DE69231676T2

DE69231676T2 - Methoden zur selektion von rekombinanten wirtszellen welche hohe mengen von einem gewünschten protein exprimieren

Info

Publication number: DE69231676T2
Application number: DE69231676T
Authority: DE
Inventors: B. Cohen
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1991-03-29
Filing date: 1992-02-20
Publication date: 2001-05-17
Anticipated expiration: 2012-02-21
Also published as: JPH06506356A; AU1580692A; AU660671B2; DK0724639T3; JP3438889B2; EP0724639B1; CA2104598A1; WO1992017566A3; ATE199023T1; GR3035599T3; WO1992017566A2; CA2104598C; EP0724639A1; DE69231676D1; ES2153358T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Entdeckung von Methoden zur Einführung von DNA in lebende Wirtszellen in funktioneller Form lieferte den Schlüssel für das Verständnis vieler grundlegender biologischer Prozesse und ermöglichte die Produktion wichtiger Proteine und anderer Moleküle in kommerziell brauchbaren Mengen.
Trotz des allgemeinen Erfolgs solcher Gentransfer-Methoden gibt es mehrere allgemeine Probleme, welche die Effizienz beschränken können, mit der ein Gen, das für ein gewünschtes Protein kodiert, in eine Wirtszelle eingeführt und darin exprimiert werden kann. Ein Problem ist die Kenntnis, ob das Gen erfolgreich in Empfängerzellen überführt wurde. Ein zweites Problem ist die Unterscheidung zwischen denjenigen Zellen, welche das Gen enthalten, und denjenigen, welche die Übertragungsprozeduren überlebten, jedoch das Gen nicht enthalten. Ein drittes Problem ist die Identifizierung und Isolierung derjenigen Zellen, welche das Gen enthalten und hohe Niveaus des von dem Gen kodierten Proteins exprimieren.
Im allgemeinen neigen die bekannten Verfahren zur Einführung von Genen in eukaryotische Zellen dazu, sehr ineffizient zu sein. Von den Zellen in einer gegebenen Kultur nimmt nur ein kleiner Anteil exogen hinzugefügte DNA auf und exprimiert sie und ein noch kleinerer Anteil behält diese DNA stabil.
Die Identifizierung derjenigen Zellen, welche ein Produktgen, das für einen gewünschtes Protein kodiert, inkorporiert haben, wird typischerweise erzielt durch Einführung eines weiteren Gens, gewöhnlich als selektierbares Gen bezeichnet, welches für ein selektierbares Protein kodiert, in dieselben Zellen. Ein selektierbares Protein ist eines, welches für das Wachstum oder Überleben einer Wirtszelle unter den speziell gewählten Kulturbedingungen erforderlich ist, wie z. B. ein Enzym, das Resistenz gegenüber einem Antibiotikum oder einem anderen Wirkstoff verleiht, oder ein Enzym, welches einen metabolischen oder katabolischen Defekt in der Wirtszelle kompensiert. Beispielsweise umfassen selektierbare Gene, die gewöhnlich bei eukaryotischen Zellen eingesetzt werden, die Gene für Aminoglycosid-Phosphotransferase (APH oder neo), Hygromycin-Phosphotransferase (hyg), Dihydrofolatredukiase (DHFR) und Thymidinkinase (tk).
Das Verfahren zur Identifizierung einer Wirtszelle, welche ein Gen exprimiert hat, auf Basis der Expression eines zweiten inkorporierten Gens, kodierend für ein selektierbares Protein, durch die Wirtszelle wird als Cotransfektion (auch Cotransformation) bezeichnet. Bei diesem Verfahren werden ein Produktgen, das für ein gewünschtes Protein kodiert, und ein selektierbares Gen gleichzeitig in die Wirtszelle eingeführt. Das Produktgen und das selektierbare Gen können auf einem einzigen DNA-Molekül oder auf separaten DNA-Molekülen vorliegen, bevor sie in die Wirtszellen eingeführt werden. Wigler et al., Cell 16 : 777 (1979). Zellen, welche das selektierbare Gen inkorporiert haben und exprimieren, werden dann durch Kultivierung unter Bedingungen, welche das Wachstum oder Überleben nur derjenigen Zellen ermöglichen, die das von dem selektierbaren Gen kodierte selektierbare Protelin synthetisieren, identifiziert oder isoliert. Typischerweise ist das Produktgen in vielen der so identifizierten oder isolierten Zellen vorhanden und wird exprimiert.
Das Expressionsniveau eines in eine eukaryotische Wirtszelle eingeführten Gens hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich Kopienzahl des Gens, Effizienz der Transkription, Messenger-RNA (mRNA)-Prozessierung, Stabilität und Translationseffizienz. Dementsprechend wird eine Expression eines gewünschten Proteins auf hohem Niveau typischerweise die Optimierung eines oder mehrerer dieser Faktoren beinhalten.
Beispielsweise kann das Niveau der Proteinproduktion erhöht werden durch kovalente Verknüpfung der kodierenden Sequenz des Gens mit einem "starken" Promotor oder Enhancer, der hohe Transkriptionsniveaus ergeben wird. Promotoren und Enhancer sind Nukleotidsequenzen, welche spezifisch mit Proteinen in einer Wirtszelle wechselwirken, die an der Transkription beteiligt sind. Kriegler, Meth. Enzymol. 185 : 512 (1990); Maniatis et al., Science 236 : 1237 (1987). Promotoren sind Nukleotidsequenzen, die sich stromaufwärts der kodierenden Sequenz eines Gens befinden und die Transkription des Gens durch RNA-Polymerase erleichtern. Unter den eukaryotischen Promotoren, welche als starke Promotoren für eine Expression auf hohem Niveau identifiziert wurden, sind der frühe SV40-Promotor, der späte Adenovirus-Hauptpromotor, Maus-Metallothionein-I-Promotor, das lange terminale Repeat des Rous-Sarkom-Virus und der "immediateearly" Hauptpromotor des Human-Zytomegalovirus (CMV).
Enhancer stimulieren die Transkription von einem verknüpften Promotor. Im Gegensatz zu Promotoren sind Enhancer aktiv, wenn sie sich stromabwärts der Transkriptionsinitiationsstelle oder in beträchtlichen Entfernungen von dem Promotor befinden, obwohl sich in der Praxis Enhancer physisch und funktionell mit Promotoren überlappen können. Beispielsweise enthalten alle die oben aufgeführten starken Promotoren auch starke Enhancer. Bendig, Genetic Engineering 7 : 91 (Academic Press, 1988).
Das Niveau der Proteinproduktion kann auch erhöht werden durch Erhöhung der Gen-Kopienzahl in der Wirtszelle. Ein Verfahren zum Erhalt einer hohen Gen- Kopienzahl ist die direkte Einführung von mehrfachen Kopien des Gens in die Wirtszelle, beispielsweise durch Verwendung eines großen molaren Überschusses des Produktgens, bezogen auf das selektierbare Gen, während der Cotransfektion. Kaufman, Meth. Enzymol. 185 : 537 (1990). Bei diesem Verfahren wird jedoch nur ein kleiner Anteil der cotransfizierten Zellen das Produktgen in einer hohen Kopienzahl enthalten und nachdem keine allgemein anwendbare bequeme Methode existiert, um solche Zellen von der Mehrheit der Zellen zu unterscheiden, welche weniger Kopien des Produktgens enthalten, sind typischerweise aufwendige und zeitraubende Screening-Methoden erforderlich, um die gewünschten Transformanten mit hoher Kopienzahl zu identifizieren.
Ein weiteres Verfahren zum Erhalt einer hohen Gen-Kopienzahl beinhaltet die Klonierung des Gens in einen Vektor, welcher zur autonomen Replikation in der Wirtszelle in der Lage ist. Beispiele solcher Vektoren umfassen Säuger-Expressionsvektoren, die vom Epstein-Barr-Virus oder Rinderpapillomavirus abgeleitet sind, und Hefe-2-Mikron-Plasmidvektoren. Stephens & Hentschel, Biochem. J. 248 : 1 (1987); Yates et al., Nature 313 : 812 (1985); Beggs, Genetic Enaineering 2 : 175 (Academic Press, 1981). Die Anwendbarkeit dieser Methode ist jedoch beschränkt, da eine unkontrollierte Replikation solcher Vektoren mit der Lebensfähigkeit der Zellen nicht verträglich ist und eine kontrollierte Replikation die Kopienzahl des Vektors beschränkt. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß eine autonome Replikation die Genexpression stört, wahrscheinlich auf der Ebene der Transkription. Lebkowski et al., Nature 317 : 169 (1985).
Ein noch weiteres Verfahren zum Erhalt einer hohen Gen-Kopienzahl beinhaltet die Genamplifizierung in der Wirtszelle. Genamplifizierung findet in eukaryotischen Zellen natürlicherweise mit einer relativ niedrigen Frequenz statt. Schimke, J. Biol. Chem. 263 : 5989 (1988). Eine Genamplifizierung kann jedoch auch induziert werden oder es kann zumindest diesbezüglich selektioniert werden, indem Wirtszellen einem geeigneten Selektionsdruck ausgesetzt werden. Beispielsweise ist es in vielen Fällen möglich, ein Produktgen zusammen mit einem selektierbaren und amplifizierbaren Markergen in eine Wirtszelle einzuführen und anschließend hinsichtlich Amplifizierung des Markergens zu selektionieren, indem die cotransfizierten Zellen allmählich steigenden Konzentrationen eines Selektionsmittels ausgesetzt werden. Typischerweise wird das Produktgen unter solchen Bedingungen mit dem Markergen gemeinsam amplifiziert werden.
Das am umfangreichsten eingesetzte selektierbare und amplifizierbare Markergen für diesen Zweck ist ein DHFR-Gen. Das Selektionsmittel, welches in Verbindung mit einem DHFR-Gen eingesetzt wird, ist Methotrexat (Mtx). Eine Wirtszelle wird mit einem Produktgen, das für ein gewünschtes Protein kodiert, und einem DHFR-Gen cotransfiziert und Transfektanten werden identifiziert, indem die Zellen zunächst in Kulturmedium gezüchtet werden, welches Mtx enthält. Eine geeignete Wirtszelle bei Verwendung eines Wildtyp-DHFR-Gens ist die Eierstock- Zellinie des Chinesischen Hamsters (CHO), der die DHFR-Aktivität fehlt, hergestellt und vermehrt wie von Urlaub & Chasin, Proc. Nat. Acad. Sci. 77 : 4216 (1980), beschrieben. Die Transfektanten-Zellen werden dann allmählich steigenden Mengen an Mtx ausgesetzt. Dies führt zur Synthese von mehrfachen Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig mehrfachen Kopien des Produktgens. Schimke, J. Biol. Chem. 263: 5989 (1988); Axel et al., US-Patent Nr. 4399216; Axel et al., US-Patent Nr. 4634665.
Zur Erweiterung des DHFR-Amplifizierungsverfahrens auf andere Zelltypen kann ein Mutanten-DHFR-Gen, welches für ein Protein mit verringerter Sensitivität für Methotrexat kodiert, in Verbindung mit Wirtszellen eingesetzt werden, welche normale Anzahlen eines endogenen Wildtyp-DHFR-Gens enthalten. Simonsen & Levinson, Proc. Nat. Acad. Sci. 80 : 2495 (1983). Alternativ können Wirtszellen mit dem Produktgen, einem DHFR-Gen und einem dominanten selektierbaren Gen, wie z. B. einem neo~-Gen, cotransfiziert werden. Kim & Wold, Cell 42 : 129 (1985). Transfektanten werden identifiziert, indem die Zellen zuerst in Kulturmedium, das Neomycin (oder den verwandten Wirkstoff G418) enthält, kultiviert werden und die so identifizierten Transfektanten dann hinsichtlich Amplifizierung des DHFR-Gens und des Produktgens durch Exposition gegenüber allmählich steigenden Mengen an Mtx selektioniert werden.
