DE69828330T2

DE69828330T2 - Aktiviertes Protein C Formulierungen

Info

Publication number: DE69828330T2
Application number: DE69828330T
Authority: DE
Inventors: Andrew David Indianapolis Carlson; Theodore Arsay Indianapolis Sheliga
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1997-04-28
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2018-04-29
Also published as: CO4950523A1; PL336420A1; ES2234072T3; CO4940438A1; HUP0003401A3; SI0875252T1; CN1261280A; ID23172A; PL336889A1; EA199900980A1; ID22933A; NO995198L; WO1998048818A1; UA73071C2; ATE285788T1; ZA983497B; JP4383547B2; UA55448C2; JP2001524111A; BR9809292A

Description

Die Erfindung liegt im Gebiet der Humanmedizin, insbesondere der Behandlung von vaskulären Störungen mit aktiviertem Protein C. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung Formulierungen von aktiviertem, humanem Protein C.
Protein C ist eine Serinprotease und ein natürlich vorkommendes Antikoagulans, das eine Rolle bei der Regulation der Hämostase durch die Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIa in der Gerinnungskaskade spielt. Humanes Protein C wird in vivo primär in der Leber als einzelnes Polypeptid mit 461 Aminosäuren gebildet. Dieses Vorläufermolekül durchläuft mehrfach posttranslationale Modifikationen einschließlich 1) Abspaltung einer 42 Aminosäure langen Signalsequenz, 2) proteolytische Spaltung des einkettigen Zymogens zwischen dem Lysinrest an der Position 156 und dem Argininrest an der Position 157 unter Bildung einer zweikettigen Zymogenform des Moleküls (das heißt eine leichte Kette mit 155 Aminosäureresten ist über eine Disulfidbrücke an die die Serinprotease enthaltende schwere Kette mit 262 Aminosäureresten gebunden), 3) Vitamin-K abhängige Carboxylierung von neun Glutaminsäureresten die in den ersten 42 Aminosäuren der leichten Kette vorkommen, was zu 9 γ-Carboxyglutaminsäureresten führt und 4) Kohlenhydratanfügung an vier Stellen (eine in der leichten Kette und drei in der schweren Kette). Die schwere Kette enthält die gut etablierte Serinproteasentriade aus Asp 257, His 211 und Ser 360. Schließlich wird das zirkulierende zweikettige Zymogen in vivo durch Thrombin an einer Phospholipidoberfläche in Gegenwart von Calciumionen aktiviert. Die Aktivierung kommt durch die Entfernung eines Dodecapeptids am N-Terminus der schweren Kette unter Bildung des aktivierten Protein C (aPC) zustande, das eine enzymatische Aktivität besitzt.
Zusätzlich zu den enzymatischen Aktivitäten von aPC innerhalb der Blutgerinnungskaskade kann aPC auch eine Autodegradierung durchmachen, was zu einer verringerten Funktionalität als Antikoagulans führt. Es wurde ein wichtiger Abbauweg aufgefunden. Die Autodegradierung des N-Terminus der leichten Kette kann zu einer Spaltung auf jeder Seite des Histidinrests an Position 10 führen. Daher führt dieser Abbauweg zu zwei inaktiven Produkten: 1) Des(1-9)-aktiviertes Protein C, worin die ersten 9 N-terminalen Reste der leichten Kette entfernt wurden und 2) Des(1-10)-aktiviertes Protein C, worin die ersten 10 N-terminalen Reste der leichten Kette entfernt wurden. Dieser Abbauweg, der vorher nicht berichtet wurde, führt zu einem Verlust der Antikoagulansaktivität aufgrund der Entfernung der entscheidenden GLA Reste an den Positionen 6 und 7. Daher ist die Minimierung des Ausmaßes an Des(1-9)- und Des(1-10)-aktivierten Protein C Autodegradierungsprodukten wichtig bei der Erzielung einer starken, hochreinen pharmazeutischen Formulierung von aktiviertem Protein C. Diese Varianten waren bisher unbekannte Abbauprodukte und sind zunehmend schwer, falls überhaupt durch herkömmliche Reinigungstechniken zu entfernen. Es wurde ferner festgestellt, dass die Löslichkeit aus dem festen Zustand in Gegenwart einer ausgewählten Gruppe an Füllstoffen signifikant verbessert ist.
Es ist auf jeden Fall erwünscht, einen solchen Abbau von aktiviertem Protein C sowohl in den Lösungs- als auch festen Lyophilisierungszuständen zu minimieren. Demnach erlauben diese Erkenntnisse die Herstellung von potenten, hochreinen, Formulierungen von aktiviertem Protein C, die pharmazeutisch elegant sind, für das Pflegepersonal.
Die vorliegende Erfindung liefert verbesserte Formulierungen von aktiviertem Protein C, die im wesentlichen frei von Autodegradierungsprodukten, insbesondere Des(1-9)- und Des(1-10)-Formen der leichten Kette des aktivierten Protein C, sind. Daher sind diese Formulierungen zur Verabreichung an einen Patienten geeignet, der dessen bedarf.
