ES2257225B1 - Preparacion terapeutica de fviia de muy alta pureza y metodo para su obtencion. - Google Patents
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Abstract
Preparación terapéutica de FVIIa de muy alta pureza y método para su obtención. La preparación terapéutica de FVIIa con una pureza de al menos 1000 Ul/mg proteína se caracteriza por que dicha preparación está libre de proteínas de origen no humano. En el método de obtención el FVII se purifica a partir de la FrII+III, FrIII o equivalente del fraccionamiento de Cohn y comprende la precipitación con PEG, la cromatografía y su posterior activación.
Description
Preparación terapéutica de FVIIa de muy alta
pureza y método para su obtención.
La presente invención se refiere a una
preparación terapéutica de FVIIa de muy alta pureza y método para
su obtención, que presentan notables características de novedad y
actividad inventiva.
El tratamiento de los problemas hemorrágicos en
hemofilia y otros desórdenes relacionados, como enfermedad
hepática, se realiza mediante terapia sustitutiva con factores de
la coagulación.
El tratamiento de elección en la hemofilia A
(déficit del factor VIII de la coagulación) es la administración de
dicho factor VIII (FVIII), tanto a nivel profiláctico, como en
episodios agudos. Desafortunadamente, uno de los problemas de la
terapia con FVIII es la aparición de anticuerpos inhibidores
frente al FVIII, lo cual merma la eficacia de este tratamiento.
Otros tratamientos alternativos incluyen la
administración de concentrados del complejo de protrombina activado
(APCC). El APCC consiste en una mezcla de factores de coagulación
dependientes de la vitamina K (factores II, VII, IX y X) y otras
proteínas acompañantes (fundamentalmente Proteína C y proteína S).
El tratamiento con estos APCCs produce el incremento de niveles de
los factores no deficitarios, encontrándose además algunos de los
factores en su forma activada, por esto se pueden desencadenar
fenómenos trombogénicos en el paciente, como la coagulación
intravascular diseminada.
La capacidad del factor VII activado (FVIIa)
para iniciar la coagulación independientemente de la actividad del
factor VIII es de gran utilidad terapéutica, ya que permite
restaurar la hemostasia en pacientes hemofílicos que han
desarrollado anticuerpos inhibidores contra el factor VIII y que,
por tanto, no responden adecuadamente a la terapia sustitutiva. En
comparación con otros factores, el FVIIa presenta una semivida
biológica corta (unas 4 horas) mientras que los otros factores del
APCC presentan una semivida más larga, lo cual provoca su
acumulación.
Otra ventaja del tratamiento con FVIIa
purificado es que su acción se localiza por la disponibilidad de su
cofactor, el factor tisular, que se libera en los puntos lesionados
(hemartrosis, extracciones dentales, intervenciones quirúrgicas,
etc.). En la actualidad se tiende a considerar al FVIIa como un
agente hemostático global, con una amplia posibilidad de
indicaciones, como sobredosis de dicumarínicos, fallo hepático,
sangrado incoercible, entre otras.
Además en la administración de FVIIa de alta
pureza, por su elevada actividad, la infusión de proteína es mínima
y no se infunden otras proteínas no necesarias.
Las preparaciones de FVIIa de origen
plasmático, han presentado hasta el momento una actividad de FVIIa
relativamente baja, en comparación con la de la presente invención.
La patente US4479938 por "Therapeutic composition containing
factor VIIa" de BAXTER TRAVENOL LAB muestra un FVIIa de baja
pureza, al igual que la patente EP0346241 por "Process for
preparing a factor VIIa fraction, and its use as a medicament" de
FOND NAT TRANSFUSION SANGUINE, que también muestra la preparación
de un FVII de baja pureza, con una actividad entre 95 y 130 UI de
FVIIa/mg de proteína.
Los métodos conocidos de purificación del FVIIa
a nivel industrial parten del complejo de protrombina o de
fracciones equivalentes del fraccionamiento plasmático, como
muestra la patente EP0346241 y se basan en métodos que incluyen
precipitaciones selectivas y la utilización de la centrifugación
como método de separación de precipitados. Como hemos visto, en los
procesos de purificación basados en la precipitación el grado de
purificación obtenido es limitado, describiendo además procesos
complejos en que la separación de precipitados es por
centrifugación, el cual es un método industrialmente complejo y
caro.
