ES2285740T3

ES2285740T3 - Tratamiento de un trastorno isquemico y mejora de las consecuencias de un accidente cerebrovascular.

Info

Publication number: ES2285740T3
Application number: ES97944453T
Authority: ES
Inventors: David J. Pinsky; David Stern; Ann Marie Schmidt; Eric A. Rose; E. Sander Connoly; Robert A. Solomon; Charles J. Prestigiacomo
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-25
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2017-09-25
Also published as: DE69737562T2; EP0951292A1; DK0951292T3; CA2266640C; CA2266640A1; ATE358492T1; EP0951292B1; PT951292E; EP0951292A4; JP2001501612A; EP1829550A2; EP1829550A3; DE69737562D1; AU4594297A; WO1998013058A1

Abstract

Uso de un gas que comprende monóxido de carbono en una cantidad suficiente para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de un trastorno isquémico en un sujeto durante un periodo de tiempo suficiente.

Description

Tratamiento de un trastorno isquémico y mejora de las consecuencias de un accidente cerebrovascular.

La invención descrita en la presente memoria se realizó con la ayuda del gobierno en el marco del National Institute of Health (Instituto Nacional de Salud) y el National Heart, Lung and Blood Institute (Instituto Nacional de Corazón, Pulmón y Sangre) bajo la concesión HL55397 del Departamento de Salud y Servicios Humanos. Por consiguiente, el gobierno de Estados Unidos posee ciertos derechos sobre esta invención.

A lo largo de esta solicitud se hace referencia a diversas publicaciones con el fin de describir con más detalle el estado de la técnica conocido para los expertos en el momento de la invención descrita y reivindicada en la presente memoria.

Antecedentes de la invención

Durante muchos años se ha centrado la investigación en el tratamiento de trastornos isquémicos. La reciente disponibilidad de ratones transgénicos ha dado lugar a un extenso número de informes que describen los efectos que ejercen productos génicos específicos sobre la fisiopatología del accidente cerebrovascular. Mientras que se han descrito en detalle modelos de isquemia cerebral focal en ratas, las descripciones relativas a un modelo murino para la oclusión de la arteria cerebral media son escasas, y siguen sin definirse las posibles fuentes de variabilidad experimental.

El reclutamiento agudo de neutrófilos hacia el tejido cardiaco o pulmonar postisquémico tiene efectos deletéreos en el periodo de reperfusión temprano, pero siguen debatiéndose los mecanismos y efectos de la entrada de neutrófilos en la patogénesis del accidente cerebrovascular en evolución.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona el uso de un gas que comprende monóxido de carbono en una cantidad suficiente para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de un trastorno isquémico en un sujeto durante un periodo de tiempo suficiente.

En la presente memoria y en las reivindicaciones se caracterizan realizaciones preferidas adicionales de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Acumulación de neutrófilos tras isquemia cerebral focal y reperfusión en ratón. Se realizó en ratones C57B1/J6 macho una oclusión de la arteria cerebral media derecha de 45 minutos de duración, seguida de 23 horas de reperfusión. Una hora antes de la oclusión de la arteria cerebral media se inyectaron en la vena de la cola \approx 3,3 x 10^{5} neutrófilos marcados con ^{111}In. Se obtuvieron recuentos ipsilaterales (hemisféricos derechos) y contralaterales (hemisféricos izquierdos) que se normalizaron por g de tejido (n = 7, **=p < 0,01).

Figura 2A, 2B, 2C y 2D. Efecto de la depleción preoperatoria de neutrófilos sobre los índices pronósticos del accidente cerebrovascular. Se sometieron ratones C57B1/J6 macho a una oclusión transitoria de la arteria cerebral media como se describió anteriormente (tipo silvestre, n = 16) y se compararon con un procedimiento similar realizado en ratones sometidos a una inmunodepleción de neutrófilos durante los tres días anteriores al día de la cirugía (PMN-, n = 18). Fig. 2A. Volúmenes de infarto calculados en base a secciones cerebrales seriadas teñidas con TTC y expresados en % del volumen hemisférico ipsilateral. Fig. 2B. Grado del déficit neurológico medido antes de la anestesia y 24 horas después de la oclusión transitoria de la arteria cerebral media; 4 representa el déficit neurológico más grave. Fig. 2C. Flujo sanguíneo cerebral medido por flujometría de láser doppler 2 mm posterior al bregma, expresado en % del flujo sanguíneo hemisférico contralateral. Fig. 2D. Mortalidad 24 horas después de la oclusión transitoria de la arteria cerebral media (*=p < 0,05, **=p < 0,01, ***=p < 0,001).

Figura 3. Expresión de transcritos de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media. Se preparó ARN de los hemisferios ipsilateral (infarto) y contralateral (sin infarto) del mismo ratón y se cargó un gel de agarosa con 20 \mug de ARN total por carril. Después de transferirlo durante la noche a una membrana de nilón, la transferencia Northern se hibridó con un ADNc de ICAM-1 murino de 1,90 kb marcado con ^{32}P ^{33}. Como control se usó una sonda de \beta-actina.

Figuras 4A y 4B. Expresión del antígeno de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) en la microvasculatura cerebral 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media. Para la inmunotinción de ICAM-1 se obtuvo una sección coronal del cerebro, de manera que se pudieron comparar los hemisferios con y sin infarto del mismo cerebro en idénticas condiciones de tinción. La tinción se llevó a cabo usando un anticuerpo de rata anti-ICAM-1 murino y visualizando los sitios de unión del anticuerpo primario mediante la fosfatasa alcalina. Fig. 4A. Microvaso cerebral en la sección contralateral (sin infarto) de un cerebro obtenido 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media. Fig. 4B. Microvaso cerebral del hemisferio ipsilateral (con infarto) de la misma sección cerebral que la mostrada en la Fig. 4A. Las células endoteliales de los microvasos cerebrales ipsilaterales muestran una mayor expresión de ICAM-1 (tinción roja brillante). Aumento 250x.

Figuras 5A y 5B. Anatomía cerebrovascular en ratones homocigotos carentes de ICAM-1 (Fig. 5B) y de tipo silvestre como controles (Fig. 5A). La tinción con tinta china de la anatomía cerebrovascular con una vista inferior del círculo de Willis muestra que no existen grandes diferencias anatómicas en el patrón vascular de la circulación cerebral, estando las arterias comunicantes posteriores intactas en ambas.

Figuras 6A y 6B. Secciones seriadas teñidas con TTC de ratones representativos de tipo silvestre (Fig. 6A) u homocigotos carentes de ICAM-1 (Fig. 6B) a las 24 horas de ser sometidos a una oclusión transitoria de la arteria cerebral media. El área blanquecina en la zona de la arteria cerebral media representa el tejido cerebral que ha sufrido un infarto, mientras que el tejido viable se tiñe de color rojo ladrillo. En la Figura 7A se muestra la cuantificación de los volúmenes de infarto por planimetría de secciones cerebrales seriadas en múltiples experimentos.

Figuras 7A, 7B, 7C y 7D. Papel de ICAM-1 en el pronóstico del accidente cerebrovascular. Se realizó una oclusión transitoria de la arteria cerebral media como se describió para ratones ICAM-1 +/+ (tipo silvestre, n = 16) o ICAM-1 -/- (n = 13) y se midieron los índices pronósticos del accidente cerebrovascular como se describió en la Figura 2. Fig. 7A. Efecto de ICAM-1 sobre el volumen de infarto, Fig. 7B. la puntuación del déficit neurológico, Fig. 7C. el flujo sanguíneo cerebral y Fig. 7D. la mortalidad (*=p < 0,05, **=p < 0,01).

Figuras 8A y 8B. Efecto de la hipoxia sobre la exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade. Fig. 8A. Se expusieron venas umbilicales humanas a hipoxia (pO_{2} 1.999,5-2.666 Pa) o normoxia durante los tiempos indicados y se cuantificó la secreción del factor von Willebrand (vWF) mediante un ELISA. ***=p < 0,001 para hipoxia frente a normoxia. Fig. 8B. Se realizaron experimentos similares de 8 h de duración en presencia de Ca^{++} 2 mM (Ca^{++} 2 mM), Ca^{++} 0 mM (sin Ca^{++}) o Ca^{++} 0 mM con EGTA 2 mM, que se añadió para quelar el Ca^{++} extracelular residual (sin Ca^{++} + EGTA).

Figuras 9A, 9B, 9C y 9D. Efecto de la hipoxia endotelial sobre la expresión de selectina P y la adhesión de neutrófilos. Fig. 9A. Expresión de selectina P en HUVECs expuestas a normoxia o hipoxia, determinada mediante la unión específica de IgG monoclonal anti-selectina P radiomarcada (clon WAPS12.2). Los datos se expresan como unión relativa respecto a la obtenida a las 4 h de normoxia. Fig. 9B. Efecto de la inhibición de la síntesis de proteínas sobre la expresión de selectina P inducida por hipoxia. En un experimento separado se muestra el efecto de cicloheximida (10 \mug/ml, +CHX) añadida al inicio del periodo de 4 horas de normoxia o hipoxia sobre la expresión de selectina P. Se compara con experimentos simultáneos realizados en ausencia de cicloheximida (-CHX), expresándose los datos como unión relativa respecto a la unión obtenida en condiciones normóxicas (-CHX). Se muestran las medias \pm error típico; *=p < 0,05 respecto a normoxia (-CHX); \dagger=p < 0,05 respecto a normoxia (+CHX). Recuadro: Efecto de cicloheximida (10 \mug/ml) sobre la síntesis de proteínas a las 4 horas, medido por determinación de las proteínas marcadas con ^{35}S que se pueden precipitar con ácido tricloroacético después de la administración de ^{35}S-metionina y ^{35}S-cisteína. Fig. 9C. Unión de neutrófilos marcados con ^{111}indio a monocapas endoteliales de la vena umbilical humana bajo normoxia (N) o hipoxia (H) a las 4 h, en presencia de un anticuerpo anti-selectina P bloqueante (clon WPAS 12.2) o de un anticuerpo anti-selectina P no bloqueante (clon AC1.2). Se muestran las medias \pm error típico; **=p < 0,01.

Figuras 10A, 10B y 10C. Papel de los neutrófilos y de la selectina P endotelial en la conservación del corazón en roedores después de un trasplante heterotópico. Fig. 10A. Conservación del corazón en ratas. Los corazones se trasplantaron inmediatamente después de extraerlos (recientes, n = 8) o se conservaron durante 16 h en solución de Ringer-lactato a 4ºC antes de trasplantarlos (cons., n = 4). Efecto que ejerce la administración de un anticuerpo anti-selectina P no bloqueante (AC1.2, n = 3), la inmunodepleción de neutrófilos en los receptores antes de implantar el corazón donante (-PMN, n = 4) o la administración de 250 \mug de IgG anti-selectina P bloqueante (n = 4) 10 minutos antes de la reperfusión sobre la supervivencia del injerto cardiaco (barras sombreadas) y la leucostasis (actividad de la mieloperoxidasa, barras oscuras). Se muestran las medias \pm error típico; para la supervivencia del injerto, c frente a a, p < 0,0001; g frente a c, p < 0,05; i frente a e o c, p < 0,05. Para la infiltración de neutrófilos en el injerto, d frente a b, p < 0,01; h frente a d, p < 0,05; j frente a d o f, p < 0,05. Fig. 10B. Papel de la selectina P endotelial coronaria en la conservación del corazón usando corazones donantes de ratones carentes de selectina P (o de tipo silvestre como control) de los cuales se eliminó la sangre antes de su conservación. La supervivencia del injerto se valoró por la presencia/ausencia de actividad cardiaca eléctrica/mecánica exactamente diez minutos después de restablecer el flujo sanguíneo. Fig. 10C. Cuantificación de la infiltración de neutrófilos por medición de la actividad de la mieloperoxidasa (dABs 460 nm/min) según se ha descrito^{15,18}. (Para las barras mostradas de izquierda a derecha n = 14, 8, 13 y 7, respectivamente, con los valores de P indicados).

Figuras 11A y 11B. Liberación de cuerpos de Weibel-Palade durante una cirugía cardiaca humana en 32 pacientes. Fig. 11A. Se tomaron muestras de sangre del seno coronario al comienzo (SC_{1}) y al término (SC_{2}) del periodo isquémico (pinzamiento transversal de la aorta). Se realizaron ELISAs para trombomodulina (TM) y vWF. Fig. 11B. Inmunoelectroforesis para vWF de una muestra representativa de sangre SC_{1} y SC_{2} del mismo paciente (se indican los factores de dilución). Se detecta un aumento de multímeros de alto peso molecular en las muestras SC_{2}.

Figuras 12A, 12B, 12C y 12D. Visión de conjunto del sistema operativo del modelo murino de isquemia cerebral focal. Fig. 12A. El esquema muestra el sistema de retracción por sutura. Fig. 12B. Vista a través del microscopio de operaciones. El muñón vascular grande representa la arteria carótida externa, que está en posición inferomedial en el área de operaciones. Fig. 12C. Fotografía de una sutura oclusiva redondeada por calor del calibre indicado (nilón 5-0 [inferior] o 6-0 [superior]). Fig.12D. Esquema de la anatomía cerebrovascular de ratón, con un hilo en la arteria cerebral anterior que ocluye la arteria cerebral media en su punto de origen.

Figura 13. Comparación de la anatomía cerebrovascular en diferentes cepas de ratones. Después de la anestesia se inyecta a los ratones tinta china por vía intracardiaca, a lo que sigue una eutanasia humanitaria. En todas las cepas se puede observar un círculo de Willis intacto, incluidas las arterias comunicantes posteriores bilaterales, lo que indica que no existen grandes diferencias entre las cepas en cuanto a la anatomía cerebrovascular.

Figuras 14A, 14B y 14C. Influencia de la cepa de ratón sobre el pronóstico del accidente cerebrovascular. Los ratones (machos de 20 a 23 g) se sometieron durante 45 minutos a una oclusión de la ACM (usando una sutura oclusiva 6.0 de 12 mm) seguida de 14 horas de reperfusión y se determinaron los índices pronósticos del accidente cerebrovascular. Fig. 14A. Influencia de la cepa sobre el volumen de infarto, determinada en porcentaje del volumen hemisférico ipsilateral como se describe en la sección "Métodos". Fig. 14B. Influencia de la cepa sobre la puntuación del déficit neuronal, que abarca desde ausencia de déficit neuronal (0) hasta déficit neurológico grave (4), determinándose las puntuaciones como se describe en la sección "Métodos". Fig. 14C. Influencia de la cepa en el flujo sanguíneo cerebral, medido por flujometría de láser doppler como flujo relativo presente en la zona del infarto en comparación con el flujo sanguíneo existente en la corteza contralateral (sin infarto). Las cepas incluían ratones 129J (n = 9), CD1 (n = 11) y C57/B16 (n = 11); *=p < 0,05 respecto a ratones 129J.

Figuras 15A, 15B y 15C. Influencia del tamaño del animal y del diámetro de la sutura oclusiva sobre el pronóstico del accidente cerebrovascular. Se sometieron ratones CD-1 macho con los tamaños indicados a una oclusión de la arteria cerebral media (45 minutos) seguida de una reperfusión (24 horas) como se describe en la sección "Métodos". El tamaño de la sutura (calibre) se indica en cada gráfico. Los animales pequeños (n = 11) incluían a aquellos que pesaban entre 20 y 25 g (media 23 g), y los animales grandes pesaban entre 28 y 35 g (media 32 g; n = 14 para la sutura 6.0, n = 9 para la sutura 5.0). Fig. 15A. Influencia del tamaño del animal/sutura sobre el volumen de infarto, Fig. 15B. la puntuación del déficit neurológico y Fig. 15C. el flujo sanguíneo cerebral, medidos como se describió en la Figura 14. Se muestran los valores de P.

Figuras 16A, 16B y 16C. Influencia de la temperatura sobre el pronóstico del accidente cerebrovascular. Se sometieron ratones C57/B16 macho durante 45 minutos a una oclusión de la ACM (sutura 6.0) y seguidamente a una reperfusión. Las temperaturas interiores se mantuvieron durante 90 minutos a 37ºC (normotermia, n = 11) usando una sonda intrarrectal con un dispositivo de calentamiento controlado por termopar. En el segundo grupo (hipotermia, n = 12), los animales se colocaron en jaulas que se dejaron a temperatura ambiente después de 10 minutos iniciales de normotermia (temperatura interna media 31ºC a los 90 minutos). Después de este periodo de observación de 90 minutos, los animales de ambos grupos se volvieron a colocar en sus jaulas manteniendo la temperatura ambiente a 37ºC durante el periodo de observación. Veinticuatro horas después de la oclusión de la ACM se registraron los índices pronósticos del accidente cerebrovascular; Fig. 16A. volumen de infarto, Fig. 16B. puntuación del déficit neurológico y Fig. 16C. flujo sanguíneo cerebral, medidos como se describió en la Figura 3. Se muestran los valores para *=p < 0,05.

Figuras 17A, 17B y 17C. Comparación del pronóstico de una isquemia cerebral focal permanente y una isquemia cerebral focal transitoria seguidas de reperfusión. La ACM se ocluyó de forma permanente (n = 11) o transitoria (45 minutos, n = 17) con una sutura de calibre 6.0 en ratones C57/B16 macho de 22 gramos, como se describe en la sección "Métodos". Veinticuatro horas después de la oclusión de la ACM se registraron los índices pronósticos del accidente cerebrovascular; Fig. 17A. volumen de infarto, Fig. 17B. puntuación del déficit neurológico y Fig. 17C. flujo sanguíneo cerebral, medidos como se describió en la Figura 14.

Figuras 18A y 18B. Expresión de selectina P y acumulación de neutrófilos (PMN) después de la oclusión de la arteria cerebral media (OACM) en ratones. Fig. 18A. Expresión de selectina P después de la OACM y la reperfusión. La expresión relativa del antígeno de selectina P en el hemisferio cerebral ipsilateral después de la oclusión de la arteria cerebral media se mostró usando una IgG monoclonal de rata anti-selectina P marcada con ^{125}I o una IgG de rata no inmunológica marcada con ^{125}I para controlar la extravasación inespecífica. Los experimentos se realizaron como se describe en la leyenda de la Figura 18. Los valores se expresan en cpm ipsilaterales/cpm contralaterales. n = 6 para todos los grupos, excepto para el control de 30 min (n = 4); ^{\ddagger}=p < 0,001, 30 min de reperfusión frente a justo antes de la oclusión; *=p < 0,025, cambio en la acumulación de selectina P frente al cambio en la acumulación de la IgG control. Fig. 18B. Curso temporal de la acumulación de PMN después de una isquemia cerebral focal y reperfusión en ratón. Para estos experimentos se inyectaron a ratones de tipo silvestre para SP (SP +/+) por vía intravenosa \approx 3,3 x 10^{5} PANS marcados con ^{111}-In 15 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media (OACM). La acumulación de ^{111}In-PMN se midió inmediatamente después de sacrificar los animales como relación de cpm ipsilaterales/contralaterales en las siguientes condiciones experimentales: antes de la OACM (Pre-O, n = 4), inmediatamente después de la OACM (Post-O, n = 6) y 10 minutos después de la OACM pero todavía antes de la reperfusión (:10 Post-O, n=6). Para establecer el efecto de la reperfusión sobre la acumulación de PMN, se inició una reperfusión después de 45 minutos de isquemia. La acumulación de PMN se midió después de 30 minutos (n = 6), 300 minutos (n = 3) y 22 horas (n = 8) de reperfusión. La acumulación de PMN se midió en idénticas condiciones en ratones carentes de selectina P (SP -/-) después de 45 minutos de isquemia y 22 horas de reperfusión (n = 7, *=p < 0,05 frente a 45 min de OACM/22 h de reperfusión en animales SP +/+).

Figura 19. Papel de la selectina P en la ausencia de reflujo cerebrovascular. El flujo sanguíneo cerebral se midió en ratones SP +/+ (gráfico superior) y SP -/- (gráfico central) usando un flujómetro de láser doppler y se expresa en porcentaje del flujo sanguíneo del hemisferio contralateral (no isquémico) (\pm error típico). El flujo sanguíneo se midió en los siguientes instantes: a, antes de la OACM (SP+/+, n = 16; SP-/-, n = 23); b, inmediatamente después de la OACM (SP+/+, n = 42; SP-/-, n = 40); c, 10 minutos después de la OACM pero todavía antes de la reperfusión (SP+/+, n = 36; SP-/-, n = 34); d, inmediatamente después de la reperfusión (SP+/+, n = 36; SP-/-, n = 34); e, 30 minutos después de la reperfusión (SP +/+, n = 8; SP-/-, n = 5); y f, 22 horas después de la reperfusión (SP+/+, n = 15; SP-/-, n = 5). El gráfico inferior representa una superposición de los dos gráficos superiores, omitiéndose las barras de error para mayor claridad.

Figura 20. Anatomía cerebrovascular en ratones homocigotos carentes de selectina P, SP-/- (derecha), y controles de tipo silvestre, SP+/+ (izquierda). La tinción con tinta china/negro de carbono de la anatomía cerebrovascular, con una vista inferior del círculo de Willis, muestra que no existen grandes diferencias anatómicas en el patrón vascular de la circulación cerebral, estando las arterias comunicantes posteriores intactas en ambas.

Figuras 21A, 21B y 21C. Efecto del gen de la selectina P sobre los pronósticos del accidente cerebrovascular. Se realizó una oclusión de la arteria cerebral media durante 45 minutos y seguidamente una reperfusión de 22 horas en ratones selectina P +/+ (n = 10) o selectina P -/- (n = 7). Efecto de la selectina P en: Fig. 21A. el volumen de infarto, como se demuestra por tinción con cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio (TTC) al 2%, calculado como porcentaje del hemisferio ipsilateral; Fig. 21B. la puntuación del déficit neurológico (1 = movimientos espontáneos normales; 2 = giros en el sentido de las agujas del reloj; 3 = giros sobre sí mismo en el sentido de las agujas del reloj; 4 = ausencia de respuesta a estímulos nocivos); Fig. 21C. el porcentaje de supervivencia en el momento de sacrificar a los animales (*=p < 0,05).

Figuras 22A, 22B, 22C y 22D. Efecto del bloqueo de selectina P sobre los pronósticos del accidente cerebrovascular. Justo antes de la cirugía se administró a ratones SP+/+ una IgG de rata anti-selectina P de ratón (clon RB 40.34, 30 \mug/ratón) o una dosis similar de una IgG de rata no inmunológica. Muestran la Fig. 22A. el flujo sanguíneo cerebral treinta minutos después de la reperfusión; y la Fig. 22B. los volúmenes de infarto, la Fig. 22C. la puntuación del déficit neuronal y la Fig. 22D la mortalidad después de 22 horas de reperfusión (n = 7 para todos los grupos, *=p < 0,05).

Figuras 23A y 23B. Fig. 23A. Efecto de la inhalación de monóxido de carbono sobre los volúmenes de infarto cerebral. Se colocaron ratones bajo campanas de cristal en las que se expusieron a 0,1% de CO durante 12 horas. Después de este tratamiento se retiraron de las campanas de cristal y se sometieron a una oclusión intraluminal de la arteria cerebral media. A las 24 horas se sacrificaron los animales y se midieron los volúmenes de infarto por tinción con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) como se muestra en la Figura 25. La cuantificación de los volúmenes de infarto (media \pm error típico) se expresa en porcentaje del infarto respecto al hemisferio ipsilateral. Estos datos muestran que el CO inhalado reduce los volúmenes de infarto tras un accidente cerebrovascular.

Fig. 23B. Efecto de la inhalación de monóxido de carbono en la mortalidad tras un accidente cerebrovascular. Los experimentos se realizaron como se describió anteriormente. Se muestra la mortalidad después de 24 horas. Estos datos muestran que el CO inhalado reduce la mortalidad tras un accidente cerebrovascular.

Figuras 24A, 24B y 24C. Fig. 24A. Dosis/respuesta de monóxido de carbono inhalado en el pronóstico del accidente cerebrovascular. Los experimentos se describieron anteriormente. El CO se inhaló en las dosis indicadas. Estos datos muestran que el CO inhalado reduce el volumen de infarto de un modo dependiente de la dosis, proporcionando el 0,1% una protección óptima. Fig. 24B y 24C. Papel de la hemooxigenasa, la enzima que produce CO, en el accidente cerebrovascular. Se administró a los animales vehículo (DMSO) solo como control o protoporfirina de cinc IX (ZnPP) o protoporfirina de estaño IX (SnPP). En un último grupo se administró a los ratones biliverdina (Bili), un compuesto que se forma junto con CO durante el proceso de la hemodegradación por la hemooxigenasa. El gráfico izquierdo muestra los volúmenes de infarto. El gráfico derecho muestra la mortalidad. Estos experimentos demuestran que cuando se bloquea la actividad de la hemooxigenasa, los pronósticos del accidente cerebrovascular son peores (infartos más extensos y mayores mortalidades). Puesto que la administración de biliverdina no protege, estos datos sugieren que es el otro coproducto de la actividad de la hemooxigenasa (CO) el que protege.

Figura 25. Tinción con TTC de secciones cerebrales seriadas correspondientes a los animales de la Figura 23. El tejido que ha sufrido un infarto aparece blanco y el tejido viable aparece de color rojo ladrillo.

Figuras 26A-26F. Efecto de la isquemia cerebral focal sobre la inducción de la hemooxigenasa I (HO-I). Las Figs. 26A a 26C muestran la hibridación in situ de ARNm de HO-I en accidentes cerebrovasculares (Fig. 26B) y en controles (Figs. 26A y 26C). Las Figs. 26D a 26F muestran los análisis inmunohistoquímicos de la proteína HO-I. La Fig. 26E muestra que tras un accidente cerebrovascular la proteína se expresa en los vasos sanguíneos y en los astrocitos. Las Figs. 26D y 26F muestran que en los controles la proteína no se expresa en los vasos sanguíneos ni en los astrocitos.

Figura 27. Efecto de la isquemia cerebral focal sobre la inducción del ARNm de la hemooxigenasa I (HO-I). Contralateral indica el lado del cerebro que no ha sufrido ningún accidente cerebrovascular. Ipsilateral indica el lado del cerebro que ha sufrido un accidente cerebrovascular. Ambos animales muestran en el lado del cerebro que ha sufrido el accidente cerebrovascular un aumento de HO-I, mientras que el lado que no ha sufrido ningún accidente cerebrovascular no lo presenta.

Figura 28. Efecto de la hipoxia sobre la inducción de la hemooxigenasa I (HO). Los ratones expuestos durante 12 horas a un entorno hipóxico (para estimular la isquemia) muestran un aumento en el ARNm de la hemooxigenasa I en comparación con los controles normóxicos. Estos datos muestran un posible mecanismo por medio del cual la preexposición a una hipoxia también puede conferir protección frente a episodios isquémicos posteriores, que se descubrió era cierto en ratones sometidos a hipoxia seguida de un accidente cerebrovascular.

Figura 29. Efecto de la hipoxia sobre la expresión de la proteína hemooxigenasa I (HO-I) en células endoteliales del cerebro de ratón. La hipoxia hace que los niveles de la proteína HO-I aumenten en estas células endoteliales procedentes del cerebro.

Figura 30. Efecto de la hipoxia sobre la inducción del ARNm de la hemooxigenasa I (HO-I) en células endoteliales del cerebro de ratón. La hipoxia hace que los niveles del ARNm de HO-I aumenten en estas células endoteliales procedentes del cerebro.

Figuras 31A-31D. Expresión de selectina P y acumulación de neutrófilos (PMN) después de una oclusión de la arteria cerebral media (OACM) en ratones. Fig. 31A. Expresión de selectina P después de la OACM y reperfusión. La expresión relativa del antígeno de selectina P en el hemisferio cerebral ipsilateral después de la oclusión de la arteria cerebral media se mostró usando una IgG monoclonal de rata anti-selectina P marcada con ^{125}I o una IgG no inmunológica de rata marcada con ^{125}I para controlar la extravasación inespecífica. Los valores se expresan en cpm ipsilaterales/cpm contralaterales. n = 6 para todos los grupos, excepto para el control de 30 min (n = 4); ^{\ddagger}=p < 0,001, 30 min de reperfusión frente a justo antes de la oclusión; *=p < 0,025, cambio en la acumulación de selectina P frente al cambio en la acumulación de la IgG control. Figs. 31B y 31C. Localización inmunohistoquímica de la expresión de selectina P en una sección del cerebro de un ratón sometido a una OACM de 45 minutos y seguidamente a una reperfusión de 1 hora. Se muestran las secciones corticales cerebrales ipsilateral y contralateral del mismo ratón. Las flechas señalan un microvaso cerebral, en el que el color marrón oscuro representa la expresión de selectina P en la superficie de las células endoteliales. Fig. 31D. Curso temporal de la acumulación de PMN tras una isquemia cerebral focal y reperfusión en ratón. Para estos experimentos se inyectaron a ratones de tipos silvestre para SP (SP+/+) por vía intravenosa \approx3,3 x 10^{5} PMN marcados con ^{111}In 15 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media (OACM). La acumulación de ^{111}In-PMN se midió inmediatamente después de sacrificar los animales como relación de cpm ipsilaterales/contralaterales en las siguientes condiciones experimentales: antes de la OACM (Pre-O, n = 4), inmediatamente después de la OACM (Post-O, n = 6) y 10 minutos después de la OACM pero todavía antes de la reperfusión (:10 Post-O, n = 6). Para establecer el efecto de la reperfusión sobre la acumulación de PMN se inició una reperfusión después de 45 minutos de isquemia. La acumulación de PMN se midió después de 30 minutos (n = 6), 300 minutos (n = 3) y 22 horas (n = 8) de reperfusión. La acumulación de PMN se midió en idénticas condiciones en ratones carentes de selectina P (SP-/-) después de 45 minutos de isquemia y 22 horas de reperfusión (n = 7, *=p < 0,05 frente a 45 min de OACM/22 h de reperfusión en animales SP+/+).

Figuras 32A-32C. Papel de la selectina P en la ausencia de reflujo cerebrovascular. El flujo sanguíneo cerebral se midió en ratones SP+/+ (gráfico superior) y SP-/- (gráfico central) usando un flujómetro de láser doppler y se expresa en porcentaje del flujo sanguíneo del hemisferio contralateral (no isquémico) (\pm error típico). El flujo sanguíneo se midió en los siguientes instantes: a, antes de la OACM (SP+/+, n = 16; SP-/-, n = 23); b, inmediatamente después de la OACM (SP+/+, n = 42; SP-/-, n = 40); c, 10 minutos después de la OACM pero todavía antes de la reperfusión (SP+/+, n = 36; SP-/-, n = 34); d, inmediatamente después de la reperfusión (SP+/+, n = 36; SP-/-, n = 34); e, 30 minutos después de la reperfusión (SP+/+, n = 8; SP-/-, n = 5); y f, 22 horas después de la reperfusión (SP+/+, n = 15; SP-/-, n = 5). El gráfico inferior representa una superposición de los dos gráficos superiores, omitiéndose las barras de error para mayor claridad.

Figuras 33A y 33B. Efecto del gen de la selectina P sobre los pronósticos del accidente cerebrovascular. Se realizó una oclusión de la arteria cerebral media durante 45 minutos y seguidamente una reperfusión de 22 horas en ratones selectina P +/+ (n = 10) o selectina P -/- (n = 7). Efecto de la selectina P sobre: Fig. 33A. el volumen de infarto, como se demuestra por tinción con cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio (TTC) al 2%, calculado como porcentaje del hemisferio ipsilateral; Fig. 33B. el porcentaje de supervivencia en el momento de sacrificar los animales. Se indican las medias \pm error típico, indicándose los números de animales que se usaron para calcular el porcentaje de supervivencia encima de las barras de supervivencia (*=p < 0,05).

Figura 34. Efecto del bloqueo de la selectina P sobre los pronósticos del accidente cerebrovascular. Se administró a ratones SP+/+ una IgG de rata anti-selectina P de ratón (clon RB 40.34, 30 \mug/ratón) o una dosis similar de IgG de rata no inmunológica justo antes de la oclusión de la arteria cerebral media (Pre-OACM; n = 7 para todos los grupos) o después de la oclusión de la arteria cerebral media (Post-OACM, n = 9 para el anticuerpo control, n = 6 para el anticuerpo anti-selectina P funcionalmente bloqueante). En ambos casos, la sutura oclusiva intraluminal se retiró después de un periodo isquémico de 45 minutos para simular una reperfusión clínica. Se muestran los volúmenes de infarto (barras oscuras), el flujo sanguíneo cerebral relativo treinta minutos después de la reperfusión (barras con rayas diagonales) y la supervivencia (barras ligeramente sombreadas) después de 22 horas de reperfusión. Se indican las medias \pm error típico, indicándose los números de animales que se usaron para calcular el porcentaje de supervivencia encima de las barras de supervivencia. *=p < 0,05 frente al anticuerpo control.

Figuras 35A y 35B. Validación del ensayo espectrofotométrico cuantitativo de la hemorragia intracerebral en ausencia (Fig. 35A) o presencia (Fig. 35B) de tejido cerebral. Fig. 35A. Curva patrón en la que concentraciones conocidas de hemoglobina se redujeron a cianomethemoglobina y después se midió la DO a 550 nm. N = 5 determinaciones en cada punto, mostrándose las medias \pm error típico. Se muestran la ecuación a la que mejor se ajusta la recta y el valor r. Fig. 35B. Se añadieron concentraciones conocidas de hemoglobina (usando sangre autóloga diluida en solución salina) a volúmenes fijos de homogenado de tejido cerebral recién preparado y se llevó a cabo el ensayo espectrofotométrico. Los cerebros se dividieron en los hemisferios; un hemisferio de cada animal se sumergió en solución salina fisiológica durante 20 minutos (NS, línea continua) y el otro hemisferio se colocó en cloruro de trifeniltetrazolio (TTC, línea discontinua) durante 20 minutos (similar al procedimiento que se realizaría para medir el volumen de infarto cerebral). El ensayo espectrofotométrico de hemoglobina se realizó en 6 hemisferios para cada concentración de hemoglobina añadida. Se muestran las medias \pm error típico.

Figuras 36A y 36B. Ensayo espectrofotométrico cuantitativo de hemoglobina. Fig. 36A. Efectos de la infusión de colagenasa y rt-PA sobre la HIC cuantitativa en ratones. Se infundieron estereotácticamente agentes inductores de una HIC en la corteza profunda derecha/ganglios basales de ratones. 24 h después se extrajeron los cerebros y se realizó el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina para cuantificar la HIC. Los ratones se sometieron a 1) ningún tratamiento (control), 2), infusión estereotáctica de 1 \mul de solución salina normal (Falso), 3) infusión estereotáctica de 0,024 \mug de colagenasa B en 1 \mul de solución salina normal (colagenasa) o 4) infusión estereotáctica de colagenasa B (como anteriormente) seguida de una inyección del activador tisular del plasminógeno intravenoso (1 mg/kg en 0,2 \mul de solución salina normal) en la vena dorsal del pene (colagenasa + rt-PA). **p < 0,001 frente a falso o control. Fig. 36B. Efecto de rt-PA tras un accidente cerebrovascular isquémico focal sobre la HIC cuantitativa en ratones. Los ratones se sometieron a una oclusión de la ACM de 45 minutos de duración, seguida de una reperfusión y después de 1) 0,2 \mul de solución salina normal intravenosa (accidente cerebrovascular + solución salina) o 2) activador tisular del plasminógeno intravenoso (15 mg/kg en 0,2 \mul de solución salina normal) (accidente cerebrovascular + rt-PA). 24 h después se extrajeron los cerebros y se realizó el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina para cuantificar la HIC. **p < 0,05.

Figura 37. Demostración del sistema de puntuación usado para la determinación visual de la HIC tras un accidente cerebrovascular. Cada corte, tomado de diferentes animales que han sufrido un accidente cerebrovascular, representa el corte coronal cerebral que muestra el diámetro hemorrágico máximo. Los números corresponden a la puntuación de la hemorragia determinada visualmente, como se define en la sección "Métodos".

Figuras 38A y 38B. Puntuación visual de la HIC. Fig. 38A. Efectos de la infusión de colagenasa y rt-PA sobre la puntuación visual de la HIC en ratones. Se infundieron estereotácticamente agentes inductores de una HIC en la corteza profunda derecha/ganglios basales de ratones. Los ratones se sometieron a 1) ningún tratamiento (control), 2), infusión estereotáctica de 1 \mul de solución salina normal (Falso), 3) infusión estereotáctica de 0,024 \mug de colagenasa B en 1 \mul de solución salina normal (colagenasa) o 4) infusión estereotáctica de colagenasa B (como anteriormente) seguida de una inyección del activador tisular del plasminógeno intravenoso (1 mg/kg en 0,2 \mul de solución salina normal) en la vena dorsal del pene (colagenasa + rt-PA). 24 h después se extrajeron los cerebros, se cortaron en secciones coronales de 1 mm y se puntuaron por un observador imparcial como se describe en la sección "Métodos". *p < 0,05 respecto a colagenasa, p < 0,005 frente a falso o control. Fig. 38B. Efecto de rt-PA tras un accidente cerebrovascular isquémico focal sobre la puntuación visual de la HIC en ratones. Los ratones se sometieron a una oclusión de la ACM de 45 minutos de duración, seguida de una reperfusión y después de 1) 0,2 \mul de solución salina normal intravenosa (accidente cerebrovascular + solución salina) o 2) activador tisular del plasminógeno intravenoso (15 mg/kg en 0,2 \mul de solución salina normal) (accidente cerebrovascular + rt-PA). 24 h después se extrajeron los cerebros, se cortaron en secciones coronales de 1 mm y se puntuaron por un observador imparcial como se describe en la sección "Métodos". *p < 0,01. Se muestran los valores individuales para las puntuaciones visuales de la HIC, indicándose el valor medio para cada grupo con una línea horizontal.

Figura 39. Correlación entre la evaluación visual de la HIC y el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina. La densidad óptica a 550 nm (ordenada) representa los resultados obtenidos en el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina, en el que se analizó tejido cerebral (de todos los experimentos). Las puntuaciones visuales correspondientes de la HIC (como se muestran en la Figura 38) están trazados en la abscisa. Para cada punto se muestran las medias \pm error típico. Se efectuó una correlación lineal usando la correlación lineal de Pearson, mostrándose la ecuación de la recta y el valor r.