Die vorliegende Erfindung liefert eine stabile lyophilisierte Formulierung, die aktiviertes Protein C und einen Füllstoff umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe, welche besteht aus Mannit, Trehalose, Raffinose, Saccharose und Gemischen hievon.
Die vorliegende Erfindung liefert auch eine stabile, lyophilisierte Formulierung, die etwa 2,5 mg/ml aktiviertes Protein C, etwa 15 mg/ml Saccharose und etwa 20 mg/ml NaCl enthält. Darüberhinaus liefert die vorliegende Erfindung eine stabile, lyophilisierte Formulierung, die etwa 5 mg/ml aktiviertes Protein C, etwa 30 mg/ml Saccharose und etwa 38 mg/ml NaCl enthält.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung einer Formulierung, die aktiviertes Protein C und einen Füllstoff umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Mannit, Trehalose, Raffinose und Saccharose und Gemischen hiervon.
Die Erfindung liefert auch eine Einheitsdosierungsform, die ein Einheitsdosierungsbehältnis umfasst, das die Formulierung enthält, worin das Gewicht-zu-Gewichtverhältnis etwa 1 Teil aktiviertes Protein C, etwa 7,6 Teile Salz und etwa 6 Teile Füllstoff enthält.
Die Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Behandlung von Krankheitszuständen, die eine intravaskuläre Koagulation umfassen, welches die Verabreichung einer hierin beschriebenen Formulierung von aktiviertem Protein C umfasst.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin beschrieben und beansprucht wird, werden die folgenden Ausdrücke wie folgt definiert.
aPC oder aktiviertes Protein C bezieht sich auf aktiviertes Protein C, das rekombinant ist oder aus dem Plasma stammt. aPC umfasst und ist vorzugsweise humanes aktiviertes Protein C, obwohl aPC auch andere Spezies oder Derivate mit den proteolytischen, amidolytischen, esterolytischen und biologischen (gerinnungshemmenden oder profibrinolytischen) Eigenschaften von Protein C umfassen kann. Beispiele für Protein C Derivate sind von Gerlitz et al., US 5 453 373 A und Foster et al., US 5 516 650 A beschrieben.
APTT – aktivierte, partielle Thromboplastinzeit
r-hPC – rekombinantes humanes Protein C Zymogen
r-aPC – rekombinantes aktiviertes Protein C, das durch die Aktivierung des Protein C Zymogens in vitro oder in vivo oder durch die direkte Sekretion der aktivierten Form von Protein C aus prokaryontischen Zellen, eukaryontischen Zellen oder transgenen Tierzellen hergestellt wird, einschließlich beispielsweise der Sekretion aus humanen Nierenzellen 293 als Zymogen und die anschließende Reinigung und Aktivierung durch Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind und in Yan, US 4 981 952 A und Cottingham, WO 97/20043 A gezeigt sind.
Kontinuierliche Infusion – die im wesentlichen ununterbrochene Fortsetzung der Einführung einer Lösung in ein Blutgefäß für einen bestimmten Zeitraum.
Bolusinjektion – die Injektion eines Arzneimittels in einer definierten Menge (Bolus genannt) auf einmal.
Zur Verabreichung geeignet – eine lyophilisierte Formulierung oder Lösung, die zur Verabreichung als therapeutisches Mittel geeignet ist.
Zymogen – Protein C Zymogen bezieht sich, wie hierin verwendet, auf sekretierte, inaktive Formen von Protein C, die einkettig oder zweikettig sein können,
Pharmazeutisch annehmbarer Puffer – ein pharmazeutisch annehmbarer Puffer ist der Technik bekannt. Pharmazeutisch annehmbare Puffer umfassen Natriumphosphat, Natriumcitrat, Natriumacetat oder Tris.
Aktiviertes Protein X ist ein antithrombotisches Mittel mit einem breiteren therapeutischen Index als verfügbare Antikoagulantien, wie Heparin und die oralen Antikoagulantien vom Hydroxykumarintyp. Als antithrombotisches Mittel weist aPC einen deutlichen Effekt auf die Behandlung einer großen Vielzahl an erworbenen Krankheitszuständen auf, die eine intravaskuläre Koagulation umfassen, einschließlich Schlaganfall, tiefe Venenthrombose, Lungenembolie, periphere, arterielle Thrombose, Embolien, die vom Herzen oder peripheren Arterien stammen, akuter Myokardinfarkt, disseminierte, intravaskuläre Koagulation und akute Prä- oder Postkapillarverschlüsse, einschließlich Transplantationen oder Retinathrombose.
Die vorliegende Erfindung betrifft Formulierungen von aktiviertem Protein C. Die gewünschte Formulierung wäre eine, die ein stabiles, lyophilisiertes Produkt mit hoher Reinheit ist, das aus aktiviertem Protein C und einem Füllstoff besteht, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus Mannit, Trehalose, Raffinose und Saccharose. Das lyophilisierte Produkt wird mit dem geeigneten Verdünnungsmittel rekonstituiert, wie sterilem Wasser oder steriler Kochsalzlösung. Vorzugsweise hat die entstehende Lösung einen pH von etwa 5,5 bis etwa 6,5.