Wie aus dieser Erörterung ersichtlich sein wird, ist die Selektion von rekombinanten Wirtszellen, welche hohe Niveaus eines gewünschten Proteins exprimieren, im allgemeinen ein mehrstufiges Verfahren. Im ersten Schritt werden anfängliche Transfektanten selektioniert, welche das Produktgen und das Selektionsgen inkorporiert haben. In nachfolgenden Schritten werden die anfänglichen Transfektanten einer weiteren Selektion auf Expression des selektierbaren Gens auf hohem Niveau und dann einem statistischen Screening hinsichtlich Expression des Produktgens auf hohem Niveau unterworfen. Zur Identifizierung von Zellen, welche hohe Niveaus des gewünschten Proteins exprimieren, ist es typischerweise erforderlich, große Anzahlen von Transfektanten zu screenen. Die Mehrheit der Transfektanten produziert weniger als maximale Niveaus des gewünschten Proteins.
Zur direkten Selektionierung solcher rekombinanter Wirtszellen in einem einzigen Schritt wurden mehrere Verfahren beschrieben. Beispielsweise beinhaltet eine Strategie die Cotransfektion von Wirtszellen mit einem Produktgen und einem DHFR-Gen und die Auswahl derjenigen Zellen, welche hohe Niveaus an DHFR exprimieren, durch direkte Kultivierung in einem Medium, das eine hohe Konzentration an Mtx enthält. Viele der auf diese Weise selektionierten Zellen exprimieren auch das cotransfizierte Produktgen in hohen Niveaus. Page & Sydenham, Bio/Technology 9 : 64 (1991). Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Verwendung von Expressionsvektoren polycistronischer mRNA, enthaltend ein Produktgen am 5'-Ende des transkribierten Bereichs und ein selektierbares Gen am 3'-Ende. Da die Translation des selektierbaren Gens am 3'-Ende der polycistronischen mRNA ineffizient ist, zeigen solche Vektoren eine bevorzugte Translation des gewünschten Gens und erfordern hohe Niveaus an polycistronischer mRNA, um die Selektion zu überleben. Kaufman, Meth. Enzymol. 185 : 487 (1990); Kaufman, Meth. Enzymol. 185 : 537 (1990); Kaufman et al., EMBO J. 6 : 187 (1987). Dementsprechend können Zellen, die hohe Niveaus des gewünschten Proteinprodukts exprimieren, in einem einzigen Schritt erhalten werden, indem die anfänglichen Transfektanten in Medium kultiviert werden, welches ein Selektionsmittel enthält, das zur Verwendung mit dem speziellen selektierbaren Gen geeignet ist.
Unglücklicherweise leiden diese bekannten Verfahren zur Einzelschritt- Selektion unter bestimmten Nachteilen, welche deren Brauchbarkeit einschränken. Stark exprimierende Zellen, die durch direkte Kultivierung in Medium, welches ein hohes Niveau an Selektionsmittel enthält, erhalten werden, können schlechte Wachstums- und Stabilitätseigenschaften aufweisen, was somit deren Brauchbarkeit für langfristige Produktionsprozesse einschränkt. Page & Snyderman, Bio/Technology 9 : 64 (1991). Die Einzelschritt-Selektion hinsichtlich hoher Resistenz gegenüber Mtx kann Zellen mit einem veränderten, Mtx-resistenten DHFR-Enzym ergeben oder Zellen, welche veränderte Mtx-Transporteigenschaften aufweisen, anstelle von Zellen, die amplifizierte Gene enthalten. Haber et al., J. Biol. Chem. 256 : 9501 (1981); Assaraf & Schimke, Proc. Nat. Acad. Sci. 84 : 7154 (1987). Bei polycistronischen Vektoren gibt es eine starke Selektion hinsichtlich Deletion oder Umlagerung des 5'-gelegenen Produktgens, wenn hinsichtlich der Expression des 3'-gelegenen selektierbaren Gens selektionient wird. Zellen, die Vektoren mit solchen Mutationen in dem 5'-Produktgen beherbergen, neigen dazu, andere Zellen in der Population zu überwuchern und somit die Selektion von Zellen zu stören, welche tatsächlich hohe Niveaus des gewünschten Proteins exprimieren. Kaufman, Meth. Enz. 185 : 537 (1990).
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung eines Verfahrens zum Erhalt einer hohen Expression eines gewünschten Proteinprodukts in rekombinanten Wirtszellen, welches nicht die Exposition der Zellen gegenüber hohen Konzentrationen von Mtx oder einem anderen Selektionsmittel beinhaltet oder die Verwendung von autonom replizierenden Vektoren oder Expressionsvektoren polycistronischer mRNA. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Selektion rekombinanter Wirtszellen, die hohe Niveaus eines gewünschten Proteinprodukts exprimieren, welches Verfahren schnell und bequem durchzuführen ist und nicht das Screening einer großen Anzahl von Zellen erfordert. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens für die Einzelschritt-Selektion von rekombinanten Wirtszellen, welche hohe Niveaus eines gewünschten Proteinprodukts exprimieren.
Die vorliegende Erfindung stellt somit verbesserte Verfahren zur Selektion von rekombinanten Wirtszellen, die hohe Niveaus eines gewünschten Proteins exprimieren, bereit, welche Verfahren sich für eine breite Vielfalt von eukaryotischen Wirtszellen eignen und die Probleme vermeiden, die mit der existierenden Zellselektionstechnologie verbunden sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zur Selektion rekombinanter Wirtszellen, die hohe Niveaus eines gewünschten Proteins exprimieren. Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein selektierbares Ausgangsgen modifiziert, indem in seinen transkribierten Bereich ein Intron solcher Länge eingeführt wird, daß das Intron aus dem entsprechenden mRNA-Vorläufer mit niedriger Effizienz korrekt gespleißt wird. Als Folge davon ist die Menge an selektierbarem Protein, welches von dem Intron-modifizierten selektierbaren Gen produziert wird, wesentlich geringer als diejenige, welche von dem selektierbaren Ausgangsgen produziert wird.
Wirtszellen werden dann mit dem Intron-modifizierten selektierbaren Gen und einem Produktgen, welches für ein gewünschtes Protein kodiert, cotransfiziert. Nach einer solchen Cotransfektion wird beobachtet, daß die meisten der resultierenden Transfektanten als Folge des relativ niedrigen Niveaus an selektierbarem Protein, welches von dem Intron-modifizierten selektierbaren Gen in den Transfektanten produziert wird, nicht in der Lage sind, den selektierbaren Phänotyp zu zeigen, welcher für das selektierbare Protein charakteristisch ist. Überraschenderweise zeigt jedoch ein kleiner Anteil der Transfektanten den selektierbaren Phänotyp und von diesen Transfektanten wird die Mehrheit befunden, hohe Niveaus des gewünschten Proteins, kodiert von dem Produktgen, zu exprimieren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Anzahl der Kolonien von Hygromycin-resistenten (hygr), Neomycin-resistenten (neo) und Hygromycin/Neomycin-resistenten (hygr/neor) Zellen, die nach Cotransfektion von Ras 2.2-Zellen wie in Beispiel 2 beschrieben erhalten wurden. Die Länge des synthetischen Introns, welches innerhalb eines jeden unterschiedlichen Neomycinresistenzgens vorliegt, ist angezeigt. Die Konstruktion von Vektoren, welche die Neomycinresistenzgene enthalten, ist in Beispiel 1 beschrieben.
Fig. 2 zeigt die Niveaus an Humanwachstumshormon (hGH), welche von verschiedenen wirkstoffresistenten Zellkulturen produziert werden. Ras 2.2-Zellen wurden mit den Vektoren wie in Beispiel 2 beschrieben cotransfiziert. Niveaus an hGH (pg/Zelle) im Medium von wirkstoffresistenten Zellenkulturen wurden mittels eines IELISA-Radioimmunoassays bestimmt.
Fig. 3 zeigt die Niveaus an hGH, welche von individuellen Zellklonen produziert wurden, die aus Kulturen von Ras 2.2-Zellen, die mit pRK-hyg, pRSVhGH und entweder pNeol&sub3; G-71 oder pNeol&sub3;GΔS wie in Beispiel 2 beschrieben transfiziert worden waren, erhalten wurden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Allgemein beinhalten die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Cotransfektion einer eukaryotischen Wirtszelle mit einem Produktgen, das für ein gewünschtes Protein kodiert, und mit einem selektierbaren Gen, das ein Intron einschließt, welches Intron das von dem selektierbaren Gen in der Wirtszelle produzierte Niveau an selektierbarem Protein im Vergleich zu dem selektierbaren Gen ohne das Intron verringert.
Introns sind nicht-kodierende Nukleotidsequenzen, normalerweise in vielen eukaryotischen Genen vorkommend, welche aus neu transkribierten mRNA- Vorläufern in einem mehrstufigen Prozeß, der insgesamt als Spleißen bezeichnet wird, entfernt werden.
Man nimmt an, daß ein einziger Mechanismus für das Spleißen von mRNA- Vorläufern in Säuger-, Pflanzen- und Hefezellen verantwortlich ist. Allgemein erfordert der Prozeß des Spleißens, daß die 5'- und 3'-Enden des Introns korrekt gespalten werden und die resultierenden Enden der mRNA präzise verbunden werden, so daß eine reife mRNA mit dem richtigen Leserahmen für Proteinsynthese produziert wird.
Die Positionen, an denen eine Spaltung des Introns stattfindet, werden als Spleißstellen bezeichnet. Durch Vergleich der Nukleotidsequenzen, welche die Spleißstellen in einer großen Anzahl verschiedener Gene umgeben, war es möglich, eine Consensus-Sequenz für die Spleißstelle an jedem Ende eines Introns zu definieren. Die Consensus-Sequenz gibt das am häufigsten gefundene Nukleotid an jeder Position, bezogen auf die Spleißstelle, an. Beispielsweise tritt bei den mRNAs von höheren Eukaryoten die 5'-Spleißstelle innerhalb der Consensus-Sequenz AG:GUAAGU (worin der Doppelpunkt die Stelle der Spaltung und Ligierung bezeichnet) auf und die 3'-Spleißstelle tritt innerhalb der Consensus-Sequenz (U/C)nIVCAG:G auf. Bei den mRNAs von Hefe wird die 5'-Spleißstelle von der Consensus-Sequenz: GUAUGU begrenzt und die 3'-Spleißstelle wird von der Consensus-Sequenz (C/U)AG: begrenzt. Ohshima & Gotoh, J. Mol. Biol. 195 : 247 (1987); Padgett et al., Ann. Rev. Biochem. 55 : 1119 (1986); Mount, Nuc. Acids Res. 10 : 4551 (1982).
