DE69030768T2

DE69030768T2 - Rekombinante dna-methode und vektoren, die dafür benutzt werden

Info

Publication number: DE69030768T2
Application number: DE69030768T
Authority: DE
Inventors: Christopher Bebbington; Geoffrey Yarranton
Original assignee: Alusuisse Holdings AG
Current assignee: Lonza Group AG
Priority date: 1989-10-25
Filing date: 1990-10-25
Publication date: 1997-10-16
Anticipated expiration: 2010-10-26
Also published as: ES2104616T3; WO1991006657A1; AU6629990A; GR3023510T3; ATE153383T1; GB8924021D0; JPH05504050A; EP0491875A1; CA2071543C; DK0491875T3; DE69030768D1; JP3073009B2; EP0491875B1; CA2071543A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer eukaryotischen Zelle, die mehrfache Kopien eines Glutamin-Synthetase- (GS) -Gens enthält. Vorzugsweise enthält die so hergestellte Zelle auch mehrfache Kopien eines heterologen Gens.
Unter "Gen" werden eine oder mehrere DNA-Sequenzen verstanden, die die für ein gewünschtens Protein codierenden Abschnitte und alle notwendigen Stromaufwärts- und Stromabwärts-Sequenzen enthalten, um zu ermöglichen, daß das Protein in einer Wirtszelle exprimiert wird. Unter "heterologem Gen" wird ein Gen verstanden, welches für ein normalerweise von der Wirtszelle, in welche es eingesetzt ist, nicht synthetisiertes Protein codiert. Im allgemeinen wird ein heterologes Gen in die Wirtszell-Linie durch Transformation mit einem oder mehreren Vektoren, in welche das heterologe Gen geklont worden war, eingesetzt. Die Vektoren können zum Beispiel virale oder Plasmid- Vektoren sein.
Die Fähigkeit von geklonten heterologen Genen, ihre Funktion zu erfüllen, wenn sie in eine Wirtszelle eingesetzt werden, erwies sich bei Untersuchungen der Gen- Expression als unschätzbar. Es wurde dadurch auch ein Mittel zur Verfügung gestellt, große Mengen von Polypeptiden zu gewinnen, die sonst selten auftreten oder die völlig neue Produkte der Genmanipulation darstellen. Vorteilhaft ist es, solche Polypeptide aus einer Säugetierzelle zu gewinnen, da Polypeptide, die in einer solchen Zelle produziert werden, im allgemeinen korrekt gefaltet, in geeigneter Weise modifiziert und vollständig funktionell sind, was oft in deutlichem Gegensatz zu jenen Polypeptiden steht, die in einer Bakterienzelle exprimiert wurden.
Wo große Produktmengen gefordert werden, ist es notwendig, Zellklone zu identifizieren, in welchen die Vektorsequenzen während der Zellvermehrung beibehalten werden. Eine solche stabile Aufrechterhaltung des Vektors kann entweder durch Verwendung eines viralen Replikons oder als eine Konsequenz der Integration des Vektors in die Wirtszellen-DNA erreicht werden.
Wo der Vektor in die DNA der Wirtszelle integriert worden ist, kann die Kopienzahl der Vektor-DNA und gleichzeitig die Menge des Polypeptids, die exprimiert werden könnte, durch Selektion jener Zellen gesteigert werden, in welchen die Vektorsequenzen nach der Integration in die DNA der Wirtszelle amplifiziert wurden.
Ein bekanntes Verfahren zur Durchführung eines solchen Selektionsverfahrens ist die Transformierung einer Wirtszelle mit einem Vektor, der ein Gen umfaßt, welches für ein Enzym codiert, das von einem bekannten Wirkstoff inhibiert wird. Der Vektor kann auch ein heterologes Gen enthalten. Andererseits kann die Wirtszelle mit einem zweiten Vektor, der das heterologe Gen enthält, co-transformiert werden.
Die transformierte oder co-transformierte Wirtszelle wird dann in steigenden Konzentrationen des bekannten Wirkstoffs gezüchtet, wodurch Wirkstoff-resistente Zellen selektiert werden. Es hat sich gezeigt, daß ein gemeinsamer Mechanismus, der zum Auftreten von mutanten Zellen führt, die in den ansteigenden Konzentrationen des andernfalls toxischen Wirkstoff überleben können, die Überproduktion des Enzyms ist, welches durch den Wirkstoff inhibiert wird. Diese resultiert sehr häufig aus gesteigerten Mengen seiner speziellen mRNA, welche ihrerseits häufig durch Amplifizierung von Vektor-DNA und somit der Gen-Kopienzahl verursacht werden.
Es wurde gefunden, daß in dem Fall, wo Wirkstoffresistenz durch eine Steigerung der Kopienzahl des für das inhibierbare Enzym codierenden Gens verursacht ist, auch eine gleichzeitige Steigerung der Kopienzahl des heterologen Gens in der DNA der Wirtszelle auftritt. Somit findet hier auch ein gesteigertes Produktionsniveau des gewünschten Polypeptids statt.
Das für eine solche Co-Amplifizierung am häufigsten verwendete System benützt Dihydrofolat-Reductase (DHFR) als das Enzym, das inhibiert werden kann. Dieses kann durch den Wirkstoff Methotrexat (MTX) inhibiert werden. Um Go-Amplifizierung zu erreichen, wird eine Wirtszelle, der ein aktives DHFR-Gen fehlt, entweder mit einem Vektor transformiert, der ein DHFR-Gen und ein heterologes Gen enthält, oder sie wird co-transformiert mit einem Vektor, der ein DHFR-Gen enthält, und mit einem Vektor, der ein heterologes Gen enthält. Die tranformierte oder co-transformierte Wirtszelle wird in einem Medium gezüchtet, das steigende Mengen von MTX enthält, und jene Zellen, die dort überleben, werden ausgewählt.
Ein anderes System, das in [1] beschrieben ist und Co-Amplifizierung bewirkt, verwendet GS als das inhibierbare Enzym und Methionin-Sulphoximin (Msx) (unter anderem) als den Inhibitor. Es wird in [1] vorgeschlagen, daß das GS-Gen einen regulierbaren Promotor enthalten sollte, welcher während der Selektion und Amplifizierung eingeschaltet und anschließend herunterreguliert wird. (In dieser Beschreibung beziehen sich die Zahlen in den eckigen Klammem auf Dokumente des Stands der Technik. Sie sind in numerischer Reihenfolge am Ende der Beschreibung aufgelistet.)
