Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

DE69028402T2 - Verfahren zur markierung und zum nachweis von stoffen mit nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zur markierung und zum nachweis von stoffen mit nukleinsäuren

Info

Publication number
DE69028402T2
DE69028402T2 DE69028402T DE69028402T DE69028402T2 DE 69028402 T2 DE69028402 T2 DE 69028402T2 DE 69028402 T DE69028402 T DE 69028402T DE 69028402 T DE69028402 T DE 69028402T DE 69028402 T2 DE69028402 T2 DE 69028402T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
substance
nucleic acid
label
oligodeoxynucleotides
nucleic acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69028402T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69028402D1 (de
Inventor
Gavin Dollinger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23397459&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69028402(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of DE69028402D1 publication Critical patent/DE69028402D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69028402T2 publication Critical patent/DE69028402T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G09—EDUCATION; CRYPTOGRAPHY; DISPLAY; ADVERTISING; SEALS
    • G09F—DISPLAYING; ADVERTISING; SIGNS; LABELS OR NAME-PLATES; SEALS
    • G09F3/00—Labels, tag tickets, or similar identification or indication means; Seals; Postage or like stamps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C06—EXPLOSIVES; MATCHES
    • C06B—EXPLOSIVES OR THERMIC COMPOSITIONS; MANUFACTURE THEREOF; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS EXPLOSIVES
    • C06B23/00—Compositions characterised by non-explosive or non-thermic constituents
    • C06B23/008—Tagging additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21H—PULP COMPOSITIONS; PREPARATION THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASSES D21C OR D21D; IMPREGNATING OR COATING OF PAPER; TREATMENT OF FINISHED PAPER NOT COVERED BY CLASS B31 OR SUBCLASS D21G; PAPER NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D21H21/00—Non-fibrous material added to the pulp, characterised by its function, form or properties; Paper-impregnating or coating material, characterised by its function, form or properties
    • D21H21/14—Non-fibrous material added to the pulp, characterised by its function, form or properties; Paper-impregnating or coating material, characterised by its function, form or properties characterised by function or properties in or on the paper
    • D21H21/40—Agents facilitating proof of genuineness or preventing fraudulent alteration, e.g. for security paper
    • D21H21/44—Latent security elements, i.e. detectable or becoming apparent only by use of special verification or tampering devices or methods
    • D21H21/46—Elements suited for chemical verification or impeding chemical tampering, e.g. by use of eradicators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/13—Tracers or tags

