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CN102176914B - 用于诊断和治疗癌症的vhz - Google Patents

用于诊断和治疗癌症的vhz Download PDF

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Abstract

本发明提供了供在个体中治疗、预防或减轻癌症的方法中使用的VHZ，所述癌症选自下组：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。本发明提供了用于治疗、预防或减轻此类癌症的抗VHZ剂。所述抗VHZ剂可以包含SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5。

Description

用于诊断和治疗癌症的VHZ
发明领域
本发明涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本发明涉及医学领域。
具体而言，它涉及疾病诸如结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴(vulva)、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌的治疗和诊断，以及用于此类用途的组合物。
发明背景
VHZ是与人PRL-PTP共享约28％的氨基酸序列同一性的磷酸酶。先前报告了，VHZ在许多组织中表达，并且位于胞质溶胶和核仁中(Alonso等，2004a)。
然而，VHZ的作用很大程度上是未知的；尽管它与蛙、鱼、苍蝇、和古细菌(Archaea)中的直向同系物(orthologue)在进化过程中是保守的。VHZ以及VHR属于VH1样PTP的不同亚组(Alonso等，2004b)。已经报告了，VHR具有调控细胞周期行进的功能(Rahmouni等，2006)。
癌症是整个世界的一项严重的健康问题。估计在2007年，世界上有760万人死于癌症。例如在英国，癌症每年造成126,000例死亡。四人中有一人死于癌症。已知的癌症治疗包括手术、化学疗法和放射疗法。若足够早地检出，则许多癌症可以治愈。
需要改良的癌症检测和治疗。
发明概述
依照本发明的第一方面，我们提供了供在个体中治疗、预防或减轻癌症的方法中使用的VHZ，所述癌症选自下组：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。
依照本发明的第二方面，提供了用于治疗、预防或减轻选自下组的癌症的抗VHZ剂：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌，优选地，其中所述抗VHZ剂能够下调以GenBank登录号NM_017823或NP_060293显示的VHZ序列或者与该序列具有至少90％序列同一性的序列的表达、量或活性的任意组合，所述抗VHZ剂优选包括抗VHZ抗体，诸如针对与人VHZ的氨基酸残基(126-140)对应的RRLRPGSIETYEQEK生成的抗肽抗体，诸如鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号LS-C32281，氨基酸35至90，LS-C42458，LS-A6806和LS-A6803，LS-C32281，LifeSpan Inc，Seattle，Washington，USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号DS-PB-00676，RayBiotech Inc，Norcross，Georgia，USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号XW-7857，ProSci Incorporated，Poway，California，USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号F4560和D9840-66A，United StatesBiological，Swampscott，Massachusetts，USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号D9840-66，United States Biological，Swampscott，Massachusetts，USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号AHP1142，AdB Serotec，Oxford，UnitedKingdom)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号NB110-40452，NovusBiologicals，Littleton，Colorado，USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号NB100-75328，Novus Biologicals，Littleton，Colorado，USA)，或者所述抗VHZ剂能够通过RNA干扰来下调VHZ，诸如包括小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、或嵌合RNAi诸如DUSP23预先设计嵌合RNAi(产品目录编号H00054935-R01，Novus Biologicals，Littleton，Colorado，USA)。
依照本发明的第三方面，我们提供了一种用于检测个体中的选自下组的癌症或个体对此类癌症的易感性的试剂盒：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌，所述试剂盒包含用于检测所述个体或自他或她采集的样品中的VHZ表达的手段，优选地，其中所述用于检测的手段选自下组：VHZ多核苷酸或其片段；与VHZ核酸互补的核苷酸序列或其片段；VHZ多肽或其片段，或依照权利要求2的抗VHZ抗体或抗VHZ剂，和任选地，使用说明书，优选地，其进一步包含用于治疗、预防或减轻所述癌症的治疗药物。
作为本发明的第四方面，提供了选自下组的方法：(a)检测选自下组的癌细胞的方法：结肠癌细胞，肺癌细胞，鳞状细胞癌细胞包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌细胞，脑癌细胞，食管癌细胞，胃癌细胞，膀胱癌细胞，肾癌细胞，皮肤癌细胞，卵巢癌细胞，前列腺癌细胞和睾丸癌细胞，所述方法包括检测所述细胞中VHZ的表达、量或活性的调控(优选上调)，优选地，其中比较所述VHZ表达与已知为非癌性的对照细胞中的VHZ的表达、量或活性；(b)依照上述(a)的方法，其中所述方法包括检测VHZ核酸，诸如依靠包含如下核酸的至少一部分的探针，所述核酸具有以GenBank登录号NM_017823或NP_060293显示的序列或与此序列具有至少90％序列同一性的序列，或者其中所述方法包括检测VHZ多肽，诸如依靠权利要求2中所列的抗VHZ抗体，且优选地包括组织学分级，诸如通过使用Elston-Ellis改良的Scarff，Bloom，Richardson分级系统(Nottingham分级系统(NGS))；(c)测定选自下组的癌细胞的增殖状态或者测定所述癌细胞会变为侵入性或攻击性的可能性的方法：结肠癌细胞，肺癌细胞，鳞状细胞癌细胞包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌细胞，脑癌细胞，食管癌细胞，胃癌细胞，膀胱癌细胞，肾癌细胞，皮肤癌细胞，卵巢癌细胞，前列腺癌细胞和睾丸癌细胞，该方法包括检测所述细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控；(d)预测患有选自下组的癌症的个体的存活率的方法：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌，该方法包括检测所述个体的细胞中的VHZ表达调控；(e)为患有选自下组的癌症的个体选择疗法的方法：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌，所述方法包括检测所述个体的细胞中的VHZ表达调控，基于所述癌症的攻击性来选择合适的疗法，诸如抗VHZ剂；(f)测定特定疗法在患有选自下组的癌症的个体中成功的可能性的方法：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌，所述方法包括比较所述疗法与通过依照上述(e)的方法确定的疗法；和(g)依照上述(a)至(f)中任一项的方法，进一步包括依照本发明的第一、第二或第三方面中任一项中所列的特征。
依照本发明的第五方面，我们提供了一种操作结肠癌细胞，肺癌细胞，鳞状细胞癌细胞包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌细胞，脑癌细胞，食管癌细胞，胃癌细胞，膀胱癌细胞，肾癌细胞，皮肤癌细胞，卵巢癌细胞，前列腺癌细胞和睾丸癌细胞的方法：(a)所述方法包括调控(优选下调)所述细胞中的VHZ表达、量或活性，例如通过将所述细胞暴露于能够特异性结合VHZ的siRNA、shRNA或嵌合RNAi，或者通过将所述细胞暴露于权利要求2中所列的抗VHZ抗体来进行，优选地，由于所述操作使得所述癌细胞变为非癌性的或者所述侵入性或转移性癌细胞变为非侵入性的或非转移性的；或(b)所述方法包括下列步骤：(a)检测细胞中升高的VHZ表达、量或活性；并(b)降低所述细胞中的VHZ水平。
在第六方面，本发明提供了一种选自下组的方法：(a)鉴定能够结合VHZ多肽的分子的方法，该方法包括使VHZ多肽或与其具有至少90％序列同一性的序列与候选分子接触，并测定所述候选分子是否结合所述VHZ多肽或与其具有至少90％序列同一性的序列；(b)鉴定VHZ调控物的方法，该方法包括使细胞与候选分子接触，并检测所述细胞中的或所述细胞的升高或降低的VHZ的表达、量或活性；(c)鉴定适合于治疗、预防或减轻选自下组的癌症的分子的方法：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌，该方法包括测定候选分子是否是VHZ的或与其具有至少90％序列同一性的序列的激动剂或拮抗剂，优选地，通过将候选分子暴露于VHZ多肽或表达VHZ多肽的细胞，以便测定所述候选分子是否是其激动剂或拮抗剂来进行；和(d)鉴定VHZ的或与其具有至少90％序列同一性的序列的激动剂或拮抗剂的方法，该方法包括向动物施用候选分子，并测定所述动物是否展现出升高或降低的VHZ的表达、量或活性。
在本发明的第七方面，提供了通过如上文所列的方法或用途鉴定的VHZ多肽的分子、激动剂或拮抗剂。
依照本发明的第八方面，我们提供了供在治疗、预防或减轻癌症中使用的分子，其能够调控诸如下调VHZ的表达，诸如针对与人VHZ的氨基酸残基(126-140)对应的RRLRPGSIETYEQEK生成的抗肽抗体。
依照本发明的第九方面，我们提供了能够结合VHZ多肽的抗体或其变体、同系物、衍生物或片段，其中所述抗体能够结合由抗体209结合的表位，其中优选地，所述抗体：(a)能够结合VHZ多肽上由抗体209结合的表位；(b)包括能够结合如下表位的抗VHZ抗体、或其变体、同系物、衍生物或片段，所述表位是包含VHZ的残基C95的序列；(c)包含单克隆抗体209的可变区，或其能够结合VHZ的变体、同系物、衍生物或片段；(d)能够结合胞内VHZ多肽；(e)能够穿过细胞的质膜；(f)能够结合VHZ，并抑制VHZ的生物学活性；(g)能够阻止癌症诸如结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌的转移；或(h)包括单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
依照本发明的第十方面，提供了包含选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的序列的多肽，或其能够结合VHZ的变体、同系物、衍生物或片段。
作为本发明的第十一方面，我们提供了包含能够编码如上文所列的分子的序列的核酸或其能够编码具有VHZ结合活性的多肽的变体、同系物、衍生物或片段。
依照本发明的第十二方面，我们提供了细胞或此类细胞的后代，所述细胞包含如上文所列的核酸序列或经如上文所列的核酸序列转化。
依照本发明的第十三方面，我们提供了测定个体中选自下组的癌症的肿瘤是否是或者是否有可能是侵入性或转移性肿瘤的方法：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌，所述方法包括检测所述个体的肿瘤细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控。
依照本发明的第十四方面，提供了治疗、预防或减轻或诊断癌症的方法，其选自下组：(a)在个体中治疗、预防或减轻选自下组的癌症的方法：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌，所述方法包括调控个体的细胞中的VHZ表达、量或活性，优选地，其中所述个体的癌细胞中的所述VHZ表达、量或活性降低；和(b)在个体中诊断选自下组的癌症或对此类癌症的易感性或者对患有此类癌症的个体预后的方法：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌，所述方法包括检测所述个体的细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控。
依照本发明的第十五方面，我们提供了在个体中治疗、预防或减轻选自下组的癌症的方法：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌，所述方法包括检测所述个体的细胞中的VHZ表达、量或活性的调控，并基于所述肿瘤的攻击性来对所述个体施用合适的疗法，诸如抗VHZ剂。
可以通过评估所述肿瘤大小和/或淋巴结阶段，任选地与其它风险因素一起或组合来进一步确定所述诊断、预后或疗法的选择，优选地，其中通过评估所述肿瘤的雌激素受体(ER)状态来进一步确定所述诊断、预后或疗法的选择。
除非另有指明，本发明的实践会采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力范围内。文献中解释了此类技术。参见例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1-3册，Cold SpringHarbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等(1995和定期补充；Current Protocolsin Molecular Biology，第9章、第13章、和第16章，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；J.M.Polak和James O’D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(编)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure PartA：Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology，AcademicPress；Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO.I byEdward Harlow，David Lane，Ed Harlow(1999，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual，Ed Harlow(编)，David Lane(编)(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN0-87969-314-2)，1855.Handbook of Drug Screening，Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes编(2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN0-8247-0562-9)；及Lab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents，and OtherReference Tools for Use at the Bench，Jane Roskams和Linda Rodgers编，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3。本文通过提及而收录这些通用教科书之每篇。
附图简述
图1A和图1B的图像显示了外源性VHZ位于中心体中，并遍及细胞质。间接的免疫荧光显示了中心体中的外源性VHZ。
图1A。将VHZ-EGFP(绿色)转染入NRK细胞中，并展现出一定范围的亚细胞定位(a)。VHZ的主要定位是中心体，在那里它与红色的中心体标志物-粒周蛋白共定位(b)。使用To-pro-3碘化物来以蓝色显现核(b)。合并的图像显示了VHZ-EGFP(绿色)与粒周蛋白共定位(c)。标尺，20μm。
图1B。将VHZ-EGFP转染入NRK细胞中，并在处于各个细胞周期阶段的细胞中显现：分裂间期(a)、前期(b)、中期(c)、和末期(d)。粒周蛋白以红色显示(a’-d’)，而核用To-pro-3碘化物以蓝色显示(a’-d’)。如所显示的那样合并图像(a”-d”)。标尺，10μm。
图2A和图2B的图像显示了内源性VHZ位于中心体和细胞质中。
图2A。在NRK(a-c，标尺，10μm)和MCF-10A(d-f，标尺，20μm)细胞中显现内源性VHZ，其通过用亲和纯化的家兔抗VHZ和小鼠抗γ-微管蛋白抗体，接着用偶联有抗家兔-FITC(绿色)的抗家兔IgG和偶联有抗小鼠-德克萨斯红的抗小鼠IgG进行的双重染色来实现。也在A431细胞(g-i，标尺，20μm)中检测内源性VHZ，其通过用小鼠单克隆抗体抗VHZ(克隆编号25)和家兔抗粒周蛋白抗体，接着用偶联有抗小鼠-FITC(绿色)的抗小鼠IgG和偶联有抗家兔-德克萨斯红的抗家兔IgG进行的双重染色来实现。
图2B。在经过血清饥饿的NRK中显现内源性VHZ(a-c，标尺，20μm)，其通过用家兔抗VHZ和小鼠抗γ-微管蛋白抗体，接着用偶联有抗家兔-FITC(绿色)的抗家兔IgG和偶联有抗小鼠-德克萨斯红的抗小鼠IgG进行的双重染色来实现。
图3A、图3B和图3C的图像显示了VHZ具有蛋白质酪氨酸磷酸酶活性，并且牵涉细胞周期调节。
图3A。我们对每种蛋白质(0.675皮摩尔)测试其PTP酶活性。通过在反应中添加10μM原钒酸钠(VHZ-GST+钒酸盐)或者通过将Cys 95点突变成Ser[VHZ(C95S)-GST)]，完全消除VHZ的PTP酶活性。
图3B。a。三份全细胞溶胞物衍生自表达VHZ-EGFP、VHZ(C95S)-EGFP、或EGFP载体的MCF-7细胞。通过用抗EGFP抗体进行的Western印迹来分析蛋白质表达水平。使用GAPDH作为蛋白质加载对照。b。通过BrdU掺入和FACS分析来测量DNA含量。APC-BrdU向新合成的DNA的掺入(R1对应于红色荧光的量)。
图3C。稳定地表达相同的三种表达构建体的NRK细胞显示VHZ能减少G1但增加S群体。所得的直方图由三种群体组成(按％计)：M1：G1期、M2：S期和M3：G2/M期。该图形显示了对增殖中的细胞群体获得的典型结果，那时通过FACS分析测定其个体细胞的DNA含量。
图4A和图4B的图像显示了VHZ增强MCF-7细胞中的G1/S转换。
图4A。对表达EGFP载体、VHZ(C95S)-EGFP或VHZ-EGFP的MCF-7细胞分析牵涉G1/S细胞周期控制的数种分子。有在Ser780、Ser795和Ser807/811处磷酸化的p21Waf1/Cip1、Cdk4、和Rb。
图4B。显示了一种提出的模型，用以例示VHZ如何可以在G1/S期转换中与这些分子协调。
图5A、图5B和图5C的图像显示了过表达的VHZ蛋白分布于一些乳腺癌样品中的上皮肿瘤细胞的中心体中或细胞质中。对福尔马林固定的且石蜡包埋的乳腺癌样品评估VHZ蛋白表达。
图5A。通过在相同的组织切片上进行的间接双重免疫荧光标记看到VHZ在乳腺癌中定位至细胞的中心体。VHZ(a)和γ-微管蛋白(b)共定位于中心体(c)，如白色箭头所标示的。图像c显示了合并的图像a和b。标尺：100μm。
图5B。为了进行免疫组织化学标记而处理乳腺癌样品的两份连续切片以分别检测VHZ和γ-微管蛋白。通过用3，3’-二氨基联苯胺色原(褐色)染色来检测阳性信号。VHZ(a)和γ-微管蛋白定位(b)的相似中心体标记样式以黑色箭标示。总貌图像(a’，b’)衍生自两份相邻切片。小图a’至c’(放大率x630)中框示的三个矩形区域进行进一步放大(x5)，并分别显示于小图a至c，其中中心体以黑色箭标示。小图c’和c显示了作为对照的VHZ阴性样品。最初的总貌图像显示于(图8A)。
图5C。VHZ蛋白在一些乳腺癌样品中的弥散上皮的整个细胞质中过表达。最初的总貌图像显示于(图8B)。来自不同乳房样品的选定切片显示于总貌图像(a’和b’)。总貌图像(a’、b’和c’放大率x400)中框示的三个矩形区域进行进一步放大(x5)，并分别显示于小图a、b和c。小图c和c’是作为对照显示的VHZ阴性样品。
图6A和图6B的图像显示了VHZ在E-钙粘着蛋白阴性细胞中的表达和VHZ的过表达增强MCF-7细胞的运动性。
图6A。两份相邻的福尔马林固定的且石蜡包埋的乳腺癌样品组织切片显示了E-钙粘着蛋白阴性的VHZ阳性细胞(a，放大率x400)和E-钙粘着蛋白阳性的VHZ阴性上皮(b，放大率x400)。
图6B。为了评估MCF-7-VHZ-EGFP和MCF-7-VHZ(C95S)-EGFP细胞运动性，将细胞在盖玻片上以汇合的单层铺板。然后使经细胞包被的盖玻片颠倒，其中细胞侧向下至新鲜培养皿上。在0小时时和48小时时为MCF-7-VHZ-EGFP细胞(a，a’)和MCF-7-VHZ(C95S)-EGFP(b，b’)采集图像。小图a’显示了自覆盖的盖玻片下移动到外面的MCF-7-VHZ-EGFP细胞(箭标示的)。免疫荧光图像(a，b)。相差图像(a’，b’放大率x200)。
图7A和图7B的图像显示了VHZ mRNA在组织和细胞中广泛表达。
人多组织阵列(产品目录编号7776-1)获自BD Bioscience(San Jose，CA)。该阵列含有自65种不同人组织和8种人细胞系衍生的73份mRNA。
图7A。依照制造商的说明书(产品目录编号1585584，Roche，Mannheim，Germany)用32P-dCTP放射性标记的人VHZ cDNA探查点印迹。显示了VHZmRNA表达样式。VHZ主要在心(斑点：4A、4C-4H)中和在许多其它组织中，以及在肺癌细胞系-A549(斑点-10H)中表达。
图7B。人多组织阵列的完整图谱。
图8A和图8B的图像通过免疫组织化学显示了VHZ蛋白在乳腺癌的中心体和细胞质中过表达。
图8A。揭示了VHZ蛋白在乳腺癌的中心体中的过表达。中心体以黑色箭标示(放大率x400)。
图8B。在乳腺癌细胞的细胞质中找到VHZ蛋白的过表达(放大率x200)。
图9A和图9B的图像显示了家兔和小鼠抗VHZ抗体的表征。
图9A。用家兔和小鼠抗VHZ抗体进行的Western印迹分析。全细胞溶胞物衍生自A431、HaLa、NRK、和MCF-7细胞。将MCF-7全细胞溶胞物与2μgVHZ-GST一起预温育(第1道)。VHZ条带的检测被VHZ-GST特异性阻断(箭标示的)。
图9B。VHZ单抗可用于ECL(A)、IF(B)和IHC(图5)。
图10的图像显示了根据伤口愈合测定法，表达VHZ的MCF10A细胞展示出比表达VHZ(C95S)的MCF10A细胞增强的迁移特性。我们已经经由使用pBABEpuro载体进行的逆转录病毒介导的转导在MCF10A细胞(5x105)中表达VHZ和VHZ(C95S)。根据伤口愈合测定法，表达VHZ的MCF10A细胞展示出比表达VHZ(C95S)的MCF10A细胞增强的迁移特性。可以观察到起点时(0小时上部小图)和终点时(8小时下部小图)的细胞迁移的明显差异。
图11。根据伤口愈合测定法，看到表达VHZ的MCF10A细胞展示出比表达VHZ(C95S)的MCF10A细胞增强的迁移特性。我们经由使用pBABEpuro载体进行的逆转录病毒介导的转导在MCF10A细胞(5x105)中表达VHZ和VHZ(C95S)。根据伤口愈合测定法，表达VHZ的MCF10A细胞展示出比表达VHZ(C95S)的MCF10A细胞增强的迁移特性。可以观察到起点时(0小时上部小图)和终点时(8小时下部小图)的细胞迁移的明显差异。
图12显示了在经福尔马林固定的且经石蜡包埋的人多种癌症样品中评估VHZ蛋白表达。用DAB色原(以褐色)使用Dako EnVisionTM系统用VHZ特异性小鼠单克隆抗体染色来揭示VHZ蛋白。
图13A是概述VHZ#209嵌合抗体的构建步骤的图。
图13B显示了VFIZ#209嵌合抗体的可变重链的序列。
图13C显示了VHZ#209嵌合抗体的可变轻链的序列。
图14是显示使用VHZ#209嵌合抗体得到的结果的图。
图14A显示了来自对NRK(ATCC-CRL-6509)表达的EGFP-VHZ使用VHZ#209嵌合抗体的间接免疫荧光的结果。
图14B显示了来自对数种细胞系使用VHZ#209嵌合抗体的Western印迹分析的结果：HeLa(ATCC CCL2)是宫颈癌细胞系；CHO-K1(ATCC CCL61)是中国仓鼠卵巢细胞系；MCF-7(ATCC HTB-22)是人乳腺癌细胞系，HCT116(CCL-247)是人结肠直肠癌细胞系；MDCK(CCL-34TM)是犬肾细胞系；而DLD-1(CCL-221)是人结肠直肠腺癌细胞系。ATCC：美国典型培养物保藏中心。
图15A。根据Western印迹，我们确认与MDCK细胞系相比，HCT116结肠癌细胞系是VHZ阳性的。在第1天经由尾静脉将1x106个HCT116癌细胞注射入裸鼠的循环中。
图15B。将PBS(未处理的)或嵌合单抗(经处理的)施用入尾静脉中，在第3天开始第一次处理；接着为两次每周施用。实验期：顶部两只动物开始于2009年2月11日-4月2日，底部两只动物开始于2009年2月11日-4月13日。
序列表
SEQ ID NO：1显示了NM_017823智人(Homo sapiens)双特异性磷酸酶23(DUSP23)，mRNA的序列。SEQ ID NO：2显示了NP_060293双特异性磷酸酶23[智人]的序列。SEQ ID NO：3显示了与人VHZ的氨基酸残基(126-140)对应的VHZ肽的序列。SEQ ID NO：4显示了209的可变区的重链序列。SEQ ID NO：5显示了209的可变区的轻链序列。
发明详述
本发明基于第一次证明了VHZ磷酸酶在结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌中发挥作用。