Ein anderes System zur Erreichung von Gen-Amplifizierung ist in [2] geoffenbart, wo verbesserte Mittel zur Erzielung einer erhöhten Produktion von Proteinen angegeben sind, welche von Strukturgenen codiert werden, die in einem zufälligen Wirt von Interesse sind. Die Offenbarung in [2] basiert auf der Transfektion des Wirts mit einem Expressionsvektor, der ein amplifizierbares Gen vom Wild-Typ und ein vorherbestimmtes Strukturgen enthält. Der Wirt wird in der Regel nicht durch das amplifizierbare Gen-Produkt komplementiert. Gewünschtenfalls kann ein anderer Selektionsmarker zur Auswahl einer gewünschten Population von Zellen vor der Amplifizierung verwendet werden.
Vor einigen Jahren beschrieben Roberts und Axel [3] Versuche, bei welchen aprt&supmin; tk&supmin; L Zellen mit einem Plasmid tranformiert wurden, welches ein aprt-Gen vom Wild-Typ und ein verkürztes promotorloses tk-Gen enthielt. Die anfänglichen Transformanten, die eine einzige Kopie dieses Plasmids integrierten, zeigten den aprt&spplus; Phenotyp, blieben jedoch tk&supmin;. In der Folge zeigten sich tk&spplus; Varianten, die aus einer 20- bis 50-fachen Amplifizierung des mit Linkem gebundenen Plasmids und der flankierenden DNA-Sequenzen resultierten, wobei voraussichtlich zufällige Gen-Umordnungen stattfanden, die das promotorlose tk-Gen aktivierten. Ähnlich wie bei gängigen Go-Amplifizierungssystemen wurden die in [3] beschriebenen Versuche unter Verwendung von Wirtszellen durchgeführt, welchen die Gene zur Codierung der aprt- und tk-Enzyme fehlen. Es sind relativ wenige solche Zell-Linien verfügbar.
Die derzeit verfügbaren Co-Amplifizierungssysteme leiden an manchen Nachteilen. Zum Beispiel ist es im allgemeinen notwendig, eine Wirtszelle zu verwenden, der ein aktives Gen, das für das inhibierbare Enzym codiert, fehlt. Dadurch wird die Anzahl der Zell-Linien, die mit einem beliebigen speziellen Co-Amplifizierungssystem verwendet werden können, eingeschränkt. Zum Beispiel sind DHFR-defiziente Mutanten nur für Chinesische Hamster-Ovarien (CHO) Zell-Linien verfügbar. Auch verwenden alle bekannten Systeme einen toxischen Inhibitor; zum Beispiel MTX für DHFR-Systeme und Aminopterin für das in [3] beschriebene Verfahren.
In dieser Hinsicht ist das GS-System insofern brauchbarer, als eine Vielzahl von Zellen des lymphoiden Typs, inklusive Myelom-Zellen, in Medien gezüchtet werden müssen, die Glutamin enthalten, jedoch durch Transfektion eines geklonten GS- Gens in glutaminunabhängiges Wachstum übergeführt werden können. Es wurde auch beobachtet, daß lymphoide Zellen, wie etwa Myelom-Zellen, zu Glutaminunabhängigkeit nur mit sehr niedriger Frequenz spontan mutieren. Somit können lymphoide Zellen, wie etwa Myelom-Zellen, in Selektions- und Amplifizierungsversuchen verwendet werden, bei welchen ein heterologes GS-Gen als der Selektions- und Amplifizierungsmarker verwendet wird. Außerdem sich solche lymphoide Zellen besonders vorteilhaft für die Verwendung in industriellen Produktionsverfahren im Hinblick auf ihre Fähigkeit, in Fermentern gut zu wachsen und sehr effizient solche Produkte, wie etwa Antikörper, auszuscheiden.
In den bisher für das GS-System ebenso wie für andere ähnliche Systeme vorgeschlagenen Selektions- und Amplifizierungsprotokollen ist der Enzym-Inhibitor sowohl während der Selektions- als auch während der Amplifizierungsschritte vorhanden. Es ist allgemein bekannt, daß die meisten der verwendeten Inhibitoren, insbesondere MTX und Msx, toxisch sind. Somit ist es bei der Durchführung der Selektions- und Amplifizierungsschritte notwendig, toxische Reagenzien zu verwenden, wodurch gleichzeitig Gesundheitsrisken auftreten.
Außerdem ist es, sobald die Amplifizierung durchgeführt wurde, im allgemeinen notwendig, den toxischen Inhibitor in dem Züchtungsmedium beizubehalten. Wenn dies nicht erfolgt, geschieht es oft, daß das für das inhibierbare Enzym codierende Gen aus der Zell-DNA deletiert wird. Wenn dies stattfindet, wird das heterologe Gen auch deletiert, wodurch die Wirkungen der Amplifizierung umgekehrt werden. Wenn der toxische Inhibitor in dem Medium beibehalten wird, wird es notwendig sein, das gewünschte Protein, insbesondere wenn es für therapeutische Verwendung gedacht ist, sorgfältig zu reinigen, um zu gewährleisten, daß seine Verwendung kein Risiko darstellt.
Es wäre daher wünschenswert imstande zu sein, ein Verfahren zur Gewinnung einer Zelle zur Verfügung zu stellen, die mehrfache Kopien eines GS-Gens enthält, ohne daß übermäßige oder überhaupt Mengen von toxischen Inhibitoren verwendet werden müssen. Dieses System könnte dann zur Go-Amplifizierung von heterologen Genen verwendet werden.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Gewinnung einer eukaryotischen Zelle zur Verfügung, die in ihrer DNA mehrfache Kopien eines GS-Gens enthält, wobei das Verfahren umfaßt:
Transformierung eines eukaryotischen Glutamin-Auxotrophs mit einem GS-Gen;
Selektion der transformanten Zellen, die das genannte GS-Gen enthalten; und
Züchtung der selektierten transformanten Zellen in einem glutaminfreien Medium oder in einem Medium, in welchem die Glutaminmenge zunehmend verringert wird, in Abwesenheit eines toxischen GS-Inhibitors;
wobei das GS-Gen so beschaffen ist oder die während der Züchtung verwendeten Bedingungen so sind, daß das GS-Gen so schwach transkribiert wird, daß Zellen, in welchen das GS-Gen amplifiziert wurde, selektiert werden.
