DE69535653T2

DE69535653T2 - Verfahren zur Herstellung einer D-N-Carbamoyl-alpha-Aminosäure

Info

Publication number: DE69535653T2
Application number: DE69535653T
Authority: DE
Inventors: Hirokazu Takasago-shi Nanba; Kazuyoshi Akashi-shi YAJIMA; Masayuki Kakogawa-shi TAKANO; Yukio Kakogawa-shi YAMADA; Yasuhiro Kobe-shi IKENAKA; Satomi Kobe-shi TAKAHASHI
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1994-12-28
Filing date: 1995-12-26
Publication date: 2008-11-13
Anticipated expiration: 2015-12-27
Also published as: DE69535653D1; CN100406553C; ES2281075T3; KR100244066B1; CN1502701A; EP0801131B1; CN1916164A; KR987001034A; WO1996020275A1; EP0801131A4; CN100516197C; EP1616945A1; DE69535398D1; EP1616946A1; EP0801131A1; CN1171812A; CN1082090C; DE69535398T2; EP1616945B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren. Genauer gesagt, betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung von D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren unter Verwendung einer neuen Transformante mit einem Gen für ein Enzym, welches 5-substituierte Hydantoine in die korrespondierenden D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren durch asymmetrische hydrolytische Spaltung umwandelt (nachfolgend als Hydantoinase bezeichnet).
HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
Optisch aktive D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren können in die korrespondierenden D-α-Aminosäuren umgewandelt werden und optisch aktive D-α-Aminosäuren sind wichtige Zwischenprodukte für medizinische Wirkstoffe. Insbesondere umfassen Beispiele von industriell nützlichen Verbindungen D-Phenylglycin und D-(p-Hydroxyphenyl)glycin als Zwischenprodukte zur Herstellung von semisynthetischen Penicillinen und semisynthetischen Cephalosporinen.
In der Herstellung von D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren sind Verfahren unter Verwendung mikrobieller enzymatischer Reaktionen bekannt, um 5-substituierte Hydantoine in die korrespondierenden D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren durch asymmetrische hydrolytische Spaltung umzuwandeln und derartige Verfahren werden beschrieben in JP-A 53-91189 , JP-A 53-44690 , JP-A 53-69884 , JP-A 53-133688 und dergleichen.
Zusätzlich wird ein Gen betreffend eine Hydantoinase, welches ein Enzym ist zur Umwandlung von 5-substituiertem Hydantoin in die korrespondierende D-N-Carbamoyl-α-aminosäure erhalten aus thermophilen Mikroorganismen und wird in mesophile Mikroorganismen eingeführt, um transformierte Mikroorganismen mit Hydantoinaseaktivität herzustellen. Des Weiteren wird in WO 94/00577 ein Hydantoinasegenfragment aus einem Mikroorganismus, der zum Genus Agrobacterium gehört, isoliert und in Escherichia coli oder einen Mikroorganismus des Genus Agrobacterium eingeführt, um die Aktivität zu exprimieren.
GEGENSTAND DER ERFINDUNG:
In den oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung mikrobieller enzymatischer Reaktionen bestehen die Nachteile, dass die Ausbeuten der Enzyme von Mikroorganismen, die hierfür bekannte Quellen sind, unzureichend ist, und des Weiteren die Kulturmedien teuer sind.
Zusätzlich ist in Bezug auf die transformierten Mikroorganismen, die in JP-A 62-87089 offenbart sind, die Verbesserung der enzymatischen Aktivität nur mehrere Male im Vergleich zu sporulierenden thermophilen Mikroorganismen mit Hydantoinaseaktivität und die Ausbeuten des Enzyms sind immer noch unzureichend.
Des Weiteren gibt es im Stand der Technik kein Beispiel, dass ein 5-substituiertes Hytantoin einer asymmetrischen hydrolytischen Spaltung unterworfen wird unter Verwendung der oben beschriebenen transformierten Mikroorganismen, um die korrespondierende D-N-Carbamoyl-α-aminosäure herzustellen und zu akkumulieren.
Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme und ist gerichtet auf die Herstellung eines Mikroorganismus mit einer sehr hohen Enzymproduktivität und auf die effiziente Herstellung von D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren unter Verwendung der so erhaltenen Enzymquelle.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:
JP-A 62-87089 und WO 94/00577 offenbaren das Verfahren zum Erhalten von Hydantoinase-herstellenden Mikroorgansimen unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken. Es sind jedoch die Ursprungs-Mikroorganismen zur Bereitstellung der Hydantoinasegene komplett unterschiedlich von den Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung zum Erhalt der Hydantoinasegene verwendet werden. Zusätzlich sind die Nucleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen der Hydantoinasegene erheblich unterschiedlich von jenen der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren zur Herstellung einer D-N-Carbamoyl-α-aminosäure zur Verfügung stellen, welches umfasst Reagierenlassen eines 5-substituierten Hydantoins in einem wässrigen Medium mit einer Hydantoinase, hergestellt durch eine Transformante, erhalten durch Transformieren eines Wirtsmikroorganismus, wie ein Mikroorganismus, der zum Genus Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Agrobacterium, Corynebacterium oder Brevibacterium gehört, mit einer rekombinanten DNA oder einem DNA-Fragment enthaltend ein Gen für Hydantoinase, abgeleitet von Bacillus sp. KNK245 (FERM BP-4863) (nicht Teil der Erfindung), Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP-1900) oder Pseudomonas sp. KNK003A (FERM BP-3181) (nicht Teil der Erfindung), und eine Vektor-DNA.
