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MXPA99002996A - Metodos para tratar un trastorno isquemico y mejorar el resultado causado por un ataque subito - Google Patents

Metodos para tratar un trastorno isquemico y mejorar el resultado causado por un ataque subito

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Publication number
MXPA99002996A
MXPA99002996A MXPA/A/1999/002996A MX9902996A MXPA99002996A MX PA99002996 A MXPA99002996 A MX PA99002996A MX 9902996 A MX9902996 A MX 9902996A MX PA99002996 A MXPA99002996 A MX PA99002996A
Authority
MX
Mexico
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selectin
attack
surgery
cerebral
mice
Prior art date
Application number
MXPA/A/1999/002996A
Other languages
English (en)
Inventor
J Pinsky David
Stern David
Marie Schmidt Ann
A Rose Eric
Connoly E Sander
A Solomon Robert
J Prestigiacomo Charles
Original Assignee
Connoly E Sander
J Pinsky David
J Prestigiacomo Charles
A Rose Eric
Marie Schmidt Ann
A Solomon Robert
Stern David
The Trustees Of Columbia University In The City Of
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Publication date
Application filed by Connoly E Sander, J Pinsky David, J Prestigiacomo Charles, A Rose Eric, Marie Schmidt Ann, A Solomon Robert, Stern David, The Trustees Of Columbia University In The City Of filed Critical Connoly E Sander
Publication of MXPA99002996A publication Critical patent/MXPA99002996A/es

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Abstract

La presente invención se refiere a un método para tratar un trastorno isquémico en un sujeto, el cual comprende administrar al sujeto una forma farmacéuticamente aceptable de un antagonista de selección en una cantidad suficiente durante un período de tiempo suficiente para evitar la acumulación de células sanguíneas blancas de manera que se trate el trastorno isquémico en el sujeto. La invención proporciona además un método para tratar un trastorno isquémico en un sujeto, el cual comprende administrar al sujeto monóxido de carbono gaseoso en una cantidad suficiente durante un período de tiempo suficiente para de esta manera tratar el trastorno isquémico en el sujeto. La invención proporciona además un método para tratar un trastorno isquémico en un sujeto, el cual comprende administrar al sujeto una forma farmacéuticamente aceptable de factor IX inactivado en una cantidad suficiente sobre un período de tiempo suficiente para inhibir la coagulación de manera que se trate el trastorno isquémico en el sujeto.

Description

MÉTODOS PARA TRATAR UN TRASTORNO ISQUÉMICO Y MEJORAR EL RESULTADO CAUSADO POR UN ATAQUE SÚBITO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención descrita en la presente se ha realizado con soporte del gobierno bajo los Institutos nacionales de salud, Instituto nacional del corazón, pulmón y sangre otorgamiento HL55397 del Departamento de salud y servicios humanos. En consecuencia, el gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre esta invención. A través de esta solicitud, se hace referencia a diferentes publicaciones. Las descripciones de estas publicaciones en su totalidad se incorporan en la presente como referencia en esta solicitud con el fin de describir más completamente el estado de la técnica como se conoce por aquéllos familiarizados en la presente hasta la fecha de la invención descrita y reivindicada en la presente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El tratamiento de trastornos isquémicos ha sido el foco de la investigación durante muchos años. La disponibilidad reciente de ratones transgénicos ha llevado a un número floreciente de reportes que describen los efectos de los productos genéticos específicos sobre la patofisiología del ataque (ataque súbito, infarto o crisis) . Aunque los modelos de isquemia cerebral focal en modelos en ratas se han descrito bien, son escasas las descripciones de un modelo de ratón de oclusión de la arteria cerebral media, y permanecen sin definirse fuentes de variabilidad experimental potencial. El reclutamiento agudo de neutrófilos al tej ido cardíaco o pulmonar postisquémico tiene efectos dañinos en el período temprano de repercusión, pero los mecanismos y efectos del flujo de entrada de neutrófilos en la patogénesis del desarrollo del ataque permanece en controversia.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN . La presente invención proporciona un método para tratar un trastorno isquémico en un sujeto, el cual comprende administrar al sujeto una forma farmacéuticamente aceptable de un antagonista de selectina en una cantidad suficiente durante un período de tiempo suficiente para evitar la acumulación de células sanguíneas blancas de manera que se trate el trastorno isquémico en el sujeto. La invención proporciona además un método para tratar un trastorno isquémico en un sujeto el cual comprende administrar al sujeto monóxido de carbono gaseoso en una cantidad suficiente durante un período de tiempo suficiente para de esta manera tratar el trastorno isquémico en el sujeto. La invención proporciona además un método para tratar un trastorno isquémico en un sujeto, el cual comprende administrar al sujeto una forma farmacéuticamente aceptable del factor IX inactivado en una cantidad suficiente durante un período de tiempo suficiente para inhibir la coagulación de manera que se trate el trastorno isquémico en el sujeto.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS Figura 1 Acumulación de neutrófilos posterior a isquemia cerebral focal y repercusión en ratón. Se realizó durante 45 minutos oclusión de la arteria cerebral media derecha, seguido por 23 horas de reperfusión en ratones machos C57B1/J6. Una hora antes de la oclusión de la arteria cerebral media, se inyectaron «3.3 x 105 neutrófilos marcados con 1X1 In en la vena de la cola. Se obtuvieron cuentas Ipsilateral (hemisferio derecho) y contralateral (hemisferio izquierdo) y se normalizaron por g de tejido (n=7, **=p < 0.01).
Figuras 2A, 2B, 2C v 2D. Efecto de la supresión preoperativa de neutrófilos sobre los índices del resultado al ataque. Se sometieron ratones macho C57B1/J6 a oclusión transitoria de la arteria cerebral media, como se describe antes (tipo silvestre, n=16) y se compararon con un procedimiento similar realizado en ratones in unosuprimidos de neutrófilos durante 3 días antes del día de la cirugía PMN-, n=18) . Figura 2A. Volúmenes de infarto, calculados basados en Cortes cerebrales en serie teñidos TTC, y expresados como el % de volumen hemisférico ipsilateral. Figura 2B. Calificación de deficiencia neurológica, evaluada antes de anestesia 24 horas después de oclusión transitoria de la arteria cerebral media; el número 4 representa la deficiencia neurológica más severa. Figura 2C. Flujo sanguíneo cerebral, medido por mediciones de flujo doppler láser 2 mm posterior al bregma, expresado como % de flujo sanguíneo hemisférico contralateral. Figura 2D. Mortalidad a las 24 horas posterior a la oclusión transitoria de la arteria cerebral media. (*•= p< 0.05, ** = p< 0.01, *** = p< 0.001) .
Figura 3. Expresión de transcritos de molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media. Se preparó ARN de los hemisferios ipsilateral (infarto) y contralateral (sin infarto) del mismo ratón y se cargó gel de agarosa con 20 µg de ARN total por banda.
Después de transferencia durante la noche a una membrana de nylon, la transferencia Northern se sondeó con ADNc33 de ICAM-1 de ratón de 1.90 kb marcado con 32P . Se utilizó para un control una sonda de /3-actina.
Figuras 4A y 4B . Expresión de antígeno para molécula de adhesión intracelular-1 (ICAM-1) en la microvasculatura cerebral 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media. Se obtuvo una sección coronal de cerebro para inmunotinción con ICAM-1, de manera que se pudieran comparar los hemisferios no infartado e infartado del mismo cerebro bajo condiciones idénticas de tinción. La tinción se realizó utilizando anticuerpo de rata contra ICAM-l de ratón, con sitios de unión de anticuerpo primario visualizados por fosfatasa alcalina. Figura 4A. Microvasos cerebrales en la sección contralateral (no infartada) de un cerebro obtenido 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media. Figura 4B. Microvasos cerebrales del hemisferio ipsilateral (infartado) de la misma sección de cerebro a la mostrada en la figura 4A. Las células endoteliales de los microvasos cerebrales ipsilaterales demuestran expresión aumentada de ICAM-l (tinción rojo brillante) . Amplificación, 250X.
Figuras 5A y 5B . Anatomía cerebrovascular en ratones homocigotos carentes de ICAM-l (figura 5B) y controles de tipo silvestre (figura 5A) . La tinción con tinta india de la anatomía cerebrovascular con una vista inferior del círculo de Willis demuestra que no hay diferencias anatómicas gruesas en el patrón vascular de la circulación cerebral, con arterias comunicantes posteriores intactas en ambos . Figuras 6A v 6B. Secciones en serie teñidas con TTC a las 24 horas a partir de ratones representativo de tipo silvestre (figura 6A) o homocigotos carentes de ICAM-l (figura 6B) sometidos a oclusión transitoria de la arteria cerebral media. El área de color blanco pálido en el territorio de la arteria cerebral media representa tejido cerebral infartado, mientras que el tejido viable se tiñe de color rojo ladrillo. En la figura 7A se muestra la cuantificación de volúmenes de infarto por planimetría de las secciones cerebrales en serie, en experimentos múltiples .
Figuras 7A, 7B, 7C y 7D. Papel de ICAM-l en el resultado del ataque. La oclusión transitoria de la arteria cerebral media se realizó como se describe en ratones ICAM-l +/+ (tipo silvestre, n=16) o ICAM-l-/- (n=13), y los índices de resultado de ataque se midieron como se describe en la figura 2. Figura 7A. Efecto de ICAM-l sobre el volumen de infarto, Figura 7B. calificación de deficiencia neurológica, Figura 7C. flujo sanguíneo cerebral y Figura 7D. mortalidad (* = p< 0.05, ** = p< 0.01).
Figuras 8A y 8B . Efecto de la hipoxia sobre la exocitosis del cuerpo de Weibel-Palade. Figura 8A. Se expusieron venas umbilicales humanas a hipoxia 4f>02 15-20 Torr) o normoxia por las duraciones indicadas, y se cuantificó por ELISA la secreción del factor vonWillebrand (vWF) . ***=P<0.001 para hipoxia versus normoxia. Figura 8B. Se realizaron experimentos similares durante 8 h en presencia de 2 mm Ca++ (Ca++ 2 mM) , Ca++ 0 mM (Ca++ libre) , o Ca++ O mM con EGTA 2 mM agregado para formar quelatos con el Ca++ extracelular residual (Ca++-libre + EGTA) .
Figuras 9A, 9B, 9C y 9D. Efecto de la hipoxia endotelial sobre la expresión de P-selectina y adhesión de neutrófilos. Figura 9A. Expresión de P-selectina en HUVEC expuesta a normoxia o hipoxia, determinado por unión específica de IgG monoclonal radiomarcada contra P-selectina (clona WPAS12.2) . Los datos se expresan como unión relativa comparada con un punto de tiempo normóxico de 4 h. Figura 9B. Efecto de la síntesis inhibidora de proteína sobre la expresión inducida por hipoxia de P-selectina. En un experimento separado, se muestra el efecto de cicloheximida (10 µg/ml, + CHX) agregado al inicio del período normóxico o hipóxico de 4 horas, sobre la expresión de P-selectina. La comparación se realiza a experimentos simultáneos realizados en ausencia de cicloheximida (-CHX), con datos expresados como unión relativa comparada con unión normóxica (-CHX), se muestran las medias ± SEM (media del error estándar) ; *=p<0.05 versus normoxia (-CHX) ; t=p<0.05 versus normoxia (+CHX) . Inserción: Efecto de ciclohexi ida (10 µg/ml) sobre la síntesis de proteína a 4 h, medido con proteínas marcadas con 3SS, precipitable con ácido tricloroacético posterior a la administración de 35S-metionina y 3SS-cisteína. Figura 9C. Unión de neutrófilos marcados con 1:L1Indio a monocapas endoteliales de vena umbilical humana normóxica (N) o hipóxica (H) a las 4 h, en presencia de un anticuerpo bloqueador contra P-selectina (WAPS clona 12.2) o un anticuerpo no bloqueador contra P-selectina (clona AC1.2) . Se muestran las medias ± SEM; **=p<0.01.
Figuras ÍOA, 10B y 10C. Papel de los neutrófilos y P-selectina endotelial en la preservación cardíaca de roedor seguida por trasplante heterotópico. Figura 10A. Preservación cardíaca de ratas . Se trasplantaron corazones inmediatamente después de recolección (Frescos, n=8) o conservados durante 16 h en solución de Ringer lactada a 4°C, seguido por trasplante (Prsvd, n=4) . El efecto de administrar anticuerpo no bloqueador contra P-selectina (AC1.2, n=3) , receptores inmunosuprimidos de neutrófilos antes de la implantación del corazón donador (-PMN, n=4) (, o al administrar 250 µg de IgG bloqueador de ratón contra P-selectina (n=4) 10 minutos antes de la repercusión sobre la supervivencia del injerto cardíaco (barras con rayas) y leucostasis (actividad de mieloperoxidasa, barras negras) . Se muestran las medias ± SEM; para supervivencia de injerto, c versus a, p<0.0001; g versus c, p<0.05; i versus e o c, p<0.05. Para infiltración de neutrófilos en el injerto, d versus b, p<0.01; h versus d, p<0.05; j versus d o f, p<0.05. Figura 10B. Papel de la P-selectina endotelial coronaria en la preservación cardíaca utilizando corazones donadores de ratones carentes de P-selectina (o control de tipo silvestre) que fueron sometidos a lavado libre de sangre antes de la preservación. Se determinó la supervivencia de injerto por la presencia/ausencia de actividad cardíaca eléctrica/mecánica exactamente diez minutos después del restablecimiento del flujo sanguíneo. Figura 10C: Cuantificación de neutrófilos por medición de actividad de mieloperoxidasa (dABs 460 nm/min) como se describe15'18. (Para las barras mostradas de izquierda a derecha, n=14, 8,13 y 7, respectivamente, con los valores indicados de P) .
Figuras HA y 11B . Liberación del cuerpo de Weibel-Palade durante la cirugía cardíaca humana en 32 pacientes. Figura HA. Se muestreó al inicio sangre de seno coronario (CSX) y a la conclusión (CS2) del período isquémico (sujeción transversal aórtica) . Se realizaron ELISA para trombomodulina (TM) y vWF . Figura 11B. La inmunoelectroforesis por vWF de una muestra representativa de CS-. y CS2 de sangre del mismo paciente (se indican los factores de difusión) . Existe un incremento en los 'multímeros de peso molecular elevado detectados en las muestras CS2.
Figuras 12A, 12B. 12C y 12D . Generalidades de la instalación operativa para el modelo de isquemia cerebral bucal de ratón. Figura 12A. En el diagrama se muestra un sistema de retracción basado en sutura. Figura 12B. Vista a través del microscopio de operación. El muñón vascular grande representa la arteria carótida externa, la cual se sitúa en la parte inferior media en el campo de operación. Figura 12C. Fotografía de una sutura ocluyente cauterizada del calibre indicado (5-0 [parte inferior] o 6-0 nylon [parte superior]). Figura 12D . Diagrama esquemático de anatomía cerebrovascular de ratón, con roscado en la arteria cerebral anterior, que ocluye la arteria cerebral media en su punto de origen .
Figura 13. Comparación de la anatomía cerebrovascular entre cepas de ratones. Después de la anestesia, se administró a los ratones una inyección intracardíaca de la India, seguida por eutanasia sin sufrimiento. Se puede observar en todas las cepas un círculo de Willis intacto que incluye las arterias que comunican posteriores y laterales, indicando que no hay diferencias gruesas relacionadas con la tinción en la anatomía cerebrovascular.
Figuras 14A. 14B y 14C. Efectos de la cepa de ratón sobre el resultado de ataque. Se sometieron ratones (machos, 20-23 g) a oclusión durante 45 minutos de MCA (utilizando una sutura ocluyente 12 mm 6.0), seguido por 24 horas de reproducción, y se determinaron los índices de resultado al ataque. Figura 14A.
Efectos de la cepa sobre el volumen de impacto, determinado como el porcentaje de volumen hemisférico ipsilateral como se describe en la sección de métodos. Figura 14B. Efectos de la cepa sobre la calificación de deficiencia neurológica, evaluado desde sin deficiencia neurológica (0) hasta deficiencia neurológica grave (4) , con calificaciones determinadas como se describe en la sección de Método. Figura 14C. Efectos de la cepa sobre el flujo sanguíneo cerebral, medido por fluometría doppler láser como flujo relativo sobre el territorio infartado, comparado con el flujo sanguíneo sobre la corteza contralateral (no infartada) . Las cepas incluyen ratones 129J (n=9) , CD1 (n=ll) y C57/B16 (n=ll) ; *= p < 0.05 versus ratones 129J.
Figuras 15A. 15B y 15C. Efectos del tamaño del animal y diámetro de la cintura de la sutura de oclusión sobre el resultado del ataque. Ratones macho CD-1 de los tamaños indicados se sometieron a la oclusión de la arteria cerebral media (45 minutos) seguido por reperfusión (24 horas) como se describe en la sección de Métodos. El tamaño de sutura (calibre) está indicado en cada panel. Los animales pequeños (n=ll) fueron aquéllos entre 20-25 g (media 23 g) , y los animales grandes estaban entre 28-35 g (media 32 g; n=14 para sutura 6.0, n=9 para sutura 5.0) . Figura 15A. Muestra los efectos de tamaño de animal/sutura sobre el volumen de infarto, Figura 15B. Calificación de deficiencia neurológica, y Figura 15C. flujo sanguíneo cerebral medido como se describe en la figura 14. Se muestran los valores de P.
Figuras 16A, 16B y 16C. Efectos de la temperatura sobre el resultado del ataque. Se sometieron ratones macho C57/B16 a 45 minutos de oclusión de MCA (sutura 6.0) seguido por reperfusión. Se mantuvieron durante 90 minutos la temperatura de núcleo a 37 °C (normotermia, n=ll) utilizando una sonda intrarrectal con un dispositivo de calentamiento controlado por termopar. En el segundo grupo (hipotermia, n=l2) , los animales se colocaron en jaulas y se dejaron a temperatura ambiente después de 10 minutos iniciales de normotermia (temperatura media del núcleo, 31°C a 90 minutos) . En ambos grupos, después de este período de observación de 90 minutos, los animales regresaron a sus cajas con temperatura ambiente mantenida a 37 °C para la duración de la observación. Veinticuatro horas después de la oclusión de MCA, se registraron los índices de resultados de ataque; Figura 16A. volumen de infarto, Figura 16B. calificación de deficiencia neurológica, y Figura 16C. flujo sanguíneo cerebral, medido como se describe en la figura 3. Se muestran los valores de * = p<0.05.
Figuras 17A, 17B y 17C. Comparaciones de resultado entre isquemia cerebral focal permanente e isquemia cerebral focal transitoria, seguido por reperfusión. El MCA fue ocluido permanentemente (n=ll) o de manera transitoria (45 minutos, n=17) con una sutura calibre 6.0 en ratones macho C57/B16 de 22 gramos, como se describe en la sección de métodos. Veinticuatro horas después de la oclusión del MCA, se registraron los índices de resultado de ataque; Figura 17A. volumen de infarto, Figura 17B. calificación de deficiencia neurológica, y Figura 17C. flujo sanguíneo cerebral, medido como se describe en la figura 14.
Figuras 18A y 18B . Expresión de P-selectina y acumulación de neutrófilos (PMN) después de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) en ratones. Figura 18A. Expresión de P-selectina seguida por MCAO y reperfusión. La expresión relativa del antígeno de P-selectina en el hemisferio cerebral ipsilateral después de oclusión de la arteria cerebral media se demuestra utilizando ya sea una IgG monoclonal de rata contra IgG de P-selectina, marcada con 12SI o una IgG de rata no inmune, marcada con 12SI para controlar la extravasación no específica. Los experimentos se realizaron como se describe en la leyenda de la figura 18. Los valores se expresan contra cpm ipsilateral/cpm contralateral. n = 6 para cada grupo, excepto para el control, de 30 minutos (n = 4) ; t = p < 0.001, 30 minutos de reperfusión versus preoclusión inmediata; * = p < 0.025, cambio en la acumulación de P-selectina versus cambio en el control de acumulación de IgG. Figura 18B. Curso en el tiempo de acumulación de PMN seguido de isquemia cerebral y reperfusión en el ratón. Para estos experimentos, se inyectó intravenosamente «3.3 x 105 PANS marcadas con 1:L1In, en donde se inyectan intravenosamente dentro del ratón tipo silvestre (PS +/+) 15 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) . Se mide inmediatamente después del sacrificio la acumulación de PMN111, como la proporción de CPM ipsilateral/contralateral bajo las siguientes condiciones experimentales: antes de MCAO (Pre-O, n = 4) , inmediatamente posterior a MCAO (Post-0, n = 6) , y 10 minutos siguiendo a MCAO pero aún antes de la reperfusión (:10 Post-O, n = 6) . Para establecer el efecto de la reperfusión sobre la acumulación de PMN, se inició la reperfusión después de 45 minutos de isquemia. La acumulación de PMN se midió siguiendo 30 minutos (n = 6) , 300 minutos (n = 3) , y 22 horas (n = 8) de reperfusión. Bajo condiciones idénticas, se mide la acumulación de PMN en los ratones carentes de P-selectina (PS -/-) después de 45 minutos de isquemia y 22 horas de reperfusión (n = 7, * = p < 0.05 versus 45 minutos MCAO/22 horas de reperfusión en PS +/+ animales) .
Figura 19. Papel de P-selectina en el no reflujo cerebrovascular. El flujo sanguíneo cerebral se mide en PS +/+ (panel superior) y PS -/- (panel medio) de ratones utilizando una sonda de flujo doppler láser y expresado como el porcentaje de flujo sanguíneo hemisférico contralateral (no isquémico). El flujo sanguíneo se midió en los siguientes puntos en el tiempo: a, antes de MCAO (PS +/+, n = 16; PS -/-, n = 23); b, inmediatamente después de MCAO (PS +/+, n = 42; PS -/-, n = 40) ; c, 10 minutos después de MCAO, pero aún antes de la reperfusión (PS +/+ , n = 36; PS -/-, n = 34) ; d, inmediatamente posterior a la reperfusión (PS +/+, n = 36; PS -/-, n = 34); e, 30 minutos después de la reperfusión (PS +/+ , n = 8; PS -/-, n = 5) ; y f , 22 horas después de la reperfusión (PS +/+, n = 15; PS -/-, n =5) . El panel inferior representa una sobrecapa de los dos paneles con barras de error omitidas por claridad.
Figura 20. Anatomía cerebrovascular en ratones homocigotos nulos en P-selectina, PS -/- (derecha) y los controles de tipo silvestre, PS +/+ (izquierda) . La tinción de tinta de la India/negro de carbón de la anatomía cerebrovascular con una vista inferior del círculo de Willis demuestra que no hay diferencias anatómicas gruesas en el patrón vascular de la circulación vascular, con la posterior intacta comunicándose con las arterias en ambas .
Figura 21A, 21B y 21C. Efecto del gen para P-selectina sobre los resultados del ataque. La oclusión de la arteria cerebral media se realizó durante 45 minutos, seguido por 22 horas de reperfusión en P-selectina al +/+ (n = 10) o de P-selectina -/- (n = 7) en ratones. El efecto de P-selectina sobre: Figura 21A. de la figura, volumen de infarto como se evidencia por el cloruro de 2, 3, 5-trifenil-2H-tetrazolio al 2% (TTC) como tinción, y calculado como por ciento del hemisferio ipsilateral; Figura 12B. calificación de deficiencia neurológica (1 = movimientos espontáneos normales; 2 = círculos en el sentido de las manecillas del reloj ; 3 = giro en el sentido de las manecillas del reloj; 4 = carencia de respuesta a estímulos nocivos) ; Figura ipsilateral. Estos datos muestran que el CO inhalado reduce los volúmenes de infarto después de un ataque . Figura 23B. Efecto de la inhalación de monóxidos de carbono sobre la mortalidad después de un ataque. Se realizaron experimentos como se describe antes, se mostró la mortalidad a las 24 horas. Estos datos muestran que el CO inhalado reduce la mortalidad después del ataque .
Figuras 24A, 24B y 24C. Figura 24A. Curva dosis-respuesta del monóxido de carbono inhalado sobre el resultado de ataque. Los experimentos se describen en lo anterior. Se inhaló CO a las dosis indicadas. Estos datos muestran que el CO inhalado reduce el volumen de infarto de una manera dependiente de la dosis, con 0.1% proporcionando protección óptima. Las figuras 24B y 24C. Papel de la hemo oxigenasa, la enzima la cual produce CO, en el ataque. A los animales se les administró el vehículo sólo (DMSO) o como un control de la protoporfirina IX de zinc (ZnPP) o protoporfirina IX de estaño (SnPP) . En un grupo final, a los ratones se les administró biliverdina (Bili) , un compuesto del cual se forma a lo largo de CO durante el proceso de degradación de hemo por hemo oxigenasa. El panel izquierdo muestra los volúmenes de infracción. El panel derecho muestra mortalidad. Estos experimentos demuestran que la actividad de oxigenasa hemo activada se bloquea, los resultados de ataque son peores (mayores infartos y mayor mortalidad) . Debido a que la administración de 21C. por ciento de supervivencia en el momento del sacrificio. (* = p< 0.05) .
Figuras 22A. 22B, 22C y 22D. Efecto del bloqueo de P-selectina sobre los resultados de ataque. Se administró ratones PS +/+ ya sea con IgG de rata contra P-selectina de ratón, bloqueante (clona RB 40.34, 30 µg/ratón) o una dosis similar de IgG de rata no inmune inmediatamente antes de la cirugía. Figura 22A. Flujo sanguíneo cerebral a los 30 minutos después de la reperfusión. Después de 22 horas de reperfusión, los volúmenes de la figura 22B de infarto de reperfusión, las calificaciones de deficiencia neurológica Figura 22C, y la mortalidad de la Figura 2D . se muestran, (n = 7 para cada grupo, * = p<0.05) .
Figuras 23A y 23B. Figura .23A. Efecto de la inhalación de monóxidos de carbono sobre los volúmenes de infarto cerebral . Los ratones se colocaron en recipientes de campana en los cuales se expusieron a 0.1% de CO durante 12 horas. Después de este tratamiento, se removieron de los recipientes de campana y se sometieron a oclusión intraluminal de la arteria cerebral media. A las 24 horas, los animales fueron sacrificados y se midieron los volúmenes de infarto por tinción con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) que tiñe, como se muestra en la figura 25. La cuantificación de los volúmenes de infarto (media ± SEM) se expresa como el por ciento de infarto del hemisferio biliverdina no es protectora, estos datos sugieren que el otro producto de la actividad de hemo oxigenasa (CO) sea protector.
Figura 25. Tinción por TTC de cortes cerebrales en serie para los animales de la figura 23. El tejido infartado aparece de color blanco, y el tejido viable aparece de color rojo ladrillo.
Figuras 26A-26F. Efecto de la isquemia cerebral focal sobre la inducción de la hemo oxigenasa I (HO-I) . Figuras 26A-26C muestran hibridización in situ de ARNm para HO-I en el ataque (Figura 26B) y en los controles (Figuras 26A y 26C) . Figuras 26D-26F muestran la inmunohistoquímica de la proteína HO-I. Figura 26E muestra que la proteína se expresa en vasos sanguíneos y astrocitos después del ataque. Figuras 26D y 26F muestran que la proteína no se expresa en los vasos sanguíneos y los astrocitos en controles.
Figura 27. Efecto de la isquemia cerebral focal sobre la inducción de ARNm de hemo oxigenasa (HO-I) . La parte contralateral indica el lado sin ataque del cerebro. La parte ipsilateral indica el lado de cerebro sometido al ataque. En ambos animales, el lado del cerebro sometido a ataque demuestra HO-I aumentada, pero el lado sin ataque no lo presenta.
Figura 28. Efecto de hipoxia sobre la inducción de hemo oxigenasa I (HO) . Los ratones expuestos a un ambiente epóxico durante 12 horas (para simular isquemia) muestra un incremento en ARNm de hemo oxigenasa I, comparado con los controles normóxicos . Estos datos muestran un mecanismo potencial por el cual la preexposición epóxica también puede contener protección contra los eventos isquémicos subsecuentes, los cuales se han encontrado que son válidos en ratones sometidos e hipoxia después por ataque .
Figura 29. Efecto de la hipoxia sobre la expresión de la proteína hemo oxigenasa I (HO-I) células endoteliales de cerebro de ratón.
La hipoxia provoca que los niveles de próteína de HO-I se incrementen en estas células endoteliales derivadas del cerebro.
Figura 30. Efecto de la hipoxia sobre la inducción de ARNm de hemo oxigenasa I (HO-I) en células endoteliales de cerebro de ratón. La hipoxia provoca que se incrementen las concentraciones de ARNm y HO-I en estas células endoteliales derivadas del cerebro.
Figuras 31A-31D. Expresión de P-selectina y acumulación de neutrófilos (PMN) después de la oclusión de la arteria cerebral (MCAO) en ratones. Figura 31A. Expresión de P-selectina después de MCAO y reperfusión. La expresión relativa del antígeno de P-selectina en el hemisferio cerebral ipsilateral posterior a la oclusión de la arteria cerebral media se demostró utilizando IgG monoclonal de rata contra P-selectina marcada con 12SI o una IgG de rata no inmune, marcada con 125I para controlar la extravasación no específica. Los valores se expresan como CPM intralateral, CPM contralateral. n = 6 para cada grupo, excepto para el control que fue de 30 min (n = 4) ; t = p < 0.001, 30 minutos de reperfusión versus preoclusión inmediata; * = p < 0.025, cambio en la acumulación de P-selectina versus cambio en la acumulación de IgG control. Figura 31B y 31C. Localización inmunohistoquímica de la expresión de P-selectina en una sección de cerebro de un ratón sometido a 45 minutos de MCAO, seguido por una hora de reperfusión. Las secciones corticales libres cerebrales ipsilateral y contralateral demuestran del mismo ratón. Las flechas apuntan a un microvaso cerebral, con un color café oscuro que representan la expresión de P-selectina como en la superficie de las células endoteliales. Figura 31D. Curso en el tiempo de la acumulación de PMN después de la isquemia cerebral focal y reperfusión en el ratón. Para estos experimentos se inyectaron intravenosamente «3.3 x 105 PMN marcados con l?a-In, en ratones tipo silvestre (PS +/+) 15 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) . Se mide inmediatamente después del sacrificio la acumulación de 11:LIn-PMN, como la proporción de CPM ipsilateral/contralateral bajo las siguientes condiciones experimentales: antes de MCAO (Pre-0, n = 4) inmediatamente después de MCAO (Post-O, n = 6) , y 10 minutos después de MCAO, pero aún antes de la reperfusión (:10 Post-O, n = 6) . Para establecer el efecto de la reperfusión sobre la acumulación de PMN, la reperfusión se inició después de 45 minutos de isquemia. La acumulación de PMN se ha medido siguiendo 30 minutos (n = 6) , 300 minutos (n = 3) , y 22 horas (n = 8) de reperfusión. Bajo condiciones idénticas, se mide la acumulación de PMN en ratones carentes de P-selectina (PS -/-) después de 45 minutos de isquemia y 22 horas de reperfusión (n = 7, * = p < 0.05 versus 45 minutos MCAO/22 horas de reperfusión en animales PS +/+) .
Figura 32A-32C. Papel de P-selectina en la carencia de reflujo cerebro vascular. Se mide el flujo sanguíneo cerebral en ratones PS +/+ (panel superior) y PS -/- (panel medio) utilizando una sonda de flujo doppler láser y se expresa como el porcentaje de flujo sanguíneo hemisférico contralateral (no isquémico) (± SEM) . Se mide el flujo sanguíneo en los siguientes puntos en el tiempo: a, antes de MCAO (PS +/+, n = 16; PS -/-, n = 23); b, inmediatamente después de MCAO (PS +/+, n = 42; PS -/-, n = 40); c, 10 minutos después de MCAO pero aún antes de reperfusión (PS +/+, n = 36; PS -/-, n = 34); d, inmediatamente después de la reperfusión (PS +/+, n = 36; PS -/-, n = 34); e, 30 minutos después de reperfusión (PS +/+, n = 8 ; PS -/-, n = 5) ; y f , 22 horas después de la reperfusión (PS +/+ , n = 15; PS -/-, n = 5) . El panel inferior representa una superposición de los dos paneles superiores, en donde se omiten las barras de error, por claridad.
Figuras 33A-33B. Efecto del gen para P-selectina sobre los resultados de ataques. Se realizó oclusión de la arteria cerebral media durante 45 minutos, seguido por 22 horas de reperfusión en ratones P-selectina +/+ (n = 10) o P-selectina -/- (n = 7) . Efecto de P-selectina en: Figura 33A. volumen de infarto, como se evidencia por 2% de tinción con cloruro de 2 , 3 , 5-trifenilo-2H-tetrazolio (TTC) , calculado como por ciento de hemisferio ipsilateral; Figura 33B. por ciento de supervivencia en el momento del sacrificio. Se indican las medias ± SEM, con los números de animales desde los cuales se calculó el porcentaje indicados por encima de las barras de supervivencia (*=p<0.05) .
Figura 34. Efecto del bloqueo de P-selectina sobre los resultados de ataques . Se administró a ratones PS +/+ ya sea una IgG de rata contra P-selectina de ratón bloqueadora (clona RB 40.34, 30 µg/ratón) o una dosis similar de IgG de rata no inmune inmediatamente antes de la oclusión de la arteria cerebral media (Pre-MCAO; n = 7 para cada grupo) o después de oclusión de la arteria cerebral media (Post-MCAO; n = 9 para el anticuerpo control, n = 6 para el anticuerpo bloqueador contra P-selectina funcionalmente) . En ambos casos, se extrajo la sutura oclusora intraluminal después de un período isquémico de 45 minutos para simular reperfusión clínica. Después de 22 horas de reperfusión, se muestran los volúmenes de infarto (barra oscura) , el flujo sanguíneo cerebral relativo a los 30 minutos después de reperfusión (barras con tiras diagonales) y la supervivencia (barras con sombras claras) . Se indican las medidas ± SEM, con los números de animales a partir de los cuales se calcularon los porcentajes de supervivencia indicados encima de las barras de supervivencia. * = p<0.05 versus anticuerpo control.
Figuras 35A-35B. Validación del ensayo de hemorragia intracerebral espectrofotométrico cuantitativo, en ausencia (Figura 35A) o presencia (Figura 35B) de tejido cerebral. Figura 35A. Curva estándar en la cual se redujeron las concentraciones conocidas de hemoglobina a cianometahemoglobina después de lo cual se midió la D.O. a 550 nm. N = 5 determinaciones en cada punto, en donde se muestran las medidas + SEM. Se muestra la ecuación para la línea de mejor ajuste y el valor de r. Figura 35B. Se agregaron concentraciones conocidas de hemoglobina (utilizando sangre autóloga diluida en solución salina) a volúmenes fijos de homogeneizado de tejido cerebral fresco y se realizó el ensayo de hemoglobina espectrofotométrico. Los cerebros se dividieron en hemisferios,- para cada animal, un hemisferio se sumergió en solución salina fisiológica durante 20 minutos (NS, línea continua) , y el otro hemisferio se colocó en cloruro de trifeniltetrasolio (TTC, línea discontinua) durante 20 minutos (similar al procedimiento que se realizaría para medir el volumen de infarto cerebral) . Para cada concentración de hemoglobina agregada, se realizó un ensayo espectrofotométrico de hemoglobina en 6 hemisferios. Se muestran las medidas ± SEM.
Figuras 36A-36B. Ensayo espectrofotométrico cuantitativo de hemoglobina. Figura 36A. Efectos de infusión de colagenasa y rt-PA sobre ICH cuantitativo de ratón. Se sometió a infusión estereotácticamente con agentes inductores de ICA en los ganglios profundos derecho de la corteza/basal . Los cerebros se recolectaron 24 h después y se realizó el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina para cuantificar ICH. Los ratones se sometieron a: 1) cero tratamiento (Contro) , 2) infusión estereotáctica de 1 µm de solución salina normal (en falso) , 3) infusión estereotáctica de 0.024 µg de colagenasa B en 1 µl de solución salina normal (Colagenasa) , o 4) infusión estereotáctica de colagenasa B (como en lo anterior) seguido por activador de plasminógeno tisular intravenoso (1 mg/kg en 0.2 µl de solución salina normal) por inyección en la vena dorsal del pene (Colagenasa + rt-PA) . ** p<0.001 versus falso o control.
Figura 36B. Efecto de rt-PA posterior a ataque isquémico focal en ICH cuantitativo en ratón. Se sometieron ratones a oclusión MCA durante 45 minutos seguido por reperfusión, y después: 1) 0.2 µm intravenoso de solución salina normal (ataque + salina) o 2) activador de plasminógeno tisular intravenoso (15 mg/kg en 0.2 µl de solución salina normal) (Ataque + rt-PA) . Los cerebros se recolectaron 24 h después y se realizó el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina para cuantificar ICH **P<0.05.
Figura 37. Demostración del sistema de calificación utilizando para la determinación visual de ICH después de ataque. Cada corte, tomado de animales diferentes sometidos a ataque, representa el corte coronal del cerebro el cual muestra el diámetro máximo hemorrágico. El número corresponde a la calificación de hemorragia determinada visualmente, definida en la sección de Métodos .
Figuras 38A-38B. Calificación visual de ICH. Figura 38A. Efectos de la infusión de colagenasa y rt-PA sobre la calificación visual de ICH. Los reactores fueron sometidos a infusión estereotácticamente con agentes inductores de ICH en los ganglios profundos derechos de la corteza/básales . Los ratones se sometieron a: 1) carencia de tratamiento (control), 2) infusión estereotáctica de 1 µl de solución salina normal (en falso) , 3) infusión estereotáctica de 0.024 µg de colagenasa B en 1 µl de solución salina normal (colagenasa) , o 4) infusión estereotáctica de colagenasa B (como en lo anterior) , seguido por activador de plasminógeno tisular intravenoso (1 mg/kg en 0.2 µl de solución salina normal) por inyección en la vena dorsal del pene (Colagenasa + rt-PA) . Los cerebros se recolectaron 24 h después, se rebanaron en cortes coronales de 1 mm y se clasificaron por un observador quien desconoce el protocolo, como se describe en la sección de métodos. *p<0.05 versus colagenasa, *p<0.05 versus en falso o control. Figura 38B. Efecto de rt-PA después de ataque isquémico focal en la calificación visual de ICH en ratones . Los ratones se sometieron a oclusión MCA durante 45 minutos seguido por reperfusión y después: 1) 0.2 µl intravenoso de solución salina normal (ataque + salina) o 2) activador de plasminógeno tisular intravenoso (15 mg/kg en 0.2 µl de solución salina normal) (ataque + rt-PA) . Los cerebros se recolectaron 24 h después, se rebanaron en placas coronales de 1 mm y se clasificaron por un observador quien desconoce el protocolo, como se describe en la sección de Métodos *p<0.01. Se muestran los valores individuales para las calificaciones visuales de ICH, con el valor mediano para cada grupo indicado por una línea horizontal .