Schwache Transkription des GS-Gens während der Züchtung kann durch Verwendung eines grundlegend schwachen Promotors mit der GS-Codierungssequenz, in der Regel in Kombination mit einem zusätzlichen selektierbaren Marker zur Selektion hinsichtlich der Transformanten, erreicht werden. Andererseits kann ein regulierbarer Promotor mit einer GS-Codierungssequenz verwendet werden, um eine relativ starke GS- Transkription zur Selektion von Transformanten und eine relativ schwache herunterregulierte Transkription von GS zur Selektion von Zellen, in welchen das GS-Gen amplifiziert wurde, zu bewirken.
Somit wird in einer ersten Ausführungsform des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung einer eukaryotischen Zelle, die mehrfache Kopien eines GS-Gens enthält, zur Verfügung gestellt, welches Verfahren umfaßt:
Transformierung eines eukaryotischen Glutamin-Auxotrophs mit einem GS-Gen, wobei die GS-Godierungssequenz unter der Steuerung eines schwachen Promotors steht, und mit einem Gen für einen selektierbaren Marker;
Selektion der transformanten Zellen durch Verwendung des selektierbaren Markers in einem glutaminhaltigen Medium; und
Züchtung der selektierten transformanten Zellen in einem glutaminfreien Medium oder in einem Medium, in welchem die Glutaminmenge zunehmend verringert wird,
wodurch Zellen selektiert werden, in welchen das GS-Gen amplifiziert wurde.
Das Gen für den selektierbaren Marker kann ein beliebiges bekanntes Marker-Gen sein, wie etwa die neo-, dhfr-, gpt-, hmb- und CAD- Gene. Vorzugsweise ist das selektierbare Marker-Gen das neo-Gen oder ein neo-Gen, dessen bakterielle Promotorsequenz deletiert wurde (hierin als ne bezeichnet), welche beide den transformanten Zellen Widerstandsfähigkeit gegen die Antibiotika Kanamycin, Neomycin und G418 verleihen.
Das GS-Gen und das Gen des selektierbaren Markers sind vorzugsweise auf einem einzigen Vektor, wie etwa einem Plasmid- oder einem viralen Vektor, angeordnet.
Geeignete Promotoren für das GS-Gen sind der SV40 frühe, SV40 späte, der MMLV-LTR, MMT-1 und MMTV-Promotor. Vorzugsweise ist der Promotor der SV40 frühe oder SV40 späte Promotor.
Bei dieser Ausführungsform der Erfindung werden die Transformanten, sobald sie selektiert sind, trotz der Anwesenheit eines exogenen GS-Gens nicht imstande sein, in einem glutaminfreien Medium zu überleben. Da das exogene GS-Gen unter der Steuerung eines schwachen Promotors steht, wird es normalerweise nicht imstande sein, ausreichend GS zu produzieren, um ein Überleben zu erlauben. Somit werden nur variante Zellen, in welchen das GS-Gen amplifiziert wurde, überleben. Es können gelegentlich transformierte Zell-Linien identifiziert werden, die in Abwesenheit von Glutamin als eine Folge entweder der Integration des exogenen GS-Gens in eine besonders aktive Stelle des Genoms oder durch Integration mehrfacher Kopien des exogenen GS-Gens zu wachsen imstande sind. Solche Zell-Linien sind nicht zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet und können durch ihre hohe Frequenz des Überlebens, z.B. nahezu 100%iges Überleben, identifiziert werden, wenn in einem glutaminfreien Medium selektiert wird.
In einer zweiten Ausführungsform des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Gewinnung einer eukaryotischen Zelle zur Verfügung gestellt, die mehrfache Kopien eines GS-Gens enthält, wobei dieses Verfahren umfaßt:
Transformierung eines eukaryotischen Glutamin-Auxotrophs mit einem GS-Gen, wobei die GS-Codierungssequenz unter der Steuerung eines regulierbaren Promotors steht;
Züchtung der transformierten Zellen in einem glutaminhaltigen Medium;
Selektion der transformanten Zellen durch Züchtung der Zellen in einem glutaminfreien Medium unter Bedingungen, die bewirken, daß der Promotor hinaufreguliert wird; und
Züchtung der selektierten transformierten Zellen in einem glutaminfreien Medium unter Bedingungen, die bewirken, daß der Promotor herunterreguliert wird,
wodurch Zellen selektiert werden, in welchen das GS-Gen amplifiziert wurde.
Regulierbare Promotoren sind auf dem Gebiet der rekombinanten DNA- Technologie allgemein bekannt und beliebige dieser bekannten Promotoren können in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Selektion und Regulierung eines geeigneten Promotors wird im allgemeinen eine innerhalb der üblichen Kompetenz von Fachleuten liegende Angelegenheit sein.
Geeignete regulierbare Promotoren für Säugetierzellen sind u.a. solche, die Serum-Antwortelemente (SRE), Interferon-Antwortelemente (IRE), Glucocorticoid-Antwortelemente (GRE), Metall-Antwortelemente (MRE), Retinolsäure-Antwortelemente (RARE), Östrogen-Antwortelemente (OERE) Androgen-Antwortelemente (ARE), Thyroid-Hormon-Antwortelemente (THRE), Phorbolester- (z.B. TPA) Antwortelemente (TRE), aktivierende Transkriptionsfaktor-(ATF)- Bindungsstellen, zyklische-AMP Antwortelemente (CRE), Hitzeschock-Antwortelemente (HSE), Streß- oder Glucose-regulierte Elemente und E. coli. lac Operator-Elemente enthalten.
Ein spezielles Beispiel eines regulierbaren Promotors, der verwendet werden kann, ist ein eukaryotischer Promotor, in welchem die bakteriellen lac Operator-Sequenzen eingesetzt worden sind. Dieser Promotor kann durch Aufnahme von Isopropylthiogalactosid (IPTG) in das Medium hinaufreguliert werden, sofern die Zell-Linie auch mit einem lac Repressor-Gen co-transformiert wird. In diesem Fall wird das Transformationsmedium IPTG enthalten, das Züchtungsmedium jedoch nicht.
