DE69621940T2

DE69621940T2 - Protein-/(poly)peptidbibliotheken

Info

Publication number: DE69621940T2
Application number: DE69621940T
Authority: DE
Inventors: Liming Ge; Achim Knappik; Simon Moroney; Peter Pack; Andreas Plueckthun
Original assignee: Morphosys AG
Current assignee: Morphosys IP GmbH
Priority date: 1995-08-18
Filing date: 1996-08-19
Publication date: 2003-01-16
Anticipated expiration: 2016-08-20
Also published as: JP2010246549A; JP2001519643A; JP4629787B2; CA2229043A1; WO1997008320A1; EP0859841A1; DK1143006T3; AU725609B2; US6300064B1; JP5362650B2; DE69621940D1; AU6874596A; ES2176484T3; PT859841E; JP4436457B2; EP0859841B1; ATE219517T1; US8513164B2; JP2010029198A; DK0859841T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung einer Bibliothek von Antikörpergenen, die vom Menschen stammen, durch die Verwendung synthetischer Konsensussequenzen, welche den im menschlichen Genom codierten strukturellen Vorrat an Antikörpern abdecken. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung eines einzigen Konsensus-Antikörpergens als universelles Gerüst für hochgradig diverse Antikörperbibliotheken.

Hintergrund der Erfindung

Alle gegenwärtigen Rekombinationsverfahren, die Bibliotheken von Proteinenl(Poly)peptiden, z. B. Antikörper, verwenden, um nach Mitgliedern mit erwünschten Eigenschaften zu suchen, z. B. Bindung eines bestimmten Liganden, sehen nicht die Möglichkeit vor, die erwünschten Eigenschaften der Mitglieder in einer einfachen und schnellen Weise zu verbessern. Üblicherweise wird eine Bibliothek hergestellt entweder durch Insertion einer Zufalls-Oligonucleotidsequeriz in eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die von einem Organismus cloniert wurden, oder eine Familie von DNA-Sequenzen wird cloniert und als Bibliothek verwendet. Die Bibliothek wird dann auf Mitglieder durchmustert, z. B. unter Verwendung des Phagen-Display, welche die erwünschte Eigenschaft zeigen. Die Sequenzen von einem oder mehreren dieser so erhaltenen Moleküle werden dann bestimmt. Es ist kein allgemeines Verfahren verfügbar, um diese Moleküle weiterhin zu verbessern.
Winter (EP-0 368 684 B1) stellte ein Verfahren zum Amplifzieren (durch PCR), Clonieren und Exprimieren der variablen Region von Antikörpergenen bereit. Ausgehend von diesen Genen war er in der Lage, Bibliotheken von funktionellen Antikörperfragmenten durch zufällige Auswahl der CDR3 der schweren und/oder der leichten Kette herzustellen. Dieses Verfahren ist funktionell dem natürlichen Prozeß der VJ- und VDJ-Rekombination äquivalent, der während der Entwicklung von B-Zellen im Immunsystem abläuft.
Jedoch stellt die Erfindung von Winter kein Verfahren zur weiteren Optimierung der Bindungsaffinitäten von Antikörperfragmenten bereit, ein Prozeß, welcher funktionell dem natürlich vorkommenden Phänomen der "Affinitätsreifung" entsprechen würde, der erfindungsgemäß bereitgestellt wird. Außerdem stellt die Erfindung von Winter keine synthetischen Gene der variablen Region bereit, die eine ganze Familie von strukturell ähnlichen, natürlichen Genen darstellen und die aus synthetischen DNA-Oligonucleotiden zusammengesetzt werden können. Weiterhin ermöglicht Winter nicht den kombinatorischen Zusammenbau von Teilen der variablen Regionen eines Antikörpers, ein Merkmal, welches von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird. Außerdem weist dieser Ansatz den Nachteil auf, daß die Gene aller Antikörper, die in dem Durchmusterungsverfahren erhalten wurden, vollständig sequenziert werden müssen, da außer für die PCR-Primingregionen keine zusätzliche Sequenzinformation über die Mitglieder der Bibliothek erhältlich ist. Dies ist Zeit- und arbeitsintensiv und führt möglicherweise zu Sequenzierungsfehlern.
Die Lehren von Winter sowie andere Ansätze haben versucht, größere Antikörperbibliotheken mit einer hohen Diversität in den komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) sowie in den Gerüsten herzustellen, um in der Lage zu sein, Antikörper gegen so viele verschiedene Antigene wie möglich zu finden. Es wurde vorgeschlagen, daß ein einziges universelles Gerüst nützlich sein könnte, um Antikörperbibliotheken herzustellen, aber bisher war kein Ansatz erfolgreich.
Ein anderes Problem besteht in der Herstellung von Reagenzien, welche von Antikörpern abgeleitet sind. Kleine Antikörperfragmente sind zur Verwendung als Therapeutik% diagnostische Reagenzien und zur biochemischen Forschung sehr vielversprechend. Folglich werden sie in großen Mengen benötigt, und die Expression von Antikörperfragmenten, z. B. Fv, Einzelketten-Fv (scFv) oder Fab, im Periplasma von E. coli (Skerra & Plückthun, 1988; Better et al., 1988) wird nun routinemäßig in vielen Laboren angewendet. Die Expressionserträge variieren jedoch sehr. Während einige Fragmente bis zu mehrere mg eines funktionellen löslichen Proteins pro Liter und OD der Kulturbrühe in einer Schüttelflaschenkultur ergeben (Carter et al., 1992; Plückthun et al., 1996), können andere Fragmente praktisch ausschließlich ein unlösliches Material ergeben, das oft in sogenannten Einschlußkörpern vorkommt. Das funktionelle Protein kann aus den Letzteren in geringen Ausbeuten durch ein arbeitsintensives und zeitaufwendiges Umfaltungsverfahren erhalten werden. Die Faktoren, welche die Antikörper-Expressionsgrade beeinflussen, sind noch kaum verstanden. Die Faltungseffizienz und Stabilität der Antikörperfragmente, die Proteaseempfindlichkeit und die Toxizität der exprimierten Proteine für die Wirtszellen begrenzen die tatsächlichen Herstellungsmengen oft sehr, und mehrere Versuche wurden unternommen, um die Expressionserträge zu erhöhen. Zum Beispiel konnten Knappik & Plückthun (1995) zeigen, daß der Expressionsertrag von der Antikörpersequenz abhängt. Sie identifizierten Schlüsselreste in dem Antikörpergerüst, welche die Expressionserträge nachdrücklich beeinflussen. In ähnlicher Weise stellten Ullrich et al. (1995) fest, daß Punktmutationen in den CDRs die Erträge bei der periplasmatischen Expression des Antikörperfragments erhöhen können. Nichtsdestoweniger sind diese Strategien nur auf wenige Antikörper anwendbar. Da die Erfindung von Winter vorhandene Vorräte an Antikörpern verwendet, ist kein Einfluß auf die Exprimierbarkeit der Gene möglich.
Außerdem zeigen die Erkenntnisse vondKnappik & Ptückthun und Ullrich, daß das Wissen über Antikörper, insbesondere über die Faltung und Expression, noch immer zunimmt. Die Erfindung von Winter erlaubt nicht, solche Verbesserungen in die Konstruktion von Bibliotheken einzubringen.
WO 95/11998 offenbart eine Peptidbibliothek, bestehend aus einer zusammengestellten Domäne, wobei die zusammengestellte Domäne immunogen, diagnostisch oder therapeutisch ist und wobei die Sequenz der Zusammenstellung durch eine Konsensusformel wiedergegeben wird. Jeder Teil der Peptide der Bibliothek umfaßt im wesentlichen alle Aminosäuren, die in den Proteinvarianten gefunden wurden, die zur Bestimmung der Konsensussequenz analysiert wurden. WO 95/11998 lehrt weder die vorliegenden Erfindung noch legt sie sie nahe. Erstens würde die Rückübersetzung der in dem Dokument erhaltenen (Poly)peptide nicht automatisch und ohne weiteres Nucleinsäuresequenzen ergeben, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich sind. Zweitens besteht die durch das in WO 95/11998 offenbarte Verfahren erhältliche Konsensussequenz nicht nur aus invarianten Teilen mit einzelnen Aminosäuren, sondern auch aus varianten Positionen mit einer Degeneration von Aminosäuren. Insofern wird der Begriff "Konsensus" in diesem Dokument gemäß dem Stand der Technik und in der vorliegenden Erfindung unterschiedlich verwendet. Es wird kein Verfahren bereitgestellt, das lehrt, wie degenerierte Nucleinsäuresequenzen entworfen und konstruiert werden, welche die Konsensussequenzen von WO 95/11998 codieren. Besonders wichtig ist, daß die Schritte des in WO 95/11998 beschriebenen Verfahrens nicht die modulare Konstruktion von Nucleinsäuren ermöglichen würden, die durch das erfindungsgemäß offenbarte Verfahren erhältlich ist.
Die Exprimierbarkeit der Gene ist auch für die Qualität der Bibliothek wichtig, da sich das Durchmusterungsverfahren in vielen Fällen auf die Darstellung des Genprodukts auf einer Phagenoberfläche stützt und eine wirksame Darstellung von einer zumindest mäßiggroßen Expression des Gens abhängig ist.
Diese Nachteile der bestehenden Methodiken werden durch die vorliegende Erfindung kompensiert. Sie weist die folgenden neuen und nützlichen Merkmale auf.
Synthetische Antikörper und Fragmente davon können auf der Grundlage von bekannten Antikörpersequenzen konstruiert werden, welche die strukturellen Eigenschaften einer ganzen Gruppe von homologen Antikörpergenen widerspiegeln. Daher ist es möglich, die Zahl der unterschiedlicher Gene ohne einen Verlust hinsichtlich des strukturellen Vorrats zu verringern. Dieser Ansatz ergibt einen begrenzten Satz von synthetischen Genen, wie in Patentanspruch 1 angegeben ist, der de novo synthetisiert werden kann, wodurch die Einführung von Schnittstellen und die Entfernung unerwünschter Schnittstellen ermöglicht wird. Außerdem ermöglicht dieser Ansatz (i) die Anpassung des Codon-Gebrauchs der Gene an den stark exprimierter Gene in einer gewünschten Wirtszelle und (ii) die Analyse aller möglichen Paare von leichten (L) und schweren (H) Antikörperketten, wie in Patentanspruch 1 angeführt, im Hinblick auf die Interaktionspräferenz, Antigenpräferenz oder den rekombinanten Expressionstiter, was unter Verwendung der vollständigen Sammlung von Antikörpergenen eines Organismus und aller Kombinationen davon praktisch unmöglich ist.
Die Verwendung eines begrenzten Satzes von vollständig synthetischen Genen ermöglicht es, Schnittstellen an den Grenzen von codierten strukturellen Unterelementen einzurichten. Daher ist jedes Gen aus Modulen aufgebaut, die strukturelle Unterelemente auf der Protein/(Poly)peptid-Ebene darstellen. Im Fall von Antikörpern bestehen die Module aus "Gerüst"- und "CDR"-Modulen. Durch die Herstellung von getrennten Gerüst- und CDR- Modulen werden verschiedene kombinatorische Zusammenstellungsmöglichkeiten möglich gemacht. Außerdem, falls zwei oder mehrere synthetische Gene identische Paare von Schnittstellen an den Grenzen eines jeden der genetischen Unterelemente tragen, können vorher zusammengesetzte Bibliotheken von Unterelementen gleichzeitig in diese Gene ohne irgendwelche zusätzlichen Informationen, welche eine bestimmte Gensequenz betreifen, inseriert werden. Diese Strategie ermöglicht eine schnelle Optimierung von zum Beispiel der Antikörperaffinität, da DNA-Kassetten, welche Bibliotheken von genetischen Unterelementen codieren, (i) vorher zusammengesetzt, gelagert und wiederverwendet und (ii) in einer dieser Sequenzen an der richtigen Position inseriert werden können, ohne daß die tatsächliche Sequenz bekannt ist oder die Sequenz des einzelnen Mitglieds der Bibliothek bestimmt werden muß.
Außerdem könnten neue Informationen über Aminosäurereste, die für die Bindung, Stabilität oder Löslichkeit und Expression wichtig sind, in die Konstruktion der Bibliothek durch das Ersetzen bestehender Module durch Module, die entsprechend den neuen Beobachtungen modifiziert wurden, integriert werden.
Die begrenzte Zahl von Konsensussequenzen, die zur Herstellung der Bibliothek verwendet wird, ermöglicht die Beschleunigung der Identifizierung bindender Antikörper nach der Durchmusterung. Nach der Identifizierung der zugrundeliegenden Konsensusgensequenz, welche durch Sequenzierung oder unter Verwendung von Fingerabdruck- Restriktionsstellen durchgeführt werden könnte, muß (müssen) gerade der (solche) Teil(e) bestimmt werden, welche(r) die Zufallssequenz(en) umfaßt (umfassen). Dies verringert die Wahrscheinlichkeit von Sequenzierungsfehlern und von falsch-positiven Ergebnissen.
Die vorstehend erwähnten Schnittstellen können nur verwendet werden, wenn sie in dem Vektorsystem, in das die synthetischen Gene inseriert wurden, einmalig sind. Als Ergebnis muß der Vektor modifiziert werden, so daß er keine dieser Schnittstellen enthält. Die Konstruktion eines Vektors, bestehend aus wesentlichen Elementen wie ein Resistenzgen und ein Replikationsursprung, in dem die Schnittstellen entfernt wurden, ist für viele Clonierungsversuche von allgemeinem Interesse. Außerdem könnte(n) diese(r) Vektor(en) Teil eines Kits sein, der die vorstehend erwähnten synthetischen Gene und vorher zusammengesetzte Bibliotheken umfaßt.
Die Sammlung von synthetischen Genen kann für ein schnelles Humanisierungsverfahren von nicht-menschlichen Antikörpern, vorzugsweise von Nagetier-Antikörpern, verwendet werden. Zuerst wird die Aminosäuresequenz des nicht-menschlichen, vorzugsweise des Nagetier-Antikörpers mit den Aminosäuresequenzen verglichen, die von der Sammlung von synthetischen Genen codiert werden, um die am stärksten homologen leichten und schweren Gerüstregionen zu bestimmen. Diese Gene werden dann zur Insertion der genetischen Unterelemente verwendet, welche die CDRs des nicht-menschlichen, vorzugsweise des Nagetier-Antikörpers codieren.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß mit einer Kombination von nur einer Konsensussequenz für jede der leichten und schweren Kette eines scFv-Fragments ein Antikörpervorrat hergestellt werden könnte, der Antikörper gegen praktisch jedes Antigen ergibt. Daher ist ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer einzigen Konsensussequenz als universelles Gerüst für die Herstellung von nützlichen (Poly)peptidbibliotheken und dafür verwendbare Antikörper-Konsensussequenzen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Herstellung von nützlichen Bibliotheken von (Poly)peptiden. In einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hervorbringen von Nucleinsäuresequenzen bereit, die zur Herstellung dieser Bibliotheken geeignet sind, wobei diese Bibliotheken Bibliotheken von Immunglobulinen oder Fv-, Disulfid verbundenem Fv-, Einzelketten-Fv- (scFv) oder Fab-Fragmenten davon sind. In einem ersten Schritt wird eine Sammlung von mindestens drei homologen Immunglobulinsequenzen identifiziert und dann analysiert. Dafür wird eine Datenbank der Immunglobulinsequenzen erstellt, in der die Sequenzen gegeneinander angeordnet bzw. ausgerichtet werden. Die Datenbank wird verwendet, um Untergruppen von Immunglobulinsequenzen zu definieren, welche einen hohen Grad an Ähnlichkeit in sowohl der Sequenz als auch, falls Informationen verfügbar sind, in der strukturellen Anordnung zeigen. Für jede der Untergruppen wird eine (Poly)peptidsequenz abgeleitet, die mindestens eine Konsensussequenz umfaßt, welche die Mitglieder dieser Untergruppe repräsentiert; die vollständige Sammlung von (Poly)peptidsequenzen gibt daher den vollständigen strukturellen Vorrat der Sammlung von homologen Immunglobulinsequenzen wieder. Diese synthetischen (Poly)peptidsequenzen werden dann, falls möglich, entsprechend ihren strukturellen Eigenschaften analysiert, um unvorteilhafte Interaktionen zwischen Aminosäuren mit diesen (Poly)peptidsequenzen oder zwischen diesen oder anderen (Poly)peptidsequenzen, zum Beispiel in multimeren Proteinen, zu identifizieren. Solche Interaktionen werden dann durch entsprechende Veränderung der Konsensussequenz entfernt. Die (Poly)peptidsequenzen werden dann analysiert, um Unterelemente wie CDRs zu identifizieren. Die Aminosäuresequenz wird in eine entsprechende codierende Nucleinsäuresequenz rückübersetzt, die an den Codon-Gebrauch des zur Expression der Nucleinsäuresequenzen vorgesehenen Wirts angepaßt ist. Ein Satz von Schnittstellen wird in einer Weise eingerichtet, daß jede der Untersequenzen, codierend die identifizierten Unterelemente, wie vorstehend beschrieben, von zwei Stellen umgeben ist, die kein zweites Mal innerhalb der Nucleinsäuresequenz vorkommen. Dies kann dadurch erreicht werden, daß entweder eine Schnittstelle identifiziert wird, die bereits eine Untersequenz umgibt, oder ein oder mehrere Nucleotide ausgetauscht werden, um die Schnittstelle zu erzeugen, und diese Stelle aus dem restlichen Teil des Gens entfernt wird. Die Schnittstellen sollten allen entsprechenden Unterelementen oder Untersequenzen gemeinsam sein, wodurch eine vollständig modulare Anordnung der Untersequenzen in der Nucleinsäuresequenz und der Unterelemente in dem entsprechenden (Poly)peptid erzeugt wird.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, das zwei oder mehrere Sätze von (Poly)peptiden festlegt, wobei für jeden Satz das Verfahren durchgeführt wird, wie vorstehend beschrieben ist, und wobei die Schnittstellen nicht nur innerhalb eines jeden Satzes, sondern auch zwischen zwei beliebigen Sätzen einmalig sind. Mindestens zwei der Sätze, wie vorstehend beschrieben, sind von der gleichen Sammlung von Immunglobulinsequenzen oder mindestens einem Teil davon abgeleitet. Dies beschreibt Bibliotheken, die zwei Domänen aus Antikörpern umfassen, d. h. VH und VL.
In einer anderen Ausführungsform werden die Nucleinsäuresequenzen, die wie vorstehend beschrieben festgelegt wurden, synthetisiert. Dies kann durch irgendeines von mehreren Verfahren erreicht werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, zum Beispiel durch eine Gen-Totalsynthese oder durch Ansätze auf PCR-Basis.
