JP2001527543A - 活性化プロテインｃの改良プロセシング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、広く、プロセシングおよび精製時の活性化プロテインＣの自己分解を減少させる方法を目的とする。本発明は水性活性化プロテインＣ溶液、およびイオン強度１５０ｍＭ以上およびｐＨ約５．５〜６．３以下で行うことを含む該溶液の改良プロセシング方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 活性化プロテインＣの改良プロセシング方法 優先権 本出願は米国仮特許出願第60/045255号（1997年４月28日出願）の恩恵を主張 する。 発明の分野 本発明は、広くは、プロセシングおよび精製時において活性化プロテインＣの 自己分解を減少させる方法を目的とする。 発明の背景 プロテインＣはセリンプロテアーゼであり、凝固カスケードにおいてＶａおよ びＶIIIa因子を不活化することにより恒常性の制御に役割を演じる天然の抗凝固 剤である。ヒトプロテインＣはin vivoでは主として肝臓において４６１アミノ 酸の一本鎖ポリペプチドとして産生される。この前駆体分子は、１）４２アミノ 酸のシグナル配列を開裂し、２）１本鎖チモーゲンから１５６位のリジン残基と １５７位のアルギニン残基をタンパク質分解により除去し、該分子の２本鎖形を 形成し（すなわち、１５５アミノ酸残基の軽鎖が２６２アミノ酸残基のセリンプ ロテアーゼ含有重鎖とジスルフィド架橋を介して結合）、３）軽鎖の最初の４２ アミノ酸中のクラスターになった９グルタミン酸残基をビタミンＫ依存性にカル ボキシル化して９γ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）残基を得、４）４部位 に炭化水素を結合させる（１つは軽鎖に、３つは重鎖に）ことを含む多翻訳後修 飾を受ける。重鎖はＡｓｐ２５７、Ｈｉｓ２１１、およびＳｅｒ３６０のよく確 立されたセリンプロテアーゼ３回対称軸を含む。最終的に、循環２本鎖チモーゲ ンはin vivoにおいてカルシウムイオン存在下、リン脂質表面でトロンビンによ り活性化される。活性化は重鎖のＮ末端のドデカペプチドを除去することにより 生じ、酵素活性を有する活性化プロテインＣ（ａＰＣ）が生成される。他のタン パク質と協力して、おそらく活性化プロテインＣは血栓症を生じる血液凝固の最 も重要な抑制的調節物質（down-regulator） として機能する。 残念なことに、ａＰＣは自己分解することにより抗凝固剤としての機能性の低 下が生じ得る。当該分野で知られた活性化プロテインＣの分解経路は、重鎖の３ ０８位のリジン残基でタンパク質分解により切り取られ、１１１アミノ酸断片が 生じるものである。この分解生成物は当該分野においてＥＡＫ断片として認識さ れている。 自己分解を減少させる以前の試みはＥＡＫ断片の形成を最小限にすることに集 中していた。Proutyら、EP0662513（1995年７月12日）が、ｐＨを約６．３〜７ ．０に調節するか、ａＰＣを３Ｍ尿素中でインキュベーションするか、またはａ ＰＣを、０．４Ｍ以上かもしくは０．０５Ｍ以下に限定する極端な塩条件に曝露 することによりａＰＣの自己分解を最小限にすることを開示しているのが最も著 名である。 出願人は、第二の重要な分解経路−１０位のヒスチジン残基のいずれかの側を 切り離す軽鎖のＮ−末端の自己分解を発見した。この分解経路は２つの不活性生 成物を生じる。軽鎖のＮ−末端の最初の９残基を切り取るとデス（１−９）活性 化プロテインＣが生じ、軽鎖のＮ−末端の最初の１０残基を切り取るとデス（１ −１０）活性化プロテインＣが生じる。以前に報告されていないこの分解経路で は、６および７位の重要なＧＬＡ残基を除去することにより抗凝固活性の損失が 生じる。したがって、デス（１−９）−およびデス（１−１０）活性化プロテイ ンＣ自己分解生成物のレベルを最小限にすることが有効で高純度の活性化プロテ インＣ医薬製剤を達成するのに重要である。これら変異体は以前には知られてい なかった分解生成物であり、通常の精製技術により除去することが不可能でない にしても極めて困難である。それらの形成を最小限にする条件は以前には知られ てなかった。 