DE69905489T2

DE69905489T2 - Protein c zur behandlung von sichelzellanämie und thalassämie

Info

Publication number: DE69905489T2
Application number: DE69905489T
Authority: DE
Inventors: Lee Um; Gail Utterback; Betty Yan
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Cardiome Pharma Corp
Priority date: 1998-11-23
Filing date: 1999-11-16
Publication date: 2003-09-11
Anticipated expiration: 2019-11-17
Also published as: EP1133314A1; AU1723200A; BR9915572A; US6372213B2; DE69905489D1; JP2002530352A; ATE232739T1; US20020012662A1; IL142247A0; ES2192874T3; CN1326357A; CA2351591A1; EP1133314B1; ZA200102727B; DK1133314T3; WO2000030676A1

Description

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der Patentanmeldung 60/109 474 vom 23. November 1998.
Die Erfindung betrifft die medizinische Wissenschaft, insbesondere die Verwendung von Protein C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Sichelzellanämie oder Thalassämie.
Protein C ist eine Vitamin K abhängige Serinprotease und ein natürlich auftretendes Antikoagulationsmittel, das eine Rolle bei der Regulation der Hämostase durch die Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIa in der Gerinnungskaskade spielt. Humanes Protein C zirkuliert als zweikettiges Zymogen, wirkt aber an der Oberfläche von Endothel und Blutplättchen nach einer Umwandlung in aktiviertes Protein C (aPC) durch limitierte Proteolyse mit Thrombin im Komplex mit dem Zelloberflächenmembranprotein, nämlich Thrombomodulin.
Zusammen mit anderen Proteinen fungiert aPC vermutlich als der wichtigste Dämpfer der Blutgerinnung, was zu einem Schutz gegen Thrombose führt. Zusammen mit den Antikoagulationsfunktionen hat aPC durch die Wirkung über der Hemmung der Cytokinerzeugung (beispielsweise TNF und IL-1) antinflammatorische Effekte und zeigt auch profibrinolytische Eigenschaften, die die Gerinnselauflösung erleichtern. Daher stellt das Protein C Enzymsystem einen physiologischen Hauptmechanismus der Gerinnungshemmung, Entzündunghemmung und Fibrinolyse dar.
Sichelzellerkrankungen (SCD) und Thalassämie sind angeborene Hämoglobulinopathien, die durch einen strukturellen Hämoglobindefekt gekennzeichnet sind. Die SCD umfaßt Erkrankungen, die die Sichelbildung von roten Blutzellen verursacht und umfaßt Sichelzellanämie (die aus zwei Hämoglobin-S-Genen resultiert), Sichel-Γ- Thalassämie (ein Hämoglobin S und ein Γ-Thalassämiegen) und Hämoglobin-SC-Erkrankung (ein Hämoglobin S und ein Hämoglobin C) und die seltenere Erkrankung Hämoglobin-C-Harlem. Die Thalassämie umfaßt β- Thalassämie und Γ-Thalassämie. Diese vererbten Erkrankungen weisen eine signifikante Morbidität und Mortalität auf und betreffen Individuen mit afrikanisch-amerikanischen Erbanlagen, wie auch die mit Abstammungen aus dem Mittelmeerraum, dem Mittleren Osten und Südostasien. Diese Erkrankung verursacht gewöhnlich starken Schmerz bei den Erkrankten, teilweise aufgrund der Ischämie, die durch die zerstörten roten Blutzellen verursacht wird, die den freien Fluß durch den Kreislauf blockieren.
SCD wird als präthrombotischer Zustand betrachtet, da bestimmte Eigenschaften der Sichelzellen, wie die abnormale Adhäsivität und das Felüen der Membranphospholipidasymmetrie im thrombotischen Prozeß beteiligt sind [Marfing-Koka et al., Nouv Rev Fr. Hamatol 35: 425-430, 1993]. Die meiste Morbidität der SCD scheint mit dem Auftreten des Verschlusses der Mikrovaskulatur zusammenzuhängen, was zu einer weit verbreiteten Ischämie und irreversiblen Organschädigung führt. Zusätzlich wurde eine Mikrothromboembolie der Lunge bei 44% der Autopsien der Thalassämiepatienten beschrieben [Chuansumrit et al., J. Med Assoc Thai, 76(2): 80-84, 1993].
