3 humano inante. El día del ensayo, las perlas se retiraron y las ti-OX40. Los anticuerpos unidos se detectaron con un on fluorescencia, y las células se tiñeron conjuntamente con respecto a CD4 y CD25 para detectar células T C

midió utilizando un citómetro de flujo FACSCanto II (Bect

geométrica (IFMG) o la intensidad de fluorescencia med

población CD4+CD25+ (programa informático FACSDi

calcularon utilizando el programa informático GraphPad

Como se muestra en la figura 11A, los anticuerpos antivalores de CE50 subnanomolares. Perceptiblemente, O

analizados. Se realizó el mismo experimento con anticu

experimentos iniciales se llevaron a cabo utilizando an

hospedadoras transfectadas con vectores de expresión

11B, determinadas sustituciones causaron una pérdida

OX40.7, OX40.9, OX40.14 y OX40.15. Se analizó tambi

variable utilizando material de anticuerpo purificado.

Como se muestra en las figuras 11C y 11D, todos los a

subnanomolares, a excepción de OX40.18, que mostró

OX40.5 mostró la unión más baja entre el grupo de an

mostró la unión más baja entre el grupo de anticuerpos a

un resumen de los valores de CE50.

tivadas. La intensidad de fluorescencia de la tinción se kinson). Se calculó la intensidad de fluorescencia media (IFMed) de la tinción de los anticuerpos anti-OX40 de la os valores de CE50 de la unión de los anticuerpos se .

se unieron a células T humanas primarias activadas con mostró la unión más baja de los anticuerpos anti-OX40 anti-OX40 con sustituciones en la región variable. Los pos en forma de sobrenadantes de cultivos de células ticuerpos recombinantes. Como se muestra en la figura ificativa de unión, concretamente para los anticuerpos conjunto de anticuerpos con sustituciones en la región

rpos analizados se unieron a OX40 con valores de CE50 nión más baja que la del clon original del hibridoma 3F4. pos analizados en la figura 11B, mientras que OX40.1 dos en la figura 11C. En la siguiente tabla 7, se muestra

Ejem plo 3: Unión de anticuerpos anti-O X-40 a célula

Los anticuerpos monoclonales humanos anti-OX-40 que

primarias activadas en el Ejemplo 1 se analizaron en cu

de macaco cangrejero.

Brevemente, para inducir la expresión de OX40, las célul

de unión. Utilizando un tampón de cloruro de amonio, s

cangrejero mediante lisis de glóbulos rojos. Después,

matraces recubiertos previamente con anticuerpos anti im arias activadas de m acaco cangrejero

alizaron con respecto a la unión con células T humanas la capacidad de unirse a células T primarias activadas

activaron durante varios días antes de realizar el ensayo laron leucocitos totales de sangre periférica de macaco ucocitos se cultivaron durante cuatro a cinco días en humanos y anti-CD28 humanos que presentan reacción cruzada con el macaco cangrejero, en presencia de IL-El día del ensayo, las células se recogieron y se tiñe

anticuerpos unidos se detectaron con un anticuerp

fluorescencia, y las células se tiñeron conjuntamente

activadas. La intensidad de fluorescencia de la tinción s

Dickinson). Se calculó la intensidad de fluorescencia

mediana (IFMed) de la tinción de los anticuerpos ant

FACSDiva). Se generaron curvas de respuesta a la do

calcularon los valores de CE50 con respecto a la unión d

Como se muestra en las figuras 12A y 12B, los anticu

células T CD4 activadas de macaco cangrejero, con v

(20B3). 18E9 y 20B3 se unieron con valores de CE50

unieron con valores de CE50 por debajo de 1 nM. OX40

analizados en la figura 12A y OX40.5 mostró la unión m

12B. Se realizó el mismo experimento con anticuerpos

muestra en la figura 12C, los anticuerpos OX40.6, OX40

de CE50 de 0,12 nM o inferiores. OX40.1 mostró una

cangrejero. No se detectó unión del anticuerpo OX40.21

tabla 8, se muestra un resumen de los valores de CE50.

T umana recombinante, para expandir y activar las células T. con una valoración de cada anticuerpo anti-OX40. Los secundario policlonal anti-IgG humana conjugado con n respecto a CD4 y CD25 para detectar células T CD4 idió utilizando un citómetro de flujo FACSCanto II (Becton dia geométrica (IFMG) o la intensidad de fluorescencia X40 de la población CD4+CD25+ (programa informático y utilizando el programa informático GraphPad Prism, se os anticuerpos.

os anti-OX40 analizados se unieron con elevada fuerza a res de CE50 que variaban de 0,068 nM (20C1) a 1,4 nM tre 1 y 1,5 nM, mientras que los anticuerpos restantes se mostró la unión más baja entre los anticuerpos anti-OX40 aja entre los anticuerpos anti-OX40 analizados en la figura ti-OX40 con sustituciones en la región variable. Como se OX40.21 mostraron la mayor fuerza de unión, con valores ión mucho más baja con las células T CD4 de macaco células T CD4+ de ratón o rata activadas. En la siguiente

l :

Ejem plo 4: A nális is S catchard de unión de anticuerp

que sobreexpresan O X40 de s e r hum ano y de m aca

La unión de OX40.21 (isotipo IgG1) con células T hu

Scatchard. Brevemente, OX40.21 se marcó con radioyo

utilizando el reactivo de yodación en fase sólida IODO

28601). Las células T c D4+ humanas activadas se aisl

Donante W-326470, adquiridas en el Banco de Sangre d

negativa (cóctel de enriquecimiento de células T CD4

15062) y se congelaron. Para inducir la expresión de O

días antes de realizar el ensayo de unión, como se in anti-O X40 con células T p rim arias activadas y células cangrejero

nas activadas se evaluó adicionalmente usando análisis con 125I-Na (1mCi; PerkinElmer catálogo NEZ033H001 MC) ® (1,3,4,6-tetracloro-3a-6a-difenilglicouril; Pierce catálogo n de células mononucleares de sangre periférica (CMSP), tanford. Las células T CD4+ se aislaron mediante selección humanas RosetteSep™, StemCell Technologies catálogo , las células T CD4+ aisladas se activaron durante cuatro a más adelante. Las células descongeladas se cultivaron durante cuatro días con perlas magnéticas recubierta

expansoras de células T CD3/CD28 humanas, Invitroge

a célula de 1:1, en presencia de 200 UI/ml de IL-2 huma

La unión de IgG1 OX40.21 marcado con radioyodo a cé

humanas activadas con una valoración de IgG1 125I_OX

en presencia de una valoración de un exceso molar de

para calcular la unión específica. Para extrapolar la ac

calcular así el número de receptores por célula, se

125I_OX40.21 frente al CPM.

Como se muestra en tabla 9 y en la figura 13A, se obs

activadas que expresaban endógenamente OX40, con

células T.

T l . ni n 12I- X4 .

anti-CD3 humano y anti-CD28 humano (Dynaperlas álogo 111.41D), a una proporción de perla con respecto combinante (Peprotech catálogo 200-02).

T humanas activadas, se demostró incubando células T . La unión inespecífica se determinó a través de la unión eces de anticuerpo no marcado y se restó del CPM total d específica, nM máxima unida a IgG1 125I_OX40.21 y una curva patrón lineal de la concentración de IgG1

nión saturable de IgG1 OX40.21 en células T humanas Kd de 0,05 nM para cada uno de los dos donantes de

l l T h m n iv

Se realizó el mismo ensayo utilizando células HEK

Brevemente, la unión de OX40.21 marcado con radioyo

células 293-hOX40 con una valoración de 125I_OX40.21

presencia de una valoración de un exceso molar de 1

para calcular la unión específica. Para extrapolar el m

receptores por célula, se utilizó una curva patrón lineal

muestra en la figura 13B y en la tabla 10, se observó

expresado en células 293-hOX40. La K^d promedio con

diferentes cantidades de células 293-hOX40 por muestr

Tabla 10: Unión de O

Conc de Unión total de anticuerpo Unión ines

Ab. (nM) marcado con 125I (nM) marc

0,1866 0,1712 0,

10

0,1800 0,1710 0,

5 0,1799 0,1643 0,

2,5 0,1722 0,1628 0,

1,25 0,1583 0,1436 0,

0,625 0,0986 0,0936 0,

0,3125 0,0624 0,0501 0,

0,15625 0,0351 0,0289 0,

0,078125 0,0211 0,0162 0,

0,039063 0,0117 0,0091 0,

0,019531 0,0075 0,0056 0,

0,009766

que sobreexpresaban OX40 humana ("293-hOX40"). OX40 humana sobreexpresada, se demostró incubando unión inespecífica se determinó a través de la unión en es de anticuerpo no marcado y se restó del CPM total nM de 125I_OX40.21 unido y calcular así el número de concentración de 125I_OX40.21 frente al CPM. Como se saturable de IgG1 OX40.21 en cuanto a unión a OX40 cto a la unión de dos condiciones de ensayo utilizando de 0,22 nM.

a células 293-hOX40

ica de anticuerpo Unión específica de anticuerpo on 125I (nM) marcado con 125I (nM)

0,0137 0,1737 0,1575 0,0099 0,1720 0,1611 0,0065 0,1734 0,1578 0,0054 0,1665 0,1574 0,0048 0,1515 0,1388 0,0044 0,0948 0,0891 0,0048 0,0589 0,0453 0,0033 0,0316 0,0255 0,0027 0,0173 0,0136 0,0028 0,0088 0,0063 0,0028

0,0048 0,0028 Se realizó el mismo ensayo utilizando células CHO

OX40macaco cangrejero"). Brevemente, la unión de OX

se demostró incubando células CHO-OX40macaco c

inespecífica se determinó a través de la unión en prese

anticuerpo no marcado y se restó del CPM total para c

125I_OX40.21 unido y calcular así el número de rece

concentración de 125I_OX40.21 frente al CPM. Como se

saturable de IgG1 OX40.21 con respecto a la unión

OX40macaco cangrejero. La K^d promedio con respecto

cantidades de células por muestra fue de 0,63 nM.

T l 11: ni n X4 .21

obreexpresaban OX40 de macaco cangrejero ("CHO-marcado con radioyodo a OX40 de macaco cangrejero, ejero con una valoración de 125I_OX40.21. La unión de una valoración de un exceso molar de 100 veces de r la unión específica. Para extrapolar el máximo nM de s por célula, se utilizó una curva patrón lineal de la stra en la figura 13C y en la tabla 11, se observó unión 40 de macaco cangrejero expresado en células CHO-nión de dos condiciones de ensayo utilizando diferentes

H - X4 m n r r

Ejem plo 5: Unión específica de anticuerpos anti-O X4

La especificidad de diversos anticuerpos OX40 se anali

tejidos humanos normales, incluidos bazo, amígdala,

páncreas, hipófisis, nervios periféricos, estómago, co

próstata, útero, testículos y placenta.

Se adquirieron tejidos humanos recientes, congelad

comerciales de tejidos (Asterand Inc. Detroit, MI; Coop

Inc, Culver City, CA). Para detectar la unión a los tejidos

FITC, 6E1-FITC, OX40.16-FITC, OX40.17-FITC, OX40.

aplicaron a secciones de criostato fijadas con acetona, s

el sistema EnVision+. Como anticuerpo de control de is

fluoresceína. Como células y tejidos de control positivo s

OX40 humana (HT1080/huOX40) y secciones de teji

conjugación con FITC tenía algún impacto sobre las prop

como no conjugados con FITC se compararon en cél

puente. Los portaobjetos teñidos se evaluaron con un m

Las pruebas iniciales revelaron que los anticuerpos antiespecíficamente el citoplasma y la membrana de células

originales. No hubo diferencia entre los anticuerpos antiresultados sugieren que los anticuerpos eran adecuados

con FITC no tenía ningún impacto sobre las propiedade

Todos los anticuerpos anti-OX40 analizados presentar

mononucleares (CMN), dispersas o en pequeños grupos

en tejido linfático (colon, estómago e intestino delgado

(pulmón, piel y tiroides). Según la morfología, estas célu

Además de teñir un subconjunto de linfocitos, el anticu

tinción en subconjuntos de endotelio/matriz subendoteli

arterias pequeñas y adventicia del vaso y sus tejidos po

infocitos

ediante inmunohistoquímica en un grupo de 22 tipos de , cerebro, cerebelo, corazón, hígado, pulmón, riñón, intestino delgado, tiroides, piel, músculo esquelético,

o incluidos en OCT de múltiples redes/proveedores e Human Tissue Network, Filadelfia, PA; ProteoGenex serie de anticuerpos anti-OX40 (OX40.6-FITC, OX40.8-TC y OX40.21-FITC) se marcaron con fluoresceína y se o de un anticuerpo puente anti-FITC y visualización con , se utilizó una IgG1 humana inespecífica marcada con izaron células HT1080 que expresaban de forma estable migdalino humano hiperplásico. Para determinar si la es de unión, los anticuerpos anti-OX40 tanto conjugados T1080/huOX40 utilizando anti-huIgG como anticuerpo copio óptico.

tanto no conjugados como conjugados con FITC teñían fectadas con OX40 humana, pero no de células HT1080 tanto no conjugados como conjugados con FITC. Estos los análisis de inmunohistoquímica y que la conjugación nión a tejidos.

nción positiva en un pequeño subconjunto de células ejidos linfáticos (amígdala, bazo y timo) y en tejidos ricos í como en algunas CMN dispersas en múltiples tejidos ositivas son principalmente linfocitos.

OX40.6, un bloqueador de ligandos, mostró una fuerte elementos intersticiales, más a menudo asociados con ctivos circundantes, prácticamente en todos los tejidos examinados (figura 14A), así como en elementos especi

vaina que rodea el túbulo seminífero en los testículos.

positivamente estructuras de tipo miofilamento en los mú

mesangial en los glomérulos del riñón. La tinción con o

también reveló tinción en células del músculo cardíaco,

y en un subconjunto de células epiteliales tubulares en el

cuando los anticuerpos se utilizaron a concentraciones r

más bajas (1 pg/ml), lo que sugiere baja afinidad de unió

Pruebas adicionales de otros anticuerpos bloqueadores

tinción limpia de un subconjunto de linfocitos, sin tinción

examinados. El anticuerpo OX40.21, una variante del a

anticuerpo OX40.16 (figura 14B). La inmunohistoquím

cangrejero reveló un patrón de tinción muy similar al hu

una especie preclínica relevante.

Ejem plo 6: Expresión de OX40 en cánceres

Se adquirieron muestras de tejido tumoral FFPE (fijado

comerciales de tejidos (n=12-20 por cada tipo de tumor).

de IHQ automatizado con un anticuerpo anti-OX40 h

Brevemente, la recuperación de antígenos inducida por

20 min a 95 °C. El clon de anticuerpo monoclonal de rat

5 pg/ml durante 60 minutos, seguido de polímero Novolin

se hicieron reaccionar con una solución de sustrato cro

contraste hematoxilina de Mayer, se deshidrataron, se li

usó el bloque de proteína Dako como diluyente para el a

Para trazar un perfil de los LIT, se utilizaron anticuerpos

(marcador de Treg) disponibles en el comercio para teñ

IgG1 comercial de ratón y como control positivo tejido am

los portaobjetos se evaluaron manualmente y se puntuar

En los cuatro tipos de tumores examinados, había LIT C

de LIT entre las muestras y siendo la distribución dentro

de esperar, los LIT estaban más distribuidos en la interf

localizó en el estroma tumoral en la inmensa mayoría d

encontraron fácilmente en nidos intratumorales. Se obse

LIT y se distribuyó principalmente en el estroma tumoral.

a la de los LIT CD3+. Entre los cuatro tipos de tumores e

y CCR (figuras 15A-15C).