In einer Ausführungsform werden die Nucleinsäuresequenzen in einen Vektor cloniert. Der Vektor könnte ein Sequenzierungsvektor, Expressionsvektor oder ein Display (z. B. Phagen-Display)-Vektor sein, die den Fachleuten gut bekannt sind. Jeder Vektor könnte eine Nucleinsäuresequenz oder zwei oder mehrere Nucleinsäuresequenzen umfassen, entweder in einem anderen oder dem gleichen Operon. Im letzten Fall könnten sie entweder getrennt oder als aufeinanderfolgende Sequenzen cloniert werden.
In einer Ausführungsform führt die Entfernung von unvorteilhaften Interaktionen, wie vorstehend beschrieben, zu einer verstärkten Expression der modifizierten (Poly)peptide.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden eine oder mehrere Untersequenzen der Nucleinsäuresequenzen durch andere Sequenzen ersetzt. Dies kann durch Ausschneiden der Untersequenzen unter Verwendung von Bedingungen, die für das Schneiden der Schnittstellen geeignet sind, die an die Untersequenz angrenzen oder sich am Ende der Untersequenz befinden, zum Beispiel unter Verwendung eines Restriktionsenzyms an der entsprechenden Restriktionsstelle unter Bedingungen, die den Fachleuten gut bekannt sind, und Ersetzen der Untersequenz durch eine andere Sequenz, die mit der geschnittenen Nucleinsäuresequenz verträglich ist, erreicht werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die anderen Sequenzen, welche die anfängliche(n) Untersequenz(en) ersetzen, genomische oder rearrangierte bzw. umgelagerte genomische Sequenzen, zum Beispiel beim Einsetzen von CDRs aus nicht-menschlichen Antikörpern in Konsensus-Antikörpersequenzen zur schnellen Humanisierung von nicht-menschlichen Antikörpern. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform sind die anderen Sequenzen Zufallssequenzen, wodurch die Untersequenz durch eine Sammlung von Sequenzen ersetzt wird, um eine Variabilität einzuführen und eine Bibliothek herzustellen. Die Zufallssequenzen können auf verschiedene Weise zusammengesetzt werden, zum Beispiel unter Verwendung eines Gemisches von Mononucleotiden oder vorzugsweise eines Gemisches von Trinucleotiden (Virnekäs et al., 1984) während der automatischen Oligonucleotidsynthese, durch eine fehleranfällige PCR oder durch andere Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind. Die Zufallssequenzen können vollständig zufällig sein oder auf oder gegen bestimmte Codons entsprechend der Aminosäureverteilung an bestimmten Positionen in bekannten Proteinsequenzen gerichtet sein. Außerdem kann die Sammlung von Zufallsuntersequenzen eine unterschiedliche Zahl von Codons umfassen, wobei eine Sammlung von Unterelementen mit unterschiedlichen Längen entsteht.
In einer anderen Ausführungsform sorgt die Erfindung für die Expression der Nucleinsäuresequenzen durch einen geeigneten Vektor und unter geeigneten Bedingungen, die den Fachleuten gut bekannt sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die von den Nucleinsäuresequenzen exprimierten (Poly)peptide durchmustert und gegebenenfalls optimiert. Die Durchmusterung kann unter Anwendung eines der Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, wie ein Phagen-Display. ein selektiv infektiöser Phage, die Polysomentechnologie zur Durchmusterung auf eine Bindung und Testsysteme auf eine enzymatische Aktivität oder Proteinstabilität. (Poly)peptide mit der gewünschten Eigenschaft können durch Sequenzieren der entsprechenden Nucleinsäuresequenz oder durch Aminosäuresequenzierung oder Massenspektroskopie identifiziert werden. Im Fall einer nachfolgenden Optimierung können die Nucleinsäuresequenzen, welche die anfangs ausgewählten (Poly)- peptide codieren, ohne Sequenzierung verwendet werden. Die Optimierung wird durch ein- oder mehrmaliges Wiederholen des Austausches von Untersequenzen durch andere Sequenzen, vorzugsweise durch Zufallssequenzen, und des Durchmusterungsschritts durchgeführt.
Die gewünschte Eigenschaft, auf welche die (Poly)peptide durchmustert werden, ist vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, ausgewählt aus der Gruppe von optimierter Affinität oder Spezifität für ein Zielmolekül, optimierter Enzymaktivität, optimierten Expressionserträgen, optimierter Stabilität und optimierter Löslichkeit.
In einer Ausführungsform sind die Schnittstellen, welche die Untersequenzen umgeben, Stellen, die von Restriktionsenzymen erkannt und geschnitten werden, wobei die Erkennungs- und Schnittstellen entweder identisch oder verschieden sind und wobei die geschnittenen Stellen entweder glatte oder klebrige Enden aufweisen.
Die Länge der Unterelemente liegt vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, im Bereich von 3 und 25 Aminosäuren, wie er in CDR-Schleifen von Antikörpern am häufigsten ist.
Die Nucleinsäuresequenzen könnten RNA oder vorzugsweise DNA sein.
Die Erfindung sorgt für die Herstellung von Bibliotheken von (Poly)peptiden, umfassend mindestens einen Teil von Mitgliedern oder Derivaten der Immunglobuline, d. h. für die Herstellung von Bibliotheken von menschlichen Antikörpern, wobei die (Poly)peptide variable Regionen der schweren oder leichten Kette sind oder davon abstammen, wobei die strukturellen Unterelemente die Gerüstregionew. (FR) 1, 2, 3 oder 4 oder die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR) 1, 2 oder 3 sind. In einem ersten Schritt wird eine Datenbank von veröffentlichten Antikörpersequenzen menschlichen Ursprungs erstellt, wobei die Antikörpersequenzen gegeneinander ausgerichtet werden. Die Datenbank wird verwendet, um Untergruppen von Antikörpersequenzen zu definieren, die einen hohen Grad an Ähnlichkeit hinsichtlich sowohl der Sequenz als auch der kanonischen Faltung von CDR-Schleifen (bestimmt durch die Analyse der Antikörperstrukturen) aufweisen. Für jede der Untergruppen wird eine Konsensussequenz abgeleitet, welche die Mitglieder dieser Untergruppe repräsentiert; die vollständige Sammlung von Konsensussequenzen gibt daher den vollständigen strukturellen Vorrat an menschlichen Antikörpern wieder.
Diese synthetischen Gene werden dann z. B. durch eine Gen-Totalsynthese oder durch die Verwendung von synthetischen genetischen Untereinheiten konstruiert. Diese genetischen Untereinheiten entsprechen strukturellen Unterelementen auf der (Poly)peptid- Ebene. Auf der DNA-Ebene sind diese genetischen Untereinheiten durch Schnittstellen am Anfang und am Ende eines jeden der Unterelemente definiert, die in dem Vektorsystem einmalig sind. Alle Gene, die Mitglieder der Sammlung von Konsensussequenzen sind, werden konstruiert, so daß sie ein ähnliches Muster von entsprechenden genetischen Untersequenzen enthalten. Diese (Poly)peptide sind die HuCAL-Konsensusgene: Vκ1, Vκ2, Vκ3, Vκ4, Vλ1, Vλ2, Vλ3, VH1A, VH1B, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, Cκ, Cλ, CH1 oder sind davon abgeleitet oder eine Kombination dieser HuCAL-Konsensusgene.
Diese Sammlung von DNA-Molekülen kann dann verwendet werden, um Bibliotheken von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, vorzugsweise Fv, Disulfid verbundenes Fv, Einzelketten-Fv (scFv) oder Fab-Fragmente, herzustellen, die als Quellen für Spezifitäten gegen neue Zielantigene verwendet werden können. Außerdem kann die Affinität der Antikörper unter Verwendung von vorher konstruierten Kassetten für die Bank und einem allgemeinen Verfahren optimiert werden. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung von einem oder mehreren Genen bereit, die ein oder mehrere Antikörperfragmente codieren, welche an ein Zielmolekül binden, umfassend die Schritte der Expression der Antikörperfragmente und dann die Durchmusterung derselben, um ein oder mehrere Antikörperfragmente zu isolieren, die an ein bestimmtes Zielmolekül binden. Vorzugsweise werden eine scFv-Fragment-Bibliothek, umfassend die Kombination von HuCAL-VH3- und HuCAL- Vλ2-Konsensusgenen, und mindestens eine Zufallsuntersequenz, die das CDR3-Unterelement der schweren Kette codiert, auf bindende Antikörper durcfimustert. Gegebenenfalls kann der modulare Aufbau der Gene dann dazu verwendet werden, um aus den Genen, welche die Antikörperfragmente codieren, eine oder mehrere genetische Untersequenzen auszuschneiden, die strukturelle Unterelemente codieren, und diese durch eine oder mehrere zweite Untersequenzen zu ersetzen, die strukturelle Unterelemente codieren. Die Expressions- und Durchmusterungsschritte können dann wiederholt werden, bis ein Antikörper mit der gewünschten Affinität erzeugt ist.
Besonders bevorzugt wird ein Verfahren, bei dem eine oder mehrere der genetischen Untereinheiten (z. B. die CDRs) durch eine Zufallssammlung von Sequenzen (die Bibliothek) unter Verwendung der Schnittstellen ersetzt werden. Da diese Schnittstellen (i) in dem Vektorsystem einmalig sind und (ii) allen Konsensussequenzen gemeinsam sind, kann die gleiche (vorher konstruierte) Bibliothek in alle synthetischen Antikörpergene inseriert werden. Die so erhaltene Bibliothek wird dann auf ein ausgewähltes Antigen durchmustert. Bindende Antikörper werden ausgewählt, gesammelt und als Ausgangsmaterial für die nächste Bibliothek verwendet. Hier werden eine oder mehrere der verbleibenden genetischen Untereinheiten zufällig ausgewählt, wie vorstehend beschrieben.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Fusionsproteine durch die Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die sowohl das (Poly)peptid, wie vorstehend beschrieben, als auch eine zusätzliche Einheit codiert. Besonders bevorzugt werden Einheiten, die eine nützliche therapeutische Funktion haben. Zum Beispiel kann die zusätzliche Einheit ein Toxinmolekül sein, das in der Lage ist, Zellen abzutöten (Vitetta et al., 1993). Es gibt zahlreiche Beispiele solcher Toxine, die dem Fachmann gut bekannt sind, wie die Bakterientoxine Pseudomonas-Exotoxin A und Diphtherie-Toxin sowie die Pflanzentoxine Ricin, Abrin, Modeccin, Saporin und Gelonin. Durch Fusion eines solchen Toxins mit einem Antikörperfragment kann das Toxin zum Beispiel zu erkrankten Zellen hingeleitet werden und auf diese Weise einen vorteilhaften therapeutischen Effekt aufweisen. In einer anderen Ausführungsform kann die zusätzliche Einheit ein Cytokin sein, wie IL-2 (Rosenberg & Lotze, 1986), das eine bestimmte Wirkung (in diesem Fall eine T-Zell-proliferative Wirkung) auf eine Familie von Zellen hat. In einer weiteren Ausführungsform kann die zusätzliche Einheit auf seinen (Poly)peptidpartner ein Mittel zum Nachweis und/oder zur Reinigung übertragen. Zum Beispiel könnte das Fusionsprotein das modifizierte Antikörperfragment und ein Enzym umfassen, das üblicherweise für Nachweiszwecke verwendet wird, wie alkalische Phosphatase (Blake et al., 1984). Es gibt zahlreiche andere Einheiten, die als Nachweis- oder Reinigungsmarkermoleküle verwendet werden können, Welche dem Fachmann gut bekannt sind. Besonders bevorzugt werden Peptide, umfassend mindestens fünf Histidinreste (Hochuli et al., 1988), die in der Lage sind, an Metallionen zu binden und daher zur Reinigung des Proteins, mit dem sie fusioniert sind, verwendet werden können (Lindner et al., 1992). Durch die Erfindung werden auch zusätzliche Einheiten bereitgestellt, wie die häufig verwendeten C-myc- und FLAG-Markermoleküle (Hopp et al., 1988; Knappik & Plückthun, 1994).
Durch Veränderung einer oder mehrerer zusätzlicher fusionierter Domänen können Antikörperfragmente zu größeren Molekülen zusammengelagert werden, die ebenfalls unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen. Zum Beispiel sind Mini-Antikörper (Pack, 1994) Dimere, welche zwei Antikörperfragmente umfassen, die jeweils mit einer selbst-zusammenlagernden Dimerisierungsdomäne fusioniert sind. Dimerisierungsdomänen, die besonders bevorzugt werden, schließen diejenigen ein, welche von einem Leucin-Reißverschluß (Pack & Plückthun, 1992) oder einem Helix-Schleife-Helix-Motiv (Pack et al., 1993) abgeleitet sind.
Alle vorstehenden erfindungsgemäßen Ausführungsformen können unter Anwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie, die jedem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Zufallssammlung von Untersequenzen (die Bibliothek) in eine einzigartige Nucleinsäuresequenz inseriert, die ein (Poly)peptid codiert, wodurch eine (Poly)peptidbibliothek basierend auf einem universellen Gerüst hergestellt wird. Vorzugsweise wird eine Zufallssammlung von CDR-Untersequenzen in ein universelles Antikörpergerüst inseriert, zum Beispiel in das vorstehend beschriebene HuCAL- H3κ2-E inzelketten-Fv-Fragment.
In weiteren Ausführungsformen sorgt die Erfindung für (eine) Nucleinsäuresequenz(en) und (Poly)peptide, die gemäß den vorstehend beschriebenen und in den Patentansprüchen weiter spezifizierten Verfahren erhältlich sind.
Die Erfindung beschreibt modulare Vektorsysteme, die mit den modularen Nucleinsäuresequenzen verträglich sind, welche die (Poly)peptide codieren. Die Module der Vektoren sind von Restriktionsstellen umgeben, die innerhalb des Vektorsystems einmalig sind und im Hinblick auf die Restriktionsstellen im wesentlichen einmalig sind, die in die Nucleinsäuresequenzen eingeführt werden, welche die (Poly)peptide codieren, abgesehen von zum Beispiel den Restriktionsstellen, die zum Clonieren der Nucleinsäuresequenzen in den Vektor notwendig sind. Die Liste von Vektormodulen umfaßt Einzelstrang-Replikationsursprünge, Doppelstrang-Replikationsursprünge für Plasmide mit hoher und niedriger Kopienzahl, Promotor/Operator, Repressor- oder Terminatorelemente, Resistenzgene, mögliche Rekombinationsstellen, das Gen III zur Darstellung auf filamentösen Phagen, Signalsequenzen, Reinigungs- und Nachweismarkermoleküle und Sequenzen zusätzlicher Einheiten.
Die Vektoren sind vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, Expressionsvektoren oder Vektoren, die zur Expression und Durchmusterung von Bibliotheken geeignet sind.
Wie vorstehend dargelegt wurde, sorgt die Erfindung für die Herstellung von Bibliotheken von menschlichen Antikörpern. In einem ersten Schritt wird eine Datenbank von veröffentlichten Antikörpersequenzen menschlichen Ursprungs erstellt. Die Datenbank wird verwendet, um Untergruppen von Antikörpersequenzen zu definieren, die einen hohen Grad der Ähnlichkeit in sowohl der Sequenz als auch in der kanonischen Faltung (bestimmt durch die Analyse von Antikörperstrukturen) zeigen. Für jede der Untergruppen wird eine Konsensussequenz abgeleitet, welche die Mitglieder dieser Untergruppe repräsentiert; die vollständige Sammlung von Konsensussequenzen gibt daher den vollständigen strukturellen Vorrat an menschlichen Antikörpern wieder.
Diese synthetischen Gene werden dann unter Verwendung von synthetischen genetischen Untereinheiten konstruiert. Diese genetischen Untereinheiten entsprechen strukturellen Unterelementen auf der Proteinebene. Auf der DNA-Ebene sind diese genetischen Untereinheiten durch Schnittstellen am Anfang und am Ende eines jeden der Unterelemente definiert, die in dem Vektorsystem einmalig sind. Alle Gene, die Mitglieder der Sammlung von Konsensussequenzen sind, werden konstruiert, so daß sie ein ähnliches Muster dieser genetischen Untereinheiten enthalten.
Diese Sammlung von DNA-Molekülen kann dann verwendet werden, um Bibliotheken von Antikörpern herzustellen, die als Quellen für Spezifitäten für neue Zielantigene verwendet werden können. Außerdem kann die Affinität der Antikörper unter Verwendung von vorher konstruierten Kassetten und eines allgemeinen Verfahrens optimiert werden. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung von einem oder mehreren Genen bereit, die ein oder mehrere Antikörperfragmente codieren, welche an ein Zielmolekül binden, umfassend die Schritte der Expression der Antikörperfragmente und dann deren Durchmusterung, um ein oder mehrere Antikörperfragmente zu isolieren, die an ein bestimmtes Zielmolekül binden. Gegebenenfalls kann der modulare Aufbau der Gene dann verwendet werden, um aus den Genen, welche die Antikörperfragmente codieren, eine oder mehrere genetische Untersequenzen auszuschneiden, die strukturelle Unterelemente codieren, und diese durch eine oder mehrere zweite Untersequenzen zu ersetzen, die strukturelle Unterelemente codieren. Die Expressions- und Durchmusterungsschritte können dann wiederholt werden, bis ein Antikörper mit der gewünschten Affinität erzeugt ist.
Besonders bevorzugt wird ein Verfahren, bei dem eine oder mehrere der genetischen Untereinheiten (z. B. die CDRs) durch eine Zufallssammlung von Sequenzen (die Bibliothek) unter Verwendung der Schnittstellen ersetzt werden. Da diese Schnittstellen (i) in dem Vektorsystem einmalig sind und (ii) allen Konsensusgenen gemeinsam sind, kann die gleiche (vorher konstruierte) Bibliothek in alle synthetischen Antikörpergene inseriert werden. Die so erhaltene Bibliothek wird dann auf ein ausgewähltes Antigen durchmustert. Bindende Antikörper werden eluiert, gesammelt und als Ausgangsmaterial für die nächste Bibliothek verwendet. Hier werden eine oder mehrere der verbleibenden genetischen Untereinheiten zufällig ausgewählt, wie vorstehend beschrieben.