Die Analyse einer Vielfalt von natürlich vorkommenden und synthetisch konstruierten Mutantengenen hat gezeigt, daß Nukleotidaustausche an vielen Positionen innerhalb der Consensus-Sequenzen an den 5'- und 3'-Spleißstellen die Wirkung der Verringerung oder Eliminierung der Synthese von reifer mRNA haben. Sharp, Science 235 : 766 (1987); Padgett et al., Ann. Rev. Biochem. 55 : 1119 (1986); Green, Ann. Rev. Genet. 20 : 671 (1986). Mutationsstudien haben auch gezeigt, daß die Spleißstellen beinhaltende RNA-Sekundärstruktur die Effizienz des Spleißens beeinflussen kann. Solnick, Cell 43 : 667 (1985); Konarska et al., Cell 42 : 165 (1985).
Die Länge eines Introns kann ebenfalls die Effizienz des Spleißens beeinflussen. Durch Herstellung von Deletionsmutanten verschiedener Größen im großen Intron des Kaninchen-β-Globin-Gens stellten Wieringa et al. fest, daß die minimal erforderliche Intronlänge für korrektes Spleißen etwa 69 Nukleotide (nt) beträgt. Cell 37 : 915 (1984). Ähnliche Studien des Introns der Adenovirus-EIA-Region haben gezeigt, daß eine Intronlänge von etwa 78 nt das Stattfinden eines korrekten Spleißens erlaubt, jedoch mit verringerter Effizienz. Die Erhöhung der Intronlänge auf 91 nt stellte die normale Spleißeffizienz wieder her, wohingegen eine Verkürzung des Introns auf 63 nt das korrekte Spleißen verhinderte. Ulfendahl et al., Nuc. Acids Res. 13 : 6299 (1985).
Die vorliegende Erfindung stellt in einer ihrer Ausführungsformen ein Verfahren zur Identifizierung oder Isolierung einer rekombinanten Wirtszelle bereit, die hohe Niveaus eines gewünschten Proteins exprimiert, welches Verfahren umfaßt die Schritte der:
(1) Cotransfektion einer eukaryotischen Wirtszelle mit
(a) einem selektierbaren Gen, das modifiziert wurde, um ein Intron zu enthalten, welches in dem natürlich vorkommenden selektierbaren Gen nicht vorhanden ist, wobei das Intron imstande ist, in der Wirtszelle gespleißt zu werden, um mRNA bereitzustellen, die für ein selektierbares Protein kodiert, und wobei die Anwesenheit des Introns in dem selektierbaren Gen das Niveau an selektierbarem Protein, welches von dem selektierbaren Gen in der Wirtszelle produziert wird, verringert, und
(b) einem Gen, das für ein gewünschtes Protein kodiert; und
(2) Kultivierung der resultierenden Transfektanten in Medium, das ein für das selektierbare Gen geeignetes Selektionsmittel enthält:
Die vorliegende Erfindung stellt in einer weiteren ihrer Ausführungsformen ein Verfahren zur Identifizierung oder Isolierung einer rekombinanten Wirtszelle bereit, die hohe Niveaus eines gewünschten Proteins exprimiert, welches Verfahren umfaßt die Schritte der:
(1) Cotransfektion einer eukaryotischen Wirtszelle mit
(a) einem ersten selektierbaren Gen,
(b) einem zweiten selektierbaren Gen, das modifiziert wurde, um ein Intron zu enthalten, welches in dem natürlich vorkommenden selektierbaren Gen nicht vorhanden ist, wobei das Intron imstande ist, in der Wirtszelle gespleißt zu werden, um mRNA bereitzustellen, die für ein selektierbares Protein kodiert, und wobei die Anwesenheit des Introns in dem selektierbaren Gen das Niveau an selektierbarem Protein, welches von dem selektierbaren Gen in der Wirtszelle produziert wird, verringert, und
(c) einem Gen, das für ein gewünschtes Protein kodiert;
(2) Kultivierung der resultierenden Transfektanten in Medium, das ein für das erste selektierbare Gen geeignetes Selektionsmittel enthält; und
(3) Kultivierung der Transfektanten, welche die Selektion von Schritt (2) überleben, in Medium, das ein für das zweite selektierbare Gen geeignetes Selektionsmittel enthält.
Der Begriff "selektierbares Gen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine DNA, die für ein Protein kodiert, welches für das Wachstum oder Überleben einer Wirtszelle unter den speziell gewählten Zellkulturbedingungen erforderlich ist. Dementsprechend wird eine Wirtszelle, die mit einem selektierbaren Gen transformiert ist, imstande sein, unter bestimmten Zellkulturbedingungen zu wachsen oder zu überleben, unter denen eine nicht-transfizierte Wirtszelle nicht zum Wachstum oder Überleben imstande ist. Typischerweise wird ein selektierbares Gen Resistenz gegenüber einem Arzneimittelwirkstoff verleihen oder einen metabolischen oder katabolischen Defekt in der Wirtszelle kompensieren. Beispielsweise umfassen gewöhnlich eingesetzte Selektionsgene die Gene für Aminoglycosid-Phosphotransferase (APH oder neo), Hygromycin-Phosphotransferase (hyg), Dihydrofolatredukiase (DHFR) und Thymidinkinase (tk).
Der Begriff "selektierbares Protein", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Protein, welches von einem selektierbaren Gen kodiert wird. Der Begriff "selektierbarer Phänotyp" bezieht sich auf den Phänotyp, der einer Wirtszelle durch ein selektierbares Gen oder ein selektierbares Protein verliehen wird. Der Begriff "Selektionsmittel" bezieht sich auf eine Substanz, welche das Wachstum oder Überleben einer Wirtszelle stört, der ein spezieller selektierbarer Marker fehlt. Beispielsweise schließen im Falle eines selektierbaren Gens, welches für Aminoglycosid-Phosphotransferase kodiert, geeignete Selektionsmittel Neomycin und G418 ein. Im Falle eines selektierbaren Gens, welches für Hygromycin- Phosphotransferase kodiert, ist ein geeignetes Selektionsmittel Hygromycin.
Der Begriff "Produktgen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine DNA, welche für ein gewünschtes Proteinprodukt kodiert. Jedes Produktgen, welches zur Expression in einer Wirtszelle imstande ist, kann eingesetzt werden, obwohl die Verfahren der Erfindung besonders geeignet sind, um hohe Expressionsniveaus eines Produktgens zu erhalten, welches nicht auch noch ein selektierbares Gen ist. Dementsprechend wird das von einem Produktgen kodierte Protein typischerweise eines sein, welches für das Wachstum oder Überleben einer Wirtszelle unter den speziell gewählten Zellkulturbedingungen nicht erforderlich ist. Beispielsweise können Produktgene für Antikörper, virale Antigene, Interferone oder Wachstumshormone kodieren.
Selektierbare Gene und Produktgene können von genomischer DNA, cDNA, die von zellulärer RNA transkribiert wurde, oder durch in vitro-Synthese erhalten werden. Beispielsweise wird die Isolierung solcher Gene aus genomischer DNA oder cDNA-Banken bequem erzielt durch die Verwendung einer DNA-Hybridisierungssonde, welche mit einer nachweisbaren Gruppierung, z. B. einem Radioisotop, markiert ist und imstande ist, bevorzugt mit einem gewünschten selektierbaren Gen oder Produktgen durch komplementäre Basenpaarung zu hybridisieren. Keller & Manak, DNA Probes, S. 149-213 (1989). Alternativ kann ein gewünschtes selektierbares Gen oder Produktgen erhalten werden durch Anwendung des Polymerasekettenreaktions(PCR)-Verfahrens, um ein solches Gen zu amplifizieren, welches in der Nukleinsäure einer geeigneten viralen, zellulären oder Gewebequelle vorliegt. Vorzugsweise befinden sich das Produktgen und das Intron-modifizierte selektierbare Gen, welches in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, auf separaten DNA-Molekülen, so daß ein großer molarer Überschuß des Produktgens, bezogen auf das Intron-modifizierte selektierbare Gen, zur Cotransfektion eingesetzt werden kann.
Der Begriff "Intron", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die in dem transkribierten Bereich eines Gens oder in einem mRNA- Vorläufer vorliegt, welche Nukleotidsequenz imstande ist, durch eine Wirtszelle vor der Translation aus dem mRNA-Vorläufer ausgeschnitten oder "gespleißt" zu werden. Introns, die sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, können nach irgendeinem von mehreren Verfahren hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, wie z. B. Reinigung aus einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure oder de novo-Synthese. Die in vielen natürlich vorkommenden eukaryotischen Genen vorliegenden Introns wurden identifiziert und charakterisiert. Mount, Nuc. Acids Res. 10 : 459 (1982). Künstliche Introns, die funktionelle Spleißstellen umfassen, wurden ebenfalls beschrieben. Winey et al., Mol. Cell. Biol. 9 : 329 (1989); Gatermann et al., Mol. Cell Bio. 9 : 1526 (1989). Introns können aus natürlich vorkommenden Nukleinsäuren beispielsweise erhalten werden durch Verdauung einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease oder durch PCR-Klonierung unter Verwendung von Primern, die zu Sequenzen an den 5'- und 3'-Enden des Introns komplementär sind. Alternativ können Introns definierter Sequenz und Länge unter Anwendung verschiedener Verfahren der organischen Chemie synthetisch hergestellt werden. Narang et al., Meth. Enzymol. 68 : 90 (1979); Caruthers et al., Meth. Enzymol. 154 : 287 (1985); Froehler et al., Nuc. Acids Res. 14 : 5399 (1986).
Die Begriffe "PCR" und "Polymerasekettenreaktion", wie hier verwendet, beziehen sich auf das im US-Patent Nr. 4,683,195 (erteilt am 28. Juli 1987) beschriebene in vitro-Amplifizierungsverfahren. Allgemein beinhaltet das PCR- Verfahren wiederholte. Zyklen von Primerverlängerungssynthese unter Verwendung von zwei DNA-Primern, welche imstande sind, bevorzugt mit einer Matrizen- Nukleinsäure zu hybridisieren, welche die zu amplifizierende Nukleotidsequenz umfaßt. Das PCR-Verfahren kann eingesetzt werden, um spezifische DNA- Sequenzen aus genomischer Gesamt-DNA, cDNA, die von zellulärer RNA transkribiert wurde, viralen oder Plasmid-DNAs zu klonieren. Wang & Mark, in PCR Protocols, S. 70-75 (Academic Press, 1990); Scharf, in PCR Protocols, S. 84-98; Kawasaki & Wang, in PCR Technology, S. 89-97 (Stockton Press, 1989).
Ein selektierbares Gen kann unter Anwendung irgendeines der verschiedenen bekannten Verfahren zur Modifizierung einer Nukleinsäure in vitro modifiziert werden, um ein Intron zu enthalten, das normalerweise nicht innerhalb des selektierbaren Gens vorkommt. Typischerweise wird ein Intron in ein selektierbares Gen eingeführt werden, indem zuerst das selektierbare Gen mit einer Restriktionsendonuklease in einem Bereich des Gens gespalten wird, welcher normalerweise in RNA transkribiert wird, und dann die resultierenden Restriktionsfragmente kovalent mit dem Intron in der richtigen Orientierung zur Expression durch die Wirtszelle verknüpft wird, beispielsweise durch Ligierung mit einem DNA-Ligase-Enzym.