Figuras 40A a 40F. Fig. 40A. Efecto del accidente cerebrovascular y de la administración del factor IXai durante el accidente cerebrovascular sobre la acumulación de plaquetas radiomarcadas. Se administraron ^{111}indio-plaquetas a animales control sin accidente cerebrovascular (n = 4) o a animales justo antes del accidente cerebrovascular con (n = 7) o sin administración preoperatoria del factor IXai (300 \mug/kg, n = 7). La acumulación de plaquetas se expresa en cpm ipsilaterales/cpm contralaterales. Se muestran las medias \pm error típico. *p < 0,05 frente a ausencia de accidente cerebrovascular; **p < 0,05 frente a accidente cerebrovascular + vehículo. Figura 40B. Acumulación de fibrina en el tejido cerebral que ha sufrido un infarto. Veinticuatro horas después de la isquemia cerebral focal y la reperfusión se extrajo el cerebro de un ratón representativo que había sido tratado previamente, antes de la cirugía, con vehículo (los dos carriles de la izquierda) o con el factor IXai (300 \mug/kg, los dos carriles de la derecha). Los cerebros se dividieron en los hemisferios ipsilateral (D) y contralateral (I), y se realizó una digestión con plasmina para solubilizar la fibrina acumulada. Se llevó a cabo una inmunotransferencia usando un anticuerpo primario dirigido contra un neoepítopo que se expresa en el dímero de cadenas gamma-gamma de la fibrina reticulada. Figs. 40C-40F. Identificación inmunohistoquímica de los sitios de formación de fibrina en el accidente cerebrovascular. Se extrajeron los cerebros de dos ratones que sufrieron un accidente cerebrovascular y se usó el mismo anticuerpo descrito en la Figura 2B para detectar la fibrina (cada uno de los paneles superior e inferior representa un ratón). Las flechas identifican microvasos cerebrales. Cabe señalar que en ambos hemisferios ipsilaterales (paneles derechos) se puede identificar claramente la fibrina
intravascular por la tinción roja, que no se observa en los hemisferios contralaterales (panel izquierdo) no isquémicos.

Figuras 41A-41C. Fig. 41A. Efecto del factor IXai sobre el flujo sanguíneo cerebral relativo en un modelo murino del accidente cerebrovascular, medido mediante láser doppler. El flujo sanguíneo cerebral a las 24 horas es significativamente mayor en los animales tratados con el factor IXai (300 \mug/kg, n = 48, línea discontinua) que en los controles tratados con vehículo (n = 62). Se muestran las medias \pm error típico. *p < 0,05. Fig. 41B. Efecto del factor IXai sobre los volúmenes de infarto en un modelo murino del accidente cerebrovascular, medido por tinción de secciones coronales seriadas con TTC. Se administró a los animales vehículo (n = 62) o el factor IXai (300 \mug/kg, n = 48). Se muestran las medias \pm error típico. *p < 0,05. Fig. 41C. Dosis/respuesta del factor IXai en el accidente cerebrovascular. El factor IXai se administró justo antes de iniciarse el accidente cerebrovascular, y los volúmenes de infarto cerebral se determinaron como se describió en la Figura 41B anterior. N = 62, 48, 6 y 6 para el vehículo y dosis de 300 \mug/kg, 600 \mug/kg y 1.200 \mug/kg, respectivamente. Se muestran las medias \pm error típico. *p < 0,05 frente a los animales tratados con vehículo.

Figuras 42A y 42B. Efecto del factor IXai sobre la hemorragia intracerebral. Fig. 42A. El ensayo espetrofotométrico de hemoglobina se llevó a cabo como se describe en la sección "Métodos". La DO a 550 nm es directamente proporcional al contenido de hemoglobina en el cerebro^{11,12}. Fig. 42B. Puntuación de la HIC determinada visualmente por un observador imparcial como se describe en la sección "Métodos". La puntuación de la HIC se correlaciona con el contenido de hemoglobina en el cerebro determinado por espetrofotometría^{11,12}. Se muestran las medias \pm error típico. *p < 0,05 frente a los animales tratados con vehículo.

Figura 43. Efecto del instante en que se administra el factor IXai sobre los volúmenes de infarto cerebral cuando éste se administra después de iniciarse el accidente cerebrovascular. Los ratones se sometieron a una isquemia cerebral focal y una reperfusión como se describe en la sección "Métodos". Los datos relativos a la administración anterior a la oclusión (las 2 barras de la izquierda) son los que se mostraron en la Figura 42B. En experimentos adicionales para determinar los efectos de la administración del factor IXai después del accidente cerebrovascular se administró por vía intravenosa vehículo (solución salina normal, n = 13) o el factor IXai (300 \mug/kg, n = 7) inmediatamente después de retirar la sutura oclusiva intraluminal. Se determinaron los volúmenes de infarto cerebral (en base a la tinción con TTC de secciones seriadas obtenidas a las 22 h). Se muestran las medias \pm error típico. *p < 0,05, **p < 0,05 frente a los animales tratados con vehículo.

Descripción detallada de la invención

En la presente memoria se describen los usos de un método para el tratamiento de un trastorno isquémico en un sujeto, que incluye administrar al sujeto una forma farmacéuticamente aceptable de un antagonista de la selectina en una cantidad suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para prevenir la acumulación de glóbulos blancos con el fin de tratar el trastorno isquémico en el sujeto. El antagonista de la selectina puede ser un péptido mimético, una molécula de ácido nucleico, un ribozima, un polipéptido, una molécula pequeña, una molécula de carbohidrato, un monosacárido, un oligosacárido o un anticuerpo. La selectina puede ser una selectina P, una selectina E o una selectina L. El anticuerpo puede ser un anticuerpo contra la selectina P. El anticuerpo puede ser asimismo un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. El antagonista de la selectina P puede incluir un precursor de óxido nítrico (NO), tal como L-arginina, un donador de NO, tal como nitroglicerina o nitroprusiato, un análogo de un nucleótido cíclico, tal como un análogo de GMP cíclico o de AMP cíclico, o un inhibidor de la fosfodiesterasa.

La forma farmacéuticamente aceptable del antagonista de la selectina P puede incluir un antagonista de la selectina P y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo puede comprender un vehículo aerosólico, intravenoso, oral o tópico.

El glóbulo blanco puede ser un neutrófilo o un monocito. El sujeto puede ser un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, una vaca, un cerdo, una oveja, un perro, un gato, un mono, un ave de corral o cualquier modelo animal de una enfermedad o trastorno humano.

El trastorno isquémico puede incluir, pero no se limita a, un trastorno vascular periférico, una flebotrombosis, una embolia pulmonar, un infarto de miocardio, un ataque isquémico transitorio, angina inestable, un déficit neurológico isquémico reversible, anemia falciforme o un trastorno de tipo accidente cerebrovascular.

El sujeto puede ser sometido a cirugía cardiaca, cirugía pulmonar, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía abdominal o cirugía de trasplante de órganos. La cirugía de trasplante de órganos puede incluir una cirugía de trasplante de corazón, pulmón, páncreas o hígado.

En particular, la presente invención proporciona el uso de un gas que comprende monóxido de carbono en una cantidad suficiente para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de un trastorno isquémico en un sujeto durante un periodo de tiempo suficiente.

La administración de monóxido de carbono puede efectuarse mediante inhalación por el sujeto o mediante exposición extracorporal de la sangre o de líquidos corporales del sujeto.

La cantidad de monóxido de carbono que puede ser suficiente para tratar el sujeto se encuentra, pero no se limita a, entre aproximadamente 0,0001% de monóxido de carbono en un gas inerte y aproximadamente 2% de monóxido de carbono en un gas inerte. El gas inerte puede ser oxígeno, nitrógeno, argón o aire. En una realización de la presente invención, la cantidad de monóxido de carbono administrada puede ascender al 0,1% de monóxido de carbono en
aire.

El periodo de tiempo suficiente durante el cual se administra monóxido de carbono a un sujeto para tratar un trastorno isquémico se encuentra, pero no se limita a, entre aproximadamente 1 día antes de la cirugía y aproximadamente 1 día después de la cirugía. El periodo de tiempo puede encontrarse entre aproximadamente 12 horas antes de la cirugía y aproximadamente 12 horas después de la cirugía. El periodo de tiempo puede encontrarse además entre aproximadamente 12 horas antes de la cirugía y aproximadamente 1 hora después de la cirugía. El periodo de tiempo puede encontrarse además entre aproximadamente 1 hora antes de la cirugía y aproximadamente 1 hora después de la cirugía. El periodo de tiempo puede encontrarse además entre aproximadamente 20 minutos antes de la cirugía y aproximadamente 1 hora después de la cirugía. El periodo de tiempo suficiente para tratar un trastorno isquémico en un sujeto que no es sometido a ninguna cirugía puede incluir un tiempo anterior a y la duración completa de cualquier manifestación física de dicho trastorno. La administración de monóxido de carbono se realiza preferentemente antes de la manifestación con el fin de reducir dicha manifestación del trastorno isquémico. Como se describe más adelante en la presente memoria, se ha demostrado que la administración de monóxido de carbono protege a un sujeto contra la isquemia si se administra antes de la cirugía.

Como se usa en la presente memoria, el "trastorno isquémico" comprende y no se limita a un trastorno vascular periférico, una flebotrombosis, una embolia pulmonar, un infarto de miocardio, un ataque isquémico transitorio, isquemia pulmonar, angina inestable, un déficit neurológico isquémico reversible, actividad trombolítica adjunta, estados de coagulación excesiva, anemia falciforme o un trastorno de tipo accidente cerebrovascular.

El monóxido de carbono se puede administrar de manera indirecta. En lugar de que el sujeto inhale o reciba directamente gas monóxido de carbono o una mezcla de gases, se pueden administrar al sujeto compuestos para estimular la producción de monóxido de carbono in vivo. Tales compuestos pueden incluir, pero no se limitan a, hem, ferritina, hematina, precursores endógenos para la hemooxigenasa o estimuladores de la hemooxigenasa. Además, el sujeto puede ser expuesto a un ambiente que presenta un nivel de oxígeno reducido en comparación con la atmósfera normal.

La hemooxigenasa es una enzima endógena que sintetiza monóxido de carbono a partir de hem precursor (forma parte de la ruta normal por medio de la cual hem se degrada y se metaboliza en el cuerpo). Cuando los ratones se expusieron a hipoxia o isquemia tisular, aumentaron tanto los niveles del ARN mensajero que codifica la proteína hemooxigenasa como los de la proteína misma. Asimismo se incrementó la actividad de la enzima, como lo indican las mediciones de monóxido de carbono en el tejido.

En la presente memoria también se describe el uso de un método para el tratamiento de un trastorno isquémico en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto una forma farmacéuticamente aceptable del factor IX inactivado en una cantidad suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para inhibir la coagulación con el fin de tratar el trastorno isquémico en el sujeto. La cantidad suficiente puede encontrarse, pero no se limita a, entre aproximadamente 75 \mug/kg y aproximadamente 550 \mug/kg. La cantidad puede ascender a 300 \mug/kg. La forma farmacéuticamente aceptable del factor IX inactivado incluye el factor IX inactivado y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El factor IX se puede inactivar mediante los métodos convencionales conocidos para el experto en la técnica, tales como la inactivación por calor. El factor IX se puede inactivar o la actividad del factor IX se puede inhibir mediante un antagonista. Este antagonista puede ser un péptido mimético, una molécula de ácido nucleico, un ribozima, un polipéptido, una molécula pequeña, una molécula de carbohidrato, un monosacárido, un oligosacárido o un anticuerpo.

La presente solicitud describe un método para la identificación de un compuesto capaz de mejorar un trastorno isquémico en un sujeto, que incluye: a) la administración del compuesto a un animal, constituyendo el animal un modelo animal del accidente cerebrovascular; b) la medición del pronóstico del accidente cerebrovascular en el animal y c) la comparación del pronóstico del accidente cerebrovascular en la etapa (b) con el del modelo animal del accidente cerebrovascular en ausencia del compuesto, con el fin de identificar un compuesto capaz de mejorar un trastorno isquémico en un sujeto. El modelo animal del accidente cerebrovascular incluye un modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión. El pronóstico del accidente cerebrovascular se puede medir por exploración física, obtención de imágenes por resonancia magnética, flujometría de láser doppler, tinción con cloruro de trifeniltetrazolio, valoración química del déficit neurológico, tomografía computerizada o medición del flujo sanguíneo en la corteza cerebral. El pronóstico del accidente cerebrovascular en un ser humano también se puede medir realizando mediciones clínicas, puntuando la calidad de vida y mediante análisis neuropsicométricos. El compuesto puede incluir un antagonista de la selectina P, un antagonista de la selectina E o un antagonista de la selectina L.

La presente solicitud describe asimismo un método para la identificación de un compuesto capaz de prevenir la acumulación de glóbulos blancos en un sujeto, que incluye: a) la administración del compuesto a un animal, constituyendo el animal un modelo animal del accidente cerebrovascular; b) la medición del pronóstico del accidente cerebrovascular en el animal y c) la comparación del pronóstico del accidente cerebrovascular en la etapa (b) con el del modelo animal del accidente cerebrovascular en ausencia del compuesto, con el fin de identificar un compuesto capaz de prevenir la acumulación de glóbulos blancos en el sujeto.

El glóbulo blanco puede ser, pero no se limita a, un neutrófilo, una plaqueta o un monocito. El compuesto puede ser, pero no se limita a, un inhibidor de selectinas, un inhibidor de monocitos, un inhibidor de plaquetas o un inhibidor de neutrófilos. El inhibidor de selectinas puede ser, pero no se limita a, un inhibidor de la selectina P, de la selectina E o de la selectina L. Las selectinas se expresan en la superficie de las plaquetas, y estos inhibidores o antagonistas de selectinas descritos en la presente memoria pueden impedir la expresión de estas selectinas en la superficie de la célula. La prevención de la expresión puede efectuarse a nivel transcripcional, traduccional o post-traduccional, o impidiendo el movimiento de estas selectinas a través del citosol e impidiendo la liberación en la superficie celular.

La presente solicitud describe el tratamiento de trastornos isquémicos mediante la inhibición de la capacidad del neutrófilo, monocito o de otro glóbulo blanco para adherirse correctamente. Esto puede realizarse eliminando el contraligando, tal como CD18. Como se comenta más adelante en la presente memoria, se ha demostrado que los ratones "knock-out" para CD18 (ratones que no expresan el gen de CD18 normal) están protegidos frente a estados isquémicos adversos. Las células endoteliales situadas en la superficie de los vasos en un sujeto también pueden constituir una diana para el tratamiento. En un modelo murino del accidente cerebrovascular, la administración de TPA como agente trombolítico provocó una hemorragia visible junto con una mejora del trastorno de tipo accidente cerebrovascular. Sin embargo, la administración de un antagonista de la selectina P también mejoró el trastorno de tipo accidente cerebrovascular pero sin provocar una hemorragia coincidente. Lo que se describe en la presente solicitud se puede usar en combinación con un tratamiento trombolítico para aumentar la eficacia de este tratamiento o para permitir la administración de dosis más bajas de este tratamiento al sujeto con el fin de reducir los efectos secundarios del tratamiento trombolítico.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "vehículo adecuado y farmacéuticamente aceptable" engloba cualquiera de los vehículos convencionales farmacéuticamente aceptados, tales como solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua o una emulsión de triglicéridos, diversos tipos de humectantes, comprimidos, comprimidos recubiertos y cápsulas. Un ejemplo de una emulsión de triglicéridos aceptable que resulta útil para la administración intravenosa e intraperitoneal de los compuestos es la emulsión de triglicéridos conocida en el mercado como Intralipid®.

Estos vehículos contienen típicamente excipientes, tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Estos vehículos también pueden incluir aditivos saborizantes y colorantes u otros ingredientes.

La solicitud también describe composiciones farmacéuticas que incluyen cantidades terapéuticamente eficaces de composiciones y compuestos proteicos capaces de tratar el trastorno de tipo accidente cerebrovascular o de mejorar el pronóstico del accidente cerebrovascular en el sujeto de la invención, junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos adecuados, que resultan útiles en el tratamiento de una degradación neuronal debida al envejecimiento, de dificultades de aprendizaje o de un trastorno neurológico. Estas composiciones son líquidos o formulaciones liofilizadas o secadas de otro modo e incluyen diluyentes con diferentes contenidos en tampones (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para impedir la absorción a superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), agentes solubilizantes (por ejemplo, glicerol, polietilenglicerol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito sódico), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), sustancias de carga o modificantes de la tonicidad (por ejemplo, lactosa, manitol), unión covalente de polímeros tales como polietilenglicol al compuesto, complejamiento con iones metálicos o incorporación del compuesto en o sobre preparaciones particuladas de compuestos poliméricos, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o sobre liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, eritrocitos fantasma o esferoplastos. Tales composiciones influirán sobre el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de aclaramiento in vivo del compuesto o la composición. La elección de las composiciones dependerá de las propiedades físicas y químicas del compuesto capaz de mitigar los síntomas del trastorno de tipo accidente cerebrovascular o de mejorar el pronóstico del accidente cerebrovascular en el sujeto.

Las composiciones de liberación controlada o sostenida incluyen la formulación en depósitos lipófilos (por ejemplo, ácidos grasos, ceras, aceites). La presente solicitud también comprende composiciones particuladas recubiertas con polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas) y el compuesto acoplado a anticuerpos dirigidos contra receptores, ligandos o antígenos específicos de tejido o acoplado a ligandos de receptores específicos de tejido. Otros aspectos de las composiciones descritas en la presente memoria abarcan recubrimientos protectores para las formas particuladas, inhibidores de proteasas o potenciadores de la permeación para diferentes rutas de administración, incluidas la parenteral, pulmonar, nasal y oral.

Una parte del compuesto de la presente invención puede estar "marcada" por asociación con una sustancia marcadora detectable (por ejemplo, radiomarcado con ^{125}I o biotinilado) para proporcionar reactivos útiles para la detección y cuantificación del compuesto o de las células que llevan su receptor o de sus derivados en tejido sólido y muestras líquidas, tales como sangre, líquido cerebroespinal u orina.

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Una vez administrados, los compuestos con frecuencia se eliminan rápidamente de la circulación y, por lo tanto, pueden mostrar su actividad farmacológica durante relativamente poco tiempo. En consecuencia, pueden requerirse inyecciones frecuentes de dosis relativamente altas de los compuestos bioactivos para mantener la eficacia terapéutica. Se sabe que los compuestos modificados mediante la unión covalente de polímeros hidrosolubles, tales como polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona o poliprolina, muestran, después de la inyección intravenosa, unas semividas sustancialmente más largas en sangre que los compuestos correspondientes no modificados (Abuchowski et al., 1981; Newmark et al., 1982; y Katre et al., 1987). Estas modificaciones también pueden aumentar la solubilidad del compuesto en soluciones acuosas, eliminar la agregación, incrementar la estabilidad física y química del compuesto y reducir en gran medida la inmunogenicidad y reactividad del compuesto. Como resultado, se puede alcanzar la actividad biológica in vivo deseada administrando tales aductos de polímero/compuesto con menor frecuencia o a dosis más bajas que el compuesto no modificado.

Resulta especialmente útil la unión de polietilenglicol (PEG) a los compuestos, puesto que el PEG presenta una toxicidad muy baja en mamíferos (Carpenter et al., 1971). Por ejemplo, en Estados Unidos se aprobó un aducto de PEG y adenosina-desaminasa para el uso en seres humanos para el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia combinada grave. Una segunda ventaja que ofrece la conjugación de PEG reside en que reduce eficazmente la inmunogenicidad y antigenicidad de compuestos heterólogos. Por ejemplo, un aducto de PEG y una proteína humana puede resultar útil para el tratamiento de enfermedades en otras especies de mamíferos sin que exista el riesgo de provocar una respuesta inmune grave. El compuesto de la presente invención capaz de mitigar los síntomas de un trastorno cognitivo de memoria o aprendizaje puede administrarse en un dispositivo de microencapsulamiento con el fin de reducir o prevenir una respuesta inmune del huésped frente al compuesto o frente a las células que puedan producir el compuesto. El compuesto de la presente invención también se puede administrar de forma microencapsulada en una membrana, tal como un liposoma.

Los polímeros tales como PEG pueden estar unidos convenientemente a uno o más restos de aminoácidos reactivos de una proteína, tal como al grupo alfa-amino del aminoácido aminoterminal, los grupos epsilon-amino de las cadenas laterales de lisina, los grupos sulfhidrilo de las cadenas laterales de cisteína, los grupos carboxilo de las cadenas laterales aspartilo y glutamilo, el grupo alfa-carboxilo del aminoácido carboxiterminal, las cadenas laterales de tirosina, o a derivados activados de cadenas glucosílicas unidas a ciertos restos de asparagina, serina o treonina.

Se han descrito numerosas formas activadas de PEG adecuadas para la reacción directa con proteínas. Los reactivos de PEG útiles para la reacción con los grupos amino de las proteínas incluyen ésteres activos de ácidos carboxílicos o derivados de carbonato, en particular aquellos en los que los grupos salientes son N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenol, imidazol o 1-hidroxi-2-nitrobenceno-4-sulfonato. Los derivados de PEG que contienen grupos maleimido o haloacetilo son reactivos útiles para la modificación de grupos sulfhidrilo libres en las proteínas. Igualmente, los reactivos de PEG que contienen grupos aminohidracina o hidracida son útiles para la reacción con aldehídos generados por oxidación de grupos carbohidrato con peryodato en proteínas.

Mediante técnicas conocidas, tales como la titulación, y teniendo en cuenta las características farmacocinéticas del agente observadas en el sujeto individual, el experto en la técnica podrá determinar un régimen de dosificación apropiado. Véase, por ejemplo, Benet et al., "Clinical Pharmacokinetics", en el capítulo 1 (págs. 20-32) de "The Pharmacological Basis of Therapeutics", de Goodman y Gilman, 8ª edición, A.G. Gilman y col. eds. (Pergamon, Nueva York, 1990).

La presente solicitud describe una composición farmacéutica que comprende un agente capaz de tratar un trastorno de tipo accidente cerebrovascular o de mejorar el pronóstico del accidente cerebrovascular y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo puede incluir, pero no se limita a, un diluyente, un aerosol, un vehículo tópico, una solución acuosa, una solución no acuosa o un vehículo sólido.

Esta invención se ilustra en la siguiente sección "Detalles experimentales". Estas secciones se exponen para ayudar a comprender la invención, pero no pretenden limitar de modo alguno la invención como se expone en las reivindicaciones que siguen a continuación, ni deben interpretarse como tales. Por lo tanto, los siguientes ejemplos no son necesariamente ejemplos de la invención.

Detalles experimentales

Abreviaturas: CE, célula endotelial; PMN, leucocito polimorfonuclear; WP, cuerpo de Weibel-Palade; vWF, factor von Willebrand; EGTA, ácido etilenglicol-bis-(aminoetiléter) tetraacético; HBSS, solución salina equilibrada de Hank; SC, seno coronario; IL, interleucina; PAF, factor de activación de plaquetas; ICAM-1, molécula de adhesión intercelular 1; HUVEC, CE de la vena umbilical humana; LR, solución de Ringer-lactato; OACM, oclusión de la arteria cerebral media; rt-PA, activador tisular de plasminógeno recombinante; HO-I o HOI o HO I, hemooxigenasa I; HIC, hemorragia intracerebral; DO, densidad óptica; ACM, arteria cerebral media; rt-PA, activador tisular de plasminógeno recombinante; AIT, ataque isquémico transitorio; TTC, cloruro de trifeniltetrazolio.

Ejemplo 1 Protección cerebral en ratones homocigotos carentes de ICAM-1 tras la oclusión de la arteria cerebral media: Papel de la adhesión de neutrófilos en la patogénesis del accidente cerebrovascular

Para investigar si los leucocitos polimorfonucleares (PMNs) contribuyen a las secuelas neurológicas adversas y a la mortalidad tras un accidente cerebrovascular y para estudiar el posible papel de la molécula de adhesión de leucocitos, la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), en la patogénesis del accidente cerebrovascular, se usó un modelo murino de la isquemia cerebral focal transitoria que consistía en una oclusión intraluminal de la arteria cerebral media (ACM) de 45 minutos de duración seguida de 22 horas de reperfusión. La acumulación de PMN, detectada mediante la deposición de PMNs marcados con ^{111}indio en el tejido cerebral postisquémico, era 2,5 veces mayor en el hemisferio ipsilateral (infarto) que en el hemisferio contralateral (sin infarto) (p < 0,01). Los ratones sometidos antes de la cirugía a una inmunodepleción de neutrófilos mostraron unos volúmenes de infarto 3 veces menores (p < 0,001) según la tinción de secciones cerebrales seriadas con cloruro de trifeniltetrazolio, un mayor flujo sanguíneo cerebral cortical ipsilateral (medido por láser doppler) y un déficit neurológico reducido en comparación con los controles. En los ratones de tipo silvestre sometidos a una isquemia de 45 minutos de duración y seguidamente a 22 horas de reperfusión estaba aumentado el ARNm de ICAM-1 en el hemisferio ipsilateral, localizándose inmunohistoquímicamente una mayor expresión de ICAM-1 en el endotelio microvascular del cerebro. El papel de la expresión de ICAM-1 en el accidente cerebrovascular se investigó en ratones homocigotos carentes de ICAM-1 (ICAM-1 -/-) en comparación con controles de tipo silvestre (ICAM-1 +/+). Los ratones ICAM-1 -/- mostraron un volumen de infarto 3,7 veces menor (p < 0,005), un aumento del 35% en la supervivencia (p < 0,05) y un déficit neurológico reducido en comparación con los controles ICAM-1 +/+. El flujo sanguíneo cerebral hacia el hemisferio que sufrió el infarto era 3,1 veces mayor en los ratones ICAM-1 -/- que en los controles ICAM-1 +/+ (p < 0,01), lo que sugiere un papel importante para ICAM-1 en la génesis del no-reflujo cerebral postisquémico. Puesto que los ratones sometidos a una depleción de PMN y carentes de ICAM-1 eran relativamente resistentes a los daños por isquemia cerebral/reperfusión, estos estudios sugieren un papel importante de la adhesión de PMN mediada por ICAM-I en la fisiopatología del accidente cerebrovascular en evolución.

Introducción

Los neutrófilos (PMNs) desempeñan un papel crítico en las etapas más tempranas de la inflamación que se produce tras una isquemia tisular, iniciando las funciones depuradoras que posteriormente son asumidas por los macrófagos. Sin embargo, la entrada de neutrófilos presenta un aspecto negativo, especialmente en tejidos postisquémicos^{1-7}, en los que los PMNs activados pueden aumentar el daño producido en los elementos celulares vasculares y parenquimatosos. Las evidencias experimentales apuntan a que las células endoteliales poseen un papel central en establecer el reclutamiento postisquémico de PMNs, ya que las células endoteliales hipóxicas/isquémicas sintetizan la citocina proinflamatoria IL-1^{8}, así como el potente activador y factor quimiotáctico de neutrófilos IL-8^{9}. La adhesión firme de los PMNs al endotelio activado en un ambiente vascular postisquémico es fomentada por el desplazamiento de la selectina P a la superficie celular^{10}, así como por la mayor producción del factor de activación de plaquetas y de ICAM-1^{11}.

Mientras que las estrategias para bloquear cualquiera de estos mecanismos de reclutamiento de neutrófilos resultan protectoras en diversos modelos de lesiones por isquemia y reperfusión, sigue debatiéndose su eficacia en el caso de lesiones cerebrales por isquemia/reperfusión. Existen numerosas evidencias de que en el cerebro, al igual que en otros tejidos, la entrada temprana de PMNs viene precedida de un episodio isquémico^{12-17}. Estudios inmunohistoquímicos han descrito una mayor expresión de las moléculas de adhesión de PMNs, la selectina P y la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), en la vasculatura cerebral postisquémica^{12,18-20}. No obstante, sigue debatiéndose la importancia patogénica de la expresión de las moléculas de adhesión en el cerebro; aún no se dispone de datos de ensayos con un anticuerpo monoclonal anti-ICAM-1 en el accidente cerebrovascular en seres humanos. En modelos animales existen evidencias experimentales contradictorias en relación con la eficacia que poseen las estrategias anti-molécula de adhesión en el tratamiento del accidente cerebrovascular experimental^{21-23}. Para determinar si ICAM-1 participa en la patogénesis del daño cerebral postisquémico, los experimentos descritos en la presente memoria se realizaron en un modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión, de manera que se pudiera determinar el papel que desempeña un solo mediador crítico de la adhesión de PMN (ICAM-1). Estos estudios demuestran que a un episodio de isquemia cerebral focal le sigue una mayor expresión de ICAM-1 y la entrada de neutrófilos. Además, estos estudios muestran que tanto los ratones deficientes en neutrófilos como los transgénicos carentes de ICAM-1 son relativamente resistentes al infarto cerebral tras una isquemia y reperfusión, lo que proporciona claras evidencias de que ICAM-1 desempeña un papel exacerbante en la fisiopatología del accidente cerebrovascular.

Materiales y métodos

Ratones: Los experimentos se llevaron a cabo con ratones transgénicos carentes de ICAM-1, creados como se ha descrito anteriormente^{24} por recombinación homóloga en células troncales embrionarias J1 inyectadas en blastocitos C57BL/6 para obtener una transmisión en la línea germinal y retrocruzados para obtener ratones homocigotos carentes de ICAM-1. Todos los experimentos se realizaron con ratones primos ICAM-1 -/- o de tipo silvestre (ICAM-1 +/+) de la quinta generación de retrocruzamientos con ratones C57BL/6. Los animales tenían edades comprendidas entre siete y nueve semanas y pesaban entre 25 y 36 gramos en el momento en que se realizaron los experimentos. Para determinados experimentos se obtuvo una depleción de neutrófilos en ratones C57BL/6 administrando un anticuerpo policlonal de conejo anti-neutrófilos de ratón^{25} (Accurate Scientific, Westbury NY) adsorbido previamente a glóbulos rojos en forma de una inyección intraperitoneal diaria (0,3 ml de una solución 1:12) durante 3 días. Los experimentos con estos ratones se llevaron a cabo el cuarto día después de confirmar la agranulocitosis en frotis de sangre periférica teñidos con Wright-Giemsa.

Oclusión transitoria de la arteria cerebral media^{26}: Los ratones se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de 0,3 ml de quetamina (10 mg/ml) y xilazina (0,5 mg/ml). Los animales se colocaron en posición supina sobre una superficie de operaciones con control de la temperatura rectal (Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH). La temperatura interna de los animales se mantuvo entre 36 y 38ºC durante la operación y durante 90 minutos después de la operación. La oclusión de la arteria cerebral media se efectuó de la siguiente manera: Se realizó una incisión en la línea media del cuello para colocar la vaina de la carótida derecha bajo el microscopio de operaciones (aumento 16-25x, Zeiss, Thornwood, NY). Se separó la vaina de la arteria carótida común y se aisló con seda 4-0, y se aislaron y dividieron las arterias occipital y pterigopalatina. Se obtuvo el control distal de la arteria carótida interna, y la carótida externa se cauterizó y dividió, exactamente en sentido proximal respecto a su bifurcación, en las divisiones lingual y maxilar. La oclusión transitoria de la carótida se efectuó introduciendo una sutura de nilón 5-0 de 13 mm redondeada por calor a través del muñón de la carótida externa hacia el origen de la arteria cerebral media. Una vez colocada la sutura oclusiva, el muñón de la arteria carótida externa se cauterizó para prevenir una hemorragia en la arteriotomía y se restableció el flujo arterial. En todos los casos, la oclusión de la carótida duró menos de dos minutos. Al cabo de 45 minutos se retiró la sutura oclusiva para establecer la reperfusión. Estos procedimientos han sido descritos previamente en detalle^{26}.

Medición del flujo sanguíneo en la corteza cerebral: Las mediciones transcraneales del flujo sanguíneo cerebral se realizaron usando flujometría de láser doppler (Perimed, Inc., Piscataway, NJ) después de retirar la piel que cubre la bóveda craneal, como se ha descrito previamente^{27} (las lecturas transcraneales coincidieron sistemáticamente con las obtenidas después de la craniectomía en estudios piloto). Las mediciones del flujo sanguíneo cerebral relativo se llevaron a cabo como se indica, inmediatamente después de la anestesia, después de la oclusión de la arteria cerebral media, inmediatamente después de la reperfusión y a las 24 horas, justo antes de la eutanasia, usando una sonda de láser doppler recta (modelo #PF303, Perimed, Piscataway, NJ) y puntos anatómicos previamente publicados (2 mm posterior al bregma, a 6 mm de cada lado de la línea media). Los datos se expresan como relación entre las intensidades de la señal doppler en el hemisferio isquémico y en el no isquémico. Aunque este método no cuantifica el flujo sanguíneo cerebral por gramo de tejido, el uso de la flujometría de láser doppler realizada en puntos anatómicos exactamente definidos sirve para comparar en serie los flujos sanguíneos cerebrales en el mismo animal a lo largo del tiempo. El procedimiento quirúrgico/la colusión intraluminal de la arteria cerebral media y reperfusión se consideraron técnicamente adecuados cuando se observaba una reducción \geq 50% en el flujo sanguíneo cerebral relativo inmediatamente después de colocar la sutura intraluminal oclusiva y cuando se observaba un aumento en el flujo \geq 30% respecto a la oclusión inicial inmediatamente después de retirar la sutura oclusiva. Estos métodos se han usado en estudios anteriores^{26}.

Preparación y administración de neutrófilos murinos marcados con ^{111}In: Se diluyó sangre citrada de ratones de tipo silvestre con NaCl (0,9%) en una relación 1:1 y seguidamente se sometió a una ultracentrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Después de la lisis hipotónica de los eritrocitos residuales (exposición de 20 s a H_{2}O destilada seguida de una reconstitución con NaCl al 1,8%) los neutrófilos se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se suspendieron durante 15 minutos a 37ºC 5-7,5 x 10^{6} neutrófilos en PBS con 100 \muCi de ^{111}indio-oxina (Amersham Mediphysics, Port Washington, NY). Tras lavarlos con PBS, los neutrófilos se sedimentaron con cuidado (450 g) y se resuspendieron en PBS a una concentración final de 1,0 x 10^{6} células/ml. Justo antes de la cirugía se administraron por inyección en la vena del pene 100 \mul de PMNs radiomarcados mezclados con solución salina fisiológica en un volumen total de 0,3 ml (\approx3 x 10^{6} cpm). Después de la eutanasia humanitaria se obtuvieron los cerebros como se ha descrito y se cuantificó la deposición de neutrófilos en cpm/g de cada hemisferio.

Examen neurológico: Veinticuatro horas después de la oclusión de la arteria cerebral media y la reperfusión y antes de anestesiarlos, los ratones se examinaron en cuanto a la existencia de un déficit neurológico usando un sistema de cuatro grados^{26}: Se dio una puntuación de (1) cuando el animal mostraba movimientos espontáneos normales; se dio una puntuación de (2) cuando, visto desde arriba (es decir, hacia el lado contralateral), se observaba que el animal giraba hacia la derecha (círculos en el sentido de las agujas del reloj); se dio una puntuación de (3) cuando se observaba que el animal giraba en sentido longitudinal (en el sentido de las agujas del reloj visto desde la cola); se dio una puntuación de (4) cuando el animal se acuclillaba sobre las cuatro patas sin responder a estímulos nocivos. Este sistema de puntuación se ha descrito previamente en ratones^{26} y se basa en sistemas de puntuación similares a los usados en ratas^{28,29}, que se basan en el movimiento contralateral de los animales con accidente cerebrovascular; después del infarto cerebral, el lado contralateral es "débil", y así el animal tiende a girar hacia el lado debilitado. Trabajos anteriores en ratas^{28} y ratones^{26} demuestran que los infartos cerebrales más extensos están asociados con un mayor grado de movimiento contralateral, hasta el punto en que los infartos son tan extensos que el animal no responde.

Cálculo del volumen de infarto: Después del examen neurológico se administraron a los ratones 0,3 ml de quetamina (10 mg/ml) y xilazina (0,5 mg/ml) y se obtuvieron las últimas mediciones del flujo sanguíneo cerebral. La eutanasia humanitaria se realizó por decapitación bajo anestesia, y se extrajeron los cerebros y se colocaron en una matriz para cerebros de ratón (Activational Systems Inc., Warren, MI) para cortarlos en secciones de 1 mm. Las secciones se sumergieron en cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio al 2% (TTC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en solución salina tamponada con fosfato al 0,9%, se incubaron durante 30 minutos a 37ºC y se colocaron en formalina al 10%^{26,30-32}. Al contrario que el tejido viable, que se tiñe de color rojo ladrillo, el cerebro que ha sufrido un infarto se visualiza en forma de un área de tejido no teñido. Los volúmenes de infarto se calcularon a partir de secciones planimétricas seriadas y se expresan en porcentaje de infarto en el hemisferio ipsilateral.

Extracción de ARN y análisis de transferencia Northern: Los cerebros se obtuvieron 24 horas después de la isquemia focal y la reperfusión y se dividieron en los hemisferios ipsilateral (infarto) y contralateral (sin infarto). Para detectar los transcritos de ICAM-1 se extrajo el ARN total de cada hemisferio usando un kit de aislamiento de ARN (Stratagene, La Jolla, CA). Para el fraccionamiento por tamaño se cargaron cantidades iguales de ARN (20 \mug/carril) en un gel de agarosa al 1,4% que contenía formaldehído 2,2 M, y después se transfirieron durante la noche a membranas de nilón (Nytran) con tampón SSC 10x mediante presión capilar. Se marcó una sonda de ADNc de ICAM-1 murino (1,90 kb, ATCC, Rockville, MD) con ^{32}P-\alpha-dCTP por marcado con cebador aleatorio (Prime-A-Gene kit, Promega), se hibridó a 42ºC con las transferencias y seguidamente éstas se lavaron 3 veces con SSC 1x/SDS 0,05%. Las transferencias se revelaron con una película X-Omat AR expuesta a filtros de luz a -70ºC durante 7 días. Se usó una sonda de \beta-actina (ATCC) para confirmar la igualdad de las cargas de ARN.