出願人による活性化プロテインＣのこの重要な自己分解経路の確認により、活 性化プロテインＣの純度と有効性を増強するプロセシングおよび製剤化条件の発 見が可能となった。出願人は、低ｐＨ（例えば、６．３以下）ではデス（１−９ ）ａＰＣまたはデス（１−１０）ａＰＣに有利な自己分解経路が３０８−３０９ 自己分解経路より優位であるが、ｐＨ６．３以下で上昇した塩化ナトリ ウム濃度（１５０ｍＭ以上）のを用いると、デス（１−９）ａＰＣおよび／また はデス（１−１０）ａＰＣの自己分解反応の程度が実質的に低下する。 したがって、本発明は１５０ｍＭ以上のイオン強度、および約５．５〜６．３ 以下のｐＨで活性化プロテインＣをプロセシングする方法を提供する。これらの 条件下においてデス（１−９）ａＰＣおよびデス（１−１０）ａＰＣの形成は有 意に減少する。したがって、本発明は望ましくない分解を生じることなく活性化 プロテインＣの水性溶液をプロセシングするための改良法を提供する。 図面の説明 図１は、本明細書に記載の自己分解経路を示すのを助ける活性化ヒトプロテイ ンＣの一次構造を示す。本明細書で用いる名称はヒト活性化プロテインＣの一次 配列の番号付けに基づく。当業者は、活性化プロテインＣの他の種は一次構造が わずかに異なるため、本明細書で定義した名称に変化が生じることがあることを 認識するであろう。 発明の要約 本発明は、水性活性化プロテインＣ溶液、および１５０ｍＭ以上のイオン強度 と約５．５〜６．３以下のｐＨでプロセシングすることを含む該溶液の改良プロ セシング方法を提供する。 さらに本発明は、イオン強度１５０ｍＭ以上およびｐＨ約５．５〜６．３以下 の水性溶出溶液を用いるクロマトグラフィ分離において活性化プロテインＣを溶 出することを含む、クロマトグラフィ分離により活性化プロテインＣを精製する 方法を提供する。 さらに本発明は、活性化プロテインＣをイオン強度１５０ｍＭ以上およびｐＨ 約５．５〜６．３以下の水性溶液としてろ過膜に通すことを含む、活性化プロテ インＣ溶液をろ過により濃縮する方法を提供する。 本発明は本明細書に記載の方法により製造される活性化プロテインＣも提供す る。 最後に、本発明はデス（１−９）ａＰＣおよび／またはデス（１−１０）ａＰ Ｃが１０重量％以下である活性化プロテインＣ医薬製剤を提供する。 発明の詳細な説明 この開示に使用するアミノ酸の略語はすべて米国特許商標庁（37 C.F.R.§1.8 22(B)(2)に記載）により承認されたものである。 本明細書に開示し、クレームしているように、本発明の目的において以下の用 語は下記に定義した通りである。 ａＰＣまたは活性化プロテインＣは、組換えまたは血漿由来のプロテインＣを 表す。ａＰＣはヒトプロテインＣを含み、それであることが好ましいが、プロテ インＣのタンパク質分解活性、アミド分解活性、エステル分解活性、および生物 学的（抗凝固またはプロフィブリノリティック）活性を有する他の種または誘導 体を含んでもよい。プロテインＣ誘導体の例は、Gerlitzら、米国特許第5453373 号、およびFosterら、米国特許第5516650号に記載されている（この内容は本明 細書の一部を構成する）。 ＡＰＴＴは活性化部分トロンボプラスチン時間である。 水性には、共溶媒系および溶媒としてのみの水の使用を含む。好ましくは水性 は溶媒としてのみの水を意味する。 クロマトグラフィによる分離には、サイズ排除、陰イオン、陽イオン、疎水性 、逆相などを含む当該分野で認められ、充分理解されているクロマトグラフィ技 術が含まれる。 クロスフローろ過は、生成物が膜により保持されるか(濃縮または透析など)、 または膜を通過する（ウイルス除去ろ過など）ろ過膜を通過するタンジェンシャ ルフローにより分配されることを表す。 ＰＣはプロテインＣチモーゲンである。 プロセシングは、カラムクロマトグラフィ、ろ過（タンジェンシャル、クロス フロー、デッドエンド）、凍結乾燥、ポンピング、または保存といった活性化プ ロテインＣの製造に有用なユニット操作を表す。 