Figura 39. Correlación entre la calificación visual de ICH y el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina. La densidad óptica a 550 nm (ordenada) representa los resultados obtenidos del ensayo espectrofotométrico de hemoglobina en los cuales se analizó el tejido cerebral (de todos los experimentos). Las calificaciones visuales correspondientes para ICH (como se muestran en la figura 38) se grafican a lo largo de la abcisa. Para cada punto, se muestran las medidas ± SEM. Se realiza correlación lineal utilizando la correlación lineal de Pearson, y se muestra la ecuación de la línea y el valor de r.
Figuras 40A-40F. Figura 40A. Efecto del ataque y administración de factor IXai en ataque sobre la acumulación de plaquetas radiomarcadas . Se administraron 11:Lindio-plaquetas ya sea con animales control sin ataque (n=4) , o en animales inmediatamente antes de un ataque con (n=7) o sin administración preoperatoria de factor IXai (300 µg/kg, n=7) . La acumulación de plaquetas se expresa como CPM ipsilateral/CPM contralateral. Se muestran las medias + SEM. *p<0.05 versus sin ataque; **p<0.05 versus ataque + vehículo. Figura 40B. Acumulación de fibrina en tejido cerebral infartado. Veintidós horas después de isquemia cerebral focal y reperfusión, se recolectó un cerebro de un ratón representativo el cual ha sido pretratado antes de cirugía ya sea con vehículo (dos bandas más a la izquierda) o factor IXai (300 µg/kg, dos bandas más a la derecha) . Los cerebros se dividieron en hemisferios ipsilateral (R) y contralateral (L) , y se realizó la digestión de plasmina para solubilizar fibrina acumulada. Se realizó inmunotransferencia (immunoblotting) utilizando un anticuerpo primario dirigido contra un neoepitopo expresado sobre el dímero de cadena gamma-gamma de fibrina reticulada. Figura 40C-40F. Identificación inmunohistoquímica de los sitios de formación de fibrina en el ataque. Utilizando el mismo anticuerpo al descrito en la figura 2b para detectar fibrina, se recolectaron cerebros a partir de dos ratones después de ataque (paneles superior e inferior, cada uno representa un ratón) . Las flechas identifican microvasos cerebrales . Nótese que en ambos hemisferios ipsilaterales (paneles del lado derecho) , se puede identificar claramente la fibrina intravascular por la tinción roja, la cual no se observa en los hemisferios no isquémicos contralaterales (paneles izquierdos) .
Figuras 41A-41C. Figura 41A. Efecto del factor IXai sobre CBF relativo en un modelo de ataque en ratón, medido por doppler láser. CBF en animales tratados con factor IXai (300 µg/kg, n=48, línea discontinua) es significativamente mayor a las 24 horas que los controles tratados con vehículo (n=62) . Se muestran las medias ± SEM. *p<0.05. Figura 41B. Efecto del factor IXai sobre volúmenes de infarto en un modelo de ataque de ratón, medidos por tinción con TTC de las secciones coronales en serie. A los animales se les administró vehículo (n=62) o factor IXai (300 µg/kg, n=48) . Se muestra en las medias ± SEM. *p<0.05. Figura 41C. Dosis-respuesta de factor IXai en ataque. Se administró factor XXai inmediatamente antes del inicio del ataque, se determiaron los volúmenes de infarto cerebral como se describe en la figura 41B antes. N = 62, 48, 6 y 6, para el vehículo, las dosis de 300 µg/kg, 600 µg/kg y 1200 µg/kg, respectivamente. Se muestran las medias ± SEM. *p<0.05 versus animales tratados con vehículo.
Figuras 42A-42B. Efecto del factor IXai sobre hemorragia intracerebral . Figura 42A. Se realizó el ensayo de espectrofotométrico de hemoglobina como se describe en la sección de Métodos. La D.O. a 550 nm se relaciona linealmente con el contenido de hemoglobina en cerebro11'12. Figura 42B. Calificación de ICH, determinada visualmente, por un observador quien desconoce el protocolo, como se describe en la sección de Métodos. La calificación de ICH se correlaciona con el contenido de hemoglobina en cerebro determinado espectrofotométricamente11'12. Se muestran las medias ± SEM. *p<0.05 versus animales tratados con vehículo-.
Figura 4 . Efecto de la sincronización de administración de factor IXai sobre volúmenes de infarto cerebral cuando se administran después del inicio del ataque. Se sometieron ratones a isquemia cerebral focal y reperfusión, como se describe en la sección de Métodos. Los datos de administración preoclusión (2 barras más a la izquierda) son los mostrados en la figura 42B. En experimentos adicionales para determinar los efectos del factor IXai administrados después del ataque, inmediatamente después de la supresión de la sutura oclusora intraluminal , se administró intravenosamente vehículo (solución salina normal, n=13) o factor IXai (300 µg/kg, n=7) . Se determinaron los volúmenes de infarto cerebral (basados en secciones en serie teñidas con TTC, obtenidas a las 22 h) . Se muestran las medias ± SEM. *p<0.05, **p<0.05 versus animales tratados con vehículo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para tratar un trastorno isquémico en un sujeto, el cual incluye administrar al sujeto una forma farmacéuticamente aceptable de un antagonista de selectina en una cantidad suficiente durante un período de tiempo suficiente para evitar la acumulación de células sanguíneas blancas de manera que se trate el trastorno isquémico en un sujeto. El antagonista de selectina puede ser un péptido mimético, una molécula de ácido nucleico, una ribozima, un polipéptido, una molécula pequeña, una molécula de carbohidrato, un monosacárido, un oligosacárido o un anticuerpo. La selectina puede ser una P-selectina una E-selectina o una L-selectina. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de P-selectina. El anticuerpo puede incluir además un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. El antagonista de P-selectina, puede incluir un precursor de óxido nítrico (NO) tal como L-arginina, un donador de NO tal como nitroglicerina o nitroprusside, un análogo de nucleótido cíclico tal como GMP cíclico o análogo de AMP cíclico, o un inhibidor de fosfodiesterasa. La forma farmacéuticamente aceptable del antagonista de P-selectina puede incluir un antagonista de P-selectina y un portador farmacéuticamente aceptable. El portador puede incluir un portador en aerosol, intravenoso, oral o tópico. La célula sanguínea blanca puede ser un neutrófilo o un monocito. El sujeto puede ser un mamífero, el mamífero puede ser un humano, una vaca, un cerdo, un borrego, un perro, un gato, un mono, un ave doméstica o cualquier modelo animal de una enfermedad o trastorno de humanos . El trastorno isquémico puede incluir, pero no se limita a trastornos vasculares periféricos, trombosis venosa, hembolia pulmonar, infarto al miocardio, ataque isquémico transitorio, angina inestable, déficit neurológico isquémico reversible, anemia de células falsiformes o un trastorno por ataque. El sujeto puede haber experimentado cirugía cardíaca, cirugía pulmonar, cirugía de médula espinal, cirugía cerebral, cirugía" vascular, cirugía abdominal o cirugía de transplante de órganos . La cirugía de transplante de órganos puede incluir cirugía de transplante de corazón, pulmón, páncreas o hígado. La presente invención proporciona además un método para tratar un trastorno isquémico en un sujeto, el cual comprende administrar al sujeto monóxido de carbono gaseoso en una cantidad suficiente durante un periodo de tiempo suficiente para de esta manera tratar el trastorno isquémico en el sujeto. La administración de monóxido de carbono puede ser vía inhalación por el sujeto o vía exposición extracorpórea a la sangre o fluidos corporales del sujeto.
La cantidad de monóxido de carbono la cual puede ser suficiente para tratar al sujeto incluye, pero no se limita desde aproximadamente 0.0001% de monóxido de carbono en un gas inerte, hasta aproximadamente 2% de monóxido de carbono en un gas inerte. El gas inerte puede ser oxígeno, nitrógeno, argón o aire. En una modalidad de la presente invención, la cantidad de monóxido de carbono administrado puede ser 0.1% de monóxido de carbono en aire . El período de tiempo suficiente para administrar monóxido de carbono a un sujeto para tratar un trastorno isquémico incluye, pero no se limita, desde aproximadamente 1 día antes de la cirugía hasta aproximadamente 1 día después de la cirugía. El período de tiempo puede ser desde aproximadamente 12 horas antes de la cirugía hasta aproximadamente 12 horas después de la cirugía. El período de tiempo puede incluir además desde aproximadamente 12 horas antes de la cirugía hasta aproximadamente 1 hora después de la cirugía. El período de tiempo puede incluir adicionalmente desde aproximadamente 1 hora antes de la cirugía hasta aproximadamente 1 hora después de la cirugía. El período de tiempo puede incluir además desde aproximadamente 20 minutos antes de la cirugía hasta aproximadamente 1 hora después de la cirugía. El período de tiempo suficiente para tratar un trastorno isquémico en un sujeto quien no experimenta cirugía puede incluir antes y durante cualquier manifestación física de tal trastorno. La administración de monóxido de carbono es preferible antes de la manifestación con el fin de disminuir tal manifestación de un trastorno isquémico. Como se describe en lo siguiente, se ha demostrado que la administración de monóxido de carbono es protectora de isquemia en un sujeto, si se administra antes de la cirugía. Como se utiliza en la presente, el término "trastorno isquémico" abarca y no se limita a un trastorno vascular periférico, trombosis venosa, embolia pulmonar, infarto al miocardio, un ataque isquémico transitorio, isquemia pulmonar, angina inestable, déficit neurológico isquémico reversible, actividad trombolítica adjunta, condiciones de coagulación excesiva, anemia de células falsiformes o un trastorno de ataque. El sujeto puede experimentar cirugía cardíaca, cirugía pulmonar, cirugía de la médula espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía abdominal o cirugía de transplante de órganos. La cirugía de transplante de órganos puede incluir cirugía de transplantes de corazón, pulmón, páncreas o hígado. El monóxido de carbono se puede administrar de una manera directa. En vez de que el sujeto inhale directamente o reciba gas de monóxido de carbono o una mezcla de gas, al sujeto se le pueden administrar compuestos para estipular la producción in vivo de monóxido de carbono. Tales compuestos pueden incluir, pero no se limitan a hemo, ferritina, hematina, precursores endógenos de hemo oxigenasa o estimuladores de hemo oxigenasa.
Además, el sujeto se puede exponer a un ambiente de baja concentración de oxígeno en comparación con la atmósfera normal . La hemo oxigenasa es una enzima endógena la cual sintetiza monóxido de carbono a partir del grupo hemo precursor (es parte de la vía normal en la cual el grupo hemo es degradado y metabolizado en cuerpo) . Cuando los ratones se exponen a hipoxia o isquemia tisular, se incrementan las concentraciones tanto de ARN mensajero el cual codifica para la proteína hemo oxigenasa como la proteína misma. Además, se incrementa la actividad de la enzima, como se indica por las mediciones de monóxido de carbono en el tej ido . Otra modalidad de la presente invención es un método para tratar un trastorno isquémico en un sujeto, el cual comprende administrar al sujeto una forma farmacéuticamente aceptable de factor IX inactivado, en una cantidad suficiente durante un período de tiempo suficiente para inhibir la coagulación de manera que se trate el trastorno isquémico en el sujeto. La cantidad suficiente puede incluir, pero no se limita desde aproximadamente 75 µg/kg hasta aproximadamente 550 µg/kg. La cantidad puede ser 300 µg/kg. La forma farmacéuticamente aceptable del factor IX inactivado incluye factor IX inactivado y un portador farmacéuticamente aceptable. El factor IX puede ser inactivado por métodos estándar conocidos por aquéllos familiarizados en la técnica, tales como inactivación por calor. El factor IX puede ser inactivado o se puede inhibir la actividad del factor IX por un antagonista. Tal antagonista puede ser un péptido mimético, una molécula de ácido nucleico, una ribozima, un polipéptido, una molécula pequeña, una molécula de carbohidrato, un monosacárido, un oligosacárido o un anticuerpo. La presente invención proporciona un método para identificar un compuesto que es capaz de mejorar un trastorno isquémico en un sujeto, el cual incluye: a) administrar el compuesto a un animal , animal el cual es un modelo animal de ataque; b) medir el resultado del ataque en el animal, y c) comparar el resultado del ataque en la etapa (b) con el del modelo animal de ataque en ausencia del compuesto de manera que se identifique un compuesto capaz de mejorar un trastorno isquémico en un sujeto. El modelo animal de ataque incluye un modelo de ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión. El resultado del ataque se puede medir por examen físico, formación de imagen por resonancia magnética, fluometría doppler láser, tinción con cloruro de trifeniltetrazolio, determinación química de déficit neurológico, exploración tomográfica computarizada o flujo sanguíneo cortical cerebral. El resultado del ataque en un humano se puede medir también por mediciones clínicas, calificaciones de calidad de vida y pruebas neuropsicométricas . El compuesto puede incluir un antagonista de P-selectina, un antagonista de E-selectina o un antagonista de L-selectina.
La presente invención proporciona además un método para identificar un compuesto que es capaz de prevenir la acumulación de células blancas sanguíneas en un sujeto, el cual incluye: a) administrar el compuesto a un animal, animal el cual es un modelo animal de ataque; b) medir el resultado del ataque en el animal, y c) comparar el resultado del ataque en la etapa (b) con la del modelo animal de ataque, en ausencia del compuesto, de manera que se identifique un compuesto capaz de prevenir un trastorno isquémico en un sujeto. El modelo de aniamal de ataque incluye un modelo de ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión. El resultado del ataque se puede medir por examen físico, formación de imagen de resonancia magnética, fluometría doppler láser, tinción con cloruro de trifeniltetrazolio, determinación química de deficiencia neurológica, exploración por tomografía computarizada o flujo sanguíneo cortical cerebral. El resultado posterior al ataque en un humano se puede medir también por mediciones clínicas, calificaciones de calidad de vida y pruebas neuropsicométricas. El compuesto puede incluir un antagonista de P-selectina, un antagonista de E-selectina o un antagonista de L-selectina. La presente invención proporciona además un método para identificar un compuesto que es capaz de prevenir la acumulación de células sanguíneas blancas en un sujeto el cual incluye.- a) administrar el compuesto a un animal, animal el cual es un modelo de animal de ataque; b) medir el resultado posterior a ataque en el animal y c) comparar el resultado posterior a ataque en la etapa (b) con el del modelo de animal de ataque en ausencia del compuesto de manera que se identifique un compuesto capaz de evitar la acumulación de células sanguíneas blancas en el sujeto. Las células sanguíneas blancas pueden ser, pero no se limitan a, neutrófilos, plaquetas o monocitos. El compuesto puede ser, pero no se limita a un inhibidor de selectina, un inhibidor de monocitos, un inhibidor de plaquetas o un inhibidor de neutrófilos. El inhibidor de selectina puede ser, pero no se limita a un inhibidor de P-selectina, de E-selectina o de L-selectina. Las selectinas se expresan sobre la superficie de las plaquetas y tales inhibidores o antagonistas de selectina, como se describe en la presente, pueden evitar la expresión de tales selectinas sobre la superficie de la célula. La prevención de la expresión puede ser a niveles transcripcional, traduccional o postraduccional, o pueden evitar el movimiento de tales selectinas a través del citosol y evitar el suministro en la superficie celular. La presente invención proporciona tratamiento de trastornos isquémicos al inhibir la capacidad de los neutrófilos, monocitos u otras células sanguíneas blancas a adherirse adecuadamente. Esto se puede llevar a cabo al remover el ligando contador, tal como CD18. Se ha demostrado, como se discute en lo siguiente, que los ratones "agénicos" para CD18 (ratones que no tienen expresión del gen CD18 normal) están protegidos de condiciones isquémicas adversas. Las células endoteliales en las superficies de los vasos en el sujeto también pueden ser un objetivo para el tratamiento. En un modelo de ratón de ataque, la administración de TPA como un agente trombolítico provoca cierta hemorragia visible junto con un mejoramiento del trastorno de ataque. Sin embargo, la administración de un antagonista de P-selectina también mejora el trastorno de ataque en el modelo animal, pero sin la hemorragia coincidente. La presente invención puede ser utilizada junto con una terapia trombolítica para incrementar la eficacia de tal terapia o para permitir que se administren al sujeto dosis menores de tal terapia de manera que se reduzcan los efectos colaterales de la terapia trombolítica. Como se utiliza en la presente, el término "portador adecuado, farmacéuticamente aceptable" abarca cualquiera de los portadores estándar farmacéuticamente aceptados, tales como solución salina amortiguada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión aceite/agua o una emulsión de triglicéridos, diversos tipos de agentes humectantes, tabletas, tabletas recubiertas y cápsulas. Un ejemplo de una emulsión de triglicéridos aceptable útil en la administración intravenosa e intraperitoneal de los compuestos es la emulsión de triglicéridos conocida comercialmente como IntralipidMR. Típicamente, tales portadores contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros recipientes conocidos. Tales portadores también pueden incluir aditivos de sabor y de color u otros ingredientes . Esta invención también proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen cantidades terapéuticamente efectivas de composiciones y compuestos de proteína capaces de tratar un trastorno de ataque o de mejorar el resultado posterior a un ataque como el objetivo de la invención, junto con diluyentes, preservativos, solubilizantes, emulsificantes, adyuvantes y/o portadores adecuados, útiles en el tratamiento de degradación neuronal debido al envejecimiento, una incapacidad en el aprendizaje o un trastorno neurológico. Tales composiciones son líquidos o leofilizados o formulaciones secadas de alguna otra manera e incluyen diluyentes de un contenido de amortiguador (por ejemplo Tris-HCl, acetato, fosfato) , pH y fuerza iónica variable, aditivos tales como albúmina o gelatina para evitar la absorción en superficies, detergentes (por ejemplo Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácido biliar) , agentes solubilizantes (por ejemplo glicerol, polietilenglicerol) , antioxidantes (por ejemplo ácido ascórbico, metabisulfito de sodio) , preservativos (por ejemplo dimerosal, alcohol bencílico, parabenos), sustancias que imparten volumen o modificadores de tonicidad (por ejemplo lactosa, manitol) , unión covalente de polímeros tales como polietilenglicol al compuesto, formación de complejos con iones metálicos o incorporación del compuesto dentro o sobre preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc. o sobre liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, eritrocitos sin citoplasma, o esferoplastos . Tales composiciones afectarán el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de aclaramiento in vivo del compuesto o la composición. La elección de las composiciones dependerá de las propiedades físicas y químicas del compuesto capaz de aliviar los síntomas del trastorno de ataque o de mejorar el resultado posterior al ataque en el sujeto. Las composiciones de liberación controlada o suspendida incluyen formulación en depósitos lipofílicos (por ejemplo ácidos grasos, ceras, aceites) . También se incluyen por la invención composiciones particuladas recubiertas con polímeros (por ejemplo poloxámeros o poloxaminas) y el compuesto acoplado a anticuerpos dirigidos contra receptores específicos de tejido, ligandos o antígenos, o acoplados a ligandos de receptores específicos de tejido. Otras modalidades de las composiciones de la invención incorporan formas particuladas de recubrimientos protectores, inhibidores de proteasa o mejoradores de permeación para diversas rutas de administración que incluyen la parenteral, pulmonar, nasal y oral . Las porciones del compuesto de la invención pueden ser "marcadas" por asociación con una sustancia marcadora o indicadora detectable (por ejemplo, radiomarcada con 12SI o biotinada) para proporcionar reactivos útiles en la detección y cuantificación del compuesto o sus células portadores receptoras o sus derivados, en tejido sólido y en muestras de fluido tales como sangre, líquido cefalorraquídeo u orina. Cuando se administran, los compuestos con frecuencia son aclarados rápidamente de circulación y por lo tanto inducen una actividad farmacológica relativamente de poca duración. En consecuencia, se pueden requerir inyecciones frecuentes de dosis relativamente grandes de compuestos bioactivos para sostener la eficacia terapéutica. Los compuestos modificados por la unión covalente de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona o poliprolina se sabe que muestran vidas medias sustancialmente más prolongadas en sangre posterior a inyección intravenosa en comparación con los compuestos no modificados correspondientes (Abuchowski et al . , 1981; Newmark et al., 1982; y Katre et al., 1987). Tales modificaciones incrementan la solubilidad de los compuestos en solución acuosa, eliminan la agregación, mejoran la estabilidad física y química del compuesto y reducen grandemente la inmunogenicidad y reactividad del compuesto. Como resultado, se puede obtener la actividad biológica deseada in vivo por la administración de tales reductos de polímero-compuesto con menos frecuencia o con dosis menores en comparación con el compuesto no modificado . La unión de polietilenglicol (PEG) a compuestos es particularmente útil debido a que PEG tiene una toxicidad muy baja en animales (Carpenter et al., 1971) . Por ejemplo, un aducto de PEG de adenosina desaminasa ha sido aprobado en los Estados Unidos para uso en humanos para el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia combinada severa. Una segunda ventaja suministrada por la conjugación de PEG es que reduce efectivamente la inmunogenicidad y antigenicidad de compuestos heterológos . Por ejemplo, un aducto de PEG de una proteína humana puede ser útil para tratamiento de enfermedades en otras especies de mamífero sin el riesgo de activar una respuesta inmune severa. El compuesto de la presente invención capaz de aliviar los síntomas de un trastorno cognoscitivo de memoria o de aprendizaje se puede suministrar en un dispositivo de microencapsulación de manera que reduzca o evite una respuesta inmune del huésped contra el compuesto o contra las células las cuales producen el compuesto. El compuesto de la presente invención también puede ser suminstrado microencapsulado en una membrana, tal como un liposoma. Los polímeros tales como PEG se pueden unir convenientemente a uno o más residuos aminoácidos reactivos en una proteína tal como el grupo alfa-amino del aminoácido amino terminal, los grupos amino epsilón de las cadenas laterales de lisina, los grupos sulfhidrilos de las cadenas laterales cisteína, los grupos carboxiio de las cadenas laterales aspartilo y glutamilo, el grupo alfa-carboxilo del aminoácido carboxi terminal, las cadenas laterales de tirosina o a derivados activados de las cadenas glicosílicas unidas a ciertos residuos de asparagina, serina o treonina. Se han descrito numerosas formas activadas de PEG adecuadas para reacción directa con proteínas . Los reactivos de PEG útiles para reacción con grupos amino de proteína incluyen esteres activos de ácido carboxílico o derivados de carbonato, particularmente aquéllos en los cuales los grupos salientes son N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenol, imidazol o l-hidroxi-2-nitrobencen-4-sulfonato . Los derivados de PEG que contienen grupos maleimido o haloacetilo son reactivos útiles para la modificación de grupos sulfhidrilo libres en la proteína. De igual manera, los reactivos que contienen grupos aminohidrazina o hidrazina son útiles para reacción con aldehidos generados por oxidación de peryodato de grupos carbohidratos en proteínas . Por medio de técnicas bien conocidas tales como titulación y al tomar en consideración las características farmacocinéticas observadas del agente en el sujeto individual, una persona familiarizada en la técnica puede determinar un régimen de dosificación apropiado. Véase, por ejemplo, Benet, et al., "Clinical Pharmacokinetics" en el capítulo 1 (pp. 20-32) de Goodman and Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a Edición, A.G. Gilman, et al. eds. (Pergamon, New York 1990) . La presente invención proporciona una composición farmacéutica la cual comprende un agente capaz de tratar un trastorno de ataque o de mejorar el resultado posterior al ataque, y un portador farmacéuticamente aceptable. El portador puede incluir, pero no se limita a un diluyente, un aerosol, un portador tópico, una solución acuosa, una solución no acuosa o un portador sólido. Esta invención se ilustra en la sección de Detalles Experimentales que sigue. Estas secciones se" establecen con el fin de ayudar en la comprensión de la invención, pero no se pretende, y no se debe considerar que limitan de manera alguna la invención, como se establece en las reivindicaciones que siguen posteriormente.
DETALLES EXPERIMENTALES Abreviaturas : EC, célula endotelial; PMN, leucocito polimorfo nuclear,- WP, cuerpo de Weibel-Palade,- vWF, factor de von Willebrand; EGTA, ácido etilenglicol bis (aminoetiléter) tetraacético,- HBSS, solución salina balanceada de Hank; CS, seno coronario; IL, interleucina; PAF, factor activador de plaquetas; ICAM-l, molécula de adhesión intercelular-1; HUVEC, EC de la vena umbilical humana; LR, solución de Ringer lactada; MCAO, oclusión de la arteria cerebral media,- rt-PA activador recombinante de plasminógeno tisular; HO-I o HOI o HO I, hemo oxigenasa I; ICH, hemorragia intracerebral ; DO, densidad óptica,-MCA, arteria cerebral media; rt-PA, activador recombinante de plasminógeno tipo tisular; TÍA, ataque isquémico transitorio; TTC, cloruro de trifeniltetrazolio .
EJEMPLO 1: Protección cerebral en ratones homocigotos carentes de ICAM-l después de oclusión de arteria cerebral media: Papel de adhesión de neutrófilos en la patogénesis del ataque Para investigar si los leucocitos polimorfo nucleares (PMN) contribuyen a secuelas neurológicas adversas y mortalidad después de un ataque, y para estudiar el papel potencial de la molécula de adhesión de leucocitos Molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-l) en la patogénesis del ataque, un modelo en ratón de isquemia cerebral focal transitoria se utilizó y consiste de oclusión de la arteria cerebral media intraluminal (MCA) durante 45 minutos seguido por 22 horas de reperfusión. La acumulación de PMN monitoreada por deposición de PMN marcados con llxIndio en tejido cerebral postisquémico, se incrementó 2.5 veces en el hemisferio ipsilateral (infartado) comparado con el hemisferio contralateral (no infartado) (p < 0.01) . Los ratones inmunosuprimidos de neutrófilos antes de la cirugía demostraron una reducción de 3.0 veces en los volúmenes de infarto (p < 0.001), en base en la tinción con cloruro de trifeniltetrazolio de cortes cerebrales en serie, un flujo sanguíneo cerebral cortical ipsilateral mejorado (medido por doppler láser) y un déficit neurológico reducido en comparación con los controles . En ratones tipo silvestre sometidos a 45 minutos de isquemia seguidos por 22 horas de reperfusión, se incrementó el ARNm para ICAM-l en el hemisferio ipsilateral, con inmunohistoquímica localizando expresión aumentada de ICAM-l en el endotelio microvascular cerebral . Se investigó el papel de que la expresión de ICAM-l en el ataque en ratones homocigotos carentes de ICAM-l (ICAM-l -/-) en comparación con controles de tipo silvestre (ICAM-l +/+) . Los ratones ICAM-l -/- mostraron una reducción de 3.7 veces en el volumen de infarto (p < 0.005) a un incremento de 35% en la supervivencia (p < 0.05), y un déficit neurológico reducido en comparación con los controles ICAM-l +/+. El flujo sanguíneo cerebral al hemisferio infartado fue 3.1 veces mayor en ratones ICAM-l -/- en comparación con los controles ICAM-l +/+ (p < 0.01) lo que sugiere un papel importante para ICAM-l en la génesis sin reflujo cerebral postisquémico. Debido a que los ratones suprimidos de PMN y deficientes en ICAM-l son relativamente resistentes a daño por isquemia-reperfusión cerebral, estos estudios sugieren un papel importante para la adhesión de PMN mediada por ICAM-l en la patofisiología del ataque en desarrollo.
INTRODUCCIÓN: Los neutrófilos (PMN) están involucrados de manera crítica en las etapas más tempranas de inflamación posterior a isquemia tisular, iniciando funciones de eliminación las cuales finalmente están relacionadas por los macrófagos . Existe un lado más oscuro para el flujo de entrada de neutrófilos, sin embargo, especialmente en tejidos post-isquémicos 1_7 en donde los PMN activados pueden aumentar el daño a los elementos vasculares y celulares del parénquima. La evidencia experimental apunta a un papel pivotal para las células endoteliales en el establecimiento del reclutamiento postisquémico de PMN, en que las células endoteliales hipóxicas/isquémicas sintetizan la citosina proinflamatoria IL-18 así como el potente quimioatrayente de neutrófilos y activador, IL-89. La adhesión firme de los PMN a endotelio activado en un ambiente vascular postisquémico está promovido por la translocación de P-selectina a la superficie celular10 así como la producción aumentada de factor activador de plaquetas y' de ICAM-l11. _ Aunque las estrategias para bloquear cada uno de estos mecanismos de reclutamiento de neutrófilos son protectoras en diversos modelos de isquemia y daño por reperfusión, su efectividad en el daño cerebral por isquemia/reperfusión permanece en controversia. Existe evidencia considerable de que en el cerebro, así como en otros tejidos, un flujo de entrada de PMN temprano sigue a un episodio isquémico12"17. Se han descrito estudios inmunohistoquímicos que describen la expresión aumentada de moléculas de adhesión de PMN a P-selectina y la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-l) en la vasculatura cerebral postisquémica12'18"20. Sin embargo, aún permanece en controversia la importancia patogénica de la expresión de la molécula de adhesión en el cerebro; los datos de un ensayo de un anticuerpo monoclonal contra ICAM-l en un ataque en humanos aún no está disponible. En modelos animales, existe evidencia experimental contradictoria respecto a la efectividad de las estrategias de moléculas antiadhesión en el tratamiento de ataque experimental21"23. Para determinar si ICAM-l participa en la patogénesis de daño cerebral postisquémico, los experimentos reportados aquí se diseñaron en un modelo de ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión de manera que se pudiera determinar el papel de un solo mediador crítico de adhesión de PMN (ICAM-l) . Estos estudios demostraron que la expresión aumentada de ICAM-l y flujo de entrada de neutrófilos sigue a un episodio de isquemia cerebral focal. Además, estos estudios mostraron que ratones carentes de ICAM-l deficientes de neutrófilos y transgénicos son relativamente resistentes a infarto cerebral posterior a isquemia y reperfusión, lo que proporciona fuerte evidencia de un papel exacerbante de ICAM-l en la patofisiología de los ataques.
MATERIALES Y MÉTODOS Ratones : Se realizaron experimentos con ratones transgénicos deficientes de ICAM-l generados como se ha reportado previamente24 mediante direccionamiento de genes en células pluripotenciales embriónicas Jl, inyectadas en blastosistos C57BL/6 para obtener la transmisión en línea germinal, y se retrocruzaron para obtener ratones homocigotos carentes de ICAM-l. Todos los experimentos se realizaron con ratones ICAM-l -/- o tipo silvestre (ICAM-1+/+) primos de la quinta generación de retrocruzamientos con ratones C57BL/6. Los animales tenían 7 a 9 semanas "de edad y pesaban entre 25 y 36 gramos en el momento de los experimentos. Para ciertos experimentos, se llevó a cabo la supresión de neutrófilos en los ratones C57BL/6 al administrar anticuerpo de conejo policlonal contra neutrófilos de ratón25 (Accurate Scientific, Westbury NY) preabsorbido para eliminar las células sanguíneas rojas como una inyección intraperitoneal diaria (0.3 ml de una solución 1:12) durante 3 días. Los experimentos en estos ratones se llevaron a cabo en el cuarto día después de confirmar agranulocitosis por tinción de Wright-Giemsa de frotis de sangre periférica.
Oclusión transitoria de la arteria cerebral media26: Se anesteciaron ratones con una inyección intraperitoneal de 0.3 ml de quetamina (10 mg/cc) y xilazina (0.5 mg/cc) . Se colocaron los animales en posición supina sobre una superficie de operación controlada por temperatura rectal (Yellow Spings Instruments, Inc., Yellow Springs, OH) . Se mantuvo a la temperatura del núcleo del animal a 36-38°C intraoperatoriamente y durante 90 minutos de manera postoperatoria. Se realizó la oclusión de la arteria cerebral media como sigue: se generó una incisión en la parte de la línea media del cuello para exponer la cobertura de la carótida derecha bajo el microscopio de operación (16-25X de aumento zoom, Zeiss, Thornwood, NY) . La arteria carótida común se liberó de su cubierta, y se aisló con hilo de seda 4-0, y las arterias occipital y pterigopalatina se aislaron y dividieron cada una. Se obtuvo control total de la arteria carótida interna y se cauterizó la carótida externa y se dividió justo proximal a su bifurcación en las divisiones lingual y maxilar. La oclusión de la transitoria de la carótida se llevó a cabo al hacer avanzar una sutura de 13 mm de nylon 5-0 roma con calor vía el muñón de la carótida externa al origen de la arteria cerebral media. Después de la colocación de la sutura oclusora, se cauterizó el muñón de la arteria carótida externa para evitar el sangrado a través de la arteriotomía y se restableció el flujo arterial. En todos los casos, la duración de la oclusión de la carótida fue menor de 2 minutos. Después de 45 minutos, se extrajo la sutura oclusora para establecer reperfusión. Estos procedimientos han sido descritos previamente con detalle26.
Medición del fluio sanguíneo cortical cerebral: Se realizaron mediciones transcraneales del flujo sanguíneo cerebral utilizando mediciones de flujo doppler láser (Perimed, Inc., Piscataway, NJ) después de la reflexión de la suprecapa cutánea del calvario, como se ha descrito previamente27 (las lecturas transcraneales fueron consistentemente las mismas a aquéllas realizadas después de craneatomía en estudios piloto. Utilizando una sonda doppler láser recta (modelo #PF303, Perimed, Piscataway, NJ) y marcas publicadas previamente (2 mm posterior al breg a, 6 mm a cada lado de la línea media) , las mediciones de flujo sanguíneo cerebral relativo se realizaron como se indicó; inmediatamente después de la anestesia, después de la oclusión de la arteria cerebral media, inmediatamente después de reperfusión y a las 24 horas justo antes de eutanasia. Los datos se expresan como la proporción de la intensidad de la señal doppler del hemisferio isquémico comparado con el no isquémico. Aunque este método no cuantifica el flujo sanguíneo cerebral por gramo de tejido, el uso de las mediciones de flujo doppler láser en marcas establecidas anatómicas definidas con precisión sirve como un medio para comparar los flujos sanguíneos cerebrales en el mismo animal en serie, con respecto al tiempo. El procedimiento quirúrgico/oclusión de la arteria cerebral media intraluminal y la reperfusión se consideran que son técnicamente adecuados si se observa = 50% de reducción en relación al flujo sanguíneo cerebral inmediatemente después de la colocación de la sutura oclusora intraluminal y un incremento de = 33% en el flujo sobre la oclusión de línea de base observado inmediatamente después de la remoción de la sutura oclusora. Estos métodos se han utilizado en estudios previos26.
Preparación y administración de neutrófilos de ratón marcados con 11:LIn: Sangre citratada de ratones tipo silvestre se diluyó 1:1 con NaCl (0.9%) seguido por ultracentrifugación en gradiente sobre Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Después de lisis hipotónica de los eritrocitos residuales (exposición de 20 segundos a H20 destilada seguido por reconstitución con NaCl al 1.8% NaCl) , los neutrófilos se suspendieron en solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Se suspendieron 5-7.5 x 106 neutrófilos en PBS con 100 µCi de oxina de xllIndio (Amersham Mediphysics, Port Washington, NY) durante 15 minutos a 37 °C. Después de lavado con PBS, los neutrófilos fueron sedimentados suavemente (450 g) y resuspendidos en PBS hasta una concentración final de 1.0 x 10s células/ml. Inmediatamente antes de la cirugía, se mezclaron 100 µl de PMN radiomarcados con solución salina fisiológica hasta un volumen total de 0.3 ml («3 x 106 cpm) y se administraron por inyección en la vena del pene . Después de eutanasia sin sufrimiento, se obtuvieron los cerebros como se describió, y se cuantificó la deposición de neutrófilos como cpm/g de cada hemisferio.
Examen neurolóaico: Veinticuatro horas después de la oclusión y reperfusión de la arteria cerebral media, antes de proporcionar anestesia, se examinó a los ratones para determinar el déficit neurológico utilizando un sistema de evaluación de cuatro niveles26: Una calificación de (1) se proporciona si el animal demuestra movimientos espontáneos normales; se proporciona una calificación de (2) si se nota que el animal se voltea hacia la derecha (círculos en el sentido de las manecillas del reloj, cuando se observa desde la parte superior (es decir, hacia el lado contralateral) ,- se proporciona una calificación de (3) si se observa que el animal gira longitudinalmente (en el sentido de las manecillas del reloj cuando se observa desde la cola) ,- se proporciona una calificación de (4) si el animal se encuentra agazapado sobre las cuatro patas, sin respuesta a estímulos nocivos. Este sistema de calificación ha sido descrito previamente en ratones26, y se basa en sistemas de calificación similares utilizados en ratas28,29 los cuales se basan en el movimiento contralateral de animales con ataque,- después del infarto cerebral, el lado contralateral es "débil" y de esta manera el animal tiende a girar hacia el lado debilitado. Los trabajos previos en ratas28 y ratones26 demuestra que los infartos cerebrales más grandes están asociados con un mayor grado de movimiento contralateral, hasta el punto en el que los infartos son demasiado grandes de manera que los animales permanecen sin respuesta.
Cálculo del volumen del infarto: Después de examen neurológico, se administra a los ratones 0.3 ml de quetamina (10 mg/ml) y xilazina (0.5 mg/ml), y se obtienen mediciones del flujo sanguíneo cerebral final. Se realiza eutanasia humana por decapitación bajo anestesia, y se extraen los cerebros y se colocan en una matriz de cerebro de ratón (Activational Systems Inc., Warren, MI) para cortes de 1 mm. Las secciones se sumergen en cloruro de 2,3,5, trifenil, 2H-tetrazolio al 2% (TTC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en solución salina amortiguada con fosfato al 0.9%, se incuba durante 30 minutos a 37 °C y se coloca en formalina al 10%26,30"32. Se visualizan los cerebros infartados como un área de tejido no teñido, en contraste con tejido viable, el cual tiñe de color rojo ladrillo. Se calculan los volúmenes de infarto a partir de los cortes en serie planimetrados si se expresan como el porcentaje de infarto en el hemisferio ipsilateral .
Extracción de ARN y análisis por transferencia Northern (Northern biot) : 24 horas después de isquemia focal y reperfusión, se obtienen los cerebros y se dividen en cerebros ipsilateral (con infarto) y contralateral (sin infarto) . Para detectar los transcritos de ICAM-l, se extrae el ARN total de cada hemisferio utilizando un equipo de aislamiento de ARN (Stratagene, La Jolla, CA) . Se cargan cantidades iguales de ARN (20 µg/banda) en un gel de agarosa al 1.4% que contiene formaldehído 2.2 M para fraccionamiento por tamaño, y después se transfiere durante la noche a membranas de nylon (Nytran) con amortiguador SSC 10X mediante presión por capilar. Se marca una sonda33 ADNc para ICAM-l de ratón (1.90 kb, ATCC, Rockville, MD) con 32P-c_-dCTP por etiquetado aleatorio del sebador o iniciador (equipo Prime-A-Gene, Promega), que hibridiza en los puntos a 42 °C, seguido por 3 lavados con IX SSC/0.5% de SDS. Se desarrollaron manchas con película X-Omat AR expuesta con tamices de luz a -70° durante 7 días. Se utilizó una sonda de ß-actina (ATCC) para confirmar cargado de ARN.
