HU214905B - Eljárás VIII. faktor izolálására - Google Patents
Eljárás VIII. faktor izolálására Download PDFInfo
- Publication number
- HU214905B HU214905B HU9201551A HU155192A HU214905B HU 214905 B HU214905 B HU 214905B HU 9201551 A HU9201551 A HU 9201551A HU 155192 A HU155192 A HU 155192A HU 214905 B HU214905 B HU 214905B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- factor
- viii
- plasma
- gel filtration
- fraction
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title claims description 35
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 72
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 34
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 34
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 19
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 17
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 12
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 7
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 7
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 108010088880 plasmagel Proteins 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 4
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 4
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 4
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 4
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 3
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 3
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 2
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 2
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 2
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 101710181853 C-factor Proteins 0.000 description 1
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000011993 High Performance Size Exclusion Chromatography Methods 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004901 Iron regulatory protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090001025 Iron regulatory protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000007696 Kjeldahl method Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108010081391 Ristocetin Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N chembl1095986 Chemical compound C1[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(C(=C(O)C=4)C)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](C(=O)N3)[C@H](O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=C(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]5[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C4=CC2=C1 BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001470 plasma protein fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229950004257 ristocetin Drugs 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Networks Using Active Elements (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Housing For Livestock And Birds (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Separation By Low-Temperature Treatments (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás a vérplazma VIII. faktőr-tartalmának azegyéb fehérjék mellől történő izőlálására, azzal jellemezve, hőgy aplazmát csőpőrtszeparáló körülmények között (grőűp sepa atingcőnditiőns) alkalmazása mellett gélszűrésnek vetjük alá, és ezáltalrendkívül magas hőzammal a VIII. faktőrt nagy mennyiségben tartalmazófrakciót kapűnk, mely az egyéb fehérjékből csak kis men yiségettartalmaz. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás biológiai vegyületek, például fehérjék, különösképpen a VIII. koagulációs faktor testfolyadékokból, így például plazmából történő izolálására, melynek során az izolálás első lépése gélszűrés.
A találmány háttere
Az A antihemofíliás faktor, illetve az AHF néven ismert VIII. faktor egy olyan plazmafehérje, mely a természetes lefolyású véralvadás folyamatában vesz részt.
A VIII. faktor rendkívül alacsony koncentrációban cirkulál a vérplazmában, két fehérje nemkovalens komplexe formájában, melyek VIII. faktor koaguláns aktivitással (VIII. faktor:C), illetve ristocetin kofaktoraktivitással [von Willebrand-faktor (vWF)] rendelkeznek, az említett komplex molekulatömege 1-20*106 D körüli érték.
A VIII. faktor: C hiányzik, illetve hibás a 100000 vizsgált egyénből körülbelül 5 esetben előforduló, hemofília A vérzési rendellenességben szenvedő betegeknél.
A von Willebrand-faktornak az aktivált vérlemezkékhez való kapcsolódása eredményeképpen az aktivált vérlemezkék aggregációja fokozódik. Ezt a hatást in vitro a ristocetinnel aktivált vérlemezkék alkalmazásával detektálhatjuk. A von Willebrand-betegség esetén a vérzési idő meghosszabbodását tapasztaljuk, amit a von Willebrand-faktor biológiai aktivitásának alacsony szintje, illetve hiánya okoz.
A hemofília A vérzési rendellenességben szenvedő betegeket, és a von Willebrand-betegség számos előfordulási formájában szenvedő betegeket napjainkban VIII. faktor:C/vWF-tartalmú koncentrátumokkal kezelik; a kezelés során számottevő mértékben javul a betegek életképessége és munkateljesítménye, valamint a kezelés hozzájárul a paciensek élettartamának meghosszabbodásához.
A VIII. faktort (VIII. faktor: C és/vagy vWF) tartalmazó gyógyszerészeti készítményeket vérből, illetve vérplazmából állíthatjuk elő. A készítmények előállítása számos jól ismert eljárással történhet, melyek mindegyikére a VIII. faktor:C alacsony hozama jellemző. Általánosságban minden eljárás kiindulási lépése krio-csapadékképzéses (cryoprecipitation) lépésből áll. A krio-csapadékképzés által megfagyasztott plazmát 0-4 °C-on megolvasztjuk, így a VIII. faktort tartalmazó csapadék keletkezése fokozódik, ami például centrifugálással távolítható el a rendszerből. Bár a krio-csapadékképzés viszonylag egyszerű eljárás, alapvető hátránnyal rendelkezik, mivel nagyobb mennyiségek alkalmazásánál, például 5 kg-nál nagyobb plazmapoolok esetén a VIII. faktor: C-hozam alacsonyabb lesz (a plazma tartalmához képest 30—45%), ami azt jelenti, hogy a végső hozam, függetlenül az alkalmazott tisztítási lépéstől, alacsony.
A VIII. faktort tartalmazó készítmények előállítása során általában egy vírus-inaktiváló lépést alkalmazunk. A vírus-inaktiváló lépések számottevő mértékben fokozzák a készítmény vírusok elleni biztonságát, de az esetek túlnyomó többségében a VIII. faktor:C hozamában további csökkenést okoznak.
A VIII. faktor általánosan megfigyelhető, rendkívül alacsony hozama számos esetben az említett készítmények elégtelenségéhez vezetett, és így a Vili. faktor tisztítására alkalmas újabb eljárásokra merült fel az igény, melyek a hemofíliás kezelés során szükséges Vili. faktor-igényt kielégítik.
A közvetlenül a plazmából történő, a VIII. faktor nagy hozammal történő izolálására alkalmas eljárások rendkívül érdekesek lennének, de a plazma VIII. faktortartalma rendkívül gyorsan, vagy még a krio-csapadékképzés előtt 70%-ra csökkenhet.
Jelenleg közvetlenül plazmából próbálták meg izolálni a VIII. faktort, affinitás kromatográfia alkalmazásával [Thromb. Haemost., 61 (2), 234—237 (1989)], de csak 60%-nál kisebb hozamot, és az izolált VIII. faktort tartalmazó frakcióra nézve 1 IU VIII. faktor/mg fehérje fajlagos aktivitást sikerült elérni.
A gélszűrés, másik nevén a gélpermeációs kromatográfia, illetve a méret szerinti kizáráson alapuló kromatográfia egy, a diffúzió által ellenőrzött folyamat, melyet az elegyek szemcseméret szerinti elválasztása során alkalmazhatunk. Az elegyet semleges, porózus géllel töltött oszlopon nyomjuk át, a nagyobb molekulákat kizáró szemcsemérettel rendelkező gélen, míg a kisebb molekulák bedifíundálnak a stacioner fázisba, a gélszemcsék belsejébe. így a legnagyobb méretű molekulák teljes mértékben kizáródnak a gélrészecskék közül, és először az üres térfogattal (void volume) együtt eluálódnak, míg a kisebb molekulák hosszabb idő alatt haladnak át az oszlopon, és a csökkenő méret, illetve a növekvő „elúciós mennyiségek” szerint eluálódnak.