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

  • Verfahren zur Markierung und zum Nachweis von Stoffen mit Nucleinsäuren
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Markierung und zum Nachweis von Stoffen unter Verwendung von Nucleinsäuren als Markierungen. Das Markierungsverfahren umfaßt das Verändern einer Substanz in einer Weise, die die nachfolgende Identifizierung der Substanz durch Nachweis der Veränderung erlaubt. Die hier offenbarte Veränderung umfaßt Nucleinsäuren.
  • Die Gesellschaft versucht gegenwärtig die Herstellung und Verteilung einer großen Anzahl von verschiedenartigen Substanzen zu verfolgen, umfassend (1) natürliche Rohstoffquellen, wie Tiere, Pflanzen, Öl, Mineralien und Wasser; (2) Chemikalien, wie Arzneimittel, Lösungsmittel, Erdölprodukte und Sprengstoffe; (3) industrielle Abfallprodukte, einschließlich Schadstoffen, wie radioaktive oder andere gefährliche Abfälle; und (4) Industriewaren, wie Gewehre, Schreibmaschinen, Autos und Autoteile. Die Markierung hilft bei der Feststellung der Produktidentität und liefert so für Hersteller und Verbraucher nützliche Informationen.
  • Einige der verschiedenartigen Anwendtingen von Markierungsverfahren und -reagentien umfassen die Identifizierung des Herstellers eines Sprengstoffs, auch nach der Detonation, und die Ermittlung von Fließdiagrammen, um die Ausbreitung von Schadstoffen zu bestimmen. Die vorliegende Erfindung stellt auf diesem Gebiet einen bedeutenden Vorteil bereit, da die Markierungen beträchtliche Informationsmengen codieren können, um die nachfolgende Identifizierung zu fördern. Außerdem kann man unter Anwendung der seit kurzem verfügbaren Amplifikationstechnik weit weniger Mengen der Markierung nachweisen, als je zuvor. In der Tat arbeiten die gegenwärtigen Markierungsverfahren mit solch verschwindend kleinen Markierungsmengen, daß durch das vorliegende Verfahren markierte Arzneimittel noch die FDA-Standards (10 pg/Dosis) für die DNA-Menge, in diesem Fall Markierungs-DNA, in einem Produkt erfüllt.
  • Die Anwendung der Markierung von Substanzen mit Polypeptiden ist bekannt. Vgl. US-Patente Nrn. 4,359,353 und 4,441,943. Wie bei den Nucleinsäure-Markierungen der vorliegenden Erfindung, nutzen die Polypeptid-Markierungen die Reihenfolge der Aminosäuren, um Informationen zu codieren.
  • Die Europäische Patentveröffentlichung Nr.231 608 beschreibt ein Verfahren zur Markierung eines Mikroorganismus durch die Integration einer spezifischen DNA-Sequenz mit mindestens 15 Nucleotiden in dessen Genom. Die PCT-Patentveröffentlichung Nr. 87/06383 beschreibt ein Verfahren zur Markierung von Artikeln, deren Echtheit bescheinigt werden soll, durch eine Signalsequenz einer Nucleinsäure mit 1.000 bis 10.000 Nucleotiden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Markierung eines Stoffs (einer Substanz) durch das Behandeln des Stoffs mit einer Nucleinsäure-Markierung bereit, so daß die Nucleinsäure an den Stoff in einer für den nachfolgenden Nachweis ausreichenden Menge angelagert wird. Die Nucleinsäure-Markierung umfaßt eine spezifische Nucleotidsequenz oder weist eine bestimmte Zusammensetzung aus spezifischen Nucleotiden auf, um den Nachweis zu erleichtern. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis eines mit einer Nucleinsäure-Markierung markierten Stoffs bereit, das den Nachweis der Gegenwart einer für diese Markierung in dem Stoff spezifischen Nucleinsäuresequenz umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Nachweisverfahren auch das Behandeln des Stoffs unter Bedingungen, die zur Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz einer Markierung, falls vorhanden, führen, um nachzuweisen, ob die spezifische Nucleinsäuresequenz vorhanden ist.
  • Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Überwachung der Gegenwart einer Substanz, die in die Umgebung oder den Handelsstrom freigesetzt wird, wie in den beigefügten Ansprüchen definiert. Eine zusätzliche Stufe der Amplifikation der Nucleinsäure wird hier ebenfalls beschrieben. Diese Amplifikation wird üblicherweise vor dem Nachweis durchgeführt und wird vorzugsweise unter Anwendung der Polymerase- Kettenreaktionstechnik durchgeführt. Die Nucleinsäuren können entweder natürlich vorkommende oder synthetisch abgeleitete Nucleinsäuren sein. Bevorzugte synthetische Nucleinsäuren sind aus Inosinbasen oder 7-Deazo-2'-desoxyguanosinnucleotiden aufgebaut.
  • Die erfindungsgemäßen Stoffe oder Substanzen umfassen diejenigen, die aus der Gruppe bestehend aus luftverschmutzenden Substanzen, Ölen, aromatischen Verbindungen, explosiven Zusammensetzungen, Nahrungsmitteln, Arzneimitteln, Tinten, Papierwaren und Farbenprodukten ausgewählt sind. Die Nucleinsäuren können wahlweise an eine Komponente der markierten Substanz über eine kovalente Bindung gebunden sein. Der Begriff "kovalent an eine Komponente der Substanz gebunden" bedeutet, daß die Nucleinsäuren kovalent an den markierten Stoff oder eine Komponente davon gebunden sind. Ist der Stoff aus verschiedenen Komponenten aufgebaut, z.B. aus verschiedenen chemischen Verbindungen, kann die Nucleinsäure kovalent an eine beliebige oder an alle Komponente(n) gebunden sein.
  • Die als Markierungen verwendeten Nucleinsäuren können frei sein oder sie können kovalent an einen festen Träger (wie Latexkügelchen, Dextran oder magnetische Kügelchen) gebunden sein, der dann mit dem zu markierenden Stoff gemischt wird. Alternativ können die Nucleinsäuren von polymeren Substanzen (wie Proteine) oder lipophilen Zusammensetzungen (wie Liposome) eingekapselt sein.
  • Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Markierung von Substanzen bereit, wie in den beigefügten Ansprüchen definiert. Die bevorzugten Markierungen und Substanzen entsprechen den vorstehend beschriebenen.
  • Die folgenden Definitionen werden angegeben, um die Erfindung verständlicher zu machen.
    • Substanz:
  • Ein Stoff, der entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren markiert und nachgewiesen werden kann.
    • Nucleinsäure:
  • Ein Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotidpolymer in entweder einzel- oder doppelsträngiger Form; die Nucleinsäure kann vollständig oder zum Teil aus modifizierten Nucleotiden bestehen.
    • Markierung:
  • Eine Nucleinsäure, die eine spezifische Nucleotidsequenz umfaßt oder eine spezifische Nucleotidzusammensetzung aufweist, wobei die Spezifität der Sequenz oder Zusammensetzung ein Verfahren zur Informationsspeicherung bereitstellt. Die Markierungen haben üblicherweise keine biologische Funktion, da sie nicht Teil einer funktionellen Nucleinsäuresequenz sind, die in einer lebenden Zelle wirksam ist. Dem Fachmann ist bekannt, daß lebende Organismen einzigartige Nucleinsäuresequenzen enthalten, die entweder natürlich sind oder künstlich eingeführt wurden. Diese Erfindung soll diese natürlich vorkommenden und biologisch funktionellen Formen der Markierungen nicht umfassen. Die Markierungen werden im allgemeinen zu den Substanzen hinzugefügt. Sie sind kein funktioneller Teil der Substanz.
    • Markierung:
  • Verfahren zur Behandlung eines Stoffs mit einer Zusammensetzung, der Markierung, für die nachfolgende Identifizierung des Stoffs durch Nachweis der Markierung.
    • Nachweis:
  • Verfahren zur Bestimmung der Herkunft oder des Ursprungs eines Stoffs.
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung von Nucleinsäuren zur Überwachung, zum Nachweis und zur Verfolgung von Substanzen, die in die Umgebung oder den Handelsstrom freigesetzt werden. Die Nucleinsäuren werden als Zusatz verwendet, um solche Substanzen zu markieren. Die spezifischen Eigenschaften der Zusammensetzung der Nucleinsäure als Markierung und ihre nachfolgende Gewinnung für die Analyse ist abhängig von der spezifischen Substanz, zu der die Nucleinsäure zugegeben wird. Die folgenden Richtlinien werden angeboten.
    • Nucleinsäuren
  • Die in dieser Erfindung verwendeten Nucleinsäuren können eine unbegrenzte Informationsmenge bereitstellen. Durch die Verwendung von Kombinationen der allgemein verwendeten Sequenzen (als Industriestandards anerkannt) und die Variation der Mengen der spezifischen Sequenzen kann man den Typ der Produktgruppe, die Herkunft des Produkts (firmenspezifische Sequenzen), die Charge oder Füllung kennzeichnen und auch einen Nachweis für eine Handelseinheit bereitstellen.
  • Die für die Verwendung in dieser Erfindung geeignete Nucleinsäuren umfassen sowohl natürliche als auch nicht-natürliche Nucleinsäuren. Sie können einzel- oder doppelsträngig sein. Natürliche Nucleinsäuren beziehen sich auf Polymere aus entweder DNA oder RNA, die die 5 natürlich vorkommenden Basen Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil umfassen.
  • Nicht-natürliche oder synthetische Nucleinsäuren können in dieser Erfindung ebenfalls verwendet werden. Synthetische Nucleinsäuren weisen in einigen Fällen gegenüber natürlichen Nucleinsäuren Vorteile auf, z.B. in bezug auf Stabilität, Löslichkeit, etc. Der Abbau einiger synthetischer Nucleotide durch Nucleaseaktivität, chemisch aktive Stoffe oder Umweltbedingungen, wie Hitze und Ultraviolettstrahlung, ist weniger wahrscheinlich. Die Verwendung nicht-natürlicher Nucleotide wird nur durch ihre Fähigkeit begrenzt, durch ausgewählte Nachweisverfahren wirksam nachgewiesen zu werden. Für Markierungsverfahren unter Anwendung der bevorzugten PCR-Technik muß die synthetische Nucleinsäure mit dem Primern Doppelstränge bilden und als Matrize für die in dem Verfahren verwendeten Polymerasen dienen. Nicht-natürliche Nucleinsäuren für die erfindungsgemäße Verwendung schließen diejenigen ein, die Inosinbasen und derivatisierte Nucleotide, wie 7-Deazo-2'-desoxyguanosin, Methyl- (oder längere Alkyl-) phosphonat-Oligodesoxynucleotide, Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotide und α-anomere Oligodesoxynucleotide, umfassen.
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Nucleinsäuren können eine unbegrenzte Informationsmenge bereitstellen. Durch die Verwendung von Kombinationen der allgemein verwendeten Sequenzen (als Industriestandards anerkannt) Lind die Variation der Mengen der spezifischen Sequenzen kann man den Typ der Produktgruppe, die Herkunft des Produkts (firmenspezifische Sequenzen) und die Charge oder Füllung identifizieren oder deren Echtheit bescheinigen.
    • Markierte Substanzen
  • Die folgenden Substanzen begrenzen die Erfindung nicht, sie sollen dem Fachmann jedoch die Vielseitigkeit dieser Erfindung verständlich machen. Zum Beispiel wird erwartet, daß diese Erfindung Anwendung findet bei Sprengstoffen (wie Plastiksprengstoffe und Schießpulver), Aerosolen (wie Auto- und Industrieschadstoffe aus Schornsteinen), organischen Lösungsmitteln (z.B. von Chemischen Reinigungen, chemischen Fabriken, Flugplätzen und Tankstellen), Papierwaren (wie Zeitungen, Geld und Gerichtsdokumente), Tinten, Duftstoffen und pharmazeutischen Produkten (wie Arzneimittel).
  • Die Herstellung der Nucleinsäuren variiert entsprechend der Beschaffenheit der Substanz und je nach dein erwarteten Einfluß der Umgebung, in die die Substanz gebracht werden soll. Die Substanzen können als Feststoffe, Flüssigkeiten oder Gase klassifiziert werden. Die Substanzen können entweder inert oder aktiv sein, wobei Flüssigkeiten und Aerosole weiterhin entweder als polar oder unpolar unterteilt werden.
  • Inerte Feststoffe, wie Papier, viele pharmazeutische Produkte, Holz, einige Nahrungsmittel oder polymere Verbindungen (z.B. Kunststoffe), können mit der Markierung verarbeitet werden, oder die Markierung kann auf die Oberfläche des Feststoffs gesprüht werden. Die Markierungen können mit inerten Flüssigkeiten oder Gasen physikalisch gemischt werden.
  • Chemisch aktive Substanzen, wie Nahrungsmittel mit enzymatischer Aktivität, Polymere mit geladenen Gruppen oder säurebildende Arzneimittel, können den Zusatz eines Schutzstoffs zu den Nucleinsäure-Markierungen erforderlich machen. Schutzstoffe umfassen Substanzen, die die Nucleinsäuren einkapseln und sie vor dem enzymatischen oder chemischen Abbau schützen. Liposome stellen eine gegenwärtig verfügbare Technik für die Verwendung als Schutzkapsel für Nucleinsäuren dar. Typische Liposome umfassen durch Detergentien erzeugte Micellenkörper. Andere polymere Substanzen können zur elektrostatischen Bindung an oder zur Einkapselung der Nucleinsäure verwendet werden. Polymere Substanzen schließen Proteine ein, wie Virushüllproteine.
  • Das gleiche Verfahren wird für die Zugabe von Markierungen zu chemisch aktiven Flüssigkeiten angewendet, außer daß der Schutzstoff für eine Flüssigkeit vorzugsweise mit der Polarität der Flüssigkeit vereinbar ist. Die Vereinbarkeit der Markierung mit einer flüssigen Substanz wird sowohl für inerte als auch für chemisch aktive Flüssigkeiten bevorzugt. Zum Beispiel können Öle und andere unpolare Flüssigkeiten durch die Verwendung von Detergentien wirksam markiert werden, die der Markierung vor der Zugabe der Markierung zu der Flüssigkeit zugesetzt werden. Die gleichmäßige Verteilung in der Flüssigkeit wird durch die Brownsche Bewegung gewährleistet.