Inmunohistoquímica : Se removieron los cerebros en los tiempos indicados después de la oclusión de la arteria cerebral media, se fijaron en formalina al 10%, se incrustaron en parafina y se cortaron para inmunohistoquímica. Los cortes o secciones se tiñieron con anticuerpo de rata contra ICAM-l de ratón (dilución 1:50, Genzyme, Cambridge MA) , y se visualizaron los sitios de unión primaria de anticuerpo mediante un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina detectado con FastRed (TR/naftol AS-MX, Sigma Chemical Co., St. Louis MO) .
Análisis de datos: Se compararon el flujo sanguíneo cerebral, los volúmenes de infarto y las calificaciones de resultado neurológico utilizando la prueba t de Student para variables no pareadas. Se evaluó la deposición de neutrófilos marcados con llxIndio como datos pareados [al comparar el hemisferio contralateral (sin infarto) con el ipsilateral (con infarto) ] , para control de las variaciones en las cuentas inyectadas o el volumen de distribución. Se determinó las diferencias de supervivencia entre los grupos utilizando análisis de contigencia con la estadística de Chi cuadrado. Los valores se expresan como medias ± como SEM (media de error estándar), con una p < 0.05 considerada como estadísticamente significativa.
RESULTADOS : Acumulación de neutrófilos en ataque: Los estudios patológicos previos han demostrado acumulación de neutrófilos después de infarto cerebral15"17,34"36. Para determinar si los neutrófilos se acumulan en el modelo de ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión, se cuantificó la acumulación de neutrófilos posterior a isquemia transitoria (45 minutos) y reperfusión (22 h) , al medir la deposición de neutrófilos marcados con lxlIn administrados a ratones tipo silvestre antes del fenómenos isquémico. Estos experimentos demostraron una acumulación de neutrófilos significativamente mayor (incremento de 2.5 veces) en los hemisferios ipsilateral (con infarto) en comparación con el contralateral (no infartado) (n = 7, p < 0.01; Figura 1) . Se obtuvieron resultados similares cuando el flujo de entrada de neutrófilos se monitoreó por ensayos de mieloperoxidasa, aunque se registraron niveles bajos de actividad en este último ensayo (datos no mostrados) .
Efecto de la supresión de neutrófilos sobre el resultado posterior a ataque: Para determinar el efecto del flujo de entrada de neutrófilos sobre los índices del resultado posterior al ataque, se inmunosuprimió a ratones de neutrófilos comenzando tres días antes de la cirugía. Cuando se realizó la cirugía en el cuarto día, fue evidente una agranulocitosis casi completa en los frotis de sangre periférica. Los ratones neutropénicos (n = 18) se sometieron a isquemia durante 45 minutos y 22 horas de reperfusión, y se determinaron los índices de resultado posterior al ataque . Los volúmenes de infarto fueron 3 veces más pequeños en animales neutropénicos en comparación con los controles de tipo silvestre (11.1 ± 1.6% versus 33.1 ± 6.4%, p < 0.001; Figura 2A) . La disminución en los volúmenes de infarto en ratones neutropénicos fue paralelo a las calificaciones de déficit neurológico reducido (Figura 2B) , flujos sanguíneos corticales cerebrales de postrreperfusión aumentados (Figura 2C) y una tendencia hacia una mortalidad durante la noche reducida (22% de mortalidad en ratones neutropénicos versus 50% de mortalidad en controles, Figura 2D) .
Expresión de ICAM-l en ataque en ratones: Para establecer el efecto de la isquemia/reperfusión cerebral en el modelo en ratón, se evaluaron las concentraciones de ARNm para ICAM-l posterior a isquemia y reperfusión cerebral en ratones tipo silvestre. El hemisferio cerebral ipsilateral (infartado) demostró ARNm para ICAM-l aumentado mediante el análisis de transferencia Northern, en comparación con el ARN obtenido del hemisferio contralateral (no infartado) del mismo animal (Figura 3) . Para evaluar la expresión del antígeno para ICAM-l en este modelo en ratón, se sometió a ratones de tipo silvestre a isquemia durante 45 minutos seguido por 23 horas de reperfusión, y se examinó la microvasculatura cerebral por inmunohistoquímica. La expresión del antígeno ICAM-l no fue detectable en la microvasculatura cerebral contralateral al infarto (Figura 4A) , pero se incrementó de manera notable en el lado ipsilateral, con una tensión prominente de ICAM-l de las células endoteliales cerebrales (Figura 4B) .
Papel de ICAM-l en el ataque: Para explorar el papel de ICAM-l en el ataque, se estudiaron ratones transgénicos los cuales son homocigotos deficientes de ICAM-l24 en el modelo de ratón de isquemia cerebral focal y de reperfusión. Debido a que se han reportado variaciones en la anatomía cerebrovascular que resultan en diferencias en susceptibilidad al ataque experimental en ratones37, se realizó tinción con tinta india sobre el círculo de Willis en ratones homocigotos carentes (ICAM-l -/-) e ICAM-l +/+ . Estos experimentos (Figura 5) demuestran que no hay diferencias anatómicas generales en el patrón vascular de la circulación cerebral. Para determinar el papel de la molécula de adhesión intercelular- 1 en el flujo de entrada de neutrófilos posterior a isquemia cerebral focal y reperfusión, se midió la acumulación de neutrófilos en ratones homocigotos carentes de ICAM-l (ICAM-l -/-) (n = 14) y en ratones controles tipo silvestre (n=7) sometidos a infusión con neutrófilos marcados con U1ln. La acumulación relativa de neutrófilos (cpm ipsilateral/cpm contralateral disminuyó (39% de reducción) en ratones ICAM-l -/-en comparación con los controles ICAM-l +/+ (1.70 ± 0.26 versus 2.9 ± 0.52, p, < 0.05) . Posteriormente se realizaron experimentos para investigar si la expresión de ICAM-l tiene un papel patofisiológico en el resultado posterior a ataque. Los ratones ICAM-l -/- (n = 13) estuvieron protegidos de manera significativamente de los efectos de isquemia cerebral focal y reperfusión, en base en una reducción de 3.7 veces en el volumen de infarto (p < 0.01), en comparación con los controles ICAM-l +/+ (Figuras 6 y 7A) . Esta reducción en el volumen de infarto fue acompañada por un déficit neurológico reducido (Figura 7B) y un flujo sanguíneo cortical cerebral aumentado posterior a la reperfusión (Figura 7C) . Dados estos resultados, no es sorprendente que la mortalidad también estuviera disminuida significativamente en los ratones ICAM-l -/- en comparación con los controles ICAM-l +/+ (15% versus 50%, p < 0.05; Figura 7D) .
DISCUSIÓN: La evidencia epidemiológica en humanos sugiere que los neutrófilos contribuyen tanto al inicio de ataque38 así como al daño tisular cerebral y al pobre resultado clínico39, con un papel potencial para los neutrófilos en la hipoperfusión postisquémica, disfunción neuronal y formación de cicatriz40"44. Aunque existe considerable evidencia experimental la cual sugiere que los neutrófilos pueden exacerbar el daño tisular posterior al ataque13,45"48, ciertas piezas de datos experimentales han establecido controversia al no encontrar una asociación entre agentes los cuales bloquean la acumulación de neutrófilos y los índices del resultado posterior al ataque. En un modelo de ataque en rata, la supresión mediada por anticuerpos de los neutrófilos antes del ataque disminuye significativamente el contenido de agua y cerebro y el tamaño del infarto13. Sin embargo, la leucocitopenia inducida por ciclofosfamida en un modelo en gerbo49 o la administración de anticuerpo contra neutrófilos a perros50 no muestra efectos benéficos en los modelos globales de isquemia cerebral. La terapia experimental que tiene como objeto interferir con las interacciones neutrófilo-endoteliales también ha producido resultados ambiguos . En un modelo en fenilo de isquemia cerebral focal transitoria, el tratamiento con el anticuerpo para CD18 (la subunidad común de las ß2 integrinas, las cuales se unen a la molécula de adhesión intercelular l51) no altera la recuperación de flujo sanguíneo cerebral, el retorno de los potenciales inducidos o el volumen de infarto23. Sin embargo, otros experimentos han demostrado que la patencia microvascular después de isquemia focal transitoria en primates es mejorada por los anticuerpos para CD1814. En un modelo similar en rata, el anticuerpo anti-CDllb/CD18 también se ha demostrado que reduce tanto la acumulación de neutrófilos como el daño neuronal relacionado con isquemia52. Los experimentos reportados aquí muestran que en un modelo en ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión, los neutrófilos se acumulan en tejido cerebral " postisquémico, un hallazgo corroborado en otros modelos los cuales muestran similarmente acumulación aumentada de granulocitos en áreas de bajo flujo sanguíneo cerebral en períodos tempranos durante el período postisquémico15'16'36,45. No sólo los neutrófilos se acumulan durante el período postisquémico en ratones, sino que su presencia exacerba los índices del resultado posterior al ataque. Cuando los animales se vuelven neutropénicos antes del evento isquémico, los infartos cerebrales son más pequeños, con perfusión cerebral mejorada posterior al evento isquémico. Estos datos son muy similares a los reportados en un modelo en conejo de ataque tromboembólico, en el cual la inmunosupresión de neutrófilos resulta tanto en un volumen de infarto reducido como en flujo sanguíneo mejorado35. Debido a que los neutrófilos contribuyen al daño cerebral postisquémico en ratón, se diseñó una estrategia para dilucidar el papel de ICAM-l en la patofisiología del ataque utilizando ratones mutantes suprimidos de ICAM-124. Los experimentos indican que los ratones homocigotos carentes de ICAM-l son relativamente resistentes a los efectos dañinos de la isquemia cerebral y reperfusión. Para demostrar el papel tanto de los neutrófilos como de ICAM-l en la patogénesis de daño tisular en ataque, los estudios reportados aquí utilizaron varios métodos para determinar el resultado posterior a ataque. Aunque numerosos investigadores han utilizado la tinción con TTC para cuantificar los volúmenes de infarto cerebral26'30"32,37,53-, ha habido cierta controversia respecto a la precisión de este método, especialmente cuando se evaluó por primera vez posterior al evento isquémico. En el método TTC, el cloruro de 2 , 3 , 5-trifenil-2H-tetrazolio (TTC) reacciona con enzimas oxidativas intactas sobre los cristales mitocondriales y de esta manera se reduce a coloreado54. La tinción con TTC no es confiable antes de que hayan transcurrido dos horas de isquemia; posterior a 36 horas, las células se filtran en el tejido infartado y se pueden teñir positivamente con TTC, por lo que oscurecen una demarcación clara entre los tejidos infartado y no infartado observados con la tinción más temprana31. Aunque el tamaño de infarto delineado por tinción con TTC se correlaciona bien con el tamaño de infarto delineado por medio de la tinción con hematoxilina y eosina30,32, las mediciones morfométricas directas tienden a sobreestimar los volúmenes de infarto debido al edema cerebral, especialmente durante los primeros 3 días posteriores al evento isquémico32. Sin embargo, dadas estas limitaciones, los estudios reportados aquí incorporan tres métodos adicionales para definir el papel de los neutrófilos y de ICAM-l en el resultado posterior al ataque, incluyendo la calificación de déficit neurológico, el flujo sanguíneo cerebral relativo al área afectada y la mortalidad. Estas medidas adicionales, las cuales no dependen de la precisión de la tinción con TTC, contribuyen fuertemente a la identificación de un papel patogénico tanto para los neutrófilos como para ICAM-l en el ataque. Ha habido profusión reciente de estudios científicos que exploran las bases mecánicas para el reclutamiento de neutrófilos a los tejidos postisquémicos . Las células endoteliales parecen ser los reguladores principales del tráfico de neutrófilos, regulando el proceso de quimioatracción, adhesión y emigración de neutrófilos desde la vasculatura55. Cuando se exponen a un ambiente epóxico como un paradigma para isquemia de tejido, las células endoteliales sintetizan el potente quimioatrayente y activador de neutrófilos interleucina-8 (IL-8) V el bloqueo del cual parece ser benéfico en un modelo en pulmón de isquemia y reperfusión6. Además, las células endoteliales epóxicas sintetizan la citosina proinflamatoria interleucina-l8, la cual puede realizar una regulación ascendente de la expresión endotelial de las moléculas de adhesión de neutrófilos de E-selectina y ICAM-l de manera autocrina8,9,56. Otros mecanismos de adhesión de neutrófilos también pueden ser activados en el cerebro posterior a isquemia, tales como la liberación de P-selectina de acumulados almacenados realizados dentro de las membranas del cuerpo Weibel-Paladel10. En un modelo en primate, la expresión de P-selectina fue aumentada rápida y persistentemente posterior a isquemia de la arteria cerebral media focal y reperfusión18. Aunque el reclutamiento de neutrófilos dependiente de P-selectina parece ser dañino posterior a isquemia cardíaca y reperfusión57, aún no se ha determinado su importancia patofisiológica en el establecimiento del ataque. Aunque la hipoxia induce la síntesis de novo de factor activador de plaquetas lipídico bioactivo (PAF)11, en un modelo de reperfusión de isquemia de la médula espinal, el antagonismo de PAF no ofrece un beneficio de incremento cuando se administra simultáneamente con anticuerpo a CD11/CD1848. La comprensión del papel de ICAM-l en la patofisiología del ataque parece ser de particular relevancia en humanos por varias razones. Se ha demostrado una expresión cerebrovascular aumentada de ICAM-l en primates a las cuatro horas de isquemia y reperfusión, particularmente en la microvasculatura lenticuloestriada18. Un estudio de autopsia de infartos cerebrales recientes en humanos también demuestra una expresión aumentada de ICAM-l20. Puesto que las ratas también expresan ICAM-l vascular cerebral en las siguientes 24 horas tanto en el modelo inducido fotoquímicamente de isquemia cerebral de rata19 así como en el modelo de oclusión de la arteria cerebral media12, estos datos sugieren la utilidad potencial de ratones transgénicos deficientes en ICAM-l para dilucidar la importancia patofisiológica de la expresión aumentada cerebral postisquémica de ICAM-l. En particular, el marco de tiempo de expresión de ICAM-l (incrementado de 4 a 24 horas) en estos modelos sugiere que las interacciones de neutrófilo-endoteliales mediadas por ICAM-l pueden ser el objetivo en estrategias farmacológicas futuras para mejorar el resultado posterior a ataque en humanos, pues este marco de tiempo representa un intervalo clínico realista para intervención terapéutica. Aunque los animales neutropénicos demostraron flujo sanguíneo cerebral regional aumentado en comparación con los controles, comparado con animales neutropénicos, los ratones deficientes en ICAM-l tienden a presentar flujos sanguíneo cerebrales ipsilaterales incluso mayores a las 24 horas. Esta observación se puede relacionar con el fenómeno de carencia de reflujo, en el que el flujo sanguíneo no regresa a los niveles previos a la obstrucción incluso después de liberación de una oclusión vascular temporal. Un cuerpo significativo de investigación previa ha implicado a los neutrófilos taponando los lechos microvasculares capilares en este proceso58, aunque en un modelo de isquemia cerebral global, una reducción de 85% en la cuenta de leucocitos circulantes no disminuye la incidencia o la gravedad del fallo de reflujo49. Los datos sugieren que los mecanismos no dependientes de neutrófilos, los cuales no obstante involucran a uno, pueden contribuir a la carencia de reflujo postisquémico cerebro vascular. Puesto que los macrófagos y linfocitos expresan, ambos, LFA-1, la cual media una interacción adhesiva con las células endoteliales ICAM-l51, es posible que ratones con deficiencia de ICAM-l tengan un reclutamiento disminuido de estas células mononucleares, una posibilidad la cual actualmente es objetivo de investigación adicional. Esta hipótesis es soportada por observaciones patológicas múltiples que demuestran la acumulación de macrófagos y linfocitos en 1-3 días posteriores a infarto cerebral12,17,19'34'59. Tomados juntos, estos estudios indican que en un modelo de ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión, los neutrófilos se acumulan en el hemisferio infartado, que los animales neutropénicos demuestran protección cerebral . La expresión aumentada de ICAM-l en células endoteliales cerebrales parece ser un mecanismo importante que activa este reclutamiento de neutrófilos, y los ratones los cuales no son capaces de expresar ICAM-l demuestran flujos sanguíneos postisquémicos mejorados, volúmenes de infarto reducidos y mortalidad reducida. Estos datos sugieren que las estrategias farmacológicas que tienen como objetivo la interferencia con interacciones de neutrófilo-endoteliales pueden mejorar el resultado posterior a ataque en humanos.
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EJEMPLO 2: ?xocitosis inducida por hipoxia de cuerpos de Weibel-Palade de células endoteliales: Un mecanismo para el reclutamiento rápido de neutrófilos posterior a preservación cardíaca El período de hipoxia (H) es un evento principal importante para la disfunción vascular la cual acompaña la reperfusión, en donde las células endoteliales (EC) y neutrófilos (PMN) juegan un papel central. Se ha establecido la hipótesis de que la exocitosis del cuerpo de Weibel-Palade de EC (WP) durante el período hipóxico/isquémico durante la preservación del órgano permite el reclutamiento vigoroso de los PMN en el tej ido postisquémico, un proceso amplificado adicionalmente en un ambiente rico en oxidante. La exposición de los EC de la vena umbilical humana a un ambiente hipóxico (p02 «20 torr) estimula la liberación del factor de von Willebrand (vWF) , almacenado en los cuerpos EC WP, así como una expresión aumentada de la molécula de adhesión de PMN derivada del cuerpo WP, P-selectina en la superficie de EC. La unión aumentada de los PMN marcados con l?:LIn a las monocapas de EC epóxicos (en comparación con controles normóxicos) se bloquea con un anticuerpo bloqueador para P-selectina, pero no tiene efecto por un anticuerpo control no bloqueador. Aunque la expresión aumentada de P-selectina y la liberación de vWF también se observa durante la reoxigenación, H sola (incluso en presencia de antioxidantes) es suficiente para incrementar la exocitosis del cuerpo WP. Para determinar la relevancia de estas observaciones en la preservación cardíaca hipotérmica, durante la cual la p02 dentro de la basculatura cardíaca declina a niveles similarmente bajos, se realizaron experimentos en roedores (rata y ratón) de preservación cardíaca/modelo de transplante. La inmunosupresión de los PMN receptores o la administración de anticuerpo contra P-selectina bloqueador antes del transplante resulta en una infiltración reducida de neutrófilos al injerto y una supervivencia mejorada al injerto, en comparación con corazones preservados idénticamente transplantados a receptores control . Para establecer el papel importante de la expresión de P-selectina endotelial sobre la vasculatura del donador, se realizaron transplantes cardíacos en ratón utilizando corazones donadores deficientes en P-selectina homocigotos y controles de tipo silvestre lavados libres de sangre/plaquetas antes de la preservación/transplante. Los corazones carentes de P-selectina transplantados en los receptores de tipo silvestre demostraron una reducción notable (13 veces) en la infiltración de neutrófilos al injerto y una supervivencia aumentada al injerto en comparación con los corazones de tipo silvestre transplantados en receptores tipo silvestre. Para determinar si la exocitosis del cuerpo de Weibel-Palade endotelial coronaria puede presentarse durante la preservación cardíaca en humanos, se midió la liberación de vWF en el seno coronario en 32 pacientes durante cirugía a corazón abierto. Las muestras de seno coronario obtenidas al inicio y a la conclusión del período isquémico demostraron un incremento en el antígeno vWF del seno coronario (por ELISA) que consiste de multímeros de peso molecular predominantemente elevado (por inmunoelectroforesis) . Estos datos sugieren que la exocitosis del cuerpo de Weibel-Palade EC ocurre durante la preservación cardíaca hipotérmica, sebando la vasculatura para reclutar rápidamente los PMN durante la reperfusión.
Introducció : Las células endoteliales (EC) se adaptan a hipoxia con un repertorio característico de respuestas (1), que varían desde una expresión aumentada de endotelina (2) hasta síntesis aumentada de factor de crecimiento de fibroblastos básicos (3) . Estudios recientes han indicado que muchas características de las respuestas de EC a hipoxia son paralelas a las características de la respuesta inflamatoria; la hipoxia regula de manera ascendente selectivamente la expresión de EC de interleucina-1 (4) , 6 (5) , y 8 (6), factor de activación de plaquetas (PAF) (7,8), e ICAM-l (4) , los cuales sirven para impulsar el reclutamiento de neutrófilos PMN, la adhesión y activación en el lugar isquémico. Aunque estos mecanismos pueden explicar las fases posteriores del daño por reperfusión, la rapidez con la cual se reclutan los PMN al miocardio reperfundido posterior a un período de preservación hipotérmica sugiere que los mecanismos estén involucrados los cuales no requieren la síntesis de proteína de novo . A este respecto, la P-selectina puede figurar prominentemente en las fases más tempranas de adhesión de PMN a la vasculatura reperfundida, y los EC pueden expresarse rápidamente P-selectina formada previamente a partir de sitios de almacenamiento subplasmalemales en las membranas del cuerpo Weibel-Palade (9) en respuesta a la abundancia de radicales libres de oxígeno generados en el ambiente de reperfusión (10-12) . Además, datos recientes han apuntado a un papel de la supresión de leucocitos mediada por P-selectina en leucostasis y daño tisular asociado con daño a pulmón (13) e isquemia cardíaca (14) . Tomados juntos, estos hallazgos llevan a la hipótesis de que el período hipóxico/isquémico asociado con la preservación miocardíca hipotérmica seba la vasculatura para su respuesta característica durante la reperfusión al exhibir prominentemente P-selectina en la superficie de EC antes de reperfusión, lo que sirve como una chispa la cual enciende y amplifica la respuesta inflamatoria subsecuente. Los experimentos fueron diseñados para establecer si la hipoxia per se (o la preservación cardíaca hipotérmica, como se produce durante la cirugía cardíaca, en la cual la p02 dentro del lecho coronario declina a pO2<20 Torr) (15) puede resultar en exocitosis de cuerpos WP . Además, se diseñaron experimentos para determinar el papel de la adhesión de PMN dependiente de P-selectina en el fallo de injerto cardíaco el cual sigue de manera característica un período de preservación hipotérmica prolongada. Los resultados muestran que la hipoxia es suficiente para inducir la exocitosis de cuerpos WP de EC, incluso en ausencia de reoxigenación (y presencia de antioxidantes) y que la expresión resultante de P-selectina causa que los EC se unan a los PMN in vitro. En roedores, las consecuencias adversas de la expresión de P-selectina posterior a preservación cardíaca hipotérmica se pueden abrogar completamente ya sea por supresión de neutrófilos, bloqueo de P-selectina o por transplante de corazones cuyas células endoteliales fallan en expresar P-selectina. Debido a que la exocitosis del cuerpo de WP también se produce en pacientes que experimentan cirugía de corazón abierto durante el período de preservación cardíaca hipotérmica, estos datos sugieren que el bloqueo de P-selectina pueden representar un objetivo para la intervención farmacológica para mejorar la preservación cardíaca en humanos .
Métodos : Cultivo de células endoteliales y exposición de las células a H o H/R. Se prepararon EC de vena umbilical humana a partir de cordones umbilicales y se hicieron crecer en cultivo por el método de Jaffe (16) modificado por Thornton (17) . Los experimentos utilizaron EC confluente (pasajes 1-4) que crecieron en medio 199 suplementado con suero bovino fetal (15%; Gemini, Calabasas, CA) , suero humano (5%; Gemini), suplemento de crecimiento endotelial (Sigma, St. Louis, MO) , heparina (90 µg/ml; Sigma) y antibióticos, como se describió (17) . Cuando los EC alcanzaron confluencia, se realizaron experimentos al colocar cultivos en una cámara ambiental Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI) la cual se proporcionó con control de temperatura (37 °C) y de atmósfera con la cantidad indicada de oxígeno, dióxido de carbono (5%) y el resto constituido de nitrógeno. El uso de esta cámara para experimentos de cultivo celular ha sido descrito previamente (15,18). Durante la exposición de los EC a hipoxia (durante un máximo de 16 horas) , la tensión de oxígeno en el medio de cultivo fue 14-18 torr y no hubo cambio en el pH del medio. La reoxigenación se realizó al colocar los EC en una atmósfera ambiente que contiene dióxido de carbono (5%) a 37°C.
Medición de la exocitosis del cuerpo de Weibel-Palade: Se colocaron en placas los EC en placas de 24 pozos, se remojaron 3 ve.ces de solución salina balanceada de Hank y se expusieron a hipoxia o normoxia por las duraciones indicadas . Para los experimentos en los cuales se midió vWF, las células se mantuvieron en medio libre de suero. Todos los demás experimentos con EC se realizaron en el medio de crecimiento de EC como se ha descrito antes. Para medición de vWF, se removieron alícuotas de 200 µl de sobrenadante de cultivo en los tiempos indicados, y se realizó en muestras por duplicado ELISA disponible comercialmente (American Diagnostica, Greenwich, CT) , basado en un anticuerpo de chivo anti vWF humano policlonal, con una curva estándar generada utilizando antígeno vWF humano purificado suministrado por el mismo proveedor. Se determinó la expresión de P-selectina en EC al medir la unión específica de un anticuerpo P-selectina antihumano monoclonal de ratón (WAPS 12.2 clona, Endogen, Cambridge, MA; esta es una IgGl la cual reconoce un epitopo sensible a calcio y bloque la adhesión de neutrófilos dependiente de P-selectina. El anticuerpo se radiomarcó con 125I por un método de lactoperoxidasa (19) utilizando Enzymobeads (Bio-Rad, Hercules, CA) , almacenadas a 4°C y se utilizaron en la siguiente semana de marcado. Los ensayos de unión se realizaron en HUVEC sembrados en placas de 96 pozos, en las cuales se agregó inmediatamente antes de cada experimento M199 fresco con 0.1% de albúmina sérica bovina (Sigma, St. Louis, MO) . Las células se colocaron en un ambiente humidificado a 37 °C y se expusieron a normoxia o H (en presencia o ausencia de profucol 50 µM como se indica, Sigma) por las duraciones indicadas. Las monocapas de células se fijaron durante 15 minutos con paraformaldehído al l%10 (células expuestas a H se fijaron mientras aún estaban dentro del aibente hipóxico) , se inspeccionaron visualmente para asegurar que las monocapas permanecían intactas, y se lavaron dos veces con HBSS que contiene 0.5% de albúmina sérica bovina (HBSS/A) . Las moncapas después se expusieron a 105 cpm de anticuerpo contra P-selectina marcado con 12SI (WAPS 12.2) en presencia de 200 µg/ml de anticuerpo de bloqueo no marcado (WAPS 12.2) o IgG contra P- selectina no bloqueante del mismo isotipo (anti-GMP-140 , clona AC1.2 , Becton-Dickinson, San José, CA) (20,21). Después de unir durante 1 hora a 37 °C, las monocapas se lavaron 4 veces con HBSS/A, se eluyó el anticuerpo unido con tritón X-100 al 1% en PBS (200 µl/pozo) y se contaron. Para ciertos experimentos se agregó cicloheximida (10 µg/ml, Sigma) al inicio del período normóxico o hipóxico de 4 horas, como se indicó. En experimentos separados, diseñados para determinar el grado de inhibición de síntesis de proteína por él tratamiento con ciloheximida, se incubaron los EC con medio esencial mínimo pobre en metionina o - cisteína (Gibco, Grand Island, NY) en presencia de 35S-metionina y 3SS-cisteína (ya sea en presencia o en ausencia de cicloheximida, 10 µg/ml) (3) . Después de 4 horas de exposición normóxica, se recolectó y contó el material precipitable con ácido tricloroacético.
Preparación de los PMN humanos y medición de unión: Brevemente, sangre citratada de donadores sanos se diluyó 1:1 con NaCl (0.9%) seguido por ultracentrifugación gradiente sobre Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Posterior a las lisas hipotónica de eritrocitos residuales (exposición durante 20 segundos a H20 destilada seguido por reconstitución con NaCl 1.8%), se suspendieron los PMN en HBSS con 5 mg/ml de albúmina sérica humana (HBSS/HSA) . Se suspendieron 50-200 x 106 PMN en HBSS/HSA en presencia de 0.2-0.5 µCi de oxina de lxlIndio (Amersham Mediphysics, Port Washington, NY) durante 15 minutos a 37 °C. Después de lavar con HBSS/HSA, los PMN se sedimentaron suavemente (450 g) y se resuspendieron en HBSS/HSA hasta una concentración final de 5.5 x 106 PMN/ml . Después de agitación suave, se agregaron 100 µl de suspensión de PMN radiomarcados a cada pozo en el tiempo indicado, se incubaron durante 30 minutos a 37 °C y después se lavaron cuatro veces con HBSS/HSA. Las monocapas después se trataron con NaOH y el contenido de cada pozo se extrajo y se contó.
Modelo heterotrópico de transplante cardíaco en rata y ratón. Se realizaron transplantes cardíacos en el modelo de isoinjerto heterotrópico de Ono-Lindsey de transplante cardíaco (15,18,22) .
Brevemente, ratas Lewis macho (250-300 gramos, Harían Sprague Dawley, Indianapolis, IN) se anesteciaron, heparinizaron y el corazón donador se extrajo rápidamente posterior a supresión cardiopléjica con potasio, altamente hipotérmica. Los corazones se preservaron mediante lavado de las arterias coronarias con solución de Ringer (LR) lactada a 4°C seguido por transplante heterotrópico en los receptores pareados por género/cepa, con anastomocis aórtica en el donador y el receptor y anastomocis pulmonar arterial en el donador/en la vena cava inferior del receptor realizada de manera secuencial. Se determinó la supervivencia de injerto por la presencia/ausencia de actividad eléctrica/mecánica cardíaca exactamente 10 minutos después del restablecimiento del flujo sanguíneo, después de lo cual los injertos se extirparon y se cuantificaron las infiltraciones de neutrófilos por actividad de mieloperoxidasa, medida como se ha descrito previamente (15,18). Para ciertos experimentos, la supresión de neutrófilos de las ratas receptoras se llevó a cabo al administrar un anticuerpo de conejo contra neutrófilos de rata policlonal (23-25) (Accurate Scientific, Westbury NY) como una sola inyección intravenosa 24 horas antes del procedimiento del transplante. La supresión de neutrófilos en estos animales se confirmó y cuantificó al contar al contar los neutrófilos restantes, identificados en frotis de tinción de Wright-Giemsa de sangre periférica. En otros experimentos, se administró un igG anti-P-selectina bloqueante (250 µg/rata, Cytel, San Diego, CA) (13,14,26) por vía intravenosa 10 minutos antes del acceso de la reperfusión. Se realizaron transplantes de corazón de ratones de manera idéntica utilizando ratones macho homocigotos carentes de P-selectina o control, de tipo silvestre, con un fondo C57BL/6J (27) , con corazones extirpados inmediatamente y liberados por flujo de sangre nativa con 1.0 ml de LR a 4°C administrada hacia abajo a través de la raíz aórtica sujetada transversal seguido por un período de preservación hipotérmica que consiste de 3 horas de inmerción en solución de Ringer lactada a 4°C.
Medición de vWF en el efluente coronario de -corazones de rata y de humano preservados hipótermicamente : Muestras de seno coronario humano. Después de obtener consentimiento informado, se obtuvo sangre del seno coronario al inicio y a la conclusión de una cirugía cardíaca habitual en una serie no seleccionada de 32 pacientes, con muestreo simultáneo de sangre periférica (arterial) en seis. Las muestras de seno coronario se obtuvieron a partir de catéter de perfusión retrógada el cual se coloca habitualmente en pacientes que experimentan derivación cardiopulmonar . Se centrifugaron muestras de palma durante 5 minutos a 1500 x g para sedimentar los elementos celulares, y se tomaron alícuotas del plasma y se congelaron a -70 °C hasta el momento del ensayo. Se realizó la prueba de ELISA para determinar vWF (como se ha descrito antes) y trombomodulina (Asserchron Thrombomodulin, Diagnostica Stago) .
Inmunoelectroforesis de vWF: Composición multimérica de vWF en muestras de plasma de seno coronario y sobrenadantes de células endoteliales se evaluó al realizar inmunoelectroforesis en gel de agarosa. Las muestras se diluyeron 1:10, 1:20, y 1:30 (como se indica) y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C en amortiguador de muestra nativo (Bio-Rad) . Después las muestras (20 µl) se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1.5% (0.675 g de Low Mr agarosa, Bio-Rad; 0.045 g de SDS; 45 ml.de amortiguador SDS Tris-tricina [Bio-Rad] ) . Los marcadores de peso molecular se corrieron simultáneamente en geles de agarosa y se visualizaron al marcar y dividir el gel, con posiciones de marcador de peso molecular asignados por tinción de azul de Coomasie. La mitad restante del gel se lavó en borato de sodio (0.01 M) durante 30 minutos seguido por transferencia electroforética durante la noche a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se lavó con amortiguador de lavado que consiste de solución salina amortiguada con Tris (pH 7.5) con Tween-20 al 0.05% y después se bloquea durante 1 hora con 50 ml de amortiguador de lavado que contiene 2.5 g de leche instantánea Carnation. Después de remojar con solución salina fisiológica, la membrana se sumerge durante la noche en amortiguador de lavado que contiene 1 g/dl de gelatina y una dilución 1:500 de suero de conejo contra vWF humano (American Bioproducts, Parsippany, NJ) . Después de lavar 5 veces con amortiguador de lavado, la membrana se sumergió durante 3 horas con agitación suave en amortiguador de lavado que contiene 1 g/dl de gelatina y 16.6 µl de IgG de chivo contra conejo, conjugado con peroxidasa de rábano picante (Bio-Rad) y se reveló con 60 ml de revelador HRP (30 mg de revelador de HRP en polvo, Bio-Rad; 10 ml de metanol; 50 ml de solución salina amortiguada con Tris,- 50 µl de peróxido de hidrógeno a 30% ajustado justo antes de su uso) .
Estadística. Se utilizó el análisis de varianza para comparar 3 o más condiciones, con comparaciones post-hoc probadas utilizando el procedimiento de Tukey. Los datos de supervivencia de injerto se analizaron utilizando análisis de contingencia con la estadística Chi cuadrado. La comparación pareada de las mediciones en serie (CS humano y muestras de sangre periférica al inicio y al finalizar la cirugía cardíaca) se compararon utilizando la prueba t de Stundent para variables pareadas. Los valores se expresan como medias ± SEM (media de error estándar) , con una p < 0.05 considerada como estadísticamente significativa.
Resultados: Exposición de los EC cultivados a hipoxia lo que resulta en la liberación de vWF y translocación de P-selectina a la superficie celular. Estudios previos han demostrado que la exposición de células endoteliales a hipoxia resulta en una elevación del calcio intracelular (28) . En vista de la asociación del calcio citosólico aumentado con la exocitosis de cuerpo de Weibel-Palade en EC, en respuesta a trombina o histamina (29,30), se consideró si la exposición de los EC a hipoxia puede iniciar este proceso. Los EC colocados en un ambiente hipóxico (p02 20 torr) liberaron más vWF en los sobrenadantes de cultivo en comparación con sus contrapartes normóxicas (Figura 8A, ELISA; confirmado por inmunoelectroforesis, datos no mostrados) . Aunque una tendencia hacia concentraciones aumentadas de vWF se observó primero a 1 hora de hipoxia, las diferencias entre las concentraciones de pWF normóxicas hipóxicas, no son estadísticamente significativas sino hasta las 4 horas de exposición, y después se incrementan de manera estable hasta las 12 horas de observación. Para determinar si la liberación de vWF aumentada observada por la hipoxia a las 4 horas de edad, debida a la liberación de vWF preformado, se llevaron a cabo experimentos similares en presencia de 10 µg/ml de cicloheximida para inhibir la síntesis de proteína. Estos experimentos mostraron que la adición de cicloheximida al inicio del período hipóxico disminuye la liberación de vWF disminuido por hipoxia en 12.5%, lo que sugiere que la mayor parte de vWF liberado por exposición hipóxica estaba preformado. Aunque estos experimentos se realizaron en su totalidad dentro de un ambiente hipóxico (es decir, no hubo reoxigenación) , para demostrar adicionalmente que esta exocitosis mediada por H de cuerpos de Weibel-Palade es independiente de la formación de intermediarios de oxígeno reactivo, se agregó el antioxidante probucol (50 µM) a los EC al inicio de H y se encontró que no tuvo efecto (vWF, 4.7 ± 0.31 x 10"3 U/ml, a las 6 horas de H) . La presencia de probucol impidió el incremento adicional en las concentraciones de vWF observadas después de la reoxigenación en los EC hipóxicos . Se demostró la dependencia al calcio de la exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade inducida por hipoxia mediante experimentos en los cuales se colocaron los EC en un medio libre de calcio al inicio de la exposición hipóxica. La ausencia de calcio extracelular atenuó la liberación de EC inducida por H, y la adición de EGTA tuvo un efecto incluso más supresor (liberación endotelial basal de vWF también disminuyó por la reducción de calcio extracelular) (Figura 8B) . Para determinar si la hipoxia también induce translocación de P-selectina a la superficie de plasmalema de las EC, se examinó la unión específica de IgG contra P de selectina, marcada con 12SI a monocapa de EC normóxica o hipóxicas . Los estudios de unión se realizaron sobre monocapas de EC fijas con paraformaldehído mientras aún se encontraban en un ambiente hipóxico, para eliminar la expresión de P-selectina inducida por radicales libres oxígeno durante la reoxigenación. Estos estudios demostraron una unión mejorada de IgG contra P-selectina marcada contra 125I por las EC hipóxicas en comparación con las normóxicas (Figura 9A) . Esta unión se bloquea por la IgG bloqueadora, contra P-selectina no etiquetada, pero no por la IgG contra P-selectina control no bloqueadora del mismo isotipo. Se notó la expresión en superficie de P-selectina en los puntos y tiempo más tempranos observados (60 minutos de H) , y se observó a concentraciones similares durante el período de exposición hipóxica (hasta 4 horas de observación) . Es posible que la expresión de P-selectina endotelial inducida por hipoxia se detectó en puntos de tiempo precedentes a un incremento estadísticamente significativo de liberación de vWF en células tratadas similarmente, debido a que una porción de la vWF secretada inicialmente se una firmemente a la matriz subendotelial (31) . Para determinar si se requería síntesis de proteína para la expresión de P-selectina inducida por hipoxia, se realizó un experimento separado en el cual se administró cicloheximida en el inicio de la normoxia o H, y se determinó la unión de IgG anti P-selectina, radiomarcada, en el punto de tiempo de 4 horas. Este experimento demostró que incluso con >85% de inhibición de la síntesis de proteína (Figura 9B, Inserción) , la hipoxia aún incrementa la expresión endotelial de P-selectina, aunque a concentraciones reducidas (Figura 9B) . Para establecer que la P-selectina en la superficie celular inducida por hipoxia puede participar en la unión de neutrófilos, se incubaron neutrófilos humanos radiomarcados con oxina de 111indio, con EC hipóxicas; se observó unión aumentada a monocapas hipóxicas . La unión de PMN marcados con X11ln inducida por hipoxia se bloqueó por la adición de una IgG anti P-selectina bloqueadora, pero no por IgG anti P-selectina no bloqueadora (Figura 9C) Papel de la adhesión de neutrófilos dependientes de P-selectina en preservación de miocardio hipotérmico/isquémico. Para establecer la relevancia de estas observaciones a la preservación miocárdica hipotérmica (en la cual la p02 de la solución de preservación dentro de la basculatura coronaria disminuye por debajo de 20 Torr (15)), se recolectaron corazones de ratas Lewis macho y se sometieron a preservación hipotérmica como se describe en la sección de métodos. Debido a que se ha establecido bien el daño mediado por neutrófilos posterior a isquemia cardíaca (32-38) , se investigó el papel potencial patofisiológico de la expresión P-selectina en un modelo ortotópico de transplante cardíaco de rata en el cual se produjo reperfusión posterior a un período de preservación hipotérmica. Estos experimentos mostraron excelente supervivencia del injerto y poca infiltración de neutrófilos si el transplante se realizaba inmediatamene posterior a la recolección (Figura 10A, fresco) . Sin embargo, cuando se realizaron experimentos similares con un período de intervención (16 horas) de preservación hipotérmica entre los procedimientos de recolección de transplante, hubo una alta incidencia (90%) de fallo de injerto y leucostasis marcada, confirmada histológicamente y por la actividad determinada de mieloperoxidasa (Figura 10A, Preservado) . Para demostrar que la adhesión de neutrófilos era responsable, por lo menos en parte del fallo de injerto después de la preservación prolongada, se realizaron transplantes después de la supresión de neutrófilos de ratas receptoras. El anticuerpo de conejo contra PMN de rata policlonal utilizado (23-25) eliminó virtualmente todos los PMN circulantes en los receptores (cuenta de PMN 1471 ± 56 versus 67 + 11 PMN/mm3 para animales control e inmunosuprimidos , respectivamente, p< 0.001), con poco efecto sobre otros tipos de células. Cuando se transplantaron corazones reservados durante 16 horas a receptores suprimidos de neutrófilos para proporcionar un ambiente de reperfusión libre de neutrófilos, hubo una reducción significativa en la actividad de mieloperoxidasa en el injerto y un incremento en la supervivencia de injerto (Figura 10A, Preservado (-) PMN) . Las ratas receptores normales sometidas a infusión con IgG contra P-selectina bloqueadora 10 minutos antes del restablecimiento del flujo sanguíneo demostraron una reducción tanto de la actividad de mieloperoxidasa como una mejoría en la supervivencia del injerto (Figura 10A, a-PS, bloqueado) de una magnitud similar de los receptores con supresión de neutrófilos. Esta infiltración reducida de PMN y supervivencia mejorada del injerto se observó pese a 16 horas de preservación hipotérmica del corazón donador. En contraste notorio, la administración de un anticuerpo control no bloqueador (AC1.2) no tuvo un efecto benéfico sobre la leucostasis del injerto o la supervivencia de injerto (Figura 10A, a-PS, sin bloqueo) . Debido a que además de que las interacciones entre las EC y los PMN, las plaquetas también pueden interactuar con los PMN vía un mecanismo dependiente de P-selectina (39) , se diseñó un experimento para aislar la construcción de P-selectina endotelial a la leucostasis y fallo de injerto el cual se produce después de preservación cardíaca hipotérmica prolongada. Para estos experimentos, los corazones donadores de ratones homocigotos deficientes en P-selectina se lavaron por descarga y se liberaron de sangre de manera que las células endoteliales coronarias carentes de P-selectina pueden ser transplantadas a receptores tipo silvestre con plaquetas que contienen P-selectina. Utilizando un modelo de transplante cardíaco heterotróico realizado de manera idéntica a la operación de rata, se obtuvieron corazones donadores tanto de ratones homocigotos carentes de P-selectina (27) como de controles tipo silvestre; todos los corazones se transplantaron en receptores tipo silvestre. Estos experimentos demostraron una tasa de supervivencia de injerto significativamente más elevada en los transplantes desde los ratones carentes de P-selectina hacia los tipos silvestre, en comparación con los transplantes desde el tipo silvestre hacia el tipo silvestre (Figura 10B) . Esta supervivencia mejorada del injerto en el primer grupo es paralela a una reducción marcada (13 veces) en la leucostasis del injerto (Figura 10C) . Debido a que estos corazones han sido lavados y liberados de sangre al inicio de la preservación, estos estudios implican que la P-selectina endotelial coronaria (en vez de la derivada de plaquetas) en la pobre preservación y supresión de leucocitos indicada después de preservación miocárdica hipotérmica.