Untersuchungen unter Verwendung von empfindlichen Tests für die Gerinnung haben Anzeichen eines hyperkoagulierbaren Zustands dokumentiert, der bei Erwachsenen mit SCD zu einem Gefäßverschluß führt. Der Gefäßverschluß ist ein komplexer Prozeß, der zelluläre, vaskuläre und humorale Faktoren und möglicherweise thrombotische Ereignisse umfaßt. Das Auftreten eines Schlaganfalls ist wahrscheinlich die verheerendste Komplikation der SCD bei einem Kind [Peters et al., Thrombosis and Haemostasis 71(2): 69-172, 1994, D. Tam, Journal of Child Neurology 12(1): 121, 1997].
Die Defizienzen von Protein C und die erhöhte Thrombinerzeugung wurden bei Patienten mit SCD oder Thalassämie bereichtet [Karayalcin et al., The American Journal of Pediatric Hematology/Oncology 11(3): 320- 323, 1989, Hazmi et al., Acta Haematol 90: 114-119, 1993, Peters, 1994, Shirahata et al. Southeast Asian J Trop Med Pub Health 23(2): 65-73]. Die geringeren Protein C Spiegel bei SCD oder Thalassämie beruhen entweder auf der verringerten Bildung oder dem erhöhten Verbrauch. Daher existiert ein Gerinnungsungleichgewicht bei Patienten mit SCD oder Thalassämie, das wiederum für die schädlichen klinischen Effekte verantwortlich ist, die bei diesen Patienten beobachtet werden.
Derzeit gibt es keine wirksame Therapie zur Verhinderung des Schmerzes, der mit SCD oder Thalassämie assoziiert ist oder zur Korrektur der krankheitsverursachenden Gene. Der derzeitige Behandlungsansatz umfaßt intravenöse Lösungen aus Glucose und Elektrolyten, narkotischen Analgetika und antientzündlichen Mitteln [Green et al., American Journal of Hematology 23: 317-321, 1986]. Kürzlich wurde das Chemotherapeutikum Hydroxyharnstoff bei einer steigenden Zahl an Sichelzellanämiepatienten verwendet. In schwereren Fällen oder nach einem ischämischen Schlaganfall werden Austauschtransfusionen und Knochenmarkstransplantationen verwendet [Ferrera et al. American Journal of Emergency Medicine 15(7): 671-679, 1997]. Die prophylaktische Transfusion ist die einzige akzeptierte Therapie für Patienten mit SCD, die einen Schlaganfall hatten. Daher besteht ein Bedarf für eine sichere, effektive Therapie für Patienten mit SCD oder Thalassämie.
Die vorliegende Erfindung beschreibt als erstes die Behandlung von SCD oder Thalassämie mit Protein C. Protein C ist mit seinen gerinnungshemmenden, entzündungshemmenden und profibrinolytischen Aktivitäten brauchbar zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des hyperkoagulierbaren Zustands oder des Protein C Mangels, der bei Patienten mit SCD oder Thalassämie auftritt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an Sichelzellerkrankung (SCD) oder Thalassämie leidet, das die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge an Protein C an diesen Patienten umfaßt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ein Verfahren zur Behandlung der Sichelzellerkrankung oder Thalassämie bei einem Patienten, der dessen bedarf, das die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge an aktiviertem Protein C an diesen Patienten umfaßt, so daß der Plasmaspiegel an aktiviertem Protein C 2 ng/ml bis 300 ng/ml beträgt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin beschrieben und beansprucht wird, werden die folgenden Ausdrücke definiert.
Protein C bezieht sich auf eine Vitamin K abhängige Serinprotease mit gerinnungshemmenden, entzündungshemmenden und profibrinolytischen Eigenschaften, das unter anderem von Plasma stammendes Protein C und rekombinant hergestelltes Protein C umfaßt. Protein C umfaßt und ist vorzugsweise humanes Protein C, obwohl Protein C auch andere Spezies oder Derivate mit den proteolytischen, amidolytischen, esterolytischen und biologischen (gerinnungshemmend, profibrinolytisch und antientzündlich) Aktivitäten von Protein C umfassen kann. Beispiele für Protein C Derivate sind beschrieben von Gerlitz et al., US 5 453 373 A und Foster et al., US 5 516 650 A.