Inmunohistoquímica: Los cerebros se extrajeron en los tiempos indicados después de la oclusión de la arteria cerebral media, se fijaron en formalina al 10%, se incorporaron en parafina y se seccionaron para la inmunohistoquímica. Las secciones se tiñeron con un anticuerpo de rata anti-ICAM-1 murino (dilución 1:50, Genzyme, Cambridge MA) y los sitios de unión del anticuerpo primario se visualizaron mediante un anticuerpo secundario conjugado con la fosfatasa alcalina, que se detectó con FastRed (TR/naphthol AS-MX, Sigma Chemical Co., St. Louis MO).

Análisis de los datos: Se compararon el flujo sanguíneo cerebral, los volúmenes de infarto y las puntuaciones del pronóstico neurológico usando el test t de Student para variables desapareadas. La deposición de ^{111}indio-neutrófilos se evaluó en forma de datos apareados [por comparación del hemisferio contralateral (sin infarto) con el ipsilateral (infarto)] para controlar las variaciones en las cuentas inyectadas o el volumen de distribución. Las diferencias en la supervivencia entre los grupos se analizó usando el análisis de contingencia con la estadística de chi-cuadrado. Los valores se expresan en medias \pm error típico, considerándose una p < 0,05 estadísticamente significativa.

Resultados

Acumulación de neutrófilos en el accidente cerebrovascular: Estudios patológicos anteriores han mostrado una acumulación de neutrófilos tras un infarto cerebral^{15-17,34-36}. Para determinar si los neutrófilos se acumulan en el modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión, se cuantificó la acumulación de neutrófilos tras una isquemia transitoria (45 min) y una reperfusión (22 h) midiendo la deposición de neutrófilos marcados con ^{111}In administrados a ratones de tipo silvestre antes del episodio isquémico. Estos experimentos mostraron una acumulación de neutrófilos significativamente mayor (aumento de 2,5 veces) en el hemisferio ipsilateral (infarto) que en el contralateral (sin infarto) (n = 7, p < 0,01; Figura 1). Se obtuvieron resultados similares cuando se siguió la entrada de neutrófilos mediante ensayos de mieloperoxidasa, si bien se registraron niveles bajos de actividad en este último ensayo (datos no mostrados).

Efecto de la depleción de neutrófilos en el pronóstico del accidente cerebrovascular: Para determinar el efecto de la entrada de neutrófilos sobre los índices pronósticos del accidente cerebrovascular, los ratones se sometieron a una inmunodepleción de neutrófilos, comenzando tres días antes de la cirugía. Cuando, al cuarto día, se realizó la cirugía, se evidenció una agranulocitosis casi completa en frotis de sangre periférica. Los ratones neutropénicos (n = 18) se sometieron a una isquemia cerebral de 45 min de duración y a 22 horas de reperfusión, y se determinaron los índices pronósticos del accidente cerebrovascular. Los volúmenes de infarto eran 3 veces menores en los animales neutropénicos que en los controles de tipo silvestre (11,1 \pm 1,6% frente a 33,1 \pm 6,4%, p < 0,001; Figura 2A). La disminución de los volúmenes de infarto en los ratones neutropénicos coincidía con una reducción en las puntuaciones del déficit neurológico (Figura 2B), un aumento de los flujos sanguíneos en la corteza cerebral después de la reperfusión (Figura 2C) y una tendencia hacia una mortalidad reducida durante la noche (mortalidad del 22% en ratones neutropénicos frente a una mortalidad del 50% en los controles, Figura 2D).

Expresión de ICAM-1 en el accidente cerebrovascular en ratones: Para establecer el efecto de la isquemia cerebral/reperfusión en el modelo murino se evaluaron los niveles de ARNm de ICAM-1 en ratones de tipo silvestre después de una isquemia cerebral y reperfusión. En el análisis de transferencia Northern, el hemisferio cerebral ipsilateral (infarto) mostró un aumento del ARNm de ICAM-1 en comparación con el ARN obtenido del hemisferio contralateral (sin infarto) del mismo animal (Figura 3). Para evaluar la expresión del antígeno de ICAM-1 en este modelo de ratón se sometieron ratones de tipo silvestre a 45 minutos de isquemia y seguidamente a 23 horas de reperfusión, y a continuación se examinó la microvasculatura cerebral mediante análisis inmunohistoquímicos. La expresión del antígeno de ICAM-1 no era detectable en la microvasculatura cerebral contralateral respecto a la del infarto (Figura 4A), pero estaba marcadamente aumentada en el lado ipsilateral, observándose una prominente tinción de ICAM-1 de las células endoteliales del cerebro (Figura 4B).

Papel de ICAM-1 en el accidente cerebrovascular: Para examinar el papel de ICAM-1 en el accidente cerebrovascular se estudiaron ratones transgénicos homocigotos carentes de ICAM-1^{24} en el modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión. Puesto que se ha informado que las variaciones anatómicas cerebrovasculares son responsables de las diferencias en la susceptibilidad al accidente cerebrovascular experimental en ratones^{37}, se realizó una tinción con tinta china en el círculo de Willis de ratones homocigotos sin ICAM-1 (ICAM-1 -/-) e ICAM-1 +/+. Estos experimentos (Figura 5) demostraron que no existían grandes diferencias anatómicas en el patrón vascular de la circulación cerebral. Para determinar el papel de la molécula de adhesión intercelular 1 en la entrada de neutrófilos tras una isquemia cerebral focal y una reperfusión, se midió la acumulación de neutrófilos en ratones homocigotos carentes de ICAM-1 (ICAM-1 -/-) (n = 14) y en controles de tipo silvestre (n = 7) a los que se infundieron neutrófilos marcados con ^{111}In. La acumulación relativa de neutrófilos (cpm ipsilaterales/cpm contralaterales) estaba reducida (reducción del 39%) en los ratones ICAM-1 -/- en comparación con los controles ICAM-1 +/+ (1,70 \pm 0,26 frente a 2,9 \pm 0,52, p < 0,05).

A continuación se realizaron experimentos para investigar si la expresión de ICAM-1 desempeña un papel fisiopatológico en el pronóstico tras un accidente cerebrovascular. Los ratones ICAM-1 -/- (n = 13) estaban significativamente protegidos contra los efectos de la isquemia cerebral focal y la reperfusión, con una reducción de 3,7 veces en el volumen de infarto (p < 0,01) respecto a los controles ICAM-1 +/+ (Figuras 6 y 7A). Esta reducción en el volumen de infarto venía acompañada de una disminución en el déficit neurológico (Figura 7B) y de un aumento del flujo sanguíneo en la corteza cerebral después de la reperfusión (Figura 7C). Con estos resultados no fue sorprendente que la mortalidad también disminuyera significativamente en los ratones ICAM-1 -/- en comparación con los controles ICAM-1 +/+ (15% frente a 50%, p < 0,05; Figura 7D).

Discusión

Las evidencias epidemiológicas en seres humanos sugieren que los neutrófilos contribuyen tanto a la iniciación del accidente cerebrovascular^{38} como al daño del tejido cerebral y al pronóstico clínico desfavorable^{39}, presentando los neutrófilos un posible papel en la hipoperfusión postisquémica, la disfunción neuronal y la formación de cicatrices^{40-44}. Aunque existen numerosas evidencias experimentales que sugieren que los neutrófilos pueden exacerbar el daño tisular después del accidente cerebrovascular^{13,45-48}, hay cierta cantidad de datos experimentales que han avivado la polémica al no encontrar ninguna asociación entre los agentes que bloquean la acumulación de neutrófilos y los índices pronósticos del accidente cerebrovascular. En un modelo de accidente cerebrovascular en ratas, la depleción de neutrófilos mediada por anticuerpos antes del accidente cerebrovascular disminuyó el contenido de agua en el cerebro y el tamaño del infarto^{13}. Sin embargo, la leucocitopenia inducida por ciclofosfamida en un modelo de gerbo^{49} o la administración de anticuerpos anti-neutrófilos a perros^{50} no mostró efectos beneficiosos en los modelos globales de isquemia cerebral. El tratamiento experimental dirigido a interferir en las interacciones neutrófilo/endotelio también dio resultados variados. En un modelo felino de isquemia cerebral focal transitoria, el tratamiento con un anticuerpo contra CD18 (la subunidad común de las integrinas \beta_{2}, que se une a la molécula de adhesión intercelular 1^{51}) no alteró la recuperación del flujo sanguíneo cerebral, el retorno de los potenciales evocados o el volumen de infarto^{23}. En otros experimentos, sin embargo, se ha descubierto que la permeabilidad microvascular tras una isquemia focal transitoria en primates mejora con anticuerpos contra CD18^{14}. En un modelo de rata similar también se ha demostrado que un anticuerpo anti-CD11b/CD18 reduce tanto la acumulación de neutrófilos como el daño neuronal relacionado con isquemia^{52}.

Los experimentos descritos en la presente memoria muestran que en un modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión los neutrófilos se acumulan en el tejido cerebral postisquémico, un hallazgo corroborado en otros modelos que demuestran de forma similar una mayor acumulación de granulocitos en las áreas de bajo flujo sanguíneo cerebral durante el periodo postisquémico temprano^{15,16,36,45}. Los neutrófilos no sólo se acumulan durante el periodo postisquémico en ratones, sino que su presencia exacerba los índices pronósticos del accidente cerebrovascular. Cuando los animales se hicieron neutropénicos antes del episodio isquémico, los infartos cerebrales eran más pequeños, con una mejor perfusión cerebral después del episodio isquémico. Estos datos son muy similares a los descritos en un modelo de conejo del accidente cerebrovascular tromboembólico, en el que la inmunodepleción de neutrófilos produjo tanto una reducción en el volumen de infarto como una mejora en el flujo sanguíneo^{35}. Puesto que los neutrófilos contribuyen al daño cerebral postisquémico en ratones, se siguió una estrategia para esclarecer el papel de ICAM-1 en la fisiopatología del accidente cerebrovascular usando ratones mutantes de deleción de ICAM-1^{24}. Los experimentos indican que los ratones homocigotos carentes de ICAM-1 son relativamente resistentes a los efectos deletéreos de la isquemia cerebral y la reperfusión.

Para demostrar el papel de los neutrófilos y de ICAM-1 en la patogénesis del daño tisular en el accidente cerebrovascular, se usaron en los estudios descritos en la presente memoria varios métodos para valorar el pronóstico del accidente cerebrovascular. Aunque numerosos investigadores han usado la tinción con TTC para cuantificar los volúmenes de infarto cerebral^{26,30-32,37,53}, ha habido cierto debate acerca de la precisión de este método, especialmente cuando éstos se evalúan poco después del episodio isquémico. En el método de TTC, el cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio (TTC) reacciona con enzimas oxidantes intactas en la cresta mitocondrial y se reduce a un formazano de color^{54}. La tinción con TTC no se puede realizar hasta que no hayan transcurrido 2 horas de isquemia; al cabo de 36 horas, las células infiltradas en el tejido que ha sufrido el infarto se pueden teñir positivamente con TTC, difuminando de este modo la clara demarcación que se veía con la tinción más temprana entre los tejidos con y sin infarto^{31}. Aunque el tamaño del infarto delineado por la tinción con TTC se correlaciona con el tamaño del infarto delineado por la tinción con hematoxilina y eosina^{30,32}, las mediciones morfométricas directas tienden a sobrestimar los volúmenes de infarto debido a edemas cerebrales, especialmente durante los 3 primeros días después del episodio isquémico^{32}. No obstante, aún dadas estas limitaciones, los estudios descritos en la presente memoria incorporan tres métodos adicionales para definir el papel de los neutrófilos y de ICAM-1 en el pronóstico del accidente cerebrovascular, que incluyen la puntuación del déficit neurológico, el flujo sanguíneo cerebral relativo hacia el área afectada y la mortalidad. Estas medidas adicionales, que no dependen de la precisión de la tinción con TTC, contribuyen enormemente a la identificación de un papel patogénico tanto para los neutrófilos como para ICAM-1 en el accidente cerebrovascular.

Últimamente abundan los estudios científicos que examinan la base mecanística del reclutamiento de neutrófilos hacia los tejidos postisquémicos. Las células endoteliales parecen ser los reguladores principales del tráfico de neutrófilos, regulando los procesos de quimioatracción, adhesión y emigración de neutrófilos de la vasculatura^{55}. Cuando se exponen a un ambiente hipóxico como paradigma de una isquemia tisular, las células endoteliales sintetizan interleucina 8 (IL-8), potente activador y factor quimiotáctico de neutrófilos^{9}, cuyo bloqueo parece beneficioso en un modelo pulmonar de isquemia y reperfusión^{6}. Además, las células endoteliales hipóxicas sintetizan la citocina proinflamatoria interleucina-1^{8}, que puede regular al alza la expresión endotelial de las moléculas de adhesión de neutrófilos selectina E e ICAM-1 de un modo autocrino^{8,9,56}. También pueden activarse en el cerebro otros mecanismos de adhesión de neutrófilos tras una isquemia, tales como la liberación de selectina P desde reservorios previamente formados dentro de las membranas de los cuerpos de Weibel-Palade^{10}. En un modelo de primate, la expresión de selectina P aumentó rápida y persistentemente después de una isquemia focal de la arteria cerebral media y reperfusión^{18}. Aunque el reclutamiento de neutrófilos dependiente de selectina P parece ser deletéreo después de una isquemia cardiaca y una reperfusión^{57}, todavía no se ha determinado su relevancia fisiopatológica en el accidente cerebrovascular establecido. Aunque la hipoxia induce la síntesis de novo del factor lipídico de activación de plaquetas bioactivo (PAF)^{11} en un modelo de isquemia y reperfusión de la médula espinal, el antagonismo de PAF no aporta ningún beneficio adicional cuando se administra simultáneamente con el anticuerpo contra CD11/CD18^{48}.

La comprensión del papel de ICAM-1 en la fisiopatología del accidente cerebrovascular parece tener una relevancia especial en los seres humanos por varios motivos. En primates se ha demostrado una mayor expresión de ICAM-1 cerebrovascular después de 4 horas de isquemia y reperfusión, en particular en la microvasculatura lenticuloestriada^{18}. Un estudio de autopsias de infartos cerebrales recientes en seres humanos también ha demostrado una mayor expresión de ICAM-1^{20}. Puesto que las ratas también expresan ICAM-1 cerebrovascular en el plazo de 24 horas tanto en un modelo de isquemia cerebral de rata inducido fotoquímicamente^{19} como en un modelo de oclusión de la arteria cerebral media^{12}, estos datos sugieren una posible utilidad de los ratones transgénicos carentes de ICAM-1 en el esclarecimiento del significado fisiopatológico que tiene la mayor expresión de ICAM-1 después de una isquemia cerebral. En particular, el marco temporal de la expresión de ICAM-1 (aumentada después de 4 a 24 horas) en estos modelos sugiere que las futuras estrategias farmacológicas para mejorar el pronóstico del accidente cerebrovascular en seres humanos se dirijan a las interacciones neutrófilo/endotelio mediadas por ICAM-1, puesto que este marco temporal representa una ventana clínica realista para una intervención terapéutica.

Aunque los animales neutropénicos mostraron un mayor flujo sanguíneo cerebral regional en comparación con los controles, los ratones carentes de ICAM-1 tendían a presentar a las 24 horas unos flujos sanguíneos cerebrales ipsilaterales incluso mayores que los de los animales neutropénicos. Esta observación puede estar relacionada con el fenómeno de falta de reflujo, en el que el flujo sanguíneo no vuelve a los niveles anteriores a la obstrucción ni siquiera después de eliminar la oclusión vascular temporal. Un conjunto significativo de trabajos anteriores ha implicado en este proceso la entrada de neutrófilos en los lechos microvasculares capilares^{58}, aunque en un modelo de isquemia cerebral global una reducción del 85% en el recuento de leucocitos circulantes no disminuyó la incidencia o gravedad de la falta de reflujo^{49}. Los datos sugieren que otros mecanismos independientes de neutrófilos, que, sin embargo, implican ICAM-1, pueden contribuir a la falta de reflujo cerebrovascular postisquémico. Puesto que tanto los macrófagos como los linfocitos expresan LFA-1, que media una interacción adhesiva con ICAM-1 de células endoteliales^{51}, es posible que los ratones carentes de ICAM-1 muestren un reclutamiento reducido de estas células mononucleares, una posibilidad que actualmente es el tema de nuevas investigaciones. Esta hipótesis la apoyan múltiples observaciones patológicas que muestran una acumulación de macrófagos y linfocitos entre 1 y 3 días después de un infarto cerebral^{12,17,19,34,59}.

En resumen, los estudios indican que en un modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión los neutrófilos se acumulan en el hemisferio que ha sufrido un infarto y que los animales neutropénicos muestran una protección cerebral. La mayor expresión de ICAM-1 en células endoteliales del cerebro parece constituir un importante mecanismo que impulsa este reclutamiento de neutrófilos, y los ratones que no son capaces de expresar ICAM-1 muestran unos flujos sanguíneos postisquémicos mejorados, unos volúmenes de infarto reducidos y una mortalidad reducida. Estos datos sugieren que las estrategias farmacológicas dirigidas a interferir en las interacciones neutrófilo/endotelio pueden mejorar el pronóstico tras un accidente cerebrovascular en los seres humanos.

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Ejemplo 2 Exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade de células endoteliales inducida por hipoxia: Un mecanismo para el reclutamiento rápido de neutrófilos tras conservación del corazón

El periodo de hipoxia (H) es un importante episodio de preparación para la disfunción vascular que acompaña a la reperfusión, en el que las células endoteliales (CEs) y los neutrófilos (PMNs) desempeñan un papel central. Se ha planteado la hipótesis de que la exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade (WP) de las CEs durante el periodo de hipoxia/isquemia en la conservación de órganos permite el reclutamiento activo de PMN hacia el tejido postisquémico, un proceso que se amplifica adicionalmente en un ambiente rico en oxidantes. La exposición de CEs de la vena umbilical humana a un entorno hipóxico (pO_{2} \approx 2666 Pa) estimulaba la liberación del factor von Willebrand (vWF), almacenado en los cuerpos de WP de las CEs, e incrementaba la expresión de la molécula de adhesión de PMN selectina P, procedente de los cuerpos WP, en la superficie de las CEs. La unión incrementada de PMNs marcados con ^{111}In a monocapas de CEs hipóxicas (en comparación con controles normóxicos) se bloqueaba con un anticuerpo bloqueante contra la selectina P pero no con un anticuerpo control no bloqueante. Aunque la mayor expresión de selectina P y liberación de vWF también eran notables durante la reoxigenación, la H sola (incluso en presencia de antioxidantes) era suficiente para aumentar la exocitosis de los cuerpos de WP. Para determinar la relevancia de estas observaciones para la conservación hipotérmica del corazón, durante la cual la pO_{2} en la vasculatura cardiaca desciende a niveles igual de bajos, se realizaron experimentos en un modelo de conservación/trasplante de corazón en roedores (rata y ratón). La inmunodepleción de PMNs en los receptores o la administración de un anticuerpo anti-selectina P bloqueante antes del trasplante dio como resultado una menor infiltración de neutrófilos en el injerto y una mayor supervivencia del injerto en comparación con corazones conservados de forma idéntica y trasplantados a receptores control. Para establecer la importancia de la expresión de selectina P endotelial en la vasculatura del donante, se llevaron a cabo trasplantes de corazón en ratones usando corazones de donantes homocigotos carentes de selectina P y controles de tipo silvestre de los cuales se eliminó la sangre/plaquetas antes de la conservación/trasplante. Los corazones sin selectina P trasplantados a receptores de tipo silvestre mostraron una marcada reducción (13 veces) en la infiltración de neutrófilos en el injerto y un aumento de la supervivencia del injerto en comparación con los corazones de tipo silvestre trasplantados a receptores de tipo silvestre. Para determinar si la exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade endoteliales coronarios se puede producir durante la conservación del corazón en seres humanos, se midió en 32 pacientes durante una cirugía a corazón abierto la liberación de vWF en el seno coronario. Las muestras de seno coronario obtenidas al comienzo y al final del periodo isquémico mostraron un aumento del antígeno vWF en el seno coronario (por ELISA) que consistía predominantemente en multímeros de alto peso molecular (por electroforesis). Estos datos sugieren que la exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade en CEs ocurre durante la conservación hipotérmica del corazón, preparando la vasculatura para un rápido reclutamiento de PMNs durante la reperfusión.

Introducción

Las células endoteliales (CE) se adaptan a la hipoxia con un repertorio característico de respuestas (1), que van desde una mayor expresión de endotelina (2) hasta una mayor síntesis del factor de crecimiento básico de fibroblastos (3). Estudios recientes han indicado que muchos elementos de la respuesta de las CE a hipoxia son similares a los elementos de la respuesta inflamatoria; la hipoxia regula selectivamente al alza la expresión de las interleucinas 1 (4), 6 (5) y 8 (6), el factor de activación de plaquetas (PAF) (7,8) e ICAM-1 (4) en las CE, que sirven para provocar el reclutamiento, la adhesión y la activación de neutrófilos (PMN) en las zonas isquémicas. Aunque estos mecanismos pueden explicar las fases posteriores del daño por reperfusión, la rapidez con la que los PMNs son reclutados hacia el miocardio reperfundido tras un periodo de conservación hipotérmica sugiere que están implicados mecanismos que no precisan de la síntesis de proteínas de novo. A este respecto, la selectina P puede desempeñar un papel destacado en las fases más tempranas de la adhesión de PMN a la vasculatura reperfundida, puesto que las CEs pueden expresar rápidamente la selectina P formada previamente a partir de los puntos de almacenamiento subplasmalemales en las membranas de los cuerpos de Weibel-Palade (9) en respuesta a los abundantes radicales libres de oxígeno generados en el ambiente de reperfusión (10-12). Además, datos recientes apuntan a un papel de la atracción de leucocitos mediada por selectina P en la leucostasis y el daño tisular asociados con lesiones pulmonares (13) e isquemia cardiaca (14). En resumen, estos hallazgos condujeron a la hipótesis de que el periodo hipóxico/isquémico asociado con la conservación hipotérmica del miocardio prepara la vasculatura para su respuesta característica durante la reperfusión exponiendo la selectina P prominentemente en la superficie de las CEs antes de la reperfusión, que sirve de chispa que enciende y amplifica la respuesta inflamatoria subsiguiente.

Los experimentos se diseñaron para establecer si la hipoxia per se (o la conservación hipotérmica del corazón, como ocurre durante la cirugía cardiaca, en la que la pO_{2} en el lecho coronario desciende a pO_{2} < 2666 Pa) (15) produce la exocitosis de los cuerpos de WP. Además se llevaron a cabo experimentos para determinar el papel que desempeña la adhesión de PMN dependiente de selectina P en el fallo del corazón injertado, que típicamente sigue a un periodo de conservación hipotérmica prolongada. Los resultados muestran que la hipoxia es suficiente para inducir la exocitosis de los cuerpos de WP en las CEs incluso en ausencia de una reoxigenación (y en presencia de antioxidantes) y que la expresión resultante de selectina P provoca la unión de las CEs a los PMNs in vitro.

En roedores, las consecuencias adversas de la expresión de selectina P tras la conservación hipotérmica del corazón se pueden anular por completo bien por depleción de neutrófilos y bloqueo de la selectina P o bien trasplantando corazones cuyas células endoteliales no expresan selectina P. Puesto que la exocitosis de los cuerpos de WP también se produce en pacientes sometidos a una cirugía a corazón abierto durante el periodo de conservación hipotérmica del corazón, estos datos sugieren que el bloqueo de la selectina P puede constituir una diana para la intervención farmacológica para mejorar la conservación de corazones en humanos.

Métodos

Cultivo de células endoteliales y exposición de las células a H o H/R. Se prepararon CEs de la vena umbilical humana a partir de cordones umbilicales y se cultivaron según el método de Jaffe (16) modificado por Thornton (17). En los experimentos se usaron CEs confluentes (pases 1-4) cultivadas en medio 199 suplementado con suero bovino fetal (15%; Gemini, Calabasas, CA), suero humano (5%; Gemini), suplemento de crecimiento endotelial (Sigma, St. Louis, MO), heparina (90 \mug/ml; Sigma) y antibióticos según se ha descrito (17). Una vez que las CEs alcanzaron la confluencia se realizaron los experimentos colocando los cultivos en una cámara ambiental (Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI) que proporcionaba una temperatura (37ºC) y atmósfera controladas, con la cantidad indicada de oxígeno, dióxido de carbono (5%) y constituyendo el resto de nitrógeno. El uso de esta cámara para experimentos con cultivos celulares se ha descrito anteriormente (15,18). Durante la exposición de las CEs a hipoxia (durante un máximo de 16 horas) la presión de oxígeno en el medio de cultivo era de 1866,2 a 2399,4 Pa y no hubo cambios en el pH del medio. La reoxigenación se efectuó colocando las CEs en una atmósfera ambiental que contenía dióxido de carbono (5%) a 37ºC.

Medición de la exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade: Las CEs se sembraron en placas de 24 pocillos, se lavaron 3 veces con solución salina equilibrada de Hank y después se expusieron a hipoxia o a normoxia durante los tiempos indicados. Para los experimentos en los que se midió vWF, las células se mantuvieron en medio exento de suero. Todos los experimentos con CE se realizaron en el medio de cultivo de CE descrito anteriormente. Para la medición de vWF se recogieron en los tiempos indicados alícuotas de 200 \mul del sobrenadante del cultivo y se llevó a cabo por duplicado un ELISA comercial (American Diagnostica, Greenwich, CT) basado en un anticuerpo policlonal de cabra anti-vMF humano, generándose una curva patrón usando el antígeno de vWF humano purificado suministrado por la misma empresa. La expresión de la selectina P en CEs se determinó midiendo la unión específica de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-selectina P humana (clon WAPS 12.2, Endogen, Cambridge, MA; es una IgG1 que reconoce un epítopo sensible a calcio y que bloquea la adhesión de neutrófilos dependiente de selectina P). El anticuerpo se radiomarcó con ^{125}I mediante el método de la lactoperoxidasa (19) usando Enzymobeads (Bio-Rad, Hercules, CA), se almacenó a 4ºC y, una vez marcado, se usó en el plazo de una semana. Los ensayos de unión se realizaron en HUVECs sembradas en placas de 96 pocillos a los que se añadió M199 reciente con 0,1% de albúmina de suero bovina (Sigma, St. Louis, MO) justo antes de cada experimento. Las células se colocaron en un ambiente humidificado a 37ºC y se expusieron a normoxia o H (en presencia o ausencia de probucol 50 \muM según se indica, Sigma) durante los tiempos indicados. Las monocapas celulares se fijaron durante 15 min con paraformaldehído al 1%^{10} (las células expuestas a H se fijaron mientras se encontraban en el ambiente hipóxico), se inspeccionaron visualmente para comprobar que las monocapas seguían intactas y se lavaron dos veces con HBSS que contenía 0,5% de albúmina de suero bovina (HBSS/A). Las monocapas se expusieron después a 10^{5} cpm de un anticuerpo anti-selectina P (WAPS 12.2) marcado con ^{125}I en presencia de 200 \mug/ml de un anticuerpo bloqueante no marcado (WAPS 12.2) o a una IgG anti-selectina P no bloqueante del mismo isotipo (anti-GMP-140, clon AC1.2, Becton-Dickinson, San Jose, CA) (20,21). Tras un periodo de unión de 1 hora a 37ºC, las monocapas se lavaron 4 veces con HBSS/A y el anticuerpo unido se eluyó con Triton X-100 al 1% en PBS (200 \mul/pocillo) y se contó. Para determinados experimentos se añadió, como se indica, cicloheximida (10 \mug/ml, Sigma) al comienzo del periodo normóxico o hipóxico de 4 horas de duración. En experimentos separados diseñados para determinar el grado de inhibición de la síntesis de proteínas por el tratamiento con cicloheximida, las CEs se incubaron con medio mínimo esencial pobre en metionina y cisteína (Gibco, Grand Island, NY) en presencia de ^{35}S-metionina y ^{35}S-cisteína (en presencia o ausencia de cicloheximida, 10 \mug/ml) (3). Al cabo de 4 horas de exposición normóxica se recogió el material precipitable con ácido tricloroacético y se contó.

Preparación de PMNs humanos y medición de la unión: Brevemente, se diluyó sangre citrada de donantes sanos con NaCl (0,9%) en una relación 1:1 y seguidamente se sometió a una ultracentrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Tras la lisis hipotónica de los eritrocitos residuales (20 s de exposición a H_{2}O destilada seguida de una reconstitución con NaCl al 1,8%) se suspendieron PMNs en HBSS con 5 mg/ml de albúmina de suero humana (HBSS/HSA). Se suspendieron entre 50 y 200 x 10^{6} PMNs en HBSS/HSA en presencia de 0,2 a 0,5 \muCi de ^{111}indio-oxina (Amersham Mediphysics, Port Washington, NY) durante 15 minutos a 37ºC. Tras lavarlos con HBSS/HSA los PMNs se sedimentaron con cuidado (450 g) y se resuspendieron en HBSS/HSA a una concentración final de 5,5 x 10^{6} PMN/ml. Tras agitar suavemente se añadieron a cada pocillo 100 \mul de la suspensión de PMN radiomarcados en el momento indicado, se incubaron durante 30 minutos a 37ºC y después se lavaron 4 veces con HBSS/HSA. A continuación, las monocapas se trataron con NaOH 1 N, y se recogió el contenido de cada pocillo y se contó.

Modelo de trasplante de corazón heterotópico en rata y ratón. Los trasplantes de corazón se realizaron en el modelo de trasplante de corazón del isoinjerto heterotópico de Ono-Lindsey (15, 18, 22). Brevemente, se anestesiaron ratas Lewis macho (250 a 300 gramos, Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN), se heparinizaron y se extrajo rápidamente el corazón donante después de una detención cardioplégica hipotérmica con alto potasio. Los corazones se conservaron lavando las arterias coronarias con solución de Ringer-lactato (LR) a 4ºC (Baxter, Edison, NJ) y sumergiéndolas durante dieciséis horas en la misma solución a 4ºC, y seguidamente se realizó el trasplante heterotópico en receptores de género/cepa coincidentes, efectuándose anastomosis secuenciales de las aortas del donante y del receptor y de la arteria pulmonar del donante/vena cava inferior del receptor. La supervivencia del injerto se valoró exactamente diez minutos después de restablecer el flujo sanguíneo mediante la presencia/ausencia de actividad eléctrica/mecánica del corazón, después de lo cual se extirpó el injerto y se cuantificó la infiltración de neutrófilos midiendo la actividad de la mieloperoxidasa como se ha descrito anteriormente (15, 18). Para determinados experimentos se efectuó una depleción de neutrófilos en las ratas receptoras por administración de un anticuerpo policlonal de conejo anti-neutrófilos de rata (23-25) (Accurate Scientific, Westbury, NY) en forma de una única inyección intravenosa 24 horas antes de proceder al trasplante. La depleción de neutrófilos en estos animales se confirmó y cuantificó por recuento de los neutrófilos residuales identificados en frotis de sangre periférica teñida con Wright-Giemsa. En otros experimentos se administró por vía intravenosa una IgG anti-selectina P bloqueante (250 \mug/rata, Cytel, San Diego, CA) (13, 14, 26) 10 minutos antes de comenzar con la reperfusión. Los trasplantes de corazón en ratones se realizó de forma idéntica usando ratones macho homocigotos carentes de selectina o controles de tipo silvestre con antecedentes de C57BL/6J (27), e inmediatamente se eliminó la sangre nativa de los corazones extraídos con 1,0 ml de LR a 4ºC administrado a través de un pinzamiento transversal de la raíz de la aorta, a lo que siguió un periodo de conservación hipotérmica que consistió en tres horas de inmersión en solución de Ringer-lactato a 4ºC.

Medición de vWF en el efluente coronario de corazones de rata y humanos conservados bajo hipotermia

Muestras del seno coronario humano. Una vez obtenido el consentimiento informado se extrajo sangre del seno coronario al comienzo y al final de una cirugía cardiaca rutinaria en una serie no seleccionada de 32 pacientes, recogiéndose al mismo tiempo muestras de sangre periférica (arterial) en seis de ellos. Las muestras del seno coronario se obtuvieron mediante un catéter de perfusión retrógrado que se colocó de forma rutinaria a pacientes sometidos a una derivación cardiopulmonar. Las muestras de plasma se centrifugaron durante 5 min a 1.500 x g para sedimentar los elementos celulares, y el plasma se dividió en alícuotas y se congeló a -70ºC hasta el momento del ensayo. Se realizaron ELISAs para vWF (como se ha descrito antes) y trombomodulina (Asserchron Thrombomodulin, Diagnostica Stago).

Inmunoelectroforesis de vWF: Se evaluó la composición multimérica del vWF en las muestras de plasma del seno coronario y en los sobrenadantes de las células endoteliales realizando una inmunoelectroforesis en gel de agarosa. Las muestras se diluyeron 1:10, 1:20 y 1:30 (según se indica) y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC en tampón de muestra nativo (Bio-Rad). A continuación, las muestras (20 \mul) se sometieron a una electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% (0,675 g de agarosa Low M^{r}, Bio-Rad; 0,045 g de SDS; 45 ml de tampón Tris-tricina SDS [Bio-Rad]). Los marcadores del peso molecular, que corrieron simultáneamente en los geles de agarosa, se visualizaron por marcado y división del gel, indicando las posiciones de los marcadores del peso molecular por tinción con azul de Coomassie. La otra mitad del gel se lavó durante 30 minutos con borato sódico (0,01 M), a lo que siguió durante la noche una transferencia electroforética a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se lavó con tampón de lavado compuesto por solución salina tamponada con Tris (pH 7,5) y 0,05% de Tween-20 y después se bloqueó durante 1 hora con 50 ml de tampón de lavado que contenía 2,5 g de leche instantánea Carnation. Después de aclararla con solución salina fisiológica, la membrana se sumergió durante la noche en tampón de lavado que contenía 1 g/dl de gelatina y una dilución 1:500 de suero de conejo anti-vWF humano (American Bioproducts, Parsippany, NJ). Después de lavarla 5 veces con tampón de lavado, la membrana se sumergió durante 3 horas y bajo suave agitación en tampón de lavado que contenía 1 g/dl de gelatina y 16,6 \mul de un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con la peroxidasa de rábano picante (Bio-Rad) y se reveló con 60 ml de HRP Developer (30 mg de HRP Developer en polvo, Bio-Rad; 10 ml de metanol; 50 ml de solución salina tamponada con Tris; 50 \mul de peróxido de hidrógeno al 30% añadido justo antes del uso).

Estadística. Se usó el análisis de la varianza para comparar 3 o más estados, realizando las comparaciones a posteriori mediante el procedimiento de Tukey. Los datos de supervivencia del injerto se analizaron usando un análisis de contingencia con la estadística de chi-cuadrado. Las mediciones en serie de muestras apareadas (muestras de SC y sangre periférica humanas al comienzo y al final de la cirugía cardiaca) se compararon usando el test t de Student para variables apareadas. Los valores se expresan como medias \pm error típico, considerándose una p < 0,05 estadísticamente significativa.

Resultados

La exposición de CEs en cultivo a hipoxia provoca la liberación de vWF y el desplazamiento de selectina P a la superficie celular. Estudios anteriores han mostrado que la exposición de células endoteliales a hipoxia produce un aumento del calcio intracelular (28). En vista de la asociación entre el aumento del calcio citosólico y la exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade en CEs en respuesta a trombina o histamina (29,30), se consideró la posibilidad de que la exposición de CEs a hipoxia pudiera desencadenar este proceso. Las CEs colocadas en un entorno hipóxico (pO_{2} 2.666 Pa) liberaron más vWF a los sobrenadantes de cultivo que sus equivalentes normóxicos (Fig. 8A, ELISA; confirmado por inmunoelectroforesis, datos no mostrados). Aunque la tendencia hacia mayores niveles de vWF se apreció por primera vez al cabo de 1 hora de hipoxia, las diferencias entre los niveles de vWF normóxicos e hipóxicos no fueron estadísticamente significativas hasta después de 4 horas de exposición, aumentando después constantemente durante las 12 horas de observación. Para determinar si la mayor liberación de vWF observada a las 4 horas de hipoxia se debía a la liberación de vWF previamente formado, se llevaron a cabo experimentos similares en presencia de 10 \mug/ml de cicloheximida para inhibir la síntesis de proteínas. Estos experimentos mostraron que la adición de cicloheximida al comienzo del periodo hipóxico reduce la liberación de vWF inducida por hipoxia en un 12,5%, lo que sugiere que la mayoría del vWF liberado a causa de la exposición hipóxica estaba formada previamente.

Aunque estos experimentos se realizaron en su totalidad en un entorno hipóxico (es decir que no hubo reoxigenación), se añadió el antioxidante probucol (50 \muM) a las CEs al inicio de la H con el fin de demostrar adicionalmente que esta exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade mediada por H era independiente de la formación de intermedios de oxígeno reactivo, y se descubrió que no ejercía ningún efecto (vWF 4,7 \pm 0,31 x 10^{-3} U/ml a las 6 horas de H). La presencia de probucol mitigó el aumento adicional de los niveles de vWF observados después de la reoxigenación de las CEs hipóxicas. La dependencia de calcio de la exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade inducida por hipoxia se demostró mediante experimentos en los que las CEs se colocaron en un medio sin calcio al inicio de la exposición hipóxica. La ausencia de calcio extracelular atenuó la liberación de vWF inducida por H en CEs, y la adición de EGTA presentaba un efecto aún más supresor (la liberación endotelial basal de vWF también disminuyó al reducir el calcio extracelular) (Fig. 8B).