  • Für Gase werden die Markierungen einfach mit dem Gas gemischt. Der Grund dafür ist, daß die Markierung viel kleiner ist als das, was üblicherweise als Staubteilchen (0,2 µm) angesehen wird. Bei in Behältern abgefüllten Gasen werden die Markierungen in den Behälter eingebracht. Für Gase, die in die Atmosphäre freigesetzt werden, können die Markierungen vor der Freisetzung oder zum Zeitpunkt der Freisetzung beigemischt werden. Um den Verlauf der Ausbreitung von durch die Industrie freigesetzten Gasen zu verfolgen, kann zum Beispiel eine Aerosol-Verteilungsvorrichtung an einer Abgasaustrittsstelle angebracht und eine bestimmte Menge der Markierung eingeleitet werden, wenn das Gas freigesetzt wird.
  • Die Verwendung von Nucleinsäure-Markierungen zum Nachweis radioaktiver Produkte, einschließlich Abfällen, wird erwartet. Das Nachweisverfahren würde bei geeignetem Schutz den hier für nicht radioaktive Stoffe beschriebenen entsprechen. Es wird darauf hingewiesen, daß kurze Oligonucleotide von weniger als 1.000 Basen wegen ihrer größeren Stabilität gegenüber einem Abbau durch Strahlung bevorzugt werden.
    • Gewinnung und Nachweis der Markierungen
  • Die einer Substanz zugesetzte Menge und das bevorzugte Verfahren zur Gewinnung und zum Nachweis der Nucleinsäure-Markierung ist abhängig von der zu überwachenden Substanz. Das Nachweisverfahren und die Menge der verfügbaren Probe, die gewonnen wird, bestimmt die für jede Anwendung dieser Erfindung erforderliche Markierungsmenge. Deshalb ist die zugesetzte Menge der Markierung ohne ein Verfahren zur Amplifizierung der Markierung von der Logistik für das Sammeln einer ausreichenden Menge der Substanz, um eine nachweisbare Menge der Markierung zu gewinnen, abhängig.
  • Die bevorzugte Molekülstruktur der Nucleinsäure-Markierung variiert mit dem zum Nachweis der Nucleinsäure angewendeten Verfahren. Üblicherweise sind mindestens 20 Basen erforderlich, um eine hinreichende Spezifität für jede Markierung zu gewährleisten, so daß eine zufällige Kontamination keine falschen Ergebnisse zur Folge hat. Vorzugsweise sollte die Sequenz eine Vielzahl von Spezifitätsbereichen umfassen. Je länger die Sequenz ist, um so mehr Information kann übertragen werden. Jedoch ist bekannt, daß, je größer der Informationsgehalt der Markierung ist, es um so wahrscheinlicher ist, daß der Abbau zu einem Problem wird. Üblicherweise werden Fragmente mit einer Größe von unter 1 Kilobase bevorzugt.
  • Die Gewinnung der Markierung kann durch die Anwendung von Standardverfahren erreicht werden. Üblicherweise wird die Probe entweder mit destilliertem Wasser oder einer Pufferlösung gewaschen oder extrahiert. Der physiologische pH-Wert wird bevorzugt, da extreme pH-Werte die Nucleinsäure zersetzen können. Geladene Substanzen können einen Waschschritt in Salzpuffern mit hoher Molarität erforderlich machen, die als Ionenaustauscher mit den elektrostatisch gebundenen Nucleinsäuren wirken. Detergentien, entweder ionische oder nicht-ionische, sind zur Entfernung der Nucleinsäuren von Oberflächen oder aus Komplexen nützlich. Unter Anwendung von Extraktionsverfahren auf Phenol-Basis oder Phenol/Chloroform- Extraktionsverfahren kann man Nucleinsäure aus komplexen biologischen Substanzen oder aus Substanzen auf Öl-Basis gewinnen.
  • Die gewonnene Nucleinsäure kann mit Standardverfahren, wie Fällen mit Alkohol, Eindampfen oder Mikrofiltration, konzentriert werden.
  • Wegen den Empfindlichkeitsgrenzen für den Nachweis der Nucleinsäure, weist die Anwendung von Verfahren zur Amplifizierung der gewonnenen Markierung einen klar erkennbaren Vorteil auf. Zum Beispiel kann man das Nucleinsäuremolekül unter Anwendung des Polymerase-Kettenreaktionsverfahrens (PCR), offenbart in den US-Patenten Nr.4,683,202 und 4,683,195 und in den Europäischen Patentanmeldungen Nrn. 258,017 und 237,362, amplifizieren und nachweisen. Das PCR-Verfahren kann ohne Modifikation zur Amplifizierung einzelsträngiger Markierungen, doppelsträngiger Markierungen und DNA- oder RNA-Markierungen angewendet werden.
  • Dem Fachmann ist bekannt, daß die PCR-Amplifikation auf vielerlei Arten ausgeführt kann. Beispielsweise sind die inverse PCR und asymmetrische PCR bekannte Variationen dieses Verfahrens. Bei einer anderen Variation können Promotoren für die RNA-Transkription in Primer eingebaut werden, die dann bei der Vermehrung und Replikation durch PCR zur Erzeugung von RNA-Kopien der Zielsequenz verwendet werden können. Diese RNA-Kopien können wiederum mehrmals umgekehrt in DNA transkribiert werden, die dann durch PCR amplifiziert werden kann. Wie bei allen PCR- Verfahren können die Reaktionscyclen so oft wiederholt werden, wie gewünscht.
  • Für die PCR, das bevorzugte Verfahren zur Amplifikation, wird eine doppelsträngige Markierung bevorzugt, obwohl eine einzelsträngige Markierung nach dem ersten Amplifikationscyclus in eine doppelsträngige Form umgewandelt wird. Die Markierung ist vorzugsweise mindestens 60 Basen lang. Dies ermöglicht die Hybridisierung von zwei Primern, die vorzugsweise jeweils 20 Basen lang sind und die bei der Hybridisierung mit der Markierung durch einen internen Bereich zwischen den Primerspezifischen Bereichen der Markierung von etwa 20 zusätzlichen Basen getrennt sind.
  • Beim Nachweis der Nucleinsäure durch PCR muß die Zielsequenz vorher bekannt sein, um geeignete Primer bereitzustellen. Dieses erforderliche Wissen bietet eine wertvollen Grad an Sicherheit für jene, die ihn wünschen. Ohne die Primer, die geschützt bleiben können, kann die Markierung praktisch nicht nachweisbar sein.
  • Zum Nachweis der Markierungen kann man Standard- Nucleinsäurehybridisierungstests und die Nucleinsäuresequenzierung anwenden. Die Standard-Nucleinsäurehybridisierungstests umfassen Einphasen- und Mehrphasentests, wie Sandwich-Tests.
  • Das spezifische Nachweisverfahren ist für diese Erfindung nicht entscheidend. Die Nucleinsäurehybridisierungstechnik ist kein ruhendes Fachgebiet. Neue Entwicklungen sind vorauszusehen und diese Erfindung ist auf jede der neuen Verbesserungen anwendbar. Einen Überblick über den Stand des Fachgebiets findet man in Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, Hrsg. Hanes B.D. und Higgins S.J., IRL-Press, Wash. D.C. (1987).
  • Die Anwendung der Nucleinsäurehybridisierungstests macht das vorherige Wissen der nachzuweisenden Sequenz erforderlich. Das Wissen der Sequenz der Markierung erlaubt die Verwendung geeigneter komplementärer Oligonucleotide für Einfang- oder Signalzwecke.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform können die aus den Proben gewonnenen Nucleinsäuren unter Anwendung der herkömmlichen Sequenzierungstechnik sequenziert werden. Für diesen Zweck sind im Handel erhältliche Kits geeignet. Die grundsätzliche Sequenzierungstechnik leitet sich von grundlegenden Literaturstellen ab, wie dem Verfahren von Maxam und Gilbert zur DNA-Sequenzierung, beschrieben in Methods in Enzymology 65 (Teil 1), 497-559. Das Sequenzieren ist ein schwierigeres Verfahren, aber es bietet eine größere Zuverlässigkeit als Nucleinsäurehybridisierungstests. Der Grund dafür ist die mögliche Kontamination durch eine fremde Nucleinsäure mit einer ausreichenden Komplementarität, so daß sie mit den ausgewählten Sonden hybridisiert und falsch positive Ergebnisse liefert.
    • Kits
  • Diese Erfindung stellt auch ein Industrieprodukt bereit, wie einen zur Markierung und Überwachung von Substanzen entwickelten Kit. Ein solcher Kit umfaßt Nucleinsäure- Markierungen und zu den Markierungen komplementäre Polynucleotide. Die komplementären Polynucleotide können für die Verwendung als Signalsonden, Einfangsonden oder als Primer im PCR-Verfahren bestimmt sein. Die Kits können auch Signal-erzeugene Mittel enthalten, wie Enzyme, Radioisotope, fluoreszierende Marker und ähnliches.
  • Alle angeführten Literaturstellen dienen dazu, die Erfindung für den Leser verständlicher zu machen. Das darin enthaltene Wissen ist dem Fachmann gut bekannt.
  • Die folgenden Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und begrenzen die Erfindung nicht.
    • Beispiele
  • In allen folgenden Beispielen wurde eine doppelsträngige Markierung einer zu dem DQα-Allel 1.3 komplementären Sequenz verwendet. Diese Sequenz leitet sich von einem seltenen DQα-Typ ab und es besteht eine geringe Wahrscheinlichkeit, daß sie zufällig als Kontamination in den nachstehend beschriebenen Stoffen vorliegt. Die Markierung wurde auch mit ³²P markiert, um die Markierung während des gesamten Verfahrens experimentell zu verfolgen. Die einzigartige Sequenz eines Strangs dieser Markierung wurde in Tabelle 1 angegeben.
  • Die Markierung wurde gewonnen, wie nachstehend beschrieben. Alle Amplifikationen wurden mit 40 Cyclen in einem Perkins-Elmer Cetus Instruments Thermocyclisierer unter Verwendung der vom Hersteller bereitgestellten Protokolle und Reagentien durchgeführt. Die biotinylierten Primer GH26 und GH27 mit der in Tabelle 1 angegebenen Sequenz wurden zur Initiierung des PCR-Verfahrens verwendet. Tabelle 1: Nucleinsäuresequenzen für DQα, verwandte Primer und Sonden
    • PCR-Standardverfahren:
  • Das folgende PCR-Verfahren wurde zur Amplifizierung von DQα in jeder der nachstehend veranschaulichten verschiedenen Substanzen angewendet.
  • Das PCR-Grundgemisch besteht aus:
  • 10x TAQ-Puffer 10 µl
  • 100mM Tris-HCl pH 8.3
  • 500mM KCl
  • 15.0mM MgCl&sub2;
  • 10µM GH26 1.5 µl
  • 10µM GH27 1.5 µl
  • 100mM dNTPs 0.75 µl
  • 5U/µl TAQ 0.5 µl
  • destilliertes Wasser 35 µl
  • 50 µ1 des PCR-Grundgemischs wurden mit einer gleichen Menge der Probe gemischt. Jeder Cyclus umfaßte Inkubationen von 30 Sekunden bei 94ºC, gefolgt von 30 Sekunden bei 55ºC und 30 Sekunden bei 72ºC. Nach dem letzten (dem vierzigsten) Cyclus wurde das Probengemisch 10 Minuten bei 72ºC inkubiert.
  • Der Nachweis der durch PCR amplifizierten Markierung wird mit Nucleinsäurehybridisierungsstandardtests unter Verwendung der in Tabelle 1 angegebenen Einfangsonde erreicht. Das Protokoll für den Hybridisierungstest ist nicht entscheidend. Das angewendete Verfahren wurde in der PCT-Veröffentlichung Nr. 89/11548, veröffentlicht am 30. November 1989, ausführlich beschrieben. Kurz zusammengefaßt, wurde die Markierung durch die Hybridisierung an eine immobilisierte Sonde, GH89 (Tabelle 1), eingefangen. Die Sonde wurde unter Verwendung von Ultraviolettstrahlung auf einer positiv geladenen Nylonmembran immobilisiert.
    • A. Schießpulver Präparation:
  • (a) Gebe 16 ng der Markierung zu 1 ml destilliertem Wasser zu; (b) mische die Lösung mit 1 g Schießpulver auf Nitrocellulose-Basis; und (c) trockne an der Luft oder unter vermindertem Druck bei 85 ºC.
    • Gewinnung:
  • (a) Wasche das Schießpulver mit destilliertem Wasser (1 ml); (b) gebe 50 µl dieser Lösung dem PCR-Reaktionsgemisch zu oder bringe Schießpulverflocken direkt in 100 µl PCR-Reaktionsgemisch ein; und (c) amplifiziere.
    • B. Öl Präparation:
  • (a) Mische 40 µg der Markierung, 10 µl "Tween 80" (Detergens), 10 µl "Span 80" (Detergens) und 100 µl destilliertes Wasser miteinander; und (b) gebe das Gemisch zu 1,7 ml Öl zu. Die vereinigten Stoffe werden dann gründlich gemischt.
    • Gewinnung:
  • (a) Gebe das Öl direkt dem PCR-Gemisch zu, mische mit einem Vortexgerät und amplifiziere; oder wende eine Phenol-Chloroform-Standardextraktion an. Nach der Behandlung mit Phenol wird die Markierung in der Grenzschicht zwischen der Öl- und Wasserphase nachgewiesen.
    • C. Arzneimittel (wasserlösliche Tabletten) Präparation:
  • (a) Gebe 48 µg der Markierung zu 325 µl destilliertem Wasser zu; (b) füge 50 µl dieses Gemisches zu einer Tablette zusammen; und (c) lasse sie trocknen.
    • Gewinnung:
  • (a) Löse die Tablette in 5 ml H&sub2;O auf; (b) gebe 50 µl dieser Lösung dem PCR-Gemisch zu; und (c) amplifiziere.
    • D. Tinte Präparation:
  • (a) Falls wasserunlöslich, vermische sie, wie bei der Markierung von Öl, mit Detergentien. Falls wasserlöslich, gebe eine verdünnte Lösung der Markierung direkt zu der Tinte zu.
    • Gewinnung:
  • Wie vorstehend für Öle und Arzneimittel beschrieben.
    • E. Papierwaren Präparation:
  • (a) Gebe eine verdünnte Lösung der Markierung in einer Konzentration von 2-3 ng/cm² zu dem Papier zu; und (b) lasse es an der Luft trocknen oder trockne unter vermindertem Druck.
    • Gewinnung:
  • (a) Weiche das Papier in destilliertem Wasser mit oder ohne Detergentien ein, um die Solubilisierung zu unterstützen; (b) konzentriere gegebenenfalls die Markierung; und (c) amplifiziere mit dem PCR-Standardverfahren.
    • F. Nahrungsmittel Präparation:
  • (a) Gebe 20 ng Markierung je Gramm Nahrungsmittel durch physikalisches Mischen oder Sprühauftragung zu.
    • Gewinnung:
  • (a) Das Nahrungsmittel wird mit destilliertem Wasser gewaschen; (b) die Spüllösung wird gegebenenfalls konzentriert; und (c) das gespülte Material wird einem PCR-Standardverfahren unterzogen.