ｒ−ａＰＣは、例えば、ヒト腎２９３細胞からチモーゲンとして分泌され、次 いで精製され、当業者によく知られ、Yan、米国特許第4981952号およびCottingh am、WO97/20043に記載の技術により活性化されることを含む、in vitroでＰＣを 活性化するか、または原核細胞、真核細胞、もしくはトランスジェニック動物か らプロテインＣの活性形を直接分泌させることにより製造される組 換え活性化プロテインＣである。 本発明は、活性化プロテインＣの改良プロセシング方法に関する。特に、本発 明は、自己分解を減少させながら、タンパク質の豊富化または濃縮操作とタンパ ク質の精製操作を介する活性化プロテインＣのプロセシングに関する。本発明は 、そのようなプロセシング、特に、本明細書に記載の条件下で該タンパク質の水 性溶液を用いて行うそのような修飾、豊富化、および精製操作を行うことを特徴 とする。 本明細書においてクレームした条件の組合せにより、デス（１−９）ａＰＣお よびデス（１−１０）ａＰＣの形成が最小限となる。デス（１−９）ａＰＣおよ びデス（１−１０）ａＰＣは既知の精製方法論で除去するのが極めて難しいため 、ａＰＣ医薬製剤の製造時にそれらの形成を最小限にするのが望ましい。クレー ムした条件下で製造した活性化プロテインＣは実質的にデス（１−９）ａＰＣお よびデス（１−１０）ａＰＣ変異体を含まない。一般的に、これら条件下で製造 したａＰＣ医薬製剤は実質的にデス（１−９）ａＰＣおよびデス（１−１０）ａ ＰＣを含まず、一般的には、これら変異体は、個々にかまたは組み合わせて１０ ％（重量）以下、好ましくは８％以下、より好ましくは５％以下、最も好ましく は３％以下である。本明細書に記載し、クレームしたごとく製造したａＰＣを用 いて製造した凍結乾燥医薬製剤は、溶液状態（凍結乾燥前）の安定性、および再 構成時の２４〜４８時間安定性が改善されていることがわかつている。２〜８℃ で５日間まで、１５℃で５０時間まで、および２５℃で４０時間までの有効性の 損失は５％以下であると観察されている。本発明以前にはそのような安定性はか って達成できなかった。 ｐＨ、イオン強度、および好ましくは温度を注意深く調節することにより、プ ロセシング時の水性溶液中、および製剤中の活性化プロテインＣの自己分解をか って得られなかったレベルまで（特に尿素または他の変性剤、ヒスチジン、塩酸 リジン、またはアルブミン非存在下で）低下させることができる。 本発明の広い実施において、プロテインＣのプロセシングには、タンパク質組 成物を精製するかもしくはタンパク質溶液を濃縮するためのか、または溶媒交換 用などのクロスフローろ過およびクロマトグラフィ処理、ならびにおそら く化学的ならびに酵素的処理を含む種々のユニット操作、物理的分離、および精 製操作が含まれることが予期される。特に本発明により予期されるタンパク質の プロセシングには、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィなど のような標準的クロマトグラフィ法による精製と、限外ろ過や同様な工程による タンパク質の濃縮が含まれる。タンパク質プロセシングは、そのような精製およ び濃縮工程に先だって保持タンクなどにタンパク質溶液を保持することも含むこ とを意図している。不安定性を減少させるために、種々のタンパク質精製および タンパク質濃縮工程を含む活性化プロテインＣ溶液の全てのプロセシングは本明 細書に記載の条件下で実施する。そのようなプロセシング工程は、通常、医薬製 造において製剤化するための凍結乾燥粉末として最終的にタンパク質を単離する ことを目的とする。 水性プロセシング溶液のｐＨは約５．５〜６．３以下、より好ましくは５．７ 〜６．３以下、さらにより好ましくはｐＨ約５．６〜約６．２である。ｐＨ約５ ．８〜約６．２がより好ましく、さらにｐＨ約５．９〜約６．１がより好ましい 。最も好ましいｐＨは約ｐＨ６．０である。有効なｐＨ調節を維持する代表的緩 衝系には、トリス−アセテート、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエ ン酸−グリシン、およびリン酸ナトリウムが含まれる。より好ましい緩衝系には 、クエン酸ナトリウムとリン酸ナトリウムが含まれる。最も好ましい緩衝系はク エン酸ナトリウムである。該緩衝系の好ましいモル濃度は１０ｍＭ〜５０ｍＭで ある。最も好ましいモル濃度は２０〜４０ｍＭである。当業者は、ｐＨをクレー ムした範囲に維持するには他の多くの緩衝系も利用できると認識するであろう。 