Definitionen

Protein:

Der Begriff Protein umfaßt monomere Immunglobulin-Polypeptidketten sowie homo- oder heteromultimere Komplexe aus zwei oder mehreren Immunglobulin-Polypeptidketten, die entweder durch kovalente Wechselwirkungen (wie Disulfidbrücken) oder durch nichtkovalente Wechselwirkungen (wie hydrophobe oder elektrostatische Wechselwirkungen) verbunden sind.

Analyse von homologen Proteinen:

Die Aminosäuresequenzen von drei oder mehreren Proteinen werden gegeneinander in einer Weise ausgerichtet (was die Einführung von Lücken erlaubt), welche die Übereinstimmung zwischen identischen oder ähnlichen Aminosäureresten an allen Positionen maximiert. Diese ausgerichteten Sequenzen werden als homolog bezeichnet, wenn der Prozentsatz der Summe der identischen und/oder ähnlichen Reste einen festgelegten Grenzwert übersteigt. Dieser Grenzwert wird gewöhnlich von den Fachleuten als überschritten angesehen, wenn mindestens 15% der Aminosäuren in den ausgerichteten Genen identisch sind und mindestens 30% ähnlich sind.

Konsensussequenz:

Unter Verwendung einer Matrix von mindestens drei ausgerichteten Aminosäuresequenzen und der Ermöglichung von Lücken bei den ausgerichteten Sequenzen ist es möglich, den häufigsten Aminosäurerest an jeder Position zu bestimmen. Die Konsensussequenz ist die Sequenz, welche die Aminosäuren umfaßt, die am häufigsten an jeder Position vorliegen. In dem Fall, daß zwei oder mehrere Aminosäuren gleich häufig an einer einzelnen Position vorliegen, schließt die Konsensussequenz beide oder alle solche Aminosäuren ein.

Entfernung unvorteilhafter Interaktionen:

Die Konsensussequenz ist per se in den meisten Fällen synthetisch und muß analysiert werden, um Aminosäurereste auszutauschen, die zum Beispiel verhindern würden, daß das so erhaltene Molekül eine funktionelle Tertiärstruktur einnimmt, oder welche die Wechselwirkung mit anderen (Poly)peptidketten in multimeren Komplexen blockieren würden. Dies kann entweder durch (i) Erstellung eines dreidimensionalen Modells der Konsensussequenz unter Verwendung bekannter verwandter Strukturen als Matrize und Identifizierung von Aminosäureresten innerhalb des Modells, die ungünstig miteinander interagieren könnten, oder (ii) Analysieren der Matrix ausgerichteter Aminosäuresequenzen, um Kombinationen von Aminosäureresten innerhalb der Sequenzen nachzuweisen, die häufig zusammen in einer Sequenz vorkommen und deshalb wahrscheinlich miteinander interagieren, erreicht werden. Diese wahrscheinlichen Interaktionspaare werden dann tabellarisiert, und die Konsensussequenz wird mit diesen "Interaktionskarten" verglichen. Fehlende oder falsche Interaktionen in der Konsensussequenz werden durch Einführung geeigneter Austausche von Aminosäuren, die diese unvorteilhaften Interaktionen minimieren, ausgebessert.

Identifizierung struktureller Unterelemente:

Strukturelle Unterelemente sind Bereiche von Aminosäureresten innerhalb eines Proteins/(Poly)peptids, die einem definierten strukturellen oder funktionellen Teil des Moleküls entsprechen. Diese können Schleifen (z. B. CDR-Schleifen eines Antikörpers) oder Gerüstregionen von Antikörpern sein. Ein strukturelles Unterelement kann unter Verwendung bekannter Strukturen ähnlicher oder homologer (Poly)peptide oder unter Verwendung der vorstehend erwähnten Matrizen von ausgerichteten Aminosäuresequenzen identifiziert werden. Hier bildet die Variabilität an jeder Position die Grundlage für die Bestimmung von Bereichen von Aminosäureresten, die zu einem strukturellen Unterelement gehören (z. B. hypervariable Regionen eines Antikörpers).

Untersequenz:

Eine Untersequenz ist definiert als ein genetisches Modul, das von einmaligen Schnittstellen umgeben ist und mindestens ein strukturelles Unterelement codiert. Es ist nicht notwendigerweise mit einem strukturellen Unterelement identisch.

Schnittstelle:

Eine kurze DNA-Sequenz, die als spezifisches Zielmolekül für ein Reagens verwendet wird, welches DNA in einer sequenzspezifischen Weise schneidet (z. B. Restriktionsendonucleasen).

Verträgliche Schnittstellen:

Schnittstellen sind miteinander verträglich, wenn sie ohne Modifikation und vorzugsweise auch ohne Hinzufügen eines Adaptermoleküle wirksam ligiert werden können.

Einmalige Schnittstellen:

Eine Schnittstelle ist als einmalig definiert, wenn sie nur einmal in einem Vektor vorkommt, der mindestens eines der Gene von Interesse enthält, oder wenn ein Vektor, der mindestens eines der Gene von Interesse enthält, in einer Weise behandelt werden könnte, daß nur eine der Schnittstellen durch das schneidende Agens verwendet werden kann.

Entsprechende (Poly)peptidsequenzen:

Sequenzen, die von dem gleichen Teil einer Gruppe von homologen Proteinen abgeleitet sind, werden als entsprechende (Poly)peptidsequenzen bezeichnet.

Häufige Schnittstellen:

Eine Schnittstelle in mindestens zwei entsprechenden Sequenzen, welche an der gleichen funktionellen Position vorkommt (d. h. die eine definierte Untersequenz umgibt), die durch das gleiche Schneidewerkzeug hydrolysiert werden kann und die identische verträgliche Enden ergibt, wird als eine gemeinsame Schnittstelle bezeichnet.

Ausschneiden genetischer Untersequenzen:

Ein Verfahren, das die einmaligen Schnittstellen und die entsprechenden Schneidereagenzien verwendet, um die Ziel-DNA an den spezifizierten Positionen zu schneiden, um die genetische Untersequenz, die von diesen einmaligen Schnittstellen umgeben ist, zu isolieren, zu entfernen oder zu ersetzen.

Austauschen genetischer Untersequenzen:

Ein Verfahren, durch das eine vorhandene Untersequenz unter Verwendung der umgebenden Schnittstellen dieser Untersequenz entfernt und eine neue Untersequenz oder eine Sammlung von Untersequenzen, enthaltend Enden, die mit den auf diese Weise erzeugten Schnittstellen verträglich sind, inseriert wird.

Expression von Genen:

Der Begriff Expression bezieht sich auf in vivo- oder in vitro-Prozesse, durch welche die Information eines Gens in mRNA transkribiert und dann in ein Protein/(Poly)- peptid translatiert wird. Folglich bezieht sich der Begriff Expression auf einen Prozeß, der innerhalb der Zellen stattfindet und durch den die Information eines Gens in mRNA und dann in ein Protein transkribiert wird. Der Begriff Expression schließt auch alle Ereignisse einer posttranslationalen Modifikation und des Transports ein, die notwendig sind, damit das (Poly)peptid funktionsfähig ist.

Durchmusterung von Protein/(Poly)peptidbibliotheken:

Jedes Verfahren, welches die Isolierung von einem oder mehreren Proteinen/(Poly)- peptiden mit einer gewünschten Eigenschaft aus anderen Proteinen/(Poly)peptiden innerhalb einer Bibliothek ermöglicht.

Antikörpergerüst:

Ein Gerüst einer variablen Domäne eines Antikörper ist von Kabat et al. (1991) definiert als der Teil der variablen Domäne, der als Gerüst für die Antigenbindungsschleifen dieser variablen Domäne dient.

Antikörper-CDR:

Die CDRs (komplementaritätsbestimmende Regionen) eines Antikörpers bestehen aus den Antigenbindungsschleifen, wie von Kabat et al. (1991) definiert. Jede der zwei variablen Domänen eines Antikörper-Fv-Fragments enthält drei CDRs.

HuCAL:

Abkürzung für humane kombinatorische Antikörperbibliothek. Antikörperbibliothek, basierend auf erfindungsgemäßen modularen Konsenussequenzen (vgl. Beispiel 1).

Antikörperfragment:

Ein Teil eines Antikörpers, der eine bestimmte Funktion hat, z. B. die Bindung eines Antigens. Üblicherweise sind Antikörperfragmente kleiner als der ganze Antikörper. Beispiele sind Fv-, Disulfid verbundenes Fv-, Einzelketten-Fv- (scFv) oder Fab-Fragmente. Außerdem werden Antikörperfragmente oft verändert, so daß sie neue Funktionen oder Eigenschaften einschließen.

Universelles Gerüst:

Ein einziges Gerüst, das verwendet werden kann, um die ganze Variabilität von Funktionen, Spezifitäten oder Eigenschaften zu erzeugen, die ursprünglich durch eine große Sammlung von verschiedenen Gerüsten aufrechterhalten werden, wird als ein universelles Gerüst bezeichnet.

Bindung eines Antikörpers an sein Zielmolekül:

Der Prozeß, der zu einem engen und spezifischen Zusammenschluß zwischen einem Antikörper und einem entsprechenden Molekül oder Liganden führt, wird als Bindung bezeichnet. Ein Molekül oder Ligand oder ein Teil eines Moleküls oder Liganden, das bzw. der von einem Antikörper erkannt wird, wird als Zielmolekül bezeichnet.

Ersetzen genetischer Untersequenzen:

Zusammensetzung genetischer Sequenzen:

Ein Prozeß, der verwendet wird, um synthetische oder natürliche genetische Sequenzen in einer spezifischen Weise zu kombinieren, um längere genetische Sequenzen zu erhalten, die mindestens Teile der verwendeten synthetischen oder natürlichen genetischen Sequenzen enthalten.

Analyse von homologen Genen:

Die entsprechenden Aminosäuresequenzen von Zwei oder mehreren Genen werden aneinander in einer Weise ausgerichtet, welche die Übereinstimmung zwischen identischen oder ähnlichen Aminosäureresten an allen Positionen maximiert. Diese ausgerichteten Sequenzen werden als homolog bezeichnet, wenn der Prozentsatz der Summe der identischen und/oder ähnlichen Reste einen festgelegten Grenzwert übersteigt. Dieser Grenzwert wird von den Fachleuten üblicherweise als überschritten angesehen, wenn mindestens 15% der Aminosäuren in den ausgerichteten Genen identisch sind und mindestens 30% ähnlich sind.

