JPH0395198A - コクシジウム症ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｅｉｍｅｒｉａ種の免疫学的性質を有する蛋
白質及びその断片、これらをコードするＤＮＡ配列、こ
れらのＤＮＡ配列を含有する組み換えベクター及び宿主
生物、並びに上記蛋白質もしくはコクシジウム症は、原
生動物門＾ＤｉＣｏｍｐｌｅＸａ亜門１＋＋ｅｒｉａ　
ｌの細胞内寄生虫によって引き起こされる疾病である。

これらの寄生虫は、胃腸管及び葉 消化器官の部分を形或する細胞中で冶殖する。

集約的生産の増大のために、養鶏産業においてこれらの
寄生虫により引き起こされる損害が、この何十年間で驚
くほど増してきた。例えば、オランダの養鶏場が毎年被
って損失は、１００万ギルダーに達する。１９８６年の
損失は約１，３００万ギルダーであった。同年、米国で
は、コクシジウム駆虫薬（　ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｔａｔ
ｓ）を使用したにもががわらず、３億米国ドルの損失を
被った。

ニワトリのコクシジウム症の病原体は９種、即Ｅ．ｍｉ
ｖａｔ＋及びＥ．ｈａｇａｎｉに細分できる。シカしな
がら、最後の２種の存在を疑っている人もいる。これら
の種はすべて、ニワトリだけを宿主としており、高度の
組織特異性を示す。しかしながら、上記の種の生活周期
は類似している。種によってニワトリに及ぼすその病原
作用は異なっており、ニワトリの種類も一役を演じる。

即ち、ブロイラーはＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ又はＥ．
ｍａｘｉ＊ａのような寄生虫によって多大の損害を被る
であろう。これは、食物消化を主要な役割とする小腸の
大部分にこれらの寄生虫が寄生するためである。

生活周期の間に、寄生虫Ｅｉｍｅｒｉａは多くの段階を
経１１る。感染段ｊ［！ｉ（胞子形成凄合子嚢）は日中
に入り、ニワトリの胃に入り込むが、ここでは破砕作用
の結果、嚢子壁が破裂して開く。この接合子嚢が含．有
する４個のスボロシストが放出され、十二指腸に運ばれ
て、ここで胆汁及び消化酵素にさらされる。その結果、
スボロシスト壁に開口部が生じ、スボロシスト中に存在
するスボロゾイトが放出される。これらのスボロゾイト
は運動性であって、侵入し、繁殖するために適当な宿主
ａｖＡ，即ち上皮細胞を捜す。種により、この最初の繁
殖段階は２０〜４８時間ｌ継続し、数十〜数百のメ０ゾ
イトが産生されるが、これらは再び新しい宿主細胞に侵
入し、繁殖する。２回乃至時として５回のこれらの無性
生殖周期の後、種に応じて、細胞内メロゾイトは有性形
態、即ち雌雄の生殖母ＩＩ胞に成長する。雄性配偶子が
雌に受精後、接合子が形成されるが、これはそれ自身の
周囲に嚢子壁をつくる。この接合子嚢は宿主細胞を離れ
、糞便とともに排出される。ニワトリ外部の温度及び湿
度が相対的に高く、同時に空気中に十分な酸素が存在す
る場合には、接合子嚢は胞子形成して感染用に進むこと
ができる。

このように、ニワトリからニワトリへと該寄生虫が移動
するのに中間宿主は必要ではない。したがって、有効表
面積の占有度が高いと、！！鶏場における感染圧（ｉｎ
ｆｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｅｓｓｌＦｒｅ）は急速に増加す
ると考えられる。

寄生虫ばは、種々の方法で撲滅することができる。

うまく管理することに加えて、しばしば餌や飲水に混合
されるコクシジウム駆虫薬を用いてコクシジウム症をｉ
．ｌｊ御することができる。

しかしながら、種々の撲滅薬に対する耐性を発現する該
寄生虫の遺伝的能力が一部高いために、近年、これらの
薬剤は有効性が低下している。さらに、これらの薬剤の
多くが食肉中に残留し、こ滅方法であると思われる。十
分に重度の感染を経て生き延びたニワトリは、同型のＥ
ｉｍｅｒｉａにその後接触しても抵抗できることは公知
である。

Ｅｉｓｅｒｉａに対する抵抗性は、鳥を数回低用量の接
合子嚢で、又は弱性（非病原性の）株の接合子嚢で感染
させることによっても誘発可能である。しかしながら、
特に非常に多数のブロイラーに制御れに代わる実行可能
な溶液であると思われる。

るが、できるならばアジュバントをも含む。

該寄生虫から単離された抗原を用いる代わりに、公知の
方法に従って実行可能な技術である組み換えＤＮＡ技術
を用いて製造される産物を使用するることもできる。

抗原又はその一部を合成的に再生産することができるし
、さらに、例えばアジュバントの存在下で担体蛋白質に
結合させた、免疫学的に認識可能な且つ刺激性の形態で
、ニワトリにこれを投与することができる。

さらに、該抗原をコードする遺伝子が組み込まれている
細菌やウイルスのような生きている宿主生物を投与する
ことにより、ワクチン接種を実施することができる。こ
の生物は、その後、十分に長い期間〆抗原の合或を保証
すＰニワ１・りの免疫系が十分に刺激される。

本発明は、コクシジウム症に対する家禽類の免疫Ｘに使
用することができる蛋白質（Ｅｔｐｌｏｏと命名されて
いる）又はその断片を提供する。

上記蛋白質Ｅｔｐ　１００は、Ｅ．ｔｅｌｌｅｌｌａの
抽出物をモノクロ−ナル抗休Ｅ．ＴＥＮ．１１Ｐ−２を
含社 有するカラム基質に注ぎ、抽出物の吸着画分を未吸着画
分から分離し、その後吸着画分を当業界で株 公知の方法によってカラム基質から＄１１することによ
り、上記抽出物から単離し得る。

この免疫クＯマトグラフイー法によって得られた蛋白質
物質を場合により、天然物質の精製のために当業界では
公知の方法によりさらに精製し得る。

このようにしてＥ．ｔｅｎｅｌｌａから得られた蛋白質
１：ｔｐ１００の特性化により、以下の性質が明らかに
なった； ａ．ＳＯＳ−ＰＡＧＥｔ’の分子量約１００ｋＤ：ｂ．
非還元条件下ではモノクローナル抗体と Ｅ．ＴＥＮ．ＩＩＰ−２々結合するが、還元条件下では
結合しない： ｃ．ｖｉ子形成された接合子嚢、スボロシスト、スポロ
ゾイト、第一及び第二世代シゾント、並びに第二世代メ
ロゾイド中に出現。

１００ｋ　Ｄ蛋白質は、種々の供給源から得られるＥ．
　ｔｅｌ　ｌｅｎａのスボＯゾイト並びにメロゾイトか
ら適当に単離することができる。

さらに、ｌ：ｔｐ１００に相当する蛋白質は、Ｅ．ｌａ
Ｘｉｌａ及びＥ．　ａｃｅｒｖｕｌ　ｉｎａのような他
のＥｉｍｅｒｔａ種から単離し得る。これらの相当する
蛋白質の確認は、上記Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの１００ｋ　
Ｄ蛋白質ノ断片ニ対するマウス抗血清を生威し、第５図
に示した通り、Ｅ．ｍａｘｉｍａスボロゾイト及びＥ．
　ａｅｅｒｖｕ　ｌ　ｉ　ｎａスボロゾイトを用いたウ
エスタン（　＠ｅｓｔｅｒｎ）プロットアッセイにおい
てこの抗血清の抗体を使用することによって確定した。

この方法で検出され得る蛋白質は、Ｅ．　ｔｅｎｅｌ　
Ｉａの［：ｔｐ　１００と同様の分子量を有することが
判明した。同一抗血清を用いて、Ｅ．ｍａｘｉｍａ蛋白
質とＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ蛋白質を免疫クロマトグ
ラフィーで分離することができる。

以下の実施例で略述する通り、Ｅ．　ｔｅｎｅｔ　Ｉａ
蛋白質又はそのポ（８）請求項７記載ｒをコードするＤ
ＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡから、並びにε．ｔｅｎｅｌ
ｌａ　　ｍＲ　Ｎ　Ａに由来する相補ＤＮＡ（ｃＤ　Ｎ
　Ａ　）から得られた。これらのＤＮＡｉｉｌ！列（及
びその部分配列）も、これらのＤＮＡ配列及５令鵠ｕＨ
ｃよ’）’：Ｊ−ｔ’ｆｆｔＬ６Ｅｉｓ。山抗原性を有
するポリベブチドとともに、本発明の一部を形或する。

所定のアミノ酸に対しては、しばしばいくつかの異なる
コドン（３つのヌクレオチド塩基）がＤＮＡではコード
し得ることは公知である。即ち、例えばグルタミン酸に
対するコドンはＧＡＴ又はＧＡＡ等である。第６〜８図
に従うアミノ酸配列を有するポリベブチド（又はそのポ
（８）請求項７記載）の発現のためご同様に、同様の代
替コドン組或を有するＤＮＡが用いられる。

さらに、コクシジウム症に対する家禽類の免疫搬に用い
得るこれらのポリペプチド断片も、本発明の一部である
。既知又は未知のアミノ酸配列内のこのような使用可能
なポ（８）請求項７記載（エビトーブと呼ばれる）を検
出するために、種々の方法が知られている。既知のアミ
ノ酸配列に基づいて、例えばこれらのエビトーブは、特
許Ｗ　０　８４／０３５６４及びＷ　Ｏ　８６／　０６
４８７明細書に記載のスクリーニング法を用いて実験的
に決定することができる。

さらに、既述のアミノ酸配列を有するポリペブチドの多
くのｍ域は、理論的考察、並びに現在知られているエビ
トープと一致する構造に基づいて、エビトープを明示す
ることができる。これらの領域の決定は、ＨＯｐｐと−
ｏｏｄｓ　　（　Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｓ　　ＬＪ　Ｓ　Ａ　７
８：３Ｂ２４〜３８２８；１９８１）による親水性判定
基準と、ＣｈｏｕとＦａｓｇ＋ａｎ　　（　＾ｄｖａｎ
ｃｅｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｇ＋ｏｌｏｇｙ　　４７　
　：　　４５〜１４８；１９８７）による二次構造予測
とを組み合わせたものを基礎とした。