VHZ是最小的已知的有活性的蛋白质酪氨酸磷酸酶(仅16kDa)，并且属于小牛痘病毒VH1相关双特异性磷酸酶组。编码VHZ的基因位于人染色体1q23.1上，并且仅由两个编码外显子组成(Wu等，2004，Int J Biochem Cell Biol.36(8)：1542-53)。
VHZ显示独特的针对对硝基苯基磷酸酯以及含有磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸残基的寡肽的磷酸酶活性。此外，VHZ在体外能使p44ERK1而非p38和p54SAPKβ去磷酸化(Alonso等(2004).J Biol Chem.20；279(34)：35768-74)。
我们显示了VHZ与结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌细胞有关。
在25/143(17.5％)的结肠癌组织样品、20/82(24.0％)的肺癌组织样品、22/63(35.0％)的鳞状细胞癌癌组织样品、17/51(33.3％)的胰腺癌组织样品、7/40(17.5％)的脑癌组织样品、4/12(33.3％)的食管癌组织样品、5/14(35.7％)的胃癌组织样品、2/6(33.3％)的膀胱癌组织样品、2/11(18.1％)的肾癌组织样品、2/6(33.3％)的皮肤癌组织样品、2/6(33.3％)的卵巢癌组织样品、3/8(37.5％)的前列腺癌组织样品和2/6(33.3％)的睾丸癌组织样品中找到VHZ蛋白的过表达。
因而，可以使用VHZ作为标志物来检测结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌或睾丸癌。可以使用VHZ表达的水平作为结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌，特别是转移性、攻击性或侵入性癌症的指标。
还可以使用VHZ表达的水平作为此类癌症可能性的指标。因此，我们提供了诊断或检测结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌的方法。我们进一步提供了诊断和检测此类癌症的攻击性或侵入性或转移性状态，或者这些的任意组合的方法。该方法可以包括分析蛋白质水平(例如免疫组织化学)或RNA水平(例如通过原位杂交)。下文更为详细地描述了此类诊断和检测方法。
使用间接免疫荧光，我们显示了外源性和内源性VHZ蛋白二者在其胞质分布外还定位于中心体中。因而，可以使用VHZ作为标志物来检测中心体结构。
我们证明了VHZ调节细胞周期行进，并且它具有增强G1-S期转换的能力。我们证明了VHZ的过表达促成癌症形成。对BrdU标记的被工程化改造成表达VHZ的MCF-7细胞的FACS分析指明VHZ能够加速G1期向S期转换。来自对稳定表达相同的三种表达构建体的NRK细胞的FACS分析的类似结果显示VHZ通过减少G1但增加S群体来加速G1向S期转换。
因而，我们提供了治疗或预防患有结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌或睾丸癌的个体的方法。还可以使用VHZ水平向正常组织中的VHZ水平的恢复作为恢复此类细胞正常功能的手段。因此，我们提供了VHZ核酸和多肽治疗癌症(包括结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌)的用途。可以使用我们的方法来治疗或预防癌症或侵入性癌症。
我们进一步提供了VHZ在筛选针对结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌(例如侵入性癌症)的药物中的用途。VHZ过表达和表达不足的细胞以及包含其的组织、器官和生物体可以用作结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌的模型或者用于筛选抗癌剂。
VHZ在MCF-7细胞中的过表达引起p21Cip1的下调和Cdk4的上调。结果，观察到磷酸化的(失活的)视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的积累，如通过用磷酸特异性抗体进行的免疫印迹所评估的。表达没有催化活性的VHZ(C95S)的细胞上述VHZ介导的事件方面受到削弱，指明这些特性需要磷酸酶活性。
VHZ中的催化性半胱氨酸残基的突变(C95S)消除其蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)活性。
在使用术语“VHZ”时，这应当被用于指任何VHZ序列，包括VHZ蛋白或VHZ核酸及其任何片段、变体同系物、衍生物、变体。
VHZ的特性和活性记载于本文件中，例如在参考文献中。
VHZ多肽
这里所描述的方法和组合物利用下文详细描述的VHZ多肽。
VHZ也称为DUSP23、MOSP、LDP-3、DUSP25、FLJ20442和RP11-190A12.1。
如本文所使用的，术语“VHZ多肽”意图指具有GenBank登录号NP_060293.2、NP_081001.1、XP_341157.1、XP_001170819.1、XP_001170835.1、XP_545747.2、NP_001076078.1、NP_001011371.1、NP_783859.1、NP_001034709.1、XP_001480730.1、XP_001117253.1或XP_001117256.1的序列。
“VHZ多肽”可以包含人VHZ多肽诸如具有登录号NP_060293的序列(SEQ ID NO：2)，或者由其组成。
还包括任何、一些或所有这些多肽的其同系物变体和衍生物。
VHZ多肽可以用于多种手段，例如，向患有或者怀疑患有结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌或睾丸癌的个体施用以进行治疗。它们还可以用于生成或筛选抗VHZ剂，诸如特异性VHZ结合剂，特别是抗VHZ抗体。这些在下文更为详细地进行描述。可以检测VHZ多肽的表达以诊断或检测癌症，特别是结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。
“多肽”指任何包含两个或更多个彼此通过肽键或修饰的肽键(即肽等排体)相连接的氨基酸的肽或蛋白质。“多肽”指短链(通常称为肽、寡肽或寡聚物)和较长的链(通常称为蛋白质)两者。多肽可以含有20种由基因编码的氨基酸以外的氨基酸。
“多肽”包括通过天然过程(诸如翻译后加工)或通过本领域中公知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰详细记载于基础教科书和更详细的专著，以及多卷的研究文献中。修饰可以在多肽中的任何地方发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当领会的是，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽中的数个位点。还有，给定多肽可以含有许多类型的修饰。
多肽可以由于遍在蛋白化而分支，并且它们可以是环状的、有分支的或没有分支的。环状的、分支的和分支环状的多肽可以源自翻译后天然过程或者可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素模块的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(诸如精氨酰化)、和遍在蛋白化。参见例如Proteins-Structure and Molecular Properties，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993和Wold，F.，Posttranslational Protein Modifications：Perspectives and Prospects，第1页-第12页，于Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，编，Academic Press，New York，1983；Seifter等，“Analysis for proteinmodifications and nonprotein cofactors”，Meth Enzymol，(1990)182：626-646和Rattan等，“Protein Synthesis：Posttranslational Modifications and Aging”，AnnNY Acad Sci(1992)663：48-62。
术语“多肽”包括本领域已知的各种合成肽变异诸如逆反(retroinverso)D肽。肽可以是抗原决定簇和/或T细胞表位。肽在体内可以是免疫原性的。肽可以能够在体内诱导中和性抗体。
如应用于VHZ的，所得的氨基酸序列可以具有一种或多种活性，诸如与VHZ多肽(例如人VHZ多肽)共同的生物学活性。例如，VHZ同系物在结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌细胞中可以具有比在正常细胞中升高的表达水平。具体地，术语“同系物”涵盖关于结构和/或功能的同一性，只要所得的氨基酸序列具有VHZ活性。关于序列同一性(即相似性)，可以有至少70％，诸如至少75％，诸如至少85％，诸如至少90％序列同一性。可以有至少95％，诸如至少98％序列同一性。这些术语还涵盖自作为VHZ核酸序列等位变异的氨基酸衍生的多肽。
在提及多肽诸如VHZ的“活性”或“生物学活性”时，这些术语意图指VHZ的代谢或生理学功能，包括类似的活性或改善的活性或者不想要的副作用降低的这些活性。还包括VHZ的抗原性和免疫原性活性。此类活性的例子及测定和量化这些活性的方法是本领域已知的，并且详细记载于本文件的别处。
例如，此类活性可以包括任何下列一项或多项：水解酶活性、蛋白质酪氨酸磷酸酶活性、蛋白质酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性和蛋白质氨基酸去磷酸化。针对这些活性的测定法是本领域已知的，并且例如记载于Wu等(2004)，Int J Biochem Cell Biol.36(8)：1542-53和Alonso等(2004).J Biol Chem.20；279(34)：35768-74。
其它VHZ多肽
VHZ变体、同系物、衍生物和片段也在本文所描述的方法和组合物中使用。
涉及VHZ的术语“变体”、“同系物”、“衍生物”或“片段”包括一个(或多个)氨基酸自序列或向序列的任意替代、变异、修饰、替换、删除或添加。除非上下文另有承认，提及“VHZ”包括提及VHZ的此类变体、同系物、衍生物和片段。
如本文中所使用的，“删除”定义为核苷酸或氨基酸序列中分别缺失一个或多个核苷酸或氨基酸残基的变化。如本文中所使用的，“插入”或“添加”指与天然存在的物质相比分别已经导致一个或多个核苷酸或氨基酸残基的添加的核苷酸或氨基酸序列变化。如本文中所使用的，“替代”源自于一个或多个核苷酸或氨基酸分别被不同核苷酸或氨基酸替换。
如本文所描述的VHZ多肽还可以具有产生沉默变化和导致功能等同氨基酸序列的氨基酸残基删除、插入或替代。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有不带电荷的极性首基(head group)、具有相似的亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可以例如依照下表来进行保守的替代。第二栏中同一块中的和第三栏中同一行中的氨基酸可以彼此替代：
VHZ多肽可以进一步包含异源氨基酸序列，通常在N端或C端，诸如N端。异源序列可以包括影响胞内或胞外蛋白质靶向的序列(诸如前导序列)。异源序列还可以包括提高VHZ多肽的免疫原性和/或便于多肽的鉴定、提取和/或纯化的序列。可以使用的另一种异源序列是多氨基酸序列诸如多组氨酸，其可以是N端的。可以采用至少10个氨基酸，诸如至少17个氨基酸但少于50个氨基酸的多组氨酸序列。
VHZ多肽可以处于“成熟的”蛋白质形式，或者可以是较大蛋白质诸如融合蛋白的一部分。通常有利的是包括额外氨基酸序列，其含有分泌或前导序列、前序列(pro-sequence)、有助于纯化的序列诸如多组氨酸残基、或为了重组生产过程中稳定性的额外序列。
使用已知技术通过重组手段来有利地制备如本文所描述的VHZ多肽。然而，还可以使用熟练技术人员公知的技术通过合成手段诸如固相合成来制备它们。此类多肽还可以作为融合蛋白生成，例如以便帮助提取和纯化。融合蛋白配偶的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活域)和β-半乳糖苷酶。也可能方便的是在融合蛋白配偶与感兴趣蛋白质序列之间包括蛋白水解切割位点以容许除去融合蛋白序列，诸如凝血酶切割位点。融合蛋白可以是不阻碍感兴趣序列的蛋白质的功能的融合蛋白。
VHZ多肽可以处于基本上分离的形式。此术语意图指自天然状态的人为改变。若“分离的”组合物或物质在自然界中存在，则它已经自其最初环境改变和/或取出。例如，在本文中采用该术语时，活的动物中天然存在的多核苷酸、核酸或多肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质分开的该多核苷酸、核酸或多肽是“分离的”。
然而，应当理解的是，VHZ蛋白可以与不会干扰蛋白质预期目的的载体或稀释剂混合，并且仍被认为是基本上分离的。VHZ多肽也可以处于基本上纯化的形式，在此情况中一般会在制备物中包含蛋白质，其中所述制备物中超过90％，例如95％、98％或99％的蛋白质是VHZ多肽。
通过比对来自不同物种的VHZ序列，有可能确定氨基酸序列的哪些区域在不同物种间是保守的(“同源区”)，及哪些区域在不同物种间有变化(“异源区”)。
因此，VHZ多肽可以包含至少与同源区的一部分对应的序列。同源区在至少两个物种间显示高度的同源性。例如，使用上文所描述的测试，同源区可以在氨基酸水平显示至少70％，至少80％，至少90％或至少95％的同一性。可以在治疗策略中使用包含与同源区对应的序列的肽，如下文更详细解释的。或者，VHZ肽可以包含至少与异源区的一部分对应的序列。异源区在至少两个物种间显示低度的同源性。
VHZ同系物
为使用而公开的VHZ多肽包括自任何来源获得的同源序列，例如相关病毒/细菌蛋白质、细胞同系物和合成肽，以及其变体或衍生物。如此，多肽还包括那些编码来自其它物种(包括动物，诸如哺乳动物(例如小鼠、大鼠或家兔)，尤其是灵长类，更尤其是人)的VHZ同系物的。更具体地，同系物包括人同系物。
在本文件的语境中，同源序列用于包括在氨基酸水平上，例如在至少50或100、110、115、120、125、130、135、140、141、142、143、144、145、146、147、148或149个氨基酸上，与相关VHZ序列的序列至少15、20、25、30、40、50、60、70、80或90％相同，诸如至少95或98％相同的氨基酸序列。
具体地，同源性通常应当关于那些已知对蛋白质功能至关重要的序列区域而非不是至关重要的相邻序列进行考虑。这在考虑来自远亲生物体的同源序列时是特别重要的。一个例子是人VHZ蛋白残基号95处的或与人VHZ蛋白残基号95对应的半胱氨酸残基(其显示为对于磷酸酶功能是至关重要的)和周围的残基。
虽然也可以根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但是在本文件的语境中同源性可以根据序列同一性来表述。
可以通过目视，或者更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行同源性比较。这些公用的和商品化的计算机程序能在两种或更多种序列之间计算％同一性。
可以在连续的序列上计算％同一性，即比对一种序列与另一种序列，并且直接比较一种序列中的每个氨基酸与另一种序列中的相应氨基酸，每次一个残基。这称作“无缺口的”比对。通常，仅在相对较短数目的残基(例如小于50个连续氨基酸)上实施此类无缺口比对。
虽然这是非常简单而一致的方法，但是它未能考虑到例如，在其它方面相同的一对序列中，一处插入或删除会引起随后的氨基酸残基比对不成，如此在实施总体比对时潜在地导致％同源性的大量降低。因此，大多数序列比较方法设计为产生最佳比对，其考虑到有可能的插入和删除，而不过度地对总体同源性得分进行罚分。这是通过在序列比对中插入“缺口”以设法使局部同一性或相似性最大化来实现的。
然而，这些更加复杂的方法将“缺口罚分”分配给比对中出现的每个缺口，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口的序列比对——反映两种比较序列之间的较高关联性——会比具有许多缺口的序列比对达到更高的得分。通常使用“仿射缺口代价”，其对缺口的存在要求相对较高的代价，而对缺口中的每个随后的残基要求较小的罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分当然会产生具有较少缺口的优化比对。大多数比对程序容许对缺口罚分进行修改。然而，可以在使用此类软件比较序列时使用缺省值。例如在使用GCG Wisconsin最佳拟合包(参见下文)时，氨基酸序列的缺省缺口罚分是针对缺口的-12和针对每个延伸的-4。
因此，最大限度％同源性的计算首先要求产生考虑到缺口罚分的最佳比对。适合于实施此类比对的一种计算机程序是GCG Wisconsin最佳拟合包(University of Wisconsin，U.S.A；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research12：387)。能实施序列比较的其它软件的例子包括但不限于BLAST包(参见Ausubel等，1999同上-第18章)、FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA两者都可进行离线和在线搜索(参见Ausubel等，1999同上，第7-58页至第7-60页)。可以使用GCG最佳拟合程序。
虽然可以根据同一性测量最终的％同源性，但是比对方法自身通常并不是基于全有或全无的成对比较。代替地，一般使用定标的相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离将得分分配给每个配对比较。通常使用的此类矩阵的一个例子是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套件的缺省矩阵。GCGWisconsin程序一般使用公共缺省值或自定义符号比较表，若提供的话(关于进一步的详情参见用户手册)。可以使用GCG包的公共缺省值，或者在其它软件的情况中，可以使用缺省矩阵，诸如BLOSUM62。
一旦软件已经产生最佳比对，便有可能计算％同源性，诸如％序列同一性。软件通常将此作为序列比较的一部分进行，并产生数值结果。
涉及氨基酸序列的术语“变体”或“衍生物”包括一个(或多个)氨基酸自序列或向序列的任意替代、变异、修饰、替换、删除或添加，只要所得的氨基酸序列保留与未修饰的序列基本上相同的活性，诸如至少具有与VHZ多肽相同的活性。
为了在本文所描述的方法和组合物中使用，可以修饰具有本文所公开的VHZ氨基酸序列的多肽，或其片段或同系物。通常，进行的修饰维持序列的生物学活性。可以进行氨基酸替代，例如自1、2或3至10、20或30处替代，只要经修饰的序列保留未修饰序列的生物学活性。或者，可以进行修饰以便有意地使本文所述多肽的一个或多个功能域失活。氨基酸替代可以包括使用非天然存在的类似物，例如以便延长治疗性施用的多肽的血浆半衰期。
VHZ片段
本文所述方法和组合物中使用的多肽还包括上文所鉴定的任何VHZ多肽的全长序列的片段。片段可以包含至少一个表位。鉴定表位的方法是本领域公知的。片段通常会包含至少6个氨基酸，诸如至少10、20、30、50或100个氨基酸。
包括如下片段，其包含来自相关VHZ氨基酸序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145个或更多个残基，或由其组成。
我们进一步描述了包含如本文所描述的VHZ多肽的一部分的肽。如此，包括VHZ及其同系物、变体或衍生物的片段。所述肽的长度可以在2个和200个氨基酸之间，诸如在4个和40个氨基酸之间。所述肽可以衍生自如本文所公开的VHZ多肽，例如通过用合适的酶诸如胰蛋白酶进行的消化来得到。或者，所述肽、片段等可以通过重组手段来制备，或者以合成法合成。
可以使用此类VHZ片段来生成探针以优先检测VHZ表达，例如经由针对此类片段生成的抗体。这些抗体会特异性结合VHZ，并且在本文所公开的诊断和治疗方法中是有用的。
可以通过重组手段来制备VHZ及其片段、同系物、变体和衍生物。然而，它们也可以使用熟练技术人员公知的技术通过合成手段诸如固相合成来制备。所述蛋白质还可以作为融合蛋白生成，例如以便帮助提取和纯化。融合蛋白配偶的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活域)和β-半乳糖苷酶。也可能方便的是在融合蛋白配偶与感兴趣蛋白质序列之间包括蛋白水解切割位点以容许除去融合蛋白序列。融合蛋白可以是不会阻碍感兴趣序列的蛋白质的功能的融合蛋白。还可以通过纯化来自动物细胞的细胞提取物来获得蛋白质。
本文所公开的VHZ多肽、变体、同系物、片段和衍生物可以处于基本上分离的形式。应当理解的是，此类多肽可以与不会干扰蛋白质预期目的的载体或稀释剂混合，并且仍被认为是基本上分离的。VHZ变体、同系物、片段或衍生物也可以处于基本上纯化的形式，在此情况中一般会在制备物中包含蛋白质，其中所述制备物中超过90％，例如95％、98％或99％的蛋白质是蛋白质。
可以用显示标记物(revealing label)标记本文所公开的VHZ多肽、变体、同系物、片段和衍生物。所述显示标记物可以是容许检测出多肽等的任何合适的标记物。合适的标记物包括放射性同位素(例如125I)、酶、抗体、多核苷酸和接头(诸如生物素)。可以在诊断规程诸如免疫测定法中使用经过标记的多肽以测定样品中的多肽量。也可以在血清学或细胞介导的免疫测定法中使用多肽或经过标记的多肽以使用标准方案来检测动物和人中针对所述多肽的免疫反应性。
也可以将本文所公开的VHZ多肽、变体、同系物、片段和衍生物(任选经过标记的)固定至固相，例如免疫测定孔或浸渍片的表面。可以将此类经过标记的和/或固定化的多肽与合适的试剂、对照、说明书等一起在合适的容器中包装入试剂盒中。此类多肽和试剂盒可以在通过免疫测定法检测针对多肽或其等位或物种变体的抗体的方法中使用。
免疫测定方法是本领域公知的，并且一般会包括：(a)提供包含下述表位的多肽，该表位可被针对所述蛋白质的抗体结合；(b)在容许抗体-抗原复合物形成的条件下将生物学样品与所述多肽一起温育；并(c)测定是否形成包含所述多肽的抗体-抗原复合物。
可以在体外或体内细胞培养系统中使用本文所公开的VHZ多肽、变体、同系物、片段和衍生物以研究它们相应的基因及其同系物在细胞功能(包括它们在疾病中的功能)中的作用。例如，可以将截短的或修饰的多肽导入细胞中以破坏细胞中发生的正常功能。可以通过自重组表达载体原位表达多肽来将多肽导入细胞中(参见下文)。任选地，表达载体携带诱导型启动子，以便控制多肽的表达。
合适的宿主细胞诸如昆虫细胞或哺乳动物细胞的使用提供此类翻译后修饰(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，其可能是对重组表达产物赋予最佳生物学活性所需要的。可以在测定系统中使用其中表达本文所公开的VHZ多肽、变体、同系物、片段和衍生物的此类细胞培养系统，以鉴定干扰或增强多肽在细胞中的功能的候选物质。
VHZ核酸
本文所描述的方法和组合物可以采用VHZ多核苷酸、VHZ核苷酸和VHZ核酸，以及这些中任一种的变体、同系物、衍生物和片段，作为用于检测VHZ表达水平的手段。另外，我们公开了对于本文所描述的诊断方法有用的特定VHZ片段。VHZ核酸还可以用于所描述的治疗或预防方法。
术语“VHZ多核苷酸”、“VHZ核苷酸”和“VHZ核酸”可以互换使用，并且应当理解为明确包括cDNA和基因组VHZ序列两者。这些术语还意图包括能够编码VHZ多肽和/或其片段、衍生物、同系物或变体的核酸序列。
在提及VHZ核酸时，这应当理解为提及VHZ核酸家族的任何成员。特别感兴趣的是选自下组的VHZ核酸：NM_017823.3、NM_026725.2、XM_341156.3、XM_001170819.1、XM_001170835.1、XM_545747.2、NM_001082609.1、NM_001011371.1、NM_175732.1、NM_001039620.1、XM_001480680.1、XM_001117253.1或XM_001117256.1。
还包括如下文“其它VHZ核酸序列”所列的任何一种或多种核酸序列。
例如，VHZ核酸可以包含具有GenBank登录号NM_017823.3的人VHZ序列(SEQ ID NO：1)。
VHZ核酸可以用于多种手段，例如，向患有或者怀疑患有结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌或睾丸癌的个体施用以进行治疗。可以检测VHZ核酸的表达以诊断或检测癌症，特别是结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。也可以使用VHZ核酸来表达或生成VHZ多肽。
“多核苷酸”一般指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA，作为单链区和双链区的混合物的DNA，单链和双链RNA，及作为单链区和双链区的混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂合分子，其可以是单链或者，更通常的是双链或单链区和双链区的混合物。另外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个经修饰的碱基的DNA或RNA和具有出于稳定性或其它原因而修饰的主链的DNA或RNA。“经修饰的”碱基包括例如三苯甲基化碱基和不常见碱基诸如肌苷。已经对DNA和RNA进行多种修饰；如此，“多核苷酸”涵盖多核苷酸的以化学方式、酶促方式或代谢方式修饰的形式，如通常在自然界中找到的，以及病毒和细胞特征性的DNA和RNA化学形式。“多核苷酸”还涵盖相对较短的多核苷酸，通常称为寡核苷酸。
熟练技术人员应当理解的是，许多核苷酸序列可以由于遗传密码的简并性而编码相同多肽。
如本文中所使用的，术语“核苷酸序列”指核苷酸序列、寡核苷酸序列、多核苷酸序列及其变体、同系物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成或重组起源的DNA或RNA，其可以是双链的或单链的，无论表示有义链还是反义链或其组合。可以通过使用重组DNA技术(例如重组DNA)来制备术语核苷酸序列。
术语“核苷酸序列”可以指DNA。
其它核酸
我们还提供了如下的核酸，其是VHZ核酸的片段、同系物、变体或衍生物。涉及VHZ核酸的术语“变体”、“同系物”、“衍生物”或“片段”包括一个(或多个)核酸自VHZ核苷酸序列的序列或向该序列的任意替代、变异、修饰、替换、删除或添加。除非上下文另有承认，提及“VHZ”和“VHZ”包括提及VHZ的此类变体、同系物、衍生物和片段。