Para determinar si la hipoxia también inducía el desplazamiento de la selectina P hacia la superficie del plasmalema de las CEs se examinó la unión específica de IgG anti-selectina P marcada con ^{125}I a las monocapas de CEs hipóxicas o normóxicas. Los estudios de unión se realizaron en monocapas de CEs fijadas con paraformaldehído que permanecían aún en el entorno hipóxico para obviar la expresión de selectina P inducida por radicales libres de oxígeno durante la reoxigenación. Estos estudios mostraron una mayor unión de ^{125}I-IgG anti-selectina P en CEs hipóxicas que en las normóxicas (Fig. 9A). Esta unión se bloqueaba mediante una IgG anti-selectina P bloqueante no marcada pero no mediante una IgG anti-selectina P control no bloqueante del mismo isotipo. La expresión de selectina P en la superficie se apreció desde los primeros momentos de observación (60 minutos de H) y se observó a niveles similares durante todo el periodo de exposición a hipoxia (hasta 4 horas de observación). Es posible que la expresión de selectina P endotelial inducida por hipoxia se detectara en tiempos anteriores al aumento estadísticamente significativo de la liberación de vWF en células tratadas de forma similar porque una parte del vWF secretado inicialmente se une fuertemente a la matriz subendotelial (31).

Para determinar si se requería síntesis de proteínas para la expresión de selectina P inducida por hipoxia, se realizó un experimento separado en el que se administró cicloheximida al inicio de normoxia o H y se determinó la unión de IgG anti-selectina P radiomarcada después de un periodo de tiempo de 4 horas. Este experimento demostró que la hipoxia seguía aumentando la expresión de selectina P endotelial, si bien a niveles reducidos (Fig. 9B), incluso con una inhibición de la síntesis de proteínas > 85% (Fig. 9B, Inicio). Para establecer si la selectina P inducida por hipoxia en la superficie celular puede participar en la unión de neutrófilos se incubaron neutrófilos humanos radiomarcados con ^{111}indio-oxina con CEs hipóxicas; se observó una mayor unión a las monocapas hipóxicas. La unión de ^{111}In-PMN inducida por hipoxia se bloqueaba mediante la adición de una IgG anti-selectina P bloqueante pero no mediante una IgG anti-selectina P no bloqueante (Fig. 9C).

Papel de la adhesión de neutrófilos dependiente de selectina P en la conservación hipotérmica/isquémica del miocardio. Para establecer la relevancia de estas observaciones en la conservación hipotérmica del miocardio (en la que la pO_{2} de la solución de conservación en la vasculatura coronaria cae a por debajo de 2.666 Pa (15)), se extrajeron corazones de ratas Lewis macho y se sometieron a una conservación hipotérmica como se describió en la sección "Métodos". Puesto que el daño mediado por neutrófilos tras una isquemia cardiaca está bien establecido (32-38), se investigó el posible papel fisiopatológico de la expresión de selectina P endotelial en un modelo de trasplante de corazón ortotópico en ratas, en el que tuvo lugar una reperfusión después de un periodo de conservación hipotérmica. Estos experimentos mostraron una excelente supervivencia de los injertos y una infiltración de neutrófilos reducida si el trasplante de corazón se realizaba inmediatamente después de la extracción (Fig. 10A, Reciente). Sin embargo, cuando se realizaron experimentos similares con un periodo intermedio (16 horas) de conservación hipotérmica entre los procedimientos de extracción y de trasplante, hubo una elevada incidencia (90%) de fallo del injerto y una marcada leucostasis, que se confirmó histológicamente y por determinación de la actividad de la mieloperoxidasa (Fig. 10A, cons.). Para demostrar que la adhesión de neutrófilos era responsable, al menos en parte, del fallo del injerto tras una conservación prolongada, se realizaron trasplantes tras llevar a cabo una depleción de neutrófilos en las ratas receptoras. El anticuerpo policlonal de conejo anti-PMN de rata usado (23-25) eliminó prácticamente todos los PMNs circulantes en los receptores (recuento de PMN 1471 \pm 56 frente a 67 \pm 11 PMNs/mm^{3} para los animales control y los sometidos a la inmunodepleción, respectivamente, p < 0,001), ejerciendo poco efecto sobre otros tipos celulares. Cuando se trasplantaron corazones conservados durante 16 horas a receptores sometidos a inmunodepleción para proporcionar un ambiente de reperfusión exento de neutrófilos, se produjo una reducción significativa de la actividad de la mieloperoxidasa en el injerto y un aumento de la supervivencia del injerto (Fig. 10A, cons. (-) PMN). Las ratas receptoras normales infundidas 10 minutos antes de restablecer el flujo sanguíneo con una IgG anti-selectina P bloqueante mostraron una reducción de la actividad de la mieloperoxidasa y una mejora en la supervivencia del injerto (Fig. 10A, \alpha-SP, Bloqueante) de magnitudes similares a las de los receptores sometidos a una inmunodepleción de neutrófilos. Esta infiltración reducida de PMN y mayor supervivencia del injerto se observaron pese a la conservación hipotérmica del corazón donante durante 16 horas. Por el contrario, la administración de un anticuerpo control no bloqueante (AC1.2) no presentaba ningún efecto beneficioso sobre la leucostasis del injerto ni sobre la supervivencia del injerto (Fig. 10A, \alpha-SP, no bloqueante).

Puesto que además de las interacciones entre CEs y PMNs también las plaquetas pueden interactuar con los PMNs por medio de un mecanismo dependiente de selectina P (39), se diseñó un experimento para aislar la contribución que hace la selectina P endotelial a la leucostasis y al fallo del injerto que se producen después de una conservación hipotérmica prolongada del corazón. Para estos experimentos se pudo eliminar la sangre de los corazones donantes procedentes de ratones homocigotos deficientes de selectina P, de manera que se pudieron trasplantar células endoteliales coronarias carentes de selectina P a receptores de tipo silvestre con plaquetas que contienen selectina P. Se obtuvieron corazones donantes a partir de ratones homocigotos carentes de selectina P (27) o de controles de tipo silvestre usando un modelo murino de trasplante de corazón heterotópico realizado de forma idéntica a la operación en ratas; todos los corazones se trasplantaron en receptores de tipo silvestre. Estos experimentos mostraron una tasa de supervivencia del injerto significativamente mayor en los trasplantes carentes de selectina P \rightarrow tipo silvestre que en los trasplantes tipo silvestre \rightarrow tipo silvestre (Fig. 10B). Esta mayor supervivencia del injerto en el primer grupo coincide con una reducción marcada (13 veces) de la leucostasis del injerto (Fig. 10C). Puesto que al comienzo de la conservación se eliminó la sangre de estos corazones, estos estudios implican a la selectina P endotelial coronaria (más que a la procedente de plaquetas) en la mala conservación y la atracción de leucocitos observada después de la conservación hipotérmica del miocardio.

Exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade durante la cirugía cardiaca humana. Para establecer la relevancia de estos hallazgos para los seres humanos, se diseñó el siguiente conjunto de experimentos para demostrar que las CEs coronarias liberan el contenido de los cuerpos de Weibel-Palade durante la conservación hipotérmica del corazón, como ocurre durante la cirugía cardiaca rutinaria. Se midió la liberación del vWF desde la vasculatura coronaria durante un periodo de isquemia cardiaca bien definido, como el que se produce durante el periodo de pinzamiento transversal de la aorta. Se tomaron muestras de sangre del seno coronario (que drena el corazón) de 32 pacientes al comienzo (SC_{1}) y al final (SC_{2}) del pinzamiento transversal de la aorta (este intervalo representa el periodo isquémico). Estos pacientes (23 masculinos, 9 femeninos) tenían una historia clínica de cardiopatía valvular (n = 11) o de cardiopatía isquémica (n = 21) y habían sido sometidos a una reparación/sustitución de la válvula o al implante de una derivación arteriocoronaria, respectivamente. Los ELISAs de captación realizados para la proteína integral de membrana trombomodulina (40) no mostraron ningún cambio entre los niveles de las muestras SC_{1} y SC_{2} (4,35 \pm 1,2 ng/ml frente a 3,48 \pm 0,8 ng/ml, p=NS), lo que sugiere que no se desprendieron CEs y que se conservó la integridad de la membrana celular durante la conservación del corazón. Mediciones similares realizadas para el vWF mostraron que había un aumento coherente y significativo del vWF secretado durante la conservación del corazón (0,68 \pm 0,06 U/ml frente a 0,90 \pm 0,05 U/ml, SC_{1} frente a SC_{2}, p < 0,01) (Fig. 11A).

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Para demostrar que este vWF era más probablemente de origen endotelial coronario que plaquetario y, por lo tanto, no simplemente una consecuencia de la derivación cardiopulmonar, se extrajeron muestras de sangre periférica al mismo tiempo que las muestras SC_{1} y SC_{2}, y se mostró que los niveles de vWF estaban inalterados (0,813 \pm 0,52 U/ml frente a 0,900 \pm 0,41 U/ml, p=NS), lo que sugiere que la perturbación mecánica de las plaquetas durante la derivación cardiopulmonar no era la causa. Puesto que el vWF está presente en el plasma en forma de multímeros con diferentes M_{r} (41-44), presentando aquellos multímeros de vWF del reservorio estimulable (al contrario que los secretados de forma constitutiva) el peso molecular más alto (45), se realizó una inmunoelectroforesis de las muestras de SC. Estos geles demostraron que, además de un aumento global de vWF en las muestras SC_{2}, parecía haber un aumento en los multímeros de alto peso molecular, lo que sugiere que son liberados de un reservorio estimulable, como el que se encuentra en las células endoteliales (Fig. 11B).

Discusión

La vasculatura desempeña un papel crítico en el mantenimiento del ambiente extracelular de los órganos sometidos a isquemia y reperfusión, un papel que es realizado principalmente por las CEs que revisten el lumen endovascular. Las CEs responden a un periodo de privación de oxígeno con una modulación fenotípica, volviéndose protrombóticas (46) y proinflamatorias (1,4,6). Las CEs expuestas a hipoxia secretan las citocinas proinflamatorias IL-1 (4) e IL-8 (6), que pueden servir para dirigir el tráfico de leucocitos hacia las áreas de isquemia. Puesto que estos procesos requieren la síntesis de novo de proteínas, no explican los acontecimientos inmediatos que se producen después de un periodo de conservación hipotérmica. Aunque la mayor expresión de ICAM-1 y la inducción de selectina E pueden contribuir en momentos posteriores a la atracción de leucocitos en los injertos cardiacos, esto no explica la rápida leucostasis observada después de la conservación en frío, en la que la síntesis de proteínas está probablemente muy ralentizada. En este sentido, el tratamiento previo con cicloheximida no altera la adhesión temprana (90 a 120 minutos) de PMN que se observa después de exponer las CEs a hipoxia (7), lo que sugiere que la síntesis de novo de proteínas no está implicada necesariamente en el aumento dependiente de hipoxia de la unión de PMN. Aunque el factor de activación de plaquetas (PAF) puede participar en la adhesión (7,47) y activación (48,49) de PMN mediada por hipoxia, el PAF no se almacena y ha de ser sintetizado, lo que puede reducir su importancia en el periodo hipotérmico durante la conservación del miocardio. Esta es la razón por la que la rápida expresión de selectina P previamente formada en CEs a partir de puntos de almacenamiento subplasmalemales en los cuerpos de Weibel-Palade (9,50,51) puede constituir el mecanismo más importante para el reclutamiento temprano de PMN después de la conservación hipotérmica. Los cuerpos de Weibel-Palade se encuentran abundantemente en la microvasculatura coronaria (52), lo que sugiere su particular importancia en la conservación del corazón.

Los datos muestran que la exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade se produce tanto en respuesta a la hipoxia misma como en corazones humanos durante la conservación hipotérmica. Aunque resulta difícil identificar con precisión un origen endotelial para el vWF observado en las muestras de seno coronario humano, los estudios realizados en plaquetas después de una derivación cardiopulmonar no muestran ningún aumento en la expresión de selectina P en la superficie ni en la secreción de gránulos \alpha (53,54). Esto sugiere que el aumento de vWF en el seno coronario observado después del pinzamiento transversal de la aorta no es de origen plaquetario. Dos aspectos de los datos también sugieren que el vWF liberado después de la isquemia es de origen endotelial; (1) los niveles de vWF periférico permanecían inalterados mientras que los niveles en el seno coronario aumentaban después de la isquemia del miocardio, lo que sugiere que el vWF elevado provenía del corazón y no del dispositivo de derivación cardiopulmonar; (2) al comienzo de la conservación se eliminó la sangre donante de los corazones donantes transgénicos carentes de selectina P, de manera que cuando se trasplantan en receptores de tipo silvestre se supone que está ausente la selectina P endotelial coronaria (no la plaquetaria). Estos experimentos demuestran la importante contribución que realiza la selectina P endotelial al reclutamiento de neutrófilos que acompaña a la reperfusión.

No resulta sorprendente que la selectina P sea importante tras la conservación hipotérmica del miocardio; estudios recientes han demostrado que la selectina P es un importante mediador del daño por reperfusión inducido por neutrófilos tras una isquemia normotérmica, como se ha mostrado en los modelos de oreja de conejo (26) y de isquemia cardiaca felina (14). Puesto que los oxidantes provocan la expresión de selectina P en la superficie de las CEs (10), era importante evaluar en estos estudios el papel del periodo hipóxico solo ya que éste puede preparar las CEs para reclutar la primera ola de PMNs, incrementándose el reclutamiento de PMN adicionalmente con el ataque de intermedios de oxígeno reactivo producidos en el microambiente de reperfusión. Aunque un informe ha sugerido que la hipoxia puede inducir la expresión de selectina P en CEs, estos experimentos (7) se realizaron en realidad después de la reoxigenación, un estado que se sabe induce la adherencia tanto de superóxido (18,55) como de neutrófilos a CEs en cultivo (56). Por el contrario, los experimentos descritos en la presente memoria se realizaron en su totalidad en un entorno hipóxico para prevenir por completo la posibilidad de una reoxigenación, y los antioxidantes no bloqueaban la expresión de selectina P inducida por hipoxia, lo que sugiere que las observaciones descritas en la presente memoria reflejan la hipoxia misma en vez de la reoxigenación. Además, la protección del corazón mostrada en la presente memoria usando una estrategia por medio de la cual se trasplantan corazones conservados sin sangre de ratones transgénicos carentes de selectina P a receptores con plaquetas de tipo silvestre demuestra que la expresión de selectina P endotelial puede ser deletérea después de una conservación hipotérmica del corazón. Puesto que durante la conservación hipotérmica de corazones humanos se produce la exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade, estos estudios sugieren que la conservación del miocardio puede mejorarse mediante estrategias terapéuticas diseñadas para bloquear la actividad de la selectina P expresada en la superficie endotelial.

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Ejemplo 3 Las variables relacionadas con el procedimiento y con la cepa afectan significativamente el pronóstico en un modelo murino de isquemia cerebral focal

La reciente disponibilidad de ratones transgénicos ha dado lugar a un extenso número de informes que describen los efectos que ejercen productos génicos específicos sobre la fisiopatología del accidente cerebrovascular. Aunque se han descrito en detalle modelos de isquemia cerebral focal en ratas, las descripciones relativas a un modelo murino para la oclusión de la arteria cerebral media son escasas, y siguen sin definirse las posibles fuentes de variabilidad experimental. Se planteó la hipótesis de que ligeras modificaciones técnicas darían resultados muy discrepantes en un modelo murino del accidente cerebrovascular y que el control de las condiciones quirúrgicas y del procedimiento podría proporcionar pronósticos fisiológicos y anatómicos reproducibles para el accidente cerebrovascular. Para comprobar esta hipótesis se estableció un modelo murino que permite provocar una isquemia cerebral focal permanente o transitoria mediante la oclusión intraluminal de la arteria cerebral media (ACM). Este estudio proporciona una descripción detallada de la técnica quirúrgica y revela importantes diferencias entre las cepas comúnmente usadas en la producción de ratones transgénicos. Además de las diferencias relativas a la cepa, parece que el volumen de infarto, el pronóstico neurológico y el flujo sanguíneo cerebral se ven afectados de forma importante por la temperatura que reina durante los periodos isquémico y postisquémico, el tamaño del ratón y el tamaño de la sutura que obstruye el lumen vascular. Cuando estas variables se mantenían constantes, se obtenía una destacada uniformidad en el pronóstico del accidente cerebrovascular. Estos datos recalcan los efectos protectores de la hipotermia en el accidente cerebrovascular y podrían ayudar a normalizar las técnicas entre diferentes laboratorios para proporcionar un marco cohesivo para evaluar los resultados de futuros estudios que se realicen en animales transgénicos.

Introducción

El reciente advenimiento de ratones genéticamente alterados proporciona una oportunidad única para evaluar el papel que desempeñan productos génicos individuales en la fisiopatología del accidente cerebrovascular. Aunque el número de informes relacionados con el efecto de la isquemia cerebral en ratones transgénicos aumenta, hasta la fecha no existe ninguna descripción detallada de los modelos murinos implicados ni aparece ningún análisis detallado de las variables de procedimiento posiblemente importantes que puedan afectar el pronóstico del accidente cerebrovascular. La mayoría de las descripciones de un modelo murino (1,4,8,9,14,17-19,23,24) son descripciones que recaen en los modelos de isquemia cerebral focal ampliamente usados en ratas (22,26). Aunque se ha prestado cierta atención a las diferencias existentes entre las cepas en cuanto a la susceptibilidad de los ratones a sufrir una isquemia cerebral (4), los estudios publicados abordan pocas consideraciones técnicas. Puesto que datos piloto demostraron que diferencias mínimas en el procedimiento quirúrgico o el cuidado postoperatorio se traducen en grandes diferencias en el pronóstico del accidente cerebrovascular, se realizó el presente estudio para identificar sistemáticamente consideraciones quirúrgicas, técnicas y anatómicas necesarias para obtener resultados coherentes en un modelo murino de isquemia cerebral focal. Si se generan accidentes cerebrovasculares de un modo estrictamente controlado, serán fáciles de distinguir las diferencias debidas a la ausencia (o sobreexpresión) de un producto génico individual.

Este estudio presenta una versión detallada de un modelo murino reproducible del infarto cerebral focal basado en modificaciones del modelo original de rata (26). Este estudio identifica variables de procedimiento que poseen una gran influencia en el pronóstico del accidente cerebrovascular y de las cuales no se ha informado previamente en descripciones técnicas de los modelos murinos del accidente cerebrovascular. Estas variables incluyen la longitud y el calibre de la sutura, los métodos de control vascular, la regulación de la temperatura en los ratones y las diferencias entre las cepas comúnmente usadas en la cría de animales transgénicos. Puesto que el modelo descrito se presta al estudio de una isquemia cerebral focal tanto permanente como transitoria, se presentan evidencias de que seleccionando cuidadosamente los tiempos de isquemia, se puede lograr que el volumen de infarto y la mortalidad en animales reperfundidos se aproximen a los que se observan con una oclusión permanente. La comprensión de las posibles fuentes de variabilidad dependientes del modelo en el pronóstico del accidente cerebrovascular puede ayudar a esclarecer los resultados divergentes entre los diferentes laboratorios. La adopción de un modelo normalizado que proporcione resultados coherentes es un primer paso importante hacia el uso de ratones transgénicos en el estudio de la fisiopatología del accidente cerebrovascular.

Materiales y métodos

Adquisición de los animales y anestesia: Se adquirieron ratones macho de tres cepas diferentes (C57 BlackJ6, CD-1 y 129J) de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los animales tenían entre ocho y diez semanas de edad y pesaban entre 18 y 37 gramos (según se indica) en el momento de los experimentos. Los ratones se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de 0,3 ml de quetamina (10 mg/ml) y xilazina (0,5 mg/ml). Se administró una dosis adicional de 0,1 ml antes de retirar el catéter en los animales sometidos a una isquemia transitoria. El día después de la cirugía se volvieron a anestesiar justo antes de la flujometría de láser doppler y la eutanasia humanitaria. Estos procedimientos han sido aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee (Comité Institucional para el cuidado y uso de animales) de la Universidad de Columbia y cumplen las directrices AALAC para el cuidado y uso humanitario de animales de laboratorio.

Disposición quirúrgica: El animal se colocó en posición supina sobre una almohadilla de gasa dispuesta sobre una superficie de operaciones de temperatura controlada (Yellow Springs Instruments, Inc. [YSI], Yellow Springs, OH). Se insertó una sonda de temperatura rectal (YSI) con el fin de regular la temperatura de la superficie de operaciones de manera que la temperatura interna del animal se mantuviera constante entre 36 y 38ºC. Para facilitar la exposición, la pata trasera derecha y la pata delantera izquierda se fijaron con cinta adhesiva a la superficie de operaciones, la pata delantera derecha se fijó al pecho del animal y la cola se fijó a la sonda rectal (Figura 12A). Se efectuó una incisión en la línea media del cuello levantando con cuidado la piel flácida entre el manubrio y la pata y extirpando un círculo de piel de 1 cm^{2}. Se dividió limpiamente la pareja de glándulas submaxilares, situadas directamente debajo de este área, en la línea media, dejando la glándula izquierda in situ. La glándula derecha se retrajo en dirección del cráneo con una pinza de aneurisma Sugita recta pequeña (Mizutto America, Inc., Beverly, MA) sujeta a la mesa mediante un hilo de seda 4.0 y cinta adhesiva. A continuación se identificó el músculo esternocleidomastoideo y se colocó una ligadura de seda 4.0 alrededor de su centro. Se tiró de esta ligadura en dirección inferolateral y se fijó con cinta adhesiva a la mesa para exponer el músculo omohioideo que cubre la vaina de la carótida. La exposición se muestra en la Figura 12B.

Planteamiento operativo: Una vez expuesta la vaina de la carótida se colocaron el ratón y la superficie de temperatura controlada bajo un microscopio de operaciones (aumentos 16-25x, Zeiss, Thornwood, NY) con una fuente de luz coaxial para iluminar el campo. El músculo omohioideo amplificado se dividió con cuidado con pinzas. Con cuidado se retiró la vaina de la arteria carótida común (ACC), prestando atención a no aplicar tensión al nervio vago (que discurre lateralmente respecto a la ACC). Una vez libre, la ACC se aisló con un hilo de seda 4.0 fijado sin tensión a la mesa de operaciones. Una vez obtenido el control proximal de la ACC, se enfocó la bifurcación de la carótida. La arteria occipital, que parte de la arteria carótida externa proximal y cruza en dirección postero-lateral la arteria carótida interna proximal (ACI) para penetrar en el músculo digástrico, se aisló en su origen y se dividió usando un microcoagulador bipolar Malis (Codman-Schurtleff, Randolph, MA). Esto permitió visualizar mejor la ACI puesto que discurre en dirección posterior y cefálica por debajo del músculo estilohioideo hacia la base del cráneo. Justo antes de entrar en el cráneo la ACI da lugar a una ramificación pterigopalatina, que discurre en las direcciones lateral y craneal. Esta ramificación se identificó, se aisló y se dividió en su origen, durante lo cual el eje ACC-ACI se estrechó. Después se colocó una sutura de seda 4.0 alrededor de la arteria carótida interna para el control distal, cuyo extremo se fijó sin tensión a la superficie de operaciones.

A continuación se enfocó la arteria carótida externa. Se esqueletizó su curso cráneo-medial, y su primera ramificación, la arteria tiroidea superior, se cauterizó y dividió. La esqueletización se realizó después distalmente levantando el hueso hioideo para exponer la bifurcación de la arteria en las arterias lingual y maxilar. La carótida externa se cauterizó y dividió justo proximalmente a esta bifurcación. A continuación se aplicó a las suturas de seda que rodeaban las arterias carótidas común proximal e interna distal una tensión suficiente para cortar el flujo sanguíneo, teniendo cuidado de no traumatizar la pared arterial. Se reajustó la cinta adhesiva en las suturas oclusivas para mantener la oclusión.

Introducción y enhebrado de la sutura intraluminal oclusiva: Inmediatamente después de la oclusión de la carótida se realizó una arteriotomía en la pared de la carótida externa distal, justo proximalmente al área cauterizada. A través de esta arteriotomía se introdujo una sutura de nilón 5.0 ó 6.0 redondeada por calor (como se indica en la sección "Resultados") (Figuras 12C y 12D). Al llegar la sutura al nivel de la bifurcación de la carótida, el muñón externo se retrajo con cuidado en dirección caudal, dirigiendo el extremo de la sutura hacia la ACI proximal. Una vez que la sutura oclusiva entró en la ACI se relajó la tensión sobre las suturas de control proximal y distal y la sutura oclusiva avanzó lentamente, bajo visualización directa, por la ACI hacia la base del cráneo (más allá del nivel de la base del cráneo se pierde de vista la sutura oclusiva). La localización del extremo distal de la sutura oclusiva al otro lado del origen de la arteria cerebral media (ACM) (proximal respecto al origen de la arteria cerebral anterior) se determinó por medio de la longitud de la sutura elegida (12 mm o 13 mm según se indica en la sección "Resultados" y se muestra en la Figura 12C), por flujometría de láser doppler (véase la sección "Procedimientos fisiológicos auxiliares") y por tinción de la vasculatura cerebral tras sacrificar a los animales (véase más adelante). Tras completar la colocación de la sutura oclusiva, se cauterizó el muñón de la arteria carótida externa para evitar el sangrado a través de la arteriotomía una vez restablecido el flujo arterial.

Terminación del procedimiento quirúrgico: En todos los experimentos mostrados la duración de la oclusión de la carótida fue inferior a dos minutos. Para cerrar la incisión se cortaron y retiraron las suturas que rodeaban las ACC proximal y distal, así como el músculo esternocleidomastoideo. Se eliminó la pinza de aneurisma de la glándula submaxilar y se colocó la glándula en el campo de operaciones. A continuación se juntaron los extremos de piel con una grapa quirúrgica y el animal se retiró de la mesa.

Eliminación de la sutura oclusiva para establecer una isquemia cerebral transitoria: Los experimentos de isquemia cerebral transitoria precisaron de una reexploración de la herida para eliminar la sutura oclusiva. Para estos experimentos, el cierre inicial de la herida se efectuó con un pinza de aneurisma temporal en lugar de con una grapa quirúrgica para facilitar un acceso rápido a la carótida. El control proximal con una sutura de seda 4-0 se restableció antes de eliminar la sutura oclusiva para minimizar el sangrado por el muñón de la carótida externa. Durante la eliminación de la sutura oclusiva se comenzó pronto, antes de que la sutura distal despejara por completo el muñón, con la cauterización del muñón de la arteria carótida externa. Una vez eliminada la sutura por completo, el muñón se cauterizó más extensamente. El restablecimiento del flujo en la arteria carótida interna extracraneal se confirmó visualmente y la herida se cerró igual que para la isquemia focal permanente antes descrita. La confirmación de la reperfusión intracraneal se realizó por flujometría de láser doppler (véase la sección "Procedimientos fisiológicos auxiliares").

Cálculo del volumen del accidente cerebrovascular: Veinticuatro horas después de la oclusión de la arteria cerebral media los ratones supervivientes se volvieron a anestesiar con 0,3 ml de quetamina (10 mg/ml) y xilazina (0,5 mg/ml). Tras registrar los pesos finales, las temperaturas y el flujo sanguíneo cerebral (como se describe más adelante), los animales se perfundieron con 5 ml de una solución al 0,15% de azul de metileno y solución salina para incrementar la visualización de las arterias cerebrales. Después se decapitaron los animales y se extrajeron los cerebros. A continuación, los cerebros se inspeccionaron en cuanto a la colocación correcta del catéter, que se evidenció por tinción negativa de la zona vascular subtendida por la ACM, y se colocaron en una matriz para cerebros de ratón (Activational Systems Inc., Warren, MI) para cortarlos en secciones de 1 mm. Las secciones se sumergieron en cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) al 2% en solución salina tamponada con fosfato al 0,9%, se incubaron durante 30 minutos a 37ºC y se introdujeron en formalina al 10% (5). Después de la tinción con TTC, el cerebro que sufrió el infarto se visualizó en forma de un área de tejido no teñido (blanco) sobre un fondo de tejido viable (rojo ladrillo) que lo rodea. Las secciones seriadas se fotografiaron y se proyectaron sobre papel de calco en ampliaciones uniformes; todas las secciones seriadas se calcaron y se recortaron, y un técnico que ignoraba las condiciones experimentales pesó el papel. En estas condiciones, los volúmenes de infarto son proporcionales a la suma de los pesos de los papeles que circunscriben la región del infarto y se expresan en porcentaje del volumen del hemisferio derecho. Estos métodos fueron validados en estudios anteriores (3,12,15,16).

Estudios fisiológicos auxiliares

Justo antes y después del procedimiento operativo se realizaron estudios fisiológicos auxiliares en cada una de las tres cepas diferentes usadas en los presentes experimentos. Las presiones arteriales sistémicas se obtuvieron por cateterización de la aorta abdominal infrarrenal y se midieron usando un polígrafo Grass, modelo 7 (Grass Instrument Co., Quincy, MA). Con este catéter aórtico infrarrenal se obtuvo una muestra de sangre arterial; el pH, la pCO_{2} (mm Hg) y la pO_{2} (mm Hg) arteriales y la saturación de oxígeno de la hemoglobina (%) se midieron usando un analizador de gases en sangre y un hemoglobinómetro (Grass Instrument Co., Quincy, MA). Debido a que es necesario realizar una punción arterial y una manipulación abdominal para medir estos parámetros fisiológicos, se asignaron animales únicamente para estas mediciones (los volúmenes de infarto, el pronóstico neurológico y los flujos sanguíneos cerebrales no se midieron en estos mismos animales).

Las mediciones transcraneales del flujo sanguíneo cerebral se realizaron usando flujometría de láser doppler (Perimed, Inc., Piscataway, NJ) tras retirar la piel que cubre la bóveda craneal, como se ha descrito previamente (10) (las lecturas transcraneales coincidieron con las obtenidas después de la craniectomía en estudios piloto). Para efectuar estas mediciones, los animales se colocaron en un marco craneal estereotáctico, después de lo cual se sometieron a una incisión en la línea media cutánea desde el nasión hasta la línea nucal superior. La piel se apartó lateralmente y se bajó una sonda de láser doppler recta de 0,7 mm (modelo #PF2B) sobre la superficie cortical humedecida con una pequeña cantidad de solución salina fisiológica. Las lecturas se obtuvieron 2 mm posterior al bregma, a 3 mm y 6 mm de cada lado de la línea media, usando un micromanipulador estereotáctico y manteniendo un ángulo recto entre la sonda y la superficie cortical. Las mediciones del flujo sanguíneo relativo se realizaron inmediatamente después de la anestesia, después de la oclusión de la ACM y justo antes de la eutanasia, y se expresan como relación entre las intensidades de la señal doppler en el hemisferio isquémico y en el no isquémico. En los animales sometidos a una isquemia cerebral transitoria se efectuaron mediciones adicionales justo antes y justo después de retirar la sutura, iniciando la reperfusión.

El procedimiento quirúrgico/oclusión intraluminal de la ACM se consideró técnicamente adecuado cuando se observaba una reducción \geq 50% en el flujo sanguíneo cerebral relativo inmediatamente después de colocar el catéter intraluminal oclusivo (se excluyeron 15 de los 142 animales usados en este estudio [10,6%] debido a un cese inadecuado del flujo sanguíneo en el momento de la oclusión). En estudios preliminares se demostró que estos criterios de exclusión proporcionan niveles de isquemia suficientes para mostrar unos volúmenes de infarto uniformes en la tinción con TTC. La reperfusión se consideró técnicamente adecuada cuando el flujo sanguíneo cerebral en el momento de retirar el catéter ascendía a al menos dos veces el flujo sanguíneo cerebral presente durante la oclusión (13/17 animales en este estudio [76%]).

Temperatura: La temperatura interna durante el periodo que rodea al infarto se controló minuciosamente a lo largo del periodo experimental. Antes de la cirugía se registró una temperatura rectal inicial (sonda rectal Thermistemp YSI, modelo 74, Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH). Durante la operación, la temperatura se controló usando una superficie de operaciones controlada por termopar. Después de la oclusión de la ACM, los animales se colocaron durante 90 minutos en un incubador, manteniendo la temperatura del animal en 37ºC usando la sonda rectal conectada a través del termopar a una fuente de calor en el incubador. La temperatura se controló de forma similar en los animales sometidos a una isquemia transitoria, incluido tanto un periodo (isquémico) de 45 minutos como un periodo postisquémico de 90 minutos en el incubador. Tras colocarlos en el incubador de temperatura interna, los animales se devolvieron a sus jaulas para el resto del periodo de observación antes de sacrificarlos.

Examen neurológico: Antes de administrar la anestesia en el momento de la eutanasia, los ratones se examinaron en cuanto a un déficit neurológico obvio usando un sistema dividido en cuatro grados: (1) movimientos espontáneos normales, (2) el animal gira hacia la derecha, (3) el animal gira sobre sí mismo hacia la derecha, (4) el animal se acuclilla sobre las cuatro patas sin responder a estímulos nocivos. En estudios preliminares se demostró que este sistema predice de forma precisa el tamaño del infarto y se basa en sistemas desarrollados para el uso en ratas (6).

Análisis de los datos: Los volúmenes del accidente cerebrovascular, las puntuaciones del pronóstico neurológico, los flujos sanguíneos cerebrales y los datos de los gases en la sangre arterial se compararon usando un test t de Student desapareado. Los valores se expresan como medias \pm error típico, considerándose p < 0,05 estadísticamente significativo. Los datos de mortalidad, cuando se presentan, se evaluaron usando un análisis de chi-cuadrado.

Resultados

Efectos de la cepa: Se usaron tres cepas de ratón diferentes comúnmente usadas (CD1, C57/B16 y 129J) para comparar la variabilidad en el pronóstico del accidente cerebrovascular tras una isquemia cerebral focal permanente. Para comprobar que no había grandes diferencias anatómicas en la colateralización de la circulación cerebral se visualizó en las tres cepas el círculo de Willis usando tinta china (Figura 13). Estos estudios no revelaron grandes diferencias anatómicas. A continuación se sometieron ratones de tamaños similares (20 \pm 0,8 g, 23 \pm 0,4 g y 23 \pm 0,5 g para ratones 129J, CD1 y C57B1 respectivamente) a una isquemia focal permanente en condiciones normotérmicas usando una sutura oclusiva de nilón 6-0 de 12 mm de longitud. En el volumen de infarto se apreciaron diferencias significativas relacionadas con la cepa, siendo los infartos en los ratones 129J significativamente más pequeños que los observados en los ratones CD1 y C57/B16 pese a idénticas condiciones experimentales (Figura 14A). Las diferencias en el tamaño del infarto coincidían con el examen neurológico, observándose las puntuaciones más altas (es decir, el daño neurológico más grave) en los ratones C57/B16 y CD1 (Figura 14B).

Para determinar la relación entre el volumen de infarto y el flujo sanguíneo cerebral hacia la región central, se realizó una flujometría de láser doppler a través de la fina bóveda craneal murina. No se observaron diferencias en el flujo sanguíneo cerebral relacionadas con la cepa antes de la operación, lo que significa que no hay grandes diferencias anatómicas en la anatomía vascular (Figura 13). La medición del flujo sanguíneo cerebral inmediatamente después de insertar el catéter oclusivo reveló que con el procedimiento se generaban unos grados de reducción del flujo sanguíneo similares (el porcentaje del flujo ipsilateral/contralateral inmediatamente después de la inserción del catéter obstructivo era de 23 \pm 2%, 19 \pm 2%, 17 \pm 3% para los ratones 129J, CD1 y C57/B16, respectivamente). No resulta sorprendente que el flujo sanguíneo hacia la región central, medido a las 24 horas justo antes de la eutanasia, demostrara que los flujos sanguíneos más bajos correspondían a los animales con el daño neurológico más grave (Figura 14C).

Características anatómicas y fisiológicas de los ratones: Las presiones arteriales iniciales, así como las presiones arteriales tras la oclusión de la arteria cerebral media, eran prácticamente idénticas en todos los animales estudiados y no se vieron afectadas por la cepa ni el tamaño del ratón (Tabla I). El análisis de la sangre arterial respecto a pH, pCO_{2} y la saturación de oxígeno de la hemoglobina (%) tampoco reveló diferencias significativas (Tabla I).

Efecto del tamaño del animal y del calibre de la sutura oclusiva: Para investigar los efectos que ejerce el tamaño del ratón sobre el pronóstico del accidente cerebrovascular se sometieron ratones de dos tamaños diferentes (23 \pm 0,4 g y 31 \pm 0,7 g) a una isquemia cerebral focal permanente. Para eliminar otras posibles fuentes de variabilidad en estos experimentos, los experimentos se realizaron en condiciones normotérmicas en ratones de la misma cepa (CD1) usando suturas oclusivas de longitud y calibre idénticos (12 mm, nilón 6-0). En estas condiciones, los ratones pequeños (23 \pm 0,4 g) presentaron uniformemente grandes volúmenes de infarto (28 \pm 9% del hemisferio ipsilateral). En condiciones experimentales idénticas, los ratones grandes (31 \pm 0,7 g) mostraron infartos bastante más pequeños (3,2 \pm 3%, p = 0,02, Figura 15A), una menor morbilidad en el examen neurológico (Figura 15B) y una tendencia a mantener un mayor flujo sanguíneo cerebral ipsilateral tras el infarto que los animales más pequeños (Figura 15C).

Puesto que se barajó la hipótesis de que la reducción del tamaño del infarto en estos animales grandes podía estar relacionada con un desajuste entre el diámetro/longitud de la sutura oclusiva y de los vasos sanguíneos cerebrales, se diseñaron suturas oclusivas más largas/gruesas (13 mm, nilón 5-0) para el uso en estos ratones más grandes. Los ratones CD1 grandes (34 \pm 0,8 g) sometidos a una oclusión permanente con estas suturas oclusivas más grandes mostraron un marcado aumento en los volúmenes de infarto (50 \pm 10% del hemisferio ipsilateral, p < 0,0001 en comparación con los ratones grandes en los que se generó un infarto con la sutura oclusiva más pequeña, Figura 15A). Estos ratones más grandes en los que se generó un infarto con suturas oclusivas más grandes mostraron puntuaciones más altas para el déficit neurológico (Figura 15B) y flujos cerebrales ipsilaterales más bajos (Figura 15C) en comparación con los ratones de tamaño similar en los que se generó un infarto con suturas oclusivas más pequeñas.