Es ist allgemein bekannt, daß regulierbare Promotoren nicht in allen Zell- Typen wirksam regulierbar sind. Somit ist es notwendig, einen Promotor auszuwählen, der für den ausgewählten Zell-Typ geeignet ist. Zum Beispiel können GRE-enthaltende Promotoren in Fibroblasten und davon abgeleiteten Zell-Linien verwendet werden, da diese Zell-Typen glucocorticoide Rezeptoren enthalten. Jedoch sind die GRE-enthaltenden Promotoren in lymphoiden Zellen unzureichend regulierbar, da solchen Zellen die Glucocorticoid-Rezeptoren fehlen. Auch sind Metallothionein enthaltende Promotoren im allgemeinen in lymphoiden Zellen unzureichend regulierbar.
Wenn ein Zell-Typ ausgewählt wird, für welchen kein geeigneter regulierbarer Promotor zur Verfügung steht, ist es möglich, den Zell-Typ so zu transformieren, daß er zur Verwendung mit einem regulierbaren Promotor geeignet gemacht wird. Zum Beispiel kann eine Zell-Linie mit einem Gen, welches für einen Glucocorticoid-Rezeptor codiert, transformiert werden. Diese transformierte Zell-Linie wird dann zur Verwendung mit einem GRE-enthaltenden Promotor zur Lenkung von GS-Expression geeignet sein. Die Entwicklung eines induzierbaren Expressionssystems auf der Basis von GREs und Überexpression des Glucocorticoid-Rezeptors in CHO-Zellen ist in [4] beschrieben. Ein noch besser geeignetes System besteht darin, den Glucocorticoid-Rezeptor von einem GRE-enthaltenden Promotor zu exprimieren. Das kann zu sehr dichter Regulierung des GS-Gens in Medien, denen GRE-induzierende Mittel fehlen, führen.
Diese zweite Ausführungsform der Erfindung ist insofern äquivalent der ersten Ausführungsform, als das GS-Gen mit dem hinaufregulierten Promotor als ein selektierbarer Marker wirkt, der die transformierten Zellen mit der Fähigkeit zum Überleben in glutaminfreiem Medium ausstattet. Sobald der Promotor herunterreguliert wurde, wird in der Regel nicht genug Glutamin produziert werden, um sogar die transformierten Zellen zum Überleben in glutaminfreiem Medium zu befähigen. Es wird notwendig sein, die Transformanten hinsichtlich solcher zu sichten, die in glutaminfreiem Medium nicht wachsen. Solche Zellen können verwendet werden, um seltene Varianten zu selektieren, in welchen das GS-Gen amplifiziert wurde und die imstande sind, in einem glutaminfreien Medium zu überleben.
Vorzugsweise ist der Glutamin-Auxotroph, der transformiert werden soll, ein solcher, der kein aktives oder ausreichend aktives GS-Gen enthält, wie etwa eine lymphoide Zell-Linie. Zusätzlich dazu ist ersichtlich, daß der verwendete Glutamin-Auxotroph eine niedrige Frequenz zur Bildung von glutaminunabhängigen Varianten, z.B. vorzugsweise eine Frequenz von weniger als 1 in 10&sup5;, aufweisen sollte. Lymphoide Zell-Linien inkludieren Myelom- oder Hybridom-Zell-Linien, T-Zellen und immortalisierte T-Zellen. Bevorzugte Zell-Linien sind Myelom-Zell-Linien, vorteilhafterweise von Maus oder Ratte. Besonders bevorzugte Zell-Linien sind die Linien NSO, IR983F und P3-X63.Ag8.653.
Wenn eine solche Zell-Linie verwendet wird, wird jede nicht transformierte Zell-Linie bei der Züchtung in einem Medium, dem das für das Überleben der Zell-Linie essentielle Glutamin fehlt, absterben. Während des Selektionsschritts in der zweiten Ausführungsform der Erfindung wird jede transformierte Zell-Linie, auch wenn sie geringe Kopienzahlen des GS-Gens enthält, wegen der Hinaufregulierung des Promotors imstande sein, ausreichend GS zu produzieren, um zu überleben. Dadurch ist gewährleistet, daß genügend GS von dem GS-Gen exprimiert wird, um die Produktion von genügend Glutamin zu ermöglichen, um das Leben der Zellen in Abwesenheit von Glutamin in dem Medium aufrechtzuerhalten.
Bei dem Amplifizierungsschritt (in der zweiten Ausführungsform, wo der Promotor herunterreguliert sein wird), liegen nur einige wenige Kopien des GS-Gens in einer transformierten Zell-Linie vor und es wird für sie nicht möglich sein, genügend Glutamin aus dem verfügbaren Substrat zu produzieren, um der Zelle das Überleben zu ermöglichen. Wenn jedoch mehrfache Kopien des GS-Gens in der Zell-Linie vorliegen (wie es der Fall sein wird, wenn Amplifizierung stattgefunden hat), werden die mehrfachen GS-Genkopien genügend GS-Expression bewirken, um zu ermöglichen, daß das Substrat in ausreichenden Mengen in Glutamin umgewandelt wird, um der Zell-Linie das Überleben zu ermöglichen.
Vorzugsweise werden die transformierten Zellen, die bei einer Züchtung in einem glutaminfreien Medium überleben und die daher mehrfache Kopien des Vektor GS-Gens enthalten, weiter in einem glutaminfreien Medium, das ein in Glutamin umwandelbares Substrat enthält, gemäß einem GS verwendenden Weg gezüchtet, erforderlichenfalls unter Bedingungen, die bewirken, daß der regulierbare Promotor herunterreguliert wird. Auf diese Weise wird der Selektionsdruck für mehrfache Kopien des GS-Gens aufrechterhalten und es wird daher eine geringere Wahrscheinlichkeit bestehen, daß die überschüssigen Kopien des GS-Gens von der Wirtszellen-DNA eliminiert werden.
Vorteilhafterweise wird das GS-Gensystem gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, um zu ermöglichen, daß ein heterologes Gen mit dem GS-Gen co-amplifiziert wird. Daher ist es bevorzugt, wenn die eukaryotische Zelle entweder mit einem Vektor, der sowohl das GS-Gen als auch ein heterologes Gen enthält, oder mit getrennten Vektoren, die unabhängig voneinander das GS-Gen und das heterologe Gen enthalten, transformiert wird.
Das heterologe Gen kann für ein Einzelketten-Protein codieren (auch wenn ein solches Einzelketten-Protein nach der Expression gespalten werden kann, um ein Mehrfachketten-Protein zu produzieren), wie etwa für den Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA), Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinase (TIMP) oder humanes (oder anderes tierisches) Wachstumshormon (HGH). Andererseits kann das heterologe Gen für ein Mehrfachketten-Protein codieren, dessen Ketten getrennt exprimiert und nach der Expression zusammengebaut werden.
