ES2641832T3 - Espectrometría de masas con filtración de iones selectiva por establecimiento de umbrales digitales - Google Patents

Description

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Espectrometna de masas con filtracion de iones selectiva por establecimiento de umbrales digitales Descripcion

CAMPO DE LA INVENCION

La invencion se refiere al campo de la deteccion y caracterizacion de analitos grandes, como biomoleculas, por analisis de masas molecular

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La espectrometna de masas se usado durante muchas decadas en la caracterizacion de moleculas organicas pequenas. La tecnica implica tipicamente la ionizacion de moleculas en la muestra para formas iones moleculares sometiendo la muestra a un haz de electrones a una presion muy baja. Los iones moleculares se enfocan y aceleran por un campo electrico en un campo magnetico o cuadrupolo. Los iones se separan en el campo magnetico o cuadrupolo de acuerdo con la proporcion de la masa del ion m a la carga en el ion z (m/z). Despues de pasar a traves del campo, los iones inciden en un detector que determina la intensidad del haz de iones y la proporcion m/z, y estos datos se usan para crear el espectro de masas de la muestra.

Con el interes creciente en moleculas mas grandes, especialmente biomoleculas como acidos nucleicos y protemas, se estan desarrollando continuamente nuevas tecnicas en el campo de la espectrometna de masas para caracterizar estas moleculas.

En anos recientes el rendimiento de espectrometros de masas comercialmente disponibles ha visto una mejora significativa debido, en parte, a la capacidad de componentes principales mejorados incluyendo suministros de potencia mas estables, digitalizadores mas rapidos y metodos de fabricacion mas sofisticados para elementos opticos de iones. Particularmente dignos de mencion son la nueva generacion de espectrometros de masa ESI-TOF que, de varios vendedores en una variedad de configuraciones, estan ahora produciendo rutinariamente los tipos de precision de medicion de masas y resolucion de masas anteriormente obtenibles solo en el sector final alto o plataformas basadas en resonancia de ciclotron de iones por transformacion de Fourier (FTICR). Como tal, el uso de tales instrumentos de alta gama por la comunidad analftica continua expandiendose a medida que estos instrumentos se hacen mas disponibles a cientfficos y tecnicos con un amplio rango de necesidades analfticas. Por consiguientes, estan emergiendo un numero de esquemas de automatizacion crecientemente sofisticados, muchos incorporando alguna forma de cromatograffa lfquida (KC como un paso de purificacion de muestras on-line para apoyar QC de alto rendimiento o actividades de seleccion de farmacos. Aunque hay un numero de aplicaciones en las que alguna forma de LC es un paso requisito que facilita el analisis de mezclas muy complejas, tambien se usa frecuentemente como un protocolo de desalacion/purificacion generico para preparar fracciones de analito relativamente puras para analisis MS.

El ruido qmmico de bajo peso molecular es a menudo el factor limitativo en el rendimiento de MS general ya que la presencia de niveles altos de componentes de bajo peso molecular, como polfmeros o constituyentes de tampones, puede limitar drasticamente el intervalo dinamico espectral y afectar adversamente a la precision de masa. Aunque la LC se usa a menudo para reducir los efectos adversos de tales antecedentes deben considerarse restricciones en el rendimiento de la muestra y problemas asociados con el uso/eliminacion de solventes como parte del flujo de trabajo de laboratorio. Adicionalmente, la LC se usa a menudo como un paso de purificacion (en oposicion a un paso de separacion) para dar analitos sensibles a analisis MS. Consecuentemente, hay una necesidad creciente de metodos simples para reducir el suelo de ruido qmmico y dar muestras menos que "pristinas" sensibles al analisis espectrometrico de masas.

La presente invencion satisface esta necesidad, asf como otras, proporcionando sistemas y metodos para la filtracion digital de senales espectrales de masas que surgen de componente de bajo peso molecular con carga unica como aditivos de solucion y modificadores de matriz sin alterar significativamente las senales espectrales de masas de analitos mas grandes como biomoleculas.

SUMARIO DE LA INVENCION

La presente invencion esta dirigida a metodos para identificar un ion con carga multiple. Se proporciona un espectro de masas que comprende los siguientes componentes: (i) un detector de iones, (ii) un digitalizador que convierte una senal analogica a una senal digital, (iii) medios de transferencia de senal analogica para transferir una senal analogica desde el detector al digitalizador, y (iv) un filtro de umbral digital que esta en comunicacion de datos digital con el digitalizador. El umbral de senal digital puede establecerse en el filtro de umbral digital y, en respuesta a una entrada de senal digital desde el digitalizador, el filtro de umbral digital produce independientemente una senal digital a un archivo de datos solo si la entrada de senal digital es mayor que el umbral de senal digital especificado. El paso siguiente del metodo se efectua despues especificando un umbral de senal digital de tal manera, que tras una medicion del espectrometro de masas del ion con carga multiple, la salida de senal digital filtrada al archivo de

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datos se origina a partir de la deteccion del ion con carga multiple y excluye la salida de senal digital de las senales analogas que surgen de iones con carga unica.

La presente invencion esta tambien dirigida a metodos para determinar la masa molecular de una pluralidad de analitos en una mezcla. Se proporciona un espectrometro de masas que comprende los siguientes componentes: (i) un detector de iones, (ii) un digitalizador que convierte una senal analogica en una senal digital, (iii) un medio de transferencia de senal analogica para transferir una senal analogica desde el detector al digitalizador, y (iv) una pluralidad de filtros de umbral digital, cada uno en comunicacion de datos digital con el digitalizador. Puede establecerse independientemente un umbral de senal digital en cualquiera de la pluralidad de filtros de umbral digital, cada uno de los cuales esta en comunicacion de datos digital con el digitalizador y, en respuesta a una entrada de senal digital desde el digitalizador, produce independientemente una senal digital a un archivo de datos correspondiente si la entrada de senal digital es mayor que el umbral de senal digital especificado. Los pasos siguientes del metodo se efectuan despues especificando un umbral de senal digital unico en algunos miembros de la pluralidad de filtros de umbral digital, haciendo una medicion de espectrometro de masas de la mezcla, en donde cada umbral de senal digital unico filtra diferencialmente las senales digitales que surgen de la pluralidad de analitos y produce una salida de senal digital unica a cada archivo de datos correspondiente. La medicion resulta en el almacenamiento de una pluralidad de archivos de datos. En el paso final, cada uno de la pluralidad de archivos de datos se analiza y la masa molecular de al menos un miembro de la pluralidad de analitos se contiene en cada uno de la pluralidad de archivos de datos.

