DE68927104T2 - Gentherapie unter verwendung von genschmelzen für genetische und erworbene störungen - Google Patents
Gentherapie unter verwendung von genschmelzen für genetische und erworbene störungenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich grundsätzlich auf den Aufbau von Fusionsgenen. Mehr im einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung die Konstruktion eines Fusionsgens, das eine kodierende Sequenz für einen wählbaren menschlichen MDR1-Genmarker aufweist, der durch Verschmelzung an eine weitere kodierende Sequenz gekoppelt ist, wobei das Produkt hiervon in Empfängerzellen exprimiert werden soll.
- Ueda et al. haben die Isolierung einer Vollängen-cDNA für das menschliche MDR1-Gen und seine Expression in Maus-NIH-3T3 und menschlichen KB-Zellen beschrieben, was einen wählbaren Mehrfachchemikalienresistenz Phänotyp dazu ergibt (Proc. Natl. Acad. Sci. (1987), 84, 3004-3008).
- Die Entwicklung der Technologie bezüglich rekombinanter DNA und das Bedürfnis zur Behandlung genetischer Fehler hat zu dem Konzept der "Gentherapie" geführt. Zu diesem Zweck sind Methoden zum Einführen und Exprimieren fremder Gene in somatische Zellen entwickelt worden. Jedoch erweist sich die Expression des zugeführten Gens in der Empfängerzelle nach den vorherrschenden Verfahren gewöhnlich als entweder sehr gering oder recht veränderlich.
- Eine Retroviren-vermittelte Übertragung und Expression des ADA-Gens (Adenosin-Desaminase-Gen) ist in einer Vielfalt von menschlichen T- und B-Lymphozyten-Zellinien, diploiden menschlichen Hautfibroblasten sowie in Mäuse-NIH-3T3- und thymusabhängigen Lymphozyten berichtet worden. Neuerdings ist ein rekombinantes Virus auf der Basis des Maloney-Maus-Leukämievirus zum Exprimieren von ADA in Maus-Hämatopoietischen Stammzellen verwendet worden (Lim et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 3459). Solche Retrovirus-Konstrukte enthielten jedoch keine dominanten Markergene, die eine Selektion und folglich eine effiziente Anreicherung von ADA-exprimierenden Zellen erlauben würden.
- Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine effiziente und reproduzierbar zuverlassige Methode des Einführens von Genen in tierische oder menschliche Zellen zur Behandlung genetischer oder erworbener Krankheiten oder Defekte zu schaffen, die durch Enzymmangel verursacht werden.
- Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein wählbares menschliches Marker-gekoppeltes MDR1-Fusionsgen zur Übertragung und Expression eines gewünschten Gens in menschlichen Zellen ohne Einführen eines nichtmenschlichen Antigens zu schaffen.
- Ein weiteres Ziel der Erfindung liegt darin, eine Gentherapie zur Behandlung schwerer kombinierter Immunmängel zu schaffen, die durch Adenosin-Desaminase-Mangel (ADA-Mangel) verursacht sind.
- Demgemäß ist nach einem ersten Aspekt der Erfindung ein Fusionsgen vorgesehen, das im lebenden Organismus exprimierbar ist und eine kodierende Sequenz für einen wählbaren Marker aufweist, der durch Verschmelzung an eine zweite kodierende Sequenz gekoppelt ist, was ein einzelnes offenes Leseraster ergibt, das ein chimäres Fusionsprotein kodiert, das in Empfängerzellen exprimiert werden soll, dadurch gekennzeichnet, daß der wählbare Marker ein menschliches MDR1-Gen ist.
- Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines fusionierten Gens nach der Erfindung nach ihrem ersten Aspekt zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einem Verfahren zur Linderung eines Zustands vorgesehen, der von einer genetischen oder erworbenen Krankheit herrührt, die mit der zweiten kodierenden Sequenz im Zusammenhang steht, wobei das fusionierte Gen in Zellen eines Wirts eingeführt wird und die zweite kodierende Sequenz im lebenden Organismus exprimiert wird.
- Nach einem dritten Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Auswirkung einer Änderung der Sequenz eines fusionierten Gens nach der Erfindung nach deren erstem Aspekt vorgesehen, welches den Schritt der Änderung der wählbaren menschlichen MDR1-Gen-Markerkodierungssequenz oder der zweiten kodierenden Sequenz und den Schritt der Bestimmung der sich ergebenden Auswirkungen dieser Änderung auf die Funktion des fusionierten Gens umfaßt.
- Nach einem vierten Aspekt der Erfindung ist ein bifunktionelles chimäres Protein vorgesehen, das durch ein fusioniertes Gen nach der Erfindung nach deren erstem Aspekt kodiert ist.
- Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung nach deren verschiedenen Aspekten sind in den Unteransprüchen definiert. Diese und weitere Merkmale und zahlreiche daraus herrührende Vorteile der Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung im Zusammenhang mit den anliegenden Zeichnungen besser verständlich, in welchen:
- Die Figuren 1A, 1B, 1C schematisch die Konstruktion eines Retrovirus-Expressionsvektors pHaMDR1ADA darstellt, der ein menschliches chimäries P-Glycoprotein-Adenosin-Desaminase- Protein kodiert (anzumerken ist, daß in den Figuren 1A, 1B, 1C MDRADA jeweils MDR1ADA darstellt);
- Figur 2 eine Southern-Blotting-Analyse von genomischen DNAs von transfektierten KB-Zellen darstellt. Genomische DNA wurde mit EcoRI digeriert, auf einem 0,7-prozentigen wässrigen Gel separiert, auf Nitrozellulose übertragen, und zu einer MDR1- spezifischen Sonde hybridisiert. Tafel A zeigt einzeln aufgenommene Zellklone. Bahn 1: KB-A, mock-transfektiert, gezüchtet bei 6 ng/ml Colchicin.
- Bahn 2: KB-MDR1A, pHaMDR1-transfektiert, gezüchtet bei 6 ng/ml Colchicin.
- Bahnen 3 und 4: KB-MDR1ADA-I, pHAMDR1A-transfektiert, gezüchtet bei 6 ng/ml (3) und 12 ng/ml (4) Colchicin.
- Tafel B zeigt gesammelte Zellenpopulationen.
- Bahnen 1 und 2: pHaMDR1-transfektiert, gezüchtet bei 6 ng/ml (1) und 24 ng/ml (2) Colchicin.
- Bahnen 3 und 4: pHaMDR1ADA-transfektiert, gezüchtet bei 6 ng/ml (4) Colchicin.
- Bahn 5: nichttransfektierte Eltern-KB-3-1-Zellinie, Colchicin-empfindlich.
- Figur 3 zeigt die Ergebnisse von Immunausfällungen von Zellenlysaten. Die Kulturen wurden während 16 Stunden mit ³&sup5;S- Methionin markiert. Die Zellenlysate wurden unter Verwendung von Anti-P-Glycoprotein-Antiserum (Bahnen 1 bis 7) oder Vorimmunserum (Bahnen 8 bis 12) und Protein-A-Sepharose immunausgefällt. Von den resultierenden SDS-Polyacrylamid-Gelen sind Fluorogramme dargestellt. Pfeile zeigen das 170-kd-P- Glycoprotein (MDR1-Genprodukt) und das 210-kd-P-Glycoprotein- ADA-Fusionsprotein (MDR1ADA) an.
- Bahn 1: chemikalienempfindliche KB-3-1-Kontrollzellinie, parallel markiert und immunausgefällt.
- Bahn 2: Vinblastin-selektierte KB-V1-Kontrollzellinie.
- Bahnen 3 und 8: pHaMDR1-transfektierte KB-Zellenpopulation, bei 24 ng/ml Colchicin gezüchtet.
- Bahnen 4, 5, 9, 10: pHaMDR1ADA-transfektierte KB-Zellenpopulationen, gezüchtet bei 6 ng/ml (4 und 9) und 24 ng/ml (5 und 10) Colchicin.
- Bahnen 6, 7, 11, 12: pHaMDR1ADA-transfektiertes Klon KB- MDR1ADA-I, gezüchtet bei 6 ng/ml (6 und 11) und 12 ng/ml (7 und 12) Colchicin.
- Figur 4 zeigt Abtötungskurven für Kontroll- und pHaMDR1ADA- Zellinien. In jedem Versuch wurden 300 Zellen in einer 60-mm- Schale plattiert, die 5 ml Kulturmedium enthielt, das mit 1,1 mM Adenosin, 1,0 mM Uridin, 0,05 mM Alanosin und veränderlichen Mengen von 2'-Desoxycoformycin ergänzt war. Nach einer Wachstumsperiode von zehn Tagen bei 37ºC und 7% CO&sub2; wurden die Zellen mit Methylenblau gefärbt und die Kolonien wurden gezählt.
- Figur 4A zeigt individuelle, bei 6 ng/ml Colchicin selektierte Klone.
- (Δ) KB-A, Schein-transfektierte Klone.
- ( ) KB-MDR-A, pHaMDR1-transfektiertes Klon.
- ( ) KB-MDR1ADA-G, pHaMDR1ADA-transfektiertes Klon.
- ( ) KB-MDR1ADA-I, pHaMDR1ADA-transfektiertes Klon.