以下の領域は、抗体に対するエピトーブと思われるもの
を含む（第８図参照）：アミノ酸番号約２７０〜３００
及び４９５〜５２５。

以後、７　ミ／　酸配列ＩＳＰＱＫＰＧＳＰＰＣＰＴＣ
Ｅ＾ＰＲＧＲＳＣＡＥＱＰＰＧＬＴＲ　及ヒＰＶＤＥＶ
ＶＧＤ＄ｌＥＤＩ４ＧＱＣＳＥＱＣＧＧＧＫＲＴＲＮＲ
ＧＰＳ　，並びにこれらの配列を含むポリペプチドも、
本発明の一部である。

しっ 必要ソ吻る可能性があるＴＩ胞エビトープは、ＢｅｒＺ
ＯｆＳｋｌ／の両親媒性判定基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２
３５　：１０５９〜６２　：　１９８７）によって、理
論的根拠に基づいて同様に得られる。

本発明に従ってコクシジウム症感染に対して免疫するた
めには、例えば、抗イディオタイプ抗体又はその抗原結
合断片を用いることもできる。こる咎＃キ肴る。上記の
本発明のポリベプチドの免疫原性等価物は、とりわけこ
の型の抗イデイオタイブ抗体を意味すると理解されたい
。

本発明に従ってコクシジウム症に対して家禽類を免疫す
るには、本発明のポリベブチド、断片、又は免疫原性等
価物をニワトリに投与するか、あるいは、組み換えＤＮ
Ａ又はＲＮＡ技術を用いた遺伝子操作により本発明のポ
リベブチドもしくはその免疫原性断片、又はその等価物
をその場で産生する能力を獲得している微生物を投与す
ることが可能である。

ｔｔＪ者の場合には「サブユニットワクチン」という用
語がしばしば用いられるし、また後者の場合には「ベク
ターワクチン」という用語が通常使われる一本出願人も
、本明細書でこの術語を用いることにする。

本発明のサブユニットワクチンは、一般に、精製形態で
のポリベブチドを、任意に医薬上許容される賦形剤の存
在下で、含有する。

このような応用に使用するポリペプチドは、Ｅｉｉｅｒ
ｌａからの単離、組み換えＤＮＡ技術、又はベブチド合
成といったような公知の方法によって製造し得る。

該ポリベブチドは、場合により、非関連蛋白質と共有結
合し得るが、この蛋白質は、例えば融合生或物を精製す
る際に有益となり得るか、もしくは成熟蛋白質へのプロ
セッシングに役立つものである。その具体例としては、
β−ガラクトシダーゼ、プロテインへ１プロキモシン、
血液凝固因子Ｘａ等が挙げられる。

所望により、該ポリベプチドを、例えばグリコシル化、
アミド化、カルボキシル化、アシル化又はリン酸化によ
って、ｉｎ　ｖｉｎｏ又はｉｎ　ＶｉｔｒＯで修飾する
こともできる。

それらの免疫原性を増強するためには、これらのポリベ
ブチドを適切に担体と結合するか又は担体と会合し、及
び／又はアジュバント特性を有する化合物と組み合わせ
ることができる。

さらに、これらのポリペブチドをベースとするワクチン
は、慣用的にワクチンに用いられる安定剤、ｍｌＩＩ液
等のような他の化合物を含有し得る。

ベクターワクチンでは、本発明のポリベブチド産物は、
それ自体が免疫されるべき個体に投与され、また生物体
内でそれ自体をしばらくの間保持し、又は増殖しさえす
る遺伝子操作された生物によって作製される。種々の生
物として、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　　ｃｏ見
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａのような
細菌、もしくは牛痘ウィルス又は鶏痘ウィルスのような
ウィルスをこのための宿主として用いることができる。

このタイプの宿主生物を用いた場合、ポリペプチドはそ
れ自体表面抗原として発現する。このような情況におい
ては、上記ポリベブチドと、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
　ｃｏｌｉ．のＯＭＰ蛋白質または線毛蛋白質、あるい
は宿主生物によって認識されるシグナル配列及びアンカ
ー配列の合成物との融合が考えられる。上記免疫原性ボ
リベブチドは、所望によりより大きな全体の一部として
、動物体内に放出ざれて免疫することもできる。こ又は
所定の病原体の種々の抗原に対する防御を生じさせるこ
とも可能ｌである。

実施例１ ＬＯｎＱら（Ｆｏｌ．Ｖｅｔ．Ｌａｔ．６　　：　　２
０１〜２１７　　：１９７６）の方法に従って、寄生虫
Ｅ．ｔ（Ｊｅｌｌａを維持し、接合了嚢を単離した。Ｗ
ｉｓｈｅｒとＲｏｓｅ（ＰａｒａＳｉｔＯＩ００１／８
８：　５１５〜５１９．　１９８４　）の報告と同様に
、さらにＬａｒＳｅｎら（　Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．
７０：５９７　〜６０１　；１９８４）の報告によるナ
イロンウール１！製法を用いて、スボロゾイトを単離、
精製した。第二世代メロゾイトを、ＳｔｏｔｉｓｈとＷ
ａｎｇ（Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．　６１：７００　〜
７０３：１９７５）の方法により感染後９６時間目にニ
ワトリ盲腸から単離し、さらに連続７０％Ｐｅｒｃｏｌ
ｌ勾配上で、遠心分離して精製した。

４Ｌ又込里亘皇追 ０．　５ｄのＰＢＳ　（リン酸１１衝塩水）中１０６個
のＥ．ｔｆ３ｎｅｌｌａスボロゾイトを腹腔内投与し、
その後融合４日前に同用量、同経路でブーストすること
により、Ｂａ１ｂ／Ｃマウスを免疫した。第１回免疫が
後６週間目に、牌臓を、無菌的に摘出し、その細胞を、
Ｋ６ｈｌｅｒとＨｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ　２５
６　＋４９５〜７；１９７５）の報告と同様に骨ｌＭＩ
Ｉｌｌ系ｐ３Ｘ６３Ａ　Ｑ　８．　６．　５３．と融合
し、標準プロトコールに従って培養した。

ハイブリドーマの選択 蛍光抗体法（ＩＦＡ）を用いてスボＯゾイト抗原を認識
する、ハイブリドーマを選択した。

スボロゾイトをＰＢＳ中に懸濁し（１〜３　Ｘ　１０６
／ｄ）、３，ｄ容醋ずっを１ｏウェルガラススライド（
Ｃｅｌ　ｌ　ｉｎｅ）上に滴下し、室温で一晩乾燥し、
−７０℃で乾燥保存した。

アセトン中でスライドを解凍、固定した後、２５成のハ
イブリドーマ上澄を各ウエルに滴下し、３７℃で３０分
間インキユベートした。スライドをＰＢＳ中ですすぎ、
ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。

標識されたウサギ抗マウスＦ　Ｉ　Ｔ　Ｃ　（　Ｎｏｒ
ｄｉｃ；フルオローイソーチオシアネート）を１：１０
０〜２００に希釈して結合体（ｃｏｎｊｕｏａｔｅ　）
として使用し、計数用染料としての０，０５％Ｅｖａｎ
ｓ　Ｂｌｕｅ存在下、３７℃で３０分間インキユベート
した。洗浄及びすすいだ後、スライドを０．１ｉｏ１　
／Ｍ　トリスー塩酸：ｐ日９．０：７５％グリセ０−ル
で固定し、Ｌｅｉｔｚｏｒｔｈｏ＋ｕｘ蛍光顕微鏡を用
いて検定した。この検定では陽性を示したハイブリドー
マを、さらに限界希釈によりクローン化し、再び検定し
て、液体窒素中に保存するか、あるいは腹水産生のため
にブリスタンを注銅しておいたＢａｎ　ｂ／Ｃマウスに
直接注射した（２．　５Ｘ　１０６ハイブリドーマｉｌ
ｌｌｌｌ／マウス，腹腔内投与〉。これらの陽性ハイブ
リドーマから、有用な抗体を産生する２つのクローンを
選択した。それぞれＥ．ＴＥＮ．１１Ｐ−２及びＥ．Ｔ
ＥＮ．ＩＯＹ−２として示されるこれらのモノクローナ
ル抗体は、ＩＦＡから判定されるようにＥ．ｔｌ３ｎｅ
ｌｌａスボＯゾイト及び第二世代メロゾイトを認識した
。蛍光パターンはともに類似していた。さらに、両モノ
クローナル抗体は、ゾイトの前半に存在する物質、おそ
らくは細胞質蛋白質と結合した。

生＞７止立亘五 これらのＥ．ＴＥＮ．１１Ｐ−２及び Ｅ．ＴＥＮ１０Ｙ−２抗体を産生ずるハイブリド−マＩ
ＩＩｌ胞系のサンプルを、１９８９年２月２日、英国、
ＰＯｒｔＯｎ　　ＤＯＷｎのｔｈｅ　ＥｔｌｒＯｐｅａ
ｒｌ　ＣｅｌｌｅＣｔｉＯｎ　Ｏｆ実施例２ Ａ．亙基 ＭｏＡｂ　　Ｅ．ＴＥＮ．１１Ｐ−２及びＥ．ＴＥＮ．
　１０Ｙ−２の標的抗原を、Ｖｅｒｌｅｕｌｅｎら（Ｊ
．　Ｅ　ｘ　ｐ．　Ｍｅ　ｄ　．　　１６２：　１４６
０〜７６；１９８５）の報告と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ
／イムノプロツテイング法を用いて特性化した。手短か
に言えば、２ｘ　１０７個の新鮮に脱嚢された（ｅＸｃ
ｖｓｔｅａ）ナイロンウール精製ざれたスボロゾイトを
、ＤＴＴ又１．１β−メルカブトエタノールのような還
元剤を加えないしａｅｕ＋　＋　＋サンプル！１衝液（
Ｎａｔｕｒｅ　２２７：　　６８０〜４：１９７０）中
ｖｊ溶解した。５分間煮沸し・　１８０００９で３分間
遠心分離した後、上清を取り出し、２０％グリセＯ−ル
液とし、４％積層ゲルを含む７〜１８％アクリルアくド
勾配ゲル（又は１２％均一ゲル）上に載せた。