Claims (11)

1. Verfahren zur Überwachung der Gegenwart einer Substanz, die in die Umgebung oder den Handelsstrom freigesetzt wird, das umfaßt, daß man die Substanz für die nachfolgende Identifizierung durch Nachweis der Markierung mit einer Nucleinsäure mit mindestens 20 und weniger als 1.000 Nucleotiden, die kein funktioneller Teil der Substanz ist, markiert, die Substanz sammelt, die Nucleinsäure amplifiziert und die Nucleinsäure nachweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Stufe der Amplifikation unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion erreicht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nucleinsäure eine synthetische Nucleinsäure ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die synthetische Nucleinsäure Inosinbasen oder derivatisierte Nucleotide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 7-Deazo-2'- deoxyguanosin, Alkylphosphonat-Oligodeoxynucleotiden, Phosphorothioat-Oligodeoxynucleotiden and α-anomeren Oligodeoxynucleotiden umfaßt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Substanz ausgewählt ist aus luftverschmutzenden Substanzen, Ölen, aromatischen Verbindungen, explosiven Zusammensetzungen, Nahrungsmitteln, Arzneimitteln, Tinten, Papierwaren und Farbenprodukten.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Nucleinsäure kovalent an eine Komponente der Substanz oder an einen festen Träger, der mit der Substanz gemischt ist, gebunden ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Nucleinsäure in eine polymere Substanz oder eine lipophile Zusammensetzung eingekapselt ist.
8. Verfahren zum Markieren einer Substanz die in die Umgebung oder den Handelsstrom freigesetzt werden soll für die nachfolgende Identifizierung durch Nachweis der Markierung, das die Stufen umfaßt, daß man in oder auf die Substanz eine Nucleinsäure bringt mit einer spezifischen Sequenz von mindestens 20 und weniger als 1.000 Nucleotidbasen, die kein funktioneller Teil der Substanz ist, wobei die Nucleinsäure eine synthetische Nucleinsäure ist, die Inosinbasen oder derivatisierte Nucleotide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 7- Deazo-2'-deoxyguanosin, Alkylphosphonat-Oligodeoxynucleotiden, Phosphorothioat-Oligodeoxynucleotiden and α-anomeren Oligodeoxynucleotiden umfaßt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Substanz ausgewählt ist aus luftverschmutzenden Substanzen, Ölen, aromatischen Verbindungen, explosiven Zusammensetzungen, Nahrungsmitteln, Arzneimitteln, Tinten, Papierwaren und Farbenprodukten.
10. Verfahren nach einen der Ansprüche 8 oder 9, worin die Nucleinsäure kovalent an eine Komponente der Substanz oder einen festen Träger, der mit der Substanz gemischt ist, gebunden ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, worin die Nucleinsäure in eine polymere Substanz oder eine lipophile Zusammensetzung eingekapselt ist.
DE69028402T 1989-05-22 1990-05-16 Verfahren zur markierung und zum nachweis von stoffen mit nukleinsäuren Expired - Lifetime DE69028402T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35544589A 1989-05-22 1989-05-22
PCT/US1990/002709 WO1990014441A1 (en) 1989-05-22 1990-05-16 Methods for tagging and tracing materials with nucleic acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69028402D1 DE69028402D1 (de) 1996-10-10
DE69028402T2 true DE69028402T2 (de) 1997-04-17

Family

ID=23397459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69028402T Expired - Lifetime DE69028402T2 (de) 1989-05-22 1990-05-16 Verfahren zur markierung und zum nachweis von stoffen mit nukleinsäuren

Country Status (10)

Country Link
US (1) US5451505A (de)
EP (1) EP0477220B1 (de)
JP (1) JP3082942B2 (de)
AT (1) ATE142274T1 (de)
AU (1) AU643217B2 (de)
CA (1) CA2017211C (de)
DE (1) DE69028402T2 (de)
DK (1) DK0477220T3 (de)
ES (1) ES2091243T3 (de)
WO (1) WO1990014441A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102006044349A1 (de) * 2006-09-18 2008-03-27 Identif Gmbh Verfahren zum Vor-Ort-Authentifizieren einer Substanz