A gélszűrést két különböző eljárással hajthatjuk végre:
1. Csoportszeparáló eljárás
A csoportszeparáló eljárás során az elegyet két csoportban szeparáljuk, melyek molekulamérete között nagy az eltérés, az egyik csoport az üres térfogattal együtt eluálódik, míg a másik csoport később eluálódik, jóval nagyobb elúciós térfogattal, ami sok esetben az egész agytérfogathoz közeli érték lehet; ezt az eljárást elsődlegesen a fehérjék oldott sói szeparálására, vagy a pufferek kicserélésére alkalmazzuk, és mint kisózásra (desalting) hivatkozunk rá. A kisózás céljából kis pórusméretű szilárd gélt alkalmazunk, és az eljárást nagy mennyiségű anyag esetén (a mintatérfogat az ágytérfogat 20-30%-a), és magas folyadékráta mellett (körülbelül egy ágytérfogat-puffer óránként) alkalmazzuk, így az oszlop kapacitása nagy lesz.
2. Frakcionálásos eljárás
A frakcionálásos eljárás során hasonló molekulatömeggel rendelkező elegyeket szeparálunk; az eljárást gyakran alkalmazzuk fehérjék elválasztására. Erre a célra az alkalmazott gélszemcsék pórusmérete nagyobb, és a gélszűrő közeget úgy választjuk meg, hogy biztosítsa a fehérjék elúcióját az üres térfogat, és a teljes ágytérfogatnak megfelelő elúciós térfogat között. Az anyagok sokkal közelebb eluálódnak, mint a csoportszeparáló eljárás során, és egymással átfedésbe kerül2
HU 214 905 Β hetnek. A magas folyadékráták nem előnyösek, mivel ezek nem teszik lehetővé a fehérjék hatásos szeparálását, és az egyes fehérjék ésszerű szeparálása céljából az oszlop töltését alacsony értéken kell tartani. így a frakcionálásos eljárással alkalmazott gélszűrés csak utolsó tisztító lépésként javasolható a fehérjék szeparálása során [Jagschies, Ullmans Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3 (10), 1988, és Bio/Technol., 4, 954-958 (1986)].
Megpróbálták a VIII. faktort a plazmából gélszűréssel izolálni [J. Láb. Clin. Med., 72 (6), 1968, 1007-1008, és J. Clin. Invest., 48, 1969, 957-962], A kísérletek során komoly eredményeket értek el a tisztításban, de a hozamok csak 40-50% között voltak. A keletkezett VIII. faktort tartalmazó frakció tisztasága a kiindulási plazmától függött, mivel a lipidek és a kilomikronok (chylomicron) nagy koncentrációja növelte a kis fajlagos aktivitással rendelkező VIII. faktor frakció zavarosságát. Meg kell jegyezni, hogy az alkalmazott gélszűrési eljárás még akkor sem tette lehetővé nagy mennyiségű plazma kezelését, amikor az előzetes mérések szerint az erőteljes mértékben koncentrált Cohn-frakció szűrése lehetségesnek tűnt.
Továbbá Paulssen és társai szerint [Thromb. Diathes. Haemorr., 22, 1969, 577-583] a VIII. faktort a többi plazma fehérjétől Sepharose 6B közeggel lehet elválasztani, de a gélszűrést alkalmazó kromatográfia csak akkor tűnt széles körben alkalmazhatónak, amikor kiindulási anyagként az újra feloldott krio-csapadékot alkalmazták.
A 3.637.489 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás egy, a vér alkotóinak szeparálására alkalmas eljárást ismertet, gélszűrés, és porózus üveggyöngyök alkalmazásával. Az eljárás különösképpen alkalmas az immunológiailag aktív anyagoknak a szérum, illetve a plazma egyéb alkotóitól történő elválasztására.
Azóta számos kísérlet történt a VIII. faktor gélszűréssel történő tisztítására, de a kísérletek a plazma részlegesen tisztított frakcióinak (az újra feloldott krio-csapadékok, és ezek további tisztított frakciói) gélszűrésére összpontosultak. Minden lépés kis mértékű oszloptöltés és/vagy kis folyadékráta, illetve ezek kombinálása mellett történt.
A gélszűrés, mint a fehérjék frakcionálásának eljárását már 1959 óta ismerték, és a biológiai laboratóriumi kutatások során széles körben alkalmazták, mint a kis mennyiségű, azaz 1 liter alatti mennyiségű fehérjék jellemzésére alkalmas eljárást. A gélszűrést a jelen találmányig nem alkalmazták széles körben plazmafrakcionálásra a fehérjeszeparálás céljából, egyetlen alkalmazási területe az etanolnak és sóinak az albumin-oldatokból történő kicsapása volt. így az irodalmi hivatkozás megállapítása szerint: „Annak fő oka, hogy a gélszűrés nem vált a plazmafrakcionálás fő eljárásává, a fehérjéknek az oszlop térfogatához viszonyított kicsi áteresztő képessége” [J. H. Berglöf: „Fractionation by Gél Filtration”, p. 163-173; J. M. Curling (Ed.): „Methods of Plasma Protein Fractionation”, Academic Press, London, 1980], és „Sajnos az ésszerűen méretezett oszlopokon kezelhető fehéijemennyiség kicsi, és a minta hígítása nem hanyagolható el. így az eljárás plazmafrakcionálásra általában nem alkalmazható” [J. J. Morgenthaler és társai: „Preservation of structure and function during isolation of humán plasma proteins”, p. 127-138; Smit Sibinga és társai (Eds.): „Plasma Fractionation and Blood Transfusion”, Martinus Nijhoff Publishers, Boston, 1985],
A 4.675.385 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás eljárást ismertet a VIII. faktor prokoaguláns fehérének egy VIII. faktort, nagy molekulatömegű alkotórészeket és kis molekulatömegű alkotórészeket tartalmazó plazmakészítményből történő izolálására, melyeket szekvenciális, nagy nyomású, méret szerinti kizáráson alapuló kromatográfia (sequential high performance size exclusion chromatography) alkalmazásával választunk el, első lépésben a plazmakészítmény pufferolt, vizes közegét állítjuk elő, és a kis molekulatömegű alkotókat úgy szeparáljuk, hogy az elegyet 13-35 μ méretű gyöngyöket tartalmazó porózus, nagy nyomású, folyadék-kromatográfiás gyöngyökkel töltött kromatográfiás oszlopra visszük, és az oszlopot pufferolt vizes eluenssel eluáljuk. A jó szeparálás érdekében a 4.675.385. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás egy, a 10—40 közötti arányértéknél (aspect ratio) nem kisebb arányú oszlopot javasol, ami a kapacitást csökkenti, de nem biztosítja a VIII. faktor alkotórészeknek a kis molekulatömegű plazmafehérjék mellők történő jó szeparálását. Míg az izolálás első lépése nem biztosítja a VIII. faktor:C-aktivitást mutató fehérjéknek a plazmakészítmény egyéb alkotói mellől történő jó elválasztását, ezt a második HPLC végrehajtásával érhetjük el.