Ejem plo 7: A nticuerpos m onoclonales hum anos anti-

Se analizó la capacidad de varios anticuerpos anti-OX40

células 293 transfectadas con OX40 humana. Breveme

humana se preincubaron primero con concentraciones v

concentración fija (0,2 pg/ml) de OX40L humano recombi

y las muestras se incubaron posteriormente. Después d

un anticuerpo de producción propia anti-etiqueta de

fluorescencia de la tinción se midió utilizando un citóme

intensidad de fluorescencia media geométrica (IFMG) de

de la población celular (programa informático FACSDiva).

programa informático GraphPad Prism, se calcularon lo

OX40L con el anticuerpo; en la tabla 12 se muestran los

T l 12. V l r E l l l

ados del tejido intersticial, como el intersticio en forma de nticuerpo OX40.8, un no bloqueador de ligandos, marcó los cardíacos del corazón (figura 14A) y en células de tipo no bloqueador de ligandos, es decir, el anticuerpo 6E1, como en neuronas y neuropilos del cerebro y el cerebelo ón. En general, la tinción de no linfocitos se detectó solo tivamente altas (3 o 5 pg/ml), pero no a concentraciones posible unión inespecífica.

ligandos, OX40.16 (figura 14A) y OX40.17, revelaron una pecífica de otros elementos tisulares en todos los tejidos cuerpo OX40.16, tenía un patrón de unión similar al del en un grupo similar de tejidos normales de macaco no, demostrando la utilidad del macaco cangrejero como

formol e incluido en parafina) a través de vendedores ra detectar la unión a los tejidos, se desarrolló un ensayo ano comercial utilizando la plataforma Leica BondRX. or (RAIC) se realizó en tampón ER2 pH9 (Leica) durante anti-OX40 humano ACT35 (BD Pharmingen) se incubó a ax (Leica) durante 30 minutos. Por último, los portaobjetos geno DAB durante 6 minutos, se tiñeron con tinción de iaron y se cubrieron con medio de montaje Permount. Se uerpo primario.

noclonales anti-CD3 (marcador de células T) y anti-FoxP3 as secciones adyacentes. Como control negativo se usó alino humano hiperplásico. Después de la inmunotinción, con un microscopio óptico.

en todas las muestras examinadas, variando la cantidad l mismo tejido heterogénea. En algunos casos, Como era del tumor y el hospedador. La mayor cantidad de LIT se s muestras tisulares. Sin embargo, en muchos casos se tinción positiva de OX40 en una pequeña fracción de los general, la abundancia de los LIT OX40+ fue proporcional minados, los LIT OX40+ fueron más abundantes en CHC

40 que bloquean la unión de OX-40L con OX-40

ra bloquear la unión de OX40L soluble recombinante con , células 293 transfectadas de forma estable con OX40 bles de anticuerpos anti-OX40. Después, se añadió una nte soluble marcado con his (OX40L-His, R & D Systems) var las células, el OX40L-His unido se detectó utilizando marcado con APC (aloficocianina). La intensidad de de flujo FACSCanto II (Becton Dickinson). Se calculó la inción del anticuerpo anti-etiqueta de His-APC/OX40L-His e generaron curvas de respuesta a la dosis y utilizando el alores de CE50 con respecto al bloqueo de la unión de ores de CE50.

r i n X4 L X4 m i r FA .

con ión

Como se muestra en la figura 16, la mayoría de los ant

unión de OX40L humano soluble con OX40 humana en

6E1, OX40.4 y OX40.5. El bloqueo incompleto por O

humana que los otros anticuerpos analizados o a la u

OX40.4 no bloquearon la unión de OX-40L humano con

unión a un epítopo diferente al de los restantes anticuer

Ejem plo 8: C om petencia/unión de anticuerpos

Los experimentos de unión de anticuerpos se llevaron

OX40 se aplicaron directamente sobre un chip CM5

Anticuerpos anti-OX40, diluidos en serie (1:3) a partir d

nM de antígeno OX40-6X-His durante al menos 1 ho

acopladas con anticuerpos y se observó si había bloqu

superficie para crear el mapa epitópico basado en el b

recubrió la superficie con OX40L para identificar y agru

OX40L. Los experimentos se llevaron a cabo en equipo

Como se resume en la figura 17, los anticuerpos 20

bloqueadores de ligandos; el anticuerpo 3F4 era un bl

bloqueadores de ligandos.

Ejem plo 9: Propiedades b iofísicas de los anticuerpo

La afinidad de varios anticuerpos OX40 por OX40 hum

de plasmón superficial). Brevemente, las mediciones

anticuerpo respectivo en un chip CM5 recubierto con a

una sola concentración de 400 nM o en una dilución en

equipos de RPS BIACORE® T200 o BIACORE® 3000.

Como se muestra en la tabla 13, los anticuerpos anti-O

intervalo de 10'8M a 10'9 M.

os anti-OX40 analizados bloquearon completamente la erficie de las células transfectadas, con la excepción de puede deberse a una menor fuerza de unión a OX40 un epítopo solapado pero diferente. En cambio, 6E1 y . Esta ausencia de bloqueo probablemente se deba a la

o de la siguiente manera. Uno o más anticuerpos antiiacore utilizando química de acoplamiento de amina. concentración inicial de 60 pg/ml, se incubaron con 20 complejo incubado se hizo fluir sobre las superficies zado. El ejercicio se repitió con varios anticuerpos en la cruzado mutuo de todos los anticuerpos. También se anticuerpos capaces de bloquear la interacción OX40-PS Biacore T200 o Biacore 3000.

B3, 8B11, 23H3, 18E9, 14B6, OX40.1 y OX40.2 eran dor parcial de ligandos; y 14A2, 6E1 y OX40.5 eran no

40

luble se analizó mediante análisis de RPS (resonancia finidad se llevaron a cabo capturando 1-10 pg/ml del humano. Se usó el antígeno OX40 humana-6XHIS en 1:2 de 400 nM. Los experimentos se llevaron a cabo en atos se ajustaron a un modelo 1:1.

xaminados tenían constantes de disociación (K^d) en el

-

También se analizó la estabilidad térmica del anticuerp

tabla 14. Las estabilidades térmicas se determinaron

procesaron a una concentración de 250 pg/ml en PBS.

a un modelo que no era de 2 estados. Se determinó

estables analizados cuando se consideraba junto

inmunogenicidad, etc.).

T 0.21, mostrándose un resumen de los resultados en la ando CAP-DSC de GE Healthcare. Las muestras se ocidad de barrido fue de 60 °C/h. Los datos se ajustaron l anticuerpo OX40.21 era uno de los anticuerpos más otros atributos (p. ej., bajos efectos inespecíficos,

4:

También se analizó la farmacocinética del anticuerpo

cangrejeros. El anticuerpo OX40.21 mostró propiedades

intravenosa (IV) a macacos cangrejeros con FC lineal (d

Tabla 15: Parámetros farmacocinéticos de OX40.1 des _______________________________________________

^{Dosis (mg/kg) ABC(INF) * (pg/ml al día) ti} /2 ⁽

0,4 86 ± 5 5,6

4 785 ± 138 6,2

Los parámetros FC se calcularon mediante un método

* Los parámetros FC se calcularon utilizando conc. pla

hasta 7 días

* El % de ABCextra varió entre 24 % y 42 %_________

Los parámetros FC humanos de OX40.21 se proyect

cangrejeros utilizando una escala alométrica (suponien

La t-i/2 humana proyectada fue de 10 días (tabla 16

bicompartimental.

Tabla 16: Parámetros farmacocinét

^{Ab Dosis (mg/kg) ABC(INF) ( pg/mlX}

OX40.21 1 303

E jem plo 10: B loqueo cruzado del clon L106 del a

anticuerpos anti-O X40 no m arcados m edido con FA

Se analizó la capacidad de varios anticuerpos anti-OX

OX40 marcado con PE con células 293 transfectadas c

forma estable con OX40 humano se incubaron primero

marcados. A continuación, las células se lavaron y se in

L106 marcado con PE (BD Biosciences). La intensidad

de flujo FACSCanto II (Becton Dickinson). Se calculó l

tinción del anticuerpo PE-L106 de la población celular

respuesta a la dosis con respecto al bloqueo de la unión

Como se muestra en la figura 18, los anticuerpos 18E9

células transfectadas con OX40 humana, mientras qu

mostraron escaso bloqueo o ninguno, lo que indica que

los otros anticuerpos analizados.

21 después de una sola dosis intravenosa a macacos acocinéticas (FC) aceptables después de una sola dosis a 4 g/kg) y una semivida terminal larga (6 días).

de administración intravenosa en macacos cangrejeros _______________________________________________

^{CLT (ml/h/kg) Vee (ml/kg)}

0,20 ± 0,01 36 ± 2

0,22 ± 0,04 49 ± 12 mpartimental. Los valores son la media ± DE.

as hasta 10 días, excepto el mono 2 a 0,4 mg/kg

_______________________________________________

a partir de los datos de farmacocinética de macacos exponente de potencia = 0,85 para CLT y 1 para Vee). s parámetros FC se calcularon mediante un método

humanos proyectados de OX40.21

^t1/2 ^{(día) CLT (ml/h/kg) Vee (ml/kg)}

10 0,14 47

erpo anti-O X40 m arcado con P E p o r un grupo de

ra bloquear la unión del clon L106 del anticuerpo anti-40 humana. Brevemente, células 293 transfectadas de concentraciones variables de anticuerpos anti-OX40 no n con una concentración fija de 2,5 pg/ml de anticuerpo orescencia de la tinción se midió utilizando un citómetro sidad de fluorescencia media geométrica (IFMG) de la rama informático FACSDiva). Se generaron curvas de 106 utilizando el programa informático GraphPad Prism.

40.1 bloquearon completamente la unión de L106 con B3 mostró bloqueo parcial. Los restantes anticuerpos y OX40.1 se unen a un epítopo diferente en OX40 que Ejem plo 11: A nálisis de bloqueo cruzado de anticue

Este experimento se realizó para examinar las propied

para evaluar las especificidades de unión. En resumen

(APC) y los anticuerpos OX40 humanos OX40.4 y OX4

de anticuerpos OX40 humanos no conjugados a líneas

la proteína OX40 humana en su superficie y se permitió

conjugado, APC-OX40.1 (1 pg/ml), se aplicó biotina-OX

ensayo y se permitió que se uniera a 4 °C durante 30

adicionalmente en presencia de conjugado de estreptavi

células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCan

fluorescencia media (IFM) fue proporcional al anticuerpo

Como se muestra en las figuras 19A-19C, la unión de

humana fue bloqueada por OX40.2 y OX40.5, pero sol

OX40.1 fue bloqueada por8B11.H9, 3F4.G11,20B3.G2

se muestra un diagrama de las relaciones de unión ob

19C.

Las figuras 19D-19E muestran que la unión de

moderadamente bloqueada por 20C1.F2, débilmente blo

por 14A2.B9. La unión de biotina-OX40.5 fue fue

moderadamente bloqueada por 3F4.G11 y débilmente b

Las figuras 19F-19G muestran que la unión de biotina

débilmente bloqueada, si acaso, por OX40.5 u OX40.

moderadamente bloqueada por OX40.6, y solo fue muy

En la figura 19I se muestra un diagrama de las relacion

19D-19G.

Ejem plo 12: Unión de anticuerpos anti-O X40 a un ep

Este ejemplo muestra que 0X40.21 se une a 0X4

desnaturalizada, y esa unión no se ve afectada por la N

La unión de 0X40.21 a 0X40 nativa o desnaturalizada

siguiente manera. Se incubaron muestras de 0X40 hu

con o sin la enzima N-glucanasa PNGasa F para elimi

con o sin glucosilación ligada a N se sometieron a el

desnaturalizada con o sin glucosilación ligada a N se so

Como se muestra en la figura 20A, 0X40.21 se une solo

o ausencia de glucosilación no afecta la unión a 0X40.

glucopéptidos mediante mapeo peptídico después de l

como para AspN12).

Estos datos sugieren que 0X40.21 se une a un epítop

ligada a N.

También se realizaron estudios de mapeo epitópico uti

peptídicos de 0X40 humana ("h0X40") marcada co

Utilizando el sistema Triple-T0F 5600 de AB Sciex,

masas).

Como se muestra en las figuras 20D y 20E, los experim

revelaron que 0X40.16 y 0X40.21 se unían predomina

178), que corresponde a los aminoácidos 46-62 de la p

2). 0X40.8 se unió al péptido DSYKPGVDCAPCPP

corresponde a los aminoácidos 89-124 de la parte ex

ubicación del epítopo unido por 0X40.21 se superpo

determinado por la estructura cristalina del complejo 0

proteínas (b Dp )). En el cuadro superior de la figura 2

espectrometría de masas para 0X40.21 e incluyen Q

(SEQ ID N0: 185), SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPC

N0: 183).

anti-O X40

de bloqueo cruzado de diversos anticuerpos anti-OX40 nticuerpo OX40 OX40.1 se conjugó con aloficocianina marcaron con biotina. Se aplicó una dosis de un grupo res 293 o HT1080 genomodificadas que sobreexpresan se unieran a 4 °C durante 30 min. Sin lavado del Ab no 0,4 pg/ml) o biotina-OX40.5 (0,4 pg/ml) a los pocillos del s células se lavaron y, si fuera necesario, se incubaron PC en las mismas condiciones. Tras el lavado final, las Bioscience, San José, CA). La señal de intensidad de gado unido.

X40.1 a células que sobreexpresan la proteína OX-40 deradamente, si acaso, por OX40.4. La unión de APC-6.C5, pero no por 6E1.A12 y 14A2.B9. En la figura 19H as entre los anticuerpos evaluados en las figuras 19A-

-OX40.4 fue fuertemente bloqueada por 20B3.G2, a, si acaso, por 3F4.G11 y 23H3.C6, y no fue bloqueada nte bloqueada por 20B3.G2, 23H3.C6 y 20C1.F2, ada por 14A2.B9.

.4 no fue bloqueada por OX40.1 u OX40.8, y solo fue unión de biotina-OX40.5 fue bloqueada por OX40.1, ente bloqueada, si acaso, por 0X40.4 u OX40.6.

unión observadas entre los Ab evaluados en las figuras

conform acional/m apeo epitópico

ana no desnaturalizada, pero no a 0X40 humana ilación.

tiene o no glucosilación ligada a N, se determinó de la nativa (es decir, no desnaturalizada) y desnaturalizada N-glucosilación. Las muestras de 0X40 humana nativa oresis en gel SDS, y las muestras de 0X40 humana ron a electroforesis en gel SDS desnaturalizante.

40 nativa y no a la forma desnaturalizada, y la presencia iguras 20B y 20C muestran que se identificaron dos N-glucosilación (ocupación del 60 % tanto para AspN118

es conformacional e independiente de la glucosilación

o espectrometría de masas. Se generaron fragmentos mediante digestión enzimática con endoproteinasas. alizó CL-EM (cromatografía líquida-espectrometría de

de unión de h0X40 nativa mediante proteólisis limitada nte al péptido DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID N0: xtracelular de la 0X-40 humana madura ( SEQ ID N0: PGDNQACKPWTNCTLAGK (SEQ ID N0: 179), que ular de la 0X40 humana madura (SEQ ID N0: 2). La n parte del sitio de unión del ligando 0X40 según lo X40L humano (código ID 2HEV del banco de datos de muestran péptidos adicionales identificados mediante QDTVCR (SEQ ID N0: 184), SQNTVCRPCGPGFYN CNLR (SEQ ID N0: 182), y PCKPCTWCNLR (SEQ ID Ejem plo 13: Los anticuerpos anti-O X-40 promueven la

Y y de IL-2 de las células T

Se analizó la capacidad de los anticuerpos anti-OX-40 p

proliferación y la cantidad de IL-2 e IFN-y secretada por la

Se generó una línea de células CHO transfectadas para

en un ensayo de activación de células T primarias. La líne

humano en un formato de Fv monocatenario, junto con el

anti-OX40 en la superficie de la célula CHO. Brevement

selección negativa (RosetteSep™, StemCell Technologi

CD32A irradiadas a una proporción de célula T:CHO de 8

OX40 o de anticuerpo de control de isotipo. Después de 3

para evaluar la activación de las células T a través de la m

(BD Biosciences) o HTRF (Cisbio), siguiendo las recomen

tritiada durante las aproximadamente 18 últimas horas de

la incorporación de timidina tritiada, como una evaluación

Como se muestra en las figuras 21A-21D y 22A-22D (y

anticuerpos anti-OX40 analizados potenciaron fuertement

células CHO-CD3-CD32, de una manera dependiente de

El grupo de anticuerpos analizado en este ensayo coesti

que, OX40.1, OX40.4 y OX40.5.

Tabl liferación de células T e inducen la secreción de IFN-

inducir la actividad de las células T in vitro midiendo la lulas T incubadas con los anticuerpos.

so como células presentadoras de antígenos artificiales elular CHO-CD3-CD32A expresa el anticuerpo anti-CD3 eptor CD32A de Fc humano para presentar anticuerpos e aislaron células T CD4 primarias humanas mediante y se cultivaron conjuntamente con células CHO-CD3-en presencia de dosis escalonadas de anticuerpos antidías en cultivo a 37 °C, los sobrenadantes se recogieron ión de IFNy humano secretado mediante ensayo ELISA iones del fabricante. Después de eso, se añadió timidina ltivo para medir la proliferación de células T a través de ional de la activación de las células T.

esume más adelante en la tabla 17), la mayoría de los activación de células T CD4 humanas estimuladas por osis, medida por la proliferación y la secreción de IFN^y. ó la activación de células T al menos tan bien, o mejor

7.

Los anticuerpos anti-OX40 humanos también se analiza

células T primarias en cultivos de células mononuclear

enterotoxina B de estafilococo (EBE). Se obtuvo sangre e

en Bristol-Myers Squibb, Redwood City, CA bajo los aus

aislaron mediante purificación en gradiente en un colchón

de cultivo complementado con una cantidad fija subóptima

(EBE; Toxin Technologies, Sarasota, FL) en presencia de para determinar sus efectos sobre la estimulación de de sangre periférica (CMSP) humanas activadas con a humana de AllCells, Inc. (Berkeley, CA) o de donantes s de un programa interno de flebotomía. Las CMSP se Ficoll-Hypaque y se cultivaron durante 3 días en medio ng/ml) de superantígeno enterotoxina B de estafilococo is escalonadas de anticuerpos OX40 o de anticuerpo de control de isotipo junto con 2 - 5 |jg/ml de anticuerpo de

Después de cultivar durante 3 días a 37 °C, los sobrenad

T a través de medición por ensayo ELISA de IL-2 huma

diluyeron 1:10 en diluyente de muestra y se analizó la

según el protocolo recomendado por el fabricante. Desp

leyeron en un lector Spectramax 340PC utilizando el pro

de 650 nm. Las densidades ópticas medidas del sustrat

detección unido.