Families Citing this family (162)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5776713A (en) * 1988-02-02 1998-07-07 Biocode Ltd. Marking of products to establish identity and source
US5429952A (en) * 1988-02-02 1995-07-04 Biocode, Inc. Marking of products to establish identity and source
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
GB9010138D0 (en) * 1990-05-04 1990-06-27 Slater James H An ultrasensitive microtrace procedure for monitoring the origin,movement and fate of any liquid or solid material
US6083689A (en) * 1990-10-16 2000-07-04 Bayer Corporation Sensitive immunoassays utilizing antibody conjugates with replicable DNA templates
AU1248292A (en) 1990-12-06 1992-07-08 Affymax Technologies N.V. Sequencing by hybridization of a target nucleic acid to a matrix of defined oligonucleotides
US5639603A (en) * 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
DE69217497T2 (de) 1991-09-18 1997-06-12 Affymax Tech Nv Verfahren zur synthese der verschiedenen sammlungen von oligomeren
JPH07505765A (ja) * 1992-02-04 1995-06-29 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 核酸の複製によるアッセイのリポーターの増幅
GB9218131D0 (en) * 1992-08-26 1992-10-14 Slater James H A method of marking a liquid
US5985548A (en) * 1993-02-04 1999-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Amplification of assay reporters by nucleic acid replication
GB9314394D0 (en) * 1993-07-12 1993-08-25 Slater James H A security device using an ultrasensitive microtrace for protecting materials,articles and items
US5503805A (en) * 1993-11-02 1996-04-02 Affymax Technologies N.V. Apparatus and method for parallel coupling reactions
US6165778A (en) * 1993-11-02 2000-12-26 Affymax Technologies N.V. Reaction vessel agitation apparatus
GB9326277D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Marconi Gec Ltd Labelling
AU701932B2 (en) * 1994-12-08 1999-02-11 Pabio Chemical labelling of objects
US5776737A (en) * 1994-12-22 1998-07-07 Visible Genetics Inc. Method and composition for internal identification of samples
US6458530B1 (en) * 1996-04-04 2002-10-01 Affymetrix Inc. Selecting tag nucleic acids
US6110710A (en) * 1996-10-15 2000-08-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Sequence modification of oligonucleotide primers to manipulate non-templated nucleotide addition
WO1998046544A1 (en) * 1997-04-17 1998-10-22 The Dow Chemical Company Encapsulated vapor-detection and identification tags
NO972556D0 (no) * 1997-06-05 1997-06-05 Forskningsparken I Aas As Metode for merking av væsker og objekter
DE19738816A1 (de) * 1997-09-05 1999-03-11 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zur Markierung von festen, flüssigen oder gasförmigen Substanzen
AU6331398A (en) * 1998-02-20 1999-09-06 Biotraces, Inc. Methods and additives for microtagging fluids
GB9822729D0 (en) * 1998-10-20 1998-12-16 Wrc Plc Release system for a marker substance
DE19860546A1 (de) * 1998-12-23 2000-06-29 Knoell Hans Forschung Ev Verfahren zur Identifikation der Herkunft von organischen Flüssigkeiten
AU717638B3 (en) * 1999-01-18 2000-03-30 Legends Genuine Memorabilia Pty Ltd Product and method
US6153389A (en) * 1999-02-22 2000-11-28 Haarer; Brian K. DNA additives as a mechanism for unambiguously marking biological samples
US6806478B1 (en) * 1999-03-16 2004-10-19 Cryovac, Inc. Authentication system and methodology
US6908737B2 (en) * 1999-04-15 2005-06-21 Vitra Bioscience, Inc. Systems and methods of conducting multiplexed experiments
JP2002542463A (ja) * 1999-04-15 2002-12-10 バーチャル・アレイズ・インコーポレーテッド コード位置に指標を有するコンビナトリアルケミカルライブラリー
US20030207249A1 (en) * 1999-04-15 2003-11-06 Beske Oren E. Connection of cells to substrates using association pairs
US7253435B2 (en) 1999-04-15 2007-08-07 Millipore Corporation Particles with light-polarizing codes
US20030134330A1 (en) * 1999-04-15 2003-07-17 Ilya Ravkin Chemical-library composition and method
US20030129654A1 (en) * 1999-04-15 2003-07-10 Ilya Ravkin Coded particles for multiplexed analysis of biological samples
US20030166015A1 (en) * 1999-04-15 2003-09-04 Zarowitz Michael A. Multiplexed analysis of cell-substrate interactions
US7112445B1 (en) * 2000-05-19 2006-09-26 Richard P Welle Fragmented taggant coding system and method with application to ammunition tagging
DE19934573C2 (de) * 1999-07-22 2002-12-05 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zur Markierung von festen, flüssigen und gasförmigen Substanzen
GB9927292D0 (en) 1999-11-19 2000-01-12 Maxwell Paul Security system
US7157564B1 (en) 2000-04-06 2007-01-02 Affymetrix, Inc. Tag nucleic acids and probe arrays
WO2003036265A2 (en) * 2001-10-26 2003-05-01 Virtual Arrays, Inc. Assay systems with adjustable fluid communication
US6560544B1 (en) * 2000-04-28 2003-05-06 Ford Motor Company Method for monitoring a mixture
JP2001352980A (ja) * 2000-06-07 2001-12-25 Internatl Business Mach Corp <Ibm> Ｄｎａへの情報記述方法、遺伝情報の出所認証方法、情報を付加したｄｎａ、塩基配列及び生物体の細胞
DE10038169A1 (de) * 2000-08-04 2002-03-07 November Ag Molekulare Medizin Synthetisches Partikel zur Markierung einer Substanz
AUPQ935700A0 (en) * 2000-08-11 2000-09-07 Starguard International Pty Ltd Authentication system and device
US6629038B1 (en) * 2000-09-05 2003-09-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method and system for identifying commercially distributed organisms
JP2004537712A (ja) * 2000-10-18 2004-12-16 バーチャル・アレイズ・インコーポレーテッド 多重細胞分析システム
DE10055368A1 (de) * 2000-11-08 2002-05-29 Agrobiogen Gmbh Biotechnologie Verfahren zur Kennzeichnung von DNA enthaltenden Proben mittels Oligonukleotiden
FR2819831A1 (fr) * 2001-01-22 2002-07-26 Arjo Wiggins Sa Papier comportant des corps porteurs d'au moins un marqueur biochimique
US7115301B2 (en) 2001-04-09 2006-10-03 Rixflex Holdings Limited Method of marking solid or liquid substances with nucleic acid for anti-counterfeiting and authentication
WO2002090581A2 (en) * 2001-05-03 2002-11-14 Genevision Inc. A molecular tag code for monitoring a product and process using same
KR100851764B1 (ko) * 2001-06-27 2008-08-13 (주)바이오니아 상전환촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체 및 이를사용하는 물체의 식별 또는 감식 방법
GB0123278D0 (en) * 2001-09-27 2001-11-21 Ucb Sa Labelled articles and uses thereof
US20030219800A1 (en) * 2001-10-18 2003-11-27 Beske Oren E. Multiplexed cell transfection using coded carriers
US20080187949A1 (en) * 2001-10-26 2008-08-07 Millipore Corporation Multiplexed assays of cell migration
JP2003157004A (ja) * 2001-11-21 2003-05-30 Id Technica:Kk 識別手段を付加する添加物及びその添加物を含有する識別情報保持物
DE10222075A1 (de) * 2002-05-17 2003-12-11 Henkel Kgaa Identifizierungsverfahren zum Produktschutz
US20040126773A1 (en) * 2002-05-23 2004-07-01 Beske Oren E. Assays with coded sensor particles to sense assay conditions
AR037006A1 (es) * 2002-06-20 2004-10-20 S I G Sist S De Identificacion Marcador de objetos a identificar consistente en al menos un fragmento de adn.
US20030236219A1 (en) 2002-06-21 2003-12-25 Nightingale Stephen D. Edible product markers and methods for making and using edible product markers
JP4398368B2 (ja) 2002-06-21 2010-01-13 ディー．ナイチンゲール スティーブン 多機能製品マーカー及びその製造方法及びその使用方法
DE10231435A1 (de) * 2002-07-11 2004-02-12 Sension, Biologische Detektions- Und Schnelltestsysteme Gmbh Nachweisverfahren zur Prüfung der Originalität eines Objekts
US20080073044A1 (en) * 2002-08-13 2008-03-27 Bowman David J Apparatus for liquid-based fiber separation
US7279073B2 (en) * 2002-08-13 2007-10-09 U.S. Greenfiber, Llc Apparatus for liquid-based fiber separation
AU2003268105B2 (en) * 2002-08-16 2011-11-03 John Wayne Cancer Institute Molecular lymphatic mapping of sentinel lymph nodes
US20040058457A1 (en) * 2002-08-29 2004-03-25 Xueying Huang Functionalized nanoparticles
WO2004038037A2 (en) * 2002-09-20 2004-05-06 Intel Corporation Controlled alignment of nano-barcodes encoding specific information for scanning probe microscopy (spm) reading
US7361821B2 (en) * 2002-09-20 2008-04-22 Intel Corporation Controlled alignment of nanobarcodes encoding specific information for scanning probe microscopy (SPM) reading
KR100851765B1 (ko) * 2002-10-16 2008-08-13 (주)바이오니아 올리고뉴클레오티드를 이용한 차량 식별 표지 및 차량감식 방법
US20080207465A1 (en) * 2002-10-28 2008-08-28 Millipore Corporation Assay systems with adjustable fluid communication
US8372648B2 (en) 2003-04-16 2013-02-12 APDN (B.V.I.), Inc. Optical reporter compositions
US8426216B2 (en) 2003-04-16 2013-04-23 APDN (B.V.I.), Inc. Methods for authenticating articles with optical reporters
US8124333B2 (en) 2003-04-16 2012-02-28 APDN, Inc. Methods for covalent linking of optical reporters
US8420400B2 (en) 2003-04-16 2013-04-16 APDN (B.V.I.), Inc. System and method for authenticating tablets
US8415165B2 (en) 2003-04-16 2013-04-09 APDN (B.V.I.), Inc. System and method for authenticating sports identification goods
US8415164B2 (en) 2003-04-16 2013-04-09 Apdn (B.V.I.) Inc. System and method for secure document printing and detection
WO2004094713A2 (en) * 2003-04-16 2004-11-04 Applied Dna Sciences, Inc. System and method for marking textiles with nucleic acids
WO2004094986A2 (en) 2003-04-16 2004-11-04 Handylab, Inc. System and method for electrochemical detection of biological compounds
JP2004329014A (ja) * 2003-04-30 2004-11-25 Id Technica:Kk 偽造行為防止機能を備えた識別手段を付加する識別添加物質及び識別情報保持物並びに識別情報保持物の不正使用検出方法
US20050084914A1 (en) * 2003-09-15 2005-04-21 Foulkes J. G. Assays with primary cells
US7488451B2 (en) * 2003-09-15 2009-02-10 Millipore Corporation Systems for particle manipulation
US20110059441A1 (en) * 2007-04-16 2011-03-10 Mcmaster University Methof of producing bioactive paper
GB2427685B (en) * 2004-05-12 2009-01-07 Axsun Tech Inc Erasable taggant distribution channel validation method and system