Zymogen - ein enzymatisch inaktiver Vorläufer eines proteolytischen Enzyms. Das hierin verwendete Protein C Zymogen betrifft sekretierte, inaktive Formen, ob einkettig oder zweikettig, von Protein C.
Aktiviertes Protein C oder aPC bezieht sich auf das Protein C Zymogen, das durch begrenzte Proteolyse in dessen aktive Form umgewandelt wurde. aPC umfaßt und ist vorzugsweise humanes Protein C, obwohl aPC auch andere Spezies oder Derivate mit den proteolytischen, amidolytischen, esterolytischen und biologischen (gerinnugshemmend oder profibrinolytisch) Eigenschaften von Protein C umfassen kann. Beispiele für Protein C Derivate sind oben bei der Beschreibung von Protein C beschrieben.
HPC - humanes Protein C Zymogen
r-hPC - rekombinantes humanes Protein C Zymogen
r-aPC - rekombinantes humanes aktiviertes Protein C, das durch die Aktivierung von r-hPC in vitro oder durch die direkte Sekretion der aktivierten Form von Protein C aus prokaryontischen Zellen, eukaryontischen Zellen und transgenen Tieren oder Pflanzen hergestellt wird, einschließlich beispielsweise der Sekretion von humanen Nierenzellen 293 als Zymogen und die anschließende Reinigung und Aktivierung durch Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind und in Yan, US 4 981 952 A und Cottingham, WO97/20043 gezeigt sind.
Aus Plasma stammendes, aktiviertes Protein C - aktiviertes Protein C, das durch die Aktivierung von Plasma-HPC hergestellt wird, wie dies in Eibl, US 5 478 558 A beschrieben ist.
Kontinuierliche Infusion - die im wesentlichen ununterbrochene Fortsetzung der Einführung einer Lösung in eine Vene für einen bestimmten Zeitraum.
Bolusinjektion - die Injektion eines Arzneimittels in einer definierten Menge (Bolus genannt) über einen Zeitraum von bis zu 120 Minuten.
Zur Verabreichung geeignet - eine lyophilisierte Formulierung oder Lösung, die zur Verabreichung als therapeutisches Mittel geeignet ist.
Einheitsdosierungsform - bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die zur einzelnen Dosierungen für Menschen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktivem Material enthält, die zur Herstellung des gewünschten therapeutischen Effekts berechnet ist, zusammen mit einem geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoff.
Pharmazeutisch wirksame Menge - steht für eine Menge einer Verbindung der Erfindung, die zur Hemmung der Sepsis beim Menschen fähig ist. Die bestimmte Dosis der gemäß der Erfindung verabreichten Verbindung wird natürlich vom behandelnden Arzt bestimmt, der die bestimmten Umstände beurteilt, die den Fall umgeben.
Die vorliegende Erfindung liefert die Verwendung von Protein C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Sichelzellanämie (SCD) oder der Thalassämie. Das Protein C ist mit seinen gerinnungshemmenden antientzündlichen und profibrinolytischen Aktivitäten zur Behandlung des hyperkoagulierbaren Zustands oder der Protein C Defizienz brauchbar, die bei Patienten mit SCD oder Thalassämie auftreten.
Das gemäß der Erfindung verwendete Protein C kann durch jedes Mittel, das in der Technik bekannt ist, oder wie dies in US 4 981 952 A und US 5 550 036 A beschrieben ist, erzeugt und/oder hergestellt werden. Beispielsweise kann Protein C durch die Sekretion von löslichem Vollängenprotein C oder biologisch aktiven Polypeptidvarianten von Protein C aus einer Zelle hergestellt werden, das umfaßt (a) Konstruktion eines Vektors, der eine DNA umfaßt, welche für Protein C kodiert, (b) Transfektion der Zelle mit dem Vektor und (c) Kultivierung der so transfizierten Zelle in einem Kulturmedium unter Bedingungen, so daß das lösliche Vollängenprotein C oder die biologisch aktiven Polypeptidvarianten von Protein C sekretiert werden. Ferner ist die Zelle eine eukaryontische Zelle, beispielsweise Säugerzelle, wie die Syrische AV12 Hamsterzelle, die humane embryonale 293 Zelle oder die Babyhamsternierenzelle.