プロセシング溶液のイオン強度は本発明の第二の重要な要素である。イオン強 度は一般的に医薬的に許容される塩、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリ ウムを加えることにより誘導される。イオン強度は、好ましくは１５０ｍＭと等 しいかまたはそれ以上であり、緩衝溶液中の１５０ｍＭ以上の塩濃度で誘導され る。好ましくは、塩濃度は、下流のプロセシングを促すため約１０００ｍＭ以下 である。最も好ましくは、塩濃度は約２００ｍＭ〜１０００ｍＭである。以前は ５０ｍＭ以上および４００ｍＭ以下の濃度は許容できないと考え られた。 自己分解を確実に最小限にするさらなる条件は温度である。好ましくは、溶液 プロセシング時のプロセシング温度は０℃〜１０℃、より好ましくは２℃〜８℃ であり、これら温度の以外では活性化プロテインＣの有意な自己分解が生じる。 しかしながら、活性化プロテインＣは短時間なら１０℃を越えても耐え得るが、 これは活性化プロテインＣが完全であることを意味するものではない。 活性化プロテインＣの濃度は本発明において重要ではない。高濃度の該タンパ ク質をプロセシングする能力は本明細書に記載の条件下で有意に増強される。好 ましいタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは １〜３０ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましく は１〜１０ｍｇ／ｍＬであるが、より高いかまたは低い濃度でも操作可能と考え られる。 本明細書の記載に従って製造される活性化プロテインＣは、血栓性発作、深部 静脈血栓症、肺塞栓症、末梢動脈血栓症、心臓または末梢動脈で生じた塞栓症、 急性心筋梗塞、播種性血管内凝固、および移植または網膜血栓症を含む急性毛細 血管前または後閉塞を含む血管内凝固が関与する種々の後天性の病的状態を治療 するのに有用である。 活性化プロテインＣは、理想的には、充填剤を用い凍結乾燥状態で製剤化され る。充填剤は、理想的には、分子の固体状態の安定性を改善するように選ばれる 。そのような賦形剤の例には、ショ糖、トレハロース、およびラフィノースがあ る。当業者は、活性化プロテインＣには他の多くの充填剤も利用できることを認 識するであろう。製剤の充填剤濃度は凍結乾燥工程における重要な製剤変数であ る。好ましい充填剤は、凍結乾燥する溶液中の濃度が１５〜３０ｍｇ／ｍＬのシ ョ糖である。凍結乾燥する溶液中のショ糖の最も好ましい濃度は２．５ｍｇ／ｍ ＬのａＰＣ製剤中１５ｍｇ／ｍＬである。凍結乾燥する溶液中のショ糖の最も好 ましい濃度は５．０ｍｇ／ｍＬのａＰＣ製剤中３０ｍｇ／ｍＬである。 以下の実施例は本発明を例示し、説明するために示す。本発明の範囲はこれら 実施例に限定されるものと解釈してはならない。特記しない限り、部分およ びパーセンテージのすべての基準は体重に基づいており、温度はすべて摂氏温度 で示す。製造例１ ヒトプロテインＣの製造 組換えヒトプロテインＣ（チモーゲン）は、Yan、米国特許第4981952号（この 内容は本明細書の一部を構成する）に示すような当業者によく知られた技術によ りヒト腎２９３細胞中で産生される。ヒトプロテインＣをコードする遺伝子は、 Bangら、米国特許第4775624号に開示され、クレームされている（この内容は本 明細書の一部を構成する）。２９３細胞中でヒトプロテインＣを発現させるのに 用いるプラスミドは、Bangら、米国特許第4992373号に開示されている（この内 容は本明細書の一部を構成する）プラスミドｐＬＰＣである。プラスミドｐＬＰ Ｃの構築は、欧州特許公開公報第0445939号、およびGrinnellら、1987,Bio/Tech nology 5:1189-1192（これらの内容は本明細書の一部を構成する）にも記載され ている。簡単には、プラスミドを２９３細胞にトランスフェクトし、次いで安定 な形質転換体を同定し、二次培養し、無血清培地中で増殖させる。発酵後、精密 ろ過により無細胞培地を得た。 Yan、米国特許第4981952号（この内容は本明細書の一部を構成する）記載の技 術を適用して培養液からヒトプロテインＣチモーゲンを分離した。