En las figuras 23A-23F se muestran los datos de las

20C1.F2 entrecruzado de forma soluble suscitó una res

en comparación con los clones 23H3.C6, 8B11.H9, 3F4.

soluble (figuras 23A-23C). Con respecto a los anticuerpo

suscitó una respuesta de citocinas más contundente en c

y OX40.8 entrecruzados de forma soluble (figuras 23D-donantes más, en los que se analizaron anticuerpos

promedio, OX40.21 mostró una fuerza superior en la

OX40.1, OX40.2, OX40.4, OX40.5, OX40.17 y OX40.18.

respuestas que son comparables con las suscitadas por cruzamiento soluble, F(ab')2 de cabra anti-FcY humano. s se recogieron para evaluar la activación de las células ecretada. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo se ncia de IL-2 humana mediante ELISA (BD Bioscience) de la adición de sustrato TMB, las placas de ensayo se a informático operativo Softmax a una longitud de onda mogénico fueron proporcionales a las del anticuerpo de

aisladas de diferentes donantes. En general, el clon a de citocinas más contundente (CE50 de 1,3 - 2,0 nM) 18E9.G5, 6E1.A12 y 20B3.G2 entrecruzados de forma mutaciones en la región variable, OX-40.21, en general, ración con los anticuerpos OX-40.17, OX40.18, OX40.6 Los datos de estos donantes junto con los datos de 8 OX40 adicionales, demuestran en conjunto, que, en a de las respuestas de células T en comparación con s resultados demuestran además que OX40.21 suscita 0.6 y OX40.8 (tabla 18).

E jem plo 14: P rom oción de lisis m ediada p o r células

O X40

Se analizó la capacidad de varios anticuerpos anti-OX4

de células T CD4+ activadas utilizado la liberación de c

diana, células T CD4+ se separaron mediante selección

72 horas con perlas recubiertas con anti-CD3 y anti-C

placas con células CD4+ activadas marcadas con calce

cada anticuerpo anti-OX40 y las células se incubaron d

la intensidad de fluorescencia del medio utilizando un l

celular dependiente de anticuerpos se calculó en función

fórmula: [(IFM de ensayo - media del fondo)/(media máx

Como se muestra en la figura 24, OX40.8 y OX40.16 i

diana (60 % y 30 %, respectivamente). La CE50 de O

restantes anticuerpos analizados indujeron ADCC a niv

Ejem plo 15: Prom oción de lis is m ediada p o r célu

anticuerpos anti-O X40

Se analizó la capacidad de varios anticuerpos anti-OX

primarias de células T CD4+ activadas. Brevemente, par

las CMSP de dos donantes mediante selección magnéti

anti-CD3 y anti-CD28. Para su uso como efectoras, célul

negativa usando perlas magnéticas y se activaron con I

células efectoras NK se mezclaron con células T diana

presencia de anticuerpo a 1 pg/ml durante 2 horas. El ni

se midió leyendo la intensidad de fluorescencia del me

porcentaje de lisis celular dependiente de anticuerpos s

(IFM) con la siguiente fórmula:

[(IFM de ensayo - media del fondo)/(

Como se muestra en las figuras 25A y 25B, el anticuerp

dos donantes de una manera más eficaz. Se observar

como con OX40.1.

Ejem plo 16: Prom oción de fagocitosis ce lu lar m edia

de los anticuerpos OX40

Para determinar la actividad fagocítica mediada por an

primarios se cultivaron durante cuatro horas con cél

valoración de anticuerpos anti-OX40. Después de cuatr

APC y se procesaron en un citómetro de flujo. Se consid

y CellTrace Violet habían sido fagocitadas. El porcentaje

100 x (Número de células doblemente positivas / Númer

Como se muestra en la figura 26, todos los anticuerpos

diana que expresaban OX40 de una manera dependi

fagocitosis y la concentración CE50 más baja fue de 6,

humanos inducen la fagocitosis mediada por FcR de un

Ejem plo 17: Los anticuerpos anti-O X40 se unen al c

Se desarrolló un ensayo ELISA colorimétrico para evalu

se unía al anticuerpo OX40.21. Todos los anticuerpos a

unión a 10 pg/ml. Después de bloquear los sitios de uni

de C1q humano (3,125-200 pM) a los pocillos, incluidos

para la unión de C1q de fondo inespecífica a la placa d

detectó utilizando una combinación de anticuerpo antisustrato de tetrametilbencidina. Los resultados se expre

Como se muestra en la figura 27, C1q se unió a OX40

(círculos blancos) de una manera dependiente de la dosi

bajo que el del anticuerpo de control de isotipo IgG1 hu

grises) y ninguna unión de C1q evidente a un control de 92 utilizando líneas celulares de los anticuerpos anti-

manos para promover la lisis mediada por células NK92 na como lectura. Brevemente, para su uso como células ativa utilizando perlas magnéticas y se activaron durante . Después de tres días, células NK92 se sembraron en AM a una relación de 5 a 1. Se añadió una valoración de te dos horas. La liberación de calceína se midió leyendo de placas Envision (Perkin Elmer). El porcentaje de lisis la intensidad de fluorescencia media (IFM) con la siguiente - media del fondo)] x 100.

jeron la mayor cantidad de lisis específica de las células 8 fue de 16 ng/ml y la de OX40.16 fue de 4 ng/ml. Los demasiado bajos para una cuantificación precisa.

N K de células T CD4+ hum anas prim arias de los

umanos para promover la lisis mediada por células NK uso como células diana, células T CD4+ se separaron de se activaron durante 72 horas con perlas recubiertas con K se separaron de un donante distinto mediante selección durante 24 horas. Después del período de activación, las rcadas con calceína a relaciones de 20:1, 10:1 o 5:1 en e calceína liberado por las células diana sometidas a lisis utilizando un lector de placas Envision (Perkin Elmer). El lculó en función de la intensidad de fluorescencia media

ia máxima - media del fondo)] x 100.

40.8 causó la lisis de células T CD4+ diana activadas de iveles más bajos de actividad ADCC tanto con OX40.21

o r m acrófagos de células HEK 293 que expresan OX40

rpos de varios anticuerpos OX40, macrófagos humanos HEK293/OX40 marcadas con CellTrace Violet y una ras, las células se recogieron, se tiñeron con anti-CD64-ue las células con tinción doblemente positiva para CD64 células diana fagocitadas se calculó utilizando la fórmula: tal de células CellTrace Violet positivas).

ti-OX40 analizados indujeron la fagocitosis de las células de la dosis. OX40.8 tuvo el nivel global más alto de /ml. Esto demuestra que los anticuerpos IgG1 anti-OX40 nera dependiente de la dosis.

onente C1q de l com plem ento hum ano

i el componente C1q del complemento de suero humano ados se aplicaron en una placa de inmunoensayo de alta proteínas desocupados, se añadieron dosis escalonadas pocillos vacíos bloqueados que sirvieron como controles ayo. La unión de C1q a los anticuerpos inmovilizados se de ratón biotinilado y estreptavidina-poli-HRP, junto con como la densidad óptica leída a 450 nm menos 630 nm.

(cuadrados negros) y al control de isotipo IgG1 humano in embargo, el nivel de unión de C1q a OX40.21, fue más . Como se esperaba, había poca señal de fondo (círculos po IgG1.1 (círculos negros). El anticuerpo IgG1.1 contiene cinco mutaciones en la parte Fc diseñadas para elimi

demuestra que el componente C1q del complemento de

puede inducir la lisis mediada por el complemento de cé

Ejem plo 18: OX40 se expresa en linfocitos in filtrante

OX-40 se expresa en linfocitos infiltrantes de tumor, co

(figura 28A) con expresión mínima en células T CD8+ (f

28C).

De manera similar, OX40 es expresado por células T CD

MC38 de ratón (figura 28E). Para analizar la expresión d

o 2x106 células MC38 se implantaron por vía subcutáne

implante, se extrajeron los tumores, se disociaron en su

flujo. Las poblaciones de células T se identificaron en f

Sa1N, las células CD4+ Foxp3+ del tumor se muestran

azul y las células CD8+ están en el histograma naranja (

el histograma verde. Para tumores MC38, las células T

muestran en el histograma verde y las células CD8+ en

Ejem plo 19: Inversión de la supresión m ediada p o r c

Se analizó la capacidad de varios anticuerpos anti-OX

reguladoras (Treg) de la proliferación de células T CD

(Tresp) se aislaron enriqueciendo las CMSP con respect

y después clasificando las células Treg CD4+CD25hiCD

células Tresp se marcaron con colorante de proliferaci

células Treg, comenzando en una proporción de 1:1.

placa, 1 pg/ml de anti-CD28 soluble y 2 pg/ml de anti-O

la proliferación de células Tresp se midió evaluando la d

Como se muestra en la figura 29, tanto en presencia c

aumentaron la proliferación de células Tresp en compara

anti-OX40 analizados invirtieron los efectos supresores

Ejem plo 20: Estudios de toxicidad

Se administró OX40.6 (2 mg/kg) por vía intravenosa a

cualquier toxicidad asociada. No se observó evidencia d

OX40.6 estimuló una respuesta inmunitaria mejorada c

mayor expresión de CD69 en células T CD4+ en un ens

aclaramiento acelerado, que se correlacionó con la form

La concentración de OX40.6 en muestras de suero de

mediante un inmunoensayo de quimioluminiscencia (QL

muestras de control de calidad (CC). Como molécul

biotinilada-his en microplacas recubiertas con estrept

muestras de control de calidad llevadas a una matriz fin

placas. Las muestras se analizaron a una dilución mínim

(PTB) que contenía suero de ratón al 2 %. El material no

se detectó utilizando como molécula de detección un a

HRP. Después de añadir sustrato quimioluminiscente

de 0X40.6 en muestras de suero de mono cangrejero s

con un lector de placa M5 utilizando una curva de calib

calibradores de anticuerpos 0X40.6. El intervalo de

5.000 ng/ml en suero de mono cangrejero. Los límites s

respectivamente (es decir, LDCS de 5.000 ng/ml, LDCI

3.750, 400 y 20 ng/ml en suero de macaco cangrejero

aceptable del ensayo. Los calibradores, los CC y las m

ratón al 2 %. Se utilizaron cuatro placas de estreptavidin

dentro de un intervalo aceptable: el % de CV entre placa

de CC estuvo dentro de ± 30 % de los valores nominale

La presencia de anticuerpos anti-fármaco contra 0X40.6

anteriormente se determinó mediante inmunoensayo de

se usó anticuerpo monoclonal de ratón anti-Fc de IgG h unión a C1q y la interacción con FcR. Este resultado humano puede unirse a OX40.21 e indica que OX40.21 que expresan OX40 in vivo.

tum or

patrón que está generalmente limitado a células CD4+ 28B) en cáncer colorrectal, de pulmón y ovárico (figura

Treg en tumores Sa1N de ratón (figura 28D) y en tumores 40 de ratón en tumores, 2x106 células de sarcoma SA1N ratones AJ o B6 respectivamente. El día 15 después del siones de células sueltas y se tiñeron para citometría de n de su expresión de CD8, CD4 y Foxp3. Para tumores histograma rojo, las CD4+ Foxp4- están en el histograma 28D). Las células teñidas de control de isotipo están en e muestran en el histograma azul, las células CD4+ se tograma rojo (figura 28E).

s Treg de los anticuerpos anti-O X40

manos para invertir la supresión mediada por células T umanas. Brevemente, células Treg y T respondedoras élulas CD4+ mediante separación con perlas magnéticas y las Tresp CD4+CD25loCD127hiCD45R0+. Después, las se sembraron en placas con números de valoración de ultivos se estimularon con 3 pg/ml de anti-CD3 unido a nido a placa o control de isotipo. Después de 96 horas, n del colorante mediante citometría de flujo.

en ausencia de células Treg, los anticuerpos anti-OX40 con el control de isotipo. Esto sugiere que los anticuerpos s células Treg sobre la proliferación de células Tresp.

s los días 1 (figura 30A) y 29 (figura 30B) para evaluar blemas de tolerabilidad o anomalías de patología clínica. KLH, como se caracteriza por una tendencia hacia una e recuerdo ex-vivo con KLH. Dos de 4 monos mostraron de anticuerpos anti-fármaco.

aco cangrejero para el experimento anterior se analizó nticuerpo OX40.6 se utilizó para preparar calibradores y captura para OX40.6. se inmovilizó la OX40-humana a (Greiner Bio-one). Las muestras, los patrones y las suero de mono cangrejero al 10 % se incubaron en las uerida del 10 % en BSA al 1 %/PBS/Tween 20 al 0,05 % se eliminó por lavado y el anticuerpo OX40.6 capturado rpo anti-IgG humano monoclonal de ratón marcado con Signal ELISA Pico (Thermo Scientific), la concentración culó a partir de la intensidad de la luminiscencia medida n logística de 4 parámetros (4-PL) generada a partir de rva de calibración del anticuerpo 0X40.6 fue de 5 a r e inferior de cuantificación fueron de 5.000 y 10 ng/ml, ng/ml). Se prepararon muestras de control de calidad a nalizaron en cada placa para garantizar un rendimiento as se diluyeron 5 veces en PTB que contenía suero de analizar las muestras. El rendimiento del ensayo estuvo os patrones estuvo por debajo del 25 % y la recuperación

uero de macacos cangrejeros en el experimento descrito por electroquimioluminiscencia (EQL). Específicamente, o para preparar el control positivo. Anti-0X40 biotinilado: como molécula de captura se usó anti-hOX40-his a 25 ng

hOX40-his a 25 ng/ml. Las muestras se analizaron a u

0,05 % (PTB) que contenía moléculas de captura y de

polipropileno, la mezcla de muestra se transfirió a placas

de incubación, el material no unido se eliminó por lavad

placas MSD SI6000, se midió la EQL. El control positivo (

100 (MPC) y 10 ng/ml (LPC) en suero de macaco cangr

cangrejero agrupado. La relación de señal para HPC, M

Se utilizó una placa de estreptavidina para analizar las mu

aceptable: El % de CV de la PC fue inferior al 10 %, y

comparable a la señal sin procesar para las muestras pre

Ejem plo 21: Estudio de evaluación de l riesgo de inm u

Se realizaron ensayos de proliferación de células T in vi

evaluar su potencial de inmunogenicidad humana. Br

periférica (CMSP) de voluntarios sanos mediante Ficoll (

leucocitario humano (HLA, Human Leukocyte Antigen) d

en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain

(Prolmmune).

Se usó un grupo de 40 donantes de CMSP que tenían tip

frecuencias de la población mundial para realizar un en

controlar la proliferación y se sembraron en placas de 96

(Lonzo) que contenía AB humano al 10 % (Bioreclamatio

Los anticuerpos anti-OX40 humanos, las proteínas de co

las CMSP a 1 pM durante 7 días, después de lo cual el m

anticuerpo monoclonal anti-CD4 humano APC (BD scienc

una etapa de lavado, las células se fijaron con formol al 3,

flujo para determinar el porcentaje de células CD4+ en pr

En la figura 31 se muestra el porcentaje de 40 donantes q

significativo en la proliferación de células T CD4+ en rela

anticuerpos anti-OX40 humanos. Todas las variantes

potencial para activar las células CD4+ en este ensayo

OX40.16 y OX40.21, que no mostró una respuesta positi

Estos resultados sugieren que estos anticuerpos antirespuesta de anticuerpos anti-fármaco en seres humanos

Ejem plo 22: La unión a receptores Fc activados m ejo

de colon

Para analizar el papel de la unión a FcR en la actividad d

de ratón, se analizaron anticuerpos anti-OX40 de difer

subcutánea de 2 millones de células tumorales MC38. D

y los ratones se aleatorizaron en grupos de tratamiento

Los anticuerpos formulados en PBS se administraron por

un volumen de 200 pl.

En modelos de tumor singénico de ratón, los anticuerpo

actividad antitumoral. Dado que la variación del isotipo

superficie de las células T (tanto coestimuladores como c

anticuerpos, se generaron variantes de isotipo Fc de ra

OX40/OX40L. Como se muestra en las figuras 32A-32C,

da como resultado una actividad antitumoral superior e

(figura 32B). Esto probablemente se deba tanto al agot

expansión de las células T efectoras por el agonismo de

Para confirmar los efectos de diferentes isotipos de antic

los tumores de ratones MC38 que fueron tratados con los

Los ratones seleccionados se sacrificaron y los tumores

la implantación del tumor. Con la parte posterior de u

disociando el tumor y el ganglio linfático en una placa de

de filtros de 70 pm, se sedimentaron, se resuspendieron

placas de 96 pocillos con 1 x 106 células por pocillo para la

de flujo FACS Canto (BD). El análisis de los bazos y tu y como molécula de detección anti-OX40 rutenilado:antidilución de 100 veces en BSA al 1 %/PBS/Tween 20 al ción. Después de 2 horas de incubación en placas de SD recubiertas con estreptavidina. Después de una hora se añadió tampón de lectura de MSD y con el lector de ti-Fc de IgG humano de ratón) se preparó a 1.000 (HPC), ro. Como control negativo (CN) se usó suero de macaco y LPC frente al CN fue de 102, 10 y 2, respectivamente. tras. El rendimiento del ensayo estuvo dentro del intervalo señal sin procesar para el control negativo (54 URL) fue s a la dosis (48-55 URL).

genic idad

para varios de los anticuerpos anti-OX40 humanos para mente, se aislaron células mononucleares de sangre Healthcare) y centrifugación en gradiente, y el antígeno ase II se caracterizó mediante amplificación por reacción action ) e hibridación con sondas de oligonucleótidos

de HLA de Clase II que coincidían estrechamente con las o. Las CMSP se marcaron con CFSE (Invitrogen) para cillos en 6 copias a 200.000 células por pocillo en RPMI aminoácidos no esenciales (Gibco) y pen-estrep (Gibco). l, los anticuerpos de referencia y ConA se cultivaron con io se eliminó por lavado y las células se marcaron con un Después de eliminar el anticuerpo anti-CD4 no unido con (Sigma) en PBS y se analizaron mediante citometría de eración.

mostró una respuesta positiva (definida como un aumento n con las CMSP incubadas en medio) para los diferentes los anticuerpos anti-OX40 humanos mostraron un bajo omparable a la proteína de bajo CC, con excepción de de proliferación de CD4 en ninguno de los 40 donantes.