Efectos de la temperatura: Para establecer el papel de la hipotermia perioperatoria en los volúmenes del infarto cerebral y los pronósticos neurológicos tras una oclusión de la ACM, se sometieron ratones C57/B16 pequeños (22 \pm 0,4 g) a una oclusión permanente de la ACM con una sutura de 12 mm y un calibre 6-0, manteniéndose la normotermia durante dos periodos de tiempo diferentes; el grupo 1 ("normotermia") se operó como se ha descrito anteriormente, manteniendo la temperatura en 37ºC desde el periodo preoperatorio hasta 90 minutos después de la oclusión. Los animales del grupo 2 ("hipotermia") se mantuvieron a 37ºC desde el preoperatorio hasta tan sólo 10 minutos después de la oclusión, como se ha descrito previamente (14). Después de retirarlos del incubador calentador controlado por termopar, la temperatura interna en este segundo grupo de animales descendió a 33,1 \pm 0,4ºC en el plazo de 45 minutos (y descendió a 31,3 \pm 0,2ºC al cabo de 90 minutos). Los animales operados en condiciones de normotermia prolongada (grupo 1) mostraron volúmenes de infarto más grandes (32 \pm 9%) que los animales hipotérmicos (grupos 2) (9,2 \pm 5%, p = 0,03, Figura 16A). Las diferencias en el volumen de infarto se reflejaron en diferencias en el déficit neurológico (3,2 \pm 0,4 frente a 2,0 \pm 0,8, p = 0,02, Figura 16B), pero eran en su mayoría independientes del flujo sanguíneo cerebral (52 \pm 5 frente a 52 \pm 7, p = NS, Figura 16C).

Efectos de la oclusión transitoria de la ACM: Puesto que las lesiones por reperfusión se consideran una causa importante del daño neuronal tras la oclusión cerebrovascular (25), se sometió un subgrupo de animales a un periodo transitorio (45 minutos) de isquemia seguido de una reperfusión, como se ha descrito anteriormente, y se compararon con aquellos animales que sufrieron una oclusión permanente de la ACM. El tiempo de oclusión se eligió en base a estudios preliminares (no mostrados) que mostraron unas tasas de mortalidad inaceptablemente altas (> 85%) con 180 minutos de isquemia y rara vez un infarto (< 15%) con 15 minutos de isquemia. Para minimizar la influencia perturbadora de otras variables se mantuvieron constantes las demás condiciones experimentales (se usaron ratones C57/B16 pequeños (22,5 \pm 0,3 g), la sutura oclusiva era de nilón 6-0 de 12 mm y los experimentos se realizaron en condiciones normotérmicas). La disminución inicial del FSC inmediatamente después de la oclusión fue similar en ambos grupos (16 \pm 2% frente a 17 \pm 3% para los grupos de oclusión transitoria y permanente, respectivamente, p = NS). La reperfusión se confirmó tanto por flujometría de láser doppler (flujo sanguíneo 2,3 veces mayor después de la retirada de la sutura oclusiva a 66 \pm 13%) como visualmente mediante la inyección intracardiaca del colorante azul de metileno en animales representativos. Los tamaños de infarto (29 \pm 10% frente a 32 \pm 9%), las puntuaciones del déficit neurológico (2,5 \pm 0,5 frente a 3,2 \pm 0,4) y el flujo sanguíneo cerebral al sacrificarlos (46 \pm 18% frente a 53 \pm 5%) fueron muy similares en los animales sometidos a una isquemia cerebral transitoria y reperfusión y los sometidos a una isquemia cerebral focal permanente (p=NS para todos los grupos) (Figuras 17A-17C).

Discusión

La creciente disponibilidad de ratones genéticamente alterados ha conducido a un mayor uso de modelos murinos de isquemia cerebral focal para implicar productos génicos específicos en la patogénesis del accidente cerebrovascular. Aunque publicaciones recientes describen el uso de una sutura intraluminal para ocluir la arteria cerebral media y crear así una isquemia cerebral permanente y/o transitoria en ratones, las modificaciones necesarias del informe técnico original en ratas sólo se han descrito someramente (8,14,17-19,24,26). Los experimentos descritos en la presente memoria no sólo proporcionan una explicación técnica detallada de un modelo murino adecuado para una isquemia focal de la arteria cerebral media tanto permanente como transitoria, sino que también tratan las posibles fuentes de variabilidad en el modelo.

Importancia de la cepa

Una de las posibles fuentes de variabilidad más importantes en el modelo murino de isquemia cerebral descrito en la presente memoria está relacionada con la cepa del animal usado. Los datos sugieren que de las tres cepas ensayadas, los ratones 129J son especialmente resistentes a lesiones neurológicas tras la oclusión de la ACM. Aunque Barone encontró igualmente diferencias entre los volúmenes del accidente cerebrovascular en 3 cepas de ratón (BDF, CFW y BALB/C), estas diferencias se atribuyeron a variaciones en las arterias comunicantes posteriores de estas cepas (4). Puesto que en el estudio no se observaron diferencias anatómicas muy evidentes en la anatomía cerebrovascular (Figura 13), los datos sugieren que también son importantes otras diferencias no anatómicas relacionadas con la cepa en el pronóstico tras la oclusión de la ACM.

Puesto que el pronóstico del accidente cerebrovascular difiere significativamente entre 2 cepas de ratón (129J y C57/B16) comúnmente usadas para producir ratones transgénicos por recombinación homóloga en células troncales embrionarias (11), los datos constituyen una importante advertencia para los experimentos realizados con ratones transgénicos. Dado que la progenie inicial del animal fundador de la creación de animales transgénicos con estas cepas presenta antecedentes mixtos de 129J/C57/B16, los experimentos deberían realizarse idealmente bien con controles hermanos o bien después de efectuar un número suficiente de retrocruzamientos para asegurar la pureza de la cepa.

Importancia del tamaño

Los animales más grandes requieren una sutura intraluminal más larga y gruesa para mostrar unos volúmenes de infarto comparables a los obtenidos en animales más pequeños con suturas oclusivas más pequeñas. La adaptación del tamaño de la sutura al del animal no sólo parece ser importante para producir infartos cerebrales uniformes, sino que mientras una sutura demasiado pequeña conduce a una isquemia insuficiente, una sutura demasiado grande conduce a frecuentes hemorragias intracerebrales y traumatismos vasculares (observación no publicada).

El uso de animales de tamaño similar es importante no sólo para minimizar la posible variabilidad relacionada con la edad en la susceptibilidad neuronal a un ataque isquémico, sino también para asegurar que pequeñas diferencias en el tamaño de los animales no ofusque la comparación de datos significativos. En este ejemplo se demuestra que unas diferencias de tamaño de tan sólo 9 gramos pueden tener un gran impacto en el volumen de infarto y el pronóstico neurológico tras una isquemia cerebral. Experimentos adicionales en los que se usó una sutura oclusiva de mayor calibre en animales más grandes sugieren que la mayor propensión de los animales más pequeños a sufrir accidentes cerebrovasculares más extensos no se debía a una resistencia relativa de los animales más grandes al daño neuronal isquémico, sino que se debía más bien al pequeño tamaño de la sutura usada para ocluir la ACM en animales grandes. Aunque estos datos se obtuvieron usando ratones CD1, se realizaron estudios similares con otras cepas de ratón, tales como C57/B16 (datos no publicados), que confirmaron estos resultados. En los informes publicados previamente se usan ratones de muchos tamaños (de 21 g a 35 g), así como diferentes diámetros y longitudes de la sutura, lo cual con frecuencia no se comunica (14,17). Los estudios indican que los tamaños del animal y de la sutura constituyen cuestiones metodológicas importantes que se deben tratar en los informes científicos.

Importancia de la temperatura

Hace tiempo que se sabe que la hipotermia protege numerosos órganos del daño isquémico, incluido el cerebro. Los estudios realizados en ratas han demostrado que una hipotermia intraisquémica de hasta 1 hora después de la oclusión de la ACM resulta protectora (2,15), reduciendo con temperaturas de 34,5ºC tanto la mortalidad como los volúmenes de infarto. Aunque estos resultados se han extrapolado a modelos murinos de isquemia cerebral en aquellos estudios que a menudo describen el mantenimiento de la normotermia en los animales, los periodos de seguimiento de la temperatura después de la oclusión de la ACM son extremadamente breves ("inmediatamente después de la cirugía" o "10 minutos después de la cirugía") (4,14). Los resultados indican que los animales no son capaces de autorregular su temperatura más allá de estos breves intervalos, volviéndose gravemente hipotérmicos durante el periodo postoperatorio, y que las diferencias de temperatura durante hasta 90 minutos después de la oclusión de la ACM pueden tener un profundo efecto en los índices pronósticos del accidente cerebrovascular tras la oclusión de la ACM (no se han estudiado periodos más largos de normotermia). Aunque otros han garantizado la normotermia usando un sistema de retroalimentación basado en la temperatura rectal similar al descrito en la presente memoria, con frecuencia no se especifica la duración de la normotermia (17). Los resultados sostienen una identificación clara de los métodos de seguimiento y mantenimiento de la temperatura, así como de las duraciones implicadas, de manera que los resultados experimentales se puedan comparar tanto dentro como entre los diferentes centros que estudian la fisiopatología del accidente cerebrovascular.

Oclusión transitoria frente a permanente

La fisiopatología de determinados aspectos de la isquemia cerebral permanente bien puede ser diferente de la de una isquemia cerebral seguida de una reperfusión, de manera que era importante describir un modelo que permitiera el análisis de cada uno de los estados. Aunque en la presente serie de experimentos no se estudiaron extensamente las diferencias entre estos dos modelos, no se encontraron en las condiciones ensayadas (45 minutos de isquemia seguida de 23 horas de reperfusión) diferencias significativas en ninguno de los índices pronósticos del accidente cerebrovascular. En otros modelos murinos de isquemia cerebral transitoria se han descrito duraciones variables de isquemia y reperfusión, durando los periodos isquémicos entre 10 minutos y 3 horas y los periodos de reperfusión entre 3 y 24 horas (17,24). Los estudios en ratas han mostrado que unos periodos de isquemia cortos seguidos de una reperfusión están asociados con infartos menos extensos que en el caso de una oclusión permanente (21,25). Sin embargo, a medida que la duración de la isquemia aumenta por encima de un umbral crítico (entre 120 y 180 minutos), la reperfusión está asociada con infartos más extensos (7,21,26). Para la presente serie de experimentos, las duraciones de la isquemia y de la reperfusión se eligieron de tal manera que se obtuvieran infartos comparables a los observados después de una oclusión permanente de la ACM, lo que probablemente explica por qué los datos no mostraron diferencias entre la isquemia permanente y transitoria. En el modelo transitorio estas duraciones se eligieron después de que experimentos piloto revelaran que periodos isquémicos más cortos (15 minutos) raras veces provocaban un infarto, mientras que 180 minutos de oclusión seguida de una reperfusión provocaba un infarto masivo y una mortalidad cercana al 100% en el plazo de 4 a 6 horas en animales normotérmicos (observación no publicada). Aunque los índices pronósticos del accidente cerebrovascular se pueden medir antes de 24 horas, se eligió un tiempo de observación de 24 horas porque la observación en este momento permite estudiar la muerte retardada en la zona de penumbra, que probablemente es clínicamente relevante para la fisiopatología del accidente cerebrovascular en los seres humanos. Además, en un modelo de rata se ha demostrado que 24 horas son suficientes para la maduración total del infarto (3,12,15,16).

Aspectos técnicos del modelo murino

Los aspectos técnicos quirúrgicos necesarios para crear una isquemia cerebral focal en ratones difiere en ciertos aspectos importantes de los de ratas. Los retractores de autorretención, por los que se ha abogado en informes anteriores en ratas (26), son difíciles de manejar en ratones. La retracción basada en suturas fijadas con cinta adhesiva constituye una mejor alternativa. En ratas se ha informado de la oclusión con pinza de las arterias carótidas proximal y distal tras la movilización de la arteria carótida externa (26), pero ésta produce un mayor traumatismo y hemorragias en la carótida en ratones. Sin control distal de la carótida interna, que no se ha descrito previamente en ratones, la hemorragia posterior de la arteria carótida externa resulta sistemáticamente incontrolable. Usando las técnicas descritas en este artículo la cirugía se puede terminar prácticamente sin pérdida de sangre, lo cual es especialmente importante dado el pequeño volumen de sangre de los ratones.

Al contrario que en el modelo de rata, la oclusión y transección de las ramificaciones de la arteria carótida externa y de la arteria pterigopalatina se logra en el modelo murino con tan solo una electrocauterización. En los informes anteriores sobre cirugía murina no quedó claro si se tomó la arteria pterigopalatina o no (17,24). Otros han descrito un método de oclusión permanente de la arteria carótida común e inserción transcarotídea de la sutura sin tener en cuenta el sistema de la carótida externa ni la arteria pterigopalatina. Si bien es eficaz para una oclusión permanente, este último método imposibilita realizar estudios de reperfusión.

El método de reperfusión descrito originalmente en la rata requiere la retirada ciega del catéter sin anestesia (26). Cuando esto se intentó hacer en estudios piloto en ratones, varios animales sufrieron una hemorragia. Por lo tanto, se desarrolló un método para eliminar la sutura bajo visualización directa en el animal anestesiado, que no sólo permite confirmar visualmente la reperfusión de la arteria carótida extracraneal sino también proporciona una hemostasia meticulosa. Además, el método permite obtener lecturas flujométricas de láser doppler inmediatas antes y después de la reperfusión en el animal anestesiado.

Estas lecturas flujométricas de láser doppler son similares a las descritas por Kamii et al. y Yang et al., en cuanto a que las lecturas se realizan de forma intermitente y con el uso de un micromanipulador estereotáctico (17,24). Las lecturas difieren, sin embargo, en que las coordenadas usadas (2 mm posterior y 3 y 6 mm lateral respecto al bregma) son ligeramente más laterales y posteriores que las coordenadas del área central y de penumbra publicadas previamente (1 mm posterior y 2 mm y 4,5 mm lateral respecto al bregma). Estas coordenadas, adoptadas en base a estudios piloto, son las mismas que las que usa Huang et al. (14).

Conclusión

Estos estudios muestran aspectos técnicos específicos de un modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión que permite reproducir las mediciones en diferentes laboratorios. Además, estos estudios proporcionan un marco para entender las variables de procedimiento importantes que puedan tener un gran impacto en el pronóstico del accidente cerebrovascular y deben conducir a la comprensión clara de las diferencias investigadas no relacionadas con el procedimiento. Más importante aún es que este estudio señala la necesidad de controlar minuciosamente la cepa de ratón, los tamaños del animal y de la sutura y la temperatura en los animales tanto experimentales como control. Las condiciones se pueden establecer de manera que el pronóstico del accidente cerebrovascular sea similar entre los modelos de isquemia cerebral focal permanente y de isquemia cerebral focal transitoria, lo que debe facilitar la comparación directa y permitir el estudio del daño causado por reperfusión. El modelo descrito en este estudio debe proporcionar un marco coherente para evaluar los resultados de futuros estudios en animales transgénicos para facilitar la comprensión de la contribución que realizan productos génicos específicos a la fisiopatología del accidente cerebrovascular.

TABLA I Parámetros fisiológicos pre- y postoperatorios

PAM, presión arterial media; pCO_{2}, presión parcial de CO_{2} arterial (mm Hg); O_{2} Sat, saturación de O_{2} (%); Hb, concentración de hemoglobina (g/dl); preoperatorio, animales anestesiados antes de la disección de la carótida; falso, animales anestesiados sometidos a la cirugía descrita en el texto, justo antes de la introducción de la sutura oclusiva; accidente cerebrovascular, animales anestesiados sometidos a la cirugía descrita en el texto, inmediatamente después de la introducción de la sutura oclusiva. p = NS para todas las comparaciones entre grupos (los datos mostrados son para ratones C57/B16 pequeños de 22 gramos).

Parámetro	Preoperatorio	Falso	Accidente
			cerebrovascular

PAM	102 \pm 5,5	94 \pm 1,9	88 \pm 4,9
pH	7,27 \pm 0,02	7,23 \pm 0,04	7,28 \pm 0,01
pCO_{2}	46 \pm 1,3	44 \pm 1,3	47 \pm 3,5
O_{2} sat	89 \pm 1,6	91 \pm 1,8	85 \pm 2,2
Hb	14,6 \pm 0,42	14,3 \pm 0,12	14,2 \pm 0,12

Referencias

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Ejemplo 4 Exacerbación del daño cerebral en ratones que expresan el gen de la selectina P: Identificación del bloqueo de la selectina P como nueva diana para el tratamiento del accidente cerebrovascular

Actualmente existe un vacío terapéutico absoluto para el tratamiento del accidente cerebrovascular en evolución. Aunque la selectina P se expresa rápidamente en células endoteliales hipóxicas in vitro, el significado funcional de la expresión de selectina P en el accidente cerebrovascular permanece sin explorar. Con el fin de identificar las consecuencias fisiopatológicas de la expresión de selectina P y para identificar el bloqueo de la selectina P como un posible planteamiento nuevo para el tratamiento del accidente cerebrovascular, se realizaron experimentos usando un modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión. La expresión temprana de selectina P en la corteza cerebral postisquémica se demostró por la acumulación específica de IgG anti-selectina P murina radiomarcada. En experimentos paralelos, la acumulación de neutrófilos en la corteza isquémica de ratones que expresaban el gen de la selectina P (SP+/+) era significativamente mayor que la demostrada en ratones homocigotos carentes de selectina P (SP-/-). La entrada reducida de neutrófilos venía acompañada de un mayor reflujo cerebral postisquémico (medido por láser doppler) en los ratones SP-/-. Además, los ratones SP-/- mostraron volúmenes de infarto más pequeños (cinco veces menores, p < 0,05) y una mayor supervivencia en comparación con los ratones SP+/+ (88% frente a 44%, p < 0,05). El bloqueo funcional de la selectina P en ratones SP+/+ usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la selectina P murina también mejora el reflujo temprano y el pronóstico del accidente cerebrovascular en comparación con los controles. Estos datos son los primeros que demuestran un papel fisiopatológico para la selectina P en el accidente cerebrovascular y sugieren que el bloqueo de la selectina P puede representar una nueva diana terapéutica para el tratamiento del accidente cerebrovascular.

Introducción

El accidente cerebrovascular isquémico constituye hoy en día la tercera causa más frecuente de fallecimiento en Estados Unidos^{1}. Hasta hace muy poco no existía ningún tratamiento directo para reducir el daño del tejido cerebral en el accidente cerebrovascular en evolución. Aunque los estudios NINDS^{2} y ECASS^{3} sobre el accidente cerebrovascular agudo con rt-PA han sugerido que hay posibles beneficios terapéuticos de una reperfusión temprana^{4}, la mayor mortalidad observada después del tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo con estreptoquinasa^{5} pone de manifiesto el duro hecho de que en este momento no existe ningún tratamiento claramente eficaz para el accidente cerebrovascular en evolución. Este vacío en el armamento médico actual para el tratamiento del accidente cerebrovascular ha conducido a una serie de planteamientos innovadores^{6}, aún distintos de rt-PA, pero ninguno ha conquistado el campo clínico. Para identificar un posible tratamiento seguro y eficaz para el accidente cerebrovascular en evolución, se ha centrado la atención en el papel deletéreo de los neutrófilos reclutados. Un trabajo reciente en un modelo murino del accidente cerebrovascular reperfundido ha demostrado que la depleción de neutrófilos (PMNs) antes del accidente cerebrovascular minimiza las lesiones en el tejido cerebral y mejora el pronóstico funcional^{7}; los ratones carentes de la molécula de adhesión celular específica, ICAM-1, están igualmente protegidos^{7}. La selectina P, una molécula que se puede desplazar rápidamente a la superficie endotelial hipóxica desde reservorios previamente formados^{8}, es un importante mediador temprano del rodamiento de neutrófilos^{9}, que facilita la atracción de neutrófilos mediada por ICAM-1. Aunque la selectina P se expresa en el accidente cerebrovascular en primates^{10}, no se han publicado datos referentes al significado funcional de la expresión de selectina P en ninguno de los modelos de accidente cerebrovascular reperfundido o no reperfundido.

Para examinar el papel fisiopatológico de la selectina P en el accidente cerebrovascular, se empleó un modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión^{11} en el que se usaron tanto ratones de tipo silvestre como ratones que eran homocigotos para la ausencia del gen de la selectina P^{9} y una estrategia para la administración de un anticuerpo funcionalmente bloqueante contra la selectina P. Este estudio confirma no sólo que la expresión de selectina P tras la oclusión de la arteria cerebral media está asociada con un reflujo cerebral reducido después de la reperfusión y con un pronóstico desfavorable tras el accidente cerebrovascular, sino que el bloqueo de la selectina P confiere un grado significativo de protección cerebral postisquémica. Estos estudios constituyen la primera demostración del papel fisiopatológico de la expresión de selectina P en el accidente cerebrovascular y sugieren la excitante posibilidad de que las estrategias anti-selectina P pueden resultar útiles para el tratamiento del accidente cerebrovascular reperfundido.

Métodos

Ratones: Los experimentos se llevaron a cabo con ratones transgénicos carentes de selectina P, creados como se ha descrito anteriormente^{9} por recombinación homóloga en células troncales embrionarias J1 inyectadas en blastocitos C57BL/6 para obtener una transmisión en línea germinal y se retrocruzaron para obtener ratones homocigotos carentes de selectina P (SP-/-). Los experimentos se realizaron con ratones primos SP-/- o de tipo silvestre (SP+/+) de la tercera generación de retrocruzamientos con ratones C57BL/6J. Los animales tenían edades comprendidas entre siete y doce semanas y pesaban entre 25 y 36 gramos en el momento en que se realizaron los experimentos.

Oclusión transitoria de la arteria cerebral media: Los ratones se anestesiaron (0,3 ml de quetamina 10 mg/ml y xilazina 0,5 mg/ml, i.p.) y se colocaron en posición supina sobre una superficie de operaciones con control de la temperatura rectal (Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH). La temperatura interna de los animales se mantuvo a 37 \pm 1ºC durante la operación y durante 90 minutos después de la operación. Se realizó una incisión en la línea media del cuello para exponer la vaina de la carótida derecha bajo el microscopio de operaciones (aumento 16-25x, Zeiss, Thornwood, NY). La arteria carótida común se aisló con seda 4-0, y se aislaron y dividieron las arterias occipital, pterigopalatina y carótida externa. La oclusión de la arteria cerebral media (OACM) se efectuó introduciendo una sutura de nilón 5-0 de 13 mm redondeada por calor a través del muñón de la carótida externa. Una vez colocada la sutura oclusiva, el muñón de la arteria carótida externa se cauterizó y la herida se cerró. Al cabo de 45 minutos se retiró la sutura oclusiva para establecer la reperfusión. Estos procedimientos han sido descritos previamente en detalle^{9}.

Medición del flujo sanguíneo en la corteza cerebral: Las mediciones transcraneales del flujo sanguíneo cerebral se realizaron usando flujometría de láser doppler (Perimed, Inc., Piscataway, NJ), como se ha descrito previamente^{12}. Las mediciones del flujo sanguíneo cerebral relativo se llevaron a cabo como se indica usando una sonda láser doppler recta de 0,7 mm (modelo #PF303, Perimed, Piscataway, NJ) y puntos anatómicos previamente publicados (2 mm posterior al bregma, a 6 mm de cada lado de la línea media)^{11,13}; inmediatamente después de la anestesia, 1 y 10 minutos después de la oclusión de la arteria cerebral media, así como después de 30 minutos, 300 minutos y 22 horas de reperfusión. Los datos se expresan como relación entre las intensidades de la señal doppler en el hemisferio isquémico y en el no isquémico. Aunque este método no cuantifica el flujo sanguíneo cerebral por gramo de tejido, el uso de la flujometría de láser doppler realizada en puntos anatómicos exactamente definidos sirve como medio para comparar en serie los flujos sanguíneos cerebrales en el mismo animal a lo largo del tiempo. El procedimiento quirúrgico se consideró técnicamente adecuado cuando se observaba una reducción \geq 50% en el flujo sanguíneo cerebral relativo inmediatamente después de colocar la sutura intraluminal oclusiva. Estos métodos se han usado en estudios anteriores^{7,11}.

La anatomía cerebrovascular se determinó en animales representativos de la siguiente manera. Los ratones se anestesiaron y se efectuó una inyección antes de la muerte (0,1 ml) de tinta china:negro de carbono: metanol:solución salina fisiológica (1:1:1:1, v:v:v:v) por punción del ventrículo izquierdo. Los cerebros se prepararon por decapitación rápida seguida de una inmersión de 2 días a 4ºC en formalina al 10%, después de lo cual se fotografiaron las superficies inferiores para mostrar el patrón vascular del círculo de Willis.

Preparación y administración de proteínas marcadas con ^{125}I y de neutrófilos murinos marcados con ^{111}In: Los anticuerpos radioyodados se prepararon de la siguiente manera. Se radiomarcaron con ^{125}I una IgG monoclonal de rata anti-selectina P murina (clon RB 40.34, Pharmingen Co., San Diego, CA)^{14} y una IgG de rata no inmunológica (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) mediante el método de la lactoperoxidasa^{15} usando Enzymobeads (Bio-Rad, Hercules, CA). Los PMNs radiomarcados se prepararon de la siguiente manera. Se diluyó sangre citrada de ratones de tipo silvestre con NaCl (0,9%) en una relación 1:1 y seguidamente se sometió a una ultracentrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Después de la lisis hipotónica de los eritrocitos residuales (exposición de 20 s a H_{2}O destilada seguida de una reconstitución con NaCl al 1,8%) los PMNs se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los neutrófilos (5-7,5 x 10^{6}) se suspendieron en PBS con 100 \muCi de ^{111}indio-oxina (Amersham Mediphysics, Port Washington, NY) y se agitaron suavemente durante 15 minutos a 37ºC. Tras lavarlos con PBS, los PMNs se sedimentaron con cuidado (450 x g) y se resuspendieron en PBS a una concentración final de 1,0 x 10^{6} células/ml.

Examen neurológico: Antes de administrar la anestesia se examinó a los ratones respecto a la existencia de un déficit neurológico 22 h después de la reperfusión usando un sistema de cuatro grados^{11}: Se dio una puntuación de 1 cuando el animal mostraba movimientos espontáneos normales; se dio una puntuación de 2 cuando se observaba que el animal giraba hacia el lado ipsilateral; se dio una puntuación de 3 cuando se observaba que el animal giraba en sentido longitudinal (en el sentido de las agujas del reloj visto desde la cola); se dio una puntuación de 4 cuando el animal no respondía a estímulos nocivos. Este sistema de puntuación se ha descrito previamente en ratones^{7,11} y se basa en sistemas de puntuación similares a los usados en ratas^{16,17}.

Cálculo de los volúmenes de infarto: Tras el examen neurológico se anestesiaron los ratones y se obtuvieron las últimas mediciones del flujo sanguíneo cerebral. La eutanasia humanitaria se realizó por decapitación, y los cerebros se extrajeron y se colocaron en una matriz para cerebros de ratón (Activational Systems Inc., Warren, MI) para cortarlos en secciones de 1 mm. Las secciones se sumergieron en cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio al 2% (TTC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en solución salina tamponada con fosfato al 0,9%, se incubaron durante 30 minutos a 37ºC y se introdujeron en formalina al 10%^{18}. El cerebro que sufrió el infarto se visualizó en forma de un área de tejido no teñido. Los volúmenes de infarto se calcularon a partir de secciones planimétricas seriadas y se expresan en porcentaje del infarto en el hemisferio ipsilateral. Este método de cálculo de los volúmenes de infarto se ha usado anteriormente^{7,11,13,18} y se ha correlacionado con los demás índices pronósticos funcionales del accidente cerebrovascular que se han descrito anteriormente.

Administración de anticuerpos no marcados, PMNs radiomarcados y anticuerpos radiomarcados: Para los experimentos en los que se administraron anticuerpos no marcados se usó uno de los dos tipos de anticuerpos diferentes; bien una IgG monoclonal de rata anti-selectina P murina bloqueante (clon RB 40.34, Pharmingen Co., San Diego, CA)^{14,19,20} o bien una IgG de rata no inmunológica (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Los anticuerpos se prepararon a 30 \mug en 0,2 ml de solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,1% de albúmina de suero bovina y que se administró después en la vena del pene 10 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media. En experimentos separados se inyectaron por vía intravenosa anticuerpos radiomarcados (0,15 ml, \approx2,6 x 10^{5} cpm/\mul) 10 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media. En un tercer conjunto de experimentos se administraron por vía intravenosa PMNs radiomarcados 10 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media en forma de una inyección de 100 \mul (los PMNs radiomarcados se mezclaron con solución salina fisiológica hasta un volumen total de 0,15 ml; \approx3 x 10^{6} cpm/\mul). Para los experimentos en los que se administraron anticuerpos no marcados, el momento en el que se realizaron las mediciones se indica en el texto, usando los métodos antes descritos para determinar el flujo sanguíneo cerebral, los volúmenes de infarto y la mortalidad. Para aquellos experimentos en los que se administraron anticuerpos radiomarcados o PMNs radiomarcados, los ratones se sacrificaron en los tiempos indicados, y los cerebros se extrajeron inmediatamente y se dividieron en los hemisferios ipsilateral (postisquémico) y contralateral. Se midió la deposición de anticuerpos o neutrófilos radiomarcados y se expresó en cpm ipsilaterales/contralaterales.

Análisis de los datos: Se compararon el flujo sanguíneo cerebral, el volumen de infarto y la deposición de ^{111}InPMN usando el test t de Student para variables desapareadas. Las puntuaciones del déficit neurológico se compararon usando el test U de Mann-Whitney. Se realizó un ANOVA de dos vías para detectar diferencias significativas entre la deposición de anticuerpos inicial y final (30 min) en los dos grupos (experimental frente a falso). El test t de Student para variables desapareadas se realizó para evaluar las diferencias dentro del grupo (inicial frente al punto temporal de 30 min). Las diferencias en la supervivencia entre los grupos se analizó usando el análisis de contingencia con la estadística de chi-cuadrado. Los valores se expresan como media \pm error típico, considerándose un valor de p < 0,05 estadísticamente significativo.

Resultados

Expresión de selectina P en el accidente cerebrovascular murino: Puesto que la selectina P media la fase inicial de la adhesión de los leucocitos a las células endoteliales activadas^{21}, se examinó la expresión temprana de selectina P en el cerebro en un modelo murino del accidente cerebrovascular reperfundido. Los ratones a los que se administró antes de la cirugía una IgG monoclonal de rata anti-selectina P de ratón marcada con ^{125}I mostraron un aumento del 216% en la acumulación del anticuerpo a los 30 minutos de reperfusión en comparación con los animales con operación falsa (p < 0,001, Figura 18A). Para demostrar que este grado de deposición de anticuerpos en el hemisferio reperfundido se debía a la expresión de selectina P en lugar de a una acumulación inespecífica, se llevó a cabo una comparación con animales tratados de forma idéntica a los que se administró una IgG de rata no inmunológica marcada con ^{125}I. Estos experimentos demostraron que hubo una acumulación significativamente mayor de la IgG anti-selectina P que de la IgG no inmunológica (p < 0,025, Figura 18A), lo que sugiere que la selectina P se expresa en el cerebro en el plazo de 30 minutos de reperfusión.

Acumulación de neutrófilos en el accidente cerebrovascular murino: Para trazar el curso temporal durante el que se produce la entrada de PMN tras el accidente cerebrovascular se midió la acumulación de PMN marcados con ^{111}In en ratones de tipo silvestre (SP+/+) antes de la OACM, inmediatamente después y 10 minutos después de la OACM y a los 30 min, 300 min y 22 h de reperfusión. En los ratones SP+/+, la acumulación de PMNs comienza pronto después de iniciarse la isquemia focal y continúa durante el periodo de reperfusión (Figura 18B). Para establecer el papel de la selectina P en esta acumulación postisquémica de neutrófilos se realizaron experimentos usando ratones homocigotos para la ausencia del gen de la selectina P (SP-/-). Los ratones SP-/- mostraron una acumulación de PMNs significativamente reducida tras la oclusión de la arteria cerebral media y la reperfusión (Figura 18B).

Papel de la SP en la ausencia de reflujo cerebrovascular: Para determinar si la reducción en la acumulación de PMNs en los ratones SP-/- daba como resultado un mayor flujo sanguíneo cerebral después de restablecer el flujo, se obtuvieron mediciones en serie del FSC relativo tanto en ratones SP+/+ como SP-/- mediante flujometría de láser doppler. Antes de iniciar la isquemia (Figura 19, punto a), los flujos sanguíneos cerebrales relativos eran prácticamente idénticos entre los grupos. La oclusión de la arteria cerebral media (Figura 19, punto b) estaba asociada con un descenso del flujo sanguíneo cerebral prácticamente idéntico en ambos grupos. Justo antes de retirar la sutura oclusiva intraluminal, a los 45 minutos de isquemia (Figura 19, punto c), los flujos sanguíneos cerebrales subieron ligeramente aunque permanecieron significativamente deprimidos en comparación con los flujos iniciales. Inmediatamente después de retirar la sutura oclusiva para iniciar la reperfusión (Figura 19, punto d), los flujos sanguíneos cerebrales aumentaron de forma comparable en ambos grupos (\approx 60% del inicial en los ratones SP-/- y SP+/+). El hecho de que los flujos sanguíneos cerebrales tras la reperfusión no alcancen de forma inmediata los niveles previos a la oclusión es característico de la ausencia de reflujo cerebrovascular^{22}, representando la disminución subsiguiente en los flujos sanguíneos cerebrales tras la reperfusión una hipoperfusión cerebral postisquémica retardada^{23}. Tras 30 minutos de reperfusión (Figura 19, punto e), los flujos sanguíneos cerebrales divergieron entre los dos grupos de animales, mostrando los animales SP-/- unos flujos sanguíneos cerebrales relativos significativamente más elevados que los controles SP+/+ (p < 0,05) (Figura 19, punto f). Esta divergencia reflejó diferencias significativas en la hipoperfusión cerebral postisquémica retardada y persistió durante el periodo de observación de 22 horas.

Puesto que se ha comunicado que variaciones en la anatomía cerebrovascular dan como resultado diferencias en la susceptibilidad de los ratones al accidente cerebrovascular experimental^{24}, se efectuó una tinción con tinta china/negro de carbono para visualizar el patrón vascular del círculo de Willis en ratones tanto SP-/- como SP+/+. Estos experimentos demostraron que no había grandes diferencias anatómicas en el patrón vascular de la circulación cerebral (Figura 20).

Pronóstico del accidente cerebrovascular: El significado funcional de la expresión de selectina P se ensayó comparando los índices pronósticos del accidente cerebrovascular en ratones SP-/- con los de los controles SP+/+. Los ratones SP-/- estaban significativamente protegidos contra los efectos de la isquemia cerebral focal y la reperfusión, con una reducción de 77% en el volumen de infarto (p < 0,01) en comparación con los controles selectina P +/+ (Figura 21A). Esta reducción en el volumen de infarto viene acompañada de una tendencia hacia un menor déficit neurológico (p = 0,06, Figura 21B) y una mayor supervivencia (p < 0,05; Figura 21C) en los animales SP-/-.

Efecto del bloqueo de selectina P: Tras observar el papel funcional de la expresión de selectina P en el accidente cerebrovascular usando ratones mutantes de deleción, se realizaron experimentos para determinar si el bloqueo farmacológico de la selectina P puede mejorar el pronóstico del accidente cerebrovascular en ratones SP+/+. Usando una estrategia de administración de un anticuerpo monoclonal de rata anti-selectina P de ratón bloqueante (clon RB 40.34,^{14,19,20}) o de una IgG de rata control no inmunológica justo antes de la cirugía, se observó que los ratones que recibieron el anticuerpo bloqueante presentaban mayores flujos sanguíneos cerebrales a los treinta minutos de reperfusión (Figura 22A), así como menores déficits neurológicos (Figura 22B), menores volúmenes de infarto cerebral (Figura 22C) y una tendencia hacia una menor mortalidad en comparación con los controles (Figura 22D).

Discusión

Pese al considerable progreso en los últimos años en la prevención primaria del accidente cerebrovascular^{1}, las opciones terapéuticas para tratar el accidente cerebrovascular en evolución siguen siendo extremadamente limitadas^{6}. Aunque se pensaba que la publicación el pasado otoño de dos ensayos de puntos anatómicos que demuestran una morbilidad reducida tras el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico con rt-PA^{2,3} conduciría a una nueva era de la terapia trombolítica en el tratamiento del accidente cerebrovascular^{4}, el entusiasmo se ha moderado algo en vista de la transformación hemorrágica y la mayor mortalidad observadas en los pacientes con accidente cerebrovascular isquémico tratados con estreptoquinasa^{5}. Estos ensayos divergentes hacen que el desarrollo de nuevas terapias seguras para el tratamiento del accidente cerebrovascular en evolución sea más crítico que nunca. Aunque el restablecimiento del flujo sanguíneo al cerebro postisquémico proporciona nuevas oportunidades para una intervención terapéutica temprana, la reperfusión es un arma de doble filo. Dado el potencial citotóxico de los neutrófilos^{25}, no resulta sorprendente que la entrada de neutrófilos en el tejido cerebral postisquémico pueda producir más daño y empeorar el pronóstico tras un accidente cerebrovascular experimental^{7,26-29}. Usando un modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión se ha identificado recientemente un importante papel contribuyente para la molécula de adhesión celular ICAM-1 en la acumulación de neutrófilos a las 22 horas después del accidente cerebrovascular^{7}. Sin embargo, un aumento de la expresión de ICAM-1 endotelial cerebrovascular requiere acontecimientos de transcripción y traducción de novo, lo que requiere tiempo. Por el contrario, la selectina P, una glicoproteína transmembranal que media las fases más tempranas de la adhesión de neutrófilos, se puede movilizar desde reservorios previamente formados para expresarse rápidamente en la superficie de las células endoteliales isquémicas^{8,30}. Puesto que los ensayos clínicos de la terapia trombolítica para el accidente cerebrovascular demuestran una estrecha ventana temporal para un posible beneficio (en las primeras horas tras iniciarse el accidente cerebrovascular)^{2,3,5}, esto sugiere que las estrategias diseñadas para interferir en las fases más tempranas de la adhesión de PMNs pueden presentar un beneficio teórico en el accidente cerebrovascular en seres humanos. Estos ensayos deberían tener como resultado que se presentase un mayor número de pacientes a una intervención terapéutica temprana, aumentando la necesidad de tratar la cuestión del daño por reperfusión en zonas médicamente revascularizadas. Además, estos ensayos recalcan la necesidad apremiante de entender las contribuciones que realizan moléculas de adhesión individuales a la patogénesis del accidente cerebrovascular.