不純物を除去 した培地をＥＤＴＡの４ｍＭ溶液とし、次いでこれを陰イオン交換樹脂(Fast-Fl ow Q,Pharmacia)に吸着させた。４カラム容量の２０ｍＭトリス、２００ｍＭ Ｎ ａＣｌ（ｐＨ７．４）、および２カラム容量の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ Ｎ ａＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、結合した組換えヒトプロテインＣチモーゲ ンを２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂（ｐＨ７．４ ）で溶出した。溶出したタンパク質の溶出後の純度は９５％以上であった（ＳＤ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定）。 タンパク質のさらなる精製は、該タンパク質溶液をＮａＣｌの３Ｍ溶液とし、 次いで、２０ｍＭトリス、３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂（Ｐｈ７．４） で平衡化した疎水性相互作用樹脂(Toyopearl Phenyl 650M，TosoHaas)に吸着さ せることにより達成された。ＣａＣｌ₂を含まない平衡緩衝液２カラム容量 で洗浄した後、組換えヒトプロテインＣチモーゲンを２０ｍＭトリス（ｐＨ７． ４）で溶出した。溶出したタンパク質を、残留カルシウムを除去することにより 活性化するために調製した。チモーゲンを金属アフィニティカラム(Chelex-100, Bio-Rad)に通してカルシウムを除去し、再度陰イオン交換体(Fast Flow Q,Pharm acia)に結合させた。これら両カラムを直列に並べ、２０ｍＭトリス、１５０ｍ Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）で平衡化した。該タンパク質を流 した後、Chelex-100カラムを同じ緩衝液１カラム容量で洗浄し、次いでこれを直 列から切り離した。陰イオン交換カラムを平衡緩衝液３カラム容量で洗浄し、次 いで、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリスーアセテート（ｐＨ６．５）を用い てタンパク質を溶出した。組換えヒトプロテインＣのタンパク質濃度をＵＶ２８ ０ｎｍの吸光度により測定した（Ｅ^0.1%＝１．８１）。製造例２ 組換えヒトプロテインＣの活性化 ウシトロンビンを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）の存在下で４℃で活 性化ＣＨ−セファロース４Ｂ(Pharmacia)とカップリングさせた。カップリング 反応は、トロンビン約５０００単位／ｍＬ樹脂を用いてカラム内にすでに詰めた 樹脂を用いて行った。トロンビン溶液を、約３時間カラムに循環させ、次いで、 ２−アミノエタノール（ＭＥＡ）を循環溶液に０．６ｍＬ／Ｌの濃度で加えた。 樹脂上の非反応アミンが確実に完全にブロックされるように、ＭＥＡ含有溶液を さらに１０−１２時間循環した。ブロッキング後、トロンビンとカップリングし た樹脂を１０カラム容量の１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ６．５）で洗 浄して非特異的に結合したタンパク質を全て除去し、次いでこれを活性化用緩衝 液で平衡化した後に活性化反応に用いた。 精製ｒＨＰＣをＥＤＴＡの５ｍＭ溶液とし（あらゆる．残留カルシウムをキレ ート化するために）、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）または２０ｍＭトリス−ア セテート（ｐＨ６．５）で濃度２ｍｇ／ｍＬに希釈した。この物質を、３７℃で ５０ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）または２０ｍＭトリ スーアセテート（ｐＨ ６．５）で平衡化したトロンビンカラムに通した。流速 は、ｒＨＰＣとトロンビン樹脂の接触時間が約２０分となるよう調整した。 流出液を回収し、直ちにそのアミド分解活性をアッセイした。