電気律動分離後、蛋白質を０．０１＋＋ｏｌ／４１　ト
リス；０．０７９ｓｏｌ＃グリシン；ｐ口８．３中で１
０■／傭で１時問、ニトロセルロース紙（　０．　４５
ｍ＋　：　Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆　　Ｓｃｈｕｌｌ）
上にブロツティングした。

免疫検出のために、ニトロセルロース紙片をＰＢＳに溶
解した０，２％脱脂粉乳＜ＮＦＭＰ）液中で３０分間前
処理し、ＰＢＳ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０；０．１
％ＮＦＭＰ中１０倍希釈したハイブリドーマ上澄と共に
、ｖ潟で９０分間インキユベートし、広範に洗浄して、
アルカリ性ホスフ７ターゼで標識された抗マウスＩｇと
共にインキユベートした。

結合されたＩＱ結合体を、１００ｍｍｏｌ　／ｊ１　ト
リス／ＨＣｊ！：　　ＤＨ　　９．５：　　１００ｍｌ
ｏｌ／ｊＩ　　ＮａＣｌ　　５ｍｍｏｌ／１Ｍ，ｃ１２
に溶解したニトロブルーテトラゾリウム（０．３３ＩＰ
Ｊ／ａｉ！）及び５−ブロモー４−クロロ−３−インド
リルホスフエートｐ−トルイジン塩（０、１７ｗＪ／ｄ
）を用いて視覚化した。

Ｂ．峻１ モノクロナール抗体Ｅ．ＴＥＮ．　１１Ｐ−２及びＥ．
ＴＥＮ．ＩＯＹ−２は非還元性Ｅ．ｔｌ３ｎｅｌｌａ　
スボロゾイトーメロゾイト蛋白質のーｅｓｔｅｒｎプロ
ットの 上ｉ９５〜１１０Ｋ［）のバンドと反応した（第１図）
．Ｂｉｏ　−ｒａｄ　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量マーカー
は、清を用いて、Ｅ．ＴＥＮ．１１Ｐ−２／Ｅ．ＴＥＮ
．１０Ｙ　−　２をＩ　ＱＧ１アイソタイプであると特
〆性化した。

Ｘ１１４旦 Ａ．た旦 比較しつる量の胞子形成された接合子嚢、精製スボロシ
スト及び精製スボロゾイトをもつｌレーンを含有する−
〇３ｔｅｒｎプロットを作顎した。実施例３Ａに記載の
手法により、モノクローナル抗体並びにニワトリ高度免
疫血清を用いてーｅｓｔｅｒｎブＯットをプＯ−ブした
。

去り ９軒のニワトリ（７週令）２Ｘ１０４個の生存するＥ，
　ｔｅｎｅｌｌａ接合子嚢を４日以内に２回経口投与し
、その後１０’　＠の用量で４回、４日間隔ぐ投与する
ことによりニワトリの高度免疫血清を生じさせた。最終
投与後１週間目に、全ニワトリを採血した。血清をプー
ルし、１：１２８０で実施例・１に記載の蛍光抗体法で
、抗スボロゾイトカ価をアッセイした。

Ｂ．緻浬 ＭｏＡｂ　　Ｅ．ＴＥＮ．１１Ｐ−２及びＥ．ＴＥＮ，
１０Ｙ−２の標的蛋白質である９５〜１１０ｋＯ蛋白質
は胞子形成された接合子嚢中にすでに存在することが明
示されたし、また、それらはスボロシスト及びスボロゾ
イト期にも発現された。９５〜１１０ｋＤ蛋白質は、ニ
ワトリの高度免疫血清によって優位に認識されたく第２
図〉。

実施例４ Ｅ．ＴＥＮ．１１Ｐ−２から得られたｌａＧを、（ＮＨ
　）　Ｓ０４の５０％飽和を用いて、室温で、４２ 腹水液から沈澱させた。その物質を、ｏ＋ｎ＋ｒｕｇｅ
　Ｔ（ＨｅｒａｅｕＳ　Ｃｈｒｉｓｔ）中で２５００ｒ
ｐ−で３０分間回転させた。そのペレットを５０％〈Ｎ
口，）２８０４で２回洗浄し、原容積の半分量の０．２
ｓｏｌ／ＩｆのＮａＨＣＯ３に再懸濁し、メーカーの説
明書に従ッＴ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　２５（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ　　Ｐ　Ｄ　１０カラム）上で説塩し、４
℃で−・晩、ＣＮＢｒ一活性化ＳｅＤｈａｒＯＳｅ　　
（　ＰｈａｒｌｌａＣｉａ）に結合させる。最終結合比
は、ゲル１一当たり６．７ＩＩｌｇＩｇＧであった。

Ｅ．ＴＥＮ．１０Ｙ−２に関しては、メーカーの説明書
に従って、ＩｏＧを、プロテインへ−Ｓ　ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　（　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて腹水から濃縮
、精製した。中和及び脱ｔｓＡ後、上記と同様に結合を
行なった．Ｅ．ＴＥＮ．１０Ｙ−２カラムの最終結合比
は４．８ｊｌ９／−ゲルとであった。

５〜７Ｉ１のＩＣＩＧ結合ＳｅｐｈａｒＯＳｅを適当な
カラムに注入し、ランニング緩衝液中で平衡化させた（
２５ｕｏｌ／ｌ　トリス／塩酸；　　ｐＨ　　ａ．ｏ；
　　Ｏ、５１０１　／ｊＮａｃｌｏ．１％ＮＰ４０）。

一７０℃でペレットとして凍結された３２０Ｘ　１０６
個のＥ．ｔｅｎｅｌｌａ　スボロシストを解凍し、２５
ｇｖｏｌ／１トリス／ｊｎ酸；　ｐ口８．０　　：　１
ｌＩｌｍｏｌ　／４１　Ｅ　ＤＴＡ　：１ｎｍｏｌｚｌ
　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆの溶液３一中に懸濁した。

３９のガラスビーズ（直径〜０．３屠）存在下で、掻き
回して量子を破壊した。その溶液を０．１％Ｎｏｎｔｄ
ｅｔ　Ｐ４０（ＮＰ４０）とし、０℃で１時間インキユ
ベートした。非溶解物質を４℃で２０００ｒｐ−で１５
分問回転し、その後３００ｒｐ−で１時間回転して遠心
分離した。上清を０．２２−フィルターに通した後、免
疫力ラムに掛けた。

５ａｔのｌｌ：．　ｔｅｎｅｌ　ｌａスボ０シスト抽出
物を、０．１５ｍ／分のｉ速テＥ．ＴＥＩ４．１ＩＰ−
２及びε．ＴＥＮ．１０Ｙ−２　カラムに、周囲温度で
１晩、再ｆｆｉ環システム中で結合させた。

±２０循環後、非結合画分を集め、ざらに分析するだめ
に保存した。カラムを、洗浄液４（０．　１１０１／１
酢酸塩：　０．５ａ＋ｏｌ／Ｊｔ　Ｎ　ａＣ１　；　　
０．１％ＭＰ４０：　　Ｉ）日４．０）及び洗浄液８（
０．　１ｍｏｌ／　Ｍ　Ｔｒｉｓ／日Ｃ１　：　０．５
ｍｏｌ／ｆｌ　Ｎ　ａｃｊ！　；　　０．１％ＮＰ４０
；　　ｐ｝−１８．０）ヲｌｉニ用イて少なくとも３サ
イクル、流速０．　５ｔｅ　／分で洗浄９ン した。固定床容量の２　’Ｗ’ｙ　Ｘニング緩衝液で洗
浄した後・、Ｏ．ｔｍｏｌ／１１炭酸塩／重炭酸塩：　
　！１｝−１１０．６：０．１％ＮＰ４０を４一用いて
アルカリ溶出を行なった。

画分を１ｍｏｌ／ｊ）　トリスｐ日８．０で中和し、カ
ラン ムをラ１ニング緩衝液で再平衡化した。その後、０．１
１０１／ｊグリシン／塩Ｗｉ；　　０．１５ｍｏｌ／Ｉ
Ｉ　Ｎ　ａｔＪ　：０．１％ＮＰ４０　：　　ｌ）８　
２．６を用いて溶出を行なった。

酸性画分を１ｍｏｌ／Ｊｌ　トリス；　ｐ口８．０で中
和した。

企画分を、非還元条件下のＳＯＳ−ＰＡＧ上で、さらに
プＯ−ブ抗体としてポリクローナルウサギ抗スボロゾイ
ト血清を用いてーｅｓｔｅｒｎプロット上で分析した〈
第３図〉。両カラムから、酸性条件を用いて主画分を溶
出した。Ｅ．　ＴＥ８．　１１Ｐ−２　ｈ　７　ムから
？Ｗ出した物質は、Ｅ．ＴＥＮ．１０Ｙ−２　ＨｏＡｂ
と陽性に反応したく示されていない〉。

ＲＮＡを単離するために、十分に胞子形成した接合子嚢
を、１０問０１／１酢酸トリス（ｐ口７．６）　：　７
５問ｏｆ／　ｆＪ酢酸ナトリウム；　１％ＳＤＳ　：　
　２ｍ１０１／ＮＥＤＴＡ：０．２■／ｄブロテイナー
ゼＫ及び１◇１１０１／ｊバナジルリボヌクレオシド複
合体を含有する緩衝液２．８ｄ中に入れた。接合子嚢を
、１３９のガラスビーズ（φ０．５ｍ＋＋）存在下で６
０ｖｊ間（最大で）ａ痒して破壊した。５ｄのフェノー
ルを全抽出物に加え、その混合物をさらに６０秒間攪拌
した。遠心分離後、水層をビベットで取り出し、再び同
容量のフェノール．クロロホルム．及Ｕイ’１アミルア
ルコール（２５：２４：１）の混合液で抽出した。２，
５容のエタノールを加えた後、ＲＮＡを沈澱させ、その
結果生じた沈澱物を、トリス１０ｗｍｏｌ／ｊ　：ＥＤ
ＴＡ　Ｏ．１開ｏｆ／Ｊ！：　　ｐｔ−１７．６を含有
する緩衝液８００Ｍ中に溶解し、その後、その物質をさ
らに、等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール（２５：２４：ｉ）で２回、クロロホルム／
イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出し、次い
でエタノールで沈澱させた。ボリＡ＋−ＲＮＡを、オリ
ゴ（ｄＴ）一セルロースクロマトグラフィー（Ｈａｎｉ
ａｔｉｓら，上記文献７参照〉によって単離した。約１
００増のポリＡ”−ＲＮＡを、５ＸＩＯ８｛１ｉ１の接
合子嚢から単離した。