Eine Transformante mit sehr hoher Hydantoinaseproduktivität, wie jene, die in der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, ist zuvor im Stand der Technik nicht bekannt gewesen und die äußerst effiziente und ökonomische Herstellung von D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren wird unter Verwendung der Reaktion des Enzyms der Transformante möglich.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Detail in Bezug auf die beigefügten Abbildungen beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:
1 ist eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pAH1043
2 ist eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pTH102 (nicht Teil der Erfindung)
3 ist eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pTH103 (nicht Teil der Erfindung)
4 ist eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pTH104 (nicht Teil der Erfindung)
5 ist eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pPHD301 (nicht Teil der Erfindung)
6 ist eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pTHB301 (nicht Teil der Erfindung)
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:
Ein DNA-Fragment enthaltend das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Gen kann von Bacillus sp. KNK245 (nicht Teil der Erfindung), Agrobacterium sp. KNK712 oder Pseudomonas sp. KNK003A (nicht Teil der Erfindung) erhalten werden. Agrobacterium sp. KNK712 und Pseudomonas sp. KNK003A (nicht Teil der Erfindung) sind beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science & Technology (NIBH), Ministry of International Trade and Industry, hinterlegt worden vom Anmelder unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-1900 und FERM BP-3181, und sind bekannte Stämme, welche im Detail in WO 92/10579 beschrieben wurden. Bacillus sp. KNK245 (nicht Teil der Erfindung) ist ein von den vorliegenden Erfindern neu gefundener Stamm und ist bei NIBH hinterlegt worden am 2. November 1994 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4863.

Mikrobielle Charakteristika von Bacillus sp. KNK245 sind wie folgt. Bacillus sp. KNK245

Form	Stäbchen, filamentös
Größe	0,5–0,8 × 3–10 (μm)
Gram-Färbbarkeit	+
Sporen	+
Mobilität	–
Wachstumstemperatur	37–60°C
Wachstums-pH	5,0–8,9
Wachstum in 5% NaCl	–
Wachstum in 7% NaCl	–
Wachstum in 0,02% Azid	–
Wachstum in 0,001% Lysozym	–
Nitratreduktion	–
Stärkehydrolyse	+
Kaseinabbau	+
Tyrosinabbau	–
Katalase	–
Oxidase	+
Indolproduktion	–

Produktion von Säuren aus Kohlenwasserstoffen

Mannose	(+)
Xylose	–
Arabinose	+
Rhamnose	–
Glucose	+
Fructose	+
Raffinose	–
Sucrose	+
Maltose	+
Lactose	–

Zum Erhalt eines Hydantoinasegens aus diesen Stämmen wird üblicherweise die folgende Prozedur durchgeführt.
Zunächst wird genomische DNA aus einer mikrobiellen Zelle extrahiert und dann wird die DNA partiell hydrolisiert mit einem geeigneten Restriktionsenzym, z. B., Sau3AI oder dergleichen. Die resultierenden Fragmente werden mit Vektor-DNA ligiert, um rekombinante DNA-Moleküle mit unterschiedlichen genomischen DNA-Fragmenten als eine Genbibliothek zu erhalten (siehe JP-A 58-126789 und U.S. Patent Nr. 4,237,224 ).
Dann wird eine Rekombinante, enthaltend das erwünschte Gen, aus dieser Genbibliothek selektiert. Z. B. kann die Selektion durchgeführt werden durch Detektion eines exprimierten Proteins unter Verwendung seiner enzymatischen Aktivität als Indikator, oder die Selektion kann durchgeführt werden durch Analyse der N-terminalen Sequenz eines Proteins, Synthetisieren einer korrespondierenden DNA-Probe und Detektieren des Vorhandenseins des erwünschten Gens durch Koloniehybridisierung oder dergleichen. Zusätzlich kann das erwünschte Gen erhalten werden durch Koloniehybridisierung oder Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Verfahren unter Verwendung von DNA-Primern, welche synthetisierte, geeignete Teile einer bekannten Hydantoinase-Basensequenz sind. Sobald das erwünschte Gen erhalten wurde, wird seine Nucleotidsequenz analysiert. Zusätzlich wird ein Hydantoinase-herstellender Mikroorganismus und eine Rekombinante enthaltend dieses Enzymgen kultiviert. Das resultierende Enzym wird gereinigt und das Molekulargewicht des resultierenden Proteins wird bestimmt. Zur selben Zeit wird die Aminosäuresequenz seiner N-terminalen Region mit einem Gasphasenproteinsequenzer oder dergleichen bestimmt.
Dann wird durch Vergleich dieser DNA-Nucleotidsequenzen mit den N-terminalen Aminosäuresequenzen die Initiierungsstelle für die Translation der Nucleotidsequenzportion, die das Hydantoinaseprotein kodiert, in ein Protein bestimmt, und, durch Bezugnahme auf das Verhältnis zum Molekulargewicht des Proteins wird bestätigt, dass das Enzymprotein von dem Teil des Gens kodiert wird, welcher sich von dieser Stelle bis zum Endkodon erstreckt, wodurch das erwünschte Gen verifiziert wird (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapters 4 and 13). So wurden die DNA-Fragmente der SEQ ID Nr. 1 und 3 von Agrobacterium sp. KNK712 und Pseudomonas sp. KNK003A (nicht Teil der Erfindung) erhalten. Wie allgemein bekannt ist, sind das so erhaltene Gen, welches das Enzym kodiert und/oder DNA-Fragmente, die es enthalten, äquivalent zu DNA-Fragmenten mit einer anderen Nucleotidsequenz, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, die zu dem obigen Gen und/oder DNA-Fragment korrespondiert, da eine Aminosäure üblicherweise zu einer Mehrzahl von Basenkodons korrespondiert.
Als Vektor, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, können Plasmide, Phagen oder Derivate davon verwendet werden, welche von Mikroorganismen abgeleitet sind und autonom vermehrt werden können in Zellen von Bakterien, die zum Genus Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Corynebacterium oder Brevibacterium gehören.
Zum Beispiel können Wirts-Vektorsysteme, beschrieben in „Guidelines an Recombinant DNA Experiments, -Commentation, Q and A-" (the Life Science Section of the Research Development Office in the Science and Technology Agency, Ed., revidiert 16. September 1987), Seiten 25 bis 27 und 36 bis 38, verwendet werden. Zusätzlich kann rekombinante DNA mit einer Translations-Initiationsstelle, die mit einer geeigneten Stelle eines Vektors verbunden ist, welcher modifiziert wurde, um einen starken strukturellen Promotor aufzuweisen, verwendet werden für den Zweck, die Menge an hergestelltem Enzym zu erhöhen. Beide Enden dieser Fragmente werden mit einem Restriktionsenzym geschnitten, um eine Rekombinante mit einerm geeigneten Vektor zu erzeugen. Ein rekombinanter Hydantoinase-herstellender Mikroorganismus kann hergestellt werden durch direkte Transformation eines Mikroorganismus, der zum Genus Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Agrobacterium, Corynebacterium oder Brevibacterium gehört.