確立された標準ａ ＰＣに比べて該物質に比活性（アミド分解）がないときは、これをトロンビンカ ラムに再循環させてｒＨＰＣの活性化を完結させた。次に、上記のごとく該物質 を２０ｍＭ緩衝液で１：１に希釈した。 活性化プロテインＣの抗凝固活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間(Ａ ＰＴＴ)凝固アッセイを用いて凝固時間の延長を測定することにより決定する。 希釈緩衝液（１ｍｇ／ｍＬラジオイムノアッセイグレードＢＳＡ、２０ｍＭトリ ス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ₃）を用い１２５〜 １０００ｎｇ／ｍＬの範囲のプロテインＣ濃度で標準曲線を作製し、試料につい てはこの濃度範囲中の数希釈を準備する。各試料のキュベットに、冷ウマ血漿５ ０μＬおよび再構成活性化部分トロンボプラスチン時間試薬（ＡＰＴＴ試薬、Si gma）５０μＬを加え、３７℃で５分間インキュベーションした。インキュベー ション後、適切な試料または標準品５０μＬを各キュベットに加える。基礎凝固 時間を決定するには試料または標準品の代わりに希釈緩衝液を用いる。各試料ま たは標準品に３７℃で３０ｍＭ ＣａＣｌ₂ ５０μＬを加えた後、速やかにフイ ブロメーター(CoA Screener Hemostasis Analyzer,American Labor)のタイマー をスタートさせる。標準曲線の直線回帰式から試料中の活性化プロテインＣ濃度 を計算する。凝固時間は、標準曲線試料を含めて最小３回反復した平均値である 。組換え活性化プロテインＣのタンパク質濃度はＵＶ２８０ｎｍの吸光度により 測定した（Ｅ^0.1%＝１．８５）。実施例１ ａＰＣのクロマトグラフィによる分離 伝導度約１４ｍＭｈｏおよびｐＨ５.７のａＰＣ溶液を、ＱセファロースFast Flow陰イオン交換樹脂カラム（２５ｃｍ ｘ １４ｃｍ（ｈｘｄ））と直列に繋い だＳ−セファロースFast Flow陽イオン交換樹脂カラム（９．５ｃｍ ｘ ９ｃｍ （ｈｘｄ））にかけた。両カラムは２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０） 、１５０ｍＭ ＮａＣｌで予め平衡化した。カラム負荷量は陰イオン交換樹脂１ ＬあたりａＰＣ１０ｇであった。カラムを＞２カラム容量の平衡緩衝液で洗浄し 、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、４００ｍＭ ＮａＣｌで 段階溶出した。操作はすべて２−８℃および線(linear)流速６０ｃｍ／ｈｒで行 った。 ａＰＣは活性が高く（ＡＰＴＴアッセイで５３９単位／ｍｇ）、クロマトグラ フィ時（ピーク時＞２０ｇ／Ｌ）および全体で主流部（１０ｇ／Ｌ）にかなり濃 縮されたが、生成物は依然安定であった。これらの観察結果は還元および非還元 トリプシン消化軽鎖質量分析法により確認され、３０８−３０９エンドプロテオ リティッククリップを含むアイソフオームは検出されず（＜２％）、デス（１− ９）ａＰＣおよびデス（１−１０）も存在しない（＜５％）ことが示された。実施例２ ウイルスろ過 ２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液中の 活性化プロテインＣ（４ｍｇ／ｍＬ）をタンジェンシャルフローろ過（Millipor e Virusolve（登録商標）180膜）を用いてろ過する。ａＰＣのフィルターの通過 は透析用緩衝液を用いることにより促進される。透析用緩衝液は２０ｍＭクエン 酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌである。２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液中のａＰＣ ４ｍｇ／ｍＬ溶液（１０ Ｌ）をろ過した。クエン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム緩衝液を透析用緩衝 液に用いて最終容量２１．５ＬのａＰＣ溶液を得た。実施例３ 凍結乾燥 予め決定された容量のｒ−ａＰＣに適当量のショ糖、塩化ナトリウム、および クエン酸ナトリウムを加えてバイアル中で溶液を調製し、２．