A jelen találmányig általánosan elfogadott tény volt az, hogy nagyobb, például 5 liter feletti mennyiségek esetén a gélszűrés nem alkalmas eljárás a plazmafrakcionálás során a fehérjék szeparálására.
Azt a meglepő észrevételt tettük, hogy nagy folyadékrátával jellemzett szelektáló gélszűrő anyagok alkalmazása esetén a VIII. faktor tiszta frakció formájában izolálható, igen magas hozammal, közvetlenül a plazmából, igen enyhe mechanikai szeparálás alkalmazása mellett anélkül, hogy a kezdeti krio-csapadékképzést figyelembe vennénk.
A találmány rövid ismertetése
A jelen találmány a VIII. faktor vérplazmából, a többi fehérje mellől történő izolálására vonatkozik, VIII. faktor: C és vWF komplex formájában, gélszűrés alkalmazásával.
A találmány szerinti eljárás azzal jellemezhető, hogy az izolált plazmát vagy a frissen megolvasztott fagyasztott plazmát csoportszeparáló körülmények (group separating conditions) alkalmazása mellett gélszűrésnek vetjük alá nagy töltöttség és nagy folyadékráta alkalmazása mellett, a gélszűrő közeg a VIII. faktorra nézve semleges részecskékből áll, melyek 1 χ 103-l x 108 D, illetve előnyösebb esetben 1χ 104-8χ107 D közötti intervallumokban frakcionálnak.
HU 214 905 Β
Előnyös esetben a plazma mennyisége az agytérfogatnak legalább 5%-a. Előnyösebb esetben a plazma mennyisége az ágytérfogatnak 15-40%-a.
A találmány szerinti eljárás kivitelezése során előnyös esetben 0,3 ágytérfogat per óra folyadékrátát alkalmazunk, illetve előnyösebb esetben 0,5-2 ágytérfogat per óra mennyiséget.
A jelen találmány céljára alkalmazott gélszűrő közeg szilárd és gyors elúciót tesz lehetővé. A gélnek a gélszűrés során a VIII. faktorra nézve mind kémiailag és immunológiailag semlegesnek kell lennie. A kísérletek eredményei azt mutatták, hogy a jelen találmány szerinti eljárást általánosan alkalmazott géleken hajthatjuk végre, így például az alábbiakon: Sepharose CLNB, Sepharose C1-6B, Sepharose 4FF, Sepharose 6FF, Sephacryl S-400, Sephacryl S-500, Fractogel TSK HW-65(F) és Matrex Cellufine CGL 2000, melyek mindegyike megfelel a találmány céljaira. Az említett gélek szemcsemérete (nedves) általában a 32-200 pm közötti intervallumba esik.
A jelen találmány egy kivitelezési formája szerint a fagyasztott plazmát megolvasztjuk, ez biztosítja azt, hogy az összes VIII. faktor oldott állapotba kerüljön, miután a fagyott plazmát előnyös esetben közvetlenül a VIII. faktor feloldása után visszük az oszlopra. Előnyös esetben nem hagyjuk túl magasra emelkedni a hőmérsékletet, így elkerülhetjük a VIII. faktor degradációját. A plazmát, mielőtt az oszlopra vinnénk, például heparin, citrát, szukróz, aminosavak, sók vagy egyéb stabilizáló anyagok hozzáadásával előkezelhetjük, tetszés szerint szűrhetjük, centrifugálhatjuk, ultraszűrővel betöményíthetjük, általánosan ismert csapadékképző anyagokkal elő-csapadékot képezhetünk, vagy más módon előkezelhetjük, míg valamely előkezelési eljárás nem mutat a plazma VIII. faktor-tartalmára nézve szignifikáns hatást.
A találmány szerinti eljárás meglepő módon rendkívül magas VIII. faktorhozamot mutatott. A termékben általánosan a plazma VIII. faktor-tartalmának a 70% feletti mennyiségét sikerült visszanyerni, és az eljárás során az IN IU VIII. faktor:C/mg fehérje fajlagos aktivitású rendkívül tiszta termék mennyiségének növekedése tapasztalható. Ezt annak a ténynek tulajdoníthatjuk, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmazásával a VIII. faktort elválasztjuk a proteolitikus enzimektől, melyek általában már az izolálási eljárás során rendkívül korán a VIII. faktor: C roncsolódását okozzák.
A találmány szerinti eljárás nagy mennyiségű plazma kezelését teszi lehetővé, a plazma kezelése a gélszűrés során az oszlop nagy töltöttsége, és nagy folyadékráta alkalmazása mellett történik, és az eljárás eredményeképpen növekvő mennyiségben nagy tisztaságú VIII. faktort kapunk. Az eljárás rendkívül hatékony, üzemi alkalmazása is javasolható.
A gélszűrés során kapott, VIII. faktort tartalmazó frakció(ka)t, illetve a gélszűrések során kapott frakciókat a továbbiakban jól ismert eljárások alkalmazásával, így például ultraszűréssel, csapadékképzéssel, ioncserével, affinitás-kromatográfiával stb. koncentrálhatjuk és tisztíthatjuk.
A visszamaradó plazma fehérjéket, például az albumint, az immunoglobulinokat, a protrombin-komplexet, az antitrombin IlI-at és hasonlókat a gélszűrés további frakcióiból szintén jól ismert eljárások alkalmazásával, így például alkoholos csapadékképzés, PEG-csapadékképzés, kromatográfia stb. szintén izolálhatjuk.
A VIII. faktor:C-aktivitás meghatározásának kivitelezése kétlépcsős, illetve egylépcsős eljárással történhet. Alapvető tény, hogy az egylépcsős és a kétlépcsős eljárás eredménye a VIII. faktor:C-aktivitásban különböző eredményt ad. Továbbá ugyanazon a mintán ugyanaz a meghatározás a VIII. faktor:C-aktivitás értékében növekvő mértékű eltéréseket ad.
Az alkalmazott „plazma” kifejezés vérre vonatkozik, melyből minden korpuszkulumot és vérlemezkét eltávolítottunk, például centrifugálással.