Legenden zu den Figuren und Tabellen

Fig. 1: Fließdiagramm, welches den Prozeß der Konstruktion einer synthetischen menschlichen Antikörperbibliothek auf der Grundlage von Konsensussequenzen beschreibt.
Fig. 2: Ausrichtung von Konsensussequenzen, die für jede Untergruppe konstruiert wurden (Aminosäurereste sind mit ihrer Ein-Buchstaben-Standardabkürzung aufgeführt). (A) Kappa-Sequenzen, (B) Lambda-Sequenzen und (C) Sequenzen der schweren Kette. Die Positionen sind gemäß Kabat (1991) numeriert. Um die Homologie bei den ausgerichteten Sequenzen zu maximieren, wurden Lücken (--) in die Sequenz an bestimmten Positionen eingeführt.
Fig. 3: Gensequenzen der synthetischen V-Kappa-Konsensusgene. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen (vgl. Fig. 2) sowie die einmaligen Schnittstellen sind ebenfalls gezeigt.
Fig. 4: Gensequenzen der synthetischen V-Lambda-Konsensusgene. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen (vgl. Fig. 2) sowie die einmaligen Schnittstellen sind ebenfalls gezeigt.
Fig. 5: Gensequenzen der synthetischen V-Konsensusgene der schweren Kette. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen (vgl. Fig. 2) sowie die einmaligen Schnittstellen sind ebenfalls gezeigt.
Fig. 6: Zur Konstruktion der Konsensusgene verwendete Oligonucleotide. Die Oligos sind gemäß des entsprechenden Konsensusgens bezeichnet, z. B. wurde das Gen Vκ1 unter Verwendung der sechs Oligonucleotide OIK1 bis OIK6 konstruiert. Die Oligonucleotide, die zur Synthese der Gene verwendet wurden, welche die konstanten Domänen Cκ (OCLK1 bis 8) und CH1 (OCH1 bis 8) codieren, sind ebenfalls gezeigt.
Fig. 7A/B: Sequenzen der synthetischen Gene, welche die konstanten Domänen Cκ (A) und CH1 (B) codieren. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen sowie einmalige Schnittstellen, die in diese Gene eingeführt wurden, sind ebenfalls gezeigt.
Fig. 7C: Funktionelle Karte und Sequenz des Moduls M24, welches das synthetische Cλ- Gensegment (huCL-Lamda) umfaßt.
Fig. 7D: Zur Synthese des Moduls M24 verwendete Oligonucleotide.
Fig. 8: Sequenz und Restriktionskarte des synthetischen Gens, welches das Konsensus- Einzelketten-Fragment VH3-Vic2 codiert. Die Signalsequenz (Aminosäuren 1 bis 21) wurde von dem E. coli-phoA-Gen abgeleitet (Skerra & Plückthun, 1988). Zwischen der phoA-Signalsequenz und der VH3-Domäne wurde ein kurzer Sequenzbereich inseriert, der 4 Aminosäurereste codiert (Aminosäure 22 bis 25), um den Nachweis des Einzelkettenfragments in einem Western-Blot oder ELISA unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers M1 zu ermöglichen (Knappik & Plückthun, 1994). Die letzten 6 Basenpaare der Sequenz wurden für Clonierungszwecke eingeführt (EcoRI-Stelle).
Fig. 9: Plasmidkarte des Vektors pIG10.3, der für ein Phagen-Display des H3κ2-scFv- Fragments verwendet wurde. Der Vektor ist von pIGlO abgeleitet und enthält das Gen für den Repressor lacI des lac-Operons, das synthetische Operon, welches die H3κ2-Gen-3ss-Fusion unter Kontrolle des lac-Promotors codiert, den Ipp-Transkriptionsterminator, den Einzelstrang-Replikationsursprung des E. coli-Phagen fl (F1_ORI), ein β-Lactamase codierendes Gen (bla) und den von CoIEI abgeleiteten Replikationsursprung.
Fig. 10: Sequenzierungsergebnisse unabhängiger Clone aus der Ausgangsbibliothek, übersetzt in die entsprechenden Aminosäuresequenzen. (A) Aminosäuresequenz von CDR3 der VH3-Konsensussequenz der schweren Kette (Position 93 bis 102, Kabat- Numerierung). (B) Aminosäuresequenzen von 12 Clonen der 10-mer-Bibliothek. (C) Aminosäuresequenzen von 11 Clonen der 15-mer-Bibliothek. Einbasendeletion.
Fig. 11: Expressionstest einzelner Mitglieder der Bibliothek. (A) Expression von 9 unabhängigen Clonen der 10-mer-Bibliothek. (B) Expression von 9 unabhängigen Clonen der 15-mer-Bibliothek. Die mit M bezeichnete Bahn enthält den Größenmarker. Es sind sowohl die gp3-scFv-Fusion als auch das scFv-Monomer gezeigt.
Fig. 12: Anreicherung spezifischer Phagenantikörper während des Panning gegen FITC- BSA. Die anfänglichen sowie die nachfolgenden Fluorescein-spezifischen Unterbibliotheken werden gegen den Blockierungspuffer einem Panning-Verfahren unterworfen, und das Verhältnis des aus der mit FITC-BSA beschichteten Vertiefung eluierten Phagen zu dem aus der mit Milchpulver beschichteten Vertiefung eluierten Phagen für jeden Panningdurchgang ist als "Spezifitätsfaktor" angegeben.
Fig. 13: Phagen-ELISA von 24 unabhängigen Clonen nach dem dritten Panningdurchgang, die auf die Bindung an FITC-BSA getestet wurden.
Fig. 14: Kompetitiver ELISA ausgewählter FITC-BSA-bindender Clone. Die ELISA- Signale (OD&sub4;&sub0;&sub5; nm) einer scFv-Bindung ohne Hemmung werden als 100% genommen.
Fig. 15: Sequenzierungsergebnisse der CDR3s der schweren Kette von unabhängigen Clonen nach 3 Panningdurchgängen gegen FITC-BSA, übersetzt in die entsprechenden Aminosäuresequenzen (Position 93 bis 102. Kabat-Numerierung).
Fig. 16: Coomassie-Blau-gefärbte SDS-PAGE der gereinigtefl anti-Fluorescein-scFv-Fragmente: M: Molekulargewichtsmarker, A: gesamter löslicher Zellextrakt nach Induktion, B: Fraktion des Durchflusses, C, D und E: gereinigte scFv-Fragmente 1HA- 3E4, 1HA-3E5 bzw. 1HA-3E10.
Fig. 17: Anreicherung spezifischer Phagenantikörper während des Panning gegen β-Östradiol-BSA, Testosteron-BSA, BSA, ESL-1, Interleukin-2, Lymphotoxin-β und LeY- BSA nach drei Panningdurchgängen.
Fig. 18: ELISA ausgewählter ESL-1- und β-Östradiol-bindender Clone.
Fig. 19: Selektiv ität und Kreuzreaktivität von HuCAL-Antikörper: in der Diagonalen ist die spezifische Bindung von HuCAL-Antikörpem zu erkennen; Signale außerhalb der Diagonalen zeigen eine unspezifische Kreuzreaktivität an.
Fig. 20: Sequenzierungsergebnisse der CDR3s der schweren Kette von unabhängigen Clonen nach 3 Panningdurchgängen gegen β-Östradiol-BSA, übersetzt in die entsprechenden Aminosäuresequenzen (Position 93 bis 102, Kabat-Numerierung). Ein Clon stammt aus der 10-mer-Bibliothek.
Fig. 21: Sequenzierungsergebnisse der CDR3s der schweren Kette von unabhängigen Clonen nach 3 Panningdurchgängen gegen Testosteron-BSA, übersetzt in die entsprechenden Aminosäuresequenzen (Position 93 bis 102, Kabat-Numerierung).
Fig. 22: Sequenzierungsergebnisse der CDR3s der schweren Kette von unabhängigen I Clonen nach 3 Panningdurchgängen gegen Lymphotoxin-β, übersetzt in die entsprechenden Aminosäuresequenzen (Position 93 bis 102, Kabat-Numerierung). Ein Clon umfaßt eine 14-mer-CDR, die vermutlich durch eine unvollständige Kopplung des Trinucleotidgemisches während der Oligonucleotidsynthese eingeführt wurde.
Fig. 23: Sequenzierungsergebnisse der CDR3s der schweren Kette von unabhängigen Clonen nach 3 Panningdurchgängen gegen ESL-1, übersetzt in die entsprechenden Aminosäuresequenzen (Position 93 bis 102, Kabat-Numerierung). Zwei Clone stammen aus der 10-mer-Bibliothek. Ein Clon umfaßt eine 16-mer-CDR, die vermutlich durch eine Kettenverlängerung während der Oligonucleotidsynthese unter Verwendung von Trinucleotiden eingeführt wurde.
Fig. 24: Sequenzierungsergebnisse der CDR3s der schweren Kette von unabhängigen Clonen nach 3 Panningdurchgängen gegen BSA, übersetzt in die entsprechenden Aminosäuresequenzen (Position 93 bis 1-02, Kabat-Numerierung).
Fig. 25: Schematische Darstellung des modularen pCAL-Vektorsystems.
Fig. 25a: Liste von Restriktionsstellen, die bereits in den modularen HuCAL-Genen und in dem pCAL-Vektorsystem verwendet wurden oder dafür geeignet sind.
Fig. 26: Liste der modularen Vektorelemente für die pCAL-Vektorreihe: gezeigt sind nur die Restriktionsstellen, die Teil des modularen Systems sind.
Fig. 27: Funktionelle Karte und Sequenz des Multiclonierungsstellenmoduls (MCS).
Fig. 28: Funktionelle Karte und Sequenz der pMCS-Clonierungsvektorreihe.
Fig. 29: Funktionelle Karte und Sequenz des pCAL-Moduls M1 (vgl. Fig. 26).
Fig. 30: Funktionelle Karte und Sequenz des pCAL-Moduls M7-III (vgl. Fig. 26).
Fig. 31: Funktionelle Karte und Sequenz des pCAL-Moduls M9-II (vgl. Fig. 26).
Fig. 32: Funktionelle Karte und Sequenz des pCAL-Moduls M11-11 (vgl. Fig. 26).
Fig. 33: Funktionelle Karte und Sequenz des pCAL-Moduls M14-Ext2 (vgl. Fig. 26).
Fig. 34: Funktionelle Karte und Sequenz des pCAL-Moduls M17 (vgl. Fig. 26).
Fig. 35: Funktionelle Karte und Sequenz des modularen Vektors pCAL4.
Fig. 35a: Funktionelle Karten und Sequenzen zusätzlicher pCAL-Module (M2, M3, M7I, M7II, M8, M10II, M11II, MI2, M13, M19, M20, M21, M41) und von Plasmidvektoren mit geringer Kopienzahl (pCAL01 bis pCAL03).
Fig. 35b: Liste von Oligonucleotiden und Primern, die zur Synthese von pCAL-Vektormodulen verwendet wurden.
Fig. 36: Funktionelle Karte und Sequenz der β-Lactamase-Kassette für das Ersetzen von CDRs zur Clonierung einer CDR-Bibliothek.
Fig. 37: Oligo- und Primerkonstruktion für Vκ-CDR3-Bibliotheken.
Fig. 38: Oligo- und Primerkonstruktion für Vλ-CDR3-Bibliotheken.
Fig. 39: Funktionelle Karte der pBSl3-Expressionsvektorreihe.
Fig. 40: Expression aller 49 HuCAL-scFvs, die durch Kombination jedes der 7 VH-Gene mit jedem der 7 VL-Gene erhalten wurden (pBSl3, 30ºC): Es sind Werte für den Prozentsatz an löslichem zu unlöslichem Material, die Gesamtmenge und die lösliche Menge, verglichen mit der Kombination H3κ2, welcher der Wert 100% zugeordnet wurde, angegeben. Außerdem sind die entsprechenden Werte für das McPC603-scFv angegeben.
Tabelle 1: Zusammenfassung der menschlichen Immunglobulin-Keimbahnsequenzen, die zur Ermittlung der Keimbahnmitgliedschaft umgelagerter Sequenzen verwendet wurden. (A) Kappa-Sequenzen, (B) Lambda-Sequenzen und (C) Sequenzen der schweren Kette. (1) Die in den verschiedenen Ermittlungen verwendete Keimbahnbezeichnung, (2) die Referenznummer für die entsprechende Sequenz (vgl. Anhang für sequenzbezogene Belegstellen), (3) die Familie, zu der jede Sequenz gehört, und (4) die in der Literatur für Keimbahngene mit identischen Aminosäuresequenzen gefundenen, verschiedenen Bezeichnungen.
Tabelle 2: Umgelagerte menschliche Sequenzen, die zur Ermittlung von Konsensussequenzen verwendet wurden. (A) Kappa-Sequenzen, (B) Lambda-Sequenzen und (C) Sequenzen der schweren Kette. Die Tabelle faßt die Bezeichnungen der Sequenz (1), die Länge der Sequenz der Aminosäuren (2), die Keimbahnfamilie (3) sowie das ermittelte Keimbahngegenstück (4) zusammen. Die Zahl der Aminosäureaustausche zwischen der umgelagerten Sequenz und der Keimbahnsequenz ist in (5) tabellarisiert, und der Prozentsatz der unterschiedlichen Aminosäuren ist in (6) angegeben. Spalte (7) gibt die Referenznummer für die entsprechende Sequenz an (vgl. Anhang für sequenzbezogene Belegstellen).
Tabelle 3: Zuordnung umgelagerter V-Sequenzen zu ihren Keimbahngegenstücken. (A) Kappa-Sequenzen, (B) Lambda-Sequenzen und (C) Sequenzen der schweren Kette. Die Keimbahngene sind entsprechend ihrer Familie tabellarisiert (1), und die für jedes Keimbahngen festgestellte Zahl umgelagerter Gene ist in (2) angegeben.
Tabelle 4: Ermittlung der Konsensussequenz der umgelagerten V-Kappa-Sequenzen. (A) V-Kappa-Untergruppe 1, (B) V-Kappa-Untergruppe 2, (C) V-Kappa-Untergruppe 3 und (D) V-Kappa-Untergruppe 4. Die an jeder Position festgestellte Zahl jeder Aminosäure ist zusammen mit der statistischen Analyse der Daten tabellarisiert (1). Die Aminosäuren sind mit ihren Ein-Buchstaben-Standardabkürzungen angegeben (und B bedeutet D oder N, Z bedeutet E oder Q und X bedeutet eine beliebige Aminosäure). Die statistische Analyse faßt die Zahl der an jeder Position gefundenen Sequenzen (2), die Zahl des Auftretens der häufigsten Aminosäure (3), den Aminosäurerest, der an dieser Position am häufigsten ist (4), die relative Häufigkeit des Auftretens der häufigsten Aminosäure (5) und die Zahl der an jeder Position festgestellten verschiedenen Aminosäuren (6)-zusammen.
Tabelle 5: Ermittlung der Konsensussequenz der umgelagerten V-Lambda-Sequenzen. (A) V-Lambda-Untergruppe 1, (B) V-Lambda-Untergruppe 2 und (C) V-Lambda- Untergruppe 3. Die an jeder Position festgestellte Zahl jeder Aminosäure ist zusammen mit der statistischen Analyse der Daten tabellarisiert. Die Abkürzungen sind dieselben wie in Tabelle 4.
Tabelle 6: Ermittlung der Konsensussequenz der umgelagerten V-Sequenzen der schweren Kette. (A) V-Untergruppe 1A der schweren Kette, (B) V-Untergruppe 1B der schweren Kette, (C) V-Untergruppe 2 der schweren Kette, (D) V-Untergruppe 3 der schweren Kette, (E) V-Untergruppe 4 der schweren Kette, (F) V-Untergruppe 5 der schweren Kette und (6) V-Untergruppe 6 der schweren Kette. Die an jeder Position festgestellte Zahl jeder Aminosäure ist zusammen mit der statistischen Analyse der Daten tabellarisiert. Die Abkürzungen sind dieselben wie in Tabelle 4.

Beispiele

Beispiel 1: Konstruktion einer synthetischen menschlichen kombinatorischen Antikörperbibliothek (HuCAL)

Das folgende Beispiel beschreibt die Konstruktion einer vollständig synthetischen menschlichen kombinatorischen Antikörperbibliothek (HuCAL) basierend auf Konsensussequenzen des menschlichen Immuriglobulinvorrats und die Synthese der Konsensusgene. Das allgemeine Verfahren ist in Fig. 1 dargestellt.

1.1 Sequenz-Datenbank

1.1.1 Sammlung und Ausrichtung menschlicher Immunglobulinsequenzen

In einem ersten Schritt wurden Sequenzen von variablen Domänen menschlicher Immunglobuline gesammelt und in drei Unterdatenbanken unterteilt: schwere V-Kette (VH), V-Kappa (Vκ) und V-Lambda (Vλ). Für jede Sequenz wurde dann die Gensequenz in die entsprechende Aminosäuresequenz übersetzt. Anschließend wurden alle Aminosäuresequenzen gemäß Kabat et al. (1991) ausgerichtet. Im Fall von Vλ-Sequenzen wurde das Numerierungssystem von Chuchana et al. (1990) verwendet. Jede der drei Hauptdatenbanken wurde dann in zwei weitere Unterdatenbanken unterteilt: die erste Unterdatenbank enthielt alle Sequenzen, die von umgelagerten V-Genen abgeleitet waren, worin mehr als 70 Positionen der Sequenz bekannt waren. Die zweite Unterdatenbank enthielt alle Keimbahngensegmente (ohne die D- und J-Minigene; Pseudogene mit internen Stoppcodons wurden auch entfernt). In allen Fällen, wo Keimbahnsequenzen mit einer identischen Aminosäuresequenz, aber mit unterschiedlichen Bezeichnungen gefunden wurden, wurde nur eine Sequenz verwendet (vgl. Tabelle 1). Die endgültigen Datenbanken von umgelagerten Sequenzen enthielten 386, 149 und 674 Einträge für Vκ, Vλ bzw. VH. Die endgültigen Datenbanken von Keimbahnsequenzen enthielten 48, 26 und 141 Einträge für Vκ, Vλ bzw. VH.

1.1.2 Zuordnung von Sequenzen zu Untergruppen

Die Sequenzen in den drei Keimbahn-Datenbanken wurden dann entsprechend der Sequenzhomologie in Gruppen zusammengefaßt (vgl. auch Tomlinson et al., 1992; Williams & Winter, 1993; und Cox et aL, 1994). Im Fall von Vk konnten 7 Familien gebildet werden. Vλ wurde in 8 Familien und VH in 6 Familien unterteilt. Die VH-Keimbahngene der VH7- Familie (Van Dijk et al., 1993) wurden in die VH1-Familie eingruppiert, da die Gene der zwei Familien in hohem Grade homolog sind. Jede Familie enthielt unterschiedliche Anzahlen von Keimbahngenen, variierend von 1 (zum Beispiel VH6) bis 47 (VH3).