Das Intron, welches in das selektierbare Gen eingeführt wird, muß, um für die Erfindung brauchbar zu sein, eine solche Länge aufweisen, daß das Expressionsniveau des Intron-modifizierten selektierbaren Gens in der Wirtszelle im Vergleich zu dem unmodifizierten selektierbaren Gen wesentlich vermindert ist. Vorzugsweise wird das Intron die Minimallänge aufweisen, welche möglich ist, ohne das Spleißen des Introns zu verhindern und somit die Synthese von reifer mRNA, welche für das selektierbare Protein kodiert. Typischerweise wird das Intron, welches in das selektierbare Gen eingeführt wird, eine Länge zwischen 50 und 80 nt aufweisen, obwohl es etwas kleiner oder größer sein kann.
Nachdem es schwierig ist, im voraus genau vorauszusagen, welche Introngröße in einem speziellen selektierbaren Gen in einer speziellen Wirtszelle optimal sein wird, um eine Expression eines Produktgens auf hohem Niveau zu erhalten, versteht sich, daß ein gewisses Screening von Introns unterschiedlicher Größe erforderlich sein wird. Sobald die richtige Introngröße jedoch bestimmt ist, kann es routinemäßig in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um ein hohes Expressionsniveau irgendeines gewünschten Proteins zu erhalten. Die Länge des Introns sollte so sein, daß relativ wenige anfängliche Transfektanten erhalten werden, welche den selektierbaren Phänotyp aufweisen, der für das von dem Intron-modifizierten selektierbaren Gen kodierte selektierbare Protein charakteristisch ist, im Vergleich zu der Anzahl anfänglicher Transfektanten, welche erhalten werden, wenn die Länge des Introns um ein oder einige wenige (vorzugsweise weniger als 10) Nukleotid(e) erhöht wird.
Die Herstellung von Introns unterschiedlicher Länge ist eine Routineangelegenheit und beinhaltet im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren, wie z. B. de novo-Synthese oder in vitro-Deletionsmutagenese eines existierenden Introns. Gleichermaßen ist die Bestimmung der Expressionsniveaus eines Produktgens in verschiedenen Wirtszellen, die selektierbare Gene enthalten, welche durch Introns unterschiedlicher Länge modifiziert wurden, eine Routineangelegenheit und beinhaltet im Stand der Technik wohlbekannte analytische Verfahren, wie z. B. analytische Gelelektrophorese, einen ELISA-Assay oder Radioimmunoassay.
Der Begriff "Expression", wie hier verwendet, bezieht sich auf die innerhalb einer Wirtszelle stattfindende Transkription oder Translation. Das Expressionsniveau eines Produktgens in einer Wirtszelle kann auf der Basis entweder der Menge an korrespondierender mRNA, welche in der Zelle vorliegt, oder der Menge des von dem Produktgen kodierten Proteins, welches von der Zelle produziert wird, bestimmt werden. Beispielsweise kann mRNA, die von einem Produktgen transkribiert wurde, durch Northern-Hybridisierung quantitativ bestimmt werden. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 7.3-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Das von einem Produktgen kodierte Protein kann entweder durch Nachweis der biologischen Aktivität des Proteins oder durch Verwendung von Assays, welche von einer solchen Aktivität unabhängig sind, wie z. B. Western-Blots oder Radioimmunoassay unter Verwendung von Antikörpern, welche zur Reaktion mit dem Protein imstande sind, quantitativ bestimmt werden. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Zur Transkription eines Gens, sei es ein selektierbares Gen, ein Intronmodifiziertes selektierbares Gen oder ein für ein gewünschtes Protein kodierendes Produktgen, ist es erforderlich, daß das Gen funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft ist, der in der zur Expression eingesetzten speziellen Wirtszelle funktionell ist. Ein Gen ist mit einem Promotor funktionsfähig verknüpft, wenn es imstande ist, unter der Kontrolle des Promotors in RNA transkribiert zu werden.
Promotoren, die sich zur Verwendung in Säuger-Wirtszellen eignen, umfassen den frühen SV40-Promotor, den späten Adenovirus-Hauptpromotor, den Maus- Metallothionein-1-Promotor, Rous-Sarkom-Virus-LTR-Promotor, den "immediateearly" Hauptpromotor des Human-Cytomegalovirus, Maus-Mammatumorvirus-LTR- Promotor und Thymidinkinase-Promotor des Herpes-simples-Virus. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S. 16.5-16.26 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Bendig, Genetic Enaineering 7 : 91 (Academic Press, 1988). Promotoren, die sich zur Verwendung in Pflanzenwirtszellen eignen, schließen die Promotoren für Octopinsynthase (ocs)- und Nopalinsynthase (nos)-Gene und den 35S-Blumenkohl-Mosaikvirus-Promotor ein. Lichtenstein & Fuller, Genetic Engineerin 6 : 104 (Academic Press, 1987). Promotoren, die sich zur Verwendung in Hefewirtszellen eignen, schließen die Promotoren für Phosphoglyceratkinase (pgk), Enolase (eno), Alkoholdehydrogenase (adh) und andere glykolytische Gene ein. Kinsman & Kingsman, Genetic Engineering, S. 76-83 (Blackwell Scientific Publications, 1988).
Die Begriffe "Transfektion" und "Cotransfektion", wie hier verwendet, beziehen sich allgemein auf den Prozeß der Einführung einer Nukleinsäure in eine Wirtszelle. Zur Einführung eines Gens in eine eukaryotische Wirtszelle sind verschiedene Verfahren bekannt. Die am häufigsten verwendeten dieser Verfahren beinhalten einen direkten DNA-Transfer in Zellen. Beispielsweise kann DNA in Säugerzellen eingeführt werden durch Exposition der Zellen gegenüber DNA in Anwesenheit von Calciumphosphat-Präzipitat oder DEAE-Dextran. Keown et al., Meth. Enzymol. 185 : 527 (1990). Im Gegensatz zu Säugerzellen sind Hefe- und Pflanzenzellen von einer dicken Wand umgeben, welche drastischen chemischen und physikalischen Behandlungen gegenüber relativ resistent ist und die Aufnahme vieler kleiner Moleküle hemmt. Dementsprechend weisen die Verfahren zur Einführung von DNA in solche Zellen typischerweise als ihren ersten Schritt die Umwandlung der Hefe- oder Pflanzenzellen in Sphäroplasten bzw. Protoplasten durch Entfernung eines Teils der Zellwand auf. DNA wird dann in die Zelle eingeführt, indem die Sphäroplasten oder Protoplasten in Gegenwart von Polyethylenglycol (PEG) DNA ausgesetzt werden. Hinnen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 75 : 1929 (1978). Peerbolte et al., Plant. Molec. Biol. 5 : 235 (1984); Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199 : 169 (1985). Alternativ kann DNA in intakte Hefezellen eingeführt werden, welche mit Lithiumacetat behandelt wurden. Stearns et al., Meth. Enzymol. 185 : 280 (1990).
Andere Verfahren zur Einführung von Genen in eukaryotische Zellen sind im Stand der Technik wohlbekannt, wie z. B. diejenigen, welche Elektroporation, Mikroinjektion oder Infektion mit rekombinanten Viren beinhalten. Kaufman, Meth. Enzymol. 185 : 487 (1990); Keown et al., Meth. Enzymol. 185 : 527 (1990); Lichtenstein et al., Genetic Engineering 6 : 104 (Academic Press, 1987).
Nach Cotransfektion mit einem selektierbaren Gen, das modifiziert wurde, um ein wie oben beschriebenes Intron zu enthalten, und einem für ein gewünschtes Protein kodierenden Produktgen werden Wirtszellen in Nährmedium kultiviert, welches ein für das spezielle selektierbare Gen geeignetes Selektionsmittel enthält. Geeignete Nährmedien und Zellkulturverfahren sind im Stand der Technik wohlbekannt. Sherman, Meth. Enzymol. 194 : 3 (1991); Mather, Meth. Enzymol. 185 : 5E37 (1990); Berlin & Bode, in Basic Biotechnology, S. 133-177 (VCH Publishers, 1987). Vorausgesetzt, daß die Introngröße richtig gewählt ist, werden nur einige wenige anfängliche Transfektanten als Ergebnis einer solchen Einzelschritt-Selektion erhalten werden, welche anfänglichen Transfektanten bequem auf hohe Expression des Produktgens untersucht werden.
Alternativ können Wirtszellen mit zwei selektierbaren Genen, die für unterschiedliche selektierbare Proteine kodieren, und einem für ein gewünschtes Protein kodierenden Produktgen cotransfiziert werden. Nach der Transfektion werden die Zellen in einem Nährmedium kultiviert, das ein für das erste selektierbare Gen geeignetes Selektionsmittel enthält, und anfängliche individuelle Transfektanten werden selektioniert. Anschließend werden diese anfänglichen Transfektanten in einem Nährmedium kultiviert, das ein für das zweite selektierbare Gen geeignetes Selektionsmittel enthält, welches zweite selektierbare Gen durch ein Intron modifiziert ist wie oben beschrieben. Wie in Fig. 2 gezeigt, kann es mit diesem zweistufigen Selektionsverfahren möglich sein, ein wesentlich höheres Expressionsniveau des Produktgens zu erhalten als mit dem oben beschriebenen Einzelschritt-Selektionsverfahren möglich ist.
Gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung wird deshalb eine hohe Expression eines für ein gewünschtes Protein kodierenden Produktgens erhalten, indem zur Expression eine Wirtszelle verwendet wird, welche 1) mit einem selektierbaren Gen cotransfiziert ist, das durch ein Intron modifiziert wurde, welches die Menge des von dem selektierbaren Gen in der Wirtszelle produzierten selektierbaren Proteins verringert, und 2) danach unter Selektionsbedingungen, welche das Wachstum oder Überleben der Wirtszelle, der das selektierbare Gen fehlt, nicht erlauben, wachsen oder überleben kann.
Dementsprechend werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung von Nutzen sein bei der Herstellung vieler verschiedener Proteine auf industriellen, landwürtschaftlichen und pharmazeutischen Gebieten und insbesondere von Nutzen bei der Herstellung von Proteinen, welche in begrenzten Mengen aus natürlichen Quellen verfügbar sind, einschließlich solcher Proteine wie Wachstumshormone, Interferone, neurotrophe Faktoren, DNase, Erythropoietin, Inhibin, Insulin, Relaxin und Gewebeplasminogenaktivator. Ein gewünschtes Protein, welches in den rekombinanten Wirtszellen der Erfindung produziert wird, wird vorzugsweise als sekretiertes Protein aus dem Zellkulturmedium gewonnen werden, obwohl es auch aus Wirtszellysaten gewonnen werden kann. In jedem Fall kann das gewünschte Protein von anderen Wirtszellproteinen nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren gereinigt werden, um Präparationen des gewünschten Proteins zu erhalten, welche im wesentlichen homogen sind.
Die folgenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung und sollen die Erfindung in keiner Weise beschränken.