Ｂ．ｃＤＮＡ合或 酸素ＭＭＬＶ逆転写酵素によ゛リボリＡ＋ＲＮＡをｃＤ
ＮＡに変換した。このために、２５Ｉ４のボリＡ”−Ｒ
ＮＡを９０成の水に溶解し、水酸化メチル水銀１０ｍｍ
ｏｌ／　（Ｊを加え、その後β−メルカブトエタノーノ
レ４５ｕ＋ｏ　ｌ　／　ｊｌを加えて、２０℃で５分間
変性させ、その混合物を２０℃で３分間インキュベート
した。４／１９のオリゴ（ｄＴ）　　　１５０Ｕの１５
） Ｒ　Ｎ　Ａ　ｓｉｎ　（Ｒ）、２０ｍｍｏｌ／　Ｍのト
リス（ｐＨ　７．６）、３０ｍｍｏ　ｌ　／　４１のＫ
Ｃｊ！、４ｉｍｏｌ／Ｉ２のジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ＞、２ｎ＋ｍｏレ」のＨｇＣｊ！　　，　　１ｖａｏ
ｌ／２ １の各ｄＮＴＰ及び３０００ｔＪのＭＭＬＶ逆転写酵素
を含有する緩衝液１９０４中で酵素反応を実施した。

反応は、３７℃で１時間インキユベートした後に、０．
５１０１／ＩＩのＥＤＴＡ１０成を加えることにより停
止させた。等容量のフェノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコール（２５：　２４：　１）で抽出後、ＲＮ
Ａ／ＤＮＡハイブリッドを、酢酸アンモニウム２ｍｏｌ
／４１と２．５容のエタノ−　ルを加えて沈澱さぜた。

が起る。べＬ／／トを、２０ｍｍｏｌ／Ｊｌ　トリス（
ｐ口７．６）、５ｍｍｏレ’　ＩＩ　ｈｃ１　　、１０
０ｍｍｏｌ／　ｊ　　（　Ｎ口．）２２ Ｓｏ　　，　　０．６旧ＯＩ／１β一ＮＡＤ、１６ｔＪ
４ ＲＮａＳｅ　　｝ｌ、２００Ｕ　　Ｄ　Ｎ　Ａ−ポリメ
ラーゼＩ及び２０ｔＪ　　ＤＮＡ−リガーゼ仕匹１旦を
含む緩衝液９６０ｉｉ１中に溶解した。インキュベーシ
ョン時間は、１２℃で１時問、次いで２２℃で１時間で
あった。その後、等容量のフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えて反応
を停止させ、エタノールで沈澱させた。

この目的に適合したベクター中でＣＤＮＡをクローン化
する前に、それを先ず修飾した．ＣＤＮＡ　（５ＩＩｊ
Ｉ＞を、３０１１０レ］酢酸ナトリウム（ｐ口５．６）
、５０ｍｍｏｌ／ＩＩ　Ｎ　ａｃ１、ｔｍｓｏｌ／Ｎ　
ＺｎＳＯ４、及び２１ＵのＨｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレア
ーゼを含有する！！衝？１００Ｉｌｉ中に溶解した。３
７℃で３０分間インキユベートした後、Ｅ　■　Ｔ　Ａ
Ｉ０１１１ｌ０１／！Ｊ及びトリス２５一■０１／１を
加えて反応を停止させた。フェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出した後
、混合液をＳｅｔ）ｈａｄｅＸ　Ｇ５０カラムに掛けて
脱塩した。

溶出物（１２５Ｉｌｉ）に以下のものを加えた：トリス
ｐ口７．６　５０ｕｏｌ／ρ　、ＥＤＴＡ　　２．５ｍ
ｍｏｌ，ｌ　　、Ｄ　Ｔ　Ｔ　５ｍｍｏｌ、Ｓ′−アデ
ノシルーメチオニン０．５μＨ　，及び１００ＵのＥＣ
ＯＲ　！−メチラーゼ。

３７℃で３０分間インキユベートした後、６５℃で１５
分間加熱することにより反応を停止させ、その後、トリ
スーＨｔＪ　１００ｍｍｏｌ／ｊ，　ＭＱ（Ｊ２　　１
００ｍｍｏｌ／１、及びＮ　ａｃｔ　５００ｍｍｏｌ／
Ｎ　（１）口７．５）を含む溶液１／１０容を加え、同
時に各ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ　Ｉｓｍｏｌ／ｊ及び１２．５Ｕ
のκＩｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａボリメラーゼを加えた。

２２℃で６０分間インキユベートした後に、等容量のフ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５
：２４：１）を加えて反応を停止させた。３５０パの口
２０と５０ハの３ｍｏｌ／Ｊｌ酢酸ナトリウム（ｐ口５
．６）を加えた後、５００Ｉ１１のイソブロパノールを
用いて水相中に存在する核酸を沈澱させた。１　０　０
　＃Ｎの口２０に溶解した後、ベレットをｓｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ５０で脱塩し、溶出物をエタノールで沈澱させ
た。

ベレットを２４ルの水に溶解した後、２埒のＥＣＯＲＩ
リンカー　トリスーＨＣｊ（ｐ日８．０）３０ｓｍｏｌ
／４１　、Ｍ　ＯＣＩ２１０ｎｍｏｌ／Ｎ　、ジチオス
レイトール１０ｍｍｏｌ／ｊ）　，　ＡＴＰ　１ｍｍｏ
ｌ／ｕ　、ゼラチン０．　１ａｙ　／　ｄ及び１０Ｕの
Ｔ４ＤＮＡ−リガーゼを加えることにより、連結を５０
成中で実施した．４℃で１６時問インキユベーションし
た後、加熱（７０℃で１５分〉して反応を停止させ、そ
の後、制限エンドヌクレアーゼＥＣＯＲＩを用いて、１
０’Ｑ＋ｎｏｌ／１トリスー口ＣＩ（ＤＨ７．６）、５
０ｍｍｏｌ／　ＪｌＮ　ａ　Ｃｌ、１０ｇａｏｌ／ｊ　
ＭＣＩＣ１２、２．５ｍｍｏｌ／ｊ）　Ｄ　Ｔ　Ｔ及び
５００Ｕ　　ＥＣＯＲＩを含有する緩衝液２１０１中で
切断を実施した。３７℃で９０分間インキユベートした
後、等容吊のフェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコール（２５：２４：１）を用いて抽出することによ
り、反応を停止させた。水相中に存在する核酸を、酢酸
ナトリウム（ｐＨ　ｓ．ｅ）　３００ｍｍｏｌ／　１１
を加えた後に２５容積のエタノールで沈澱させ、Ｂｉｏ
ｇｅｌ＾１５ｍカラムを用いてＣＤＮＡ及′びリンカー
を分離した。ｃＤＮＡをエタノールで沈澱した後、その
沈澱物をトリスー目Ｃｊ！　　１０旧ｏ１ｚｌ　、ＥＤ
ＴＡＯ．　ｌｍｓｏｌ／　ｊ！　（ｐ口７．６）に溶解
した。次いでｃＤＮ八分子をファージλＱｔｌ１並びに
ファージλ９ｔ１０中に、Ｈｕｙｎｈら（ＤＮＡ　ｃｌ
ｏｎｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　：＾Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ＾Ｉ）ｌ）ｒｏａｃｈ，　１９８４）に従ってクロ
ーン化した。

Ｃ．　ＨｏＡｂ　Ｅ．丁ＥＮ．　１１Ｐ−２によるλｇ
ｔ１１ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライλｇｔ１１ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａク
ローンで感染させたＥ．　ｃｏｌｉＹ１０９０−により
産生された蛋白質を、上記（Ｈｕｙｎｈら、上記文献参
照）と同様にニトロセルロースフィルター上に固定化し
た。ｃＤＮＡライブラリーをＨｏＡｂ　Ｅ．丁ＥＮ．１
１Ｐ−２で免疫スクリーニングし、その結果、２Ｘ１０
５個の７７−ジクローン中に約１個の陽性反応が起きた
。モノクローナル抗体を、プロテインＡ　Ｓｃｐｈａｒ
ｏｓｅ■上で精製し、１容のトリスＩＩＩ液（　１０ｍ
ｍｏｌ／　Ｊｌ　トリスー目Ｃｌ　：　　１５０ｍ＋＋
＋ｏｌ／Ｉ　　ＮａＣｌ　　ｐ目８．０）＋０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０及び１０％　ＦＯＳで希釈した。

２５℃で２時間、前記フィルターと一緒にインキユベー
ションした。フィルターを５０一の上記トリス緩衝液＋
０．０５％Ｔｌｅｎ２０で１０分間、４回洗浄した。ヤ
ギ抗マウス抗体及びアルカリ性ホスファターゼの結合体
（上記トリス！ｌ衝液−｝０．０５％ｒｗｅｅｎ２◇及
び１０％ＦＯＳで１　：　７５００ニ希釈）を用いて二
次抗体を３７℃で３０分間インキユベーションし、その
後、フィルターを一次抗体のインキュベーションに関す
る上記記載とＩｉｌｉｌ１に洗浄した。

１００ｍｉｏｌ／４１　トＩＪ　スー目Ｃｆｌ　；　　
１００ｍｌ！ｌｏｌ／ｊ　Ｎ　ａｃ１　；１０ｇｉｍｏ
ｌ／ｊ　ＭＱＣ１２　　：　　ｐＨ９．６に０．３３９
／ｊニトロブルーテトラゾリウム及び０．１７９／Ｊｌ
　　５−プロモー４−クロロ−３−インドリルーホスフ
エートを含有させた溶液中で、ｖ温で３０分間インキュ
ベ一トした後、結合されたアルカリ性ホスファターゼを
検出した。