所得的核苷酸序列可以编码具有任何一种或多种VHZ活性的多肽。术语“同系物”可以意图涵盖关于结构和/或功能的同一性，使得所得的核苷酸序列编码具有VHZ活性的多肽。例如，VHZ的同系物等在结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌或睾丸癌细胞中可以具有比正常细胞升高的表达水平。关于序列同一性(即相似性)，可以有至少70％，至少75％，至少85％或至少90％序列同一性。与相关序列(例如具有GenBank登录号NM_017823.3的VHZ序列)可以有至少95％，诸如至少98％的序列同一性。这些术语还涵盖所述序列的等位变异。
变体、衍生物和同系物
VHZ核酸变体、片段、衍生物和同系物可以包含DNA或RNA。它们可以是单链的或双链的。它们还可以是如下的多核苷酸，所述多核苷酸在其内包括合成的或经修饰的核苷酸。对寡核苷酸进行的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯主链、在所述分子的3’和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本文件的目的，应当理解的是，可以通过本领域中可用的任何方法来修饰多核苷酸。可以实施此类修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。
若多核苷酸是双链的，则本文所描述的方法和组合物涵盖双链体的两条链，或是个别地或是组合地。若多核苷酸是单链的，则应当理解的是，还包括该多核苷酸的互补序列。
涉及核苷酸序列的术语“变体”、“同系物”或“衍生物”包括一个(或多个)核酸自序列或向序列的任意替代、变异、修饰、替换、删除或添加。所述变体、同系物或衍生物可以编码具有生物学活性的多肽。VHZ的此类片段、同系物、变体和衍生物可以包含经调控的活性，如上文所列的。
如上文所指明的，关于序列同一性，“同系物”与相关序列(例如具有GenBank登录号NM_017823.3的VHZ序列)可以具有至少5％同一性、至少10％同一性、至少15％同一性、至少20％同一性、至少25％同一性、至少30％同一性、至少35％同一性、至少40％同一性、至少45％同一性、至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、或至少95％同一性。
可以有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。可以如上文所描述的那样进行核苷酸同一性比较。可以使用的序列比较程序是上文所描述的GCG Wisconsin最佳拟合程序。缺省评分矩阵具有如下的匹配值：针对每个相同核苷酸的10和针对每个错配的-9。缺省缺口产生罚分是-50，而缺省缺口延伸罚分是针对每个核苷酸的-3。
杂交
我们进一步描述了能够与本文中呈现的任何序列，或其任何变体、片段或衍生物，或与上文任一种的互补物选择性杂交的核苷酸序列。核苷酸序列的长度可以是至少15个核苷酸，诸如至少20、30、40或50个核苷酸。
如本文中所使用的，术语“杂交”应当包括“核酸链经由碱基配对而与互补链结合的过程”以及如聚合酶链式反应技术中所实施的扩增过程。
能够与本文中呈现的核苷酸序列，或与其互补物选择性杂交的多核苷酸可以与本文中呈现的相应核苷酸序列(例如具有GenBank登录号NM_017823.3的VHZ序列)至少40％同源、至少45％同源、至少50％同源、至少55％同源、至少60％同源、至少65％同源、至少70％同源、至少75％同源、至少80％同源、至少85％同源、至少90％同源、或至少95％同源。一般而言，此类多核苷酸可以在至少20个，诸如至少25或30个，例如至少40个、60个或100个或更多个连续核苷酸的区域上与相应的核苷酸序列至少70％、至少80或90％或至少95％或98％同源。
术语“可选择性杂交的”指在如下条件下使用作为探针使用的多核苷酸，在所述条件下发现靶多核苷酸以显著高于背景的水平与探针杂交。由于例如所筛选的cDNA或基因组DNA文库中存在的其它多核苷酸，可能发生背景杂交。在此事件中，背景暗示通过探针与文库的非特异性DNA成员之间的相互作用产生的信号水平，其是用靶DNA观察到的特异性相互作用的强度的不到1/10，诸如不到1/100。例如，可以通过用例如32P或33P放射性标记探针或者用非放射性探针(例如荧光染料、生物素或洋地黄毒苷)测量相互作用的强度。
杂交条件基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，San Diego CA)中所教导的，并且赋予限定的“严格性”，如下文所解释的。
最大限度的严格性通常于约Tm-5℃(探针的Tm下5℃)发生；高严格性在Tm下约5℃至10℃发生；中等严格性在Tm下约10℃至20℃发生；而低严格性在Tm下约20℃至25℃发生。如本领域技术人员应当理解的，可以使用最大限度的严格性杂交来鉴定或检测相同的多核苷酸序列，而可以使用中等(或低)严格性杂交来鉴定或检测相似的或相关的多核苷酸序列。
我们提供了可以能够在严格条件(例如65℃和0.1xSSC(1xSSC＝0.15MNaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0))下与VHZ核酸、片段、变体、同系物或衍生物杂交的核苷酸序列。
同系物、变体和衍生物的生成
可以以许多方式来获得与相关序列(例如具有GenBank登录号NM_017823.3的人VHZ序列)不是100％相同但是也包括在内的多核苷酸，以及VHZ的同系物、变体和衍生物。可以通过例如探查自一系列个体例如来自不同群体的个体制备的DNA文库来获得所述序列的其它变体。例如，可以自其它个体或其它物种鉴定VHZ同系物。可以如下生成别的重组VHZ核酸和多肽，即鉴定同系物中的相应位置，并合成或生成所述分子，如本文件中别处描述的。
另外，可以获得VHZ的其它病毒/细菌、或细胞同系物，特别是哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中找到的细胞同系物，并且一般而言，此类同系物及其片段会能够与人VHZ选择性杂交。可以使用此类同系物来设计非人VHZ核酸、片段、变体和同系物。可以通过本领域已知的手段来实施诱变以产生别的种类(variety)。
可以如下获得VHZ同系物的序列，即探查自其它动物物种制备的cDNA文库或来自其它动物物种的基因组DNA文库，并在中等至高严格性条件下用包含VHZ核酸、片段、变体和同系物之任一种的或VHZ的其它片段的整个或部分的探针探查此类文库。
类似的考虑适用于获得本文所公开的多肽或核苷酸序列的物种同系物和等位变体。
也可以使用简并PCR来获得变体和株系/物种同系物，所述简并PCR会使用设计用于靶向变体和同系物内如下序列的引物，所述序列编码VHZ核酸序列内的保守氨基酸序列。可以通过例如比对来自数种变体/同系物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件来实施序列比对。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
简并PCR中使用的引物会含有一个或多个简并位置，并且会在如下的严格条件使用，所述严格条件低于那些用于用针对已知序列的单一序列引物克隆序列的严格条件。熟练技术人员应当领会的是，来自远亲生物体的序列之间的总体核苷酸同源性有可能是非常低的，并且如此在这些情况中简并PCR可以是选择的方法，而不是用经过标记的VHZ序列片段筛选文库。
另外，可以通过使用搜索算法诸如BLAST程序套件搜索核苷酸和/或蛋白质数据库来鉴定同源序列。
或者，可以通过对已表征序列(例如VHZ核酸、或其变体、同系物、衍生物或片段)的定点诱变来获得此类多核苷酸。这在如下情况中可以是有用的，即例如序列需要沉默密码子变化来针对表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱。其它序列变化可能是想要的，以便引入限制酶识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的特性或功能。
可以使用本文所描述的多核苷酸来生成引物，例如PCR引物，用于备选(alternative)扩增反应的引物，探针，例如使用放射性或非放射性标记物通过常规手段用显示标记物标记的探针，或者可以将多核苷酸克隆入载体中。此类引物、探针和其它片段的长度会是至少8个、9个、10个、或15个，诸如至少20个，例如至少25个、30个或40个核苷酸，并且也包括在术语“多核苷酸”内，如本文中所使用的。
可以以重组方式、合成方式、或者通过本领域技术人员可用的任何手段来生成多核苷酸诸如DNA多核苷酸和探针。它们也可以通过标准技术来克隆。
一般而言，会通过合成手段来生成引物，牵涉逐步制备想要的核酸序列，每次一个核苷酸。用于使用自动化技术实现此制备的技术是本领域容易获得的。
包含VHZ片段的引物在检测VHZ表达诸如VHZ表达的上调(例如如与结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌有关的)的方法中是特别有用的。可以自任何合适的VHZ区段生成适合于扩增VHZ的引物。可以使用的引物包括那些能够扩增特异性的VHZ序列的引物。
虽然可以独立地提供VHZ引物，但是它们作为引物对(包含正向引物和反向引物)提供是最有用的。
一般而言，会使用重组手段例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来生成较长的多核苷酸。这会牵涉制备一对引物(例如有约15至30个核苷酸)，使引物与自动物或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在引起想要的区域扩增的条件下实施聚合酶链式反应，分离所扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收所扩增的DNA。引物可以设计成含有合适的限制酶识别位点，使得能将所扩增的DNA克隆入合适的克隆载体中。
多核苷酸或引物可以携带显示标记物。合适的标记物包括放射性同位素诸如32P或35S、洋地黄毒苷、荧光染料、酶标记物、或其它蛋白质标记物诸如生物素。可以将此类标记物添加至多核苷酸或引物，并且可以通过使用本身已知的技术来检测。本领域技术人员可以在基于核酸的测试中使用标记的或未标记的多核苷酸或其引物或片段以检测人体或动物体中的多核苷酸或对其测序。
此类用于检测的测试一般包括使含有DNA或RNA的生物学样品在杂交条件下与包含多核苷酸或引物的探针接触，并检测探针与样品中的核酸之间形成的任何双链体。可以使用诸如PCR的技术或者如下来实现此类检测，即在固体支持物上固定化探针，除去样品中不与探针杂交的核酸，然后检测已经与探针杂交的核酸。或者，可以在固体支持物上固定化样品核酸，并可以检测与此支持物结合的探针量。这种和其它形式的合适测定方法可以参见例如WO89/03891和WO90/13667。
用于对核苷酸(例如VHZ核酸)测序的测试牵涉使含有靶DNA或RNA的生物学样品在杂交条件下与包含多核苷酸或引物的探针接触，并通过例如Sanger双脱氧链终止方法(参见Sambrook等)来测定序列。
此方法一般包括在存在合适的试剂的情况中通过合成与靶DNA或RNA互补的链来延伸引物，并在一个或多个A、C、G或T/U残基处选择性终止延伸反应；容许发生链延伸和终止反应；依照大小将所延伸的产物分开以测定已经发生选择性终止的核苷酸的序列。合适的试剂包括DNA聚合酶，脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP，缓冲液和ATP。使用双脱氧核苷酸进行选择性终止。
VHZ控制区
出于一些目的，可能有必要利用或调查VHZ的控制区。此类控制区包括启动子、增强子和基因座控制区。控制区指能够调控与其可操作连接的编码序列的表达的核酸序列或结构。
例如，控制区在生成表达VHZ的转基因动物中是有用的。此外，可以使用控制区来生成VHZ的表达构建体。这在下文更为详细地进行描述。
VHZ控制区的鉴定是直接的，并且可以以多种方式实施。例如，可以如下自生物体获得VHZ的编码序列，即使用人或小鼠VHZ cDNA序列作为探针来筛选cDNA文库。可以通过筛选合适的基因组文库，或者通过如本领域中已知的引物延伸来获得5’序列。也可以采用基因组数据库的数据库搜索。特别感兴趣的此类5’序列包括非编码区。可以通过目视或者借助于计算机程序来检查5’区以鉴定指明启动子和/或增强子区存在的序列基序。
此外，可以进行来自两种或更多种生物体的VHZ核酸序列的序列比对。通过比对来自不同物种的VHZ序列，有可能确定氨基酸序列的哪个区域在不同物种之间是保守的。此类保守区可能含有所讨论的基因(即VHZ)的控制区。出于此目的可以采用如本文所公开的小鼠和人基因组序列，例如小鼠VHZ基因组序列。此外，可以使用标准的筛选方法来获得来自其它生物体的VHZ同系物，其使用自小鼠和人VHZ序列生成的合适探针来实现。也可以筛选河豚(红鳍东方鲀(Takifugu rubripes))或斑马鱼的基因组来鉴定VHZ同系物；如此，已经鉴定出数种斑马鱼VHZ序列(上文所记录的)。可以使用河豚或斑马鱼VHZ基因与小鼠或人基因组VHZ序列的5’非编码区比较来鉴定含有控制区的保守区。
也可以进行删除研究来鉴定VHZ的启动子和/或增强子区。
可以通过分子生物学实验来证实推定的控制区的身份，其中将候选序列与报告基因连接，并检测报告物的表达。
检测和诊断方法
VHZ表达的检测
我们在实施例中显示了，在与正常组织相比时，结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌组织中的VHZ表达是上调的。
因而，我们提供了一种诊断癌症(包括结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌诸如转移性、攻击性或侵入性癌症)的方法，包括在个体的细胞或组织中检测VHZ表达的调控，诸如VHZ表达的上调。
可以使用VHZ表达、活性或量的检测来提供一种测定细胞增殖状态的方法。如此，增殖性细胞是与正常细胞相比具有高水平的VHZ表达、活性或量的细胞。类似地，非增殖性细胞可以是与正常细胞相比具有低水平的VHZ表达、活性或量的细胞。
也可以使用此检测来测定细胞是否会变为侵入性的或攻击性的。如此，在细胞中检测出高水平的VHZ表达、量或活性可以指明该细胞有可能是或变为攻击性的、转移性的或侵入性的。类似地，若细胞具有低水平的VHZ表达、量或活性，则所述细胞不是或者不太可能是攻击性的、转移性的或侵入性的。
应当领会的是，若VHZ的水平随肿瘤的攻击性而变化，则也可以使用VHZ表达、量或活性的检测来预测患有癌症的个体的存活率，即高水平的VHZ指明较低的存活率或概率，而低水平的VHZ指明较高的存活率或概率，两者都如与具有正常水平的VHZ的个体或关联群体相比的。因此，VHZ表达、量或活性的检测可以作为对患有癌症的个体预后的方法使用。
可以使用VHZ表达、量或水平的检测来测定特定疗法在患有癌症的个体中成功的可能性。它可以在测定个体中的肿瘤是否是或者是否有可能是侵入性或转移性肿瘤的方法中使用。
本文件中所描述的诊断方法可以与所描述的治疗方法组合。如此，我们提供了一种在个体中治疗、预防或减轻癌症的方法，该方法包括检测所述个体的细胞中的VHZ的表达、量或活性的调控，并基于所述肿瘤的攻击性来向所述个体施用合适的疗法。所述疗法可以包含如上文所描述的抗VHZ剂。
典型地，使用对组织或器官的身体检查和X射线来检测结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。通常可以采集肿瘤活检来进行组织病理学检查以诊断癌症。可以使用VHZ表达、量或活性的检测与标准的组织病理学规程一起来诊断此类癌症，或进一步证实此类癌症的诊断。这在组织病理学分析没有产生清晰结果时可以是特别有用的。
可以在样品中检测VHZ多肽和核酸的存在和数量，如下文更为详细地描述的。如此，可以通过如下方法来诊断VHZ相关疾病(包括结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌)，所述方法包括从自受试者衍生的样品测定VHZ多肽或VHZ mRNA的异常降低或升高的表达、量或活性，诸如升高的表达、量或活性。
所述样品可以包含来自患有或怀疑患有如下疾病的生物体或个体的细胞或组织样品，所述疾病与升高的、降低的或在其它方面异常的VHZ表达、量或活性(包括表达、量或活性的水平或样式的空间或时间变化)有关。比较患有或怀疑患有此类疾病的生物体中的VHZ表达、量或活性的水平或样式与正常生物体中的表达、量或活性的水平或样式可以有效作为诊断疾病的手段。
所述样品可以包含来自患有或怀疑患有结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌的个体的细胞或组织样品，诸如那些组织或细胞之任一种的组织或细胞样品。
在一些实施方案中，在样品中检测出升高的VHZ表达、量或活性水平。在与正常细胞或已知不是癌性的细胞相比时，VHZ的水平可以是程度显著地升高的。可以自所测试的个体，或另一名个体诸如那些与所测试个体在年龄、重量、生活方式等方面匹配的个体获得此类细胞。
在一些实施方案中，VHZ的表达、量或活性水平升高10％、20％、30％或40％或更多。在一些实施方案中，VHZ的表达、量或活性水平升高45％或更多，诸如50％或更多，如通过cDNA杂交所判断的。
可以以多种方式来检测VHZ的表达、量或活性，如本领域中已知的，和如下文更为详细地描述的。通常，测量来自个体的组织样品中的VHZ量，并与来自不受影响的个体的样品比较。可以测量VHZ核酸以及VHZ多肽水平两者。
可以使用VHZ量、活性或表达的检测来对结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌或睾丸癌分级。例如，高水平的VHZ量、活性或表达可以指明攻击性、侵入性或转移性癌症。类似地，低水平的VHZ量、活性或表达可以指明非攻击性、非侵入性或非转移性癌症。
此分级系统可以与已经建立的分级系统诸如Elston-Ellis改良的Scarff，Bloom，Richardson分级系统(也称为Nottingham分级系统(NGS))(5，6，Haybittle等，1982)一起使用。此系统是研究最多且广泛使用的乳房肿瘤分级方法。NGS基于表型评分规程，其牵涉对肿瘤细胞的形态学和细胞学特征进行显微镜检查评估，包括小管形成的程度、细胞核多形性和有丝分裂计数(6)。这些得分的总和将乳房肿瘤分层成等级I(G1)(充分分化的、缓慢生长中的)、等级II(G2)(中等分化的)、和等级III(G3)(较差分化的、高度增殖性的)恶性肿瘤。
可以使用许多不同技术来测定VHZ基因表达的水平。
在RNA水平测量VHZ的表达
可以在RNA水平检测VHZ基因表达。
因此，在一个实施方案中，我们公开了一种在样品中检测包含VHZ核酸的核酸的存在的方法，其如下进行，即使所述样品与对VHZ核酸特异性的至少一种核酸探针接触，并对所述样品监测VHZ核酸的存在。例如，所述核酸探针可以特异性结合VHZ核酸，或其一部分，并检测两者之间的结合；也可以检测复合物自身的存在。
如此，在一个实施方案中，可以在样品中测量VHZ mRNA形式的VHZ核酸的量。可以通过原位杂交、Northern印迹和逆转录酶-聚合酶链式反应来测定VHZ mRNA。可以通过原位杂交、Southern印迹、单链构象多态性、PCR扩增和DNA芯片分析来鉴定核酸序列，其使用特异性引物(Kawasaki，1990；Sambrook，1992；Lichter等，1990；Orita等，1989；Fodor等，1993；Pease等，1994)。
可以使用RNA提取技术(包括例如使用酸性酚/胍异硫氰酸盐提取(RNAzol B；Biogenesis)或RNeasy RNA制备试剂盒(Qiagen))自细胞提取VHZRNA。利用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核连缀测定法(nuclear run-onassay)、RT-PCR和RNA酶保护测定法(Melton等，Nuc.Acids Res.12：7035)。可以采用的检测方法包括放射性标记物、酶标记物、化学发光标记物、荧光标记物和其它合适的标记物。
这每一种方法容许进行定量测定，并且是本领域公知的。因此，可以使用本领域公知的对多核苷酸定量的任何方法在RNA水平测量降低的或升高的VHZ表达、量或活性。可以使用来自VHZ序列的任何合适的探针(例如合适的人VHZ序列的任何部分)作为探针。用于设计VHZ探针的序列可以包括具有登录号NM_015472的序列，或其部分。
典型地，使用RT-PCR来扩增RNA靶物。在此方法中，使用逆转录酶来将RNA转变成互补DNA(cDNA)，然后可以扩增所述互补DNA以便于检测。
许多DNA扩增方法是已知的，其中大多数依赖于酶促链式反应(诸如聚合酶链式反应、连接酶链式反应、或自主序列复制)或者复制它被克隆其中的载体的整个或部分。
许多靶物和信号扩增方法已经记载于文献中，例如这些方法的一般性综述记载于Landegren，U.等，Science 242：229-237(1988)和Lewis，R.，GeneticEngineering News 10：1，54-55(1990)。
例如，可以采用聚合酶链式反应来检测VHZ mRNA。
“聚合酶链式反应”或“PCR”是一种核酸扩增方法，其特别记载于美国专利号4,683,195和4,683,202。在诊断背景中可以使用PCR来扩增任何已知的核酸(Mok等，1994，Gynaecologic Oncology 52：247-252)。自主序列复制(3SR)是TAS的一种变型，其牵涉经由由酶混合物和合适寡核苷酸引物介导的连续多轮逆转录酶(RT)、聚合酶和核酸酶活性来等温扩增核酸模板(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874)。连接扩增反应或连接扩增系统使用DNA连接酶和4种寡核苷酸，每条靶链两种。此技术记载于Wu，D.Y.和Wallace，R.B.，1989，Genomics 4：560。在Qβ复制酶技术中，使用噬菌体Qβ的RNA复制酶(其复制单链RNA)来扩增靶DNA，如记载于Lizardi等，1988，Bio/Technology 6：1197的。
PCR规程基本上牵涉：(1)处理所提取的DNA以形成单链互补链；(2)添加一对寡核苷酸引物，其中该对中的一条引物与有义链中的序列的一部分基本上互补，而每对中的另一条引物与互补反义链中的相同序列的不同部分基本上互补；(3)使配对引物与互补序列退火；(4)从每条引物的3’末端同时延伸退火的引物以合成与每条引物所退火的链互补的延伸产物，其中所述延伸产物在与互补物分开后充当用于针对每对中的另一条引物合成延伸产物的模板；(5)分开所述延伸产物与所述模板以生成单链分子；并(6)通过重复至少一次所述退火、延伸和分开步骤来扩增所述单链分子。
可以采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。也可以使用定量RT-PCR。此类PCR技术是本领域公知的，并且可以采用来自VHZ序列的任何合适的引物。
也可以利用备选的扩增技术。例如，滚环扩增(Lizardi等，1998，Nat Genet19：225)是由DNA聚合酶驱动且能在等温条件下以线性或几何动力学复制环状寡核苷酸探针的商品化扩增技术(RCATTM)。一种别的技术，即链置换扩增(SDA；Walker等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：392)以对特定靶物独特的明确限定的序列开始。
在多肽水平测量VHZ表达
可以在多肽水平检测VHZ表达。
因此，在又一个实施方案中，可以通过检测样品中VHZ多肽的存在或量来检测VHZ表达、量或活性。这可以是通过使用结合VHZ多肽的分子来实现的。直接或间接结合VHZ多肽以便检测其存在的合适分子/试剂包括天然存在的分子诸如肽和蛋白质，例如抗体，或者它们可以是合成分子。
如此，我们公开了一种检测VHZ多肽的存在的方法，即使细胞样品与能够结合所述多肽的抗体接触，并对所述样品监测所述多肽的存在。
例如，可以使用抗VHZ抗体来检测VHZ多肽。可以通过本领域已知的手段(如下文更为详细地描述的)来制备此类抗体。例如，抗VHZ抗体可以包括任何针对VHZ的商品化抗体，诸如但不限于鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号LS-C32281，氨基酸35至90，LS-C42458，LS-A6806和LS-A6803，LS-C32281，LifeSpan Inc，Seattle，Washington，USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号DS-PB-00676，RayBiotech Inc，Norcross，Georgia，USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号XW-7857，ProSci Incorporated，Poway，California，USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号F4560和D9840-66A，United StatesBiological，Swampscott，Massachusetts，USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号D9840-66，United States Biological，Swampscott，Massachusetts，USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号AHP1142，AdB Serotec，Oxford，UnitedKingdom)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号NB110-40452，NovusBiologicals，Littleton，Colorado，USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号NB100-75328，Novus Biologicals，Littleton，Colorado，USA)。
这可以方便地通过监测抗体与多肽之间形成的复合物的存在，或者监测多肽与抗体之间的结合来实现。检测两个实体之间的结合的方法是本领域已知的，并且包括FRET(荧光共振能量转移)、表面等离振子共振等。
可以使用标准的实验室技术诸如如上文所描述的免疫印迹来检测改变的VHZ蛋白水平，如与相同细胞群体中的未处理细胞相比的。
也可以通过检测VHZ多肽的翻译后加工或VHZ核酸的转录后修饰的变化来测定基因表达。例如，可以测量VHZ多肽的差异磷酸化、对VHZ多肽的切割或对VHZ RAN的可变剪接等。可以使用专有的蛋白质测定法或技术诸如2D聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测基因产物诸如VHZ多肽的表达水平以及它们的翻译后修饰。
可以用于测定VHZ蛋白在自宿主衍生的样品中的水平的测定技术是本领域技术人员公知的。可以通过本领域已知的任何方法来对抗体测定免疫特异性结合。