La patente EP 0391974 por "Process for the
purification of vitamin K-dependent blood clotting
factors" de CENTRAL BLOOD LAB AUTHORITY se refiere
fundamentalmente a la purificación del FIX, a partir del complejo
de protrombina, mediante la cromatografía con una columna metal
quelante. Como subproducto, procedente de los lavados de la
obtención del FIX, se reivindica la obtención del FVII, no de
FVIIa. Este FVII obtenido es de baja pureza (alrededor de una UI
por mg. de proteína) y se caracteriza por no contener FII, pero si
puede contener cantidades significativas de otros factores
vitamina K dependientes. Por el método descrito, no es posible la
obtención de un FVIIa de alta pureza. La cromatografía en columna
metal quelante utiliza una resina activada con Cobre. En el método
descrito en la presente invención la cromatografía metal quelante
utiliza una resina con níquel, que no requiere activación previa;
los lavados se realizan a conductividades elevadas, lo cual permite
una estabilización del FVII en la columna y la elución no requiere
la presencia de aminoácidos. Esto, ligado también a que se parte de
un material de mayor pureza, permite la obtención de un producto de
alta pureza, que no sería alcanzable según la patente EP
0391974.
0391974.
Otros métodos de purificación del FVIIa
plasmático se basan en el aislamiento y separación del FVII por
inmunoafinidad (con anticuerpos monoclonales) [Vox Sanguinis (2003)
84, 54-64]. Con este método se consigue una pureza
elevada (actividad específica del orden de 40.000 UI/mg de
proteína), pero no se puede descartar la presencia, en el producto
final, de proteínas de origen no humano procedentes de los
anticuerpos monoclonales liberados por la resina empleada. Estas
proteínas no humanas serían responsables de reacciones antigénicas
en los pacientes tratados.
Otro aspecto a destacar es el material de
partida del proceso de purificación del FVIIa, que ha sido
tradicionalmente el complejo de protrombina (PTC) o fracción
equivalente. Esto implica que este material pueda ser destinado
únicamente para la obtención de uno de los dos productos, o bien
PTC o bien FVIIa. La posibilidad de purificar el FVIIa a partir de
un material alternativo, que sea una fracción de desecho no
utilizada en el fraccionamiento, como el precipitado de la
suspensión de la FrII+III, abre la posibilidad de un
aprovechamiento más eficiente del plasma fraccionado.
Por la presente invención se consigue una
preparación terapéutica de FVIIa de muy alta pureza a partir del
plasma humano, con al menos 1000 UI/mg de proteína o
preferentemente 6000 UI/mg proteína y a una concentración de al
menos 12000 UI/ml. El método de obtención de este FVIIa parte de la
FrII+III, FrIII o equivalente del fraccionamiento de Cohn y
comprende la precipitación con PEG y la cromatografía y el producto
resultante está libre de proteínas de origen no humano.
De acuerdo con la presente invención se
describe y reivindica una preparación terapéutica de FVIIa,
procedente de plasma humano, con una pureza de al menos 1000 UI/mg
proteína, pudiendo alcanzar más de 6000 UI/mg de proteína. Esta
preparación terapéutica de FVIIa está libre de proteínas de origen
no humano y en ella el FVIIa está presente a una concentración de
al menos 12000 UI/ml.
Este FVII se purifica a partir de la fracción
II+III o de la fracción III o equivalentes, del fraccionamiento del
plasma humano y el método de purificación comprende la
precipitación con PEG y la cromatografía.
En una primera etapa la suspensión de la
fracción de partida (FrII+III, Fr III o equivalente) se precipita a
una concentración entre el 3 y el 5% de PEG y el precipitado
resultante se solubiliza y reprecipita a concentración entre el 5 y
el 7% de PEG, recuperando el sobrenadante de esta
precipitación.
A partir de este sobrenadante, el FVII se
captura por cromatografía de intercambio jónico con una resina del
tipo Q Sepharosa o Q cerámica y se realiza la elución por cambio de
pH.
Este eluido rico en FVII se purifica
opcionalmente por cromatografía de interacción hidrofóbica con una
resina del tipo Octyl Sepharosa. Una característica de este
procedimiento es que se realiza en ausencia de sales de amonio.
Adicionalmente se realiza una etapa de
purificación del FVII por cromatografía Metal Quelante con la
resina Ni Sepharosa HP.
La activación del FVII se realiza en presencia
de calcio.