Ein Hydantoinase-herstellender rekombinanter Mirkoorganismus kann auch erhalten werden ohne direkte Transformation eines Mikroorganismus des oben beschriebenen Genus, d. h., das erwünschte Gen wird einmal in ein Wirts-Vektorsystem kloniert unter Verwendung eines anderen Mikroorganismus, wie Escherichia coli, wonach rekombinante DNA mit einem geeigneten Vektor hergestellt wird.
Die Beschreibung der folgenden Dokumente kann allgemein angewandt werden auf die Herstellung von Rekombinanten: die Beschreibung von U.S. Patent Nr. 4,237,244 , S. N. Cohen et al.; „Idenshi-sousa Jikken-hou (Experimental Method of Gene Manipulation)" [Ed. Yasuyuki Takagi, Kohdan-sha Scientific (1980)]; Method in Enzymology, 68, Recombinant DNA [Ed., Ray Mv, Academic Press (1979)], die Beschreibung von JP-A 58-126789 und dergleichen.
Das erwünschte Gen wird kloniert und unnötige DNA wird davon entfernt. Rekombinante DNA mit seiner Translations-Startstelle, verbunden mit einer geeigneten Position eines Vektors, welcher modifiziert wurde, um einen starken strukturellen Promotor aufzuweisen, kann verwendet werden für die Transformation der obigen Wirtszelle, um die Menge des produzierten Enzyms zu erhöhen.
Die Transformante wird kultiviert in einem konventionellen Nährstoff-Kulturmedium, um die eingeführte rekombinante DNA zu exprimieren. Wenn eine bestimmte Eigenschaft, abgeleitet von der Gen-DNA oder Vektor-DNA, auf die rekombinante DNA übertragen wird, kann eine geeignete Komponente zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden, gemäß einer bestimmten Eigenschaft.
Um die so erhaltene Transformante als Enzymquelle zu nehmen, kann sie kultiviert werden unter Verwendung eines konventionellen Kulturmediums. Falls nötig, ist es auch möglich, eine Behandlung zur Enzyminduktion durchzuführen, wie das Hinzufügen von Hydantoinverbindungen, Uracil, Isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG) oder dergleichen und einen Temperaturanstieg. Üblicherweise ist das Kulturmedium, das zum Kultivieren der Transformante verwendet wird, ein konventionelles Kulturmedium, enthaltend Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Ionen. In vielen Fällen können die gewünschten Ergebnisse erhalten werden durch weiteres Hinzufügen von organischen Spurennährstoffen, wie Vitaminen, Aminosäuren und dergleichen. Als Kohlenstoffquellen können Kohlenwasserstoffe, wie Glucose und Sucrose, organische Säuren, wie Essigsäuren, Alkohole und dergleichen praktisch verwendet werden. Als Stickstoffquellen können Ammoniumgas, Ammoniumwasser, Ammoniumsalze und dergleichen verwendet werden. Als anorganische Ionen können Phosphationen, Magnesiumionen, Kaliumionen, Eisenionen, Manganionen, Kobaltionen, Nickelionen, Kupferionen, Aluminiumionen, Molybdenionen und dergleichen verwendet werden.
Wenn die Kultivierung unter aeroben Bedingungen für 1 bis 10 Tage durchgeführt wird, während der pH und die Temperatur auf einen geeigneten Bereich von 4 bis 8 beziehungsweise 25 bis 60°C eingestellt werden, können die gewünschten Ergebnisse erhalten werden.
Die enzymatische Aktivität eines von der Transformante hergestellten Enzyms kann ausgedrückt werden in Form von, z. B., einer Kulturlösung der Transformante, seiner mikrobiellen Zellen, dem aus den mikrobiellen Zellen extrahierten Enzym, immobilisierten mikrobiellen Zellen und dergleichen.
Als mikrobielle Zellen können eine Kulturlösung, wie sie nach der Fertigstellung der Kultivierung vorliegt, mikrobielle Zellen, die von der Kulturlösung getrennt wurden, gewaschene mikrobielle Zellen und dergleichen verwendet werden. Als die behandelten mikrobiellen Zellen können lyophilisierte mikrobielle Zellen, Azeton-getrocknete mikrobielle Zellen, mikrobielle Zellen, die in Kontakt mit Toluol oder einem Detergens gebracht wurden, Lysozym-behandelte mikrobielle Zellen, ultrabeschallte mikrobielle Zellen, mechanisch zerriebene mikrobielle Zellen und dergleichen verwendet werden. Zusätzlich können Enzymextrakte mit Hydantoinase-Aktivität, erhalten aus diesen behandelten mikrobiellen Zellen, diesen immobilisierten mikrobiellen Zellen, diesen unlöslich gemachten mikrobiellen Zellen, diesen Enzymproteinen, die auf einen Träger zur Immobilisierung fixiert wurden (z. B. Anionenaustauscherharz) und dergleichen verwendet werden. Als Immobilisierungsverfahren kann z. B. Bezug genommen werden auf die Beschreibung von JP-A 63-185382 und dergleichen.
Als Träger zur Verwendung für die Immobilisierung sind Phenol-Formaldehydanionen-Austauscherharze, wie Duolite A568 oder DS17186 (Rohm & Haas Co.: registrierte Handelsmarke), und verschiedene Anionenaustauscherharze enthaltend verschiedene Amine, Ammoniumsalze oder funktionelle Gruppen von der Art der Diethanolamine, z. B. Polystylolharze, wie Amberlite IRA935, IRA945, IRA901 (Rohm & Haas Co.: registrierte Handelsmarke), Lewatit OC1037 (Bayer A. G.: registrierte Handelsmarke) und Diaion EX-05 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.: registrierte Handelsmarke) geeignet. Andere Träger, wie DEAE-Zellulose, können auch verwendet werden.