- Figur 4B zeigt gesammelte Zellenpopulationen, die bei 16 ng/ml (Kreise) und 24 ng/ml (Dreiecke) Colchicin gezüchtet wurden. Gestrichelte Linien und nicht ausgefüllte Symbole ( , Δ) stellen pHaMDR1-transfektierte Zellen dar, und Vollinien und ausgefüllte Symbole ( , ) sind pHaMDR1ADA-transfektierte Zellen.
- Sofern nicht anders angegeben, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Bezeichnungen die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet dieser Erfindung verstanden werden. Obwohl bei der Ausführung der Erfindung oder zum Testen nach der Erfindung auch andere Methoden und Materialien eingesetzt werden können, die ähnlich oder äquivalent zu den beschriebenen sind, werden nunmehr die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben.
- Soweit nichts anderes angegeben ist, sind die hier eingesetzten Techniken Standardmethoden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
- Der Begriff "fusioniertes Gen" ist hier als DNA-Segment definiert, bei welchem zwei oder mehr Gene miteinander verschmolzen sind, was ein einzelnes offenes Leseraster zum Kodieren von zwei oder mehr Proteinen ergibt, die als Resultat dieser Verschmelzung durch eine oder mehrere Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
- Das Konzept der "Gentherapie" unter Anwendung des Genfusion- Expressionssystems nach der vorliegenden Erfindung wird nun beispielhaft durch Aufbau, Übertragung und zuverlässig effiziente Expression des ADA-Gens gleichzeitig mit einem wählbaren menschlichen MDR1-Markergen zur Erzeugung eines bifunktionellen chimären Proteins in den Wirtszellen beschrieben.
- Das ADA-Gen wurde hier zu Erläuterungszwecken ausgewählt, weil ein Mangel an Adenosin-Desaminase (ADA; Adenosin-Aminohydrolase: E.C. 3.5.4.4) eine genetische Krankheit ist, die bei ungefähr einem Viertel sämtlicher Fälle eines schweren kombinierten Immundefekts beteiligt ist (Hirschhorn et al, 1979, Clin. Immunol. Immunopathol. 14, 107). Diese Krankheit führt unweigerlich zum Tod, wenn sie nicht wirksam behandelt wird. ADA katalysiert die irreversible Desaminierung von Adenosin und Desoxyadenosin zu Inosin bzw. Desoxymosin. Die meisten ADA-Mangel-Patienten erzeugen ein katalytisch defektes Enzym. Infolgedessen werden zytotoxische ADA-Substrate, Adenosin und Desoxyadenosin sowie ihre Metaboliten, insbesondere Desoxyadenosin-5'-Triphosphat, intrazellulär angehäuft. Dies führt zu der spezifischen Zerstörung der T-Lymphozyten und, in geringerem Ausmaß, der B-Lymphozyten mit der daraus folgenden schweren immunologischen Dysfunktion.
- Eine der verfügbaren Therapien bei ADA-Mangel ist die Knochenmarktransplantation von einem normalen histokompatiblen Spender. Jedoch sind für viele Patienten keine geeigneten Knochenmarkspender verfügbar. Alternative Behandlungsformen wie beispielsweise Enzymersatz durch wiederholte Erythrozytentransfusionen oder wiederholte intramuskuläre Injektion von Polyethylenglykol-modifizierter Rinder-ADA sind ebenfalls verfügbar, aber diese können bei der Langzeittherapie zu schweren Komplikationen führen.
- Wie oben erwähnt, wurden die Retrovirus-vermittelte Übertragung und Expression des ADA-Gens bei einer Vielfalt von menschlichem T- und B-Lymphozytenzellinien, diploiden, menschlichen Hautfibroblasten wie auch in Maus-NIH-3T3-Zellen und thymusabhängigen Lymphozyten berichtet, und in neuerer Zeit wurde ein rekombinantes Retrovirus auf der Basis des Maloney-Maus-Leukämivirus dazu benutzt, ADA in hämatopoietischen Maus-Stammzellen zu exprimieren (Lim et al., 1987, Mil. Cell. Biol. 7, 3459). Solche retroviralen Kunstrukte enthielten jedoch kein dominantes Markergen, das eine Selektion und folglich eine effiziente Anreicherung von ADA exprimierenden Zellen ermöglichen würde.
- Es ist bemerkenswert, daß alle bisher hergestellten rekombinanten Retroviruskonstrukte zusätzlich zu dem ADA-Gen ein dominantes selektierbares Markergen führen (z.B. Neomycin- Phosphotransferase, Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase oder Dihydrofolat-Reduktase) und exprimierten dementsprechend ADA in vitro, konnten aber ADA nicht in vivo exprimieren, d.h. in Stammzellen von Versuchstieren (Williams et al., 1986, Proc. Natl. Adac. Sci. USA 83, 2566; McIvor et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 838; Zwiebel et al., 1986, Blood 68, 307).
