JPH10512142A - 抗炎症性ｃｄ１４ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、７位〜１０位に天然型配列とは異なるアミノ酸を有するか又はアミノ酸１〜１４が欠失している可溶性ＣＤ１４関連ポリペプチドを含む抗炎症性ポリペプチドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗炎症性ＣＤ１４ポリペプチド 発明の分野 本発明は一般的には、抗炎症性を有するポリペプチドの分野に関する。ＣＤ１ ４のアミノ酸７−１０がＩＬ−６産生のような細胞中の炎症性応答を生じ得る重 要なドメインを含んでいることは知見されていた。本発明のポリペプチドは、可 溶性形態のＣＤ１４のアミノ酸７−１０を別のアミノ酸で置換することに基づく 。本発明の他のポリペプチドは、可溶性ＣＤ１４の最初の１４個のアミノ酸を欠 失している。本発明のポリペプチドは、敗血症のような炎症性疾患を治療するた めに使用され得る。発明の背景 敗血症は、感染または外傷によって引き起こされる命にかかわる身体の異常で ある。敗血症の症状としては、悪寒、大量の発汗、発熱、衰弱または血圧降下が あり、次いで、白血球減少、血管内凝固、ショック、成人性呼吸困難症候群、多 臓器不全などを生じ、しばしば死亡することもある。Ｒ．Ｕｌｅｖｉｔｃｈら，Ｊ．Ｔｒａｕｍａ ３０：Ｓ１８９−９２（１９９０）。 すべてのグラム陰性菌の外膜に典型的に存在するリポ多糖（“ＬＰＳ”、「内 毒素」とも呼ばれる）は、最も研究され最も理解されている敗血症誘発物質に属 する。種々の細菌から得られるＬＰＳ分子の正確な化学構造は種特異的に多様で あろうが、リピドＡ領域と呼ばれる領域はすべてのＬＰＳ分子に共通である。Ｅ ．Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ，１ ：１８７−２１４，ｅｄｓ．Ｒ．Ｐｒｏｃｔｏｒ および Ｅ．Ｒｉｅｔｓｃｈ ｅｌ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）。 敗血症を特徴付けるＬＰＳ依存性病態生理学的変化の全部のではないとしても その多くの原因は、このリピドＡ領域にある。 グラム陰性敗血症に罹患したヒト患者を死亡させる第一の原因はＬＰＳである と考えられている。ｖａｎ Ｄｅｖｅｎｔｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ，１：６０５（ １９８８）；Ｚｉｅｇｌｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１３６：１９− ２８（１９８７）。敗血症及びグラム陰性菌血症に罹患した患者をＬＰＳに対す るモノクローナル抗体で治療すると、死亡率が低下した。Ｚｉｅｇｌｅｒら，Ｎ ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ． ，３２４：４２９（１９９１）。 グラム陽性菌もまた敗血症の原因となる。Ｂｏｎｅ，Ｒ．Ｃ．Ａｒｃｈ．Ｉｎ ｔｅｒｎ．Ｍｅｄ． ，１５４：２６−３４（１９９４）。宿主細胞の活性化は、 グラム陽性菌の細胞壁またはペプチドグリカン及びリポテイコ酸のような精製さ れた細胞成分によって生じる。これらの物質は、ＬＰＳによって誘発されるのと 同様のパターンの炎症性応答を誘発する。Ｃｈｉｎ と Ｋｏｓｔｕｒａ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：５５７４−５５８５（１９９３）；Ｍａｔｔｓｏｎら ，ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：２８１−２８８（ １９９３）；及びＲｏｔｔａ，Ｊ．Ｚ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｆｏｒｓｃｈ．Ｂｄ． ，１４９：２３０−２４４（１９７５）。ＬＰＳ及びグラム陽性菌の細胞壁物質 は多形核白血球、内皮細胞及び単球／マクロファージ系の細胞にサイトカインの ような多様な細胞産生物を速やかに産生させて放出させ、これらの産生物は体液 性及び細胞性の免疫応答及び免疫作用を開始、調節または仲介し得る。 アルファ−カケクチンまたは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）と呼ばれる特定のサ イトカインは明らかに敗血症ショックの主要な仲介物質である。Ｂｅｕｔｌｅｒ ら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ． Ｍｅｄ． ，３１６：３７９（１９８７）。実験用動物及びヒトにＬＰＳを静注す るとＴＮＦ−αの速やかな一過性放出が生じる。Ｂｅｕｔｌｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ． ，１３５：３９７２（１９８５）；Ｍａｔｈｉｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉ ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ８１：１９２５（１９８８）。動物を抗ＴＮＦ−α抗体によ って前処理すると、敗血症ショックを変調し得る。Ｂｅｕｔｌｅｒら，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ，２２９：８６９（１９８５）；Ｍａｔｈｉｓｏｎら，Ｊ．Ｃ１ｉｎ．Ｉ ｎｖｅｓｔ． ８１：１９２５（１９８８）。 敗血症誘発物質と結合でき、結合後にいくつかの化学反応を開始する分子受容 体は、敗血症の症状の病因において極めて重要な役割を果たしている。ＣＤ１４ は、単球及びマクロファージの表面で強力に発現し好中球のような顆粒球の表面 では弱く発現する５５−ｋＤの糖タンパク質である。Ｓ．Ｍ．Ｇｏｙｅｒｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３９０９（１９８６）。Ａ．Ｈａｚｉｏｔら，Ｊ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：５４７−５５２（１９８８）；Ｓ．Ｍ．Ｇｏｙｅｒ ｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４９７（１９８８）。 ヒト及びマウスのＣＤ１４のｃＤＮＡ及び遺伝子はクローニ ングされ配列決定されている。Ｅ．Ｆｅｒｒｅｒｏ と Ｓ．Ｍ．Ｇｏｙｅｒｔ ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：４１７３（１９８８）；Ｓ．Ｍ．Ｇｏｙ ｅｒｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４９７（１９８８）；Ｍ．Ｓｅｔｏｇｕｃ ｈｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １００８：２１３−２２ （１９８９）。ＣＤ１４は、切断可能なグリコシルホスファチジルイノシトール 尾部〔Ａ．Ｈａｚｉｏｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：５４７−５５２（１ ９８８）〕によって、成熟単球、マクロファージ、顆粒球及び樹枝状細網細胞、 腎の非糸球体内皮、並びに拒絶された肝臓の肝細胞、の外質表面に結合する。 ＣＤ１４はＬＰＳに結合することによって応答を仲介する。ＬＰＳとｓＣＤ１ ４との複合体は１：１の化学量論を示し（Ｈａｉｌｍａｎ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ ．Ｍｅｄ． １７９：２６９−２７７（１９９４））、これらの複合体は単球中の ＴＮＦ−αの産生（Ｄｅｎｔｅｎｅｒ，Ｍ．Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７： ２８８５−２８９１（１９９３））、星状膠細胞中のＩＬ−６の産生（Ｆｒｅｙ ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６６５−１６７１（１９９２））、 内皮細胞中の接着 分子の産生（Ｆｒｅｙ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６６５−１６ ７１（１９９２））、及び、ＰＭＮ（多形核好中球）中の白血球インテグリンの 活性化（Ｈａｉｌｍａｎ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：２６９−２７ ７（１９９４）を開始させる。ＣＤ１４に対するＬＰＳの自発的結合は緩慢であ るが、ＬＢＰによってこの結合が飛躍的に促進され得る。ＬＢＰは触媒的に作用 し、１分子のＬＢＰが数百のＬＰＳ分子を数百のＣＤ１４分子に移動させる。 別の実験は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ，及びＳ．ｍｉｔｕｓ のようなグラム陽性菌の成分とＣＤ１４との相互作用も細胞活性化を誘発するこ とを示した（Ｐｕｇｉｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：５０９−５１６（１９９４ ）。更に、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓ ）の細胞壁に由来のリポアラビノマンナンとＣＤ１４との相互作用も細胞活 性化をＣＤ１４依存的に誘発する（Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ． ９１：２０７６−２０８３（１９９３）；Ｐｕｇｉｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：５０９−５１６（１９９４））。これらの研究は、ＣＤ１４が多様な細菌構 造を認識する受容体であることを示唆する。ＣＤ １４とこれらの構造との相互作用が宿主の炎症性応答を開始させる。 ＣＤ１４に対するいくつかの中和モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）はｉｎ ｖ ｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＬＰＳに対する細胞性応答に拮抗することが判明 した（ｉｎ ｖｉｔｒｏに関しては、Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２４９，１４３１−１４３３（１９９０）；Ｈａｉｌｍａｎ，Ｅ．