DE69129899T2

DE69129899T2 - Verfahren zur Herstellung von D-Alpha-Aminosäuren

Info

Publication number: DE69129899T2
Application number: DE69129899T
Authority: DE
Inventors: Yasuhiro Akasi-Shi Hyogo 673 Ikenaka; Hironori Takasago-Shi Hyogo 676 Nanba; Satomi Kobe-Shi Hyogo 655 Takahashi; Masayuki 106 Leopalace Futami-Cho Akashi-Shihyogo 674 Takano; Kazuyoshi Suma-Ku Kobe-Shi Hyogo 654-01 Yajima; Yukio Kakogawa-Shi Hyogo 675 Yamada
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-12-07
Filing date: 1991-12-06
Publication date: 1999-01-14
Anticipated expiration: 2011-12-07
Also published as: KR920703834A; US5695968A; KR100247853B1; DE69129899D1; US5565344A; KR100257212B1; WO1992010579A1; EP0515698B1; CN1057568C; EP0515698A1; EP0515698A4; CN1063310A; ES2121001T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-α- Aminosäuren und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von D-α-Aminosäuren unter Verwendung eines neuen Transformanten, der mit ein Gen enthält, das mit einem Enzym, das D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren in die entsprechenden D-α- Aminosäuren umwandeln kann, verwandt ist.

Hintergrund der Erfindung

Optisch aktive D-α-Aminosäuren sind wichtige Verbindungen als Zwischenprodukte von Medikamenten und insbesondere sind D- Phenylglycin, D-Parahydroxyphenylglycin und andere Zwischenprodukte von semisynthetisierten Penicillin- oder Cephalosporin-Antikörpern industriell wichtige Verbindungen. Als Verfahren zur Herstellung solcher D-α-Aminosäuren gibt es ein gut bekanntes Verfahren, bei dem die Carbamoylgruppen der entsprechenden D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren unter Erhalt der gewünschten D-α-Aminosäure entfernt werden. Die Entfernung der Carbamoylgruppen wird in diesem Verfahren durch ein chemisches Verfahren erreicht (z. B. die Beschreibung der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 58-4707) oder durch ein Verfahren, welches die Enzymreaktion von Mikroorganismen verwendet (z. B. die Beschreibungen der japanischen Patentveröffentlichungen Nrn. 57-18793, 63-20520 und 1- 48758).

Problemstellungen der Erfindung

In einem zum Entfernen der Carbamoylgruppen verwendeten Verfahren, wie oben beschrieben, wird eine große Mineralsäuremenge, wie Schwefelsäure, verwendet und daher treten schwerwiegende Umweltprobleme bezüglich ihrer Entsorgung und dergleichen auf. Auf der anderen Seite hat ein Verfahren, das die Enzymreaktion von Mikroorganismen verwendet, verschiedene Nachteile, und zwar, daß Mikroorganismen, die bisher als Quelle der Enzymbereitstellung bekannt sind, keine ausreichende Enzymmenge herstellen können und daß teure Hydantoin- oder N- Carbamoylaminosäure-Verbindungen zur Enzymherstellung erforderlich sind.

Mittel zur Lösung der Probleme

Zur Lösung solcher Probleme ist es Aufgabe dieser Erfindung, Mikroorganismen mit hoher Enzymproduktivität bereitzustellen, sowie D-α-Aminosäuren mit hoher Wirksamkeit unter Verwendung einer so erhaltenen Quelle der Enzymbereitstellung herzustellen.
Ein ähnliches Verfahren ist in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 63-24894 beschrieben. Diese Technik betrifft jedoch die Herstellung von L-α-Aminosäuren, und es enthält kein Versuchsbeispiel, das die Herstellung von D-α- Aminosäuren beschreibt.
Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung von D- α-Aminosäuren, wobei bei dem Verfahren die D-N-Carbamoyl-α- Aminosäuren in die entsprechenden D-α-Aminosäuren in einem wässrigen Medium mit Hilfe der Wirkung eines Enzyms umgewandelt werden, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym, das die D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umwandeln kann, durch einen Transformanten hergestellt wird, der erhältlich ist durch Transformation von Wirtsbakterienzellen, ausgewählt aus den Mikroorganismen, die zu den Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Corynebacterium und Brevibacterium gehören, mit einer rekombinanten DNA, umfassend eine Vektor-DNA und ein DNA-Fragment, enthaltend ein Gen, das dieses Enzym codiert, woraufhin die erzeugten D-α-Aminosäuren gesammelt werden.
Übrigens ist bisher kein Beispiel bekannt, daß eine rekombinante DNA, umfassend einen Vektor und ein Gen, das mit einem Enzym, das D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umwandeln kann, verwandt ist, in Mikroorganismen eingeführt wurde, um die Expression des Gens zu erreichen. Eine solche Technik war bis zur Vollendung dieser Erfindung nicht erfolgreich.
Die Enzyme, die D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umwandeln können, sind in der Tat nicht auf solche beschränkt, die spezifisch auf D-Isomere wirken oder solche, die entweder auf D- oder L-Isomere wirken. Insbesondere können als Enzyme mit einer genauen Stereoselektivität für D- N-Carbamoyl-α-Aminosäuren D-N-Carbamoyl-α- Aminosäurenamidohydrolasen erwähnt werden.
Beispiele des DNA-Fragments, enthaltend ein Gen, das erfindungsgemäß verwendet werden kann, sind solche, die von Eukaryonten, Prokaryonten, Viren, Bakteriophagen oder Plasmiden abstammen, und die ein Gen enthalten, das mit einer bestimmten D-N-Carbamoyl-α-Aminosäureamidohydrolase verwandt ist. Als das von Prokaryonten abstammende Gen sind solche bevorzugt, die von Bakterien abstammen, die zum Beispiel zur Gattung Pseudomonas, Agrobacterium, Aerobacter, Aeromonas, Brevibacterium, Bacillus, Flavobacterium, Serratia, Micrococcus, Arthrobacter, Alkaligene, Achromobacter, Moraxella oder Paracoccus gehören, und die mit D-N-Carbamoyl-α-Aminosäureamidohydrolasen verwandt sind. Spezifische Beispiele solcher Stämme sind wie folgt: Aerobacter cloacae IAM 1221, Bacillus macroides ATCC 12905, Bacillus alvei IFO 3343, Brevibacterium ammoniagenes IFO 12071, Flavobacterium flavescens IFO 3086, Sarcina lutea IFO 1099, Serratia marcescens IFO 3054, Micrococcus luteus IFO 12708, Aeromonas hydrophilia IFO 3820, Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900), Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181), Agrobacterium 1302 NRRL B11291, Alkaligenes aquamarinus AJ 11199, Achromobacter liquefaciens AJ 11198, Moraxella nonliquefaciens AJ 11221, Paracoccus denitrificans AJ 11222, Arthrobacter fragilus AJ 11223 und dergleichen.
Als kennzeichnende Beispiele der obigen Bakterien sind die mikrobiologischen Eigenschaften von der Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900), Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) und Pseudomonas sp. KNK 505 (FERM BP-3182) unten beschrieben.

Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900)

(a) Morphologie

(1) Zellgröße und -form: 0,5-1,0 · 2,0-4,0 um, Stäbchen
(2) Zellulärer Polymorphismus: keiner
(3) Motilität und Geiselanordnung: aktiv, subpolar
(4) Sporenbildung: keine
(5) Gram-Färbung: negativ

(b) Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien

(1) Fleischextrakt/Agarkultur: zufriedenstellendes Wachstum, rund, wellig, glatte Ränder, glatte, feuchte Oberfläche, weiß bis cremefarben, glänzend, opaque, flüssige Form.
(2) Fleischextrakt/Schrägagarkultur: ausgezeichnetes Wachstum, sogar Wachstum auf der Inokulationslinie, dicker Kamm, glatte feuchte Oberfläche, glatter Rand, weiß bis cremefarben, glänzend, opaque, keine Änderung im Medium.
(3) Fleischextrakt/Gelatinestichkultur: schwaches Wachstum, Wachstum entlang der Einstichlinie, Wachstum um die Einstichlinie, keine Gelatineverflüssigung, weiß bis cremefarben, keine Änderung in der Transparenz, keine Änderung im Medium.
(4) Fleischextraktflüssigkultur: mittleres Wachstum, ungleiche Trübung, Flockenbildung, kein Oberflächenwachstum
(5) Lakmusmilch: schwache Säure

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Nitratreduktion:
(2) Denitrifikation:
(3) MR-Test: +
(4) Vp-Test: -
(5) Indolbildung: -
(6) Wasserstoffsulfidbildung:
(7) Stärkehydrolyse:
(8) Verwendung von Citrat: - (Simmonsmedium)
(9) Anorganische Stickstoffquelle: + (Nitrate, Ammoniumsalze)
(10) Urease: -
(11) Oxidase: +
(12) Katalase: +
(13) Wachstumsbereich: 20-37ºC, pH 6,5-8,5
(14) Verhalten gegenüber Sauerstoff: Aerob
(15) O-F-Test: O-Typ
(16) Bildung von Säure und Gas aus Saccharid: Säurebildung: -, Gasbildung: - (D-Glucose)
(17) Verwendung von Malonat: -
(18) Deaminasereaktion von Phenylalanin: -
(19) Decarboxylasereaktion: - (Lysin)
(20) Arginin-Dihydrolase-Reaktion: -
(21) Caseinabbau: -
(22) DNA-Abbau: -
(23) Auxotrophie: keine
(24) Verwendung von Kohlenstoffverbindungen:
D-Glucose: +
L-Arabinose: +
Saccharose: +
D-Fructose: +
Malonat: -
Cellobiose: +
Ethanol: -
D-Xylose: +
D-Tartrat: -
Sorbitol: +
Citrat: -
Lactose: +
D-Mannitol: +
Meso-Inositol: +
Raffinose: +
L-Rhamnose: +
Maltose: +
α-Methyl-D-glycosid: +
D-Mannose: +
Salizin: -
N-Acetylglucosamin: +
Gluconat: -
Caprinat: -
Adipat: -
Phenylacetat: -
Methanol: -
(25) Eigelbreaktion: -
(26) β-Galactosidase: +
(27) Esculinhydrolyse: +
(28) Cytochromoxidase: +
(29) Tween®-Abbau: - (Tween®80)
(30) 3-Ketolactosebildung: -

Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181)