La presente invencion tambien esta dirigida a metodos para calibrar un espectro de masas de un analito. Se proporciona un espectrometro de masas que comprende los siguientes componentes: (i) un detector de iones, (ii) un digitalizador que convierte una senal analogica en una senal digital, (iii) un medio de transferencia de senal analogica para transferir una senal analogica desde el detector al digitalizador, y (iv) una pluralidad de filtros de umbral digital, cada uno en comunicacion de datos digital con el digitalizador. Puede establecerse independientemente un umbral de senal digital en cualquiera de la pluralidad de filtros de umbral digital, cada uno de los cuales esta en comunicacion de datos digital con el digitalizador y, en respuesta a una entrada de senal digital desde el digitalizador, produce independientemente una senal digital a un archivo de datos correspondiente si la entrada de senal digital es mayor que el umbral de senal digital especificado. Los pasos siguientes del metodo se efectuan despues especificando un umbral de senal digital unico en un filtro de umbral digital de tal manera que la salida de senal digital a un primer archivo de datos tiene senales de tanto el analito como un ion calibrador y despues especificar un segundo umbral de senal digital unico en otro filtro de umbral digital de tal manera que la salida de senal digital a un segundo archivo de datos tiene senales del analito pero no del calibrador. El segundo archivo de datos se sustrae del primer archivo de datos para obtener un archivo de calibracion que se usa despues para calibrar el espectro de masas.

La presente invencion esta tambien dirigida a un sistema comprendido de un espectrometro de masas que comprende los siguientes componentes: (i) un detector de iones, (ii) un digitalizador que convierte una senal analogica en una senal digital, (iii) un medio de transferencia de senal analogica para transferir una senal analogica desde el detector al digitalizador, y (iv) una pluralidad de filtros de umbral digital para establecer un umbral de senal digital que esta cada uno en comunicacion de datos digital con el digitalizador y en respuesta a una entrada de senal digital del digitalizador enviando independientemente una senal digital a un archivo de datos correspondiente solo si la entrada de senal digital es mayor que el umbral de senal digital especificado. El sistema tiene una pluralidad de archivos de datos y una pluralidad de medios de transferencia de salida de senal digital paralela, cada una de las cuales esta en comunicacion de datos digital con uno de la pluralidad de filtros de umbral digital y un archivo de datos correspondiente de la pluralidad de archivos de datos.

BREVE ANALISIS DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra la intensidad de respuesta del detector como una funcion del valor del umbral de senal digital (en este cado indicada por el voltaje de corte) de los iones del analito que tienen proporciones m/z similares pero difieren en pesos moleculares. Cfrculos: oligonucleotido 140-mer (m/z = 1232.9), cuadrados oligonucleotidos 70-mer (m/z = 1199), diamantes: oligonucleotidos 38-mer (m/z = 1174.7), cruces oligonucleotido 12-mer (m/z = 1233) y triangulos: propilenglicol (PPG -m/z =1236).

La Figura 2 es una representacion esquematica de los efectos de especificar umbrales de senal digital en espectro de masas. La Figura 2a representa la salida de digitalizador bruto (ADC, convertidor digital analogico) desde un escaneo teoricamente individual que contiene un ion con carga unica (ion1) que golpea el detector en T1 y un ion con carga multiple grande (ion2) que golpea el detector en T2. Las Figuras 2b y 2c indican un espectro con un umbral de senal digital alto y bajo respectivamente. La Figura 2d indica un espectro sin un umbral de senal digital y el detector "ruido blanco- es visible en el espectro.

La Figura 3 muestra espectro de masas de un producto de PCR. La Figura 3a es un espectro de masas ESI- TOF de un producto de PCT 140-mer adquirido a un ajuste de umbral digital normal (3 mV). La muestra contiene una cantidad contaminante de niveles relativamente altos de polipropilenglicol (PPG) de peptidos

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con carga unica (que sirven como estandares de masa internos). Los picos etiquetados con "x" indican senales del PPG y "c" representa senales de los estandares de masa de peptidos. La Figura 3b es un espectro ESI-TOF de la misma muestra del producto de PCR obtenida en un ajuste de umbral digital de 15 mV. Los contaminantes y los estandares de masas se han filtrado fuera del espectro.

La Figura 4 es una region expandida de los espectros ESI-TOF de la Figura 3 en las que se detectan los estados de carga alta de relativamente baja abundancia del amplicon de PCR. La senal efectiva al ruido del espectro en la Figura 4a se define por la senal a la proporcion de ruido qmmico, mientras que la senal efectiva al ruido del espectro en la Figura 4b se define por la senal a la proporcion de ruido electronico.

La Figura 5 muestra los espectros ESI-TOF de una solucion que contiene aproximadamente .5 nm de producto de PCR en presencia de 500 nM de PPG se caracterizo a ajustes de umbral bajo (Figura 5a) y alto (Figura 5b) como se muestra en el recuadro, el espectro superior esta tambien inundado con otros componentes de ruido qmmico y el pico en cada fondo de masa imposibilita la deteccion de los productos de PCR de bajo nivel, Cuando el umbral de senal digital se establece de tal manera que las senales de especies con carga unica no se detectan, se detecta una firma distinta para el amplicon de nivel bajo.