40 humano tienen un bajo potencial para suscitar una

la activ idad anti-m O X40 en un m odelo de carcinom a

s anticuerpos anti-OX40 de ratón en modelos de tumores es isotipos. Ratones C57BL/6 recibieron una inyección ués de 7 días, se determinaron los volúmenes tumorales respecto a volúmenes tumorales medios comparables. intraperitoneal los días 7, 10 y 14 a 200 pg por dosis en

nti-OX40 murinos (p. ej., OX86, IgG1 de rata) presentan muchos anticuerpos específicos para los receptores de hibidores) puede alterar la actividad antitumoral de estos de OX86, un anticuerpo que no bloquea la interacción X86 formateado como Fc de IgG2a de ratón (figura 32C) omparación con OX86 formateado como IgG1 de ratón iento de las células Treg en el sitio del tumor como a la 40 mediado por anticuerpos.

rpo en las poblaciones de células T infiltrantes de tumor, ferentes isotipos fueron evaluados por citometría de flujo. azos se extrajeron para su análisis el día 15 después de jeringa, se prepararon suspensiones de células sueltas pocillos. Las suspensiones celulares se pasaron a través e contaron. A continuación, las células se sembraron en ción. Después, las muestras se analizaron en un citómetro res de los ratones portadores de tumores tratados con anticuerpos anti-OX40 muestra que el isotipo IgG2a pued

(figura 33A), y que los isotipos IgG1 e IgG2a pueden ac

dan como resultado un aumento del número de células

agonismo de OX40 (pero no necesariamente el bloqueo

anticuerpo OX86, promueven la actividad antitumoral.

El papel del Fc y de los FcR humanos se analizó utilizan

y se habían reemplazado por FcR humanos. Estos exp

médula ósea en el que se irradiaron hospedadores cong

médula ósea transgénicas FcR humanas. Después, se d

antes de ser inoculados con 2x106 células tumorales

tumorales y los ratones se aleatorizaron en grupos de

comparables. Los anticuerpos formulados en PBS se ad

por dosis en un volumen de 200 jl. Los ratones se tratar

híbrido G1 humano OX-86 quimérico (figura 34B) o con e

34C). Los resultados fueron similares a los observados c

tuvo un efecto antitumoral significativo ya que puede uni

que aumenta la unión tanto a CD32B como a CD32A, tu

mayor nivel de actividad se deba al aumento del agon

agotamiento de las células Treg en el sitio del tumor.

Las poblaciones de células T en el sitio del tumor y los b

se ha descrito anteriormente. Las Treg fueron menos frec

observándose un mayor efecto con el isotipo S267E (fi

porcentajes de células T CD8+ (figura 35B) y de efectora

fueron mayores con el anticuerpo G1 S267E. También s

ratones tratados con los anticuerpos anti-OX-40 (figura 3

mostró una fuerte actividad antitumoral (figuras 34A-34C)

Ejem plo 23: Un anticuerpo anti-O X40 b loqueante m

ratón

Para determinar si un anticuerpo que bloquea la int

antitumoral, se realizó el siguiente experimento. Para est

que bloquea la interacción OX40/OX40L (anticuerpo IgG1

modelo de tumor CT-26 de ratón subcutáneo. ^c T-26 es

ratón cuyo crecimiento de tumor sólido se puede control

vía subcutánea.

Ratones hembra Balb/c (Charles River Laboratories, H

antes de iniciar los estudios. Se alojaron 5 ratones por

microaisladores. La temperatura del alojamiento estaba

doce cambios de aire de la sala por hora. Se mantuv

proporcionó dieta esterilizada para roedores de laboratori

Las células CT-26 se mantuvieron en medio RPMI-164

bovino fetal al 10% (FBS; Hyclone, cat. n.° SH30071.

contenidas en un solo matraz T175, se dividieron y expa

que se obtuvo un número suficiente de células para la i

80 % de confluencia, se lavaron y se resuspendieron en

El día 0, se implantaron 1 x 106 células CT-26 en los rato

Lakes, NJ) y una aguja de calibre 27 de 5/8 pulgadas. D

dimensiones con un calibrador electrónico (Mitutoyo, Auro

tumorales (mm3) se calcularon usando la fórmula: anchur

del volumen tumoral el día 6 después de la implantació

ratones con un volumen tumoral medio de 26 mm3 se a

tabla 19.

El anticuerpo de control de isotipo de hámster es un anti

contra Gs T (clon PIP, n.° de catálogo BE0260; BioXcell

antes de la administración para proporcionar dosis de 1

días 6, 10 y 14, como se muestra en la tabla 19.

El anticuerpo monoclonal contra OX40 de ratón (clo

administración para proporcionar dosis de 10, 3, 1 o 0,3 sar el agotamiento de células Treg CD4+ en los tumores la expansión de células T en la periferia (figura 33B) y el bazo (figura 33C). Estos resultados sugieren que el interacción OX40/OX40L) y la unión al receptor Fc del

tones en los que los FcR de ratón se habían inactivado ntos se realizaron utilizando un sistema de quimera de os CD45.1 y después se reconstituyeron con células de ue estos ratones se reconstituyeran durante 8 semanas . Después de 7 días, se determinaron los volúmenes amiento con respecto a volúmenes tumorales medios traron por vía intraperitoneal los días 7, 10 y 14 a 200 |jg on una IgG1 humana de control (figura 34A), con un Ab rido G1 humano OX-86 con una mutación S267E (figura s isotipos de ratón, es decir, el anticuerpo IgG1 humano los FcR activadores, mientras que la mutación S267E, ayor actividad (figuras 34A-34C). Es probable que este en las células T efectoras, así como al aumento del

de ratones portadores de tumores se examinaron como s en ratones tratados con el anticuerpo G1 o G1 S267E, 35A). También fueron evidentes los aumentos en los 4+ (figura 35C) y en el sitio del tumor, y estos aumentos servó un aumento de la celularidad en los bazos de los Estos resultados sugieren que el anticuerpo OX86-hIgG1 agotamiento medible de células Treg (figuras 35A-35D).

a activ idad antitum oral en un m odelo de tum or de

ión entre OX40/OX40L muestra una fuerte actividad se generó un anticuerpo de hámster anti-OX40 de ratón de hámster) y se analizó su actividad antitumoral en un línea celular de tumor de adenocarcinoma de colon de ratones BALB/c cuando las células se trasplantan por

r, CA) se aclimataron durante un mínimo de tres días , y las jaulas se colocaron en estantes ventilados con 26 °C y a 50 20 % de humedad relativa con al menos ciclo de luz/oscuridad de 12 h. A los animales se les gua de abastecimiento municipal a demanda.

clone, cat. n. °SH30096.01) complementado con suero Aproximadamente dos veces por semana, las células on en cuatro matraces T175 a una dilución de 1:5 hasta ntación del tumor. Las células se recogieron cerca del .

tilizando una jeringa de 1 cc (Becton Dickinson, Franklin és, los tumores se midieron dos veces por semana en 3 llinois) y se las mediciones se registraron. Los volúmenes ngitud x altura x 0,5. Después de realizar las mediciones ratones se clasificaron según el volumen tumoral. Los rizaron en grupos y se trataron como se muestra en la

po monoclonal (mAb) de IgG de hámster armenio inerte st Lebanon, NH). Se preparó en PBS inmediatamente /kg por ratón mediante inyección intraperitoneal (IP) los

5) se preparó en PBS inmediatamente antes de la kg por ratón mediante inyección IP los días 6, 10 y 13, como se muestra en la tabla 19.

T l :

Diariamente, se comprobaron los cambios de postura, de

animales. Los animales se pesaron dos veces por sema

comprobó la presencia y el tamaño de los tumores en los ra

Los tumores se midieron en 3 dimensiones con un calibrad

se registraron. La respuesta a los compuestos de tratamien

alcanzaba un volumen > 1500 mm3 o parecía ulcerado, los

Como se muestra en las figuras 36A-36E, el mAb de há

muestran el tratamiento con diferentes dosis de 8E5), de

subcutáneo en comparación con el grupo de control de i

administró a dosis que variaron entre 0,3 y 10 mg/kg, e in

ratones no presentaban tumores (NT) al final del período d

no difirió significativamente entre cada grupo de dosis, tenie

de estudio, los ratones tratados con cualquiera de las dos

el crecimiento del tumor en comparación con los ratones

hubo ratones sin tumor en el grupo tratado con control de is

el día 39 como resultado de la ulceración o de la carga tum

Estos datos indican que un anticuerpo anti-OX40, que blo

fuerte actividad antitumoral en un modelo de tumor subcut

tumores establecidos.

Ejem plo 24: E l agonism o de O X40 se s inerg iza con e l

M C38 m urino

Para analizar la sinergia entre los tratamientos con el

analizaron combinaciones de estos anticuerpos en el mod

una inyección subcutánea de 2 millones de células tu

volúmenes tumorales y los ratones se aleatorizaron en gr

medios comparables. Los anticuerpos formulados en PBS

a 200 |jg por dosis en un volumen de 200 jl.

Como se muestra en las figuras 37A-37D, tanto el anticu

(figura 37C) mostró una actividad mínima cuando se utilizar

cuando se combinaban (figura 37D), con 5 de 8 ratones si

Ejem plo 25: E l agonism o de OX40 aum enta la respuest

Se midió el aumento de las respuestas inmunitarias a las

para estimular las respuestas inmunitarias en macacos c

deseado, es decir, el aumento de las respuestas inmunit

humanos sanos, ya que carecen de tumores.

Los monos se inmunizaron con hemocianina de lapa califo

el día 1 (10 mg, por vía intramuscular) y con antígeno de s

surface antigen) (ENGERIX-B) (20 jg por vía intramuscul

vacunas, los monos recibieron una dosis intravenosa de

respuestas inmunitarias se midieron los días 22 y 41 media

respuestas de anticuerpos dependientes de células T con

38B, los hallazgos relacionados con OX40.6 a 2 mg/kg los d

en la respuesta de recuerdo ex-vivo contra KLH, caracter icalamiento y de respiración, así como el letargo, de los y se sacrificaron si la pérdida de peso era > 20 %. Se es dos veces por semana hasta la muerte o el sacrificio. lectrónico (Mitutoyo, Aurora, Illinois) y se las mediciones se midió en función del crecimiento del tumor. Si el tumor imales se sacrificaban.

ter anti-OX40 de ratón (clon 8E5; figuras 36B-36E que tró una fuerte actividad antitumoral en el modelo CT-26 ipo IgG de hámster (figura 36A). El anticuerpo 8E5 se so a la dosis más baja evaluada (0,3 mg/kg), 10 de 12 studio (Día 72). Aunque el número de ratones sin tumor o cada grupo 9 o 10 ratones sin tumor al final del período sis más altas (3 o 10 mg/kg) mostraron más retrasos en tados con las dos dosis más bajas (0,3 o 1 mg/kg). No po; todos los ratones de ese grupo se habían sacrificado al (>1500 mm3).

ea la interacción entre OX40 y OX40-L, demuestra una eo CT-26 de ratón cuando se administra a ratones con

queo de PD-1 en un m odelo de carcinom a de colon

icuerpo anti-OX-40 y con el anticuerpo anti-PD-1, se de tumor de ratón MC38. Ratones C57BL/6 recibieron ales MC38. Después de 7 días, se determinaron los os de tratamiento con respecto a volúmenes tumorales administraron por vía intraperitoneal los días 7, 10 y 14

o anti-PD-1 (figura 37B) como el anticuerpo anti-OX40 solos, pero tenían una actividad antitumoral significativa mor.

las vacunas en m acaco cangrejero

unas para evaluar la capacidad del anticuerpo OX40.6 grejeros. Se seleccionó este enfoque porque el efecto as a los tumores, no puede evaluarse en primates no

ana (KLH, siglas del inglés keyhole limpet hemocyanin) rficie del virus de la hepatitis B (HBsAg, hepatitis B virus los días 1 y 29). Después de la administración de las o 2 mg/kg de anticuerpo OX40.6 los días 1 y 29. Las la respuesta ex-vivo de células T contra KLH y mediante KLH y HBsAg. Como se muestra en las figuras 38A y 22 (figura 38A) y 41 (figura 38B), incluyeron un aumento do por aumentos en el porcentaje medio de células T CD4+CD8- que expresan CD69+, IFN-gamma+ y TNF-alf

Ejem plo 26: Unión de l recep to r Fc a anticuerpos con

Este ejemplo demuestra que los anticuerpos que tiene

comprenden el dominio CH1 y la bisagra de la IgG2 se

de la IgG1.

Además de la unión a antígeno por los dominios variable

(FcgR) a través de la interacción con los dominios consta

tales como la citotoxicidad celular dependiente de an

anticuerpos (ADCP). La actividad de la función efectora e

IgG2 y IgG4 debido a que estos isotipos tienen una afini

IgG1 se puede modificar a través de la mutación de rest

selectividad y la afinidad por FcgR.

La unión de los anticuerpos a receptores Fc gamma (Fc

incluyendo resonancia de plasmón superficial (RPS) de

estudios con RPS se realizaron en un equipo de Biaco

anticuerpo anti-6xHis murino se inmovilizó sobre un c

~3000 UR. Se capturaron diversos FcgR etiquetados co

utilizando un tiempo de contacto de 30 s a 10 ul/min, y

ejecución de NaPO4 10 mM, NaCl 130 mM, p20 al 0,05

incluían CD64 (FcgRI), CD32aH131 (FcgRIIa-H131), C

(FcgRIIIa-V158), CD16b-NA1 (FcgRIIIb-NA1) y CD16B

(interferometría de biocapa) en un equipo RED Fortebio O

p20 al 0,05 % (PBS-T) pH 7,1. Los anticuerpos se capt

detectores recubiertos con proteína A, seguido de la

hCD16a-V158 a 1 pM o hCD64 a 0,1 pM.

En primer lugar, se produjeron anticuerpos que conten

sustituciones S267E (SE) y S267E/L328F (SELF), así

P271G, H268D, A330R, G237D, E233D, referidas com

estudió mediante RPS de Biacore en comparación con l

S228P), así como con un anticuerpo IgG1.1f que se ha

resultados, mostrados en la figura 70, demuestran las pro

y de los anticuerpos IgG1 mutados, incluyendo un aume

SE y SELF, así como un aumento de la selectividad de lo

H131 y CD32a-R131 (figura 39).

El siguiente conjunto de construcciones se usó para gen

modo tendría una función efectora negativa. Para este es

en el contexto de la región constante de IgG2.3, o de un

Los anticuerpos se expresaron a pequeña escala como

FcgR utilizando tecnología de biodetección por interf

anticuerpos estaban presentes a baja concentración en l

anticuerpos fuera de los sobrenadantes utilizando dete

analitos FcgR en solución. Para la comparación, también

sobrenadante, incluidos los anticuerpos IgG1 de tipo silv

de control demostró las propiedades de unión al FcgR e

el perfil de unión esperado, con unión apreciable solame

introducir las mutaciones S267E, L328F, P238D, P271G,

recapitular la afinidad de FcgR de los correspondientes

construcción IgG2.3G1-AY puedo preservar completam

silvestre, conservando al mismo tiempo las regiones

IgG2.3G1-AY que contenían S267E, L328F, P238D,

propiedades de unión a FcgR comparables a las de los

(figura 40). Esto demuestra el éxito de la genomodificac

combinada con la función efectora de la IgG1 de tipo silv inios constantes genom odificados

iones constantes de cadena pesada modificadas que a los F^cyR cuando contienen los dominios CH2 y CH3

anticuerpos se pueden acoplar a receptores Fc gamma . Estas interacciones median en las funciones efectoras rpos (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de para el isotipo IgG1, pero es muy baja o no existe para más baja por los FcgR. Además, la función efectora de e aminoácido en las regiones constantes para alterar la

FcgR) se estudió utilizando tecnologías de biodetección ore e interferometría de biocapa (IBC) de Fortebio. Los 100 (GE Healthcare) a 25 °C. El fragmento Fab de un etector CM5 utilizando EDC/NHS a una densidad de (7 ug/ml) a través de la etiqueta de his en C-terminal ión del anticuerpo 1,0 uM se evaluó en un tampón de S-T) pH 7,1. Los FcgR utilizados en estos experimentos -R131 (FcgRIIa-R131), CD32b (FcgRIIb), CD16a-V158 (FcgRIIIb-NA2). Se realizaron experimentos de IBC (Pall, Fortebio) a 25 °C en NaPO4 10 mM, NaCl 130 mM, n de cada sobrenadantes de expresión no diluidos en de analitos hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b,

los dominios Fc de IgG1 modificados que incluían las o diversas combinaciones de las mutaciones P238D, , V7, V8, V9 y V12. La unión de estos anticuerpos se nticuerpos IgG1f, IgG2.3 (IgG2-C219S) e IgG4.1 (IgG4-modificado para reducir la unión a todos los FcgR. Los ades unión a FcgR esperadas de IgG1f, IgG2.3 e IgG4.1 e la unión de CD32a-H131, CD32a-R131 y CD32b para tantes V4, V7, V8, V9 y V12 para CD32b sobre CD32a-

dificar la función efectora en el isotipo IgG2, que de otro , las mutaciones descritas anteriormente se introdujeron ido IgG2.3/IgG1f denominado IgG2.3G1-AY (Tabla 20). renadantes, y se analizaron en cuanto a la unión a los etría de biocapa de Fortebio Octet. Puesto que los obrenadantes, el experimento se realizó capturando los s recubiertos con proteína A, seguido de la unión de incluyeron anticuerpos IgG1f de control purificados y en , SE, P238D, V4 y V12 y cada uno de estos anticuerpos das (figura 40). El anticuerpo IgG2.3 también demostró CD32a-H131. Sin embargo, todas las mutaciones para 8D, A330R, G237D o E233D en IgG2.3 no consiguieron b de IgG1 genomodificados (figura 40). En cambio, la las propiedades de unión a FcgR de la IgG1 de tipo y bisagra de IgG2.3. Además, todos los mutantes de 1G, H268D, A330R, G237D y E233D demostraron b versión IgG1 que conteníam las mismas mutaciones e los anticuerpos con regiones CH1 y bisagra de IgG2 o mutante.