- Die vorliegende Erfindung koppelt erstmals direkt die Expression des selektierbaren menschlichen MDR1-Markergens an die Expression des ADA-Gens durch Erzeugung eines MDR1-ADA-Fusionsgens, welches die Synthese eines bifunktionellen chimären Proteins in den Empfängerzellen des Wirts dirigiert und gleichzeitig Mehrfachchemikalienresistenz und effiziente ADA- Aktivität besitzt.
- Wie in Fig. 1 schematisch dargestellt ist, wurde eine menschliche MDR1-cDNA (siehe Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1987), 84, 3004 bis 3008) mittels eines synthetischen Linkers mit einer menschlichen ADA-cDNA verschmolzen und nach Standardverfahren, wie sie durch Velu et al., 1987, Science 238, 1408, beschrieben sind, zwischen die 5' und 3' langen terminalen Sequenzwiederholungen (LTRs) des Harvey-Maus- Sarcomvirus-Expressionsvektors pC06-HX plaziert. Alle Zwischenstufen sowie die Endkonstrukte wurden durch Restriktionsendonuklease-Kartierung charakterisiert.
- Als erster Schritt (Fig. 1A) wurde ein 1,1kb-Asp-718-HhaI- Fragment, das einen carboxyterminalen Bereich des NDR1-Genprodukts P-Glykoprotein (von Val-926 bis Lys-1278 reichend) von dem Plasmid pMDR1-104-2 isoliert. Zwei Oligonucleotide, nämlich ein 12-mer und ein 18-mer, wurden synthetisiert und reassoziieren lassen und ergaben einen DNA-linker mit HhaIund HindIII-kompatiblen Enden, der eine einfache SalI-Restriktionsstelle enthielt. Der DNA-Linker kodiert die beiden carboxyl-terminalen Aminosäurereste von P-Glycoprotein.
- In einem zweiten, in Fig. 1 B gezeigten Schritt wurde menschliche ADA-cDNA entsprechend der von Adrian et al., 1984, Hum. Genet. 68, 169, beschriebenen ADA-211-cDNA als 1,5-kb-EcoRI- Fragment in das Plasmid pUC8 subkloniert. Das Klon pUC8-ADA wurde dann teilweise mit NcoI digeriert, um zwei Typen linearisierter Moleküle zu ergeben, die beide durch Agarosegel- Elektrophorese isoliert wurden. Die gewünschte linearisierte Form von pUC8-ADA wurde innerhalb des Codons für das Initiator-Methionin von ADA gespalten. Um dieses Codon wieder herzustellen, wurden die Enden des linearisierten Plasmids unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I aufgefüllt. Dann wurde ein nichtphosphorylierter SalI-Linker (der die neuen Aminosäuren (Arg-Pro) der abschließenden Tripeptid- Verbindung zwischen P-Glycoprotein und ADA trägt) durch Ligasierung hinzugefügt, und es wurde das Plasmid pESE-13 erhalten.
- Im nächsten, in Fig. 10 umrissenen Schritt wurden die menschlichen MDR1- und ADA-Gene an der neugeschaffenen einfachen SalI-Stelle verschmolzen, die am 3'-Ende des das P-Glycoprotein kodierenden Bereichs (pAHSH-1) und am 5'-Ende des ADA-Strukturgens (pESE-13) gelegen ist. Im gleichen Zuge wurde das Fusionsgen in den pGEM-2-Vektor insertiert (Promega). Zu diesem Zweck wurden ein 2,9-kb-EcoRI-SacI- Fragment (das pGEM-2-Plasmidsequenzen enthält) und ein 2,9- kb-SacI-Asp-718-Fragment (das den aminoterminalen Teil P- Glycoproteins kodiert) von pMDR1-2000XS isoliert (Ueda et al., 1987, Acad. Sci. USA 84, 3004) und mit einem 1,1-kb-Asp- 718-SalI-Fragment von pAHSH-1 (das den kodierenden Bereich für den carboxylterminalen Teil von P-Glycoprotenin trägt) ligasiert und ein 1,4-kb-SalI-EcoRI-Fragment von pESE-13 (welches das Strukturgen für ADA enthält) isoliert. In dem resultierenden Plasmid (pMDRADAS) war eine einfache SacII- Stelle am 5'-Ende des Fusionsgens vorhanden und könnte für seine Übertragung in den Retrovirus-Expressionsvektor pCO6-HX benutzt werden (Velu et al., 1987, Science 238, 1408).