La Figura 6 indica dos picos superpuestos de un oligonucleotido 140-mer y de un oligonucleotido 12-mer que pueden resolverse a traves de la adquisicion de datos con diferentes umbrales de senal digital. El espectro superior se obtuvo con un ajuste de umbral de senal digital de 7 mV. El espectro medio se obtuvo con un ajuste de umbral de senal digital de 11 mV. El espectro inferior se obtuvo por la sustraccion del espectro medio del espectro superior para obtener un espectro isotopicamente resuelto limpio del oligonucleotido 12- mer.

La Figura 7 muestra la configuracion de digitalizador tfpica (Figura 7a) con un ajuste de umbral individual en comparacion con un digitalizador que permite ajustes de umbral multiple a ser aplicados simultaneamente al flujo de datos que vienen del digitalizador TOF (Figura 7b).

La Figura 8 muestra los espectros de masas de anhidrasa carbonica en presencia de 0,001% de SDS y tampon P/I. Las senales derivadas de protemas del espectro obtenido con un ajuste de umbral de senal digital de 1 mV (Figura 8a) estan sometidas a interferencia considerable de los componentes de detergente y tampon. Por el contrario, la Figura 8b indica que los componentes interferentes se vuelven "invisibles" especificando un ajuste de umbral digital de 11 mV.

En algunas realizaciones de la presente invencion, el sistema de espectrometro de masas comprende los siguientes componentes: (i) un detector de iones, (ii) un digitalizador que convierte una senal analogica en una senal digital, (iii) un medio de transferencia de senal analogica para transferir una senal analogica desde el detector al digitalizador, y (iv) una pluralidad de filtros de umbral digital para establecer un umbral de senal digital que esta cada uno en comunicacion de datos digital con el digitalizador y en respuesta a una entrada de senal digital del digitalizador produce independientemente una senal digital a un archivo de datos correspondiente solo si la entrada de senal digital es mayor que el umbral de senal digital especificado. En algunas realizaciones, las senales analogica y digital son senales de voltaje y el convertidor de analogico a digital (ADC) convierte la senal de voltaje analogica a una senal de voltaje digital. En algunas realizaciones, se hacen una pluralidad de mediciones de espectrometro de masas y se co-anaden la pluralidad de archivos de datos resultantes.

En algunas realizaciones, el espectrometro de masas es un espectrometro de masas de tiempo de vuelo, un espectrometro de masas de tiempo de vuelo con cuadrupolo, un espectrometro de masas con cuadrupolo lineal, un espectrometro de masas de trampa lineal, un espectrometro de masas de sector electrico/magnetico o un espectrometro de masas de trampa de iones con cuadrupolo. En algunas realizaciones, los iones es producen por ionizacion por electrospray (ESI).

En algunas realizaciones, el analito con carga multiple es una biomolecula como, por ejemplo, un acido nucleico, una protema, un carbohidrato o un lfpido. Ejemplos de acidos nucleicos incluyen, pero no estan limitados a, constructos de ARN usados para seleccionar moleculas pequenas para descubrimiento de farmacos y productos de amplificacion como productos de PCR que pueden usarse para analisis geneticos. En algunas realizaciones, el analito con carga multiple es de un peso molecular de 5-500 kDa, 25-250 kDa, o 50-10 kDa.

En algunas realizaciones, el metodo permite la caracterizacion ESI-TOF de biomoleculas en presencia de agentes estabilizadores de biomoleculas o modificadores de matriz usados en tecnicas de separacion online. Los agentes estabilizadores incluyen, pero no estan limitados a, sales tampon como fosfatos por ejemplo, anfolitos, glicerol, polietilenglicol, polipropilenglicol, agentes reductores, detergentes, y similares. Los modificadores de matriz pueden ser cualquier tipo de aditivo usado para efectuar una propiedad de matriz de solucion ventajosa para una separacion analttica y pueden incluir, pero no estan limitados a, anfolitos, detergentes y sales tampon como fosfatos por ejemplo.

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En algunas realizaciones, los agentes estabilizadores de biomoleculas o modificadores de matriz tienen carga unica cuando se detectan por el espectrometro de masas. En otras realizaciones, los agentes estabilizadores de biomoleculas o modificadores de matriz tienen una o dos cargas.

En algunas realizaciones, cuando se emplean una pluralidad de filtros de umbral de senal digital en el sistema de espectrometro de masas, se especifican una pluralidad de umbrales de senal digital unicos para obtener flujos de datos diferencialmente filtrados paralelos que se almacenan en los archivos de datos correspondientes. En algunas realizaciones, cualquier miembro de los archivos de datos puede sustraerse de cualquiera de los otros archivos de datos para obtener una representacion mas precisa de una senal de analito dada. Estas realizaciones pueden usarse para obtener un espectro de masas mas preciso de un ion de calibracion, o cualquier otro peso molecular mas bajo que contamina el ion sustrayendo una senal superpuesta de un ion que tiene un m/z similar pero con una masa molecular mas grande.

En algunas realizaciones, los metodos descritos en la presente que emplean flujos de datos con umbrales establecidos diferencialmente multiples pueden usarse en adquisicion de datos multiplexada de una pluralidad de iones como los obtenidos de productos qmmicos, proteasa o digestion pro restriccion de protemas o acidos nucleicos.

En algunas realizaciones, los metodos descritos en la presente pueden usarse para reducir la carga del nivel de purificacion de analitos de peso molecular grande o con carga multiple como biomoleculas, por ejemplo, de agentes estabilizadores o modificadores de matriz.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Condiciones de Espectrometna de Masas ESI-TOF

En este trabajo se uso un espectrometro de masas Bruker Daltonics (Billerica, MA) MicroTOF ESI time-of- flight (TOF). Los iones de la fuente ESI se someten a extraccion de iones ortogonal y se enfocan en reflecton antes de la deteccion. Los iones se forman en la fuente MicroTOF ESI estandar que esta equipada con un pulverizador fuera de eje y capilaridad vftrea. Para el funcionamiento en el modo de iones negativo, el extremo de presion atmosferica de la capilaridad vftrea se desplaza a 6000 V en relacion a la aguja ESI durante la adquisicion de datos. Se emplea un flujo contracorriente de N2 seco para ayudar en el proceso de desolvatacion. Se emplea acumulacion de iones externos para mejorar el ciclo de trabajo de ionizacion durante la adquisicion de datos. Cada espectro ESI- TOF esta comprendido de 75.000 puntos de datos digitalizados sobre 75 ps. Todos los aspectos de la adquisicion de datos se controlaron por el paquete de datos Bruker MicroTOF. El procesamiento posterior de datos tambien se realizo usando el software Bruker estandar.