(a) Morphologie

(1) Zellgröße und -form: 0,5-0,7 · 1,2-2,5 um, Stäbchen
(2) Zellulärer Polymorphismus: keiner
(3) Motilität: aktiv
(4) Sporenbildung: keine
(5) Gram-Färbung: negativ
(6) Kolonienform: rund, regelmäßig, vollständig, flach, glatt, glänzend, semitranslucent, gelbbraun

(b) Physiologische Eigenschaften

(1) Lyse bei 3% KOH: +
(2) Aminopeptidase: +
(3) Oxidase: +
(4) Katalase: +
(5) Zellwachstum:
Anaerobe Bedingung: -
37/40ºC: +/+
pH 5,6: -
Mac-Conkey-Agar: -
SS-Agar: -
Cetrimid-Agar: -
(6) Säurebildung (O-F-Test)
Glucose, aerobe Bedingungen: -
Glucose, anaerobe Bedingungen: -
(7) Gasbildung von Glucose: -
(8) Säurebildung (ASS)
Glucose: +
Fructose: -
Xylose: +
(9) ONPG: -
(10) ADH: -
(11) ODC: -
(12) VP: -
(13) Indolbildung: -
(14) Nitratreduktion: -
(15) Denitrifikation: -
(16) Phenylalanindeaminase: -
(17) Lävanbildung von Sucrose: -
(18) Lecithinase: -
(19) Urease: -
(20) Hydrolyse
Stärke: -
Geratin: -
Casein: -
DNA: -
Tween®80: -
Äsculin: -
(21) Tyrosinabbau: -
(22) Verwendung verschiedener Verbindungenn:
Acetat: schwach
Adipat: -
Caprinat: -
Citrat: -
Citraconat: -
Glycolat: -
Lactat: +
Lävulinat: -
Malat: -
Malonat: -
Mesaconat: -
Phenylacetat: -
Suberat: -
m-Tartrat: -
D-Tartrat: -
L-Arabinose: +
Fructose: +
Glucose: +
Mannose: +
Maltose: -
Xylose: +
Saccharose: -
Trehalose: -
Ribose: -
Saccharat: -
Hydroxybutylat: -
Benzoat: -
Mannitol: +
Gluconat: +
2-Ketogluconat: +
N-Acetylglucosamin: -
L-Serin: -
L-Histidin: -
L-Valin: -
(23) Chinon-Typ der Hauptatmung: Ubichinon 10

Pseudomonas sp. KNK 505 (FERM BP-3182)