Exocitosis del cuerpo de Weibel-Palade durante la cirugía cardíaca humana . Para establecer la relevancia de estos hallazgos en humanos, se diseñó el siguiente conjunto de experimentos para demostrar que las EC coronarias liberan el contenido de los cuerpos de Weibel-Palade durante la preservación cardíaca hipotérmica como ocurre durante una cirugía cardíaca habitual . Se realizaron mediciones de la liberación de vWF de la vasculatura coronaria durante un período bien definido de isquemia cardíaca, el cual se produce durante el período de sujeción transversal aórtica. Se tomaron muestras de sangre de seno coronario (drenado del corazón) al inicio (CS^ y conclusión (CS2) de una sujeción cruzada aórtica en 32 pacientes (este intervalo representa el período isquémico) . Estos pacientes (23 hombres, 9 mujeres) presentaban antecedentes clínicos de enfermedad cardíaca valvular (n=ll) , o enfermedad cardíaca isquémica (n=21) y habían experimentado reparación/sustitución de la válvula o injerto de derivación de la arteria coronaria, respectivamente. Los ELISA de captura realizados para la proteína trombomodulina de membrana integral (40) no mostraron cambios en las concentraciones entre las muestras CS-. y CS2 (4.35 ± 1.2 ng/ml versus 3.48 ± 0.8 ng/ml, p=NS) , lo que sugiere que las EC no se desprenden y que se mantiene la integridad de la membrana celular durante la preservación cardíaca. Las mediciones similares realizadas para vWF mostraron que hay un incremento consistente y significativo en vWF que se secreta durante el curso de preservación cardíaca (0.68 ± 0.06 U/ml versus 0.90 + 0.05 U/ml, CSX versus CS2, p<0.01) (Figura HA) . Para demostrar que este vWF es probable que sea endotelial coronario en vez de origen plaquetario y por lo tanto que no implica una consecuencia en derivación cardiopulmonar, se obtuvieron muestras de sangre periférica espontáneamente con las muestras y CS2, mostraron que las concentraciones de vWF no cambiaban (0.813 ± 0.52 U/ml versus 0.90 ± 0.41 U/ml, p=NS) , lo que sugiere que la perturbación mecánica de las plaquetas durante la derivación cardiopulmonar no es causal. Debido a que vWF está presente en plasma como multímeros con un intervalo de Mr' s (41-44) , con aquéllos multímeros de vWF del acumulado estimulable (en oposición al secretado de manera constitutiva) el cual es de mayor peso molecular (45) , la inmunoelectroforesis se realiza sobre las muestras de CS . Estos geles demostraron que además de un incremento total en vWF en las muestras CS2/ parece haber un incremento en los multímeros de peso molecular elevado, lo que sugiere liberación de un acumulado estimulable, como se encuentra en células endoteliales (Fibura 11B) .
Discusión: La vasculatura juega un papel crítico en el mantenimiento del ambiente extracelular de órganos sometidos a isquemia y reperfusión, un papel el cual es orquestado principalmente por las EC que se encuentran en el lumen endovascular . La EC responde a un período de privación de oxígeno por modulación fenotípica sorprendente, volviéndose protrombótica (46) y proinflamatoria (1,4,6) . Las EC expuestas a hipoxia secretan citosinas proinflamatorias IL-1 (4) e IL-8 (6) las cuales pueden servir para dirigir el tráfico de leucocitos a áreas de isquemia. Debido a que estos procesos requieren síntesis de proteína de novo, no explican los eventos inmediatos los cuales se producen posteriores a un período de preservación hipotérmica. Aunque la expresión aumentada de ICAM-l e inducción de E-selectina pueden contribuir en períodos posteriores a la supresión de leucocitos en injertos cardíacos, esto no explica la rápida leucostasis observada posterior a la preservación en frío, en la cual es probable que la síntesis de proteína disminuya considerablemente. En este contexto, el pretratamiento con cicloheximida no altera la adhesión temprana (90-120 minutos) de PMN observada posterior a la exposición hipóxica de las EC (7) , lo que sugiere que la síntesis de proteínas de novo no necesita estar involucrada en los incrementos mediados por hipoxia en la unión de PMN. Aunque el factor de activación de plaquetas (PAF) puede participar en la adhesión de PMN mediada por hipoxia (7,47) y la activación (48,49), el PAF no se almacena y debe ser sintetizado, lo cual puede disminuir su importancia durante el período hipotérmico durante la preservación miocárdica. Es por esta razón que la expresión rápida de EC de P-selectina formada previamente a partir de sitios de almacenamiento subplasmalemales en los cuerpos de Weibel-Palade (9,50,51) puede representar el mecanismo más importante para el reclutamiento temprano de PMN posterior a la preservación hipotérmica. Los cuerpos de Weibel-Palade se encuentran en abundancia dentro de la microvasculatura coronaria (52) , lo que sugiere su particular importancia en la preservación cardíaca. Los datos muestran que la exocitosis de Weibel-Palade se produce tanto en respuesta a la hipoxia per se, así como en corazones humanos durante la preservación hipotérmica. Aunque es difícil identificar con precisión un origen endotelial para los vWF observados en las muestras de seno coronario humano, los estudios de plaquetas posteriores a derivación cardiopulmonar demuestran que no hay incremento en la expresión superficial de P-selectina o secreción de granulos o. (53,54) . Esto sugiere que el incremento observado en vWF en el seno coronario posterior a sujeción cruzada aórtica no es de origen plaquetario. Dos aspectos de los datos también sugieren que el vWF liberado posterior a isquemia es de origen endotelial; (1) las concentraciones de vWF periférica permanecen sin cambio mientras que las concentraciones del seno coronario se incrementan posterior a isquemia miocárdica, lo que sugiere que vWF elevado surge del corazón, y no del aparato de derivación cardiopulmonar; (2) Los corazones donadores carentes de P-selectina, transgénicos fueron liberados por lavado de sangre donadora en el inicio de la preservación, de manera que cuando se transplantaron en pacientes receptores de tipo silvestre, probablemente estaba ausente la P-selectina endotelial coronaria (no plaquetaria) . Estos experimentos demuestran la importante contribución de la P-selectina endotelial al reclutamiento de neutrófilos los cuales acompañan a la reperfusión. No es sorprendente que P-selectina sea importante después de la preservación miocárdica hipotérmica; estudios recientes han demostrado que P-selectina es un mediador importante del daño de reperfusión inducido por neutrófilos posterior a isquemia normotérmica, como se ha demostrado en oreja de conejo (26) y en los modelos de isquemia cardíaca felina (14) . Debido a que los oxidantes causan expresión de P-selectina en la superficie EC (10) , es importante en estos estudios evaluar el papel del período hipóxico solo el cual puede sebar a las EC a reclutar la primera onda de PMN, en donde el reclutamiento adicional de las PMN amplificado con el asalto de los intermediarios reactivos de oxígeno producidos en el microambiente de reperfusión. Aunque un informe ha sugerido que la hipoxia puede inducir la expresión de P-selectina por las EC, estos experimentos (7) actualmente se realizan después de reoxigenación, una condición la cual se sabe induce tanto su peróxido (18,55) como adherencia de neutrófilos a las EC cultivadas (56) . En contraste, los experimentos descritos en la presente se realizaron completamente dentro de un ambiente hipóxico para evitar por completo la posibilidad de reoxigenacíón, y los antioxidantes no bloquearon la expresión de P-selectina inducida por hipoxia, lo que sugiere que las observaciones descritas en. la presente reflejan la hipoxia hipoxia per se en vez de la reoxigenación. Además, la protección cardíaca demostrada en la presente utilizando una estrategia en donde los corazones preservados libres de sangre de ratones transgénicos carentes de P-selectina se transplantan en receptores con plaquetas tipo silvestre demuestran que la expresión endotelial de P-selectina puede ser dañina posterior a preservación cardíaca hipotérmica. Debido a que la exocitosis corporal de cuerpos de Weibel-Palade se producen durante la preservación cardíaca hipotérmica en humanos, estos estudios sugieren que la preservación miocárdica puede mejorarse por estrategias terapéuticas diseñadas para bloquear la actividad de P-selectina expresada en la superficie endotelial.
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EJEMPLO 3 : Variables de procedimiento y relacionadas con la cepa que afectan significativamente el resultado en un modelo de ratón de isquemia cerebral focal La reciente disponibilidad de ratones transgénicos ha llevado a un número cada vez mayor de reportes que describen los efectos de productos genéticos específicos sobre la patofisiología de los ataques. Aunque se han descrito bien modelos de isquemia cerebral focal en ratas, se carece de descripciones de un modelo de ratón oclusión de la arteria cerebral media, y permanecen sin definirse fuentes de variabilidad experimental potencial. Se ha establecido la hipótesis de que modificaciones técnicas ligeras pueden resultar en resultados altamente discrepantes en un modelo de ratón de ataque y que el control de las condiciones quirúrgicas y de procedimiento puede llevar a resultados posteriores a ataque fisiológicos y anatómicos reproducibles . Para probar esta hipótesis se estableció un modelo de ratón el cual puede permitir la isquemia cerebral focal permanente o transitoria por oclusión intraluminal de la arteria cerebral media (MCA) . Este estudio proporciona una descripción detallada de la técnica quirúrgica y revela diferencias importantes entre las • cepas utilizadas comúnmente en la producción de ratones transgénicos . Además de las diferencias relacionadas con la cepa, el volumen de infarto, el resultado neurológico y el flujo sanguíneo cerebral parecen ser afectados de manera importante por la temperatura durante los períodos isquémico y post-isquémico, el tamaño del ratón y el tamaño de la sutura la cual obstruye al lumen vascular. Cuando se mantienen constantes estas variables, existe una uniformidad notable en el resultado posterior al ataque. Estos datos enfatizan los efectos protectores de la hipotermia en el ataque, y pueden ayudar a estandarizar técnicas entre diferentes laboratorios para proporcionar una estructura cohesiva para evaluar los resultados de estudios posteriores en animales transgénicos .
Introducción: El advenimiento reciente de ratones alterados genéticamente proporciona una oportunidad única para evaluar el papel de productos genéticos únicos en la patofisiología de los ataques. Aunque ha habido una cantidad cada vez mayor de informes acerca del efecto de la isquemia cerebral en ratones transgénicos, hasta la fecha, no existe descripción detallada de los modelos de ratón involucrados, ni existe un análisis detallado de las variables de procedimiento potencialmente importantes las cuales pueden alterar el estado posterior a ataque. La mayor parte de las descripciones de un modelo de ratón (1,4,8,9,14,17-19,23,24) son descripciones desarrolladas de los modelos de rata ampliamente utilizados de isquemia cerebral focal (22,26) . Aunque ha habido cierta atención puesta a las diferencias relacionadas con la cepa respecto a la susceptibilidad de ratones a isquemia cerebral (4) , pocas consideraciones técnicas se han resuelto en estudios publicados . Debido a que los datos piloto demuestran que las diferencias menores en el procedimiento operatorio o cuidado postoperatorio se traducen en diferencias mayores en el resultado posterior al ataque, el presente estudio se diseñó para identificar sistemáticamente las consideraciones quirúrgicas, técnicas, y anatómicas importantes necesarias para obtener resultados consistentes en un modelo de ratón de isquemia cerebral focal.
Cuando los ataques se generan de una manera controlada rígidamente, las diferencias debidas a ausencia (o sobreexpresión) de un proceso genético único pueden ser discernibles con facilidad. Este estudio presenta un trabajo detallado de un modelo de ratón reproducible de infarto cerebral focal basado en modificaciones del modelo de rata original (26) . Este estudio identifica las variables de procedimiento que tienen tal intacto en el resultado del ataque, los cuales previamente no se han reportado en descripciones previas de modelos de ataque de ratón. Estas variables incluyen longitud y calibre d? la sutura, métodos de control vascular, regulación de la temperatura en los ratones y diferencias entre cepas utilizadas comúnmente en la proliferación de animales transgénicos. Como el modelo descrito se vuelve en sí mismo al estudio de isquemia cerebral focal permanente o transitoria, se presenta evidencia de que con tiempos de isquemia elegidos con precisión, se puede realizar un volumen de infarto y mortalidad en animales sometidos a reperfusión que se aproxime a los observados con oclusión permanente. La comprensión de las fuentes potenciales dependientes del modelo de la variabilidad en el resultado posterior al ataque pueden ayudar a aclarar resultados divergentes entre laboratorios diferentes . La adopción de un modelo estandarizado el cual proporciona resultados consistentes es un primer paso importante hacia el uso de ratones transgénicos en el estudio de la patofisiología del ataque.
Materiales y métodos : Animales adquiridos y anestesia: Se adquirieron ratones macho de tres cepas diferentes (C57 BlackJd, CD-1 y 129J) de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) . Los animales tenían de 8 a 10 semanas de edad y pesaban entre 18 y 37 gramos (como se indicó) al momento de los experimentos. Los ratones fueron anestesiados con inyección intraperitoneal de 0.3 ml de quetamina (10 mg/cc) y xilazina (0.5 mg/cc). Se administró una dosis adicional de 0.1 ce antes de la extracción del catéter en animales que experimentaron isquemia transitoria. En el día posterior a la cirugía, se repitió la anestesia inmediatamente antes de la medición de flujo doppler láser y eutanasia sin sufrimiento. Estos procedimientos han sido aprobados por el Comité Institucional de cuidado y uso de animales en Columbia University y están de acuerdo con las líneas de guía AALAC para el cuidado y uso humano de animales de laboratorio.
Instalación quirúrgica: Los animales se colocaron en posición supina en una almohadilla calibrada la cual se apoya sobre una superficie que opera con temperatura controlada (Yellow Springs Instruments, Inc. [YSI] , Yellow Springs, OH). Se insertó una sonda de temperatura rectal (YSI) con el fin de regular la temperatura de la superficie de operación para mantener una temperatura constante en el núcleo del animal de 36-38°C. Para facilitar la exposición, se pegaron la pata posterior derecha y la pata anterior izquierda a la superficie de operación, la pata anterior derecha se pegó al pecho del animal y la cola se pegó a la sonda rectal (Figura 12A) . Se realizó una incisión en la línea media del cuello al levantar suavemente la piel suelta entre el manubrio y la quijada se cortó un círculo de piel de 1 cm2. La línea media pareada de las glándulas mandibulares está subyacente directamente a esta área y se dividió de manera general, con la glándula izquierda dejada in situ. La glándula derecha se extrajo cranealmente con un clip de aneurisma Sugita recto pequeño (Mizutto America, Inc., Beverly, MA) asegurado a la mesa por seda 4.0 y cinta. El músculo esternocleidomastoideo se identificó y se colocó una ligadura de seda 4.0 alrededor de su parte prominente. Esta ligadura se extrajo inferolateralmente y se pegó a la tabla para exponer el músculo homoyoideo que cubre la cubierta carótida. La exposición se muestra en la figura 12B.
Aproximación operativa: Una vez que se expuso la cubierta de la carótida, el ratón y la superficie de control de temperatura se colocaron bajo un microscopio de operación (16-25X de aumento zoom, Zeiss, Thornwood, NY) , con una fuente de luz coaxial utilizada para iluminar el campo. Bajo la amplificación, se dividió con precaución el músculo homoyoideo con retractores . Se liberó cuidadosamente la arteria carótida común (CCA) de su cubierta, teniendo precaución de no aplicar tensión al nervio vago (el cual corre lateral a la CCA) . Una vez liberada, la CCA se aisla con seda 4.0, se pega de manera floja a la mesa de operaciones . Una vez que se obtiene control proximal de la CCA, se coloca a la vista la bifurcación de la carótida. La arteria occipital, la cual surge de la arteria carótida externa proximal y se dirige de manera posterolateral a través de la arteria carótida interna proximal (ICA) para entrar al músculo digástrico, se aisla en su origen y se divide utilizando un microcoagulador bipolar Malis (Codman-Schurtleff , Randolph, MA) . Esto permite una mejor visualización de la ICA conforme se dirige posteriormente y se encuentra hacia la parte inferior cefálica del músculo estiloyoideo, hacia la base del cráneo. Justo antes de que la ICA entre al cráneo se divide la rama pterigopalatina, la cual se dirige lateralmente y cranealmente. Esta ramificación se identifica, se aisla y se divide en su origen, tiempo durante el cual se vuelve recto el eje CCA-ICA. Después se coloca una sutura de seda 4.0 alrededor de la arteria carótida interna para control distal, el extremo de la cual se pega de manera resuelta a la superficie de operación. Posteriormente, se coloca a la vista la arteria carótida externa. Se contornea el curso cráneo-medio en su primera ramificación, y se cauteriza y divide la arteria tiroidea superior. El contorneo es llevado a cabo subsecuentemente de manera distal por elevación del hueso yoide para exponer la bifurcación de la arteria en las arterias lingual y maximal . Justo proximal a esta bifurcación, se cauteriza y divide la carótida externa. Posteriormente se aplica tensión suficiente a las suturas de seda que rodean a las arterias carótida común proximal y distal interna para ocluir el flujo sanguíneo, teniendo precaución de no traumatizar la pared de la arteria. Se vuelve a ajustar la cinta de las suturas de oclusión para mantener la oclusión.
Introducción y cosido de la sutura intraluminal de oclusión: Inmediatamente después de la oclusión de la carótida, se realiza arteriotomía en la pared de la carótida externa distal justo proximal al área de cauterización. A través de esta arteriotomía, se introduce una sutura de nylon 5.0 ó 6.0 que se ha vuelto roma por calor (como se indica en la sección de resultados) (Figuras 12C y 12D) . Conforme la sutura avanza al nivel de la bifurcación carótida, el muñón externo se retrae suavemente caudalmente dirigiendo la punta de la sutura a la ICA proximal. Una vez que la sutura de oclusión entra a la ICA, se relaja la tensión sobre las suturas de control proximal y distal y se hace avanzar lentamente la sutura de oclusión hacia arriba de la ICA, hacia la base del cráneo bajo visualización directa (más allá del nivel de la base del cráneo, se pierde la vista de la sutura de oclusión) .
La localización de la punta distal de la sutura de oclusión a través del origen de la arteria cerebral media (MCA) (proximal al origen de la arteria cerebral anterior) se determinó por la longitud de la sutura elegida (12 mm ó 13 mm como se indica por la sección de resultados, mostrado en la Figura 12C) por fluometría doppler láser (véase la sección de procedimientos fisiológicos antiguos) , y por tinción postsacrificio de la vasculatura cerebral (véase abajo) . Después de que se completó la colocación de la sutura de oclusión, se cauterizó el muñón de la arteria carótida externa para evitar el sangrado a través de la arteriotomía una vez que se restableció el flujo arterial.
Completado del procedimiento quirúrgico : Para la totalidad de los experimentos mostrados, la oclusión de la carótida fue menor de dos minutos. Para cerrar la incisión, las suturas que rodean la CCA proximal y distal así como el músculo esternocleidomastoideo se cortaron y retiraron. Se removió el broche de aneurisma de la glándula submandibular y la glándula se colocó sobre el campo de operación. Los bordes cutáneos se aproximaron con una grapa quirúrgica y se retiró al animal de la mesa.
Remoción de la sutura de oclusión para establecer isquemia cerebral transitoria: Los experimentos de isquemia cerebral transitoria requieren la reexploración de la herida para remover la sutura de oclusión. Para estos experimentos, se realizó un cierre de herida inicial con un broche de aneurisma temporal en vez de una grapa quirúrgica para proporcionar acceso rápido a la carótida. Un control proximal con una sutura de seda 4-0 se restableció antes de la remoción de la sutura de oclusión para minimizar el sangrado del muñón de la carótida externa. Durante la remoción de la sutura de oclusión, la cauterización del muñón de la arteria carótida externa se comenzó temprano, antes de que la sutura distal haya sido aclarada completamente del muñón. Una vez que se ha removido completamente la sutura, el muñón se cauteriza de manera más extensa. Se confirma visualmente el restablecimiento de flujo en la arteria carótida interna extracraneal y se cierra la herida al igual que para la isquemia focal permanente descrita antes. Se lleva a cabo la confirmación de reperfusión intracraneal con fluometría doppler láser (véase sección de procedimiento fisiológicos antiguos) .
Cálculo del volumen de ataque : Veinticuatro horas después de la oclusión de la arteria cerebral media, los ratones sobrevivientes se volvieron a anestesiar con 0.3 ce de quetamina (10 mg/ml) y xilazina (0.5 mg/ml) . Después de las lecturas de peso final, temperatura y flujo sanguíneo cerebral (como se describe en lo siguiente) , los animales fueron perfundidos con 5 ml de una solución al 0.15% de azul de metileno y solución salina para mejorar la visualización de las arterias cerebrales. Posteriormente los animales fueron decapitados y se extirparon los cerebros . Los cerebros después se inspeccionaron para determinar evidencia de colocación correcta del catéter, como se evidenció por tinción negativa del territorio vascular irrigado por la MCA, y colocado en la matriz de cerebro de ratón (Activational Systems Inc., Warren, MI) para cortes de 1 mm. Las secciones se sumergieron en cloruro de 2 , 3 , 5-trifeniltetrazolio al 2% (TTC) en solución salina amortiguada con fosfato al 0.9%, se incubaron durante 30 minutos a 37 °C y se colocaron en formalina al 10% (5) . Después de tinción con TTC, el cerebro infartado se visualizó como un área de tejido no teñido (blanco) y un fondo circundante de tejido viable (color rojo ladrillo). Las secciones en serie se fotografiaron y proyectaron sobre papel de trazado a una amplificación uniforme; todas las secciones en serie fueron trazadas, recortadas y se pesó el papel por un técnico quien desconocía el protocolo respecto a las condiciones experimentales. Bajo estas condiciones, los volúmenes de infarto son proporcionales a los pesos sumados de los papeles que circunscriben la región infartada y se expresan como porcentaje del volumen hemisférico derecho. Estos métodos han sido validados en estudios previos (3,12,15,16).
Estudios fisiológicos antiguos: Los estudios fisiológicos antiguos se realizaron en cada uno de tres cepas diferentes utilizadas en los experimentos actuales, inmediatamente antes y después del procedimiento operatorio. Se obtuvieron presiones sanguíneas sistémicas por cateterización de la aorta abdominal infrarrenal y se midieron utilizando un polígrafo Grass Modelo 7 (Grass Instrument Co., Quincy, MA) . Se obtuvo una muestra de sangre arterial a partir de este catéter aórtico infrarrenal; se midieron pH arterial, pCO,. (mm Hg) , pOa (mm Hg) y saturación de oxígeno y hemoglobina (%) utilizando un analizador de gas sanguíneo y hemoglobinómetro (Grass Instrument Co . , Quincy, MA) . Debido a la necesidad de perforación arterial y manipulación abdominal para medir estos parámetros fisiológicos, los animales -fueron designados únicamente para estas mediciones (volumen de ataque, resultado neurológico y flujos sanguíneos cerebrales no se midieron en estos mismos animales) . Las mediciones transcraneales del flujo sanguíneo cerebral se realizaron utilizando fluometría doppler láser (Perimed, Inc., Piscataway, NJ) después de reflexión de la piel subyacente al calvario, como se ha descrito previamente (10) (las lecturas transcraneales fueron consistentemente iguales a aquéllas realizadas después de craniectomía en estudios piloto) . Para llevar a cabo estas mediciones, se colocaron a los animales en un armazón de cabeza estereotáctico, después de lo cual experimentaron incisión cutánea de la línea media subyacente desde el nasion hasta la línea nucal superior. La piel se separó lateralmente, y se disminuyó una sonda doppler láser recta de 0.7 mm (modelo #PF2B) sobre la superficie cortical, se humedeció con una cantidad pequeña de solución salina fisiológica. Las lecturas se obtuvieron 2 mm posteriores al bregma, tanto 3 mm y 6 mm a cada lado de la línea media utilizando un micromanipulador estereotáctico, manteniendo el ángulo de la sonda perpendicular a la superficie cortical. Las mediciones de flujo sanguíneo cerebral relativo se realizaron inmediatamente después de la anestesia, después de la oclusión de la MCA, e inmediatamente antes de eutanasia, y se expresaron como la proporción de la intensidad de señal doppler del hemisferio isquémico comparado con el no isquémico. Para animales sometidos a isquemia cerebral transitoria, se realizaron mediciones adicionales justo antes y justo después de la extracción de la sutura, iniciando la reperfusión. La oclusión del procedimiento quirúrgico/MCA intraluminal se consideró que fue técnicamente adecuado si =50% de reducción en el flujo sanguíneo cerebral relativo se observaba inmediatamente posterior a la colocación del catéter de oclusión intraluminal (15 de 142 animales utilizados en este estudio [10.6%] se excluyeron debido a una caída inadecuada en el flujo sanguíneo en el momento de la oclusión) . Estos criterios de exclusión se muestran en los estudios preliminares para proporcionar niveles de isquemia suficientes para volver consistentes los volúmenes de infarto por tinción con TTC. Se consideró que la reperfusión fue técnicamente adecuada si el flujo sanguíneo cerebral a la hora de extracción del catéter era por lo menos dos veces el flujo sanguíneo cerebral en la oclusión (13/17 animales en este estudio [76%] ) .
Temperatura : Se controló cuidadosamente la temperatura del núcleo durante el período peri-infarto a través de todo el período experimental. Antes de la cirugía, se registró la temperatura rectal de línea de base (YSI, modelo 74 de sonda rectal Thermistemp, Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH) . Intraoperatoriamente, la temperatura se controló utilizando una superficie de operación controlada por termopar. Después de la oclusión de MCA, los animales se colocaron durante 90 minutos en un incubador, con una temperatura mínima mantenida a 37 °C utilizando la sonda rectal conectada vía un termopar a una fuente de calentamiento en el incubador. La temperatura se controló similarmente en aquéllos animales sometidos a isquemia transitoria incluyendo un período de 45 minutos (isquémico) así como un período postisquémico de 90 minutos en el incubador. Después de la colocación en el incubador de la temperatura del núcleo, los animales regresaron a sus jaulas por la duración restante de la observación antes del sacrificio.
Examen neurológico : Antes de suministrar anestesia en el momento de eutanasia, se examinó a los ratones por deficiencias neurológicas obvias utilizando el sistema de calificación de cuatro niveles: (1) movimientos espontáneos normales, (2) el animal realiza círculos hacia la derecha, (3) el animal gira hacia la derecha, (4) el animal se agazapa en sus cuatro patas, sin responder a estímulos nocivos. Se ha demostrado en estudios preliminares que este sistema predice con precisión el tamaño del infarto, y se basa en sistemas desarrollados para uso en ratas (6) .
Análisis de datos: Volúmenes de ataque, las calificaciones del resultado neurológico y los flujos sanguíneos cerebrales y los datos de gas sanguíneo arterial se compararon utilizando una prueba t de Student no pareada. Los valores se expresan como medias ± SEM, con una p < 0.05 considerada como estadísticamente significativa. Los datos de mortalidad, cuando se presentaron, fueron evaluados utilizando el análisis chi cuadrada.
Resultados : Efectos de la cepa: Se utilizaron tres cepas de ratones, utilizadas comúnmente, diferentes (CDl, C57/B16, y 129J) para comparar la variabilidad en el resultado posterior al ataque después de isquemia cerebral focal permanente. Para establecer que no hay diferencias anatómicas grandes en la colateralización de la circulación cerebral, se visualizó el círculo de Willis utilizando tinta India en las tres cepas (Figura 13) . Estos estudios no mostraron ninguna diferencia anatómica grande. Después se sometieron ratones de tamaños similares (20 ± 0.8 g, 23 ± 0.4 g, y 23 ± 0.5 g para ratones 129J, CDl y C57B1, respectivamente) a isquemia focal permanente bajo condiciones normotérmicas utilizando 12 mm de largo de sutura de oclusión de nylon 6-0. Se notaron diferencias significativas relacionadas con la cepa en el volumen de infarto, con infartos en ratones 129J significativamente más pequeños que los observados en CDl y C57/B16 pese a condiciones experimentales idénticas (Figura 14A) . Las diferencias en el tamaño de infarto fueron igualadas por examen neurológico, con las calificaciones más elevadas (es decir, daño neurológico más grave) observado en los ratones C57/B16 y CDl (Figura 14B) . Para determinar la relación entre el volumen de infarto y el flujo sanguíneo cerebral a la región del núcleo, se realizó fluometría doppler láser a través del calvario del ratón delgado. No se observaron diferencias preoperatorias relacionadas con la cepa en el flujo sanguíneo cerebral, que corresponden a la carencia de diferencias anatómicas grandes en la anatomía vascular (Figura 13) . La medición del flujo sanguíneo cerebral inmediatamente después de la inserción del catéter de oclusión mostró que se generaron grados similares de reducción de flujo por el procedimiento (el porcentaje de flujo ipsilateral/contralateral inmediatamente posterior a la inserción del catéter de obstrucción fue de 23 ± 2%, 19 ± 2%, 17 ± 3% para ratones 129J, CDl y C57/B16, respectivamente) . No es sorprendente que el flujo sanguíneo a la región del núcleo medida a las 24 horas justo antes de la eutanasia demostró que los flujos sanguíneos más bajos son en aquéllos animales con el daño neurológico más grave (Figura 14C) .
Características anatómicas y fisiológicas de los ratones: Las presiones sanguíneas arteriales de línea de base así como las presiones a líneas bacterias posteriores a la oclusión de la arteria cerebral media fueron casi idénticas para todos los animales estudiados, y no fueron alteradas por la cepa o el tamaño del ratón (Tabla I) . El análisis de la sangre arterial de pH, pC02 y la saturación de oxígeno por hemoglobina (%) reveló de manera similar que no hay diferencias significativas (Tabla I) .
Efecto de tamaño del animal y la perforación sobre la sutura de oclusión: Para investigar los efectos del tamaño de ratón sobre el resultado posterior al ataque, se sometieron ratones de dos tamaños diferentes (23 ± 0.4 g y 31 ± 0.7 g) a isquemia cerebral focal permanente. Para eliminar otras fuentes potenciales de variabilidad en estos experimentos, los experimentos se realizaron bajo condiciones normotérmicas en ratones de la misma cepa (CDl) utilizando suturas de oclusión de longitud idéntica y perforación (12 mm nylon 6-0) . Bajo estas condiciones, los ratones pequeños (23 ± 0.4 g) sostuvieron volúmenes de infarto consistentemente grandes (28 ± 9% de hemisferio ipsilateral) . Bajo condiciones experimentales idénticas, los ratones grandes (31 + 0.7 g) mostraron infartos mucho más pequeños (3.2 ± 3%, p = 0.02, Figura 15A) , menos morbilidad en el examen neurológico (Figura 15B) y una tendencia a mantener un flujo sanguíneo cerebral ipsilateral mayor posterior al infarto en comparación con los animales más pequeños (Figura 15C) . Debido a que se ha establecido la hipótesis de que la reducción en el tamaño del infarto incide en estos animales grandes y se relaciona con un mal pareamiento en el diámetro/longitud entre la sutura de oclusión y los vasos sanguíneos cerebrales, se adaptaron suturas de oclusión más grandes/más gruesas (13 mm, 5.0 nylon) para uso en estos ratones más grandes. Los ratones grandes CDl (34 ± 0.8 g) los cuales experimentaron oclusión permanente con estas suturas de oclusión más grandes sostuvieron un incremento notable en los volúmenes de infarto (50 ± 10% de hemisferio ipsilateral, p<0.000l comparado con ratones grandes infartados con la sutura de oclusión más pequeña, Figura 15A) . Estos ratones más grandes se infartaron con suturas de oclusión más grandes lo que demuestra mayores calificaciones de deficiencia neurológica (Figura 15B) y menores flujos sanguíneos cerebrales ipsilaterales (Figura 15C) en comparación con ratones similarmente grandes infartados con suturas de oclusión más pequeñas .
Efectos de la temperatura: Para establecer el papel de la hipotermia preoperatoria en los volúmenes de ataque y resultados neurológicos posteriores a la oclusión de MCA, se sometieron ratones pequeños C57/B16 (22 ± 0.4 g) a oclusión permanente de MCA con una sutura de calibre 12 mm 6-0 con normotermia mantenida durante dos duraciones diferentes; grupo 1 ("Normotermia") fue operado como se describe en lo anterior, manteniendo una temperatura a 37 °C desde el período preoperatorio hasta 90 minutos postoclusión. Los animales del grupo 2 ("Hipotermia") se mantuvieron a 37 °C desde el período preoperatorio hasta únicamente 10 minutos después de la oclusión, .como se ha descrito previamente (14) . En los siguientes 45 minutos posteriores a la remoción del incubador de calentamiento controlado por termopar, la temperatura del núcleo de este segundo grupo de animales disminuyó a 33.1 ± 0.4°C (y descendió adicionalmente a 31.3 + 0.2°C a los 90 minutos). Los animales operados bajo condiciones de normotermia prolongada (grupo 1) mostraron volúmenes de infarto más grandes (32 ± 9%) en comparación con los animales hipotérmicos (grupo 2) (9.2 ± 5%, p = 0.03, Figura 16A) . Las diferencias en el volumen de infarto se reflejaron por diferencias en la deficiencia neurológica (3.2 ± 0.4 versus 2.0 + 0.8, p = 0.02, Figura 16B) , pero fueron grandemente independientes del flujo sanguíneo cerebral (52 ± 5 versus 52 ± 7, p = NS, Figura 16C) .
Efectos de la oclusión transitoria de MCA: Debido a que el daño por reperfusión ha sido implicado como una causa importante de daño neuronal posterior a oclusión cerebrovascular (25) se sometió a un subconjunto de animales a un período transitorio (45 minutos) de isquemia seguido por reperfusión como se describe en lo anterior y se realizaron comparaciones con aquéllos animales los cuales experimentaron oclusión permanente de MCA. Se eligió el tiempo de oclusión en base a estudios preliminares (no mostrados) los cuales demuestran tasas de mortalidad inaceptablemente elevadas (>85%) con 180 minutos de isquemia e infartos raros (<15%) con 15 minutos de isquemia. Para minimizar la influencia confusa de otras variables, se mantuvieron constantes las demás condiciones experimentales (se utilizaron ratones pequeños (22.5 ± 0.3 g) C57/B16 la sutura de oclusión consistió de 12 mm de nylon 6-0 y los experimentos se realizaron bajo condiciones normotérmicas) . La disminución inicial en CBF inmediatamente postoclusión fue similar en ambos grupos (16 ± 2% versus 17 ± 3% para grupos de oclusión transitorio versus permanente, respectivamente, p=NS) . Se confirmó la reperfusión tanto por doppler láser (incremento de 2.3 véase en el flujo sanguíneo posterior a la remoción de la sutura de oclusión a 66 ± 13%) , como visualmente por inyección de colorante azul de metileno intracardíaco en animales representativos. Los tamaños de infarto (29 ± 0.5 versus 32 ± 9%), las calificaciones de deficiencia neurológicas (2.5 ± 0.5 versus 3.2 ± 0.4) y el flujo sanguíneo cerebral al sacrificio (46 ± 18% versus 53 ± 5%) fueron muy similares entre animales sometidos isquemia cerebral transitoria y reperfusión, y aquéllos sometidos a isquemia cerebral focal permanente (p = NS, para todos los grupos) (Figuras 17A-17C) .