BEISPIEL I

Konstruktion von Vektoren für die Transfektion

1. pSVE.hVOB
Das bakterielle Hygromycin B-Phosphotransferasegen ("hygB"), ursprünglich in dem Plasmid pLG90, Gritz & Davies, Gene 25 : 179 (1983), erhalten und hinsichtlich der Sequenz, welche dem Initiationscodon unmittelbar vorausgeht, wie von Cullen et al., Gene 57 : 21 (1987), beschrieben modifiziert, wurde als zwei Restriktionsendonukleasefragmente isoliert: ein Clal-PstI-Fragment, enthaltend den 5'-Anteil des Gens, und ein PstI-BamHI-Fragment, enthaltend den 3'-Anteil. Diese Fragmente wurden gleichzeitig mit einem großen Clal-BamHI-Fragment, enthaltend den frühen SV40-Enhancer/Promotor und Human-Hepatitis B-Virus (HBV)- Polyacienylierungs (Poly(A))-Bereiche in dem Plasmid pML-1, Lusky & Botchan, Nature 293 : 79 (1981), ligiert. Der resultierende Vektor enthält das hygB-Gen, dem der frühe SV40-EnhancerlPromotor vorausgeht und der HBV-Poly(A)-Bereich folgt.

2. Rp K. hvg

Der Vektor pRK.hyg wurde konstruiert durch Ligierung des großen HindIII- BamHI-Fragments des Vektors pRK7, PCT Veröffentl.-Nr. WO 90/02798 (veröffentlicht am 22. März 1990), mit dem HindIII-BamHI-Fragment von pSVE.hygB, welches die für hygB kodierende Sequenz enthält. Dementsprechend gehen dem hygB-Gen in pRIK.hyg die Enhancer/Promotor- und Intronbereiche von pRK7 voraus und es folgt ihm der späte SV40-Poly(A)-Bereich von pRK7.

3. pRSV-hGH

Dieser Vektor enthält die vollständige kodierende Sequenz für das Humanwachstumshormon (hGH) unter der Kontrolle von transkriptionalen regulatorischen Sequenzen aus dem langen terminalen Repeat (LTR) des Rous-Sarkom-Virus. Er wurde konstruiert durch Ersatz des ras-Promotors von rasP.hGH, Cohen & Levinson, Nature 334 : 119 (1988), durch den RSV-Promotor.