Ejemplo 2: Condiciones de PCR y Purificacion de Productos de Amplificacion

Todas las reacciones de PCR se ensamblaron en volumenes de reaccion de 50 pL en un formato de placa de microtitulacion de 96 pocillos usando una plataforma robotica de manejo de lfquidos Packard MPII y termocicladores M.J. Dyad (MJ research, Waltham, MA). La mezcla de la reaccion de PCR consistfa de 4 unidades de tampon Amplitaq Gold, 1x (Applied Biosystems, Foster City, CA), 1.5 mM de MgCh, 0.4M de betaina, 800 pM de mezcla de dNTP y 250 nM de cebador. Se usaron las siguientes condiciones de PCR: 95° C durante 10 min seguido por 50 ciclos de 95° C durante 30 segundos, 50° C durante 30 segundos, y 72° C durante 30 segundos.

Los productos de PCR se purificaron usando los protocolos divulgados y reivindicados en la Solicitud de Patente U.S. N° de Serie: 10/943.344 de propiedad comun e incorporada en la presente por referencia en su totalidad.

Ejemplo 3: Investigacion de la Eficiencia de Deteccion de Iones de Oligonucleotidos Grandes

En un intento de optimizar la eficiencia de deteccion de iones de oligonucleotidos grandes, y para comprender mejor la relacion entre las estadfsticas de llegada de iones y la precision de masas, se diseno un estudio sistematico detallado para investigar la respuesta del detector como una funcion del peso molecular, m/z, y estado de carga en el nivel de iones individuales.

En la espectrometna de masas de tiempo de vuelo los iones se separan en base a las diferencias en su velocidad a medida que atraviesan el tubo de vuelo. A medida que los iones golpean el detector, se registran sus tiempos de llegada y se convierten posteriormente a m/z en base a la configuracion espedfica del espectrometro (longitud de la trayectoria de vuelo, voltaje de aceleracion, geometna, etc.) Se acepta generalmente que para especies con carga unica, la respuesta del detector es inversamente proporcional al peso molecular (velocidad) y, por ejemplo en el cado de MALDi, las especies de peso molecular mas alto inducen una senal de deteccion mas pequena que las especies de peso molecular mas bajo. Se sospechaba que los estados de carga mas bajos (es decir especies de velocidad menor) inducen una senal mas pequena que la de los estados de carga mas alto (es

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decir especies de velocidad alta) bajo los mismos voltajes de aceleracion. La respuesta reducida de los iones "lentos" de peso molecular alto puede mejorarse parcialmente por el uso de metodos post-aceleracion en los que los iones se aceleran a energfas cineticas muy altas inmediatamente antes de la deteccion.

Durante el curso de esta investigacion, fue inmediatamente aparente que los iones del mismo m/z nominal pero diferentes pesos moleculares indujeron respuestas del detector significativamente diferentes. Los iones mas altamente cargados, mas pesados produjeron consistentemente respuestas del detector varias veces las de sus contrapartidas con carga unica en la mimas m/z. Asf, mientras en el analizador de masas TOF los iones de la misma m/z tienen la misma velocidad, los iones de diferente peso molecular no tienen el mismo momento o energfa cinetica y no inducen la misma senal en el detector.

Este fenomeno se ilustra facilmente examinando la respuesta espectral como una funcion del umbral digital empleado para adquirir espectros de masas de especies que cubren un intervalo de pesos moleculares.

A diferencia del MALDI de biomoleculas grandes, el fenomeno de carga multiple inherente al proceso ESI produce generalmente espectros de masas en los que la mayona de las senales estan en el mismo intervalo de m/z. Los iones moleculares de biomoleculas moderadas a grandes (1 kDa a 100 k-Da) se detectan generalmente en el intervalo de 500 - 2000 m/z y no es por lo tanto raro para mezclas complejas para producir espectros en los que se detectan los picos de muchas masas diferentes en el mismo m/z. Para caracterizar la respuesta del detector como una funcion de peso molecular (carga), se analizaron soluciones que contienen analitos con proporciones de peso molecular de 1,0, 3,7, 11,8, 21, 5, y 43 a un intervalo de umbrales digitales. Para cada serie, se uso una carga unica en o cerca de m/z 1233 para calibrar la respuesta del detector. Las isopletas de peso molecular resultantes se estan trazadas en la Figura 1. De manera importante, en umbrales de senal digital bajos establecidos de acuerdo con el Ejemplo 4 (vide infra), los iones de PPC de carga unica caen en intensidad a voltajes de corte significativamente mas bajos que las de especies de peso molecular (carga) mas alto. Por ejemplo, en un voltaje de corte de umbral de senal digital de 9 mV, la senal de los iones de PPG a m/z 1233 se atenua a niveles no detectables mientras que el producto de PCR de 43 kDa a m/z 1233 se detecta todavfa a aproximadamente el 90% de la respuesta inicial. Hay una tendencia definida en los voltajes de corte como una funcion del peso molecular (estado de carga) que sugiere que se puede seleccionar un umbral de senal digital para detectar (o no detectar) selectivamente especies de interes.