- Für diesen Zweck mußte jedoch ein zweiter Mutationsort, nämlich ein einfacher XhoI-Mutationsort, am 3'-Ende des Fusionsgens neu geschaffen werden. Deshalb wurde pMDRADAS mit EcoRI teilweise geschnitten, um das Molekül zu linearisieren, unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I aufgefüllt, und mit nichtphosphorylierten XhoI-Linkern ligasiert. Das Fusionsgen wurde dann aus pMDRADA-XS als ein 5,45-kb- SACII-Xho-I-Fragment ausgeschnitten und mit dem 10,7-kb- SACII-Xhoi-Fragment ligasiert, das von pHaMDR1 abgeleitet ist und die Retrovirus-Vektorsequenzen enthält. Das endgültige Konstrukt wird mit pHaMDR1ADA bezeichnet und trägt das menschliche MDR1-ADA-Fusionsgen zwischen den 5'-und 3'- LTRs des Harvey-Maus-Sarcomvirus. Das MDR1-ADA-Fusionsgen ist das einzige funktionelle eukaryontische Gen in diesem Vektor und kodiert ein chimäres Protein mit einer erwarteten Mr von 210kd. Es besteht aus P-Glycoprotein, das mit der carboxylterminalen Aminosäure Gln-1280 mit dem Initiator-Methionin von ADA durch das Tripeptid Gly-Arg-Pro verbunden ist.
- Eine Hinterlegung des pHaMDR1ADA ist bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, am 18. Mai 1988 unter der Zugriffsnummer 67699 erfolgt.
- Chemikalienempfindliche menschliche KB-3-1-Zellen wurden mit pHaMDR1ADA-DNA transfektiert. Negative Kontrollzellen erhielten keine DNA, während positive Kontrollzellen mit pHaMDR1 transfektiert wurden, das die menschliche MDR1-DNA voller Länge in dem gleichen Harvey-Maus-Sarcomvirus-Expressionsvektor repräsentiert (siehe Fig. 10). Dieses Plasmid stellt menschliche MDR1-cDNA voller Länge in dem gleichen Harvey-Mäus-Sarcomvirus-Expressionsvektor dar (siehe Fig. 10). Dieses Plasmid verkörpert den vollständigen Phänotyp der Mehrchemikalienresistenz bei einer Vielfalt von Maus- und menschlichen Zelllinien.
- Für Zellentransfektionen verwendete Plasmid-DNA wurde durch alkalische Standard-Lyse isoliert, gefolgt von einer Cäsium- Chlodird-Gradientenzentrifugierung. Chemikalienempfindliche menschliche KB-3-1-Zellen wurden nach der Standard-Kalziumphosphat-Ausfällungsmethode trans fektiert. 10 Mikrogramm Plasmid-DNA wurden zum Transfektieren von 5 x 10&sup5; Zellen pro 10cm³&supmin;Schale verwendet. 16 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen zweimal gewaschen und 24 Stunden später wurden sie 1:5 in Medium aufgeteilt, welches das Selektions-Chemikalien-Colchicin mit einer Konzentration von 6 ng/ml enthielt.
- Nach einer Wachstumsperiode von 10 Tagen wurden zwei Schalen mit Zellen mit 0,5%igem (Gewicht/Volumen) Methylenblau in 10%igem (Volumen/Volumen) Ethanol gefärbt und individuelle Kolonien wurden gezählt. Die in Tafel I dargestellten Daten zeigen die relativen Transfektionswirkungsgrade der Plasmide pHaMDR1ADA und pHaMDR1.
- Von drei nichtgefärbten Schalen wurden 6 individuelle, Colchicin-resistente Kolonien aufgenommen und repräsentative Zellenansammlungen wurden gesammelt. Sowohl individuelle Klone als auch Zellenpopulationen wurden während mindestens 10 weiteren Tagen in Anwesenheit von 6 ng/ml Colchicin gezüchtet. Es hat sich gezeigt, daß aufgrund der Amplifikation des endogenen NDR1-Gens menschliche mehrfachchemikalienresistente Zellinien zunehmend chemikalienresistenter werden, wenn die Konzentration der Selektionschemikalie in dem Wachstumsmedium gesteigert wird. Um zu untersuchen, ob die übertragenen MDR1- bzw. MDR1ADA-DNA-Sequenzen ebenfalls amplifiziert werden, wurde die Cholchicinkonzentration in dem Kulturmedium der transfektierten Zellen stufenweise mit zweifachen Steigerungen bis zu 96 ng Cholchizin/ml angehoben. Sowohl die einzelnen Klone als auch die Zellenpopulationen wurden zwei Passagen in geeigneten Chemikalienkonzentrationen unterzogen, bevor sie in die next höhere Konzentration eingebracht wurden. Bei keiner Cholchicinkonzentration wurde ein Unterschied in der Wachstumsrate zwischen pHaMDR1- und pHaMDR1ADA-transfektierten KB-Zellen beobachtet, was anzeigt, daß die ADA-Fusion die funktionelle Aktivität von p- Glycoprotein in dem chimären Protein nicht beeinträchtigt.