A „VIII. faktor:Ag” kifejezés a VIII. faktorhoz kapcsolódó antigént és a „vWF-Ag” kifejezés a von Willebrand-faktorhoz kapcsolódó antigént jelöl.
Az „ágytérfogatot” mint a töltött gél közeg és az intersticiális folyadék mennyiségét definiáljuk. Az „üres térfogat” a gélrészecskék közötti puffer mennyiségétjelöli, míg az „elúciós térfogat” a specifikus anyag eluálásához alkalmazott puffer mennyiségét jelöli. Az „oszloptöltés” kifejezés az ágyba töltött anyag mennyiségétjelöli, az ágytérfogat%-os arányában meghatározva. A „frakcionálási sorozat” (fractionation rangé) kifejezés a (globuláris) fehérjék, vagy nagyobb molekulák molekulatömegének sorozatát jelöli, melyekre a gél anyagát a szállító javasolja.
A találmány szerinti eljárást az ábrákra és a példákra hivatkozva ismertetjük, melyek a találmány kivitelezési fomáit teszik érthetőbbé. A példák csak a célokat szemléltetik, de nem korlátozzák a találmány területét, ezt csak az igénypontok teszik.
Az ábrák rövid ismertetése
A jelen találmányt a továbbiakban a kísérő ábrákra hivatkozva ismertetjük.
1. ábra A VIII. faktor jelen találmány szerinti, különböző mérésekkel meghatározott gélszűréses elúcióját szemlélteti.
2. ábra A számos plazmafehérjének a találmány szerinti, gélszűréssel történő elúcióját ábrázolja. Kísérleti rész
I. példa
Egy 2,6 cm átmérőjű oszlopot Sepharose CINB-vel 60 cm magasságig töltöttünk meg.
A dán vérbankból származó plazmát 25 °C-on, vízfürdőn megolvasztottuk. 1 IU heparin/ml hozzáadása után 50 ml plazmát (az ágytérfoat 16%-a) vittünk fel az oszlopra, 100 ml/óra folyadékráta mellett, miután az oszlopot 200 ml/óra folyadékrátával átvitt pufferrel inkubáltuk, ami 0,63 ágytérfogat/órának felel meg. Az oszlop equilibrálása és az elúció 0,02 M citrátot és 0,15 M NaCl-t tartalmazó pufferrel történt (pH=7,4). A pufferhez még 2,55 ml 1 M CaCl2-t adtunk literenként, így a szabad kalciumion-koncentráció (Ca2+) 7x10 5 lett. A szabad kalciumion-koncentrációt az Ingold GmbH
HU 214 905 Β cégtől (Frankíurt/Main, FRG) származó szelektív elektródával ellenőriztük. Frakciókat gyűjtöttünk, és az egyes frakcióból az alábbiakat határoztuk meg: OD28o, VIII. faktor:C (mind az egylépcsős koagulációs, mind a kétlépcsős eljárás alkalmazásával), VIII. faktor:Ag, albumin, IgG, fibrinogén, IgM, alfa-2-makroglobulin, IX. faktor, X. faktor, C-fehérje és antitrombin III. Az OD280-nal meghatározott fehéqék az üres térfogatból kis csúccsal eluálódtak (10—18. frakció), majd ezután egy nagy, széles csúcs következett (19-50. frakció, lásd
1. ábra). A kétlépcsős koagulációs eljárás szerint a VIII. faktor: C-akti vitás 82%-a és az egylépcsős koagulációs eljárás szerint a VIII. faktor:C-aktivitás 91%-a az üres térfogattal egy aggregációs csúcsban eluálódott (a VIII. faktor fő frakciója), az előbbi kis fehéijecsúcsokkal együtt. A visszamaradó VIII. faktor egy következő kisebb „farok”-csúcsban („peak-tail”) eluálódott, közvetlenül a VIII. faktor főcsúcsa után (19-26. frakció). A VIII. faktor:Ag és a vWF:Ag a VIII. faktor:C-vel együtt eluálódott, de a következő „farok”-csúcs („peaktail”) valamivel szélesebb volt. Minden egyéb meghatározott plazmafehéije a VIII. faktor fő frakciója után eluálódott a nagy, széles fehéijecsúcsokkal együtt (lásd
2. ábra). A VIII. faktor:C-től szeparált plazmafehéqék az alábbi molekulatömegekkel rendelkeztek:
| antitrombin III. | 65 000 D |
| C-fehérje | 62 000 D |
| X. faktor | 59 000 D |
| IX. faktor | 57000D |
| alfa-2-makroglobulin | 718000D |
| IgM | 900 000 D |
| fibrinogén | 340000D |
| IgG | 150000D |
| albumin | 67 000 D |
| A VIII. faktor.C-aktivitás meghatározása a kétlép- |
esős kromogén eljárással történt, a kromogén-szubsztrát eljárás (KABI Coatest Factor VIII) alkalmazásával, az eredeti eljárás során a csöveket 37 °C-on kezelték, ezt az eljárást módosítottuk, és a microtiter lemezeket csökkentett mennyiségű reagenssel kezeltük. 50 μΐ mintát vagy standardot alkalmaztunk, amit 75 μΐ foszfolipid, IXa faktor, X faktor és CaCl2-oldattal elegyítettünk, 37 °C-on 15 percig inkubáltunk, majd 50 μΐ szubsztrátot adtunk hozzá. További 20 perces, 37 °C-on végzett inkubálás után a reakciót 50 μΐ 1 M citromsav hozzáadásával leállítottuk. A színreakció eredményeit 405 nm-en olvastuk le, a referencia 492 nm volt.
A VIII. faktor:C-aktivitás meghatározása egylépcsős eljárással történt APTT-módszer alkalmazásával (Actiated Parttal Thromboplastin Time). A küvettákba 100 μΐ mintát vagy standardot pipettáztunk, majd 100 μί deficiens-plazmát adtunk hozzá (VIII. faktor deficiens-plazma, General Diagnostic), és az elegyet 37 °C-on 5 percig termosztáltuk. 100 μΐ és 0,03 M CaCl2 hozzáadása után meghatároztuk az elegy koagulációjához szükséges időt.
A mennyiségi meghatározáshoz a WHO standard szerint (3. International Standard of FVIII, humán plazma, 3,9 IU/ml) kalibrált általános standardokból hígítási sorokat készítettünk. A fent említett kétlépcsős eljárás detektálási határa alacsonyabb (körülbelül 10-szer), mint az egylépcsős eljárásé. A kétlépcsős eljárás során alkalmazott heparin adagolása előnyös, mivel a heparinnak a mérésre esetleges hatásait a mérés során a hígítással könnyen megszüntethetjük.