Das zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von SCD oder Thalassämie verwendete Protein C kann gemäß bekannter Verfahren unter Bildung von brauchbaren Zusammensetzungen formuliert werden. Beispielsweise würde eine erwünschte Formulierung eine sein, die ein stabiles lyophilisiertes Produkt mit hoher Reinheit ist, das einen Füllstoff, wie Saccharose, ein Salz, wie Natriumchlorid, einen Puffer, wie Natriumcitrat, und Protein C oder aPC umfaßt.
Das Protein C wird parenteral verabreicht, um die Abgabe in den Blutstrom in einer effektiven Form sicherzustellen, indem man die geeignete Dosis als kontinuierliche Infusion für etwa 1 Stunde bis etwa 240 Stunden injiziert.
Der Fachmann kann leicht die pharmazeutisch wirksamen Dosierungen und die Verabreichungspläne für therapeutische Zusammensetzungen optimieren, die Protein C enthalten, wie dies durch eine gute medizinische Praxis und dem klinischen Zustand des einzelnen Patienten bestimmt wird. Im allgemeinen beträgt die Menge an verabreichtem Protein C 5,0 ug/kg/h bis 250 ug/kg/h. Vorzugsweise ist das bei der Behandlung von SCD verwendete Protein C aktiviertes Protein C (aPC). Die Menge an verabreichtem aPC beträgt 1,0 ug/kg/h bis 96 ug/kg/h. Bevorzugter beträgt die Menge an verabreichtem aPC 1,0 ug/kg/h bis 50 ug/kg/h. Bevorzugter beträgt die verabreichte Menge an aPC 1,0 ug/kg/h bis 35 ug/kg/h. Noch bevorzugter beträgt die Menge an verabreichtem aPC 5,0 ug/kg/h bis 30 ug/kg/h. Noch bevorzugter beträgt die Menge an verabreichtem aPC 15 ug/kg/h bis 30 ug/kg/h. Vor allem beträgt die Menge an verabreichtem aPC 20 ug/kg/h bis 30 ug/kg/h. Die bevorzugte Menge an verabreichtem aPC beträgt etwa 24 ug/kg/h. Die am meisten bevorzugte Menge an verabreichtem aPC beträgt etwa 48 ug/kg/h. Die geeignete Dosis an verabreichtem aPC führt zu einer Verringerung der thrombotischen Komplikationen, die mit SCD assoziiert sind.
Die aus der verabreichten Menge erhaltenen Plasmaspiegel betragen etwa 2 ng/ml bis 300 ng/ml. Die bevorzugten Plasmaspiegel betragen 2 ng/ml bis 200 ng/ml. Am bevorzugtesten betragen die Plasmaspiegel 30 ng/ml bis 150 ng/ml und noch bevorzugter etwa 100 ng/ml.
Alternativ dazu kann aPC durch die Injektion eines Drittels der geeigneten Dosis pro Stunde als Bolusinjektion gefolgt von den verbleibenden zwei Dritteln der stündlichen Dosis als kontinuierliche Infusion für eine Stunde gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion der geeigneten Dosis für 23 Stunden verabreicht werden, was zur geeigneten Dosis führt, die über 24 Stunden verabreicht wird. Zusätzlich kann die Bolusinjektion über eine intravenöse Beuteltropfpumpe oder Spritzenpumpe mit dem Zweifachen der normalen Geschwindigkeit für 15 Minuten, gefolgt vom 1,5-fachen der normalen Geschwindigkeit für 45 Minuten verabreicht werden. Die normale Geschwindigkeit, das heißt die Geschwindigkeit, die zur Verabreichung des geeigneten Dosisspiegels des therapeutischen Mittels pro Zeiteinheit bestimmt wurde, wird dann für bis zu 240 Stunden fortgesetzt.
Die Verwendung von Protein C zur Behandlung der SCD oder Thalassämie, wie dies gezeigt wurde, liefert eine erforderliche Therapie für eine potentiell ernste und entkräftende Störung. Die Verwendung von Protein C ist wirksam und vermeidet die Komplikationen, wie Blutungstendenz, Toxizität und andere allgemeine Nebenwirkungen der derzeit verfügbaren gerinnungshemmenden Mittel.
Die folgenden Beispiele werden nur bereitgestellt, um die Erfindung weiter zu erläutern. Der Umfang der Erfindung soll nicht so aufgefaßt werden, daß er nur aus den folgenden Beispielen besteht.