Ejemplo 4: Base Logica del Umbral de Senal Digital

Bajo las condiciones de adquisicion empleadas rutinariamente para caracterizar productos de PCR, se adquieren escaneos individuales y se co-anaden a una tasa de 75 kHz. Asf para una adquisicion tfpica de 45 segundos, cada espectro esta comprendido de 660.000 escaneos individuales co-anadidos. Para reducir el ruido disparado/blanco en el espectro co-anadido, las electronicas Micro TOF permiten establecer un umbral de filtro digital (corte de voltaje) de tal manera que el ruido blanco del detector a un recuento de ADC unico o de bits bajos se establece en cero de cada escaneo y solo las respuestas del detector consistentes con los eventos de deteccion de iones se pasan al sistema de datos del digitalizador de suma transiente a ser co-anadidos. Este concepto se muestra esquematicamente en la Figura 2. La Figura 2a representa la salida de ADC bruta de un escaneo individual teorico en el que un ion con carga unica (ion1) golpea el detector en T1 y un ion con carga multiple grande (ion2) que golpea el detector en el momento T2. Durante los intervalos temporales en los que no el ion1 ni el ion2 estan golpeando el detector el ADC esta recogiendo y digitalizando el ruido del detector correspondiente generalmente a 1-5 bits. Debido a la tasa de adquisicion rapida del TOF y la capacidad de iones finita de la fuente, cada escaneo esta comprendido tipicamente de relativamente pocos eventos de deteccion de iones y para cualquier canal de iones dado, es muy improbable que un ion se detecte en cada escaneo. Asf, co-anadir gran numero de escaneos no filtrados como los representados en la Figura 2d resultana en un suelo de ruido que aumentana linealmente con el numero de escaneos y un espectro de masas en el que el intervalo dinamico ultimo estana limitado por el suelo de ruido electronico relativamente alto.

Para minimizar los efectos perjudiciales de co-anadir ruido del detector de bits bajos, las electronicas de MicroTOF permiten al usuario establecer un voltaje de corte que tiene el efecto neto de establecer a cero senales de nivel bajo que se atribuyen solo al ruido del detector. Como se ilustra en la Figura 2c, este enfoque, idealmente, no afecta a los recuentos de ADC para senales consistentes con un ion con carga unica pero filtra digitalmente cada escaneo antes de la co-adicion, de tal manera que el ruido blanco del detector no se co-anade con la misma eficiencia como respuesta ionica del detector. Como se ilustra en la Figura 2b, este concepto puede llevarse un paso adelante estableciendo un umbral de filtro digital de tal manera que los recuentos de aDc derivados del ruido del detector e iones con carga unica que golpean el detector se establecen a cero antes de la co-adicion. Asf, con el umbral digital establecido al nivel representado en la Figura 2b, un ion con carga unica que golpea el detector es "invisible" en la salido de ADC post-filtrada y el resultado neto es un filtro de peso molecular (carga) de "paso alto" en el que las especies de peso molecular (carga) bajo no se detectan pero las especies de peso molecular (carga) alto, que tienden a ser de carga multiple todavfa se detectan.

Ejemplo 5: Eliminacion del Ruido Qmmico por Filtrado de Umbral Digital de Paso Alto

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Un desaffo principal en el analisis de biopoKmeros grandes por ESI-MS es la purificacion de las muestras. Los contaminantes de bajo peso molecular en soluciones de biopoKmeros pueden tener efectos perjudiciales en la calidad de espectros ESI-MS y pueden limitar significativamente el intervalo dinamico y la precision de la medicion. En algunos casos estos "contaminantes" de bajo peso molecular son aditivos realmente requeridos como componentes de separaciones en lmea. Tales aditivos incluyen anfolitos usados en enfoque isoelectrico capilar, fosfatos usados comunmente como componentes de tampones usados en electroforesis de zona capilar, y modificadores de matriz de la solucion usados para promover la formacion de micelas en cromatograffa electrocinetica micelar. De manera similar, aditivos incompatibles con electrospray como glicerol y polfmeros (polietilenglicol, PPG) se usan a menudo para estabilizar enzimas a ser usado en procesos bioqmmicos. Estos compuestos a menudo hacen su camino a traves de un proceso bioqmmico completo y terminan en el espectrometro de masas. Un ejemplo clave del ultimo<tipo de "contaminante" es la presencia de niveles altos de polfmeros de polietilenglicol y polipropilenglicol en la polimerasa Taq usada para PCR. Aunque tfpicamente solo 1-2 pL de Taq usados en cada 50 pL de reaccion de PCR, la concentracion relativamente alta de polfmero en presencia de la concentracion relativamente baja de productos de PCR (tfpicamente 10-100 nM), acoplada con el hecho de que tales polfmeros se ionizan con eficiencia alta, puede provocar un problema de supresion de ruido qrnmico significativa.

La Figura 3a ilustra un ejemplo de un espectro ESI-TOF de un producto de PCR 140-mer en el que una cantidad contaminante de PPG clavo junto con niveles relativamente altos de peptidos con carga unica (que sirven como estandares de masa interna). La senal del envolvente del estado de carga de las hebras con carga multiple de los amplicones de PCR se confunde por la presencia de la senal intensa que surge de las especies de bajo peso molecular. Este espectro se adquirio usando un ajuste de umbral digital "normal" en el que la salida de ruido blanco del detector del digitalizador se filtra pero el umbral esta establecido lo suficientemente bajo para asegurar que se capturen las senales de iones con carga unica. El espectro es ejemplar de una situacion comun en la que un biopolfmero grande se analiza en presencia de un fondo de ruido qrnmico significativo que surge de contaminantes de bajo peso molecular. Como se muestra, tales interferencias pueden afectar adversamente a la precision de la masa de la medicion y resultar en un intervalo dinamico espectral reducido.