Discusión: La disponibilidad cada vez mayor de ratones alterados genéticamente ha llevado a un incremento en el uso de modelos de ratón de isquemia cerebral focal para imputar productos genéticos específicos en la patogénesis de los ataques . Aunque las publicaciones recientes describen el uso de una sutura intraluminal para ocluir la arteria cerebral media para generar isquemia cerebral permanent.e y/o transitoria en ratones, ha habido sólo una descripción escasa de las modificaciones necesarias del reporte técnico original en ratas (8,14,17- 19,24,26). Los experimentos descritos en este documento no sólo proporcionan una explicación técnica detallada de un modelo de ratón adecuado para isquemia de arteria cerebral media focal permanente o transitoria, sino que también resuelven fuentes potenciales de variabilidad en el modelo.
Importancia de la cepa: Una de las fuentes potenciales más importantes de variabilidad en el modelo de isquemia cerebral en ratón descrito en la presente se relaciona con la cepa de animal utilizado. Los datos sugieren que, de las tres cepas probadas, los ratones 129J son particularmente resistentes a daño neurológico posterior a oclusión de MCA. Aunque Barone encontró similarmente diferencias en los volúmenes de ataque entre 3 cepas de ratones (BDF, CFW y BALB/C) , estas diferencias fueron adjudicadas a variaciones en las arterias de comunicación posteriores en estas cepas (4) .
Puesto que las diferencias anatómicas en la anatomía cerebrovascular no son aparentes de manera general en el estudio (Figura 13) , los datos sugieren que las diferencias no anatómicas relacionadas con la cepa también son importantes en el resultado posterior a la oclusión de MCA. Puesto que el resultado del ataque difiere significativamente entre 2 cepas de ratones (129J y C57/B16) utilizados comúnmente para producir ratones transgénicos vía recombinación homologa en células pluripotenciales embriónicas (11) , los datos sugieren una cantidad importante de experimentos realizados con ratones transgénicos. Debido a que la progenie fundadora inicial para la creación de animales transgénicos con estas cepas se tienen un fondo mezclado 129J/C57/B16, idealmente los experimentos se realizaron ya sea con controles consanguíneos o después de un número suficiente de retrocruzamientos para asegurar pureza de la cepa.
Importancia del tamaño: Los animales más grandes requieren una sutura intraluminal más grande y más gruesa para sostener los volúmenes de infarto los cuales sean consistentes con los obtenidos en animales más pequeños con suturas de oclusión más pequeñas. La igualación del tamaño del animal y la sutura parece ser importante no sólo para producir un infarto cerebral consistente, sino que mientras que una sutura pequeña lleva a una isquemia insuficiente, una sutura demasiado grande produce hemorragia intracerebral frecuente y trauma vascular (observación no publicada) . El uso de animales de tamaño similar es importante no sólo para minimizar la variabilidad potencial relacionada con la edad en la susceptibilidad neuronal al ataque isquémico, sino también para asegurar que las pequeñas diferencias en el tamaño de animal no oscurezcan la comparación de datos con significado. En este ejemplo, se demostró que las diferencia de tamaño de una cantidad tan pequeña como 9 gramos pueden tener un impacto grande sobre el volumen de infarto y el resultado neurológico posterior a isquemia cerebral. Experimentos adicionales utilizando una sutura de oclusión de perforación más grande en animales mayores sugiere que esta propensión aumentada de los animales pequeños a presentar ataques más grandes no es debido a la resistencia relativa de los animales más grandes a daño neuronal isquémico, sino que más bien se debe a un tamaño pequeño de la sutura utilizada para ocluir la MCA en los animales grandes. Aunque estos datos se obtuvieron utilizando ratones CDl, se han realizado estudios similares y se ha encontrado que estos resultados son válidos también con otras cepas de ratones, tales como C57/B16 (datos no publicados) . Los reportes publicados previamente utilizando ratones de tamaños muy diferentes (desde 21 g hasta 35 g) así como diámetros de sutura diferentes y longitudes las cuales con frecuencia no se han reportado (14,17) . Los estudios indican que el tamaño del animal y de la sutura son características metodológicas importantes las cuales deben ser resueltas en informes científicos.
Importancia de la temperatura: Durante mucho tiempo se ha reconocido que la hipotermia protege a numerosos órganos de daño isquémico, incluyendo al cerebro. Los estudios realizados en ratas han demostrado que la hipotermia intrahisquémica de hasta 1 hora posterior a la oclusión de MCA es protectora (2,15), reduciendo tanto la mortalidad como los volúmenes de infarto con temperaturas de 34.5°. Aunque estos resultados se han extrapolado a modelos en ratón de isquemia cerebral en aquéllos estudios con frecuencia se describe el mantenimiento de normotermia en animales, la temperatura de oclusión post-MCA en períodos de monitoreo ha sido extremadamente breve ("inmediatamente después de la cirugía" o "10 minutos después de la cirugía") (4,14) . Los resultados indican que los animales no regulan su temperatura más allá de estas duraciones breves, y se vuelven severamente hipotérmicos durante el período post-operatorio y estas diferencias de temperatura de hasta 90 minutos posterior a la oclusión de MCA pueden tener un efecto profundo en los índices del resultado posterior a ataque que sigue a la oclusión de MCA (no se han estudiado duraciones más prolongadas de normotermia) . Aunque otros han asegurado que la normotermia utilizando un sistema de retroalimentación basado en temperatura rectal similar al descrito en la presente, con frecuencia no se especifica la duración de la normotermia (17) . Los resultados arguyen por una identificación clara de métodos para monitorear y mantener la temperatura, así como las duraciones involucradas de manera que se puedan comparar los resultados experimentales tanto dentro como entre centros que estudien la patofisiología de los ataques.
Oclusión transitoria versus permanente: La patofisiología de ciertos aspectos de la isquemia cerebral permanente pueden estar diferenciadas de la isquemia cerebral seguida por reperfusión, de manera que es importante que se describa un modelo el cual permita el análisis en cualquier condición. Aunque las diferencias entre estos dos modelos no se prueban extensivamente en las series actuales de experimentos, bajo las condiciones probadas (45 minutos de isquemia seguido por 23 horas de reperfusión) , no se encontraron diferencias significativas en un índice de resultado posterior a ataque. Se han reportado duraciones variables de isquemia y reperfusión en otros modelos de ratón de isquemia cerebral transitoria, con tiempos isquémicos que varían desde 10 minutos hasta 3 horas y tiempos de reperfusión que varían desde 3 a 24 horas (17,24) . Los estudios en ratas han demostrado que los períodos breves de isquemia seguidos por reperfusión están asociados con infartos más pequeños que la oclusión permanente (21,25). Sin embargo, conforme la duración de isquemia se incrementa más allá del umbral crítico (entre 120 y 180 minutos) , la reperfusión se asocia con infartos más grandes (7,21,26) . Para la serie actual de experimentos, se eligieron las duraciones de isquemia y reperfusión de manera que se obtuvieran infartos comparables con aquéllos observados posterior a oclusión permanente de MCA, lo cual es probable que explique el motivo por el cual los datos no muestran diferencias entre la isquemia permanente y transitoria. Estas duraciones en el modelo transitorio se eligieron después de que los experimentos piloto revelaron que duraciones isquémicas más cortas (15 minutos) rara vez llevan a infarto, mientras que 180 minutos de oclusión seguido por reperfusión lleva a infarto masivo y casi 100% de mortalidad en las siguientes 4-6 horas en animales normotérmicos (observación no publicada) . Aunque los índices de resultado posterior a ataque se pueden medir anterior a las 24 horas, se eligió un tiempo de observación de 24 horas debido a que la observación en este tiempo permite el estudio de la muerte penumbral retardada, la cual es probable que sea clínicamente relevante a la patofisiología del ataque en humanos. Además, se ha demostrado en un modelo en rata que 24 horas es suficiente para maduración de un infarto completo (3,12,15,16).
Aspectos técnicos del modelo de ratón: Los aspectos técnicos de la cirugía necesaria para crear isquemia cerebral focal en ratones difiere en ciertos aspectos importantes del de las ratas . Los retractores de autorretención los cuales se han mencionado en reportes previos en ratas (26), son indebidos unweildy en ratones. La retracción basada en sutura asegurada con cinta proporciona una alternativa superior. En ratas, la oclusión con broche de la arteria carótida proximal y distal después de la obligación de la arteria carótida externa se ha reportado (26) , pero genera más trauma en la carótida y hemorragias en los ratones . Sin control de la carótida interna distal, el cual no ha sido descrito previamente en ratones, el retrosangrado desde la arteria carótida externa es consistentemente incontrolable. Mediante la utilización de las técnicas descritas en este documento, se puede completar la cirugía virtualmente sin pérdida de sangre, lo cual es especialmente importante dado el pequeño volumen sanguíneo en ratones . A diferencia del modelo en rata, la oclusión y transección de las ramas de la arteria carótida externa y la arteria pterigopalatina en el modelo en ratón se obtiene únicamente con el electrocauterización. Los reportes previos de cirugía en ratones no han sido claros respecto a si se ha tomado o no la arteria pterigopalatina (17,24) . Otros investigadores han descrito un método con oclusión permanente de la arteria carótida común y de la inserción trans-carótida de la sutura sin atención al sistema carótido externo o a la arteria pterigopalatina. Aunque es efectiva para oclusión permanente, este último método vuelve imposible los estudios de reperfusión. El método de reperfusión descrito originalmente en rata requiere la extracción de catéter ciego sin anestesia (26) . Cuando se intenta en estudios piloto en ratones, varios animales presentaron hemorragia. Por lo tanto, se desarrolló un método de remoción de sutura bajo visualización directa del animal anestesiado, el cual no sólo permite confirmación visual de la reperfusión de la arteria carótida extracraneal, sino que también permite hemostasis meticulosa. Además, el método permite reperfusión previa y posterior inmediata a las lecturas de fluometría doppler láser en el animal anestesiado. Estas lecturas de fluometría doppler láser son similares a las descritas por Kamii et al . y Yang et al. en donde las lecturas se realizan intermitentemente y con el uso de un micromanipulador estereotáctico (17,24). Sin embargo, las lecturas difieren en que las coordenadas utilizadas (2 mm posterior y 3 y 6 mm lateral al bregma) son ligeramente más laterales y posteriores que el núcleo publicado previamente y las coordenadas penumbrales (1 mm posterior y 2 mm y 4.5 mm lateral al bregma) . Estas coordenadas, las cuales se adoptaron en base en los estudios piloto, son las mismas a las utilizadas por Huang et al (14) .
Conclusión: Estos estudios demuestran aspectos técnicos específicos de un modelo en ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión el cual permite la capacidad de reproducción de mediciones entre laboratorios diferentes. Además, estos estudios proporcionan fundamentos para la comprensión de importantes variables de procedimiento las cuales pueden tener un impacto grande en el resultado posterior al ataque, lo cual puede llevar a una comprensión clara de diferencias que no estén relacionadas con el procedimiento bajo investigación. Lo que es más importante, este estudio indica la necesidad de un control cuidadoso de la cepa de ratón, el tamaño del animal y la sutura y la temperatura en los animales experimentales así como los controles . Se pueden establecer condiciones de manera que el resultado posterior al ataque sea similar entre modelos de isquemia cerebral focal permanente e isquemia cerebral focal transitoria, lo cual puede facilitar la comparación directa y permitir el estudio de daño por reperfusión. El modelo descrito en este estudio puede proporcionar un fundamento cohesivo para evaluar los resultados de estudios posteriores en animales transgénicos para facilitar la comprensión de la contribución de productos genéticos específicos en la patofisiología del ataque.
Tabla I . Parámetros fisiológicos preoperatorios y postoperatorios. MAP, presión arterial media,- pC02, presión parcial de C02 arterial (mm Hg) ; 02 Sat, saturación de 02 (%) ,- Hb, concentración de hemoglobina (g/dl) ; preoperatorio, animales anestesiados antes de la disección de la carótida, en falso, animales anestesiados experimentando la cirugía descrita en el texto, inmediatamente antes de la introducción de la sutura de oclusión; ataque, animales anestesiados que experimentaron la cirugía descrita en el texto, inmediatamente después de la introducción de la sutura de oclusión p=NS para todas las comparaciones entre grupos (datos mostrados son para ratones pequeños de 22 gramos C57/B16) .
PARÁMETRO PREOPERATORIO EN FALSO ATAQUE MAP 102 ± 5.5 94 ± 1.9 88 ± 4.9 pH 7.27 ± 0.02 7.23 ± 0.04 7.28 ± 0.01 pC02 46 ± 1.3 44 ± 1.3 47 ± 3.5 02Sat 89 ± 1.6 91 ± 1.8 85 ± 2.2 Hb 14.6 + 0.42 14.3 + .12 14.2 ± 0.12 Referencias 1. Backhaub C, Karkoutly C, Welsch M, Krleglstein J: A mouse model of focal cerebral ischemia for screening neuroprotective drug effects: J Pharmacol Methods 27:27-32, 1992. 2. Baker CJ, Onesti ST, Solomon RA: Reduction by delayed hypothermia of cerebral infarction following middle cerebral artery occlusion in the rat: a time-course study. J Neurosurg 77:438-444, 1992. 3. Baker CJ, Fiore AJ, Frazzini VI, Choudhri TF, Zubay GP, Solomon RA: Intraischemic hypothermia decreases the reléase of gluta ate in the cores of permanent focal cerebral infarcts. Neurosurgery 36:1-9, 1995. 4. Barone FC, Knudsen DJ, Nelson AH, Feuerstein GZ, Willette RN: Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow M-tab 13:683-692, 1993..
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EJEMPLO 4 : Exacerbación del daño cerebral en ratones los cuales expresan el gen para P-selectina: Identificación del bloqueo de P-selectina como un nuevo objetivo para el tratamiento de ataque Actualmente existe un hueco terapéutico notable para el tratamiento de un ataque en desarrollo. Aunque la P-selectina se expresa rápidamente por células endoteliales hipóxicas in vitro, permanece sin explorarse la significancia funcional de la expresión de P-selectina en ataque. Con el fin de identificar las consecuencias patofisiológicas de la expresión de la P-selectina y para identificar el bloqueo de P-selectina como un nuevo enfoque potencial para el tratamiento de ataque, para el tratamiento de ataque, se realizaron experimentos utilizando un modelo de ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión. Se demostró la expresión temprana de P-selectina en la corteza cerebral postisquémica por la acumulación específica de IgG contra P-selectina de ratón, radiomarcada . En experimentos en paralelo, la acumulación de neutrófilos en la corteza isquémica de ratón es que expresan el gen para P-selectina (PS +/+) es significativamente mayor que la demostrada en ratones homocigotos carentes de P-selectina (PS -/-) . El flujo de entrada reducido de neutrófilos fue acompañado por mayor reflujo cerebral postisquémico (medido por doppler láser) en los ratones PS -/-. Además, los ratones PS -/- demostraron volúmenes de infarto más pequeños (reducción de cinco veces, p < 0.05) y una supervivencia mejorada en comparación con los ratones PS +/+ (88% versus 44% p < 0.05) . El bloqueo funcional de P-selectina en ratones PS +/+ utilizando anticuerpos monoclonales dirigidos contra P-selectina de ratón también mejoró el reflujo temprano y el resultado posterior a ataque, en comparación con los controles. Estos datos son los primeros en demostrar un papel patifisiológico de P-selectina en el ataque, y sugiere que el bloqueo de P-selectina puede representar un objetivo terapéutico nuevo para el tratamiento de ataque .
INTRODUCCIÓN El ataque isquémico constituye la tercera causa principal de muerte en los Estados Unidos actualmente1. Hasta muy recientemente, no ha habido un tratamiento directo para reducir el daño tisular cerebral en el ataque en desarrollo. Aunque los estudios de ataque agudo NINDS2 y ECASS3 rt-PA1 han sugerido que existen beneficios terapéuticos potenciales de la reperfusión temprana4, la mortalidad aumentada observada posterior al tratamiento con estreptocinasa del ataque isquémico agudo5 aclara el . hecho evidente de que hasta la fecha no hay un tratamiento claramente efectivo para este ataque en desarrollo. Este hueco en el armamento médico actual para el tratamiento de ataque ha llevado a numerosos enfoques innovadores6, aunque otros diferentes a rt-PA, ninguno ha alcanzado el objetivo clínico. Para identificar un tratamiento potencial seguro y para evitar un ataque en desarrollo, se ha enfocado la atención en el papel dañino de los neutrófilos reclutados. El trabajo reciente en un modelo en ratón de ataque reperfundido ha. demostrado que la supresión de neutrófilos (PMN) antes del ataque minimiza el daño a tejido cerebral y mejora el resultado funcional7,- los ratones los cuales carecen de la molécula de adhesión celular específica, ICAM-l, están protegidos similarmente7. P-selectina, una molécula que puede ser colocada rápidamente a la superficie endotelial hipóxica desde los sitios de almacenamiento preformados8, es un mediador temprano importante del reclutamiento de neutrófilos9, lo cual facilita la supresión de neutrófilos mediada por ICAM-l. Aunque P-selectina se expresa en ataque10 en primates, no hay datos publicados los cuales aclaren la importancia funcional de la expresión de P-selectina en cualquier modelo de ataque ya sea reperfundido o sin reperfusión. Para explorar el papel patofisiológico de P-selectina en el ataque, se utilizó un modelo en ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión11 utilizando ratones tanto de tipo silvestre como ratones los cuales eran homocigotos carentes del gen para P-selectina9 y una estrategia de administración de un anticuerpo contra P-selectina funcionalmente bloqueador. Este estudio confirma no sólo que la expresión de P-selectina posterior a oclusión de la arteria cerebral media está asociado con un reflujo cerebral reducido posterior a reperfusión empeora el resultado posterior a ataque, sino que el bloqueo de P-selectina confiere un grado importante de protección cerebral postisqué ica. Estos estudios representan la primera demostración del papel patofisiológico de la expresión de P-selectina en el ataque y sugiere la excitante posibilidad de que las estrategias contra P-selectina pueden demostrar utilidad para el tratamiento del ataque reperfundido.
MÉTODOS Ratones : Se realizaron experimentos con ratones transgénicos deficientes en P-selectina, producidos como se ha reportado previamente9, por objetivo de genes en células pluripotenciales embriónicas Jl, inyectadas en plastositos C57BL/6 para obtener la transmisión en línea germinal y se retrocruzaron para obtener ratones homocigotos carentes de P-selectina (PS -/-) . Los experimentos se realizaron con ratones primos tipo PS -/-silvestre (PS +/+) de la tercera generación de retrocruzamientos con ratones C57BL/6J. Los animales tenían de siete a doce semanas de edad y pesaban entre 25 y 36 gramos en el momento de los experimentos .
Oclusión transitoria de la arteria cerebral media: Se anestesió a ratones (0.3 ce de 10 mg/cc de quetamina y 0.5 mg/cc de xilazina, i.p.), y se colocaron en posición supina sobre una superficie operada con control de temperatura rectal (Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH) . Se mantuvo la temperatura del animal a 37 ± 1°C intraoperatoriamente y durante 90 minutos postoperatoriamente. Se produjo una incisión en la línea media del cuello para exponer la cubierta de la carótida derecha bajo el microscopio de operación (16-25X de aumento zoo , Zeiss, Thornwood, NY) . Se aisló la arteria carótida común con seda 4-0 y cada una de las arterias occipital, pterigopalatina y carótida externa se aislaron y dividieron. La oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) se llevó a cabo al hacer avanzar una sutura de nylon 5-0 roma por calor de 13 mm vía el muñón de la carótida externa. Después de colocación de la sutura de oclusión, se cauterizó el muñón de la arteria carótida externa y se cerró la herida. Después de 45 minutos, se extrajo la sutura de oclusión para establecer reperfusión. Estos procedimientos han sido descritos previamente con detalle9.
Medición del flujo sanguíneo cortical cerebral: Se realizaron mediciones del flujo sanguíneo cerebral utilizando doppler láser (Perimed, Inc., Piscataway, NJ) , como se ha descrito previamente12. Utilizando una sonda doppler láser recta de 0.7 mm (modelo #PF303, Perimed, Piscataway, NJ) y marcas publicadas previamente (2 mm posterior al bregma, 6 mm a cada lado de la línea media)11,13, se realizaron mediciones del flujo sanguíneo cerebral relativo como se ha indicado; inmediatamente después de la anestesia, y 1 y 10 minutos después de la oclusión de la arteria cerebral media, así como después de 30 minutos, 300 minutos y 22 horas de reperfusión. Los datos se expresan como proporción de la intensidad de la señal doppler del hemisferio isquémico en comparación con el no isquémico. Aunque este método no cuantifica el flujo sanguíneo cerebral por gramo de tejido, el uso de las mediciones de flujo doppler láser en marcas anatómicas definidas con precisión sirve como un medio para comparar los flujos sanguíneos cerebrales en el mismo animal, en serie sobre el tiempo. Se consideró que el procedimiento quirúrgico era técnicamente adecuado si se observaba = 50% de reducción en el flujo sanguíneo cerebral relativo inmediatamente posterior a la colocación de la sutura de oclusión intraluminal. Estos métodos se han utilizado en estudios previos7,11.
La anatomía cerebrovascular se determinó en animales representativos de la siguiente manera. Se anestesió a los ratones, y se administró inyección antemortem (0.1 ml) de tinta India: negro de carbón: metanol: solución salina fisiológica (1:1:1:1, v:v:v:v) por punción ventricular izquierda. Se prepararon los cerebros por decapitación rápida seguido por inmersión en 10% de formalina a 4°C durante 2 días, después de lo cual se fotografiaron las superficies inferiores para demostrar el patrón vascular del círculo de Willis.
Preparación y administración de proteínas marcadas con 125I y neutrófilos de ratón marcados con lxlIn: Se prepararon anticuerpos radioyodados como sigue. Se radiomarcaron IgG de rata contra P-selectina de ratón, monoclonal (Clona RB 40:34, Pharmingen Co., San Diego, CA) 14 e IgG de rata no inmune (Sigma Chemical Co . , St. Louis, MO) con 125I por el método de lactoperoxidasa15 utilizando Enzymobeads (Bio-Rad, Hércules, CA) . Se prepararon PMN radiomarcados de la siguiente manera. Sangre citratada de ratones tipo silvestre se diluyó 1:1 con NaCl (0.9%) seguido por ultracentrifugación en gradiente sobre Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Posterior a la lisis hipotónica de eritrocitos residuales (exposición de 20 segundos a H20 destilada seguida por reconstitución con NaCl 1.8%), los PMN se suspendieron en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Se suspendieron los neutrófilos (5-7.5 x 10s) en PBS con 100 µCi de oxina de l?:LIndio (Amersham Mediphysics, Port Washington, NY) , y se sometieron a agitación suave durante 15 minutos a 37 °C. Después del lavado con PBS, los PMN se sedimentaron suavemente (450 x g) y se resuspendieron en PBS hasta una concentración final de 1.0 x 10s células/ml.
Examen neurológico: Antes de suministrar anestesia, los ratones fueron examinados para determinar deficiencias neurológicas 22 h después de la reperfusión utilizando el sistema de calificación de cuatro niveles11: se proporcionaba una calificación de 1 si el animal demostraba movimientos espontáneos normales; se proporcionaba una calificación de 2 si el animal se observaba que giraba hacia su lado ipsilateral; se proporcionaba una calificación de 3 si se observaba que el animal giraba longitudinalmente (en el sentido de las manecillas del reloj cuando se observa desde la cola) ,- se proporciona una calificación de 4 si el animal no respondía a estímulos nocivos. Este sistema de calificaciones ha sido descrito previamente en ratones7'11, y se basa en sistemas de calificación similares utilizados en ratas16,17.
Cálculo de volúmenes de infarto: Después de examen neurológico, los ratones fueron anestesiados y se obtuvieron mediciones de flujo sanguíneo cerebral final. Se realizó eutanasia sin sufrimiento por decapitación, y se removieron los cerebros y colocaron en una matriz de cerebro de ratón (Activational Systems Inc., Warren, MI) para seccionado de 1 mm. Las secciones o cortes se sumergieron en cloruro de 2, 3, 5-trifenil-2H-tetrazolio al 2% (TTC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en solución salina amortiguada con fosfato al 0.9%, se encubaran durante 30 minutos a 37 °C y se colocaron en formalina al 10%lß. Se visualizó el cerebro infartado como un área de tejido no teñido. Se calcularon los volúmenes de infarto a partir de cortes en serie planimetrados y se expresaron como el por ciento de infarto en el hemisferio ipsilateral. Este método para calcular los volúmenes de infarto ha sido utilizado previamente7, 11,13,lß, y se ha correlacionado con otros índices funcionales de resultado posterior a ataque los cuales han sido descritos antes.
Administración de anticuerpos no marcados, PMN radiomarcados y anticuerpos radiomarcados : Para experimentos en los cuales se administraron anticuerpos no marcados, se utilizaron uno de dos tipos diferentes de anticuerpos; ya sea IgG de rata contra P-selectina de ratón, monoclonal bloqueadora (Clona RB 40.34, Pharmingen Co., San Diego, CA)14'19'20 o IgG de rata no inmune (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . Se prepararon anticuerpos como 30 µg en 0.2 ml de solución salina amortiguada con fosfato que contiene 0.1% de albúmina sérica bovina, la cual se administró posteriormente en la vena del pene 10 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media. En experimentos separados, se inyectaron intravenosamente anticuerpos radiomarcados (0.15 ml, «2.6 x 10s cpm/µl) 10 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media. En un tercer conjunto de experimentos, se administraron PMN radiomarcados intravenosamente 10 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media como una inyección de 100 µl (los PMN radiomarcados se mezclaron con solución salina fisiológica hasta un volumen total de 0.15 ml ,-«3 x 106 cpm/µl) . Para los experimentos en los cuales se administraron los anticuerpos no marcados, se indicó en el texto el tiempo en el cual se realizaron las mediciones utilizando los métodos descritos antes para determinar el flujo sanguíneo cerebral, volúmenes de infarto y la mortalidad. Para aquéllos experimentos los cuales los anticuerpos radiomarcados o los PMNn radiomarcados se administraron, los ratones se sacrificaron en los puntos de tiempo indicados y se removieron de inmediato los cerebros y se dividieron en hemisferios ipsilateral (postisquémico) y contralateral. La deposición de anticuerpos radiomarcados o neutrófilos se midió y expresó como ipsilateral/contralateral cpm.
Análisis de datos: Se compararon el flujo sanguíneo cerebral, volumen de infarto y deposición de PMN marcados con X11ln utilizando la prueba t de Students para variables no pareadas. Se compararon las calificaciones de deficiencia neurológico utilizando la prueba U de Mann-Whitney . Se realizó ANOVA de dos colas para probar diferencias significativas entre la deposición de anticuerpos de línea de base y final (30 minutos) entre los dos grupos (experimental versus en falso) . Se realizó la prueba t de Student para variables no pareadas con el fin de evaluar diferencias dentro del grupo (línea de base versus el punto del tiempo a los 30 minutos) . Las diferencias de supervivencia de grupos se probó utilizando análisis de contingencia con la estadística chi cuadrada. Los valores se expresaron como media ± SEM con un valor de p < 0.005 considerado estadísticamente significativo .
RESULTADOS Expresión de P-selectina en ataque en ratones: Debido a que P-selectina media la fase inicial de adhesión de leucocitos a células endoteliales activadas21, se examinó la expresión cerebral temprana de P-selectina en un modelo de ratón de ataque reperfundido. A los ratones se les administró IgG de rata anti P-selectina de ratón, monoclonal, marcada con 125I antes de la cirugía y demostraron únicamente de 216% en la acumulación de anticuerpos a los 30 minutos de reperfusión en comparación con los animales operados en falso (p < 0.001, Figura 18A) . Para demostrar que este grado de deposición de anticuerpo en el hemisferio reperfundido se debe a expresión de P-selectina en vez de acumulación no específica, se realizó una comparación con animales tratados de manera idéntica a los que se les administró IgG no inmune de rata marcada con 12SI. Estos experimentos demostraron que hay una acumulación significativamente mayor de IgG contra P-selectina en ' comparación con IgG no inmune (p < 0.025, Figura 18A) , lo que sugiere que P-selectina se expresa en el cerebro en los siguientes 30 minutos de reperfusión.
Acumulación de neutrófilos en ataque en ratones: Para delinear el curso en el tiempo sobre el cual ocurre el flujo de entrada de PMN después del ataque, se midió la acumulación de PMN marcados con l?aTn en ratones tipo silvestre (PS +/+) antes de MCAO, inmediatamente después y 10 minutos después de MCAO, y a los 30 minutos, 300 minutos y 22 h de reperfusión. En ratones PS +/+, la acumulación de los PMN comienza temprano después del inicio de isquemia focal, y continúa durante el período de reperfusión (Figura 18B) . Para establecer el papel para P-selectina en esta acumulación postisquémica - de neutrófilos, se realizaron experimentos utilizando ratones que son homocigotos carentes para el gen para P-selectina (PS -/-) . Los ratones PS -/- mostraron acumulación de PMN significativamente reducida posterior a oclusión de la arteria cerebral media y reperfusión (Figura 18B) .
Papel de PS en la carencia de reflujo cerebrovascular: Para determinar si la reducción en la acumulación de PMN en ratones PS -/- resulta en flujo sanguíneo cerebral mejorado posterior al restablecimiento de flujo, se obtuvieron mediciones en serie de CBF relativo por doppler láser en ratones tanto PS +/+ como PS -/-. Antes del inicio de la isquemia (Figura 19, punto a), los flujos sanguíneos cerebrales relativos fueron casi idénticos entre grupos . La oclusión de la arteria cerebral media (Figura 19, punto b) se asoció con una disminución casi idéntica en el flujo sanguíneo cerebral en ambos grupos. Inmediatamente antes de la extracción de la sutura de oclusión intraluminal a los 45 minutos de isquemia (Figura 19, punto c) , el flujo sanguíneo cerebral se incrementó ligeramente, aunque permaneció significativamente abatido en comparación con los flujos de línea de base. Inmediatamente después de la extracción de la sutura de oclusión para iniciar la reperfusión (Figura 19, punto d) , el flujo sanguíneo cerebral en ambos grupos se incrementó en un grado comparable («60% de línea de base en ratones PS -/- y PS +/+.). La falla inmediata de los flujos sanguíneos cerebrales postrreperfusión para alcanzar los niveles previos a la oclusión es característico de la carencia de reflujo cerebrovascular22, con declinación subsecuente en los flujos sanguíneos cerebrales postrreperfusión, lo que representan la hipoperfusión cerebral postisquémica tardía23. A los 30 minutos de reperfusión (Figura 19, punto e) , los flujos sanguíneos cerebrales entre los dos grupos de animales se separó, los animales PS -/- demuestran flujos sanguíneos cerebrales relativamente mayores significativamente en comparación con los controles PS +/+.
(Figura 19, punto f) . Esta discrepancia refleja diferencias significativas en la hipoperfusión cerebral postisquémica retardada y persistió durante el período de observación de 22 horas. Debido a que se ha reportado que las variaciones en la anatomía cerebrovascular resulta en diferencias en la susceptibilidad a ataque experimental en ratones24, se realizó tinción con tinta india/negro de carbón para visualizar el patrón vascular del círculo de illis en ratones tanto PS -/- como PS +/+. Estos experimentos demostraron que no hay diferencias anatómicas grandes en el patrón vascular de la circulación cerebral (Figura 20) .
Resultado posterior al ataque-. Se probó la importancia funcional de la expresión de P-selectina al comparar los índices del resultado posterior a ataque en ratones PS -/- en comparación con los controles PS +/+. Los ratones PS -/- estaban protegidos significativamente de los efectos de isquemia cerebral focal y reperfusión, en base en una reducción de 77% en el volumen de infarto (p < 0.01) en comparación con los controles P-selectina +/+ (Figura 21A) . Esta reducción en el volumen de infarto estaba acompañada por una tendencia hacia una deficiencia neurológica reducida (p = 0.06, Figura 21B) y una supervivencia aumentada (p < 0.05; Figura 21C) en los animales PS -/-.
Efecto de bloqueo de P-selectina: Después de haber observado el papel funcional de la expresión de P-selectina en el ataque utilizando ratones rautantes por supresión, se realizaron experimentos para determinar si el bloqueo farmacológico de P-selectina puede mejorar el resultado posterior a ataque en ratones PS +/+. Utilizando una estrategia de administración de 5 anticuerpo de rata bloqueador, contra P-selectina de ratón, monoclonal (clona RB 40.34, 14,19,20) o IgG de rata control no inmune inmediatamente antes de la cirugía, se observó que los ratones que recibieron anticuerpo bloqueador tienen flujos sanguíneos cerebrales mejorados posteriores a la reperfusión a los 10 30 minutos (Figura 22A) , así como deficiencias neurológicas reducidas (Figura 22B) , volúmenes de infarto cerebrales reducidos (Figura 22C) y una tendencia hacia una mortalidad reducida en comparación con los controles (Figura 22D) .
DISCUSIÓN Pese al avance sustancial en años recientes en la prevención primaria de ataque1, las opciones terapéuticas para tratar un ataque en desarrollo permanecen extremadamente limitadas*. Aunque la publicación de dos ensayos fundamentales el último otoño demuestra una morbilidad reducida posterior al tratamiento de ataque isquémico con rt-PA2,3, se consideró introducir una nueva era de terapia trombolítica en el tratamiento de ataque4, el entusiasmo ha disminuido un poco por la transformación hemorrágica y mortalidad aumentada observada en pacientes con ataque isquémico tratado con el estreptogenasas . Estos ensayos divergentes se vuelven más críticos que nunca que se desarrollen nuevas terapias y inocuas para tratar un ataque en desarrollo. Aunque el restablecimiento del flujo sanguíneo a un cerebro postisquémico proporciona oportunidades nuevas para una intervención terapéutica temprana, la reperfusión es una espada de doble filo. Dado el potencial citotóxico de los neutrófilos25, no es sorprendente que el flujo de entrada de neutrófilos al tejido cerebral postisquémico puede llevar a daño adicional y empeore el resultado posterior al ataque experimental7,26"29. Al utilizar un modelo de ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión, recientemente se ha identificado un papel contribuyente importante de la molécula de adhesión celular ICAM-l en la acumulación de neutrófilos a las 22 horas posterior al ataque7. Sin embargo, la expresión aumentada endotelial cerebrovascular de ICAM-l requiere los eventos transcripcional y traduccional de novo, lo cual requiere tiempo. En contraste, la P-selectina, una glicoproteína que abarca la membrana, la cual media las fases más tempranas de la adhesión de neutrófilos, se puede movilizar desde sus acumulados almacenados preformados para expresarse rápidamente en la superficie de la célula endotelial isquémica8'30. Puesto que los ensayos clínicos de la terapia trombolítica para ataque demuestran un intervalo de tiempo estrecho para beneficio potencial (en las siguientes varias horas de inicio del ataque)2,3,5, esto sugiere que las estrategias diseñadas para interferir con las fases más tempranas de adhesión de los PMN pueden ser de beneficio teórico en el ataque en humanos. Estos ensayos resultarían en números más elevados de pacientes que presenten para intervención terapéutica más temprana, lo que incrementa la necesidad de resolver el problema de daño por reperfusión en territorios revascularizados médicamente. Además, estos ensayos subrayan la necesidad cada vez mayor de comprender las contribuciones de las moléculas de adhesión individuales a la patogénesis del ataque. Dado el considerable cuerpo de literatura que describe el papel de P-selectina en otros modelos de isquemia y reperfusión8,31"34, sorprendentemente se sabe poco acerca del papel de P-selectina en el ataque. El conocimiento del papel específico de P-selectina en la vasculatura cerebral es importante debido a que los requerimientos de moléculas de adhesión varían entre los lechos vasculares y las condiciones bajo estudio. Por ejemplo, en un modelo de trasplante intestinal35, los anticuerpos contra P-selectina no reducen el daño por reperfusión, mientras que los anticuerpos contra CD11/CD18 sí lo hicieron. Aunque el bloqueo de P-selectina no es efectivo para reducir la adhesión de PMN y la fuga de albúmina en la isquemia mesentérica de rata y en el modelo de reperfusión, el bloqueo de ICAM-l fue efectiva36. En un modelo de isquemia/reperfusión del miembro posterior de rata, los requerimientos de selectina por adhesión de PMN difirieron entre los lechos vasculares pulmonar y de músculo crural33.
El único estudio publicado que trabaja con P-selectina en el cerebro isquémico es una descripción histopatológica de ataque a primates, en el cual se incrementó la expresión de P- selectina en la microvasculatura del lenticuloestriado10. Además, no hay datos los cuales aclaren la importancia funcional de esta expresión de P-selectina. Actualmente se están llevando a cabo estudios para estudiar si la expresión de P-selectina contribuye a la acumulación postisquémica cerebral de neutrófilos, la carencia de reflujo y el daño de tejido en un modelo en ratón de ataque con reperfusión. Utilizando un modelo recientemente establecido de isquemia cerebral focal y reperfusión en ratones11, se demostró expresión de P-selectina por deposición aumentada de anticuerpo radiomarcado en el territorio isquémico. En esta técnica, la deposición de anticuerpos en el hemisferio isquémico se normalizó de manera que en el hemisferio no isquémico en cada animal, no solo se minimizan las variaciones potenciales en el volumen de inyección o el volumen de distribución, sino que - permite la comparación entre animales dados los anticuerpos diferentes. Debido a la ruptura de la función de la barrera endotelial en la corteza isquémica se puede aumentar la deposición no selectiva de anticuerpos, y se realizaron experimentos similares con IgG de rata como control. Estos datos mostraron que los anticuerpos los cuales se unen a P-selectina se depositan a una velocidad acelerada en comparación con el anticuerpo control, 5 lo que sugiere que se aumenta la expresión local de P-selectina en el tejido sometido a reperfusión. Estos datos en el modelo de ratón son paralelos a los reportados en el modelo en babuino de ataque10, en el cual se incremento la expresión de P-selectina en la siguiente hora posterior al evento isquémico. Se demostró el papel de la expresión de P-selectina en el reclutamiento de PMN en la zona postisquémica utilizando una estrategia en la cual se midió la acumulación de PMN marcados con ulIn. Aunque previamente se ha reportado que a las 22 horas se eleva la. acumulación de PMN en el hemisferio isquémico7, los datos actuales en el curso en el tiempo demuestran que la acumulación de PMN comienza poco después del acceso de isquemia. La falla de expresar el gen para P-selectina se asoció con una acumulación reducida, de PMN, lo que sugiere la participación de P-selectina en el reclutamiento postisquémico cerebral de los PMN. Sin embargo, animales carentes de P-selectina demostraron una acumulación modesta (aunque menor que el control) de neutrófilos a las 22 horas. Estos datos indican que P-selectina no es un mecanismo efector exclusivo responsable para el reclutamiento postisquémico cerebral de PMN, y es consistente con los datos previos de que ICAM-l también participa en la adhesión postisquémica de PMN7. Además, estos datos no son diferentes de aquellos en los cuales la instilación intraabdominal de tioglicolato en ratones deficientes de P-selectina causa reclutamiento retardado (pero no ausente) de PMN9.