ら，Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７９，２６９−２７７（１９９４）；Ｆｒｅｙ，Ｅ．Ａ．ら ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６，１６６５−１６７１（１９９２）；Ａｒｄｉｔ ｉ，Ｍら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１，３１４９−３１５６（１９９３） ；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３，１２８１−１２８ ６（１９９１）；Ｄｅｎｔｅｎｅｒ，Ｍ．Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０ ，２８８５−２８９１（１９９３）；Ｇｒｕｎｗａｌｄ，Ｕ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５５，２２５−２３２（１９９２）参照、ｉｎ ｖ ｉｖｏに関しては、Ｌｅｔｕｒｃｑ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｍｅｅ ｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ３ｒｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎ ｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２２（Ａｂｓｔｒａ ｃｔ）（１９９４））；Ｗｒｉｇｈｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ９０：１４３１−１ ４３３（１９９０）参照）。追加のｉｎ ｖｉｖｏデータでは、ＣＤ１４中和モ ノクローナル抗体を注射した動物はＬＰＳに対する反応低下を示し、ＣＤ１４欠 失マウスはＬＰＳに対して反応しないことが証明された。これらの実験は、ＬＰ Ｓと膜ＣＤ１４との相互作用を阻害することによって炎症性サイトカインの放出 を遮断できることを示唆する。 また、ＣＤ１４が正常血清またはネフローゼ患者の尿から検出される可溶性タ ンパク質として存在することも判明した。最近の証拠は、ｓＣＤ１４が、内皮細 胞及び上皮細胞のような膜ＣＤ１４が欠失している細胞中でＬＰＳ依存性応答を 生じ得ることを示した。ｓＣＤ１４はこの種の細胞中でＬＰＳと結合するとき、 炎症性サイトカインの放出及び接着分子のアップレギュレーションを促進する。 全血アッセイで高濃度のｓＣＤ１４が単球からの炎症性サイトカインの放出を 遮断するという注目すべき知見が得られた。このアッセイでｓＣＤ１４が示した 有利な効果は、マクロファ ージ及びＰＭＮ上のｍＣＤ１４からＬＰＳを遠ざけるその能力に起因すると推定 される。従って、ｓＣＤ１４は、ＣＤ１４中和モノクローナル抗体と同様に、ｍ ＣＤ１４中のＬＰＳの相互作用を有効に阻止し得るであろう。しかしながら、ｓ ＣＤ１４は内皮細胞中で炎症性サイトカインを誘発するという別の特性を有して おり、この特性が、ＬＰＳに媒介される炎症性障害を治療するためのｓＣＤ１４ の使用を制約している。従って、ＬＰＳに結合する能力を維持しながら内皮細胞 を活性化しないｓＣＤ１４分子が得られるならば、この分子は炎症の治療におい て卓越した特性を有するに違いない。 モノクローナル抗体はｓＣＤ１４中の細胞活性化に必要なドメインの同定を補 助する有効なツールとなり得る。本発明者らは、ｍＡｂ ＭＥＭ−１８及び３Ｃ １０がアミノ酸１５２で切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）されたｓＣＤ１４突然変異 体を認識することを証明し、これらの２つのｍＡｂに対するエピトープが最初の １５２個のアミノ酸内部に存在することを示した（Ｊｕａｎ，Ｔ．Ｓ．−Ｃ．ら ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１３８２−１３８７（１９９５））。本発 明者らは更に、ＭＥＭ−１８のエピトープがアミノ酸５７と６４との間に 存在すること、及び、この領域もＬＰＳの結合に必須であることを知見した（Ｊ ｕａｎ，Ｔ．Ｓ．−Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，５２１９−５２ ２４（１９９５））。この領域が欠失すると、ＭＥＭ−１８の結合だけでなくＬ ＰＳの結合も途絶した。 ｍＡｂ ３Ｃ１０に対するエピトープはＣＤ１４の別の機能ドメインを規定す る。このｍＡｂは、ＭＥＭ−１８の認識領域とは異なる領域を認識すると考えら れる（Ｊｕａｎ，Ｔ．Ｓ．−Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１３８ ２−１３８７（１９９５））。モノクローナル抗体３Ｃ１０がｓＣＤ１４に結合 しても、ｓＣＤ１４に対するＬＰＳの結合には影響がない（Ｊｕａｎ，Ｔ．Ｓ． −Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，５２１９−５２２４（１９９５） ）。これは、このエピトープがＬＰＳ結合以外の細胞機能に関与するらしいこと を示唆する。 上述の理由から、本発明の１つの目的は、敗血症のような炎症性疾患の諸症状 の予防を含む有効な処置の方法及び療法を開発することである。また、敗血症の ような炎症症状に苦しむ恐れのある個体を有効に保護するための方法及び療法を 開発する ことも本発明の目的の１つである。 本発明の別の目的は、ＬＰＳ、グラム陰性菌血症、グラム陽性菌細胞成分、グ ラム陽性菌血症、マイコバクテリアのリポアラビノマンナン、マイコバクテリア 感染症及び／またはＣＤ１４によって媒介される疾病の諸症状の予防を含む有効 な処置の方法及び療法を開発することである。このような疾病としては、ＡＲＤ Ｓ、敗血症ショック、急性膵炎、急性及び慢性の肝不全、腸または肝臓の移植、 炎症性腸疾患、骨髄移植の移植片対宿主病並びに結核がある。発明の概要 本発明の発明者らは、リポ多糖（ＬＰＳ）に結合でき、その結果として膜ＣＤ １４に対するＬＰＳまたはグラム陽性菌細胞成分の結合を阻害し、従ってＣＤ１ ４によって仲介される炎症性応答を低下または消去させる一群のポリペプチドを 見出した。本明細書中で使用するＬＰＳの結合阻害なる表現は、グラム陽性菌細 胞成分に対する結合の阻害も意味する。本発明者らはＣＤ１４中のＬＰＳ結合ド メインの重要な発見に基づいてこのグループのポリペプチドを設計した。 本発明のポリペプチドは、好ましくは可溶性形態のＣＤ１４ の７−１０位の天然アミノ酸を、中性アミノ酸好ましくは水素またはＣ１−Ｃ６ のアルキル側鎖を有する中性アミノ酸で置換することに基づく。本発明のポリペ プチドはまた、図１のアミノ酸１５から始まるポリペプチドを包含する。図１を 参照すると、「可溶性」ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）は、１位から６位までのうちの １つのアミノ酸で始まり１５２位から３４８位までのうちの１つのアミノ酸で終 わる配列から選択された分子である。天然型のヒトＣＤ１４は、図１のＸ₁−Ｘ₄ としてＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐを有している。好ましくは、ポリペプチ ドの７−１０位の各々がアラニンで置換されている。 本発明のポリペプチドはＬＰＳに結合でき、その結果として、微生物細胞成分 が膜ＣＤ１４に結合することを阻止し得る。微生物細胞と膜ＣＤ１４との相互作 用が阻止されると、炎症、特に敗血症に導く事象のカスケードが抑制または阻止 される。従って、本発明のポリペプチドは抗炎症性を有している より詳細には、本明細書中で提示された証拠は特に、ＣＤ１４のアミノ酸７− １０の領域がアラニン残基で置換されたポリペプチドまたは可溶性ＣＤ１４から アミノ酸１−１４が欠失したポリペプチドはＬＰＳに結合するが、ＬＰＳに応答 したサ イトカインＩＬ−６産生のような、該ポリペプチドに仲介される細胞の炎症性応 答が天然型ＣＤ１４に比較して実質的に低下していることを示す。 後出の実施例において本発明者らは、ｓＣＤ１４中で一連の部位特異的アラニ ン置換突然変異体を作製することによって３Ｃ１０のエピトープを同定する。本 発明者らは、３Ｃ１０の結合にはアミノ酸７−１４の領域が必要であることを示 す。発明者らは更に、アミノ酸７−１０にアラニン置換を有するｓＣＤ１４突然 変異体（ｓＣＤ１４_(7ー10)A）を作製することによってこのドメインを特性決定 した。この突然変異体は、ＬＰＳを結合することはできたが、ＬＰＳに対する細 胞性応答を仲介する能力は低下していた。 本発明のペプチド及びポリペプチドは、（ａ）標準合成方法、（ｂ）ＣＤ１４ からの誘導、（ｃ）組換え方法、（ｄ）方法（ａ）から（ｃ）の組合せまたは（ ａ）から（ｃ）のいずれか１つ以上と別のポリペプチド製造方法との組合せ、に よって製造できる。 本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドを適当な医薬用担体物質に取込ませ 、ヒト（または他の哺乳動物）のような治療 を要する患者に有効量を投与することによって治療目的または予防目的に使用さ れ得る。図面の簡単な説明 従って、本発明の多くの別の態様及び利点は、添付図面を参照した以下の詳細 な記載から明らかであろう。 図１は、３４８個のアミノ酸を有する可溶性ヒトＣＤ１４の配列図であり、ア ミノ酸７−１０（Ｘ₁−Ｘ₄として示す）は天然型成熟ヒトＣＤ１４ではＧｌｕ− Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐである。本発明のポリペプチド中のアミノ酸７−１０は 本明細書中に記載のアミノ酸のいずれかでよい。 図２は、ｓＣＤ１４アラニン置換突然変異体の配列及び発現を示す。 図３は、ｓＣＤ１４のアラニン置換突然変異体に対するモノクローナル抗体３ Ｃ１０の結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果を示す。