4. pML-UM20

Das Plasmid pML-UM20 enthält einen Polylinkerbereich zwischen den EcoRI- und FlindIII-Stellen des Plasmids pML-1. Es wurde konstruiert durch Ligierung des großen EcoRI-HindIII-Fragments von pML-1 mit dem kleinen EcoRI-HindIII-Fragment eines Zwischenplasmids, pUM20, welches den Polylinkerbereich des Plasmids pUC18, Norrander et al., Gene 26 : 101 (1983), enthält. Die Sequenz des Polylinkerbereichs in pML-UM20, einschließlich der EcoRI- und HindIII-Stellen, ist:
5'-GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGA
CCTGCAGGGGCCCTCGAGACGCGTGGCATGAAGCTT-3'

[SEQ.ID-NR.1]

Diese Sequenz schließt Erkennungsstellen für die Restriktionsendonukleasen Smal (CCC/GGG), BamHI (G/GATCC), Sall (GITCGAC) und Xhol (C/TCGAG) ein, welche bei den im folgenden beschriebenen Konstruktionen verwendet wurden. (Spaliatellen sind durch "P' angezeigt).

5. pSVI6B.neo

Dieser Vektor enthält ein modifiziertes bakterielles Neomycin-Phosphotransferase (neo)-Gen, dem die Enhancer/Promotor- und Intronbereiche des Vektors pSV16B5, PCT-Veröffentlichung WO91/08291, veröffentlicht am 13. Juni. 1991, vorangehen und das HBV-Poly(A)-Signal folgt. Er wurde in mehreren Schritten wie folgt konstruiert:

a. Konstruktion des Zwischenplasmids DUC.neo3'

Das Plasmid pUC119 wurde linearisiert durch Verdauung mit den Restriktionsendonukleasen Sphl und PstI und dann gleichzeitig mit (i) dem PstI-Smal-Fragment des Vektors pSVE. Neoßal6, Seeburg et al., Nature 312 : 71 (1984), welches den 3'-Anteil des für neo kodierenden Bereichs enthält, und (ii) dem BamHI-Sphl-Fragment des Vektors p311 E, Liu et al., welches den HBV-Poly(A)-Bereich enthält, ligiert. Vor der Ligierung wurde das kohäsive BamHI-Ende des von p311 E abgeleiteten Fragments mit Hilfe des Klenowfragments von E. coli DNA-Polymerase I in Anwesenheit aller vier Desoxyribonukleotide aufgefüllt, um dessen Verbindung mit dem durch Smal erzeugten glatten Ende des von pSVE. NeoBal6 abgeleiteten Fragments zu erlauben. Das resultierende Plasmid pUC.neo3' besteht so aus dem 3'-Ende des neo-Gens und dem HBV-Poly(A)-Bereich, inseriert in dem Polylinkerbereich von pUC119.

b. Konstruktion von pSVI6B.hyg

Dieser Vektor wurde konstruiert durch eine Dreifachligierung, welche (i) das Sstl-PstI-Fragment des Vektors pSVI6B.tPA, welches die Enhancer- Promotor- und Intronbereiche dieses Vektors enthält, und (ii) das HindIII- Sall-Fragment von pSVI6B.tPA, welches die für hygB kodierende Sequenz enthält, mit (iii) pUC119, linearisiert durch Verdauung mit Sstl und Sall, verbindet. Das 3'-überhängende Ende des durch PstI-Spaltung erzeugten SVI6B.tPA-Fragments wurde mit Hilfe von T4 DNA-Polymerase entfernt und das 5'-überhängende Ende des durch HindIII-Verdauung erzeugten SVI6B.tPA-Fragments wurde aufgefüllt, um die glattendige Ligierung dieser beiden Enden zu ermöglichen. Der Vektor enthält die SV16B-Enhancer-Promotor- und Intronbereiche, gefolgt von der für hygB kodierenden Sequenz, gefolgt von dem HBV-Poly(A)-Bereich, inseriert in dem Polylinkerbereich von pUC119.

c. Konstruktion von SV16B.neo

Dieser Vektor wurde konstruiert durch Ligierung von (1) dem großen Sstl- PstI-Fragment von pUC.neo3', (ii) dem Sstl-Clal-Fragment von pSVI6B.hyg, welches die SVf6B-Enhancer-Promotor- und Intronbereiche enthält, und (iii) dem Clal-PstI-Fragment von pSVE. Neoßal6, welches den 5'-Anteil der für neo kodierenden Sequenz enthält.

6. pNeol&sub3;G

Der Vektor pNeol&sub3;G unterscheidet sich von pSV16B.neo durch die Anwesenheit eines Introns innerhalb der für neo kodierenden Sequenz. Das große BaII-PstI- Fragment von pSVI6B.neo, welches die Gesamtheit von pSVI6B.neo mit Ausnahme eines kurzen BaII-PstI-Fragments innerhalb des neo-Gens enthält, wurde mit einem Intron-enthaltenden neo-Fragment ligiert, welches mittels PCR-Verfahren wie folgt erzeugt wurde:
a. Ein erster Primer, neol3-529 G, wurde hergestellt, der aus der Sequenz (untranskribierter Strang), welche die nur einmal vorkommende PstI-Stelle in dem für neo kodierenden Bereich umgibt, und der 5'-terminalen Sequenz des Introns, das dem alternativen H-ras-Exon IDX folgt, Cohen et al., Cell 58 : 461 (1989), wie es in dem T24/EJ-Allel des humanen H-ras- Gens gefunden wird, Cohen & Levinson, Nature 334 : 119 (1988), besteht. Die vollständige Nukleotidsequenz des neol3-529 G-Primers ist:
5'-ATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTgtaggtctcccg-3'

[SEQ-ID-NR. 2]

Die neo-Sequenz ist in großen Buchstaben dargestellt und die H-ras- Sequenz in kleinen Buchstaben. Die PstI-Erkennungssequenz ist unterstrichen. Man beachte, daß die letzten drei Nukleotide der neo-Sequenz mit den letzten drei Nukleotiden des alternativen H-ras-Exons IDX identisch sind. Cohen et al., Cell 58 : 461 (1989)
b. Ein zweiter Primer, neol3-567, wurde hergestellt, der aus der Sequenz des transkribierten Stranges des neo-Gens zwischen der BaII-Spaltstelle und dem letzten Nukleotid der neo-Sequenz in dem Primer neol3-529 G, gefolgt von der Sequenz des transkribierten Stranges des 3'-Terminus des H-ras-Introns D, Cohen et al., Cell 58 : 461 (1989), besteht. Die vollständige Nukleotidsequenz des neol3-567-Primers ist:
5'-CCAGCCACGATctgggaaaggagggatgggatc-3'

[SEQ-ID-NR. 3]

Die neo-Sequenz ist in großen Buchstaben dargestellt und die H-ras- Sequenz ist in kleinen Buchstaben dargestellt.
c. Die Primer neoI3-529G und neoI3-567 wurden in dem PCR-Verfahren eingesetzt, um das zwischen IDX und Exon 4 befindliche Intron, Cohen et al., Cell 58 : 461 (1989), des H-ras-Gens, welches in dem Plasmid ile12N(G), Cohen & Levinson, Nature 334 : 119 (1988) (alternativ als Ile12(G) in Cohen et al., Cell 58 : 461 (1989) bezeichnet), vorliegt, zu amplifizieren. Das resultierende Amplifizierungsprodukt wurde einer partiellen Verdauung mit PstI unterworfen und das durch Spaltung an der PstI-Erkennungsstelle innerhalb der für neo kodierenden Sequenz erzeugte Fragment wurde aus einem Polyacrylamidgel nach elektrophoretischer Fraktionierung isoliert. Das isolierte Fragment enthält so die gesamte Intron D-Sequenz, welche IDX in dem H-ras-Gen des Plasmids ile12N(G) folgt, inseriert in einem PstI-BaII-Fragment des neo-Gens.

7. pNeol&sub3;GΔS

Diesem Vektor fehlt das Intron-interne Smal-Fragment von pNeol&sub3;G (etwa 300 nt). Er wurde konstruiert durch Verdauung von pNeol&sub3;G mit Smal und anschließende Selbstligierung des größeren Smal-Fragments.

8. pNeoLG-65

Diesem Vektor fehlt der zentrale Teil des H-ras-Introns, welches im Vektor pNeol&sub3;G vorliegt, er bewahrt jedoch die 5'-terminalen 11 und 3'-terminalen 54 Nukleotide des Introns. Er wurde konstruiert durch Entfernung der Sequenzen zwischen der 5'-proximalen Smal-Stelle und der 3'-proximalen EcoNI-Stelle des Introns durch Ligierung von (i) dem großen Smal-SstII-Fragment des Vektors pNeol&sub3;G mit (ii) dem EcoNI-SstII-Fragment des Vektors pNeol&sub3;A (welcher Vektor mit Ausnahme einer G-zu-A-Substitution an Nukleotidposition 4 des Introns mit pNeol&sub3;G identisch ist), welches den 3'-Anteil des H-ras-Introns, gefolgt von neo- und HBV- Sequenzen, enthält. Das durch EcoNI-Verdauung erzeugte 5'-überhängende Ende wurde aufgefüllt, um eine Ligierung dieses Endes mit dem durch Smal-Spaltung erzeugten glatten Ende zu erlauben.