Beispiel 1

Herstellung von humanem Protein C

Rekombinantes humanes Protein C (r-hPC) wird in humanen 293-Nierenzellen durch Techniken hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind, wie die, die in Yan, US 4 981 952 A beschrieben sind. Das für humanes Protein C kodierende Gen ist beschrieben und beansprucht in Bang et al., US 4 775 624 A. Das zur Expression von humanem Protein C in 293-Zellen verwendete Plasmid ist pLPC, das in Bang et al., US 4 992 373 A beschrieben ist. Die Konstruktion des Plasmids pLPC ist auch in der EP 0 445 939 A und in Grinnell et al., 1987, Bio Technology 5: 1189-1192 beschrieben. Kurz gesagt wird das Plasmid in 293-Zellen transfiziert und dann werden stabile Transformanden identifiziert, subkultiviert und in serumfreiem Medium angezogen. Nach der Fermentation wird zellfreies Medium durch Mikrofiltration erhalten.
Das humane Protein C wird aus der Kulturflüssigkeit durch eine Anpassung an die Techniken von Yan US 4 981 952 A abgetrennt. Das geklärte Medium wird auf 4 mM EDTA gebracht, bevor es an eine Anionenaustauscherharzsäule adsorbiert wird (Fast-Flow Q, Pharmacia). Nach dem Waschen mit 4 Säulenvolumina 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 und 2 Säulenvolumina 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4 wird das gebundene rekombinante humane Protein C Zymogen mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl&sub2; pH 7,4 eluiert. Das eluierte Protein ist zu mehr als 95% rein nach der Elution, wie dies durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese beurteilt wird.
Eine weitere Reinigung des Proteins wird durch Aufstocken des Proteins auf 3 M bezüglich NaCl gefolgt von einer Adsorption an ein hydrophobes Wechselwirkungsharz (Toyopearl Phenyl 650M, TosoHaas) erreicht, das mit 20 mM Tris, 3 M NaCl, 10 mM CaCl&sub2; pH 7,4 äquilibriert ist. Nach dem Waschen mit 2 Säulenvolumina des Äquilibrierungspuffers ohne CaCl&sub2; wird das rekombinante humane Protein C mit 20 mM Tris pH 7,4 eluiert.
Das eluierte Protein wird durch die Entfernung des restlichen Calciums auf die Aktivierung vorbereitet. Das rekombinante humane Protein C passiert eine Metallaffinitätschromatographiesäule (Chelex-100, Bio-Rad), um Calcium zu entfernen und wird erneut an einen Anionenaustauscher gebunden (Fast Flow Q, Pharmacia). Diese beiden Säulen werden in Reihe angeordnet und mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA pH 7,4 äquilibriert. Nach der Beladung mit Protein wird die Chelex-100 Säule mit einem Säulenvolumen desselben Puffers gewaschen, bevor sie aus der Reihe genommen wird. Die Anionenaustauschersäule wird mit 3 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor das Protein mit 0,4 M NaCl, 20 mM Tris-Acetat pH 6,5 eluiert wird. Die Proteinkonzentrationen der Lösungen an rekombinantem humanem Protein C und rekombinantem aktiviertem Protein C werden jeweils durch Extinktion bei UV mit 280 nm und E0,1% = 1,81 oder 1,85 gemessen.