Por el contrario, el espectro ESI-TOF en la Figura 3b se adquirio en el mismo espectrometro de la solucion identica usando los parametros de la fuente ESI identicos condiciones de adquisiciones con la importante excepcion de que el espectro en la Figura 3b se adquirio en un voltaje de corte de 15 mV mientras que el espectro en 3a se adquirio momentos antes en un voltaje de corte de 3 mV. Resulta claro de estos espectros, y los datos presentados en la Figura 2 que el ajuste de corte de 15 mV impide la deteccion de las especies con carga unica en la solucion aunque facilita la deteccion de los amplicones de PCR con carga mas alta, mas grandes. Es evidente de los espectros en la Figura 3 y los perfiles de corte en la Figura 2 que la intensidad de los picos del amplicon se reducen alrededor de un 30%; de manera importante los picos del polfmero con carga unica y los calibradores no estan presentes en el espectro adquirido en el voltaje de corte mas alto y el espectro en la Figura 3b tiene caractensticas de ruido senal a qrnmico significativamente mejoradas. Merece la pena enfatizar que no se cambiaron otros instrumentos, solucion o parametros de procesamiento de datos entre la recoleccion de espectros en las Figuras 3a y 3b, la unica diferencia fue el ajuste del umbral de senal digital.

Indicando la aplicabilidad del metodo para biomoleculas distintas de acidos nucleicos, la Figura 8 muestra espectros de masas de anhidrasa carbonica en presencia de 0,001% de SDS y 25 mM de tampon de piperidina/imidizol. Las senales derivadas de protemas del espectro obtenido con un ajuste de umbral de senal digital de 1 mV estan sometidas a interferencia considerable de los componentes de detergente y tampon. Por el contrario, la Figura 8b indica que los componentes interferentes se vuelven "invisibles" especificando un ajuste de umbral digital de 11 mV.

Estos datos indican que en algunas aplicaciones de seleccion de alto rendimiento y QC puede emplearse un protocolo de purificacion de muestras menos riguroso y el ruido qrnmico puede eliminarse a traves del enfoque de filtrado digital descrito anteriormente. De manera importante, este enfoque permite el analisis ESI-MS de biomoleculas grandes (o complejos no covalentes) de soluciones que podnan contener de otra manera demasiado ruido qrnmico para producir espectros impenetrables.

Ejemplo 6: Potenciamiento del Intervalo Dinamico por Filtrado de Umbral Digital

Reduciendo o eliminado el suelo de ruido qrnmico ademas de reduciendo el suelo de ruido electronico, se pueden obtener mejoras significativas en el intervalo dinamico y calidad espectral. Este concepto se demuestra en la Figuras 4 y 5. En la Figura 4 se muestra una region expandida de los espectros ESI-TOF de la Figura 3 en los que se detecta la relativamente baja abundancia de estados de carga alta del amplicon de PCR. Tener en cuenta que las senales de los estados de carga de M-43H+)43', (M-42H+)42', y (M-41H+)41 son apenas visibles en el espectro no filtrado (Figura 4a) pero claramente visibles en el espectro filtrado (Figura 4b). La senal efectiva a ruido del espectro en la Figura 4a se define por la senal a proporcion de ruido qrnmico, mientras que la senal efectiva a ruido del espectro en la Figura 4b se define por la senal a proporcion ruido electronico. Por ejemplo, para el estado de carga (M-41H+)41 del amplicon de la senal a ruido (qrnmico) en el espectro adquirido en el umbral de corte bajo es

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aproximadamente 2 mientras que la senal a ruido (electronico) del espectro adquirido en umbral de corte mas alto es aproximadamente 12. Adicionalmente, las senales de los estados de carga (M-40H+)40- y (M-39H+)39 no son facilmente discernibles del ruido qrnmico en la Figura 4a pero claramente visibles en la Figura 4b.

La mejora en el intervalo dinamico efectivo proporcionado por la presente invencion se ilustra adicionalmente en la Figura 5 en la que una solucion que contiene aproximadamente 0.5 nm de producto de PCR en presencia de 500 nM de PPg se caracterizo en ajustes de umbral alto y bajo. En el ajuste de umbral normal el espectro esta dominado por iones de polfmero de carga unica altamente abundantes y no se observan productos de PCR de bajo nivel. Como se muestra en el recuadro, el espectro superior esta tambien inundado con otros componentes de ruido qrnmico y el fondo de pico en cada masa impide la deteccion de los productos de PCR de bajo nivel. Cuando el umbral de senal digital esta establecido de tal manera que las senales de especies con carga unica no se detectan, se detecta una firma distinta para el amplicon de bajo nivel. Este atributo tiene el potencial de mejorar significativamente la deteccion de biomoleculas de concentracion baja en solucion como lo es frecuentemente la presencia de contaminantes ubicuos, de bajo nivel introducidos de impurezas de tampones, artfculos de plastico, y manejo de muestras que definen el suelo de ruido qrnmico de los espectros de masas y limitan la aplicabilidad del ESI-MS para sistemas biologicos complejos.

Ademas de reducir el intervalo dinamico util de un espectro de masas, el ruido qrnmico y los contaminantes de bajo peso molecular pueden tener efectos adversos en las mediciones de masas precisas. Como se ha descrito anteriormente, los espectros ESI-MS a menudo tienen picos superpuestos que resultan de especies de diferentes pesos moleculares pero el mismo m/z. Esto es particularmente problematico para iones de biopolfmeros grandes que producen generalmente espectros algo congestionados en los que se observan estados de carga multiple en el intervalo de 500 a 2000 m/z. Como las especies de bajo peso molecular se resuelven isotopicamente y las especies por encima de alrededor de 10 kDa generalmente no lo hacen, es bastante comun ver un pico contaminante de peso molecular bajo superponerse con y distorsionar un pico de analitos de otra manera analfticamente util. Un ejemplo de esto se muestra en la Figura 6 en la que la senal del estado de carga (M-3H+)3- de un oligonucleotido 12-mer se observa en el mismo m/z que el estado de carga (M-35H+)35 de un producto de PCR 140-mer mucho mayor. En este caso se pretende que el oligonucleotido mas pequeno sirva como un estandar de masa interna pero, como se ilustra en la Figura 6 y en los datos de precision de masas en la Tabla 1, la co-localizacion de estas senales es perjudicial para ambas senales. Primero, en el umbral de 7 mV no es inmediatamente aparente que hay dos especies en m/z 1233 ya que los picos 12-mer isotopicamente resueltos enmascaran la presencia del pico del amplicon no resuelto mas grande. Adicionalmente, la presencia del pico del amplicon no resuelto distorsiona las formas y centroides del pico de los picos 12-mer isotopicamente resueltos de tal manera que se compromete la precision de masa. Cuando el umbral digital se establece a 11 mV, la contribucion al pico del 12-mer con carga triple se reduce sustancialmente y la presencia de un pico no resuelto de alto peso molecular es aparente. De manera importante, debido a que la senal agregada (es decir, 12-mer y 140-mer) se captura en el nivel de umbral digital 7 mV, y la contribucion a la senal del 140-mer puede medirse en un nivel de umbral digital mas alto (11 mV en este ejemplo), la senal del 12-mer puede derivarse sustrayendo el espectro adquirido en 11 mV del espectro adquirido en 7 mV. El espectro resultante muestra una distribucion notablemente mejorada (que contiene 5 picos) y, quizas con mas importancia, los picos centroides producen un error de medicion de masas reducido a lo largo de la distribucion. En este ejemplo, el error de medicion de masas medio para los cinco picos se redujo de 5,9 a 1,5 ppm siguiendo la sustraccion espectral.