５ｍｇ／ｍＬａＰ Ｃ、１５ｍｇ／ｍＬショ糖、３２５ｍＭ塩化ナトリウム、および２０ｍＭクエン 酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を得る。通常の凍結乾燥器を用いて溶液を凍結乾燥 し、再構成と患者への投与に適した凍結乾燥ａＰＣバイアルを得た。凍結乾燥製 剤はデス（１−９）ａＰＣおよびデス（１−１０）ａＰＣが１０％以下である。実施例４ 凍結乾燥 予め決定された容量のｒ−ａＰＣに適当量のショ糖、塩化ナトリウム、および クエン酸ナトリウムを加えてバイアル中で溶液を調製し、５ｍｇ／ｍＬ ａＰＣ 、３０ｍｇ／ｍＬショ糖、６５０ｍＭ塩化ナトリウム、および４０ｍＭクエン酸 ナトリウム（ｐＨ６．０）を得る。通常の凍結乾燥器を用いて溶液を凍結乾燥し 、再構成と患者への投与に適した凍結乾燥ａＰＣバイアルを得た。凍結乾燥製剤 はデス（１−９）ａＰＣおよびデス（１−１０）ａＰＣが１０％以下である。 本発明の原理、好ましい態様、および操作方法を先に明細書中に記載した。し かしながら、開示された特定の形は例示であって限定するためのものではなく、 本明細書中で保護することを意図する発明はそれらの形に限定されると解釈すべ きではない。当業者は、本発明の精神から離れることなく改変し、変更すること ができよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ， ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，Ｔ Ｄ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ， ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 フアン，リフア アメリカ合衆国46033インディアナ州カー メル、ペニーグル・ドライブ13138番 (72)発明者 シェリガ，セオドア・アーセイ アメリカ合衆国46217インディアナ州イン ディアナポリス、ベネチアン・ウェイ7901 番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．イオン強度１５０ｍＭ以上およびｐＨ約５．５〜６．３以下でプロセシン グを行うことを含む活性化プロテインＣの水性溶液の改良プロセシング方法。 ２．プロテインＣがヒト活性化プロテインＣである請求項１記載の方法。 ３．ｐＨが５．６〜６．２である請求項２記載の方法。 ４．該溶液が塩化ナトリウムを含む請求項３記載の方法。 ５．塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭ〜１０００ｍＭである請求項４記載の方 法。 ６．プロセシングがクロマトグラフィ分離、凍結乾燥、またはろ過の群から選 ばれる請求項５記載の方法。 ７．ｐＨがクエン酸ナトリウムを用いて緩衝されている請求項６記載の方法。 ８．塩化ナトリウム濃度１５０ｍＭ〜１０００ｍＭおよびｐＨ約５．８〜約６ ．２（クエン酸ナトリウムで緩衝された）の水性溶液中で、温度約０℃〜約１０ ℃でプロセシングを行うことを含む活性化プロテインＣの水性溶液のプロセシン グ方法。 ９．ｐＨがクエン酸ナトリウムで緩衝される請求項８記載の方法。 １０．塩化ナトリウム濃度２００ｍＭ〜１０００ｍＭおよびｐＨ約５．８〜約 ６．２の水性溶液中で、温度約０℃〜約１０℃でプロセシングを行うことを含む 活性化プロテインＣの水性溶液のプロセシング方法。 １１．デス（１−９）活性化プロテインＣおよびデス（１−１０）活性化プロ テインＣが１０重量％以下である請求項１０記載の水性溶液。 １２．デス（１−９）活性化プロテインＣおよびデス（１−１０）活性化プロ テインＣが５重量％以下である請求項11記載の水性溶液。 １３．請求項１記載のプロセスにより製造される活性化プロテインＣ。 １４．デス（１−９）活性化プロテインＣおよびデス（１−１０）活性化プロ テインＣが約１０重量％以下である、活性化プロテインＣと充填剤を含む医薬製 剤。 １５．デス（１−９）活性化プロテインＣおよびデス（１−１０）活性化プロ テインＣが約５重量％以下である請求項１４記載の医薬製剤。