9. pNeol&sub3;G-101

Dieser Vektor wurde konstruiert durch Hinzufügen eines Teils des Polylinkerbereichs des Plasmids pML-UM20 zu dem 65 nt langen Intron des Vektors pNeol3 G- 65, unn ein 101 nt langes Intron zu erzeugen. Das große Smal-SstII-Fragment des Vektors pNeol3 G wurde gleichzeitig mit dem 36 nt langen Smal-Xho1-Fragment, erzeugt durch Verdauung von pML-UM20, und mit dem oben beschriebenen, von pNeol,A abgeleiteten EcoNI-SstII-Fragment ligiert. Das durch Xhol-Verdauung erzeugte 5'-überhängende Ende wurde aufgefüllt, um eine Blunt-End-Ligierung zu erlauben. Eines der resultierenden Plasmide, pNeol&sub3;G-101, weist die aufgefüllte Xhol-Stelle des Polylinkerbereichs fusioniert mit der Smal-Stelle des pNeol&sub3;G- Fragments (was die Xhol-Stelle wiederherstellte) und das durch Smal erzeugte Ende des Polylinkerbereichs fusioniert mit dem aufgefüllten EcoNI-Ende des pNeol,A-Fragments auf.
10. pNeol&sub3;G-76
Der Vektor pNeol&sub3;G-76 enthält ein 76 nt langes Intron und wurde von pNeol&sub3;G-101 durch Deletion eines Teils des von pML-UM20 stammenden Polylinkerbereichs in pNeol&sub3;G-101 abgeleitet. Er wurde konstruiert durch Ligierung des großen Xhol-SstII-Fragments von pNeol&sub3;G-101 mit dem BamHI-SstII-Fragment von pNeol&sub3;G-101, welches den 3'-Abschnitt des Introns und das neo-Gen enthält. Die durch Xhol und BamHI erzeugten 5'-überhängenden Enden wurden aufgefüllt, um eine Blunt-End-Ligierung zu erlauben.

11. pNeol&sub3;G-72*

Der Vektor pNeol&sub3;G-72* enthält ein 72 nt langes Intron und wurde von pNeol&sub3;G-101 durch Deletion eines Teils des von pML-UM20 stammenden Polylinkerbereichs in pNeol&sub3;G-101 abgeleitet. Der Teil des Polylinkers, welcher in pNeol&sub3;G-72* verblieb, besitzt die Sequenz 5'-GATCCCC-3'. Dieser Vektor wurde konstruiert durch Ligierung des großen Smal-SstII-Fragments von pNeol&sub3;G mit dem BamHI-SstII-Fragment von pNeol&sub3;A-101 (welcher Vektor mit Ausnahme einer G-zu-A-Substition an Nukleotidposition 4 des Introns mit pNeol&sub3;G-101 identisch ist), welches den 3'- Abschnitt des Introns und das neo-Gen enthält. Das durch BamHI-Spaltung erzeugte 5'-überhängende Ende wurde aufgefüllt, um die Ligierung mit dem durch Smal erzeugten glatten Ende zu erlauben.

12. pNeol&sub3;G-72

Der Vektor pNeol&sub3;G-72 enthält ebenfalls ein 72 nt langes Intron, unterscheidet sich jedoch von pNeol&sub3;G-72* darin, daß die Polylinker-abgeleitete Sequenz von pNeol&sub3;G-72* durch die Sequenz 5'-TCGAGTC-3' ersetzt ist. Dieser Vektor wurde wie folgt konstruiert:
a. Der Zwischenvektor 10.28.9 wurde durch eine Vierfachligierung gebildet. Die vier Fragmente waren:
i. Das große EcoRI-SstII-Fragment von pNeol3A-101, welches den HBV-Poly(A)-Bereich und pUC119-Sequenzen enthält.
ii. Das EcoRI-Xhol-Fragment von pNeol3A-101, welches den von SVI6B stammenden Enhancer/Promotor, den 5'-Abschnitt des neo-Gens und den 5'-terminalen Abschnitt des 101 nt langen Introns enthält.
iii. Das EcoNI-SstII-Fragment von pNeol&sub3;A, welches den 3'- Abschnitt des Introns und das neo-Gen enthält.
iv. Ein synthetisches DNA-Fragment, erhalten durch Verschmelzung zweier komplementärer Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen:
Strang A: 5'-TCGAGCCCTTTTCTCGAGTC-3'
[SEQ-ID-N R. 4]
Strang B: 5'-GGACTCGAGAAAAGGGC-3'
[SEQ-ID-NR. 5]
Diese Oligonukleotide wurden so konstruiert, um einen 5'- Überhang der Sequenz 5'-TCGA an einem Ende und einen 5'-Überhang eines einzelnen G-Nukleotids am anderen Ende nach dem Verschmelzen zurückzulassen. Diese Überhänge sind komplementär zu den 5'-überhängenden Enden, welche durch Xhol- bzw. EcoNI- Spaltung erzeugt werden.
Die Ligierung dieser vier Fragmente ergab den Vektor 10.28.9 mit einem 85 nt langen Intron und einer G-zu-A-Substitution an Position 4 des Introns. Dieser Vektor enthält 2 eng benachbarte Xhol-Stellen innerhalb des Introns: eine durch Ligierung des durch Xhol erzeugten Terminus des Fragments 2 mit dem 5'- TCGA-Überhang des synthetischen Fragments wiedergebildet, und die andere ist in dem synthetischen Fragment enthalten (unterstrichen).
b. pNeol&sub3;G-72 wurde konstruiert durch Ligierung des großen Xhol-SstII- Fragments von pNeol&sub3;G-101 mit dem Xhol-SstII-Fragment von 10.28.9, weiches den 3'-Abschnitt des Introns und das neo-Gen enthält. Diese Konstruktion entfernt das interne Xhol-Fragment aus dem Intron und erzeugt somit ein 72 nt langes Intron und die A-zu-G-Substitution an Nukleotidposition 4 des Introns.

13. pNeol&sub3;G-71 und DNeol&sub3;G-70

Diese Vektoren wurden konstruiert nach dem gleichen Verfahren wie oben für pNeol&sub3;G-72 ausgeführt. In jedem Fall unterschieden sich die synthetischen Oligonukleotidsequenzen jedoch leicht von denen, welche zur Konstruktion von pNeol3 G-72 eingesetzt wurden. Zur Erzeugung des Zwischenvektors 10.28.5 fehlte dem Strang A-Oligonukleotid das letzte Nukleotid der oben gezeigten Sequenz, während dem Strang B-Oligonukleotid das erste Nukleotid der gezeigten Strang B- Sequenz fehlte. Dies führte zu einem 84 nt langen Intron in diesem Zwischenvektor 10.28.5 und einem 71 nt langen Intron in dem schließlichen Vektor pNeol&sub3;G-71. Gleichermaßen wurde der Zwischenvektor 10.28.1 erzeugt durch Verwendung eines Strang A-Oligonukleotids, dem die letzten zwei Nukleotide der oben gezeigten Strang A-Sequenz fehlten, und eines Strang B-Oligonukleotids, dem das erste und dritte Nukleotid der oben gezeigten Strang B-Sequenz fehlte. Dies führte zu einem 83 nt langen Intron in diesem Zwischenvektor 10.28.1 und einem 70 nt langen Intron in dem schließlichen Vektor pNeol&sub3;G-70.

14. pNeol&sub3;G-69

Der Vektor pNeol&sub3;G-69 enthält ein 69 nt langes Intron und wurde von pNeol&sub3;-G-101 durch Deletion eines Teils des von pML-UM20 stammenden Polylinkerbereichs in pNeol&sub3;G-101 abgeleitet. Er wurde konstruiert durch Ligierung des gIoßen Xhol-SstII-Fragments von pNeol&sub3;G-101 mit dem EcoNI-SstII-Fragment von plNeol&sub3;A, welches den 3'-Abschnitt des Introns und das neo-Gen enthält.

BEISPIEL 2

1. Ras 2.2-Zellinie

Ratte-1-Zellen, Seeburg et al., Nature 312 : 71 (1984), wurden nach dem Calciumphosphat-Verfahren, Graham & von der Eb, Virology 52 : 456 (1973), mit dem Plasmid pT24-10, Capon et al., Nature 302 : 33 (1983), enthaltend das transformierende T24/EJ-Allel des Human-H-ras-Gens, stabil transfziert. Nach 2 Wochen Kultivierung in nicht-selektivem Medium wurden Foci von transformierten Zellen, die vor einem Hintergrund kontaktinhibierter Zellen erschienen, identifiziert, weiter vermehrt, bei niedriger Dichte in Weichagar ausplattiert, wovon individuelle Kolonien transformierter Zellen isoliert wurden. Eine Kolonie, die einen relativ hohen Transformationsgrad zeigte, erhielt die Bezeichnung Ras 2.2.