Tabla 1: Error Calculado en Mediciones de m/z para Umbral de Senal Digital de 7 mV frente a Umbrales de _______________________________Senal Digital (7 mV) - (11 mV)_______________________________

Umbral de Senal Digital (mV)

Numero de Pico Teorico (m/z) Medido (m/z) Error (ppm)

7

1 1232.5408 1232.5596 -15.2512

7-11

1 1232.5408 1232.5449 -3.3246

7

2 1232.8752 1232.8809 -4.6266

7-11

2 1232.8752 1232.8753 -0.0844

7

3 1233.2095 1233.2005 7.2811

7-11

3 1233.2095 1233.2071 1.9292

7

4 1233.5437 1233.5452 -1.1898

7-11

4 1233.5437 1233.5428 0.7558

7

5 1233.8780 1233.8764 1.2781

7-11

5 1233.8780 1233.8799 -1.5585

5

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15

20

25

30

35

40

45

50

55

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65

En la Tabla 1, 7-11 indica que un espectro obtenido con un umbral de senal digital de 11 mV se sustrajo de un espectro obtenido con un umbral de senal digital de 7 mV.

Ejemplo 7: Sustraccion Espectral y Particionamiento de lones: Obtener "Cortes de Iones"

De acuerdo con la presente invencion, los experimented ilustrados en las Figuras 3-5 ilustran que el metodo de establecimiento de umbral digital descrito anteriormente permite la deteccion de iones biomoleculares con carga multiple grandes de tal manera que las especies de peso molecular bajo se vuelven "invisibles" (en base al establecimiento de umbrales digitales) aunque los datos presentados en la Figura 6 ilustran un metodo por el que las especies de bajo peso molecular pueden analizarse de tal manera que los iones biomoleculares con carga multiple grandes se hacen "invisibles" (por establecimiento de umbral digital y sustraccion espectral). Los resultados de la sustraccion relativamente simple descrita en el Ejemplo 6 sientan la base para esquemas de establecimiento de umbrales digitales mas sofisticados en los que "cortes" multiples de una poblacion de iones complejos puede analizarse simultaneamente con el resultado efectivo siendo una configuracion de deteccion multidimensional en la que los iones se miden simultaneamente.

En este trabajo todas las comparaciones del umbral alto/umbral bajo se hicieron por mediciones multiples de la misma solucion de analito adquirida bajo identicas condiciones instrumentales excepto que se vario el umbral digital. Esto se hizo por necesidad ya que, como se ilustra en la Figura 7a, la arquitectura del sistema basica del Bruker MicroTOF consiste de un unico flujo de datos del detector al digitalizador para el que se aplica un unico nivel de umbral al flujo de datos antes de co-anadir los escaneos. Como el rendimiento de las muestra es un impulsor principal en muchos laboratorios, requerir que cada muestra se analice dos (o mas) veces en diferentes umbrales digitales puede no ser factible.

De acuerdo con al presente invencion y como un medio para sortear este problema, el esquema de digitalizacion alternativo ilustrado en la Figura 7b indica que la salida del ADC puede dividirse en multiples flujos de datos paralelos, cada uno de los cuales se somete a un umbral digital diferente. Sustrayendo los espectros adquiridos en diferentes umbrales digitales, se puede obtener un espectro de masas para cualquier "corte" de la poblacion de iones. Esto permitina realizar establecimientos de umbrales digitales en un espectro de masas muy complejo y evaluar un intervalo de pesos moleculares (Cargas) independientes de otras poblaciones de iones, potencialmente interferentes como por ejemplo, una digestion de restriccion de un acido nucleico o digestion de proteasa de una protema. Otro ejemplo podna ser una biomolecula como un acido nucleico o una protema que tenga una molecula pequena enlazada no covalentemente.

Tener multiples espectros de masas con umbral establecido variablemente derivados del identico evento de digitalizacion garantizana la sustraccion perfecta de caractensticas espectrales y eliminana artefactos potenciales que puedan surgir de la deriva espectral durante el curso de la adquisicion de multiples espectros. De manera importante, esto tambien significa que se podna introducir estandares (calibradores) de masas internas de bajo peso molecular para calibrar con mucha precision el eje m/z (por ejemplo, la serie PPG en la Figura 3a) pero mediciones de masas precisas derivadas de analitos biomoleculares de picos que no han sido nunca "pisados" por especies de bajo peso molecular (por ejemplo, el espectro con umbral establecido digitalmente en la Figura 3b).

Seran aparentes varias modificaciones de la invencion, ademas de las descritas en la presente a los expertos en la tecnica a partir de la descripcion anterior. Tales modificaciones tambien se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anadidas.