Des Weiteren werden, um stärkere und stabiliere Adsorption von Enzymen zu erhalten, üblicherweise Kreuzvernetzungsmittel verwendet, wovon das bevorzugte Beispiel Glutaraldehyd ist. Als zu verwendendes Enzym kommen nicht nur gereinigte Enzyme, sondern auch jene mit unterschiedlichen Graden an Aufreinigung, wie teilweise gereinigte Enzyme, Suspensionen von disintegrierten mikrobiellen Zellen und zellfreie Extrakte verwendet werden. Die Herstellung von immobilisierten Enzymen kann durchgeführt werden gemäß einem konventionellen Verfahren, z. B. durch Absorbieren von Enzymen auf einem Träger, gefolgt durch eine Kreuzvernetzungsbehandlung.
Das 5-substituierte Hydantoin, das zu verwenden ist als Substrat der enzymatischen Reaktion der vorliegenden Erfindung, ist nicht besonders limitiert und kann jede Verbindung sein, die üblicherweise in dieser Art von Reaktion verwendet wird. Beispiele davon umfassen jene dargestellt durch die allgemeine Formel (1):
Der Rest R in der Verbindung der Formel (1) kann in einem weiten Bereich ausgewählt werden. Um industriell nützliche Produkte, wie Zwischenprodukte von medizinischen Wirkstoffen zur Verfügung zu stellen, ist R vorzugsweise Phenyl, Phenyl-substituiert mit Hydroxy, Alkyl, substituiertes Alkyl, Aralkyl oder Thienyl. Im Fall von Phenyl substituiert mit Hydroxy, kann die Anzahl von Hydroxygruppen eine oder mehrere sein und sie können an jeder der o-, m- und p-Positionen lokalisiert sein, wobei ein typisches Beispiel davon p-Hydroxyphenyl ist. Die Alkylgruppe ist eine Gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, so dass die korrespondierende D-N-Carbamoyl-α-aminosäure D-N-Carbamoyl-alanin, D-N-Carbamoyl-valin, D-N-Carbamoyl-leucin, D-N-Carbamoyl-isoleucin oder dergleichen ist. Die substituierte Alkylgruppe ist eine solche Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, substituiert mit Hydroxy, Alkylthio, Carboxyl, Amino, Phenyl, Phenyl-substituiert mit Hydroxy, Amido oder dergleichen, so dass die korrespondierende D-N-Carbamoyl-aminosäure D-N-Carbamoyl-serin, D-N-Carbamoyl-threonin, D-N-Carbamoyl-methionin, D-N-Carbamoyl-cystein, D-N-Carbamoyl-asparagin, D-N-Carbamoyl-glutamin, D-N-Carbamoyl-tyrosin, D-N-Carbamoyl-tryptophan, D-N-Carbamoyl-aspartat, D-N-Carbamoyl-glutamat, D-N-Carbamoyl-histidin, D-N-Carbamoyl-lysin, D-N-Carbamoyl-arginin, D-N-Carbamoyl-citrullin oder dergleichen ist. Die Aralkylgruppe ist eine solche Gruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen, z. B. Benzyl oder Phenethyl, dass die korrespondierende D-N-Carbamoyl-α-aminosäure, D-N-Carbamoyl-phenylalanin oder dergleichen ist.
Als wässriges Medium können solche enthaltend Wasser, Puffer oder organische Lösungsmittel, wie Ethanol, verwendet werden.
Des Weiteren können, falls nötig, Nährstoffe, die für das Wachstum der Mikroorganismen benötigt werden, Antioxidantien, Detergenzien, Coenzyme, Hydroxylamine, Metalle und dergleichen zu dem wässrigen Medium hinzugefügt werden.
In dem Fall, wo während der Kultivierung der mikrobiellen Zellen des obigen Mikroorganismus in einem wasserlöslichen Medium die mikrobiellen Zellen mit einem bestimmten 5-substituierten Hydantoin in Kontakt gebracht werden, wird ein wässriges Medium, welches nicht nur das 5-substituierte Hydantoin enthält, sondern auch Nährstoffe, die für das Wachstum der Mikroorganismen benötigt werden, wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Ionen, verwendet. Wenn organische Spurennährstoffe, wie Vitamine und Aminosäuren, des Weiteren dazu hinzugefügt werden, können in vielen Fällen zufriedenstellende Ergebnisse erhalten werden. Als Kohlenstoffquellen werden Kohlenwasserstoffe wie Glucose, Sucrose, organische Säuren wie Essigsäure, Alkohole und dergleichen praktischerweise verwendet. Als Stickstoffquellen können Ammoniumgas, Ammoniumwasser, Ammoniumsalze und dergleichen verwendet werden. Als anorganische Ionen können Phosphationen, Magnesiumionen, Kaliumionen, Eisenionen, Manganionen, Kobaltionen, Nickelionen, Kupferionen, Aluminiumionen, Molybdenionen und dergleichen verwendet werden.
Die Kultivierung wird durchgeführt unter aeroben Bedingungen, während der pH und die Temperatur auf einen geeigneten Bereich von 4 bis 8 bzw. 25 bis 60°C eingestellt werden. Wenn die Kultivierung durchgeführt wird für 1 bis 10 Tage, werden 5 substituierte Hydantoine mit einer hohen Effizienz nur in D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren umgewandelt.
Auf der anderen Seite, in dem Fall, wo die Kulturlösung der obigen Mikroorganismen so wie sie ist reagieren gelassen wird mit kultivierten mikrobiellen Zellen, behandelten mikrobiellen Zellen, Enzymextrakten, immobilisierten mikrobiellen Zellen, unlöslich gemachten mikrobiellen Zellen oder fixierten Enzymproteinen in einem wässrigen Medium, enthaltend ein gelöstes oder suspendiertes 5-substituiertes Hydantoin, kann die Reaktionsmischung für einige Zeit stehen gelassen oder gerührt werden, während sie bei einer geeigneten Temperatur von 10–80°C und einem pH von 4 bis 9,5 gehalten wird. Somit erfolgen, wenn 5 bis 100 Stunden vergangen sind, die D-spezifische Hydrolysereaktion des Substrats durch Hydantinase und chemische Racemisierung des Substrats und jegliche von D-, DL- oder L-5-substituierten Hydantoinen werden in die korrespondierenden D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren umgewandelt, um eine große Menge der Aminosäuren in dem wässrigen Medium zu akkumulieren. Zusätzlich können 5-substituierte Hydantoine in separaten Portionen hinzugefügt werden mit dem Fortschreiten der Reaktion.