1.2 Analyse der Sequenzen

1.2.1 Ermittlung der Keimbahnmitgliedschaft

Für jede der 1209 Aminosäuresequenzen in den Datenbanken umgelagerter Gene wurde dann das nächste Keimbahngegenstück ermittelt, d. h. die Keimbahnsequenz mit der geringsten Zahl von Aminosäureunterschieden. Nach der Feststellung des Keimbahngegenstücks konnte die Zahl der somatischen Mutationen, die in dem umgelagerten Gen auftraten und die zu Aminosäureaustauschen führten, tabellarisiert werden. In 140 Fällen konnte das Keimbahngegenstück nicht genau ermittelt werden, da mehr als ein Keimbahngen mit einer identischen Zahl von Aminosäureaustauschen gefunden wurde. Diese umgelagerten Sequenzen wurden aus der Datenbank entfernt. In einigen Fällen wurde festgestellt, daß die Zahl der Aminosäureaustausche ungewöhnlich groß ist (> 20 für VL und > 25 für VH), was darauf hinweist, daß entweder stark mutierte, umgelagerte Gene oder eine Ableitung von Keimbahngenen in der Datenbank nicht repräsentiert sind. Da es nicht möglich war, zwischen diesen zwei Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden diese Sequenzen ebenfalls aus der Datenbank entfernt. Schließlich wurden 12 umgelagerte Sequenzen aus der Datenbank entfernt, da festgestellt wurde, daß sie sehr ungewöhnliche CDR-Längen und -Zusammensetzungen oder ungewöhnliche Aminosäuren an kanonischen Positionen aufwiesen (vgl. nachstehend). Zusammenfassend konnten 1023 umgelagerte Sequenzen von 1209 (85%) eindeutig zu ihren Keimbahngegenstücken zugeordnet werden (vgl. Tabelle 2).
Nach dieser Ermittlung konnte jedes umgelagerte Gen in eine der für die Keimbahngene erstellten Familien eingeordnet werden. Nun konnte der Gebrauch jedes Keimbahngens, d. h. die Zahl der umgelagerten Gene, die von jedem Keimbahngen abstammen, ermittelt werden (vgl. Tabelle 2). Es wurde festgestellt, daß der Gebrauch stark auf einen Untersatz von Keimbahngenen ausgerichtet war war, während die meisten der Keimbahngene nicht in Form umgelagerter Gene in der Datenbank vorlagen und daher anscheinend nicht im Immunsystem verwendet wurden (Tabelle 3). Über diese Beobachtung wurde bereits im Fall von Vk berichtet (Cox et al., 1994). Alle Keimbahngenfamilien, denen keine oder nur sehr wenige umgelagerte Gegenstücke zugeordnet werden konnten, wurden aus der Datenbank entfernt, wobei 4 Vκ-, 3 Vλ- und 6 VH-Familien verblieben.

1.2.2 Analyse von CDR-Konformationen

Die Konformation der Antigenbindungsschleifen von Antikörpermolekülen, der CDRs, hängt stark von sowohl der Länge der CDRs als auch den Aminosäureresten ab, die an den sogenannten kanonischen Positionen lokalisiert sind (Chothia & Lesk, 1987). Es wurde festgestellt, daß nur wenige kanonische Strukturen existieren, die den strukturellen Vorrat der variablen Domänen der Immunglobuline bestimmen (Chothia et al., 1989). Die kanonischen Aminosäurepositionen können in CDR- als auch in Gerüstregionen vorkommen. Die 13 verwendeten, vorstehend definierten Keimbahnfamilien (7 VL und 6 VH) wurden nun auf ihre kanonischen Strukturen analysiert, um den strukturellen Vorrat zu definieren, der in diesen Familien codiert wird.
In 3 der 4 Vκ-Familien (Vκ1, 2 und 4) konnte ein anderer Typ der CDR1- Konformation für jede Familie festgestellt werden. Die Familie Vic3 zeigte zwei Typen der CDR1-Konformation: einen Typ, der mit Vκ1 identisch war, und einen Typ, der nur in Vκ3 vorkam. Alle Vκ-CDR2s verwendeten denselben kanonischen Strukturtyp. Die CDR3- Konformation ist nicht in den Keimbahngensegmenten codiert. Daher entsprachen die durch Sequenzhomologie und Gebrauch definierten 4 Vκ-Familien auch 4 kanonischen Strukturtypen, die in Vκ-Keimbahngenen gefunden wurden.
Die vorstehend definierten 3 Vλ-Familien zeigten 3 CDR1-Konformationstypen, wobei jede Familie einen einmaligen Typ aufwies. Die Vλ1-Familie enthielt zwei unterschiedliche CDR1-Längen (13 und 14 Aminosäuren), aber identische kanonische Reste, und es wird angenommen, daß beide Längen die gleiche kanonische Konformation einnehmen (Chothia & Lesk, 1987). In der CDR2 der verwendeten Vλ-Keimbahnen liegt nur eine kanonische Konformation vor, und die CDR3-Konformation ist nicht in den Keimbahngensegmenten codiert. Daher entsprachen die durch Sequenzhomologie und Gebrauch definierten 3 Vλ-Familien auch 3 kanonischen Strukturtypen
Der strukturelle Vorrat der menschlichen VH-Sequenzen wurde von Chothia et al., 1992, im einzelnen analysiert. Insgesamt konnten 3 Konfornnationen von CDR1 (H1-1, H1-2 und H1-3) und 6 Konformationen von CDR2 (H2-1, H2-2, H2-3, H2-4, H2-5 und H2-x) definiert werden. Da die CDR3 in den D- und J-Minigenseg; menten codiert ist, werden keine besonderen kanonischen Reste für diese CDR definiert.
Alle Mitglieder der vorstehend definierten VH1-Familie enthielten die CDR1- Konformation H1-1, aber unterschieden sich in ihrer CDR2-Konformation: die H2-2-Konformation wurde in 6 Keimbahngenen festgestellt, während die, Konformation H2-3 in 8 Keimbahngenen festgestellt wurde. Da die zwei CDR2-Konfonnationstypen durch verschiedene Aminosäurearten an der Gerüstposition 72 defmiert sind, wurde die VH1-Familie in zwei Unterfamilien unterteilt: VH1A mit der CDR2-Konformation H2-2 und VHIB mit der Konformation H2-3. Die Mitglieder der VH2-Familie wiesen alle die Konformationen H1-3 und H2-1 in CDR1 bzw. CDR2 auf Es wurde festgestellt, daß die CDR1-Konformation der VH3-Mitglieder in allen Fällen H1-1 war, aber es wurden 4 unterschiedliche Typen in CDR2 festgestellt (H2-1, H2-3, H2-4 und H2-x). In diesen CDR2-Konformationen ist der kanonische Gerüstrest 71 immer durch einen Argininrest definiert. Daher war es nicht notwendig, die VH3-Familie in Unterfamilien zu unterteilen, da die 4 CDR2-Konformationstypen ausschließlich durch die CDR2 selbst definiert wurden. Das Gleiche traf für die VH4- Familie zu. Hier wurden alle drei CDR1-Konformationstypen gefunden; da aber die CDR1- Konformation durch die CDR selbst definiert wurde (es wurde festgestellt, daß der kanonische Gerüstrest 26 in allen Fällen ein Glycinrest ist), waren keine Unterteilungen notwendig. Für die CDR2-Konformation der VH4-Mitglieder wurde in allen Fällen festgestellt, daß es sich um H2-1 handelt. Für alle Mitglieder der VH5-Familie wurde festgestellt, daß sie die Konformation H1-1 bzw. H2-2 aufweisen. Das einzelne Keimbahngen der VH6-Familie wies die Konformationen H1-3 und H2-5 in CDR1 bzw. CDR2 auf.
Zusammenfassend waren alle möglichen CDR-Konformationen der Vκ- und Vλ- Gene in den durch einen Sequenzvergleich definierten 7 Familien vorhanden. Von den 12 verschiedenen CDR-Konformationen, die in den verwendeten VH-Keimbahngenen gefunden wurden, konnten 7 durch Unterteilen der Familie VH1 in zwei Unterfamilien abgedeckt werden, wodurch 7 VH-Familien gebildet wurden. Die restlichen 5 CDR-Konformationen (3 in der VH3- und 2 in der VH4-Familie) wurden durch die CDRs selbst definiert und könnten während der Konstruktion der CDR-Bibliotheken erzeugt worden sein. Daher konnte der strukturelle Vorrat der verwendeten menschlichen V-Gene durch 49 (7 · 7) verschiedene Gerüste abgedeckt werden.

1.2.3 Ermittlung von Konsensussequenzen

Die 14 Datenbanken der umgelagerten Sequenzen (4 Vκ, 3 Vλ und 7 VH) wurden verwendet, um die HuCAL-Konsensussequenzen jeder Untergruppe zu ermitteln (4 HuCAL- Vκ, 3 HuCAL-Vλ und 7 HuCAL-VH, vgl. Tabelle 4, 5 und 6). Dies wurde durchgeführt, indem die Zahl der an jeder Position verwendeten Aminosäurereste gezählt (Positionsvariabilität) und anschließend der Aminosäurerest, der am häufigsten an jeder Position verwendet wurde, identifiziert wurde. Unter Verwendung der umgelagerten Sequenzen anstelle der verwendeten Keimbahnsequenzen zur Ermittlung der Konsensussequenz wurde die Konsensussequenz entsprechend der Verwendungshäufigkeit gewichtet. Außerdem konnten häufig mutierte und stark konservierte Positionen identifiziert werden. Die Konsensussequenzen wurden mit der Konsensussequenz der Keimbahnfamilien gegengeprüft, um zu sehen, ob die umgelagerten Sequenzen an bestimmten Positionen eine Vorliebe für Aminosäurereste hatten, die nicht in den gesammelten Keimbahnsequenzen vorkommen; aber es wurde festgestellt, daß dies nicht der Fall war. Anschließend wurde die Zahl der Unterschiede einer jeden der 14 Konsensussequenzen zu jeder der Kexmbahnsequenzen, die in jeder spezifischen Familie gefunden wurden, berechnet. Für die Gesamtabweichung der im höchsten Grade homologen Keimbahnsequenz wurde ein Wert von 2,4 Aminosäureresten (SA = 2,7) festgestellt, was sichergestellt, daß die "synthetischen" Konsensussequenzen noch immer als wirklich menschliche Sequenzen angesehen werden können, so weit es die Immunogenität betrifft.

1.3 Strukturanalyse

Bisher wurden nur Sequenzinformationen verwendet, um die Konsensussequenzen zu konstruieren. Da es möglich war, daß während der Berechnung bestimmte künstliche Kombinationen von Aminosäureresten erzeugt wurden, die in der Sequenz weit entfernt lokalisiert sind, aber in der dreidimensionalen Struktur miteinander Kontakte haben, was destabilisierte oder auch falsch gefaltete Gerüste zur Folge hat, wurden die 14 Konsensussequenzen auf ihre Struktureigenschaften analysiert.
Es wurde davon ausgegangen, daß alle in der Datenbank vorliegenden umgelagerten Sequenzen funktionellen und daher richtig gefalteten Antikörpermolekülen entsprechen. Daher wurde für jede Konsensussequenz die im höchsten Grade homologe umgelagerte Sequenz berechnet. Die Positionen, an welchen sich die Konsensussequenz von der umgelagerten Sequenz unterschied, wurden als mögliche "künstliche Reste" identifiziert und überprüft.
Die Überprüfung selbst wurde in zwei Richtungen durchgeführt. Erstens wurde der lokale Sequenzbereich um jeden möglichen "künstlichen Rest" herum mit dem entsprechenden Bereich aller umgelagerten Sequenzen verglichen. Falls für diesen Bereich festgestellt wurde, daß er wirklich künstlich ist, d. h. er nie in einer der umgelagerten Sequenzen vorkommt, wurde der kritische Rest in die am zweit häufigste Aminosäure umgewandelt, die an dieser Position gefunden wurde, und noch einmal analysiert. Zweitens wurden die möglichen "künstlichen Reste" auf ihre weitreichenden Interaktionen analysiert. Dies wurde dadurch bewirkt, daß alle verfügbaren Strukturen von variablen Domänen eines menschlichen Antikörpers aus den entsprechenden PDB-Dateien gesammelt und für jede Struktur die Zahl und die Art der Interaktionen, die jeder Aminosäurerest zu jeder Seitenkette herstellte, berechnet wurden. Diese "Interaktionskarten" wurden verwendet, um die wahrscheinlichen Seitenketten/Seitenketten-Interaktionen der möglichen "künstlichen Feste" zu analysieren. Als Ergebnis dieser Analyse wurden die folgenden Reste ausgetauscht (angegeben ist die Bezeichnung des Gens, die Position gemäß dem Kabat-Numerierungsschema, die an dieser Position als die am häufigsten vorkommende, festgestellte Aminosäure und die Aminosäure, die statt dessen verwendet wurde):
VH2: S&sub6;&sub5;T
Vκ1: N&sub3;&sub4;A,
Vκ3: G&sub9;A, D&sub5;&sub0;A, R&sub7;&sub7;S
Vλ3: V&sub7;&sub8;T

1.4 Konstruktion von CDR-Se uenzen

Das vorstehend beschriebene Verfahren stellte die vollständigen Konsensussequenzen bereit, die sich nur von den Datenbanken der umgelagerten Sequenzen ableiteten. Es wurde davon ausgegangen, daß die CDR1- und CDRQ-Regionen aus den Datenbanken verwendeter Keimbahnsequenzen entnommen werden sollten, da die CDRs umgelagerter und mutierter Sequenzen gegen ihre besonderen Antigene gerichtet sind. Außerdem ist von den Keimbahn-CDR-Sequenzen bekannt, daß sie die Bindung einer Vielzahl von Antigenen bei der primären Immunantwort ermöglichen, bei der nur CDR3 variiert wird. Daher wurden die aus den vorstehend beschriebenen Berechnungen erhaltenen Konsensus-CDRs im Fall von VH und Vκ durch Keimbahn-CDRs ersetzt. Im Fall von Vκ wurden einige wenige Aminosäureaustausche in einige der ausgewählten Keimbahn-CDRs eingeführt, um mögliche Protease-Schnittstellen sowie mögliche strukturelle Einschränkungen zu vermeiden.
Die CDRs folgender Keimbahngene wurden ausgewählt:
Im Fall der CDR3s konnte eine beliebige Sequenz ausgewählt werden, da vorgesehen war, daß diese CDRs als erstes durch Oligonucleotidbibliotheken ersetzt werden sollten. Um die Expression und das Faltungsverhalten der Konsensussequenzen in E. coli zu untersuchen, wäre es nützlich, wenn alle Sequenzen die gleiche CDR3 aufweisen, da der Einfluß der CDR3s auf das Faltungsverhalten dann in allen Fällen identisch wäre. Die Scheinsequenzen QQHYTTPP und ARWGGDGFYAMDY wurden für die VL-Ketten (Kappa und Lambda) bzw. für die VH-Keilen ausgewählt. Von diesen Sequenzen ist bekannt, daß sie mit der Antikörperfaltung in E. coli kompatibel sind (Carter et al., 1992).

1.5 Genkonstruktion

Das Endergebnis des vorstehend beschriebenen Verfahrens war eine Sammlung von 14 HuCAL-Aminosäuresequenzen, die den oft verwendeten strukturellen Antikörpervorrat des menschlichen Immunsystems wiedergeben (vgl. Fig. 2). Diese Sequenzen wurden in DNA-Sequenzen rückübersetzt. In einem ersten Schritt wurde die Rückübersetzung nur unter Verwendung von Codons durchgeführt, von denen bekannt ist, daß sie oft in E. coli verwendet werden. Diese Gensequenzen wurden dann zur Erstellung einer Datenbank aller möglichen Restriktionsendonucleasestellen verwendet, die eingeführt werden konnten, ohne die entsprechenden Aminosäuresequenzen zu verändern. Unter Verwendung dieser Datenbank wurden Schnittstellen ausgewählt, die in den umgebenden Bereichen aller Unterelemente der Gene (CDRs und Gerüstregionen) lokalisiert waren und die in alle HuCAL-VH-, -Vκ- oder -Vλ-Gene gleichzeitig an der gleichen Position eingeführt werden konnten. In einigen wenigen Fällen war es nicht möglich, Schnittstellen für alle Gene einer Untergruppe zu finden. Falls dies vorkam, wurde die Aminosäuresequenz, falls dies möglich war, entsprechend den verfügbaren Sequenz- und Strukturinformationen verändert. Dieser Austausch wurde dann noch einmal analysiert, wie vorstehend beschrieben. Insgesamt wurden die folgenden 6 Aminosäurereste während dieser Konstruktion ausgetauscht (angegeben ist die Bezeichnung des Gens, die Position gemäß dem Kabat-Numerierungsschema, die an dieser Position als die am häufigsten vorkommende, festgestellte Aminosäure und die Aminosäure, die statt dessen verwendet wurde):
VH2: T&sub3;Q
VH6: S&sub4;&sub2;G
Vκ3: E&sub1;D, I&sub5;&sub8;V
Vκ4: K&sub2;&sub4;R
Vλ3: T&sub2;&sub2;S
In einem Fall (5'-Ende von VH-Gerüst 3) war es nicht möglich, eine einzige Schnittstelle für alle 7 VH-Gene zu identifizieren. Statt dessen wurden zwei verschiedene Arten von Schnittstellen verwendet: BstEII für HuCAL-VH1A, -VHIB, -VH4 und -VH5 und NspV für HuCAL-VH2, -VH3, -VH4 und -VH6.
Mehrere Restriktionsendonucleasestellen wurden identifiziert, die nicht in den umgebenden Bereichen der Unterelemente lokalisiert waren, aber die in jedes Gen einer bestimmten Gruppe ohne Veränderung der Aminosäuresequenz eingeführt werden konnten. Diese Schnittstellen wurden auch eingeführt, um das System für weitere Verbesserungen flexibler zu machen. Schließlich wurden alle verbleibenden Restriktionsendonucleasestellen bis auf eine in jeder Gensequenz entfernt. Die einzige Schnittstelle, die nicht entfernt wurde, war in allen Genen einer Untergruppe verschieden und konnte daher als eine "Fingerabdruck"-Stelle verwendet werden, um die Identifizierung der verschiedenen Gene durch Restriktionsverdau zu erleichtern. Die konstruierten Gene zusammen mit den entsprechenden Aminosäuresequenzen und den gruppenspezifischen Restriktionsendonucleasestellen sind in Fig. 3, 4 bzw. 5 gezeigt.