可以使用的免疫测定法包括但不限于使用如下技术的竞争性和非竞争性测定系统，诸如Western印迹、放射性免疫测定法、ELISA、三明治式免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射计量测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法。此类测定法是本领域中常规的(参见例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，通过提及而完整收入本文)。
可以通过免疫组织化学和免疫细胞化学染色来对标本测定多肽/蛋白质(一般参见Stites和Terr，Basic and Clinical Immunology，Appleton and Lange，1994)、ELISA、RIA、免疫印迹、Western印迹、免疫沉淀、功能测定法和蛋白质截短测试。其它测定方法包括放射性免疫测定法、竞争性结合测定法、Western印迹分析和ELISA测定法。
ELISA测定法是本领域技术人员公知的。可以在测定法中使用多克隆和单克隆抗体两者。若合适的话，可以使用本领域技术人员已知的其它免疫测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)。可用的免疫测定法广泛记载于专利和科学文献中。参见例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521以及Sambrook等，1992。
诊断试剂盒
我们还提供了用于检测个体中的结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌或个体中对此类癌症的易感性的诊断试剂盒。
诊断试剂盒可以包含用于检测个体中的VHZ表达、量或活性的手段，其通过如本文件中所描述的任何手段来进行。因此，诊断试剂盒可以包含下列任何一种或多种：VHZ多核苷酸或其片段；VHZ核酸的或其片段的互补核苷酸序列；VHZ多肽或其片段，或针对VHZ的抗体，诸如包括针对VHZ的抗VHZ抗体，例如抗肽抗体人VHZ抗体。
诊断试剂盒可以包含使用指令或其它指示(indicia)。诊断试剂盒可以进一步包含用于治疗或预防结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌或睾丸癌的手段，诸如本文件中所描述的任何组合物，或本领域已知的用于治疗此类癌症的任何手段。具体地，诊断试剂盒可以包含如所描述的抗VHZ剂，例如通过筛选获得的。诊断试剂盒可以包含治疗药物诸如他莫昔芬(Tamoxifen，Nolvadex)或其变体诸如他莫昔芬、柠檬酸他莫昔芬或任何其它的抗雌激素或雌激素阻断剂。治疗药物也可以包括抗VHZ抗体。
预防和治疗方法
我们公开了治疗与VHZ表达或活性的量不足有关的异常状况诸如结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌的方法。预防此类癌症(即防范)的方法也适合采用相同或类似的办法。
一般而言，我们的方法牵涉通过调控(诸如下调)细胞中的VHZ表达、量或活性来操作癌细胞。可以在操作步骤前或后进行检测细胞中调控的VHZ表达、量或活性的步骤。检测步骤可以检测上调的或下调的VHZ表达、量或活性。可以使用调控或下调VHZ的任何方法，如本文件中别处详细描述的。
所述方法可以包括将细胞暴露于合适的siRNA、shRNA或嵌合RNAi。例如，可以采用DUSP23预先设计嵌合RNAi(产品目录编号H00054935-R01，Novus Biologicals，Littleton，Colorado，USA)来下调VHZ mRNA表达。嵌合RNA干扰(嵌合RNAi)是小干扰RNA/DNA嵌合物触发对初始基因mRNA的破坏的过程。嵌合RNAi详细记载于Ui-Tei K等，2008，Nucleic Acids Res.，2008年4月；36：2136-2151，Naito等Nucleic Acids Res.，2005年7月；33：W589-W591，Ui-Tei K等，2004，Nucleic Acids Res.2004年2月9日；32(3)：936-48及Naito等Nucleic Acids Res.2004年7月1日；32(网络服务器发表)：W124-9。
所述方法可以包括将细胞暴露于能够特异性结合VHZ的抗VHZ抗体。此类抗体可以包括任何商品化的抗VHZ抗体，如上文所列出的。
依照我们的方法，由于所述操作，癌细胞变为非癌性的或者侵入性或转移性癌细胞变为非侵入性的或非转移性的。具体地，癌症可以包括结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。它可以包括侵入性或转移性癌症。
因为VHZ与结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌的攻击性和侵入性有关，可以在患有癌症的个体的细胞中、在癌或非癌细胞中检测VHZ的水平，并且评估癌症的攻击性。与正常的细胞相比高水平的VHZ量、表达或活性指明攻击性或侵入性癌症，因此可需要和选择更强的或更严厉的疗法。类似地，较低水平可指明攻击性或侵入性较小的疗法。
一般而言，可以使用本文所描述的办法来治疗任何VHZ相关疾病。VHZ相关疾病包括增殖性疾病，并且特别包括癌症。例如，VHZ相关疾病可以包括结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌，诸如转移性、侵入性或攻击性结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。
若相对于对照而言与疾病有关的状况受到显著抑制(即达50％或更多)，则VHZ相关疾病被定义为得到“治疗”。所述抑制相对于对照而言可以达至少75％，诸如相对于对照而言达90％、95％或100％。所述状况可以包括细胞增殖，或者它可以包括细胞周期时间、细胞数目、细胞迁移、细胞侵入性等。术语“治疗/处理”还包括预防或减轻癌症。
VHZ多肽表示疗法抑制其功能的靶物，特别是在肿瘤细胞和其它增殖性细胞中。
术语增殖性病症在本文中以广义使用，包括需要控制细胞周期的任何病症。具体地，增殖性病症包括恶性的和肿瘤发生前的(pre-neoplastic)病症。本文所描述的方法和组合物涉及治疗或诊断腺癌是特别有用的，诸如：小细胞肺癌、和肾癌、子宫癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌和乳腺癌。例如，可治疗的恶性肿瘤包括急性和慢性白血病(leukaemia)、淋巴瘤(lymphoma)、骨髓瘤(myeloma)、肉瘤(sarcomas)诸如纤维肉瘤(fibrosarcoma)、粘液肉瘤(myxosarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、内皮肉瘤(endotheliosarcoma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)、骨源性肉瘤(osteogenicsarcoma)、脊索瘤(chordoma)、淋巴管肉瘤(lymphangiosarcoma)、滑膜瘤(synovioma)、间皮瘤(mesothelioma)、平滑肌肉瘤(leimyosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、结肠癌(colon carcinoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、乳腺癌(breast cancer)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、腺癌(adenocarcinoma)、汗腺癌(sweat gland carcinoma)、皮脂腺癌(sebaceousgland carcinoma)、乳头状癌(papillary carcinoma)、乳头状腺癌(papillaryadenocarcinomas)、囊腺癌(cystadenocarcinoma)、髓样癌(medullary carcinoma)、支气管癌(bronchogenic carcinoma)、绒毛膜癌(choriocarcinoma)、肾细胞癌(renal cell carcinoma)、肝瘤(hepatoma)、胆管癌(bile duct carcinoma)精原细胞瘤(seminoma)、胚胎性癌(embryonal carcinoma)、宫颈癌(cervical cancer)、睾丸肿瘤(testicular tumour)、肺癌(lung carcinoma)、小细胞肺癌(small cell lungcarcinoma)、膀胱癌(bladder carcinoma)、上皮癌(epithelial carcinoma)、胶质瘤(glioma)、星形细胞瘤(astrocytoma)、室管膜瘤(ependymoma)、松果体瘤(pinealoma)、成血管细胞瘤(hemangioblastoma)、听神经瘤(acoustic neuoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、颅咽管瘤(craniopharyngioma)、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤(melanoma)、成神经细胞瘤(neutroblastoma)和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)。
可以使用本文所描述的方法和组合物来治疗或诊断脑癌、食管癌、胃癌、皮肤癌和睾丸癌。可以使用它们来治疗或诊断鳞状细胞癌，诸如唇癌、喉癌、外阴癌、宫颈癌、阴茎癌等。
一种有可能用于治疗此类病症的办法是表达针对VHZ多核苷酸的反义构建体，如本文所描述的，并向肿瘤细胞施用它们，以便抑制基因功能，并阻止肿瘤细胞生长或进展。
可以使用反义构建体来抑制基因功能以阻止增殖性细胞的生长或进展。反义构建体，即与有义核酸或mRNA互补的核酸诸如RNA构建体详细记载于US 6,100,090(Monia等)及Neckers等，1992，Crit Rev Oncog 3(1-2)：175-231，通过提及而明确收入所述文件的教导。
在一个具体的例子中，结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌或睾丸癌可以如下治疗或预防，即通过例如能够结合和破坏VHZ mRNA的siRNA来完全或部分降低VHZ的量、表达或活性。我们明确提供了一种通过RNA干扰来下调VHZ的抗VHZ剂。抗VHZ剂可以包括小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。它可以包括嵌合RNAi，诸如DUSP23预先设计嵌合RNAi(产品目录编号H00054935-R01，Novus Biologicals，Littleton，Colorado，USA)。
RNA干扰(RNAi)是一种通过直接引入双链RNA(dsRNA)诱导的转录后基因沉默(PTGS)的方法，并且已经显现为用于敲除多种生物体中的特定基因的表达的有用工具。RNAi记载于Fire等，Nature 391：806-811(1998)。PTGS的其它方法是已知的，并且包括例如引入转基因或病毒。一般而言，在PTGS中，所沉默的基因的转录物被合成但不积累，因为其被快速降解。用于PTGS的方法(包括RNAi)记载于例如Ambion.com万维网网站，在目录“/hottopics/”中，在“rnai”文件中。
本文中描述了适用于体外RNAi的方法。一种此类方法牵涉引入siRNA(小干扰RNA)。当前的模型指明这些21-23个核苷酸的dsRNA能诱导PTGS。用于设计有效的siRNA的方法记载于例如上文所描述的Ambion网站。RNA前体诸如短发夹RNA(shRNA)也可以由整个或部分VHZ核酸序列编码。
或者，双链(ds)RNA是一种干扰一系列生物体中的基因表达的有力方式，最近已经显示了其在哺乳动物中是成功的(Wianny和Zernicka-Goetz，2000，Nat Cell Biol2：70-75)。可以将对应于VHZ多核苷酸序列的双链RNA导入候选生物体的卵母细胞和细胞中或者在其中进行表达以干扰VHZ活性。
调控VHZ基因表达的其它方法是本领域技术人员已知的，并且包括显性负性办法。如此，另一种办法是使用本文件中的VHZ多肽的非功能性变体，其与内源基因产物竞争，导致功能抑制。VHZ的非功能性变体的一个例子是人序列(或对应人序列)的第95位半胱氨酸突变。实施例显示磷酸酶和相关生物学活性缺陷的VHZ C95S变体的生成和使用。
也可以通过引入抑制基因表达或功能活性的肽或小分子来调控VHZ基因表达。如此，可以向肿瘤或增殖性细胞施用通过本文所描述的测定法鉴定为结合或调控诸如下调VHZ多肽的量、活性或表达的化合物以阻止VHZ多肽的功能。可以与药学可接受载体一起以有效下调VHZ表达或活性的量施用此类化合物，或者通过活化或下调控制VHZ表达、活性或量的第二信号，由此减轻异常状况。
针对如本文中所描述的VHZ多肽的合适抗体也可以作为治疗剂使用。抗VHZ抗体可以包括针对VHZ的家兔抗VHZ抗体。此外，抗VHZ抗体可以包括下列任何一项或多项：鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号LS-C32281，氨基酸35至90，LS-C42458，LS-A6806和LS-A6803，LS-C32281，LifeSpan Inc，Seattle，Washington，USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号DS-PB-00676，RayBiotech Inc，Norcross，Georgia，USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号XW-7857，ProSciIncorporated，Poway，Calfornia，USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号F4560和D9840-66A，United States Biological，Swampscott，Massachusetts，USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号D9840-66，United StatesBiological，Swampscott，Massachusetts，USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号AHP1142，AdB Serotec，Oxford，United Kingdom)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号NB110-40452，Novus Biologicals，Littleton，Colorado，USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号NB100-75328，Novus Biologicals，Littleton，Colorado，USA)。
或者，可以采用基因疗法来控制受试者中相关细胞诸如结肠、肺、鳞状细胞(包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎)、胰腺、脑、食管、胃、膀胱、肾、皮肤、卵巢、前列腺和睾丸细胞进行的VHZ内源生成。例如，可以工程化改造编码VHZ siRNA或其一部分的多核苷酸以在复制缺陷型逆转录病毒载体中表达，如下文所讨论的。然后可以分离逆转录病毒表达构建体，并导入用含有编码抗VHZ siRNA的RNA的逆转录病毒质粒载体转导的包装细胞中，使得所述包装细胞此刻生成含有感兴趣序列的感染性病毒颗粒。可以给受试者施用这些生产细胞以在体内工程化改造细胞，并在体内调节VHZ多肽的表达。关于基因疗法的综述，参见第20章，Gene Therapy and other MolecularGenetic-based Therapeutic Approaches，(及其中所引用的参考文献)于HumanMolecular Genetics，T Strachan和A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)。
在一些实施方案中，VHZ的水平在结肠、肺、鳞状细胞(包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎)、胰腺、脑、食管、胃、膀胱、肾、皮肤、卵巢、前列腺和睾丸细胞中是降低的。此外，在此类实施方案中，治疗可以靶向此类细胞，或者是对此类细胞特异性的。VHZ的表达可以仅在患病的细胞(即那些癌性细胞)中特异性降低，而在其它不患病的细胞中基本上不降低。在这些方法中，VHZ的表达在其它细胞(即非结肠、肺、鳞状上皮细胞(包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎)、胰腺、脑、食管、胃、膀胱、肾、皮肤、卵巢、前列腺和睾丸细胞的细胞)中基本上不降低。如此，在此类实施方案中，VHZ的水平在治疗过程中或者在治疗后在此类细胞中保持基本上相同或相似。
结肠、肺、鳞状细胞(包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎)、胰腺、脑、食管、胃、膀胱、肾、皮肤、卵巢、前列腺和睾丸细胞特异性的VHZ水平降低可以通过靶向施用，即仅向此类而非其它细胞应用治疗来实现。然而，在其它实施方案中，采用此类细胞中(而基本上不在其它细胞或组织类型中)的VHZ表达下调。此类方法可以有利地利用组织或器官特异性表达载体来进行例如siRNA的组织或器官特异性表达，如下文更为详细地描述的。
转基因(抗VHZ siRNA)的组织特异性表达
癌基因疗法不得不选择性靶向肿瘤组织从而降低正常组织中的不想要的副作用。将转基因表达靶向恶性组织需要使用特定的调控元件，包括基于肿瘤生物学的启动子、组织特异性启动子和诱导型调控元件(A1)。
基于肿瘤生物学的启动子
某些基因在结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌中是上调的。可以使用这些基因的启动子来驱动转基因的肿瘤选择性表达，其使用重组复制缺陷型逆转录病毒载体来实现。乳腺癌的此类基因的例子包括血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)和VEGFR-2，已知它们在乳腺癌中以肿瘤阶段依赖性方式上调(A2)。c-erbB2癌基因在乳腺癌中选择性上调(A3，A6)。L-丝束蛋白(plastin)，即一种人肌动蛋白结合蛋白在恶性上皮细胞中而不是正常组织中(只是在成熟的造血细胞中有低水平表达)进行组成型且丰富的表达(A4)。已经发现了抗凋亡基因Bc1-2在乳腺癌细胞中上调(A5)。与正常的乳房组织相比，人乳房肿瘤表达高水平的MUC1(A7)。
组织特异性启动子
某些基因在乳房组织中特异性表达。此类基因的例子是人α-乳清蛋白(ALA)和绵羊β-乳球蛋白(BLG)。可以使用此类基因的启动子来驱动腺病毒载体中的转基因以乳腺癌细胞特异性方式表达(A8)。可以通过修改对此组织具有亲和力的病毒诸如小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)来进行乳腺癌的基因疗法。可以使用此逆转录病毒的糖皮质激素响应性长末端重复(LTR)作为启动子用于转基因的糖皮质激素诱导的表达(A9)。
诱导型启动子
使用诱导型启动子作为瞬时转基因表达的介导物。放射或化学治疗处理后，多种应激基因在乳房肿瘤中是上调的。此类应激基因的例子是热休克蛋白(HSP)(A10)和多抗药性基因-1(MDR-1)(A11)。因此，可以使用这些基因的启动子来驱动转基因在已经进行过放射或化学疗法的乳腺癌中的肿瘤特异性表达。
通常通过直接瘤内注射含有感兴趣转基因的复制缺陷型腺病毒表达载体来实现转录靶向的基因疗法(A6，A12，A13)。也可以通过瘤内注射与阳离子脂质体形成的脂质复合物来投递转基因(A14，A15)。
癌症
依照本文所描述的方法和组合物，VHZ对于诊断或治疗结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌是有用的。若本文件提及“癌症”，则这应当理解成包括转移性、攻击性或侵入性癌症。例如，所述癌症可以是与VHZ过表达有关的癌症。这意味着所讨论的癌症的癌细胞与非癌细胞相比展示出水平升高的VHZ表达或活性(或两者)。
诊断
我们的诊断方法可以与结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌的任何已知诊断方法一起使用。
治疗
已知的针对结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌的治疗可以由下列任何一项或多项组成：手术、放射疗法、化学疗法、高剂量化学疗法、激素疗法和免疫疗法。因而，本文所描述的任何治疗方法可以与任何一种或多种在先已知疗法组合。另外，可以使用任何一种或多种已知对治疗或减轻癌症有效的下列一般疗法。
非特异性免疫调节剂
非特异性免疫调节剂是刺激或间接提升免疫系统的物质。通常，这些药剂靶向关键的免疫系统细胞，并引起次反应诸如升高的细胞因子和免疫球蛋白生成。癌症治疗中使用的两种非特异性免疫调节剂是卡介苗(BCG)和左旋咪唑(levamisole)。本文所描述的抗VHZ剂可以与任何此类非特异性免疫调节剂一起使用。
生物学应答修饰剂
可以在实验室中生成一些抗体、细胞因子、和其它免疫系统物质以在癌症治疗中使用。这些物质通常称作生物学应答修饰剂(BRM)。它们改变身体的免疫防御与癌细胞之间的相互作用以加强、指导、或恢复身体抵抗疾病的能力。BRM包括干扰素、白介素、集落刺激因子、单克隆抗体、和疫苗。本文所描述的抗VHZ剂可以与任何此类生物学应答修饰剂一起使用。
干扰素(IFN)
有三种主要类型的干扰素-干扰素α、干扰素β、和干扰素γ；干扰素α是癌症治疗中最广泛使用的类型。
干扰素能改善癌症患者的免疫系统针对癌细胞起作用的方式。另外，干扰素可以直接对癌细胞起作用，其通过减缓它们的生长或促进它们形成更具正常行为的细胞来实现。一些干扰素还可以刺激NK细胞、T细胞、和巨噬细胞，加强免疫系统的抗癌功能。
本文所描述的抗VHZ剂可以与任何此类干扰素一起使用。
白介素(IL)
与干扰素一样，白介素是身体中天然存在的细胞因子。已经鉴定出许多白介素；白介素-2(IL-2或阿地白介素)已经在癌症治疗中进行了最广泛的研究。IL-2刺激许多能破坏癌细胞的免疫细胞诸如淋巴细胞的生长和活性。
本文所描述的抗VHZ剂可以与任何此类白介素一起使用。
集落刺激因子(CSF)
集落刺激因子(CSF)(有时称作造血生长因子)通常不直接影响肿瘤细胞；更确切地，它们促进骨髓干细胞分裂和发育成白细胞、血小板、和红细胞。骨髓对于身体的免疫系统是至关重要的，因为它是所有血细胞的来源。
G-CSF(非格司亭(filgrastim))和GM-CSF(沙格司亭(sargramostim))能增加白细胞的数目，由此降低接受化学疗法的患者的感染风险。G-CSF和GM-CSF还能刺激干细胞的生成，为干细胞或骨髓移植作准备；(促)红细胞生成素能增加红细胞的数目，并降低接受化学疗法的患者对输注红细胞的需要；而奥普瑞白介素(Oprelvekin)能降低接受化学疗法的患者对输注血小板的需要。
本文所描述的抗VHZ剂可以与任何此类集落刺激因子一起使用。
单克隆抗体(单抗)
本文所描述的抗VHZ剂可以与已知可用于治疗结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌的单克隆抗体一起使用。
结肠癌
肺癌详细记载于自其改编以下段落的美国专利5,861,494。
胃肠道是美国每年发生的新诊断的癌症和致命性癌症两者的最常见的位置，数字对于男性比对于女性稍高。
在美国的结肠癌发生率在升高，而胃癌的发生率在降低，小肠癌是罕见的。胃肠癌的发生率在地理上有所变化。胃癌在日本是常见的，而在美国是不常见的，然而结肠癌在日本是不常见的，而在美国是常见的。显示迁移至高风险区域的人呈现高风险的统计学数据强烈提示了环境的病因学因素。一些提示的关于胃癌的病因学因素包括黄曲霉毒素(即一种由黄曲霉(aspergillus flavus)形成并存在于受污染的食物中的致癌原)、熏鱼、酒精、和维生素A和镁缺乏。脂肪高且体积低的饮食和有可能地固醇代谢的降解产物可以是结肠癌的病因学因素。某些病症可以易患癌症，例如恶性贫血易患胃癌，未治疗的非热带口炎性腹泻和免疫缺陷易患淋巴瘤和癌瘤，而溃疡性和肉芽肿性结肠炎、孤立性息肉(isolated polyps)、和遗传性家族性息肉病(inherited familial polyposis)易患结肠癌。
最常见的结肠肿瘤是腺瘤性息肉(adenomatous polyp)。原发性淋巴瘤在结肠中是罕见的，而在小肠中是最常见的。
腺瘤性息肉是最常见的良性胃肠肿瘤。它们遍及整个GI道发生，最通常在结肠和胃中，而且在男性中比在女性中更常发现。它们可以是单一的，或者更常见地为多发性的，而且是无柄的或有柄的。它们可以是遗传性的，如在家族性息肉病和加德纳氏综合征(Gardener’s syndrome)(其主要牵涉结肠)中的。结肠癌的形成在家族性息肉病中是常见的。息肉常常引起出血，其可以隐蔽的(occult)或严重的(gross)，但是很少引起疼痛，除非并发症随之发生。乳头状腺瘤(papillary adenoma)(一种仅在结肠中找到的不太常见的形式)还可以引起电解质损失和类粘蛋白释放。
恶性肿瘤包括结肠癌，其可以是浸润的或外生性的，并且最通常在直肠乙状结肠中发生。由于升结肠的内容物是液体，此区域中的癌瘤通常不引起阻塞，但是患者趋于在疾病过程晚期呈现贫血(anemia)、腹部疼痛(abdominalpain)、或腹块(abdominal mass)或可触知的块(palpable mass)。
结肠肿瘤的预后取决于肠壁侵入的程度和局部淋巴结牵涉和远距离转移的存在。直肠和降结肠癌瘤的预后好得相当出乎意料。在结侵入形成前通过早期切除术，80至90％的治愈率是有可能的。出于此原因，在解释不明的贫血、隐性胃肠出血、或肠习性变化在先前健康的患者中形成时，必须很小心排除此疾病。在其扩散至淋巴结前将损伤完全除去为结肠癌患者提供最好的存活机会。在无症状的患者中通过隐性出血、血液筛选进行的检测导致最高五年的存活。
通常可以在放射线学上检测临床上怀疑为恶性的损伤。会容易地漏过小于1cm的息肉，尤其在上部乙状结肠中和在存在憩室病的情况中。可以通过与通过直接活组织检查和刷饮食学(brush sitology)进行的组织学组织诊断组合的纤维光学内镜检查术来确认食管、胃或结肠中在临床上怀疑的和在放射线学上检出的损伤。结肠镜检查术是另一种用于检测结肠疾病的方法。经常在结肠镜检查术上检测出通过X-射线不显现的良性和恶性息肉。另外，在X-射线上具有一处损伤的患者常常具有在结肠镜检查术上检出的别的损伤。然而，乙状结肠镜检查仅检出约50％的结肠肿瘤。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防结肠癌。它们可以与上文所描述的用于治疗结肠癌的任何方法联合。