電気穿孔の４日後にＤＮＡ非 含有（ＭＯＣＫ）、ｓＣＤ１４_1-348またはｓＣＤ１４突然変異体でトランスフ ェクトしたＣＯＳ−７細胞からならし培地（ＣＭ）で収集した。全部のＣＭにつ いて、本明細書の実施例の項で記載の手順で抗体３Ｃ１０に対する結合能力を分 析した。１つの実験を４回反復 して相対応答単位（ＲＲＵ）を記録し、平均±標準偏差として算出した。 図４は、ｍＡｂ ３Ｃ１０が精製ｓＣＤ１４_(7-10)Aを認識しないことを示す 。ｍＡｂ ３Ｃ１０をセンサチップに固定化する方法は文献に記載されている（ Ｊｕａｎ，Ｔ．Ｓ．−Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１３８２−１ ３８７（１９９５））。注射には１０μｇ／ｍｌのｓＣＤ１４_1-348またはｓＣ Ｄ１４_(7-10)Aを使用した。種々の「段階」での溶液の注入をセンサグラムに示 す。「洗浄」は実施例の項に記載のようなＨＢＳバッファを用いる洗浄段階を示 す。実験を３回反復し、１つの実験の結果を示す。 図５は、ｓＣＤ１４_(7-10)AにはＬＰＳに対する細胞性応答を生じる能力が欠 損していることを示す。Ａ．ｓＣＤ１４_(7-10)Aでは、Ｕ３７３細胞によるＩＬ −６産生を刺激する能力が低下している。Ｕ３７３細胞をＬＰＳ（２０ｎｇ／ｍ ｌ）の存在下または非存在下で種々の濃度のｓＣＤ１４_1-348またはｓＣＤ１４_{( 7-10)A} によって２４時間処理した。ＩＬ−６のレベルを文献に記載の手順で測定 した（Ｊｕａｎ，Ｔ．Ｓ．−Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１３８ ２−１３ ８７（１９９５））。提示したデータは、１つの実験を３回反復することによっ て得られた４つの読取り値の平均±標準偏差である。Ｂ．ｓＣＤ１４_1-348はＬ ＰＳ及びＬＢＰに対するＰＭＮの応答を仲介するが、ｓＣＤ１４_(7-10)Aは仲介 しない。新しく単離したＰＭＮを「スムース（ｓｍｏｏｔｈ）」ＬＰＳ（大腸菌 ０１１１：Ｂ４ ３０ｎｇ／ｍｌ）、ｒＬＢＰ（１μｇ／ｍｌ）、及び、指定濃 度のｓＣＤ１４_1-348またはｓＣＤ１４_(7-10)Aと共に３７℃で１０分間インキュ ベートした。細胞を洗浄し、フィブリノーゲン被覆ウエルに対する接着量を測定 した（Ｈａｉｌｍａｎ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，２６９−２７７ （１９９４），２５）。誤差線は重複する３つの測定値の標準偏差を示す。 図６は、ｓＣＤ１４_(7-10)AがＮＦ−κＢを活性化しないことを示す。種々の 処理（レーン１、対照；レーン２、ＬＰＳ；レーン３、ｓＣＤ１４_1-348；レー ン４、ｓＣＤ１４_1-348とＬＰＳ；レーン５、ｓＣＤ１４_(7-10)A；レーン６、ｓ ＣＤ１４_(7-10)AとＬＰＳ；レーン７、ｓＣＤ１４_Δ(57-64)A；レーン８、ｓＣ Ｄ１４_Δ(57-64)AとＬＰＳ）によってＵ３７３細胞の全細胞抽出物を採取し、実 施例の項に記載の手順で標識 ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドにタンパク質を結合させた。４．５％の未変性ポ リアクリルアミドゲルでＮＦ−κＢの複合体を分離した。電気泳動後、ゲルを乾 燥し、Ｘ線フィルムに１６時間露光した。標識プローブとＮＦ−κＢとの複合体 を示す。 図７は、ｓＣＤ１４_(7-10)Aが³Ｈ−ＬＰＳと安定な複合体を形成することを示 す。実施例の項に記載の手順を用い、種々の濃度のｓＣＤ１４_1-348（レーン２ −４）またはｓＣＤ１４_(7-10)A（レーン５−７）を３μｇ／ｍｌの³Ｈ−ＬＰＳ と共に、１６．７ｎＭのｒＬＢＰの非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）でインキ ュベートした。レーン１は追加タンパク質の非存在下のＬＰＳを含む。混合物を ４−２０％の未変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動し、フルオログラフィー用 に処理した。複合体を形成しないＬＰＳの位置及びＬＰＳとｓＣＤ１４_1-348ま たはｓＣＤ１４_(7-10)Aとの複合体の位置を示す。 図８は、ｓＣＤ１４_(7-10)AによるＬＰＳ誘発細胞応答の阻害を示す。Ａ．ｓ ＣＤ１４_(7-10)AによるＬＰＳ誘発ＰＭＮ接着の阻害。ラフ（ｒｏｕｇｈ）ＬＰ Ｓ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒ６０，１０ｎｇ／ｍｌ）を 、ＬＢＰ 及び種々の濃度のｓＣＤ１４_1-348またはｓＣＤ１４_(7-10)Aと共に、ＰＭＮを添 加する前に３７℃で３０分間インキュベートした。実施例の項に記載の手順でフ ィブリノーゲンに対するＰＭＮの接着を測定した。誤差線は、３つの読取り値か らの標準偏差を示す。Ｂ．ｓＣＤ１４_(7-10)Aによる全血中のＴＮＦ−α産生の 阻害。実施例の項に記載の手順で、２５０μｌの全血を種々の濃度のウシ血清ア ルブミン、ｓＣＤ１４_1-348またはｓＣＤ１４_(7-10)Aと共に、０．２５ｎｇ／ｍ ｌのスムースＬＰＳ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ野生型）の存 在下で３７℃で３時間インキュベートし、ＴＮＦ−α産生を測定した。ＴＮＦ− αの産生比率は、外来タンパク質の存在下で産生されたＴＮＦ−αを、添加タン パク質の非存在下で産生されたＴＮＦ−αによって除算した比で示される。誤差 線は６つの読取り値で生じた標準偏差である。 図９は、グラム陽性菌細胞成分がｓＣＤ１４に対する結合に関してＬＰＳと競 合することを示す。³Ｈ−ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を加えたｓＣＤ１４（５０μ ｇ／ｍｌ）を単独で（レーン１）、またはＬＰＳと共に（レーン２）またはＳｔ ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ粗抽出物（ＳＡＣＥ）と共に （レーン３−６）、１ｍＭのＥＤＴＡを加えたＰＢＳ中で３７℃で１７時間イン キュベートした。次いでサンプルを未変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動し、 ラジオオートグラフィーによって放射性バンドの位置を測定した。好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌の細胞成分（例えばグラム陰性菌 由来のＬＰＳ）に応答したＩＬ−６産生のような、ＣＤ１４によって仲介される 炎症性細胞応答に関与するＣＤ１４の領域が本発明者らによって発見されたこと に基づく。これらの発見の裏付けとなる証拠を後出の実施例で詳細に説明する。 図１は、アミノ酸７−１０に対応するＬＰＳ結合及びＩＬ−６誘発領域を含む ヒトＣＤ１４の配列図を示す。 本発明のポリペプチドは可溶性ＣＤ１４中の７−１０位（両端位置を含む）の アミノ酸を、天然型分子中のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換するかまたは可 溶性ＣＤ１４の最初の１４個のアミノ酸を欠失させることに基づく。図１を参照 すると、置換アミノ酸を含有するポリペプチド中のアミノ酸７−１０はＧｌｕ− Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐではない。好ましくは、置換 アミノ酸が中性アミノ酸である。これらの中性アミノ酸の側鎖は好ましくは、水 素及び炭素原子１−６個を有するアルキル基から成るグループから選択され、ア ルキル基は、ハロゲン（例えばＣｌ、Ｂｒ、Ｉ）、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＯＲ（Ｒ ＝炭素原子数１−６個のアルキル）及び近縁構造（ｒｅｌａｔｅｄ ｓｔｒｕｃ ｔｕｒｅｓ）から選択された１つ以上の置換基によって置換されていてもよい。 得られるポリペプチドがＬＰＳに結合でき及び／または単球中及びＰＭＮ中の炎 症仲介物質の放出を阻害し、同時に内皮細胞及び上皮細胞中の炎症性応答を誘発 する能力の低下（野生型ｓＣＤ１４に比較して）を示す限り、アミノ酸７−１０ に置換するアミノ酸の詳細はそれほど重要ではない。可溶性ＣＤ１４の最初の１ ４個のアミノ酸が欠失した本発明のポリペプチドは、ｓＣＤ１４中の１５２位か ら３４８位までのうちの１つのアミノ酸で終止する。好ましい欠失型ペプチドは 、図１のアミノ酸１５−１５２及び１５−３４８である。 （置換アミノ酸以外の）ポリペプチドの残部は、一般に、天然型の可溶性ＣＤ １４と等しい。「可溶性ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）」なる用語は、図１の１−６位 から１５２−３４８位ま でのアミノ酸に対応するポリペプチドを意味する。本明細書では常に、本明細書 中で使用したアミノ酸の番号が図１のアミノ酸配列に対応することに留意された い。例えば、特定の可溶性ＣＤ１４が図１に示すアミノ酸２−６から開始する場 合であっても、置換されるべきアミノ酸は、図１の完全配列のアミノ酸７−１０ に対応するアミノ酸である。 本発明の説明のために、図１に示す分子をｓＣＤ１４またはｓＣＤ１４_1-348 と呼ぶ。可溶性ＣＤ１４の他の具体例は、図１の番号図に基づく開始アミノ酸と 終止アミノ酸とによって命名し、例えば、ｓＣＤ１４_1-152；ｓＣＤ１４_2-152； ｓＣＤ１４_15-152；ｓＣＤ１４_15-348などとする。図１のアミノ酸が置換された ポリペプチドは以下のように命名する。例えば、図１のアミノ酸７−１０にアラ ニンが置換したｓＣＤ１４_1-348はｓＣＤ１４_1-348(7-10)Aと命名する。この“ Ａ”は、アラニンというアミノ酸を示す１文字コードである。７位及び９−１０ 位にアラニンを有し８位にグリシンを有するｓＣＤ１４_1-348はｓＣＤ１４_{1-348 (7,9,10)A(8)G} と命名する。 本発明のポリペプチドの幾つかの好ましい特定例を以下に示す。 