Al tratarse de un producto de origen biológico,
es aconsejable la inclusión de al menos una, o preferiblemente dos
o más etapas de eliminación de agentes patógenos. Por su eficacia
contrastada, es conveniente, por ejemplo, la inclusión de una etapa
de eliminación de virus por tratamiento con Solvente/Detergente
previa a cualquiera de las etapas cromatográficas. Este método, y
el producto obtenido, permiten también la inclusión de etapas
adicionales de eliminación de virus, por ejemplo, por
nanofiltración.
En una forma de realización preferente del
método descrito, el FVII se purifica a partir de la FrII+III,
mediante la precipitación con PEG entre 3,5 y 4,5% a pH entre 5 y
5,4. El precipitado obtenido se resuspende y precipita con PEG
entre 5,5 y 6,5% a un pH entre 6 y 7. La adsorción del FVII del
sobrenadante de esta precipitación se realiza por intercambio
iónico, con una resina del tipo Q-Sepharosa FF, a
un pH próximo a la neutralidad y eluyendo el FVII a un pH entre 5 y
6.
Posteriormente se realiza opcionalmente una
purificación del FVII por cromatografía de interacción hidrofóbica,
adsorbiendo el FVII en una resina del tipo Octyl Separosa FF. Esta
adsorción se realiza a pH neutro. La elución del FVII purificado se
realiza mediante una solución que contiene fosfato disódico anhidro
10 mmol/l citrato trisódico dihidratado 10 mmol/l Na, Cl 500 mmol/l
a pH neutro.
El eluido, rico en FVII, se aplica a una
columna metal quelante, con una resina Ni Separosa HP, adsorbiendo
el FVII a un pH entre 7,5 y 8,5. Esta resina permite la realización
de lavados en condiciones de elevada conductividad y también a un
pH entre 6 y 7. La elución del FVII con una solución que contiene
fosfato disódico anhidro 10 mmol/l, NaCl 25 mmol/l, ajustado a pH
neutro permite la obtención de un FVII de alta pureza, con una
actividad específica alrededor de 200 UI/mg de proteína.
La activación del FVII puede realizarse
mediante la adición de calcio, aplicada a cualquiera de los
materiales intermedios o final, del proceso de purificación, lo
cual no variará las condiciones de obtención ni del FVII
descrito.
Asimismo se pueden implementar una o varias
etapas de reducción de agentes patógenos, aplicadas al proceso
descrito, sin variar la esencia de la invención.
A continuación se adjunta, a título
ilustrativo, un ejemplo de realización de la presente invención,
dividido en las etapas sucesivas 1 a 4.
Etapa
1
La suspensión inicial de la fracción II+III, se
realizó con una solución de extracción fosfato 5 mmol/l y sorbitol
5%.
Una vez completada la suspensión se mantuvo
durante 1 hora en agitación entre 2-6°C. Después de
ajustar el pH a la suspensión de la fracción II+III se le adicionó
PEG hasta una concentración final del 4% (p/p).Después de la
adición, se mantuvo la suspensión en agitación durante 30 minutos.
A la suspensión obtenida anteriormente, se le añadió bentonita
agitándola posteriormente durante 20 minutos, momento a partir del
cual se iniciará una etapa de reposo de al menos 4 horas.
Posteriormente se inició el proceso de centrifugación durante 20
minutos. Una vez finalizado el proceso de centrifugación se separó
el sobrenadante del precipitado. Este último fue disuelto en
solución tampón fosfato, realizándose las valoraciones analíticas
de FVII, tanto en este material como en la suspensión inicial de
la fracción II+III. Para el test de actividad se empleó el kit
COASET®FVII (CHROMOGENIX). Este método se basa en dos pasos. En el
primero, el Factor X se activa a FXa por la vía extrínseca
(FVII-tromboplastina). El factor VII es
completamente activado a FVIIa durante este proceso, por lo tanto,
en este test no hay interferencia con el FVII preactivado. En el
segundo paso el Factor Xa generado, hidroliza el sustrato
cromogénico S-2765 liberándose el grupo cromogénico
pNA. El color se lee fotométricamente a 405 nm. El Factor Xa
generado y en consecuencia la intensidad de color, es proporcional
a la actividad de Factor VII de la muestra. El precipitado de PEG
reconstituido muestra una actividad de Factor VII de 0,86 UI/ml.