Die molekularen Wechselwirkungen in einer Formulierung zwischen aktiviertem Protein C, Puffer, Salzkonzentration, pH, Temperatur und Füllstoffen sind komplex und die Rolle, die jeder Faktor zur Stabilität der Formulierung beiträgt, ist nicht vorhersehbar. Die lyophilisierten Formulierungen der vorliegenden Erfindung liefern stabiles, enzymatisch aktives aktiviertes Protein C nach einer Resuspendierung aufgrund einer verringerten Autodegradierung. Die vorliegende Erfindung weist insbesondere verringerte Mengen des Des(1-9)-aPC und des Des(1-10)-aPC auf. Im allgemeinen betragen die Mengen des Des(1-9)- und des Des(1-10)-aPC weniger als 10 % des Autodegradierungsprodukts. Vorzugsweise betragen die Mengen des Des(1-9)- und des Des(1-10)-aPC weniger als 8 % des Autodegradierungsprodukts. Noch bevorzugter betragen die Mengen des Des(1-9)- und des Des(1-10)-aPC weniger als 5 % und vor allem weniger als 3 % des Autodegradierungsprodukts. Diese Stabilität wird durch eine sorgfältige Kontrolle der Prozessierungsbedingungen und durch die Zugabe von Saccharose, Trehalose, Raffinose oder Mannit erhalten. Interessanterweise liefern andere Füllstoffe, wie Hydroxyethylstärke und Glycin nicht die notwendige Stabilität oder pharmazeutische Eleganz.
Die Füllstoffe der vorliegenden Erfindung liefern eine pharmazeutisch elegante Formulierung, die eine gleichförmige Erscheinung aufweist und leicht solubilisiert werden kann, wenn sie mit einem geeigneten Solut resuspendiert wird. Nach einer Rekonstitution ist die Formulierung für bis zu 24 Stunden bis 48 Stunden bei Raumtemperatur stabil. Dies führt zu einer Stabilität, die vorher nicht erreicht werden konnte.
Bevorzugte Füllstoffe in der Formulierung von aktiviertem Protein C sind Saccharose, Trehalose und Raffinose. Noch bevorzugtere Füllstoffe sind Saccharose und Raffinose und der am meisten bevorzugte Füllstoff ist Saccharose. Die Menge an Füllstoff beträgt in der Formulierung 1 Teil aPC auf 1 bis 10 Teile Füllstoff auf einer Gewicht-zu-Gewicht Basis. Darüber hinaus ist die Füllstoffkonzentration der Formulierung eine wichtige Formulierungsvariable des Gefriertrocknungsprozesses. Die optimale Konzentration an Füllstoff hängt von der Menge an aPC und der Art des ausgewählten Füllstoffs ab. Die bevorzugte Konzentration an Saccharose in der Gefrierlösung beträgt 10 bis 40 mg/ml. Eine bevorzugtere Konzentra tion an Saccharose beträgt 15 bis 30 mg/ml. Die am meisten bevorzugte Konzentration an Saccharose in der Gefrierlösung beträgt 15 mg/ml in einer Formulierung von aPC bei 2,5 mg/ml. Die am meisten bevorzugte Konzentration an Saccharose in der Gefrierlösung beträgt 30 mg/ml in einer Formulierung von aPC bei 5,0 mg/ml. Das Vorkommen des beanspruchten Füllstoffs in der Formulierung an aktiviertem Protein C bietet eine erhöhte chemische und physikalische Stabilität.
Vor dem Gefriertrocknen und bei der Rekonstitution ist es bevorzugt, den pH im Bereich von 5,5 bis 6,5 zu halten, um die Autodegradierung im gelösten Zustand zu minimieren. Der bevorzugte pH der Formulierung ist ein pH zwischen etwa pH 5,6 und etwa pH 6,4. Bevorzugter ist ein pH zwischen etwa 5,7 und etwa 6,3. Noch bevorzugter ist ein pH zwischen etwa 5,8 und etwa 6,2. Noch bevorzugter ist ein pH zwischen etwa 5,9 und etwa 6,1. Der am meisten bevorzugte pH beträgt etwa pH 6,0.