ｓＣＤ１４_1-348(7-10)G ｓＣＤ１４_1-152(7-10)G ｓＣＤ１４_1-348(7-10)A ｓＣＤ１４_1-152(7-10)A ｓＣＤ１４_1-348(7-10)V ｓＣＤ１４_1-152(7-10)V ｓＣＤ１４_1-348(7-10)L ｓＣＤ１４_1-152(7-10)L ｓＣＤ１４_1-348(7-10)I ｓＣＤ１４_1-152(7-10)I ｓＣＤ１４_1-348(7-10)P ｓＣＤ１４_1-152(7-10)P ｓＣＤ１４_15-348 ｓＣＤ１４_15-152 本発明はまた、本明細書中に開示されたポリペプチドの生理学的に許容され得 る塩を包含する。また、各ポリペプチド中に１つまたはそれ以上のＤまたはＬア ミノ酸が含まれていてもよい。しかしながら、全部のアミノ酸がＬ配置を有して いるのが好ましい。 本発明のポリペプチドは、天然型ｓＣＤ１４に比較して、細胞内の炎症性応答 を低下させる能力を有すると期待されている。炎症の低下を便利に測定するため には、例えば後出の実施例４に記載の方法を用い、このような細胞によるＩＬ− ６の産生を測定する。ＩＬ−６は、天然型ｓＣＤ１４に比較して、好ましくは１ ／５以下、特に好ましくは１／１０以下に減少するであろう。 また、どの場合にも、ＩＬ−６（または近縁のサイトカイン）の誘発能力の低 下につながるようなＬＰＳ結合が維持されている限り、アミノ酸が化学的に誘導 体化されてもよい。従って、本発明のポリペプチドの「化学的誘導体」なる用語 は、本明細書中で使用した「ポリペプチド」という用語の範囲に包含される。こ れらの化学的誘導体は、Ｘ₁−Ｘ₄のアミノ酸が置換されたポリペプチド部分でな い追加の化学的部分を含有している。 ポリペプチドの共有結合修飾は本発明の範囲に包含される。このような修飾は 、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応し 得る有機誘導化剤と反応させることによって分子内に導入し得る。 ヒスチジル残基は、ジエチルピロカーボネートとｐＨ５．５〜７．０で反応さ せることによって誘導体化する。その理由は、この物質がヒスチジル側鎖に比較 的特異的なためである。パラブロモフェナシルブロミドも有用である。好ましく はｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で反応を惹起する。 リシニル及びアミノ末端残基は、無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反 応する。これらの物質による誘導体化はリシニル残基の電荷を反転させる効果を 有する。アルファ−アミノ −含有残基を誘導体化する他の適当な試薬としては、メチルピコリンイミデート のようなイミドエステル、ピリドキサルホスフェート、ピリドキサル、クロロボ ロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４ペン タンジオンがあり、トランスアミナーゼに触媒されるグリオキシレートとの反応 がある。 アルギニル残基は、１種または複数の慣用の試薬との反応によって修飾される 。試薬の例としては、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２ −シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化の 場合、グアニジン官能基のｐＫが高いのでアルカリ性条件で反応させる必要があ る。更に、これらの試薬は、リシンの基及びアルギニンのイプシロン−アミノ基 と反応し得る。 特にチロシル残基自体の修飾は熱心に研究されており、芳香族ジアゾニウム化 合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトルラベ ルを導入することが特に関心を集めている。Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニ トロ誘導体を夫々形成するために、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロ メタンが頻用されている。 カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル −３−（２−モルフォリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル −３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのようなカ ルボジイミド（Ｒ′−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ′）との反応によって選択的に修飾される 。更に、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンと反応するこ とによってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。 グルタミニル及びアスパラギニル残基はしばしば脱アミド化されて対応するグ ルタミル及びアスパルチル残基になる。または、これらの残基を弱酸性条件下で 脱アミド化してもよい。これらの残基のどちらの形態も本発明の範囲内に包含さ れる。 二価性試薬による誘導体化は、ペプチドまたはそれらの機能性誘導体を水不溶 性支持マトリックスまたは他の高分子担体に架橋させるために有用である。常用 の架橋剤の例としては、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン 、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４− アジドサリチル酸とのエステル、３，３′−ジチオビス（スクシニミジルプロピ オネート）のようなジスクシニミジル エステルを含むホモ二価性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オ クタンのような二価性マレイミドがある。メチル−３−〔（ｐ−アジドフェニル ）ジチオ〕プロピオイミデートのような誘導化剤は、光の存在下で架橋構造を形 成し得る光活性化可能な中間体を生じる。または、臭化シアンで活性化された炭 水化物のような反応性の水不溶性マトリックス及び米国特許第３，９６９，２８ ７号、第３，６９１，０１６号、第４，１９５，１２８号、第４，２４７，６４ ２号、第４，２２９，５３７号及び第４，３３０，４４０号の各明細書に記載さ れている反応性基質がタンパク質固定化のために使用される。 その他の修飾としては、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリルまたは トレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓのイオウ原子の酸化、リシ ン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のアルフア−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌ ｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓ ａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンの アセチル化、及び、いくつかの場合には、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化があ る。 所望の特性に基づく適当なスクリーニングアッセイでポリペプチド変異体の活 性をスクリーニングする。本明細書中に記載のような適当なバイオアッセイで生 物学的活性をスクリーニングする。例えば、ＬＰＳとＣＤ１４（または本発明の ポリペプチド）との結合は、標準的な競合結合アッセイで測定するとよい。細胞 の炎症性応答を低下させる活性は、本明細書中に記載のように細胞（例えばＵ３ ７３細胞）によるＩＬ−６産生の低下によって測定し得る。 レドックスもしくは熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、また は、担体と共に凝集する傾向もしくはマルチマーとして凝集する傾向のようなポ リペプチド特性の変化は、平均的な当業者に周知の方法で検定される。 このような誘導体化した部分は、溶解性、吸収、生物学的半減期、などを改善 し得る。または、このような部分は、タンパク質の望ましくない副作用を除去ま たは軽減し得る。このような作用を仲介し得る部分は例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏ ｎのＰｈａｒｃｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈｅｄ．，Ｍ ａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（１９８０）に開 示されている。 本発明のポリペプチドはまた、ポリペプチド、非ＣＤタンパク質、直鎖状ポリ マー（ポリエチレングリコール、ポリリシン、など）、分枝状ポリマー（例えば 、１９８１年９月１５日発行のＤｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらの米国特許第４，２ ８９，８７２号、１９９３年７月２０日発行のＴａｍの米国特許第５，２２９， ４９０号、１９９３年１０月２８日公表のＦｒｅｃｈｅｔらのＷＯ９３／２１２ ５９参照）、脂質、コレステロール群（例えばステロイド）、または炭水化物も しくはオリゴ糖のような担体分子に共有結合または非共有結合し得る。 本発明のポリペプチドはＬＰＳに結合する能力を有していると期待されている 。この結合によってＬＰＳはマクロファージの膜ＣＤ１４（ｍＣＤ１４）に結合 することができなくなり、従って、哺乳動物中で抗炎症性応答が生じる。更に、 本発明のポリペプチドにおいては、内皮細胞及び上皮細胞のようなｍＣＤ１４欠 失細胞中の炎症性応答をトリガーする能力が低下している。本発明のポリペプチ ドはまた、炎症の原因となるグラム陽性菌細胞の細胞成分に結合すると予想され る（これらの細胞成分はＬＰＳと類縁であるが、グラム陽性菌中で細胞に対する 炎症性応答を生じる（１つまたは複数の）構造は未解明で ある）。ＬＰＳに対する「結合」なる用語は、標準的な競合アッセイで、ポリペ プチドが、１ｍＭと１ｎＭとの間、好ましくは１００μＭと１０ｎＭとの間のＬ ＰＳに対するＣＤ１４の結合を５０％阻害し得ること（ＩＣ₅₀値）を意味する。 標準的な結合アッセイは当業界で周知の手順で行う。 