イムノアツセイで陽性を示す１つのクローンは精製され
たプラークであって、このクローンをクローンＥ　ｔ　
１００として示した（第７図参照）。

及墓皿亙 Ａ．亙基 Ｌ工りユ然 Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｙ１０８８ｕ肚Ｅ　尼狙Ｆ　ｓｔｒＡ　
ｍｅｔｅ　ｔｒｏＲ　ｈｓｄＲｈｓｄＨ−ｔｏｎ　Ａ２
１　Δｌａｃｌｌｌ６９（ｐｒｏｃ　：　Ｔｎ５）（ｐ
Ｈｃ９）　）、子 Ｙ１０８９　　　（　Δｌａｃｔｌｌ６９　ト』Ａ　　
Δｔｏｎ　ａｒａＤ１３９Ｓｔ．ｒＡ　ｈｒｌａ１５０
（ｃｈｒ：　Ｔｎ１０）（１）ＨＣ９））及びＹ１０９
０（ΔｌａＣ０１６９　１）ｒＯＡ　　Δｎｏｎ　ａｒ
ａＤ１３９　ＳｔｒＡ　ＳｕｐＦ江ｕＣ２２　　　：　
Ｔｎ１０）（ｐＨｃ９））は、ＡｍｅｒｉＣＱｙ’＋　
ｒｙｐｅＣｕｌｔｌＪｒｅ　ＣＯｌｌｅＣｔｉＯｎから
得られたものである。

ＤＮＡの単離 Ｅ．　ｔｅｎｅｔ　ｌａ染色体ＤＮＡ，：ワトリＤＮＡ
，及びＥ．ｃｏｌｉＤ　Ｎ　Ａの単離は、Ｃｌａｒｋｅ
ら（Ｈ０１Ｂｉｏｃｈｅ−．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．　２
２　：　７９　〜８７；　１９８７）の報告と同様に実
施した。

ゲノムライブラリーの構 Ｅ．ｔｅｎｅｔｌａ　Ｄ　Ｎ　ＡをＥ　Ｃ　Ｏ　Ｒ　Ｉ
　（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）で一部消化し１これにＥＣＯＲ　Ｉ’ｔ
’消化された、仔ウシ腸ホスフ７ターゼ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ　Ｈａｎｎｈｅｉｍ）　５１！ｌ理されたλａ
ｍｐ３をＴ４［）Ｎ八リガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｑｅｒ
　Ｈａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、４℃で１６時間、連結
した。１埒のＤＮＡに対する最終連結容社は１０／ｉｆ
！であり、ベクター：挿入比は４：１であった。λａｓ
ｐ３は、Ｋｅｌｌｐら（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ｌＩＳＡ８０
　：　３７８７　：　１９８３）に従って、λ９ｔ１１
から発生させた。ファージをｉｎ　ｖｉｔｒｏで包装し
（ＨａｎｉａｔｉＳら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎａ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　　″Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｍａｎｕａｌ　　　：　１９８２）、ｔｌ．．ｃｏｌ
ｉ　Ｙ１０８８株と一緒にインキユベートして、一β−
Ｄ−ガラクトビラノシド）及びＴＰＴＧ（イソプロビル
ーβ一〇一チオガラクトビラノシ参照）、スクリーニン
グ前に力価を測定した。

Ｃｌａｒｋｅら（上記文献参照）の記載に従って実施し
た。

Ｂ．虹屡 組み換えバクテリオファージＥｔ日Ｌ６は、Ｅｔｅｎｅ
ｌｌａ　Ｄ　Ｎ　Ａの７２２ｂｐ　　ＥｃｏＲＩ制限断
片を含有する。これも第７図を参照されたい。

ＥｔＨ１６によって生じるブラークは、最初は、免疫ニ
ワトリ血清によるゲノムＤＮＡライブラリーＸ−ｇａｌ
（５−ブロモー４−クロロ−３−インドリルのスクリー
ニング後に抗体陽性として確認された。

寡１口生ヱ Ａ．方法 抗体のアフィニティ Ｅｔ口し６ストックからのバクテリオファージ（ＩＸ１
０４）を９αの皿の中のＥ．ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０株上
にブレーティングし、４２℃で３時間インキユベートし
た。前記と同様に予めＩ　ＰＴＧで処理したフィルター
の各サイドを、プレート表面と接触させて３７℃で２時
間放置した。フィルターを、免疫ニワトリ血清（Ｅ．ｃ
ｏ！ｉを予め吸着し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ　Ｉ）Ｈ
７．０中で１：２０に希釈）と一緒に室温で１時間イン
キユベートした。洗浄後、結合した抗体を０．　２ｍｏ
レ］グリシン（ｐ口２．８）　５−で１０分間溶出し、
次いで２ｍｏｌ／１トリス（８０ｍ）　：１０ｘＰＢＳ
（５ｏＯｄ）　：　　２ａｙ／Ｍ１クロラムフェニコー
ル（５０ｐ！）及び０．２５９のＢＳＡを含む溶液ｅｓ
ｏＩｌ１で中和した。選択された抗体を用いて、それ以
上希釈せずに、スボロゾイト及びメロゾイト蛋白質のｔ
４ｅｓｔｅｒｎプロットを精査（ｐｒｏｂｅ）　シた。

４互叉亘１ Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｙ１０８９株を実施例６Ｂ記載ノファー
シテ溶原化し、溶解物を１ＩＩ１の対数増殖期培養物（
　Ｃｏｐｐｅ　ｌら，　Ｎａｔｕｒｅ　３０６：　　７
５１〜７５６　　：　１９８３）から：ｌ４製した。

ポリアクリルアミ゛ 洗浄済みスボロゾイトベレット又は可溶化ファージ溶解
物を、２％（Ｗ／Ｖ　）ドデシル＠酸ナトリウム；　　
６ｍｏｌ　／Ｊｌ尿素；　５％（ｖ／ｖ）　　２−メル
カプトエタノーノレ；　Ｏ、４９ｌｌ０１／１トリスー
口ＣＩ：Ｏ日６．７中に溶解して、５分間沸騰させる。

マイクロ遠心機中で５分間回転させた後、０．１％（Ｗ
／Ｖ　）プロモフェノールブルーを含有する５０％（Ｖ
／Ｖ　）グリセロールを上清に加える。ゲルは不連続で
、３．６％（Ｗ／Ｖ）アクリルアミドスベーサーゲノレ
，ｐ口６．７と６〜１４％（Ｗ／Ｖ）アクリルアミド匂
配分離ゲル，　　ｐ｝−１８．９　　（　１６Ｘ０．１
　ｃｍ）からなる。５０〜７０■（定電圧〉で１６時間
、電気泳動を実施し、蛋白質バンドを、３５％（ｖ／ｖ
　）メタノール，１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸に溶解した０．
２％（ｗ／ｖ）　ＰＡ　Ｇ　Ｅ　７）Ｉ．ｔ−８３（　
Ｂ　Ｄ　Ｈ　　ｃｈｅｌｉｃａｌｓ）で染色した。

ポリベブチドのイムノープロッティン ＳＯＳ−ＰＡＧＥ後、スラブゲルを２５ｇｖｏｌ／ｊト
リス：１９２ｍｓｏｌ／　ｊグリシン：　　ｐ｝１８．
３　：２０％（ｖ／ｖ）メタノール（移動用ＩＩ液〉５
０ｏＩｊＩ中テ３０分間平衡化した。ゲル中のポリベプ
チドを電気泳動的に、Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ移動セル（Ｂ
ｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内のニトロセ
ルロース紙に移動させた（Ｔｏｗｂｉｎら、ＰＮＡＳユ
６　：　４３５９　〜４３５４　：１９７９）（Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｌｌ，　ＢＡ８５，　０
．４５　Ａｓ！＞。

３０Ｖ（７）定１１圧１’、４℃ｔ’１６　〜２２時間
、移動用１！１ｉ液を用いて、電気泳動を実施した。移
動させた後、スボロゾイトサンプルを含むニトロセルロ
ース紙を、３％（ｗ／Ｖ　）ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ　；Ｓｉｇｍａ　Ａ４５０３）を含むＰＢＳ　ｐＨ７
．０中でブロツクした。移動させたマーカー蛋白質を含
むニトロセルロース紙片をＩｎｄｉａｎインキで染色し
た。

ブロットを、室温で１時間、免疫又は正常ニワトリ血清
（１％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡ　；　ＰＢＳ　；　　ｐ日７
，Ｏ：０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔ＊ｅｅｎ２０中で１：
２００に希釈）と反応させた。プロットを、ＰＢＳ　；
　　ｌ）Ｈ７．Ｏ　；　０　０５％ＴＷｅｅｎ２０中で
各５分ずつ、計５回洗浄し、その後アフィニティー精製
したウサギ抗二ワＩ・りＩｇＧ（口＋１−）一ベルオキ
シダーゼ結合体（７ｙｍｅｄ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ　　Ｉｎｃ．　　１％　（ｗ／ｖ）　　Ｂ　　Ｓ　
　Ａ　　：ＰＢＳ　；　　Ｉ）Ｈ７．Ｏ　：ｏ．ｏｓ％
Ｔｗｅｅｎ２０中で１　：　２００に柏釈）を用いて、
室温で１時間インキユベートした。次いでプロットを上
記と同様にざらに５回洗浄した。ベルオキシダーゼ結合
体の結合を、０．　５Ｒｇ／　ｄジアミノーベンジジン
；　５０１１１１１０１／ｊｌトリス−ＨＣＪ！Ｄ口７
．４　：　　２００ｍｍｏｌ／ＪＩ　Ｎａ（Ｊ及び０．
　０３％（ｖ／ｖ）　８２　０２中で前記二トＯセルロ
ースと反応させることにより検出した。反応は、プロッ
トをＰＢＳ　Ｉ）日７．０　，　０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０中でブＯットを洗浄することにより停止させた。