1.6 Gensvnthese und Clonierung

Die Konsensusgene wurden unter Anwendung des von Prodromou & Pearl, 1992, beschriebenen Verfahrens unter Verwendung der in Fig. 6 gezeigten Oligonucleotide synthetisiert. Gensegmente, welche die menschlichen konstanten Domänen Cκ, Cλ und CH1 codieren, wurden basierend auf der von Kabat et al., 1991, angegebenen Sequenzinformation ebenfalls synthetisiert (vgl. Fig. 6 und Fig. 7). Da für die Gensegmente von sowohl CDR3 als auch von Gerüst 4 in allen HuCAL-Vκ-, -Vλ- bzw. -VH-Genen identische Sequenzen ausgewählt wurden, wurde dieser Teil zusammen mit den entsprechenden Gensegmenten, welche die konstanten Domänen codieren, nur eifmal konstruiert. Die PCR-Produkte wurden in pCR-Script KS(+) (Stratagene, Inc.) oder pZErO-1 (Invitrögen, Inc.) cloniert und durch Sequenzieren überprüft.

Beispiel 2: Clonieren und Testen einer Antikörperbibliothek auf HuCAL-Basis

Eine Kombination aus zwei der synthetischen Konsensusgene wurde nach der Konstruktion ausgewählt, um zu testen, ob bindende Antikörperfragmente aus einer Bibliothek isoliert werden können, die auf diesen zwei Konsensusgerüsten basiert. Die zwei Gene wurden als ein Einzelketten-Fv (scFv)-Fragment cloniert, und eine VH-CDR3-Bibliothek wurde inseriert. Um diese Bibliothek auf die Anwesenheit funktioneller Antikörpermoleküle zu testen, wurde ein Selektionsverfahren unter Verwendung des kleinen Haptens Fluorescein, gebunden an BSA (FITC-BSA), als Antigen durchgeführt.

2.1 Clonierung des HuCAL-VH3-Vκ2-scFv-Fragments

Um die Konstruktion der Konsensusgene zu überprüfen, wurde eine zufällig ausgewählte Kombination aus einem leichten und schweren synthetischen Gen (HuCAL-Vic2 und HuCAL-VH3) für die Konstruktion eines Einzelketten-Antikörper-(scFv)-Fragments verwendet. Kurz zusammengefaßt wurden die Gensegmente, die das VH3-Konsensusgen und das CH1-Gensegment einschließlich der CDR3-Gerüst 4-Region sowie das Vic2-Konsensusgen und das Cκ-Gensegment einschließlich der CDR3-Gerüst 4-Region codieren, zusammengesetzt, wobei das Gen für das VH3-CH1-Fd-Fragment bzw. das Gen, welches die leichte Kette Vic2-Cκ codiert, erhalten wurde. Das CH1-Gensegment wurde dann durch eine Oligonucleotidkassette ersetzt, die einen 20-mer-Peptidlinker mit der Sequenz AGGGSGGGG- SGGGGSGGGGS codiert. Die zwei diesen Linker codierenden Oligonucleotide waren:
Schließlich wurde das HuCAL-Vic2-Gen mit Hilfe von EcoRV und BsiWI in das Plasmid inseriert, welches die HuCAL-VH3-Linker-Fusion codiert, was zu dem endgültigen Gen HuCAL-VH3-Vκ2 führte, das die zwei Konsensussequenzer in dem Einzelkettenformat VH- Linker-VL codierte. Die vollständige codierende Sequenz ist in Fig. 8 gezeigt.

2.2 Konstruktion des monovalenten Phagen-Display-Phagemidvektors pIG10.3

Das Phagemid pIG10.3 (Fig. 9) wurde konstruiert, um ein Phagen-Display-System (Winter et al., 1994) für das H3κ2-scFv-Gen herzustellen. Kurz zusammengefaßt wurde das EcoRI/HindIII-Restriktionsfragment in dem Phagemidvektor pIGIO (Ge et al., 1995) durch c-myc, gefolgt von einem Amber-Codon (das einen Glutamatrest in dem Amber-Suppressorstamm XL1-Blue und ein Stoppcodon in dem Nicht-Suppressorstamm JM83 codiert) und einer verkürzten Ausführungsform des Gens III (Fusionsverbindungsstelle bei Codon 249, vgl. Lowman et al., 1991), durch PCR-Mutagenese ersetzt.

2.3 Konstruktion von H-CDR3-Bibliotheken

CDR3-Bibliotheken der schweren Kette mit zwei Längen (10 und 15 Aminosäuren) wurden unter Verwendung von Trinucleotid-Codons enthaltenden Oligonucleotiden (Virnekäs et al., 1994) als Matrize und den die umgebenden Bereiche komplementierenden Oligonucleotiden als Primer konstruiert. Um sich nur auf die CDR3-Strukturen zu konzentrieren, die in funktionellen Antikörpern am häufigsten vorkommen, behielten die Anmelder die Salzbrücke von RH94 und DHIO1 in der CDR3-Schleife bei. Für die 15-mer-Bibliothek wurden sowohl ein Phenylalaninrest als auch ein Methioninrest an Position 100 eingeführt, da für diese zwei Reste festgestellt wurde, daß sie sehr oft in menschlichen CDR3s dieser Länge vorkommen (nicht gezeigt). Aus dem gleichen Grund wurden ein Valinrest und ein Tyrosinrest an Position 102 eingeführt. Alle anderen zufälligen Positionen enthielten Codons für alle Aminosäuren, außer Cystein, das nicht in dem Trinucleotidgemisch verwendet wurde.
Die CDR3-Bibliotheken mit den Längen 10 und 15 wurden aus den PCR-Fragmenten unter Verwendung der Oligonucleotidmatrizen O3HCDR103T (5'-GATACGG- CCGTGTATTATTGCGCGCGT (TRI)6GATTATTGGGGCCAAGGCACCCTG-3') und O3HCDR153T (5'-GATACGGCCGT GTATTATTGCGC'GCGT(TRI)&sub1;&sub0;(TTT/ATG)GAT- (GTT/TAT)TGGGGCCAAGGCACCCTG-3') und der Primer O3HCDR35 (5'-GATACGG- CCGTGTATTATTGC-3') und O3HCDR33 (5'-CAGGGTGCCTTGGCCCC-3') hergestellt, worin TRI Trinucleotidgemische sind, die alle Aminosäuren ohne Cystein darstellen; (TTT/ATG) und (GTT/TAT) Trinucleotidgemische sind, welche die Aminosäuren Phenylalanin/Methionin bzw. Valin/Tyrosin codieren. Die potentielle Diversität dieser Bibliotheken betrug 4,7 · 10&sup7; und 3, 4 · 10&sup7; für die 10-mer- bzw. 15-rner-Bibliothek. Die Bibliothekskassetten wurden zuerst durch PCR-Amplifikatio.n der Oligomatrizen in Gegenwart beider Primer synthetisiert: 25 umol der Oligomatrize O3HCDR10 : 3T oder O3HCDR153T, 50 umol eines jeden der Primer O3HCDR35 und O3HCDR33, 20 nmol dNTPs, 10x Puffer und 2,5 Einheiten PFU-DNA-Polymerase (Stratagene) in einem Gesamtvolumen von 100 ul für 30 Zyklen (1 Minute bei 92ºC, 1 Minute bei 62ºC und 1 Minute bei 72ºC). Es wurde ein Heißstart-Verfahren angewendet. Die so erhaltenen Gennische wurden phenolextrahiert, ethanolgefällt und über Nacht mit EagI und StyI geschnitten. Der Vektor pIG10.3-scH3κ2cat, worin das EagI-StyI-Fragment in dem Vektor pIG10.3-scH3κ2, codierend die H-CDR3, durch das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen (cat), umgeben von diesen zwei Stellen, ersetzt worden war, wurde in ähnlicher Weise geschnitten. Der geschnittene Vektor (35 ug) wurde in einem Gel gereinigt und mit 100 ug der Bibliothekskassette über Nacht bei 16ºC ligiert. Die Ligierungsgemische wurden mit Isopropanol gefällt, luftgetrocknet, und die Pellets wurden in 100 ul ddH&sub2;O wieder gelöst. Die Ligierung wurde mit 1. ml frisch hergestellten, elektrokompetenten XL1-Blue-Zellen auf Eis gemischt. 20 Elektroporationsdurchgänge wurden durchgeführt, und die Transformanten wurden in SOC-Medium verdünnt, bei 37ºC 30 Minuten geschüttelt und auf große LB-Platten (Amp/Tet/Glucose) bei 37ºC 6-9 Std. ausplattiert. Die Zahl der Transformanten (Bibliotheksgröße) betrug 3,2 · 10&sup7; und 2,3 · 10&sup7; für die 10-mer- bzw. die 15-mer-Bibliothek. Die Kolonien wurden in 2x YT-Medium (Amp/Tet/Glucose) suspendiert und als Glycerinkultur aufbewahrt.
Um die Qualität der Ausgangsbibliothek zu überprüfen, wurden Phagemide von 24 unabhängigen Kolonien (12 von der 10-mer- bzw. 12 von der 15-mer-Bibliothek) isoliert und durch Restriktionsverdau und Sequenzierung analysiert. Die Restriktionsanalyse der 24 Phagemide zeigte in allen Fällen die Anwesenheit eines inlakten Vektors. Die Sequenzanalyse dieser Clone (Fig. 10) zeigte, daß 22 von 24 eine funktionelle Sequenz in ihren CDR3- Regionen der schweren Kette enthielten. 1 von 12 Clone der 10-mer-Bibliothek wies eine CDR3 mit einer Länge von 9 anstatt 10 auf, und 2 von 12 Clonen der 15-mer-Bibliothek wiesen kein offenes Leseraster auf, was ein nicht-funktionelles scFv zur Folge hatte; einer dieser zwei Clone enthielt zwei aufeinanderfolgende Insertionen, aber außerhalb des Rasters (Daten nicht gezeigt). Alle eingeführten Codons lagen in gleicher Verteilung vor.
Die Expressionsgrade einzelner Mitglieder der Bibliothek wurden ebenfalls gemessen. Kurz zusammengefaßt wurden 9 Clone aus jeder Bibliothek in 2x YT-Medium, enthaltend Amp/Tet/0,5% Glucose, bei 37ºC über Nacht gezüchtet. Am nächsten Tag wurden die Kulturen in frischem Medium mit Amp/Tet verdünnt. Bei einer OD6oonn, von 0,4 wurden die Kulturen mit 1 mM IPTG induziert und bei RT über Nacht geschüttelt. Dann wurden die Zellpellets in 1 ml PBS-Puffer + 1 mM EDTA suspendiert. Die Suspensionen wurden mit Ultraschall behandelt, und die Überstände wurden auf einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen getrennt, auf eine Nylonmembran geblottet und mit dem anti-FLAG M1-Antikörper nachgewiesen (vgl. Fig. 11). Von den 9 Clonen der 10-mer-Bibliothek exprimieren alle die scFv-Fragmente. Außerdem waren in allen Fällen die Gen IIIiscFv-Fusionsproteine vorhanden. Von den 9 analysierten Clonen der 15-mer-Bibliothek veranlaßten 6/9 (67%) die Expression von sowohl scFv als auch den Gen III/scFv-Fusionsproteinen. Noch wichtiger ist, daß alle Clone, welche die scFvs und die Gen III/scFv-Fusionen exprimierten, etwa den gleichen Expressiongrad hervorriefen.

2.4 Biopanning

Phagen, welche die Antikörperbibliotheken zeigen, wurden unter Verwendung von Standardprotokollen hergestellt. Von der 10-mer-Bibliothek stammende Phagen wurden mit Phagen aus der 15-mer-Bibliothek in einem Verhältnis von 20 : 1 (1 · 10¹&sup0; CFU/Vertiefung der 10-mer- bzw. 5 · 10 g CFU/Vertiefung der 15-mer-Phagen) gemischt. Anschließend wurde die Phagenlösung für das Panning in ELISA-Platten (Maxisorp, Nung), beschichtet mit FITC- BSA (Sigma) in einer Konzentration von 100 ug/ml in PBS, bei 4ºC über Nacht verwendet. Die antigenbeschichteten Vertiefungen wurden 3% Trockenmilchpulver in PBS blockiert, und die Phagenlösungen in 1% Trockenmilchpulver wurden zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platte wurde bei RT 1 Std. geschüttelt. Die Vertiefungen wurden dann mit PBST und PBS gewaschen (jeweils 4mal unter Schütteln bei RT für 5 Minuten). Die gebundenen Phagen wurden mit 0,1 M Triethylamin (TEA) bei RT 10 Minuten eluiert. Die eluierten Phagenlösungen wurden sofort mit 1/2 des Volumens mit 1 M Tris Cl, pH 7,6, neutralisiert. Eluierte Phagenlösungen (ca. 450 pl) wurden verwendet, um 5 ml XL1-Blue-Zellen bei 37ºC 30 min zu infizieren. Die infizierten Kulturen wurden dann auf großen LB-Platten (Amp/TetIGlucose) ausplattiert und bei 37ºC gezüchtet, bis die Kolonien sichtbar waren. Die Kolonien wurden in 2x YT-Medium suspendiert, und die Glycerinkulturen wurden hergestellt, wie vorstehend beschrieben. Dieser Panningdurchgang wurde zweimal wiederholt, und beim dritten Durchgang wurde eine Elution unter Zugabe von Fluorescein in einer Konzentration von 100 ug/ml in PBS durchgeführt. Die Anreicherung spezifischer Phagenantikörper wurde durch das Panning der Ausgangs- sowie der nachfolgenden Fluorescein-spezifischen Unterbibliotheken gegen den Blockierungspuffer überwacht (Fig. 12). Antikörper mit einer Spezifität gegen Fluoreseein wurden nach 3 Panningdurchgängenisoliert.

2.5 ELISA-Messungen

Eines der Kriterien für das erfolgreiche Biopanning ist die Isolierung einzelner Phagenclone, die an das Ziel-Antigen oder -Hapten bindlen. Die Anmelder nahmen die Isolierung von Anti-FITC-Phagenantikörper-Clonen vor und charakterisierten sie zuerst in einer Phagen-ELISA-Anordnung. Nach dem dritten Biopanningdurchgang (vgl. vorstehend) wurden 24 das Phagemid enthaltende Clone verwendet, um 100 ul 2x YT-Medium (Amp/Tet/Glucose) in einer ELISA-Platte (Nung) zu beimpfen, die anschließend bei 37ºC 5 Std. geschüttelt wurde. 100 ul 2x YT-Medium (Amp/Tetfl mM IPTG) wurden zugegeben, und das Schütteln wurde 30 Minuten fortgesetzt. Weitere 100 ul 2x YT-Medium (Amp/Tet), enthaltend den Helferphagen (1 · 10&sup9; CFU/Vertiefung), wurden zugegeben, und das Schütteln wurde bei RT 3 Std. durchgeführt. Nach Zugabe von Kanamycin, um auf eine erfolgreiche Helferphageninfektion zu selektieren, wurde das Schütteln über Nacht fortgesetzt. Die Platten wurden dann zentrifugiert, und die Überstände wurden direkt in ELISA-Vertiefungen pipettiert, die mit 100 ul FITC-BSA (100 ug/ml) beschichtet und mit Milchpulver blockiert worden waren. Das Waschen wurde in einer ähnlichen Weise durchgeführt, wie beim Panningverfahren, und die gebundenen Phagen wurden mit einem anti-M13-Antikörper-POD- Konjugat (Pharmacia) unter Verwendung von löslichem POD-Substrat (Boehringer- Mannheim) nachgewiesen. Von den auf FITC-BSA durehmusterten 24 Clonen waren 22 in dem ELISA aktiv (Fig. 13). Die Ausgangsbibliotheken mit einem ähnlichen Titer riefen kein nachweisbares Signal hervor.
Die Spezifität für Fluorescein wurde in einem kompetitiven ELISA gemessen. Periplasmafraktionen von 5 FITC-spezifischen scEvs wurden hergestellt, wie vorstehend beschrieben. Ein Western-Blot zeigte, daß alle Clone etwa die gleiche Menge des scFv- Fragments exprimierten (Daten nicht gezeigt). Der ELISA wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben, aber zusätzlich wurden die Periplasmafraktionen 30 min bei RT mit Puffer (keine Hemmung), mit 10 mg/ml BSA (Hemmung mit BSA) oder mit 10 mg/ml Fluorescein (Hemmung mit Fluorescein) vor der Zugabe zu der Vertiefung inkubiert. Das bindende scFv-Fragment wurde unter Verwendung des anti-FLAG-Antikörpers M1 nachgewiesen. Das ELISA-Signal konnte nur gehemmt werden, wenn lösliches Fluorescein zugegeben wurde, was zeigt, daß die Bindung der scFvs für Fluorescein spezifisch war (Fig. 14).