A VIII. faktor:Ag-t ELISA eljárással határoztuk meg, „coatingoló” anyagként (coating matériái) VIII. faktor inhibitor-betegek antitestjeit alkalmaztuk a microtiter lemezeken, és ugyanezekből az inhibitor-betegekből származó, peroxidázzal jelzett F(AB’)2-ket alkalmaztunk a VIII. faktor kötéseinek meghatározására [Thromb. Haemost., 53(3), 1985, 346-350]. A standardgörbéket a WHO standard szerint (1. IRP, elfogadva 1982-ben) kalibrált poolozott normál plazma alkalmazásával hoztuk létre.
A vWF:Ag-t ELISA eljárással határoztuk meg, de „coatingoló” anyagként (coating matériái) nyúl antihumán vWF-t (DAKO, Denmark) alkalmaztunk a kötött vWF meghatározására. A standardgörbéket ugyanannak a normál plazmának az alkalmazásával hoztuk létre, mint a VIII. faktor: Ag ELISA esetén.
AIX. faktort egylépcsős eljárással határoztuk meg, a VIII. faktor:C-vel analóg módon, de IX. faktor deficiens plazma alkalmazásával. Az IgG-t radiális immundifíúzióval határoztuk meg (Immunochemistry, 2, 1965, 235-254), míg az albumint, a fíbrinogént, az alfa-2-makroglobulint, a X. faktort és az antitrombin Ill-t „rockét” immunoelektroforézissel (Anal. Biochem., 15, 1966, 45-52) határoztuk meg. Az OD280 meghatározása spektrofotométerrel történt (Spectronic 601, a Milton Roy Company), míg a fehérjék meghatározása Kjeldahl eljárása szerint történt (Ph. Eur. 2. Ed., I, V.3.5.2.), a TCA-val való csapadékképzés nélkül. A tisztított frakciók fajlagos aktivitását a VIII. faktor:C koncentrációjának és az OD280-nak, illetve a fehétjék Kjeldahl eljárása szerint meghatározott koncentrációjának az arányával kaptuk meg. Amennyiben a fajlagos aktivitás meghatározása az OD280-al történt, és nem ugyanazt a kiindulási plazmát alkalmaztuk, a különböző kísérletek eredményei nem voltak közvetlenül összehasonlíthatók, mivel Ratnoff és társai szerint (J. Clin. Invest., 48, 1969, 957-962) a VIII. faktort tartalmazó frakciók zavarosak.
A kísérletek során alkalmazott gélszűrő anyagok az alábbiak voltak:
Sepharose CL-2B, Sepharose CL—4B, Sepharose C1-6B, Sepharose 4FF, Sepharose 6FF, Sephacryl S—400 és Sephacryl S-500 a Pharmacia-tól (Hillerod, Denmark), Biogel A-5m, Fine a BioRad-tól (Bie kriocsapadékképzés Berntsen, Rodovre, Denmark), Fractogel TSK HW-65(F) a Merck-től (Struers, Rodovre, Denmark) és Matrex Cellufíne CGL 2000 az Amicon-tól (Helsingborg, Sweden).
2. példa
A plazma gélszűrése a VIII. faktor izolálása céljából különböző gélszűrő közegek alkalmazásával
Egy 2,6 cm átmérőjű oszlopot különböző gélszűrő közegekkel töltöttünk meg, melyek eltérő frakcionálási sort alkottak, és a szerkezetük is eltérő volt. A töltött
HU 214 905 Β oszlop végső magassága minden esetben 60 cm volt. A plazmát az 1. példa eljárása szerint olvasztottuk meg, és ml-enként 1 IU heparint adtunk hozzá. Minden egyes gélszűrő közeg esetén 50 ml plazmát vittünk fel az oszlopra (az ágytérfoat 16%-a). Az oszlop töltése és a pufferrel történő eluálás az 1. példa eljárása szerint történt. A folyadékráta minden esetben az 1. példában alkalmazottal volt azonos, kivéve a Biogel A-5m esetén, amikor a fokozott háttémyomás miatt a folyadékráta alacsonyabb, 50 ml/óra volt. A frakciókat összegyűjtöttük és Coatest alkalmazásával minden egyes frakcióból meghatároztuk az OD28o-at és a VIII. faktor:C-t. A VIII. faktor fő frakcióját az 1. példa eljárása szerint szelektáltuk, és a hozamot mint a VIII. faktor fő frakció VIII. faktor:C-tartalmának, és a felvitt plazma VIII. faktor.C-tartalmának a százalékos arányát határoztuk meg.
Az egyes közegek frakcionálási sorozata, szemcsemérete és a kapott főértékek összefoglalása az I. táblá10 zatban található.
I. táblázat
| Gélszűrő közeg | Frakcionálási sorozat | Kísérlet száma | Hozam,% | Fajlagos aktivitás | Részecskeátmérö, pm (nedves) |
| A | 1x104-4x106 | 3 | 95 | 0,16 | 40-165 |
| B | 6χ104-2χ107 | 4 | 82 | 0,88 | 40-165 |
| C | 7x105-4x10’ | 3 | 68 | 0,24 | 60-200 |
| D | 1χ104-4χ106 | 3 | 96 | 0,71 | 40-165 |
| E | 6x104-2x10’ | 3 | 86 | 1,35 | 40-165 |
| F | 6x104-8x10’ | 3 | 91 | 0,28 | 40-105 |
| G | 1x104-5x10« | 1 | 71 | 0,12 | 40-80 |
| H | 5x104-5x106 | 2 | 84 | 0,18 | 32-63 |
| I | 1x104-3x106 | 2 | 92 | 0,18 | 45-105 |
| J | 1x104-8x106 | 3 | 101 | 0,75 | 40-105 |
A: Sepharose CL-6B, B: Sepharose C1-4B, C: Sepharose C1-2B, D: Sepharose 6FF, E: Sepharose 4FF, F: Sephacryl S-500, G: Biogel A-5m, Fine, H: Fractogel TSK HW-65 (F), I: Matrex Cellufine CGL 2000, J: Sepharcyl
3. példa
A plazma gélszűrése a VIII. faktor izolálása céljából különböző oszloptöltések alkalmazásával
Egy 2,6 cm átmérőjű oszlopot 60 cm végső magasságig Sepharose 4FF-el töltöttünk meg. A plazmát az 1. kísérlet eljárása szerint olvasztottuk meg. Az olvasztás után 0,5 M HCI alkalmazásával a plazma pH-ját 7,0 értékre állítottuk be, 1 IU heparint adunk hozzá, és 10 μηι-es nylonszűrőn átszűrtük. Az oszlopra 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, illetve 70 ml plazmát vittünk fel. Az áramlást és az elúciót pufferrel hoztuk létre, az 1. példa eljárása szerint, a puffer pH-értéke 7,0 volt. A frakciókat összegyűjtöttük, és Coatest alkalmazásával minden egyes frakcióból meghatároztuk az OD280-at, és a VIII. faktor:C-t. A VIII. faktor fő frakciójának a fajlagos aktivitását a Vili. faktor:C/ml-nek az OD280-hoz viszonyított aránya alapján határoztuk meg. A kísérleteket háromszor ismételtük meg, az egyes töltöttségek esetén három különböző plazmát alkalmaztunk, és meghatároztuk a fő értékeket (χ). A VIII. faktor fő frakció mennyisége (ml) a VIII. faktort tartalmazó frakciónak az a mennyisége, melyet a nagy, széles fehérjecsúcs (OD280) elúciója előtt gyűjthetünk, és az 1. példa eljárása szerint szelektálhatunk. A hozamot, mint a VIII. faktor fő frakció VIII. faktor:C-tartalmának, és a felvitt plazma VIII. faktor:C-tartlamának a százalékos arányát határoztuk meg.