Ｂ．結果 ＥｔＨ１６により産生されたβ−ガラクトシダ−ゼＭ合
１白１のｓＤｓ−ＰＡＧＥ及びｔ４ｅｓｔｅｒｎプロッ
ト分析により、該蛋白質と免疫血清との、並びにマウス
抗β−ガラクトシダーゼ血清との反応が確かめられた。

Ｅｉｍｅｒｉａ　Ｄ　Ｎ　Ａによりコードされるポリベ
ブチドの大きさは、３５．５ｋＤ（２つの読み値の平均
。データは示されていない〉と推定されキ→る。

１：ｔＨ１６抗原に対応する天然蛋白質を、Ｅｔ口Ｌ（
３＠合蛋白質を含有するポリアクリルアミドゲルスライ
スの注射によりマウス又はウサギに生じた抗体、あるい
は免疫ニワトリ血清からアフィニティ精製された抗体を
用いて同定した。これらの抗体は、Ｅ．　ｔｅｎ０１　
Ｉａのスボロゾイト及び第二世代メロゾイトの両方から
単離される蛋白質の応したく第４図，一・重矢印〉。９
４．０±１．０ｋＤ（ｎ−５）の第三世代スボロゾイト
ボリベブチドが第４図で明らかに認められる（二重矢印
）。同様のポリペブチドはメロゾイトで確認されている
。

ＥｔＨＬＢ１１合蛋白質に対するマウス抗血清はまた、
Ｅ．＊ａｘｕｉａ及びＥ．　ａｃｅｒｖｕ　ｌ　＋　ｎ
ａスボロゾイト蛋白質のｗｅｓｔｅｒｎプロット上の小
グループのポリベプチドとも反応した（第５図）。その
ポリベブチドの分子量は、Ｅ．　ｔｅｎｅｔ　ｌａ蛋白
質の１４ｅｓｔｅｒｎプロット上で反応するものと同様
であり、Ｅ．ｍａｘｉｍａに関しては１◇８　〜９２ｋ
　ｌ）　，　Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａに関しては１０
２〜９４ｋ［）の範囲であった。

実』Ｌ遜一一＆ ファージストックを：１１製し、プレート溶解物からＤ
ＮＡを抽出した。標準技術を用いて、プラスミド及びコ
スミドＤＮＡをＭ’！７した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、上
記文献参照）。５０Ａ９／ｄのＲ　Ｎ　ａｓｅ存在下で
制限エンドヌクリアーゼを用いて消化した後、４０ｍｍ
ｏｌ／　ｊ２　トリスー口Ｃｊ！　，　２０ｍｍｏｌ／
　ｌ酢酸ナトリウム，　　０．１ｍｍｏ１／Ｊ！ＥＤＴ
Ａ（ｐｌｌ８．３）（ＴＡＥＩＩ％Ｉ液〉中アガロース
ゲル上でＤＮＡを分画した。

ＤＮＡパイプリ　イゼーション ゲノム．フ？−ジ，コスミド及びプラスミドＤＮＡの制
限消化物を１％アガロースゲル上で分画し、ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ法（Ｊ．Ｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８　：　　５０３
　〜５１７　：１９７５　）を用いて，　２５ｍｍｏｌ
／　１リンＩ！ｉ！ＩＩ衝液ＤＨ　６・５中Ｇｅｎｅｓ
，ｃｒｅｅｎ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｏｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅ
ａｒ）ニ移動させた。メーカーの説明１　（　Ａｓｅｒ
ｓｈａｓ）に従ってニツクトランスレーションキットで
３２Ｐ一標識化したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼ
ーションを、Ｉ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％
（ｗ／ｖ）　Ｓ　Ｏ　Ｓ　．及び４×クエン酸ナトリウ
ム塩水（ＳＳＣ）中で３７℃で１６時間行った。Ｇｒｕ
ｎＳｔｅｉｎとＨｏｇｎｅｓｓ（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＩＪ
ＳＡ　７２　：　３９６１〜３９６５　；　１９７５）
　１７）手法により、コロニーハイプリダイゼーシコン
を実施した。

クローンＥｔＨＬ６からのＤＮＡ挿入物を、４０一ｍｏ
ｌ／　１　トリスー口ＣＪ！　：　２０＋ｎｏｌ／　１
酢酸ナトリウム；０．１鋼ｍｏｌ／　！ｌ　Ｅ　Ｄ　Ｔ
Ａ　；　ｐｌｌ　８．３中の１％アガロースゲルからの
電気溶出（Ｈａｎｉａｔｉｓら、上記文献参照）によっ
て精製した。ＤＩＪＤＯｎｔの増感板及びＦｕｊｉのＲ
Ｘ　Ｘ線フィルムを用いて、−　７０’Ｃでオートラジ
オグラフィーを実施した。

Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ　　−ノム　　　（７）ＤスＳ’−
　　　一Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａゲノムＤＮＡをＭｂｏＩで
部分的に消化し、３ａｍＨＩ消化コスミドＰ　ｌ−Ｉ　
Ｃ　７９と連結し、ＨａｎｉａｔｉＳら（上記文献参照
）に従って包装した。

非増幅ライブラリーから約５００クローンを、ニツクト
ランスレーション及び［ＪされたＥｔＨＬ６挿入物を用
いて精査することによりスクリーニングした。コスミド
クローン７．４６（ｎ入物はＥｔＱ１００として示され
る一第７図参照）を多数の異なる制限エンドヌクレアー
ゼで消化し、その断片をアガロースゲル上で分離し、ニ
トロセルロース上にＳＯｕｔｈｅｒｎプロットし、再び
精査して、ＥｔＨＬ６に関連する配列を含有する制限断
片を同定した。

λ（ｌｔ　１０中の胞子形成されたＥ．ｔｅｎｅｌｌａ
接合子ｌｍＲＮＡのＣＤＮＡクローンを、上記のニツク
トランスレーション及び精製されたＥｔＨ１６挿入物を
用いて精査することによりスクリーニングした。２１個
の陽性ファージが見出された。これらのうちの１個（　
Ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１０一挿入物はＥ　ｔ　ｃ　１００と
して示される一第７図参照〉をさらに研究するために選
択した。

クローンの配列決定 ＥｔＨＬ６及びＥｔＨＬ６関連クローンからの挿入物｛
コスミドＥ　ｔ　ｇ１００及びＥｔＣ１０◇）を、配列
決定前にＭ１３１１１１１．　ｐＵＣ１３又はｐＡ　Ｔ
　１５３由来のベクターにサブクローン化した。配列決
定反応は、ジデオキシ法によって実施した（Ｂａｎｋｉ
ｅｒ　ａＢａｒｒｅｌｌ，　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉ
ｎ　ｔｈｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（（Ｂｉｏｃ
’ｈｅｍｉｓｔｒｙ）８５　：　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
　ｔｎ　Ｎｕｃｌ．＾ｃｉｄｓＢｉｏｃｈ．　　１〜３
４　：　１９８３）。

Ｂ．結　果 Ｅｔ口し６から得られたＤＮＡの物理的マツビングによ
り、ＥＣＯＲＩ挿入物のサイズは約７００ｂｌ）であっ
て、それは単一のＨｉｎｄｌＩ１部位を含むことが示さ
れた。ヌクレオチド配列分析からは、挿入物の正確なサ
イズは７２２ｂＤであることが確定され、さらに挿入物
の一方の末端付近に日ｉｎｄ　ｍ部位が存在することが
確証された。読み枠は、λａｍｐ　３ベクター内のＥｃ
ｏＲＩクローニング部位の既知の読み枠を参照して確定
したが、これにより、融合蛋白質の産生が起こる。同定
された唯一大きな読みとり枠（ＯＲＦ）は、β−ガラク
トシダーゼ遺伝子に関して挿入物の遠位部分に目ｉｎｄ
ｆ［１部位を置く配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）にあ
った。

Ｅｔ口し６バクテリオフ？−ジＤＮＡのＩ！ｉ｛ｌ限マ
ッピングから、これが実際に活性配向であることが確証
された。

Ｅｔ｝−ＩＬ６１１＋片は遺伝子全体を含有しないため
、部分的に消化されたＥ．ｔｅｎｅｌｌａゲノムＤＮＡ
の］スミドライブラリーをスクリーニングし、組み換え
コスミド７．４６を単離した。このコスミドの種々の制
限酵素消化物のＳｏｕｔｈｅｒｎブロツテイングにより
、プローブとハイブリダイズする約３ｋｂと１．３ｋｂ
の２つのＨｉｎｄｌｌｌ断片が明らかになった。さらに
１．７ｋｂ　Ｈ　ｉｎｄ　ｍ断片が確認されたが、これ
は１．３ｋｂ　Ｈ　ｉｎｄ　ｍ断片に対して轡３′側に
ある。

３ｋｂＨ　ｉｎｄ　　ｎ［　（Ｈ３）．　　１．３ｋｂ
　　Ｈ　ｉｎｄ　　ｍ　（Ｈ３Ａ）　　，　　１．３５
ｋｂ　Ｅ　ｃｏＲ　ｌ　（Ｅ５）及び１．７ｋｂ　Ｈ　
ｉｎｄ　ｌ　（Ｃ４）ｌｉ片をＤｔＪＣ１３にサブクロ
ーニングし、それらのヌクレオチド配列を決定して、２
３５９〜３０８０の位置から伸びるＥｔＨ１６断片を伴
う５，９９０ｂｐの連続するゲノム配列を得た。このヌ
クレオチド配列を第６図に示す。

ゲノムの配列決定に加えて、λｇｔｔｏライブラリ一か
らの１個のＣＤＮＡクローン、即ちＥｔ日Ｌ６挿入物に
対するハイブリダイぜーションにより確認されたＣＤＮ
ＡＩＯの配列を決定した。その挿入物は３，４０２ｂｃ
＋の長さであり、ゲノム配列上の６８８位置で開始し、
且つ４，９９３位置で終わり、ゲノム配列内で確認ざれ
た３つの介在非コードｆｉ域（イントロン）を伴なって
いた。このｃＤＮＡクローンから得られた配列データは
、第６図で示されるゲノム配列に合致する。Ｅ　ｔ　ｃ
　１００の３′末端でＡ　（１７）のざらに別の配列が
認められるが、これはＥ　ｔ　ｃ　１００のボリＡ尾部
を表わす。