Debido a la necesidad crítica de identificar las razones para una reperfusión fallida, los estudios actuales examinaron el papel de P-selectina en la hipoperfusión cerebral postisquémica retardada22,23, el fenómeno en el que el flujo sanguíneo declina durante la reperfusión, pese al restablecimiento de presiones adecuadas de reperfusión. En modelos cardíacos de isquemia, la carencia de reflujo empeora conforme transcurre el tiempo después de la reperfusión37, lo que sugiere un papel importante para los mecanismos efectores reclutados, tales como trombosis microcirculatoria progresiva, disfunción vasomotora y reclutamiento de los PMN. Se ha demostrado en otros modelos que tanto las reacciones de adherencia dependientes de P-selectina como de ICAM-l38 así como el taponamiento capilar por los PMN39 participan en la carencia de reflujo postisquémico. En cerebro, los PMN han sido implicados en la carencia de reflujo cerebral postisquémico40,41, pero el papel de la P-selectina en este proceso aún no ha sido dilucidado. El estudio actual utiliza una técnica relativamente no invasiva (doppler láser) para obtener mediciones en serie del flujo sanguíneo cerebral relativo, con el fin de establecer la existencia, curso en el tiempo y dependencia de P-selectina de la carencia de reflujo cerebrovascular postisquémica. En estos experimentos, se sometieron animales carentes de P-selectina y control a grados virtualmente idénticos de isquemia, y la recuperación instantánea del flujo sanguíneo posterior a la remoción de la sutura de oclusión intraluminal fue la misma en los dos grupos. Sin embargo, el flujo sanguíneo cerebral declinó en el período de tiempo posterior a la reperfusión en los animales P-selectina +/+. En contraste notable, los animales PS -/- demostraron únicamente una hipoperfusión cerebral postisquémica ligeramente retardada. Esta declinación tardía (aunque limitada) en el flujo sanguíneo cerebral por 22 horas es consistente con el reclutamiento modesto de PMN observado en los animales PS -/- sobre el mismo período. Esto sugiere nuevamente que otros mecanismos efectores (tales como ICAM-l) pueden ser responsables de la declinación tardía en el flujo sanguíneo cerebral en animales PS -/-. Los efectos funcionales de la expresión de P-selectina son evidentes a partir del conjunto actual de estudios. Los animales los cuales fallan en expresar el gen para P-selectina (o animales PS +/+ tratados con un anticuerpo contra P-selectina que bloquea funcionalmente) muestran infartos más pequeños, una supervivencia mejorada y los sobrevivientes demuestran resultados neurológicos mejorados en comparación con los controles. Cuando estos datos se consideran junto con los datos publicados previamente que demuestran un papel dañino para la expresión de ICAM-l en un ataque7, se vuelve cada vez más evidente que existe medios múltiples para reclutar los PMN a la corteza cerebral postisquémica y que un bloqueo de cada una representa una estrategia potencial para mejorar el resultado posterior a ataque en humanos. Dado el actual reconocimiento de la importancia de la reperfusión a tiempo para detener el avance de la onda frontal de la muerte neuronal posterior al ataque, el interferir con la adhesión de los PMN en sus etapas más tempranas parece ser una opción atractiva para reducir la morbilidad y mortalidad. De hecho, las estrategias antiadhesión de la molécula no solo pueden ser benéficas por su mismas (es decir, que incluye a pacientes no elegibles por trombosis) , sino que puede ampliar el intervalo de oportunidades para intervención trombolítica42. El conjunto de estudios actual contribuye a la compresión de los mecanismos patofisiológicos que operan en un ataque con reperfusión. Estos estudios sugieren la necesidad de ensayos clínicos de terapias para desarrollar ataque las cuales optimicen el ambiente de reperfusión para reducir la acumulación de PMN.
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Ejemplo 5? Los ratones homocigotos carentes de P-selectina son resistentes a isquemia cerebral focal y daño por reperfusión El papel de los neutrófilos (PMN) en potenciar el daño por reperfusión ante isquemia focal en el sistema nervioso central permanece en controversia. Una etapa temprana importante en la captura de los PMN circulantes por la vasculatura está medida por P-selectina expresada en el endotelio postisquémico. Aunque la expresión temprana y persistente de P-selectina endotelial ha sido descrita en los microvasos del cerebro posterior a la oclusión de la arteria cerebral media en babuinos, no se ha determinado las consecuencias de la expresión endotelial de P-selectina en el ataque. Para definir el papel de P-selectina en el ataque, se utilizó en dos grupos de ratones un modelo en ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión que consiste de oclusión de la arteria cerebral media intraluminal (MCA) durante 45 minutos seguido por 22 horas de reperfusión; se utilizaron ratones transgénicos que son homocigotos carentes para P-selectina (PS -/-) Y primos control de tipo silvestre (PB +/+) . Se calcularon los volúmenes de infarto cerebral a partir de cortes o secciones en serie planimetradas con cloruro de trifeniltetrazolio, y se expresaron como el porcentaje de tejido infartado en el hemisferio ipsilateral. El resultado neurológico se baso en el observado por un investigador quien desconoce el protocolo (1: sin déficit; 2: en círculos; 3: girando; 4: inmóvil) . Se determinó el flujo sanguíneo cerebral (CBF) cortical ipsilateral por fluometría doppler láser y se expreso como por ciento del GBF cortical contralateral. Los ratones PS -/- mostraron una reducción de 3.8 veces en los volúmenes de infarto en comparación con los controles PS +/+ (7.6 ± 4.4% vs 29.2 ± 10.1%, p<0.05) . Esta reducción en los volúmenes de infarto en ratones carentes de P-selectina fue reflejada por una supervivencia mejorada (87% vs . 42%, p<0.05) y una tendencia hacia un déficit neurológico reducido (1.9 ± 0.4 vs . 2.5 ± 0.3, p=NS) en los sobrevivientes. Debido a que hubo una tendencia por un flujo sanguíneo cerebral aumentado posterior a isquemia cerebral y reperfusión en la cohorte PS -/- (65 ± 11% vs . 46 ± 18% para controles, p=NS) , estos estudios sugieren que la adhesión dependiente de P-selectina puede contribuir a la carencia de reflujo cerebral. Tomados juntos, estos datos implican un papel importante para la expresión de P-selectina en la patofisiología del ataque, y sugieren estrategias farmacológicas novedosas para mejorar el resultado posterior a ataque.
EJEMPLO 6; La ausencia del gen para P-selectina reduce la acumulación postisquémica cerebral de neutrófilos, la carencia de reflujo y el daño tisular en el modelo en ratón de ataque con reperfusión Estudios recientes en seres humanos indican que el restablecimiento del flujo sanguíneo cerebral (CBF) durante el período temprano posterior al inicio del ataque reduce las secuelas neurológicas. Se ha establecido la hipótesis de que la P-selectina (PS) , una molécula de adhesión de neutrófilos (PMN) de acción temprana expresada por el endotelio hióxico puede tener un papel patofisiológico importante en el desarrollo de un ataque con reperfusión. Se realizaron estudios para eliminar en un modelo en ratón de isquemia cerebral focal transitoria que consiste de oclusión de la arteria cerebral media intraluminal durante 45 minutos seguido por 22 horas de reperfusión. En este modelo, los ratones los cuales no expresaron el gen PS (PS -/-) presentan volúmenes de infarto más pequeños, calificaciones reducidas de déficit.- neurológico y una supervivencia mejorada en comparación con los controles de tipo silvestre (PS +/+) . Los estudios actuales se realizaron para definir adicionalmente los mecanismos inducidos por PS de daño cerebral. A ratones PS +/+ (n = 6) se les administró IgG contra PS marcado con 125I antes de la cirugía y se demostró una acumulación 216% mayor de anticuerpo en el hemisferio ipsilateral por 30 minutos de reperfusión, en comparación con animales operados en falso (n = 6, p < 0.001) o con animales a quienes se les administró IgG no inmune y se sometieron a isquemia cerebral focal transitoria y 30 minutos de reperfusión (n = 4, p < 0.03) . En los ratones PS +/+, la acumulación de PMN comienza temprano posterior al inicio de isquemia focal, y continúa a través del período de reperfusión (incremento de dos veces en la acumulación de 113-In-PMN ipsilateral/contralateral en 22 horas, n = 8, p < 0.05) . Los ratones PS -/- muestran una reducción de 25% en la acumulación de PMN en el hemisferio ipsilateral a las 22 horas (n = 7, p < 0.05) . Se investigó el efecto de la expresión de PS en la carencia de reflujo cerebral postisquémica al medir CBF ipsílateral en serie durante la evolución del ataque. Aunque las CBF de línea de base, posterior a la oclusión, y reperfusión inicial fueron idénticas, las CBF a los 30 minutos de reperfusión fueron significativamente mayores en ratones PS -/- (n = 5) en comparación con los ratones PS +/+ (n = 8, 2.4 veces mayor, p < 0.05) . Esta diferencia es sostenida durante el resto del período de reperfusión de 22 h. Estos datos soportan* un papel temprano importante para PS en el reclutamiento de los PMN, la carencia de reflujo postisquémico y el daño a tejido én el desarrollo del ataque. Esta es la primera demostración de un papel patofisiológico para PS en el daño por reperfusión cerebral, lo cual sugiere que el bloqueo de PS pueda representar un objetivo terapéutico para el tratamiento de ataque con reperfusión.
EJEMPLO 7: Monóxido de carbono y evolución del ataque El monóxido de carbono gaseoso, un subproducto tóxico del catabolismo del hemo, está involucrado en la potenciación a largo plazo y la memoria en el sistema nervioso central. Sin embargo, se desconocen otros papeles fisiológicos para la producción de CO en cerebro. Debido a que lajiemo oxigenasa es inducida durante condiciones inflamatorias, se investigó si la producción endógena de CO puede conferir un papel protector cerebral en ataque. En un modelo de ratón de isquemia cerebral focal, se indujo hemo oxigenasa tipo I en el ARNm (mediante transferencia Northern) y niveles de proteína (mediante transferencia Western) , localizadas en el endotelio vascular cerebral en el hemisferio isquémico por hibridización in situ e inmunohistoquímica. Se observó producción local de CO por medio directa en la zona isquémica. En experimentos por paralelo, las células endoteliales de cerebro de ratón expuestas a un ambiente hipóxido demostraron una inducción similar de ARNm para hemo oxigenasa, proteína y generación de CO. Para determinar si la producción de CO es incidental a la patofisiología del ataque, se bloqueo la producción de CO por administración de protoporfirina de estaño (confirmada por medición directa de las concentraciones locales reducidas de CO) . Estos animales demostraron volúmenes de infarto significativamente más grandes, resultados neurológicos peores y mortalidad aumentada, en comparación con los controles no tratados. Además, la administración de CO antes del ataque confiere protección cerebral significativa. Puesto que esta protección no se observó en animales tratados con biliverdina, el subproducto coincidente del catabolismo de hemo, estos datos sugieren que la producción de CO endógeno per se tiene un papel protector en el desarrollo del ataque .
Introducción Existe un cuerpo considerable de literatura y un reconocimiento común de los efectos tóxicos del monóxido de carbono exógeno (CO) , el cual se une ávidamente a los centros hemo, inhibiendo el transporte de oxígeno y envenenando la respiración celular. Durante muchos años, se consideró al CO como un subproducto incidental del catabolismo del hemo, pero datos recientes en el cerebro sugieren que CO producido - en neuronas definidas por hemo oxigenasa II puede modular la potenciación a largo plazo. En ratas, la exposición a choque térmico ha sido correlacionado con la expresión de la proteína de choque térmico de 32 kDa (hemo oxigenasa I) en varios órganos incluyendo el. cerebro. La significancia fisiológica de esta inducción de HSP32 ha sido adscrita teleológicamente a la liberación estequiométrica de CO por hemo oxigenasa I (HOI) . En la mayor parte de los estudios experimentales, la inducción de HOI sirve únicamente como un marcador incidental de la tensión oxidante celular. La identificación reciente del papel antiinflamatoria para HOI en un modelo de inflamación peritoneal se ha adscrito a la producción de la biliverdina antioxidante natural durante el proceso del catabolismo del hemo. Los estudios actuales reportan por primera vez que el cerebro postisquémico genera cantidades enormes de CO. Al utilizar el modelo de ratón de isquemia cerebral focal en el cual se ocluyó la arteria cerebral media por una sutura intraluminal, se incremento significativamente la producción de HOI en el hemisferio isquémico en comparación con el hemisferio no isquémico. Debido a la inmunohistoquímica y la hibridización in situ localizada en la fuente de HOI a las células endoteliales dentro del hemisferio isquémico, se utilizó un modelo in vitro de hipoxia celular para confirmar la inducción del mensaje HOI, la proteína y la actividad en las células endoteliales microvasculares cerebrales de ratón. El bloqueo de la producción de CO utilizando protoporfina IX de estaño o de zinc se asocio con un incremento en el volumen de infarto cerebral y mortalidad, mientras que la exposición de los animales a CO inmediatamente antes de isquemia confirió una protección cerebral significativa, dependiente de la dosis, dentro de un intervalo terapéutico estrecho. La administración de biliverdina no tuvo efecto en este modelo. Tomados juntos, estos datos indican que el tejido cerebral isquémico produce grandes cantidades de CO, la producción del cual confiere protección cerebral que limita la cantidad de tejido destruido durante un ataque.
MÉTODOS Preparación y administración de protoporfirina. Inicialmente se disolvieron cloruro de protoporfirina IX de estaño (20 mg, Porphyrin Products, Logan, UT) , protoporfirina IX de zinc (17 mg, Porphyrin Products, Logan, UT) , o biliverdina (18 mg, Porphyrin Products, Logan, UT) . en sulfóxido de dimetilo (2 ml) . Una alícuota de esta solución (200 µl ) se agrega a solución salina normal (9.8 ml) y esta mezcla se somete a vortex vigorosamente para producir una solución 2.7 x 10"4 M de la protoporfirina. El recipiente de solución se envuelve en lámina de aluminio para evitar fotolisis de la protoporfirina y se almacena a 4°C hasta que se utiliza. Se cargan bombas microosmóticas (#1003D Alza Corp. , Palo Alto, CA) con esta solución de protoporfirina (91 µl/bomba) y se implantan subcutáneamente en el ratón anestesiado vía una incisión en la línea media dorsal de 1 cm 24 h antes del inicio de la cirugía. Estas bombas administran solución de medicamento a un régimen de 0.95 + 0.02 µl/h. Al momento de la cirugía se administró una dosis adicional de la solución de protoporfirina (0.3 ml, i.v.) antes de la inserción del catéter oclusor intraluminal. Cada animal recibió las cantidades de medicamento total siguientes (inyección + bomba) durante el curso del estudio: protoporfirina de estaño (0.070 mg) , protoporfirina de zinc (0.059 mg) o biliverdina (0.061 mg) .
EJEMPLO 8 La hipoxia de radicales libres induce translocación de P-selectina (PS) a la superficie de células endoteliales (EC) , en donde participa en la adhesión de neutrófilos (PMN) durante la reperfusión. Para explorar un mecanismo por el cual los nitrovasodilatadores pueden atenuar t el leucosecuestro postisquémico, probamos si la estimulación de la vía NO/GMPc puede atenuar la expresión en superficie de PS en las EC de vena umbilical humano Hipóxicas. Las EC se expusieron a hipoxia (p02 < 20 Torr durante 4 horas) , lo que demostró un incremento de 50% en la liberación de vWF (p < 0.005) (vWF se empaca con PS) , paralelo por un incremento de 80% en la expresión de superficie de PS (p < 0.0001), medido por unión específica de un anticuerpo radiomarcado, contra PS . Bajo condiciones similares, la adición del donador de NO 3 -morfolino sidnonimina (SIN-1, 0.1 mM) o del análogo de GMPc 8-bromo-GMPc (GMPc, 10 nM) causó una reducción en la liberación de vWF; Control vWF, 11 + 0.4 mU/ml ; SIN-1, 9.1 + 0.3 mU/ml; GMPc, 9.7 ± 0.2 mU/ml ; p < 0.005 tanto para SIN-1 o GMPc versus control. Comparado con los controles, SIN-1 o GMPc también reduce la expresión superficial de PS (40% y 48% de disminuciones, respectivamente, de p < 0.005 para cada uno) utilizando un ensayo de adherencia inmunofluorescente, tanto SIN-1 como GMPc redujeron la unipon de HL60 a HUVEC hipóxicos (53% y 86% de disminución versus controles, p < 0.05 para cada uno) . La medición de fluorescencia de fura-2 demostró que la hipoxia incrementó la concentración intracelular de calcio [Cai] y que la [Cai] incrementada puede ser bloqueada por GMPc. Ni SIN-1 ni GMPc pueden reducir adicionalmente la expresión de PS cuando las EC se colocan en un medio libre de calcio. Estos datos sugieren que la estimulación de la vía de NO/GMPc inhibe la expresión de PS al inhibir el flujo de calcio en las EC, e identifica esta inhibición como un mecanismo importante por el cual los nitrovasosdilatadores pueden disminuir la unión de PMN en tejidos postisquémicos .
EJEMPLO 9: Factor IXai El factor IX es un factor de la coagulación el cual existe en los humanos y otros mamíferos, y es una parte importante de la vía de la coagulación. En el esquema normal de la coagulación, el factor IX es activado ya sea por el factor Xla o por el complejo de factor tisular/VIIa a su forma activa, factor IXa. Después, el factor IXa puede activar al factor X, el cual impulsa la parte final de la cascada de la coagulación, lo que lleva a la trombosis. Debido a que el factor X puede ser activado por una de dos vías, ya sea la extrínseca (vía Vlla/factor tisular) o la vía intrínseca (vía factor IXa) , establecimos la hipótesis de que la inhibición del factor IXa puede llevar a disminución de algunas formas de hemostasis, pero deja a la hemostasis en respuesta al daño en tejido intacta. En otras palabras, puede llevar a bloqueo de algunos tipos de coagulación, pero puede no llevar a hemorragia excesiva o no deseada. El factor IXai es el factor IX el cual ha sido modificado químicamente de manera que aún recuerda al factor IXa (y por lo tanto, puede competir con el factor IXa nativo) , pero el cual carece de su actividad. Esto puede "sobrepasar" o causar una inhibición competitiva de la vía normal de factor IXa dependiente de la coagulación. Debido a que el factor IXa se une al endotelio y plaquetas y tal vez a otros sitios, el bloqueo de la actividad del factor IXa también puede llevarse a cabo al administrar agentes los cuales interfieren con la unión del factor IXa (o por medio de interferencia con la activación del factor IX) . En el ataque y en otros trastornos isquémicos, puede haber un beneficio clínico suministrado al lisar un trombo existente, pero también existe la complicación potencialmente debastadora de hemorragia. En los experimentos actuales, se utilizó el modelo de ratón de isquemia cerebral y reperfusión (ataque) . Los ratones recibieron un bolo intravenoso de 300 µg/kg de factor kg del factor IXai justo antes de la cirugía. Se generaron ataques por oclusión intraluminal de la arteria cerebral media derecha. Cuando los resultados del ataque se midieron 24 horas después, los animales que habían recibido factor IXai presentaban volúmenes de infarto más pequeños, perfusión cerebral mejorada, menos déficit neurológicos y mortalidad reducida en comparación con los controles experimentaron la misma cirugía pero los cuales no recibieron factor IXai . También se hace notar que los animales con factor IXai estaban libres de hemorragia intracerebral aparente. En contraste, la hemorragia intracerebral se observaba ocasionalmente en los animales control quienes no recibieron factor IXai . Tabla II Control Experimental Ejemplo 10: Exacerbación de daño cerebral en ratones quienes expresan el gen para P-selectina; Identificación del bloqueo de P-selectina como un nuevo ob tivo para el tratamiento de ataques Extracto: Actualmente existe un hueco terapéutico notable para el tratamiento del desarrollo de los ataques. Aunque la P-selectina se expresa rápidamente por células endoteliales hipóxicas in vitro, aún permanece sin explorar la importancia funcional de la expresión de P-selectina en los ataques. Con el fin de identificar las consecuencias patofisiológicas de la expresión de P-selectina y para identificar el bloqueo de P-selectina como un nuevo enfoque potencial para el tratamiento de los ataques, se realizaron experimentos utilizando un modelo de ratón de isquemia focal y reperfusión. La expresión temprana de P-selectina en la corteza cerebral postisquémica se demostró por la acumulación específica de IgG radiomarcada contra P-selectina de ratón, con una expresión aumentada de P-selectina localizada en las células endoteliales icrovasculares cerebrales ipsilaterales por inmunohistoquímica. En experimentos diseñados para probar la significancia funcional de la expresión aumentada de P-selectina en el ataque, se demostró que la acumulación de neutrófilos en la corteza isquémica de ratones que expresan el gen para P-selectina (PS +/+) es significativamente mayor que en los ratones homocigotos carentes de P-selectina (PS -/-) . El flujo de entrada reducido de neutrófilos está acompañado por un mayor reflujo cerebral postisquémico (medido por doppler láser) , en los ratones PS -/-. Además, los ratones PS -/- demostraron volúmenes de infarto más pequeños (reducción de cinco veces, p < 0.05) y una supervivencia mejorada en comparación con los ratones PS +/+ (88% vs . 44%, p <z 0.05) . El bloqueo funcional de P-selectina en ratones PS +/+ utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra P-selectina de ratón también mejoró el reflujo temprano y el resultado posterior al ataque, en comparación con los controles, con volúmenes dé infarto cerebral reducidos observados incluso cuando el anticuerpo bloqueador se administraba después de la oclusión de la arteria cerebral media. Estos datos son los primeros en demostrar un papel patofisiológico para P-selectina en el ataque, y sugieren que el bloqueo de P-selectina puede representan un nuevo objetivo terapéutico para el tratamiento de ataques.
INTRODUCCIÓN: El ataque isquémico constituye la tercera causa principal de muerte actualmente en los Estados Unidos1. Hasta muy recientemente, no ha habido un tratamiento directo para reducir el daño tisular cerebral en el desarrollo de un ataque. Aunque los estudios de ataque agudo NINDS2 y ECASS3 y rt-PA2+ han sugerido que existen beneficios terapéuticos potenciales de la reperfusión temprana4, la mortalidad aumentada observada después del tratamiento con estreptocinasa de ataque isquémico agudo5 aclara el hecho evidente de que hasta la fecha no hay un tratamiento claramente efectivo para un ataque en desarrollo. Este vacío el armamento médico actual para el tratamiento de ataque ha llevado a números enfoques inovadores6, aunque diferentes de rt-PA, ninguno ha alcanzado beneficios clínicos. Para identificar un tratamiento potencial seguro y eficaz para un ataque en desarrollo, nos hemos enfocado en el papel dañino de los neutrófilos reclutados. En trabajo reciente en un modelo en ratón de ataque reperfundido ha demostrado que la supresión de neutrófilos (PMN) antes del ataque minimiza el daño al tejido cerebral y mejora el resultado funcional7,- los ratones los cuales carecen de la molécula de adhesión celular específica, ICAM-l están protegidos de manera similar7. P-selectina, una molécula la cual puede ser translocada rápidamente a la superficie endotelial hipóxica de los sitios de almacenamiento formados previamente8, es un mediador temprano importante del reclutamiento de neutrófilos9, lo cual facilita la supresión de neutrófilos mediada por ICAM-l. Aunque P-selectina se expresa en el ataque a primates10, se desconoce la significancia funcional de la expresión de P-selectina en el ataque. Para explorar el papel patofisiológico de P-selectina en el ataque, utilizamos un modelo de ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión11 utilizando tanto ratones de tipo silvestre como ratones los cuales son homocigotos carentes del gen para P-selectina9, y una estrategia de administración de un anticuerpo que bloquea funcionalmente a P-selectina. En estos estudios, confirmamos no solo que la expresión de P-selectina posterior a la oclusión de la arteria cerebral media está asociada con el reflujo cerebral reducido posterior a reperfusión y a un resultado empeorado posterior al ataque, sino que el bloque de P-selectina confiere un grado significativo de protección cerebral postisquémica. Estos estudios representan la primera demostración del papel patofisiológico de la expresión de P-selectina en el ataque, y sugieren la existente posibilidad de que las estrategias contra P-selectina pueden demostrar utilidad para el tratamiento de ataque reperfundido .
MÉTODOS: Ratones : Se realizaron experimentos con ratones transgénicos deficientes en P-selectina creados como se ha reportado previamente9 por objetivo de genes en células pluripotenciales embriónicas Jl, inyectadas en blastocistos C57BL/6 para obtener una línea germinal de transmisión, y se retrocruzo para obtener ratones homocigotos carentes de P-selectina (PS -/-) . Los experimentos se realizaron con ratones primos PS -/- o tipo silvestre (PS +/+) de la tercera generación de retrocruzamientos con ratones C57BL/6J. Los animales que tenían 7 a 12 semanas de edad y que pesaban entre 25-36 gramos en el momento de los experimentos. Debido a que se han reportado variaciones en la anatomía cerebrovascular que resultan en diferencias en la susceptibilidad a ataque experimental en ratones12, se realizó una tinción con tinta india/negro de carbón para visualizar el patrón vascular del círculo de Willis tanto en ratones PS -/- como en PS +/+. Estos experimentos demostraron que no hay diferencias anatómicas grandes en el patrón vascular de la circulación cerebral .
Oclusión transitoria de la arteria cerebral media: Se_anestesió a los ratones (0.3 ce de 10 mg/cc de quetamina y 0.5 mg/cc de xilazine, i.p.) y se colocaron en posición supina sobre una superficie operada controlada rectal (Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH) . Se mantuvo la temperatura del núcleo del animal a 37 ± IoC intraoperativamente y durante 90 minutos postoperatoriamente. Se produjo una incisión en la línea media del cuello para exponer la cubierta de la carótida derecha bajo el microscopio de operación (16-25X de aumento zoom, Zeiss, Thornwood, NY) . Se aisló la arteria carótida común con un hilo de seda 4-0 y se aislaron y dividieron cada una de las arterias occipital, pterigopalatina y carótida externa. Se llevó a cabo la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) al hacer avanzar una sutura de nylon de 13 mm, roma con calor 5-0. ía- un muñón de la carótica externa. Después de la colocación de la sutura de oclusión, el muñón de la arteria carótida externa se cauterizó y la herida se cerro. Después de 45 minutos, la sutura de oclusión se extrajo para establecer reperfusión. Estos procedimientos han sido descritos previamente con detalle11.
Medición del flujo sanguíneo cortical cerebral : Se realizaron mediciones transcraneales del flujo sanguíneo cerebral utilizando doppler láser (Perimed Inc. , Piscataway, NJ) , como se ha descrito previamente13. Utilizando una sonda doppler láser recta de 0.7 mm (modelo #PF303, Perimed, Piscataway, NJ) y marcas publicadas previamente (2 mm posterior al bregma, 6 mm a cada lado de la línea media)11, se realizaron como se indicó mediciones relativas del flujo sanguíneo cerebral; inmediatamente después de la anestesia, 1 y 10 minutos después de la oclusión de la arteria cerebral media, así como después de 30 minutos, 300 minutos y 22 horas de reperfusión. Los datos se expresaron como la proporción de la intensidad de señal doppler de la parte isquémica comparada con el hemisferio no isquémico. Aunque este método no cuantifica el flujo sanguíneo cerebral por gramo de tejido, el uso de mediciones de flujo doppler láser en puntos indicados anatómicos definidos con precisión sirve como un medio para comparar en los flujos sanguíneos cerebrales en el mismo animal de manera seriada con respecto al tiempo. Se consideró que el procedimiento quirúrgico fue técnicamente adecuado si se observaba _> 50% de reducción en relación al flujo sanguíneo cerebral inmediatamente después de la colocación de la sutura de oclusión intraluminal. Estos métodos han sido utilizados en estudios previos7,11.
Preparación y administración de proteínas marcadas con 125I y neutrófilos de ratón marcados con X11ln: Se prepararon como sigue anticuerpos radioyodados. Se radiomarcaron IgG de rata contra P-selectina de ratón, monoclonal (clona RB 40.34, Pharmingen Co . , San Diego, CA)14, e IgG de rata no inmune (Sigma Chemical Co . , St . Louis, MO) con 125I por el método de lactoperoxidasa utilizando Enzymobeads (BIO-Rad, Hercules, CA) . Se prepararon PMN radiomarcados de la siguiente manera. Sangre c tratada de ratones tipo silvestre se diluyó 1:1 con NaCl (0.9%) seguido por ultracentrifugación en gradiente en Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Pisctaway, NJ) . Posterior a la lisis hipotónica de eritrocitos residuales (20 segundos de exposición a H20 destilada seguido por reconstitución con NaCl al 1.8%), se suspendieron los PMN en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Los neutrófilos (5-7.5 x 106) se suspendieron en PBS con 100 µCi de oxina111 indio y se sometieron a agitación suave durante 15 minutos a 37°C. Después de lavar con PBS, los PMN se sedimentaron suavemente (450 x g) y se resuspendieron en PBS hasta una concentración final de 1.0 x 106 células/ml.
Calculo de los volúmenes <_1= infarto; Después del examen neurológico, los ratones fueron anestesiados y se obtuvo mediciones de flujo sanguíneo cerebral final. Se realizó eutanasia sin sufrimiento por decapitación, y se removieron los cerebros y se colocaron en una matriz de cerebro de ratón (Activational Systems Inc., Warren, MI) para cortes de 1 mm. Las secciones se sumergieron en cloruro de 2 , 3 , 5-trifenil-2H-tetrazolio al 2% en solución salina amortiguada con fosfato al 0.9%, se incubaron durante 30 minutos a 37°C y se colocaron en formalina al 10%16. El cerebro infartado se visualizó como un área de tejido no teñido. Se calcularon los volúmenes de infarto a partir de las secciones en serie planimetradas y se expresaron como el porcentaje de infarto en el hemisferio ipsilateral. Este método de calcular volúmenes de infarto ha sido utilizado previamente por nuestro grupo7'11, y otros16'17, y se ha correlacionado con los otros índices funcionales de resultado posterior al ataque, los cuales se describen antes.
Administración de anticuerpos no marcados. PMN radiomarcados y anticuerpos radiomarcados : Para experimentos en los cuales se administraron anticuerpos no marcados, se utilizaron uno de dos tipos diferentes de anticuerpos; ya sea IgG de rata contra P-selectina de ratón monoclonal (clona RB40.34, Pharmingen Co . , San Diego, CA)14,18,19 o IgG de rata no inmune (Sigma Chemical Co . , St. Louis, MO) . Los anticuerpos se prepararon como 30 µg en solución salina amortiguada con fosfato que contiene albúmina sérica bovina al 0.1%, la cual después se administró en la vena del pene 10 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media. En experimentos separados, se inyectaron intravenosamente anticuerpos radiomarcados (0.15 ml , ~ . 6 c 105 cpm/µl) 10 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media. En un tercer conjunto de experimentos, se administraron los PMN radiomarcados intravenosamente 10 minutos antes de la oclusión de la arteria cerebral media, como 100 µl de inyección (los PMN radiomarcados se mezclaron con solución salina fisiológica hasta un volumen total de 0.15 ml ; «3 x 106 cpm/µl) . Para experimentos en los cuales se administraron anticuerpos no marcados, se indicaron en el texto el tiempo en el cual se realizaron las mediciones, utilizando los métodos descritos antes para determinar el flujo sanguíneo cerebral, los volúmenes de infarto y la mortalidad. Para aquellos experimentos en los cuales se administraron anticuerpos radiomarcados o PMN radiomarcados, los ratones fueron sacrificados en los puntos de tiempo indicados y los cerebros se extrajeron de inmediato y se dividieron en hemisferios ipsilateral (postisquémicos) y contralateral. La deposición de anticuerpos radiomarcados o neutrófilos se midió y expresó como ipsilateral/contralateral cpm.
Inmunohistoquímica : Se removieron los cerebros a 1 hora posterior a la oclusión de la arteria cerebral media, se fijaron en formalina al 10%, se incrustaron en parafina y se seccionaron para inmunohistoquímica. Las secciones se tiñeron con anticuerpo de conejo contra P-selectina humana policlonal purificada por afinidad (dilución 1:25, Pharmigen, San Diego, CA) , y se visualizaron los sitios de unión de anticuerpo primario utilizando IgG de chivo contra conejo, conjugado con biotina (1:20) detectados con ExtrAvidin peroxidasa (Sigma Chemical_ Co . , St . Louis) .
Análisis de Datos: Se compararon el flujo sanguíneo cerebral, el volumen de infarto y la deposición de 11:LIn-PMN utilizando la prueba t de Student para variables no pareadas. Se realizó ANOVA (análisis de varianza) de dos colas para probar las diferencias significativas entre la línea de base y la deposición final de anticuerpos (30 min) entre los dos grupos (experimental versus en falso) . Se realizó la prueba t de Students para variables no pareadas, para evaluar diferencias dentro del grupo (línea de base versus el punto en el tiempo a los 30 min) . Las diferencias de supervivencia entre grupos se probó utilizando análisis de contingencia con la estadística de Chi cuadrada. Los valores se expresaron como media ±. SEM, con un valor p < 0.05 considerado como estadísticamente significativo.
RESULTADOS Expresión de P-selectina en ataque en ratones: Debido a que P-selectina media la fase inicial de adhesión de leucocitos a células endoteliales activadas20, examinamos la expresión temprana cerebral de P-selectina en un modelo de ratón de ataque reperfundido. Se administró a los ratones una IgG de rata monoclonal contra P-selectina de ratón, marcada con 125I antes de cirugía lo que demostró un incremento de 216% en la acumulación de anticuerpo a los 30 minutos de reperfusión, en comparación con los animales operados en falso (p < 0.001, Figura 31A) . Para demostrar que este grado de deposición de anticuerpo en el hemisferio reperfundido es debido a la expresión de P-selectina en vez de acumulación no específica, se realizó la comparación con animales tratados de manera idéntica a los que se les administró IgG no inmune de rata marcada con 125I. Estos experimentos demostraron que hay una acumulación significativamente mayor en la IgG contra P-selectina en comparación con la IgG no inmune (p < 0.025, Figura 31A) , lo que sugiere que la P-selectina se expresa en el cerebro en los siguientes 30 minutos de reperfusión. El examen de secciones de tejido de cerebro inmunoteñidas con P-selectina revela que la expresión de P-selectina se localiza principalmente en las células endoteliales microvasculares en la corteza cerebral ipsilateral (Figura 31B) .
Acumulación de neutrófilos en ataque en ratones: Para delinear el curso de tiempo sobre el flujo de entrada de PMN que se produce después de un ataque, se midió la acumulación de PMN marcados 11:LIn en ratones tipo silvestre (PS +/+) antes de MCAO, inmediatamente después y a los 10 minutos después de MCAO, y a los 30 minutos, 300 minutos y 22 horas de reperfusión. En ratones PS +/+, la acumulación de PMN comienza temprano posterior al inicio de isquemia focal, y continúa durante el período de reperfusión (Figura 31C) . Para establecer el papel de P-selectina en esta acumulación postisquémica de neutrófilos, se realizaron experimentos utilizando ratones en donde fueran homocigotos carentes del gen para P-selectina (PS -/-) . Los ratones PS -/-mostraron acumulación significativamente reducida de PMN posterior a la oclusión de la arteria cerebral media y reperfusión (Figura 31B) .
Papel de P-selectina en la carencia de reflujo cerebrovascular : Para determinar si la reducción en la acumulación de PMN en ratones PS -/- resulta en un flujo sanguíneo cerebral mejorado posterior al restablecimiento del flujo, se obtuvieron mediciones en serie del CBF relativo por doppler láser en ratones tanto PS +/+ como PS -/-. Antes del inicio de la isquemia (Figura 32, punto a) , los flujos sanguíneos cerebrales relativos fueron casi idénticos entre grupos. La oclusión de la arteria cerebral media (Figura 32, punto b) se asocio con una disminución casi idéntica en el flujo sanguíneo cerebral en ambos grupos. Inmediatamente antes de extracción de la sutura de oclusión intraluminal a los 45 minutos de isquemia (Figura 32, punto c) , los flujos sanguíneos cerebrales se han incrementado ligeramente, aunque permanecen significativamente deprimidos en comparación con los flujos de línea de base. Inmediatamente posterior a la extracción de la sutura de oclusión para iniciar la reperfusión (Figura 32, punto d) , los flujos sanguíneos cerebrales en ambos grupos se incrementaron en un grado comparable («60% de línea de base en los ratones PS -/- y PS +/+) . La falla inmediata de los flujos sanguíneos cerebrales posteriores a reperfusión para alcanzar los niveles previos a la oclusión es característico de la carencia de reflujo cerebrovascular21, con declinación subsecuente en los flujos sanguíneos cerebrales posteriores a reperfusión representando la hipoperfusión cerebral postisquémica retardada22. Por 30 "minutos de reperfusión (Figura 32, punto e) , los flujos sanguíneos cerebrales entre los dos grupos de animales se separaron, los animales PS -/- demostraron flujos sanguíneos cerebrales relativos significativamente mayores en comparación con los controles PS +/+. (Figura 32, punto f) . Esta separación o divergencia reflejó diferencias significativas en la hipoperfusión postisquémica retardada, y persistió durante el período de observación de 22 horas.
Resultado posterior al ataque: Se probó la importancia funcional de la expresión de P-selectina al comparar los índices de los resultados posteriores a ataque en ratones PS -/- con respecto a los controles PS +/+. Los ratones PS -/- estuvieron protegidos de manera significativa de los efectos de isquemia cerebral focal y reperfusidn, en base en una reducción de 77% en el volumen de infarto (p z 0.01) en comparación con los controles de P-selectina +/+ (Figura 33A) . Esta reducción en el volumen de infarto fue acompañada por supervivencia aumentada en los animales PS -/- (p z 0.05; Figura 33B) .
Efecto del bloqueo de P-selectina: Después de haber observado el papel funcional de la expresión de P-selectina en el ataque utilizando ratones mutantes por supresión, se realizaron experimentos para determinar si el bloqueo farmacológico de P-selectina puede mejorar el resultado posterior a ataque en ratones PS +/+. Mediante la utilización de una estrategia de administración de un anticuerpo de rata contra P-selectina de ratón monoclonal bloqueador funcionalmente (clona RB 40.3414'18,19= o IgG de rata control no inmune inmediatamente antes de la cirugía, los animales que recibieron el anticuerpo bloqueador inmediatamente antes de la oclusión de la arteria cerebral media se observo que obtuvieron flujos sanguíneos cerebrales postreperfusión mejorados a los 30 minutos, así como volúmenes de infarto cerebral reducidos y una tendencia hacia mortalidad reducida en comparación con los controles (Figura 34, 6 barras más a la izquierda) . Para incrementar la relevancia química potencial de una estrategia de bloqueo de P-selectina como un tratamiento nuevo para ataques, se realizaron experimentos adicionales en los cuales el anticuerpo control o el de bloqueo se administraron después de oclusión intraluminal de la arteria cerebral media (debido a que la mayor parte de los pacientes presentan posterior al inicio del ataque) . En estos estudios, se observó una reducción significativa de los volúmenes de infarto así como una tendencia hacia un flujo sanguíneo cerebral mejorado (Figura 34, 6 barras más a la izquierda) .