肺癌
肺癌详细记载于自其改编以下段落的美国专利5,733,748。
肺是两个海绵样器官。空气经由气管进入肺中。气管分成称作支气管的管，其分成称作细支气管的更小的分支。在细支气管末端是称为肺泡的微小气囊。许多微小的血管贯穿肺泡，将氧从吸入的空气吸收入血流中，并释放二氧化碳。吸收氧和除去二氧化碳是肺的主要功能。称作胸膜的光滑衬里围绕着肺。此衬里保护肺，而且在它们在呼吸过程中扩张和收缩时帮助它们来回滑动。
大多数肺癌在支气管的衬里中开始。这就是为什么关于肺癌的另一项术语是支气管源性癌症(bronchogenic cancer)。肺癌也可以在支气管的衬里下的腺中形成，通常在肺的外周。认为肺癌在一段多年的时间里形成。首先，可以有肺的癌前变化的区域。这些癌前变化常常进展成真正的癌症。能够检测这些癌前变化会是非常有用的。随着癌症形成，癌细胞能生成引起新血管在附近形成的化学物。这些新血管滋养癌细胞，其能继续生长并形成大得足以在X-射线上看到的肿瘤。来自癌症的细胞能脱离初始肿瘤，并扩散至身体的其它部分。此过程称作转移。
肺癌有两种主要类型：小细胞肺癌(SCLC)和非细胞肺癌(NSCLC)。若肺癌具有这两种类型的特征，则它称作混合型小细胞/大细胞癌。
所有肺癌中约13％是小细胞类型(SCLC)，以构成这些癌症的小圆细胞命名。SCLC趋于遍及身体广泛扩散。癌细胞能快速繁殖，形成大的肿瘤，并扩散至淋巴结和其它器官诸如骨、脑、肾上腺、和肝。此类癌症常常在接近胸部中央的支气管中开始。小细胞肺癌几乎总是由吸烟引起的。从不吸烟的人患有小细胞肺癌是非常罕见的。关于SCLC的其它名称是燕麦细胞癌(oatcell carcinoma)和小细胞未分化癌(small cell undifferentiated carcinoma)。
剩余的87％肺癌是非小细胞(NSCLC)。NSCLC有三种亚型。这些亚型中的细胞在大小、形状、和化学构成上不同。所有肺癌中约25％-30％是鳞状细胞癌。它们与吸烟史有关，而且趋于在支气管附近在中央发现。腺癌占肺癌的约40％。通常在肺的外部区域中找到腺癌。患有称为细支气管肺泡癌(bronchioloalveolar carcinoma)(有时称作细支气管肺泡癌(bronchoalveolarcarcinoma或bronchioalveolar carcinoma))的一类腺癌的人趋于比那些患有其它类型的肺癌的人具有更好的预后。大细胞未分化癌是占肺癌的约10％-15％的一类癌症。它可以在肺的任何部分中出现，而且它趋于快速生长并扩散，导致不良预后。
在2种主要类型的肺癌外，其它肿瘤可以在肺中发生。这些中的一些是非癌性的(良性的)。肺的类癌肿瘤占肺肿瘤的少于5％。大多数是缓慢生长的肿瘤，其称作典型性类癌肿瘤。它们一般通过手术治愈。虽然一些典型性类癌肿瘤可以扩散，但是它们通常比小细胞或非小细胞肺癌具有更好的预后。介于良性类癌和小细胞肺癌之间的癌症称为非典型性类癌肿瘤。
肺癌阶段
分期(staging)是确定癌症是多么局部化或分布广泛的过程。它描述癌症已经扩散了多远。治疗和预后很大程度上取决于癌症的阶段。使用诸如CT、MRI、扫描、骨髓活检、纵隔镜检查术、和血液测试等测试来对癌症分期。
非小细胞肺癌的分期
用于描述非小细胞肺癌(NSCLC)生长和扩散的系统是TNM分期系统，又称为美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)系统。T代表肿瘤(其大小和其已经在肺内和向邻近的器官扩散了多远)，N代表扩散至淋巴结，而M代表转移(扩散至远离的器官)。在TNM分期中，将关于肿瘤、淋巴结、和转移的信息组合，并将阶段指派特定的TNM分组。使用数字0和I至IV(1至4)的罗马数字来描述分组的阶段。将一些阶段细分成A和B。
在一些癌症中，使用称作等级的另一种测量。这反映病理学家评估癌症如何快速生长和其多么可能要扩散。这通常不对肺癌进行。
非小细胞肺癌T期
Tis：仅在给气道做衬里的细胞层中发现癌症。它尚未侵入其它肺组织。此阶段又称为原位癌。
T1：癌症不大于3厘米(略小于11/4英寸)，尚未扩散至围绕肺的膜(内脏胸膜)，而且不影响支气管的主要分支。
T2：癌症具有下列一项或多项特征：它大于3cm；它牵涉主支气管，但是与气管(风管)分支成左和右主支气管的点(脊)不近于2cm(约3/4英寸)；它已经扩散至围绕肺的膜(胸膜)。癌症可以部分阻塞气道，但是这尚未引起整个肺萎陷或形成肺炎。
T3：癌症具有下列一项或多项特征：扩散至胸壁、分开胸与腹的呼吸肌(膈)、两个肺之间的空间周围的膜(纵隔胸膜)、或心脏周围的囊的膜(壁层心包)；侵入主支气管，而且与风管(气管)分支成左和右主支气管的点近于2cm(约3/4英寸)，但是不影响此区域；已经生长入气道中，足以引起整个肺萎陷或在整个肺中引起肺炎。
T4：癌症具有下列一项或多项特征：扩散至胸骨后和心脏前的空间(纵隔)心脏，在那里风管分支成左和右主支气管；两个或更多个分开的肿瘤小结存在于同一叶、风管(气管)、食管(连接喉与胃的管)、脊柱、或点中；在肺周围的空间中有含有癌细胞的流体。
非小细胞肺癌N期
N0：没有扩散至淋巴结。
N1：扩散至肺内和/或位于支气管进入肺的区域周围(门淋巴结)的淋巴结。转移影响仅与癌性肺同一侧的淋巴结。
N2：扩散至风管分支成左和右支气管的点周围或胸骨后和心脏前的空间(纵隔)中的淋巴结。受影响的淋巴结在癌性肺的同一侧。
N3：扩散至任一侧锁骨附近的淋巴结，扩散至癌性肺相反侧的门淋巴结或纵隔淋巴结。
非小细胞肺癌M期
M0：没有扩散至远离的器官或区域。认为远离的位置包括其它肺叶、比那些在N期中提及的淋巴结远的淋巴结、和诸如肝、骨、或脑等其它器官或组织。
M1：癌症已经远距离扩散。
用于非小细胞肺癌的阶段分组
一旦已经分配T、N、和M种类，将此信息组合(阶段分组)以分配0、I、II、III、或IV的总体阶段。具有较低阶段数字的患者具有较好的预后。
0期；Tis、N0、M0：仅在给气道做衬里的细胞层中发现癌症。它尚未侵入其它肺组织，也没有扩散至淋巴结或远离的位置。
IA期；T1、N0、M0：癌症不大于3厘米，尚未扩散至围绕肺的膜，不影响支气管的主要分支，而且尚未扩散至淋巴结或远离的位置。
IB期；T2、N0、M0：癌症大于3cm，或者牵涉主支气管，但是不接近脊或者它已经扩散至胸膜或者癌症部分阻塞气道。它尚未扩散至淋巴结或远离的位置。
IIA期；T1、N1、M0：癌症不大于3厘米，尚未扩散至围绕肺的膜，不影响支气管的主要分支。它已经扩散至邻近的淋巴结或门淋巴结，但尚未扩散至远离的位置。
IIB期；T2、N1、M0或T3、N0、M0：癌症大于3cm，或者牵涉主支气管，但是不接近脊或者它已经扩散至胸膜或者癌症部分阻塞气道。它已经扩散至邻近的淋巴结或门淋巴结，但尚未扩散至远离的位置。或者，它已经扩散至胸壁或膈、纵隔胸膜、或围绕心脏的膜，或者它侵入主支气管，而且接近脊或者它已经生长入气道中，足以引起整个肺萎陷或在整个肺中引起肺炎。它尚未扩散至淋巴结或远离的位置。
IIIA期；T1或2、N2、M0或T3、N1或2、M0：癌症可以是任何大小，或者牵涉主支气管，但是不接近脊或者它已经扩散至胸膜或者癌症部分阻塞气道。它已经扩散至胸中间(纵隔)的结，但是尚未扩散至远离的位置。或者，它已经扩散至胸壁或膈、纵隔胸膜、或围绕心脏的膜，或者它侵入主支气管，而且接近脊或者它已经生长入气道中，足以引起整个肺萎陷或在整个肺中引起肺炎。它已经扩散至与癌症同一侧的胸中的任何地方的淋巴结，但是尚未扩散至远离的位置。
IIIB期；T1、2或3、N3、M0或T4、N0、1、2或3、M0：癌症可以是任何大小。它已经扩散至任一侧的锁骨周围的淋巴结，或者扩散至癌性肺相反侧的门淋巴结或纵隔淋巴结。或者，它已经扩散至纵隔、心脏、风管(气管)、食管(连接喉与胃的管)、脊柱、或脊，或者两个或更多个分开的肿瘤小结存在于同一叶中，或者肺周围的空间中有含有癌细胞的流体。癌症可以已经或尚未扩散至淋巴结。它尚未扩散至远离的位置。
IV期；任何T、任何N、M1：癌症已经扩散至远离的位置。
小细胞肺癌的分期
虽然小细胞肺癌可以与NSCLC一样分期，但是大多数医生优选2期系统。存在有“局限期”和“广泛期”。局限期通常意味着癌症仅在一个肺中和在同一侧胸的淋巴结中。
癌症扩散至另一个肺，至另一侧胸的淋巴结，或至远离的器官指明广泛性疾病。许多医生认为已经扩散至肺周围的流体的小细胞肺癌是广泛期。
以此方式对小细胞肺癌分期，因为它有助于分开具有好的预后而且可以治愈的患者与具有较坏的前景且没有治愈机会的患者。约三分之二的患有小细胞肺癌的人在其癌症首次被发现时患有广泛性疾病。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防肺癌。它们可以与上文所描述的用于治疗肺癌的任何方法联合。
鳞状细胞癌
鳞状细胞癌详细记载于自其改编以下段落的美国专利6,432,452。
将皮肤暴露于阳光的紫外光成分与形成皮肤癌诸如恶性黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌，主要为基底细胞癌(basal cell carcinomas，BCC)和鳞状细胞癌(SCC)之间有强的联系。这些癌症的发生率在全世界快速增加。在英国，在1994年有4000例新诊断的恶性黑素瘤病例，在过去10年里增加了80％(Wessex Cancer Trust，1996)。在美国，预期约34,100例新病例，每年升高4％。澳大利亚昆士兰具有世界上最高的黑素瘤发生率，但是早期检测和普遍的公共健康活动及宣传使用遮光剂和降低紫外暴露已经帮助降低死亡数目。BCC目前影响英国群体中的1,000分之一，而且发生率在过去20年中已经增加大于一倍(Imperial Cancer Research Fund，U.K.，1997)。与1990年的600,000例和1980年的400,000例相比，预期在1997年在美国诊断出一百万新的BCC和SCC病例(Naional Oceanic and Atmospheric Administration U.S.A.，1997)。在澳大利亚，没有理由怀疑相似升高的发生率也不会适用，尽管广泛宣传日光和UV照射的危险，其中昆士兰群体有最大的风险。
所有皮肤癌的超过90％在定期暴露于阳光或其它紫外照射的皮肤区域上发生，其中U.V.B.造成灼伤皮肤，而且与恶性黑素瘤有关，而U.V.A.与过早的皮肤老化及BCC和SCC形成有关(Wessex Cancer Trust，1996)。已经将儿童太阳暴露与较年轻的成人中的恶性黑素瘤形成联系起来。其它风险因素包括遗传素因(白皙的肤色、许多皮肤痣)、化学污染、过度暴露于X-射线、和暴露于一些药物和杀虫药。认为消减平流层的臭氧层促成皮肤癌的长期升高。
到目前为止，手术除去是最常见的用于恶性黑素瘤、BCC和SCC的治疗。这可以采用电干燥法和刮除术、冷冻手术、简单的广泛切除、显微照相手术或激光疗法形式。在较晚的形成阶段检测出癌症时使用的其它治疗是外部放射疗法，化学疗法或在较小的程度上生物免疫疗法或光动力学疗法。治疗的选择取决于疾病的类型和阶段及患者的年龄和健康(National Cancer Institute，U.S.A.，1997)。
所有目前的治疗受到严重限制。主要的顾虑是切除位置处的癌性细胞识别差和复发概率高，需要追踪手术和治疗，具有进一步毁容和结疤的风险。在一份出版物中，报告的不完全切除BCC的比率是30-67％(Sussman和Liggins，1996)。与手术有关的免疫抑制可以引起任何剩余的细胞增殖，而且增加转移的风险。在黑素瘤患者中，有如下的高风险，即癌症在初始手术时已经转移，而且导致死亡的晚期复发是常见的。目前手术的备选诸如放射疗法和化学疗法也携带免疫抑制和特异性较差的风险。免疫疗法和基因疗法有最大的希望，但是这些的合理应用有可能仍要等数十年。
在肿瘤超过适合手术的阶段时，最常见的用于所有类型的黑素瘤或转移性皮肤癌的治疗是化学疗法，其在很大程度上没有获得成功(Beljanski和Crochet，1996)。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防鳞状细胞癌。它们可以与上文所描述的用于治疗鳞状细胞癌的任何方法联合。
胰腺癌
胰腺癌详细记载于自其改编以下段落的美国专利7,405,227。
胰腺癌可以包含胰管组织中的上皮样癌瘤和胰管中的腺癌。
最常见的胰腺癌类型是腺癌，其在胰管的衬里中发生。可用于胰腺癌的可能的治疗是手术、免疫疗法、放射疗法、和化学疗法。可能的手术治疗选项包括远端或完全胰切除术和胰十二指肠切除术(Whipple规程)。
放射疗法可以是胰腺癌患者的一个选项，特异性外部束照射，其中通过身体外部的机器将照射聚焦于肿瘤。另一个选项是在手术过程中施用的术中电子束照射。
可以使用化学疗法来治疗胰腺癌患者。合适的抗癌药物包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、丝裂霉素(mitomycin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、多柔比星(doxorubicin)、链佐星(steptozocin)、氯脲菌素(chlorozotocin)、和其组合。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防胰腺癌。它们可以与上文所描述的用于治疗胰腺癌的任何方法联合。
脑癌
脑癌详细记载于自其改编以下段落的美国专利7,148,252。
每年有约10,000例脑肿瘤发生，并且每年有约4000例脊髓肿瘤发生(Komblith等(1985)，Cancer：Principles and Practice of Oncology，第2增补版，DeVita，V.，Hellman，S.，Rosenberg，S.编，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，第41章：Neoplasms of the Central Nervous System)。中枢神经系统(CNS)肿瘤包含年轻患者中最常见的实体瘤组(同上)。胶质瘤(glioma)包含所有原发性CNS肿瘤的约60％，其中最常见的脑原发性肿瘤是星形细胞瘤(astrocytoma)、脑膜瘤(meningioma)、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)和组织细胞淋巴瘤(histocytic lymphoma)(同上)。胶质瘤通常在脑的大脑半球中发生，但是可以在诸如视神经、脑干或小脑等其它区域中发现(Brain Tumor Society；www/tbts.org/primary.htm)。
依照它们起源的神经胶质细胞类型将胶质瘤分类成组(同上)。最常见的胶质瘤类型是星形细胞瘤。这些肿瘤从称作星形胶质细胞的星形状的神经胶质细胞形成。星形细胞瘤依照其恶性来归入等级。低等星形细胞瘤(又称为I级和II级星形细胞瘤)是恶性最小的，相对缓慢生长，而且常常可以使用手术来完全除去。中等星形细胞瘤(又称为III级星形细胞瘤)更快速地生长，而且是更恶性的。用手术接着为放射和一些化学疗法来治疗III级星形细胞瘤。高等星形细胞瘤(又称为IV级星形细胞瘤)快速生长，侵入邻近的组织，而且是非常恶性的。通常用手术接着为放射疗法和化学疗法的组合来治疗IV级星形细胞瘤。多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme)是IV级星形细胞瘤，其是最恶性的且致命的原发性脑肿瘤之一(同上)。
传统上，星形细胞瘤的治疗已经牵涉手术以除去肿瘤，接着进行放射疗法。也可以在放射疗法前或后施用化学疗法(Kornblith等(1985)，Cancer：Principles and Practice of Oncology，第2增补版，DeVita，V.，Hellman，S.，Rosenberg，S.编，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，第41章：Neoplasms ofthe Central Nervous System)。虽然相同的手术技术和原理应用于治疗多形性胶质母细胞瘤和恶性较小的脑肿瘤，但是完全除去多形性胶质母细胞瘤肿瘤是更难以实现的(同上)。
对诊断为患有IV级星形细胞瘤脑肿瘤的患者的预后在传统上是较差的。虽然治疗I级星形细胞瘤的人通常可以在不复发的情况中存活10年或更长，但是IV级星形细胞瘤肿瘤患者的均值存活长度是手术治疗后15周。由于IV级星形细胞瘤肿瘤的高恶性生长潜力，仅5％的患者在单独的手术治疗后存活1年，在2年后具有接近0％的存活率。与手术治疗组合的放射治疗将存活率提高至治疗2年后的约10％；然而，最终，没有患者存活长于5年(同上)。
通常，已经在脑肿瘤的治疗中使用亚硝基脲化疗剂。这些化合物的关键特性是其穿过血脑屏障的能力。1-3-二-2-氯乙基-1-亚硝基脲(BCNU，又称为卡莫司汀(Carmustine))是这些中要在临床上使用的第一种。虽然已经证明了与手术和/或放射治疗联合使用BCNU是有益的，但是它尚未治愈多形性胶质母细胞瘤脑肿瘤。另外，已经报告了关于延长的亚硝基脲治疗的并发症(Cohen等(1976)，Cancer Treat.Rep.60，1257 1261)。这些并发症包括肺纤维化(pulmonary fibrosis)、肝毒性、肾衰竭和与亚硝基脲治疗有关的继发性肿瘤的病例。
还已经调查了雌激素受体调节剂他莫昔芬(Tamoxifen)和雷洛昔芬(Raloxifene)在癌治疗中的使用。已经在牵涉复发性恶性神经胶质肿瘤治疗的人临床试验中使用他莫昔芬(Couldwell等(1996)，Clin.Cancer Res.2，619622)。已经在大鼠模型中显示了雷洛昔芬抑制尾部肿瘤转移至肺(Neubauer等(1995)，Prostate 27，220229)。
虽然手术、放射疗法和化学疗法的治疗方案为IV级星形细胞瘤脑肿瘤患者提供了适度延长的寿命的机会，但是与每种治疗方法有关的风险是许多的。治疗的益处是最小的，而且治疗可以显著降低患者的短暂剩余寿命的质量。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防脑癌。它们可以与上文所描述的用于治疗脑癌的任何方法联合。
食管癌
食管癌详细记载于自其改编以下段落的美国专利7,223,405。
食管癌是食管(将食物从口推进至胃的肌肉管)的一种恶性肿瘤。虽然食管癌在北美是相对不常见的(在那里，发生率小于100,000人中5人)，但是其流行在世界的其它地区已经达到几乎流行的比例，特别是在中国、日本、伊朗和南非。然而，在西方世界的罹患食管癌的人的数目在过去几十年里已经在稳定增加。例如，在1994年至1999年之间，食管癌在美国的每年的发生率是1974年至1989年的4至5倍，期间食管癌每年的发生率是1935年至1971年的5至6倍。
食管癌最常在超过50岁龄的男性中发生。男性与女性比率是约3∶1(Garfinkel等，1980，CA Cancer J Clin.30：3944)。食管癌的确切原因是未知的，而且在引起食管癌方面怀疑许多病因学因素。除在患有掌跖角化病(keratosispalmaris et plantaris)(胼胝症(tylosis))(其作为常染色体显性性状遗传)的罕见状况的个体中外，遗传因素不表现为发挥作用。饮食因素可以发挥作用，这是因为亚硝胺及其前体(硝酸盐和亚硝酸盐)的浓度在来自中国的具有高食管癌发生率的地区的食物和水样品中是高的。其它风险因素包括吸烟、酒精消费、低的社会经济状态和缺乏的饮食。巴雷特氏食管(Barrett’s esophagus)(即胃食管返流疾病(GERD)的一种并发症)也是一项形成食管癌的风险因素。
到目前为止，吞咽困难是食管癌患者的最经常的抱怨。吞咽固体或液体困难、食物反流、胃灼热(heartburn)、呕吐食物和与进食无关的胸痛是其它常见的症状。与食管癌有关的并发症包括严重的体重减轻和肿瘤扩散至身体的其它部分。提示疾病晚期阶段的体征包括颈腺病；慢性咳嗽，其提示气管牵涉；进食后呛食(chocking after eating)，其提示气管支气管树的瘘；大量咯血和/或呕血，其提示损伤穿孔入邻近的血管结构中；和声嘶，其提示复发性咽神经麻痹。
常常对抱怨吞咽困难的患者使用的诊断规程范围为使用镓67或钴57吞咽、EGD(食管胃十二指肠镜检术)、活组织检查、胸MRI、胸CT(通常用于测定疾病的阶段)、PET扫描、和粪便中潜隐血液的证据。腔变窄的不规则的参差不齐的粘膜样式的特征性发现是食管癌典型的。与良性阻塞损伤不一样，食管癌通常与食管的近端扩张无关。
食管癌有两种主要的类型，即鳞状细胞癌和腺癌。曾经，鳞状细胞癌是到目前为止两种癌症中更常见的，而且曾经造成所有食管癌的几乎90％。然而，新近的医学研究显示了，鳞状细胞癌现今构成仅约三分之二的食管癌。因为整个食管通常以鳞状细胞做衬里，所以鳞状细胞癌可以在沿着食管长度的任何地方发生。另一方面，腺癌在腺组织中开始，所述腺组织通常不涵盖食管，而且通常源自巴雷特氏粘膜的组织转化。与那些在唾液腺中发生的肿瘤在显微外观上相似的肿瘤诸如腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma)、腺鳞癌(adenosquamous carcinoma)、癌肉瘤(carcinosarcoma)和假性肉瘤(pseudosarcoma)占剩余的食管腺肿瘤的大多数。肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤(plasmacytoma)、疣状癌(verrucous carcinoma)和燕麦细胞癌共同代表所有恶性食管肿瘤的小于1％。
食管癌的分期基于在1988年出版的由美国癌症联合委员会(AJCC)修订的TNM分期标准。分期是描述癌症已经从其起源位置扩散的程度的过程。使用它来评估患者的预后，并确定疗法的选择。通过原发性肿瘤的大小和在身体中的位置，及其是否已经扩散至身体的其它区域来测定癌症的阶段。分期牵涉使用字母T、N和M来评估肿瘤，其通过原发性肿瘤的大小(T)；牵涉局部淋巴结的程度(N)；和远距离转移的缺失或存在(M)--癌症已经从初始(原发性)肿瘤扩散至远离的器官或远离的淋巴结。用数字1到4将这些种类之每种进一步分类以给出总体阶段。一旦测定T、N和M，分配I、II、III或IV“期”。I期癌症是小的、局部的且通常可治愈的。II和III期癌症通常是局部晚期的和/或已经扩散至局部淋巴结。IV期癌症通常是转移性的(已经扩散至身体的远离部分)，而且一般认为是不能手术的。
传统的治疗选项包括用于除去肿瘤和整个或部分食管的手术(食管切除术)、化学疗法和放射疗法。手术是早期肿瘤的常见选择，而且在癌症限于食管时通常会治愈疾病。然而，对于已经经历在食管外部扩散的癌症(转移性疾病)的患者，治愈一般是不可能的，并且治疗以减轻症状为目的(姑息性疗法)。可以用于改善患者吞咽能力的其它模态包括用于打开食管的食管内窥镜扩张(有时通过放置支架进行)，或者光动力学疗法。
放射疗法作为单一模态在食管癌的确定性治疗中的使用获得很少的成功，尽管努力提高对肿瘤的总剂量并降低照射的正常组织的量。用放射治疗的患者的中值存活是12个月左右，而且长期存活者很少(Beatty等，1979，Cancer 43：225467；Newaishy等，1982，Clin Radiol.33：347352；Schuchman等，1980，J Thorac Cardiovasc Surg.79：6773)。用单独的放射得到的最好结果来自由Pearson报告的一个系列，其中每分段2.5Gy，在50Gy后实现17％的5年存活率(1977，Cancer 39：882 90)。然而，Earlam和Cunha-Melo对来自49个系列的超过8,400名患者的审阅得出结论，总体1、2和5年存活率分别是18％、8％和6％(1980，Br J Surg.67：457 61)。此外，因为根本上治疗或实现减轻所必需的放射剂量超过40Gy，大多数患者经历一定程度的吞咽困难。
化学疗法在管理食管癌中的作用不断发展。时常地，使用伴随手术的化学疗法及放射。一般地，化学疗法可以甚至在复发性或转移性疾病患者中实现多至15％至20％的长期存活率(Ali等，2000，Oncology 14(8)：1223 30)。不幸地，对第一线化学疗法的高初始响应率没有表现为转化成存活益处(Kohno和Kitahara，2001，Gan To Kagaku Ryoho 28(4)：44853)。此外，有许多与化学疗法有关的不想要的副作用，诸如暂时的脱发、口腔溃疡、贫血(红血球的数目减少，其可以引起疲劳、头晕、和呼吸急促)、白血球减少(白细胞数目减少，其可以降低对感染的抵抗)、血小板减少(血小板数目减少，其可以导致容易出血或挫伤)、和胃肠症状如恶心、呕吐、和腹泻。活性化疗剂包括博来霉素(bleomycin)、顺铂(cisplatin)、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、多柔比星(oxorubicin，doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、帕利他塞(paclitaxel)(Taxol)、和伊立替尿(irinotecan)(CPT-11或Camptosar)。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防食管癌。它们可以与上文所描述的用于治疗食管癌的任何方法联合。
胃癌
胃癌详细记载于自其改编以下段落的美国专利6,962,779。
胃癌常常难以在早期阶段诊断，而且可以在胃中持续长时间，在症状出现前生长至较大的大小。此癌症由于其接近性而通常转移至小肠。在胃癌的早期阶段中，个体可以经历不消化和胃不适、进餐后发胀感、轻度恶心、食欲不振或胃灼热。在胃癌的更晚期阶段中，可以有粪便中的血液、呕吐、重量减轻或更严重的疼痛。
由于这些类型的癌症的频率(仅每年有约160,000例新的结肠和直肠癌病例)，高风险组的鉴定、证明的原发性损伤的缓慢生长和早期阶段损伤的更好存活、筛选胃肠癌应该是对在年龄50岁开始的所有成人(尤其是那些具有患有结肠直肠癌的一级亲属的)的常规护理的部分。
用于检测、诊断、监测、分期、和预测结肠、小肠或胃癌的规程对于患者的结果是具有重要意义的。与诊断患有远距离转移性癌症的患者的存活率相比，诊断患有早期阶段癌症的患者一般具有大得多的5年存活率。明确需要对检测胃、小肠和结肠的早期癌症更灵敏且特异性的新的诊断方法。
初始疗法后且在辅助疗法过程中紧密监测胃肠癌患者以测定对疗法的响应，并检测持续性或复发性转移疾病。明确需要在检测这些类型的癌症的复发中更灵敏且特异性的癌症标志物。
管理胃肠癌中的另一个重要步骤是测定患者疾病的阶段。阶段测定具有潜在的预后价值，而且提供用于设计最佳疗法的标准。一般而言，癌症的病理学分期比临床分期更优选，这是因为前一种给出更精确的预后。然而，若临床分期至少与病理学分期一样精确，则它会是优选的，因为它不依赖于侵入性规程来获得进行病理学评估的组织。通过鉴定细胞、组织、或体液中能区分侵入的不同阶段的新标志物会改善胃肠癌的分期。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防胃癌。它们可以与上文所描述的用于治疗胃癌的任何方法联合。
膀胱癌