(a) Morphologie

(b) Physiologische Eigenschaften

(1) Lyse bei 3% KOH: +
(2) Aminopeptidase: +
(3) Oxidase: +
(4) Katalase: +
(5) Zellwachstum:
Anaerobe Bedingung: -
37/40ºC: +/+
pH 5,6: -
Mac-Conkey-Agar: -
SS-Agar: -
Cetrimid-Agar: -
(6) Säurebildung (O-F-Test)
Glucose, aerobe Bedingungen: -
Glucose, anaerobe Bedingungen: -
(7) Gasbildung von Glucose: -
(8) Säurebildung (ASS)
Glucose: +
Fructose: -
Xylose: +
(9) ONPG: -
(10) ADH: -
(11) ODC: -
(12) VP: -
(13) Indolbildung: -
(14) Nitratreduktion: -
(15) Denitrifikation: -
(16) Phenylalanindeaminase: -
(17) Lävanbildung von Sucrose: -
(18) Lecithinase: -
(19) Urease: -
(20) Hydrolyse
Stärke: -
Geratin: -
Casein: -
DNA: -
Tween®80: -
Äsculin: -
(21) Tyrosinabbau: -
(22) Verwendung verschiedener Verbindungenn:
Acetat: schwach
Adipat: -
Caprinat: -
Citrat: -
Citraconat: -
Glycolat: -
Lactat: +
Lävulinat: -
Malat: -
Malonat: -
Mesaconat: -
Phenylacetat: -
Suberat: -
m-Tartrat: -
D-Tartrat: -
L-Arabinose: +
Fructose: +
Glucose: +
Mannose: +
Maltose: -
Xylose: +
Saccharose: -
Trehalose: -
Ribose: -
Saccharat: -
Hydroxybutylat: -
Benzoat: -
Mannitol: +
Gluconat: +
2-Ketogluconat: +
N-Acetylglucosamin: -
L-Serin: -
L-Histidin: -
L-Valin: -
(23) Chinon-Typ der Hauptatmung: Ubichinon 10
Zum Erhalt eines Gens aus diesen Stämmen, das mit einem Gen verwandt ist, das D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umwandeln kann, wird gewöhnlich genetische DNA aus einem Chromosom von Mikroorganismen gemäß dem herkömmlichen Verfahren extrahiert, woraufhin ein DNA-Fragment, das das gewünschte Gen enthält, erhalten und einer Analyse seiner Basensequenz unterzogen wird. Außerdem werden Mikroorganismen, die ein Enzym erzeugen, das D-N-Carbamoyl-α- Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umwandeln kann, sowie transformierte Mikroorganismen, in die dieses Gen eingeführt worden ist, kultiviert, und das erzeugte Gen wird gereinigt, woraufhin das Molekulargewicht des Enzyms und die Aminosäuresequenz in der Nähe des Aminoterminus durch einen Gasphasen-Proteinsequenzierer oder dergleichen bestimmt wird. Anschließend wird die DNA-Basensequenz mit der aminoterminalen Sequenz des Proteins verglichen, so daß die Startstelle der genetischen Translation in dem Teil der Basensequenz, die ein Enzymprotein codiert, das Carbamoylgruppen entfernt, in einem Protein bestimmt wird, und unter Berücksichtigung des Molekulargewichts des Proteins wurde bestätigt, daß das Enzymprotein von dem Genteil codiert wird, der von dieser Stelle bis zum Terminator-Codon reicht, wodurch das gewünschte Gen verifiziert wurde (siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kap. 4 und 13). Gemäß dieser Verfahren wurden die DNA-Fragmente der SEQ ID Nrn. 1 und 2 der beiliegenden Sequenzliste von den Stämmen Agrobacterium Art NK 712 und Pseudomonas sp. KNK 003A erhalten. Das das obige Enzym codierende so erhaltene Gen und/oder das dieses Gen enthaltende DNA-Fragment entspricht DNA-Fragmenten mit einer anderen Basensequenz, die eine Aminosäuresequenz codiert, die dem obigen Gen und/oder DNA-Fragment entspricht, da eine Aminosäure gewöhnlich einer Pluralität von Basencodonen entspricht, und diese Tatsache offensichtlich ist.
Als Vektor, der in dieser Erfindung verwendet wird, können Plasmide, Phagen oder Derivate davon verwendet werden, die von Mikroorganismen abstammen und die autonom in Bakterienzellen wachsen können, die zur Gattung Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Corynebacterium oder Brevibacterium gehören. Zum Beispiel können Wirts-Vektorsysteme, die in "Guidelines on Recombinant DNA Experiments" (Hrsg. The Life Science Section of the Research Development Office in the Science and Technology Agency: revidiert am 16. September 1987) auf Seite 55 beschrieben sind, verwendet werden. Außerdem können Vektoren verwendet werden, die so modifiziert wurden, daß sie einen starken Strukturpromotor zum Zweck des Erhöhens der zu erzeugenden Enzymmenge besitzen.
Die Herstellung eines Rekombinanten, umfassend eine Vektor- DNA und ein DNA-Fragment, das ein Gen enthält, kann durch freie Anwendung der bekannten in vitro Rekombinanten-DNA- Technik durchgeführt werden. Die in vitro DNA-Rekombination wird gewöhnlich durch Spalten und Ligasieren (Ligasereaktion) von einer Vektor-DNA und einer Donor-DNA, die das gewünschte Gen enthält, durchgeführt (z. B. siehe die Beschreibungen der japanischen Patentanmeldung Nr. 56-211908 und des US Patents Nr. 4 237 224). Viele Arten rekombinanter DNA können zusätzlich zu der gewünschten rekombinanten DNA durch die Ligasereaktion erzeugt werden und deshalb können zum Zweck des selektiven Erhalts der gewünschten rekombinanten DNA Mikroorganismen, die zum Stamm Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Corynebacterium oder Brevibacterium gehören, direkt mit einer Ligasereaktionsmischung transformiert werden, und die resultierenden Transformanten, auf die der erbliche Charakter der genetischen Information des gewünschten Gens übertragen wurde, können selektiv getrennt werden, und die gewünschte rekombinante DNA kann aus ihren kultivierten Bakterienzellen extrahiert und isoliert werden.
Zum Beispiel kann die Rekombinante außerdem ohne direkte Transformation der Bakterienarten, die zu einer der obigen Gattungen gehören, erhalten werden; das heißt, das gewünschte Gen wird unter Verwendung anderer Mikroorganismen, wie Escherichia coli, in ein Wirts-Vektorsystem kloniert, woraufhin die rekombinante DNA in einem geeigneten Vektor in vitro erzeugt wird, und dann die obigen Bakterienarten transformiert werden, gefolgt von der selektiven Trennung der Transformanten auf die gleiche Weise wie oben beschrieben.
Die Beschreibungen der folgenden Dokumente können in großem Umfang auf die Herstellung von Rekombinanten angewendet werden: die Beschreibung des US Patents Nr. 4 237 224; S. N. Cohen et al., "Idenshi-sousa Jikken-hou (Experimental Method of Gene Manipulation)" [Hrsg. Yasuyuki Takagi, Kohdan-sha Scientific (1980)]; Method in Enzymdogy, 68, Recombinant DNA [Hrsg. Ray Mv, Academic Press (1979)]; die Beschreibung der japanischen Patentanmeldung Nr. 56-211908 usw.
In dem Fall, in dem Escherichia coli mit verschiedenen Arten rekombinanter DNA transformiert ist, wird ein Verfahren zum Selektieren bestimmter transformierter Stämme, die das gewünschte Gen besitzen, d. h. das Gen einer bestimmten D-N- Carbamoyl-α-Aminosäureamidohydrolase, und in denen das Gen exprimiert wurde, aus den transformierten Stämmen wie folgt durchgeführt: Kolonien der transformierten Stämme werden zunächst auf einer Platte wachsen gelassen, die einen Selektionsmarker, wie Ampicillin, enthalten. Dann werden verschiedene Kolonien der transformierten Stämme, die die rekombinante DNA aufweisen, gesammelt und in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, wonach die Suspension auf dem minimalen Flüssigmedium, enthaltend eine bestimmte D-N- Carbamoyl-α-Aminosäure als einzige Stickstoffquelle, inokuliert wird. Auf diesem Medium können nur transformierte Stämme wachsen, die die D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure verwenden können, d. h. transformierte Stämme, auf die die D-N- Carbamoyl-α-Aminosäureamidohydrolase-Aktivität übertragen wurde. Die so erhaltene Kulturlösung wird auf dem obigen Minimalmedium inokuliert und ein solcher Vorgang wird wiederholt, was zu einer Anreicherung der gewünschten transformierten Stämme führt. Aus dieser angereicherten Kulturlösung werden Bakterienzellen gemäß dem herkömmlichen Verfahren getrennt, und die getrennten transformierten Stämme werden zur bakteriellen Reaktion mit einer D-N-Carbamoyl-α- Aminosäure als Substrat kultiviert, wodurch die das gewünschte Gen enthaltenden transformierten Stämme durch Bestätigen der Herstellung einer D-α-Aminosäure erhalten werden.
Aus den so erhaltenen transformierten Stämmen wird rekombinante DNA gemäß herkömmlicher Verfahren, wie ein Verfahren unter Verwendung Alkalidenaturation, extrahiert (siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kap. 1); das Strukturgen des gewünschten Enzyms in den DNA-Fragmenten, die das klonierte gewünschte Gen enthalten, wird subkloniert und nicht notwendige DNA wird entfernt; rekombinante DNA, die so modifiziert wurde, daß sie einen starken Promotor hat, wird in einem Vektor erzeugt; die obigen Wirtsbakterien werden damit transformiert, und die resultierenden transformierten Stämme werden zum Erhöhen der Menge des zu erzeugenden gewünschten Enzyms verwendet.
Die eingeführte Eigenschaft der rekombinanten DNA kann durch Kultivieren der transformierten Stämme auf einem herkömmlichen Nährboden exprimiert werden. In den Fällen, in denen die Eigenschaft der Gen-DNA oder der Vektor-DNA auf die rekombinante DNA übertragen wurde, kann das Medium mit jedem Medikament in Abhängigkeit von dessen Eigenschaft ergänzt werden.
Zur Verwendung der so erhaltenen transformierten Stämme als Quelle der Enzymbereitstellung kann eine Kultur unter Verwendung eines herkömmlichen Mediums hergestellt werden, und wenn notwendig, ist es auch möglich, eine Behandlung zur Enzyminduktion durchzuführen, wie durch Zugabe von Hydantoinverbindungen, D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren, Isopropyl-1-thio-β-D-galactosiden (IPTG) oder dergleichen, und einer Temperaturerhöhung.
Gewöhnlich ist das zum Kultivieren der transformierten Stämme verwendete Medium ein herkömmliches Medium, enthaltend Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Ionen. Wenn geringe organische Mengen an Nährstoffen, wie Vitaminen und Aminosäuren, zugegeben werden, können in vielen Fällen zufriedenstellende Ergebnisse erhalten werden. Als Kohlenstoffquellen werden gewöhnlich Kohlenhydrate, wie Glucose und Sucrose; organische Säuren, wie Essigsäure; Alkohole und dergleichen verwendet werden. Als Stickstoffquellen werden Ammoniakgas, Ammoniakwasser, Ammoniumsalze und dergleichen verwendet. Als anorganische Ionen können Phosphationen, Magnesiumionen, Kaliumionen, Eisenionen und dergleichen verwendet werden.
Wenn die Kultur unter aeroben Bedingungen 1 bis 10 Tage, während der pH und die Temperatur jeweils auf einen geeigneten Bereich von jeweis 4-8 und 25-45ºC eingestellt werden, hergestellt wird, ist es möglich, die gewünschten Ergebnisse zu erhalten.
Beispiele der Ausführungsformen, die als Enzym wirken, das durch die transformierten Stämme hergestellt wurde, umfassen Kulturlösungen der transformierten Stämme, Bakterienzellen, behandelte Bakterienzellen, Enzyme, die aus Bakterienzellen extrahiert wurden, immobilisierte Bakterienzellen und dergleichen.
Als Bakterienzellen kann jede Kulturlösung von Bakterienzellen, die vcn der Kulturlösung getrennt werden, gewaschene Bakterienzellen und dergleichen verwendet werden, da es nach dem Abschluß der Kultivierung erfolgt. Als behandelte Bakterienzellen können lyophilisierte Bakterienzellen, Aceton-getrocknete Bakterienzellen, Bakterienzellen, die in Kontakt mit Toluol oder oberflächenaktiven Mitteln gebracht wurden, Lysozym- behandelte Bakterienzellen, Bakterienzellen, die mit Ultraschallwellen bestrahlt wurden, mechanisch zerkleinerte Bakterienzellen und dergleichen, sowie Enzymextrakte mit Enzymaktivität, die D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren, die von diesen behandelten Bakterienzellen erhalten werden, durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α- Aminosäuren umwandeln, die immobilisierten Bakterienzellen, Bakterienzellen, die unlöslich gemacht wurden, Enzymproteine, die auf einem Träger zur Immobilisierung fixiert wurden (z. B. Anionenaustauschharz) und dergleichen, verwendet werden. Bei einem Immobilisierungsverfahren ist es zum Beispiel möglich, auf die Beschreibung des japanischen offengelegten Patents mit der Veröffentlichungsnummer 63-185382 Bezug zu nehmen.
Als Träger, der zur Immobilisierung verwendet wird, sind Phenol-Formaldehyd-Anionenaustauscherharze, wie Duolite A568 oder DS17186 (Rohm & Haas Co.: eingetragene Marke) und verschiedene Anionenaustauscherharze, die verschiedene Amine, Ammoniumsalze oder funktionelle Gruppen des Diethanolamintyps, zum Beispiel Polystylenharze, wie Amberlite IRA935, IRA945, IRA901 (Rohm & Haas Co.: eingetragene Warenzeichen) Lewatit OC1037 (Bayer AG: eingetragene Marke) und Diaion EX-05 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.: eingetragene Marke) geeignet. Andere Träger, wie DEAE-Cellulose, können auch verwendet werden.
Zum Erhalt stärkerer und stabilerer Enzymadsorption werden gewöhnlich außerdem Vernetzungsmittel verwendet, das bevorzugte Beispiel ist Glutaraldehyd. Als zu verwendende Enzyme können nicht nur gereinigte Enzyme, sondern auch solche mit unterschiedlichen Reinigungsgraden verwendet werden, wie teil-gereinigte Enzyme, Suspensionen zerkleinerter Bakterienzellen und zellfreie Extrakte.
Die Herstellung immobilisierter Enzyme kann unter Verwendung einer Enzymlösung und eines herkömmlichen Verfahrens, bei dem zum Beispiel Enzyme auf einem Träger adsorbiert werden, gefolgt von einer Vernetzungsbehandlung, durchgeführt werden.
D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren, die als Substrat der erfindungsgemäßen enzymatischen Reaktion verwendet werden, können durch die Formel: R-CH(NHCONH&sub2;)-COOH dargestellt werden, und als eine praktische Ausführungsform können sie in Fällen, bei denen das Enzym eine genaue Stereoselektivität für D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren hat, in der D-Form oder einer Mischung aus den D- und L-Formen verwendet werden. In Fällen, bei denen die Stereoselektivität nicht genau ist, da Enzyme außerdem auf L-Carbamoylaminosäuren wirken, oder wenn Enzyme als eine Enzymmischung verwendet werden, die auch auf die L-Form wirken, ist es außerdem bevorzugt, daß nur Enzyme der D-Form zum Herstellen von α-Aminosäuren der D-Form verwendet werden.
Der Substituent R kann aus einem breiten Bereich ausgewählt werden, wie in den Beschreibungen der offengelegten japanischen Patente mit den Nummern 57-18793, 63-20520 und 1- 48758 beschrieben, insbesondere zum Bereitstellen industriell nützlicher Verbindungen, wie Zwischenprodukte von Medikamenten, ist es bevorzugt, daß R Phenyl, Phenyl substituiert mit Hydroxy, Alkyl, substituiertes Alkyl, Aralkyl oder Thienyl ist. Im Fall von Phenyl substituiert mit Hydroxy ist die Hydroxyzahl 1 oder mehr und sie kann/können an jeder o-, m- und p-Positionen angebracht werden, wobei das typische Beispiel davon p-Hydroxyphenyl ist. Die Alkylgruppe ist eine Gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, so daß die entsprechende Aminosäure D- Alanin, D-Valin, D-Leucin, D-Isoleucin oder dergleichen wird. Die substituierte Alkylgruppe ist ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, das mit Hydroxy, Alkylthio, Carboxyl, Amino, Phenyl, Phenyl substituiert mit Hydroxy, Amido oder dergleichen substituiert ist, so daß die entsprechende Aminosäure D-Serin, D-Threonin, D-Methionin, D-Cystein, D- Asparagin, D-Glutamin, D-Tyrosin, D-Tryptophan, D- Asparinsäure, D-Glutaminsäure, D-Hystidin, D-Lysin, D- Arginin, D-Citrullin oder dergleichen wird. Als wässriges Medium können solche verwendet werden, die Wasser, Puffer, organische Lösungsmittel, wie Ethanol, enthalten. Wenn notwendig, können außerdem für das Wachstum von Mikroorganismen erforderliche Nährstoffe, Antioxidationsmittel, oberflächenaktive Mittel, Coenzyme, Hydroxylamine, Metalle oder dergleichen zu dem wässrigen Medium gegeben werden.
In Fällen, in denen die Bakterienzellen während des Kultivierens der Bakterienzellen der obigen Mikroorganismen in einem wasserlöslichen Medium mit einer bestimmten D-N- Carbamoyl-α-Aminosäure in Kontakt gebracht werden, wird ein wässriges Medium, das nicht nur eine D-N-α-Aminosäure, sondern außerdem für das Wachstum von Mikroorganismen erforderliche Nährstoffe, wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Ionen enthält, verwendet. Außerdem können in vielen Fällen zufriedenstellende Ergebnisse erhalten werden, wenn organische Spurennährstoffe, wie Vitamine und Aminosäuren, zugegeben werden. Als Stickstoffquellen werden herkömmlich Kohlenhydrate, wie Glucose und Sucrose, organische Säuren, wie Essigsäure, Alkohole und dergleichen verwendet. Als Stickstoffquellen werden Ammoniakgas, Ammoniakwasser, Ammoniumsalze und dergleichen verwendet. Als anorganische Ionen können das Phosphation, Magnesiumion, Kaliumion, Eisenion und dergleichen verwendet werden.
Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, während der pH und die Temperatur jeweils auf den geeigneten Bereich von 4-8 und 25-45ºC eingestellt werden. Wenn die Kultivierung 1 bis 10 Tage durchgeführt wird, können D-N- Carbamoyl-α-Aminosäuren mit hoher Effizienz ausschließlich in D-α-Aminosäuren umgewandelt werden.
In Fällen, in denen die Kulturlösung der obigen Mikroorganismen unverändert gelassen wird, um mit kultivierten Bakterienzellen, behandelten Bakterienzellen, Enyzmextrakten, immobilisierten Bakterienzellen, löslich gemachten Bakterienzellen oder fixierten Enzymproteinen in einer wässrigen Lösung, die eine bestimmte gelöste oder suspendierte D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren enthält, zu reagieren, kann im Gegensatz dazu die Reaktionsmischung für einige Zeit stehen gelassen oder gerührt werden, während sie bei einer geeigneten Temperatur von 10-80ºC und einem pH von 4-9,5 gehalten wird. Nach 5 bis 100 Stunden wird die entsprechende D-α-Aminosäure folglich in großer Menge hergestellt und in dem wässrigen Medium angereichert. Außerdem kann die D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure in getrennten Portionen während des Reaktionsverlaufs zugegeben werden.
Die erzeugte D-α-Aminosäure kann durch ein herkömmliches Trennungsverfahren getrennt und gereinigt werden.
Die so erhaltene D-α-Aminosäure kann durch die Formel dargestellt werden: R-CHNH&sub2;COOH (R ist wie oben definiert).