Die hergestellte D-N-Carbamoyl-α-aminosäure kann isoliert und gereinigt werden durch konventionelle Trennungsverfahren.
D-α-Aminosäuren können einfach erhalten werden unter Verwendung der isolierten und gereinigten D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren, erhalten durch die oben beschriebenen Verfahren oder die Reaktionsmischungen erhalten durch die Hydantoinasereaktion wie sie sind, durch die Aktion und das Umwandeln der D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren in die korrespondierenden D-α-aminosäuren, chemisch oder enzymatisch mit Enzymen, die Decarbamylaseaktivität aufweisen.
Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung weiter im Detail.
REFERENZBEISPIEL 1
Isolierung eines Mikroorganismus mit Hydantoinaseaktivität aus Boden
Nach dem Suspendieren von 0,5 g einer Bodenprobe in 2 ml physologischer Salzlösung wurde die Suspension stehen gelassen und ein Tropfen des Überstands wurde auf ein Isolations-Agar-Plattenmedium gestrichen (1,0% Fleischextrakt, 1,0% Pepton, 1,0% Hefeextrakt, 0,3% Natriumchlorid, 2,0% Agar, pH 7,5). Dieses wurde bei 50°C für 2 Tage kultiviert und die erhaltene Kolonie wurde auf das gleiche Isolationsplattenmedium transferiert, zu welchem 0,1% Uracil und 20 ppm Manganchlorid hinzugefügt worden waren und dann 1 Tag bei 50°C weiter kultiviert. Die so erhaltenen mikrobiellen Zellen wurden in 100 μl einer Reaktionssubstratlösung suspendiert [DL-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin, 30 mM, Natriumsulfit 0,1%, Caronatpuffer 50 mM] und wurden für 2 Stunden bei 50°C reagieren gelassen. Dann wurde die Reaktionsmischung auf eine TLC-Platte punktförmig aufgebracht und entwickelt mit einem Entwicklungs-Lösungsmittel aus Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:1), gefolgt durch das Farbentwickeln mit einer 10% Lösung von p-Dimethylamino-benzaldehyd in konzentrierter Salzsäure und Detektieren eines gelben Punktes, um mikrobielle Stämme zu selektieren, welche N-Carbamoyl-p-hydroxyphenylglycin herstellten. So wurde unter 2.740 Kolonien Bacillus sp. KNK245 (FERM BP-4863) mit einer hohen Hydantinaseaktivität isoliert.
REFERENZBEISPIEL 2
N-terminale Aminosäure-Sequenzierung von der Hydantoinase, abgeleitet von Bacillus sp. KNK245 (nicht Teil der Erfindung)
Eine kleine Menge („loopful") Bacillus sp. KNK245 wurde in 100 ml eines Startkulturmediums inokuliert (1,0% Fleischextrakt, 1,0% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, pH 7,5) in einem 500 ml Sakaguchi-Behälter und bei 55°C für 19 Stunden kultiviert. Dann wurden 2% davon inokuliert in 500 ml eines Hauptkulturmediums (1,0% Fleischextrakt, 1,0% Pepton, 0,5% Uracil, 20 ppm Manganchloridtetrahydrat, pH 7,5) in einem 2 Liter Sakaguchi-Behälter und bei 55°C für 19 Stunden kultiviert. Mikrobielle Zellen wurden von 9 Litern der so erhaltenen Kulturflüssigkeit durch Zentrifugation gesammelt. Sie wurden in 0,2 M Tris-HCl (pH 8,0) mit 20 mM Mangansulfat suspendiert, ultrabeschallt und zentrifugiert, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten. Dann wurde das Extrakt bis zu 32-fach aufgereinigt durch Ammoniumsulfat-Präzitipationsfraktionierungen, DEAE-Sepharose und Phenyl-Sepharose. Des Weiteren wurden Hydantoinasekristalle erhalten unter Verwendung von Ammoniumsulfat. Die Kristalle wurden in Wasser aufgelöst und unter Verwendung eines 470 A Gasphasen-Protein-Sequenzers (hergestellt von Applied Biosystems) analysiert. Im Ergebnis wurde gefunden, dass die Hydantoinase die Aminosäuresequenz:
an ihrem N-Terminus aufwies.
BEISPIEL 1
Erhalten eines Plasmids enthaltend das Gen für Hydantoinase, abgeleitet von Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP-1900)
Durch eine Untersuchung gemäß dem folgenden Verfahren wurde gefunden, dass ein Hydantoinasegen auf dem DNA-Fragment, welches in dem Plasmid pAHD101, beschrieben in WO 92/10579 , lokalisiert ist. Escherichia coli JM109 wurde mit pAHD101 transformiert gemäß einem herkömmlichen Verfahren, in 50 ml L-Medium inokuliert (10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Natiumchlorid, pH 7,0), enthaltend 100 mg/l Ampicillin und bei 37°C für 16 Stunden kultiviert. Dann wurden 50 ml der Kulturlösung gesammelt, gefolgt vom Entfernen des Überstands, Suspendieren der mikrobiellen Zellen in 50 ml Substratlösung (0,5% 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin, 0,05% Triton X-100, 0,05 M Phosphatpuffer, pH 8,7) und Reagieren lassen bei 37°C für 3 Stunden in einem Fluss von Stickstoff. Die Reaktionsmischung wurde auf eine TLC-Platte punktförmig aufgetragen, entwickelt und gefärbt mit einer Lösung von p-Dimethylamino-benzaldehyd in Salzsäure, um einem Punkt von D-N-Carbamoyl-(p-hydroxyphenyl)glycin zu detektieren, in Übereinstimmung mit einer Kontrollprobe. Angesichts des Obigen wurde bestätigt, dass die Transformante von pAHD101 ein Gen exprimiert, welches Hydantoinase kodiert.
Ein 2,1 kbp-Fragment, erhalten durch Spalten des Plasmids pAHD101 mit SacI und SalI, um das eingesetzte Fragment zu verkürzen, wurde an ein pUC18-Fragment, gespalten mit SacI und SalI, ligiert, um das Plasmid pAH1043 zu erhalten (siehe 1).