Esta estrategia de genomodificación se exploró adicio

IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-S267E (IgG2.3G1-AY-V27)

IgG2.5G1-AY-V27), y otros anticuerpos híbridos que cont

IgG1 y IgG2, y analizando la unión de estos anticuerpos

utilizando la tecnología de RPS de Biacore. De acuerdo

mostraron que los anticuerpos IgG2.3G1-AY e IgG2.3G1-las de IgG1f y IgG1f-S267E respectivamente, a pesar de

de IgG2 de forma A (IgG2.3) (Tabla 21). También se obt

AY e IgG2.5G1-AY-V27, demostrando el éxito de la geno

la mutación C131S denominada IgG2.5) que tienen func

Los datos de diversos otros anticuerpos con regiones con

IgG2.3G1-AY-V27, IgG2.5G1-AY o IgG2.5G1-AY-V27

ampliamente aplicable a otros anticuerpos independiente mente produciendo otros anticuerpos formateados con sí como variantes de IgG2 forma B (IgG2.5G1-AY e ían combinaciones diferentes de dominios constantes de os FcgR etiquetados con his capturados por anti-Fab his n los datos de sobrenadante de Octet, los datos de RPS -V27 tenían propiedades de unión a FcgR comparables a e contenían las regiones CH1 y bisagra de un anticuerpo eron datos similares utilizando los anticuerpos IgG2.5G1-dificación de los anticuerpos IgG2 forma B (que contienen es efectoras de IgG1f o similares de IgG1f modificadas. ntes pero regiones variables diferentes de IgG2.3G1-AY, uestran que esta estrategia de genomodificación es e los dominios variables (Tabla 21).

- - -

ni i n

Ejem plo 27: Efectos de los anticuerpos anti-O X40 c

sobre la p ro liferación de células T e IF N -^y y secreción

Los anticuerpos anti-OX40 con regiones CHI/bisagra de

activación de las células T en ausencia de entrecruzam

células T in vivo en ausencia, o con baja expresión, de ti

promover la actividad antitumoral en una gama más amp

de isotipo IgG1.

Como alternativa, los anticuerpos con la región CHI/bisa

para promover la activación de las células T, pero puede

los F^cyR en comparación con los anticuerpos de isotipo

activación de células T y la actividad antitumoral.

Se generan anticuerpos anti-OX40 que tienen regiones c

las secuencias mostradas en la tabla 22 y utilizando los regiones constantes de cadena pesada m odificadas e IL -2 de células T con o sin entrecruzam iento.

2 modificadas pueden tener la capacidad de promover la to y, por lo tanto, pueden promover la activación de las de células que expresan los FcyR, y posiblemente para de tipos de tumores en comparación con los anticuerpos

modificada pueden seguir necesitando entrecruzamiento ner una actividad agonista aumentada cuando se unen a G1 y, por tanto, pueden ser más fuertes promoviendo la

stantes de cadena pesada modificadas que comprenden ayos descritos a continuación, se analizaron sus efectos sobre la proliferación de células T y la secreción de IF

secuencias de cadena ligera de los anticuerpos OX40.6,

y 116 (tanto de OX40.16 como de 40.21), respectivamen

T IL-2 de las células T con o sin entrecruzamiento. Las , 40.16 y 40.21 corresponden a las SEQ ID NO: 96, 110 2.

Ensayo con CHO-CD3 /- CD32

Los anticuerpos anti-OX-40 con las secuencias que s

capacidad para inducir la actividad de las células T in

secretada por las células T incubadas con los anticuerpo

Las líneas de células CHO transfectadas se generan par

en un ensayo de activación de células T primarias. La lí

humano en un formato de Fv monocatenario, junto con el

anti-OX40 en la superficie de la célula CHO. La línea c

formato Fv monocatenario sin FcR.

Brevemente, las células T CD4 primarias humanas se

Technologies) y se cocultivan con células CHO-CD3-C

proporción de T:CHO de 8:1, en presencia de dosis esca

de isotipo. Después de 3 a 4 días en cultivo a 37 °C, los

células T a través de la medición de IFN-^y humano se

(Cisbio), siguiendo las recomendaciones del fabricant

aproximadamente 18 últimas horas de cultivo para medi

timidina tritiada, como una evaluación adicional de la act

Ensayo con CMSP activadas con EEB

Los anticuerpos anti-OX-40 con las secuencias que se m

sobre la estimulación de células T primarias en cultiv

humanas activadas con enterotoxina B de estafilococo (

AllCells, Inc. (Berkeley, CA) o de donantes en Bristolprograma interno de flebotomía. Las CMSP se aislaron

Hypaque y se cultivaron durante 3 días en medio de culti

de superantígeno enterotoxina B de estafilococo (EBE;

escalonadas de anticuerpos OX40 o de anticuerpo de c

cultivos 2 - 5 |jg/ml de anticuerpo de entrecruzamiento s

durante 3 días a 37 °C, los sobrenadantes se recogen par estran en la tabla 22 se analizan para determinar su midiendo la proliferación y la cantidad de IL-2 e IFN-y

uso como células presentadoras de antígenos artificiales elular CHO-CD3-CD32A expresa el anticuerpo anti-CD3 tor Fc humano (FcR) CD32A para presentar anticuerpos CHO-CD3 expresa anticuerpo anti-CD3 humano en un

mediante selección negativa (RosetteSep™, StemCell irradiadas o con células CHO-CD3 irradiadas, a una as de anticuerpos anti-OX40 o de anticuerpo de control enadantes se recogen para evaluar la activación de las do mediante ensayo ELISA (BD Biosciences) o HTRF spués de eso, se añade timidina tritiada durante las roliferación de células T a través de la incorporación de n de las células T.

an en la tabla 22 se analizan para determinar sus efectos células mononucleares de sangre periférica (CMSP) Las muestras de sangre entera humana se obtienen en Squibb, Redwood City, CA bajo los auspicios de un iante purificación en gradiente en un colchón de Ficollmplementado con una cantidad fija subóptima (85 ng/ml) in Technologies, Sarasota, FL) en presencia de dosis l de isotipo. En algunos casos, también se añade a los , F(ab')2 de cabra anti-FcY humano. Después de cultivar luar la activación de las células T a través de la medición de IL-2 humana secretada mediante ensayo ELISA. Br

diluyente de muestra y se analizan con respecto a la

según el protocolo recomendado por el fabricante. Des

leen en un lector Spectramax 340PC utilizando el progr

650 nm. Las densidades ópticas medidas del sustrato

detección unido.

Ensayo de RLM

En una reacción linfocitaria mixta alogénica de células

anti-OX-40 con las secuencias mostradas en la tabla 2

de células T humanas primarias y la secreción de IF

donantes humanos sanos mediante selección negativa (

de sangre periférica de donantes humanos sanos utili

días en presencia de GM-CSF e IL-4 para obtener cél

cocultivan en presencia de dosis escalonadas de anticu

casos, también se añade a los cultivos 2 - 5 pg/ml de

cabra anti-FcY humano. El sobrenadante de cada mue

secretado mediante ensayo ELISA (BD Biosciences) o

Después de recoger el sobrenadante, los cultivos celul

últimas 16-18 horas del cultivo. Las células se recogen

de 3[H]-timidina incorporada en las células como una m

Ejem plo 28: A ctiv idad antitum oral de l m A b OX40 ag

Para analizar la sinergia entre los tratamientos con el

analizaron combinaciones de estos anticuerpos en el

tumores CT26 y se inició la dosificación de mAb el día

200 pg/ratón de los anticuerpos indicados en las figuras

Como se muestra en las figuras 41A-41D, tanto el antic

(figura 41C), mostraron una actividad mínima cuand

tratamientos), pero tenían una actividad antitumoral si

ratones sin tumor.

Ejem plo 29: Ensayo clínico de fase 1/2a en sujetos c

Se lleva a cabo un estudio de fase 1/2a de OX40.21 ad

con tumores sólidos avanzados para demostrar la eficac

o ipilimumab.

1. Objetivo

El objetivo principal del estudio es evaluar la seguridad,

la dosis máxima tolerada (DMT)/dosis recomendada pa

nivolumab o ipilimumab en sujetos con tumores maligno

Los objetivos secundarios incluyen investigar la activida

con nivolumab o ipilimumab en sujetos con tumores mal

solo y junto con nivolumab o ipilimumab; y caracterizar l

nivolumab o ipilimumab y la inmunogenicidad de nivolu

de exploración incluyen explorar las posibles asociacio

biomarcadores en muestras de biopsia tumoral y sangre

de OX40.21 solo o junto con nivolumab o ipilimumab;

con OX40.21 en el intervalo QTc; caracterizar la FC de n

y OX40.21; caracterizar la FC de ipilimumab en sujetos

la supervivencia global (SG) en sujetos tratados con O

posibles relaciones entre la dosis/exposición y la

(biomarcadores seleccionados en muestras de sangre

clave en sujetos tratados con OX40.21 solo y junto con

2. D iseño y duración de l estudio

Se trata de un estudio abierto de fase 1/2a de OX40

monoterapia inicial con OX40.21 con combiterapia post ente, los sobrenadantes de cultivo se diluyen a 1:10 en ncia de IL-2 humana mediante ELISA (BD Bioscience) de la adición de sustrato TMB, las placas de ensayo se nformático operativo Softmax a una longitud de onda de ogénico fueron proporcionales a las del anticuerpo de

las dendríticas (RLMAlo T:CD), se analizan anticuerpos respecto a su capacidad para potenciar la proliferación as células T totales se aíslan de sangre periférica de tteSep, Stemcell Technologies). Los monocitos se aíslan microperlas CD14 (Miltenyi) y se cultivan durante seis dendríticas (CD) inmaduras. Las CD y las células T se OX40 o de anticuerpo de control de isotipo. En algunos erpo de entrecruzamiento soluble, tal como F(ab')2 de se recoge entre el día 4 y el día 7 para medir el IFN-y (Cisbio), siguiendo las recomendaciones del fabricante. se pulsan con 1 pCi/pocillo de 3[H]-timidina durante las lacas de filtro y se leen los recuentos de 3[H] por minuto de la proliferación de células T.

a con bloqueo de CTLA-4 en un m odelo de CT26

uerpo anti-OX-40 y con el anticuerpo anti-CTLA-4, se lo de tumor de ratón CT26. Se inocularon ratones con pués de la inoculación (se dosificó los días 3, 7 y 10) con 41D.

anti-CTLA-4 (figura 41B) como el anticuerpo anti-OX40 utilizaron solos (1 de 8 ratones sin tumor en ambos ativa cuando se combinaban (figura 41D), con 4 de 8

m ores sólidos

rado solo o junto con nivolumab o ipilimumab en sujetos la administración de OX40.21 solo o junto con nivolumab

lerabilidad, las toxicidades limitantes de la dosis (TLD) y ase 2 (DRF2) de OX40.21 administrado solo o junto con nzados.

tumoral preliminar de OX40.21 administrado solo o junto avanzados; caracterizar la FC de OX40.21 administrado unogenicidad de OX40.21 administrado solo o junto con ipilimumab administrado con OX40.21. Otros objetivos tre la actividad antitumoral y seleccionar mediciones de rica antes del tratamiento y después de la administración ar el posible efecto de la monoterapia y la combiterapia ab en sujetos que reciben la combinación de nivolumab eciben la combinación de ipilimumab y OX40.21; evaluar solo y junto con nivolumab o ipilimumab; y explorar las dad antitumoral, los efectos farmacodinámicos (FC) rica y de biopsia tumoral) y las medidas de seguridad mab o ipilimumab.

n sujetos con tumores sólidos avanzados que integra e nivolumab o ipilimumab.

Los apartados del estudio (aumento de la dosis y ampli

en datos de seguridad, FC y FD emergentes del estudi

aumento de la dosis de monoterapia con OX40.21.

monoterapia sirven como base para iniciar el aumento d

de las 3 primeras cohortes de dosis de monoterapia, ad

junto con nivolumab, sirven como base para iniciar el au

de establecer una DRF2 tolerable y farmacológicamente

inicia la ampliación de la dosis en cohortes tumorales e

3. A um ento de la dosis

En la figura 42 se muestra un esquema del diseño del e

La fase del estudio de aumento de la dosis evalúa la se

0 ipilimumab, en sujetos con tumores sólidos avanzado

El nivel de dosis inicial de OX40.21 es de 20 mg. Las d

basan en las TLD utilizando un modelo BLRM (siglas

regresión logística bayesiana) (para monoterapia con O

nivolumab o ipilimumab). El período de TLD es de 28 dí

y combiterapia. La tasa de TLD se determina en funci

producen en el período de TLD y para los cuales no s

dosis para la siguiente cohorte/nivel de dosis de monot

junto con todos los datos FC, FD y de seguridad clínica

selección de la dosis inicial de OX40.21 para la Parte 2

incluyendo evaluaciones de seguridad clínica y de labor

marco de modelado jerárquico bayesiano incorporando

1A) como de nivolumab (CA209-003). La selección de la

los datos disponibles de las Partes 1A y 2A, incluyen

FC/FD, y recomendación de modelado dentro del marc

toxicidad de agente único tanto de OX40.21 (Parte 1A)

modificarse según el BLRM (-Cópula), pero no deben s

Durante el aumento de la dosis de todas las cohortes d

días antes de que otros sujetos de esa cohorte se trate

En cada parte de aumento de la dosis se inscriben aprox

de aumento de la dosis varía según las recomendaci

Cópula). Inicialmente, se tratan aproximadamente 3 suj

junto con nivolumab o ipilimumab. Durante la fase

aproximadamente 3 sujetos evaluables a los niveles

sujetos evaluables con respecto a la TLD se tratan con

Parte 1A: La inscripción comienza en la Parte 1A, aum

de OX40.21 de la Parte 1A es de 20 mg, con dosis po

pueden modificarse según el BLRM, pero no deben sup

Parte 2A: la Parte 2A es el grupo de combinación de O

tolerado al menos 3 niveles de dosis en el aumento de

DMT en el aumento de la dosis de monoterapia (Parte

nivel de dosis por debajo de la dosis que se ha demost

seguridad de la combinación. En ningún momento la dos

en la Parte 1A. Nivolumab se administra a una dosis con

de 2 semanas y los fármacos del estudio se administr

máximo de 12 ciclos.

Parte 3A: la Parte 3A es el grupo de combinación de O

hayan tolerado al menos 3 niveles de dosis en el aume

una DMT en el aumento de la dosis de monoterapia (Pa

en la parte de aumento de la dosis de OX40.21 con nivo

1 nivel de dosis por debajo de la dosis que se ha dem

dosis de OX40.21 en la Parte 3A supera la dosis más alt

de las dosis combinadas en los sujetos tratados. Ipili

tratamiento tiene una duración de 3 semanas. OX40.21

hasta 8 ciclos inclusive, e ipilimumab se administra c

administra OX40.21 en los 4 últimos ciclos.

de la dosis) proceden en un enfoque por fases basado primer apartado del estudio comienza con cohortes de atos clínicos de las 3 primeras cohortes de dosis de osis de OX40.21 junto con nivolumab. Los datos clínicos de los datos clínicos de la primera cohorte de OX40.21 de la dosis de OX40.21 junto con ipilimumab. Después a de OX40.21 en el apartado de aumento de la dosis, se cas.

de la Parte 1A.

d y tolerabilidad de OX40.21, solo o junto con nivolumab

nes de aumento de dosis para las dosis posteriores se nglés bayesian logistic regression method, método de ) o un modelo BLRM (-Cópula) (para OX40.21 junto con a las dos partes de aumento de la dosis de monoterapia la frecuencia, gravedad y duración de los AA que se de identificar una causa alternativa. La selección de la tiene en cuenta la recomendación del BLRM (-Cópula) laboratorio disponibles de todos los sujetos tratados. La etermina utilizando los datos disponibles de la Parte 1A, datos FC/FD, y recomendación de modelado dentro del s de toxicidad de agente único tanto de OX40.21 (Parte inicial de OX40.21 de la Parte 3A se determina utilizando aluaciones de seguridad clínica y de laboratorio, datos odelado jerárquico bayesiano incorporando perfiles de o de ipilimumab (CA184-022). Las dosis reales pueden el doble de la dosis previamente analizada.