Beispiel 2

Aktivierung von rekombinantem humanem Protein C

Rinderthrombin wird an aktivierte CH-Sepharose 4B (Pharmacia) in Gegenwart von 50 mMHEPES pH 7,4 bei 4ºC gekuppelt. Die Kupplungsreaktion wird mittels etwa 5000 Einheiten Thrombin/ml Harz auf Harz ausgeführt, das bereits in eine Säule gepackt ist. Die Thrombinlösung zirkuliert für etwa 3 Stunden, bevor MEA in einer Konzentration von 0,6 ml/l der zirkulierenden Lösung zugegeben wird. Die MEA enthaltende Lösung wird für weitere 10-12 Stunden zirkuliert, um die vollständige Blockierung der nicht-abreagierten Amine auf dem Harz sicherzustellen. Nach der Blockierung wird das mit Thromin-gekuppelte Harz mit 10 Säulenvolumina an 1 M NaCl, 20 mM Tris pH 6,5 gewaschen, um das gesamte nicht-spezifisch gebundene Protein zu entfernen und wird in Aktivierungsreaktionen nach der Äquilibrierung in Aktivierungspuffer verwendet.
Gereinigtes r-hPC wird auf 5 mM EDTA gebracht (um restliches Calcium zu binden) und mit 20 mM Tris. pH 7,4 oder 20 mM Tris-Acetat pH 6,5 auf eine Konzentration von 2 mg/ml verdünnt. Dieses Material passiert eine Thrombinsäule, die bei 37ºC mit 50 mM NaCl und entweder 20 mM Tris pH 7,4 oder 20 mM Tris-Acetat pH 6,5 äquilibriert ist. Die Flußrate wird so eingestellt, daß eine Kontaktzeit von etwa 20 Minuten zwischen dem r-hPC und dem Thrombinharz ermöglicht wird. Der Effluent wird gesammelt und sofort auf amidolytische Aktivität getestet. Falls das Material keine spezifische Aktivität (amidolytisch) im Vergleich zu einem etablierten aPC Standard auf weist, wird es über die Thrombinsäule zurückgeführt, um das r-hPC vollständig zu aktivieren. Danach erfolgt eine 1 : 1 Verdünnung des Materials mit 20 mM Puffer wie oben mit einem pH von entweder 7,4 oder 6,5, um das aPC bei geringeren Konzentrationen zu halten, während es auf den nächsten Aufarbeitungsschritt wartet.
Die Entfernung des ausgelaugten Thrombins vom aPC Material wird durch Bindung des aPC an ein Anionenaustauscherharz erreicht (Fast Flow Q, Pharmacia), das in einem Aktivierungspuffer mit 150 mM NaCl äquilibriert ist (entweder 20 mM Tris pH 7,4 oder 20 mM Tris-Acetat pH 6,5). Thrombin interagiert unter diesen Bedingungen nicht mit dem Anionenaustauscherharz, sondern läuft durch die Säule in den Probenauftragseffluent. Wenn das aPC auf die Säule aufgetragen ist, wird ein Waschschritt mit 2-6 Säulenvolumina mit einem 20 mM Äquilibrierungspuffer ausgeführt, bevor das gebundene aPC mit einem Stufengradienten mittels 0,4 M NaCl entweder in 5 mM Tris-Acetat pH 6,5 oder 20 mM Tris pH 7,4 eluiert wird. Größervolumige Waschschritte der Säule erleichtern die vollständige Entfernung des Dodecapeptids. Das Material, das aus dieser Säule eluiert, wird entweder in einer gefrorenen Lösung (-20ºC) oder als lyophilisiertes Pulver gelagert.
Die Antikoagulansaktivität des aktivierten Protein C wird durch Messen der Verlängerung der Gerinnungszeit im aktivierten partiellen Thromboplastinzeittest (APTT) bestimmt. Es wird eine Standardkurve in Verdünnungspuffer (1 mg/ml Radioimmuntest-reines BSA, 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02% NaN&sub3;) hergestellt, die von 125-1000 ug/ml reicht, wobei die Proben in mehreren Verdünnungen in diesem Konzentrationsbereich hergestellt werden. Zu jeder Probenküvette werden 50 ul kaltes Pferdeplasma und 50 ul des rekonstituierten Reagenzes für die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT Reagenz, Sigma) gegeben und bei 37ºC für 5 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation werden 50 ul der geeigneten Proben oder Standards zu jeder Küvette gegeben. Verdünnungspuffer wird anstelle der Probe oder des Standards verwendet, um die basale Gerinnungszeit zu bestimmen. Der Timer des Fibrometers (CoA Screener Hemostasis Analyser, American Labor) wird unmittelbar nach der Zugabe von 50 ul 30 mM CaCl&sub2; mit 37ºC zu jeder Probe oder zu jedem Standard gestartet. Die Konzentration des aktivierten Protein C in den Proben wird aus der linearen Regressionsgleichung der Standardkurve berechnet. Die hierin angegebenen Gerinnungszeiten sind das Mittel von minimal drei Parallelansätzen, einschließlich der Proben für die Standardkurve.
Die obigen Beschreibungen ermöglichen es einem Fachmann, Protein C zur Verwendung bei der Behandlung der Sichelzellanämie herzustellen.