Zusätzlich wurde das Sequenzieren des Hydantoinasegens durchgeführt unter Verwendung eines DNA-Sequenz-Kits (hergestellt von Applied Biosystems). Die Ergebnisse werden in SEQ ID Nr. 1 gezeigt.
Escherichia coli HB101 wurde transformiert mit dem Plasmid pAH1043, um eine Transformante, Escherichia coli HB101 pAH1043 zu erhalten (FERM BP-4865).
REFERENZBEISPIEL 3
Herstellung rekombinanter DNA aus genomischer DNA von Bacillus sp. KNK245 und Vektor-DNA
Bacillus sp. KNK245 (FERM BP-4863) wurde in 2 Litern einer Lösung kultiviert (10 g/l Fleischextrakt, 10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt, pH 7,5) bei 45°C für 24 Stunden, und die mikrobiellen Zellen wurden gesammelt. Genomische DNA wurde aus den erhaltenen mikrobiellen Zellen extrahiert gemäß der Marmur-Methode. Zehn Einheiten BamHI wurden zu 1 μg der genomischen DNA hinzugefügt und bei 37°C für 16 Stunden reagieren gelassen.
Auf der anderen Seite wurde das Plasmid pUC19 komplett gespalten mit BamHI und die oben erhaltenen genomischen DNA-Fragmente wurden daran ligiert mit T4DNA-Ligase, um eine Mischung von verschiedenen rekombinanten Plasmiden zu erhalten.
REFERENZBEISPIEL 4
Erhalten des Hydantoinasegens, abgeleitet von Bacillus sp. KNK245
Basierend auf der Nucleotidsequenz des Hydantoinasegens, abgeleitet von Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP-1900) aus Beispiel 1 und dem Lu1220-Stamm, offenbart in JP-A 62-87089 , wurden zwei Arten von Primern 1 und 2 (siehe Tabelle 1) mit Sequenzen jedes komplementären Strangs der obigen Nucleotidsequenzen, orientiert in unterschiedlichen Richtungen, von 1.155 bp unterbrechenden Nucleotiden synthetisiert. Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde ausgeführt unter Verwendung von zwei Primern, welche synthetisiert wurden unter Verwendung genomischer DNA, abgeleitet von Bacillus sp. KNK245, hergestellt in Referenzbeispiel 3 als ein Template, um ein etwa 1,2 kbp-Fragment zu erhalten. Die Nucleotidsequenzierung dieses Fragments wurde ausgeführt unter Verwendung eines DNA-Sequenz-Kits (hergestellt von Applied Biosystems). Im Ergebnis hatte es eine hohe Komplementarität mit einem bekannten Hydantoinasegen und es wurde gefunden, dass das erhaltene PCR-Fragment ein Teil des Hydantoinasegens war. Dann wurden die zwei Primer 3 und 4 (Tabelle 1) mit in unterschiedliche Richtungen ausgerichtete Sequenzen der jeweiligen komplementären Stränge dieses Fragments synthetisiert.
Des Weiteren wurde Primer 5 (Tabelle 1) mit der Sequenz eines Vektorteils in der rekombinanten DNA von Referenzbeispiel 3 synthetisiert und unter Verwendung der obigen synthetisierten Primer und des letzteren Primers und Verwendung der rekombinanten DNA von Referenzbeispiel 3 als Template wurde PCR durchgeführt, um zwei Arten von DNA-Fragmenten, enthaltend die vordere Hälfte bzw. die hintere Hälfte des Hydantoinasegens zu erhalten. Diese DNA-Fragmente wurden der Nucleotidsequenzierung unterworfen. Auf Basis der Nucleotidsequenzen, welche anhand der N-terminalen Aminosäuresequenz des Hydantoinaseproteins von Referenzbeispiel 2 erwartet wurden, wurde das Translationskodon bestimmt. Zusammen mit den Ergebnissen der oben bestimmten Nucleotidsequenzen wurde die gesamte Nucleotidsequenz des Gens, welches Hydantoinase kodiert, bestimmt.
Dann wurden, auf Basis der so erhaltenen Nucleotidsequenz, Primer 6 (Tabelle 1) mit einer Sequenz im Bereich des Initiationskodons des Hydantoinasegens und der NdeI-Restriktionsstelle und Primer 7 (Tabelle 1) mit einer Sequenz im Bereich der PstI-Restriktionsstelle in dem Hydantoinasegen synthetisiert und PCR wurde durchgeführt unter Verwendung der genomischen DNA von Referenzbeispiel 3 als Template, um ein 1,2 kb Fragment 1 zu erhalten. Dann wurden Primer 8 (Tabelle 1) mit einer entgegengesetzt ausgerichteten Sequenz an der obigen PstI-Restriktionsstelle und Primer 9 (Tabelle 1) mit einer Sequenz, die zur Downstream-Sequenz des Terminationskodons korrespondiert und der HindIII-Restriktionsstelle synthetisiert und PCR wurde durchgeführt unter Verwendung der genomischen DNA von Referenzbeispiel 3 als Template, um ein 0,25 kb Fragment 2 zu erhalten. Fragment 1 wurde mit NdeI und PstI geschnitten, Fragment 2 wurde mit PstI und HindIII geschnitten und pUCNT, welches ein verbessertes Vektorplasmid von pUC19, beschrieben in WO 94/03613 , ist, wurde mit NdeI und HindIII geschnitten. Die geschnittenen Fragmente wurden mit T4DNA-Ligase ligiert, um das Plasmid pTH102, enthaltend das Hydantoinasegen (siehe 2), zu erhalten.
Tabelle 1
REFERENZBEISPIEL 5
Herstellung rekombinanter DNA zur Expression des Bacillus sp. KNK245 Hydantoinasegens
PCR wurde in derselben Weise, wie zum Erhalt des Fragments 2 in Referenzbeispiel 4 durchgeführt, um ein 0,25 kb Fragement 3 zu erhalten, abgesehen davon, dass an Stelle des Primers mit einer PstI-Restriktionsstelle, welcher für die Herstellung des Fragments 2 verwendet worden war, der synthetisierte Primer 10 (Tabelle 1), worin ein Nucleotid an der NdeI-Restriktionsstelle nahe der PstI-Restriktionsstelle substituiert wurde, um die Spaltung mit NdeI zu blockieren, verwendet wurde, und anstelle des Primers mit der Sequenz im Bereich des Terminationskodons, der synthetisierte Primer 11 (Tabelle 1), worin die Anzahl der Nucleotide downstream des Terminationskodons noch weiter reduziert worden waren, verwendet wurde. Dann wurde in derselben Weise, wie für das Erhalten von pTH102 in Referenzbeispiel 4 das Plasmid pTH103 aus den Fragmenten 1 und 3 und pUCNT (siehe 3) erhalten.