, el sujeto inicial (sujeto centinela) se observa durante 5 el fármaco del estudio.

mente 30 sujetos. El número de sujetos en cada cohorte el BLRM (método de regresión logística bayesiana) (­ on los niveles de dosis iniciales de OX40.21 u OX40.21 mento de la dosis se tratan cohortes adicionales de is recomendados por el BLRM (-Cópula). Al menos 6 T.

e la dosis en monoterapia con OX40.21. La dosis inicial es previstas de 40, 80, 160 y 320 mg. Las dosis reales l doble de la dosis previamente analizada.

con nivolumab que se inicia después de que se hayan sis de monoterapia o de que se haya determinado una a dosis inicial de OX40.21 en la Parte 2A es al menos 1 que se tolera en la Parte 1A para garantizar una mayor OX40.21 en la Parte 2A supera la dosis más alta tolerada de 240 mg. Cada ciclo de tratamiento tiene una duración a 2 semanas a partir del Día 1 de cada ciclo hasta un

1 con ipilimumab que se inicia solo después de que se la dosis de monoterapia o de que se haya determinado ) y de que se haya tolerado al menos 1 cohorte de dosis . La dosis inicial de OX40.21 en la Parte 3A es al menos o que se tolera en la Parte 1A. En ningún momento la ada en la Parte 1A para garantizar aún más la seguridad se administra a una dosis de 1 mg/kg. Cada ciclo de dministra cada 3 semanas a partir del Día 1 del Ciclo 1, semanas a partir del día 1 durante 4 ciclos. Solo se Ampliación de la dosis:

El tratamiento en las cohortes de ampliación de la dosis

de la evaluación de todos los datos de seguridad clínica

producen después del período de TLD), FC, FC y de m

3A). En todas las cohortes de ampliación de la dosis se

La Parte 1B es la cohorte de ampliación de la dosis de m

en la DMT/DRF2 determinada en la Parte 1A. La dosi

administra cada 2 semanas hasta un máximo de 12 ciclo

12 sujetos.

La Parte 2B es la parte de ampliación de la dosis de la c

la DMT/DRF2 determinada en la Parte 2A. Nivolumab s

tratamiento tiene una duración de 2 semanas y los fárm

Día 1 de cada ciclo hasta un máximo de 12 ciclos. En

sujetos.

La Parte 2C es la parte de ampliación de la dosis de la c

DMT/DRF2 determinada en la Parte 2A. Cada ciclo de t

del estudio se administran cada 2 semanas a partir del

cohorte de ampliación se tratan aproximadamente 27 su

La Parte 3B es la parte de ampliación de la dosis de la

la DMT/DRF2 determinada en la Parte 3A. Cada ciclo de

administra en los 4 ciclos iniciales junto con OX40.21.

hasta un máximo de 4 ciclos más durante un total de h

esta cohorte de ampliación se tratan aproximadamente

Resumen de los periodos del estudio:

Los sujetos completan hasta 5 períodos en el estudio: E

24 semanas), Seguimiento de seguridad (mínimo 100 dí

de Supervivencia (hasta aproximadamente 2 años des

figura 43 se muestra el esquema del programa de visita

Periodo de exploración:

El período de exploración dura hasta un máximo de 28 dí

de la elegibilidad inicial del sujeto y la firma del formul

utilizando una tecnología de respuesta interactiva (TRI).

Período de tratam iento:

El período de tratamiento consiste en hasta un máxim

tratamiento, la decisión de tratar a un sujeto con el si

semanas de tratamiento, se basa en evaluaciones del

realizan cada 8 semanas durante cada régimen de dosif

régimen de dosificación de 3 semanas (c3s). Las evalu

pueden confirmarse al menos 4 semanas después de l

valoración de la respuesta se evalúan utilizando los crite

por las siglas del inglés Response Evaluation Criteria In

Los sujetos con una respuesta de enfermedad estable (

el siguiente ciclo de tratamiento. Por lo general, se per

hasta que se produzca por primera vez una de las sigui

1) finalización del número máximo de ciclos; 2) enfer

probable que el tratamiento obtenga más beneficios; 4)

interrupción de la terapia del estudio.

Seguim iento de seguridad:

Al finalizar la terapia del estudio, los sujetos ingresan en

de fin de tratamiento (FTT), los sujetos se evalúan co

durante al menos 100 días después de la última dosis d inicia cuando se ha determinado la DMT/DRF2 en función s TLD, los acontecimientos adversos significativos que se lado disponibles del aumento de la dosis (Partes 1A, 2A y tan aproximadamente 110 sujetos.

oterapia con OX40.21 en sujetos con cáncer cervicouterino ción de OX40.21 comienza el Día 1 de cada ciclo y se En esta cohorte de ampliación se tratan aproximadamente

biterapia (OX40.21 con nivolumab) en sujetos con CCR a dministra a una dosis constante de 240 mg. Cada ciclo de os del estudio se administran cada 2 semanas a partir del sta cohorte de ampliación se tratan aproximadamente 35

biterapia (OX40.21 con nivolumab) en sujetos con CM a la amiento tiene una duración de 2 semanas y los fármacos ía 1 de cada ciclo hasta un máximo de 12 ciclos. En esta s.

biterapia (OX40.21 con ipilimumab) en sujetos con CO a tamiento tiene una duración de 3 semanas. Ipilimumab se pués, el sujeto continúa con la monoterapia con OX40.21 a un máximo de 24 semanas (8 ciclos) de tratamiento. En sujetos con CO.

loración (hasta un máximo de 28 días), Tratamiento (hasta , Seguimiento de la Respuesta y Seguimiento Prolongado la primera dosis) como se describe más adelante. En la el estudio.

El período de exploración comienza con el establecimiento o de consentimiento informado. Los sujetos se inscriben

e 24 semanas de dosificación. Después de cada ciclo de nte ciclo de terapia del estudio, hasta un máximo de 24 sgo/beneficio y del tumor. Las evaluaciones del tumor se ción de 2 semanas (c2s) y cada 9 semanas durante cada nes de respuesta parcial (RP) y respuesta completa (RC) valuación inicial. La progresión del tumor o los criterios de de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST, lid Tumors ) v1.1.

), RP o RC al final de un ciclo determinado, continúan con e que los sujetos continúen con el tratamiento del estudio s situaciones:

ad progresiva; 3) deterioro clínico que sugiere que no es olerancia a la terapia; o 5) cumplir con los criterios para la

período de Seguimiento de Seguridad. Después de la visita respecto a cualquier acontecimiento adverso (AA) nuevo terapia. Las visitas de seguimiento se realizan los días 30, 60 y 100 después de la última dosis o de la fecha

consentimiento para participar en el estudio) comp independientemente de si comienzan una nueva terapia

Seguim iento de supervivencia:

Después de finalizar el período de Seguimiento de Segu

Supervivencia. Se realiza un seguimiento de los paciente

se produzca la muerte, la pérdida de contacto, la retirada

primero. La duración de esta fase es de hasta 2 años des

Seguim iento de la Respuesta:

Después de finalizar el período de Seguimiento de Seguri

de FTT ingresan en el período de Seguimiento de Resp

Seguimiento de Supervivencia. A estos sujetos se les sig

cada 3 meses (12 semanas) durante el período de S

enfermedad o la retirada del consentimiento del estudio.

que tienen un beneficio clínico continuado siguen reco

supervivencia del estudio. Los sujetos que presentan pr

terapia del estudio no se evalúan en cuanto a la respue

terapia dirigida al tumor según sea necesario.

Duración de l estudio:

La duración total del tiempo del estudio de cualquier sujet

cuando el último sujeto completa su última visita del estu

estudio.

Núm ero de sujetos:

Se inscribirán aproximadamente 225 sujetos, y se tratará

Población de estudio:

Los sujetos tienen al menos 18 años y tienen confirmació

(metastásica, recurrente, refractaria y/o irresecable) con e

Criteria In Solid Tumors, criterios de evaluación de respu

R eglas de aum ento y de detención de la dosis

En las Partes 1A, 2A y 3A, los modelos BLRM y BLRM (-la dosis después de que la información de la TLD esté

dosis de OX40.21 para la siguiente cohorte/nivel de dosis

con la recomendación clínica y todos los datos disponible

sujetos tratados.

Toxicidades L im itantes de la Dosis

Para aconsejar el aumento de la dosis, las TLD se defin

AA para los que no se identifica una causa alternativa cl

los) fármaco(s) del estudio. Para la gestión de los sujetos,

del ciclo en el que se produzca, conduce a la interrupci

estudio durante el intervalo de evaluación de la TLD por

sujeto al mismo nivel de dosis. La frecuencia de la(s) TL

decisiones de aumento de la dosis y para definir la DMT.

tienen en cuenta para definir la DMT, si se determina

relacionados con la progresión de la enfermedad. Los suj

fármaco del estudio e ingresan en el período de seguimie

con los criterios terminológicos comunes para acontecim

Adverse Events) v4.03 del Instituto Nacional del Cáncer (

TLD no hemática:

A. TLD hepática

interrupción. Los sujetos (excepto los que retiran su an 3 visitas clínicas de seguimiento de seguridad tra el cáncer.

d, los sujetos ingresan en el período de Seguimiento de proximadamente cada 3 meses (12 semanas) hasta que consentimiento la o finalización del estudio, lo que suceda és de la primera dosis del fármaco del estudio.

, todos los sujetos con EE en curso, RP o RC en la visita sta, que se produce al mismo tiempo que el período de realizando evaluaciones clínicas y radiológicas del tumor uimiento de la Respuesta o hasta la progresión de la evaluaciones radiológicas de los tumores de los sujetos ndose después de que los sujetos finalicen la fase de resión de la enfermedad después del curso inicial de la más allá de la visita de FTT y se les permite recibir otra

dividual es de aproximadamente 2 años. El estudio acaba , que es aproximadamente 4 años después del inicio del

proximadamente 200 sujetos en el estudio.

istológica o citológica de una neoplasia maligna avanzada rmedad medible según los RECIS^t (Response Evaluation a en tumores sólidos) v1.1.

ula) se utilizan para las recomendaciones de aumento de onible para cada cohorte de sujetos. La selección de la ne en cuenta la recomendación del BLRM (-Cópula) junto e FC, FD y seguridad clínica y de laboratorio de todos los

en función de la frecuencia, intensidad y duración de los . El período de TLD es de 28 días desde el inicio del (de AA que cumpla los criterios de TLD, independientemente del fármaco del estudio. Los sujetos que se retiren del tivos distintos a una TLD pueden sustituirse por un nuevo urante el período de evaluación de la TLD se usa en las s AA que se producen después del período de la TLD se no tienen una causa alternativa clara y que no están s que experimentan una TLD no vuelven a tratarse con el de seguridad del estudio. Los AA se clasifican de acuerdo tos adversos (CTCAE, Common Terminology Criteria for ).

• Cualquier elevación > grado 3 de AST, ALT o bilirr

• AST, ALT o bilirrubina total,

• AST o ALT de grado 2 con inflamación hepática si

derecho, ictericia, prurito)

• AST o ALT > 3 x L^s N y bilirrubina total simultáne

alcalina [ALP] en suero elevada) (p. ej., hallazgos

posible lesión hepática inducida por fármacos o p

B. TLD no hepática

• Uveítis, epiescleritis o iritis de grado 2 o mayor

• Cualquier otro dolor ocular de grado 2 o visión b

gravedad de grado 1 en 2 semanas o requiera trat

• Neumonitis, broncoespasmo, toxicidad neurológic

grado 3 o mayor

• Cualquier toxicidad no dermatológica, no hepátic

siguientes excepciones específicas:

• Anomalías electrolíticas de grado 3 o grado 4

asociadas, que duren menos de 72 horas y que

médica convencional

• Náuseas, vómitos o diarrea de grado 3 que duren

respondan a intervención médica convencional

• Elevación de amilasa o lipasa de grado 3 o 4 no a

• Fiebre aislada de grado 3 no asociada a deteri

laboratorio de alteración de la perfusión de órgano

• Endocrinopatía de grado 3 bien controlada con su

• Reagudización tumoral de grado 3 (definida como

se sabe, o se sospecha, que hay un tumor)

• Cansancio de grado 3 durante menos de 7 días

• Reacción a la infusión de grado 3 que vuelve al gr

TLD dermatológica

• Exantema de grado 4

• Exantema de Grado 3 si no hay mejoría (es decir, res

1 a 2 semanas. Los sujetos que no hayan experimenta

en presencia de toxicidad cutánea de grado 2.

TLD hemática

• Neutropenia de grado 4 > 5 días de duración

• Trombocitopenia de grado 4 o trombocitopenia de gr

necesidad de transfusión de plaquetas

• Anemia de grado 4 no explicada por enfermedad sub

• Neutropenia febril de grado 4

• Neutropenia febril de grado 3 que dura > 48 horas

• Hemólisis de grado > 3 (es decir, que requiere transfu

Tratam iento con ciclos adicionales m ás allá de las 24

Los sujetos reciben tratamiento durante 24 semanas a m

del fármaco del estudio. Los sujetos que completen aproxi

de la enfermedad (RC, RP o E^e ) son elegibles para 24

(Parte 1) y combiterapia (Partes 2 y 3) más allá de las 24

favorece la administración continuada de la terapia de est

del estudio, los sujetos ingresan en el período de Seguim

Tratam iento m ás allá de la p rogresión

Se permite el tratamiento más allá de la progresión en suje

en los RECIST v1.1 después de determinar que la evalua

de la terapia del estudio (p. ej., los sujetos siguen experim

otros criterios).

ina total

ática (p. ej., dolor a la palpación en el cuadrante superior 2 x LSN sin hallazgos iniciales de colestasis (fosfatasa consonancia con la ley de Hy o la definición de la FDA de F)

sa que no responda a la terapia tópica y no mejore a la iento sistémico

reacción de hipersensibilidad o reacción a la infusión de de grado 3 o mayor se considerará como TLD con las no se compliquen por experiencias clínicas adversas resuelvan espontáneamente o respondan a intervención nos de 72 horas y que se resuelvan espontáneamente o iada a indicio clínico o radiográfico de pancreatitis hemodinámico (p. ej., hipotensión, indicio clínico o de erminales)

ución hormonal

lor, irritación o exantema que se localiza en sitios donde

1 en menos de 6 horas

ción a < grado 1) después de un retraso de la infusión de un AA cutáneo de grado 3 pueden reanudar el tratamiento

3 con hemorragia clínicamente significativa o cualquier ente

n o intervención médica, tal como esteroides)

m anas

os que se cumplan antes los criterios para la interrupción damente 24 semanas de tratamiento con control continuo anas adicionales de terapia del estudio en monoterapia manas iniciales cuando la evaluación de riesgo/beneficio io. Tras completar las 24 semanas adicionales de terapia to de Seguridad.

seleccionados con enfermedad progresiva inicial definida n de beneficio/riesgo favorece la administración continua tando beneficios clínicos, toleran el tratamiento y cumplen Retratam iento

Si durante el período de seguimiento de la respuesta se

el tratamiento (retratamiento). Los sujetos que complet

adicionales, si procede) de terapia y que ingresen en el pe

de la enfermedad (RC, RP o EE) sin toxicidad significati

elegibles para un retratamiento caso por caso tras evalu

la administración de terapia adicional del estudio, y si el

tratamiento con la terapia del estudio. Los sujetos que

régimen de monoterapia o combiterapia asignado origin

administró durante las 24 primeras semanas), a menos qu

la DMT, en cuyo caso al sujeto se le trata con la siguiente

Criterios de inclusión

1) Consentimiento informado por escrito

a) Antes de realizar cualquier procedimiento relac

del SOC (standar of care, tratamiento habitual), el

b) Consentimiento para muestras de biopsia tum

tratamiento para las cohortes de ampliación de l

cualquiera de las cohortes de aumento de la dosis

aumento de la de dosis).

2) Población destinataria

Los sujetos deben tener al menos 18 años y confir

avanzada (metastásica, recurrente, refractaria y/o irre

A. Aumento de la dosis:

Los sujetos deben haber recibido y después hab

menos 1 régimen de tratamiento estándar en el

sujetos que no sean elegibles para ninguna terapi

esté documentada en los registros médicos. Se

sujetos con tumores primarios del sistema nervios

de enfermedad activa.

(i) Melanoma: el estado de la mutación BRAF

(ii) CPNM: el estado de la mutación EGFR, AL

(iii) Cáncer de cabeza y cuello restringido a car

si se conoce

(iv) Carcinoma de células de transición del apa

(v) Carcinoma de células renales

(vi) Adenocarcinoma pancreático

(vii) CCR: el estado de MSI, KRAS y BRAF de

(viii) Cáncer cervicouterino: el estado del VPH

(ix) Cáncer de mama HER2 triple negativo, el

(x) Adenocarcinoma del endometrio

(xi) Cáncer ovárico

(xii) Adenocarcinoma de próstata

(xiii) Cáncer hepatocelular, solo con Child Pug

(xiv) Cáncer de pulmón microcítico

(xv) Cáncer gástrico y de la unión gastroesofá

B. Ampliación de la dosis: Partes 1B, 2B, 2C y 3

Se permitirán los siguientes tipos de tumores:

(a) Cáncer cervicouterino - Parte 1B

(i) Cáncer cervicouterino histológicament

progresión documentada de la enfermedad

(ii) Documentar el estado del VPH del tum

consentimiento para permitir que se analice

portaobjetos sin teñir).