- Um das Vorhandensein der eingefügten MDR1- bzw. MDR1ADA-Gene zu bestätigen und ihre Kopienzahl zu untersuchen, wurde genomische DNA von transfektierten und Kontroll-KB-Zellen mittels Standardverfahren isoliert (Chen et al., 1986, Cell 47, 381). Gleiche Mengen genomischer DNA wurden durch Restriktions-Endonukleasedigestion und Verwendung von EcoRI analysiert, gefolgt durch Agarosegel-Elektrophorese, Southern-Übertragung und Hybridisierung in eine MDR1-spezifische Sonde. Ein 3kb-Fragment von pHaMDR1-transfektierten Zellen und ein 4-kb-Fragment von pHaMDR1ADA-transfektierten Zellen gaben vermutlich Anlaß für ein Hybridisierungssignal. Tatsächlich, wie in Fig. 2 gezeigt ist, wurden starke Hybridisierungssignale der korrekten Größe sowohl für die transfektierten individuellen Klone als auch für die Zellenpopulationen erhalten, was anzeigt, daß die integrierten DNA-Sequenzen intakt waren. Ein schwaches 1,8-kb-Hybridisierungssignal wurde in allen untersuchten Zellen einschließlich der Eltern-KB-3-1-Zelllinie und in einem scheintransfektiertem KB-Klon nachgewiesen. Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird postuliert, daß dieses Signal wahrscheinlich von dem endogenen Einfachkopie-MDR1-Gen abgeleitet ist. Die Intensität der 3-kb- und 4-kb-Hybridisierungssignale zeigt an, daß die pHaMDR1-und pHaMDR1ADA-transfektierten Zellen Mehrfachkopien der eingeführten DNA-Sequenzen enthalten. Jedoch konnte aus den in Fig. 3 dargestellten Daten nicht definitiv geschlossen werden, ob in der durch zunehmende Colchicinkonzentrationen im Kulturmedium bewirkten weiteren Amplifikation in den Zellenpopulationen (Fig. 2, Bahnen 2 und 4) sich nicht einfach nur eine Anreicherung von Zellen wiederspiegelt, die hohe Pegel des MDR1- oder MDR1ADA-Gens selbst bei niedrigem Colchicinkonzentrationen expremieren. Darüber hinaus ist auch eine mögliche Umordnung der eingeführten DNA-Sequenzen in pHaMDR1ADA-transfektierten Zellen möglich (Fig. 2B Bahn 4).
- Nachdem die Anwesenheit der eingeführten DNA-Sequenzen in pHaMDR1ADA-und pHaMDR1-transfektierten KB-Zellen bestätigt worden war, war es wichtig, ihre Expression zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden Immunpräzipitationen unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antiserums gegen die carboxylterminalen Bereiche von P-Glycoprotein durchgeführt. Es wurden Zellenkulturen mit (³&sup5;S)-Methionin während 16 Stunden radiomarkiert und Zellenlysate zubereitet. Antigen- Antikörper-Komplexe konnten sich während 18 Stunden bei 4ºC bilden und wurden dann mit Protein-A-Sepharose (Sepharose ist eine eingetragene Handelsmarke) ausgefällt. Die ausgefällten Proteine wurden durch Elektrophorese auf einem 7%igen SDS- Polyacrylamidgel und nachfolgender Fluorographie analysiert. Wie in Fig. 3 dargestellt ist, wurde P-Glykoprotein mit einer Mr von 170kd in pHaMDR1-transfektierten Zellen nachgewiesen. Das immunausgefällte Protein aus pHaMDR1ADA-transfektierten Zellen besitzt eine höhere Mr, was in guter Übereinstimmung mit der berechneten Mr von 210kd des MDR1ADA Fusionsproteins steht. Des weiteren scheinen die Werte des chimären Proteins zusammen mit der Colchicinresistenz der Zellen zuzunehmen.