本発明のポリペプチドは多様な方法で製造できる。例えば、固相合成技術を使 用し得る。適当な技術は当業界で周知であり、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｐｐ．３３５−６１（Ｋａｔｓｏｙａｎ ｎｉｓ と Ｐａｎａｙｏｔｉｓ編１９７３）：Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａ ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ，８５，２１４９（１９６３）；Ｄａｖｉｓら，Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ’ｌ ，１０，３９４−４１４（１９８５）；Ｓｔｅｗａｒｔ と Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ ｓ （１９６９）；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎら，Ｔｈｅ Ｐｒ ｏｔｅｉｎｓ ，３ｒｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１０５−２５３（１９７６ ）；及びＥｒｉｃｋｓｏｎら，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，３ｒｄ ｅｄ．，ｖ ｏｌ．２，ｐｐ．２５７−５２７（１９７６）に記載の技術がある。 更に、組換えＤＮＡ技術を用いて形質転換宿主細胞中でポリペプチドを製造す るのが極めて好ましい。このためには、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ 分子を作製する。このようなＤＮＡ分子の作製方法は当業界で周知である。例え ば、ポリペプチドをコードする配列を適当な制限酵素によってＤＮＡから切り出 すことができる。または、ホスホアミダイト法のような化学的合成技術を用いて ＤＮＡ分子を合成できる。また、これらの技術を併用することも可能である。 本発明はまた、適当な宿主中でペプチドを発現し得るベクターを包含する。ベ クターは、適当な発現調節配列に作動可能に結合されたペプチドをコードするＤ ＮＡ分子から成る。ＤＮＡ分子をベクターに挿入する前または挿入後にこの作動 可能調節配列の結合を行う方法は周知である。発現調節配列としては、プロモー ター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開 始シグナル、終止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び 、転写または翻訳の調節に関与する他のシグナルがある。 得られたＤＮＡ分子保有ベクターを使用して適当な宿主を形質転換させる。こ の形質転換は当業界で周知の方法で行うとよ い。 本発明を実施するために、入手可能な公知の多数の宿主細胞のいずれを使用し てもよい。特定の宿主の選択は、当業界の技術によって認識されている多数の要 因に依存する。このような要因としては例えば、選択された発現ベクターとの適 合性、ＤＮＡ分子によってコードされているペプチドのベクターに対する毒性、 形質転換の速度、ペプチドの回収容易性、発現特性、生体安全性及び経費がある 。特定のＤＮＡ配列の発現に必ずしも全部の宿主が同等に有効であるとは限らな いことを理解してこれらの要因の均衡を図る必要がある。 これらの一般指針に適う有用な微生物宿主としては、細菌（例えば大腸菌種） 、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種）、及び他の菌類、昆虫、植物、 哺乳動物（ヒトを含む）の培養細胞、または当業界で公知の他の宿主がある。 次に、所望のペプチドが発現するように形質転換宿主を慣用の発酵条件下で培 養する。このような発酵条件も当業界で周知である。 最後に、培養物からポリペプチドを精製する。これらの精製方法も当業界で周 知である。 本発明のポリペプチドは、ＬＰＳ／グラム陽性菌細胞成分との結合が必要であ るような多数の状況のいずれにおいても使用できる。例えば、炎症性腸疾患、急 性及び慢性の肝不全、移植片対宿主病（骨髄移植）、腸または肝臓の移植、ＡＲ ＤＳ、急性膵炎及び結核に対して治療的及び予防的にポリペプチドを使用し得る 。特に好ましい標的疾患は敗血症ショックである。 新規なポリペプチドは、ヒトを含む哺乳動物の敗血症ショックの予防または治 療のために体重１ｋｇあたり約０．１〜１００ｍｇの用量、好ましくは約１〜５ ０ｍｇ／ｋｇのレベルで有効であり、この量を例えば１日用量を基準として分割 用量で投与してもよい。ポリペプチドは、敗血症ショックの原因となるような生 物に接触するかもしれない患者または接触した患者に予防的に投与されてもよく 、または、上記と同じ用量の使用によるＬＰＳ（細菌性内毒素）を解毒するため に、内毒素汚染のｉｎ ｖｉｖｏ；ｉｎ ｖｉｔｒｏの解毒または予防を所望の 結果を達成するために有効なレベルで行ってもよい。その量は、約１モルの内毒 素に１モルのポリペプチドが結合するという前提に基づいて常用の実験手順に基 づいて決定し得る。特定のポリペプチドの特定の用量は、特定の用途または疾病 の重 篤度及び宿主の体調などに依存して本明細書中で特定した範囲内または範囲外で 変更し得る。当業者は標準手順を用いて適正用量を確認し得るであろう。 本発明の医薬組成物は予定の目的を果たす任意の手段によって投与され得る。 例えば、皮下、静脈内、皮膚内、筋肉内、腹腔内、莢膜内、経皮、または口腔内 などの経路で投与し得る。代替的にまたは同時に、経口または直腸経路で投与し てもよい。医薬組成物は、全量（ｂｏｌｕｓ）注入または長時間の漸次的潅流に よって非経口投与されてもよい。 これらの医薬組成物はポリペプチドに加えて医薬上許容され得る適当な担体を 含有し得、担体は有効成分を医薬として使用できる製剤に容易に加工するための 助剤及び賦形剤から成る。製剤、特に、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤のような経 口投与でき且つ好ましい投与形態で使用できる製剤、座剤のような直腸投与でき る製剤、並びに、注射によってもしくは経口的に投与できる適当な溶液剤は、好 ましくは約０．１〜約９９％、より好ましくは約２５〜８５％の（１種以上の） 活性化合物を賦形剤と共に含有している。 適当な賦形剤としては特に、糖、例えばラクトース、スクロ ース、マンニトールもしくはソルビトールのような充填剤；セルロース調製物、 及び／またはリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウムのようなリン酸カ ルシウム；トウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチ ン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロー ス、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、及び／またはポリビニルピロリド ンを用いて調製される澱粉ペーストのような結合剤がある。所望の場合、上記澱 粉、カルボキシメチル澱粉、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、または、アルギ ン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどの塩のような崩壊剤を添加してもよい。 本発明組成物中で使用できる助剤としては、シリカ、タルク、ステアリン酸もし くはその塩のような滑沢剤及び流動調整剤、並びに、Ｔｒｉｔｏｎ及び／または ポリエチレングリコールのような界面活性剤がある。 本明細書に含まれる教示に基づいて本発明の教示を特定の課題または状況に応 用することは当業者の能力の範囲内にあることは理解されよう。本発明物質の実 施例を以下に説明する。 実施例 材料及び方法 試薬 組換え可溶性ＣＤ１４（ｒｓＣＤ１４）及び組換えＬＢＰ（ｒＬＢＰ）は、Ha ilman,E.ら、J.Exp.Med．179，269-277(1994)に記載の通り、構築し、精製した 。全ての精製タンパク質の濃度は、製造業者の説明書の通りにミクロＢＣＡプロ テインキット（Pierce，Rockford，IL）により測定した。完全長のｒｓＣＤ１４ は成熟タンパク質の位置３４８で終るので(Hailman,E.ら、J.Exp.Med.179，269- 277(1994))、本明細書でそれをｓＣＤ１４_1-348という。抗ＣＤ１４ｍＡｂ ３Ｃ １０は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ２２８）からの 細胞系列のならし培地からプロテインＧ上のクロマトグラフィーによって精製し た。ウサギポリクローナル抗ヒトＣＤ１４抗血清は、Juan,T.S.-C.ら、J.Biol.C hem.270，1382-1387(1995)に記載の通り調製した。ラフＬＰＳ（Salmonella min nesota R60又はRe595）及びスムースＬＰＳ（E.coli 0111:B4又はSalmonellamin nesota 野生型）は、LIST Biological Laboratories （Campbell,CA）から購入した。ＤＮＡ操作用酵素は、Boehringer Mannheim（In dianapolis，IN）から購入した。部位特異的変異誘発 ｓＣＤ１４の９種のアラニン置換変異体を本研究で使用した。図２は、各変異 体の名称と置換されたアミノ酸残基を要約する。トランスフォーマー部位特異的 変異誘発キット（Clontech，Palo Alto，CA）を以前に記載された（Juan,T.S.-C .ら、J.Biol.Chem．270，5219-5224(1995)）通りに使用して、哺乳動物発現ベク ター中にクローン化された、ｓＣＤ１４のアラニン置換変異体をコードするｃＤ ＮＡを作製した。各変異体のために使用したプライマーは以下の通り： ＣＯＳ−７細胞におけるｓＣＤ１４変異タンパク質の一過性発現 ｓＣＤ１４変異タンパク質を発現させるために、ｓＣＤ１４変異体ｃＤＮＡを 含む哺乳動物発現ベクターを、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）細胞に エレクトロポレーションで導入した。