Präparation 3

Formulierung von aktiviertem Protein C

Es wird eine stabile lyophilisierte Formulierung von aktiviertem Protein C durch ein Verfahren hergestellt, das die Lyophilisierung einer Lösung umfaßt, die etwa 2,5 mg/ml aktiviertes Protein C, etwa 15 mg/ml Saccharose, etwa 20 mg/ml NaCl und einen Natriumcitratpuffer mit einem pH von mehr als 5, 5 aber weniger als 6,5 enthält. Zusätzlich umfaßt die stabile lyophilisierte Formulierung von aktiviertem Protein C die Lyophilisierung einer Lösung, die etwa 5 mg/ml aktiviertes Protein C, etwa 30 mg/ml Saccharose, etwa 38 mg/ml NaCl und einen Citratpuffer mit einem pH von mehr als 5,5 aber weniger als 6,5 enthält.
Das Verhältnis von Protein C : Salz : Füllstoff (G : G : G) ist ein wichtiger Faktor in einer Formulierung, die für den Gefriertrocknungsprozeß geeignet ist. Das Verhältnis variiert in Abhängigkeit der Konzentration an Protein C, der Auswahl und Konzentration des Salzes und der Auswahl und der Konzentration des Füllstoffs. Insbesondere ist ein Verhältnis von etwa 1 Teil aktiviertem Protein C zu etwa 7,6 Teilen Salz zu etwa 6 Teilen Füllstoff bevorzugt.
Eine Einheitsdosierungsform von aktiviertem Protein C, die zur Verabreichung durch kontinuierliche Infusion geeignet ist, wird durch Mischen von aktiviertem Protein C, NaCl, Saccharose und Natriumcitratpuffer hergestellt. Nach dem Mischen werden 4 ml der Lösung in ein Einheitsdosierungsbehältnis überführt und lyophilisiert. Das Einheitsdosierungsbehältnis, das etwa 5 mg bis etwa 20 mg aktiviertes Protein C enthält und zur Verabreichung einer Dosis von etwa 0,01 mg/kg/h bis etwa 0,05 mg/kg/h an behandlungsbedürftige Patienten geeignet ist, wird verschlossen und bis zur Verwendung gelagert.