第７図はＥｔＨＬ６、Ｅ　ｔ　ｇｌ００　，　Ｅ　ｔ　
ｃ１００及びＥ　ｔ　１００の一次配列（ａｔ　ｉｇｎ
ｌｅｎｔｓ＞を示す。

Ｅ　ｔ　ｃ　１００の末端の位置を、予測されるアミノ
酸配列及びゲノムイントロンとともに第６図に示す。Ｅ
　ｔ　ｃ　１００がその全長をコードしているとは思え
ない．，５′末端には、ヌクレオチド９〜１１に単一の
終止コドン（ＴＡＧ．第６図のゲノム配列のヌクレオチ
ド６９６〜６９８）があって、その直後に、同一読み枠
内で、予測されるコード配列が続く。

このコード配列は；ヌクレオチド７８〜８０にその最初
の有力な開始コドン（ＡＴＧ．第６図のゲノム配列のヌ
クレオチド７６５〜７６７）を有し、ヌクレオチド２２
１３　（第６図のゲノム配列のヌクレオチド３８０４　
）まで途切れずに続くが、ここではさらに、枠内終止コ
ドン（ＴＡＡ）が後に続く。この後には、１，１８９ｂ
ｐの見掛けの非コード配列が続き、３′末端に連なる。

この読みとり枠（ＯＲＦ）によって予測されるポリベプ
チドは長さが７１２個のアミノ酸からなり、その分子量
は７４．　８ｋＤであると算定される。予測されるアミ
ノ酸配列を、その配列組或とともに第８図に示す。この
配列を、ＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ（上記文献参照〉並びに
ＣｈｏｕとＦａｓｓｍａｎ（上記文献参照〉の計算法を
用いて、可能な抗体を結合するエビトープに関して分析
し、その結果、以下のエビトーブ領域を得た：２１０〜
３００及び４９５〜５２５。

実施例　９ Ｅ　ｔ　１００を　　する鶏痘　イルス　　え　の１至 Ａ）プラスミドの　２ ３′末端の３６２ヌクレオチドを除く全てのＥ　ｔ　ｃ
　１００を含有する１埒のブラスミドｐ　１０１９を制
限酵素３ａｍ口■及びＨｉｎｄｌｌ［で切断した。

Ｅ　ｔ　ｃ１００　ＢａｍＨ　Ｉ／日ｉｎｄ　Ｉｌｌ断
片は、５′非コード配列の上流のｐｌＪＣ１３ポリリン
カーのＢａｍＨ　Ｉ−ＥＣＯＲ　ｔ部分、並びに３′非
コード領域内の口ｉｎｄ　ｍ部位での予測される読みと
り枠（ＯＲＦ）及び末端（第６Ｃ図の４３０９〜４３１
４位置）を含有する。制限消化物を、１０ｌｉ位のＴ４
−ＤＮＡポリメラーゼ及び１０単位のＥ．　ｃｏｌｉ　
ＤＮＡボリメラーゼ（大きな断片〉で末端修復し、次い
で鶏痘ウィルス組換えブラスミド内の平滑末端化された
挿入部位にクローニングした。Ｅｔｃ１００挿入物を保
有するブラスミドを含むｍ菌シロ二を、３２Ｐで標識し
たＥ　ｔ　ｃ　１００を用いて精査することにより確認
し、挿入物の配向をミニブリーブＤ　Ｎ　Ａ　（ｉｉｎ
ｉｐｒｅｐｐｅｄ　ＤＮＡ）の制限消化によッテ確定し
た。鶏痘ウイルス内での発現に関して正しい配向の挿入
物を含有するブラスミドを確認した。

して用いて、ブラスミドＤＮＡから誘導された鶏痘ウイ
ルス組換えブラスミドとＥ　ｔ　ｃ　１００配列との結
合部分を配列決定した。この配列決定から、Ｅ　ｔ　ｃ
１００　ＢａｍＨ　ｌ／目ｉｎｄ　ｍ断片は該ベクター
の鶏痘ウイルス転写プロモーターに隣接し、また正しく
配向していることが確証された。

ルスＦＰＱ株に感染したヒヨコ−ＩＪ４−１ｉ芽細胞（
ＣＥＦ）にブラスミドをトランスフエクトしたク組換え
ウイルスを単離し、ブラークを３回精製した。鶏痘ウイ
ルスＥ１０と呼ばれる１種の組換えウイルスを、さらに
研究するために使用した。Ｅ１０の親ストックは、２５
，Ｊフラスコに単一ブラークから得られたウィルスを接
種し、その結果生じたウイルスをアリコートとして−２
０℃で保存することによッテ得た。準親ストック（ｓｕ
ｂ−ｍａｓｔｅｒ　ｓｔｏｃｋｓ）は、２０個の１２５
１フラスコのバッチに親ストックの細胞当たり０．１ブ
ラーク形成単位（ｐ．　ｆ．ｕ．　）を接種することに
より得た。ストックは全て、標準技術を用いて、ＣＥＦ
上でプラーキングして力価測定した。

Ｃ）鶏痘　イルス　１０ｆ．：　　　　ｔ　１００の２
５，Ｊ又は１２５ｄフラスコ中のＣＥＦの部分融合単層
（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ　ｍｏｎｏ１ａｙｅｒｓ
）を、１１ＢＩＩｉｉ当たり０．１　ｐ．ｆ．ｕ．で鶏
痘ウイルスＥ１０に感染させた。

感染細胞をリン酸緩衝塩水ｐＨ　７．０中で破砕するこ
とにより、感染後の種々の時間に採取し、等吊の２　Ｘ
　　Ｌａｅｍｇ＋ｌｉｌｌｌｊ液を加えて溶解した。溶
解物（約１０６ｉｌの感染細胞相当物〉を５分間沸騰さ
せ、次いで１０％ポリアクリルアミドゲル上に載せ、１
００ｖで一晩電気泳動を実施した。親鶏痘ウイルス（１
）ａｒｅｎｔａｌ　ｆｏｗｌｐｏｘｖｔｒｕｓ）に感染
した細胞からの同等の溶解物を並列させて印加、移動さ
せた。

標準技術を用いてゲルをニトロセルロース上にエレクト
ロブロツティングし、ニトロセルロース膜をＥｉｌｅｒ
ｉａ　ｔｅｎｅｌｌａに対する抗血清を用い゛で精査し
た。ＥＩＯからの溶解物において、約１００ｋＤのサィ
ズのポリベプチドはウサギ抗スボロゾイト及びニワトリ
回復期抗血清によって認識された。このポリベブチドは
、親鶏痘ウイルスに感染した細胞から得られる溶解物中
には存在しなかった。

０．１　ｐ．ｆ．ｕ．の多重感染を用いて、感染後２日
目に１００ｋＤのポリペプチドを検出したが、これは、
ウイルスの細胞変性効果により該単層が完全に破壊され
る７日目まで存続した。そのベプチドは、還元及び非還
元ゲルの両方で検出された。

Ｄ）鶏痘ウィルスＥ１０を　現するＥ　ｔ　ｉｏｏによ
ワクチン接種 １）３週令のニワトリ（Ｌｉ！ｌｈｔ　ｓｕｓｓｅｘ）
の各群に、５００／Ｊ１の１９９組織培地中で作製した
３　Ｘ　１０７ｐ．ｆ．ｕ．の親鶏痘ウイルス《■群〉
又は組換え鶏痘ウイルスＥ　１０　（　ＩＩ群〉を静脈
内に接種した。三番目の群には１９９培地のみを接種し
た（■群）．，ニワトリは全て５遍令目に２回目の同一
注射を受け、そのブースター後１０日目に採血された。

鶏痘ウイルス、並びにＥｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎＱｌｌａ
の粉砕された胞子形成接合子嚢に対するＥＬＩＳＡ力価
を測定した。

両ウイルス接種群のニワトリの９０％以上が鶏痘ウイル
スに対する抗体を有しており、これを力価おいては、力
価は無視してもよい値であった。

Ｅｉａ＋ｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａに対する力価は、有
意には上野しなかったが、１／１０００希釈液では、光
学密度の読み値が２１０群でわずかに上昇したく例えば
以下を参照〉。

抗血　の１／１０００　　　　での 群　抗−ＦＰＶ（平均〉　抗Ｅ．ｔ（平均〉Ｉ　　　　
Ｏ．８４４　　　　　　　　０．１２６ｃＩ［　　　　
０．８５５　　　　　　　　０．１６１ＩＩＩ　　　　
Ｏ．０１６　　　　　　　　０．０７０各群１０羽のニ
ワトリから得られた抗血清をブールし、これを用いて、
Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａのスボＯゾイト又は第
二世代メロゾイトから電気泳動によって分離された蛋白
質のーｅｓｔｅｒｎプロットを精査した。

１／１０００の血清希釈液では、組換えＥ１０を接種さ
れたニワトリから得られたプールされた抗血清はスボロ
ゾイトとメロゾイトの両方に関してＥｔ１０◇ボリベブ
チドを認識したが、一方他の群から得られた血清は該ポ
リベブチドを認識しなかった。

２）１週令のニワトリの各群に、５０Ｉ１１の１９９組
織培地中で作製された親又は組換え鶏痘ウイルスＥ１０
を３　ｘ　１０６ｐ．　ｆ．ｕ．用イテ、翼を乱切して
、接種した。第三群のニワトリには、１９９培地のみを
接種した。４遍令目の全ニワトリには２回目の接種を施
したが、この時にも５０ｆｉの１９９培地中の３　ｘ　
１０７ｐ．ｆ．ｕ．の適切なウィルスを接種した。

４週間目以降、１週問おきに全ニワトリを採血し、ソノ
血清を用いて、Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌ８のスボ
ロゾイト及び第二世代メロゾイトから電気泳動により分
離した蛋白質のＷｅｓｔｅｒｎプロットを精査した。

４遍目には反応性は認められなかったが、１遍間後まで
にはく２回目接種の１週問後）、ＥＩＯ接ｌ啄ワトリは
特異的に、スボロゾイト及びメロゾイトからのＥ　ｔ　
１００を識別した。