Um eine wirksame pH Kontrolle aufrechtzuerhalten sollte die aPC Lösung einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer aufweisen. Demnach enthält die Formulierung bei der Gefriertrocknung wahlweise und vorzugsweise einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer. Repräsentative Puffersysteme umfassen Tris-Acetat, Natriumcitrat und Natriumphosphat. Bevorzugtere Puffersysteme umfassen Natriumcitrat und Natriumphosphat. Der am meisten bevorzugte Puffer ist Natriumcitrat. Die bevorzugte Molarität des Puffersystems beträgt 10 mM bis 50 mM. Eine bevorzugtere Molarität des Puffersystems beträgt 10 mM bis 20 mM. Die am meisten bevorzugte Molarität beträgt 40 mM. Der Fachmann erkennt, dass viele andere Puffersysteme verfügbar sind, die ebenfalls in den Formulierungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Ähnlich ist während dem Gefriertrocknen und bei der Rekonstitution die Ionenstärke eine kritische Variable, um die Stabilität im Lösungszustand sicherzustellen. Die Ionenstärke wird im allgemeinen durch die Salzkonzentration der Lösung bestimmt. Pharmazeutisch annehmbare Salze, die typischerweise verwendet werden, um die Ionenstärke zu bilden, umfassen unter anderem Kaliumchlorid (KCl) und Natriumchlorid (NaCl). Das bevorzugte Salz in der vorliegenden Erfindung ist Natriumchlorid. Während der Gefriertrocknung muss die Salzkonzentration hoch genug sein, um das Salz während dem Gefrierschritt des Gefriertrocknungszyklus ausfallen zu lassen. Vorzugsweise beträgt die Natriumchloridkonzentration mehr als 150 mM. Bevorzugter liegt die Natriumchloridkonzentration in der Gefrierlösung zwischen 150 mM bis 1000 mM. Für eine Formulierung, die 2,5 mg/ml aPC enthält, liegt eine bevorzugtere Natriumchloridkonzentration in der Gefrierlösung zwischen 150 mM und 650 mM. Noch bevorzugter liegt die Natriumchloridkonzentration in der Gefrierlösung zwischen 250 mM und 450 mM. Noch bevorzugter liegt die Natriumchloridkonzentation in der Gefrierlösung zwischen 300 mM und 400 mM. Die am meisten bevorzugte Natriumchloridkonzentration in der Gefrierlösung beträgt 325 mM für eine Formulierung, die 2,5 mg/ml aPC enthält.
Ähnlich liegt für eine Formulierung, die 5,0 mg/ml aPC enthält, die bevorzugtere Natriumchloridkonzentration in der Gefrierlösung zwischen 150 mM und 1000 mM. Noch bevorzugter liegt die Natriumchloridkonzentration in der Gefrierlösung zwischen 250 mM und 750 mM. Noch bevorzugter liegt die Natriumchloridkonzentration in der Gefrierlösung zwischen 400 mM und 700 mM. Die am meisten bevorzugte Natriumchloridkonzentration in der Gefrierlösung beträgt 650 mM für eine Formulierung, die 5,0 mg/ml aPC enthält.
Das Verhältnis von aPC : Salz : Füllstoff (G:G:G) ist ein wichtiger Faktor bei einer Formulierung, die für den Gefriertrocknungsprozess geeignet ist. Das Verhältnis variiert in Abhängigkeit von der Konzentration an aPC, der Salzauswahl und der Konzentration und Füllstoffauswahl und der Konzentration. Der Fachmann kann leicht das bevorzugte Verhältnis von aPC : Salz : Füllstoff durch Techniken ermitteln, die in der Technik bekannt und beschrieben sind, wie in Beispiel 1. Insbesondere ist ein Gewichtsverhältnis von einem Teil aktiviertem Protein C zu etwa 7 bis 8 Teilen Salz zu etwa 5 bis 7 Teilen Füllstoff bevorzugt. Bevorzugter ist ein Gewichtsverhältnis von einem Teil aktiviertem Protein C zu etwa 7,5 bis etwa 8 Teilen Salz zu etwa 5,5 bis etwa 6,5 Teilen Füllstoff. Am bevorzugtesten ist ein Verhältnis von etwa 1 Teil aktiviertem Protein C zu etwa 7,6 Teilen Salz zu etwa 6 Teilen Füllstoff.
Das bevorzugte Salz ist Natriumchlorid mit einer Konzentration von 325 mM (für eine Formulierung, die 2,5 mg/ml aPC enthält) und 650 mM (für eine Formulierung, die 5,0 mg/ml aPC enthält) und ein Verhältnis von etwa 1,3:1 mit Saccharose (G:G) bevorzugt. Diese Konzentration ist hoch genug, um das Salz während des Einfrierprozesses ausfallen zu lassen, was höchstwahrscheinlich zu einem amorphen Gemisch aus aPC, Saccharose und Citrat führt, das lyophilisiert werden kann. So verleiht die Ionenstärke von NaCl in den bevorzugten Konzentrationen von 325 mM und 650 mM der Formulierung während dem Gefriertrocknungsprozess eine Stabilität.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen, lyophilisierten Formulierung, das die Lyophilisierung einer Lösung umfasst, die aktiviertes Protein C und einen Füllstoff aus der Gruppe enthält die aus Mannit, Trehalose, Raffinose, Saccharose und Gemischen hiervon besteht. Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen, lyophilisierten Formulierung, das die Lyophilisierung einer Lösung umfasst, die etwa 2,5 mg/ml aktiviertes Protein C, etwa 15 mg/ml Saccharose, etwa 19 mg/ml NaCl und einen Natriumcitratpuffer mit einem pH von mehr als 5,5 aber weniger als 6,5 enthält. Darüberhinaus liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen, lyophilisierten Formulierung, das die Lyophilisierung einer Lösung umfasst, die etwa 5 mg/ml aktiviertes Protein C, etwa 30 mg/ml Saccharose, etwa 38 mg/ml NaCl und einen Citratpuffer mit einem pH von mehr als 5,5 aber weniger als 6,5 enthält.
Die vorliegende Erfindung liefert eine Einheitsdosierungsform, die einen Einheitsdosierungsbehälter umfasst, der eine stabile lyophilisierte Formulierung enthält, die aktiviertes Protein C und einen Füllstoff enthält, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus Mannit, Trehalose, Raffinose, Saccharose und Gemischen hiervon. Darüberhinaus liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Krankheitszuständen, die die intravaskuläre Koagulation betreffen, das die Verabreichung dieser Formulierung umfasst.