(iii) Requisito de terapia previa:

1. Deben haber recibido y después pro

terapia sistémica estándar, para enferm nfirma la progresión de la enfermedad, se permite repetir aproximadamente 24 semanas (o ciclos de tratamiento do de seguimiento de la respuesta con un control continuo son elegibles para un retratamiento. Dichos sujetos son determinar si la relación entre riesgo/beneficio respalda jeto sigue cumpliendo los criterios de elegibilidad para el plen los criterios para el retratamiento se tratan con el ente (p. ej., la misma dosis y pauta posológica que se osteriormente se descubra que esa dosis y pauta superan sis más baja que se considere tolerable/segura.

ado con el estudio que no se considere que forme parte to debe firmar el formulario de consentimiento informado. l (se requieren biopsias obligatorias antes y durante el osis, y para los sujetos adicionales que se incorporen a eviamente completadas y opcionales para las cohortes de

ción histológica o citológica de una neoplasia maligna able) con enfermedad medible según los RECIST v1.1.

progresado, o haber sido refractarios o intolerantes a, al texto avanzado o metastásico, si tal terapia existe. Los stándar podrán inscribirse siempre que su no elegibilidad miten las siguientes histologías tumorales excepto para entral (SNC) o con metástasis del SNC como único sitio

e documentarse si se conoce.

KRAS y ROS1 debe documentarse si se conoce

oma epidermoide. El estado del VPH debe documentarse

o genitourinario

documentarse si se conoce.

be documentarse si se conoce.

ado RE y RP debe documentarse

: el estado de HER2 debe documentarse si se conoce.

onfirmado e irresecable, metastásico o recurrente con

si se conoce. Si se desconoce, los sujetos deben dar su muestra de tejido tumoral enviada y archivada (bloque o

sado o haber sido intolerantes o refractarios a al menos 1 d metastásica y/o irresecable (p. ej., paclitaxel/cisplatino, paditaxel/cisplatino/bevacizumab). La q

primaria y la quimioterapia adyuvante d

regímenes de quimioterapia sistémica.

(b) Cáncer colorrectal - Parte 2B

(i) CCR histológicamente confirmado que es

la enfermedad

(ii) Documentar el estado de MSI, MMR, KRA

dar su consentimiento para permitir que se

(bloque o portaobjetos sin teñir).

(iii) Requisito de terapia previa:

Los sujetos deben haber recibido y después

al menos 1 terapia sistémica estándar,

progresado en los 6 meses siguientes a la te

(c) Cáncer de vejiga - Parte 2C

(i) Carcinoma urotelial histológica o citoló

carcinoma urotelial con elementos de otros

progresión o enfermedad refractaria

(ii) Requisito de terapia previa:

Los sujetos deben haber recibido y después

al menos 1 régimen de terapia sistémica e

tratamiento de enfermedad metastásica (Est

(d) Cáncer ovárico - Parte 3B

(i) Carcinoma ovárico histológica o citológi

primario peritoneal o de las trompas de Falo

(ii) Estado documentado de la mutación BR

sujetos deben dar su consentimiento para p

y archivada (bloque o portaobjetos sin teñir).

(iii) Requisito de terapia previa:

Los sujetos deben haber recibido y después

al menos 1 terapia sistémica estándar (p.

metastásica y/o irresecable.

3) Estado funcional según el Grupo Oncológico Cooper

4) Presencia de al menos 1 lesión con enfermedad medi

de la respuesta. Los sujetos con lesiones en un camp

medible, pueden inscribirse siempre que la(s) lesión(

medirse con precisión.

5) Para los sujetos que requieran biopsia tumoral en fre

para la biopsia antes y durante el tratamiento, adem

requerida para la evaluación de la respuesta. Esta lesi

que se esté(n) evaluando para determinar la respuesta

6) Sujetos con exposición anterior a terapia con cualqui

de puntos de control (tal como los anticuerpos antidespués de un período de reposo farmacológico de

tratamiento

Observación: (i) Los sujetos que hayan experiment

relacionados con la terapia de puntos de control, deben

en el momento de incorporarse en el estudio, que no

según lo documentado por la resolución de todos los

exploración física y/o anomalías de laboratorio asocia

haber completado la reducción gradual de esteroides

antes de comenzar el tratamiento con la terapia del

inmunorelacionados con la terapia de puntos de control

con el monitor médico (p. ej., se permite la inscripción d

sin características clínicas o radiológicas de pancreatitis

7) Se permiten sujetos con terapia previa con cu ioterapia simultánea administrada con la radiación después de finalizar la radioterapia no cuentan como

tastásico o recurrente con progresión documentada de

BRAF si se conoce. Si se desconoce, los sujetos deben alice su muestra de tejido tumoral enviada y archivada

ber progresado o haber sido intolerantes o refractarios a a enfermedad metastásica y/o irresecable (o haber ia adyuvante).

mente confirmado (incluyendo histologías mixtas de ubtipos) de la pelvis renal, uréter, vejiga o uretra con

ber progresado o haber sido intolerantes o refractarios a ndar (p. ej., quimioterapia basada en platino) para el o IV) o localmente avanzada e irresecable.

ente confirmado (incluyendo CO epitelial, carcinoma con progresión documentada de la enfermedad

de la línea germinal, si se conoce. Si se desconoce, los itir que se analice su muestra de tejido tumoral enviada

ber progresado o haber sido intolerantes o refractarios a , quimioterapia basada en platino), para enfermedad

o de la Costa Este (ECOG) <1.

según lo definido en los RECIST v1.1 para la evaluación previamente irradiado como único sitio de enfermedad haya(n) demostrado una clara progresión y pueda(n)

, los sujetos deben tener al menos una lesión accesible de la lesión mínima medible según los RECIST v1.1 debe ser distinta de la de la(s) lesión(es) indicadora(s) iológica.

agente dirigido específicamente a la inhibición de la ruta -1, anti-PD-Ll, anti-PD-L2, anti-LAG-3 y anti-CTLA-4) alquier tiempo superior a 4 semanas desde el último

previamente AA inmunomediados de grado 1 a 2, er confirmado la recuperación de estos acontecimientos an endocrinopatías tratadas con com plem entación, tomas clínicos relacionados, hallazgos anómalos en el . Cuando sea aplicable, estos sujetos también deben a el tratamiento de estos AA en un mínimo de 14 días dio. (ii) La elegibilidad de los sujetos con AA previos grado > 3, se considerará caso por caso tras comentarlo levaciones aisladas asintomáticas de lipasa de grado 3

uier agente dirigido específicamente a las vías de coestimulación de células T, excepto el anticuerpo an

de reposo farmacológico de más de 4 semanas desde

8) La radioterapia paliativa previa debe haberse com

fármaco del estudio. Se recomienda encarecidament

del estudio que puedan requerir radioterapia paliativa

del estudio que reciban radioterapia paliativa antes de

9) Los sujetos inscritos en las cohortes de aumento y

adquisición de tejido tumoral existente fijado en formol

de 15 portaobjetos (preferentemente 25 portaobjetos)

se dispone de una muestra archivada, el sujeto debe d

al tratamiento. Los sujetos que no pueden proporc

consentimiento para realizar una biopsia tumoral previ

elegibles. (Sin embargo, los sujetos cuya biopsia pr

inadecuada no serán rechazados solo por este motiv

de las cohortes de aumento de la dosis previament

durante el tratamiento.

10) Los sujetos inscritos en la ampliación de la dosi

previamente completada, deben someterse obligator

riesgo clínico aceptable. (a) La muestra de tejido tu

realizada con una con aguja gruesa. En biopsias reali

Cytospin o biopsias con sacabocados no se considera

aceptables las biopsias de lesiones óseas que no ten

óseos descalcificados. (b) Las lesiones biopsiadas de

se esté(n) evaluando para determinar la respuesta ra

11) Función orgánica adecuada para los sujetos segú

(a) Neutrófilos >1500/|jl (estables sin ningún facto

administración del fármaco del estudio)

(b) Plaquetas >80 x 103/pl (no se permite la transf

a la primera administración del fármaco del estudi

(c) Hemoglobina >8 g/dl (no se permite la transfusi

primera administración del fármaco del estudio)

(d) ALT y AST <3x límite superior de la normalidad

(e) Bilirrubina total <1,5 x LSN (excepto sujetos co

normal)

(f) Función tiroidea normal o estable con suplemen

g) Albúmina > 2 mg/dl

(h) Creatinina sérica <1,5 x LSN o aclaramiento de

fórmula de Cockcroft-Gault):

CrCl en mujeres = (140 - edad en años) x

CrCl en hombres = (140 - edad en años) x

12) Capacidad para cumplir el tratamiento, recogida d

Edad y estado reproductor

a) Hombres y mujeres, con edades > 18 años en el m

b) Las mujeres en edad fértil (WOCBP, por las siglas

de embarazo en suero u orina (sensibilidad mínima de

humana [hCG]) en las 24 horas previas al inicio del fá

c) Las mujeres no deben estar en periodo de lactancia

d) Las WOCBP deben aceptar seguir las instrucci

tratamiento con el fármaco del estudio OX40.21 má

duración debe ser de 12 semanas para los sujetos de l

los sujetos de la Parte 2 (130 días más 30 días [durac

después de la finalización del tratamiento.

e) Los hombres sexualmente activos con WOCBP de

anticonceptivo(s) durante el tratamiento con el fárma

estudio más 90 días. La duración debe ser de 20 se

días) o de 31 semanas para los sujetos de la Parte 2 40, anti-CD137, anti-GITR y anti-CD27, tras un período ltimo tratamiento.

do al menos 2 semanas antes de la primera dosis del os sujetos con lesiones tumorales sintomáticas al inicio as 4 semanas siguientes a la primera dosis del fármaco nscripción.

liación de la dosis deben dar su consentimiento para la cluido en parafina (FFPE), ya sea un bloque o un mínimo teñir, para la realización de estudios correlativos. Si no u consentimiento para realizar una biopsia tumoral previa r una muestra de tumor archivada y que no dan su tratamiento o que no tienen lesiones accesibles, no son al tratamiento arroje una cantidad o calidad de tejido ara cualquier sujeto adicional incorporado a cualquiera mpletadas, se requieren biopsias obligatorias antes y

añadidos a cualquier cohorte de aumento de la dosis ente a biopsias antes y durante el tratamiento con un al sólido debe ser una biopsia escisional o incisional as con aguja fina, el drenaje de derrames pleurales con cuado para la revisión de biomarcadores. Tampoco son un componente de tejido blando o muestras de tumores ser distintas de las de la(s) lesión(es) indicadora(s) que gica

define a continuación:

crecimiento en las 4 semanas siguientes a la primera

n para alcanzar este nivel en las 2 semanas siguientes

ara alcanzar este nivel en las 2 semanas siguientes a la

N)

drome de Gilbert que deben tener una bilirrubina directa

hormonales según la evaluación del investigador

atinina (CrCl) >40 ml/min (medido utilizando la siguiente

en kg x 0,8572 x creatinina sérica en mg/dl

en kg x 1,0072 x creatinina sérica en mg/dl

uestras FC y FD y seguimiento requerido del estudio

nto del consentimiento informado.

inglés) deben tener un resultado negativo en la prueba Ul/l o unidades equivalentes de gonadotropina coriónica co del estudio.

del método o métodos anticonceptivo(s) durante el semividas del fármaco del estudio más 30 días. Esta artes 1 y 3 (50 días más 30 días) o de 23 semanas para del ciclo ovulatorio]), durante un total de hasta 160 días

aceptar seguir las instrucciones del método o métodos del estudio OX40.21 más 5 semividas del fármaco del s para los sujetos de las Partes 1 y 3 (50 días más 90 días de finalización. Además, los hombres deben estar dispuestos a abstenerse de donar esperma durante

f) Los hombres azoospérmicos están exentos de

heterosexualmente activas continuamente también

someterse a pruebas de embarazo.

Criterios de exclusión

1) Excepciones de enfermedades diana

a) Quedan excluidos los sujetos que se sabe, o q

metástasis no tratadas del SNC o cuyo sitio do

inscribirse los sujetos con metástasis cerebrales

como la ausencia de progresión radiográfica dur

tratamiento quirúrgico (o 4 semanas de observac

sin esteroides durante al menos 2 semanas, así

o progresivos.

b) Sujetos con meningitis carcinomatosa

c) Para el cáncer ovárico:

i) se excluyen sujetos con cáncer ovárico c

anteriores o con sonda Tenckhoff.

ii) se permiten hasta 4 tratamientos anterio

hormonal o inmunoterapia). El reinicio del mi

considerarse como un régimen; sin embargo,

utilizado cualquier otro régimen.

2) Antecedentes Médicos y Enfermedades Simultáne

a) Sujetos con una neoplasia maligna previa,

diagnosticada en menos de 2 años anteriores

melanoma y los cánceres in situ como el de vejiga

Además, los sujetos con otras segundas neoplas

recibido terapia con intención curativa sin evidenc

presentan un bajo riesgo de recurrencia son elegi

b) Otra neoplasia maligna activa que requiera int

c) Aloinjerto de órgano previo

d) Tratamiento anterior:

i) Se permiten tratamientos anteriores contra

inmunoterapia)

ii) La toxicidad (excepto la alopecia) relaciona

haberse resuelto, haber vuelto a la situación i

iii) Para los agentes citotóxicos, deben haber

a la terapia contra el cáncer y el inicio de la te

iv) Para los agentes no citotóxicos, deben h

sea más corto) desde la última dosis previa a

e) Terapia previa con anticuerpo anti-OX40

f) Quedan excluidos los sujetos que se sabe, o q

A los sujetos con vitíligo, diabetes mellitus

autoinmunitaria que solo requiere sustitución hor

de Graves (los sujetos con sospecha de trast

anticuerpos tiroglobulina y peroxidasa tiroidea e

dosis del fármaco del estudio), psoriasis que no r

que se repitan en ausencia de un desencadena

bien controlada y/o rinitis alérgica leve (alergias e

g) Sujetos con antecedentes de toxicidad potenc

tratamiento con anti-CTLA-4 o anti-PD-1/PD-específicamente a la coestimulación de células T

en los que es improbable que reaparezcan con c

de una crisis suprarrenal)

h) Sujetos con enfermedad pulmonar intersticial

el manejo de sospecha de toxicidad pulmonar rel

i) Enfermedad pulmonar obstructiva crónica q

recurrentes a dosis superiores a 10 g/día de pred e tiempo.

s requisitos anticonceptivos. Las WOCBP que no son n exentas de los requisitos anticonceptivos, pero aun así

se sospecha, que tienen metástasis del SNC o que tienen esté la enfermedad sea el SNC. Sin embargo, pueden troladas. Las metástasis cerebrales controladas se definen te al menos 4 semanas después de la radioterapia y/o el si no está clínicamente indicada ninguna intervención), y o la ausencia de signos y síntomas neurológicos nuevos

antecedentes de obstrucción intestinal en los 6 meses

contra el cáncer (es decir, quimioterapia, radioterapia, o régimen después de un descanso farmacológico puede contaría como dos regímenes si entre medias se hubiese

rente de la utilizada para la inscripción en este estudio, ingreso en el estudio (excepto los cánceres de piel no olon, cervicouterino/displasia cervical, melanoma o mama). malignas diagnosticadas hace más de 2 años que hayan de enfermedad durante el intervalo y que se considere que s.

ención simultánea

cáncer (es decir, quimioterapia, radioterapia, hormonal o

con la terapia anterior contra el cáncer y/o la cirugía, debe ial o al Grado 1 o haberse considerado irreversible nscurrido al menos 4 semanas entre la última dosis previa ia del estudio

r transcurrido al menos 4 semanas o 5 semividas (lo que terapia contra el cáncer y el inicio de la terapia del estudio.

se sospecha, que tienen enfermedades autoinmunitarias. tipo 1, hipotiroidismo residual debido a una afección nal, sujetos eutiroideos con antecedentes de enfermedad os tiroideos autoinmunitarios deben ser negativos a los unoglobulina estimulante del tiroides antes de la primera uiera tratamiento sistémico o afecciones que no se espera externo, se les permite inscribirse. Los sujetos con asma cionales) son elegibles.

ente mortal relacionada con inmunoterapia previa (p. ej., o con cualquier otro anticuerpo o fármaco dirigido a rutas de puntos de control inmunitario), excepto aquellos ramedidas estándar (p. ej., reemplazo sustitución después

sea sintomática o que pueda interferir con la detección o onada con fármacos

requiera ráfagas de esteroides o esteroides crónicos ona o el equivalente

j) Sujetos con una afección que requiera trata

equivalentes de prednisona) u otros medicamentos

fármaco del estudio, excepto en el caso de dosis

equivalentes de prednisona en ausencia de enfer

tratamiento con un ciclo corto de esteroides (< 5 dí

k) Enfermedad cardiovascular no controlada o signi

las siguientes:

i) Infarto de miocardio o accidente cerebrovascu

ii) Angina de pecho no controlada en los últimos

iii) Cualquier antecedente de arritmias clínica

fibrilación ventricular o torsade de pointes (taqui

iv) Antecedentes de otras enfermedades car

insuficiencia cardiaca congestiva con clasifica

pericarditis, derrame pericárdico significativo)

v) Necesidad de oxigenoterapia complementaria

vi) Prolongación del intervalo QT corregido por

(QTcF) >480 ms

l) Antecedentes de cualquier hepatitis crónica como

i) Prueba positiva del antígeno de superficie de l

ii) Prueba positiva de carga vírica cualitativa de

Observación: Los sujetos con anticuerpos de la h

PCR son elegibles. Los antecedentes de infección

criterio de exclusión. Se permiten pruebas ad

institucionales para descartar la infección.

m) Evidencia de infección activa que requiera terapi

antes del inicio de la terapia con el fármaco del est

que están asociadas al tipo de tumor subyacente re

n) Antecedentes conocidos de prueba positiva de V

o) Evidencia o antecedentes de infección tubercu

purificado) recientemente convertido a positivo; r

cambios recientes inexplicables en los patrones de

p) Cualquier cirugía mayor en las 4 semanas de la

haberse recuperado de los efectos de una cirugía

días antes de la primera dosis del fármaco del estu

q) Uso de vacunas no oncológicas que contengan v

en las 4 semanas previas al fármaco del estudio.

estacional, p. ej., Fluzone®).

r) Uso de pRBC (por las siglas del inglés, packed re

plaquetas 2 semanas antes de la primera dosis del

s) Una afección médica o psiquiátrica conocida o

administración del fármaco del estudio fuera peligro

la capacidad del sujeto para cumplir o tolerar el est

3) Alergias y reacciones adversas a fármacos

a) Antecedentes de alergia a nivolumab o ipilimuma

b) Antecedentes de cualquier alergia significativa a inmunomoduladoras previas contra el cáncer ( coestimuladores de células T)

Evaluaciones del estudio:

Se realizaron exploraciones físicas, mediciones de las

derivaciones y evaluaciones clínicas de laboratorio en mom

Durante todo el estudio, los sujetos se controlaron de cerc

• Evaluaciones de Seguridad: Los AA se evaluaron d

tratamiento. Los AA se evaluaron de acuerdo con lo

adversos (CTCAE) definidos por el Instituto Nacional de

hasta que todos los AA relacionados con el tratami

considerasen irreversibles.