Beispiele

Im folgenden werden Ausführungsformen dieser Erfindung beschrieben. Die erzeugte D-α-Aminosäure wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) oder Dünnschichtchromatographie (TLC) nachgewiesen und bestimmt.

Beispiel 1 Herstellung von rekombinanter DNA, umfassend Chromosomen-DNA von der Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900) und Vektor-DNA:

Die Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900) wurde in 2 Litern L-Nährbrühe (10 g Pepton/Liter, 5 g Hefeextrakt/Liter, 5 g Natriumchlorid/Liter, pH 7,0) bei 33ºC 27 Stunden kultiviert, woraufhin die Kulturen unter Erhalt von 20 g Bakterienzellen geerntet wurden. Aus den erhaltenen Bakterienzellen wurde die Chromosomen-DNA gemäß dem Marmurverfahren extrahiert. Zu 250 ug dieser Chromosomen-DNA wurden 2 U Sau3AI gegeben und bei 37ºC 30 Minuten reagiert, wodurch Teilverdau verursacht wird. Aus der teilverdauten DNA wurden durch Agarosegelelektrophorese 2-9 kbp DNA- Fragmente erhalten. Auf der anderen Seite wurde das Plasmid pUCl8 vollständig mit BamHI verdaut und mit T4 DNA-Ligase zu den oben erhaltenen Chromosomen DNA-Fragmenten ligasiert, was zu einer gemischten Lösung verschiedener rekombinanter Plasmide führt.

Beispiel 2 Selektion des von der Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900) abstammenden Plasmids, das das Gen enthält, welches D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure in die entsprechende D-α-Aminosäure umwandelt:

Unter Verwendung der gemischten Plasmidlösung aus Beispiel 1 wurde Escherichia coli JM 109 gemäß dem herkömmlichen Verfahren transformiert. Diese wurden mit dem Medium der Tabelle 1, enthaltend Ampicillin als Selektionsmarker, inokuliert.

Tabelle 1

Polypepton 1 g
Hefeextrakt 0,5 g
Natriumchlorid 0,5 g
Ampicillin 100 mg
Agar 15 g
Wasser wurde auf ein Volumen von 1 Liter zugegeben (pH 7,0). Die gewachsenen Kolonien wurden gesammelt und mit der flüssigen Lösung der Tabelle 2, enthaltend D-N-Carbamoylalanin als einzige Stickstoffquelle, inokuliert, gefolgt von Kultivierung.

Tabelle 2

Na&sub2;HPO&sub4; 6 g
KH&sub2;PO&sub4; 3 g
NaCl 0,5 g
MgSO&sub4; 0,12 g
CaCl&sub2; 11 mg
Glucose 2 g
Ampicillin 50 mg
Thiamin 1mg
D-N-Carbamoylalanin 1 g
Wasser wurde auf ein Volumen von 1 Liter zugegeben (pH 7,0).
Nur die das gewünschte Gen exprimierenden transformierten Stämme können durch Verwendung von D-N-Carbamoylalanin als einzige Stickstoffquelle auf dem Medium wachsen. Die Kulturlösung in dem Medium der Tabelle 2 wurde mit dem gleichen Medium, das oben verwendet wurde, inokuliert und dieser Vorgang wurde zur Anreicherung der gewünschten transformierten Stämme wiederholt. Aus der angereicherten Kulturlösung wurden die transformierten Stämme mit dem Medium der Tabelle 1 sauber getrennt. Diese sauber getrennten Zellen wurden mit 10 ml L-Nährbrühe (10 g Pepton/Liter, 5 g Hefeextrakt/Liter, 5 g Natriumchlorid/Liter, pH 7,0), enthaltend 100 mg/Liter Ampicillin, inokuliert und bei 37ºC 16 Stunden inkubiert, woraufhin 1 ml der Kulturlösung geerntet und der Überstand entfernt wurde, gefolgt von Suspension der Bakterienzellen in 0,5 ml Substratlösung (0,5% D-N-Carbamoylparahydroxyphenylglycin, 0,05% Triton®X-100, 0,1 M Phosphatpuffer (hiernach mit KBP bezeichnet), pH 7,0) und bei 37ºC 3 Stunden reagiert. Diese Reaktionsmischung wurde auf TLC getüpfelt und entwickelt, gefolgt von Färben mit Ninhydrin, wodurch in Übereinstimmung mit dem Standard ein D-Parahydroxyphenylglycinfleck entsteht. Durch diese Tatsache wurde bestätigt, daß die sauber getrennten transformierten Stämme ein Plasmid aufweisen, das ein Gen des gewünschten Enzyms enthält. Das in diesen Stämmen enthaltene Plasmid wurde pAHD 101 genannt.
Anschließend wurde pAHD 101 von den obigen transformierten Stämmen in großen Mengen gemäß dem Alkalidenaturierungsverfahren erzeugt, gefolgt von Kartieren, was ergab, daß es die in Fig. 1 gezeigte Struktur hatte.
Mit pAHD 101 transformierte Escherichia coli JM109 wurden Escherichia coli JM109 pAHD 101 genannt.

Beispiel 3 Selektion des von Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) abstammenden Plasmids, das das die Umwandlung von D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure in die entsprechende D-α-Aminosäure betreffende Gen enthält:

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wurde das Plasmid pUC18 aus einer gemischten Lösung verschiedener rekombinanter Plasmide, die aus den Chromosomen-DNA- Fragmenten von Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) gebildet wurden, erhalten. Unter Verwendung dieser gemischten Lösung wurde Escherichia coli JM109 gemäß dem herkömmlichen Verfahren transformiert. Aus diesen verschiedenen transformierten Stämme wurden bestimmte transformierte Stämme, die ein Plasmid enhalten, das das Gen des betreffenden Enzyms enthält, das D-N-Carbamoyl-α- Aminosäuren in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umwandeln kann, auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 beschrieben erhalten, außer daß das flüssige Medium der Tabelle 2, enhaltend 100 mg/Liter IPTG, anstelle des flüssigen Mediums der Tabelle 2 verwendet wurde. Das in diesen Stämmen enthaltene Plasmid wurde pPHD 301 genannt.
Dann wurde pPHD 301 von den obigen transformierten Stämmen in großen Mengen erzeugt, gefolgt von Kartieren, was ergab, daß es die in Fig. 2 gezeigte Struktur hatte.
Mit pPHD 301 transformierte Escherichia coli JM109 wurde Escherichia coli JM109 pPHD 301 genannt.

Beispiel 4 Subklonieren von pAHD 101

Das in Beispiel 2 erhaltene pAHD 101 wurde vollständig mit I und RI verdaut, und ein 2,7 kbp I- RI-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese erhalten. Auf der anderen Seite wurde das Plasmid pUC 19 mit I und RI vollständig verdaut und mit T4-DNA-Ligase an das I- RI- Fragment von pAHD 101 ligasiert, woraufhin Eschericia coli JM109 mit diesem ligasierten Plasmid transformiert wurde, und die transformierten Stämme wurden auf einem L-Medium (1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5 Natriumchlorid, 1,5% Agar, pH 7,0), enthaltend Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid (IPTG), 5-Chlor-4-brom-3-indolyl-β-D-galactose (Xgal) und Ampicillin kultiviert.
Das Plasmid, das pUC 19 entspricht, enthaltend das I- RI-Fragment von pAHD 101 bildete weiße Kolonien ohne Entfalten einer blauen Farbe, und daher wurden die weißen Kolonien selektiert. Als Bestätigung, daß die selektierten Bakterien die gewünschte Enzymaktivität aufweisen, wurden sie mit 10 ml L-Nährbrühe (1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5 Natriumchlorid), enthaltend 100 mg/Liter Ampicillin inokuliert, wobei nach der Kultivierung 1 ml der Kulturlösung geerntet und der Überstand entfernt wurde, und die Bakterienzellen wurden in 0,5 ml Substratlösung (0,5% D-N- Carbamoylparahydroxyphenylglycin, 0,05% Triton®X-100, 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0) suspendiert, gefolgt von der Reaktion 3 Stunden bei 37ºC. Diese Reaktionsmischung wurde auf TLC getüpfelt und entwickelt, gefolgt von Färben mit Ninhydrin, was in Übereinstimmung mit dem Standard zu einem D- Parahydroxyphenylglycin-Fleck führte.
Dann wurde das Plasmid pAD 107 hergestellt und teilweise mit I hydrolysiert, gefolgt von Agarosegelelektrophorese unter Erhalt eines 4,5 kbp Fragmentes, enthaltend den pUC 19-Teil. Das Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase zirkularisiert, und das Plasmid wurde zum Transformieren von Escherichia coli JM 109 verwendet. Die transformierten Stämme wurden aus dem L- Medium, enthaltend Ampicillin erhalten, und die bakterielle Reaktion wurde auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durchgeführt, unter Erhalt von transformierten Stämmen, die die Fähigkeit besitzen, D-N-Carbamoylparahydroxyphenylglycin in D-Parahydroxyphenylglycin umzuwandeln. Das in diesen transformierten Stämmen enthaltene Plasmid wurde pAD 108 genannt. Das Plasmid pAD 108 wurde von den obigen transformierten Stämmen erzeugt, gefolgt von Kartieren, was ergab, daß es die in Fig. 3 gezeigte Struktur hatte.
Mit pAD 108 transformierte Escherichia coli JM109 wurde Escherichia coli JM109 pAD 108 genannt. Die vom Fermentation Research Institute erhaltene Erkennungsnummer ist FERM BP- 3184.