Ein besonders bevorzugtes heterobges Gen codiert für ein Immunglobulin(Ig)-Molekül oder ein Fragment oder Analogon desselben (ein Molekül vom Ig-Typ). Bei einem Ig-Molekül oder einem Molekül des Ig-Typs können die Sequenzen, die für die schweren und leichten Ketten codieren, auf dem gleichen oder auf getrennten Vektoren vorliegen. Das GS-Gen kann auf einem der Vektoren, der die für die schwere oder die leichte Kette codierende Sequenz enthält, vorliegen, wenn diese auf getrennten Vektoren vorliegen, oder es kann auf einem ganz eigenen Vektor vorliegen. Es ist jedoch bevorzugt, wenn sich das GS-Gen und die Sequenzen, die für die schwere bzw. für die leichte Kette des Ig-Moleküls oder des Moleküls vom Ig-Typ codieren, alle auf dem gleichen Vektor befinden.
Vorteilhafterweise sind die Gene der schweren und leichten Kette jeweils unter der Steuerung eines starken Promotors, wie etwa des humanen Cytomegalovirus (hCMV) Promotors, und das GS-Gen ist stromaufwärts von einem der starken Promotoren angeordnet, wobei der andere starke Promotor auf dem Vektor angeordnet ist, um die Expression in der entgegengesetzten Richtung zu dem GS und dem ersten starken Promotor zu lenken. Bei einer anderen Anordnung sind die Gene der schweren und leichten Kette jeweils unter der Steuerung eines starken Promotors und diese beiden starken Promotoren und die assoziierten Gene sind in Tandem-Weise stromabwärts des GS-Gens lokalisiert.
Als eine allgemeine Regel gilt, daß Wirtszellen, die in der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden, in Medien transformiert und gezüchtet werden, die bis zu 4 mM Glutamin und eine Quelle anderer Nährstoffe, Proteine und Anregungsmittel, wie etwa fötales Kalbsserum (FCS), enthalten. Es kann jedes bekannte Medium als die Basis für die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Medien verwendet werden. Es soll jedoch gewährleistet sein, daß beim endgültigen Züchtungsschritt das Medium im wesentlichen glutaminfrei ist.
Außerdem werden die Medien normalerweise Asparagin enthalten müssen. Ein Beispiel eines geeigneten glutaminfreien Mediums ist G-DMEM, das in [5] beschrieben ist.
Somit stellt die Erfindung Verfahren zur Gewinnung von Zellen zur Verfligung, die mehrfache Kopien eines GS-Gens enthalten, ohne daß irgendwelche Mengen von toxischen Inhibitoren verwendet werden müssen. Insbesondere können jedoch mehrfache Kopien des GS-Gens und entsprechende mehrfache Kopien der gewünschten heterologen Gene in der DNA der transformanten Zellen während des Wachstums und der Züchtung aufrechterhalten werden, ohne daß toxische Inhibitoren verwendet werden müssen. Diese Vorgangsweise ist besonders wünschenswert für Produktionsverfahren mit Zellzüchtungen, nicht nur um die bei der Verwendung von toxischen Inhibitoren inherent auftretenden Gefahren zu vermeiden, sondern auch um die sorgfältige Entfernung des Inhibitors bei der Reinigung des gewünschten Proteins nicht vornehmen zu müssen.
Dementsprechend wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Aufrechterhaltung von mehrfachen Kopien eines GS-Gens in der DNA von transformanten eukaryotischen Wirtszellen zur Verfügung gestellt, bei welchem die transformanten Zellen in einem Medium gezüchtet werden, in dem kein Glutamin und kein toxischer GS-Enzym-Inhibitor vorliegt, wobei das GS-Gen so beschaffen ist oder die während der Züchtung verwendeten Bedingungen so sind, daß das GS-Gen so schwach transkribiert wird, daß Zellen, die die mehrfachen Kopien des GS-Gens enthalten, gegenüber Zellen selektiert werden, in welchen Kopien des GS-Gens aus der DNA der Wirtszelle eliminiert worden sind.
Vorzugsweise wird die verwendete transformante Zell-Linie nach einem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung hergestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren zur Verwendung in beiden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sowie Wirtszellen, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung transformiert wurden. Insbesondere umfaßt die vorliegende Erfindung Vektoren, die ein GS-Gen enthalten, wobei die GS-Codierungssequenz unter der Steuerung eines eukaryotischen Promotors, der einen flac Operator enthält, oder eines GRE enthaltenden Promotors steht. Vorzugsweise enthalten solche Vektoren auch ein heterologes Gen, am bevorzugtesten eines, das für ein Ig-Molekül oder ein Molekül vom Ig-Typ codiert. Bevorzugte transformierte Zellen sind solche, die aus der Transformation einer Myelom-Zelle mit einem Vektor gemäß obiger Beschreibung stammen.
Die vorliegende Erfindung wird nun in beispielhafter Weise unter Bezugnahme auf die angeschlossene Zeichnung beschrieben, in welcher:
Fig. 1 eine Restriktionskarte des Plasmids pRS3GSne13 zeigt;
Fig. 2 eine Restriktionskarte des Plasmids pRS3GSne18 zeigt;
Fig. 3 eine GS-Transkriptionseinheit zeigt, die von pSV2.GS abgeleitet ist, das in pRS3GSne13, pRS3GSne18 und pST-6 sowie in Plasmid pGSC45 vorliegt, bei welchem das als eine Sonde zur Feststellung der GS-Codierungssequenzen in Southern Blots verwendete Pst1-Fragment angegeben ist; und
Fig. 4 eine Restriktionskarte des Plasmids pEE14ne zeigt.
In Fig. 3 stellen die ausgefüllten Kästchen die SV40-Sequenzen dar und die dünnen Striche bedeuten Hamster GS cDNA-Sequenzen. Die GS-Sequenzen in den beiden Hälften der Figur sind aneinandergereiht.