Claims (13)

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   Reivindicaciones

   1. Un metodo para determinar la masa molecular de una pluralidad de analitos en una mezcla que comprende:

   a) hacer una medicion de espectrometro de masas de la mezcla usando un espectrometro de masas, en donde el espectrometro de masas comprende:

   (i) un detector de iones que produce una senal de voltaje analogica;

   (ii) un digitalizador para convertir una senal de voltaje analogica en una senal de voltaje digital;

   (iii) un medio de transferencia de senal analogica para transferir una senal analogica desde el detector al digitalizador; y

   (iv) una pluralidad de filtros de umbral digital para establecer una pluralidad de umbrales de senal digital unicos, cada uno en comunicacion de datos digital con el digitalizador,

   b) especificar una pluralidad de voltajes de umbral de senal digital unicos para al menos un primer miembro y un segundo miembro de la pluralidad de filtros de umbral digital;

   c) en respuesta a una entrada de senal digital del digitalizador:

   (1) generar una primera salida de senal digital filtrada enviando independientemente una senal digital a un primer archivo de datos solo si la entrada de senal digital es mayor que el voltaje del umbral de la senal digital especificado en un primer filtro de umbral digital en el primer miembro de la pluralidad de filtros de umbral digital; y

   (2) generar una segunda salida de senal digital filtrada enviando independientemente una senal digital a un segundo archivo de datos solo si la entrada de senal digital es mayor que el voltaje del umbral de la senal digital especificado en un segundo filtro de umbral digital unico en el segundo miembro de la pluralidad de filtros de umbral digital, en donde cada voltaje de umbral de senal digital unico filtra diferencialmente senales que surgen de la pluralidad de analitos y produce una salida de senal digital unica, de tal manera que la medicion del espectrometro de masas de la mezcla proporciona flujos de datos diferencialmente filtrados paralelos que se almacenan en una pluralidad de archivos de datos correspondientes; y

   d) analizar cada miembro de la pluralidad de archivos de datos correspondientes en donde la masa molecular de al menos un miembro de la pluralidad de analitos esta contenida en el mismo,

   en donde el analisis comprende la sustraccion matematica de al menos un miembro de la pluralidad de archivos de datos correspondientes de al menos un otro miembro correspondiente de la pluralidad de archivos de datos correspondientes para obtener un archivo de datos que proporciona una representacion mas precisa de una senal de analito dado.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la pluralidad de analitos comprende iones con carga unica e iones con carga multiple.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que la pluralidad de filtros de umbral digital se establece para excluir salida de senal digital de las senales analogicas que surgen de iones con carga unica y/o poblaciones de iones interferentes.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 2, en el que los iones con carga multiple son biomoleculas.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que las biomoleculas comprenden moleculas pequenas enlazadas no covalentemente, por ejemplo, las biomoleculas son acidos nucleicos, peptidos, protemas, lfpidos o carbohidratos.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 2 o la reivindicacion 3, en el que los iones con carga unica son aditivos estabilizadores de biomoleculas o modificadores de matriz.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que los aditivos estabilizadores son uno o mas de: polietilenglicol, glicerol, agentes reductores, detergentes, o sales tampon, o cualquier combinacion de los mismos.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 6, en el que los aditivos modificadores de matriz son uno o mas de: anfolitos, detergentes, o sales tampon, o cualquier combinacion de los mismos.
9. 9. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, que comprende ademas hacer una pluralidad de mediciones de espectrometro de masas de acuerdo con el paso b) y co-anadir la pluralidad resultante de archivos de datos obtenidos de la pluralidad de mediciones de espectrometro de masas.
10. 10. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en el que el espectrometro de masas es un espectrometro de

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    10

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    60

    65

    masas de tiempo de vuelo, un espectrometro de masas de tiempo de vuelo con cuadrupolo, un espectrometro de masas con cuadrupolo lineal, un espectrometro de masas de trampa lineal, un espectrometro de masas de sector electrico/magnetico o un espectrometro de masas de trampa de iones con cuadrupolo.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 1, que es un metodo para calibrar un espectro de masas de un analito, en el que:

    (1) el primer voltaje de umbral de senal digital se especifica de tal manera que la salida de senal digital a un primer archivo de datos comprende senales del analito y un ion de calibracion; y

    (2) el segundo voltaje de umbral de senal digital se especifica de tal manera que la salida de senal digital a un segundo archivo de datos comprende senales del analito pero no del ion de calibracion,

    y en el que el metodo comprende sustraer el segundo archivo de datos del primer archivo de datos para obtener un archivo de datos de calibracion que comprende una senal del ion de calibracion pero no del analito y usar dichos datos de calibracion para calibrar el espectro de masas del analito.
12. 12. Un espectrometro de masas que comprende:

    (i) un detector de iones que produce una senal de voltaje analogica;

    (ii) un digitalizador para convertir una senal de voltaje analogica en una senal de voltaje digital;

    (iii) un medio de transferencia de senal analogica para transferir una senal analogica desde el detector al digitalizador;

    (iv) una pluralidad de filtros de umbral digital para establecer una pluralidad de voltajes de umbral de senal digital independientes, cada filtro de umbral digital en comunicacion electronica paralela con el digitalizador;

    (v) una pluralidad de medios de transferencia de salida de senal digital paralelos, para generar una pluralidad de archivos de datos de espectro de masas digitales, cada uno de los cuales esta en comunicacion de datos digital con uno de los filtros de umbral digital y medios para el almacenamiento digital de la pluralidad de archivos de datos de espectro de masas digitales; y

    (vi) medios para la sustraccion matematica de al menos un miembro de la pluralidad de archivos de datos de al menos un otro miembro de la pluralidad de archivos de datos para obtener una representacion mas precisa de una senal de analito dada.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 11 o el espectrometro de masas de la reivindicacion 12, en el que la pluralidad de filtros de umbral digital se establece para excluir la salida de senal digital de senales analogicas que surgen de iones con carga unica y/o poblaciones de iones interferentes.