A pesar del gran volumen de bibliografía que describe el papel de la selectina P en otros modelos de isquemia y reperfusión^{8,31-34}, se sabe sorprendentemente poco acerca del papel de la selectina P en el accidente cerebrovascular. Es importante conocer el papel específico que desempeña la selectina P en la vasculatura cerebral, ya que los requerimientos de moléculas de adhesión varían entre los lechos vasculares y los estados estudiados. Por ejemplo, en un modelo de trasplante intestinal^{35}, los anticuerpos anti-selectina P no redujeron el daño por reperfusión, mientras que los anticuerpos anti-CD11/CD18 sí lo hicieron. Mientras que el bloqueo de la selectina P era ineficaz en la reducción de la adhesión de PMNs y la filtración de albúmina en un modelo de rata de isquemia y reperfusión mesentérica, el bloqueo de ICAM-1 sí era eficaz^{36}. En un modelo de rata de isquemia/reperfusión de las extremidades posteriores, los requerimientos de selectina para la adhesión de PMNs difería entre los lechos vasculares de los músculos pulmonar y crural.

El único estudio publicado que trata de la selectina P en el cerebro isquémico consiste en una descripción histopatológica del accidente cerebrovascular en primates, en el que la expresión de selectina P estaba aumentada en la microvasculatura lenticuloestriada^{10}. Además, no existen datos que reflejen el significado funcional de esta expresión de selectina P. Los presentes estudios se realizaron para estudiar si la expresión de selectina P contribuye a la acumulación de neutrófilos en el cerebro postisquémico, a la ausencia de reflujo y al daño tisular en un modelo murino del accidente cerebrovascular reperfundido. La expresión de selectina P se demostró por una mayor deposición de anticuerpos radiomarcados en la zona isquémica usando un modelo recientemente establecido de isquemia cerebral focal y reperfusión en ratones^{11}. En esta técnica, la deposición de anticuerpos en el hemisferio isquémico se normalizó en cada animal respecto a la presente en el hemisferio no isquémico, no sólo para minimizar las posibles variaciones en el volumen de inyección o en el volumen de distribución, sino para poder comparar los animales a los que se administraron diferentes anticuerpos. Puesto que la alteración de la función de barrera endotelial en la corteza isquémica puede aumentar la deposición no selectiva de anticuerpos, se realizaron experimentos similares con una IgG control de rata. Estos datos muestran que el anticuerpo que se une a la selectina P se deposita a una mayor velocidad que el anticuerpo control, lo que sugiere que la expresión local de selectina P está aumentada en el tejido reperfundido. Estos datos del modelo murino coinciden con los presentados en un modelo de babuino del accidente cerebrovascular^{10}, en el que la expresión de selectina P aumentó en el plazo de 1 hora después del episodio isquémico.

El papel de la expresión de selectina P en el reclutamiento de PMNs hacia la zona postisquémica se demostró usando una estrategia en la que se midió la acumulación de PMNs marcados con ^{111}In. Aunque se ha informado previamente que a las 22 horas está incrementada la acumulación de PMNs en el hemisferio isquémico^{7}, los presentes datos del curso temporal demuestran que la acumulación de PMNs comienza poco después de iniciarse la isquemia. La falta de expresión del gen de la selectina P se asoció con una acumulación reducida de PMNs, lo que sugiere la participación de la selectina P en el reclutamiento de PMNs en el cerebro postisquémico. Sin embargo, los animales carentes de selectina P mostraron una modesta acumulación de neutrófilos (aunque menor que el control) a las 22 horas. Estos datos indican que la selectina P no es el único mecanismo efector responsable del reclutamiento de PMNs en el cerebro postisquémico y son coherentes con los datos anteriores, según los cuales ICAM-1 también participa en la adhesión postisquémica de PMNs^{7}. Además, estos datos no difieren de aquellos en los que la instilación abdominal de tioglicolato en ratones deficientes de selectina P causó un retraso (pero no la ausencia) en el reclutamiento de PMNs^{9}.

Debido a la necesidad apremiante de identificar las razones por las cuales no se produce la reperfusión, los presentes estudios examinaron el papel de la selectina P en la hipoperfusión cerebral postisquémica retardada^{22,23}, el fenómeno por el cual el flujo sanguíneo decrece durante la reperfusión a pesar de restablecerse las presiones de perfusión adecuadas. En modelos de isquemia en el corazón, la ausencia de reflujo empeora a medida que el tiempo pasa tras la reperfusión^{37}, lo que sugiere un papel importante para los mecanismos efectores reclutados, tales como trombosis microcirculatoria progresiva, disfunción vasomotora y reclutamiento de PMNs. En otros modelos se ha demostrado que tanto las reacciones de adhesión dependientes de selectina P como las dependientes de ICAM-1^{38} y la obstrucción capilar por PMNs^{39} participan en la ausencia de reflujo postisquémico. En el cerebro, los PMNs se han implicado en la ausencia de reflujo cerebral postisquémico^{40,41}, pero no se ha esclarecido el papel de la selectina P en este proceso. El presente estudio usa una técnica relativamente poco invasiva (láser doppler) para obtener mediciones en serie del flujo sanguíneo cerebral relativo con el fin de establecer la existencia, el curso temporal y la dependencia de selectina P de la ausencia de reflujo cerebrovascular postisquémico. En estos experimentos se sometieron animales carentes de selectina P y controles a unos grados de isquemia prácticamente idénticos, y la recuperación instantánea del flujo sanguíneo tras retirar la sutura oclusiva intraluminal era la misma en ambos grupos. Sin embargo, el flujo sanguíneo cerebral disminuyó en los animales selectina P +/+ en el periodo de tiempo que sigue a la reperfusión. Por el contrario, los animales SP-/- mostraron sólo una ligera hipoperfusión cerebral postisquémica retardada. Esta disminución tardía (aunque limitada) del flujo sanguíneo cerebral a las 22 horas es coherente con el modesto reclutamiento de PMNs observado en los animales SP-/- durante el mismo periodo de tiempo. De nuevo esto sugiere que otros mecanismos efectores (tales como ICAM-1) pueden ser responsables de la disminución tardía del flujo sanguíneo cerebral en los animales -/-.

El presente conjunto de estudios deja claros los efectos funcionales de la expresión de selectina P: los animales que no expresan el gen de la selectina P (o los animales SP+/+ tratados con un anticuerpo anti-selectina P funcionalmente bloqueante) muestran infartos más pequeños y una mayor supervivencia, y los supervivientes muestran mejores pronósticos neurológicos que los controles. Cuando estos datos se consideran junto con los datos previamente publicados que demuestran un papel deletéreo de la expresión de ICAM-1 en el accidente cerebrovascular^{7}, resulta cada vez más obvio que existen múltiples medios para reclutar los PMNs hacia la corteza cerebral postisquémica y que el bloqueo de cada uno de ellos constituye una posible estrategia para mejorar el pronóstico del accidente cerebrovascular en los seres humanos. Una vez reconocida la importancia de la reperfusión a tiempo en la detención del avance del frente de la muerte neuronal tras el accidente cerebrovascular, la interferencia en los estadios más tempranos de la adhesión de PMNs parece ser una opción atractiva para reducir la morbilidad y mortalidad. De hecho, las estrategias anti-molécula de adhesión no sólo pueden ser beneficiosas por sí mismas (es decir, incluidos los pacientes que no se pueden seleccionar para trombolisis), sino que pueden ampliar la ventana de oportunidades para la intervención trombolítica^{42}. El presente conjunto de estudios contribuye a la comprensión de los mecanismos fisiopatológicos que funcionan en el accidente cerebrovascular reperfundido. Estos estudios sugieren la necesidad de realizar ensayos clínicos de terapias para el accidente cerebrovascular en evolución que optimicen el ambiente de reperfusión para reducir la acumulación de PMNs.

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Ejemplo 5 Los ratones homocigotos carentes de selectina P son resistentes a la isquemia cerebral focal y al daño por reperfusión

Sigue debatiéndose el papel de los neutrófilos (PMNs) en la potenciación del daño producido por reperfusión en una isquemia focal en el sistema nervioso central. Un paso temprano importante en la captación de PMNs circulantes por la vasculatura es mediado por la selectina P expresada en el endotelio postisquémico. Aunque se ha descrito la expresión temprana y persistente de selectina P endotelial en microvasos del cerebro tras una oclusión de la arteria cerebral media en babuinos, no se han determinado las consecuencias de la expresión de selectina P endotelial en el accidente cerebrovascular. Para definir el papel de la selectina P en el accidente cerebrovascular se usó un modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión que consistía en una oclusión intraluminal de la arteria cerebral media (ACM) de 45 minutos de duración seguida de 22 horas de reperfusión en dos grupos de ratones; ratones transgénicos que eran homocigotos en cuanto a la ausencia de selectina P (SP-/-) y primos de tipo silvestre como control (SP+/+). Los volúmenes de infarto cerebral se calcularon a partir de secciones planimétricas seriadas teñidas con cloruro de trifeniltetrazolio y se expresaron en porcentaje del tejido que ha sufrido un infarto en el hemisferio ipsilateral. El pronóstico neurológico se basó en el comportamiento del animal observado por un investigador imparcial (1: sin déficit; 2: giros hacia un lado; 3: giros sobre sí mismo; 4: inmóvil). El flujo sanguíneo cerebral (FSC) en la corteza ipsilateral se determinó mediante flujometría de láser doppler y se expresó en porcentaje del FSC en la corteza contralateral. Los ratones SP-/- mostraron una reducción de 3,8 veces en los volúmenes de infarto en comparación con los controles SP+/+ (7,6 \pm 4,4% frente a 29,2 \pm 10,1%, p < 0,05). Esta reducción en los volúmenes de infarto en ratones carentes de selectina P se reflejó en una mayor supervivencia (87% frente a 42%, p < 0,05) y en una tendencia hacia un menor déficit neurológico (1,9 \pm 0,4 frente a 2,5 \pm 0,3, p=NS) en los supervivientes. Puesto que el flujo sanguíneo cerebral tendía a aumentar tras la isquemia y reperfusión cerebral en el cohorte SP-/- (65 \pm 11% frente a 46 \pm 18% para los controles, p=NS), estos estudios sugieren que la adhesión dependiente de selectina P puede contribuir a la ausencia de reflujo cerebral. Resumiendo, estos datos atribuyen un papel importante a la expresión de selectina P en la fisiopatología del accidente cerebrovascular y sugieren nuevas estrategias farmacológicas para mejorar el pronóstico del accidente cerebrovascular.

Ejemplo 6 La ausencia del gen de la selectina P reduce la acumulación de neutrófilos en el cerebro postisquémico, la ausencia de reflujo y el daño tisular en un modelo murino del accidente cerebrovascular reperfundido

Estudios recientes en seres humanos indican que el restablecimiento del flujo sanguíneo cerebral (FSC) durante el periodo temprano tras iniciarse el accidente cerebrovascular reduce las secuelas neurológicas. Se supuso que la selectina P (SP), una molécula de adhesión de neutrófilos (PMN) de actuación temprana expresada en el endotelio hipóxico, puede desempeñar un importante papel fisiopatológico en el accidente cerebrovascular en evolución reperfundido. Se realizaron estudios preliminares en un modelo murino de isquemia cerebral focal transitoria que consistía en una oclusión intraluminal de la arteria cerebral media de 45 minutos de duración seguida de 22 horas de reperfusión. En este modelo, los ratones que no expresaban el gen de la SP (SP-/-) presentaban menores volúmenes de infarto, menores puntuaciones del déficit neurológico y una mayor supervivencia en comparación con los controles de tipo silvestre (SP+/+). Los presentes estudios se realizaron para definir adicionalmente el (los) mecanismo(s) del daño cerebral inducido(s) por SP. Los ratones SP+/+ (n = 6) a los que se administró antes de la cirugía una IgG anti-SP marcada con ^{125}I mostraron una acumulación del anticuerpo de 216% en el hemisferio ipsilateral a los 30 minutos de reperfusión, respecto a los animales con operación falsa (n = 6, p < 0,001) o a los animales a los que se administró una IgG no inmunológica y que se sometieron a una isquemia cerebral focal transitoria y a 30 min de reperfusión (n = 4, p < 0,03). En los ratones SP+/+, la acumulación de PMNs comienza poco después de iniciarse la isquemia focal y continúa durante todo el periodo de reperfusión (acumulación de ^{111}In-PMN ipsilateral/contralateral 2 veces mayor a las 22 horas, n = 8, p < 0,05). Los ratones SP-/- mostraron a las 22 horas una reducción de 25% en la acumulación de PMNs en el hemisferio ipsilateral (n = 7, p < 0,05). El efecto de la expresión de SP sobre la ausencia de reflujo en el cerebro postisquémico se investigó midiendo en serie el FSC ipsilateral durante la evolución del accidente cerebrovascular. Aunque los FSC iniciales, tras la oclusión y al inicio de la reperfusión eran idénticos, los FSCs a los 30 minutos de reperfusión eran significativamente mayores en los ratones SP-/- (n = 5) que en los ratones SP+/+ (n = 8, 2,4 veces mayor, p < 0,05). Esta diferencia se mantuvo durante el resto del periodo de reperfusión de 22 h. Estos datos indican un importante papel temprano para la SP en el reclutamiento de PMNs, la ausencia de reflujo postisquémico y el daño tisular en el accidente cerebrovascular en evolución. Es la primera vez que se demuestra un papel fisiopatológico para la SP en el daño cerebral por reperfusión, lo que sugiere que el bloqueo de la SP puede constituir una diana terapéutica para el tratamiento del accidente cerebrovascular reperfundido.

Ejemplo 7 Monóxido de carbono y el accidente cerebrovascular en evolución

El gas monóxido de carbono, un producto secundario tóxico del catabolismo de hem, está implicado en la potenciación y memoria a largo plazo en el sistema nervioso central. Sin embargo, no se conocen otros papeles fisiológicos para la producción de CO en el cerebro. Puesto que la hemooxigenasa se induce en estados inflamatorios, se investigó si la producción endógena de CO puede desempeñar un papel protector en el cerebro en el caso de un accidente cerebrovascular. En un modelo murino de isquemia cerebral focal se indujo la hemooxigenasa de tipo I a los niveles de ARNm (transferencia Northern) y de proteína (transferencia Western) y se localizó en el endotelio vascular cerebral en el hemisferio isquémico por hibridación in situ y análisis inmunohistoquímicos. La producción local de CO se observó por medición directa en la zona isquémica. En experimentos paralelos, las células endoteliales del cerebro de ratón expuestas a un entorno hipóxico mostraron una inducción similar de la producción de ARNm y proteína de hemooxigenasa y de CO. Para determinar si la producción de CO estaba relacionada con la fisiopatología del accidente cerebrovascular, se bloqueó la producción de CO mediante la administración de protoporfirina de estaño (confirmado por medición directa de niveles locales de CO reducidos). Estos animales mostraron unos volúmenes de infarto significativamente más grandes, peores pronósticos neurológicos y una mortalidad aumentada en comparación con los controles no tratados. Además, la administración de CO antes del accidente cerebrovascular confiere una protección cerebral significativa. Puesto que esta protección no se observó en animales tratados con biliverdina, el producto secundario coincidente del catabolismo de hem, estos datos sugieren que la producción endógena de CO per se desempeña un papel protector en el accidente cerebrovascular en evolución.

Introducción

Existe un considerable volumen de bibliografía y el reconocimiento común de los efectos tóxicos del monóxido de carbono (CO) exógeno, que se une con avidez a los centros hem inhibiendo el transporte de oxígeno y envenenando la respiración celular. Durante muchos años el CO se consideró un producto secundario adicional del catabolismo de hem, pero datos recientes obtenidos en el cerebro sugieren que el CO producido en neuronas discretas por la hemooxigenasa II puede modular la potenciación a largo plazo. En ratas, la exposición a un choque térmico se ha correlacionado con la expresión de una proteína de choque térmico de 32 kDa (hemooxigenasa I) en varios órganos, incluido el cerebro. El significado fisiológico de esta inducción de la HSP32 se ha atribuido teleológicamente a la liberación estequiométrica de CO por la hemooxigenasa I (HOI). En la mayoría de los estudios experimentales, la inducción de la HOI sirve únicamente como marcador adicional de estrés oxidativo celular. La reciente identificación de un papel antiinflamatorio para la HOI en un modelo de inflamación peritoneal se ha atribuido a la producción del antioxidante natural biliverdina durante el proceso catabólico de hem.

El presente estudio informa por primera vez de que el cerebro postisquémico genera enormes cantidades de CO. En un modelo murino de isquemia cerebral focal, en el que se ocluye la arteria cerebral media mediante una sutura intraluminal, la producción de HOI en el hemisferio isquémico estaba significativamente aumentada en comparación con el hemisferio no isquémico. Puesto que los análisis inmunohistoquímicos y la hibridación in situ localizaron la fuente de HOI en las células endoteliales del hemisferio isquémico, se usó un modelo in vitro de hipoxia celular para confirmar la inducción del mensajero, la proteína y la actividad de HOI en células endoteliales microvasculares cerebrales en ratones. El bloqueo de la producción de CO usando protoporfirina IX de estaño o de cinc se asoció con un aumento del volumen del infarto cerebral y de la mortalidad, mientras que la exposición de animales a CO justo antes de la isquemia confería una protección cerebral significativa dependiente de la dosis en una estrecha ventana terapéutica. La administración de biliverdina no presentaba ningún efecto en este modelo. Resumiendo, estos datos indican que el tejido cerebral isquémico produce grandes cantidades de CO, cuya producción confiere una protección cerebral que limita la cantidad de tejido destruido durante el accidente cerebrovascular.

Métodos

Preparación y administración de protoporfirina. Primero se disolvieron cloruro de protoporfirina IX de estaño (20 mg, Porphyrin Products, Logan, UT), protoporfirina IX de cinc (17 mg, Porphyrin Products, Logan, UT) o biliverdina (18 mg, Porphyrin Products, Logan, UT) en dimetilsulfóxido (2 ml). Se añadió una alícuota de esta solución (200 \mul) a una solución salina normal (9,8 ml) y esta mezcla se agitó vigorosamente en un vórtex para obtener una solución 2,7 x 10^{-4} M de la protoporfirina. El recipiente con la solución se envolvió en hoja de aluminio para evitar la fotolisis de la protoporfirina y se almacenó a 4ºC hasta su uso.

Esta solución de protoporfirina se cargó en bombas microosmóticas (#1003D, Alza Corp., Palo Alto, CA) (91 \mul/bomba) y se implantaron subcutáneamente en el ratón anestesiado a través de una incisión de 1 cm en la línea media dorsal 24 h antes de comenzar con la cirugía. Estas bombas administran la solución del fármaco a una velocidad de 0,95 \pm 0,02 \mul/h. En el momento de la cirugía, antes de insertar el catéter intraluminal oclusivo, se administró una dosis adicional de la solución de protoporfirina (0,3 ml, i.v.). Cada animal recibió las siguientes cantidades totales (inyección + bomba) de fármaco durante el curso del estudio: protoporfirina de estaño (0,070 mg), protoporfirina de cinc (0,059 mg) o biliverdina (0,061 mg).

Ejemplo 8

La hipoxia o los radicales libres inducen el desplazamiento de la selectina P (SP) a la superficie de las células endoteliales (CE), en donde participa en la adhesión de neutrófilos (PMN) durante la reperfusión. Para examinar el mecanismo por medio del cual los nitrovasodilatadores pueden atenuar el secuestro postisquémico de leucocitos, los autores analizaron si la estimulación de la ruta de NO/GMPc puede atenuar la expresión de SP en la superficie de CEs de la vena umbilical humana hipóxica. Las CEs expuestas a hipoxia (pO_{2} < 2.666 Pa durante 4 horas) mostraron un aumento del 50% en la liberación del vWF (p < 0,005) (vWF está empaquetado junto con la SP) que coincidió con un aumento del 80% en la expresión de SP en la superficie (p < 0,0001), medida mediante la unión específica de un anticuerpo anti-SP radiomarcado. En condiciones similares, la adición del donador de NO 3-morfolino-sidnonimina (SIN-1, 0,1 mM) o del análogo de GMPc 8-bromo-GMPc (GMPc, 10 nM) provocó una disminución de la liberación de vWF; Control vWF, 11 \pm 0,4 mU/ml; SIN-1, 9,1 \pm 0,3 mU/ml; GMPc, 9,7 \pm 0,2 mU/ml; p < 0,005 para SIN-1 o GMPc frente al control. En comparación con los controles, SIN-1 o GMPc también redujeron la expresión de SP en la superficie (disminuciones de 40% y 48% respectivamente, p < 0,005 para cada uno). Usando un ensayo de adherencia inmunofluorescente, tanto SIN-1 como GMPc redujeron la unión de HL60 a las HUVECs hipóxicas (disminución de 53% y 86% frente a los controles, p < 0,05 para cada uno). La medición de la fluorescencia de fura-2 demostró que la hipoxia aumentaba la concentración intracelular de calcio [Cai] y que el aumento de [Cai] se podía bloquear mediante GMPc. Ni SIN-1 ni GMPc eran capaces de reducir adicionalmente la expresión de SP cuando las CEs se introducían en un medio exento de calcio. Estos datos sugieren que la estimulación de la ruta de NO/GMPc inhibe la expresión de SP inhibiendo el flujo de calcio en las CEs e identifican esta inhibición como un mecanismo importante por medio del cual los nitrovasodilatadores pueden reducir la unión de PMNs en los tejidos postisquémico.

Ejemplo 9 Factor IXai

El factor IX es un factor de coagulación que existe en los seres humanos y en otros mamíferos y constituye una parte importante de la ruta de coagulación. En el esquema normal de coagulación el factor IX es activado por el factor XIa o por un complejo factor tisular/VIIa, convirtiéndose en su forma activa, el factor IXa. El factor IXa puede activar después el factor X, que dispara la última parte de la cascada de coagulación, lo que conduce a trombosis. Puesto que el factor X puede ser activado por una de dos rutas, bien por la ruta extrínseca (vía VIIIa/factor tisular) o bien por la intrínseca (vía factor IXa), los autores plantearon la hipótesis de que la inhibición del factor IXa podría producir el deterioro de algunas formas de hemostasia pero dejar intacta la hemostasia que se produce en respuesta al daño tisular. En otras palabras, podría conducir al bloqueo de algunos tipos de coagulación pero no a una hemorragia excesiva o indeseada. El factor IXai es el factor IX que ha sido modificado químicamente de manera que todavía se puede reensamblar en el factor IXa (y, por lo tanto, puede competir con el factor IXa nativo) pero carece de actividad. Esto puede "arrollar" o causar una inhibición competitiva de la ruta de coagulación dependiente del factor IXa normal. Puesto que el factor IXa se une al endotelio y a plaquetas y, tal vez, a otros sitios, también puede ser posible bloquear la actividad del factor IXa mediante la administración de agentes que interfieran en la unión del factor IXa (o interfiriendo en la activación del factor IX).

En el accidente cerebrovascular y en otros trastornos isquémicos puede obtenerse un beneficio clínico derivado de la lisis de un trombo existente, pero también existe la complicación, potencialmente devastadora, de hemorragias. En los presentes experimentos se usó el modelo de ratón de isquemia cerebral y reperfusión (accidente cerebrovascular). Los ratones recibieron un bolo intravenoso de 300 \mug/kg de factor IXai justo antes de la cirugía. Los accidentes cerebrovasculares se crearon por oclusión intraluminal de la arteria cerebral media derecha. Cuando 24 horas más tarde se midieron los pronósticos del accidente cerebrovascular, los animales que habían recibido el factor IXai presentaban menores volúmenes de infarto, una mejor perfusión cerebral, menores déficits neurológicos y una mortalidad reducida en comparación con los controles que fueron sometidos a la misma cirugía pero que no recibieron el factor IXai. Asimismo se observó que los animales con factor IXai carecían de hemorragias intracerebrales evidentes. Por el contrario, en los animales control que no recibieron el factor IXai se observó ocasionalmente una hemorragia intracerebral.

TABLA II

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Ejemplo 10 Exacerbación del daño cerebral en ratones que expresan el gen de la selectina P: Identificación del bloqueo de selectina P como nueva diana para el tratamiento del accidente cerebrovascular Resumen

Actualmente existe un vacío terapéutico absoluto para el tratamiento del accidente cerebrovascular en evolución. Aunque la selectina P se expresa rápidamente en células endoteliales hipóxicas in vitro, sigue sin analizarse el significado funcional de la expresión de selectina P en el accidente cerebrovascular. Con el fin de identificar las consecuencias fisiopatológicas de la expresión de selectina P y para identificar el bloqueo de la selectina P como un posible planteamiento nuevo para el tratamiento del accidente cerebrovascular, se realizaron experimentos usando un modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión. La expresión temprana de selectina P en la corteza cerebral postisquémica se demostró por la acumulación específica de IgG anti-selectina P murina radiomarcada, localizándose por análisis inmunohistoquímicos la mayor expresión de selectina P en las células endoteliales microvasculares cerebrales ipsilaterales. En experimentos diseñados para ensayar el significado funcional de la mayor expresión de selectina P en el accidente cerebrovascular, se demostró que la acumulación de neutrófilos en la corteza isquémica de ratones que expresaban el gen de la selectina P (SP+/+) era significativamente mayor que la de ratones homocigotos carentes de selectina P (SP-/-). La entrada reducida de neutrófilos venía acompañada de un mayor reflujo cerebral postisquémico (medido por láser doppler) en los ratones SP-/-. Además, los ratones SP-/- mostraron volúmenes de infarto más pequeños (cinco veces menores, p < 0,05) y una mayor supervivencia en comparación con los ratones SP+/+ (88% frente a 44%, p < 0,05). El bloqueo funcional de la selectina P en ratones SP+/+ usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la selectina P murina también mejora el reflujo temprano y el pronóstico del accidente cerebrovascular en comparación con los controles, observándose unos volúmenes de infarto cerebral reducidos incluso cuando el anticuerpo bloqueante se administra después de la oclusión de la arteria cerebral media. Estos datos son los primeros que demuestran un papel fisiopatológico para la selectina P en el accidente cerebrovascular y sugieren que el bloqueo de la selectina P puede representar una nueva diana terapéutica para el tratamiento del accidente cerebrovascular.

Introducción

El accidente cerebrovascular isquémico constituye hoy en día la tercera causa más frecuente de fallecimiento en Estados Unidos^{1}. Hasta hace muy poco no existía ningún tratamiento directo para reducir el daño del tejido cerebral en el accidente cerebrovascular en evolución. Aunque los estudios NINDS^{2} y ECASS^{3} sobre el accidente cerebrovascular agudo con rt-PA han sugerido que hay posibles beneficios terapéuticos de una reperfusión temprana^{4}, la mayor mortalidad observada después del tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo con estreptoquinasa^{5} pone de manifiesto el duro hecho de que en este momento no existe ningún tratamiento claramente eficaz para el accidente cerebrovascular en evolución. Este vacío en el armamento médico actual para el tratamiento del accidente cerebrovascular ha conducido a una serie de planteamientos innovadores^{6}, aún distintos de rt-PA, pero ninguno ha conquistado el campo clínico. Para identificar un posible tratamiento seguro y eficaz para el accidente cerebrovascular en evolución, los autores se han centrado en el papel deletéreo de los neutrófilos reclutados. Un trabajo reciente en un modelo murino del accidente cerebrovascular reperfundido ha demostrado que la depleción de neutrófilos (PMNs) antes del accidente cerebrovascular minimiza las lesiones en el tejido cerebral y mejora el pronóstico funcional^{7}; los ratones carentes de la molécula de adhesión celular específica, ICAM-1, están igualmente protegidos^{7}. La selectina P, una molécula que se puede desplazar rápidamente a la superficie endotelial hipóxica desde reservorios previamente formados^{8}, es un importante mediador temprano del rodamiento de neutrófilos^{9}, que facilita la atracción de neutrófilos mediada por ICAM-1. Aunque la selectina P se expresa en el accidente cerebrovascular en primates^{10}, se desconoce aún el significado funcional de la expresión se selectina P en el accidente cerebrovascular.

Para examinar el papel fisiopatológico de la selectina P en el accidente cerebrovascular, los autores emplearon un modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión^{11} en el que se usaron tanto ratones de tipo silvestre como ratones que eran homocigotos para la ausencia del gen de la selectina P^{9} y una estrategia para la administración de un anticuerpo funcionalmente bloqueante contra la selectina P. En estos estudios, los autores confirmaron no sólo que la expresión de selectina P tras la oclusión de la arteria cerebral media está asociada con un reflujo cerebral reducido después de la reperfusión y con un pronóstico desfavorable tras el accidente cerebrovascular, sino que el bloqueo de la selectina P confiere un grado significativo de protección cerebral postisquémica. Estos estudios constituyen la primera demostración del papel fisiopatológico de la expresión de selectina P en el accidente cerebrovascular y sugieren la excitante posibilidad de que las estrategias anti-selectina P puedan resultar útiles para el tratamiento del accidente cerebrovascular reperfundido.

Métodos

Ratones: Los experimentos se llevaron a cabo con ratones transgénicos carentes de selectina P, creados como se ha descrito anteriormente^{9} por recombinación homóloga en células troncales embrionarias J1 inyectadas en blastocitos C57BL/6 para obtener una transmisión en la línea germinal y se retrocruzaron para obtener ratones homocigotos carentes de selectina P (SP-/-). Los experimentos se realizaron con ratones primos SP-/- o de tipo silvestre (SP+/+) de la tercera generación de retrocruzamientos con ratones C57BL/6J. Los animales tenían edades comprendidas entre siete y doce semanas y pesaban entre 25 y 36 gramos en el momento en que se realizaron los experimentos. Puesto que se ha informado que variaciones en la anatomía cerebrovascular dan lugar a diferencias en la susceptibilidad al accidente cerebrovascular experimental en ratones^{12}, se realizó una tinción con tinta china/negro de carbono para visualizar el patrón vascular del círculo de Willis en los ratones SP-/- y SP+/+. Estos experimentos demostraron que no había grandes diferencias anatómicas en el patrón vascular de la circulación cerebral.

Oclusión transitoria de la arteria cerebral media: Los ratones se anestesiaron (0,3 ml de quetamina 10 mg/ml y xilazina 0,5 mg/ml, i.p.) y se colocaron en posición supina sobre una superficie de operaciones con control de la temperatura rectal (Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH). La temperatura interna de los animales se mantuvo a 37 \pm 1ºC durante la operación y durante 90 minutos después de la operación. Se realizó una incisión en la línea media del cuello para exponer la vaina de la carótida derecha bajo el microscopio de operaciones (aumento 16-25x, Zeiss, Thornwood, NY). La arteria carótida común se aisló con seda 4-0, y se aislaron y dividieron las arterias occipital, pterigopalatina y carótida externa. La oclusión de la arteria cerebral media (OACM) se efectuó introduciendo una sutura de nilón 5-0 de 13 mm redondeada por calor a través del muñón carotídeo externo. Una vez colocada la sutura oclusiva, el muñón de la arteria carótida externa se cauterizó y la herida se cerró. Al cabo de 45 minutos se retiró la sutura oclusiva para establecer la reperfusión. Estos procedimientos han sido descritos previamente en detalle^{11}.

Medición del flujo sanguíneo en la corteza cerebral: Las mediciones transcraneales del flujo sanguíneo cerebral se realizaron usando flujometría de láser doppler (Perimed, Inc., Piscataway, NJ) como se ha descrito previamente^{13}. Las mediciones del flujo sanguíneo cerebral relativo se llevaron a cabo como se indica, inmediatamente después de la anestesia, 1 y 10 minutos después de la oclusión de la arteria cerebral media, así como después de 30 minutos, 300 minutos y 22 horas de reperfusión, usando una sonda láser doppler recta (modelo #PF303, Perimed, Piscataway, NJ) y puntos anatómicos previamente publicados (2 mm posterior al bregma, a 6 mm de cada lado de la línea media)^{11}. Los datos se expresan como relación entre las intensidades de la señal doppler en el hemisferio isquémico y en el no isquémico. Aunque este método no cuantifica el flujo sanguíneo cerebral por gramo de tejido, el uso de la flujometría de láser doppler realizada en puntos anatómicos exactamente definidos sirve para comparar en serie los flujos sanguíneos cerebrales en el mismo animal a lo largo del tiempo. El procedimiento quirúrgico se consideró técnicamente adecuado cuando se observaba una reducción \geq 50% en el flujo sanguíneo cerebral relativo inmediatamente después de colocar la sutura intraluminal oclusiva. Estos métodos se han usado en estudios anteriores^{7,11}.

Cálculo de los volúmenes de infarto: Tras el examen neurológico se anestesiaron los ratones y se obtuvieron las últimas mediciones del flujo sanguíneo cerebral. La eutanasia humanitaria se realizó por decapitación, y los cerebros se extrajeron y se colocaron en una matriz para cerebros de ratón (Activational Systems Inc., Warren, MI) para cortarlos en secciones de 1 mm. Las secciones se sumergieron en cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio al 2% (TTC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en solución salina tamponada con fosfato al 0,9%, se incubaron durante 30 minutos a 37ºC y se introdujeron en formalina al 10%^{16}. El cerebro que sufrió el infarto se visualizó en forma de un área de tejido no teñido. Los volúmenes de infarto se calcularon a partir de secciones planimétricas seriadas y se expresan en porcentaje del infarto en el hemisferio ipsilateral. Este método de cálculo de los volúmenes de infarto lo han usado anteriormente el grupo de los autores^{7,11} y otros^{16,17} y se ha correlacionado con los demás índices pronósticos funcionales del accidente cerebrovascular descritos anteriormente.

Administración de anticuerpos no marcados, PMNs radiomarcados y anticuerpos radiomarcados: Para los experimentos en los que se administraron anticuerpos no marcados se usó uno de los dos tipos de anticuerpos diferentes; bien una IgG monoclonal de rata anti-selectina P murina bloqueante (clon RB 40.34, Pharmingen Co., San Diego, CA)^{14,18,19} o bien una IgG de rata no inmunológica (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Los anticuerpos se prepararon a 30 \mug en 0,2 ml de solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,1% de albúmina de suero bovina y que se administró después en la vena del pene 10 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media. En experimentos separados se inyectaron por vía intravenosa anticuerpos radiomarcados (0,15 ml, \approx2,6 x 10^{5} cpm/\mul) 10 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media. En un tercer conjunto de experimentos se administraron por vía intravenosa PMNs radiomarcados 10 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media en forma de una inyección de 100 \mul (los PMNs radiomarcados se mezclaron con solución salina fisiológica hasta un volumen total de 0,15 ml; \approx3 x 10^{6} cpm/\mul). Para los experimentos en los que se administraron anticuerpos no marcados, el momento en el que se realizaron las mediciones se indica en el texto, usando los métodos antes descritos para determinar el flujo sanguíneo cerebral, los volúmenes de infarto y la mortalidad. Para aquellos experimentos en los que se administraron anticuerpos radiomarcados o PMNs radiomarcados, los ratones se sacrificaron en los tiempos indicados, y los cerebros se extrajeron inmediatamente y se dividieron en los hemisferios ipsilateral (postisquémico) y contralateral. Se midió la deposición de anticuerpos o neutrófilos radiomarcados y se expresó en cpm ipsilaterales/contralaterales.

Inmunohistoquímica: Los cerebros se extrajeron 1 hora después de la oclusión de la arteria cerebral media, se fijaron en formalina al 10%, se incorporaron en parafina y se seccionaron para el análisis inmunohistoquímico. Las secciones se tiñeron con un anticuerpo policlonal de conejo anti-selectina P humana (dilución 1:25, Pharmigen, San Diego, CA) y los sitios de unión del anticuerpo primario se visualizaron usando un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con biotina (1:20) que se detectó con peroxidasa ExtrAvidin (Sigma Chemical Co.,
St. Louis MO).

Análisis de los datos: Se compararon el flujo sanguíneo cerebral, el volumen de infarto y la deposición de ^{111}In-PMN usando el test t de Student para variables desapareadas. Se realizó un ANOVA de dos vías para detectar diferencias significativas entre la deposición de anticuerpos inicial y final (30 min) en los dos grupos (experimental frente a falso). El test t de Student para variables desapareadas se realizó para evaluar las diferencias dentro del grupo (inicial frente al punto temporal de 30 min). Las diferencias en la supervivencia entre los grupos se analizó usando el análisis de contingencia con la estadística de chi-cuadrado. Los valores se expresan como media \pm error típico, considerándose un valor de p < 0,05 estadísticamente significativo.

Resultados

Expresión de selectina P en el accidente cerebrovascular murino: Puesto que la selectina P media la fase inicial de la adhesión de los leucocitos a las células endoteliales activadas^{20}, los autores examinaron la expresión temprana de selectina P en el cerebro en un modelo murino del accidente cerebrovascular reperfundido. Los ratones a los que se administró antes de la cirugía una IgG monoclonal de rata anti-selectina P de ratón marcada con ^{125}I mostraron un aumento del 216% en la acumulación del anticuerpo a los 30 minutos de reperfusión en comparación con los animales con operación falsa (p < 0,001, Figura 31A). Para demostrar que este grado de deposición de anticuerpos en el hemisferio reperfundido se debía a la expresión de selectina P en lugar de a una acumulación inespecífica, se llevó a cabo una comparación con animales tratados de forma idéntica a los que se administró una IgG de rata no inmunológica marcada con ^{125}I. Estos experimentos demostraron que hubo una acumulación significativamente mayor de la IgG anti-selectina P que de la IgG no inmunológica (p < 0,025, Figura 31A), lo que sugiere que la selectina P se expresa en el cerebro en el plazo de 30 minutos de reperfusión. El examen de las secciones de tejido cerebral inmunoteñidas para selectina P revelaron que la expresión de selectina P se localiza principalmente en las células endoteliales microvasculares de la corteza cerebral ipsilateral (Figura 31B).