2.6 Sequenzanalyse

Die CDR3-Region der schweren Kette von 20 Clonen wurde sequenziert, um die Sequenzdiversität von Fluorescein-bindenden Antikörpern in der Bibliothek abzuschätzen (Fig. 15). Insgesamt waren 16 von 20 Sequenzen (80%) verschieden, was zeigt, daß die konstruierte Bibliothek einen hochgradig diversen Vorrat an Fluorescein-Bindemolekülen enthielt. Die CDR3s zeigten keine besondere Sequenzhomologie, aber enthielten im Durchschnitt 4 Argininreste. Diese Vorliebe für Arginin in Fluorescein-bindenden Antikörpern wurde bereits von Barbas et al., 1992, beschrieben.

2.7 Herstellung

E. coli JM83 wurde mit der Phagemid-DNA von 3 ausgewählten Clonen transformiert und in 0,5 l 2x YT-Medium gezüchtet. Die Induktion wurde mit 1 mM IPTG bei OD6ü0 nm = 0,4 durchgeführt, und die Züchtung wurde unter kräftigem Schütteln bei RT über Nacht fortgesetzt. Die Zellen wurden geerntet, und die Pellets wurden in PBS-Puffer suspendiert und mit Ultraschall behandelt. Die Überstände wurden von den Zelttrümmern mittels Zentrifugation getrennt und mit Hilfe des BioLogic-Systems (Bio-Rad) mit einer POROS® MC 20-Säule (IMAC, PerSeptive Biosystems, Inc.), gekoppelt mit einer Ionenaustauschchromatographiesäule, gereinigt. Die Ionenaustauschersäule war eine POROS - H5-, cm- oder HQ- oder PI-20-Säule (PerSeptive Biosystems, Inc.; , abhängig von dem theoretischen pl-Wert des gereinigten scFv. Der ph-Wert aller Puffer wurde durchweg auf einen Wert, der eine Einheit niedriger oder höher als der pl-Wert des gereinigten scFv war, eingestellt. Die Probe wurde auf die erste IMAC-Säule geladen, mit 7 Säulenvolumina 20 mM Natriumphosphat, 1 M NaCl und 10 mM Imidazol gewaschen. Diesem Waschschritt folgten 7 Säulenvolumina 20 mM Natriumphosphat und 10 mM Imidazol. Dann wurden 3 Säulenvolumina eines Imidazolgradienten (10 bis 250 mM) aufgetragen, und der Eluent wurde direkt an den Ionenaustauscher gebunden. 9 Säulenvolumina isokratischer Waschlösung mit 250 mM Imidazol folgten 15 Säulenvolumina von 250 mM bis 100 mM und 7 Säulenvolumina eines Imidazol/NaCl-Gradienten (100 bis 10 mM Imidazol, 3 bis 1 M NaCl). Die Durchflußrate betrug 5 ml/min. Die Reinheit der seFv-Fragmente wurde durch eine SDS-PAGE- Coomassie-Färbung überprüft (Fig. 16). Die Konzentration der Fragmente wurde aus der Absorption bei 280 nm unter Verwendung des theoretisch bestimmten Extinktionskoeffizienten (Gill & von Hippel, 1989) bestimmt. Die scFv-Fragmente konnten bis zur Homogenität gereinigt werden (vgl. Fig. 16). Der Ertrag der gereinigten Fragmente lag im Bereich von 5 bis 10 mg/l/OD.

Beispiel 3: HuCAL-H3K2-Bibliothek gegen eine Sammlung von Antigenen

Um die in Beispiel 2 verwendete Bibliothek weiter zu testen, wurde ein neues Selektionsverfahren unter Verwendung einer Vielzahl von Antigenen durchgeführt, umfassend β-Östradiol, Testosteron, Lewis-Y-Epitop (LeY), Interleukin-2 (IL-2), Lymphotoxin-β (LT-β), E-Selectin-Ligand-1 (ESL-1) und BSA.

3.1 Biopanning

Die Bibliothek und alle Verfahren stimmten mit den in Beispiel 2 beschriebenen überein. Die ELISA-Platten wurden mit β-Östradiol-BSA (100 ug/ml), Testosteron-BSA (100 ug/ml), LaY-BSA (20 ug/ml), IL-2 (20 ug/ml), ESL-1 (20 ug/ml) und BSA (100 ug/ml) sowie LT-β (denaturiertes Protein, 20 ug/ml) beschichtet. 1[n den ersten zwei Durchgängen wurden gebundene Phagen mit 0,1 M Triethylamin (TEA) bei RT 10 Minuten eluiert. Im Fall von BSA wurde die Elution nach drei Panningdurchgängen unter Zugabe von BSA in einer Konzentration von 100 ug/ml in PBS durchgeführt. Im Fall der anderen Antigene wurde ein dritter Elutionsdurchgang mit 0,1 M Triethylamin durchgeführt. In allen Fällen ausgenommen LeY konnte eine Anreicherung bindender Phagen beobachtet werden (Fig. 17). Außerdem führte eine Wiederholung des Biopanningexperiments unter alleiniger Verwendung der 15- mer-Bibliothek auch zur Anreicherung von LeY-bindenden Phagen (Daten nicht gezeigt).

3.2 ELISA-Messungen

An β-Östradiol, Testosteron, LeY, LT-β, ESL-1 und BSA bindende Clone wurden weiter analysiert und charakterisiert, wie in Beispiel 2 für FITC beschrieben wurde. ELISA- Daten für anti-β-Östradiol- und anti-ESL-1-Antikörper sind in Fig. 18 dargestellt. In einem Experiment wurden die Selektivität und Kreuzreaktivität von bindenden scFv-Fragmenten getestet. Zu diesem Zweck wurde eine ELISA-Platte mit FITC, Testosteron, β-Östradiol, BSA und ESL-1 in 5 Vertiefungen für jedes Antigen, angeordnet in 5 Reihen, beschichtet, und 5 Antikörper, einer gegen jedes der Antigene, wurden gegen jedes der Antigene durchmustert.
Fig. 19 zeigt die spezifische Bindung der Antikörper an das Antigen, für welches sie ausgewählt wurden, und die geringe Kreuzreaktivität mit den anderen vier Antigenen.

3.3 Sequenzanalyse

Die Sequenzierungsdaten mehrerer Clone gegen β-Östradiol (34 Clone), Testosteron (12 Clone), LT-β (23 Clone), ESL-1 (34 Clone) und BSA (10 Clone) sind in den Fig. 20 bis 24 angegeben.

Beispiel 4: Vektorkonstruktion

Um von der Modularität des Konsensusgenvorrats profitieren zu können, mußte ein Vektorsystem konstruiert werden, das bei der Phagen-Display-Durchmusterung von HuCAL- Bibliotheken und nachfolgenden Optimierungsverfahren verwendet werden konnte. Daher mußten alle notwendigen Vektorelemente wie Einzelstrang- oder Doppelstrang-Replikationsursprünge, Promotor/Operator, Repressor- oder Terminatorelemente, Resistenzgene, mögliche Rekombinationsstellen, Gen III zur Darstellung auf filamentösen Phagen, Signalsequenzen oder Nachweismarkermoleküle, mit dem Restriktionsstellenmuster der modularen Konsensusgene kompatibel gemacht werden. Fig. 25 zeig eine schematische Darstellung des pCAL- Vektorsystems und die Anordnung von Vektormodulen und Restriktionsstellen darin. Fig. 25a zeigt eine Liste aller Restriktionsstellen, die bereits in die Konsensusgene oder die Vektorelemente als Teil des modularen Systems eingeführt sind oder die in dem ganzen System noch nicht vorhanden sind. Die Letzteren könnten in einen späteren Stadium für die Einführung von neuen Modulen oder innerhalb neuer Module verwendet werden.

4.1 Vektormodule

Eine Reihe von Vektormodulen wurde konstruiert, worin die Restriktionsstellen, welche die Gen-Unterelemente der HuCAL-Gene umgeben, entfernt wurden, wobei die Vektormodule selbst von einmaligen Restriktionsstellen umgeben sind. Diese Module wurden entweder durch Gensynthese oder durch Mutagenese von Matrizen konstruiert. Die Mutagenese wurde durch eine Additions-PCR, ortsgerichtete Mutagenese (Kunkel et al., 1991) oder Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese an mehreren Stellen (Sutherland et al., 1995; Perlak, 1990) unter Anwendung eines Zusammenlagerungsverfahrens auf PCR-Basis durchgeführt.
Fig. 26 enthält eine Liste der konstruierten Module. Anstelle des Terminatormoduls M9 (HindIII-Ipp-PacI) wurde eine größere M9II-Kassette hergestellt, um FseI als zusätzliche Restriktionsstelle einzuführen. M9II kann über HindIII/BsrGI cloniert werden.
Alle Vektormodule wurden mittels Restriktionsanalyse und Sequenzierung charakterisiert. Im Fall von Modul M11-II ergab dle Sequenzierung des Moduls einen Zwei- Basen-Unterschied an den Positionen 164/65, verglichen mit der Sequenzdatenbank der Matrize. Diese zwei unterschiedlichen Basen (CA → GC) erzeugten eine zusätzliche Banil- Stelle. Da der gleiche Zwei-Basen-Unterschied im fl-Urspnrng anderer Bakteriophagen vorkommt, kann angenommen werden, daß der Zwei-Basen-Unterschied in der Matrize vorhanden war und nicht durch Mutagenese während des Clonierens hervorgerufen wurde. Diese Banil-Stelle wurde durch ortsgerichtete Mutagenese entfernt, was zu Modul M11-III führte. Die BssSI-Stelle von Modul M14 konnte anfangs nicht ohne Auswirkung auf die Funktion des ColE1-Ursprungs entfernt werden, daher wurde M14-Ext2 zur Clonierung der ersten pCAL-Vektorreihe verwendet. Die Fig. 29 bis 34 zeigen die funktionellen Karten und Sequenzen der Module, die zur Zusammenlagerung des modularen Vektors pCAL4 verwendet wurden (vgl. nachstehend). Die funktionellen Karten und Sequenzen zusätzlicher Module kann man in Fig. 35a finden. Fig. 35b enthält eine Liste von Oligonucleotiden und Primem, die für die Synthese der Module verwendet wurden.

4.2 Clonierungsvektor pMCS

Um die einzelnen Vektormodule zusammensetzen zu können, wurde der Clonierungsvektor pMCS konstruiert, der eine spezifische Multiclonierungsstelle (MSC) enthielt. Zuerst wurde eine MCS-Kassette (Fig. 27) mittels Gensvnthese hergestellt. Diese Kassette enthält alle Restriktionsstellen in der Reihenfolge, die für die folgende Einführung aller Vektormodule erforderlich ist, und kann über die 5'-HindIII-Stelle und ein überhängendes Ende von 4 Basen am 3'-Ende, das mit einer AatII-Stelle verträglich ist, cloniert werden. Der Vektor pMCS (Fig. 28) wurde durch Schneiden von pUC19 mit AatII und HindIII, Isolieren des 2174 Basenpaare großen Fragments, enthaltend das bla-Gen und den CoIE1-Ursprung, und Ligieren der MCS-Kassette konstruiert.

4.3 Clonierung des modularen Vektors pCAL4

Dieser wurde schrittweise durch den Restriktionsverdau von pMCS und die anschließende Ligierung der Module M1 (über AatII/XbaI), M7III (über EcoRI/HindIII) und M9II (über HindIII/BsrGI) und M11-11 (über BrsGIINheI) eloniert. Schließlich wurden das bla-Gen durch das cat-Gen-Modul M17 (über AatII/BglII) und der Wildtyp-ColEl-Ursprung durch Modul M14-Ext2 (über BgIII/NheI) ersetzt. Fig. 35 zeigt die funktionelle Karte und die Sequenz von pCAL4.

4.4 Clonierung der Plasmidvektoren pCALO mit niedriger Kopienzahl

Eine Reihe von Plasmidvektoren mit niedriger Kopienzahl wurde in ähnlicher Weise unter Verwendung des plSA-Moduls M12 anstelle des CoIE1-Moduls M14-Ext2 konstruiert. Fig. 35a zeigt die funktionellen Karten und Sequenzen der Vektoren pCALO1 bis pCALO3.

Beispiel 5: Konstruktion einer HuCAL scFv-Bibliothek

5.1 Clonierung aller 49 HuCAL-scFv-Fragmente

Alle 49 Kombinationen der 7 HuCAL-VH- und der 7 HuCAL-VL-Konsensusgene wurden zusammengefügt, wie es für das HuCAL-VH3-Vκ2-seFv in Beispiel 2 beschrieben wurde, und in den Vektor pBS12, eine modifizierte Ausführungsform der pLisc-Reihe von Antikörper-Expressionsvektoren (Skerra et al., 1991), inseriert.

5.2 Konstruktion einer CDR-Clonierungskassette

Zum Austausch von CDRs wurde eine universelle β-Lactamase-Clonierungskassette mit einer Multiclonierungsstelle am 5'-Ende sowie am 3'-Ende konstruiert. Die 5'-Multiclonierungsstelle umfaßt alle Restriktionsstellen, die an das 5'-Ende der HuCAL-VH- und VL-CDRs angrenzen; die 3'-Multiclonierungsstelle umfaßt alle Restriktionsstellen, die an das 3'-Ende der HuCAL-VH- und VL-CDRs angrenzen. Sowohl die 5'- als auch die 3'-Multiclonierungsstelle wurden als Kassetten mit Hilfe der Additions-PCR unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide als 5'- und 3'-Primer unter Verwendung des Wildtyp-β-Lactamase- Gens als Matrize hergestellt. Fig. 36 zeigt die funktionelle Karte und die Sequenz der Kassette bla-MCS.

5.3 Herstellung von VL-CDR3-Bibliothekskassetten

Die VL-CDR3-Bibliotheken, umfassend 7 Zufallspositionen, wurden aus den PCR- Fragmenten unter Verwendung der Oligonucleotidmatrizen Vκ1&Vκ3, Vκ2 und Vκ4 und der Primer O_K3L_5 und O_K3L_3 (Fig. 37) für die Vκ-Gene und Vλ und der Primer O_L3L_3 (5'-GCAGAAGGCGAACGTCC-3') und O_L3LA_3 (Fig. 38) für die Vλ-Gene hergestellt. Die Konstruktion der Kassetten wurde durchgeführt wie es in Beispiel 2.3 beschrieben wurde.

5.4 Clonierung von HuCAL-scFv-Genen mit VL-ODR3-Bibliotheken

Jede der 49 Einzelketten wurde in pCAL4 über XbaIJEcoRI subcloniert, und die VL-CDR3 wurde durch die β-Lactamase-Clonierungskassette mit Hilfe von BbsIIMscI ersetzt, welche dann durch die entsprechende VL-CDR3-Bibliothekskassette ersetzt wurde, die synthetisiert wurde, wie vorstehend beschrieben. Dieser CDR-Austausch ist in Beispiel 2.3 ausführlich beschrieben, wo das cat-Gen verwendet wurde.

5.5 Herstelluns einer VH-CDR3-Bibliothekskassette

Die VH-CDR3-Bibliotheken wurden, wie in Beispiel 2.3 beschrieben, konstruiert und synthetisiert.

5.6 Clonierung von HuCAL-scFv-Genen mit VL- und VH-CDR3-Bibliotheken

Jede der 49 Einzelkevten-VL-CDR3-Bibliotheken wurde mit BssHII/StyI geschnitten, um VH-CDR3 zu ersetzen. Die mit BssHII/StyI geschnittene "Schein-" Kassette wurde inseriert und dann durch eine entsprechende VH-CDR3-Bibliothekskassette ersetzt, die synthetisiert wurde, wie vorstehend beschrieben.