Des Weiteren wurde in derselben Weise, wie für das Erhalten von pTH103, pTH104 erhalten, abgesehen davon, dass anstelle des Primers 11 mit der Downstream-Sequenz im Bereich des Terminationskodons, Primer 12 (Tabelle 1) verwendet wurde.
Escherichia coli HB101, transformiert mit pTH104, wurde als Escherichia coli HB101 pTH104 bezeichnet. Dieser Stamm ist hinterlegt worden bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology am 2. November 1994 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4864.
REFERENZBEISPIEL 6
Zum Erhalt des Plasmids enthaltend das Gen für Hydantoinase, abgeleitet von Pseudomonas sp. KNK003A (FERM BP-3181)
In derselben Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde gefunden, dass auf dem in WO 92/10579 beschriebenen Plasmid pPHD301 ein Hydantoinasegen lokalisiert ist.
Escherichia coli HB101 wurde mit pPHD301 transformiert, um Escherichia coli HB101pPHD301 (FERM BP-4866) zu erhalten. Die Restriktionsenzymkarte von pPHD301 ist in 5 gezeigt.
Die Sequenzierung des Hydantoinasegens wurde in derselben Weise ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse werden in SEQ Nr. 3 (nicht Teil der Erfindung) gezeigt. SEQ Nr. 4 ist ebenfalls nicht Teil der Erfindung.
REFERENZBEISPIEL 7
Umwandlung von 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin in D-N-Carbamoyl-(p-hydroxyphenyl)glycin durch die erhaltene Transformante
Die in Referenzbeispiel 5 erhaltene Transformante, Escherichia coli HB101pTH104 wurde in 50 ml 2YT-Medium (16 g/l Polypepton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Natriumchlorid, pH 7,0), enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 400 ppm Manganchloridtetrahydrat, inokuliert, und bei 37°C für 24 Stunden kultiviert. Die mikrobiellen Zellen wurden aus 50 ml dieses Kulturmediums gesammelt und in 0,05 M Carbonatpuffer (pH 8,7) suspendiert, um ein Volumen von 50 ml zu ergeben. Triton X-100 wurde hinzugefügt, so dass die Endkonzentration 0,05% betrug. Hierzu wurden 1,5 g 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin hinzugefügt und die Mischung wurde unter Rühren bei 40°C für 3 Stunden in einem Strom von Stickstoff reagieren gelassen, wobei der pH auf 8,7 durch 6 N Natriumhydroxid eingestellt wurde. Nach Beenden der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zentrifugiert und der Überstand wurde einer colorimetrischen Bestimmung von D-N-Carbamoyl-(p-hydroxyphenyl)glycin unterworfen durch Farbentwicklung mit einer 10% Lösung von p-Dimethylaminobenzaldehyd in konzentrierter Salzsäure. Im Ergebnis wurde D-N-Carbamoyl-(p- hydroxyphenyl)glycin mit einer Umwandlungsausbeute von 97,5% produziert.
Die Reaktionsmischung wurde auf pH 5 mit Salzsäure eingestellt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand konzentriert, mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2 eingestellt und bei 4°C gelagert. Die präzipitierten Kristalle wurden abgefiltert und aus Wasser-Ethanol rekristallisiert, um 970 mg D-N-Carbamoyl-(p-hydroxyphenyl)glycin, m. p. 176–177°C, [α]_D ²⁰ = –177,0°C (c = 0,5, 5% Ethanol), zu erhalten.
REFERENZBEISPIEL 8
Herstellung immobilisierter Hydantoinase
Mikrobielle Zellen wurden aus 1 l einer Kulturlösung von Escherichia coli HB101pTH104 gesammelt, welche erhalten wurde in derselben Weise, wie in Referenzbeispiel 6 beschrieben, in wässriger 1 mM Mangangsulfatlösung suspendiert, um ein Volumen von 60 ml zu ergeben, auf einen pH von 8,5 eingestellt und durch Ultraschall aufgeschlossen. Zu der so erhaltenen Enzymlösung wurden 20 g eines Anionenaustauschharzes, Duolite A-568, äquilibriert auf pH 8,5, hinzugefügt, und die Mischung wurde bei 15°C für 20 Stunden gerührt, um das Enzym zu absorbieren. Zu dieser Mischung wurde Glutaraldehyd hinzugefügt, so dass die Endkonzentration davon 0,1% war und die Mischung wurde für 1 Stunde gerührt, um die Quervernetzungsreaktion zu bewirken. Dann wurde das Harz gesammelt und gewaschen, um 20 g einer immobilisierten Hydantoinase zu erhalten.
REFERENZBEISPIEL 9
Umwandlung von 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin in D-Carbamoyl-(p-hydroxyphenyl)glycin durch immobilisiertes Enzym
5 g der immobilisierten Hydantoinase, die in Referenzbeispiel 8 erhalten wurde, wurde zu 100 ml einer wässrigen 1 mM Mangansulfatlösung bei 40°C hinzugefügt, welche von Stickstoff durchströmt wurde. Hierzu wurden 3 g 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin hinzugefügt und die Reaktion wurde unter Rühren bei 40°C für 3 Stunden und Durchströmen mit Stickstoff durchgeführt. Nach Fertigstellen der Reaktion wurde die Reaktionsmischung stehen gelassen und abgesaugt, um die Reaktionsmischung zu erhalten. In derselben Weise, wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde das Carbamoylaminosäureprodukt gereinigt, um 2,2 g D-N-Carbamoyl-(p-hydroxyphenyl)glycin zu erhalten.