エレクトロポレーションの条件及びトラン スフェクトされたＣＯＳ−７細胞からの血清を含まないＣＭの作製は、Juan,T.S .-C.ら、J.Biol.Chem．270,1382-1387(1995)に記載の通りであった。変異ｓＣＤ １４の発現を、抗ＣＤ１４ポリクローナル抗体を用い、ウエスタンブロットで分 析した。ｓＣＤ１４変異体と３Ｃ１０ｍＡｂの相互作用のＢＩＡｃｏｒｅ分析 中和モノクローナル抗体３Ｃ１０によるｓＣＤ１４変異体タンパク質の認識を 、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー装 置で実験した。装置、ＣＭ５センサーチップ、及びアミン結合キットは、Pharma cia Biosensor（Piscataway，NJ）から購入した。要約すれば、ｍＡｂ ３Ｃ１０ （２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．４）中２００μｇ／ｍＬ）を、製造業者の 説明書の通り、アミン結合によってＣＭ５センサーチップに固定化した。それか ら、３Ｃ１０を固定化したフローセルを、以下のステップで詳述の溶液と順次イ ンキュベートした：ステップ１、ＣＯＳ−７ ＣＭ、２分間及びステップ２、Ｈ ＢＳ緩衝液［１０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタ ンスルホン酸、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０ ．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０（Pharmacia Biosensor）］、２分間。 再生のためには、１０ｍＭ ＨＣｌ溶液を２分間注入した。注入は５μＬ／分の 流速で行った。ＣＯＳ−７ ＣＭ中のｓＣＤ１４変異体の、固定化３Ｃ１０への 結合を定量化するために、相対的応答ユニット（ＲＲＵ）を計算した。ＣＭ注入 及び２分間洗浄後に記録された応答ユニット（ＲＵ）から、ＣＭ注入直前に記録 されたＲＵを差し引くことにより、ＲＲＵを得た。ｓＣＤ１４_(7-10)Aの精製 ｓＣＤ１４_(7-10)AをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、Hailman,E. ら、J.Exp.Med．179，269-277(1994)に記載の通りジヒドロ葉酸還元酵素欠損チ ャイニーズハムスター巣（ＣＨＯ）細胞に安定にトランスフェトした。無血清培 地中で単一のクローンを生育させ、ｓＣＤ１４_(7-10)Aを含むＣＭを産生させた 。セファロース４Ｂ（Pharmacia,Piscataway,NJ）に結合した抗ＣＤ１４ポリク ローナル抗体を用いて免疫アフィニティクロマトグラフィーを行ったことを除い て、正確にJuan,T.S.-C．ら、J.Biol.Chem．270，5219-5224(1995)に記載の通り に、変異タンパク質を精製した。サンプルの純度を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、次に銀染色又はクーマシーブルー染色で チェックした。変化したアミノ酸配列は、Ｎ−末端配列決定で証明した。Ｕ３７３バイオアッセイ Ｕ３７３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ１７，Rockville,MD）の生育、精製ｓＣＤ１ ４調製物による活性化、及びＩＬ−６の定量は、Juan,T.S.-C.ら、J.Biol.Chem ．270，1382-1387(1995)に記載の通り正確に行った。要約すれ ば、ｓＣＤ１４_1-348又はｓＣＤ１４_(7-10)AとＬＰＳの混合物を、血清無しの培 地中のＵ３７３細胞単層に加え、２４時間インキュベートした。それから、上清 のＩＬ−６をＥＬＩＳＡで測定した。多形核白血球（ＰＭＮ）接着アッセイ フィブリノーゲンでコートされたプレートにＰＭＮを接着させうるｒＬＢＰと ｓＣＤ１４_(7-10)A又はｓＣＤ１４_1-348の能力を、以前に確立されたプロトコル （Hailman,E.ら、J.Exp.Med．179，269-277(1994)；Juan,T.S.-C． ら、J.Biol. Chem． 270，1382-1387(1995)）により評価した。要約すると、ＰＭＮを、ＬＰ Ｓ、ｒＬＢＰ、及びｓＣＤ１４_(7-10)A又はｓＣＤ１４_1-348と１０分間インキュ ベートし、洗浄し、フィブリノーゲンでコートされた表面への接着をHailman,E ．ら、J.Exp.Med．179，269-277(1994)；Juan,T.S.-C．ら、J.Biol.Chem．270， 1382-1387(1995)に記載の通り測定した。このプロトコルでスムースＬＰＳを使 用したとき、接着は完全にｓＣＤ１４_1-348に依存する（Juan,T.S.-C．ら、J.Bi ol.Chem．270，1382-1387(1995)）。 ＬＰＳに結合し、ＬＰＳ仲介のＰＭＮ接着を阻害する、高濃度でのｓＣＤ１４_(7-10)A 又はｓＣＤ１４_1-348の能力も評価した。この実験で、ＰＭＮ添加前に、 ラフＬＰＳ（Salmonella minnesota R60、１０ｎｇ／ｍｌ）をｒＬＢＰ（１μｇ ／ｍＬ）と示した濃度のｓＣＤ１４_(7-10)A又はｓＣＤ１４_1-348と３７℃で３０ 分間インキュベートした。ＰＭＮの接着は、上記の通り測定した。電気泳動移動度シフトアッセイ Ｕ３７３細胞からの細胞まるごとの抽出液を調製し、転写因子ＮＦ−κＢの活 性化を評価した。刺激１日前に、密度１００万細胞／ウエルで、６穴プレートに 細胞を接種した。刺激のために、精製ｓＣＤ１４_1-348、ｓＣＤ１４_Δ(57-64)（ Juan,T.S.-C.ら、J.Biol.Chem．270，5219-5224(1995)）、又はｓＣＤ１４_{(7-10 )A} を、最終濃度２０ｎｇ／ｍｌで、Ｒｅ５９５ ＬＰＳ２０ｎｇ／ｍｌの存在下 又は不存在下で２０時間にわたって加えた。細胞を１×ＰＢＳ（GIBCO-BRL）で ２度洗浄し、１％トライトンＸ−１００（Sigma）を補充した溶解緩衝液（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９、２０％グリセロール、０．１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ジチオトレイト ール、１ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ(Boehrinqer Mannheim)、５μｇ／ｍＬ ロイペ プチン、１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、２μｇ／ｍＬアプロチニン）２ ００μＬ中にかきとった。粗抽出液を微量遠心分離チューブに移し、細胞破片を １４、０００×ｇ、４℃、１０分の遠心分離で分離した。抽出液を素早く液体窒 素で凍結し、−８０℃で保存した。細胞まるごとの抽出液のタンパク質濃度をミ クロＢＣＡアッセイで測定したが、それは１．５−２μｇ／μＬであった。 ＮＦ−κＢ複合体を試験するために、電気泳動移動度シフトアッセイを行った 。２種のオリゴヌクレオチド： をアニールし、ヒト免疫不全ウイルスロングターミナルリピートプロモーター（ Nabel,G.及びBaltimore,D.Nature 326，711-713(1987)）のＮＦ−κＢ結合部位 を含む二本鎖ＤＮＡを産生させた。それから、このアニールさせたＤＮＡフラグ メントを、クレノーフラグメント（ Boehrinqer Mannheim）とα−³²ＰｄＣＴＰ （Amersham，Arlinqton Heiqhts，IL）で充填し、こ れを、濃度５０，０００ｃｐｍ／レーン（約２５ｆｍｏｌｅ）でプローブとして 使用した。結合のために、細胞まるごとの抽出液４μＬを、５×結合緩衝液（１ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、４０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＤＴＴ 、１０％グリセロール）４μＬ、（ポリｄＩ−ｄＣ）：（ポリｄＩ−ｄＣ）（ph armacia,piscataway,NJ）２．５μｇ、放射性標識ＤＮＡプローブ、及び溶解緩 衝液適当量（最終容量を２０μＬ／反応にする）とインキュベートした。反応液 を３０℃水浴で３０分間インキュベートし、複合体を、０．５×ＴＢＥ（５０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４５ｍＭホウ酸、５ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用 する未変性４．５％ポリアクリルアミドゲル（３０ｍＡ、２時間）で分離した。 その後、ゲルを８０℃で１時間真空乾燥し、コダックＸ線フィルムに２０時間露 光した。。競合実験で、放射性プローブの添加前に、１００倍モル過剰の非標識 ＮＦ−κＢプローブを１０分間プレインキュベートした。未変性ＰＡＧＥアッセイ 精製ｓＣＤ１４調製物のＬＰＳ結合を直接評価するために、ｓＣＤ１４_1-348 又はｓＣＤ１４_(7-10)Aを種々の 濃度（０，１０１，３０３，９０９ｎＭ）で、E.coli Ｋ１２株ＬＣＤ２５から 調製した³Ｈ−ＬＰＳ（List Biological Laboratories）３μｇ／ｍＬと、１６ ．７ｎＭ ｒＬＢＰの存在下又は非存在下でインキュベートした。反応液を３７ ℃で３０分間インキュベートし、それから未変性の４−２０％ポリアクリルアミ ドゲルで電気泳動した。ゲルを、以前にHailman,E.ら、J.Exp.Med．179，269-27 7(1994)に記載された通りにフルオログラフィー用に調製した。全血におけるＬＰＳ誘導ＴＮＦ−α産生の阻害 ＬＰＳに結合し、全血中でＴＮＦ−α産生を阻害する、ｓＣＤ１４の能力につ いては、Haziot,A.ら、J.Immunol 152，5868-5876(1994)に記載されている。簡 単に説明すれば、種々の濃度の、５０μＬ ＲＰＭＩ培地(GIBCO-BRL，Gaithersb urg，MD）中に希釈した、ウシ血清アルブミン（Miles，New Haven，CT）、ｓＣ Ｄ１４_1-348又はｓＣＤ１４_(7-10)Aを、抗凝固剤としてヘパリンを使用して、２ ５０μＬの新鮮採取血液に加えた。