US20060073506A1 (en) 2004-09-17 2006-04-06 Affymetrix, Inc. Methods for identifying biological samples
JP2006168084A (ja) * 2004-12-15 2006-06-29 Nissan Motor Co Ltd 積層塗膜構造
JP4674793B2 (ja) * 2004-12-15 2011-04-20 日産自動車株式会社 下塗り塗料組成物及び下塗り塗膜
JP4674794B2 (ja) * 2004-12-15 2011-04-20 日産自動車株式会社 クリヤー塗料組成物及びクリヤー塗膜
JP4674795B2 (ja) * 2004-12-15 2011-04-20 日産自動車株式会社 艶消し塗料組成物及び艶消し塗膜
JP2006169332A (ja) * 2004-12-15 2006-06-29 Nissan Motor Co Ltd 着色上塗り塗料組成物及び着色上塗り塗膜
JP4674796B2 (ja) * 2004-12-15 2011-04-20 日産自動車株式会社 非露出面用塗料組成物及び非露出面塗膜
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
EP1717321A1 (de) * 2005-04-29 2006-11-02 Avvocato Alberto Franchi System zur Oberflächenindentifizierung von kommerziellen Produkten mittels DNA Markierung
US20150141264A1 (en) * 2005-05-20 2015-05-21 Apdn (B.V.I.) Inc. In-field dna extraction, detection and authentication methods and systems therefor
US7874489B2 (en) * 2005-06-20 2011-01-25 Authentiform Technologies, Llc Product authentication
US8247018B2 (en) * 2005-06-20 2012-08-21 Authentiform Technologies, Llc Methods for quality control
EP1907988B1 (de) * 2005-06-20 2013-11-06 AuthentiForm Technologies, L.L.C. Systeme und verfahren zur produktauthentifikation
US8785130B2 (en) * 2005-07-07 2014-07-22 Bio-Id Diagnostic Inc. Use of markers including nucleotide sequence based codes to monitor methods of detection and identification of genetic material
US20070172429A1 (en) * 2005-08-12 2007-07-26 Xiaolian Gao Labeling compositions and methods of use for deterrent trackability
US20100021887A1 (en) * 2005-09-26 2010-01-28 Moshe Azoulay Probe for tagging valuables based on dna-metal complex
USH2257H1 (en) * 2005-09-28 2011-06-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Microtags for detection and identification of materials
US20140106357A1 (en) * 2012-10-16 2014-04-17 Applied Dna Sciences, Inc. Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity
US10741034B2 (en) 2006-05-19 2020-08-11 Apdn (B.V.I.) Inc. Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity
US9790538B2 (en) 2013-03-07 2017-10-17 Apdn (B.V.I.) Inc. Alkaline activation for immobilization of DNA taggants
DE102007026958B4 (de) * 2006-06-13 2014-10-09 Csem Centre Suisse D'electronique Et De Microtechnique S.A. Presswerkzeug mit diffraktiver Mikrostruktur und Verfahren zur Herstellung eines solchen Werkzeugs sowie Tablettierungspresse
US9592646B2 (en) * 2006-06-13 2017-03-14 Csem Centre Suisse D'electronique Et De Microtechnique Sa Pharmaceutical tablets with diffractive microstructure and compression tools for producing such tablets
CH699631B1 (de) * 2007-01-12 2010-04-15 Suisse Electronique Microtech Realisieren einer diffraktiven Mikrostruktur in eine Pillenoberfläche.
WO2008033042A2 (en) * 2006-09-12 2008-03-20 Agresearch Limited Method for identifying the origin of a compound biological product
DK1958620T3 (da) 2007-02-16 2012-07-30 Suisse Electronique Microtech Verificeringsfremgangsmåde
US20090008925A1 (en) * 2007-05-07 2009-01-08 Centre Suisse D'electronique Et De Microtechnique Sa Security device for the identification or authentication of goods and method for securing goods using such a security device
EP2012293A1 (de) * 2007-07-06 2009-01-07 Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO Markierungsverfahren für Materialien
FR2930063B1 (fr) * 2008-04-14 2013-02-15 Bioquanta Procede de marquage d'un produit, procede d'identification du marquage et produit marque
US20090269800A1 (en) * 2008-04-29 2009-10-29 Todd Covey Device and method for processing cell samples
US20120003749A1 (en) * 2008-05-21 2012-01-05 Nec Soft, Ltd. Nucleic acid molecule capable of binding to 2,4,6-trinitrophenyl skeleton, method for detecting compound having 2,4,6-trinitrophenyl skeleton using the nucleic acid molecule, and use of the nucleic acid molecule
US20100014741A1 (en) * 2008-07-10 2010-01-21 Banville Steven C Methods and apparatus related to gate boundaries within a data space
GB2474613A (en) * 2008-07-10 2011-04-20 Nodality Inc Methods and apparatus related to management of experiments
US20100030719A1 (en) * 2008-07-10 2010-02-04 Covey Todd M Methods and apparatus related to bioinformatics data analysis
US9183237B2 (en) 2008-07-10 2015-11-10 Nodality, Inc. Methods and apparatus related to gate boundaries within a data space
EP2320875B1 (de) 2008-07-23 2019-07-03 I-Property Holding Corp. Sichere verfolgung von tabletten
US9034257B2 (en) 2008-10-27 2015-05-19 Nodality, Inc. High throughput flow cytometry system and method
US8669079B2 (en) 2008-11-12 2014-03-11 Cara Therapeutics, Inc. Methods for genetic analysis of textiles made of Gossypium barbadense and Gossypium hirsutum cotton
US8940485B2 (en) 2008-11-12 2015-01-27 Apdn (B.V.I.) Inc. Methods for genotyping mature cotton fibers and textiles
FR2942807B1 (fr) * 2009-03-09 2013-10-18 Commissariat Energie Atomique Procede de detection, d'identification et/ou de quantification de nanotubes de carbone
US8053744B2 (en) * 2009-04-13 2011-11-08 Src, Inc. Location analysis using nucleic acid-labeled tags
GB2472371B (en) * 2009-04-24 2011-10-26 Selectamark Security Systems Plc Synthetic nucleotide containing compositions for use in security marking of property and/or for marking a thief or attacker
US9189728B2 (en) 2009-07-23 2015-11-17 I-Property Holding Corp. Method for the authentication of dosage forms
US8735327B2 (en) * 2010-01-07 2014-05-27 Jeansee, Llc Combinatorial DNA taggants and methods of preparation and use thereof
US8703493B2 (en) 2010-06-15 2014-04-22 Src, Inc. Location analysis using fire retardant-protected nucleic acid-labeled tags
US8716027B2 (en) 2010-08-03 2014-05-06 Src, Inc. Nucleic acid-labeled tags associated with odorant
KR101352391B1 (ko) * 2010-09-03 2014-01-24 (주)바이오니아 올리고뉴클레오티드 마커 및 이를 이용한 물체의 식별 또는 감식방법
KR101350919B1 (ko) * 2011-03-14 2014-01-14 (주)바이오니아 핵산을 포함하는 물체의 식별 방법
GB2489714B (en) * 2011-04-05 2013-11-06 Tracesa Ltd Fluid Identification Method
JP2013050941A (ja) * 2011-07-30 2013-03-14 Visionbio Corp 製品検査方法
US9057712B1 (en) 2011-10-27 2015-06-16 Copilot Ventures Fund Iii Llc Methods of delivery of encapsulated perfluorocarbon taggants
US9297032B2 (en) 2012-10-10 2016-03-29 Apdn (B.V.I.) Inc. Use of perturbants to facilitate incorporation and recovery of taggants from polymerized coatings
US9266370B2 (en) 2012-10-10 2016-02-23 Apdn (B.V.I) Inc. DNA marking of previously undistinguished items for traceability
EP2915098A4 (de) 2012-10-30 2016-07-06 Certirx Corp Produkt-, bild- oder dokumentenauthentifizierung und -verifizierung und objektidentifikation
US9243283B2 (en) 2012-11-19 2016-01-26 Src, Inc. System and method for authentication and tamper detection using nucleic acid taggants
US9963740B2 (en) 2013-03-07 2018-05-08 APDN (B.V.I.), Inc. Method and device for marking articles
US9428792B2 (en) 2013-03-14 2016-08-30 Certirx Corporation Nucleic acid-based authentication and identification codes
AU2014233373B2 (en) * 2013-03-15 2019-10-24 Verinata Health, Inc. Generating cell-free DNA libraries directly from blood
US20140349861A1 (en) * 2013-05-22 2014-11-27 Sunpower Technologies Llc Method for Distinguishing Biological Material Products
GB201315745D0 (en) * 2013-09-04 2013-10-16 Maersk Olie & Gas Enhanced hydrocarbon recovery
US9904734B2 (en) 2013-10-07 2018-02-27 Apdn (B.V.I.) Inc. Multimode image and spectral reader
US10745825B2 (en) 2014-03-18 2020-08-18 Apdn (B.V.I.) Inc. Encrypted optical markers for security applications
EP3119610B1 (de) 2014-03-18 2024-05-22 APDN (B.V.I.) Inc. Verschlüsselte optische marker für sicherheitsanwendungen
US9751812B2 (en) 2014-05-30 2017-09-05 Elwha Llc Taggant for cement authentication
US10760182B2 (en) 2014-12-16 2020-09-01 Apdn (B.V.I.) Inc. Method and device for marking fibrous materials
US20180016627A1 (en) * 2015-03-17 2018-01-18 Apdn (B.V.I.) Inc. Method for authenticating active pharmaceutical ingredients
WO2016172137A1 (en) * 2015-04-20 2016-10-27 Apdn (B.V.I.) Inc. Hydrophobic nucleic acid salts as security markers
EP3356552A1 (de) * 2015-09-29 2018-08-08 Kapa Biosystems, Inc. Hochmolekulare dna-probenverfolgungsetiketten zur sequenzierung der nächsten generation
US10047235B2 (en) * 2015-12-08 2018-08-14 Xerox Corporation Encoding liquid ink with a device specific biomarker
WO2017139403A1 (en) * 2016-02-08 2017-08-17 Apdn (B.V.I.) Inc. Identifying marked articles in the international stream of commerce
CN109070130B (zh) 2016-04-11 2022-03-22 亚普蒂恩（B V I）公司 用于标记纤维素产品的方法
CA3031415A1 (en) * 2016-07-22 2018-01-25 Nucleotrace Pty. Ltd. A method for amplification of nucleic acid sequences
US10995371B2 (en) 2016-10-13 2021-05-04 Apdn (B.V.I.) Inc. Composition and method of DNA marking elastomeric material
WO2018132694A1 (en) * 2017-01-12 2018-07-19 Apdn (B.V.I.) Inc. Traceable nucleic acid marked fertilizer
GB201701574D0 (en) * 2017-01-31 2017-03-15 Forecast Tech Ltd Oil tagging
US10920274B2 (en) 2017-02-21 2021-02-16 Apdn (B.V.I.) Inc. Nucleic acid coated submicron particles for authentication
WO2019204482A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Invisidex, Inc. Composition of variegated witness mark
GB201819256D0 (en) 2018-11-27 2019-01-09 Crime Solutions Ltd Security markers
US20230101083A1 (en) 2021-09-30 2023-03-30 Microsoft Technology Licensing, Llc Anti-counterfeit tags using base ratios of polynucleotides
US20230101409A1 (en) 2021-09-30 2023-03-30 Microsoft Technology Licensing, Llc Anti-counterfeit tags using high-complexity polynucleotides
US20240346270A1 (en) 2023-04-17 2024-10-17 Microsoft Technology Licensing, Llc Anti-counterfeit polynucleotide taggants