Estos resultados indican que la actividad de FVII esta presente en
la fracción II+III, y que se recupera significativamente en el
precipitado, obtenido al adicionar PEG 4% en las condiciones
descritas.
Etapa
2
La suspensión de la fracción de precipitado de
PEG al 4% se realizó con una solución de extracción (fosfato 5
mmol/l, citrato 5 mmol/l y NaCl 50 mmol/ pH 7,5 con NaOH 0,5 mol/l)
a una temperatura de 20-25°C. Una vez completada la
resuspensión se mantuvo durante 2 horas en agitación, enfriándose
después hasta 5°C y ajustando el pH a 6,5. Esta suspensión, se
diluyó con una solución compuesta por fosfato 45 mmol/l, NaCl 50
mmol/l a pH 6,5 a 5\pm3°C y se le adicionó PEG hasta obtener una
concentración final de PEG del 6% (p/p). Finalmente se procedió a
clarificar el sobrenadante de PEG al 6% mediante una filtración con
una placa de profundidad para separar el precipitado del PEG. Una
vez finalizado el proceso, la solución filtrada fue analizada en
relación a la actividad de FVII y su contenido en proteína
(estimado por densidad óptica), obteniendo una actividad especifica
de 0,11 UI/UA. Este valor ha sido calculado dividiendo la actividad
del FVII (UI/ml) entre la proteína aproximada, valorado mediante
el método descrito en la etapa 1.
En este punto se realiza la implementación de
una etapa de inactivación de virus mediante tratamiento con un
disolvente orgánico asociado a un detergente. Estos reactivos de
inactivación de virus son posteriormente separados en las etapas
cromatográficas siguientes.
A partir del sobrenadante de PEG al 6%
clarificado de la fracción II+III, se realizó una dilución al 20%
con API ajustando el pH a 7,5 con el fin de disminuir la
conductividad. A continuación se adicionaron resinas Q Sepharose FF
(previamente equilibradas) a la solución anterior, la cual sé
mantuvo bajo agitación moderada durante una hora. Posteriormente
se procedió al empaquetamiento de la columna (FINE LINE FF) con la
suspensión con resinas. Una vez empaquetada se realizó el lavado de
las resinas mediante fosfato 10 mmol/l, citrato 10 mmol/l, NaCl 100
mmol/l ajustado a pH 7,5 y a una temperatura de
2-8°C. Finalizado el lavado, se inyectó la solución
de elución Q en la columna. Esta elución se realizó con fosfato 10
mmol/l NaCl 200 mmol/l ajustado a pH 5,5 a una temperatura de
2-8°C. El Eluido Q fue valorado, obteniéndose una
actividad específica de FVII de 1,16 UI/UA.
\newpage
Se partió del Eluido Q Sepharose, el cual fue
ajustado a 2,5 mol/ de NaCl, pH 7,0 y a una temperatura de
25\pm3°C. A continuación se realizó el equilibrado de la columna
(Octyl Sepharose FF) con fosfato 10 mmol/l, citrato 10 mmol/l, NaCl
2500 mmol/l a pH 7,0 y a una temperatura de 25\pm3°C. El
siguiente paso fue la inyección del eluido en la columna y el
lavado con la misma solución de equilibrado (a una temperatura de
25\pm3°C). Seguidamente se realizó la elución con fosfato 10
mmol/l citrato 10 mmol/l Na, Cl 500 mmol/l a pH 7,0 y una
25\pm3°C de temperatura. El eluido octyl se valoró obteniendo
unos resultados de actividad específica de FVII de 3,79 UI/UA. Como
podemos observar, los resultados obtenidos en esta etapa 2 reflejan
un aumento de la actividad específica a lo largo de las tres etapas
de 34 veces respecto al valor inicial en el sobrenadante de PEG 6%
clarificado.
Etapa
3
En primer lugar, se realizó el equilibrado de
la Columna Ni Sepharose HP con fosfato 10 mmol/l, NaCl 1 mol/l
ajustado a pH 8,0\pm0,05. A continuación se inyectó el Eluido
Octyl en la columna. Seguidamente se realizaron dos lavados, un
primer lavado en condiciones de elevada conductividad (1 mol/l
NaCl), seguido de un segundo lavado con una reducción de pH (6,5).
Finalmente se procedió a la elución específica con una solución que
comprende fosfato 10 mmol/l, NaCl 25 mmol/l, ajustado a pH 7,0. Al
eluido Ni resultante se le realizaron las valoraciones analíticas,
obteniendo unos resultados de actividad específica de 204 UI/UA, lo
que representa un incremento de pureza respecto al Eluido Q de en
unas 54 veces.