膀胱癌包括膀胱中的移行细胞癌。膀胱癌是给膀胱做衬里的尿路上皮细胞中的尿路上皮癌(移行细胞癌)或肿瘤。剩余的膀胱癌病例是鳞状细胞癌、腺癌、和小细胞癌。根据它们是非侵入性的还是侵入性的和它们是乳头状的还是扁平的，存在数种亚型的尿路上皮癌。非侵入性肿瘤在尿路上皮(即膀胱的最内层)中，而侵入性肿瘤已经从尿路上皮扩散至膀胱的主肌肉壁的更深层。侵入性乳头状尿路上皮癌是细指样凸出物，其分支入膀胱的空的中心中，而且还向外生长入膀胱壁中。非侵入性乳头状尿路上皮肿瘤朝膀胱的中心生长。虽然非侵入性的、扁平尿路上皮肿瘤(又称作原位扁平癌)限于与膀胱的内部空的部分最接近的细胞层，但是侵入性扁平尿路上皮癌侵入膀胱的更深层，特别是肌肉层。
为了治疗膀胱癌，可以应用手术、放射疗法、免疫疗法、化学疗法、或其组合。一些可能的手术选项是经尿道切除、膀胱切除术、或根治性膀胱切除术。用于膀胱癌的放射疗法可以包括外部束照射和近程治疗。
免疫疗法是另一种可用于治疗膀胱癌患者的方法。通常，这是膀胱内完成的，其经由导管将治疗剂直接施用入膀胱中。一种方法是卡介苗(BCG)，其中将有时在结核病疫苗接种中使用的细菌经由导管直接给予膀胱。身体发动对细菌的免疫应答，由此攻击并杀死癌细胞。
免疫疗法的另一种方法是施用干扰素，即一种调控免疫应答的糖蛋白。常常使用干扰素α来治疗膀胱癌。可以在化学疗法中用于治疗膀胱癌的抗癌药物包括塞替派(thitepa，thiotepa)、甲氨蝶呤(methotrexate)、长春碱(vinblastine)、多柔比星(doxorubicin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、帕利他塞(paclitaxel)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、吉西他滨(gemcitabine)、或其组合。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防膀胱癌。它们可以与上文所描述的用于治疗膀胱癌的任何方法联合。
皮肤癌
皮肤癌详细记载于自其改编以下段落的美国专利6,792,137。
皮肤癌(其最致命的形式是黑素瘤)通常由皮肤科医生对患者检查色素性皮肤损伤(俗称“痣”)和/或其它皮肤异常来诊断。通常，皮肤科医生基于每个皮肤损伤的形态学的目视检查、它是否有可能是皮肤癌或皮肤癌的潜在前体来做决定。在患者的临床史、皮肤癌的风险因素、和其它信息的背景中做出此决定。然后，皮肤科医生确定色素性损伤是否应切除以进行组织病理学评估。
皮肤黑素瘤在皮肤的顶层-表皮中开始生长。若其在仍限于表皮时被检出并完全除去，则它可以完全治愈，并且若它刚刚进入下一皮层，即乳头状真皮，则具有非常高的治愈率。如此，筛选和早期检测对降低此癌症的发病率和死亡率是至关重要的，此癌症的发生率上已经在快速升高，而且是年轻人(特别是年轻女性)最常见的癌症之一。
在1992年，由国立卫生研究院(National Institutes of Health)主办的共识会议推荐在美国启动皮肤癌筛选，但是认识到初级护理医生没有足以将其良好执行的培训。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防皮肤癌。它们可以与上文所描述的用于治疗皮肤癌的任何方法联合。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防皮肤癌。它们可以与上文所描述的用于治疗皮肤癌的任何方法联合。
卵巢癌
卵巢癌详细记载于自其改编以下段落的美国专利7,321,030。
在欧洲和美国，已经认为卵巢癌是五种主要癌症之一。在日本，卵巢癌每年杀死约4,000人，而且伤亡数目在过去40年中已经快速增加约30倍，并且它与肺癌和胰腺癌一起是数目上增长最多的癌症之一。因为卵巢癌存在于腹腔中，难以早期诊断，而且卵巢癌的囊容易破裂，并且如此趋于容易转移至腹腔，所以60％的患者最终死亡，并且如此它与胰腺癌一起是具有不良预后的癌症之一。已经由于手术方法和抗癌剂诸如顺铂和泰素(taxol)的开发而认可疗法的性能改良，但是治疗方案的随后改良无一是有效的，并且如此需要开发新的治疗方法。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防卵巢癌。它们可以与上文所描述的用于治疗卵巢癌的任何方法联合。
前列腺癌
前列腺癌详细记载于自其改编以下段落的美国专利7,470,514。
前列腺癌是成年男性中除皮肤癌外最普遍的恶性肿瘤，而且在美国是日益普遍的健康问题。在1996年，估计在美国，41,400例死亡会源自此疾病，指明前列腺癌作为相同群体中的最常见死亡原因仅次于肺癌。若在癌症仍限于前列腺时早期诊断并治疗，则治愈机会显著较高。
对个体的治疗决定与所述个体中存在的前列腺癌的阶段相联系。美国泌尿学协会(American Urological Association，AUA)开发出前列腺癌扩散的常见分类。AUA分类将前列腺肿瘤分成四期，即A至D。将A期，即前列腺内的显微癌(microscopic cancer)进一步细分成A1和A2期。A1亚期是限于前列腺内的一个位置的充分分化的癌症。治疗一般是观察、根治性前列腺切除术、或放射。A2亚期是一种在前列腺内的多个位置的中等至不良分化的癌症。治疗为根治性前列腺切除术或放射。将B期，即前列腺内的可触知肿块进一步细分成B1和B2期。在B1亚期中，癌症在前列腺的一个叶中形成小的小结。在B2亚期中，癌症形成大的或多个小结，或者在前列腺的两个叶中都发生。B1和B2两个亚期的治疗是根治性前列腺切除术或放射。C期是牵涉大部分或整个前列腺的大的癌症块，并且进一步细分成两个阶段。在C1亚期中，癌症形成连续块(continuous mass)，其可以已经延伸出前列腺。在C2亚期中，癌症形成连续块，其侵入周围组织。这两个亚期的治疗是与或不与药物一起的放射。第四期是转移癌，而且也细分成两个阶段。在D1亚期中，癌症在骨盆的淋巴结中出现。在D2亚期中，癌症牵涉超出淋巴结的组织。这两个亚期的治疗是系统药物以解决癌症及疼痛。
然而，目前的前列腺癌分期方法是有限的。最初分期为A2、B、或C的多至50％的前列腺癌实际上是D期，即转移性的。转移的发现是重要的，因为转移癌患者比那些局限性癌症患者具有更差的预后，而且需要显著不同的疗法。局限性和转移性前列腺癌患者的5年存活率分别是93％和29％。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防前列腺癌。它们可以与上文所描述的用于治疗前列腺癌的任何方法联合。
睾丸癌
睾丸癌详细记载于自其改编以下段落的美国专利6,989,253。
睾丸癌占男性中所有癌症的仅约1％，但是它是年龄为15岁和35岁龄之间的年轻男性中最常见的癌症。在2000年，在美国诊断估计7,600例睾丸癌病例和约400例死亡。高加索人比拉丁美洲人更有可能患上睾丸癌，而且比黑人或亚洲人可能性多得多地染上它。睾丸癌的发生率在丹麦最高，而在远东最低。令人不安地，全世界的睾丸癌发生率在过去30至40年中已经几乎加倍。
通常，没有早期症状。大多数睾丸癌是由男性自己以无痛肿块、睾丸硬化或大小变化(增加或减小)、称重感或阴囊中液体突然聚集、下腹部或腹股沟中隐隐作痛、或阴囊或睾丸中的疼痛或不适而发现的。全身化症状通常指明转移，诸如肺转移，引起呼吸困难或咯血、腹块、或淋巴结牵涉所致的尿道阻塞。有时，可以存在其它症状，诸如背痛、胃痛、呼吸急促(breathlessness)、持续性干咳、和触痛性乳头。不过，睾丸癌的早期诊断尤其重要，因为若其在早期发现，则睾丸癌几乎总是可治愈的。若不治疗所述癌症，则来自初始位置的癌细胞可以脱离，并扩散至邻近的淋巴结，但是很少扩散至其它器官。
仅有的用于知道睾丸癌是否存在的确信方式是通过进行活组织检查。至今，睾丸癌的原因是未知的。以未降落的睾丸或隐睾出生的孩子具有升高的患上睾丸癌的风险(3至14倍)，不管是否进行手术来矫正问题(Farer等，1985，J.Urol.134：1071 1076)。研究还已经显示了，睾丸癌有时与睾丸没有正常发育的某些其它罕见的状况相联系。研究指明一些男性(其母亲在怀孕期间服用称作DES(己烯雌酚)的激素来预防流产)可以形成睾丸异常。一些睾丸癌患者具有阴囊损伤的历史。没有损伤或运动劳损增加形成睾丸癌风险的证据。其它风险因素包括先前一个睾丸中的睾丸癌，受人免疫缺陷病毒(HIV)感染，特别是若已经形成获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的话，和性染色体病症克兰费尔特综合征(Klinefelter’s syndrome)，其导致低水平的雄性激素、不育、乳房增大、和小睾丸。若癌症确实在第二个睾丸中出现，则其几乎总是新的疾病，而不是自第一个肿瘤的转移。
在年龄60岁以下的男性中，95％的睾丸肿瘤源于生殖细胞，即睾丸内的特殊的精子形成细胞。睾丸癌有两种主要类型，即精原细胞瘤(seminoma)和非精原细胞瘤(nonseminoma)(又称作畸胎瘤(teratoma))。纯粹的精原细胞瘤占所有睾丸癌的约40％，而且由未成熟的生殖细胞构成。通常，精原细胞瘤缓慢生长，并趋于在睾丸中保持局部化达一段长时间。另一方面，非精原细胞瘤是一组常常彼此组合发生的癌症，包括绒毛膜癌(choriocarcinoma)、胚胎性癌(embryonal carcinoma)、未成熟的畸胎瘤和卵黄囊肿瘤(yolk sactumor)。非精原细胞瘤源自更成熟的、特化的生殖细胞，而且趋于比精原细胞瘤更具攻击性。其它形式的睾丸癌包括莱迪希(Leydig)和塞托利(Sertoli)细胞肿瘤。更罕见的肿瘤诸如PNET、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、间皮瘤(mesothelioma)和其它肿瘤可以在睾丸中发生。
睾丸癌的分期基于于1988年出版的由美国癌症联合委员会(AJCC)修订的TNM分期标准。分期是描述癌症已经从其起源位置扩散的程度的过程。使用它来评估患者的预后，并确定疗法的选择。通过原发性肿瘤的大小和在身体中的位置，及其是否已经扩散至身体的其它区域来测定癌症的阶段。分期牵涉使用字母T、N和M来评估肿瘤；其通过原发性肿瘤的大小(T)；牵涉局部淋巴结的程度(N)；和远距离转移的缺失或存在(M)--癌症已经从初始(原发性)肿瘤扩散至远离的器官或远离的淋巴结。用数字1到4将这些种类之每种进一步分类以给出总体阶段。一旦测定T、N和M，分配I、II、III或IV“期”。I期癌症是小的、局部的且通常可治愈的。II和III期癌症通常是局部晚期的和/或已经扩散至局部淋巴结。IV期癌症通常是转移性的(已经扩散至身体的远离部分)，而且一般认为是不能手术的。
若睾丸癌在早期被发现，即使它已经扩散至身体的其它部分，则它几乎总是可治愈的。具体地，诊断患有I期精原细胞瘤的男性的存活率是约99％。患有I期非精原细胞瘤的男性的存活率是约98％。II期肿瘤的治愈率在90％以上变化，而III期肿瘤的治愈率在50-80％之间变化。此外，在患者摆脱疾病后，精原细胞瘤和非精原细胞瘤两者都具有非常低的复发率(小于5％)。
可以用手术、放射疗法、化学疗法、监视、或这些处理的组合来治疗睾丸癌。用于治疗睾丸癌的最常见的手术操作是完全除去睾丸(称作腹股沟睾丸切除术)。外科医生由于扩散疾病的风险而不仅除去睾丸的部分。有时，还必须除去深入腹中的淋巴结(称作RPLND手术)，因为睾丸癌通常经由非常可预测的路径经由淋巴结向上扩散至肺，然后向外扩散至肝、脑、和别的地方。另外，可以通过手术部分或完全除去已经扩散至身体的其它部分的肿瘤。不幸地，虽然用于除去淋巴结的手术不改变男性具有勃起或性欲高潮的能力，但是手术可以引起不育，因为它可能干扰射精中牵涉的神经。
与手术一样，放射疗法是一种局部治疗，并且仅影响治疗区域中的细胞。精原细胞瘤对放射是高度敏感的，而非精原细胞瘤对放射的敏感性低得多。此外，放射疗法可以干扰精子生成，虽然影响通常是暂时的。放射疗法的一些其它令人不快的影响包括腹泻和呕吐。在所治疗的区域中还可以有皮肤反应。
通常使用数种药物来治疗睾丸癌：Platinol(顺铂)、Vepesid或VP-16(依托泊苷)和Blenoxane(硫酸博来霉素)、博来霉素(Bleomycin)、依托泊苷(Etoposide)、和顺铂(Cisplatin)。另外，可以使用Ifex(异环磷酰胺)、Velban(硫酸长春碱)和其它的。许多医学专家认为Platinol是用于治疗睾丸癌的“魔方”。主要原因是认为睾丸癌是可治愈的疾病。然而，化学疗法引起许多副作用，因为它不仅损伤癌细胞，而且也损伤其它快速生长细胞诸如毛发和齿龈组织。不想要的副作用包括暂时的脱发、口腔溃疡、贫血(红血球数目减少，其可以引起疲劳、头晕、和呼吸急促)、白血球减少(白细胞数目减少，其可以降低对感染的抵抗)、血小板减少(血小板数目减少，其可以导致容易出血或挫伤)、和胃肠症状如恶心、呕吐、和腹泻。
时常地，使用伴随手术的化学疗法及放射。一般地，化学疗法可以甚至在复发性或转移性疾病患者中实现多至15％至20％的长期存活率(Ali等，2000，Oncology 14(8)：122330)。不幸地，对第一线化学疗法的高初始响应率没有表现为转化成存活益处(Kohno和Kitahara，2001，Gan To Kagaku Ryoho28(4)：44853)。此外，有许多与化学疗法有关的不想要的副作用，诸如暂时的脱发、口腔溃疡、贫血(红血球数目减少，其可以引起疲劳、头晕、和呼吸急促)、白血球减少(白细胞数目减少，其可以降低对感染的抵抗)、血小板减少(血小板数目减少，其可以导致容易出血或挫伤)、和胃肠症状如恶心、呕吐、和腹泻。
针对癌症的活性化疗剂的鉴定在传统上牵涉使用癌症的多种动物模型。小鼠已经是用于研究致癌作用(Sills等，2001，Toxicol Letters 120：187 198)、癌症疗法(Malkinson，2001，Lung Cancer 32(3)：265279；Hoffman R M.，1999，Invest New Drugs 17(4)：343359)、和癌症化学预防(Yun，1999，Annals NY AcadSci.889：157 192)的最具信息的且多产的实验系统之一。癌症研究以动物中移植的肿瘤开始，所述动物为调查提供可再现的且可控制的材料。原发性动物肿瘤的碎片、自这些肿瘤生成的细胞悬浮液、和自这些肿瘤细胞建立的永生细胞系在移植至相同物种的动物时增殖。
为了将人癌症移植至动物，并阻止排斥所致的其破坏，使动物的免疫系统受损。虽然最初通过放射、胸腺切除术、和应用类固醇以消除获得性免疫来实现，已经使用先天无胸腺的裸鼠作为多种人肿瘤的接受者(Rygaard，1983，于13.sup.th International Cancer Congress Part C，Biology of Cancer(2)，第3744页，Alan R.Liss，Inc.，NY；Fergusson和Smith，1987，Thorax，42：753758)。虽然无胸腺裸鼠模型提供了有用的模型来在体内研究大量的人肿瘤，但是它不形成自发转移，而且不适合所有类型的肿瘤。接着，开发了重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠，其中通过遗传突变使获得性免疫系统完全丧失能力。首先使用人肺癌来证明人癌症在SCID小鼠模型中的成功移植(Reddy S.，1987，Cancer Res.47(9)：24562460)。随后，已经显示了SCID小鼠模型容许许多人肿瘤，特别是血液学病症和恶性黑素瘤的播散性转移生长(Mueller和Reisfeld，1991，Cancer Metastasis Rev.10(3)：193200；Bankert等，2001，Trends Immunol.22：386393)。近来随着转基因技术的出现，小鼠基因组已经变为用于研究癌症的主要哺乳动物遗传模型(Resor等，2001，Human Molec Genet.10：669675)。
本文所描述的方法和组合物适合于检测、诊断、治疗或预防睾丸癌。它们可以与上文所描述的用于治疗睾丸癌的任何方法联合。
筛选抗VHZ剂
鉴定VHZ调控剂、激动剂和拮抗剂
可以使用拮抗剂，特别是小分子来特异性抑制VHZ以作为抗VHZ剂使用。
因此，我们公开了VHZ拮抗剂和小分子VHZ抑制剂，以及用于筛选这些的测定法。可以通过检测对结合或其它VHZ活性的调控诸如下调来筛选VHZ拮抗剂。因此，我们提供了一种能够下调VHZ多肽的表达、量或活性的化合物。可以在本文所描述的方法和组合物中使用此类化合物以治疗或预防癌症，特别是结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。
因此，可以在例如细胞、无细胞的制备物、化学文库、和天然产物混合物中使用VHZ来评估小分子物质和配体的结合。这些物质和配体可以是天然物质和配体，或者可以是结构或功能模拟物。参见Coligan等，CurrentProtocols in Immunology 1(2)：第5章(1991)。此外，可以进行筛选以鉴定影响VHZ表达(特别是在结肠、肺、鳞状细胞(包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎)胰腺、脑、食管、胃、膀胱、肾、皮肤、卵巢、前列腺和睾丸细胞中)的因子。
一般而言，用于激动剂和拮抗剂的测定法依赖于测定候选分子对一种或多种VHZ活性的影响。测定法可以牵涉在存在候选分子的情况中，和任选地在没有候选分子的情况中，或者在存在已知抑制或活化VHZ活性的分子的情况中测定VHZ活性。
我们已经证明了VHZ的表达在结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌细胞中是升高的；因而，可以采用对VHZ表达的控制来治疗结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌和其它癌症。因此，期望找到刺激VHZ的表达和/或活性，或者能抑制此蛋白质的功能的化合物和药物。一般而言，出于治疗和预防目的对任何已知癌症，特别是结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌采用激动剂和拮抗剂。
“下调”包括对所研究行为的任何负面影响；这可以是完全的或者部分的。如此，在检测结合的情况中，候选拮抗剂能够降低、改善、或消除两个实体之间的结合。与在没有候选分子的情况中的结合(或无论哪种活性)相比，候选分子实现的结合(或任何其它活性)的下调可以是至少10％，诸如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。如此，适合于作为拮抗剂使用的候选分子是能够降低大于10％的结合或其它活性的分子。
术语“化合物”指化学化合物(天然存在的或合成的)诸如生物学大分子(例如核酸、蛋白质、非肽、或有机分子)，或自生物学材料诸如细菌、植物、真菌、或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制成的提取物，或者甚至无机元素或分子。化合物可以是抗体。
潜在的VHZ拮抗剂的例子包括抗体、小分子、核苷酸及其类似物(包括嘌呤和嘌呤类似物)、寡核苷酸或与VHZ的结合配偶紧密相关的蛋白质(例如结合配偶的片段)、或如下的小分子等，所述小分子结合VHZ多肽，但不引发响应，使得该多肽的活性得到阻止。
筛选试剂盒
可以将要进行的此类筛选所必需的材料包装入筛选试剂盒中。
此类筛选试剂盒对于鉴定VHZ多肽的激动剂、拮抗剂、配体、受体、底物、酶等或降低或增强VHZ生成的化合物是有用的。筛选试剂盒可以包含：(a)VHZ多肽；(b)表达VHZ多肽的重组细胞；或(c)针对VHZ多肽的抗体。筛选试剂盒可以包含文库。筛选试剂盒可以包含筛选所需要的任何一种或多种成分，如下文所描述的。任选地，筛选试剂盒可以包含使用指令。
还可以提供能够在核酸水平检测VHZ表达的筛选试剂盒。此类试剂盒可以包含用于扩增VHZ的引物，或一对用于扩增的引物。可以自任何合适的序列(例如VHZ序列的一部分)选择所述一种或多种引物。鉴定引物序列的方法是本领域公知的，并且熟练技术人员会能够容易地设计此类引物。试剂盒可以包含用于VHZ表达的核酸探针，如本文件中所描述的。任选地，试剂盒还可以包含使用指令。
理性设计
可能能够与VHZ相互作用的候选化合物的理性设计可以基于VHZ多肽的分子形状的结构研究。一种用于测定哪些位点与特定的其它蛋白质相互作用的手段是物理结构测定，例如X射线晶体学或二维NMR技术。这些会提供关于哪些氨基酸残基形成分子接触区的指导。关于蛋白质结构测定的详细描述，参见例如Blundell和Johnson(1976)Protein Crystallography，Academic Press，New York。
多肽结合测定法
可以通过本领域已知的任何手段来鉴定VHZ活性或表达的调控剂和拮抗剂。
在它们的最简单形式中，测定法可以仅包括以下步骤，即混合候选化合物与含有VHZ多肽的溶液以形成混合物，测量混合物中的VHZ多肽活性，并比较混合物与标准品的活性。
此外，可以在检测VHZ与推定分子之间的结合的测定法中通过对VHZ的结合来鉴定分子。
一类用于鉴定结合本文所描述的VHZ多肽的物质的测定法牵涉使固定化在固体支持物上的VHZ多肽与非固定化的候选物质接触，测定感兴趣的VHZ多肽与候选物质是否彼此结合和/或以何种程度彼此结合。或者，候选物质可以是固定化的，而如本文件中所列出的VHZ多肽是非固定化的。
所述物质与VHZ多肽的结合可以是瞬时的、可逆的或永久的。所述物质可以以如下的Kd值结合所述多肽，所述Kd值低于结合对照多肽(例如已知不涉及癌症生长或进展的多肽)的Kd值。所述物质的Kd值可以比结合对照多肽的Kd值小2倍，诸如比结合对照多肽的Kd小100倍的Kd值或小1000倍的Kd。
在一种例示性的测定方法中，可以在珠诸如琼脂糖珠上固定化VHZ多肽。通常，这可以如下实现，即在细菌、酵母或高等真核细胞系中以GST-融合蛋白表达VHZ多肽，并使用谷胱甘肽-琼脂糖珠自粗制细胞提取物纯化GST-VHZ融合蛋白(Smith和Johnson，1988；Gene 67(10)：31-40)。作为对照，可以在没有VHZ多肽的情况中测定候选物质(其不是GST-融合蛋白)与固定化的多肽的结合。然后可以测定候选物质与固定化的VHZ多肽的结合。此类测定法在本领域中称为GST下拉(pulldown)测定法。再一次，候选物质可以是固定化的，而VHZ多肽是非固定化的。
使用不同亲和纯化系统(例如Ni-NTA琼脂糖和加有组氨酸标签的成分)固定化成分之一来实施此类型的测定法也是有可能的。
可以通过本领域公知的多种方法来测定多肽与候选物质的结合。例如，可以(用例如放射性标记物、表位标签或酶-抗体偶联物)标记非固定化的成分。或者，可以通过免疫学检测技术来测定结合。例如，可以对反应混合物进行Western印迹，并用检测非固定化成分的抗体探查印迹。也可以使用ELISA技术。
通常添加候选物质至1至1000nmol/ml，诸如1至100nmol/ml的终浓度。在抗体的情况中，所使用的终浓度通常自100至500μg/ml，诸如自200至300μg/ml。
也可以通过检测对VHZ与此多肽结合的任何分子之间的结合的调控，或对因此类结合或释放引起的任何活性的调控来鉴定VHZ的调控剂和拮抗剂。
基于细胞的测定法
基于细胞的测定法可以仅测试候选化合物的结合，其中借助于与候选化合物直接或间接关联的标记物或者在牵涉与经标记竞争剂竞争的测定法中检测对携带VHZ多肽的细胞的粘着。
此外，这些测定法可以测试候选化合物是否通过结合VHZ多肽导致信号产生，其使用适合于在其表面上携带多肽的细胞的检测系统来实现。一般而言，在存在已知激动剂的情况中测定活化的抑制剂，并观察候选化合物的存在对激动剂进行的活化的影响。
另一种筛选化合物的方法利用用重组DNA分子稳定转化的表达化合物文库的真核或原核宿主细胞。可以使用此类细胞(或是活的或是固定的形式)来进行标准结合配偶测定法。还可参见Parce等(1989)Science 246：243-247；和Owicki等(1990)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 87；4007-4011，其记载了用于检测细胞应答的灵敏方法。
竞争性测定法是特别有用的，其中使表达化合物文库的细胞与已知结合VHZ多肽的经标记抗体(诸如125I-抗体)、和测试样品诸如候选化合物(其就是要测量其对结合组分的结合亲和力的)接触或一起温育。然后分开结合的和游离的经标记VHZ多肽结合配偶以评估结合程度。所结合的测试样品量与结合VHZ多肽的经标记抗体量成反比。
可以使用众多技术之任一种来分开结合的与游离的结合配偶以评估结合程度。此分开步骤通常可牵涉如下规程，诸如对滤器的粘着，接着进行清洗，对塑料的粘着，接着进行清洗，或细胞膜离心。
所述测定法可以牵涉将候选分子暴露于细胞，诸如结肠、肺、鳞状细胞(包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎)胰腺、脑、食管、胃、膀胱、肾、皮肤、卵巢、前列腺和睾丸细胞，并通过任何合适的手段来测定VHZ的表达。任选地，可以选择在此类测定法中下调VHZ表达的分子，用于进一步的研究，和作为下调VHZ表达的药物使用。可以有效地采用此类药物来治疗或预防结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。
也可以使用编码VHZ蛋白的cDNA和针对所述蛋白质的抗体来配置用于检测添加的化合物对细胞中VHZ mRNA和蛋白质生成的影响的测定法。例如，可以构建如下的ELISA，其用于通过本领域已知的标准方法使用单克隆和多克隆抗体来测量分泌的或细胞结合的VHZ多肽水平，并且这可以用于发现可抑制或增强自合适操作的细胞或组织生成VHZ蛋白的药剂(分别也称作拮抗剂或激动剂)。用于进行筛选测定法的标准方法是本领域中充分理解的。
活性测定法
用于检测调控剂或拮抗剂的测定法通常牵涉在存在候选分子的情况中检测对VHZ的任何活性的调控，任选地，以及在没有候选分子的情况中检测对活性的调控。
可以使用检测VHZ特定生物学活性诸如磷酸酶活性的测定法。该测定法通常牵涉使候选分子(例如文库形式)与VHZ(无论以多肽、编码多肽的核酸、还是以包含其的细胞、细胞器、提取物或其它材料形式)及候选调控剂接触。可以检测VHZ的相关活性(诸如磷酸酶活性，如下文所描述的)，以建立候选调控剂的存在是否有任何影响。
磷酸酶测定法是本领域已知的，并且记载于Wu等(2004)，Int J BiochemCell Biol.36(8)：1542-53和Alonso等(2004).J Biol Chem.20；279(34)：35768-74。此类测定法包括测定VHZ使合适的底物诸如对硝基苯基磷酸酯，或者如含有磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸残基的寡肽去磷酸化的能力。可以在存在或没有候选调控剂的情况中实施测定法，并检测合适的活性以检测对VHZ活性的调控，因此鉴定VHZ的候选调控剂和/或拮抗剂。
也可以使用用于检测结合和/或影响VHZ的转录或表达的候选调控剂的启动子结合测定法。然后可以为进一步研究而选择候选调控剂，或为了使用而分离候选调控剂。此类筛选规程的详情是本领域公知的，并且例如记载于Handbook of Drug Screening，Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes编(2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN 0-8247-0562-9)。