A kapott eredményeket a II. tábláztában foglaltuk 35 össze.
II. táblázat
| Felvitt plazma mennyisége | VIII. faktor fő frakció, ml | Hozam, % | Fajlagos aktivitás | ||
| ml | agy- térfogat | arány- szám | |||
| 30 | 9,4 | 1 | 70 | 88 | 0,81 |
| 2 | 70 | 95 | 0,18 | ||
| 3 | 70 | 90 | 0,63 | ||
| X | 70 | 91 | 0,54 | ||
| 40 | 12,6 | 1 | 70 | 76 | 0,68 |
| 2 | 70 | 85 | 0,17 | ||
| 3 | 70 | 93 | 0,61 | ||
| X | 70 | 85 | 0,49 | ||
| 50 | 15,7 | 1 | 80 | 91 | 0,57 |
| 2 | 80 | 90 | 0,20 | ||
| 3 | 80 | 85 | 0,53 | ||
| X | 80 | 89 | 0,43 |
HU 214 905 Β
| Felvitt plazma mennyisége | VIII. faktor fő frakció, ml | Hozam, % | Fajlagos aktivitás | ||
| ml | agy- térfogat | arány- szám | |||
| 60 | 18,8 | 1 | 80 | 79 | 0,81 |
| 2 | 80 | 85 | 0,16 | ||
| 3 | 90 | 95 | 0,61 | ||
| X | 83 | 86 | 0,53 | ||
| 70 | 12,6 | 1 | 80 | 85 | 0,82 |
| 2 | 100 | 90 | 0,21 | ||
| 3 | 100 | 93 | 0,53 | ||
| X | 93 | 89 | 0,52 |
4. példa
A plazma gélszűrése a VIII. faktor izolálása céljából, különböző elúciós ráták alkalmazásával
A 3. példában alkalmazott oszlopra 50 ml mennyiségű, a fenti eljárással megolvasztott plazmát vittünk fel. Az olvasztás után 0,5 M HCI alkalmazásával a plazma pH-ját 7,0 értékre állítottuk be, 1IU heparint adtunk hozzá, és 10 μηι-es nylonszűrőn átszűrtük. Három különböző folyadékráta alkalmazását (100, 200, illetve 300 ml/óra) vizsgáltuk a plazmán. A plazma felvitele és az elúció során ugyanazt az áramlást alkalmaztuk. Az elúciót a 3. példában alkalmazott pufferrel végeztük. A frakciókat összegyűjtöttük, és Coatest alkalmazásával minden egyes frakcióból meghatároztuk az OD280at és a VIII. faktor:C-t. A fajlagos aktivitást és a VIII. faktor fő frakciót a 3. példa szerint határoztuk meg. Meghatároztuk a VIII. faktor fő frakció mennyiségének az értékét (x), a hozamot és a fajlagos aktivitást. Az eredményeket a III. táblázatban foglaltuk össze.
III. táblázat
| Áramlás | Plazma arány- szám | VIII. faktor fő frakció, ml | Hozam, % | Fajlagos aktivitás | |
| ml/óra | ágy térfogat/ óra | ||||
| 100 | 0,31 | 1 | 80 | 89 | 0,75 |
| 2 | 80 | 88 | 0,17 | ||
| 3 | 80 | 80 | 0,65 | ||
| X | 80 | 86 | 0,52 | ||
| 200 | 0,63 | 1 | 80 | 84 | 0,99 |
| 2 | 80 | 88 | 0,18 | ||
| 3 | 80 | 89 | 0,79 | ||
| X | 80 | 87 | 0,65 | ||
| 300 | 0,94 | 1 | 70 | 85 | 0,72 |
| 2 | 80 | 96 | 0,18 | ||
| 3 | 80 | 83 | 0,44 | ||
| X | 77 | 88 | 0,45 |
5. példa
A plazma gélszűrése a VIII. faktor izolálása céljából, különböző oszloptöltések alkalmazásával
Egy 10 cm átmérőjű oszlopot 60 cm végső magasságig Sepharose 4FF-el töltöttünk meg. A dán vérbankból (Danish Bloodbank) származó fagyasztott plazmát 30 °C-on, vízfürdőn olvasztottuk meg. Az oszlopra 925 gramm, 1497 gramm, illetve 2000 gramm mennyiséget vittünk fel. A plazma felvitele és az elúció során alkalmazott folyadékráta értéke 4200 ml/óra volt, ezt „Masterflex hőse pump” (Buch & Hóim, Herlev, Denmark) alkalmazásával biztosítottuk, és az említett érték óránként 0,89 ágytérfogatnak felelt meg. Az elúciót a 3. példában alkalmazott pufferrel végeztük. Az OD280 értékét Pharmacia Monitor UV-1 alkalmazásával folyamatosan követtük. Amikor az OD280 értéke az üres térfogattal emelkedni kezdett, elkezdtük gyűjteni a VIII. faktor fő frakciót, és amikor az OD280 értéke a nagy fehérjecsúcs megjelenését mutatta, befejeztük a frakciók gyűjtését. A VIII. faktor fő frakció VIII. faktor:C-tartalmát egylépcsős koagulációs eljárással határoztuk meg, a fehérjéket Kjeldahl eljárása szerint. A fajlagos aktivitás meghatározása a VIII. faktor fő frakció VIII. faktor:C egység összmennyiségének a VIII. faktor fő frakció fehéqemennyisége milligrammjaihoz viszonyított aránya szerint történt. A hozamot, mint a VIII. faktor fő frakció VIII. faktor:C-tartalmának és a felvett plazma VIII. faktor:C-tartalmának a százalékos arányát határoztuk meg.
Az eredményeket a IV. táblázatban foglaltuk össze.