【図面の簡単な説明】

第１図：モノクローナル抗体でプローブされた（．ｔｅ
ｎｅｌｌａのスボＯゾイト及び第二世代メロゾイトのｗ
ｅｓｔｅｒｎブロ”７ト。 Ａ．　Ｅ．ＴＥ？１．１０’／−２（レーン１），　Ｅ
．ＴＥＮ．１１Ｐ−２（レーン２）でブローブされたス
ボロゾイトプロットＢ．　Ｅ．ＴＥＨ．１０Ｙ−２（レ
ーン１），　Ｅ．ＴＥＮ．１１Ｐ−２（レーン２）でブ
ローブされたメロゾイトプロット第２図：異なるスボロ
ゴニー段階におけるＥ　ｔ　Ｄ　１００（矢印〉の発現
。ニワトリの高度免疫血清でプロープされた、異なる段
階のＳＯＳ−ＰＡＧＥ分離物質の一ｅｓｔｅｒｎプロッ
ト。 レーン１：胞子形成された接合子嚢 レーン２：スボロシスト レーン３：スボロゾイト 第３図：　Ｅ．　ＴＥＮ．　１１Ｐ−２又はＥ．　ＴＥ
Ｎ．　ＩＯＹ−２モノクローナル抗体の使用による、Ｅ
．ｔｅｎｅｌｌａスボロシストからのＥ　ｔ　ｐ　１０
０（矢印）のイムノアフイニティ精製。 Ａ．グリシン／口（Ｊ（ＤＨ　２．６）の銀染色ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ 溶出画分及び出発物質 レーン１　：　Ｅ．ＴＥＮ．１０Ｙ−２カラムから溶出
レーン２　：　Ｅ．ＴＥＮ．　１１Ｐ−２カラムから溶
出レーン３：出発物質 Ｂ．出発物質及びｐＨ２．６のーｅｓｔｅｒｎブロット
ボリクローナルウサギ抗スボロゾイト 血清でプローブされた溶出画分 レーン　１：出発物質 レーン２：Ｅ．丁ＥＮ．　１１Ｐ−２カラムから溶出レ
ーン３　：　Ｅ．ＴＥＮ．　１０Ｖ−２カラムから溶出
第４図：ＥｔＨ１６抗原に対応する天然俵白質の確認。 くバネルＡ〉 び６）．免疫ニワトリ血清（レーン３及び７），並びに
正常ニワトリ血清（レーン４及び８）によって形成され
たプラークから得られた蛋白質で選択された抗体を用い
て、Ｅ．　ｔｅｎｅｌ　ｌａのスボロゾイト（Ｓｐｚ）
及びメロゾイト（Ｈｚ）蛋白質からの還元蛋白質のＷｅ
Ｓｔｅｒｎプロットを精査した。 くバネルＢ〉 ＥｔＨ１６融合蛋白質に対する抗血清。マウス抗Ｅｔ｝
−ＩＬ６融合蛋白質〈レーン１及び７），ウサギ抗Ｅｔ
Ｈ１６融合蛋白質（レーン２及び８），ＥｔＨ１６融合
蛋白質と同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の領域内を移動
するλａＩｇｐ３リゾゲンによって産生きれる蛋白質に
対する抗血清（陰性対照：レーン３及び９）．正常ウサ
ギ血清（レーン４及び１０），免疫ニワトリ血清（レー
ン５）．正常ニワトリ血清（レーン６）並びにＥ．　ｔ
ｅｎｅｔ　ｌａのスボロゾイトに対するウサギ抗血清（
レーン１１）を用いて、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａのスボロゾ
イト（Ｓｐｚ）及び／又はメロゾイト（Ｈｚ）蛋白質か
らの還元蛋白質のＷｅｓｔｅｒｎプロットを精査した。 −４矢印は、１１０及び１０２ｋ［ｌのポリベブチドダ
ブレットの位置を示す：三番目の９４ｋＯのポリペブチ
ドの位置は、二重矢印で示す〈詳細は本文参照）。分子
屋マーカーは、ミオシン，　　２００ｋＤ　：ホスフォ
リラーゼ，９２ｋＤ：ウシ血清アルブミン，６７ｋＤ　
：オボアノレブミン，　４５ｋＤ：カノレボニックアン
ヒドラーゼ．２８ｋＯ：及びミオグロビン，　１９ｋＤ
であった。 第５図：ＥｔＨ１６抗原に対応する、異なる種からの天
然ポリベブチドの検出。 ＥｔＨ１６１合蛋白質に対するマウス抗血清（レーン／
１．３及び５）．並びにＥｔＨ１６融合蛋白質と同一の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の領域内を移動するλａｍｐ３
リゾゲンによって産生された蛋白質に対するマウス抗血
清（陰性対照．レーン２．４及び６）を、Ｅ．ｔｅｎｅ
ｌｌａ　　（レーン１及び２），　Ｅ．ｍａｘｉｍａ　
（レーン３及び４）並びにＥ．　ａｃｅｒｖｕ　Ｉ　ｉ
　ｎａ　（レーン５及び６）の各スボロゾイトからの還
元蛋白質のーｅｓｔｅｒｎプロットと反応させた。分子
量マーカーの位置も示される。 第６図：　Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａゲノムＤＮＡ　（Ｅ　ｔ
　ｇ１００）のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド１か
ら５９９０まで伸びている。ＥｔＨＬ６からのゲノム挿
入物は、ヌクレオチド２３５９〜３０８０に対応する。 示される翻訳されたアミノ酸配列は、Ｅ　ｔ　ｃ　１０
０から予測ざれるものである。３つのゲノムイントロン
を破線領域で示してある。またＥ　ｔ　Ｃ　１００の５
′末端及び３′末端は黒矩形で示す。 第７図：ＥｔＨＬ６及びＥｔＨＬ６関連ゲノム配列並び
にｃＤＮＡ配列の配列図。５′及び３′末端を黒矩形で
示す。３つのゲノムイントロンを破線で示す。 第８図：ＥｔｐｌＯＯの予測されるアミノ酸配列及びそ
の含量の統計的分析。 図面の浄書（内容に変更なし） Ｆ工Ｇ．　　１ Ｆ工Ｇ．　　２ Ｆ工Ｇ．　　３Ｂ ＦＩＧ．３Ａ ＦＩＧ．　　５ １８一 Ｆ工Ｇ． ４ −　　〜　　ｃｏ　　　寸　　０１．０　　　〜　　の
　　マ　　０　　り　　　〜　　　ω　　　リ　　　Ｏ
Ｔ−ｆ＋　　〜　　門　　『つ　　り　　？　　い　　
−　　Ｑ　　　　訃　　　　ゝ　　　　の　　　　Ｏ手
続補正書 （方式） 手続補正書 平成２年７月１９８ 事件の表示 平或２年特許願第８０５６２号 事件の表示 平或２年特許願第８０５６２号 発明の名称 コクシジウム症ワクチン 補正をする者 事件との関係

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）本質的に、 （ａ）モノクロナール抗体Ｅｔ１１Ｐ−２を含有するカ
   ラム基質に￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥￥ｔｅｎｅｌｌａ￥の抽
   出物を免疫吸着すること； （ｂ）該抽出物の吸着画分を非吸着画分から分離するこ
   と； （ｃ）該カラム基質から該吸着画分を脱離すること； から成る単離方法によって得られる、￥Ｅ．ｔｅｎｅｌ
   ｌａ￥の免疫学的性質を有する蛋白質、もしくは該蛋白
   質のポリペプチド断片、又は免疫原性のある等価なポリ
   ペプチド又は蛋白質。
2. （２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約１００±１０ｋＤの
   見掛けの分子量を有する請求項１記載の蛋白質。
3. （３）第８図に示されるアミノ酸配列を特徴とする請求
   項１記載のポリペプチド又は該ポリペプチドの断片。
4. （４）請求項１記載の蛋白質又は蛋白質断片をコードす
   るポリヌクレオチド配列。
5. （５）第６図に示されるヌクレオチド配列を特徴とする
   請求項４記載のポリヌクレオチド配列又は該ポリヌクレ
   オチド配列の部分配列。
6. （６）第６図に示されるコーディングヌクレオチド配列
   を特徴とする請求項４記載のポリヌクレオチド配列。
7. （７）請求項４から６記載のポリヌクレオチド配列の発
   現を可能にする調節配列に関して位置を定められた 前記ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
8. （８）請求項７記載のベクターで形質転換された宿主生
   物。
9. （９）￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥種の抗原特性を有する蛋白質
   又はポリペプチド断片の製造方法であって、請求項８記
   載の宿主生物を培養することを包含する方法。
10. （１０）請求項１〜３記載の蛋白質もしくはそのポリペ
    プチド断片と免疫反応性の抗体又は抗血清。
11. （１１）本質的に、 （ａ）請求項１０記載の抗血清を含有するカラム基質に
    ￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥種の抽出物を免疫吸着すること： （ｂ）該抽出物の吸着画分を非吸着画分から分離するこ
    と； （ｃ）該吸着画分をカラム基質から脱離すること；から
    成る単離方法によつて得られる、￥Ｅｉｍｅｒｉａ￥種
    の免疫学的性質を有する蛋白質、又は該蛋白質のポリペ
    プチド断片。
12. （１２）請求項１〜３もしくは１１記載の蛋白質又はポ
    リペプチド、請求項４〜６記載のポリヌクレオチド配列
    、請求項７記載の組み換えベクター、請求項８記載の宿
    主生物、又は請求項１０記載の抗体を含有する￥Ｅｉｍ
    ｅｒｉａ￥感染に対する予防活性を有するワクチン。
13. （１３）アミノ酸配列ＩＳＰＱＫＰＧＳＰＰＣＰＴＣＥ
    ＡＰＲＧＲＳＣＡＥＱＰＰＧＬＴＲ又はＰＶＤＥＶＶＧ
    ＤＷＥＤＷＧＱＣＳＥＱＣＧＧＧＫＲＴＲＮＲＧＰＳを
    持つポリペプチド、及びこれらの配列を含有するポリペ
    プチド。