本文所描述的筛选方法可以采用体内测定法，虽然它们可以为了体外使用而进行设定。体内测定法一般牵涉将包含VHZ的细胞暴露于候选分子。在体外测定法中，将VHZ暴露于候选分子，任选地，在存在其他成分诸如粗制的或半纯化的细胞提取物，或纯化的蛋白质的情况中。若进行体外测定法，则这些可以采用候选分子的阵列(例如阵列化的文库)。可以采用体内测定法。因此，VHZ多肽可包含在细胞中，诸如以异源方式。此类细胞可以是转基因细胞，其已经进行过工程化改造以表达如上文所描述的VHZ。
若采用提取物，则它可以包含细胞质提取物或细胞核提取物，其制备方法是本领域公知的。
应当领会的是，可以采用包含VHZ的细胞的任何成分，诸如细胞器。一个实施方案利用细胞质或细胞核制备物，例如包含细胞核，其包含如所描述的VHZ。细胞核制备物可以包含一个或多个细胞核，其可通过例如去污剂处理来透化(permeabilise)或半透化。
如此，在一个具体的实施方案中，测定形式可以包括下列：建立多孔微量滴定板，每孔中包括一个或多个表达VHZ多肽的细胞；可以将自例如文库衍生的个别候选分子，或候选分子的集合添加至各个孔，并测量对VHZ活性的调控。若使用集合，则可以将这些细分成进一步的集合，并以相同的方式测试。然后可以测定VHZ活性，例如结合活性或转录共活化活性，如本文件别处所描述的。
作为上文所描述的测定方法的替代或附加，也可以使用“扣除”规程来鉴定VHZ的调控剂或拮抗剂。在此类“扣除”规程下，提供了多种分子，其包含一种或多种能够发挥调控剂功能的候选分子(例如细胞提取物、细胞核提取物、分子文库等)，并从所述多种分子除去、消减或扣除一种或多种成分。然后通过暴露于包含所述VHZ的细胞(或其成分)来对“扣除后的”提取物等测定活性。
如此，例如，可以进行“免疫消减”测定法来如下鉴定此类调控剂。可以自合适的细胞制备细胞质或细胞核提取物。可以消减或分级提取物来除去推定的调控剂，诸如通过使用用合适的抗体进行的免疫消减来实现。若提取物消减去调控剂，则它会丧失影响VHZ功能或活性或表达的能力。可能需要一系列扣除和/或消减来鉴定调控剂或拮抗剂。
还应当领会的是，可以使用上文的“消减”或“扣除”测定法作为初步步骤来鉴定推定的调控因子以进行进一步筛选。此外/或者，可以使用“消减”或“扣除”测定法来证实通过其它手段(例如如本文件别处所描述的“正”筛选)鉴定为推定调控剂的分子的调控活性。
可以分离进行所述测定法并发现为感兴趣的候选分子，并进行进一步研究。分离感兴趣分子的方法会取决于所采用分子的类型、其是否处于文库形式、在任一时间测试多少候选分子、是否遵循分批规程等。
可以以文库形式提供候选分子。在一个实施方案中，可以同时筛选超过一种候选分子。可以通过本领域已知的手段来生成候选分子的文库，例如，小分子文库、多肽文库、核酸文库、化合物文库(诸如组合文库)、反义分子诸如反义DNA或反义RNA的文库、抗体文库等。此类文库适合于高通量筛选。可以将包含VHZ的不同细胞暴露于文库的各成员，并测定对VHZ活性的影响。可以为此目的采用阵列技术。细胞在空间上可以是分开的，例如在微量滴定板的孔中。
在一个实施方案中，采用小分子文库。“小分子”指其分子量可以小于约50kDa的分子。在具体的实施方案中，小分子可以具有小于约30kDa，诸如小于约15kDa或小于10kDa左右的分子量。此类小分子的文库(在本文称为“小分子文库”)可以含有多肽、小肽(例如20个氨基酸或更少，例如15、10或5个氨基酸的肽)、简单化合物等。
或者/另外，可以对组合文库(如下文更为详细地描述的)筛选VHZ的调控剂或拮抗剂。上文描述了用于VHZ活性的测定法。
文库
可以在本文所描述的VHZ拮抗剂和抑制剂的筛选中采用候选分子的文库，诸如多肽或核酸的文库。将此类文库暴露于VHZ蛋白，并测定它们对蛋白质活性的影响，若有的话。
用于分离大文库的想要成员的选择方案是本领域已知的，如噬菌体展示技术所代表的。已经证明了此类系统(其中多种多样的肽序列展示在丝状噬菌体的表面上(Scott和Smith(1990见上文))可用于创建抗体片段(和编码它们的核苷酸序列)的文库来体外选择和扩增结合靶抗原的特异性抗体片段。将编码VH和VL区的核苷酸序列与编码将它们指引至大肠杆菌(E.coli)的周质空间的前导信号的基因片段连接，因此所得的抗体片段展示在噬菌体的表面上，通常作为与噬菌体外壳蛋白(例如pIII或pVIII)的融合物。或者，在λ噬菌体壳体(噬菌体小体(phagebody))上在外部展示抗体片段。基于噬菌体的展示系统的优点在于，因为它们是生物学系统，所以能仅仅通过在细菌细胞中培养含有选定文库成员的噬菌体来扩增选定的文库成员。此外，因为编码多肽文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体上，所以测序、表达和随后的遗传操作是相对直接的。
用于构建噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法是本领域公知的(McCafferty等(1990)见上文；Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson等(1991)Nature，352：624；Lowman等(1991)Biochemistry，30：10832；Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：10134；Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133；Chang等(1991)J.Immunol.，147：3610；Breitling等(1991)Gene，104：147；Marks等(1991)见上文；Barbas等(1992)见上文；Hawkins和Winter(1992)J Immunol.，22：867；Marks等，1992，J.Biol.Chem.，267：16007；Lerner等(1992)Science，258：1313，通过提及而收入本文)。若对于表达(一般是多肽文库的)必要的话，可以修改此类技术。
一种特别有利的办法是scFv噬菌体文库的使用(Bird，R.E.等(1988)Science 242：423-6；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：5879-5883；Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，87：1066-1070；McCafferty等(1990)见上文；Clackson等(1991)见上文；Marks等(1991)见上文；Chiswell等(1992)Trends Biotech.，10：80；Marks等(1992)见上文)。展示在噬菌体外壳蛋白上的scFv文库的各种实施方案已经有记载。噬菌体展示办法的改进也是已知的，例如如记载于WO96/06213和WO92/01047(Medical Research Council等)和WO97/08320(Morphosys，见上文)的，通过提及而将其收入本文。
备选的文库选择技术包括噬菌体λ表达系统，其可以直接以噬菌体噬斑或者以溶源体菌落筛选，均如先前所记载的(Huse等(1989)Science，246：1275；Caton和Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：8095；Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：2432)，并且在本文所描述的方法和组合物中使用。可以使用这些表达系统来筛选文库中约106或甚至更高阶的众多不同成员。其它筛选系统依赖于例如文库成员的直接化学合成。一种早期方法牵涉在一组针或棒上合成肽，诸如记载于WO84/03564的。一种牵涉珠上的肽合成的类似方法(其形成肽文库，其中每粒珠是单个文库成员)记载于美国专利号4,631,211，而一种相关方法记载于WO92/00091。基于珠的方法的显著改进牵涉用独特的标识标签诸如寡核苷酸给每粒珠加上标签，以便促进对每个文库成员的氨基酸序列的鉴定。这些改良的基于珠的方法记载于WO93/06121。
另一种化学合成方法牵涉以如下方式在表面上合成肽(或肽模拟物(peptidomimetics))的阵列，所述方式在阵列中在离散的、预定的位置处放置每个独特的文库成员(例如独特的肽序列)。每个文库成员的身份由其在阵列中的空间位置决定。测定阵列中发生预先确定的分子(例如受体)与反应性文库成员之间的结合相互作用的位置，由此基于空间位置来鉴定反应性文库成员的序列。这些方法记载于美国专利号5,143,854；WO90/15070和WO92/10092；Fodor等(1991)Science，251：767；Dower和Fodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.，26：271。
用于生成多肽或核苷酸文库的其它系统牵涉使用无细胞的酶促机器(machinery)来在体外合成文库成员。在一种方法中，通过交替多轮的针对靶配体的选择和PCR扩增来选择RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Science，249：505；Ellington和Szostak(1990)Nature，346：818)。可以使用类似的技术来鉴定结合预先确定的人转录因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)Nucleic AcidsRes.，18：3203；Beaudry和Joyce(1992)Science，257：635；WO92/05258和WO92/14843)。以类似的方式，可以使用体外翻译来合成多肽，作为一种用于生成大文库的方法。这些一般包含稳定化的多核糖体复合物的方法进一步记载于WO88/08453，WO90/05785，WO90/07003，WO91/02076，WO91/05058，和WO92/02536。不基于噬菌体的备选展示系统诸如披露于WO95/22625和WO95/11922(Affymax)的展示系统使用多核糖体来展示多肽以进行选择。也通过提及而将这些和所有上述文件收入本文。
组合文库
文库，特别是候选分子的文库可以适当地处于组合文库(也称为组合化学文库)的形式。
“组合文库”在该术语在本文件中使用时指由随机选择的亚基组成的多种化学化合物的集合。可以对组合文库筛选能够抑制VHZ的分子。
化学化合物的多种组合文库是目前可用的，包括对蛋白水解酶和非蛋白水解酶有活性的文库、G蛋白偶联受体(GPCR)的激动剂和拮抗剂的文库、对非GPCR靶物(例如整联蛋白、离子通道、域相互作用、细胞核受体、和转录因子)有活性的文库和全细胞肿瘤学和抗感染靶物的文库等。在Dolle和Nelson(1999)，Journal of Combinatorial Chemistry，第1卷第4期，235-282中提供了组合文库，特别是其构建和用途的全面综述。还可参考Combinatorialpeptide library protocols(Shmuel Cabilly编，Totowa，NJ.：Humana Press，c1998.Methods in Molecular Biology v.87)。特定的组合文库和其构建方法披露于美国专利6,168,914(Campbell等)，以及B aldwin等(1995)，“Synthesis of a SmallMolecule  Library  Encoded  with  Molecular  Tags，”J.Am.Chem.Soc.117：5588-5589，及那些文件中所提及的参考文献。
在一个实施方案中，筛选的组合文库是为了潜在地包括与细胞成分相互作用以影响基因表达的分子而设计的组合文库。例如，可以筛选针对染色质结构蛋白的组合文库。对于该实施方案有用的其它文库包括针对组蛋白修饰酶(例如组蛋白乙酰化或组蛋白甲基化酶)、或DNA修饰(例如DNA甲基化或脱甲基化)的组合文库。
记载化学组合文库、其生成和用途的别的参考文献包括那些可自URLhttp://www.netsci.org/Science/Combichem/获得的，包括The  ChemicalGeneration of Molecular Diversity.Michael R.Pavia，Sphinx Pharmaceuticals，ADivision of Eli Lilly(1995年7月出版)；Combinatorial Chemistry：A Strategy forthe Future-MDL Information Systems discusses the role its Project Libraryplays in managing diversity libraries(1995年7月出版)；Solid SupportCombinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization，Adnan M.M.Mjalli和Barry E.Toyonaga，Ontogen Corporation(1995年7月出版)；Non-Peptidic Bradykinin Receptor Antagonists From a Structurally DirectedNon-Peptide Library.Sarvajit Chakravarty，Babu J.Mavunkel，Robin Andy，Donald J.Kyle*，Scios Nova Inc.(1995年7月出版)；Combinatorial ChemistryLibrary Design using Pharmacophore Diversity Keith Davies和Clive Briant，Chemical Design Ltd.(1995年7月出版)；A Database System for CombinatorialSynthesis Experiments-Craig James和David Weininger，Daylight ChemicalInformation Systems，Inc.(1995年7月出版)；An Information ManagementArchitecture for Combinatorial Chemistry，Keith Davies和Catherine White，Chemical Design Ltd.(1995年7月出版)；Novel Software Tools for AddressingChemical Diversity，R.S.Pearlman，Laboratory for Molecular Graphics andTheoretical Modeling，College of Pharmacy，University of Texas(1996年6月/7月出版)；Opportunities for Computational Chemists Afforded by the NewStrategies in Drug Discovery：An Opinion，Yvonne Connolly Martin，ComputerAssisted Molecular Design Project，Abbott Laboratories(1996年6月/7月出版)；Combinatorial Chemistry and Molecular Diversity Course at the University ofLouisville：A Description，Arno F.Spatola，Department of Chemistry，Universityof Louisville(1996年6月/7月出版)；Chemically Generated Screening Libraries：Present and Future.Michael R.Pavia，Sphinx Pharmaceuticals，A Division of EliLilly(1996年6月/7月出版)；Chemical Strategies For Introducing CarbohydrateMolecular Diversity Into The Drug Discovery Process.Michael J.Sofia，Transcell Technologies Inc.(1996年6月/7月出版)；Data Management forCombinatorial Chemistry.Maryjo Zaborowski，Chiron Corporation和Sheila H.De Witt，Parke-Davis Pharmaceutical Research，Division of Warner-LambertCompany(1995年11月出版)；及The Impact of High Throughput OrganicSynthesis on R&D in Bio-Based Industries，John P.Devlin(1996年3月出版)。
组合化学中的技术在用于产生新的药学前导物(pharmaceutical lead)的现代方法中获得广泛的接受(Gallop，M.A.等，1994，J.Med.Chem.37：1233-1251；Gordon，E.M.等，1994，J.Med.Chem.37：1385-1401)。使用的一种组合办法基于如下策略，其牵涉在每个固相支持物颗粒上合成含有不同结构的文库，使文库与可溶性受体相互作用，鉴定与大分子靶物相互作用的“珠”，并测定由鉴定出的“珠”携带的结构(Lam，K.S.等，1991，Nature 354：82-84)。此办法的一种备选是自固体支持物序贯释放化合物的确定等分试样，随后测定溶液中的活性，鉴定释放活性化合物的颗粒，并通过直接测序(Salmon，S.E.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：11708-11712)，或者通过阅读其代码(Kerr，J.M.等，1993，J.Am.Chem.Soc.115：2529-2531；Nikolaiev，V.等，1993，Pept.Res.6：161-170；Ohlmeyer，M.H.J.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：10922-10926)来阐明其结构。
可以使用由Furka首次记载的用于产生肽的等摩尔混合物的简单原理来合成可溶性随机组合文库(Furka，A.等，1988，Xth International Symposium onMedicinal Chemistry，Budapest 1988；Furka，A.等，1988，14th InternationalCongress of Biochemistry，Prague 1988；Furka，A.等，1991，Int.J.PeptideProtein Res.37：487-493)。用于重复筛选的可溶性文库的构建也已经有记载(Houghten，R.A.等，1991，Nature 354：84-86)。K.S.Lam披露了使用不溶性随机组合文库的新的且有力得出乎意料的技术。Lam在固相支持物上合成随机组合文库，使得每个支持物具有一致分子结构的测试化合物，并在事先不从支持物除去测试化合物的情况中通过固相结合方案来筛选文库(Lam，K.S.等，1991，Nature 354：82-84)。
如此，候选分子的文库可以是合成的组合文库(例如组合化学文库)、细胞提取物、体液(例如尿液、血液、泪液、汗液、或唾液)，或者合成的或天然的产物的其它混合物(例如小分子的文库或发酵混合物)。
分子文库可以包括例如氨基酸、寡肽、多肽、蛋白质、或肽或蛋白质的片段；核酸(例如反义的；DNA；RNA；或肽核酸，即PNA)；适体；或碳水化合物或多糖。文库的每个成员可以是单个的或者可以是混合物(例如压缩的文库(compressed library))的一部分。文库可以含有纯化的化合物或者可以是“脏的”(即，含有显著数量的杂质)。
也可以与本文所描述的方法一起使用商品化的文库(例如来自Affymetrix、ArQule、Neose Technologies、Sarco、Ciddco、Oxford Asymmetry、Maybridge、Aldrich、Panlabs、Pharmacopoeia、Sigma、或Tripose)。
在如上文所描述的文库外，可以使用称作多样性文件的特殊文库来评估新方法的特异性、可靠性、或再现性。多样性文件含有许多化合物(例如1000种或更多种小分子)，其代表多类能潜在导致测定法中的非特异性检测的化合物。多样性文件是商品化的或者也可以自购自上文所列厂商的个别化合物装配。
抗体
抗VHZ剂(包括VHZ的拮抗剂或调控剂)(其可以用于调节此蛋白质的活性，例如用于治疗或预防疾病诸如癌症的方法，如本文件中所描述的)可以包括针对VHZ蛋白的抗体。
因此，我们提供了结合VHZ多肽、其片段、同系物、变体或衍生物的抗体。此类抗体在检测VHZ表达，并且特别在诊断VHZ相关疾病诸如结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌中是有用的。其它抗体包括那些具有治疗活性的，即其可以以治疗方式用于治疗、管理或预防任何VHZ相关疾病，包括结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。
可以通过用与人VHZ的氨基酸残基(126-140)对应的肽RRLRPGSIETYEQEK(SEQ ID NO：3)进行的免疫接种来生成针对VHZ的抗体，如实施例中所描述的。
能够结合VHZ的抗体的例子包括鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号LS-C32281，氨基酸35至90，LS-C42458，LS-A6806和LS-A6803，LS-C32281，LifeSpan Inc，Seattle，Washington，USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号DS-PB-00676，RayBiotech Inc，Norcross，Georgia，USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号XW-7857，ProSci Incorporated，Poway，California，USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号F4560和D9840-66A，United States Biological，Swampscott，Massachusetts，USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号D9840-66，United States Biological，Swampscott，Massachusetts，USA)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号AHP1142，AdB Serotec，Oxford，United Kingdom)、家兔抗人VHZ抗体(产品目录编号NB110-40452，Novus Biologicals，Littleton，Colorado，USA)、鸡抗人VHZ抗体(产品目录编号NB100-75328，NovusBiologicals，Littleton，Colorado，USA)。
此外，可以针对任何合适的表位(例如自VHZ蛋白衍生的表位)生成对VHZ特异性的抗体。合适的VHZ片段的序列可以包含VHZ的残基C95，并且可以使用来自此序列的任何表位来生成特异性VHZ抗体。
出于本文件的目的，术语“抗体”指能够结合选定靶物的完整抗体或抗体片段。除非相反地规定，该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、天然的或工程化改造的抗体，包括嵌合的、CDR嫁接的和人源化的抗体，和使用噬菌体展示或备选技术生成的人工选择的抗体。该术语还包括单链、Fab片段和自Fab表达文库生成的片段。此类片段包括整个抗体中保留其对靶物质的结合活性的片段、Fv、F(ab’)和F(ab’)2片段，以及单链抗体(scFv)、包含抗体之抗原结合位点的融合蛋白和其它合成蛋白。小片段诸如Fv和ScFv由于其小尺寸和随后的卓越组织分布而在诊断和治疗应用方面拥有有利的特性。
抗体及其片段可以是人源化抗体，例如如记载于EP-A-239400的。此外，也可以使用具有完全人的可变区的抗体(或其片段)，例如如记载于美国专利号5,545,807和6,075,181的。中和性抗体(即那些抑制VHZ的任何生物学活性的)可以用于诊断学和治疗学。
本文所描述的抗体可以是经过改变的抗体，其包含效应蛋白诸如标记物。可以使用容许在体内或在体外对抗体分布成像的标记物。此类标记物可以是放射性标记物或不透射线的标记物，诸如金属颗粒，其可容易地在胚胎或细胞团内显现。此外，它们可以是在组织样品上可显现的荧光标记物或其它标记物。
可以通过标准技术诸如通过免疫或者通过使用噬菌体展示文库来生成抗体。此类抗体可能够特异性结合VHZ蛋白或同系物、片段等。
多克隆抗体
若多克隆抗体是想要的，则可以用包含VHZ多肽或肽的免疫原性组合物来免疫选定的哺乳动物(例如小鼠、家兔、山羊、马等)。根据宿主物种，可以使用各种佐剂来提高免疫学应答。此类佐剂包括但不限于弗氏，矿物凝胶诸如氢氧化铝，和表面活性物质诸如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)是潜在有用的人佐剂，如果出于刺激系统防御的目的给免疫学受损的个体施用纯化的物质氨基酸序列，那么其可以被采用。
依照已知的规程收集和处理来自经过免疫的动物的血清。若含有针对自VHZ多肽可获得的表位的多克隆抗体的血清含有针对其它抗原的抗体，则可以通过免疫亲和层析来纯化多克隆抗体。用于生成和加工多克隆抗血清的技术是本领域中已知的。为了可以制备此类抗体，我们还提供了作为半抗原与另一种氨基酸序列联合(haptenise)的VHZ氨基酸序列或其片段以在动物或人中作为免疫原使用。
单克隆抗体
本领域技术人员也能容易地生成针对自VHZ多肽或肽可获得的表位的单克隆抗体。用于通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是公知的。可以通过细胞融合，并且也可以通过其它技术诸如用致癌性DAN直接转化B淋巴细胞，或者用埃巴病毒进行转染来创建永生的抗体生成细胞系。可以对针对眶表位(orbit epitope)生成的数组单克隆抗体筛选各种特性，即同种型和表位亲和力。
可以使用提供由培养中的连续细胞系进行的抗体分子生成的任何技术来制备单克隆抗体。这些包括但不限于最初由Koehler和Milstein记载的杂交瘤技术(1975Nature 256：495-497)、三源杂交瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等(1983)Immunol Today 4：72；Cote等(1983)Proc Natl Acad Sci80：2026-2030)和EBV杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，第77页-第96页，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