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4441943A (en) * 1981-05-18 1984-04-10 Hri Inc. Polypeptides as chemical tagging materials
US4359353A (en) * 1981-05-18 1982-11-16 Hydrocarbon Research, Inc. Polypeptides as chemical tagging materials
US4786600A (en) * 1984-05-25 1988-11-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Autocatalytic replication of recombinant RNA
US4957858A (en) * 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4703011A (en) * 1985-11-12 1987-10-27 Novagene, Inc. Thymidine kinase deletion mutants of bovine herpesvirus-1
GB8529275D0 (en) * 1985-11-28 1986-01-02 Whitbread & Co Plc Dna recombination
JPH0684474B2 (ja) * 1986-02-26 1994-10-26 東レ・ダウコ−ニング・シリコ−ン株式会社 シリカ含有オルガノポリシロキサン組成物
GB8608629D0 (en) * 1986-04-09 1986-05-14 Biotechnica Ltd Labelling
ZA876216B (en) * 1986-08-22 1989-04-26 Cetus Corp Purified thermostable enzyme
CA1338457C (en) * 1986-08-22 1996-07-16 Henry A. Erlich Purified thermostable enzyme
EP0290144A1 (de) * 1987-05-05 1988-11-09 City of Hope Verfahren zum Nachweis von beginnender Widerstandsfähigkeit gegen therapeutische Agenzien bei Krebskranken
NO884048L (no) * 1988-09-12 1990-03-13 Cheminor As Elektrolyse av kobber i tynne loesninger som inneholder stoerre mengder jern.
FR2649518B1 (fr) * 1989-07-07 1991-10-18 Bioprobe Systems Sa Procede et dispositif de marquage crypte de haute securite pour la protection d'objets de valeur