スムースＬＰＳ（Salmonella minnesota 野 生型）を、最終濃度０．２５ｎｇ／ｍＬで加えた。反応液を、３７℃で３時間イ ンキ ュベートし、１６，０００×ｇで２分の遠心分離で上清を得た。上清のＴＮＦ− α濃度を、製造業者が指示したように、Quantikine ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキッ ト（R&DSystems，Minneapolis，MN）を用いてアッセイした。 実施例１ アミノ酸７〜１０又は１１〜１４のアラニン置換は、中和ｍＡｂ ３Ｃ１０とＣ Ｄ１４への結合を完全に妨げる ３Ｃ１０は、ＣＤ１４のＮ末端１５２アミノ酸を認識するｍＡｂである（Juan ,T.S.-C.ら、J.Biol.Chem.270，1382-1387(1995)）。３Ｃ１０は、ｓＣＤ１４_{1- 348} の活性を中和することを以前の実験は示した（Wright,S.D.ら、Science 249 ，1431-1433(1990)；Hailman,E.ら、J.Exp.Med．179，269-277(1994)；Frey,E.A .ら、J.Exp.Med．176，1665-1671(1992)；Wright,S.D.ら、J.Exp.Med．173，128 1-1286(1991)）。ｓＣＤ１４活性の中和がＮ末端１５２アミノ酸内のエピトープ の結合によることを証明するために、３Ｃ１０は、ｓＣＤ１４_1-348又はｓＣＤ １４_1-152によって仲介される、Ｕ３７３細胞のＩＬ−６産生を阻害することを 本発明者らは証明した（データは示さず）。 ｍＡｂ３Ｃ１０に対するエピトープを調べるために、一連のアラニン置換変異 体を部位特異的変異誘発で産生させた（図２）。種々のｓＣＤ１４変異体をコー ドするｃＤＮＡ配列を含むプラスミドをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、 これらの細胞からのＣＭを、ｓＣＤ１４変異タンパク質の発現についてウエスタ ンブロットで試験した。ｓＣＤ１４_(18-21)Aを除く全てのｓＣＤ１４変異体は、 ＣＯＳ−７細胞で発現分泌された（図２）。その後、ＢＩＡｃｏｒｅ分析（図３ ）を用い、３Ｃ１０に結合する変異体ｓＣＤ１４を含むＣＭの能力を試験した。 ｓＣＤ１４_(7-10)A又はｓＣＤ１４_(11-14)Aを含むＣＭは、３Ｃ１０に結合しな いことが知見された。これらのデータは、アミノ酸７〜１４の領域は、３Ｃ１０ を認識するのに関与することを示唆する。 実施例２ ｓＣＤ１４_(7-10)Aの精製及び特性決定 中和ｍＡｂ ３Ｃ１０はアミノ酸７〜１４を認識するので、本発明者らは、Ｃ Ｄ１４のこの領域は、ＣＤ１４の生物活性に重要な役割を果たしうるということ を結論した。この領域の役割の理解の助けとするために、ｓＣＤ１４₍₇ -10)Aを発現する安定なＣＨＯ細胞系を作製し、この細胞系の無血清ＣＭから変 異体タンパク質を精製した。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、精製ｓＣＤ１ ４_(7-10)Aは見掛けの分子量５５，０００の位置に移動した（データは示さず） 。Ｎ末端配列決定により、アミノ酸７〜１０はアラニン残基で置換されているこ とを確認した。 実施例３ ｍＡｂ ３Ｃ１０は、精製ｓＣＤ１４_(7-10)Aを認識しない ＢＩＡｃｏｒｅリアルタイム分析を再度使用して、ｍＡｂ ３Ｃ１０が精製ｓ ＣＤ１４_(7-10)Aに結合できるかどうかを測定した。図４は、ｓＣＤ１４_1-348は 固定化３Ｃ１０を認識し、洗浄後２分で１８００ＲＵの増加を引起す（Ｔ＝３０ ０でのＨＣｌ注入前のセンサーグラムのＲＵとＴ＝０のｓＣＤ１４_1-348の注入 前のそれを比較）ことを示し、以前の観察を確認した（Juan,T.S.-C.ら、J.Biol .Chem．270，1382-1387(1995)）。しかし、精製ｓＣＤ１４_(7-10)Aは、３Ｃ１０ を認識できず、ウシ血清アルブミンなどの無関連タンパク質を注入したときに観 察されるＲＵ変化と同様なほんのわずかのＲＵ変化を引 起したにすぎず（Ｔ＝７５０の第２の洗浄後のセンサーグラムのＲＵを、Ｔ＝０ のｓＣＤ１４_1-348の注入前のそれと比較）、アミノ酸７〜１０はｍＡｂ ３Ｃ １０結合に必要であることを示した。 実施例４ ｓＣＤ１４_(7-10)Aは、ＬＰＳに対する細胞応答を仲介する能力の低下を示す ｓＣＤ１４の７〜１０の残基を変異させた結果を評価するために、２種の以前 に記載されたアッセイを使用し（Hailman,E.ら、J.Exp.Med．179，269-277(1994 )；Juan,T.S.-C． ら、J.Biol.Chem． 270，1382-1387(1995)；Frey,E.A.ら、J. Exp.Med．176，1665-1671(1992)）、ｓＣＤ１４_(7-10)A生物活性を測定した。最 初に、ＬＰＳに対するＵ３７３細胞の応答を可能とするｓＣＤ１４_(7-10)Aの能 力を試験した。ＬＰＳの存在下、５ｎｇ／ｍＬの小さい濃度のｓＣＤ１４_1-348 の添加は、強いＩＬ−６産生を可能とした（図５Ａ）。対照的に、ｓＣＤ１４_{(7 -10)A} は、応答させる能力が大きく低下し、ｓＣＤ１４_1-348の応答と同様の応答 をさせるために、約１０倍のタンパク質を必要とした（図５Ａ）。 また、ｓＣＤ１４_(7-10)Aが、ＰＭＮのフィブリノーゲンへのＬＰＳ誘発接着 を可能とするかどうかを試験した。図５Ｂは、ｓＣＤ１４_1-348の１００ｎｇ／ ｍＬが、スムースＬＰＳとｒＬＢＰに対するＰＭＮの強い接着応答を可能とした ことを示す。しかし、１０，０００ｎｇ／ｍＬのｓＣＤ１４_(7-10)Aを加えたと きでさえ、非常にわずかの応答しか見られなかった。これらの知見は、アミノ酸 ７〜１０の領域はｓＣＤ１４の生物活性に必要であることを確認する。 実施例５ ｓＣＤ１４_(7-10)Aは、ＬＰＳ存在下で転写因子ＮＦ−κＢを活性化する能力の 低下を示す 細胞のＬＰＳ及びｓＣＤ１４仲介活性化には、ＮＦ−κＢなどの転写因子の活 性化を含むことが示されている（Sen,R．及び Baltimore,D．Cell 47，921-928( 1986)； Lee,J.D.ら、J.Exp.Med．175，1697ー1705(1992)； Baqasra,D.ら、Pr oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．89，6285-6289(1992)）。ｓＣＤ１４_(7-10)Aの変異が 下流へのシグナル伝達に影響を与えるかどうかを評価するために、野生型又は変 異型ｓＣＤ１４で処理し たＵ３７３細胞でのＮＦ−κＢ活性化を試験した。ＬＰＳ又はｓＣＤ１４の非存 在下、Ｕ３７３細胞は、標識ＮＦ−κＢプローブと複合体を形成する内因性ＮＦ −κＢを有する（複合体１、図６、レーン１）。ＬＰＳのみ又はｓＣＤ１４_{1-34 8} のみによる刺激は、ＮＦ−κＢ複合体１のわずかの増大及び新しいＮＦ−κＢ 複合体のわずかの誘導を引起したが（複合体２、図６、レーン２及び３）、ｓＣ Ｄ１４_1-348とＬＰＳの添加は、ＮＦ−κＢの両方の複合体を大きく誘導した（ 図６、レーン１と４を比較）。複合体１と２の両方はＮＦ−κＢ特異的である。 何故ならば、Ｕ３７３細胞抽出液と共にプレインキュベートした１００倍過剰の 非標識ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドが両方の複合体の形成を阻止したからであ る（データ示さず）。ｓＣＤ１４_(7-10)AとＬＰＳによるＵ３７３細胞の刺激は 、ゲル走査による定量でほんの５％のＮＦ−κＢ活性化を引起した（図６、レー ン６）。比較すると、ＬＰＳに結合しない変異体（ｓＣＤ１４_Δ57-64）［註： Δ５７−６４はアミノ酸５７−６４の欠失を意味する］によるＵ３７３細胞の刺 激では、ＬＰＳの存在下でさえ、ＮＦ−κＢ複合体を活性化できなかった（図６ 、レーン８）。これらのデー タは、ｓＣＤ１４_(7-10)Aの欠陥が転写因子ＮＦ−κＢのレベルで観察されるこ とを示す。ＮＦ−κＢの活性化はシグナル伝達における初期の事象なので（Gril li,M.ら、Int.Rev.Cytol．143，1-62(1993)、これらのデータは、ｓＣＤ１４_{(7- 10)A} はシグナル伝達ができないことを示唆する。 実施例６ ｓＣＤ１４_(7-10)AはＬＰＳとの安定な複合体を形成する ｓＣＤ１４_(7-10)Aによるシグナル伝達の低下は、ＬＰＳとの結合における欠 陥に起因し得る。ｓＣＤ１４_(7-10)AがＬＰＳと正常に結合するか否かを直接評 価するために、ｓＣＤ１４_1-348又はｓＣＤ１４_(7-10)Aと³Ｈ−ＬＰＳとの安定 な複合体の検出に未変性ＰＡＧＥアッセイを用いた。既に報告されている〔Ｈａ ｉｌｍａｎ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，２６９−２７７（１９９４ ）〕ように、ｓＣＤ１４_1-348とＬＰＳとの安定な複合体の形成は、インキュベ ーションの３０分後に確認され（図７Ａ）、ｒＬＢＰを加えると、複合体の形成 に必要なｓＣＤ４_1-348の濃度が低下した（図７Ｂのレーン２ と図７Ａのレーン２を比較されたい）。これは、ｒＬＢＰがＬＰＳのｓＣＤ１４ への移動を促進するという上記所見〔Ｈａｉｌｍａｎ，Ｅ．ら，前掲〕と一致す る。興味深いことには、ｓＣＤ１４_(7-10)AもｒＬＢＰの不在下に³Ｈ−ＬＰＳと の安定な複合体を形成することができ、この複合体の形成もｒＬＢＰによって促 進された（図７Ｂのレーン５と図７Ａのレーン５を比較されたい）。これらのデ ータは、ｓＣＤ１４_(7-10)AとＬＰＳとの結合がｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＢＰによ って促進されたり、ＬＢＰとは無関係に行われたりし得ることを裏付けるもので あり、ｓＣＤ１４_(7-10)Aの生物学的活性の低下は、ＬＰＳと結合し得ないため ではないことを示唆している。 実施例７ 高濃度のｓＣＤ１４によるＬＰＳ誘発細胞応答の阻害 ｓＣＤ１４_(7-10)AがＬＰＳと結合し得ることをさらに確証するために、高濃 度のｓＣＤ１４がＬＰＳ仲介による細胞の活性化を阻止する２種の細胞ベースア ッセイを用いた。最初のアッセイでは、ＬＰＳにより誘発されるＰＭＮのフィブ リノーゲンへの接着を阻害するｓＣＤ１４_{1- 348} 又はｓＣＤ１４_(7-10)Aの能力をテストした（図８Ａ）。