Beispiel 5 Subklonieren von pPHD 301

Das in Beispiel 3 erhaltene pPHD 301 wurde vollständig mit I verdaut, und ein 5,2 kbp Fragment, enthaltend den pUC 18-Teil, wurde durch Agarosegelelektrophorese erhalten. Das Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase zirkularisiert, und das Plasmid wurde zum Transformieren von Escherichia coli JM 109 verwendet. Die transformierten Stämme wurden aus einem L- Medium, enthaltend Ampicillin, erhalten, und die bakterielle Reaktion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt unter Erhalt von transformierten Stämme mit der Fähigkeit, D-N- Carbamoylparahydroxyphenylglycin in D-Parahydroxyphenylglycin umzuwandeln. Das in den transformierten Stämmen enthaltene Plasmid wurde pPD 302 genannt. Dann wurde das Plasmid pPD 302 erzeugt und vollständig mit I und I verdaut, woraufhin ein 1,8 kbp I- I- Fragment durch Agarosegelelektrophorese erhalten wurde. Auf der anderen Seite wurde das Plasmid pUC 19 mit I und I vollständig verdaut und mit T4-DNA-Ligase an das I- I- Fragment von pPD 302 ligasiert, woraufhin Eschericia coli JM109 mit diesem ligasierten Plasmid transformiert wurden. Die transformierten Stämme wurden aus einem Ampicillin enthaltenden L-Medium erhalten, und die bakterielle Reaktion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt, unter Erhalt transformierter Stämme mit der Fähigkeit, D-N-Carbamoylparahydroxyphenylglycin in D- Parahydroxyphenylglycin umzuwandeln. Das in den transformierten Stämmen enthaltene Plasmid wurde pPD 304 genannt. Das Plasmid pPD 304 wurde von den obigen transformierten Stämmen erzeugt, gefolgt von Kartieren, was ergab, daß es die in Fig. 4 gezeigte Struktur hatte.
Mit pPD 304 transformierte Escherichia coli JM109 wurde Escherichia coli JM109 pPD 304 genannt. Die vom Fermentation Research Institute erhaltene Erkennungsnummer ist FERM BP- 3183.

Beispiel 6 Umwandlung von D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren in D-α-Aminosäure mit dem aus den transformierten Stämmen erhaltenen Enzym.

Unter Verwendung des in Beispiel 4 erhaltenen Plasmids pAD 108 wurde Escherichia coli JM 109 transformiert. Dieser Stamm wurde in L-Nährbrühe, enthaltend 100 ug/Liter Ampicillin und 100 ug/Liter IPTG, bei 37ºC 16 Stunden kultiviert. Aus 100 ml dieser Kulturlösung wurden Bakterienzellen geerntet und anschließend in 0,1 M KBP (pH 7,0) auf ein Volumen von 10 ml suspendiert. Dies wurde bei Eiskühlung einer Ultraschallbehandlung unterworfen, gefolgt von Zentrifugierung unter Erhalt des Überstandes als eine rohe Enzymlösung. Unter Verwendung dieser rohen Enzymlösung wurde eine Reaktion mit verschiedenen D-N-Carbamoyl-α- Aminosäurenarten, die in Tabelle 3 gezeigt sind, als Substrat durchgeführt. Zu 2 ml 40 mM D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren (Tabelle 3) und 0,2 M KBP (pH 7,0) wurden 100 ul der obigen rohen Enzymlösung gegeben, wodurch die Reaktion bei 40ºC 20 Minuten ermöglicht wurde, und die erzeugte D-α- Aminosäuremenge wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Außerdem verbesserte sich die spezifische Aktivität einer von JM 109 pAD 108 erhaltenen D-N-Carbamoyl- α-Aminosäureamidohydrolase 10-fach im Vergleich zu einer von der Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900) erhaltenen rohen Enzymlösung.

Beispiel 7 Umwandlung von D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure in D-α-Aminosäure mit dem aus den transformierten Stämmen erhaltenen Enzym.

Unter Verwendung des in Beispiel 4 erhaltenen Plasmids pPD 304 wurde Escherichia coli JM 109 transformiert. Aus diesem Stamm wurde eine rohe Enzymlösung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 6 erhalten. Unter Verwendung dieser rohen Enzymlösung wurde die Reaktion auf die gleiche Weise wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Enzymaktivität einer von JM 109 pPD 304 erhaltenen D-N-Carbamoyl-α-Aminosäureamidohydrolase, war 40-fach größer im Vergleich zu einer von Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) erhaltenen rohen Enzymlösung.

Beispiel 8 Umwandlung von D-N- Carbamoylparahydroxyphenylglycin in D- Parahydroxyphenylglycin mit dem aus den transformierten Stämmen erhaltenen Enzym.

Unter Verwendung des in Beispiel 4 erhaltenen Plasmids pAD 108 wurde Escherichia coli JM 109 transformiert. Dieser Stamm wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 6 beschrieben kultiviert. Aus 100 ml der Kulturlösung wurden Bakterienzellen geerntet und mit 0,1 M KPB (pH 7,0) gewaschen, woraufhin sie in 100 ml 5% D-N- Carbamoylparahydroxyphenylglycin, 0,5% Triton®X-100 und 0,1 M KBP (pH 7,0) suspendiert wurden, gefolgt von 20 Stunden Rühren bei 70ºC, um die Reaktion zu verursachen. Die so erhaltene Reaktionsmischung wurde zum Entfernen der Bakterienzellen 10 Minuten der Zentrifugation bei 6000 Upm unterworfen, und der pH wurde durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf 2,7 verringert, gefolgt von Adsorption an das Kationenaustauscherharz IR-120 B (H&spplus;-Typ) und Elution mit 5% NH4OH. Dann wurden die Eluate mit IRC-84 (H&spplus;-Typ) entsalzt und mit einem AF-Harz entfärbt. Die entfärbte Lösung wurde konzentriert, um Kristallisierung zu ermöglichen, und die abgelagerten Kristalle wurden aus Wasser kristallisiert unter Erhalt von 3,8 g weißem Pulver. Diese Kristalle entfalteten eine spezifische Rotation von [α]D²&sup0; = -158 (C = 1, 1 N HCl) und ergaben einen einzelnen Fleck auf TLC, und das IR- Spektrum stand in Übereinstimmung mit dem D- Parahydroxyphenylglycin-Standard.

Beispiel 9 Herstellung von fixierter D-N-Carbamoyl-α- Aminosäureamidohydrolase

Nachdem 200 ml der Kulturlösung erhalten wurden, wurden die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 6 erhaltenen mit pAD 108 transformierten Escherichia coli JM 109 Stämme geerntet, sie wurden mit 0,1 M KPB (pH 7,0) gewaschen und in 0,1 M KBP (pH 7,0) suspendiert, gefolgt von einer Ultraschallbehandlung der Bakterienzellen. Die Suspension der desintegrierten Bakterienzellen wurde 20 Minuten der Zentrifugation bei 12000 Upm unter Erhalt des Überstandes als eine rohe Enzymlösung unterworfen. Zu dieser rohen Enzymlösung wurden 2 g Anionenaustauscherharz Duolite A568, das mit 0,1 M KPB (pH 7,0) äquilibriert wurde, gegeben und 15 Stunden zum Adsorbieren des Enzyms bei 4ºC gerührt. Zu dieser Lösung wurde zum Erhalt einer Endkonzentration von 0,1% Glutaraldehyd gegeben, und die Lösung wurde 1 Stunde gerührt, gefolgt von einer Crossvernetzungsbehandlung, woraufhin das Harz durch Filtration gesammelt und mit 0,1 M KPB gewaschen wurde, unter Erhalt von 2 g fixierter D-N-Carbamoyl-α- Aminosäureamidohydrolase.

Beispiel 10 Umwandlung von D-N-Carbamoylparahydroxyphenylglycin in D-Parahydroxyphenylglycin mit immobilisiertem Enzym.