IV. táblázat
| Felvitt plazma mennyisége | VIII. faktor fő frakció, gramm | Hozam, % | Fajlagos aktivitás, IU/ml | |
| gramm | agy- térfogat | |||
| 925 | 19,6 | 1192 | 74 | 2,5 |
| 1497 | 31,8 | 1860 | 73 | 2,24 |
| 2000 | 42,4 | 2200 | 81 | 1,08 |
6. példa
A plazma gélszűrése a VIII. faktor izolálása céljából, üzemi méretű oszlop alkalmazásával
Egy 29 cm átmérőjű oszopot Sepharose 4FF-el töltöttünk meg. Az ekvilibrálás után az 1. példában említett puffért alkalmaztuk, a gél magassága 53 cm volt. A dán vérbankból (Danish Bloodbank) származó 10 kg mennyiségű fagyasztott plazmát megolvasztottuk, 30 °C-ra melegítettük, majd felvittük az oszlopra. A felvitt mennyiség az ágytérfogat 28,8%-a volt. „Masterflex hőse pump” (Buch & Hóim, Herlev, Denmark) alkalmazásával az adagolás és az ekvilibráló pufferrel történő eluálás során 30 1/óra folyadékrátát biztosítottunk, ez az érték óránként 0,89 ágytérfogatnak felelt meg. Az OD280 értékét Pharmacia Monitor UV-1 alkalmazásával folyamatosan követtük, és az OD280 értéke növekedésének kezdetekor a Vili. faktor fő frakciót tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük.
HU 214 905 Β
Összesen 11,73 kg VIII. faktor fő frakciót gyűjtöttünk. A VIII. faktor:C-tartalmat egylépcsős koagulációs eljárással határoztuk meg, a fehérjéket Kjeldahl eljárása szerint. Összesen 8798 IU VIII. faktor:C-t és 2346 mgnál kevesebb fehérjét találtunk a VIII. faktor fő frakcióban, ami 880 IU/kg plazmahozamot VIII. faktor:C adott, ez 88%;os hozamnak felel meg a 3,75 IU/mg fehérjét tartalmazó termékből.
A jelen találmány szerinti eljárással kapott VIII. faktor fő frakciót a feloldott krio-csapadékból hagyományosan alkalmazott tisztítási eljárásokkal analóg módon tovább tisztíthatjuk, például további kromatográfiás tisztítással és liofílezéssel, és általánosan ismert kötőanyagokkal stabil készítménnyé alakíthatjuk. A készítményt az alkalmazás előtt fiziológiás konyhasó-oldatban készíthetjük elő, hagyományos hordozóanyagok alkalmazása mellett.
Claims (8)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás a vérplazma VIII. faktor-tartalmának az egyéb fehérjék mellől történő izolálására, azzal jellemezve, hogy az eljárás során gélszűrő közeget alkalmazunk, a vérplazmát csoportszeparáló körülmények között (group separating conditions) gélszűrésnek vetjük alá, nagy töltöttség és nagy folyadékráta alkalmazása mellett, a gélszűrő közeg a VIII. faktorra nézve semleges részecskékből áll, és az 1 * 103-l x 108 Dalton közötti intervallumokban frakciónál.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gélszűrő közeg olyan gélanyagból áll, amely az 1χ104_8χ107 Dalton közötti intervallumokban frakciónál.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gélszűrő közeg olyan gélanyagból áll, amely az 5*104—4*107 Dalton közötti intervallumokban frakciónál.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a felvitt plazma mennyisége az ágytérfogatnak legalább 5%-a.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a felvitt plazma mennyisége az ágytérfogatnak a 15-40%-a.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a folyadékráta legalább 0,3 ágytérfogat/óra.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a folyadékráta 0,5-2 ágytérfogat/óra.
- 8. Eljárás a Vili. faktort tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással izolált Vffl. faktort gyógyászatilag elfogadható segédanyagokkal szokásos dózisformává alakítjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK562189A DK162233C (da) | 1989-11-09 | 1989-11-09 | Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9201551D0 HU9201551D0 (en) | 1992-08-28 |
| HUT60511A HUT60511A (en) | 1992-09-28 |
| HU214905B true HU214905B (hu) | 1998-07-28 |
Family
ID=8144000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9201551A HU214905B (hu) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | Eljárás VIII. faktor izolálására |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5245014A (hu) |
| EP (1) | EP0524172B1 (hu) |
| JP (1) | JP2509407B2 (hu) |
| CN (1) | CN1044121C (hu) |
| AT (1) | ATE118508T1 (hu) |
| AU (1) | AU631471B2 (hu) |
| BG (1) | BG61231B1 (hu) |
| CA (1) | CA2073012C (hu) |
| CZ (1) | CZ537190A3 (hu) |
| DE (1) | DE69017050T2 (hu) |
| DK (1) | DK162233C (hu) |
| ES (1) | ES2068404T3 (hu) |
| FI (1) | FI103510B1 (hu) |
| HU (1) | HU214905B (hu) |
| IE (1) | IE66836B1 (hu) |
| IL (1) | IL96277A (hu) |
| NO (1) | NO180741C (hu) |
| NZ (1) | NZ236004A (hu) |
| PL (1) | PL164894B1 (hu) |
| PT (1) | PT95830B (hu) |
| RU (1) | RU2055593C1 (hu) |
| SK (1) | SK537190A3 (hu) |
| UA (1) | UA29421C2 (hu) |
| WO (1) | WO1991007438A1 (hu) |
| YU (1) | YU47524B (hu) |
| ZA (1) | ZA908599B (hu) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2042138T3 (es) * | 1989-05-24 | 1993-12-01 | Miles Inc. | Filtracion en gel del factor viii tratado termicamente. |
| US5859204A (en) * | 1992-04-07 | 1999-01-12 | Emory University | Modified factor VIII |
| US5888974A (en) * | 1992-04-07 | 1999-03-30 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
| US6180371B1 (en) | 1996-06-26 | 2001-01-30 | Emory University | Modified factor VIII |
| US5659017A (en) * | 1995-11-07 | 1997-08-19 | Alpha Therapeutic Corporation | Anion exchange process for the purification of Factor VIII |
| US6458563B1 (en) | 1996-06-26 | 2002-10-01 | Emory University | Modified factor VIII |
| US7560107B2 (en) | 1996-06-26 | 2009-07-14 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6531577B1 (en) * | 1997-12-15 | 2003-03-11 | Hemasure Denmark A/S | von Willebrand factor (vWF)-containing preparation, process for preparing vWF-containing preparations, and use of such preparations |
| US6290527B1 (en) * | 1998-07-03 | 2001-09-18 | Nippon Telegraph And Telephone Corp. | Nippon telegraph and telephone corporation |
| PL203177B1 (pl) | 1999-02-22 | 2009-09-30 | Baxter Int | Sposób liofilizacji wodnego preparatu farmaceutycznego |
| JP2002348300A (ja) * | 1999-04-12 | 2002-12-04 | Fujimori Kogyo Co Ltd | 血液凝固第ｖｉｉｉ因子および血液凝固第ｖｉｉｉ因子／フォン・ビルブラント因子複合体の精製方法 |