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102006044349A1 (de) * 2006-09-18 2008-03-27 Identif Gmbh Verfahren zum Vor-Ort-Authentifizieren einer Substanz

Also Published As

Publication number Publication date
AU5741990A (en) 1990-12-18
DK0477220T3 (da) 1996-10-21
AU643217B2 (en) 1993-11-11
US5451505A (en) 1995-09-19
CA2017211C (en) 2004-02-10
JPH04505708A (ja) 1992-10-08
EP0477220B1 (de) 1996-09-04
ATE142274T1 (de) 1996-09-15
DE69028402D1 (de) 1996-10-10
CA2017211A1 (en) 1990-11-22
WO1990014441A1 (en) 1990-11-29
JP3082942B2 (ja) 2000-09-04
EP0477220A1 (de) 1992-04-01
ES2091243T3 (es) 1996-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69028402T2 (de) Verfahren zur markierung und zum nachweis von stoffen mit nukleinsäuren
DE69312498T2 (de) Verfahren zur markierung einer flüssigkeit
DE69426129T2 (de) Eine sicherheitsvorrichtung unter verwendung eines hochempfindlichen spurenmittels zum schutz von materialen, artikeln und dergleichen
DE69127080T2 (de) Ultraempfindliches verfahren, um den ursprung, die bewegung und den verbleib einer flüssigkeit oder eines feststoffes zu beobachten
DE3854470T2 (de) Verfahren für Affinitätsuntersuchungen durch Verwendung von Ziel-Amplifizierung.
DE60208278T2 (de) System und Verfahren zum Testen von Nukleinsäuremolekülen
DE3850273T2 (de) Polykationische Träger zur Reinigung, Trennung und Hybridisierung von Nukleinsäure.
DE68926504T2 (de) Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen
EP1007741B1 (de) Verfahren zur markierung von festen, flüssigen oder gasförmigen substanzen
DE69017204T2 (de) Immobilisierte oligonukleotidsonden und ihre verwendungen.
DE68926238T2 (de) Dns-analyse verfahren mit genamplifikation und magnetischen teilchen
DE69533092T2 (de) HYBRIDISIERUNGS- UND ABDRUCKVERFAHREN ZUR CHARAKTERISIERUNG ODER INTERAKTIONEN VON 16S-rRNS-ANALOGEN ZUR IDENTIFIZIERUNG NEUER ANTIBIOTIKA
US20160102215A1 (en) Incorporating soluble security markers into cyanoacrylate solutions
DE3855709T2 (de) Hybridisierungsverfahren und Reagenzsatz dafür
DE60032760T3 (de) Methode zur markierung von materialien
DE60318723T2 (de) Methode zur quantitativen bestimmung von polynukleotiden in einem gemisch
EP1064409B1 (de) Verfahren und vorrichtung zum identifizieren einer markierung
DE60221964T2 (de) Verfahren und testkit zur quantitativen bestimmung von variationen der polynukleotidmengen in zell- oder gewebeproben
EP1327004A2 (de) Verfahren zum nachweis mindestens einer nukleinsäuresequenz
EP1865070A1 (de) Verfahren zur Markierung von Produkten mit Nukleinsäuren für den Identitäts- und Herkunftsnachweis der Produkte
EP2771485B1 (de) Verfahren zur identifikation von aptameren
DE60026284T2 (de) Nukleinsäurefragmente zur identifizierung von dechlorierenden bakterien
DE3420925A1 (de) Verfahren und reagenz zum nachweis einer nukleinsaeure-sequenz
DE102013213279B4 (de) Universelles Verfahren zur Detektion von diversen Analyten in Form von Nukleinsäuresequenzen
AU738768C (en) Methods of labelling a material and of detecting such labelling

Legal Events

Date Code Title Description
8363 Opposition against the patent