Plasmid -Konstruktion

Die Plasmide pRS3GSne13 und pRS3GSne18 wurden wie folgt konstruiert. Eine GS Transkriptionseinheit wurde aus dem Plasmid pSV2.GS [6] als ein 2,4 kb PvuII-BamHI-Frament isoliert. Es wurden Bam-HI-Linker an der PvuII-Stelle in dem 2,4 kb Fragment angesetzt und das gebundene Fragment wurde in die einzige BamHI-Stelle in das Plasmid pRSV3, das eine Translrriptionseinheit für Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) enthält, eingesetzt. Dadurch wurde das Plasmid pRS3GS [7] produziert, in welchem die tPA- und GS-Gene in der gleichen Orientierung transkribiert werden. Ein ne-Gen wurde dann als ein 1,5 kb Fragment aus pSV3Bne [7] isoliert und in eine der beiden BamHI-Stellen im Plasmid [RS3GS nach teilweiser Verdauung des Plasmids mit BamHI eingesetzt. Es wurden aus dieser Ligation zwei Plasmide isoliert. Das erste, pRS3GSne13, hatte das ne-Gen stromabwärts des GS-Gens eingesetzt. Das zweite, pRS3GSne18, hatte das ne-Gen zwischen dem tPA-Gen und dem GS-Gen eingesetzt. Die Strukturen dieser beiden Plasmide sind in Fig. 1 gezeigt.
Das Plasmid pRS3GSne18 enthält eine cDNA-Sequenz, die für tPA unter der Steuerung des Promotors aus der langen endständigen Wiederholung des Rous- Sarcom-Virus (RSV-LTR) codiert, einen selektierbaren Marker und ein amplifizierbares Gen. Der Marker ist das ne-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum G418 verleiht. Das amplifizierbare Gen ist das GS-Gen, in welchem die GS-Codierungssequenz unter der Steuerung des SV40-frühen (SV40E) Promotors und der SV40 Spleiß- und Polyadenylierungssignale steht.
Ein anderer Vektor, pEE14ne genannt, der Selektion für GS-Gen-Amplifizierung mit einem toxischen Inhibitor gestattet, wurde konstruiert und ist in Fig. 4 dargestellt. Er enthält ein Derivat des GS-Minigens unter der Steuerung des SV40 späten Promotors von pSVLGS-1 [6] in einem Plasmidvektor pEE6. Auch vorhanden ist die SV40 frühe ne-Transkriptionseinheit, die mit der oben beschriebenen inpRS3GSne13 und pRS3GSne18 identisch ist.
PEE14ne wurde wie folgt konstruiert. Die HindIII-Stelle am 5'-Ende des SV40 Späten Promotors in pSVLGS.1 [6] wurde durch teilweise Verdauung von pSVLGS.1 mit HindIII und Ligation eines Oligonukleotid-HindIII-BamHI-Adapters in eine BamHI-Stelle umgewandelt. Plasmidherstellungen einer Reihe bakterieller Transformanten in kleinem Maßstab wurden hinsichtlich der Umwandlung der geeigneten Stelle gescreent. Das entstehende Plasmid ist pSVLGS.2. Die beiden verbleibenden HindIII-Stellen in dem GS-Minigen wurden dann durch Verdauung von pSVLGS.2 mit HindIII, Isolierung der beiden Fragmente, Auffüllen der kohäsiven Enden mit DNA- Polymerase 1 und Religation zur Schaffung von pSVLGS.3 zerstört. Die EcoRI-Stelle in der GS-Codierungsregion wurde durch stellengelenkte Mutagenese in M13 entfernt, wobei ein T in ein C unter Verwendung des Oligonukleotids
5'-CTATTTGGAACTCCCACTGG-3'
(wobei das unterstrichene Nukleotid an der Stelle der Punktmutation vorliegt) umgewandelt wurde.
Ein Kpn-EcoRV-Fragment, welches die mutierte EcoRI-Stelle von M13 enthielt, wurde dann verwendet, um das entsprechende Kpn-EcoRV-Fragment in pSVLGS.3 zur Schaffung von pSVLGS.4 zu ersetzen. Die verbleibende EcoRI-Stelle am 5'-Ende des GS-Minigens wurde durch Verdauung von pSVLGS.4 mit EcoRI, Auffüllen der Enden mit DNA-Polymerase I und Religation zur Bildung von pSVLGS.5 deletiert. Das 4,8kb BamHI-Fragment von pSVLGS.5, welches die SV40L-GS-Minigen- Transkriptionseinheit enthält, wurde dann an der BglII-Stelle von pEE6hCMV-BglII [5] zur Bildung von pEE14 eingesetzt. Ein ne-Gen unter der Kontrolle des SV40 Frühen Promotors von pSV4Bne wurde eingesetzt, nachdem die 3'-BamHI-Stelle durch Standardverfahren in eine SalI-Stelle zwischen der BamHI- und der SalI-Stelle von pEE14 zur Schaffung von pEE14ne umgewandelt wurde. pGSC45 ist in [8] beschrieben.