• Evaluaciones de Eficacia: La evaluación de la enferme nto sistémico con corticosteroides (> 10 mg diarios munosupresores en los 14 días de la administración del esteroides suprarrenales sustitutivos > 10 mg diarios ad autoinmunitaria activa. Observación: Se permite el hasta 7 días antes de iniciar el fármaco del estudio. ativa, incluyendo, aunque sin limitación, a cualquiera de

/ataque isquémico transitorio en los últimos 6 meses meses

nte significativas (tales como taquicardia ventricular, dia ventricular (polimorfa) en entorchado))

cas clínicamente significativas (p. ej., miocardiopatía, n funcional III-IV de la New York Heart Association,

aria relacionada con enfermedades cardiovasculares frecuencia cardíaca utilizando la fórmula de Fridericia

demuestra mediante lo siguiente:

epatitis B

epatitis C (mediante PCR)

atitis C positivos y hepatitis C cuantitativa negativa por suelta por el virus de la hepatitis A no constituyen un nales o pruebas sustitutivas según las directrices

istémica antibacteriana, antivírica o antifúngica < 7 días io (no se aplica a las infecciones víricas que se supone erido para ingresar en el estudio)

o síndrome de inmunodeficiencia adquirida conocido. a activa o latente, incluyendo DPP (derivado proteico grafía de tórax con evidencia de infiltrado infeccioso; re/escalofríos.

ministración del fármaco del estudio. Los sujetos deben yor o de una lesión traumática importante al menos 14

s vivos para la prevención de enfermedades infecciosas permite el uso de vacunas inactivadas contra la gripe

lood cell, concentrado de eritrocitos) o de transfusión de maco del estudio

yacente y/o un motivo social que pudiera hacer que la para los sujetos o que pudiera afectar negativamente a .

Partes 2 y 3 únicamente, respectivamente)

macos (tal como anafilaxia o hepatotoxicidad) a terapias ej., inhibidores de puntos de control, anticuerpos

onstantes vitales, electrocardiogramas (ECG) de 12 tos seleccionados a lo largo del intervalo de dosificación. ara detectar AA.

nte el estudio y durante 100 días después del último riterios terminológicos comunes para acontecimientos áncer (NCI) v4.03. Se hizo un seguimiento de los sujetos o se hubiesen recuperado a la situación inicial o se

con TC y/o RM, según corresponda, se realizó al inicio del estudio y cada 8 semanas (± 1 semana) en el ca

1 semana) en el de los regímenes de dosificación c3s

del tratamiento y la respuesta hasta la interrupción de

acerca de la progresión del tumor, se realizaron eval

de la respuesta tumoral de sujetos con tumores mali

• Evaluaciones de farmacocinética y de inmunogenicid

de inmunogenicidad de los sujetos que reciben O

OX40.21 se caracteriza por el método de análisis no

analizan en busca de anticuerpos anti-OX40.21 y/o

mediante inmunoensayos validados.

• Evaluaciones exploradoras de biomarcadores: Par

clínica a OX40.21 en relación con la dosis y la FC,

pruebas de biomarcadores: (i) sangre entera, (ii) sue

A spectos estadísticos

Determinación del tamaño de la muestra

Aumento de la dosis:

Al tratarse de un ensayo en Fase 1 de aumento de la do

la dosis depende de la toxicidad y de la consecuencia

durante cada parte de aumento de la dosis (monoterapia

2A] y OX40.21 junto con ipilimumab [Parte 3A]) para un t

1A, 2A y 3A. Inicialmente, se tratan aproximadamente

OX40.21 junto con nivolumab o ipilimumab. Se tratan co

a los niveles de dosis recomendados según las recome

dosis. Al menos 6 sujetos evaluables con respecto a la

Ampliación de la dosis:

En términos generales, el tamaño de la fase de ampliaci

global diana) y en la capacidad para identificar una s

tratamiento de referencia (tasa de respuesta global histó

En la cohorte de ampliación de la dosis de la Parte 1

ampliación de la dosis de la Parte 2B se tratan aproxim

de la Parte 2C se tratan aproximadamente 27 sujetos. E

aproximadamente 35 sujetos.

Criterios de valoración

Criterios de valoración principales

La evaluación de la seguridad se basa en la frecuencia

interrupción y de las muertes. Además, se examinan an

Criterios de valoración secundarios

Eficacia: La actividad antitumoral de OX40.21 solo y de

de la TRO (tasa de respuesta objetiva), duración de la r

24 semanas según los RECIST v1.1. Lo anterior se det

inicio del estudio, cada 8 semanas (± 1 semana) en los r

en los regímenes de dosificación c3s durante el perío

período de seguimiento de supervivencia.

• La mejor respuesta global (MRG) se evalúa según l

• La TRO es la proporción de todos los sujetos tratado

• La duración de la respuesta, calculada para todos l

transcurrido entre la fecha de la primera respuesta

primero que se produzca.

• La TSSP a las 24 semanas se define como la pro

enfermedad y que sobreviven a las 24 semanas. La

que tiene en cuenta los datos de censura estadística los regímenes de dosificación c2s y cada 9 semanas (± ués, cada 12 semanas durante las fases de seguimiento miento o la retirada del estudio. En caso de existir dudas es tumorales en otros puntos temporales. La evaluación se realizó según los RECIST v1.1.

e recogen muestras para realizar evaluaciones de FC y solo o junto con nivolumab o ipilimumab. La FC de artimental (ANC). Las muestras de inmunogenicidad se cuerpos anti-nivolumab y/o anticuerpos anti-ipilimumab

lorar posibles marcadores predictivos de la respuesta ienen 3 tipos de muestras de todos los sujetos para las sma, y (iii) tejido tumoral.

l tamaño de la muestra de cada cohorte de aumento de rior observadas. Se tratan aproximadamente 30 sujetos OX40.21 [Parte 1A], OX40.21 junto con nivolumab [Parte ombinado de aproximadamente 90 sujetos en las Partes jetos con los niveles de dosis iniciales de OX40.21 u s adicionales de aproximadamente 3 sujetos evaluables nes del BLRM (-Cópula) durante la fase de escalada de e tratan con la DMT.

basa en las tasas de respuesta diana (tasa de respuesta ara dicha respuesta clínica que están por encima del

tratan aproximadamente 12 sujetos. En la cohorte de ente 35 sujetos. En la cohorte de ampliación de la dosis ohorte de ampliación de la dosis de la Parte 3B se tratan

os AA, de los AA graves, de los AA que conducen a la as de las pruebas analíticas.

.21 junto con nivolumab o ipilimumab, se mide a través sta y tasa de supervivencia sin progresión (TSSP) a las a en función de las mediciones tumorales realizadas al nes de dosificación c2s y cada 9 semanas (± 1 semana) tratamiento, y cada 3 meses (12 semanas) durante el

erios RECIST 1.1.

a MRG es una RC o una RP.

jetos tratados con una MRG de RC o RP, es el tiempo cha de progresión de la enfermedad o de la muerte, lo

n de sujetos tratados que siguen sin progresión de la ción se calcula mediante la estimación de Kaplan-Meier, Farmacocinética

Los parámetros seleccionados, tales como Cmáx, Tmáx,

de la pauta de la monoterapia o junto con nivolumab o ipili

de acumulación (IA) y semivida de eliminación eficaz (S

FC intensiva.

Inmunogenicidad

El objetivo secundario de inmunogenicidad se evalúa

nivolumab o ipilimumab.

Criterios de valoración exploradores

Los objetivos exploradores relacionados con la SG (su

momento determinado (p. ej., 2 años). La tasa de SG es l

sujeto se define como el tiempo desde la fecha de la pri

muerte por cualquier causa. Los objetivos exploradores r

cambio de las mediciones de los biomarcadores desde

factores solubles, que incluyen, aunque sin limitación,

infiltrantes de tumores).

En sujetos con múltiples mediciones de ECG, opcional

ECG de los intervalos de QT, QTc, QRS e intervalo P-R

Análisis

Análisis de seguridad: Todos los AA registrados se enu

término preferente y tratamiento. Las constantes vitales

resumen por tratamiento. También se anotan todos los ha

de las pruebas analíticas. Se evalúan las lecturas de EC

Análisis de eficacia: Se proporciona una lista de medicio

nivel de dosis. La MRG del sujeto individual se enumera s

de OX40.21 solo o junto con nivolumab o ipilimumab, se

y/o nivel de dosis y tipo de tumor, se proporciona la TR

95 % mediante el método de Clopper-Pearson. La m

correspondiente del 95 % se notifican por tratamiento y/o

se analiza utilizando el método de Kaplan-Meier. Además,

o de que sobreviva hasta las 24 semanas, se estima me

de tumor y nivel de dosis. El IC del 95 % correspondie

representa gráficamente utilizando el método de Kapla

correspondiente del 95 %.

Análisis farmacocinéticos: Se enumeran todos los pa

exclusiones y los motivos de exclusión de los resúmenes.

FC por tratamiento. Se presentan las medias geomét

ABC(TAU), Ctau, CLT, Cssprom e IA. Se presentan las

y las desviaciones estándar de los restantes parámetros

La dependencia de la dosis de OX40.21 se evalúa

dependencia de la dosis de OX40.21, se proporcionan dia

a la dosis en cada día medido. Se realiza una evaluació

en un modelo de fuerza y se realiza un IC sobre el coe

nivolumab e ipilimumab al final de la infusión y la concentr

y estudio utilizando estadígrafos descriptivos. Estos dat

para el análisis FC de la población.

Análisis de inmunogenicidad: Todos los datos de inmuno

y estado de inmunogenicidad. Se determina la frecuenc

nivolumab e ipilimumab.

Análisis exploradores de biomarcadores: En cada grupo

cambios correspondientes (o cambios porcentuales) des

planificados. El curso temporal de las medidas de los bi

un patrón significativo a lo largo del tiempo, se realiza u

para caracterizar la relación. Para explorar posibles asoc C(O-t) y ABC(TAU), se evalúan en 2 ciclos dependiendo mab. Parámetros tales como Ctau, CLT, Cssprom, índice IVef) se evalúan en el segundo ciclo cuando se recoge la

avés de la frecuencia de ADA positivo a OX40.21 o a

vivencia global) se evalúan según la tasa de SG en un roporción de sujetos vivos en ese momento. La SG de un a dosis del medicamento del estudio hasta la fecha de la cionados con los biomarcadores se evalúan a través del icio del estudio o nivel inicial en sangre periférica (p. ej., ocinas y quimiocinas) o tejido tumoral (p. ej., linfocitos

te se evalúan los siguientes parámetros: cambios en el de el inicio.

ran y tabulan por clasificación de órganos del sistema, los resultados de las pruebas analíticas se enumeran y zgos significativos de la exploración física y los resultados las anomalías, caso de haber, se notan.

s tumorales por sujeto y día de estudio en cada grupo y ún los RECISt 1.1. Para describir la actividad antitumoral cula la TRO (tasa de respuesta objetiva). Por tratamiento el IC (índice de confianza) bilateral correspondiente del iana de la duración de la respuesta y el IC bilateral vel de dosis y tipo de tumor. La duración de la respuesta TSSP, la probabilidad de que un sujeto siga sin progresión nte la metodología de Kaplan-Meier por tratamiento, tipo se obtiene según la fórmula de Greenwood. La SG se eier. Se notifica la mediana de la SG y el IC bilateral

etros FC individuales de cada analito, incluidas las tabulan los estadígrafos descriptivos de cada parámetro s y los coeficientes de variación de Cmáx, ABC(0-t), ianas y los intervalos de Tmáx. Se presentan las medias (p. ej., SEMIVef).

monoterapia con aumento de dosis. Para describir la mas de dispersión de Cmáx, ABC(0-t) y ABC(TAU) frente xploradora de la proporcionalidad de la dosis basándose ente de fuerza. Las concentraciones mínimas (Cmín) de ión mínima de OX40.21, se tabulan por día de tratamiento también pueden agruparse con otros conjuntos de datos

icidad disponibles se proporcionan por tratamiento, dosis de sujetos con evaluación de ADA positivo a OX40.21,

os estadígrafos descriptivos de los biomarcadores y sus el inicio del estudio, se tabulan por dosis y día de estudio arcadores se representa gráficamente. Si hay indicios de nálisis adicional (p. ej., mediante un modelo mixto lineal) iones entre las medidas de los biomarcadores de sangre periférica o de biopsias tumorales y los resultados clíni

regresión logística.

TABLA 23: RESUM , se utilizan, aunque sin limitación, métodos tales como

DE SECUENCIAS

co uación

co uación

co uación

co uación

co nuación

c nuación

c nuación

c nuación

c nuación

co uación

co uación

co uación

co uación

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co nuación

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co nuación

co nuación

co nuación

co uación

co nuación

co nuación

co nuación

co nuación

c nuación

continuación

co uación

co uación

co uación

co uación

continuación

continuación

continuación

co uación

co uación

co uación

co uación

co uación

conti ción

La tabla 23 proporciona las secuencias de las regiones v

se indica, secuencias con péptidos señal.

Equivalentes:

Los expertos en la materia reconocerán, o serán capa

habitual, muchos equivalentes de las realizaciones espec ables maduras y de las cadenas pesada y ligera y donde

de determinar, utilizando únicamente experimentación as divulgadas en el presente documento.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une a OX40 humana, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 318 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 94.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 124 y una cadena ligera que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 116.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la región constante de cadena pesada carece de una lisina C-terminal.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo estimula una respuesta de células T específica de antígeno.

6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el anticuerpo se une a OX40 humana soluble con una KD de 10 nM o menor, medida con Biacore.

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el anticuerpo se une a toda, o a una parte de, la secuencia DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178) de OX40 humana (SEQ ID NO: 2).

8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que es un isotipo IgG1.

9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que es un anticuerpo humano.

10. Un ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 10.

12. Una célula transformada con (i) el vector de expresión de la reivindicación 11 o (ii) un vector de expresión que comprende el ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un vector de expresión distinto que comprende el ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un vehículo.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, que comprende además al menos otro agente contra el cáncer.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, en donde el al menos otro agente contra el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-PD1 y un anticuerpo CTLA-4.

16. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su uso en un método para tratar el cáncer en donde el método comprende administrar el anticuerpo a un sujeto.

17. Una composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, para su uso en un método para tratar el cáncer en donde el método comprende administrar la composición a un sujeto.

18. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 16 o la composición para el uso de la reivindicación 17, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer cervicouterino, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga y cáncer ovárico.

19. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, y el anticuerpo anti-PD-1 nivolumab para su uso en un método para tratar el cáncer, en donde el método comprende administrar la composición al sujeto.

20. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, y el anticuerpo anti-CTLA-4 ipilimumab para su uso en un método para tratar el cáncer, en donde el método comprende administrar la composición al sujeto.

21. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 16, en donde el método comprende además administrar el anticuerpo anti-PD-1 nivolumab al sujeto.

22. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 16, en d

anti-CTLA-4 ipilimumab al sujeto.

e el método comprende además administrar el anticuerpo