Das aPC wird vorzugsweise parenteral verabreicht, um dessen Abgabe in den Blutstrom in einer wirksamen Form sicherzustellen, wobei die geeignete Dosis als kontinuierliche Infusion für etwa 1 bis etwa 48 Stunden verabreicht wird. Die Menge an verabreichtem aPC reicht von etwa 0,01 mg/kg/h bis etwa 0,05 mg/kg/h. Alternativ dazu wird das aPC durch die Injektion eines Teils der geeigneten Dosis pro Stunde als Bolusinjektion über einen Zeitraum von etwa 5 Minuten bis etwa 30 Minuten verabreicht, wonach eine kontinuierliche Infusion der geeigneten Dosis für etwa 23 Stunden bis etwa 47 Stunden erfolgt, die zur geeigneten Dosis führt, welche über 24 Stunden bis 48 Stunden verabreicht wird.
Die folgenden Beispiele helfen bei der Beschreibung, wie die Erfindung durchgeführt wird und erläutern die Erfindung. Der Umfang der vorliegenden Erfindung soll nicht nur aus den folgenden Beispielen bestehen.
Präparation 1
Herstellung von humanem Protein C
Rekombinantes humanes Protein C (rHPC) wird in humanen 293 Nierenzellen durch Techniken hergestellt, die dem Fachmann gut bekannt sind, wie die, die in Yan, US 4 981 952 A beschrieben sind, wobei die gesamte Beschreibung hiervon hiermit eingeführt ist. Das für humanes Protein C kodierende Gen ist in Bang et al, US 4 775 624 A beschrieben und beansprucht. Das zur Expression von humanem Protein C in 293-Zellen verwendete Plasmid ist das Plasmid pLPC, das in Bang et al, US 4 992 373 A beschrieben ist. Die Konstruktion von Plasmid pLPC ist auch in der EP 0 445 939 A und Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5: 1189-1192 beschrieben. Kurz gesagt wird das Plasmid in 293 Zellen transfiziert, dann werden stabile Transformanden identifiziert, subkultiviert und in serumfreiem Medium angezogen. Nach der Fermentation erhält man ein zellfreies Medium durch Mikrofiltration.
Das humane Protein C wird aus der Kulturtlüssigkeit durch eine Anpassung an die Techniken von Yan US 4 981 952 A abgetrennt. Das geklärte Medium wird auf 4 mM EDTA gebracht, bevor es an eine Anionenaustauscherharzsäule adsorbiert wird (Fast-Flow Q, Pharmacia). Nach dem Waschen mit 4 Säulenvolumina 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 und 2 Säulenvolumina 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4 wird das gebundene rekombinante humane Protein C Zymogen mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂ pH 7,4 eluiert. Das eluierte Protein ist zu mehr als 95 % rein nach der Elution, wie dies durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese beurteilt wird.
Eine weitere Reinigung des Proteins wird durch Aufstocken des Proteins auf 3 M bezüglich NaCl gefolgt von einer Adsorption an ein hydrophobes Wechselwirkungsharz (Toyopearl Phenyl 650M, Toso Haas) erreicht, das mit 20 mM Tris, 3 M NaCl, 10 mM CaCl₂ pH 7,4 äquilibriert ist. Nach dem Waschen mit 2 Säulenvolumina des Äquilibrierungspuffers ohne CaCl₂ wird das rekombinante humane Protein C mit 20 mM Tris pH 7,4 eluiert.
Das eluierte Protein wird durch die Entfernung des restlichen Calciums auf die Aktivierung vorbereitet. Das rekombinante humane Protein C passiert eine Metallaffinitätssäule (Chelex-100, Bio-Rad), um Calcium zu entfernen und wird erneut an einen Anionenaustauscher gebunden (Fast Flow Q, Pharmacia). Diese beiden Säulen werden in Reihe angeordnet und mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA pH 7,4 äquilibriert. Nach der Beladung mit Protein wird die Chelex-100 Säule mit einem Säulenvolumen desselben Puffers gewaschen, bevor sie aus der Reihe genommen wird. Die Anionenaustauschersäule wird mit 3 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor das Protein mit 0,4 M NaCl, 20 mM Tris-Acetat pH 6,5 eluiert wird. Die Proteinkonzentrationen der Lösungen an rekombinantem humanem Protein C und rekombinantem aktiviertem Protein C werden jeweils durch Extinktion bei UV von 280 nm und mit E^0,1% = 1,81 oder 1,85 gemessen.