- Nachdem demonstriert wurde, daß das exprimierte MDR1ADA-Fusionsprotein intakt ist, war es wesentlich, zu testen, ob der ADA-Teil funktionell aktiv war. Um die ADA-Funktion zu demonstrieren, wurde die Empfindlichkeit von pHaMDR1ADA-transfektierten Zellen auf 2'-Desoxycoformycin (dCF) in Anwesenheit von toxischen Konzentrationen von Adenosin untersucht und mit der Empfindlichkeit von pHaMDR1-transfektierten Zellen verglichen. dCF ist ein sich fest bindender Übergangszustand- Analoginhibitor ADA (Dd = 2,5 x 10&supmin;¹², Agarwal et al., 1977, Biochem. Pharmacol., 26, 359; Frieden et al., 1980, Biochemistry 19, 5303). Unter Bedingungen, unter denen ADA-Aktivität gefordert ist (beispielsweise in Anwesenheit von cytotoxischen Mengen von Adenosin) kann dCF zum Schätzen intrazellulärer ADA-Werte benutzt werden. Die zum Hemmen des Zellenwachstums notwendigen Mengen von dCF korrelierten mit den Mengen an funktionellem ADA. Die Abtötungskurven wurden durch Züchten einer konstanten Anzahl von Zellen (ursprünglich wurden 300 Zellen in einer 60-mm-Schale eingebracht) in Kulturmedium durchgeführt, das mit 1,1 mM Adenosin, 1,0 mM Uridin, 0,05 mM Alanosin und veränderlichen Mengen dCF ergänzt war. Alanosin wurde zugegeben, um eine erneute AMP- Synthese zu blockieren, und Uridin wurde zugegeben, um die Blockierung der UMP-Synthese abzuschwächen, die durch die hohe Adenosinkonzentration verursacht wurde. Nach Inkubation bei 37ºC in 7%CO&sub2; während 10 Tagen wurden die Zellen mit 0,5%igem (Gewicht/Volumen) Methylenblau in 50%igem (Volumen/Volumen) Ethanol gefärbt und die Kolonien wurden gezählt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt, und ID&sub5;&sub0;-- Werte sind in Tafel II dargestellt. Der ID&sub5;&sub0;-Wert entspricht der Konzentration von dCF, der den Anteil lebensfähiger Zellen auf 50% der Kontrolle ohne dCF reduziert. Die Daten zeigen klar, daß pHaMDR1ADA-transfektierte Zellen höhere Konzentrationen dCF überleben als pHaMDR1-transfektierte Zellen oder scheintransfektierte Kontrollzellen. Folglich ist zu schließen, daß ADA als Teil des chimären MDR1-ADA-Fusionsproteins funktionelle ist. Der Nachweis für enzymatische Aktivität, hauptsächlich in der Membranfraktion der transfektierten Zellen liegt, ist in Tafel III gezeigt.
- Es sollte beachtet werden, daß MDR1 nur ein Beispiel eines wählbaren Markergens ist. Mit der hier erläuterungshalber beschriebenen Methodologie kann natürlich irgendein wählbares Markergen in gleicher Weise zur Herstellung eines chimären Gens angewendet werden. Des weiteren kann das gekoppelte Gen, das durch Fusion mit dem wählbaren Markergen eingeführt wird, verändert werden (beispielsweise durch Mutation), und die Wirkungen solcher Veränderungen können in intakten lebenden Zellen bestimmt werden. Solche Manipulationen ermöglichen die Bestimmung der Auswirkung der Veränderung und die Verifizierung, daß das mutante Gen tatsächlich eingebaut ist und als Polypeptid exprimiert wird. Bei dem vorliegenden Beispiel könnte das an das ADA-Gen gekoppelte menschliche MDR1-Gen zum Einbau mutanter ADA-Proteine in Zellen zur Bestimmung der Funktion der verschiedenen Teile ADA-Moleküls benutzt werden. Da ADA außerdem über die Desoxycoformycin-Selektion ein wählbares Markergen in Gewebekulturzellen ist, kann ADA als wählbarer Marker zum Einbau eines veränderten MDR1-Gens in Zellen benutzt werden, um dadurch die Bestimmung der Funktion der verschiedenen Modifikationen des MDR1-Proteins zu ermöglichen. Tafel 1 Transfektionen menschlicher KB-3-1-Zellen mit pHaMDR1ADA und pHaMDR1
- KB-3-1-Zellen wurden mit 5 x 10&sup5; Zellen/10cm-Schale plattiert und am nächsten Tag mit den angegebenen DNAs transfektiert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen trypsinisiert und 1:5 in Kulturmedium aufgeteilt, das mit 6ng/ml Colchicin ergänzt war. 10 Tage später wurden die Kolonien mit Methylenblau gefärbt und gezählt. Tafel II Empfindlichkeit transfektierter KB-Zelllinien gegen 2'-Desoxycoformycin in Anwesenheit toxischer Konzentrationen von Adenosin
- KB-A, KB-MDR1, KB-MDR1ADA-G, und KB-MDR1ADA-I sind individuelle Klone. Tafel III ADA-Aktivität roher Membran- und cytosolischer Fraktionen von Eltern- und transfektierten KB-Zellinien
- Es wurden ADA-Tests durchgeführt nach C.Y. Yeung, D.E. Ingolia, C. Bobonis, B.S. Dunbar, M.E. Riser, M.J. Sciliano, R.E. Kellems (1983) J. Biol. Chem. 258, 8338 bis 8345. Zur Bestimmung der ADA-Aktivität in der Membran- bzw. cytosolischen Fraktion wurden Zellen durch Abschaben in PBS gesammelt, zweimal mit PBS gewaschen, in hypotonischem Lyse- Puffer resuspendiert (10mMtris-HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl&sub2;) mit einer Konzentration von 2 x 10&sup7; Zellen/ml und in einem Eisbad während 15 Minuten inkubiert. Die angeschwollenen Zellen wurden mit 20 Schlägen in einem straff sitzenden Dounce-Homogenisieres aufgebrochen und die Kerne wurden durch Zentrifugieren bei 400 x g während 10 Minuten bei 4ºC entfernt. Das durch anschließendes Zentrifugieren bei 30.000 x g während 30 Minuten bei 4ºC gewonnene Pellet wurde als die rohe Membranfraktion und der Überstand als die cytosolische Fraktion verwendet.