DISCUSIÓN: Pese al progreso sustancial en años recientes en la prevención primaria de ataques1, las opciones terapéuticas para tratar un ataque que se está desarrollando, son extremadamente limitadas. Aunque la publicación de dos ensayos fundamentales el último otoño demuestra una morbilidad reducida posterior al tratamiento de ataque isquémico con rt-PA2,3 el cual se considera un preámbulo para una nueva era de terapia trombolítica en el tratamiento de los ataques4, en entusiasmo ha sido templado en cierta medida por la transformación hemorrágica y la mortalidad aumentada que se observa a pacientes con ataque isquémicos tratados con estreptocinasa5. Estos ensayos divergentes se vuelven más críticos que nunca en la medida en que se han desarrollado nuevas terapias seguras para tratar un ataque en desarrollo. Aunque el restablecimiento del flujo sanguíneo al cerebro postisquémico proporciona oportunidades nuevas para una intervención terapéutica temprana, la reperfusión es una espada de doble filo. Dado el potencial citotóxico de los neutrófilos23, no es sorprendente que el flujo de entrada de neutrófilos al tejido cerebral postisquémico pueda generar más daño y empeorar el resultado posterior a ataque experimental7,24"27. Utilizando un modelo de ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión, recientemente hemos identificado un papel contribuyente importante para la molécula de adhesión celular ICAM-l en la acumulación de neutrófilos a las 22 horas posterior al ataque'7. Sin embargo, la expresión de ICAM-l endotelial cerebrovascular aumentada requiere eventos transcripcionales y traduccionales de novo , los cuales requieren tiempo. En contraste, la P-selectina, una glicoproteína distribuida en la membrana la cual media las fases más temprana de la adhesión de neutrófilos, puede ser movilizada de sus acumulados de almacenamiento preformados para expresarse rápidamente en la superficie de la célula endotelial isquémica8,28. En la medida en que los ensayos clínicos de terapia trombolítica para el ataque demuestran un intervalo de tiempo estrecho para beneficio potencial (en las siguientes primeras horas del inicio del ataque)2,3,5, esto sugiere que las estrategias diseñadas para interferir con las fases más tempranas de la adhesión de los PMN puede ser de beneficio teórico en un ataque en humanos. Estos ensayos pueden resultar en números más elevados de pacientes que se presenten para intervención terapéutica temprana, lo que incrementa la necesidad de resolver el tema del daño por reperfusión en territorios inmediatamente revascularizados .
Además, subrayan la necesidad cada vez mayor de comprender las contribuciones de las moléculas de adhesión individuales a la patogénesis del ataque. Dado el considerable cuerpo de literatura que describe el papel de P-selectina en otros modelos de isquemia y reperfusión8'29"32, sorpredentemente se conoce poco acerca del papel de P-selectina en el ataque. El conocimiento del papel específico de P-selectina en la vasculatura cerebral es importante debido a que los requerimientos de molécula de adhesión varían entre lechos vasculares y condiciones bajo estudio. Por ejemplo, en un modelo de trasplante intestinal33, los anticuerpos contra P-selectina no reducen el daño por reperfusión, mientras que los anticuerpos contra CD11/CD18 si lo hacen. Aunque el bloqueo de P-selectina no es efectivo para reducir la adhesión de PMN y la fuga de albúmina en el modelo de isquemia mesentérica y reperfusión en rata, el bloqueo de ICAM-l fue efectivo34. En el modelo de isquemia/reperfusión del miembro trasero en rata, los requerimientos de selectina por adhesión de PMN difieren entre los lechos vasculares pulmonar y del músculo crural31. Hasta nuestro conocimiento, el único estudio publicado que describe la expresión aumentada de P-selectina en el cerebro isquémico es una descripción histopatológica del ataque en primates, en el cual se incremento la expresión de P-selectina en la microvasculatura lenticuloestriada10. Se llevaron a cabo estudios actuales para estudiar si la expresión de P-selectina contribuye a la acumulación de neutrófilo cerebral postisquémica, la carencia de reflujo y el daño a tejido en un modelo en ratón de ataque reperfundido. Utilizando un modelo establecido recientemente de isquemia cerebral focal y reperfusión en ratones11, se demostró la expresión de P-selectina por inmunotinción endotelial aumentada y deposición aumentada de anticuerpo radiomarcado en el territorio isquémico. En esta última técnica, se normalizó la deposición de anticuerpo en el hemisferio isquémico, en comparación con el hemisferio no isquémico en cada animal, no solo para minimizar las variaciones potenciales en el volumen de inyección o el volumen de distribución, sino para permitir la comparación entre animales dados cuerpos diferentes. Debido a la interrupción de la barrera endotelial en la corteza isquémica lo que puede aumentar la deposición no selectiva de anticuerpos, se realizaron experimentos similares con IgG de rata control. Estos datos muestran que el anticuerpo el cual se une a P-selectina se deposita a velocidad acelerada en comparación con el anticuerpo control, lo que sugiere que la expresión local de P-selectina está aumentada en el tejido reperfundido. Estos datos en el modelo en ratón son paralelos a los reportados en el modelo de babuino de ataque10, en el cual, se incremento la expresión de P-selectina en la siguiente 1 hora posterior al fenómeno isquémico. Se demostró el papel de la expresión P-selectina en el reclutamiento de los PMN a la zona postisquémica utilizando una estrategia en la cual se midió la acumulación de los PMN marcados con ?:L1In. Aunque hemos reportado previamente que a las 22 horas, la acumulación de PMN se eleva en el hemisferio isquémico7, los datos actuales del curso en el tiempo demuestran que la acumulación de PMN comienza poco después del acceso de isquemia. El fallo de expresar el gen para P-selectina se asocio con una acumulación reducida de PMN, lo que sugiere la participación de P-selectina en el reclutamiento del PMN cerebral postisquémico. Sin embargo, los animales carentes de P-selectina demostraron una acumulación modesta (aunque menor al control) de neutrófilos a las 22 horas. Estos datos indican que la P-selectina no es el mecanismo reflector exclusivo responsable del reclutamiento de PMN cerebral postisquémico, y es consiste con nuestros datos previos de que ICAM-l también participa en la adhesión postisquémica de los PMN7. Además, estos datos.no son diferentes a aquellos en los cuales la instilación intraabdominal de tioglicolato en ratones deficientes de P-selectina causa reclutamiento retardado (pero no ausente) de PMN9. Debido a la necesidad crítica de identificar razones para reperfusión fallida, los estudios actuales examinaron el papel de P-selectina en la hipoperfusión cerebral postisquémica retardada21,22, el fenómeno en el que el flujo sanguíneo declina durante la reperfusión, pese al restablecimiento de presiones adecuadas de perfusión. En modelos cardíacos de carencia de reflujo en isquemia empeora conforme transcurre el tiempo después de la reperfusión35, lo que sugiere un papel importante para los mecanismos efectores reclutados, tales como trombosis microcirculatoria progresiva, disfunción vasomotora y reclutamiento de PMN. En otros modelos se ha demostrado que las reacciones de adherencia dependientes tanto de P-selectina como de ICAM-l36 y el taponamiento capilar por PMN37 participan en la carencia de reflujo postisquémica. En cerebro, se ha implicado a los PMN en la carencia de reflujo cerebral postisquémica38,39, pero no se ha dilucidado previamente el papel de P-selectina. El estudio actual utiliza una técnica relativamente no invasiva (doppler láser) para obtener mediciones en serie del flujo sanguíneo cerebral relativo, con el fin de establecer la existencia, curso en el tiempo y dependencia de P-selectina de la carencia de reflujo cerebrovascular postisquémico. Con el fin de demostrar que el procedimiento de cocido en si mismo no es la causa de daño vascular y del infarto cerebral subsecuente, se realizaron experimentos de isquemia en falso (n = 10) en los cuales la sutura de nylon se coció en el interior de la arteria carótida interna durante un período sin oclusión de 45 minutos. En estos experimentos, se demostró que el cocido no es oclusivo en base en la carencia de declinación en perfusión por doppler láser durante el período de 45 minutos. Posteriormente, cuando los cerebros se recolectaron y finieron con TTC a las 24 horas, ninguno mostraba evidencia de infarto cerebral. Por lo tanto, podemos concluir que el procedimiento de cocido per se no provoca daño suficiente para afectar nuestras variables principales de resultado. Cuando se examinó el flujo sanguíneo cerebral relativo posterior a la oclusión de la arteria cerebral media franca en animales experimentales, observamos que los animales carentes de P-selectina y control sometidos a grados virtualmente idénticos de isquemia (hubo una disminución inicial -4.5 veces en el flujo sanguíneo cerebral relativo posterior a la oclusión de la arteria cerebral media en ambos) . Sin embargo, hubo un ligero incremento en el flujo sanguíneo cerebral relativo en los primeros 10 minutos posterior a oclusión, aunque la sutura de oclusión permanecía en su lugar. Esta es una observación empírica que hemos hecho consistentemente, para la cual existen probabilidades de varias explicaciones posibles. Existe la probabilidad de que cierto grado de flujo colateral el cual se abre en el territorio isquémico. Otra explicación pertinente es que puede haber un elemento de vasoespasmo inicial en la región de la punta de catéter oclusora, la cual se remueve modestamente en los siguientes minutos. Aunque son posibles ambas explicaciones, debido al tamaño pequeño de la vasculatura de ratón, no podemos identificar el mecanismo con certeza en nuestro modelo. No obstante, en la medida en que hemos observado el mismo grado de reclutamiento de flujo en animales tanto control como experimentales, estos datos no alteran nuestras conclusiones principales de que P-selectina es un mediador importante del daño a tejido cerebral en ataque reperfundido.
Después de la remoción de la sutura de oclusión intraluminal, la recuperación instantánea del flujo sanguíneo fue la misma en animales tanto P-selectina +/+ como -/-. El hecho de que los niveles de flujo nunca regresaran a la línea de base (ni hubiera un sobrepasado, como se puede observar con hiperemia reactiva) puede ser debido a la gravedad y duración del período isquémico, el cual es probable que reclute otros mecanismos de carencia de reflujo cerebrovascular postisquémica, tales como trombosis o reclutamiento de neutrófilos causado por mecanismos que no dependen de selectina. Cuando, incluso, en puntos de tiempo posteriores son examinados (tales como 30 minutos a 22 horas después de la remoción de la sutura de oclusión) , es interesante notar que existe una ligera declinación en el flujo sanguíneo cerebral en los animales P-selectina -/-. Esta declinación tardía (aunque limitada) en el flujo sanguíneo cerebral a las 22 horas es consistente con el reclutamiento modesto de PMN observado en los animales PS -/- durante el mismo período, lo que sugiere nuevamente el reclutamiento o activación de otros mecanismos efectorés que limiten el flujo (tales como ICAM-l) en animales PS -/-. Los efectos funcionales de la expresión de P-selectina son evidentes a partir del conjunto actual de estudios: los animales los cuales fallan en expresar el gen para P-selectina (o animales PS +/+ tratados con un anticuerpo contra P-selectina funcionalmente bloqueador) muestran infartos más pequeños y una supervivencia mejorada en comparación con los controles. Cuando se consideran estos datos junto con los datos publicados previamente que demuestran un papel dañino para la expresión de ICAM-l en el ataque7, se vuelve cada vez más evidente que existen medios múltiples para reclutar a los PMN a la corteza cerebral postisquémica y que el bloqueo de cada uno representa una estrategia potencial para mejorar el resultado posterior a ataque en humanos. Dado nuestro reconocimiento actual de la importancia de la reperfusión en tiempo para detener el avance de la onda frontal de la muerte neuronal posterior a ataque, la interferencia con la adhesión de los PMN en sus etapas más tempranas parece ser una opción atractiva para reducir la morbilidad y mortalidad. De hecho, las estrategias contra la adhesión de moléculas pueden no solo ser benéficas por si mismas (es decir, que incluye a pacientes inelegibles para trombolísis) sino que puede extender el intervalo de oportunidades para intervención trombolítica40. El conjunto actual de estudios contribuye a nuestra comprensión de los mecanismos aptofisiológicos que operan en el ataque reperfundido. Estos estudios sugieren la necesidad por ensayos clínicos de terapias para el ataque en desarrollo las cuales optimicen el ambiente de reperfusión para reducir la acumulación de PMN.
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Ejemplo 11: Uso de monoxido de carbono para tratar un trastorno isquémico-Ejeirplo de efectos protectores del monoxido de carbono en la isquemia pulmonar En la solicitud de patente inicial, mostramos datos que indican que la producción endógena de monóxido de carbono o la administración de monóxido de carbono exógeno es benéfico para proteger al cerebro contra daño isquémico subsecuente. Como otro ejemplo del uso de monóxido de carbono en el tratamiento de trastornos isquémicos, administramos monóxido de carbono a ratas para probar sus efectos sobre la preservación mejorada de los pulmones para trasplante (esto es similar a un trastorno isquémico, debido a que los pulmones del donador se remueven del receptor, durante el período en el cual los pulmones se preservan y transfieren desde el donador al receptor, existe una interrupción del flujo sanguíneo.
Métodos para probar el efecto del monóxido de carbono sobre la preservación del pulmón: Materiales utilizados para preparar solución de preservación: Para todos los experimentos, la solución de preservación base consistió de solución Euro Collins modificada (EC) (Na* 10 mEq/1, K+ 115 mEq/1, Cl" 15 mEq/1, H2P04" 85 mEq/1, H2P04" 15 mEq/1, HC03" 10 mEq/1) .
Recolección, preservación y trasplante de pulmón: Se utilizaron ratas Lewis macho endogámicas (250-300 g) para todos los experimentos de acuerdo con un protocolo aprobado por Institutional Animal Carea and Use Committee en la Universidad de Columbia, de acuerdo con las líneas de guía establecidas por el American Academic for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) . Los experimentos de trasplante de pulmón se realizaron de la siguiente manera. A ratas donadores se les administró 500 unidades de heparina intravenosamente, y se drenó la arteria pulmonar (PA) con un volumen de 30 ml de solución de preservación a 4°C, a una presión constante de 20 mmHg. Cuando los pulmones se preservan de esta manera, la mayor parte de la solución de lavado infundida sale de la ventilación arqueal izquierda creada por el pulmón donador, así como la salida de las venas pulmonares posteriores a la transección. El pulmón izquierdo se cosecha o extirpa, se coloca un puño en cada muñón vascular, se inserta un cilindro en el bronquio, y el pulmón se sumergió durante 6 horas en una solución de preservación a 4°C la cual fue idéntica a la solución de lavado de PA. Ratas pareadas en cuanto a género/cepa/tamaño fueron anestesiadas, incubadas y ventiladas con 02 al 100% utilizando un ventilador para roedores (Harvard Apparatus, South Natick, MA) . Se realizó trasplante del pulmón izquierdo ortotópico a través de toracotomía izquierda utilizando una técnica de puño rápido para anastomosis completa, con tiempos isquémicos calientes mantenidos inferiores a 5 minutos. Se liberó la grapa de cruz hilar, se restableció el flujo sanguíneo y la ventilación al pulmón trasplantado. Después se hizo pasar un asa un lazo quirúrgico alrededor de PA derecha, y se introdujeron catéteres Millar (2F; Millar Instruments, Houston, TX) en el PA principal y el atrio izquierdo (LA) . Se coloco una sonda de flujo doppler (Transonics, Ithaca, NY) alrededor del PA principal.
Medición de la función del injerto de pulmón Se llevo a cabo el monitoreo hemodinámico en línea utilizando una computadora MacLab y Macintosh Ilci. Los parámetros hemodinámicos medidos incluían presiones LA y PA (mmHg) y el flujo PA (ml/min) . Se midió la tensión arterial de oxígeno (p02, mmHg) durante la inspiración de 02 al 100% utilizando un analizador de gas modelo ABL-2 (Radiometer, Copenhagen, Dinamarca) . Se calcularon los PVR como (presión media PA - presión LA) /flujo medio PA, y se expresaron como mmHg/ml/min. Después de las mediciones de línea de base, se ligo la PA derecha nativa y se tomaron mediciones en serie cada 5 minutos hasta el momento de eutanasia a los 30 minutos (o hasta la muerte del receptor) .
Administración de monóxido de carbono: En el tiempo indicado antes de la cirugía (4, 8 ó 12 horas) , se colocó a las ratas en una jaula de campana, y se administró monóxido de carbono a diversas concentraciones (0.01%, 0.03% o 0.1%), con el resto de la mezcla de gas constituida de aire ambiente. (El gas se hizo pasar a través de un recipiente de agua antes de la administración, con el fin de humidificario para comodidad del animal) . En los tiempos indicados posteriores al inicio de la exposición, las ratas fueron anestesiadas y los pulmones se recolectaron como se describe en lo anterior. Estos pulmones donadores se utilizaron en experimentos subsecuentes de trasplante de pulmón.
Resultados y Discusión: Los resultados de estos experimentos indicaron que en comparación con los controles no tratados, la inhalación de monóxido de carbono antes de la recolección de los pulmones confiere protección significativa para los pulmones después del trasplante. Esta protección es evidenciada por: (1) oxigenación arterial mejorada de los receptores de pulmones donadores pretratados con monóxido de carbono; (2) flujo sanguíneo arterial pulmonar aumentado (y resistencia vascular pulmonar reducida) con el uso de los pulmones donadores pretratados con monóxido de carbono; y (3) supervivencia mejorada de los receptores de pulmones donadores pretratados con monóxido de carbono en comparación con los controles. Los efectos benéficos del monóxido de carbono fueron dependientes de la dosis, es decir, la mejor protección se observó a la dosis de 0.1%, con un nivel intermedio de protección observado a la dosis de 0.3% y la menor protección se observó a la dosis de 0.01%. Los efectos benéficos del monóxido de carbono también fueron dependientes del tiempo, en donde exposiciones más prolongadas parecen proporcionar la mayor protección. Juntos, estos datos indican que el monóxido de carbono puede proteger en otro trastorno isquémico (isquemia pulmonar) y sugieren que los resultados pueden ser generalizables también a otros trastornos isquémicos.
Ejemplo 12: Uso de un ensayo de hemoglobina espectrofotométrico para cuantificar objetivamente la hemorragia intracerebral en ratones Extracto Antecedentes y Propósito Existe un gran interés en desarrollar estrategias novedosas anticoagulantes o trombolíticas para tratar el ataque isquémico. Sin embargo, hasta la fecha, existen medios limitados para determinar con precisión el potencial hemorrágico de estos agentes. Los estudios actuales fueron diseñados para desarrollar y validar un método para cuantificar con precisión el grado de hemorragia intracerebral en modelos en ratón. Métodos En un modelo en ratón, se indujo hemorragia intracerebral (ICH) por infusión intraparenquimal estereotáctica de colagenasa B sola (6 x 10"6 unidades, n = 5) o colagenasa B seguido por activador de plasminógeno tisular intravenoso (rt-PA, 0.1 mg/kg, n = 6) . Los controles consistieron de cirugía en falso con infusión estereotáctica de solución salina (n = 5) o animales no tratados (n = 5) . La ICH (1) se clasificó por una escala basada en diámetro máximo de hemorragia sobre secciones coronales, y (2) se cuantificó por un ensayo espectrofotométrico midiendo cianometahemoglobina en extractos químicamente reducidos de cerebro de ratón homogeneizado. Este ensayo espectrofotométrico fue validado utilizando cantidades conocidas de hemoglobina o sangre autóloga agregada a una cohorte separada de cerebros homogeneizados . Al utilizar este ensayo, se cuantificó el grado de hemorragia posterior a oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media focal en ratones tratados con dosis elevadas postoclusión de rt-PA IV (10 mg/kg, n = 11) y los ratones control se sometieron a ataque pero fueron tratados con solución salina fisiológica (n = 9) . Resultados Las cantidades conocidas de hemoglobina o sangre autóloga agregada a homogeneizado de tejido de cerebro completo fresco muestran una relación lineal entre la cantidad agregada y la DO al pico de absorbancia de cianometahemoglobina (r = 1.00 y 0.98, respectivamente). Cuando se realizaron estudios in vivo para cuantificar ICH inducida experimentalmente, los animales que recibieron la infusión intracerebral de colagenasa B tuvieron DO significativamente más elevadas en comparación con los controles a los que se les infundió solución salina (incremento de 2.1 veces, p = 0.05) . En un modelo de ataque de oclusión y reperfusión de la arteria cerebral media, la administración de rt-PA después de la reperfusidn incremento la DO en 1.8 veces en comparación con los animales los cuales recibieron solución salina fisiológica (p < 0.001) . Cuando se compararon los dos métodos de medición de ICH (calificación visual y DO) , hubo una correlación lineal (r = 0.88) . Experimentos adicionales demostraron que la tinción con trifeniltetrazolio, la cual se utiliza comúnmente para teñir tejido de cerebro viable, no interfiere con la cuantificación espectrofotométrica de ICH. Conclusiones Estos datos demuestran que el ensayo espectrofotométrico cuantifica con precisión y de manera confiable la ICH en ratón. Este nuevo método puede ayudar a la determinación objetivo de los riesgos hemorrágicos de estrategias novedosas anticoagulantes o trombolíticas para tratar el ataque y puede facilitar la cuantificación de otras formas de hemorragia intracerebral .
Introducción El ataque isquémico constituye la gran mayoría de las presentes de ataque agudo. Por lo tanto, ha habido un interés tremendo en diseñar estrategias las cuales puedan restablecer de manera expedita y efectiva el flujo sanguíneo a la región isquémica del cerebro. Aunque la heparina puede ser efectiva en un ataque incipiente (TÍA)3, su uso durante las fases agudas de ataque se puede asociar con un alto grado de morbilidad y hemorragia intracerebral1"4. Similarmente, a inicios de la década de 1960, los resultados desalentadores en los ensayos de estreptocinasa para ataque agudo llevaron a reductancia de los médicos a trombalizar los ataques agudos durante las tres décadas subsecuentes5,6. Esta reductancia ha sido validada por ensayos recientes en los cuales se ha asociado el uso de estrocinasa con el riesgo aumentado de mortalidad y de hemorragia intracerebral7. Por otra parte, el uso de activador de plasminógeno tipo celular recombinante (rt-PA) para tratar un ataque en progreso ha demostrado ser más promisorio8, con un subconjunto de pacientes con ataque agudo quienes son tratados con rt-PA que demuestran una morbilidad a largo plazo reducida si se tratan en las primeras 3 horas del acceso de los síntomas9"11. Incluso así, otros ensayos utilizando el mismo agente (rt-PA) no han demostrado beneficio o han tenido tasas excesivamente elevadas de ICH9,12"15. Este embrollo confuso de datos clínicos subraya la necesidad urgente de identificar estrategias mejoradas para obtener una reperfusión rápida. Para este fin, es imperativo identificar un modelo experimental en el cual se puedan ponderar objetivamente los beneficios potenciales de la reperfusión a tiempo en un ataque, contra los riesgos de hemorragia intracerebral aumentada. En la mayor parte de los estudios animales de terapia trombolítica para ataque clínico, los riesgos de hemorragia intracerebral se han estimado en vez de ser medidos cuantitativamente16"24. Los estudios actuales fueron diseñados para desarrollar y validar un método para cuantificar con precisión el grado de hemorragia intracerebral en modelos en ratón, con el fin de determinar los riesgos potenciales de nuevos tratamientos anticoagulantes o trombolíticos para ataque agudo, Materiales y Métodos Animales Experimentales En el presente estudio, se adquirieron ratones machos C57BL/6J de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) , y se utilizaron entre 8 y 10 semanas de edad (22-32 g) . Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado institucionalmente y está de acuerdo con las líneas de guía proporcionadas por la American Academy of Accreditatio of Laboratory Animal Care (AAALAC) .
Ensayo espectrofotométrico para hemorragia intracerebral Se cuantificó el contenido de hemoglobina de los cerebros sometidos a los procedimientos experimentales a continuación utilizando un ensayo espectrofotométrico como sigue. Se obtuvo el tejido cerebral completo de animales control o experimentales sometidos a eutanasia reciente, y cada cerebro se trató individualmente como sigue. Se agregó a cada cerebro agua destilada (250 µl) seguido por homogeneización durante 30 segundos (Brinkman Instruments, Inc., Westbury, NY) , sonicación en hielo con un ultrasonicador por pulsos, durante 1 minuto (SmithKline Corporation, Collegeville, PA) , y centtifugación a 13,000 rpm durante 30 minutos (Baxter Scientific Products, Deerfield, IL) . Después de recolectar el sobrenadante que contiene hemoglobina, se agregan 80 µl de reactivo de Drabkin (adquirido de Sigma Diagnostics, St . Louis, MO; K3Fe (CN) 6200 mg/l, JCN 50 mg/l, NaHC03 lg/1, pH 8.625) a una alícuota de 20 ml y se permite que repose durante 15 minutos. Esta reacción convierte la hemoglobina a cianometahemoglobina la cual tiene un pico de absorbancia a 540 nm, y cuya concentración puede ser determinada por la densidad óptica de la solución a =550 nm de longitud de onda26. Para validar la absorbancia medida siguiendo estos procedimientos que reflejan la cantidad de hemoglobina, se realizaron cantidades de hemoglobina de eritrocitos bovinos (Sigma, St . Louis, MO) utilizando procedimientos similares junto con cada ensayo de tejido de cerebro. Como una medida adicional, se obtuvo sangre de ratones control por punción cardíaca posterior a anestesia. Las alícuotas en aumento de esta sangre después se agregaron a tejidos de cerebro homogeneizado fresco obtenido de ratones no tratados para generar una curva de absorbancia estándar.
Hemorragia intracerebral inducida por colagenasa Los procedimientos generales para inducir hemorragia intracerebral en ratón se adaptaron de un método el cual ha sido descrito previamente en ratas27. Después de anestesia con una inyección intraperitoneal de 0.35 ml de quetamina /10 mg/ml) y xilazina (0.5 mg/ml) , se colocó a ratones en posición prona en un armazón de cabeza estereotáctico . Se expuso el calvario por una incisión en la línea media del cráneo desde el nasion hasta la línea nucal superior y después se retrajo lateralmente la piel. Utilizando un taladro de velocidad variable (Dremel, Racine, Wl) , se hizo un agujero de 1.0 mm a los 2.0 mm posterior al pregma y 2.1 mm hacia la parte derecha de la línea media. Se insertó una aguja de angiocatéter calibre 22 única utilizando una guía estereotáctica dentro de los ganglios de la corteza/basal profunda derecha (coordenadas: 2.0 mm posterior, 2,00 mm lateral) . La aguja se unió por tubería plástica a una jeringa de microinfusión y se suministraron por infusión soluciones en el cerebro a una velocidad de 0.25 µl por minuto durante 4 minutos con una bomba de infusión (Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN) . Los animales recibieron: (1) 0.024 µg de colagenasa B (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) en 1 µl de solución salina normal (colagenasa) ; 2) i µl de solución salina normal sola (en falso) ,-(3) sin tratamiento (control) ; o (4) infusión guiada estereotácticamente de colagenasa B como en lo anterior, pero seguida inmediatamente por activador de plasminógeno tisular humano recombinante intravenoso (Genentech Inc., South San Francisco, CA, 1 mg/ml en 0.2 ml de solución salina normal (administrado por inyección en la vena dorsal del pene (Colagenasa + rt-PA) . En los grupos de colagenasa, en falso, y colagenasa + rt-PA, la aguja estereotáctica se removió inmediatamente después de la infusión y la incisión se cerro con grapas quirúrgicas. El tejido cerebral se recolectó de inmediato después de decapitación anestesiada rápida.
Conversión hemorrágica en un modelo de isquemia cerebral focal de ratón Se produjo isquemia cerebral focal en animales por oclusión transitoria de la arteria cerebral media derecha utilizando un método descrito previamente con detalle28,29. Brevemente, se hace pasar una sutura de nylon calibre 5-0 o 6-0 roma por calor de 12 ó 13 mm dentro de la arteria carótida interna derecha hasta el nivel de la arteria cerebral media. Después de 45 minutos, se remueve la sutura de oclusión para restablecer la reperfusión. Inmediatamente después de la remoción de la sutura de oclusión, los animales recibieron activador de plasminógeno tisular intravenoso (10 mg/kg en 0.2 ml de solución salina normal, ataque + rt-PA) o solución salina normal (ataque + solución salina) administrada por inyección en la vena dorsal del pene. A las 24 horas, se recolectó de inmediato tejido cerebral después de decapitación anestesiada rápida. Para evaluar el efecto del cloruro de 2 , 3 , 5-trifeniltetrazolio (TTC), el cual se utiliza comúnmente para diferenciar tejido cerebral infartado de no infartado28,30, se dividieron cerebros no manipulados (control) en la mitad, y se sumergieron en 2% de TTC (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) o en solución salina amortiguada con fosfato al 0.9%, incubado durante 30 minutos a 37°C, y después preparada como se describe antes para el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina. La otra mitad de cada cerebro se sumergió en solución salina durante una duración idéntica y después se sometió a los procedimientos descritos en lo anterior para el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina.
Validación del ensayo de hemorragia intracerebral cuantitativo El grado de ICH primero se clasificó visualmente por un observador quien desconoce el protocolo. Para la calificación visual de la hemorragia intracerebral en el ratón, los cerebros obtenidos de los ratones que habrían sobrevivido al punto de tiempo de 24 horas posterior al procedimiento (hemorragia inducida por colagenasa u oclusión de MCA) se colocaron en una matriz de cerebro de ratón (Activational Systems, Inc., Warren, MI) para obtener secciones coronales en serie de 1 mm. Las secciones se inspeccionaron por un observador quien desconoce el protocolo y a los cerebros se les proporcionó una calificación ICH a partir de una escala graduada basada en el diámetro máximo de hemorragia observado en cualquiera de las secciones (calificación 0 de ICH, sin hemorragia; 1, < 1 mm, 2, 1-2 mm, 3, >2-3 mm; 4, > 3 mm] . Los cortes de cada cerebro después se acumularon, homogeneizaron y después se trataron de acuerdo con los procedimientos descritos en lo anterior para el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina.
Estadística Las correlaciones entre las calificaciones de ICH determinadas visualmente y las de erminaciones espectrofotométricas de ICH se realizaron utilizando la correlación lineal de Pearson, indicándose los coeficientes de correlación. Para establecer si un tratamiento dado (colagenasa, en falso, ataque, etc) tuvo un efecto significativo sobre cualquiera de ICH espectrofotométrico o calificado visualmente, se realizaron comparaciones en una prueba T no pareada de doble cola. Para datos no paramétricos (calificaciones visuales de ICH) , se realizó análisis no paramétrico utilizando la prueba de Mann-Whotney. Los valores se expresan como medias ± SEM, con p < 0.05 considerado como estadísticamente significativo.
Resultados Ensayo espectrofotométrico de hemoglobina Se realizaron estudios iniciales para determinar la confiabilidad y capacidad de reproducción del ensayo espectrofotométrico de hemoglobina. En el primer conjunto de experimentos, se convirtieron cantidades conocidas de hemoglobina a cianometahemoglobina de acuerdo con procedimientos publicados previamente y se midió la DO [Figura 35A)26. En un segundo conjunto de experimentos, se agregaron cantidades conocidas de sangre autóloga a volúmenes fijos de homogeneizado de tejido cerebral fresco, con tratamiento adicional de las muestras como se describe en lo anterior. Estos datos muestran que la densidad óptica de los sobrenadantes que contienen cianometahemoglobina a 550 nm se correlacionan de manera lineal con la cantidad de sangre agregada [Figura 35B] . Estos datos muestran estrechas correlaciones lineales (r = 1.00 y 0.98 para las figuras 35A y 35B, respectivamente) , así como excelente capacidad de reproducción como se calibra por errores estándar relativamente pequeños de la media. Para establecer que TTC (utilizado comúnmente) para distinguir tejido cerebral infartado de no infartado28,30) no afecta el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina, cerebros no manipulados (control) se dividieron a la mitad, en donde cada mitad se sometió al procedimiento estándar de tinción TTC y la mitad se trató con solución salina como un control. Estos datos (comparece la figura 35B, líneas continuas y discontinuas) indica que el tratamiento previo del tejido cerebral TTC no afecta al ensayo espectrofotométrico de hemoglobina. Para determinar si este método es capaz de detectar ICH, se realizó un ensayo en hemorragia intracerebral de ratón causada por dos procedimientos diferentes, infusión intraparenquimal de colagenasa u oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media. En el primer procedimiento, se aplicó colagenasa B como una infusión local a través de la perforación, con el fin de debilitar la pared vascular para promover ICH (grupo colagenasa) . Para incrementar adicionalmente la propensión para, y el grado de ICH, se realizó un procedimiento similar, con administración inmediata de rt-PA posterior al procedimiento (grupo colagenasa + rt-PA) . También se incluyeron dos condiciones control, una operación en falso la cual incluía taladrado de la perforación, pero con instilación de solución salina fisiológica (en falso) , y un grupo no tratado (control) . Estos experimentos demostraron que la infusión de colagenasa incrementa la cantidad de sangre intracerebral detectada por el ensayo espectrofotométrico (especialmente con colagenasa + rt-PA) en comparación con los animales tratados en falso con controles normales [Figura 36A] .
En el segundo método y tal vez el método más relevante clínicamente para inducir ICH, se generó un ataque por oclusión intraluminal transitoria de la arteria cerebral media seguido por reperfusión. Además, intentamos incrementar la propensión por conversión hemorrágica mediante administración de un agente trombolítico. Se estudiaron dos grupos, aquellos los cuales habían recibido solución salina normal o aquellos los cuales recibieron rt-PA intravenosa inmediatamente después de la remoción de la sutura de oclusión intraluminal. Estos datos indican que la adición de agente fibrinolítico posterior a ataque incrementa la cantidad de ICH la cual se detecta por el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina [Figura 36B] . Es interesante hacer notar que la absorbancia de la línea de base es menor en animales sometidos a ataque en comparación con los animales control/no tratados [Figuras 36A y 36B] . Para investigar adicionalmente la manera en que la sangre intravascular residual puede afectar al ensayo espectrofotométrico de hemoglobina, se realizaron experimentos en los cuales, inmediatamente antes de la decapitación del animal para extirpación o recolección del cerebro, se realizó una perfusión cefálica de solución salina fisiológica (administrada vía el ventrículo cardíaco izquierdo) . En animales control (n = 5) los cuales recibieron perfusión salina cardíaca antes de la recolección del cerebro, la densidad óptica posterior a la preparación del tejido y el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina fue de 0.25 + 0.3 (esto es mejor que la densidad óptica observada en animales perfundidos no cardíacos sometidos o no a cirugía en falso (n = 10, DO 0.34 ±. 0.05, p = 0.05 versus controles perfundidos cardíacos) . Por otra parte, después del ataque, no hubo diferencias en la D.O. ya sea que se haya realizado o no la perfusión salina cardíaca (0.15 ± 0.04 para ataque con solución salina cardíaca n = 5; 0.15 ± 0.03 para ataque con perfusión con solución salina cardíaca, P=NS) . Cuando los animales con ataque perfundidos con solución salina se compararon con animales perfundidos con solución salina pero sin ataque, aparentemente hubo una reducción en la DO posterior al ensayo espectrofotométrico de hemoglobina. -Estos datos pueden sugerir que los animales con ataque tienen menos sangre intracerebral detectada, tal vez como resultado de una reducción de la cantidad total de sangre en la región MCA ipsilateral posterior a isquemia.
Calificación visual de ICH Con el fin de validar adicionalmente el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina, lo comparamos con la determinación morfométrica de tamaño de hemorragia, la cual ha sido utilizada tradicionalmente en la literatura31"35. Desarrollamos un sistema de calificación visual (0-4) en el cual un observador quien desconoce el protocolo califica el grado de ICH en secciones cerebrales en serie basado en el diámetro de hemorragia máximo. Esta determinación visual se realizó en una fotografía del cerebro tomada inmediatamente antes de la realización del ensayo espectrofotométrico de hemoglobina [Figura 7] de manera que las dos técnicas pueden correlacionarse en las mismas muestras. Cuando comparamos con controles no sometidos a intervención alguna, los animales que recibieron infusión local en falso (es decir, perforación + solución salina) demuestran únicamente un incremento ligero en la calificación visual de ICH [Figura 38A] . Sin embargo, cuando se agregó colagenasa sola o colagenasa + rt-PA al material infundido, las calificaciones visuales de ICH se incrementaron significativamente [Figura 38 ] . En el modelo de ataque, rt-PA resultó similarmente en un incremento en la calificación visual de ICH [Figura 38B] . Cuando los datos se grafican para mostrar la relación entre la calificación visual de ICH y la técnica espectrofotométrica para cuantificar ICH, se sugirió una relación lineal (r = 0.88), sin embargo, con grados más pequeños de hemorragia (calificaciones visuales de ICH de 0 ó 1) , no se mantuvo esta relación [Figura 39] .