Präparation 2
Aktivierung von rekombinantem humanem Protein C
Rinderthrombin wird an aktivierte CH-Sepharose 4B (Pharmacia) in Gegenwart von 50 mM HE-PES pH 7,5 bei 4°C gekuppelt. Die Kupplungsreaktion wird mittels etwa 5000 Einheiten Thrombin/ml Harz auf Harz ausgeführt, das bereits in eine Säule gepackt ist. Die Thrombinlösung zirkuliert für etwa 3 Stunden durch die Säule, bevor 2-Aminoethanol (MEA) in einer Konzentration von 0,6 ml/l der zirkulierenden Lösung zugegeben wird. Die MEA enthaltende Lösung wird für weitere 10-12 Stunden zirkuliert, um die vollständige Blockierung der nicht-abreagierten Amine auf dem Harz sicherzustellen. Nach der Blockierung wird das mit Thromin-gekuppelte Harz mit 10 Säulenvolumina an 1 M NaCl, 20 mM Tris pH 6,5 gewaschen, um das gesamte nicht-spezifisch gebundene Protein zu entfernen und wird in Aktivierungsreaktionen nach der Äquilibrierung in Aktivierungspuffer verwendet.
Gereinigtes r-hPC wird auf 5 mM EDTA gebracht (um restliches Calcium zu binden) und mit 20 mM Tris, pH 7,4 oder 20 mM Tris-Acetat pH 6,5 auf eine Konzentration von 2 mg/ml verdünnt. Dieses Material passiert eine Thrombinsäule, die bei 37°C mit 50 mM NaCl und entweder 20 mM Tris pH 7,4 oder 20 mM Tris-Acetat pH 6,5 äquilibriert ist. Die Flußrate wird so eingestellt, dass eine Kontaktzeit von etwa 20 Minuten zwischen dem r-hPC und dem Thrombinharz ermöglicht wird. Der Effluent wird gesammelt und sofort auf amidolytische Aktivität getestet. Falls das Material keine spezifische Aktivität (amidolytisch) im Vergleich zu einem etablierten aPC Standard aufweist, wird es über die Thrombinsäule zurückgeführt, um das r-hPC vollständig zu aktivieren. Danach erfolgt eine 1:1 Verdünnung des Materials mit 20 mM Puffer wie oben mit einem pH von entweder 7,4 oder 6,5, um das aPC bei geringeren Konzentrationen zu halten, während es auf den nächsten Aufarbeitungsschritt wartet.
Die Entfernung des ausgelaugten Thrombins vom aPC Material wird durch Bindung des aPC an ein Anionenaustauscherharz erreicht (Fast Flow Q, Pharmacia), das in einem Aktivierungspuffer mit 150 mM NaCl äquilibriert ist (entweder 20 mM Tris pH 7,4 oder 20 mM Tris-Acetat pH 6,5). Thrombin interagiert unter diesen Bedingungen nicht mit dem Anionenaustauscherharz, sondern läuft durch die Säule in den Probenauftragseffluent. Wenn das aPC auf die Säule aufgetragen ist, wird ein Waschschritt mit 2-6 Säulenvolumina mit einem 20 mM Äquilibrierungspuffer ausgeführt, bevor das gebundene aPC mit einer Stufenelution mittels 0,4 M NaCl entweder in 5 mM Tris-Acetat pH 6,5 oder 20 mM Tris pH 7,4 eluiert wird. Größervolumige Waschschritte der Säule erleichtern die vollständige Entfernung des Dodecapeptids. Das Material, das aus dieser Säule eluiert, wird entweder in einer gefrorenen Lösung (-20°C) oder als lyophilisiertes Pulver gelagert.
Die Antikoagulansaktivität des aktivierten Protein C wird durch Messen der Verlängerung der Gerinnungszeit im aktivierten partiellen Thromboplastinzeittest (APTT) bestimmt. Es wird eine Standardkurve in Verdünnungspuffer (1 mg/ml Radioimmuntest-reines Rinderserumalbumin [BSA], 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃) hergestellt, die von 125-1000 ng/ml reicht, wobei die Proben in mehreren Verdünnungen in diesem Konzentrationsbereich hergestellt werden. Zu jeder Probenküvette werden 50 μl kaltes Pferdeplasma und 50 μl des rekonstituierten Reagenzes für die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT Reagenz, Sigma) gegeben und bei 37°C für 5 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation werden 50 μl der geeigneten Proben oder Standards zu jeder Küvette gegeben. Verdünnungspuffer wird anstelle der Probe oder des Standards verwendet, um die basale Gerinnungszeit zu bestimmen. Der Timer des Fibrometers (CoA Screener Hemostasis Analyser, American Labor) wird unmittelbar nach der Zugabe von 50 μl 30 mM CaCl₂ mit 37°C zu jeder Probe oder zu jedem Standard gestartet. Die Konzentration des aktivierten Protein C in den Proben wird aus der linearen Regressionsgleichung der Standardkurve berechnet. Die hierin angegebenen Gerinnungszeiten sind das Mittel von minimal drei Parallelansätzen, einschließlich der Proben für die Standardkurve.