2. Transfektion

Ras 2.2-Zellen wurden in doppelter Ausführung nach dem Calciumphosphat- Verfahren mit den folgenden DNAs in den angegebenen Mengen pro 1,4 · 10&sup6; Zellen transfiziert
1. 0,5 ug pRIC-hyg, und
2. 10,0 ug pRSV-hGH, und
3. 2,0 ug einer der folgenden DNAs (Neomycinresistenzvektoren, die ein Intronmodifiziertes Neomycinresistenzgen enthalten):
a) pNeol&sub3;G-71
b) pNeol&sub3;G-72
c) pNeol&sub3;G-72*
d) pNeol&sub3;G-76
e) pNeol&sub3;G-101
f) pNeol&sub3;G-ΔS

3. Selektion

Cotransfizierte Zellen wurden zwei Tage später auf Medium (gleiche Volumina an DMEM- und F12-Medien, 5% fötales Rinderserum, 2 mM Glutamin), enthaltend entweder 400 ug/ml des Neomycin-Analogons G418 oder 200 ug/ml Hygromycin, überführt und danach alle zwei Tage mit Nährstoffen versorgt. G418-resistente Kolonien (G418r) wurden nach 20 Tagen Exposition gegenüber dem Wirkstoff gezählt und für die weitere Kultivierung gepoolt. Hygromycin-resistente Kolonien (hygr) wurden nach 10 Tagen Exposition gegenüber dem Selektionswirkstoff gezählt und für die weitere Kultivierung gepoolt. Zellen in dem hygr-Pool wurden einmal einer Passage unterworfen und in unterschiedlichen Dichten in Medium, das G418 in Konzentrationen von entweder 350 ug/ml (hygT-Pools von Zellen, die mit pNeol&sub3;G-71 oder pNeol&sub3;G-72 transfiziert waren) oder 400 ug/ml (hygr-Pools von Zellen, die mit pNeol&sub3;G-72*, pNeol&sub3;G-76, pNeol&sub3;G-101 oder pNeol&sub3;G-ΔS transfiziert waren) enthielt, ausplattiert und danach alle zwei bis vier Tage mit Nährstoffen versorgt. Die resultierenden Hygromycin/G418-resistenten Kolonien (hygr/G4189 wurden nach zwei bis vier Wochen Exposition gegenüber G418 gezählt und für die weitere Kultivierung gepoolt.
Fig. 1 zeigt die Anzahl von Wirkstoff-resistenten Kolonien, die mit den verschiedenen Neomycin-Resistenzvektoren erhalten wurden. Die Daten zeigen, daß die optimale Introngröße 71 oder 72 nt beträgt, insofern als die Vektoren pNeol&sub3;G- 71, IpNeol&sub3;G-72 und pNeol&sub3;G-72*, welche Introns dieser Längen im Neomycinresistenzgen enthalten, zu G418r und hygr/G418r-Kolonien führen, jedoch zu relativ weniger Kolonien als mit dem Vektor pNeol&sub3;G-76, welcher ein 76 nt langes Intron in dem Neomycinresistenzgen enthält.

4. Bestimmung der Expressionsniveaus von Humanwachstumshormon (hGH) in den cotransfizierten Zellkulturen

Pools von G418-, hygr- und hyg7G418-resistenten Zellen in etwa gleichen Zelldichten wurden metabolisch mit ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S-Cystein radioaktiv markiert und danach wurden die Niveaus an Humanwachstumshormon (hGH), die in den Zellkulturüberständen vorlagen, durch Analyse der Überstandsproteine auf Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgelen bestimmt.
Ferner wurden Niveaus an hGH in den Zellkulturüberständen durch einen ELISA-Radioimmunoassay unter Verwendung von polyklonalem Anti-hGH-Antikörper bestimmt. Pools von wirkstoffresistenten Zellen wurden in einer Dichte von 1,5 · 10&sup5; Zellen pro Vertiefung in einer Mikrotiter-Kulturplatte ausplattiert und bis zur Konfluenz wachsengelassen. Zellen wurden dann geerntet, gezählt und die Zellkulturüberstände (konditioniertes Medium) einem Assay unterworfen. Fig. 2 zeigt für jeden der verschiedenen cotransfizierten Zelltypen die berechnete Menge an hGH in dem Zellkulturüberstand, bezogen auf eine Zelle (pg/Zelle). Diese Zahlen wurden erhalten durch Teilen der Menge an immunologisch reaktivem hGH in dem Zellkulturüberstand aus einer gegebenen Vertiefung der Mikrotiterplatte (bestimmt durch ELISA) durch die Anzahl der Zellen, welche aus der Vertiefung gewonnen wurden.
In Übereinstimmung mit der vorherigen Feststellung, daß die optimale Introngröße 71 oder 72 nt beträgt, zeigen die Daten in Fig. 2, daß die höchsten hGH- Niveaus von Zellen produziert werden, welche mit den Vektoren pNeol&sub3;G-71, pNeol&sub3;G-72 oder pNeol&sub3;G-72* cotransfiziert wurden.

5. Bestimmung der Expressionsniveaus von Humanwachstumshormon (hGH) in individuellen Zellklonen

Pools von G418-resistenten Zellen, transfiziert mit entweder pNeol&sub3;G-71 oder pNeol&sub3;G-ΔS, wurden in sehr niedriger Dichte in 10-mm-Gewebekulturschalen ausplattiert. Individuelle Kolonien (Klone) wurden isoliert und für eine Passage vermehrt, dann wurden die Zellen aus jedem Klon geerntet und in einer Dichte von 4 · 10&sup8; Zellen pro 60-mm-Gewebekulturschale ausplattiert. Nach mehreren Stunden wurden die Zellen metabolisch mit ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S-Cystein radioaktiv markiert und danach die Niveaus an Humanwachstumshormon (hGH), welche in den Zellkulturüberständen vorlagen, durch Analyse der Überstandsproteine auf Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgelen bestimmt.
Ferner wurden die von individuellen Klonen produzierten hGH-Niveaus durch einen ELISA-Radioimmunoassay unter Verwendung von polyklonalem Anti-hGH- Antikörper bestimmt. Die Zellen aus jedem Klon wurden in einer Dichte von 1,5 · 10&sup5; Zellen pro Vertiefung einer Mikrotiter-Zellkulturplatte ausplattiert und bis zur Konfluenz wachsengelassen. Die Zellen wurden dann geerntet, gezählt und die Zellkulturüberstände (konditioniertes Medium) einem Assay unterworfen. Fig. 3 zeigt für jeden der verschiedenen analysierten Klone die Anzahl der Zellen, die Menge an hGH in den Zellkulturüberständen (bestimmt durch ELISA) und die berechnete Menge an hGH, welche pro Zelle produziert wurde (pg/Zelle).

SEQUENZVERZEICHNIS

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDERIN: GENENTECH, INC.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: METHODEN ZUR SELEKTION REKOMBINANTER WIRTSZELLEN, WELCHE HOHE NIVEAUS EINES GEWÜNSCHTEN PROTEINS EXPRIMIEREN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 5
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Genentech, Inc.
(B) STRASSE: 460 Point San Bruno Blvd.
(C) STADT: South San Francisco
(D) STAAT: Kalifornien
(E) LAND: U. S. A.
(F) PLZ: 94080
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: 5,25 Zoll, 360-Kb-Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: patin (Genentech)
(vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICHUNGSDATUM: 20. Februar 1992
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:07/677,045
(B) EINREICHUNGSDATUM: 29. MÄRZ 1991
(viii) ANWALTNERTRETERINFORMATION:
(A) NAME: Hensley, Max D.
(B) ZULASSUNGSNUMMER: 27.043
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN:693
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON:415/266-1994
(B) TELEFAX: 415/952-9881
(C) TELEX:910/371-7168
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR.1:
(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 75 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR.1:
GAATTCGAGC TCGGTACCCG GGGATCCTCT AGAGTCGACC 40
TGCAGGGGCC CTCGAGACGC GTGGCATGCA AGCTT 75
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR.2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 40 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR.2:
ATGAACTGCA GGACGAGGCA GCGCGGCTGT AGGTCTCCCG 40
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR.3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE:linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR.3:
CCAGCCACGA TCTGGGAAAG GAGGGATGGG ATC 33
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR.4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR.4:
TCGAGCCCTT TTCTCGAGTC 20
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. S.
(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR.5:
GGACTCGAGA AAAGGGC 17

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung oder Isolierung einer rekombinanten Wirtszelle, die hohe Niveaus eines gewünschten Proteins exprimiert, welches Verfahren umfaßt die Schritte der:

(1) Transfektion einer eukaryotischen Wirtszelle mit

(a) einem selektierbaren Gen, das ein Intron enthält, welches nicht natürlicherweise innerhalb des selektierbaren Gens vorkommt, wobei das Intron imstande ist, in der Wirtszelle gespleißt zu werden, um mRNA bereitzustellen, die für ein selektierbares Protein kodiert, und wobei die Anwesenheit des Introns in dem selektierbaren Gen das Niveau an selektierbarem Protein, welches von dem selektierbaren Gen in der Wirtszelle produziert wird, verringert; und

(b) einem Produktgen, das für ein gewünschtes Protein kodiert; und

(2) Identifizierung von Transfektanten, die den selektierbaren Phänotyp aufweisen, welcher durch das selektierbare Protein verliehen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das selektierbare Gen aus einer prokaryotischen Quelle stammt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das selektierbare Gen ein Hygromycinresistenzgen oder ein Neomycinresistenzgen ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner die Transfektion der Wirtszelle mit einem zweiten selektierbaren Gen umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das zweite selektierbare Gen ein Hygromycinresistenzgen oder eine DHFR-Gen ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Intron eine Länge von 55 bis 85 Nukleotiden aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Intron eine Länge von 65 bis 75 Nukleotiden aufweist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Intron innerhalb des kodierenden Bereichs des selektierbaren Gens vorliegt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Intron innerhalb des transkribierten nicht-kodierenden Bereichs des selektierbaren Gens vorliegt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die eukaryotische Wirtszelle eine Säugerzelle ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Säugerzelle eine Eierstockzelle des Chinesischen Hamsters (CHO) oder eine Affen-COS-Zelle oder eine Humanembryonieren-293-Zelle ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner die Gewinnung des von dem Produktgen kodierten Proteins aus der transfizierten Wirtszelle umfaßt.

13. Transfektanten-Zelle, erhältlich nach dem Verfahren von Anspruch 1.

14. Isolierte Nukleinsäure, umfassend ein selektierbares Gen und ein Intron innerhalb des transkribierten Bereichs des selektierbaren Gens, welches Intron nicht natürlicherweise innerhalb des selektierbaren Gens vorkommt und welches Intron eine ausreichende Länge aufweist, um das Niveau an selektierbarem Protein, welches von dem selektierbaren Gen in einer Wirtszelle produziert wird, zu verringern.