Beispiel 1

Das Plasmid pRS3GSne18 wurde in die Maus-Myelom-Zell-Linie NSO durch Elektroporation unter Verwendung eines Biorad "Gen-Pulser" Geräts im wesentlichen nach den Angaben des Herstellers eingeführt. 10&sup7; Zellen wurden zwei Pulsen von 1500 Volt bei 3µF in Anwesenheit von 40 µg ringförmiger Plasmid-DNA unterworfen.
Dann wurden die Zellen mit verschiedenen Dichten auf Gewebskulturplatten mit 96 Vertiefungen in nicht-selektivem Medium (DMEM mit 2 mM Glutamin und 10 % FCS) ausgestrichen. Nach 24 Stunden wurde das Antibiotikum G418 bis zu einer endgültigen Konzentration von 1 mg/ml zugesetzt, um Zellen zu selektieren, welche das ne-Gen exprimieren. 15 Tage später wurden die lebensfähigen Kolonien ausgezählt. Die Transfektionseffizienz betrug etwa 1 Kolonie pro 10&sup4; transfizierte Zellen.
Die Zellen aus 17 Vertiefungen (A1 bis A6, B1 bis B6 und C1 bis C5), die nur eine einzige lebensfähige Kolonie enthielten, wurden dann einzeln in Kultur expandiert und gefrorene Ansätze wurden sichergestellt. Jede dieser 17 G418-resistenten Zell- Linien wurde dann auf die Fähigkeit zum Wachstum ohne Glutamin untersucht, indem die Zellen in den Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen mit einer Dichte von etwa 5 x 10&sup5; Zellen pro Vertiefung in 0,5 ml DMEM + 10 % FCS + 2 mM Glutamin verteilt wurden.
Zu jeder Vertiefung wurde dann 1 ml G-DMEM, ein glutaminfreies DMEM-Medium, das nicht-essenzielle Aminosäuren (inklusive Glutamat und Asparagin) enthielt, zugesetzt. G-DMEM ist in [5] beschrieben. Diese Verfahrensführung erlaubt es, daß die Zellen dem Medium stufenweise das Glutamin entziehen. Anschließend wurden die Zellen in G-DMEM übertragen.
Jede der 17 untersuchten Zell-Linien zeigte extensiven Zelltod innerhalb von 4 bis 5 Tagen bei diesem Selektionsverfahren, was darauf hindeutet, daß in den meisten Zellen das GS-Gen nicht exprimiert wurde oder in jeder Zelle in einem zu geringen Ausmaß exprimiert wurde, um glutaminunabhängiges Wachstum zu erlauben. Trotz dieses deutlichen Zelltodes wurden nach 2 bis 3 Wochen Züchtung in G-DMEM kleine lebensfähige Kolonien in den Kultur-Vertiefungen von fünf der Zell-Linien (Zell-Linien A1, B1, B5, B6 und C3) festgestellt. Die Frequenz, mit welcher solche Kolonien entstanden, variierte je nach der Zell-Linie und betrug zwischen 1 und 20 Kolonien pro 10&sup5; ausgestrichenen Zellen. Im Gegensatz dazu zeigten die Vergleichs-NSO-Zellen, die unter den gleichen Bedingungen ausgestrichen waren, kein glutaminunabhängiges Wachstum. Die fünf Pools von glutaminunabhängigen varianten Zell-Linien wurden erfolgreich in selektivem glutaminfreiem Medium (Q-DMEM) expandiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1
Um zu prüfen, ob die glutaminunabhängigen Varianten, die in mit pRS3GSne13 transfizierten NSO-Zellen entstanden, aus der Vektor-Amplifizierung resultierten, wurde genomische DNA aus drei Zell-Linien (A1, B1 und B6) und aus den entsprechenden Pools der glutaminunabhängigen Varianten (A1-gln, B1-gln und B6-gln) hergestellt. Diese DNA-Proben wurden dazu verwendet, um die Kopienzahl sowohl von Vektor- als auch zellulären GS-Genen durch Southern Blot Analyse wie folgt zu bestimmen. 5 µg der genomischen DNA aus jeder Zell-Linie wurden mit BglI und BglII Restriktionsenzymen verdaut und einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterworfen. Eine Southern Blot von diesem Gel wurde mit einem 0,5 kb PstI-Fragment sondiert, welches die 5'-Region einer aus pGSC45 isolierten Hamster GS cDNA überspannte (vgl. Fig. 3). Das Plasmid pGSC45 ist in [8] beschrieben.
Es wurden auch DNA-Proben von nicht-transfizierten NSO-Zellen und Zellen, die mit dem Vektor pST-6 [5] transfiziert waren, als Vergleiche aufgenommen. Die endogenen zellulären GS-Gene werden als eine Bande von etwa 5 kb und ein Doublett bei etwa 2,8 kb in jeder Spur, die die NSO DNA-Probe enthält, festgestellt. Die DNA aus der Zell-Linie 6A1 [5], die mit dem Vektor pST-6 transfiziert ist, zeigt eine zusätzliche 1,4 kb Bande, die mit der GS-Sonde festgestellt wird. Diese Bande hat die vorhergesagte Größe für ein BglII-Fragment, welches die Vektor GS-DNA enthält (vgl. Fig. 3). Die DNA aus der Zell-Linie 6A1-100-3, einem Klon, der durch Selektion von GS-Amplifizierung aus 6A1 unter Verwendung von 100 µM Msx abgeleitet war (nach der Beschreibung in [5]), zeigt auch die 1,4 kb Vektor-GS-Bande, deren Intensität im Verhältnis zu der DNA aus der Zell-Linie 6A1 angestiegen ist, was darauf hindeutet, daß Vektor-Amplifizierung als ein Resultat der Selektion mit Msx stattgefunden hat. Ein ähnliches Ausmaß der Amplifizierung wird bei der Vektorbande in dem A1-gln Pool im Verhältnis zu der ursprünglichen Zell-Linie A1 beobachtet, was darauf hindeutet, daß wieder Vektor-Amplifizierung selektiert wurde, in diesem Fall jedoch ohne Notwendigkeit von Msx.
Aus einer Reihe anderer Southern Blots wurde die Vektor-Kopienzahl in der Zell-Linie 6A1 auf etwa 1 Kopie/Zelle und in 6A1-100-3 auf etwa 4 Kopien pro Zelle geschätzt. Zum Vergleich ist das Ausmaß der Amplifizierung nach der Selektion von glutaminunabhängigen Varianten von Al das etwa 2- bis 4-Fache. Die Intensität der Banden, die auf die zellulären GS-Gene zurückzuführen ist, ist in jeder Spur die gleiche, was darauf hindeutet, daß keine signifikante Amplifizierung der endogenen Gene stattfindet. Diese Banden dienen daher als ein Vergleich zur Beladung mit ähnlichen Mengen DNA in jeder Spur des Gels.
Die DNAs aus den Zell-Linien B1, B-gln, B6 und B6-gln zeigen die erwarteten vom Vektor stammenden Banden. Es besteht jedoch keine feststellbare Vektor- Amplifizierung in den Pools der glutaminunabhängigen Varianten sowohl von B1 als auch auch von B2, was darauf hindeutet, daß Sichtung durch Southern Blot oder ein äquivalentes Verfahren zur Identifizierung der amplifizierten Zell-Linien hilfreich ist.
Nichtsdestoweniger ist die 2-fache in dem Pool von A1-gln beobachtete Amplifizierung, signifikant, da die Resultate der Mittelwert vieler einzelner Klone in dem Pool sind. Zur Untersuchung, ob einzelne Klone innerhalb des Pools eine höhere Vektor- Kopienzahl hatten, wurde der Pool A1-gln durch begrenzende Verdünnungsklonierung geklont. 10 getrennte glutaminunabhängige Zellklone wurden in Kultur expandiert und die DNA aus diesen Klonen wurde durch Southem Blotting analysiert. Eine Anzahl von Sub-Klonen des A1-gln Pools zeigte eine höhere Vektor-Kopienzahl als der Durchschnitt des Pools. So zeigen die Klone 1, 2, 6 und 8 signifikante Vektor-Amplifizierung und aus Verdünnungen der Vektor-DNA, die auf dem gleichen Gel laufengelassen wurden, wurde die Kopienzahl in den Klonen 1 und 8 auf zwischen 5 und 10 Kopien pro Zelle geschätzt.