Etapa
4
En esta etapa se activó el FVII a FVIIa
mediante la adición de calcio, partiendo de un eluido Ni Sepharose.
Para ello la fracción conteniendo el FVII fue incubada a 30°C
durante 20 horas en presencia de tris 50mmol/l, NaCl 30mmol/l y
Cl_{2}Ca 2 mmol/l para producir la autoactivación del FVII. Las
valoraciones analíticas de estas muestras para la actividad de
FVIIa, se han realizado con el kit STACLOT®VIIa-rTF
(DIAGNOSTICA STAGO) frente al 1er estándar internacional de FVIIa.
El principio de este método se basa en que el rsTF posee una
función específica como cofactor del FVIIa. El rsTF en presencia de
FVIIa, fosfolípidos y calcio produce coagulación del plasma. En
este sistema el tiempo de coagulación observado presenta una
relación inversa con el nivel de FVII inicialmente presente en el
plasma. EL rsTF no activa el FVII a FVIIa, por lo tanto, el FVII
presente en el test no interfiere en le ensayo. Paralelamente se
han realizado las valoraciones de la actividad de FVII por el
método descrito en la etapa 1. Los resultados de actividad de FVII
y FVIIa en la fracción activada así obtenida muestra un ratio de
30,3 UI FVIIa/UI FVII.
La combinación de los procedimientos descritos
en las cuatro etapas, permite estimar la actividad específica de un
Factor VII activado obtenido a partir del eluido Ni entorno a las
6056 UI/UA.
Con objeto de eliminar partículas víricas u
otros patógenos que pudieran estar presentes, se implementa una
etapa final de nanofiltración de la solución por nanofiltros de 15
nanómetros de tamaño de poro.
Si bien la invención se ha explicado en la
descripción anterior, incluyendo un ejemplo ilustrativo, se
comprenderá que en base a lo que se ha dado a conocer, los expertos
en la materia podrán introducir variantes y alternativas incluidas
dentro de la invención, que queda limitada solamente por las
siguientes reivindicaciones.
Claims (17)
1. Preparación terapéutica de FVIIa con una
pureza de al menos 1000 UI/mg proteína, caracterizado porque
dicha preparación está libre de proteínas de origen no humano.
2. Preparación terapéutica de FVIIa, según la
reivindicación 1, caracterizada porque su pureza es de al
menos 6000 UI/mg de proteína.
3. Preparación terapéutica de FVIIa según la
reivindicación 2, caracterizada porque el FVIIa está
presente a una concentración de al menos 12000 UI/ml.
4. Preparación terapéutica de FVIIa según la
reivindicación 1, caracterizada porque el FVIIa procede de
plasma humano.
5. Preparación terapéutica de FVIIa según la
reivindicación 4, caracterizada porque ha sido sometida al
menos a una etapa de eliminación de agentes patógenos.
6. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa, según las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque el FVII se purifica a partir de la
FrII+III, FrIII o equivalente del fraccionamiento de Cohn y
comprende la precipitación con PEG, la cromatografía y su
activación.
7. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa según la reivindicación 6,
caracterizado porque la suspensión de la FrII+III, FrIII o
equivalente se precipita a una concentración entre el 3 y el 7% de
PEG.
8. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa según la reivindicación 6,
caracterizado porque el FVII se captura por cromatografía de
intercambio iónico.
9. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 6,
caracterizado porque la elución cromatográfica se realiza
por cambio de pH.
10. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 6,
caracterizado porque el FVII se purifica por cromatografía
de interacción hidrofóbica.
11. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 6,
caracterizado porque el procedimiento se realiza en ausencia
de sales de amonio.
12. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 6,
caracterizado porque se realiza una etapa de purificación
del FVII por cromatografía Metal Quelante.
13. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 12,
caracterizado porque la resina Metal Quelante es Ni
Sepharosa HP.
14. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 6,
caracterizado porque el FVII se activa en presencia de
calcio.
15. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 6,
caracterizado porque comprende al menos una etapa específica
de eliminación de virus.
16. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 15,
caracterizado porque comprende una etapa de eliminación de
virus por nanofiltración.
17. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 15,
caracterizado porque comprende una etapa de eliminación de
virus por tratamiento con Solvente/Detergente.
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