この実験では、一定 濃度のＬＰＳとｒＬＢＰを増大量（１→１００μｇ／ｍｌ）のｓＣＤ１４_1-348 又はｓＣＤ１４_(7-10)Aと共にインキュベートした。どちらのタンパク質もＬＰ Ｓを中和し、ＬＰＳにより誘発されるＰＭＮの接着を阻害し得た。 バキュロウイルス中で発現させた組換えｓＣＤ１４について示されたように〔 Ｈａｚｉｏｔ，Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，５８６８−５８７６（１ ９９４）〕、全血アッセイでＬＰＳが仲介するＴＮＦ−αの産生をｓＣＤ１４_{(7 -10)A} が阻害し得るか否かも調べた。全血アッセイにおいて、増大量のｓＣＤ１ ４_1-348又はｓＣＤ１４_(7-10)Aを加えるとＴＮＦ−αの産生が阻害された（図８ Ｂ）が、ウシ血清アルブミンを加えてもＴＮＦ−αの産生は阻害されず、これは 上記所見（Ｈａｚｉｏｔ，Ａ．ら，前掲）を裏付けるものである。これらのデー タは、ｓＣＤ１４_(7-10)AがＬＰＳともｓＣＤ１４_1-348とも相互作用することを 立証している。 実施例１から７の考察 上記実施例において、ｍＡｂ ３Ｃ１０を中和するエピトープは、ｓＣＤ１４ の７〜１４のアミノ酸領域にマッピングした。この領域でのアラニン残基の置換 により、３Ｃ１０とｓＣＤ１４との結合が阻止された。これらのデータは、３Ｃ １０エピトープがｓＣＤ１４の最初の１５２アミノ酸内に位置し、残基５７〜６ ４のＭＥＭ−１８のエピトープとは異なるという本発明者の先の知見〔Ｊｕａｎ ，Ｔ．Ｓ．−Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１３８２−１３８７（ １９９５）；Ｊｕａｎ，Ｔ．Ｓ．−Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｊｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０， ５２１９−５２２４（１９９５）〕と一致する。３Ｃ１０エピトープがＣＤ１４ の機能にどのように貢献しているかを理解する助けとするために、ｓＣＤ１４_{(7 -10)A} を精製し、このタンパク質の細胞活性化能が非常に低いことを証明した。 該タンパク質がＮＦ−κＢの活性化を促進し得ないということは、ｓＣＤ１４_{(7 -10)A} がＬＰＳ仲介のシグナル伝達を支持し得ないことを示唆している。 ｓＣＤ１４_(7-10)Aのシグナル伝達における欠陥は、該タンパタ質がＬＰＳと 適切に結合し得ないとか、ＬＢＰと相互作用し得ないからではないと考えられる 。ゲル移動 （図７Ａ）及び２種の細胞ベースアッセイ（図８）で調べたように、ｓＣＤ１４_(7-10)A はＬＰＳと正常に結合し、ｒＬＢＰはＬＰＳのｓＣＤ１４_(7-10)Aへの移 動を促進する（図７Ｂ）。これらのデータは、３Ｃ１０がｓＣＤ１４とＬＰＳと の複合体に正常に結合するという本発明者の先の所見（Ｊｕａｎ，Ｔ．Ｓ．−Ｃ ．ら，前掲）を裏付けるものである。これらの実験では、他の報告〔Ｗｒｉｇｈ ｔ，Ｓ．Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１４３１−１４３３（１９９０）； Ｖｉｒｉｙａｋｏｓｏｌ，Ｓ．及びＫｉｒｋｌａｎｄ，Ｔ．Ｎ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．２７０，３６１−３６８（１９９５）〕において測定されたＬＰＳ −ＬＢＰ複合体と細胞表面ＣＤ１４との結合ではなく、ＬＰＳとｓＣＤ１４_{(7-1 0)A} との直接結合を測定した。 ｓＣＤ１４_(7-10)AはＬＰＳと正常に結合するので、ｓＣＤ１４_(7-10)Aのシグ ナル伝達の欠陥は細胞膜にはっきり表れると考えられる。本発明者〔Ｆｒｅｙ， Ｅ．Ａ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６，１６６５−１６７１（１９９２）〕 及び他の研究者〔Ｐｕｇｉｎ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０， ２７４４−２７４８（１９９３）；Ｈａｚｉｏｔ，Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１５１，１５００−１５０７（１９９３）；Ａｒｄｉｔｉ，Ｍ．ら，Ｉｎｆｅ ｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１，３１４９−３１５６（１９９３）〕は、ＬＰＳ及び／ 又はＣＤ１４と相互作用し且つシグナルを細胞質に伝達する膜貫通タンパク質の 存在を仮定した。従って、ｓＣＤ１４とこの膜貫通成分との相互作用には残基７ 〜１０が不可欠であると考えられる。あるいは、ｓＣＤ１４_(7-10)Aは、細胞の 脂質二重層へのＬＰＳの輸送に欠陥を有し得る。最近、本発明者は、ｓＣＤ１４ がＬＰＳをＨＤＬ粒子〔Ｗｕｒｆｅｌ，Ｍ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８ １：１７４３−１７５４（１９９５）〕及びリン脂質小胞（Ｗｕｒｆｅｌ，Ｍ． Ｍ．及びＳ．Ｄ．Ｗ．，原稿準備中）に迅速に行き来させることを証明し、従っ て、結合したＬＰＳを細胞形質膜へ輸送させるには残基７〜１０が不可欠である と考えられる。 実施例８ グラム陽性菌細胞成分はｓＣＤ１４との結合に関してＬＰＳと競合する 図９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＳＡＣＥ）のフェノール抽出物中に存在するグラ ム陽性菌分子がｓＣＤ１４に結合し、結合部位に対してＬＰＳと競合し得ること を証明している。他のデータ（示さず）は、ＳＡＣＥがＣＤ１４依存的に細胞を 強く刺激することを示している。現在ＣＤ１４上に規定されている結合部位は、 グラム陰性菌によって開始される応答だけでなくグラム陽性菌によって開始され る応答にも関与し得る。略号の説明 上記実施例の項に用いられている略号は、ＢＣＩＰ：５−ブロモ−４−クロロ −３−インドリルホスフェート−トルイジン塩；ＢＰＩ：殺菌性／透過性増強タ ンパク質；ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣；ＣＤ：円二色性；ＣＭ：なら し培地；ＨＢＳＳ：ハンクス平衡塩類溶液；ＩＬ−６：インターロイキン−６； ＬＡＬＦ：リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）抗ＬＰＳ因子；ＬＢＰ：ＬＰＳ結合タン パク質；ＬＰＳ：リポ多糖；ＮＢＴ：ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド ；ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＰＢＳ：リン酸緩衝塩水；ＰＭ Ｎ：多形核白血球；ｒ：組換え体；ＲＵ：応答単位；ｓＣＤ１４：可溶性ＣＤ １４；ＥＬＴＳＡ：酵素結合イムノソルベントアッセイである。 ここで本発明の説明を終えるが、当業者には、本明細書に記載されている本発 明の思想及び範囲を逸脱せずに多くの改変及び変更が可能であることは明らかで あろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ジユアン，シヤオ・チー アメリカ合衆国、カリフオルニア・93021、 ムーアパーク、ブロードビユー・ドライ ブ・11373 (72)発明者 ライケンスタイン，ヘンリー・エス アメリカ合衆国、カリフオルニア・73004、 ベンチユラ、リユーサーン・ストリート・ 9586 (72)発明者 ライト，サミユエル・デイー アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10538、 ラーチモント、ブライアー・クローズ・２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 図１の配列（ここで、Ｘ₁−Ｘ₄はそれぞれ独立に、Ｇｌｙ及びＣ₁−Ｃ₆脂 肪族側鎖を有するアミノ酸から選択される）の１位〜６位のアミノ酸のうちの１ つで始まり、１５２位〜３４８位のアミノ酸のうちの１つで終わるアミノ酸配列 を含むポリペプチド、又はその生理学的に許容可能な塩。 ２． 前記アミノ酸配列が、図１の配列のアミノ酸１〜１５２を含む、請求項１ に記載のポリペプチド。 ３． 前記アミノ酸配列が、図１の配列のアミノ酸１〜３４８を含む、請求項１ に記載のポリペプチド。 ４． Ｘ₁−Ｘ₄がそれぞれ独立に、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及 びＰｒｏから選択される、請求項１に記載のポリペプチド。 ５． Ｘ₁−Ｘ₄がそれぞれＡｌａである、請求項１に記載のポリペプチド。 ６． Ｘ₁−Ｘ₄がそれぞれＬ−配置のアミノ酸である、請求項１に記載のポリペ プチド。 ７． 前記配列が、図１の配列のアミノ酸１〜１５２又は １〜３４８を含み且つＸ₁−Ｘ₄がそれぞれＬ−Ａｌａである、請求項１に記載の ポリペプチド。 ８． 図１の配列の１５位のアミノ酸で始まり、１５２位〜３４８位のアミノ酸 のうちの１つで終わるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はその生理学的に許 容可能な塩。 ９． 前記アミノ酸配列が図１の配列のアミノ酸１５〜１５２を含む、請求項８ に記載のポリペプチド。 １０． 前記アミノ酸配列が図１の配列のアミノ酸１５〜３４８を含む、請求項 ８に記載のポリペプチド。 １１． 請求項８に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 １２． ＤＮＡである、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。 １３． 炎症性症状の治療を要する患者の該症状を治療する方法であって、前記 患者に請求項１又は請求項８に記載のポリペプチドを有効量投与することを含む 前記方法。 １４． 前記有効量が０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項１３ に記載の方法。 １５． 請求項１又は請求項８に記載のペプチドとその医薬上許容可能な担体と の混合物を含む医薬組成物。