Beispiel 6: Expressionstests

Expressions- und Toxizitätsstudien wurden unter Verwendung des scFv-Konstrukts VH-Linker-VL durchgeführt. Alle 49 Kombinationen der 7 HuCAL-VH- und der 7 HuCAL- VL-Konsensusgene, zusammengefügt wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden in den Vektor pBS13, eine modifizierte Ausführungsform der pLisc-Reihe von Antikörper-Expressionsvektoren (Skerra et al., 1991), inseriert. Eine Karte dieses Vektors ist in Fig. 39 gezeigt.
E. coli JM83 wurde mit jedem der Vektoren 49ma1 transformiert und als Glycerin- Stammlösung aufbewahrt. Zwischen 4 und 6 Clone wurden gleichzeitig getestet, immer einschließlich des Clons H3κ2, der überall als interne Kontrolle verwendet wurde. Als zusätzliche Kontrolle wurde das McPC603-scFv-Fragment (Knappik & Plückthun, 1995) in pBS13 unter identischen Bedingungen exprimiert. Zwei Tage vor Durchführung des Expressionstests wurden die Clone auf LB-Platten, enthaltend 30 ug/ml Chloramphenicol und 60 mM Glucose, gezüchtet. Unter Verwendung dieser Platten wurde eine 3 ml-Kultur (LB- Medium, enthaltend 90 ug/ml Chloramphenicol und 60 mM Glucose) über Nacht bei 37ºC beimpft. Am nächsten Tag wurde die Übernachtkultur vervwendet, um 30 ml LB-Medium, enthaltend Chloramphenicol (30 ug/ml), zu beimpfen. Die Ausgangs-OD600nm wurde auf 0,2 eingestellt, und es wurde eine Züchtungstemperatur von 30ºC verwendet. Die Physiologie der Zellen wurde dadurch überwacht, daß die optische Dichte bei 600 nm alle 30 Minuten für 8 bis 9 Stunden gemessen wurde. Nachdem die Kultur eine OD600nm von 0,5 erreichte, wurde die Antikörperexpression durch Zugabe von IPT6 bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert. Ein 5 ml-Aliquot der Kultur wurde nach 2-stündiger Induktion entnommen, um die Antikörperexpression zu analysieren. Die Zellen wurden lysiert, und die löslichen und unlöslichen Fraktionen des Rohextrakts wurden getrennt, wie bei Knappik & Plückthun, 1995, beschrieben ist. Die Fraktionen wurden durch eine reduzierende SDS-PAGE getestet, wobei die Proben auf identische optische Dichten normalisiert wurden. Nach Blotten und Immunfärbung unter Verwendung des oc-FLAG-Antikörpers M1 als ersten Antikörper (vgl. Ge et al., 1994) und eines Fc-spezifischen Anti-Maus-Antiserums, konjugiert an alkalische Phosphatase, als zweiten Antikörper wurden die Bahnen abgesucht, und die Intensitäten der Banden mit der erwarteten Größe (etwa 30 kDa) wurden densitometrisch quantifiziert und im Verhältnis zu dem Kontrollantikörper tabellarisiert (vgl. Fig. 40).

Beispiel 7: Optimierung von Fluorescein-Bindemolekülen

7.1 Konstruktion von L-CDR3- und H-CDR2-Bibliothekskassetten

Eine L-CDR3-Bibliothekskassette wurde aus der Oligonucleotidmatrize CDR3L (5'-TGGAAGCTGAAGACGTGGGCGTGTATTATTGCCA GCAG(TR5)(TRI)&sub4;CCG(TRI)- TTTGGCCAGGGTACGAAAGTT-3') und dem Primer 5'-AACTTTCGTACCCTGGCC-3' für die Synthese des Komplementärstrangs hergestellt, wobei (TRI) ein Trinucleotidgemisch war, das alle Aminosäuren ausgenommen Cys repräsentierte, und (TR5) ein Trinucleotidgemisch umfaßte, das die 5 Codons für Ala, Arg, His, Ser und Tyr repräsentierte.
Eine H-CDR2-Bibliothekskassette wurde aus der Oligonucleotidmatrize CDRsH (5'-AGGGTCTCGAGTGGGTGAGC(TRI)ATT(TRI)2 3(6)2(TRI)ACC(TRI)TATGCGGAT- AGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCA-3' und dem Primer 5'-TGGTGTTTTTCGAATTATCA-3' für die Synthese des Komplementärstrangs hergestellt, wobei (TRI) ein Trinucleotidgemisch war, welches alle Aminosäuren ausgenommen Cys repräsentierte, (6) den Einbau von (A/G)(A/C/G)T umfaßte, was in der Bildung von 6 Codons für Ala, Asn, Asp, Gly, Ser und Thr resultierte, und die Längenverteilung durch Durchführung einer substöchiometrischen Kopplung des (TRI)-Gemisches während der Synthese erhalten wurde, wobei der Verkappungsschritt ausspart wurde, der normalerweise bei der DNA-Synthese verwendet wird.
Die DNA-Synthese wurde in einem Maßstab von 40 nmo1 durchgeführt, die Oligos wurden in TE-Puffer gelöst, mittels Gelfiltration unter Verwendung von Zentrifugensäulen (S-200) gereinigt, und die DNA-Konzentration wurde durch eine OD-Messung bei 260 nm (OD 1,0 = 40 ug/ml) bestimmt.
10 nmol der Oligonucleotidmatrizen und 12 nmol der entsprechenden Primer wurden gemischt und bei 80ºC 1 min aneinandergelagert und innerhalb von 20 bis 30 min langsam auf 37ºC abgekühlt. Die Auffüllreaktion wurde 2 h bei 37ºC unter Verwendung der Klenow-Polymerase (2,0 ul) und 250 nmol jedes dNTP's durchgeführt. Der Überschuß an dNTPs wurde durch Gelfiltration unter Verwendung von Nick-Spin-Säulen (Pharmacia) entfernt, und die doppelsträngige DNA wurde mit BbsI/MscI (L-CDR3) oder XhoJISfuI (H-CDR2) über Nacht bei 37ºC geschnitten. Die Kassetten wurden über Nick-Spin-Säulen (Pharmacia) gereinigt, die Konzentration wurde mittels OD-Messung bestimmt, und die Kassetten wurden vor der Lagerung bei -80ºC allquotiert (15 umol).

7.2 Clonierung der Bibliothek

Die DNA wurde aus der in Beispiel 2 erhaltenen Sammlung von FITC-bindenden Clonen (etwa 10&sup4; Clone) präpariert. Die Sammlung von scFv-Fragmenten wurde mittels XbaI/EcoRI-Verdau isoliert. Der in Beispiel 4.3 beschriebene Vektor pCAL4 (100 fmol, 10 ug) wurde in ähnlicher Weise mit XbaI/EcoRI geschnitten, in einem Gel gereinigt und mit 300 fmol der scFv-Fragmentsammlung über Nacht bei 16ºC ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde mit Isopropanol gefällt, luftgetrocknet, und die Pellets wurden in 100 ul ddH&sub2;O wieder gelöst. Das Ligierungsgemisch wurde mit 1 ml frisch hergestellten, elektrokompetenten SCS 101-Zellen (zur Optimierung von L-CDR3) oder XL1-Blue-Zellen (zur Optimierung von H-CDR2) auf Eis gemischt. Ein Elektroporationsdurchgang wurde durchgeführt, und die Transformanten wurden in SOC-Medium eluiert, bei 370C 30 Minuten geschüttelt, und ein Aliquot wurde auf LB-Platten (Amp/Tetlülucose) bei 37ºC 6-9 Std. ausplattiert. Die Zahl der Transformanten betrug 5 · 10&sup4;.
Die Vektor-DNA (100 ug) wurde isoliert und mit BbsI/MscI zur Optimierung von L-CDR3 oder XhoI/NspV zur Optimierung von H-CDR2 geschnitten (für die Sequenz und die Restriktionskarte von scH3κ2 vgl. Fig. 8). 10 ug gereinigte Vektorfragmente (5 umol) wurden mit 15 umol der L-CDR3- oder H-CDR2-Bibliothekskassetten über Nacht bei 16ºC ligiert. Die Ligierungsgemische wurden mit Isopropanol gefällt, luftgetrocknet und die Pellets wurden in 100 ul ddH&sub2;O wieder gelöst. Die Ligierungsgemische wurden mit 1 ml frisch hergestellten, elektrokompetenten XL1-Blue-Zellen- auf Eis gemischt. Eine Elektroporation wurde durchgeführt, und die Transformanten wurden in SOC-Medium eluiert und bei 37ºC 30 Minuten geschüttelt. Ein Aliquot wurde auf LB-Platten (Amp/Tet/Glucose) bei 37ºC 6-9 Std. ausplattiert. Die Zahl der Transformanten (Bibliotheksgröße) war für beide Bibliotheken größer als 10&sup8;. Die Bibliotheken wurden als Glycerinkulturen aufbewahrt.

7.3 Biopanning

Dieses wurde durchgeführt, wie in Beispiel 2.1 für die anfängliche H3κ2-H-CDR3- Bibliothek beschrieben wurde. An FITC bindende, optimierte scFvs könnten charakterisiert und analysiert werden, wie in Beispiel 2.2 und 2.3 beschrieben wurde, und weitere Optimierungsdurchgänge könnten gegebenenfalls durchgeführt werden.
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Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer oder mehrerer Nucleinsäuresequenzen, die eine oder mehrere immunglobulinsequenzen codieren, welche zur Herstellung von Bibliotheken von Immunglobulinen oder I = v, Disulfid-verbundenem Fv, Einzelketten Fv (scFv) oder deren Fab-Fragmenten geeignet sind, wobei diese Immunglobulinsequenzen Aminosäure-Konsensussequenzen umfassen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Erstellen einer Datenbank durch Anorclnung einer Sammlung von mindestens drei humanen VH oder VL Sequenzen, die Untergruppen der Immunglobuline definieren, welche einen hohen Grad an Ähnlichkeit in der Sequenz und in der strukturellen Anordnung zeigen, Ableitung einer Immunglobulinsequenz für jede dieser Untergruppen, umfassend mindestens eine Aminosäure-Konsensussequenz, wobei diese Konsensussequenz die Aminosäuren umfaßt, die am häufigsten an jeder Position vorliegen;

(b) Identifizierung mindestens eines strukturellen Unterelements innerhalb jeder der Immunglobulinsequenzen, wobei die strukturellen Unterelemente den Gerüstregionen 1, 2, 3 oder 4 oder den komplementaritätsbestimmenden Regionen 1, 2 oder 3 entsprechen;

(c) Rückübersetzung jeder der Immunglobulinsequenzen in eine entsprechende codierende Nucleinsäuresequenz;

(d) Einrichten von DNA-Schnittstellen in Bereichen, die an die Untersequenzen, die die Unterelemente codieren, angrenzen oder zwischen diesen liegen, wobei jede dieser Schnittstellen:

(da) einmalig innerhalb jeder dieser codierenden Nucleinsäuresequenzen ist;

(db) den entsprechenden Untersequenzen einer jeder dieser codierenden Nucleinsäuren gemeinsam ist;

wodurch eine vollständig modulare Anordnung der Untersequenzen in den Nucleinsäuresequenzen erzeugt wird; und

(e) Synthetisieren der codierenden Nucleinsäuresequenzen, wobei die codierenden Nucleinsäuresequenzen aus der Liste der Konsensusgene der humanen kombinatorischen Antikörperbibliothek (HuCAL) genommen werden:

Vκ1 (SEQ ID NO: 42), Vic2 (SEQ ID NO: 44), Vκ3 (SEQ ID NO: 46), Vκ4 (SEQ ID NO: 48), Vλ1 (SEQ ID NO: 50), Vλ2 (SEQ ID NO: 52), Vλ3 (SEQ ID NO: 54), VH1A (SEQ ID NO: 56), VH1B (SEC ID NO: 58), VH2 (SEQ ID NO: 60), VH3 (SEQ ID NO: 62), VH4 (SEQ ID NO: 64), VH5 (SEQ ID NO: 66), VH6 (SEQ ID NO: 68).

2. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner zwischen den Schritten (a) und (b) den Schritt umfaßt:

(a) Identifizierung von Aminosäuren in den Immunglobulinsequenzen, die modifiziert werden sollen, um ungünstige Interaktionen zu entfernen, die verhindern, daß das entstehende Molekül eine funktionelle Tertiärstruktur zwischen Aminosäuren innerhalb oder zwischen diesem oder anderen Immunglobulinsequenzen annimmt, welches entweder erreicht wird durch

(i) Erstellung eines dreidimensionalen Modells der Konsensussequenz durch Verwendung bekannter verwandter Strukturen als Matrize und Identifizierung von Aminosäureresten innerhalb des Modells, die ungünstig miteinander interagieren könnten; oder

(ii) Analysieren der Matrix angeordneter Aminosäuresequenzen, um Kombinationen von Aminosäureresten innerhalb der Sequenzen zu detektieren, die häufig zusammen in einer Sequenz vorkommen und deshalb wahrscheinlich miteinander interagieren; dann

(iii) Tabellarisieren dieser wahrscheinlichen Interaktionspaare und Vergleichen des Konsensus mit diesen Interaktionskarten; und

(iv) entsprechendes Ausbessern von fehlenden oder falschen Interaktionen in dem Konsensus durch Einführung geeigneter Austausche von Aminosäuren, die diese unvorteilhaften Interaktionen minimieren.

3. Verfahren zur Herstellung von zwei oder mehreren Sätzen von einer oder mehreren Nucleinsäuresequenzen, umfassend das Ausführen der Schritte beschrieben in Anspruch 1 oder 2 für jeden dieser Sätze mit der zusätzlichen Maßgabe, daß die Schnittstellen für die Sätze einmalig sind und mindestens zwei von diesen Sätzen von der gleichen Sammlung von mindestens drei homologen Immunglobulinen abgeleitet sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, ferner umfassend das Clonieren der codierenden Nucleinsäuresequenzen in einen Vektor.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei aus dem Entfernen der ungünstigen Interaktionen eine erhöhte Expression der Immunglobuline resultiert.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, ferner umfassend die Schritte:

(f) Schneiden von mindestens zwei der Schnittstellen, die in benachbarten Regionen zu den Untersequenzen oder zwischen den Untersequenzen lokalisiert sind; und

(g) Austausch der Untersequenzen durch verschiedene Sequenzen, welche

(i) genomische Sequenzen von Immunglobulinen sind;

(ii) rearrangierte genomische Sequenzen von Immunglobulinen sind;

(iii) zufällige Sammlungen von Untersequenzen sind; oder

(iv) CDRs sind; und

(h) gegebenenfalls, ein- oder mehrmaliges UUiederholen der Schritte (f) und (g).

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ferner umfassend die Expression der codierenden Nucleinsäuresequenzen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, ferner umfassend die Schritte:

(i) nach der Expression, Durchmustern der resultierenden Immunglobuline nach einer gewünschten Eigenschaft;

(k) gegebenenfalls, ein- oder mehrmaliges Wiederholen der Schritte (f) bis (i) mit Nucleinsäuresequenzen, die ein oder mehrere Immunglobuline codieren, die in Schritt (i) erhalten wurden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die gewünschte Eigenschaft ausgewählt ist aus der Gruppe von optimierter Affinität oder Spezifität für ein Zielmolekül, optimierter Enzymaktivität, optimiertem Expressionsertrag, optimierter Stabilität und optimierter Löslichkeit.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Schnittstellen Stellen sind, die durch Restriktionsenzyme geschnitten werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Nucleinsäure DNA ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Fragment ein scFv Fragment ist, umfassend die Kombination von HuCAL VH&sub3; und HuCAL Vκ2 Konsensusgenen, welches eine Zufallsuntersequenz umfaßt, clie das Unterelement CDR3 der schweren Kette codiert.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Immunglobulinsequenzen oder immunglobuline verbunden sind mit einer Sequenz, die mindestens einen weiteren Teil codiert, bzw. mit mindestens einem weiteren Teil, wobei der weitere Teil ein Toxin, ein Cytokin, ein Reporterenzym, ein Teil der in der Lage ist, ein Metall-Ion zu binden, ein Peptid, ein Tag geeignet zur Detektion und/oder Reinigung, oder eine Horno- oder Hetero-Assoziationsdomäne ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Verbindung durch eine durchgehende Nucleinsäuresequenz bzw. Aminosäuresequenz gebildet wird.

15. Nucleinsäuresequenz, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14.

16. Sammlung von Nucleinsäuresequenzen, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14.

17. (Poly)peptid, codiert durch die Nucleinsäuresequenz, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 bis 11 und 13 bis 14.

18. Sammlung von (Poly)peptiden, codiert durch die Sammlung von Nucleinsäuresequenzen, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 bis 11 und 13 bis 14.