Discusión Recientemente, se ha vuelto evidente que la intervención temprana en el ataque con ciertos agentes trombolíticos intravenosos (rt-PA) puede ser benéfico si se instituye en las siguientes 3 horas al inicio de los síntomas9,10, sin embargo, la administración de agentes trombolíticos fuera de este intervalo terapéutico estrecho puede provocar una incidencia inaceptablemente elevada de ICH devastador (estreptocinasa versus placebo, mortalidad a los 10 días 34.0% versus 18.2%, p = 0.002, mortalidad a los 6 meses, 73% versus 59%, p = 0.06)7. Por lo tanto permanece como un imperativo clínico identificar más agentes adecuados para restablecer la perfusión los cuales estén asociados con menos riesgo de conversión hemorrágica. Con el fin de estudiar agentes nuevos los cuales interfieren con la coagulación o los mecanismos fibrinolíticos, es necesario tener un medio objetivo para cuantificar el riesgo en el lado inferior de ICH. En la literatura experimental, la cuantificación de ICH se ha realizado ya sea por procedimientos radiológicos de formación de imagen32"37, o por estimación visual de la.cantidad de hemorragia en tejido de cerebro postmortem31"35. Estos procedimientos son de utilidad limitada y dependen de las condiciones bajo estudio. Por ejemplo, además de los impedimentos logísticos impuestos por la necesidad de equipo sofisticado, la mayor parte de las técnicas radiológicas de formación de imagen son de uso limitado en modelos en ratón, lo cual puede impedir su uso en la evaluación de ratones transgénicos, una herramienta potencialmente poderosa para estudiar la coagulación los sistemas fibrinolíticos . La estimación visual de ICH es de naturaleza subjetiva y, como lo muestran nuestros propios datos, puede ser relativamente insensible para detección de grados pequeños de ICH. Además, ninguna de las técnicas, radiológica o visual, permite la cuantificación precisa de ICH cuando la región hemorrágica está en forma de parches o es de focos múltiples. Los estudios actuales se llevaron a cabo para desarrollar y validar un método objetivo para cuantificar ICH en animales experimentales. El uso de un ensayo espectrofotométrico para la cuantificación de hemoglobina basado en la conversión de hemoglobina a cianometahemoglobina ha sido reportado previamente26,31. Sin embargo, hasta el mejor de nuestro conocimiento, en el cerebro, únicamente se ha utilizado en ratas para medir el tamaño de un coágulo sanguíneo franco posterior a su remoción de tejido cerebral adyacente31. El ensayo espectrofotométrico que describimos y validamos puede ser utilizado en animales tan pequeños como ratones, lo cual facilita el uso de muchas cepas transgénicas de ratón ahora disponibles (particularmente aquellas con alteraciones en las cascadas trombótica o fibrinolítica) . Además, este ensayo espectrofotométrico permite la cuantificación de ICH incluso cuando existen hemorragias por parches o de focos múltiples, lo cual de otra manera sería de identificar o aislar. Finalmente, en contraste con el estudio de Lee, hemos validado nuestro estudio para determinar su capacidad de repetición y confiabilidad utilizando técnicas conocidas de hemoglobina y sangre autóloga mezclada con tejido de cerebro31. Debido a que el procedimiento quirúrgico utilizado en los experimentos de ataque no altera significativamente las concentraciones de hemoglobina en sangre (datos no mostrados) , el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina puede ser utilizado para extrapolar el volumen de hemorragia intracerebral cuando se conoce la concentración de hemoglobina en el momento de la hemorragia. Para desarrollar y validar el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina para situaciones que pueden ser relevantes para ICH clínico, generamos hemorragias intracerebrales por dos métodos diferentes: (1) inyección intracerebral de colagenasa (para debilitar la pared vascular, como se puede presentar con un aneurisma o con trauma) y (2) en un modelo de ataque. En ambos casos, un grupo de animales también recibió rt-PA con el fin de validar el modelo en el extremo elevado del espectro de ICH. Debido a que no ha habido una medición de estándar básico para ICH en ratones, se compararon nuestras mediciones espectrofotométricas con el tamaño de ICH determinado independientemente por calificación visual. Finalmente, para probar el ensayo incluso de manera más útil para modelos experimentales de ataque en los cuales los cerebros están teñidos con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) para cuantificar el volumen de infarto cerebral, los cerebros de los animales sometidos a oclusión/reperfusión por MCA se finieron con TTC antes de su acumulación y homogeneización para establecer que el procedimiento de tinción TTC en si mismo no interfiere con la capacidad para cuantificar ICH por el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina.
Estos datos (Figura IB) indican que no hay interferencia cruzada detectable entre los dos procedimientos cuando se utilizan secuencialmente (primero tinción con TTC, seguido por homogeneización y el ensayo espectrofotométrico de hemoglobina) . Además de su capacidad para detectar ICH, los estudios actuales indicaron que está técnica también puede proporcionar una indicación de la cantidad de sangre intravascular residual posterior a la recolección o extirpación del cerebro. El procedimiento de perfusión con solución salina cefálica no altera la densidad óptica para cianoematohematoglobina en cerebros sometidos a ataque, lo que sugiere que la -cantidad de sangre intravascular es relativamente fija y no se elimina por lavado por el procedimiento. Sin embargo, en animales control los cuales de otra manera no han sido tratados, el tratamiento con perfusión de solución salina parece disminuir la densidad óptica para cianometahemoglobina en aproximadamente 30%. Nuestros experimentos no proporcionan la razón para esta diferencia, pero se puede especular que posterior al ataque, existe un elemento de vasoconstricción/vasooclusión en el territorio de infarto el cual hace a la técnica de perfusión con solución salina menos efectiva en el eliminado por lavado de sangre intravascular residual adicional. Además, si en realidad existe un elemento de vasoconstricción posterior a ataque o a hemorragia intracerebral inducida experimentalmente, esto puede reducir el acumulado de sangre intravascular y por lo tanto explicaría la disminución total de la densidad óptica cuando se comparan los cerebros control y con ataque/ICH (incluso si está presente cierta sangre extravascular en este último grupo) . Varios aspectos técnicos de la técnica espectrofotométrica para medir la hemorragia intracerebral también merecen mencionarse . Para los experimentos actuales, aunque existe un pico de absorbancia amplio para cianometahemoglobina centrado a aproximadamente 450 nm, medimos la absorbancia de cianometahemoglobina a 550 mm. La razón para hacer esto es que muchos espectrofotómetros tienen capacidades fijas de longitud de onda que dependen de los filtros preestablecidos, y 550 nm es una longitud de onda utilizada comúnmente (especialmente en lectores de placa ELISA) . Aunque tal vez la medición de absorbancia a 540 nm puede proporcionar mediciones de densidad óptica ligeramente mayores, el pico de absorbancia de cianometahemoglobina es amplio en esta área, y por lo tanto se puede utilizar 550 nm sin necesidad de corregir la absorbancia de ferricianuro o ferrucianuro (los coeficientes de extinción para cianometahemoglobina a 551 nm y 540 nm son de 11.5 y 11.1, respectivamente, comparados con el coeficiente de extinción, 41 veces menor de ferricianuro o ferrucianuro38) . Los estudios que utilizan un espectrofotómetro de longitud de onda continua (los cuales se utilizan para medir la DO a 540 nm) y los lectores de placa ELISA de espectro definido (utilizados para medir DO a 550 nm) proporcionaron resultados similares. Puesto que está última técnica es más sencilla, incrementa el rendimiento del procedimiento y nos permite minimizar el volumen de muestra, elegimos utilizar esta última técnica para los estudios mostrados en la sección de Resultados. Existen algunas otras consideraciones técnicas potenciales que deben ser consideradas cuando se utilice el ensayo espectrofotométrico. Aunque hemos demostrado que el procedimiento espectrofotométrico puede ser utilizado junto con la tinción con TTC de secciones o cortes de cerebro en serie para análisis de volumen de infarto, el tejido debe ser homogeneizado subsecuentemente y extraído, destruyendo la arquitectura del tejido y volviendo imposible una caracterización histológica adicional. Es posible que está técnica pueda sobreestimar el grado de ICH si se incluye no intencionalmente sangre extracerebral durante la recolección, o la. técnica puede subestimar el grado de ICH si permanece sangre epidural, subdural o subaracnoidea adherida al cráneo, la cual se desecha durante el proceso de remoción del cerebro. Debido a la naturaleza de la técnica de medición, en la cual la luz a una longitud de una onda dada se absorbe a lo largo de una trayectoria de longitud fija, cualquier coas que provoque turbidez del sobrenadante del cerebro homogeneizado puede incrementar la lectura de DO. Esto puede incluir a lípidos, proteínas anormales plasmáticas y estroma de eritocitos . De hecho, en experimentos preliminares, encontramos que las DO se elevaban de manera falsa cuando la centrifugación era insuficiente y se incluía en el ensayo parte de la capa de lípidos. Las piridinas libres pueden alterar el espectro de absorbancia de la cianometahemoglobina y existe el potencial de que otros hemocromogenos también reaccionen con el reactivo de Drabkin39. Sin embargo, hasta donde sabemos, estas reacciones no interfieren en un grado significativo con la determinación de sangre/hemorragia intracerebral . En resumen, los datos actuales ilustran una manera sencilla y barata de ensayos espectrofotométrico para hemoglobina el cual puede proporcionar un método útil para cuantificar ICH. Esta técnica puede demostrar ser especialmente útil para evaluar el potencial hemorrágico de terapias trombolíticas o anticoagulantes recién desarrolladas para el tratamiento de ataque.
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J Biol Chem 1935;112:89-104 Ejemplo 13: El factor IXa bloqueado en sitio activo limita la trombosis microvascular y el daño cerebral en ataque en ratones, sin incrementar la hemorragia intracerebral Restañen El dilema clínico cuando se realiza el tratamiento de ataque es que los agentes los cuales restablecen la patencia vascular incrementan el riesgo de hemorragia intracerebral . El factor IXa bloqueado en su sitio activo (IXa) , formado a partir de factor IXa purificado por dansilación de su sitio activo, compite con el factor IXa nativo para inhibir el montaje de factor IXa en el complejo de activación de factor X intrínseco. Cuando se pretratan con factor IXai, los ratones sometidos a isquemia cerebral focal y reperfusión demuestran fibrina microvascular y deposición de plaquetas reducidos, perfusión cerebral aumentada e infartos cerebrales significativamente más pequeños en comparación con los controles tratados con vehículo. La protección del cerebro mediada por el factor IXai es dependiente de la dosis, y no está asociada con hemorragia intracerebral a las dosis terapéuticamente efectivas, y se puede observar incluso cuando se administrar el factor IXai después del inicio de la isquemia cerebral. La administración de factor IXai representa una nueva estrategia para tratar un ataque en evolución sin que se incremente el riesgo de hemorragia intracerebral.
Introducción El restablecimiento a tiempo de flujo sanguíneo al cerebro isquémico representa el paradigma del tratamiento actual para un ataque agudo1"3. La administración de un agente trombolítico, incluso cuando se suministra bajo condiciones óptimas, puede que no produzca este resultado clínico deseado. La perfusión con frecuencia falla al regresar a los niveles preisquémicos (hiperfusión postisquémica) lo que sugiere que el daño isquémico no se produce únicamente por la oclusión original, sino que también hay un elemento de falla microcirculatoria. Además, la trombólisis de ataque agudo está asociada con un riesgo aumentado de hemorragia intracerebral (ICH)1"4, lo que indica que permanece una clara necesidad por identificar agentes nuevos los cuales puedan promover la reperfusión sin que se incremente el riesgo de ICH. Después de un evento isquémico, la pared vascular se modifica de su estado en reposo, antiadhesivo, antitrombótico, a uno en el cual se promueve la adhesión de leucocitos y la trombosis. En un ataque agudo, el reclutamiento activo de leucocitos por receptores de adhesión expresados en la microvasculatura ipsilateral, tal como ICA. -I5 y P-selectina6, potencia la hipoperfusión postisquémica. Sin embargo, en experimentos con ratones mutantes por supresión para cada uno de estos genes demuestran que incluso en su ausencia, el flujo sanguíneo cerebral postisquémico (CBF) regresa solo parcialmente a la línea basal, lo que sugiere la existencia de mecanismos adicionales responsables de la carencia de reflujo cerebrovascular postisquémico. Para explorar esta posibilidad, se diseño un primer conjunto de experimentos para probar la hipótesis de que la trombosis local se produce a nivel de la microvasculatura (distal al sitio de oclusión primaria) en el ataque. Para determinar las consecuencias dañinas de la trombosis microvascular en el ataque, el segundo conjunto de experimentos probo la hipótesis de que el bloqueo selectivo de la vía intrínseca de la coagulación podría limitar la trombosis microvascular, y de esta manera proteger al cerebro en ataque. Se eligió la estrategia de inhibición selectiva de la vía intrínseca de la coagulación debido a que es la responsable principal de la trombosis intravascular. La heparina, hirudina y los agentes fibrinolíticos interfieren con la vía común final de la coagulación para inhibir la formación o acelerar la lisis de fibrina, y por lo tanto incrementan la propensión por ICH. Establecimos la hipótesis de que el bloqueo selectivo del montaje de complejo de activación IXa/VIIIa/X puede proporcionar un mecanismo novedoso para limitar la trombosis intravascular mientras que preserva los mecanismos de hemostasis extravascular por la vía de la coagulación extrínseca/factor tisular lo cual puede ser crítico en tejido cerebral infartado o regiones adyacentes en donde los vasos pequeños son susceptibles y se someten a ruptura. Utilizamos una estrategia novedosa en la cual se administro inhibidor competitivo de factor IXa ( IXa bloqueado en el sitio activo, o IXai) a ratones sometidos a ataque para probar la hipótesis de que se puede mejorar el resultado posterior a ataque sin incrementar ICH.
Métodos Modelo d= ataque an ra-_-Ón: Se indujo isquemia cerebral focal transitoria en ratones por oclusión intraluminal de la arteria cerebral media (45 minutos) y reperfusión (22 h) como se ha reportado previamente7. Las mediciones en serie del flujo sanguíneo cerebral relativo (CBF) se registraron vía fluorometría doppler láser7, y se determinaron los volúmenes de infarto (% de hemisferio ipsilateral) por análisis planimétrico/volumétrico de cortes de cerebro en serie teñidos con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC)7.
Estudios de plaquetas marca as QQ 111indio: Se determinó la acumulación de plaquetas utilizando plaquetas marcadas con xllindio, recolectadas y preparadas como se ha descrito previamente8. Inmediatamente antes de la cirugía, se administró a los ratones 5 x 106 de plaquetas marcadas con ?x?ln intravenosamente. Se cuantificó la deposición después de 24 horas por medio de cpm ipsilateral/cpm contralateral.
Inmunotransferencia/inmunotinción de fibrina: Se midió la acumulación de fibrina posterior al sacrificio (en animales completamente heparinizados) utilizando procedimientos de inmunotransferencia/inmunotinción los cuales se han descrito y validado recientemente9. Debido a que la fibrina es extremadamente insoluble, se prepararon extractos de tejido de cerebro por digestión con plasmina, y después se aplicaron a un gel estándar de SDS-poliacrilamida para electroforesis, seguido por inmnunotransferencia utilizando anticuerpo de conejo anti-humano o policlonal preparado a dímeros de cadena gamma-gamma presentes en fibrina reticulada los cuales pueden detectar fibrina de ratón, con actividad cruzada relativamente pequeña con fibrinógeno10. La acumulación de fibrina se reportó como una proporción ipsilateral respecto a contralateral. En experimentos adicionales, se incrustaron cerebros en parafina, se cortaron e inmunotiñeron utilizando el mismo anticuerpo antifibrina.
Ensayo espectrofotométrico de hemoglobina y calificación visual de ICH ; Se cuantificó ICH por un ensayo basado en espectrofotometría el cual ha sido desarrollado y validado11,12. Brevemente, los cerebros de ratón se homogeneizaron, sonicaron, centrifugaron y la metahemoglobina en los sobrenadantes se convirtió a cianometahemoglobina (utilizando el reactivo de Drabkin) , cuya concentración se determinó al medir la D.O. a 550 nm contra una curva estándar generada con cantidades conocidas de hemoglobina. Se realizó una calificación visual de ICH en secciones coronales en serie de 1 mm por un observador quien desconoce el protocolo, en base en el diámetro máximo de hemorragia observado en cualquiera de las secciones [ICH calificación 0, sin hemorragia; 1, < 1 mm; 2, 1-2 mm; 3, >2-3 mm; 4 , > 3 mm] .
Preparación de factor IXai13 : Se preparó factor IXai al modificar selectivamente el residuo histidina de sitio activo en el factor IXa, utilizando dansil-glu-gly-arg-clorometilcetona. Se aplicó proplex a una columna preparativa que contiene anticuerpo monoclonal para factor IX dependiente de calcio, inmovilizado. La columna se lavó, se eluyó con amortiguador que contiene EDTA y después se activo el factor IX en el eluido (confirmado como una sola banda en SDS-PAGE) al aplicar factor IXa (incubado en presencia de CaCl2) - El factor IXa purificado se hizo reaccionar con un exceso molar de 100 veces de dansil-glu-gly-arg-clorometilcetona y la mezcla se dializó. El producto final (IXai) carente de actividad procoagulante, migra idénticamente a IXa en el análisis SDS-PAGE. Este material (Factor IXai) se utiliza después para experimentos posteriores a filtración (0.2 µm) y cromatografía en columnas DeToxi-gel, para remover cualquier traza de contaminación de endotoxina (en alícuotas de muestra, no hubo lipopolisacáridos detectables) . Subsecuentemente se congeló IXai en alícuotas a -80°C hasta el momento de su uso. Para aquellos experimentos en los cuales se utilizó IXai, se administró como un bolo intravenoso único en los tiempos indicados y a las dosis indicadas .
Resultados Para crear un ataque en un modelo en ratón, se introdujo una sutura en la vasculatura cerebral de manera que ocluyera el orificio de la arteria cerebral media derecha, volviendo al territorio irrigado isquémico. Al extraer la sutura después de un período de 45 minutos de oclusión, se generó un modelo reperfundido de ataque; los ratones tratados de esta manera demostraron deficiencias neurológicas focales así como áreas claramente definidas de infarto cerebral . Debido a que la sutura de oclusión no avanza más allá del tributario vascular principal (la arteria cerebral media) , este modelo proporciona una excelente oportunidad para investigar los eventos "corriente abajo" que se producen dentro de la microvasculatura cerebral en respuesta al período de flujo interrumpido sanguíneo. Utilizando este modelo, se investigó como sigue el papel de la trombosis microvascular. Para demostrar que se producen focos trombóticos ricos en plaquetas dentro del hemisferio cerebral isquémico, se administraron a los ratones plaquetas marcadas con X11ln inmediatamente antes de la introducción de la sutura de oclusión intraluminal para seguir su deposición durante el período posterior a la isquemia cerebral y reperfusión. En animales no sometidos a procedimiento quirúrgico para generar un ataque, la presencia de plaquetas es aproximadamente igual entre los hemisferios derecho e izquierdo, como era de esperarse [Figura 40A, barra izquierda] . Sin embargo, cuando los animales se someten a ataque (y reciben únicamente vehículo para control de experimentos subsecuentes] , las plaquetas radiomarcadas se acumulan preferencialmente en el hemisferio isquémico (ipsilateral) en comparación con una deposición significativamente menor en el hemisferio contralateral (no isquémico) [Figura 40A, barra media] . Estos datos apoyan la presentación de trombos ricos en plaquetas en el territorio isquémico. Cuando se administra factor IXai a animales antes de la introducción de la sutura de oclusión intraluminal, existe una reducción significativa en la acumulación de plaquetas radiomarcadas en el hemisferio ipsilateral [Figura 40A, barra derecha] . Otra línea de evidencia también apoya la presentación de trombosis microvascular en el ataque. Estos datos provienen de la inmunodetección de fibrina, utilizando un anticuerpo dirigido contra un neoepitopo en el dímero de cadena gamma-gamma de fibrina reticulada. Las inmunotransferencias demuestran una banda de intensidad aumentada en el hemisferio ipsilateral (derecho) de animales tratados con vehículo sometidos a isquemia cerebral focal y reperfusión [Figura 40B, "vehículo"] . En animales tratados con factor JXai (300 µg/kg) antes del ataque, no hubo incremento aparente en la acumulación ipsilateral de fibrina [Figura 40B "factor IXai"] . Para demostrar que la acumulación de fibrina es debida a la deposición de fibrina intravascular (en vez de deberse a cambios de permeabilidad no específicos y exposición a la matriz subendotelial) , la inmunotinción de fibrina claramente localiza la fibrina aumentada en el lumen de los microvasos intracerebrales ipsilaterales [Figura 40C] . Para investigar si el factor IXai puede limitar la trombosis intracerebral y restablecer la perfusión, se administró IXai a ratones inmediatamente antes del ataque (300 µg/kg) . Estos experimentos demostraron una reducción tanto en la acumulación de plaquetas X11ln en el hemisferio ipsilateral [Figura 41A] así como una evidencia disminuida de fibrina intravascular por inmunotinción. Además, hay un incremento significativo en CBF a las 24 horas, lo que sugiere el restablecimiento de la patencia microvascular por el factor IXai [Figura 41A] . La relevancia clínica de esta observación está subrayada por la capacidad del factor IXai para reducir los volúmenes de infarto cerebrales [Figura 4IB] . Estos efectos benéficos del factor IXai son dependientes de la dosis, y la dosis óptima es de 600 µg/kg [Figura 41C] . Debido a que el desarrollo de ICH es una preocupación principal con cualquier estrategia anticoagulante en el establecimiento de un ataque, se midió el efecto de IXai sobre ICH utilizando nuestro método espectrofotométriso, recién validado, para cuantificar ICH11-12. Estos datos indican que a las dosis más bajas (y las más efectivas) no hay un incremento significativo en ICH [Figura 42A] . A la dosis más elevada probada (1200 µg/kg) hay un incremento en ICH, el cual se corroboró por un método de calificación visual semicuantitativo el cual también ya hemos reportado recientemente [Figura 42B]11,12. Debido a que las terapias dirigidas en el mejoramiento del resultado posterior aún el ataque agudo deben ser suministradas después de presentación clínica, y debido a que la fibrina continúa formándose después de un evento isquémico inicial en un ataque, probamos si IXai puede ser efectivo cuando se administra posterior al inicio de isquemia cerebral . IXai administrado después de oclusión de la arteria cerebral media (posterior a remoción de la sutura de oclusión) proporciona protección cerebral significativa juzgada por la capacidad para reducir significativamente los volúmenes de infarto cerebral en comparación con los controles tratados con vehículo [Figura 43] .
Discusión Los datos en estos estudios demuestran una evidencia clara de formación de trombos intravasculares (tanto de plaquetas como de fibrina) dentro de la microvasculatura cerebral postisquémica. La importancia patofisiológica de la trombosis microvascular en el ataque está subrayada por la capacidad del factor IXai de reducir la trombosis microvascular (se reducen la acumulación tanto de plaquetas como de fibrina, con un incremento concomitante en CBF postisquémico) y en el mejoramiento en el resultado posterior a ataque. Estas poderosas acciones antitrombóticas del factor IXai probablemente son clínicamente importantes en el establecimiento del ataque, debido a que el factor IXai no solo reduce los volúmenes de infarto de una manera dependiente de la dosis, sino que también incluso cuando se administra después del inicio del ataque. Además, a dosis clínicamente relevantes, el tratamiento con factor IXai no provoca un incremento en ICH, realizando una inhibición selectiva del conjunto de complejo de activación de factor IXa/VIIa/X con el factor IXai como un objetivo atractivo para la terapia contra los ataques en humanos . Existen numerosas razones por las cuales las estrategias anticoagulantes dirigidas pueden ser una alternativa atractiva al uso actual de agentes trombolíticos en el manejo de ataque agudo, debido a su éxito con altibajos en ensayos clínicos. Teóricamente, un tratamiento ideal para el ataque agudo evitaría la formación o induciría la disolución de la malla fibrina-plaquetas que provoca la trombosis microvascular en la zona isquémica sin incrementar el riesgo de hemorragia intracerebral. Sin embargo, los agentes trombolíticos los cuales han sido estudiados en ensayos clínicos de ataque agudo tienen consistentemente aumentado el riesgo de hemorragia intracerebral3 La estreptocinasa, administrada en las primeras horas (<6) posterior al inicio del ataque, se asoció con una tasa aumentada de transformación hemorrágica (hasta 67%) ; aunque hubo una mortalidad temprana aumentada, los pacientes sobrevivientes presentaron menos incapacidad residual. La administración de activador de plasminógeno tipo tisular (tPA) en las siguientes 7 horas (particularmente en las siguientes 3 horas) al inicio del ataque resulta en una mortalidad temprana aumentada y tasas aumentadas de conversión hemorrágica (entre 7-20%) , aunque los sobrevivientes demostraron menos incapacidad residual. Con el fin de desarrollar terapias anticoagulantes o trombolíticas mejoradas, se han examinado diversos modelos animales de ataque. Estos modelos consisten generalmente de la administración de sangre coagulada en la arteria carótida interna seguido por administración de un agente trombolítico . En ratas, la administración de tPA en las siguientes dos horas al ataque mejora el flujo sanguíneo cerebral y reducá el tamaño de infarto hasta en un 77%14,1S. En un modelo de ataque embólico similar en conejo, tPA fue efectivo en el restablecimiento del flujo sanguíneo y reducción del tamaño del infarto, con aparición ocasional de hemorragia intracerebral16'17. Sin embargo, aunque existen ventajas para la disolución inmediata del coágulo, estos estudios (así como los ensayos clínicos de agentes trombolíticos) indican que existe un riesgo aumentado concomitante de hemorragia intracerebral con este enfoque terapéutico.
Debido al inicio habitualmente precipitado del ataque isquémico, la terapia se ha enfocado principalmente hacia la lisis de los residuos fibrinosos/ateroembólicos principales los cuales ocluyen un tributario vascular principal al cerebro. Sin embargo, como lo demuestra el trabajo actual, existe un componente importante de trombosis microvascular el cual se produce corriente abajo desde el sitio de oclusión original, el cual es probable que sea de significancia patofisiológica considerable para hipoperfusión postisquémica (sin reflujo) y daño cerebral en un ataque en desarrollo. Estos datos concuerdan de manera excelente con los que se han reportado previamente, en los cuales los microtrombos se han localizado topográficamente en la región isquémica en infartos frescos de cerebro18. El uso de un agente el cual inhibe el montaje del complejo de activación factor IXa/VIIIa/X representa un enfoque novedoso para limitar la trombosis que se presenta dentro de los lúmenes vasculares, sin dañar la hemostasis extravascular, el mantenimiento de la cual puede ser crítico para evitar ICH. En los estudios actuales, el tratamiento con factor IXai reduce la acumulación microvascular de plaquetas y fibrina, mejora el flujo sanguíneo cerebral postisquémico y reduce los volúmenes de infarto cerebral en el establecimiento de ataque, sin incrementar ICH. La potencia del factor IXai como un agente anticoagulante se basa en el papel integral del factor IX activado en las cascada de la coagulación. No solo la estrategia de bloqueo del factor IXa parece ser efectiva en el establecimiento del ataque, sino que también parece ser efectivo para evitar oclusión progresiva de la atería coronaria inducida posterior a aplicación inicial de corriente eléctrica a la arteria coronaria circunfleja izquierda en perros13. Al igual que en esos estudios, en los cuales el factor IXai no prolonga el tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT (224) , en el modelo en ratón, la administración de factor IXai a la dosis terapéuticamente efectiva de 300 µg/kg similarmente no altera de modo significativo el protiempo o APTT [13.4 ± 0.7 y 7.9 ± 8.9 versus 12.1 ± 0.7 y 70.6 + 8.9 para PT y APTT de ratones tratados con IXai (n = 7) y tratados con vehículos (n = 4) , respectivamente, P = NS] . Los datos los cuales demuestran que IXai administrado después del inicio del ataque es efectivo lleva a otra hipótesis interesante, de que la formación de trombo se representa un equilibrio dinámico entre los proceso de la trombosis que avanza y la fibrinólisis que se produce. Incluso bajo establecimientos normales (no isquémicos) se ha demostrado que este equilibrio dinámico se produce en el hombre19. Los datos en los estudios actuales, los cuales muestran que el factor IXai es efectivo incluso cuando se administra después del acceso del ataque, sugieren que esta estrategia restablece el equilibrio dinámico, el cual se encuentra desplazado después de la isquemia cerebral a favor de la trombosis, y la regresa hacia un fenotipo de pared vascular más en reposo (antitrombótica) .
Como una consideración final, incluso si la trombólisis remueve exitosamente los trombos oclusores mayores y/o las estrategias anticoagulantes son efectivas para limitar la trombosis microcirculatoria progresiva, el flujo sanguíneo habitualmente falla en regresar a niveles preisquémicos . Esto se ejemplifica por datos en el estudio actual, en los cuales CBF es mejorado considerablemente por un factor IXai (lo cual limita la acumulación de fibrina/plaquetas) , CBF aún no regresa a los niveles preisquémicos. Estos datos apoyan la existencia de mecanismo múltiples efectores para hipoperfusión cerebral postisquémica que incluyen acumulación ; postisquémica de neutrófilos y taponamiento microvascular consecuente, con expresión de P-selectina y ICAM-l por las células endoteliales microvasculares cerebrales que son particularmente pertinentes a este respecto5,6. Cuando se observa desde la perspectiva de la expresión de receptor de adhesión de leucocitos, incluso cuando están ausentes estos receptores de adhesión, los niveles de CBF se mejoran posterior a ataque en comparación con los controles pero no regresan a los niveles preisquémicos. Tomados juntos, estos datos sugieren que la trombosis microvascular y la adhesión de leucocitos contribuyen juntos a la hipoperfusión cerebral postisquémica . En resumen, la administración de un inhibidor competitivo de factor IXa, factor IXa bloqueado en su sitio activo, representa una terapia novedosa para el tratamiento del ataque. Esta terapia no solo reduce la trombosis microvasculatoria, mejora el flujo sanguíneo cerebral postisquémico y reduce el daño de tejido cerebral posterior a ataque, sino que también puede hacerlo si se proporciona después del inicio de la isquemia cerebral y sin incrementar el riesgo de ICH. Esta combinación de propiedades benéficas y riesgos en el lado descendente relativamente bajos de la transformación hemorrágica vuelven a este enfoque extremadamente atractivo para pruebas adicionales y ensayos clínicos potenciales en el ataque humano.
Referencias 1. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group : Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke. New Ensl J Med 1995;333:1581-1587 2. Hacke W, Kaste M, Fieschi C, Toni D, Lesaffre E, von Kummer R, Boysen G, Bluhmki E, Hoxter G, Mahagne MH, Hennerici M, for the ECASS Study Group : Intravenous thrombolysis with recombinant tissue plasminogen activator for acute hemispheric stroke. J A M A. 1995;274 (13) :1017-1025 3. del Zoppo GJ: Acute stroke - sn the threshold of a therapy. N Ensl J Med 1995 ; 333 ( 13 ): 1632 -1633 4. Hommel M, Cornu C, Boutitie F, Boissel JP, The MultiCenter Acute Stroke Trial - Europe Study Group : Thrombolytic therapy with streptokinase in acute ischemic stroke. N EnGl J Med 1996;335:145-150 5 5. Connolly ESJr, Winfree CJ, Springer TA, Naka Y, Liao H, Yan SD, Stern DM, Solomon RA, Gutiérrez-Ramos J-C, Pinsky DJ: Cerebral protection in homozygous nuil ICAM-l mice after middle cerebral artery occlusion. Role of neutrophil adhesión in the pathogenesis 0 of stroke. J Clin Invest 1996;97:209-216 6. Exacerbation of cerebral injury in mice which express the P-selectin gene: identification of P-selectin blockade as a new target for the treatment of stroke. Example 10 Hereinabove 5 7. Connolly ESJr, Winfree CJ, Stern DM, Solomon RA, Pinsky DJ: Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurg 1996;38 (3) :523-532 0 8. Naka Y, Chowdhury NC, Liao H, Roy DK, Oz MC, Micheler RE, Pinsky DJ: Enhanced preservation of orthotopically transplanted rat lungs by nitroglycerin but not hydralazine: requirement for graft vascular homeostasis beyond harvest vasodilation. Circ Res 1995;76:900-906 9. Lawson CA, Yan S-D, Yan S-F, Liao H, Chen G, Sobel J, Kisiel W, Stern DM, Pinsky DJ: Monocytes and tissue factor promote thrombosis in a murine model of oxygen deprivation. Journal of Clinical Investisation 1997;99:1729-1738 5 10. Lahiri B, Koehn JA, Canfield RE, Birken S, Lewis J: Development of an lmmunoassay for the COOH-terminal región of the gamma chains if human fibrin. Thromb Res 1981;23:103-112 0 11. Use of a spectrophotometric hemoglobin assay to objectively quantify intracerebral hemorrhage in mice. Example 12 Hereinabove 12. Choudhri TF, Hoh BL, Solomon RA, Connolly ES, Pinsky DJ: Spectrophotometric hemoglobin assay: A new method to quantify; 5 experimental murine intracerebral hemorrhage and its potentiation by tissue plasminogen activator. Annual Meeting Joint Section on Cerebrovascular Surgery 1997 13. Benedict CR, Ryan J, Wolitzky B, Ramos R, Gerlach M, Tijburg 0 P, Stern D: Active site-blocked Factor IXa prevents intravascular thrombus formation in the coronary vasculature without inhibiting • extravascular coagulation in a canine thrombosis model. J Clin lH3££St ;991;88:1760-1765 14. Papadopoulos SM, Chandler WF, Salamat MS, Topol EJ, Sackellares JC: Recombinant human tissue-type plasminogen activator therapy in acute thromboembolic stroke. J Neurosurg 1987;67:394-398 5 15. Overgaard K, Sereghy T, Pedersen H, Boysen G: Neuroprotection with NBQX and thrombolysis with rt-PA in rat embolic stroke. Neurol Res 1993;15:344-349 0 16. Cárter LP, Guthkelch AN, Orozco J, Temeltas O- Influence of tissue plasminogen activator and heparin on cerebral ischemia in a rabbit model. Stroke 1992;23:883-888 17. Phillips DA, Fisher M, Davis MA, Smith TW, Pang RL: Delayed 5 treatment with a t -PA analogue and streptokinase in a rabbit embolic stroke model. Stroke 1990;21:602-605 18. Heye N, Paetzold C, Steinberg R, Cervos-Navarro J: The topography of m-crothrombi in ischemic brain infarct. Acta 0 Neuroloaica Scandinavica 1992;86:450-454 - 19. Nossel HL : Relative proteolysis of the fibrinogen B beta chain by thrombin and plasmin as a determinant of thrombosis. Nature 1981;291:155-167

Claims (45)

REIVINDICACIONES
1. Un método para tratar un trastorno isquémico en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una forma farmacéuticamente aceptable de un antagonista de selectina en una cantidad suficiente durante un período de tiempo suficiente para evitar la acumulación de células sanguíneas blancas de manera que se trata el trastorno isquémico en el sujeto.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista de selectina comprende un péptido mimético, una molécula de ácido nucleico, una ribosima, un polipéptido, una molécula pequeña. una molécula de carbohidrato, un monosacárido, un oligosacárido o un anticuerpo.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo de selectina.
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista de selectina comprende nitroglicerina o un agente el cual estimula la vía de óxido - 2'68 -nítrico, monofosfato de adenosina 3 ' , 5 ' -cíclico, AMP cíclico o GPM cíclico.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la forma farmacéuticamente aceptable comprende un antagonista de selectina y un portador farmacéuticamente aceptable.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el portador comprende un portador en aerosol, intravenoso, oral o tópico.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula sanguínea blanca es un neutrófilo, un monocito o una plaqueta.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el mamífero es un humano.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el trastorno isquémico comprende un trastorno vascular periférico, embolia pulmonar, trombosis venosa, infarto al miocardio, ataque isquémico transitorio, angina inestable, déficit neurológico isquémico reversible, anemia de células falsiformes o un trastorno de ataque.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto experimenta cirugía cardíaca, cirugía pulmonar, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía abdominal o cirugía de trasplante de órganos.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la cirugía de trasplante de órganos comprende cirugía de trasplante de corazón, pulmón, páncreas o hígado.
14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la selectina es una P-selectina, una E-selectina o una L-selectina.
15. Un método para tratar un trastorno isquémico en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto monóxido de carbono gaseoso en una cantidad suficiente durante un período de tiempo suficiente para de esta manera tratar el trastorno isquémico en el sujeto.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la administración es vía inhalación o exposición extracorporal .
17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cantidad comprende desde aproximadamente 0.001% de monóxido de carbono en el aire hasta aproximadamente 2% de monóxido de carbono en un gas inerte .
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el gas inerte comprende aire, oxígeno, argón 0 nitrógeno.
19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cantidad comprende 0.1% de monóxido de carbono en aire.
20. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el período de tiempo comprende desde aproximadamente 1 día antes de la cirugía hasta aproximadamente 1 día después de la cirugía.
21. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el período de tiempo comprende desde aproximadamente 12 horas antes de la cirugía hasta aproximadamente 12 horas después de la cirugía.
22. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el período de tiempo comprende desde aproximadamente 12 horas antes de la cirugía hasta aproximadamente 1 hora después de la cirugía.
23. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el período de tiempo comprende desde aproximadamente 1 hora antes de la cirugía hasta aproximadamente 1 hora después de la cirugía.
24. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el mamífero es un humano.
26. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el trastorno isquémico comprende un trastorno vascular periférico, embolia pulmonar, trombosis venosa, infarto al miocardio, ataque isquémico transitorio, angina inestable, déficit neurológico isquémico reversible, anemia de células falsiformes o un trastorno de ataque.
27. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el sujeto experimenta cirugía cardíaca, cirugía pulmonar, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía abdominal o cirugía de trasplante de órganos.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la cirugía de trasplante de órganos comprende cirugía de trasplante de corazón, pulmón, páncreas o hígado.
29. Un método para tratar un trastorno isquémico en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una forma farmacéuticamente aceptable de factor IX inactivado en una cantidad suficiente durante un período de tiempo suficiente para inhibir la coagulación de manera que se trate el trastorno isquémico en el sujeto. —
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la cantidad comprende desde aproximadamente 75 µg/kg hasta aproximadamente 550 µg/kg.
31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la cantidad comprende 300 µg/kg.
32. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la forma farmacéuticamente aceptable comprende factor IX inactivado y un portador farmacéuticamente aceptable .
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el portador comprende un portador en aerosol, intravenosa, oral o tópico.
34. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.
35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el mamífero es un humano.
36. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el trastorno isquémico comprende un trastorno vascular periférico, embolia pulmonar, trombosis venosa, infarto al miocardio, ataque isquémico transitorio, angina inestable, déficit neurológico isquémico reversible, anemia de células falsiformes o un trastorno de ataque.
37. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto experimenta cirugía cardíaca, cirugía pulmonar, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía abdominal o cirugía de trasplante de órganos.
38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la cirugía de trasplante de órganos comprende cirugía de trasplante de corazón, pulmón, páncreas o hígado.
39. Un método para identificar un compuesto que es capaz de mejorar un trastorno isquémico en un sujeto, caracterizado porque comprende: a) administrar el compuesto a un animal, animal el cual es un modelo animal de ataque ; b) medir el resultado posterior al ataque en el animal, y c) comparar el resultado posterior al ataque en la etapa (b) con el del modelo animal de ataque en ausencia del compuesto de manera que se identifique un compuesto capaz de mejorar un trastorno isquémico en un sujeto.
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el modelo animal de ataque comprende un modelo de ratón de isquemia cerebral focal y reperfusión.
41. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el resultado causado por un ataque súbito se mide por examen físico, formación de imagen por resonancia magnética, fluometría doppler láser, tinción con cloruro de trifeni-Ltetrazolio, determinación química de deficiencia neurológica, exploración de tomografía computarizada o flujo sanguíneo cortical cerebral.
42. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el compuesto comprende un antagonista de P-selectina.
43. Un método para identificar un compuesto que es capaz de prevenir la acumulación de células sanguíneas blancas en un sujeto, caracterizado porque comprende: a) administrar el compuesto a un animal, animal el cual es un modelo animal de ataque ; b) medir el resultado de ataque en el animal, y c) comparar el resultado posterior al ataque en la etapa __ (b) con el del modelo animal de ataque en ausencia del compuesto de manera que se identifique un compuesto capaz de mejorar un trastorno isquémico en un sujeto.
44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la célula sanguínea blanca es un neutrófilo, un monocito o una plaqueta.
45. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el compuesto es un inhibidor de P-selectina, un inhibidor de monocitos, un inhibidor de plaquetas o un inhibidor de neutrófilos.
MXPA/A/1999/002996A 1996-09-27 1999-03-26 Metodos para tratar un trastorno isquemico y mejorar el resultado causado por un ataque subito MXPA99002996A (es)

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