Beispiel 1
Formulierung von aktiviertem Protein C
Das humane aktivierte Protein C wird wie in den Präparationen 1 und 2 beschrieben hergestellt. Die Formulierungen des aktivierten Protein C werden auf die Verarbeitung in einem herkömmlichen Gefriertrockner analysiert. Gefriertrocknungsmikroskopie und Differentialscanningkalorimetrie (DSC) werden zum Messen der zwei Parameter verwendet, die bestimmen, ob eine Formulierung in einem herkömmlichen Gefriertrockner verarbeitet werden kann. Die Gefriertrocknungsmikroskopie ist eine brauchbare Technik bei der Bestimmung der Kolabierungstemperaturen der gefrorenen Lösungen, die lyophilisiert werden sollen. Die DSC ist eine brauchbare Technik bei der Bestimmung der Glasübergangstemperatur (Tg') der gefrorenen Lösung. Die Kolabierungs- und Glasübergangstemperaturen sind speziell bei der Vorhersage der oberen Temperaturgrenzen brauchbar, die sicher während des Gefriertrocknungsprozesses verwendet werden können. Die Ergebnisse der Gefriertrocknungsmikroskopie sind zur Glasübergangstemperatur des Tg' komplementär, wobei die Werte durch DSC erhalten werden. Eine Kolabierungstemperatur über -40°C ist für die Probe optimal, die in einem herkömmlichen Gefriertrockner verarbeitet werden soll.
Tabelle 1: Gefriertrocknungsverarbeitung von aPC Formulierungsmatrizes
Das Verhältnis von aPC zu Saccharose zu Natriumchlorid (in 10 oder 20 mM Citratpuffer) ist eine wichtige Formulierungsvariable, die die Kolabierungs- und Glasübergangstemperaturen beeinflusst. Um in einem herkömmlichen Gefriertrockner verarbeitet zu werden, muss die Natriumchloridkonzentration hoch genug sein (vorzugsweise 325 mM für 2,5 mg/ml aPC und 650 mM für 5 mg/ml aPC Formulierungen), um das Auskristallisieren des Natriumchlorids während dem Gefrierabschnitt des Gefriertrocknungsprozesses zu verursachen. Die aPC Formulierungen können in einem herkömmlichen Gefriertrockner unter Bildung der lyophilisierten Produkte verarbeitet werden, die aus 1 Teil aPC, 6 Teilen Saccharose und 7,6 Teilen Natriumchlorid bezogen auf das Gewicht bestehen.
Beispiel 2
Stabilität von aPC in Produktformulierungen, die unterschiedliche Füllstoffe enthalten
Es werden Fomulierungen von aPC hergestellt, um die Wirkung von verschiedenen Füllstoffen auf die Stabilität des Moleküls zu untersuchen. Es werden insgesamt 6 Hilfsstoffe zu aPC in Phosphatpuffer gegeben, der kein Salz enthält. Diese Füllstoffe sind Glycin, Mannit, Saccharose, Trehalose, Raffinose und Hydroxyethylstärke (HES). Die Stabilität von aPC im Phosphat ohne Salz und ohne Füllstoffformulierung ("Kontrolle") wird mit der in den Füllstoffformulierungen verglichen. Es werden Proben bei 50°C, 40°C und 25°C für verschiedene Zeitspannen gelagert. Die Daten aus der Analyse dieser Proben werden mit den anfänglichen Werten (Zeitpunkt = 0) verglichen. Die APTT Wirksamkeit, Größenausschlusshochleistungsflüssigchromatographie (SE-HPLC), SDS-PAGE und Proteingehaltstests werden verwendet, um die physikalische und chemische Stabilität der Formulierungen zu evaluieren.
Die aPC Formulierungen werden durch Lösen von aPC in Phosphatpuffer mit 5 mg/ml aPC hergestellt. Die Füllstoffe werden zu Teilen der aPC Lösung in einem Verhältnis von 6:1 (Füllstoff zu aPC) oder 30 mg/ml gegeben. Die Proben werden mit 5 mg aPC/Gläschen lyophilisiert.
Die Formulierungen werden bei 50°C für 14 und 28 Tage, bei 40°C für 28 Tage, 48 Tage und 6 Monate und bei 25°C für 6 und 12 Monate auf Stabilität gelegt. Für jeden Zeitpunkt werden 2 Gläschen jeder Formulierung unabhängig als getrennte Proben analysiert und die Daten aus diesen Proben werden mit denen der anfänglichen Werte (Zeitpunkt = 0) verglichen. Die Analysen umfassen aPC Wirksamkeit (APTT), SDS-PAGE, Prozent an aPC Monomer und Proteingehalt.
Es gibt keine signifikanten Veränderungen im pH, der Farbe, der Verpackungscharakteristiken und des physikalischen Erscheinungsbildes bei allen Proben über die Stabilitätsperiode von 1 Jahr. Bei einer Analyse durch die APTT und SE-HPLC Verfahren weisen die HES und Glycin-Formulierungen eine geringere physikalische Stabilität (durch Aggregation) und eine chemische Stabilität (Wirksamkeit) auf, wenn sie mit der Kontrolle verglichen werden. Die Mannitformulierung bietet eine leicht bessere physikalische und chemische Stabilität als die Kontrolle und die verbleibenden Formulierungen mit Saccharose, Trehalose und Raffinose zeigen alle eine sogar verbesserte physikalische und chemische Stabilität im Vergleich zur Kontrolle. Daher bieten Mannit, Saccharose, Trehalose und Raffinose als Füllstoffe in aPC Formulierungen eine erhöhte chemische und physikalische Stabilität im Vergleich mit einer aPC Formulierung ohne Füllstoff oder mit denen, die Glycin oder HES enthalten.