Claims (12)
1. Fusioniertes Gen, das im lebenden Organismus exprimierbar
ist und eine kodierende Sequenz für einen wählbaren Marker
aufweist, der durch Verschmelzung an eine zweite kodierende
Sequenz gekoppelt ist, was ein einzelnes offenes Leseraster
ergibt, das ein chimäres Fusionsprotein kodiert, das in
Empfängerzellen exprimiert werden soll, dadurch
gekennzeichnet, daß der wählbare Marker ein menschliches MDR1-Gen ist.
2. Fusioniertes Gen nach Anspruch 1, wobei die zweite
kodierende Sequenz ein ADA-Gen ist.
3. Fusioniertes Gen nach Anspruch 1 oder 2, wobei das
fusionierte Gen die Eigenschaften des im Plasmid ATCC 67699
geführten MDR1ADA-Fusionsgens aufweist.
4. Fusioniertes Gen nach Anspruch 3, wobei das fusionierte
Gen in einem Expressionsvektor kloniert ist.
5. Fusioniertes Gen nach Anspruch 4, wobei der resultierende
Expressionsvektor die identifizierenden Eigenschaften von
ATCC 67699 aufweist.
6. Verfahren zum Bestimmen der Auswirkung einer Änderung der
Sequenz eines fusionierten Gens nach Anspruch 1, welches den
Schritt der Änderung der zweiten kodierenden Sequenz und des
Bestimmens der resultierenden Auswirkung dieser Änderung auf
die Funktion des genannten fusionierten Gens umfaßt.
7. Fusioniertes Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur
Verwendung in einem Verfahren zur Linderung eines Zustands, der
von einer genetischen oder einer erworbenen Krankheit
herrührt, die mit der zweiten kodierenden Sequenz in
Zusammenhang steht, wobei das fusionierte Gen in Zellen eines Wirts
eingeführt werden und die zweite kodierende Sequenz im
lebenden Organismus exprimiert wird.
8. Verwendung eines fusionierten Gens nach einem der
Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments zur
Verwendung bei einem Verfahren zur Linderung eines Zustands, der
von einer genetischen oder erworbenen Krankheit herrührt, die
mit der zweiten kodierenden Sequenz im Zusammenhang steht,
wobei das fusionierte Gen in Zellen eines Wirts eingeführt
wird und die zweite kodierende Sequenz im lebenden Organismus
exprimiert wird.
9. Bifunktionales chimäres Protein, das durch ein
fusioniertes Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 7 kodiert
ist.
10. Bifunktionales chimäres Protein nach Anspruch 9, das ein
menschliches MDR1-Genprodukt, P-Glycoprotein, aufweist, das
an seinem carboxyterminalen Aminosäurerest Gln-1280 an die
aminoterminale Aminosäure eines Genprodukts einer zweiten
kodierenden Sequenz gekoppelt ist.
11. Bifunktionales chimäres Protein nach Anspruch 10, wobei
der carboxyterminale Aminosäurerest Gln-1280 des
P-Glycoproteins an die aminoterminale Aminosäure des Genprodukts der
zweiten kodierenden Sequenz durch ein kurzes Peptid mit der
Sequenz Gly-Arg-Pro gekoppelt ist.
12. Bifunktionales chimäres Protein nach Anspruch 11, wobei
das kurze Peptid mit dem Initiator-Methionin von ADA-Protein
verbunden ist.
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