2 g der in Beispiel 9 erhaltenen immobilisierten D-N- Carbamoyl-α-Aminosäureamidohydrolase wurden zu 100 ml 2% D- N-Carbamoylparahydroxyphenylglycin und 0,1 M KBP (pH 7,0) gegeben und 20 Stunden bei 40ºC gerührt, während der pH durch Zugabe von 1 N HCl bei 7,0 gehalten wurde, wodurch die Reaktion verursacht wurde. Nach der Reaktion wurde die Mischung stehen gelassen, und die Reaktionsmischung wurde durch Ansaugen gesammelt, woraufhin die erzeugte Aminosäure auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 beschrieben unter Erhalt von 1,5 g D-Parahydroxyphenylglycin gereinigt wurde. Tabelle 3

Beispiel 11 Analyse der DNA-Basensequenz des Gens, das von der Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900) abstammt und das Enzym codiert, das D-N- Carbamoyl-α-Aminosäure in die entsprechende D-α-Aminosäure umwandeln kann

Das Plasmid pAD 108, enthaltend das Gen für eine D-N- Carbamoyl-α-Aminosäureamidohydrolase, hiernach mit Amidohydrolase bezeichnet, das von der Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900) abstammt, wurde mit den Restriktionsendonucleasen RI und II (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut und ein 1,8 kb DNA-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese getrennt. Dieses Fragment wurde mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut und mit T4-DNA-Ligase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) an M13mp18 oder M13mp19 ligasiert, woraufhin Escherichia coli JM 109 unter Bildung eines Plaques damit infiziert wurde. Das einzelne Plaque wurde in 1,5 ml 2YZ Medium (16 g/l Bactotrypton (Difco Co.), 10 g/l Hefeextrakt (Difco Co.) und 5 g/l NaCl), mit dem 1% JM 109 inokuliert wurde, inokuliert und 5 Stunden der Schüttelkultur bei 37ºC unterworfen. Nach der Zentrifugierung wurden 200 ul 20% Polyethylenglycol 6000 und 25 M NaCl Lösung zu dem Überstand gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, unter Gewinnung der Phagenpartikel durch Zentrifugierung als Niederschlag. Dieser wurde in 100 ul TE Lösung [10 mMol Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA] gelöst und mit 50 ul Phenol (gesättigt mit TE Lösung) extrahiert, woraufhin 10 ul 3 M Natriumacetatlösung und 250 ul Ethanol zugegeben und über Nacht bei -20ºC stehen gelassen wurden, gefolgt von Zentrifugierung. Nach dem Trocknen wurde der Niederschlag in 50 ul TE Lösung gelöst. Anschließend wurden 7 ul dieser Lösung zur Reaktion, Elektrophorese und Autoradiographie mit Hilfe eines DNA-Sequenz-Kits (hergestellt von Unites States Biochemical Corp.) unter Verwendung von SEQUENASE (eingetragene Marke) ver. 2 gemäß der Bedienungsanleitung verwendet. Von den erhaltenen Ergebnissen wurde die DNA- Basensequenz des Amidohydrolasegens aus dem Stamm KNK 712 bestimmt, wie in SEQ. ID Nr. 1 in der beigefügten Sequenzliste gezeigt ist.

Beispiel 12 Analyse der DNA-Basensequenz des Gens, das von Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) abstamment und das Enzym codiert, das D-N- Carbamoyl-α-Aminosäure in die entsprechende D- α-Aminosäure umwandeln kann

Das Plasmid pPD 304, enthaltend das Amidohydrolasegen, das vom Stamm KNK 003A (FERM BP-3181) abstammt, wurde mit den Restriktionsendonucleasen HI und III (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut, und ein 1,8 kb DNA-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese zur Herstellung getrennt. Das Fragment wurde mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut und mit T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) an M13mp18 oder M13mp19 ligasiert, woraufhin Escherichia coli JM 109 unter Bildung eines Plaques damit infiziert wurde. Das einzelne Plaque wurde in 1,5 ml 2YT Medium (16 g/l Bactotrypton (Difco Co.), 10 g/l Hefeextrakt (Difco Co.) und 5 g/l NaCl), mit dem 1% JM 109 inokuliert wurde, inokuliert und 5 Stunden der Schüttelkultur bei 37ºC unterworfen. Nach der Zentrifugierung wurden 200 ul 20% Polyethylenglycol 6000 und 25 M NaCl Lösung zu dem Überstand gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, unter Gewinnung der Phagenpartikel durch Zentrifugierung als Niederschlag. Dieser wurde in 100 ul TE Lösung [10 mMol Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA] gelöst und mit 50 ul Phenol (gesättigt mit TE Lösung) extrahiert, woraufhin 10 ul 3 M Natriumacetatlösung und 250 ul Ethanol zugegeben wurden, dann über Nacht bei -20ºC stehen gelassen, gefolgt von Zentrifugierung. Nach dem Trocknen wurde der Niederschlag in 50 ul TE Lösung gelöst. Anschließend wurden ul dieser Lösung für die Reaktion, Elektrophorese und Autoradiographie mit Hilfe eines DNA-Sequenz-Kits (hergestellt von Unites States Biochemical Corp.) unter Verwendung von SEQUENASE (eingetragene Marke) ver. 2 gemäß der Bedienungsanleitung verwendet. Von den erhaltenen Ergebnissen wurde die DNA-Basensequenz des Amidohydrolasegens aus dem Stamm KNK 003A bestimmt, wie in SEQ. ID Nr. 2 in der beigefügten Sequenzliste gezeigt ist.

Beispiel 13 Reinigung der D-N-Carbamoyl-α-Amidohydrolase, die von der Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900) abstammt

Die Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900) wurde 25 Stunden in dem Medium der Tabelle 4 bei 33ºC kultiviert.

Tabelle 4

Glycerin 25 g
Sucrose 5 g
KH&sub2;PO&sub4; 5 g
Na&sub2;HPO&sub4; 5 g
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 1g
MnCl&sub2;.4H&sub2;O 10 mg
Hefeextrakt 4 g
Harnstoff 2 g
D-N-Carbamoyl-P- 1 g
Hydroxyphenylglycin
Wasser wurde auf ein Volumen von 1 Liter zugegeben (pH 6,5).
Einundzwanzig Liter dieser Kulturlösung wurden geerntet und die Bakterienzellen wurden der Ultraschallbehandlung ausgesetzt. Nach dem Entfernen des Restes durch Zentrifugierung wurden die Nucleinsäuren durch Protaminsulfatbehandlung (0,1 mg/mg Protein) entfernt. Der zentrifugierte Überstand wurde 20 Minuten der Wärmebehandlung bei 50ºC unterworfen und nach dem Entfernen des Niederschlags wurde das Protein durch Zugabe von Ammoniumsulfat ausgefällt und eine Proteinfraktion mit Aktivität, die mit 5% bis 35% gesättigtem Ammoniumsulfat ausgefällt wurde, gewonnen. Diese Fraktion wurde gelöst und HPLC unter Verwendung einer DEAE- Spw-Säule (hergestellt von Toso Co., Ltd.) durchgeführt, gefolgt von Elution mit einem NaCl-Konzentrationsgradienten und Wiedergewinnung der aktiven Fraktionen. In diesem Stadium erhöhte sich die spezifische Aktivität der Amidohydrolase im Vergleich zu einer Suspension desintegrierter Bakterienzellen ungefähr 20-fach. Wenn die Fraktion durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert wurde, migrierte die Amidohydrolase in der Nähe der Position entsprechend dem Molekulargewicht von 35000.

Beispiel 14 Bestimmung der Aminosäuresequenz am Proteinaminoterminus von D-N-Carbamoyl-α- Aminosäureamidohydrolase, die von der Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900) abstammt

Eine durch die Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900) gereinigte Amidohydrolasepräparation, die in Beispiel 13 erhalten wurde, wurde auf eine Umkehrphasen-HPLC-Säule (AP- 303), hergestellt von YMC Co.) aufgetragen und mit einem Acetonitril-Konzentrationsgradienten eluiert. Die Amidohydrolase enthaltende Fraktion wurde zur Analyse in einen Gasphasenproteinsequenzierer (hergestellt von Applied Biosystems Co., Ltd.) geladen, und es wurde festgestellt, daß die Amidohydrolase ein Protein mit einer Sequenz im Aminoterminusteil, der aus den Aminosäuren 1 bis 20 der SEQ. ID Nr. 1 besteht, ist.

Beispiel 15 Reinigung der D-N-Carbamoyl-α- Aminosäureamidohydrolase, die von transformierten Stämme Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) abstammt

Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) wurde drei Tage bei 45ºC in dem Medium der Tabelle 5 kultiviert.

Tabelle 5

Glycerin 10 g
Glucose 5 g
KH&sub2;PO&sub4; 3,5 g
Na&sub2;HPO&sub4; 3,5 g
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,5 g
MnCl&sub2;.4H&sub2;O 20 mg
FeSO&sub4; 10 mg
CaCO&sub3; 1 g
Fleischextrakt 2 g
Hefeextrakt 2 g
Polypepton 2 g
D-N-Carbamoylalanin 1 g
Wasser wurde auf ein Volumen von 1 Liter zugegeben (pH 7,0).
Sechsundzwanzig Liter dieser Kulturlösung wurden geerntet und auf die gleiche Weise wie in Beispiel 13 beschrieben wurden die folgenden Vorgänge durchgeführt: Ultraschallbehandlung der Bakterienzellen, Entfernung der Nucleinsäuren durch Protaminsulfatbehandlung, Wärmebehandlung (65ºC, 20 Minuten), Fraktionierung durch Ammoniumsulfatausfällung (Auftrennung der Proteinfraktion mit Amidohydrolaseaktivität, die mit 5% bis 70% gesättigtem Ammoniumsulfat ausgefällt wurden) und HPLC unter Verwendung der DEAE-5pw-Säule. Die aktiven Fraktionen wurden auf eine Biogel-HT (Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.) Säule adsorbiert und mit einem Ammoniumsulfat- Konzentrationsgradienten eluiert, woraufhin die aktiven Fraktionen konzentriert und einer Gelfiltration unter Verwendung einer Sephacryl® S-300 (Pharmacia LKB Biotechnology Co., Ltd.) Säule unterworfen wurden.
Bei Durchführung isoelektrischer Fokusierung (pH 4 bis 6,5) migrierte die obige Amidohydrolase in der Nähe der pH 5,7- Position, und der Teil des Gels mit Aktivität, wurde ausgeschnitten, und aus diesem das Protein extrahiert wurde.
Im Vergleich zu einer Suspension desintegrierter Bakterienzellen erhöhte sich die spezifische Aktivität der Amidohydrolase 100-fach. Bei Analyse der Probe durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese migrierte die Amidohydrolase in der Nähe der Position, die dem Molekulargewicht von ungefähr 38000 entspricht. Als die Probe der Gelfiltration unter Verwendung einer Sephacryl S-300 (Pharmacia LKB Biotechnology Co., Ltd.) Säule unterworfen wurde, eluierte sie außerdem bei der Position, die dem Molekulargewicht von ungefähr 67000 entspricht.

Beispiel 16 Bestimmung der Aminosäuresequenz am Proteinaminoterminus von D-N-Carbamoyl-α- Aminosäureamidohydrolase, die von Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) abstammt

Eine gereinigte Amidohydrolasepräparation aus Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181), die in Beispiel 15 erhalten wurde, wurde auf eine Umkehrphasen (HPLC)-Säule aufgebracht und mit einem Acetonitril-Konzentrationsgradienten eluiert. Die Amidohydrolase enthaltende Fraktion wurde zur Analyse in einen Gasphasenproteinsequenzierer geladen, und es wurde festgestellt, daß die Amidohydrolase ein Protein mit einer Sequenz im Aminoterminusteil, der aus den Aminosäuren 1 bis 20 der SEQ. ID Nr. 2 besteht, ist.