REFERENZBEISPIEL 10
Expression von Bacillus sp. KNK245 Hydantoinasegen in Bacillus subtilis
In derselben Weise, wie in Referenzbeispiel 4 beschrieben, wurde PCR ausgeführt unter Verwendung genomischer DNA von Bacillus sp. KNK245 als Template und unter Verwendung von den Primern 12 und 13 (Tabelle 1), um ein 1,7 kb Fragment zu erhalten. Dieses wurde mit BamHI und HindIII geschnitten und in das Plasmid pHY300PLK (Takara Shuzo) ligiert, welches in einer ähnlichen Weise geschnitten worden war, um das Plasmid pTHB301 zu erhalten. Seine Restriktionsenzymkarte wird in 6 gezeigt.
Dieses Plasmid pTHB301 wurde in Bacillus subtilis ISW1214 (erhältlich von Takara Shuzo), Bacillis subtilis YS-11 (IAM12019) oder Bacillus subtilis 3115 (IAM12020) durch Elektroporation (unter Verwendung des Shimadzu Corporation GTE-10 Modells, 10 KV/cm, 2 ms) eingeführt, und in dem Kulturmedium, welches in Beispiel 3 gezeigt wurde, zu welchem 0,02 g/l Manganchloridtetrahydrat hinzugefügt worden waren, bei 37°C für 20 Stunden kultiviert. Ein zellfreies Extrakt wurde durch Sammeln der mikrobiellen Zellen und Zerstören durch Ultrabeschallung hergestellt. Im Ergebnis war die jeweilige Hydantoinaseaktivität etwa 2,2-fach höher als jene, die durch Kultivierung von Bacillus sp. KNK245 unter den gleichen Bedingungen erhalten wurde.
REFERENZBEISPIEL 11
Expression von Bacillus sp. KNK245 Hydantoinasegen in Thermophilen
Bacillus stearothermophilus IFO12550 wurde mit dem Plasmid pTHB301, welches in Referenzbeispiel 10 hergestellt worden war, durch die Protoplasten-Methode gemäße J. Bacteriol., 149, 824 (1982) transformiert und kultiviert in derselben Weise, wie in Beispiel 11 beschrieben, um ein zellfreies Extrakt herzustellen. Die Hydantoinase-Aktivität war etwa 3,6-fach höher als jene von Bacillus sp. KNK245, welches unter den gleichen Bedingungen hergestellt worden war.
Wie voranstehend beschrieben, kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein Mikroorganismus mit sehr hoher Hydantoinase-Aktivität hergestellt werden und unter Verwendung desselben als Enzymquelle, können D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren effizient produziert werden.
HINTERLEGUNG DER MICROORGANISMEN:
Agrobacterium sp. KNK712 ist hinterlegt worden am 31. Mai 1988 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-1900, Pseudomonas sp. KNK003A (nicht Teil der Erfindung) ist am 1. Dezember 1990 hinterlegt worden unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-3181, Bacillus sp. KNK245 (nicht Teil der Erfindung) ist am 2. November 1994 hinterlegt worden unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4863 und Escherichia coli HB101pAH1043 ist am 2. November 1994 hinterlegt worden unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4865 bei der folgenden Hinterlegungsstelle gemäß dem Budapester Vertrag.
Name: National Institute of Bioscience and Human-Technology (früher Fermentation Research Institute), Agency of Industrial Science & Technology, Ministery of International Trade & Industry
Adresse: 1–3, Higashi 1 chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japan SEQUENZLISTE

Claims

Mikroorganismen-Transformante, umfassend eine rekombinante DNA eines DNA-Fragments, das ein Gen enthält, welches für ein Enzym codiert, welches 5-substituierte Hydantoine in die entsprechenden D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren durch asymmetrische Hydrolysespaltung umwandelt (nachfolgend bezeichnet als Hydantoinase), welche aus Agrobacterium sp. KNK712 stammt, hinterlegt als FERM BP-1900, und eine Vektor-DNA.
Mikroorganismen-Transformante gemäß Anspruch 1, wobei der Wirtsmikroorganismus ausgewählt ist aus einem Mikroorganismus, der zum Genus Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Agrobacterium, Corynebacterium oder Brevibacterium gehört.
Mikroorganismen-Transformante gemäß Anspruch 2, wobei die Mikroorganismen-Transformante Escherichia coli HB101 pAH1043 ist, hinterlegt als FERM BP-4865.
Verfahren zum Herstellen eines Enzyms, das 5-substituierte Hydantoine in die entsprechenden D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren durch asymmetrische Hydrolysespaltung davon umwandelt, welches die Verwendung der Mikroorganismen-Transformante gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.
Verfahren zum Herstellen von D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren, welches die Verwendung des Enzyms umfaßt, welches in einem Verfahren gemäß Anspruch 4 gewonnen wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das 5-substituierte Hydantoin eine Verbindung ist, die durch die allgemeine Formel (1) dargestellt wird:
worin R Phenyl ist, Phenyl, welches mit Hydroxy substituiert ist, Alkyl, substituiertes Alkyl, Aralkyl oder Thienyl.
Rekombinantes Plasmid, das durch eine Rekombination eines DNA-Fragments, welches für eine Hydantoinase codiert, die aus Agrobacterium sp. KNK712, hinterlegt als FERM BP-1900, und dem Plasmid pUC18 gewonnen wird, und die Restriktionsenzymkarte in 1 hat.
Gen für ein Protein, welches die enzymatische Aktivität zur Umwandlung von 5-substituierten Hydantoinen in die entsprechenden D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren durch asymmetrische Hydrolysespaltung davon besitzt, wobei das Gen eine Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID No. 2 gezeigt ist.
DNA-Fragment, welches ein Gen für ein Protein enthält, das die enzymatische Aktivität zur Umwandlung von 5-substituierten Hydantoinen in entsprechende D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren durch asymmetrische Hydrolysespaltung davon hat, wobei das Gen die Nukleotidsequenz von Nukleotidposition 160 bis Position 1533 hat, welche in SEQ ID No. 1 gezeigt ist, oder eine Aminosäuresequenz codiert, die der Nukleotidsequenz von Nukleotidposition 160 bis Position 1533 entspricht, die in SEQ ID No. 1 gezeigt ist.
Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz enthält, die in SEQ ID No. 2 gezeigt ist, und die enzymatische Aktivität zur Umwandlung von 5-substituierten Hydantoinen in entsprechende D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren durch asymmetrische Hydrolysespaltung davon hat.