Beispiel 1

Durch Plazebo kontrollierte Doppelblindstudie mit rekombinantem, humanem aktiviertem Protein C (r-aPC) bei Patienten mit Sichelzellerkrankung (SCD)

Studien an Patienten mit Sichelzellerkrankung (SCD) in einer Schmerzkrise haben die Abnormalitäten des Blutplättchenüberlebens und deren Aggregation wie auch die Veränderungen in den Gerinnungsfaktoren gezeigt. Der Gefäßverschluß in der Mikrozirkulation ist ein Schlüsselfaktor in der Pathogenese von homozygoter SCD. Der Prozeß des Gefäßverschlusses ist multifaktoriell und die Koagulationsstörungen dürften dazu beitragen.
Der derzeitige Behandlungsansatz für Patienten mit SCD umfaßt intravenöse Lösungen aus Glucose und Elektrolyten, narkotischen Analgetika und/oder entzündungshemmenden Mitteln. In schwereren Fällen oder nach einem ischämischen Schlaganfall werden Autauschtransfüsionen und Knochenmarkstransplantation verwendet.
Dieser Versuch soll zeigen, daß die Infusion von r-aPC zu einer statistisch signifikanten Reduktion des kombinierten Ergebnisses aus verringerter Schmerzkrise und Vorkommen von ischämischen Schlaganfällen in Patienten mit homozygoter SCD führt.
Aufnahmekriterien umfassen Patienten mit homozygoter Sichelzellerkrankung aus einer Studienpopulation aus Kindern und jungen Erwachsenen. Diese Patienten treten innerhalb von 48 Stunden nach einer Krankenhauseinweisung und in einer typischen Schmerzkrise in die Studie ein.
Patienten, die die Aufnahmekriterien für SCD erfüllen, werden intravenöse Lösungen aus Glucose und Elektrolyten und narkotischen Analgetika verabreicht. Zusätzlich erhalten die Patienten entweder ein Plazebo oder r- aPC für 96 Stunden. r-aPC wird in einer Dosis von 24 ug/kg/h verabreicht.
Der primäre Endpunkt der Untersuchung ist die Reduktion/Eliminierung der Schmerzkrise. Die Sicherheit und Wirksamkeit von r-aPC wird mit dem Plazebo verglichen. Der zweite Endpunkt des Versuchs ist die Reduktion /Eliminierung des ischämischen Schlaganfalls, der mit SCD assoziiert ist.

Claims

1. Verwendung von Protein C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der an Sichelzellanämie (SCD) oder Thalassämie leidet.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Protein C humanes Protein C Zymogen ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Protein C humanes aktiviertes Protein C ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, worin die Menge an humanem aktiviertem Protein C 1 ug/kg/h bis 50 ug/kg/h beträgt.

5. Verwendung nach Anspruch 4, worin das humane Protein C durch kontinuierliche Infusion für 1 bis 240 Stunden verabreicht wird.

6. Verwendung von aktiviertem Protein C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der an Sichelzellanämie oder Thalassämie leidet, worin das Arzneimittel in einer Menge verabreicht wird, daß sich ein Plasmaspiegel an aktiviertem Protein C von 2 ng/ml bis 300 ng/ml ergibt.

7. Verwendung nach Anspruch 6, worin das aktivierte Protein C als Bolusinjektion verabreicht wird.

8. Verwendung nach Anspruch 6, worin das aktivierte Protein C durch kontinuierliche Infusion für 1 bis 240 Stunden verabreicht wird.

9. Verwendung nach Anspruch 6, worin das aktivierte Protein C zuerst als Bolus und dann als kontinuierliche Infusion verabreicht wird.

10. Verwendung nach Anspruch 9, worin ein Drittel des aktivierten Protein C als Bolus verabreicht wird und die verbleidenen zwei Drittel des aktivierten Protein C anschließend durch kontinuierliche Infusion verabreicht werden, so daß sich insgesamt ein Plasmaspiegel an aktiviertem Protein C im Bereich von 2 ng/ml bis 300 ng/ml ergibt.