Beispiel 17 Reinigung der D-N-Carbamoyl-α-Aminosäureamidohydrolase, die von Escherichia coli abstammt

In Beispiel 4 erhaltene Escherichia coli JM 109.pAD 108 und in Beispiel 5 erhaltene Escherichia coli JM 109.pPD 304 wurden durch das in Beispiel 6 beschriebene Verfahren kultiviert. Die Bakterienzellen wurden aus jeder Kulturlösung durch Zentrifugierung gesammelt und mit Ultraschall behandelt. Nach dem Entfernen des Restes wurden die rohen Enzymlösungen durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Im Hinblick auf eine Suspension aus den kultivierten und desintegrierten Bakterienzellen von Escherichia coli JM 109.pAD 108 migrierte die Amidohydrolase zu der Position, die dem Molekulargewicht von ungefähr 35000 entspricht, und eine Analyse durch Densitometer nach dem Färben ließ erkennen, daß die Amidohydrolase ungefähr 50% der gesamten löslichen Proteine der Bakterienzellen betrug. In Bezug auf eine Suspension aus kultivierten und desintegrierten Bakterienzellen von Escherichia coli JM 109.pPD 304 migrierte die Amidohydrolase außerdem zu der Position, die dem Molekulargewicht von ungefähr 38000 entspricht, und eine Analyse durch Densitometer nach dem Färben ergab, daß die Amidohydrolase ungefähr 15% der gesamten löslichen Proteine der Bakterienzellen betrug.

Beispiel 18 Bestimmung der Proteinaminoterminalsequenz von D-N-Carbamoyl-α-Aminosäureamidohydrolase, die von transformierter Escherichia coli hergestellt wird

Eine Suspension aus kultivierten und desintegrierten Bakterienzellen von Escherichia coli JM 109.pAD 108, die in Beispiel 17 erhalten wurde, wurde 30 Minuten einer Wärmebehandlung bei 50ºC unterworfen, und nach dem Entfernen des Niederschlags durch Zentrifugierung wurde Ammoniumsulfat auf 30% zugegeben, wodurch das Protein ausgefällt wurde. Das ausgefällte Protein wurde durch Zentrifugierung entfernt und in entionisiertem Wasser gelöst, gefolgt von Entsalzung unter Verwendung einer NAP-10-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology Co., Ltd.) und in einen Gasphasenproteinsequenzierer geladen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß die gemischten Proteine ungefähr in den gleichen Mengen vorkamen, wobei die eine eine Sequenz im Aminoterminusteil hat, die aus den Aminosäuren 1 bis 16 der SEQ. ID Nr. 1 besteht und die andere eine Sequenz im Aminoterminusteil hat, die einen zusätzlichen Methioninrest enthält, der am Aminoterminus der vorhergehenden Sequenz gebunden ist.

Wirkung der Erfindung

Wie hier beschrieben ermöglicht diese Erfindung es, D-α- Aminosäuren aus D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren mit hoher Effizienz durch Verwendung von Gentechnologie herzustellen.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt die Restriktionsendonukleasekarte des erfindungsgemäßen Plasmids pAHD 101.
Fig. 2 zeigt die Restriktionsendonukleasekarte des erfindungsgemäßen Plasmids pPHD 301.
Fig. 3 zeigt die Restriktionsendonukleasekarte des erfindungsgemäßen Plasmids pAD 108.
Fig. 4 zeigt die Restriktionsendonukleasekarte des erfindungsgemäßen Plasmids pPD 304.

SEQUENCE LISTING

SEQ ID NO.: 1
SEQUENCE LENGTH: 1785
SEQUENCE TYPE: nucleic acid
STRANDEDNESS: double
TOPOLOGY: linear
MOLECULE TYPE: genomic DNA
ORIGINAL SOURCE
ORGANISM:
STRAIN: KNK 712 (FERM BP-1900)
SEQ ID NO.: 2
SEQUENCE LENGTH: 1820
SEQUENCE TYPE: nucleic acid
STRANDEDNESS: double
TOPOLOGY: linear
MOLECULE TYPE: genomic DNA
ORIGINAL SOURCE
ORGANISM:
STRAIN: KNK 003a (FERM BP-3181)

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von D-α-Aminosäuren durch ein Verfahren, worin D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren in einem wässrigen Medium mit Hilfe der Wirkung eines Enzyms, das D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernung ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umwandeln kann, in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umgewandelt werden, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym von einem Transformanten hergestellt wird, der erhältlich ist durch Transformation von Wirtsbakterienzellen, ausgewählt aus den Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Corynebacterium oder Brevibacterium gehören, mit einer rekombinanten DNA, umfassend eine Vektor-DNA und ein DNA-Fragment mit einem dieses Enzym codierenden Gen, woraufhin die erzeugten D-α-Aminosäuren gesammelt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin D-N-Carbamoyl-α- Aminosäure eine Verbindung der allgemeinen Formel ist:

R-CH(NHCONH&sub2;)-COOH

(worin R Phenyl, Phenyl substituiert mit Hydroxy, Alkyl, substituiertes Alkyl, Aralkyl oder Thienyl ist).

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das von dem Transformanten hergestellte Enzym in einer Kulturlösung des Transformanten, der Bakterienzellen, der behandelten Bakterienzellen, der Extrakte aus Bakterienzellen, der immobilisierten Bakterienzellen vorhanden ist oder als immobilisiertes Enzym verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das dieses Gen enthaltende DNA-Fragment von Eukaryonten, Prokaryonten, Viren, Bakteriophagen oder Plasmiden abstammt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Prokaryonten Bakterien sind.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Bakterien ausgewählt werden aus Mikroorganismen, die zur Gattung Pseudomonas, Agrobacterium, Aerobacter, Aeromonas, Brevibacterium, Bacillus, Flavobacterium, Serratia oder Micrococcus gehören.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Bakterien Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) oder Pseudomonas sp. KNK 505 (FERM BP-3182) sind.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Bakterien die Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900) sind.

9. Mikroorganismus, einschließlich ein rekombinanter, umfassend eine Vektor-DNA und ein DNA-Fragment mit einem Gen, das ein Enzym codiert, das D-N-Carbamoyl-α- Aminosäuren in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umwandeln kann.

10. Mikroorganismus nach Anspruch 9, worin der Mikroorganismus einschließlich des rekombinanten ausgewählt ist aus Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Corynebacterium oder Brevibacterium gehören.

11. Mikroorganismus nach Anspruch 10, worin der Mikroorganismus Escherichia coli JM 109 pAD 108 (FERM BP-3184) oder Escherichia coli JM 109 pPD 304 (FERM BP- 3183) ist.

12. Verfahren zur Herstellung von D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure Amidohydrolasen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Transformant kultiviert wird, der erhalten wird durch Transformation von Wirtsbakterienzellen, ausgewählt aus Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Corynebacterium oder Brevibacterium gehören, mit einer rekombinanten DNA, umfassend eine Vektor-DNA und ein DNA-Fragment mit einem für ein Enzym codierenden Gen, wobei das Enzym D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umgewandeln kann, und das Enzym gewonnen wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin D-N-Carbamoyl-α- Aminosäure eine Verbindung der allgemeinen Formel ist:

R-CH(NHCONH&sub2;)-COOH

14. Rekombinantes Plasmid, das durch Rekombination des Plasmids pUC 18 oder pUC 19 mit einem DNA-Fragment, das eine der Restriktionsendonukleasen-Karten der Fig. 1 bis 4 hat und ein Gen enthält, das eine von Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) oder der Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900) abstammende D-N-Carbamoyl-α- Aminosäure Amidohydrolase codiert, erhalten wird.

15. Immobilisiertes Enzym, wobei ein Enzym, das D-N- Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umwandeln kann, auf einem das Enzym tragenden Träger zur Immobilisation fixiert ist.

16. Gen eines Proteins, das Enzymaktivität hat, um D-N- Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umzuwandeln, wobei das Gen die gesamte oder einen Teil der Aminosäuren 1 bis 303 der Aminosäuresequenz, die in der beiliegenden Sequenzliste (SEQ. ID Nr. 1) gezeigt ist, codiert.

17. DNA-Fragment, worin die Basen 167 bis 232 der Basensequenz der SEQ. ID Nr. 1 oder einer äquivalenten Basensequenz davon stromaufwärts an das 5'-Ende des DNA- Fragments nach Anspruch 16 gebunden ist.

18. DNA-Fragment, das die gesamten oder einen Teil der Basen 1 bis 1785 der Basensequenz der SEQ. ID Nr. 1, oder eine äquivalente Basensequenz davon hat, und ein Gen eines Proteins enthält, das Enzymaktivität hat, um D-N- Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umzuwandeln.

19. DNA-Fragment nach Anspruch 18, umfassend ein DNA- Fragment, das für die Aminosäuren 1 bis 20 der Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 1 codiert.

20. Gen eines Proteins, das Enzymaktivität hat, um D-N- Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umzuwandeln, wobei das Gen die gesamte oder einen Teil der Aminosäuren 1 bis 311 der Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 2 codiert.

21. DNA-Fragment, das die Basen 1 bis 1820 der Basensequenz der SEQ. ID Nr. 2, oder eine äquivalente Basensequenz davon hat, und ein Gen eines Proteins enthält, das Enzymaktivität hat, um D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umzuwandeln.

22. DNA-Fragment nach Anspruch 21, umfassend ein DNA- Fragment, das für die Aminosäuren 1 bis 20 der Aminosäurensequenz der SEQ. ID Nr. 2 codiert.

23. Protein mit den gesamten oder einem Teil der Aminosäuren 1 bis 303 der Aminosäurensequenz der SEQ. ID Nr. 1 und mit Enzymaktivität, um D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umzuwandeln.

24. Protein nach Anspruch 23, das die Aminosäuren 1 bis 20 der Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 1 hat.

25. Protein mit den gesamten oder einem Teil der Aminosäuren 1 bis 311 der Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 2 und mit Enzymaktivität, um D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umzuwandeln.

26. Protein nach Anspruch 25, das die Aminosäuren 1 bis 20 der Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 2 hat.

27. Mikroorganismus nach Anspruch 9, worin die Vektor-DNA ein Vektor ist, der autonom in einer Zelle eines zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismus wächst.

28. Verfahren zur Herstellung von einer D-α-Aminosäure aus einer D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym verwendet wird, das die Carbamoylgruppe der D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren entfernt durch einen Mikroorganismus wie in Anspruch 9 oder 27 definiert hergestellt wird, um es in die entsprechende D-cL-Aminosäure umzuwandeln.

29. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms zum Entfernen der Carbamoylgruppe einer D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure, um es in die entsprechende D-α-Aminosäure umzuwandeln, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus nach Anspruch 9 oder 27 verwendet wird.

30. DNA-Fragment, das die gesamten oder einen Teil der Basen 230 bis 1144 der Basensequenz, die in der SEQ. ID Nr. 1 gezeigt ist, oder eine äquivalente Basensequenz davon, hat und ein Gen enthält, das ein Protein codiert, das Enzymaktivität hat, um eine D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppe in die entsprechende D-α-Aminosäure umzuwandeln.

31. DNA-Fragment, das die gesamten oder einen Teil der Basen 233 bis 1141 der Basensequenz, die in der SEQ. ID Nr. 1 gezeigt ist, oder eine äquivalente Basensequenz davon, hat und ein Gen enthält, das ein Protein codiert, das Enzymaktivität hat, um eine D-N-Carbamoyl-x-Aminosäure durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppe in die entsprechende D-α-Aminosäure umzuwandeln.

32. Exprimierbare rekombinante DNA, umfassend ein DNA- Fragment nach Anspruch 30 oder 31 und eine Vektor-DNA.

33. Mikroorganismus, umfassend eine rekombinante DNA nach Anspruch 32.

34. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das eine Carbamoylgruppe von einer D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure entfernt, um sie in die entsprechende D-α-Aminosäure umzuwandeln, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus nach Anspruch 33 verwendet wird.

35. Verfahren zur Herstellung einer D-α-Aminosäure aus einer D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, daß ein durch ein Verfahren nach Anspruch 34 hergestelltes Enzym verwendet wird.

36. Immobilisiertes Enzym, das durch Immobilisieren eines Proteins nach Anspruch 23 auf einem immobilisierten Träger erhalten wird.

37. Verfahren zur Herstellung einer D-α-Aminosäure aus einer D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein nach Anspruch 23 oder ein Enzym nach Anspruch 36 verwendet wird.

38. Verwendung eines Proteins mit Decarbamylase-Aktivität nach Anspruch 23 zur Herstellung einer D-α-Aminosäure.

39. Verwendung eines immobilisierten Enzyms nach Anspruch 36 zur Herstellung einer D-α-Aminosäure.

Patentansprüche FÜR DEN VERTRAGSSTAAT Es

R-CH(NHCONH&sub2;)-COOH

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Prokaryonten Bakterien sind.

9. Verfahren zum Herstellen eines Mikroorganismus, umfassend den Schritt des Einführens eines Rekombinanten, umfassend eine Vektor-DNA und ein DNA- Fragment mit einem Gen, das ein Enzym codiert, das D-N- Carbamoyl-α-Aminosäuren in die entsprechenden D-α- Aminosäuren umwandeln kann.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Mikroorganismus einschließlich des rekombinanten ausgewählt ist aus Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Corynebacterium oder Brevibacterium gehören.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Mikroorganismus Escherichia coli JM 109 pAD 108 (FERM BP-3184) oder Escherichia coli JM 109 pPD 304 (FERM BP-3183) ist.

12. Verfahren zur Herstellung von D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure Amidohydrolasen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Transformant kultiviert wird, der erhalten wird durch Transformation von Wirtsbakterienzellen, ausgewählt aus Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Coryriebacterium oder Brevibacterium gehören, mit einer rekombinanten DNA, umfassend eine Vektor-DNA und ein DNA-Fragment mit einem für ein Enzym codierenden Gen, wobei das Enzym D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umgewandeln kann, und das Enzym gewonnen wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin D-N-Carbamoyl-α- Aminosäuren eine Verbindung der allgemeinen Formel ist:

R-CH(NHCONH&sub2;)-COOH

14. Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Plasmids, umfassend den Schritt des Rekombinierens des Plasmids pUC 18 oder pUC 19 mit einem DNA-Fragment, das eine der Restriktionsendonukleasen-Karten der Fig. 1 bis 4 hat und ein Gen enthält, das eine von Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) oder Agrobacterium Arten KNK 712 (FERM BP-1900) abstammende D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure Amidohydrolase codiert.

15. Verfahren zum Herstellen eines immobilisierten Enzyms, worin ein Enzym, das D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-o%Aminosäuren umwandeln kann, auf einem Träger, der das Enzym tragen kann, zur Immobilisation fixiert ist.

16. Verfahren zum Herstellen eines Gens von einem Protein mit Enzymaktivität, um D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umzuwandeln, wobei das Gen für die gesamte oder einen Teil der Aminosäuren 1 bis 303 der Aminosäuresequenz, die in SEQ. ID Nr. 1 gezeigt ist, codiert, umfassend den Schritt des Isolierens des Gens aus Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) oder der Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900).

17. Verfahren zum Herstellen eines DNA-Fragments, umfassend den Schritt des Zusammenfügens der Basen 167 bis 232 der Basensequenz der SEQ. ID Nr. 1 oder einer äquivalenten Basensequenz davon stromaufwärts des 5'-Endes des DNA- Fragments nach Anspruch 16.

18. Verfahren zum Herstellen eines DNA-Fragments, umfassend den Schritt des Isolierens der DNA-Sequenz mit den gesamten oder einem Teil der Basen 1 bis 1785 der Basensequenz der SEQ. ID Nr. 1, oder mit einer äquivalenten Basensequenz davon, und enthaltend ein Gen eines Proteins, das Enzymaktivität hat, um D-N- Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umzuwandeln.

19. Verfahren nach Anspruch 18, umfassend ein DNA-Fragment, das für die Aminosäuren 1 bis 20 der Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 1 codiert.

20. Verfahren zum Herstellen eines Gens von einem Protein, das Enzymaktivität hat, um D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umzuwandeln, wobei das Gen die gesamte oder einen Teil der Aminosäuren 1 bis 311 der Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 2 codiert, umfassend den Schritt des Isolierens des Gens aus Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181) oder der Agrobacterium Art KNK 712 (FERM BP-1900).

21. Verfahren zum Herstellen eines DNA-Fragments mit den Basen 1 bis 1820 der Basensequenz der SEQ. ID Nr. 2, oder mit einer äquivalenten Basensequenz davon, und enthaltend ein Gen eines Proteins, das Enzymaktivität hat, um D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α- Aminosäuren umzuwandeln, umfassend den Schritt des Isolierens der DNA-Sequenz.

22. Verfahren nach Anspruch 21, umfassend ein DNA-Fragment, das für die Aminosäuren 1 bis 20 der Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 2 codiert.

23. Verfahren zum Herstellen eines Proteins mit den gesamten oder einem Teil der Aminosäuren 1 bis 303 der Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 1 und mit Enzymaktivität, um D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umzuwandeln, umfassend den Schritt des Isolierens des Proteins.

24. Verfahren Anspruch 23, worin das Protein die Aminosäuren 1 bis 20 der Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 1 hat.

25. Verfahren zum Herstellen eines Proteins mit den gesamten oder einem Teil der Aminosäuren 1 bis 311 der Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 2 und mit Enzymaktivität, um D-N- Carbamoyl-α-Aminosäuren durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppen in die entsprechenden D-α-Aminosäuren umzuwandeln, umfassend den Schritt des Isolierens des Proteins.

26. Verfahren nach Anspruch 25, das die Aminosäuren 1 bis 20 der Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 2 hat.

27. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Vektor-DNA ein Vektor ist, der autonom in einer Zelle eines zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismus wächst.

28. Verfahren zur Herstellung einer D-α-Aminosäure aus einer D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym verwendet wird, das die Carbamoylgruppe der D-N-Carbamoyl-α-Aminosäuren entfernt durch einen Mikroorganismus wie in Anspruch 9 oder 27 definiert hergestellt wird, um es in die entsprechende D-α-Aminosäure umzuwandeln.

29. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms zum Entfernen der Carbamoylgruppe von einer D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure, um es in die entsprechende D-α-Aminosäure umzuwandeln, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus nach Anspruch 9 oder 27 verwendet wird.

30. Verfahren zum Herstellen eines DNA-Fragments mit den gesamten oder einem Teil der Basen 230 bis 1144 der Basensequenz, die in SEQ. ID Nr. 1 gezeigt ist, oder einer äquivalente Basensequenz davon, und enthaltend ein Gen, das ein Protein codiert, das Enzymaktivität hat, um eine D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppe in die entsprechende D-α-Aminosäure umzuwandeln, umfassend den Schritt des Isolierens des DNA-Fragments.

31. Verfahren zum Herstellen eines DNA-Fragments mit den gesamten oder einem Teil der Basen 233 bis 1141 der Basensequenz, die in SEQ. ID Nr. 1 gezeigt ist, oder einer äquivalente Basensequenz davon, und enthaltend ein Gen, das ein Protein codiert, das Enzymaktivität hat, um eine D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure durch Entfernen ihrer Carbamoylgruppe in die entsprechende D-α-Aminosäure umzuwandeln, umfassend den Schritt des Isolierens des DNA-Fragments.

32. Verfahren zum Herstellen einer exprimierbaren rekombinanten DNA in eine Vektor-DNA, umfassend den Schritt des Einführens eines DNA-Fragments, wie in Anspruch 30 oder 31 definiert.

33. Verfahren zum Herstellen eines Mikroorganismus, umfassend den Schritt des Einschließens einer rekombinanten DNA, wie in Anspruch 32 definiert.

34. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das eine Carbamoylgruppe von einer D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure entfernt, um sie in entsprechende D-α-Aminosäure umzuwandeln, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus nach Anspruch 33 verwendet wird.

36. Verfahren zum Herstellen eines immobilisierten Enzyms, umfassend den Schritt des Immobilisierens eines Proteins auf einem immobilisierten Träger, wie in Anspruch 23 definiert.

37. Verfahren zur Herstellung einer D-α-Aminosäure aus einer D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein, wie in Anspruch 23 definiert, oder ein Enzym, wie in Anspruch 36 definiert, verwendet wird.

38. Verwendung eines Proteins mit Decarbamylase-Aktivität, wie in Anspruch 23 definiert, zur Herstellung einer D-α- Aminosäure.

39. Verwendung eines immobilisierten Enzyms, wie in Anspruch 36 definiert, zur Herstellung einer D-α-Aminosäure.