Beispiel 2

pEE14ne wurde durch Verdauung mit SalI oder BamHI linearisiert und nach der Beschreibung von Beispiel 1 in NSO-Zellen eingeführt. Es wurden 11 G418-resistente transfektante Linien selektiert, die in Kultur vermehrt und auf glutaminfreies Me- Linien zeigte extensiven Zelltod innerhalb von 4-5 Tagen nach der Zugabe von G-DMEM, was darauf hindeutet, daß die Expression des Vektor-GS-Gens zur Aufrechterhaltung von glutaminunabhängigem Wachstum nicht ausreichte. Nach 2-3 Wochen wurde die Anzahl der glutaminunabhängigen varianten Kolonien, die aus jeder Zell-Linie erwuchsen, bewertet und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2
Zwei Zell-Linien, S-A2 und B-D1, erzeugten glutaminunabhängie Varianten. Somit kann der Vektor pEE14ne auch dazu verwendet werden, seltene Varianten von anfänglichen transfizierten Linien zu bilden, die ohne Glutamin wachsen können. Es ist anzunehmen, daß durch Sichtung von Pools oder Sub-Klonen solcher varianter Linien durch Southem Blot-Analyse Zell-Linien identifiziert werden können, die amplifizierte Kopien des Vektors enthalten. Die Frequenz, mit welcher transfizierte Zell-Linien bei Verwendung von pEE14ne gebildet werden (2 aus 11 Zell-Linien) ist geringer als die Frequenz, die mit pRS3GSne18 erhalten wurde, wie aus Tabelle 1 hervorgeht (5 von 17). Das ist nicht überraschend, weil pEE14ne einen schwächeren Promotor in Verbindung mit der GS-Codierungssequenz verwendet. Nichtsdestoweniger wird gezeigt, daß, solange ein geeignetes Sichtungsprotokoll verwendet wird, es möglich ist, Varianten zu identifizieren, in welchen Amplifizierung stattgefunden hat.
Somit wird angenommen, daß die Verwendung eines Marker-Gens (ne) in Verbindung mit einem GS-Gen, das einen schwachen Promotor enthält, wie etwa den SV40E Promotor, ein neues Verfahren zur Selektion und Amplifizierung in glutaminauxotrophen Zellen ergibt. Dies hat den besonderen Vorteil, daß die Aufrechterhaltung der Amplifizierung nur durch Verwendung eines glutaminfreien Mediums erreicht werden kann, ohne daß toxische selektive Mittel, wie etwa MTX, Aminopterin oder Msx, verwendet werden müssen.

LITERATURSTELLEN

[1] WO-A-87/04462
[2] EP-A-0 319206
[3] Roberts und Axel, Cell, 29, 109-119, 1982.
[4] Israel und Kaufman, Nucleic Acids Research, 17, Nr.12, 4589-4604, 1989.
[5] EP-A-0338841
[6] Bebbington und Hentschel, DNA Cloning, Band III, Kapitel 8, herausgegeben von D.M. Glover, 1987.
[7] EP-A-0216846
[8] Hayward et al., Nucleic Acids Research, 14, 999-1008, 1986.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung einer eukaryotischen Zelle, die mehrfache Kopien eines GS-Gens enthält, welches Verfahren umfaßt:

Transformierung eines eukaryotischen Glutamin-Auxotrophs mit einem GS-Gen;

Selektion der transformanten Zellen, die das GS-Gen enthalten;

Züchtung der selektierten transformanten Zellen in einem Medium ohne Glutamin oder in einem Medium, in welchem die Glutaminmenge progressiv verringert wird, in Abwesenheit eines toxischen GS-Inhibitors,

wobei das GS-Gen so beschaffen ist oder die während des Züchtungsschrittes eingesetzten Bedingungen so sind, daß das GS-Gen so schwach transkribiert wird, daß die Zellen, in welchen das GS-Gen amplifiziert wurde, bevorzugt gegenüber Zellen überleben, in welchen das GS-Gen nicht amplifiziert wurde.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem:

in dem GS-Gen die GS-Codierungssequenz unter der Steuerung eines schwachen Promotors steht;

der eukaryotische Glutamin-Auxotroph auch mit einem Gen für einen selektierbaren Marker transformiert wird; und

in dem Selektionsschritt die Selektion unter Verwendung des selektierbaren Markers in einem glutaminhaltigen Medium vorgenommen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, in welchem der selektierbare Marker das neo-Gen oder das ne-Gen ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, in welchem das GS-Gen und das Gen für den selektierbaren Marker auf einem einzigen Vektor angeordnet sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, in welchem der Promotor der SV40 frühe oder der SV40 späte Promotor ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem

in dem GS-Gen die GS-Codierungssequenz unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors steht;

im Selektionsschritt die transformierten Zellen in einem glutaminfreien Medium unter Bedingungen gezüchtet werden, die den Promotor dazu veranlassen, hinaufreguliert zu werden; und

im Züchtungsschritt das Medium ein glutaminfreies Medium ist und die Bedingungen so sind, daß der Promotor herunterreguliert wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in welchem der Glutamin-Auxotroph eine lymphoide Zelle ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, in welchem die lymphoide Zelle eine Myelom- oder eine Hybridom-Zell-Linie ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in welchem der Züchtungsschritt in einem asparaginhaltigen Medium durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in welchem der Glutamin-Auxotroph auch mit einem heterologen Gen transformiert wird, wobei die varianten Zell-Linien, die mehrfache Kopien des heterologen Gens enthalten, selektiert werden können.

11. Verfahren zur Aufrechterhaltung mehrfacher Kopien eines GS-Gens in der DNA von transformanten glutaminauxotrophen eukaryotischen Wirtszellen, bei welchem die Züchtung der transformanten Zellen in einem Medium erfolgt, in dem kein Glutamin und toxischer GS-Enzyminhibitor enthalten sind, wobei das GS-Gen so beschaffen ist oder die während der Züchtung eingesetzten Bedingungen so sind, daß das GS-Gen so schwach transkribiert wird, daß Zellen, die die mehrfachen Kopien des GS-Gens enthalten, gegenüber Zellen selektiert werden, in welchen Kopien des GS-Gens von der Wirtszellen-DNA eliminiert wurden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, in welchem die transformanten Wirtzellen durch ein Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt werden.