| AUPR638801A0 (en) * | 2001-07-13 | 2001-08-09 | Life Therapeutics Limited | Factor viii separation |
| WO2005107776A1 (en) | 2004-05-03 | 2005-11-17 | Emory University | METHOD OF ADMINISTERING PORCINE B-DOMAINLESS fVIII |
| WO2006021584A2 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Novo Nordisk Health Care Ag | Purification of factor xiii polypeptides from biological materials |
| US20060226086A1 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-12 | Robinson Thomas C | Centrifuge for blood processing systems |
| BRPI0921429B1 (pt) | 2008-11-07 | 2022-07-12 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Formulação farmacêutica liofilizada estável, e, método para preparar um fator liofilizado estável |
| AU2011234521B2 (en) * | 2010-03-30 | 2015-04-23 | Octapharma Ag | A process for purifying Vitamin K dependent proteins such as coagulation factor IX |
| RU2445974C2 (ru) * | 2010-04-26 | 2012-03-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр ГНЦ РАМН | Способ получения концентрата фактора viii из плазмы крови человека |
| CN103298483B (zh) | 2010-11-05 | 2017-04-12 | 百深有限责任公司 | 具有增加的比活性的抗血友病因子viii的新型变体 |
| AU2011343813B2 (en) | 2010-12-15 | 2015-05-21 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Eluate collection using conductivity gradient |
| CN103506080A (zh) * | 2012-06-19 | 2014-01-15 | 汪志友 | 一种用于分离纯化凝血因子viii的介质及其制备方法 |
| BR112015006634B1 (pt) | 2012-09-28 | 2022-06-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Método e kit para avaliação de reação de coagulação sanguínea |
| US9663553B2 (en) | 2014-01-29 | 2017-05-30 | Hemarus Therapeutics Limited | Integrated process for the production of therapeutics (human albumin, immunoglobulins, clotting factor VIII and clotting factor IX) from human plasma |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4495175A (en) * | 1982-08-05 | 1985-01-22 | University Of Rochester | Preparation of highly purified human antihemophilic factor |
| US4543210A (en) * | 1984-10-04 | 1985-09-24 | Miles Laboratories, Inc. | Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate |
| DK525384D0 (da) * | 1984-11-05 | 1984-11-05 | Nordisk Insulinlab | Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat |
| US4847362A (en) * | 1985-02-01 | 1989-07-11 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| US4675385A (en) * | 1985-03-27 | 1987-06-23 | Alpha Therapeutic Corporation | Isolation of human plasma procoagulant protein factor VIII from biological factors |
| US4758657A (en) * | 1985-07-11 | 1988-07-19 | Armour Pharmaceutical Company | Method of purifying Factor VIII:C |
| AT391808B (de) * | 1986-11-03 | 1990-12-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf)-haeltigen fraktion |
| EP0321835B1 (en) * | 1987-12-21 | 1994-09-28 | Miles Inc. | Gel filteration of factor VIII |
| WO1989009784A1 (en) * | 1988-04-08 | 1989-10-19 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Production of heat-stable factor viii concentrate |
| ES2042138T3 (es) * | 1989-05-24 | 1993-12-01 | Miles Inc. | Filtracion en gel del factor viii tratado termicamente. |
-
1989
- 1989-11-09 DK DK562189A patent/DK162233C/da not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-10-26 ZA ZA908599A patent/ZA908599B/xx unknown
- 1990-11-01 CZ CS905371A patent/CZ537190A3/cs unknown
- 1990-11-01 SK SK5371-90A patent/SK537190A3/sk unknown
- 1990-11-05 HU HU9201551A patent/HU214905B/hu unknown
- 1990-11-05 JP JP3500067A patent/JP2509407B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 WO PCT/DK1990/000279 patent/WO1991007438A1/en active IP Right Grant
- 1990-11-05 CA CA002073012A patent/CA2073012C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 RU SU905052211A patent/RU2055593C1/ru active
- 1990-11-05 AU AU67470/90A patent/AU631471B2/en not_active Ceased
- 1990-11-05 EP EP90917201A patent/EP0524172B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 DE DE69017050T patent/DE69017050T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-05 ES ES90917201T patent/ES2068404T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 UA UA94020494A patent/UA29421C2/uk unknown
- 1990-11-05 AT AT90917201T patent/ATE118508T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-07 US US07/610,480 patent/US5245014A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-07 YU YU210590A patent/YU47524B/sh unknown
- 1990-11-07 NZ NZ236004A patent/NZ236004A/xx unknown
- 1990-11-08 IL IL9627790A patent/IL96277A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 IE IE402290A patent/IE66836B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 PT PT95830A patent/PT95830B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-11-09 PL PL90287703A patent/PL164894B1/pl unknown
- 1990-11-09 CN CN90109030A patent/CN1044121C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-08 FI FI922105A patent/FI103510B1/fi active
- 1992-05-08 BG BG96316A patent/BG61231B1/bg unknown
- 1992-05-08 NO NO921839A patent/NO180741C/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU214905B (hu) | Eljárás VIII. faktor izolálására | |
| JP3701028B2 (ja) | 高純度フォンビルブラント因子の入手方法 | |
| FI106721B (fi) | Menetelmä ihmisen standardisoidun, korkean puhtauden omaavan von Willebrand -tekijän konsentraatin valmistamiseksi | |
| US6005077A (en) | Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation | |
| CA2159702C (en) | High molecular and low molecular fractions of von willebrand factor | |
| JP2000506869A (ja) | 安定な因子ｖｉｉｉ／▲下ｖ▼ｗｆ複合体 | |
| US20110275570A1 (en) | Process for obtaining a concentrate of von willebrand factor of a complex of factor viii/von willebrand factor and use of the same | |
| JP2009161547A (ja) | 高度に精製された第ｖｉｉｉ因子コンプレックス | |
| CN105622746A (zh) | 一种从冷沉淀提取凝血因子ⅷ的废料中提取人血管性血友病因子的制备工艺 | |
| JP2004123744A (ja) | Ｖｉｉｉ因子：ｃ含有フォンビルブラント因子の濃縮物およびそれに関連する方法 | |
| EP0245875A2 (en) | Method of purifying factor VIII | |
| CN116322920A (zh) | 使用氧化硅吸附从血浆中纯化fviii | |
| CN114249812B (zh) | 一种降低vWF制品中IgM含量的方法 | |
| JPH10504310A (ja) | 生物学的に活性な化合物で患者を治療する方法 | |
| HRP930277A2 (en) | A method for isolating biologically active compounds |