Acumulación de neutrófilos en el accidente cerebrovascular murino: Para trazar el curso temporal durante el que se produce la entrada de PMNs tras el accidente cerebrovascular se midió la acumulación de PMNs marcados con ^{111}In en ratones de tipo silvestre (SP+/+) antes de la OACM, inmediatamente después y 10 minutos después de la OACM y a los 30 min, 300 min y 22 h de reperfusión. En los ratones SP+/+, la acumulación de PMNs comienza pronto después de iniciarse la isquemia focal y continúa durante el periodo de reperfusión (Figura 31C). Para establecer el papel de la selectina P en esta acumulación postisquémica de neutrófilos se realizaron experimentos usando ratones homocigotos para la ausencia del gen de la selectina P (SP-/-). Los ratones SP-/- mostraron una acumulación de PMNs significativamente reducida tras la oclusión de la arteria cerebral media y la reperfusión (Figura 31B).

Papel de la SP en la ausencia de reflujo cerebrovascular: Para determinar si la reducción en la acumulación de PMNs en los ratones SP-/- daba como resultado un mayor flujo sanguíneo cerebral después de restablecer el flujo, se obtuvieron mediciones en serie del FSC relativo tanto en ratones SP+/+ como SP-/- mediante flujometría de láser doppler. Antes de iniciar la isquemia (Figura 32, punto a), los flujos sanguíneos cerebrales relativos eran prácticamente idénticos en todos los grupos. La oclusión de la arteria cerebral media (Figura 32, punto b) estaba asociada con un descenso del flujo sanguíneo cerebral prácticamente idéntico en ambos grupos. Justo antes de retirar la sutura oclusiva intraluminal, a los 45 minutos de isquemia (Figura 32, punto c), los flujos sanguíneos cerebrales subieron ligeramente aunque permanecieron significativamente deprimidos en comparación con los flujos iniciales. Inmediatamente después de retirar la sutura oclusiva para iniciar la reperfusión (Figura 32, punto d), los flujos sanguíneos cerebrales aumentaron de forma comparable en ambos grupos (\approx60% del inicial en los ratones SP-/- y SP+/+). El hecho de que los flujos sanguíneos cerebrales tras la reperfusión no alcancen de forma inmediata los niveles previos a la oclusión es característico de la ausencia de reflujo cerebrovascular^{21}, representando la disminución subsiguiente en los flujos sanguíneos cerebrales tras la reperfusión una hipoperfusión cerebral postisquémica retardada^{22}. Tras 30 minutos de reperfusión (Figura 32, punto e), los flujos sanguíneos cerebrales divergieron entre los dos grupos de animales, mostrando los animales SP-/- unos flujos sanguíneos cerebrales relativos significativamente más elevados que los controles SP+/+ (p < 0,05) (Figura 32, punto f). Esta divergencia reflejó diferencias significativas en la hipoperfusión cerebral postisquémica retardada y persistió durante el periodo de observación de 22 horas.

Pronóstico del accidente cerebrovascular: El significado funcional de la expresión de selectina P se ensayó comparando los índices pronósticos del accidente cerebrovascular en ratones SP-/- con los de los controles SP+/+. Los ratones SP-/- estaban significativamente protegidos contra los efectos de la isquemia cerebral focal y la reperfusión, con una reducción de 77% en el volumen de infarto (p < 0,01) en comparación con los controles selectina P +/+ (Figura 33A). Esta reducción en el volumen de infarto viene acompañada de una mayor supervivencia en los animales SP-/- (p < 0,05; Figura 33B).

Efecto del bloqueo de selectina P: Tras observar el papel funcional de la expresión de selectina P en el accidente cerebrovascular usando ratones mutantes de deleción, se realizaron experimentos para determinar si el bloqueo farmacológico de la selectina P puede mejorar el pronóstico del accidente cerebrovascular en ratones SP+/+. Usando una estrategia de administración de un anticuerpo monoclonal de rata anti-selectina P de ratón bloqueante (clon RB 40.34^{14,18,19}) o de una IgG de rata control no inmunológica justo antes de la cirugía, se observó que los ratones que recibieron el anticuerpo bloqueante justo antes de la oclusión de la arteria cerebral media presentaban mayores flujos sanguíneos cerebrales a los treinta minutos de reperfusión, así como menores volúmenes de infarto cerebral y una tendencia hacia una menor mortalidad en comparación con los controles (Figura 34, las 6 barras de la izquierda). Para aumentar la posible relevancia clínica de la estrategia de bloqueo de la selectina P como nuevo tratamiento para el accidente cerebrovascular, se realizaron experimentos adicionales en los que se administraron el anticuerpo control o el bloqueante después de la oclusión intraluminal de la arteria cerebral media (pues la mayoría de los pacientes se presentan después de iniciarse el accidente cerebrovascular). En estos estudios se observó una reducción significativa de los volúmenes de infarto, así como una tendencia hacia un mayor flujo sanguíneo cerebral (Figura 34, las 6 barras de la derecha).

Discusión

Pese al considerable progreso en los últimos años en la prevención primaria del accidente cerebrovascular^{1}, las opciones terapéuticas para tratar el accidente cerebrovascular en evolución siguen siendo extremadamente limitadas. Aunque se pensaba que la publicación el pasado otoño de dos ensayos de puntos anatómicos que demuestran una morbilidad reducida tras el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico con rt-PA^{2,3} conduciría a una nueva era de la terapia trombolítica en el tratamiento del accidente cerebrovascular^{4}, el entusiasmo se ha moderado algo en vista de la transformación hemorrágica y la mayor mortalidad observadas en los pacientes con accidente cerebrovascular isquémico tratados con estreptoquinasa^{5}. Estos ensayos divergentes hacen que el desarrollo de nuevas terapias seguras para el tratamiento del accidente cerebrovascular en evolución sea más crítico que nunca. Aunque el restablecimiento del flujo sanguíneo al cerebro postisquémico proporciona nuevas oportunidades para una intervención terapéutica temprana, la reperfusión es un arma de doble filo. Dado el potencial citotóxico de los neutrófilos^{23}, no resulta sorprendente que la entrada de neutrófilos en el tejido cerebral postisquémico pueda producir más daño y empeorar el pronóstico tras un accidente cerebrovascular experimental^{7,24-27}. Usando un modelo murino de isquemia cerebral focal y reperfusión los autores han identificado recientemente un importante papel contribuyente para la molécula de adhesión celular ICAM-1 en la acumulación de neutrófilos a las 22 horas después del accidente cerebrovascular^{7}. Sin embargo, un aumento de la expresión de ICAM-1 endotelial cerebrovascular requiere acontecimientos de transcripción y traducción de novo, lo que requiere tiempo. Por el contrario, la selectina P, una glicoproteína transmembranal que media las fases más tempranas de la adhesión de neutrófilos, se puede movilizar desde reservorios previamente formados para expresarse rápidamente en la superficie de las células endoteliales isquémicas^{8,28}. Puesto que los ensayos clínicos de la terapia trombolítica para el accidente cerebrovascular demuestran una estrecha ventana temporal para un posible beneficio (en las primeras horas tras iniciarse el accidente cerebrovascular)^{2,3,5}, esto sugiere que las estrategias diseñadas para interferir en las fases más tempranas de la adhesión de PMNs pueden presentar un beneficio teórico en el accidente cerebrovascular en seres humanos. Estos ensayos deberían tener como resultado que se presentase un mayor número de pacientes a una intervención terapéutica temprana, aumentando la necesidad de tratar la cuestión del daño por reperfusión en zonas médicamente revascularizadas. Además, estos ensayos recalcan la necesidad apremiante de entender las contribuciones que realizan moléculas de adhesión individuales a la patogénesis del accidente cerebrovascular.

A pesar del gran volumen de bibliografía que describe el papel de la selectina P en otros modelos de isquemia y reperfusión^{8,29-32}, se sabe sorprendentemente poco sobre el papel de la selectina P en el accidente cerebrovascular. Es importante conocer el papel específico que desempeña la selectina P en la vasculatura cerebral, ya que los requerimientos de moléculas de adhesión varían entre los lechos vasculares y los estados estudiados. Por ejemplo, en un modelo de trasplante intestinal^{33}, los anticuerpos anti-selectina P no redujeron el daño por reperfusión, mientras que los anticuerpos anti-CD11/CD18 sí lo hicieron. Mientras que el bloqueo de la selectina P era ineficaz en la reducción de la adhesión de PMNs y la filtración de albúmina en un modelo de rata de isquemia y reperfusión mesentérica, el bloqueo de ICAM-1 sí era eficaz^{34}. En un modelo de rata de isquemia/reperfusión de las extremidades posteriores, los requerimientos de selectina para la adhesión de PMNs difería entre los lechos vasculares de los músculos pulmonar y crural.

Por lo que se sabe, el único estudio publicado que describe una mayor expresión de selectina P en el cerebro isquémico consiste en una descripción histopatológica del accidente cerebrovascular en primates, en el que la expresión de selectina P estaba aumentada en la microvasculatura lenticuloestriada^{10}. Los presentes estudios se realizaron para estudiar si la expresión de selectina P contribuye a la acumulación de neutrófilos en el cerebro postisquémico, a la ausencia de reflujo y al daño tisular en un modelo murino de accidente cerebrovascular reperfundido. La expresión de selectina P se demostró por una inmunotinción endotelial más intensa y una mayor deposición de anticuerpos radiomarcados en la zona isquémica usando un modelo recientemente establecido de isquemia cerebral focal y reperfusión en ratones^{11}. En esta última técnica, la deposición de anticuerpos en el hemisferio isquémico se normalizó en cada animal respecto a la presente en el hemisferio no isquémico, no sólo para minimizar las posibles variaciones en el volumen de inyección o en el volumen de distribución, sino para poder comparar los animales a los que se han administrado diferentes anticuerpos. Puesto que la alteración de la función de barrera endotelial en la corteza isquémica puede aumentar la deposición no selectiva de anticuerpos, se realizaron experimentos similares con una IgG control de rata. Estos datos muestran que el anticuerpo que se une a la selectina P se deposita a una mayor velocidad que el anticuerpo control, lo que sugiere que la expresión local de selectina P está aumentada en el tejido reperfundido. Estos datos del modelo murino coinciden con los presentados en un modelo de babuino del accidente cerebrovascular^{10}, en el que la expresión de selectina P aumentó en el plazo de 1 hora después del episodio isquémico.

Debido a la necesidad apremiante de identificar las razones por las cuales no se produce la reperfusión, los presentes estudios examinaron el papel de la selectina P en la hipoperfusión cerebral postisquémica retardada^{21,22}, el fenómeno por el cual el flujo sanguíneo decrece durante la reperfusión a pesar de restablecerse las presiones de perfusión adecuadas. En modelos de isquemia en el corazón, la ausencia de reflujo empeora a medida que el tiempo pasa tras la reperfusión^{35}, lo que sugiere un papel importante para los mecanismos efectores reclutados, tales como trombosis microcirculatoria progresiva, disfunción vasomotora y reclutamiento de PMNs. En otros modelos se ha demostrado que tanto las reacciones de adhesión dependientes de selectina P como las dependientes de ICAM-1^{36} y la obstrucción capilar por PMNs^{37} participan en la ausencia de reflujo postisquémico. En el cerebro, los PMNs se han implicado en la ausencia de reflujo cerebral postisquémico^{38,39}, pero el papel de la selectina P todavía no se había esclarecido.

El presente estudio usa una técnica relativamente poco invasiva (láser doppler) para obtener mediciones en serie del flujo sanguíneo cerebral relativo con el fin de establecer la existencia, el curso temporal y la dependencia de selectina P de la ausencia de reflujo cerebrovascular postisquémico. Con el fin de demostrar que el procedimiento de enhebrado mismo no era la causa del daño vascular y del infarto cerebral subsiguiente, se realizaron experimentos de isquemia falsa (n = 10) en los que se enhebró una sutura de nilón en la arteria carótida interna durante un periodo no oclusivo de 45 minutos. En estos experimentos se demostró que el enhebrado no era oclusivo ya que no se observó ninguna disminución de la perfusión en la flujometría de láser doppler durante el periodo de 45 minutos. Cuando a las 24 horas se extrajeron los cerebros y se tiñeron con TTC, ninguno mostró evidencias de un infarto cerebral. Por lo tanto, se puede concluir que el procedimiento de enhebrado per se no provoca el suficiente daño como para afectar a las principales variables pronósticas. Al examinar el flujo sanguíneo cerebral relativo tras la oclusión franca de la arteria cerebral media en animales experimentales, los autores observaron que los animales control y los carentes de selectina P sufrieron unos grados de isquemia prácticamente idénticos (en ambos hubo un descenso inicial de \approx4,5 veces en el flujo sanguíneo cerebral relativo tras la oclusión de la arteria cerebral media). Sin embargo, hubo un ligero aumento en el flujo sanguíneo cerebral relativo en los primeros 10 minutos después de la oclusión, incluso cuando permanecía colocada la sutura oclusiva. Es una observación empírica que han hecho sistemáticamente los autores, para la cual probablemente existan varias explicaciones posibles. Es probable que haya un cierto flujo colateral que se abre en la zona isquémica. Otra explicación válida consiste en que puede haber un componente de vasoespasmo inicial en la región de la punta del catéter oclusivo que se resuelve moderadamente en varios minutos. Aunque ambas explicaciones son posibles, los autores no pueden identificar el mecanismo con certeza en su modelo debido al pequeño tamaño de la vasculatura del ratón. No obstante, puesto que los autores observaron el mismo grado de recuperación del flujo en los animales control y experimentales, estos datos no alteran sus conclusiones principales de que la selectina P se un importante mediador del daño tisular cerebral en el accidente cerebrovascular reperfundido.

Tras retirar la sutura intraluminal oclusiva, la recuperación instantánea del flujo sanguíneo era el mismo en los animales selectina P +/+ y -/-. El hecho de que los niveles del flujo nunca volvieran a los iniciales (ni se excedieran, como se puede apreciar con hiperemia reactiva) puede deberse a la gravedad y duración del periodo isquémico, que probablemente reclute otros mecanismos en la ausencia de reflujo cerebrovascular postisquémico, tales como trombosis o reclutamiento de neutrófilos causado por mecanismos independientes de selectina. Al examinar tiempos posteriores (tales como entre 30 minutos y 22 horas después de retirar la sutura oclusiva), cabe destacar que se produce una ligera disminución en el flujo sanguíneo cerebral en los animales selectina P -/-. Esta disminución (si bien limitada) tardía en el flujo sanguíneo cerebral a las 22 horas es coherente con el reclutamiento moderado de PMNs observado en los animales SP-/- durante el mismo periodo, lo que de nuevo sugiere el reclutamiento de otros mecanismos efectores que limitan el flujo (tales como ICAM-1) en los animales SP-/-.

El presente conjunto de estudios deja claros los efectos funcionales de la expresión de selectina P: los animales que no expresan el gen de la selectina P (o los animales SP+/+ tratados con un anticuerpo anti-selectina P funcionalmente bloqueante) muestran infartos más pequeños y una mayor supervivencia que los controles. Cuando estos datos se consideran junto con los datos previamente publicados que demuestran un papel deletéreo de la expresión de ICAM-1 en el accidente cerebrovascular^{7}, resulta cada vez más obvio que existen múltiples medios para reclutar los PMNs hacia la corteza cerebral postisquémica y que el bloqueo de cada uno de ellos constituye una posible estrategia para mejorar el pronóstico del accidente cerebrovascular en los seres humanos. Una vez reconocida la importancia de la reperfusión a tiempo en la detención del avance del frente de la muerte neuronal tras el accidente cerebrovascular, la interferencia en los estadios más tempranos de la adhesión de PMNs parece ser una opción atractiva para reducir la morbilidad y mortalidad. De hecho, las estrategias anti-molécula de adhesión no sólo pueden ser beneficiosas por sí mismas (es decir, incluidos los pacientes que no se pueden seleccionar para trombolisis), sino que pueden ampliar la ventana de oportunidades para la intervención trombolítica^{40}. El presente conjunto de estudios contribuye a la comprensión de los mecanismos fisiopatológicos que funcionan en el accidente cerebrovascular reperfundido. Estos estudios sugieren la necesidad de realizar ensayos clínicos de terapias para el accidente cerebrovascular en evolución que optimicen el ambiente de reperfusión para reducir la acumulación de PMNs.

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Ejemplo 11 Uso de monóxido de carbono para tratar un trastorno isquémico - Ejemplo de los efectos protectores del monóxido de carbono en la isquemia pulmonar

En la solicitud de patente inicial los autores expusieron datos que indicaban que la producción endógena de monóxido de carbono o la administración de monóxido de carbono exógeno es beneficiosa en la protección del cerebro contra lesiones isquémicas subsiguientes. En otro ejemplo del uso de monóxido de carbono en el tratamiento de un trastorno isquémico los autores administraron monóxido de carbono a ratas para analizar sus efectos con vistas a una mejor conservación de los pulmones para el trasplante (que es similar a un trastorno isquémico puesto que los pulmones donantes se extirpan de un receptor; durante el periodo en que los pulmones se conservan y transfieren del donante al receptor se produce una interrupción del flujo sanguíneo).

Métodos para analizar el efecto de monóxido de carbono sobre la conservación de los pulmones Materiales usados para preparar la solución de conservación

En todos los experimentos, la solución de conservación básica constaba de solución Euro-Collins (EC) modificada (Na^{+} 10 mequiv/l, K^{+} 115 mequiv/l, Cl^{-} 15 mequiv/l, HPO_{4}^{2-} 85 mequiv/l, H_{2}PO_{4}^{-} 15 mequiv/l, HCO_{3}^{-} 10 mequiv/l).

Extracción, conservación y trasplante de pulmones

En todos los experimentos se usaron ratas Lewis macho endogámicas (250 a 300 g) de acuerdo con el protocolo aprobado por el Institutional Animal Care and Use Comittee (Comité institucional para el cuidado y uso de animales) de la Universidad de Columbia conforme a las directrices expuestas por la American Academy for Acreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC, Academia americana para la acreditación del cuidado de animales de laboratorio). Los experimentos de trasplante de pulmones se realizaron de la siguiente manera. Se administraron a las ratas donantes 500 unidades de heparina por vía intravenosa, y la arteria pulmonar (AP) se lavó con un volumen de 30 ml de solución de conservación a 4ºC a una presión constante de 20 mm Hg. Cuando los pulmones se conservan de esta manera, la mayoría de la solución de lavado infundida sale por una ventana de la aurícula izquierda generada en el donante de los pulmones, así como por las venas pulmonares después de la transección.

A continuación se extrajo el pulmón izquierdo, se colocó un manguito sobre cada muñón vascular, se insertó un cilindro en el bronquio y el pulmón se sumergió durante 6 horas en solución de conservación a 4ºC que era idéntica a la solución de lavado de la AP. Se anestesiaron ratas del mismo sexo/cepa/tamaño, se intubaron y se ventilaron con 100% de O_{2} usando un ventilador para roedores (Harvard Apparatus, South Natick, MA). Se realizó un trasplante ortotópico del pulmón izquierdo a través de una toracotomía izquierda usando una técnica de manguito rápida para todas las anastomosis, manteniendo los tiempos isquémicos calientes por debajo de 5 minutos. Se soltó el pinzamiento transversal hiliar, restableciéndose el flujo sanguíneo y la ventilación hacia el pulmón trasplantado. Se pasó un lazo alrededor de la AP derecha y se introdujeron catéteres Millar (2F; Millar Instruments, Houston, TX) en la AP principal y la aurícula izquierda (AI). Se colocó una sonda de flujometría doppler (Transonics, Ithaca, NY) alrededor de la AP principal.

Medición de la función del injerto pulmonar

El seguimiento hemodinámico en línea se efectuó usando MacLab y un ordenador Macintosh IIci. Los parámetros hemodinámicos medidos incluían las presiones de la AI y la AP (mm Hg) y el flujo de la AP (ml/min). La presión arterial de oxígeno (pO_{2}, mm Hg) se midió durante la inspiración de O_{2} al 100% usando un analizador de gases modelo ABL-2 (Radiometer, Copenhague, Dinamarca). Las PVRs se calcularon como (presión media en la AP - presión media en la AI)/flujo medio en la AP y se expresaron en mm Hg/ml/min. Tras tomar las medidas iniciales se ligó la AP derecha nativa y se realizaron mediciones en serie cada cinco minutos hasta el momento de la eutanasia, a los 30 minutos (o hasta la muerte del receptor).

Administración de monóxido de carbono

Antes de la cirugía, en los tiempos indicados (4, 8 ó 12 horas), las ratas se colocaron bajo una campana de cristal y se administró monóxido de carbono a diferentes concentraciones (0,01%, 0,03% o 0,1%), constando el resto de la mezcla gaseosa de aire ambiental. (El gas se hizo pasar a través de una jarra de agua antes de la administración, con el fin de humidificarlo para mayor comodidad del animal). En los tiempos indicados tras iniciar la exposición, las ratas se anestesiaron y se extrajeron los pulmones como se describió anteriormente. Estos pulmones donantes se usaron en los experimentos siguientes de trasplante de pulmón.

Resultados y discusión

Los resultados de estos experimentos indican que la inhalación de monóxido de carbono antes de extraer los pulmones confiere una protección significativa a los pulmones tras el trasplante en comparación con los controles no tratados. Esta protección se manifiesta en: (1) una mejor oxigenación arterial en los receptores de los pulmones donantes tratados previamente con monóxido de carbono; (2) un mayor flujo sanguíneo arterial pulmonar (y una menor resistencia vascular pulmonar) cuando se usan pulmones donantes tratados previamente con monóxido de carbono; y (3) una mayor supervivencia de los receptores de los pulmones donantes tratados previamente con monóxido de carbono en comparación con los controles. Los efectos beneficiosos del monóxido de carbono dependían de la dosis, es decir que la mayor protección se observó a la dosis de 0,1%, un nivel de protección intermedio a la dosis de 0,03% y la menor protección a la dosis de 0,01%. Los efectos beneficiosos del monóxido de carbono también dependían del tiempo en cuanto a que las exposiciones prolongadas parecían proporcionar la mayor protección. En conjunto, estos datos indican que el monóxido de carbono puede proteger en otro trastorno isquémico (isquemia pulmonar) y sugieren que los resultados se pueden generalizar asimismo para otros trastornos isquémicos.

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Ejemplo 12 Uso de un ensayo espectrofotométrico de hemoglobina para cuantificar objetivamente la hemorragia intracerebral en ratones Resumen

Antecedentes y finalidad. Existe un gran interés en desarrollar nuevas estrategias anticoagulantes o trombolíticas para tratar el accidente cerebrovascular isquémico. Sin embargo, en la actualidad se dispone de medios limitados para valorar con exactitud el potencial hemorrágico de estos agentes. Los presentes estudios se han diseñado para desarrollar y validar un método para cuantificar con exactitud el grado de hemorragia intracerebral en modelos murinos. Métodos. En un modelo murino se indujo una hemorragia intracerebral (HIC) por infusión intraparenquimatosa estereotáctica de colagenasa B sola (6 x 10^{-6} unidades, n = 5) o de colagenasa B seguida del activador tisular del plasminógeno intravenoso (rt-PA, 0,1 mg/kg, n = 6). Los controles consistieron en cirugía falsa con infusión estereotáctica de solución salina (n = 5) o en animales no tratados (n = 5). La HIC (1) se evaluó según una escala basada en el diámetro máximo de la hemorragia en secciones coronales y (2) se cuantificó mediante un ensayo espectrofotométrico midiendo la cianomethemoglobina en extractos químicamente reducidos de cerebro murino homogeneizado. Este ensayo espectrofotométrico se validó usando cantidades conocidas de hemoglobina o de sangre autóloga que se añaden a un cohorte separado de cerebros homogeneizados. Usando este ensayo se cuantificó el grado de hemorragia tras una oclusión/reperfusión focal de la arteria cerebral media en ratones tratados después de la oclusión con una dosis elevada de rt-PA IV (10 mg/kg, n = 11) y en ratones control sometidos a un accidente cerebrovascular pero tratados con solución salina fisiológica (n = 9). Resultados. La adición de cantidades conocidas de hemoglobina o de sangre autóloga a homogenados recientes de tejido cerebral completo mostró una relación lineal entre la cantidad añadida y la DO en el pico de absorbancia de la cianomethemoglobina (r = 1,00 y 0,98, respectivamente). Cuando se realizaron estudios in vivo para cuantificar la HIC inducida experimentalmente, los animales que recibieron una infusión intracerebral de colagenasa B presentaban DOs significativamente mayores que los controles infundidos con solución salina (2,1 veces mayor, p = 0,05). En un modelo de oclusión de la arteria cerebral media y reperfusión para el accidente cerebrovascular, la administración de rt-PA tras la reperfusión aumentó 1,8 veces la DO en comparación con los animales que recibieron solución salina fisiológica (p < 0,001). Cuando se compararon los dos métodos de medición de la HIC (puntuación visual y DO), se obtuvo una correlación lineal (r = 0,88). Experimentos adicionales demostraron que la tinción con trifeniltetrazolio, que se usa habitualmente para teñir el tejido cerebral viable, no interfiere en la cuantificación espectrofotométrica de la HIC. Conclusiones. Estos datos demuestran que el ensayo espectrofotométrico cuantifica con exactitud y de forma fiable la HIC en ratones. Este nuevo método debería contribuir a la valoración objetiva de los riesgos hemorrágicos de nuevas estrategias anticoagulantes o trombolíticas para tratar el accidente cerebrovascular y puede facilitar la cuantificación de otras formas de hemorragia intracerebral.

Introducción

El accidente cerebrovascular isquémico representa la gran mayoría de las presentaciones del accidente cerebrovascular agudo. Por lo tanto, existe un enorme interés en diseñar estrategias que puedan restaurar rápida y eficazmente el flujo sanguíneo hacia la región isquémica del cerebro. Aunque la heparina puede resultar eficaz en el accidente cerebrovascular incipiente (TIAs)^{3}, su uso durante las fases agudas del accidente cerebrovascular puede estar asociado con un alto grado de morbilidad y hemorragia intracerebral^{1-4}. De forma similar, a principios de los años 60, los pronósticos desalentadores de los ensayos con estreptoquinasa para el accidente cerebrovascular agudo condujeron a que durante las siguientes tres décadas los médicos se mostraran reticentes a usar la trombolisis en el accidente cerebrovascular agudo^{5,6}. Esta reticencia se ha validado en ensayos recientes en los que el uso de estreptoquinasa se ha asociado con un mayor riesgo de mortalidad y hemorragia intracerebral^{7}. Por otra parte, el uso del activador tisular del plasminógeno intravenoso recombinante (rt-PA) para tratar el accidente cerebrovascular en evolución ha resultado más prometedor^{8}, mostrando un subconjunto de pacientes con accidente cerebrovascular agudo tratados con rt-PA una menor morbilidad a largo plazo si se tratan en las 3 primeras horas tras aparecer los síntomas^{9-11}. Aún así, otros ensayos que han usado el mismo agente (rt-PA) no han mostrado ningún beneficio o han observado tasas excesivamente elevadas de HIC^{9,12-15}.

Este confuso mar de datos clínicos recalca la necesidad urgente de identificar estrategias mejoradas para lograr una rápida reperfusión. Con este propósito, es imprescindible identificar un modelo experimental en el que se puedan sopesar objetivamente los posibles beneficios de la reperfusión a tiempo en el accidente cerebrovascular y los riesgos de una mayor hemorragia intracerebral. En la mayoría de los estudios sobre la terapia trombolítica para el accidente cerebrovascular clínico en animales, los riesgos de hemorragia intracerebral más bien se han estimado en lugar de medido cuantitativamente^{16-24}. Los presentes estudios se han diseñado para desarrollar y validar un método para cuantificar con exactitud el grado de hemorragia intracerebral en modelos murinos, con el fin de evaluar los posibles riesgos de nuevos tratamientos anticoagulantes o trombolíticos para el accidente cerebrovascular agudo.

Materiales y métodos Animales experimentales

En el presente estudio se adquirieron ratones C57BL/6J macho de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) que se usaron con 8 a 10 semanas de edad (22 a 32 g). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado institucionalmente y cumplían las directrices establecidas por la American Academy of Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC, Academia americana para la acreditación del cuidado de animales de laboratorio).

Ensayo espectrofotométrico para la hemorragia intracerebral

El contenido de hemoglobina en los cerebros sometidos a los procedimientos experimentales descritos más adelante se cuantificó usando un ensayo espectrofotométrico de la siguiente manera. Se obtuvo el tejido cerebral completo de animales control o experimentales recién eutanasiados, y cada cerebro se trató individualmente como sigue. Se añadió agua destilada (250 \mul) a cada cerebro, y a continuación se homogeneizaron durante 30 s (Brinkman Instruments, Inc., Westbury, NY), se sonicaron en hielo durante 1 minuto con un ultrasonicador de impulsos (SmithKline Corporation, Collegeville, PA) y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 30 minutos (Baxter Scientific Products, Deerfield, IL). Tras recoger el sobrenadante, que contenía la hemoglobina, se añadieron 80 \mul de reactivo de Drabkin (suministrado por Sigma Diagnostics, St. Louis, MO; K_{3}Fe(CN)_{6} 200 mg/l, KCN 50 mg/l, NaHCO_{3} 1 g/l, pH 8,6^{25}) a una alícuota de 20 \mul y se dejó reposar durante 15 minutos. Esta reacción convierte la hemoglobina en cianomethemoglobina, que presenta un pico de absorbancia a 540 nm y cuya concentración se puede evaluar así mediante la densidad óptica de la solución a una longitud de onda de \approx 550 nm^{26}. Para validar que la absorbancia medida según estos procedimientos refleja la cantidad de hemoglobina, se analizaron cantidades conocidas de hemoglobina de eritrocitos bovinos (Sigma, St. Louis, MO) usando procedimientos similares junto con cada ensayo de tejido cerebral. Como medida adicional se obtuvo sangre de ratones control por punción cardiaca tras la anestesia. A continuación se añadieron alícuotas incrementales de esta sangre al tejido cerebral recién homogeneizado obtenido de ratones no tratados para generar una curva patrón de absorbancia.

Hemorragia intracerebral inducida por colagenasa

Los procedimientos generales para inducir una hemorragia intracerebral en el ratón se han adaptado a partir de un método descrito previamente en ratas^{27}. Tras anestesiarlos con una inyección intraperitoneal de 0,35 ml de quetamina (10 mg/ml) y xilazina (0,5 mg/ml), los ratones se colocaron en posición prona en un marco estereotáctico de cabeza. Se expuso la bóveda craneal mediante una incisión en la línea media del cuero cabelludo desde el nasión hasta la línea nucal superior y después se retrajo la piel lateralmente. Mediante un perforador de velocidad variable (Dremel, Racine, WI) se realizó un orificio de 1,0 mm a 2,0 mm posterior del bregma y 2,0 mm a la derecha de la línea media. Usando una guía estereotáctica se insertó una aguja de angiocatéter simple de calibre 22 en la corteza profunda derecha/ganglios basales (coordenadas: 2,0 mm posterior, 2,0 mm lateral). La aguja se sujetó mediante un tubo de plástico a una jeringa de microinfusión y las soluciones se infundieron en el cerebro a una velocidad de 0,25 \mul por minuto durante 4 minutos con una bomba para infusión (Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN). Los animales recibieron: (1) 0,024 \mug de colagenasa B (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) en 1 \mul de solución salina normal (Colagenasa); (2) 1 \mul de solución salina normal sola (Falso); (3) ningún tratamiento (Control); o (4) una infusión guiada estereotácticamente de colagenasa B como anteriormente pero seguida inmediatamente de la administración del activador tisular del plasminógeno intravenoso humano recombinante (Genentech Inc., South San Francisco, CA, 1 mg/kg en 0,2 ml de solución salina normal) mediante una inyección en la vena dorsal del pene (Colagenasa + rt-PA). En los grupos Colagenasa, Falso y Colagenasa + rt-PA, la aguja estereotáctica se retiró inmediatamente después de la infusión y la incisión se cerró con grapas quirúrgicas. El tejido cerebral se obtuvo inmediatamente después de una rápida decapitación bajo anestesia.

Conversión hemorrágica en un modelo murino de isquemia cerebral focal

Se generó una isquemia cerebral focal en los animales por oclusión transitoria de la arteria cerebral media derecha usando un método descrito previamente en detalle^{28,29}. Brevemente, se introdujo una sutura de nilón redondeada por calor de calibre 5-0 ó 6-0 y de 12 ó 13 mm en la arteria carótida interna derecha hasta llegar al nivel de la arteria cerebral media. Al cabo de 45 minutos se retiró la sutura oclusiva para restablecer la perfusión. Inmediatamente después de retirar la sutura oclusiva, los animales recibieron el activador tisular del plasminógeno intravenoso (10 mg/kg en 0,2 ml de solución salina normal, Accidente cerebrovascular + rt-PA) o solución salina normal (Accidente cerebrovascular + Solución salina) administrados mediante una inyección en la vena dorsal del pene. A las 24 horas se extrajo el tejido cerebral, inmediatamente después de una rápida decapitación bajo anestesia. Para evaluar el efecto de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC), que se usa comúnmente para distinguir el tejido cerebral que ha sufrido un infarto del que no lo ha sufrido^{28,30}, se dividieron por la mitad cerebros no manipulados (control), se sumergieron en TTC al 2% (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) en solución salina tamponada con fosfato, se incubaron durante 30 minutos a 37ºC y después se prepararon como se describió anteriormente para el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina. La otra mitad de cada cerebro se sumergió en solución salina durante el mismo tiempo y después se sometió a los procedimientos antes descritos para el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina.

Validación del ensayo cuantitativo de la hemorragia intracerebral

El grado de HIC se puntuó en primer lugar visualmente por un observador imparcial. Para la puntuación visual de la hemorragia intracerebral en los ratones, los cerebros obtenidos de los ratones que habían sobrevivido durante 24 horas después del procedimiento (hemorragia inducida por colagenasa u oclusión de la ACM) se colocaron en una matriz para cerebros de ratón (Activational Systems Inc., Warren, MI) para obtener secciones coronales seriadas de 1 mm. La secciones fueron inspeccionadas por un observador imparcial y los cerebros recibieron una puntuación de la HIC de acuerdo con una escala graduada basada en el diámetro máximo de hemorragia observado en cualquiera de las secciones (puntuación de la HIC 0, no hay hemorragia; 1, < 1 mm; 2, 1-2 mm; 3, > 2-3 mm; 4, > 3 mm). A continuación, los cortes de cada cerebro se combinaron, se homogeneizaron y después se trataron de acuerdo con los procedimientos antes descritos para el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina.

Estadística

Las correlaciones entre las puntuaciones de la HIC determinadas visualmente y las determinaciones espectrofotométricas de la HIC se realizaron usando la correlación lineal de Pearson con los coeficientes de correlación indicados. Para establecer si un tratamiento dado (colagenasa, falso, accidente cerebrovascular, etc.) presentaba un efecto significativo sobre la HIC espectrofotométrica o puntuada visualmente, se llevaron a cabo comparaciones usando un test t desapareado de dos colas. Para los datos no paramétricos (puntuaciones visuales de la HIC) se realizó un análisis no paramétrico usando el test de Mann-Whitney. Los valores se expresan como medias \pm error típico, considerándose una p < 0,05 estadísticamente significativa.

Resultados Ensayo espectrofotométrico de hemoglobina

Se realizaron estudios iniciales para determinar la fiabilidad y reproducibilidad del ensayo espectrofotométrico de hemoglobina. En el primer conjunto de experimentos se convirtieron cantidades conocidas de hemoglobina en cianomethemoglobina de acuerdo con los procedimientos publicados previamente y se midió la DO (Figura 35A)^{26}. En un segundo conjunto de experimentos se añadieron cantidades conocidas de sangre autóloga a volúmenes fijos de homogenado reciente de tejido cerebral, tratándose después las muestras como se ha descrito anteriormente. Estos datos demuestran que la densidad óptica a 550 nm de los sobrenadantes que contenían cianomethemoglobina se correlacionaban de forma lineal con la cantidad de sangre añadida (Figura 35B). Estos datos muestran estrechas correlaciones lineales (r = 1,00 y 0,98 para las Figuras 35A y 35B, respectivamente), así como una excelente reproducibilidad, como lo indican los errores típicos relativamente pequeños de la media. Para establecer que el TTC (usado comúnmente para distinguir el tejido cerebral que ha sufrido un infarto del que no lo ha sufrido^{28,30}) no afecta al ensayo espectrofotométrico de hemoglobina se dividieron por la mitad cerebros no manipulados (control), y una mitad se sometió al procedimiento de tinción con TTC convencional y la otra mitad se trató con solución salina como control. Estos datos (véase la Figura 35B, líneas continua y discontinua) indican que el tratamiento previo del tejido cerebral con TTC no afecta al ensayo espectrofotométrico de hemoglobina.

Para determinar si este método es capaz de detectar una HIC, el ensayo se realizó en una hemorragia intracerebral murina causada por dos procedimientos diferentes: infusión intraparenquimatosa de colagenasa u oclusión de la arteria cerebral media/reperfusión. En el primer procedimiento se administró colagenasa B en forma de infusión local a través de un orificio, con el fin de debilitar la pared vascular para promover la HIC (grupo Colagenasa). Para aumentar más aún la propensión a y el grado de la HIC se realizó un procedimiento similar en el que se administró inmediatamente el rt-PA después del procedimiento (grupo Colagenasa + rt-PA). También se incluyeron dos estados control, una operación falsa que incluía la perforación del orificio y la instilación de solución salina fisiológica (Falso) y un grupo no tratado (Control). Estos experimentos demostraron que la infusión de colagenasa aumenta la cantidad de sangre intracerebral detectada en el ensayo espectrofotométrico (especialmente con colagenasa + rt-PA) en comparación con los animales con tratamiento falso o los controles normales (Figura 36A).