Beispiel 3
Stabilität von rekombinantem, humanem, aktiviertem Protein C
Zwei Lots einer lyophilisierten Formulierung von rekombinantem, humanem, aktiviertem Protein C (aPC) werden für 1 Monat bei 40°C/75 % relativer Luftfeuchtigkeit gelagert und dann auf einen möglichen Abbau analysiert. Die Stabilität von aPC wird auch nach einer Rekonstitution mit sterilem Wasser und einer Lagerung für bis zu 72 Stunden bei Umgebungstemperatur getestet. Das lyophilisierte aPC Produkt besteht aus 10 mg aPC, 60 mg Saccharose, 76 mg Natriumchlorid und 15,1 mg Citrat pro Gläschen. Das aPC ist in dieser Formulierung im trockenen Zustand für mindestens 1 Monat stabil, wenn es bei 40°C/75 % relativer Luftfeuchtigkeit gelagert wird und in Lösung für 24 Stunden, wenn es bei Umgebungstemperatur gelagert wird.
Beide Lots werden mit derselben Einheitsformel aus 10 mg aPC, 60 mg Saccharose, 76 mg Natriumchlorid und 15,1 mg Citrat pro Gläschen hergestellt. Beide lyophilisierten Lots an aPC werden für 1 Monat bei 40°C/75 % relativer Luftfeuchtigkeit gelagert und die Stabilität von aPC wird mittels des APTT Wirksamkeitstests, Ionenpaar-HPLC zur Quantifizierung der aPC Peptide und Massenspektroskopie zur Quantifizierung der Proteinvarianten verfolgt. Ein Lot wird auch mit sterilem Wasser auf 1 mg/ml aPC rekonstituiert und bei Umgebungstemperatur gehalten. Die Stabilität von aPC in Lösung wird zu den Zeitpunkten 0, 1, 4, 8, 24, 48 und 72 Stunden mittels APTT und Massenspektrometriemethoden verfolgt.
Es findet kein Verlust der aPC Aktivität und eine nicht signifikante Menge an strukturellem Abbau des Moleküls nach einer Lagerung im trockenen Zustand für 1 Monat bei 40°C/75 % relativer Luftfeuchtigkeit statt. Das aPC ist in dieser Formulierung für bis zu 24 Stunden bei 1 mg/ml nach der Rekonstitution stabil.

Claims

Lyophilisierte Formulierung, die ein rekombinantes, humanes, aktiviertes Protein C, einen Füllstoff, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Mannit, Trehalose, Raffinose und Saccharose und Gemischen hiervon und ein Puffersystem umfasst, so dass bei der Rekonstitution die entstehende Formulierung einen pH zwischen etwa 5,5 und 6,5 aufweist.
Formulierung nach Anspruch 1, worin der pH zwischen etwa 5,9 und 6,1 liegt.
Formulierung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Puffersystem ausgewählt ist aus Trisacetat, Natriumcitrat und Natriumphosphat oder Gemischen hiervon.
Formulierung nach Anspruch 3, worin das Puffersystem Natriumcitrat ist.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die ferner ein pharmazeutisch annehmbares Salz umfasst.
Lyophilisierte Formulierung, die ein rekombinantes, humanes, aktiviertes Protein C, ein Salz und einen Füllstoff umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Mannit, Trehalose, Raffinose und Saccharose, worin das Gewichtsverhältnis ein Teil rekombinantes, humanes, aktiviertes Protein C zu etwa 7 bis 8 Teile Salz zu etwa 5 bis 7 Teile Füllstoff beträgt.
Formulierung nach Anspruch 6, worin das Gewichtsverhältnis ein Teil rekombinantes, humanes, aktiviertes Protein C zu 7,6 Teile Salz zu 6 Teile Füllstoff beträgt.
Formulierung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin das Salz ausgewählt ist aus Kaliumchlorid und Natriumchlorid.
Formulierung nach Anspruch 8, worin das Salz Natriumchlorid ist.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin der Füllstoff Saccharose ist.
Formulierung nach einem der Ansprüche 5 bis 10, so dass bei der Rekonstitution die entstehende Formulierung 5 mg/ml rekombinantes, humanes, aktiviertes Protein C, 30 mg/ml Saccharose und 38 mg/ml Natriumchlorid enthält.
Lyophilisierte Formulierung, die 5 mg rekombinantes, humanes, aktiviertes Protein C, 30 mg Saccharose und 38 mg Natriumchlorid umfasst.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Verwendung bei der Behandlung der Krankheitszustände, die die intravaskuläre Koagulation betreffen.
Formulierung nach Anspruch 13, worin der Krankheitszustand, der eine intravaskuläre Koagulation umfasst, aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus thrombotischem Schlaganfall, tiefer Venenthrombose, Lungenembolie, peripherer arterieller Thrombose, Embolien, die aus dem Herzen oder den peripheren Arterien kommen, akutem Myokardinfarkt, disseminierter intravaskulärer Koagulation und akuter Prä- oder Postkapillarverschlüsse.
Formulierung nach Anspruch 14 zur Verwendung bei der Behandlung des thrombotischen Schlaganfalls.
Einheitsdosierungsform, die eine Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in einem Einheitsdosierungsbehältnis umfasst.