En el segundo método, que es quizá el más relevante clínicamente, se generó para la inducción de una HIC un accidente cerebrovascular mediante la oclusión intraluminal transitoria de la arteria cerebral media seguida de una reperfusión. Además, los autores intentaron aumentar la propensión a la conversión hemorrágica administrando un agente trombolítico. Se estudiaron dos grupos, el que había recibido solución salina normal o el que había recibido rt-PA intravenoso inmediatamente después de retirar la sutura intraluminal oclusiva. Estos datos indican que la adición de un agente fibrinolítico después del accidente cerebrovascular aumenta la magnitud de la HIC que se detecta en el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina (Figura 36B). Cabe destacar que la absorbancia inicial es menor en los animales sometidos al accidente cerebrovascular que en los animales control/no tratados (Figuras 36A y 36B). Para investigar adicionalmente cómo la sangre intravascular residual puede afectar al ensayo espectrofotométrico de hemoglobina, se llevaron a cabo experimentos en los que se realizó una perfusión cefálica con solución salina fisiológica (administrada a través del ventrículo cardiaco izquierdo) justo antes de la decapitación del animal para extraerle el cerebro. En los animales control (n = 5), que recibieron una perfusión cardiaca con solución salina antes de la extracción del cerebro, la densidad óptica media tras preparar el tejido y el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina ascendió a 0,25 \pm 0,3 (que es menor que la densidad óptica observada en los animales sin perfusión cardiaca sometidos a una cirugía falsa o a ninguna (n = 10, DO 0,34 \pm 0,05, p = 0,05 frente a los controles con perfusión cardiaca). Por otra parte, no hubo ninguna diferencia en la DO después del accidente cerebrovascular se realizara o no la perfusión cardiaca con solución salina (0,15 \pm 0,04 para el accidente cerebrovascular sin perfusión cardiaca con solución salina, n = 5; 0,15 \pm 0,03 para el accidente cerebrovascular con perfusión cardiaca con solución salina, p = NS). Cuando los animales con accidente cerebrovascular perfundidos con solución salina se comparan con los animales sin accidente cerebrovascular perfundidos con solución salina, se observa una clara reducción de la DO en el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina. Estos datos sugieren que en los animales con un accidente cerebrovascular tal vez se detecte menos sangre intracerebral como resultado de una reducción en la cantidad total de sangre en la región ipsilateral de la ACM tras la isquemia.

Puntuación visual de la HIC

Con el fin de validar adicionalmente el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina, los autores lo compararon con una evaluación morfométrica del tamaño de la hemorragia, que se ha usado tradicionalmente en la bibliografía^{31-35}. Los autores desarrollaron un sistema de puntuación visual (0-4) en el que un observador imparcial puntúa el grado de la HIC en secciones cerebrales seriadas en base al diámetro máximo de la hemorragia. Esta valoración visual se realizó sobre una fotografía del cerebro tomada justo antes de realizar el ensayo espectrofotométrico de la hemoglobina (Figura 37), de manera que se pudieron correlacionar las dos técnicas en la misma muestra. En comparación con los controles no sometidos a ninguna intervención, los animales que recibieron una infusión local falsa (es decir, orificio + solución salina) muestran sólo un ligero aumento en la puntuación visual de la HIC (Figura 38A). Sin embargo, cuando se añadía al líquido de infusión colagenasa sola o colagenasa + rt-PA, las puntuaciones visuales de la HIC eran significativamente mayores (Figura 38A). En el modelo del accidente cerebrovascular el rt-PA igualmente dio como resultado un aumento en la puntuación visual de la HIC (Figura 38B). Cuando con estos datos se traza una curva para mostrar la relación entre la puntuación visual de la HIC y la técnica espectrofotométrica para cuantificar la HIC, se intuía una relación lineal (r = 0,88); sin embargo, esta relación no se mantenía con grados de hemorragia más bajos (puntuaciones visuales de la HIC 0 ó 1) (Figura 39).

Discusión

Recientemente ha quedado claro que una intervención temprana en el accidente cerebrovascular con ciertos agentes trombolíticos intravenosos (rt-PA) puede ser beneficiosa si se inicia en un plazo de 3 horas a partir de la aparición de los síntomas^{9,10}. Sin embargo, la administración de agentes trombolíticos fuera de esta estrecha ventana terapéutica puede causar una incidencia inaceptablemente elevada de HIC devastadoras (estreptoquinasa frente a placebo, mortalidad a los 10 días 34,0% frente a 18,2%, p = 0,002, mortalidad a los 6 meses 73% frente a 59%, p = 0,06)^{7}. Por lo tanto, sigue siendo un imperativo clínico la identificación de agentes mejores para el restablecimiento de la perfusión que conlleven un menor riesgo de conversión hemorrágica. Con el fin de estudiar adecuadamente nuevos agentes que interfieren en los mecanismos de coagulación o fibrinolíticos es necesario disponer de medios objetivos para cuantificar el riesgo de HIC. En la bibliografía experimental, la cuantificación de la HIC se ha realizado bien mediante procedimientos radiológicos de generación de imágenes^{32-37} o bien mediante una estimación visual de la magnitud de la hemorragia en el tejido cerebral tras la muerte^{31-35}. Estos procedimientos poseen una utilidad limitada, dependiendo de los estados estudiados. Por ejemplo, además de las restricciones logísticas impuestas por la necesidad de disponer de un equipo sofisticado, la mayoría de las técnicas radiológicas de generación de imágenes tienen un uso limitado en los modelos murinos, lo que puede excluir su uso en la evaluación de ratones transgénicos, una herramienta potencialmente potente para estudiar los sistemas de coagulación o fibrinolíticos. La estimación visual de la HIC es subjetiva por naturaleza y, como muestran los propios datos de los autores, puede ser relativamente insensible en la detección de grados bajos de HIC. Además, ni las técnicas radiológicas ni las visuales permiten cuantificar con exactitud la HIC cuando la región hemorrágica es irregular o multifocal.

Los presentes estudios se realizaron para desarrollar y validar un método objetivo para la cuantificación de la HIC en animales experimentales. Se ha informado previamente del uso de un ensayo espectrofotométrico para cuantificar la hemoglobina basado en la conversión de hemoglobina en cianomethemoglobina^{26,31}. En el cerebro, sin embargo, a su entender sólo se ha usado en ratas para medir el tamaño de un coágulo sanguíneo franco tras retirarlo del tejido cerebral adyacente^{31}. El ensayo espectrofotométrico que describen y validan los autores se puede usar en animales tan pequeños como los ratones, lo que facilita el uso de las numerosas cepas de ratón transgénicas disponibles en la actualidad (en particular de aquéllas que presentan alteraciones en las cascadas trombóticas o fibrinolíticas). Además, este ensayo espectrofotométrico permite cuantificar la HIC incluso en el caso de hemorragias irregulares o multifocales, que de otro modo serían difíciles de identificar o de aislar. Finalmente, y al contrario que el estudio de Lee, los autores han validado su estudio respecto a la reproducibilidad y fiabilidad usando cantidades conocidas de hemoglobina y sangre autóloga mezclada con tejido cerebral^{31}. Puesto que el procedimiento quirúrgico usado en los experimentos del accidente cerebrovascular no alteraba significativamente las concentraciones de hemoglobina en sangre (datos no mostrados), el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina se puede usar para extrapolar el volumen de hemorragia intracerebral cuando se conoce la concentración de hemoglobina en el momento de la hemorragia.

Para desarrollar y validar el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina para situaciones que pueden ser importantes en la HIC clínica, los autores generaron hemorragias intracerebrales mediante dos métodos diferentes: (1) inyección intracerebral de colagenasa (para debilitar la pared vascular, como puede ocurrir en el caso de un aneurisma o traumatismo) y (2) en un modelo del accidente cerebrovascular. En ambos casos, un cohorte de animales también recibió rt-PA con el fin de validar el modelo en el extremo superior del espectro de la HIC. Puesto que no existe ninguna medición establecida con patrón de oro para la HIC en ratones, las mediciones espectrofotométricas se compararon con el tamaño de la HIC valorado independientemente por puntuación visual. Finalmente, para probar que el ensayo es aún más útil en modelos experimentales del accidente cerebrovascular en los que los cerebros se tiñen con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) para cuantificar el volumen del infarto cerebral, los cerebros de los animales sometidos a una oclusión/reperfusión de la ACM se tiñeron con TTC antes de combinarlos y homogeneizarlos, para establecer que el procedimiento de tinción con TTC mismo no interfiere con la capacidad del ensayo espectrofotométrico de hemoglobina para cuantificar la HIC. Estos datos (Figura 1B) indican que no existe ninguna interferencia cruzada detectable entre los dos procedimientos cuando se usan sucesivamente (primero la tinción con TTC y después la homogeneización y el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina).

Además de su capacidad para detectar una HIC, los presentes estudios indican que esta técnica también puede dar una idea de la cantidad de sangre intravascular residual presente después de extraer el cerebro. El procedimiento de perfusión cefálica con solución salina no altera la densidad óptica para la cianomethemoglobina en los cerebros sometidos a un accidente cerebrovascular, lo que sugiere que la cantidad de sangre intravascular es relativamente fija y no se elimina por lavado con este procedimiento. Sin embargo, en los animales control que no se trataron de otra manera, el tratamiento de perfusión con solución salina parece reducir la densidad óptica para la cianomethemoglobina en aproximadamente 30%. Los presentes experimentos no proporcionan ninguna razón para esta diferencia, pero se puede especular que después del accidente cerebrovascular se da un componente de vasoconstricción/vasooclusión en la zona del infarto, lo que hace que la técnica de perfusión con solución salina sea menos eficaz a la hora de eliminar por lavado la sangre intravascular residual adicional. Asimismo, si realmente existe un componente de vasoconstricción después del accidente cerebrovascular o la hemorragia intracerebral inducida experimentalmente, esto puede reducir la reserva de sangre intravascular y, por lo tanto, ser responsable de una disminución generalizada de la densidad óptica cuando se comparan los cerebros control y accidente cerebrovascular/HIC (aún cuando esté presente algo de sangre extravascular en el último grupo).

Merece la pena mencionar también algunos aspectos técnicos de la técnica espectrofotométrica para medir la hemorragia intracerebral. Aunque existe un amplio pico de absorbancia para la cianomethemoglobina alrededor de 540 nm, en los presentes experimentos se midió la absorbancia de cianomethemoglobina a 550 nm. La razón de ello es que muchos espectrofotómetros presentan capacidades para longitudes de onda fijas que dependen de los filtros predeterminados, y 550 nm es una longitud de onda comúnmente usada (especialmente en lectores de placas ELISA). Aunque quizá la medición de la absorbancia a 540 nm hubiera proporcionado mediciones de densidad óptica ligeramente mayores, el pico de absorbancia de la cianomethemoglobina es amplio en este área, y de este modo se puede usar 550 nm sin necesidad de corregir para la absorbancia de ferri- o ferrocianuro (los coeficientes de extinción para la cianomethemoglobina a 551 nm y 540 nm son 11,5 y 11,1, respectivamente, frente al coeficiente de extinción 41 veces menor de ferri- o ferrocianuro^{38}). Los estudios en los que se usó un espectrofotómetro de longitudes de onda continuas (que se usó para medir la DO a 540 nm) y un lector de placas ELISA de espectro discreto (usado para medir la DO a 550 nm) dieron resultados similares. Puesto que la última técnica era más sencilla, aumentaba el rendimiento del procedimiento y permitía minimizar el volumen de las muestras, los autores decidieron usar esta última técnica para los estudios mostrados en la sección "Resultados".

Existen otras posibles consideraciones técnicas que se deben tener en cuenta a la hora de usar el ensayo espectrofotométrico. Aunque los autores han demostrado que el procedimiento espectrofotométrico se puede usar en combinación con la tinción de TTC de secciones cerebrales seriadas para analizar el volumen de infarto, el tejido seguidamente debe ser homogeneizado y extraído, lo que destruye la arquitectura del tejido e imposibilita realizar una caracterización histológica posterior. Es posible que esta técnica sobrestime el grado de HIC si involuntariamente se incluye sangre extracerebral durante la extirpación del cerebro, o que la técnica subestime el grado de HIC si queda adherida a la bóveda craneal sangre epidural, subdural o subaracnoidea residual, que se desecha durante el proceso de extirpación del cerebro.

Debido a la naturaleza de la técnica de medición, en la que se absorbe luz a una longitud de onda dada y a lo largo de un recorrido de longitud fija, cualquier cosa que enturbie el sobrenadante del cerebro homogeneizado puede aumentar la lectura de la DO. Puede incluir lípidos, proteínas plasmáticas anormales y estroma de eritrocitos. De hecho, en experimentos preliminares los autores descubrieron que las DOs estaban falsamente elevadas cuando la centrifugación era insuficiente y se incluía parte de la capa lipídica en el ensayo. Las piridinas libres pueden alterar el espectro de absorbancia de la cianomethemoglobina, y existe la posibilidad de que otros hemocromógenos también reaccionen con el reactivo de Drabkin^{39}. Sin embargo, a su entender estas reacciones no deberían interferir de forma significativa en la determinación de la sangre/hemorragia intracerebral.

Resumiendo, los presentes datos ilustran cómo un ensayo espectrofotométrico sencillo y económico para la hemoglobina puede proporcionar un método útil para cuantificar una HIC. Esta técnica debería resultar especialmente útil en la evaluación del potencial hemorrágico de terapias trombolíticas o anticoagulantes de nuevo desarrollo para el tratamiento del accidente cerebrovascular.

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Ejemplo 13 El factor IXa bloqueado en el sitio activo limita la trombosis microvascular y el daño cerebral en el accidente cerebrovascular murino sin aumentar la hemorragia intracerebral Compendio

El dilema clínico en el tratamiento del accidente cerebrovascular reside en que los agentes que restablecen la permeabilidad vascular incrementan el riesgo de hemorragia intracerebral. El factor IXa bloqueado en el sitio activo (IXai), formado a partir del factor IXa purificado por dansilación de su sitio activo, compite con el factor IXa nativo para inhibir el ensamblaje del factor IXa en el complejo de activación intrínseca del factor X. Cuando se tratan previamente con el factor IXai, los ratones sometidos a una isquemia cerebral focal y reperfusión mostraron una menor deposición microvascular de fibrina y plaquetas, una mayor perfusión cerebral e infartos cerebrales significativamente más pequeños que los controles tratados con vehículo. La cerebroprotección mediada por el factor IXai dependía de la dosis, no estaba asociada con una hemorragia intracerebral a las dosis terapéuticamente eficaces y se observaba incluso cuando se administró el factor IXai una vez iniciada la isquemia cerebral. La administración del factor IXai constituye una nueva estrategia para el tratamiento del accidente cerebrovascular en evolución sin aumentar el riesgo de hemorragia intracerebral.

Introducción

El restablecimiento del flujo sanguíneo hacia el cerebro isquémico a tiempo constituye el actual paradigma del tratamiento para el accidente cerebrovascular agudo^{1-3}. La administración de un agente trombolítico, incluso cuando se administra en las condiciones óptimas, puede no proporcionar este resultado clínico deseado. La perfusión a menudo no vuelve a los niveles preisquémicos (hipoperfusión postisquémica), lo que sugiere que el daño isquémico no es causado únicamente por la oclusión original sino que también existe un componente de fallo microcirculatorio. Además, la trombolisis del accidente cerebrovascular agudo está asociada con un mayor riesgo de hemorragia intracerebral (HIC)^{1-4}, lo que indica que continúa existiendo una clara necesidad de identificar nuevos agentes que puedan promover la reperfusión sin aumentar el riesgo de HIC.

Tras un episodio isquémico, la pared vascular pasa de su estado de reposo antiadhesivo y antitrombótico a uno que promueve la adhesión de leucocitos y la trombosis. En el accidente cerebrovascular agudo, el reclutamiento activo de leucocitos mediante receptores de adhesión expresados en la microvasculatura ipsilateral, tales como ICAM-1^{5} y selectina P^{6}, potencia la hipoperfusión postisquémica. Sin embargo, experimentos con ratones mutantes de deleción para cada uno de estos genes demuestran que incluso en su ausencia el flujo sanguíneo cerebral (FSC) postisquémico sólo vuelve parcialmente al nivel inicial, lo que sugiere la existencia de mecanismos adicionales responsables de la ausencia de reflujo cerebrovascular postisquémico. Para estudiar esta posibilidad se ha diseñado un primer conjunto de experimentos para comprobar la hipótesis de que se produce una trombosis local a nivel de la microvasculatura (distal respecto al sitio de oclusión primaria) en el accidente cerebrovascular.

Para valorar las consecuencias deletéreas de la trombosis microvascular en el accidente cerebrovascular, en el segundo conjunto de experimentos se estudió la hipótesis de que el bloqueo selectivo de la ruta intrínseca de coagulación pudiera limitar la trombosis microvascular, protegiendo de este modo el cerebro durante el accidente cerebrovascular. Se eligió la estrategia de la inhibición selectiva de la ruta intrínseca de coagulación porque es la principal responsable de la trombosis intravascular. La heparina, la hirudina y los agentes fibrinolíticos interfieren en la ruta final común de coagulación para inhibir la formación o acelerar la lisis de fibrina y, por lo tanto, aumentan la propensión a una HIC. Los autores plantearon la hipótesis de que el bloqueo selectivo del ensamblaje del complejo de activación de IXa/VIIIa/X puede proporcionar un nuevo mecanismo para limitar la trombosis intravascular, conservando al mismo tiempo los mecanismos de hemostasia extravascular por medio de la ruta de coagulación del factor extrínseco/tisular, que puede ser crítica en el tejido cerebral que ha sufrido el infarto o en las regiones adyacentes en las que los vasos pequeños son frágiles y se rompen. Los autores usaron una nueva estrategia en la que se administró un inhibidor competitivo del factor IXa (IXa bloqueado en el sitio activo, o IXai) a ratones sometidos a un accidente cerebrovascular para comprobar la hipótesis de que ésta mejora el pronóstico del accidente cerebrovascular sin aumentar la HIC.

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Métodos

Modelo murino del accidente cerebrovascular: Se indujo una isquemia cerebral focal transitoria en ratones mediante la oclusión intraluminal de la arteria cerebral media (45 minutos) y reperfusión (22 h) como se describió anteriormente^{7}. Se realizaron mediciones en serie del flujo sanguíneo cerebral (FSC) relativo mediante flujometría de láser doppler^{7} y se determinaron los volúmenes de infarto (% del hemisferio ipsilateral) mediante un análisis planimétrico/volumétrico de secciones cerebrales seriadas teñidas con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC)^{7}.

Estudios de ^{111}indio-plaquetas: La acumulación de plaquetas se determinó usando plaquetas marcadas con ^{111}indio, recogidas y preparadas como se ha descrito previamente^{8}. Justo antes de la cirugía se administraron a los ratones por vía intravenosa 5 x 10^{6} plaquetas marcadas con ^{111}In; la deposición se cuantificó después de 24 horas en forma de cpm ipsilaterales/cpm contralaterales.

Inmunotransferencia/inmunotinción de fibrina: La acumulación de fibrina se midió tras sacrificar (a los animales totalmente heparinizados) usando procedimientos de inmunotransferencia/inmunotinción descritos y validados recientemente^{9}. Puesto que la fibrina es extremadamente insoluble, los extractos de tejido cerebral se prepararon por digestión con plasmina, a continuación se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida convencional para la electroforesis y después se inmunotransfirieron usando un anticuerpo policlonal de conejo anti-humano preparado contra los dímeros de cadenas gamma-gamma presentes en la fibrina reticulada y que es capaz de detectar la fibrina murina, presentando una reactividad cruzada relativamente reducida con fibrinógeno^{10}. La acumulación de fibrina se expresó como relación ipsilateral/contralateral. En experimentos adicionales los cerebros se incorporaron en parafina, se seccionaron y se inmunotiñeron usando el mismo anticuerpo anti-fibrina.

Ensayo espectrofotométrico de la hemoglobina y puntuación visual de la HIC: La HIC se cuantificó mediante un ensayo espectrofotométrico que desarrollaron y validaron los autores^{11,12}. Brevemente, los cerebros de ratón se homogeneizaron, se sonicaron y se centrifugaron, y la methemoglobina presente en los sobrenadantes se convirtió en cianomethemoglobina (usando el reactivo de Drabkin) cuya concentración se evaluó midiendo la DO a 550 nm frente a una curva patrón generada con cantidades conocidas de hemoglobina. La puntuación visual de la HIC la realizó un observador imparcial en secciones coronales seriadas de 1 mm en base al diámetro máximo de la hemorragia observada en cualquiera de las secciones (puntuación de la HIC 0, no hay hemorragia; 1, < 1 mm; 2, 1-2 mm, 3, > 2-3 mm; 4, > 3 mm.).

Preparación del factor IXai^{13}: El factor IXai se preparó modificando selectivamente el residuo de histidina en el sitio activo del factor IXa usando dansil-glu-gly-arg-clorometilcetona. Se cargó con Proplex una columna preparativa que contenía inmovilizado un anticuerpo monoclonal dependiente de calcio contra el factor IX. La columna se lavó, se eluyó con un tampón que contenía EDTA y a continuación se activó el factor IX presente en el eluato (confirmado como banda única en SDS-PAGE) añadiendo el factor XIa (incubación en presencia de CaCl_{2}). El factor IXa purificado se hizo reaccionar con un exceso molar de 100 veces de dansil-glu-gly-arg-clorometilcetona y la mezcla se dializó. El producto final (IXai), desprovisto de la actividad procoagulante, migra en la SDS-PAGE de forma idéntica a IXa. Este material (factor IXai), tras filtrarlo (0,2 \mum) y cromatografiarlo en columnas de DeToxi-gel para eliminar cualquier traza de contaminación por endotoxinas (no se detectaron lipopolisacáridos en alícuotas de la muestra), se usó después para los experimentos. Seguidamente, el IXai se congeló en alícuotas a -80ºC hasta el momento de su uso. En los experimentos en los que se usó IXai, éste se administró en forma de un solo bolo intravenoso en los tiempos indicados y a las dosis indicadas.

Resultados

Para generar un accidente cerebrovascular en un modelo murino se introduce una sutura en la vasculatura cerebral de tal manera que ocluya el orificio de la arteria cerebral media derecha, causando una isquemia en la zona subtendida. Al retirar la sutura después de un periodo de oclusión de 45 minutos se genera un modelo reperfundido del accidente cerebrovascular; los ratones así tratados muestran déficits neurológicos focales, así como áreas claras de infarto cerebral. Puesto que la sutura oclusiva no avanza más allá del afluente vascular principal (la arteria cerebral media), este modelo brinda una excelente oportunidad para investigar los acontecimientos "corriente abajo" que ocurren en la microvasculatura cerebral en respuesta al periodo de interrupción del flujo sanguíneo. El papel de la trombosis microvascular se investigó en este modelo de la siguiente manera. Para demostrar que se generan focos trombóticos ricos en plaquetas en el hemisferio cerebral isquémico, se administraron a los ratones, justo antes de introducir la sutura intraluminal oclusiva, plaquetas marcadas con ^{111}In para seguir su deposición durante el periodo resultante de isquemia cerebral y reperfusión. En los animales no sometidos al procedimiento quirúrgico para generar el accidente cerebrovascular, la presencia de plaquetas era, como era de esperar, aproximadamente la misma en los hemisferios derecho e izquierdo (Figura 40A, barra izquierda). Sin embargo, cuando los animales se sometieron a un accidente cerebrovascular (y recibieron únicamente vehículo para controlar los experimentos posteriores), las plaquetas radiomarcadas se acumulaban con preferencia en el hemisferio isquémico (ipsilateral), observándose una deposición significativamente menor en el hemisferio contralateral (no isquémico) (Figura 40A, barra central). Estos datos confirman la existencia de trombos ricos en plaquetas en la zona isquémica. Cuando el factor IXai se administra a los animales antes de introducir la sutura intraluminal oclusiva, se produce una reducción significativa en la acumulación de plaquetas radiomarcadas en el hemisferio ipsilateral (Figura 40A, barra derecha).

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Otra serie de evidencias también confirma la existencia de una trombosis microvascular en el accidente cerebrovascular. Estos datos provienen de la inmunodetección de fibrina mediante un anticuerpo dirigido contra un neoepítopo en el dímero de cadenas gamma-gamma de la fibrina reticulada. Las inmunotransferencias muestran una banda de mayor intensidad en el hemisferio ipsilateral (derecho) de animales sometidos a una isquemia cerebral focal y reperfusión y tratados con vehículo (Figura 40B, "Vehículo"). En los animales tratados con el factor IXai (300 \mug/kg) antes del accidente cerebrovascular no se observa ningún aumento obvio en la acumulación ipsilateral de fibrina (Figura 40B, "Factor IXai"). Para demostrar que la acumulación de fibrina se debía a la deposición de fibrina intravascular (y no a cambios inespecíficos de permeabilidad y a la exposición a la matriz subendotelial), la inmunotinción de fibrina localizó claramente el aumento de fibrina en los lúmenes de los microvasos intracerebrales ipsilaterales (Figura 40C).

Para investigar si el factor IXai puede limitar la trombosis intracerebral y restablecer la perfusión se administró el IXai a los ratones justo antes del accidente cerebrovascular (300 \mug/kg). Estos experimentos demuestran tanto una reducción en la acumulación de ^{111}In-plaquetas en el hemisferio ipsilateral (Figura 41A) como una menor presencia de fibrina intravascular medida por inmunotinción. Además se observa un aumento significativo en el FSC a las 24 horas, lo que sugiere que el factor IXai ha restablecido la permeabilidad microvascular (Figura 41A). La relevancia clínica de esta observación se ve subrayada por la capacidad del factor IXai para reducir los volúmenes de infarto cerebral (Figura 41B). Estos efectos beneficiosos del factor IXai dependían de la dosis, siendo 600 \mug/kg la dosis óptima (Figura 41C).

Puesto que el desarrollo de una HIC es la principal preocupación de toda estrategia anticoagulante en el accidente cerebrovascular establecido, se midió el efecto de IXai sobre la HIC usando el método espectrofotométrico recientemente validado por los autores para cuantificar la HIC^{11,12}. Estos datos indican que a las dosis más bajas (y a las más eficaces) no hay ningún aumento significativo de la HIC (Figura 42A). A la dosis más alta ensayada (1.200 \mug/kg) se produce un aumento en la HIC, que fue corroborado por un método de puntuación visual semicuantitativo que los autores también han publicado recientemente (Figura 42B)^{11,12}.

Puesto que los tratamientos dirigidos a mejorar el pronóstico del accidente cerebrovascular agudo deben ser administrados después de la presentación clínica y puesto que la fibrina se sigue formando después del episodio isquémico inicial del accidente cerebrovascular, los autores investigaron si IXai puede ser eficaz cuando se administra una vez iniciada la isquemia cerebral. El IXai administrado tras la oclusión de la arteria cerebral media (después de retirar la sutura oclusiva) proporcionó una protección cerebral significativa a juzgar por su capacidad para reducir significativamente los volúmenes de infarto cerebral en comparación con los controles tratados con vehículo (Figura 43).

Discusión

Los datos de estos estudios muestran evidencias claras de la formación de trombos intravasculares (tanto plaquetas como fibrina) en la microvasculatura cerebral postisquémica. La importancia fisiopatológica de la trombosis microvascular en el accidente cerebrovascular se ve subrayada por la capacidad del factor IXai para reducir la trombosis microvascular (disminuye tanto la acumulación de plaquetas como la de fibrina, con un aumento concomitante en el FSC) y para mejorar el pronóstico del accidente cerebrovascular. Estas potentes actividades antitrombóticas del factor IXai probablemente son clínicamente significativas en el accidente cerebrovascular establecido, pues el factor IXai no sólo reduce los volúmenes de infarto de una manera dependiente de la dosis, sino que también lo hace cuando se administra tras iniciarse el accidente cerebrovascular. Además, el tratamiento con el factor IXai a dosis clínicamente relevantes no provoca ningún aumento de la HIC, lo que convierte la inhibición selectiva del ensamblaje del complejo de activación del factor IXa/VIIIa/X con el factor IXai en una diana atractiva para el tratamiento del accidente cerebrovascular en seres humanos.

Hay numerosas razones por las que las estrategias anticoagulantes dirigidas pueden constituir una alternativa atractiva al uso actual de agentes trombolíticos en el control del accidente cerebrovascular agudo, debido a su éxito irregular en los ensayos clínicos. En teoría, un tratamiento ideal para el accidente cerebrovascular agudo debe prevenir la formación o inducir la disolución de la red de fibrina-plaquetas que causa la trombosis microvascular en la zona isquémica sin aumentar el riesgo de hemorragia intracerebral. Sin embargo, los agentes trombolíticos que se han estudiado en ensayos clínicos sobre el accidente cerebrovascular han aumentado sistemáticamente el riesgo de hemorragia intracerebral^{1-4}. La estreptoquinasa, administrada en las primeras horas (< 6) tras iniciarse el accidente cerebrovascular, estaba asociada con una mayor tasa de transformación hemorrágica (hasta 67%); aunque hubo una mayor mortalidad temprana, los pacientes sobrevivientes sufrían menos discapacidades residuales. La administración del activador tisular de plasminógeno (tPA) en las 7 horas siguientes (en particular en las 3 horas siguientes) al inicio del accidente cerebrovascular dio como resultado una mayor mortalidad temprana y mayores tasas de conversión hemorrágica (entre 7 y 20%), aunque los supervivientes presentaban menos discapacidades residuales. Con el fin de desarrollar mejores terapias anticoagulantes o trombolíticas se examinaron varios modelos animales del accidente cerebrovascular. Estos modelos generalmente consisten en la administración de sangre coagulada por la arteria carótida interna seguida de la administración de un agente trombolítico. En ratas, la administración de tPA en el plazo de 2 horas tras el accidente cerebrovascular mejoró el flujo sanguíneo cerebral y redujo el tamaño del infarto hasta en un 77%^{14,15}. En un modelo similar del accidente cerebrovascular embólico en conejos, el tPA era eficaz en el restablecimiento del flujo sanguíneo y en la reducción del tamaño del infarto, apareciendo ocasionalmente una hemorragia intracerebral^{16,17}. Sin embargo, y aunque se ha avanzado en la disolución inmediata de los coágulos, estos estudios (así como los ensayos clínicos de agentes trombolíticos) indican que existe un mayor riesgo concomitante de hemorragia intracerebral en este planteamiento terapéutico.

Debido al inicio normalmente precipitado del accidente cerebrovascular isquémico, el tratamiento se ha dirigido en primer lugar a la lisis de los restos fibrinosos/ateroembólicos más importantes que obstruyen un afluente vascular principal del cerebro. Sin embargo, como demuestra el presente trabajo, existe un importante componente de trombosis microvascular que se produce corriente abajo del sitio de oclusión original y que probablemente tiene un considerable significado fisiopatológico para la hipoperfusión postisquémica (ausencia de reflujo) y el daño cerebral en el accidente cerebrovascular en evolución. Estos datos coinciden de forma excelente con los que se han comunicado previamente, en los que los microtrombos se han localizado topográficamente en la región isquémica de infartos cerebrales recientes^{18}. El uso de un agente que inhibe el ensamblaje del complejo de activación del factor IXa/VIIIa/X representa un nuevo planteamiento para limitar la trombosis que se produce dentro de los lúmenes microvasculares sin afectar a la hemostasia extravascular, cuyo mantenimiento puede ser crucial para prevenir una HIC. En los presentes estudios, el tratamiento con el factor IXai reduce la acumulación microvascular de plaquetas y de fibrina, mejora el flujo sanguíneo cerebral postisquémico y reduce los volúmenes de infarto cerebral en el accidente cerebrovascular establecido sin aumentar la HIC.

El poder del factor IXai como agente anticoagulante es el resultado del papel integral que desempeña el factor IX activado en la cascada de coagulación. La estrategia del bloqueo del factor IXa no sólo parece ser eficaz en el accidente cerebrovascular establecido, sino que también resulta ser eficaz en la prevención de una oclusión progresiva de la arteria coronaria inducida por la aplicación de una corriente eléctrica a la arteria coronaria circunfleja izquierda en perros^{13}. Al igual que en aquellos estudios, en los que el factor IXai no prolongaba el tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT) (224), la administración del factor IXai a la dosis terapéuticamente eficaz de 300 \mug/kg en el modelo murino tampoco alteró significativamente el tiempo de protrombina ni el APTT (13,4 \pm 0,7 y 79,9 \pm 8,9 frente a 12,1 \pm 0,7 y 70,6 \pm 8,9 para PT y APTT de ratones tratados con IXai (n = 7) y tratados con vehículo (n = 4), respectivamente, P=NS).

Los datos que demuestran la eficacia del IXai administrado tras iniciarse el accidente cerebrovascular conducen a otra hipótesis interesante, que consiste en que la formación del trombo representa un equilibrio dinámico entre los procesos de trombogénesis y fibrinolisis. Se ha demostrado que este equilibrio dinámico en los hombres existe incluso en estados normales (no isquémicos)^{19}. Los datos de los presentes estudios, que muestran que el factor IXai es eficaz aún cuando se administra una vez comenzado el accidente cerebrovascular, sugieren que esta estrategia restablece el equilibrio dinámico, que después de una isquemia cerebral está desplazado hacia la trombosis, a través de un fenotipo de reposo (antitrombótico) de la pared vascular.

Por último, aunque la trombolisis elimine con éxito el principal trombo oclusivo y/o las estrategias anticoagulantes sean eficaces para limitar el progreso de la trombosis microcirculatoria, el flujo sanguíneo normalmente no vuelve a los niveles preisquémicos. Un ejemplo de ello lo proporciona el presente estudio en el que el FSC sigue sin volver a los niveles preisquémicos, aunque el FSC mejora considerablemente con el factor IXai (que limita la acumulación de fibrina/plaquetas). Estos datos confirman la existencia de múltiples mecanismos efectores para la hipoperfusión cerebral postisquémica, que incluyen la acumulación postisquémica de neutrófilos y la consecuente obstrucción microvascular, siendo la expresión de selectina P y de ICAM-1 en las células endoteliales microvasculares cerebrales especialmente importante a este respecto^{5,6}. Visto desde la perspectiva de la expresión de los receptores de adhesión de leucocitos, los niveles del FSC mejoran después del accidente cerebrovascular en comparación con los controles, pero no vuelven a los niveles preisquémicos ni siquiera en ausencia de estos receptores de adhesión. En conjunto, estos datos sugieren que la trombosis microvascular y la adhesión de leucocitos contribuyen conjuntamente a la hipoperfusión cerebral postisquémica.

Resumiendo, la administración de un inhibidor competitivo del factor IXa, el factor IXai bloqueado en el sitio activo, representa una nueva terapia para el tratamiento del accidente cerebrovascular. Esta terapia no sólo reduce la trombosis microcirculatoria, mejora el flujo sanguíneo cerebral postisquémico y reduce el daño del tejido cerebral tras un accidente cerebrovascular, sino que también lo hace si se administra después de comenzar la isquemia cerebral sin aumentar el riesgo de HIC. Esta combinación de propiedades beneficiosas y el riesgo relativamente bajo de transformación hemorrágica lo convierte en un planteamiento extremadamente atractivo para estudios posteriores y posibles ensayos clínicos sobre el accidente cerebrovascular en seres humanos.

Referencias

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6. Exacerbación del daño cerebral en ratones que expresan el gen de la selectina P: Identificación del bloqueo de la selectina P como nueva diana para el tratamiento del accidente cerebrovascular. Ejemplo 10 de la presente memoria.

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11. Uso de un ensayo espectrofotométrico de hemoglobina para cuantificar objetivamente la hemorragia intracerebral en ratones. Ejemplo 12 de la presente memoria.

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19. Nossel HL: Relative proteolysis of the fibrinogen B beta chain by thrombin and plasmin as a determinant of thrombosis. Nature 1981; 291:165-167.

Claims

1. Uso de un gas que comprende monóxido de carbono en una cantidad suficiente para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de un trastorno isquémico en un sujeto durante un periodo de tiempo suficiente.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que la cantidad de monóxido de carbono constituye entre 0,0001% de monóxido de carbono y 2% de monóxido de carbono en un gas inerte.

3. El uso de la reivindicación 2, en el que dicho gas inerte comprende aire, oxígeno, argón o nitrógeno.

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composición farmacéutica está adaptada para inhalación.

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composición farmacéutica está adaptada para la exposición extracorporal de sangre o de líquidos corporales.

6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el trastorno isquémico comprende un trastorno vascular periférico, una flebotrombosis, una embolia pulmonar, un infarto de miocardio, un ataque isquémico transitorio, isquemia pulmonar, angina inestable, un déficit neurológico isquémico reversible, actividad trombolítica adjunta, estados de coagulación excesiva, anemia falciforme o un trastorno de tipo accidente cerebrovascular.

7. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sujeto es sometido a una cirugía seleccionada del grupo formado por cirugía cardiaca, cirugía pulmonar, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía abdominal o cirugía de trasplante de órganos.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que la cirugía de trasplante de órganos comprende una cirugía de trasplante de corazón, pulmón, páncreas o hígado.

9. El uso de la reivindicación 7 u 8, en el que dicho periodo de tiempo comprende de aproximadamente 1 día antes de la cirugía a aproximadamente 1 día después de la cirugía.

10. El uso de la reivindicación 7 a 8, en el que dicho periodo de tiempo comprende de aproximadamente 12 horas antes de la cirugía a aproximadamente 12 horas después de la cirugía.

11. El uso de la reivindicación 7 a 8, en el que dicho periodo de tiempo comprende de aproximadamente 12 horas antes de la cirugía a aproximadamente 1 hora después de la cirugía.

12. El uso de la reivindicación 7 a 8, en el que dicho periodo de tiempo comprende de aproximadamente 1 hora antes de la cirugía a aproximadamente 1 hora después de la cirugía.