可以使用重组DNA技术来改善抗体，如本文所描述的。如此，可以构建嵌合抗体以在诊断或治疗应用中降低其免疫原性。此类技术包括将小鼠抗体基因剪接至人抗体基因以获得具有合适的抗原特异性和生物学活性的分子(Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 81：6851-6855；Neuberger等(1984)Nature 312：604-608；Takeda等(1985)Nature 314：452-454)。此外，可以如下使免疫原性最小化，即通过CDR嫁接[参见欧洲专利申请0239400(Winter)]和任选地，框架修饰[EP 0 239 400]来使抗体人源化。
或者，可以改编为生成单链抗体而描述的技术(美国专利号4,946,779)以生成物质特异性单链抗体。
针对自VHZ多肽或肽可获得的表位的抗体(单克隆和多克隆两者)在诊断中是特别有用的。具体地，可以使用单克隆抗体来制备抗独特型抗体。抗独特型抗体是携带所期望的保护针对的物质和/或媒介物的“内影像”(internalimage)的免疫球蛋白。用于制备抗独特型抗体的技术是本领域中已知的。这些抗独特型抗体在治疗中也可以是有用的。
也可以如下生成抗体，即在淋巴细胞群体中诱导体内生成或者筛选重组免疫球蛋白文库或数组高度特异性的结合剂，如披露于Orlandi等(1989，ProcNatl Acad Sci 86：3833-3837)及Winter G和Milstein C(1991；Nature349：293-299)的。
还可以生成含有针对多肽或肽的特异性结合位点的抗体片段。例如，此类片段包括但不限于可以通过对抗体分子的胃蛋白酶消化而生成的F(ab’)2片段和可以通过还原F(ab’)2片段的二硫桥而生成的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库以容许快速且容易地鉴定具有想要的特异性的单克隆Fab片段(Huse WD等(1989)Science 256：1275-1281)。
也可以改编用于生成单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)来生成针对VHZ多肽的单链抗体。还有，可以使用转基因小鼠或其它生物体(包括其它哺乳动物)来表达人源化抗体。
可以采用上文所描述的抗体来分离或鉴定表达多肽的克隆或者通过亲和层析来纯化多肽。
抗体生成的重组技术
可以依照已建立的规程使用重组DNA技术在细菌或哺乳动物细胞培养物中生成抗体。选定的细胞培养系统可以分泌抗体产物。
因此，我们公开了一种用于生成抗体的方法，包括培养宿主(例如大肠杆菌或哺乳动物细胞)，并分离所述蛋白质，所述宿主已经用包含如下表达盒的杂合载体转化，所述表达盒包含启动子、与其可操作连接的编码信号肽的第一DNA序列、与第一DNA序列以符合正确读码框的方式连接的编码所述抗体蛋白质的第二DNA序列。
在合适的培养基中实施杂交瘤细胞或哺乳动物宿主细胞的体外增殖，所述合适的培养基是常规的标准培养基，例如Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)或RPMI 1640培养基，任选地，补充有哺乳动物血清，例如胎牛血清、或痕量元素和生长维持补充物，例如饲养细胞诸如正常的小鼠腹膜渗出细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞、2-氨基乙醇、胰岛素、运铁蛋白、低密度脂蛋白、油酸等。同样在本领域已知的合适培养基中实施宿主细胞(其是细菌细胞或酵母细胞)的增殖，例如对于细菌，在培养基LB、NZCYM、NZYM、NZM、极端培养基(Terrific Broth)、SOB、SOC、2x YT、或M9基本培养基中，而对于酵母，在培养基YPD、YEPD、基本培养基、或完全极限撤除成分培养基(Complete Minimal Dropout Medium)中。
体外生成提供相对较纯的抗体制备物，并容许放大至给出大量的想要抗体。用于细菌细胞、酵母或哺乳动物细胞培养的技术是本领域已知的，并且包括均质悬浮培养，例如在气升式反应器中或者在连续搅拌器反应器中，或者固定化的或俘获的(entrapped)细胞培养，例如在空心纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷筒上。
也可以通过在体内增殖哺乳动物细胞来获得大量的想要抗体。出于此目的，将生成想要的抗体的杂交瘤细胞注射入组织相容性哺乳动物中以引起抗体生成肿瘤的生长。任选地，用烃引发(prime)动物，尤其是矿物油诸如姥鲛烷(四甲基十五烷)，之后进行注射。1至3周后，自那些哺乳动物的体液分离抗体。例如，将通过融合合适的骨髓瘤细胞与来自Balb/c小鼠的抗体生成脾细胞获得的杂交瘤细胞，或自杂交瘤细胞系Sp2/0衍生的生成想要的抗体的经转染细胞腹膜内注射入任选地用姥鲛烷预处理的Balb/c小鼠中，并在1至2周后，自动物采集腹水。
上述的和其它的技术记载于例如Kohler和Milstein，(1975)Nature256：495-497；US 4,376,110；Harlow和Lane，Antibodies：a Laboratory Manual，(1988)Cold Spring Harbor，通过提及而收入本文。用于制备重组抗体分子的技术记载于上文的参考文献中，并且还记载于例如EP 0623679；EP 0368684和EP 0436597，通过提及而将它们收入本文。
对细胞培养物上清液筛选想要的抗体，其优先通过对PGC或其它多能细胞诸如ES或EG细胞的免疫荧光染色、通过免疫印迹、通过酶免疫测定法(例如三明治式测定法或斑点测定法)、或放射性免疫测定法来进行。
为了分离抗体，可以通过例如用硫酸铵进行的沉淀、针对吸湿性材料诸如聚乙二醇进行的透析、流过选择性膜的过滤等来浓缩培养物上清液中或腹水中的免疫球蛋白。若必要和/或想要的话，通过常规的层析方法，例如凝胶过滤、离子交换层析、流过DEAE-纤维素的层析和/或(免疫)亲和层析(例如用抗原或其片段或用蛋白A进行的亲和层析)来纯化抗体。
还提供了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞可以是遗传方面稳定的，分泌具有想要的特异性的单克隆抗体，并可以通过融化和再克隆自深度冷冻培养物活化。
还包括一种用于制备分泌针对VHZ多肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，其特征在于用一种或多种VHZ多肽或其抗原性片段免疫合适的哺乳动物例如Balb/c小鼠；融合经过免疫的哺乳动物的抗体生成细胞与合适的骨髓瘤细胞系的细胞，克隆在融合中获得的杂交细胞，并选择分泌想要的抗体的细胞克隆。例如，融合用VHZ免疫的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系PAI或骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14的细胞，对获得的杂交细胞筛选想要的抗体的分泌，并克隆阳性杂交瘤细胞。
我们描述了一种用于制备杂交瘤细胞系的方法，其特征在于在数月(例如2个和4个月之间)里通过数次(例如4至6次)皮下和/或腹膜内注射10和107和108个之间的表达VHZ的细胞和合适的佐剂来免疫Balb/c小鼠，并在最后一次注射后2至4天采集来自经过免疫的小鼠的脾细胞，并在存在融合促进剂诸如聚乙二醇的情况中与骨髓瘤细胞系PAI的细胞融合。可以在含有约30％至约50％的分子量4000左右的聚乙二醇的溶液中融合骨髓瘤细胞与3至20倍过量的来自经过免疫的小鼠的脾细胞。融合后，如上文所描述的那样在合适的培养基中扩充细胞，以有规律的时间间隔补充选择培养基，例如HAT培养基，以便阻止正常的骨髓瘤细胞长得超过想要的杂交瘤细胞。
还公开了包含插入物的重组DNA，所述插入物编码如上文所描述的针对VHZ的抗体的重链可变域和/或轻链可变域。根据定义，此类DNA包含编码单链DNA、由所述编码DNA构成及其互补DNA构成的双链DNA、或这些互补(单链)DNA自身。
此外，编码针对VHZ的抗体的重链可变域和/或轻链可变域的DNA可以是以酶促方式或以化学方式合成的DNA，其具有编码重链可变域和/或轻链可变域的真实DNA序列或其突变体。真实DNA的突变体是编码上文所提及抗体的重链可变域和/或轻链可变域的DNA，其中删除一个或多个氨基酸或者一个或多个氨基酸用一个或多个其它氨基酸替换。修饰可以在抗体的重链可变域和/或轻链可变域的CDR外。还意图此类突变型DNA是沉默突变体，其中一个或多个核苷酸用其它核苷酸替换，新的密码子编码相同的氨基酸。此类突变型序列也是简并序列。简并序列在遗传密码的意义内是简并的，即不限数目的核苷酸用其它核苷酸替换，而不导致最初编码的氨基酸序列的变化。此类简并序列由于它们不同的限制性位点和/或特定宿主(特别是大肠杆菌)优选的特定密码子的频率(以便获得重链鼠可变域和/或轻链鼠可变域的最佳表达)而可以是有用的。
术语突变体意图包括依照本领域已知的方法通过在体外诱变真实DNA来获得的DNA突变体。
为了装配完整的四聚体免疫球蛋白分子和表达嵌合抗体，融合编码重链和轻链可变域的重组DNA插入物与编码重链和轻链恒定域的相应DNA，然后转移入合适的宿主细胞中，例如在掺入杂合载体中后。
还公开了包含如下插入物的重组DNA，所述插入物编码与人恒定域g，例如γ1、γ2、γ3或γ4，诸如γ1或γ4融合的针对VHZ的抗体的重链鼠可变域。同样的，还公开了包含如下插入物的重组DNA，所述插入物编码与人恒定域κ或λ诸如κ融合的针对VHZ的抗体的轻链鼠可变域。
在另一个实施方案中，我们公开了编码重组多肽的重组DNA，其中重链可变域和轻链可变域经由间隔物基团而相连接，任选地，包含便于在宿主细胞中加工抗体的信号序列和/或编码便于纯化抗体的肽和/或切割位点和/或肽间隔物和/或效应分子的DNA。
意图编码效应分子的DNA是编码在诊断或治疗应用中有用的效应分子的DNA。如此，特别指明如下的效应分子，其是毒素或酶，特别是能够催化前药活化的酶。编码此类效应分子的DNA具有天然存在的酶的序列或者毒素编码DNA，或其突变体，并且可以通过本领域公知的方法来制备。
抗VHZ抗体
实施例描述了针对VHZ蛋白的抗体，即抗VHZ抗体的生成和生产。此类抗VHZ抗体可以能够结合VHZ，诸如胞内VHZ。
单克隆抗体和人源化单克隆抗体两者及其特性详细记载于此文件和实施例中。抗体包括能够结合VHZ的单克隆抗体209。还涵盖此抗体的人源化型式。
我们描述了能够结合VHZ多肽的抗体，其中所述抗体能够结合由抗体209结合的表位，或其变体、同系物、衍生物或片段。
所述抗体可以能够结合VHZ多肽上由抗体209结合的表位。抗体可以包含能够结合如下表位的抗VHZ抗体，所述表位是包含VHZ的残基C95的序列，或其变体、同系物、衍生物或片段。
抗体可以包含单克隆抗体209的可变区。
我们进一步描述了包含单克隆抗体209的可变区的抗体，或其能够结合VHZ的变体、同系物、衍生物或片段。
抗体可以能够结合胞内VHZ多肽。抗体可以能够穿过细胞的质膜。
抗体可以能够能够结合VHZ，并抑制VHZ的生物学活性。
抗体可以能够阻止癌症诸如结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌的转移。癌症可以包括表达VHZ的癌症。
抗体可以包括单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
我们进一步描述了包含抗VHZ抗体和别的治疗性抗体的组合。
我们进一步描述了包含与药学可接受赋形剂、稀释剂或载体一起的此类抗体或组合的药物组合物。
我们进一步描述了能够结合VHZ的抗体(其可以包括如描述的抗体)、如上文所列的组合或如上文所列的药物组合物，用于在治疗或预防癌症或其转移的方法中使用。
方法可以包括将癌细胞暴露于抗体或组合。方法可以包括对患有或怀疑患有癌症的个体施用治疗有效量的抗体、组合或组合物。癌症可以包括转移癌。癌症可以是表达VHZ的癌症。
癌症可以包括结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。
与未治疗的个体相比，经治疗的个体中的转移性肿瘤的数目可以降低至少50％。它可以降低至少60％。它可以降低至少70％。它可以降低至少80％。与未治疗的个体相比，经治疗的个体中的转移性肿瘤的数目可以降低至少90％。
我们进一步描述了如上文所列的抗体、如上文所列的组合或如上文所列的药物组合物，用于在诊断癌症或其转移的方法中使用。
我们进一步描述了包含与指令一起的此类抗体、此类组合或此类药物组合物的诊断试剂盒，用于在诊断癌症或其转移中使用。
我们进一步描述了包含选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的序列的多肽，或其能够结合VHZ的变体、同系物、衍生物或片段。
我们进一步描述了包含能够编码如上文所列分子的序列的核酸，或其能够编码具有VHZ结合活性的多肽的变体、同系物、衍生物或片段。
我们进一步描述了细胞或此类细胞的后代，所述细胞包含此类核酸序列或经此类核酸序列转化。
我们进一步描述了一种生成如所描述的抗体的方法，该方法包括提供此类细胞，并自所述细胞表达所述抗体。
我们进一步描述了一种在个体中诊断癌症诸如转移癌的方法，该方法包括将来自所述个体的生物学样品暴露于如上文所列的抗体，并检测抗体与VHZ多肽之间的结合。
我们进一步描述了一种在患有或怀疑患有癌症的个体中治疗或预防癌症诸如转移癌的方法，该方法包括对个体施用治疗有效量的如所描述的抗体、如所描述的组合或如所描述的组合物。
方法可以包含如上文任一段落中所列的特征。
我们进一步描述了一种在患有或怀疑患有癌症的个体中治疗或预防癌症诸如转移癌的方法，该方法包括通过如所描述的方法来诊断个体中的癌症，并通过如所描述的方法来治疗所述个体。
我们进一步描述了一种检测转移性细胞的方法，该方法包括将候选细胞暴露于如上文所描述的抗体，并检测细胞的VHZ多肽表达。
我们进一步描述了一种为转移性肿瘤产生动物模型的方法，该方法包括：(a)将多个转移癌细胞诸如表达VHZ的癌细胞施用入第一动物中；(b)容许细胞在第一动物中形成转移性肿瘤；(c)自第一动物提取转移性肿瘤，并自转移性肿瘤衍生细胞系；并(d)将细胞系的多个细胞施用入第二动物中。
我们进一步描述了通过此类方法可获得的动物模型。
我们进一步描述了通过此类方法生成的或如上文所列的动物模型作为转移性肿瘤的模型的用途。
我们进一步描述了包括下列步骤的方法，即提供如所描述的抗体，并容许抗体结合VHZ多肽。
可以容许抗体结合表达VHZ多肽的细胞。
为了避免疑问，在本文件中提及特定抗体名称的情况中，这应当理解为包括提及小鼠单克隆抗体(如由杂交瘤分泌的)及其人源化型式两者，除非上下文另有规定。如此，例如在提及抗体209的情况中，这包括单克隆抗体209(即称作209的小鼠杂交瘤分泌性抗体)及人源化单克隆抗体209两者。
本领域技术人员可以从本文件中所公开的信息，并采用我们也详细描述的分子生物学技术来生成本文件中所描述的特定抗体。
出于此目的，我们公开了单克隆抗体209的可变区的序列。我们进一步公开了可变区的变体、同系物、片段和衍生物。使用此序列信息，技术人员可以生成包含可变区或其变体、同系物、片段和衍生物的抗体。
我们进一步描述了用于表达这些单克隆抗体的核酸构建体。这些构建体实现与209具有相同序列的单克隆抗体的生成。我们进一步公开了209的变体、同系物、片段和衍生物。
最后，我们描述了能够表达人源化单克隆抗体209的构建体。我们描述了自用构建体及这些人源化构建体的变体、同系物、片段和衍生物转染的细胞表达感兴趣的抗体的方法。
使用此类序列和表达方法，技术人员可以容易地转染相关宿主细胞，并引起它们表达整个单克隆或人源化抗VHZ抗体、或其变体、同系物、片段和衍生物。
我们进一步提供了一般具有VHZ结合活性的多肽。此类多肽包括抗VHZ抗体。VHZ结合多肽可以包含一项或多项与单克隆抗体209相同或相似的特性。为了方便，多肽一般会称为“抗VHZ抗体”。
构建结合分子在读者的技术范围内，所述结合分子可以不是(或者可以不描述为)抗体或免疫球蛋白，但是包含如本文所描述的抗VHZ结合活性。因而，并且在上下文容许的情况中，术语“抗VHZ抗体”应当理解为包括任何分子，只要它能够结合VHZ。此类分子可以包括多肽、小分子、及抗体和免疫球蛋白，而且可以经由本领域已知的多种手段来鉴定，例如通过在VHZ结合活性方面筛选合适的文库来进行。
抗VHZ抗体(其包括VHZ结合分子)可以包含可与单克隆抗体209相似或相同的特性。特别地，此类相似或相同的特性可以包括结合特性。一般地，抗VHZ抗体可以能够结合VHZ多肽，例如VHZ。
如此，术语“抗VHZ抗体”会理解为包括单克隆抗体209(及其人源化对应物)。还包括包含抗体209之可变区或其变体、同系物、片段和衍生物的多肽。在上下文容许的情况中，此术语还应当理解为包括提及抗VHZ抗体的变体、同系物、片段和衍生物，如下文所描述的。
VHZ表位
抗VHZ抗体可以与209具有相同或相似的结合特异性、结合亲和力和/或结合亲和力。抗VHZ抗体可以特异性结合由抗体209结合的表位。
用于测定由特定抗体结合的表位的方法是本领域中已知的。此类表位定位方法记载于例如Hanson等，(2006).Respiratory Research，7：126。此外，技术人员会能够生成抗体，并对它们筛选特定特性。实施例27中显示了此类方法的详细描述。因而，技术人员会容易能够鉴定与209结合相同表位的抗VHZ抗体。
抗VHZ抗体可以包含抗体209的可变区，其在下文详细描述。它们可以在单一抗体分子中包含相同或不同可变区。它们可以包含一个可变区，或者超过一个可变区。因而，我们为技术人员提供了生成许多与抗体209包含相同或相似结合反应性的抗体的能力。
此类抗体可以包含抗体的完整或基本上完全的序列(即重链和轻链)，或者它们可以包含整个抗体的片段(诸如Fv、F(ab’)和F(ab’)2片段或单链抗体(scFv))。抗体可以进一步包含融合蛋白或合成蛋白，其包含抗体的抗原结合位点，如下文详细描述的。也会明显的是，可以在想要的特性诸如降低的宿主反应性、降低的排斥等方面工程化改造此类抗体。
工程化改造可以包括“人源化”，通过该术语，我们想要在抗体序列诸如小鼠抗体序列中包含一种或多种人残基或序列(或用一种或多种人残基或序列替代)。“人源化”在本文件的上下文中包括“嵌合”抗体，其中抗体包含小鼠和人序列的离散部分，例如其中可变区之一或两者包含小鼠序列，而抗体分子的剩余部分(诸如恒定区)包含人序列。在此类嵌合抗体中，例如小鼠或大鼠抗体的所有可变区可以与人恒定区一起表达。这给此类嵌合抗体提供人效应器功能，而且还降低由鼠Fc区引起的免疫原性(HAMA)。
一般地，“嵌合抗体”可以指具有或是由自鼠免疫球蛋白基因衍生的核苷酸序列编码的重链和轻链和或是由自人免疫球蛋白基因衍生的核苷酸序列编码的重链和轻链的抗体。
“人源化”还包括CDR嫁接的或重构的抗体。如此，它包括在更离散的水平工程化改造，例如小鼠可变区已经进行过突变以包含人残基来降低免疫原性的抗体。在此类抗体中，仅将来自啮齿类抗体V区的互补决定区与来自人V区的框架区组合。此类抗体应当比嵌合抗体更多人的且免疫原性更小。
一般地，抗VHZ抗体可以能够结合多种条件中的VHZ多肽。
在一个实施方案中，结合环境包含胞内条件。也就是说，抗VHZ抗体可以能够结合完整的或未透化的细胞中的VHZ多肽。此类未透化的细胞可以包括尚未暴露于或基本上尚未暴露于透化剂诸如去污剂(例如Triton X-100)或毛地黄皂苷的细胞。
如本文所描述的抗VHZ抗体可以能够在VHZ在细胞内部、在细胞膜内或在细胞内包囊时结合它。类似地，VHZ多肽可以在包括细胞内部的环境的背景中被抗VHZ抗体结合，如本文件中一般描述的。特别地，抗VHZ抗体可以能够结合胞内VHZ多肽。胞内VHZ多肽可以与一种或许多细胞结构，例如细胞膜的内部小叶、细胞器、细胞骨架结构、核膜等有关。VHZ多肽可以位于细胞核内。在这些情况之每种中，抗VHZ抗体可以能够结合胞内环境内的VHZ多肽。
抗VHZ抗体可以能够以多种方式结合胞内环境中的VHZ多肽。抗VHZ抗体可以能够穿过质膜。它可以能够以其它方式接近VHZ多肽的结合区，例如通过细胞摄取进行。可以通过任何手段将它内化或转移或以其它方式投递入细胞中。
在另一个实施方案中，结合条件包括胞外条件。因此，抗VHZ抗体可以能够结合其在胞外环境中的关联VHZ多肽。
因此，抗VHZ抗体可以能够在胞外结合VHZ多肽。换言之，如本文所描述的抗VHZ抗体可以能够在VHZ在细胞外部时结合它。类似地，VHZ多肽可以在细胞内部外的环境的背景中被抗VHZ抗体结合，如本文件中一般描述的。抗VHZ抗体可以能够结合分泌性VHZ多肽，这视情况而定。VHZ多肽可以包括循环VHZ多肽。
抗VHZ抗体可以能够结合外部或外化的VHZ多肽。它们可以结合血液循环中的分泌性VHZ多肽。
抗VHZ抗体与其靶物之间的结合或多或少可以是强的或弱的、瞬时的、半永久性的或永久性的。
抗VHZ抗体对VHZ多肽的结合可以在细胞内发生。此类结合可以灭活、抑制或降低VHZ多肽的活性。结合可以中和VHZ活性。活性可以包括由VHZ多肽引起的或与VHZ多肽有关的任何生物学活性。活性可以包括结合另一种蛋白质，例如下游蛋白质或因子。抗VHZ抗体对VHZ多肽的结合可以灭活、抑制或降低下游蛋白质或因子的活性。活性可以包括与其它细胞(例如诸如循环中的转移癌细胞等细胞)通信。如此，抗VHZ抗体可以中和血液循环中的VHZ多肽以阻止VHZ磷酸酶结合下游因子或阻止其与循环中的其它细胞通信。
活性可以包括生物化学活性或病原性活性。生物化学活性可以包括催化活性。催化活性可以包括磷酸酶活性。活性可以包括生长调节活性、癌症活性、致癌活性或转移活性。
可以使用单克隆抗体209来治疗人或其它动物中的疾病。我们在实施例中显示了，此类抗VHZ抗体具有抗癌活性。具体地，实施例显示了，抗VHZ抗体能够预防癌肿瘤的转移性扩散。
实施例27显示了与未用抗VHZ抗体处理的动物相比，用抗VHZ抗体处理的动物显示显著较少的肿瘤。抗VHZ抗体能够结合以阻断VHZ多肽活性。
因而，我们提供了抗VHZ抗体在治疗或预防疾病诸如癌症中的用途。癌症可以包括转移癌。可以使用抗VHZ抗体作为药物或疗法来治疗癌症转移，诸如已建立的肿瘤。可以使用它们来预防癌症或其转移。
可治疗或可预防的癌症可以包括与VHZ蛋白的表达或过表达有关的癌症。VHZ蛋白可以是家族的相关成员。这样，我们的意思是与VHZ的表达或过表达有关的癌症可以通过抗VHZ抗体诸如209或具有相似或相同特性的抗体可治疗或可预防。类似地，与VHZ的表达或过表达有关的癌症可以通过抗VHZ抗体诸如209或具有相似或相同特性的抗体可治疗或可预防。
一般地，治疗可以包括使癌细胞或怀疑为癌细胞的细胞与抗VHZ抗体接触。可以将细胞暴露于抗VHZ抗体。可以将暴露重复许多次。可以使用任何暴露时机的任何量或相对量的抗VHZ抗体的任何组合。
因此，我们提供了如上文所描述的抗VHZ抗体的组合在治疗疾病诸如癌症中的用途。
细胞可以是个别的细胞，或者它可以在细胞块诸如癌症或肿瘤细胞块中。细胞可以在生物体身体内部。生物体可以是已知患有癌症的，或者它可以是怀疑有癌症的。治疗可以包括对生物体施用一种或多种抗体。如上文的，可以施用单一抗体，或者可以施用抗VHZ抗体与另一种治疗性抗体的组合。施用可以是同时的或序贯的，如上文所描述的。如此，治疗可以包括与别的治疗性抗体同时或序贯地将抗VHZ抗体施用于个体。
一般地，抗VHZ抗体可以包含能够结合VHZ分子的任何免疫球蛋白，如下文更为详细地描述的。
抗体
如本文件中所使用的，在上下文容许的情况中，术语“抗体”和“免疫球蛋白”可以互换使用。这些术语包括抗体分子的经蛋白水解切割的或重组制备的部分中能够与VHZ或其表位诸如由209结合的VHZ表位选择性起反应或者识别VHZ或其表位诸如由209结合的VHZ表位的片段。
此类蛋白水解和/或重组片段的非限制性例子包括Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv片段、和含有由肽接头连接的VL和VH域的单链抗体(scFv)。可以共价或非共价连接这些Fv以形成具有两个或更多个结合位点的抗体。
通过“ScFv分子”，我们指VH和VL配偶域经由柔性寡肽连接的分子。牵涉合成保留其特异性结合位点的抗体片段的技术的一般性综述要参见Winter和Milstein(1991)Nature 349，293-299。
完整的抗体和F(ab’)2片段是“二价的”。通过“二价的”，我们指所述抗体和F(ab’)片段具有两个抗原结合位点。比较而言，Fab、Fv、ScFv和dAb片段是单价的，仅具有一个抗原结合位点。
抗VHZ抗体可以包含具有10-2s-1至10-4s-1的解离速率的高亲和力抗体。解离速率可以是约2x10-4s-1。
如本文件中所使用的，术语“解离率”指抗体诸如本文所公开的抗VHZ抗体的解离速率(koff)。它可以使用BIAevaluation软件(Pharmacia)来测量。低的解离速率是想要的，因为它反映Fab片段对抗原的亲和力。
术语“亲和力”根据抗体诸如抗VHZ抗体的解离速率(koff)定义。解离速率越低，抗体诸如抗VHZ抗体对抗原诸如VHZ具有的亲和力越高。
抗VHZ抗体可以包含肽本身或者形成融合蛋白的部分。
本文所描述的抗VHZ抗体包括包含VHZ结合活性，诸如对胞内VHZ的结合能力或结合由209结合的相同表位的任何抗体，视情况而定。
抗VHZ抗体还包括整个或完整的抗体(无论是小鼠的、人源化的还是人的)，此类抗体衍生物和生物学活性片段。这些可以包括具有VHZ结合活性的抗体片段，其具有氨基酸替代或者具有附着至氨基酸功能团的糖或其它分子，等等。
抗VHZ抗体可以包括分离的抗体或纯化的抗体。它可以自任何合适的来源(无论是否为天然的)可获得或者由任何合适的来源生成，或者它可以是合成的抗VHZ抗体、半合成的抗VHZ抗体、衍生化的抗VHZ抗体或重组抗VHZ抗体。
在抗VHZ抗体是非天然抗VHZ抗体的情况中，它可以包括其中至少部分已经通过重组DNA技术制备的或者通过化学合成技术生成的抗VHZ抗体或其组合。
如本文件中所使用的，术语“衍生物”包括对抗VHZ抗体的化学修饰。例示性的此类修饰会是用例如烃基、酰基、或氨基基团替换氢。抗VHZ抗体的序列可以与天然存在形式的序列相同或者它可以是其变体、同系物、片段或衍生物。
抗体可变区
如本文件中所使用的，术语“可变区”指轻链(VL)和重链(VH)中含有关于针对VHZ(或变体、同系物、片段或衍生物)的抗体的结合识别特异性和关于总体亲和力的决定子的可变区或域，视情况而定。
每对轻链(VL)和重链(VH)的可变域牵涉抗原识别，而且形成抗原结合位点。轻链和重链的域具有相同的一般结构，并且每个域具有由三个互补决定区(CDR)连接的四个序列是相对保守的框架(FR)区。FR区维持可变域的结构完整性。CDR是可变域内介导抗原结合的多肽区段。
如本文件中所使用的，术语“恒定区”指抗体(或变体、同系物、片段或衍生物)的轻链(CL)和重链(CH)中提供结构稳定性和其它生物学功能诸如抗体链联合、分泌、经胎盘移动、和补体结合，但是不牵涉结合VHZ表位的域。恒定区的氨基酸序列和基因中相应的外显子序列会取决于衍生其的物种。然而，导致同种异型的氨基酸序列变异对于物种内的特定恒定区是相对有限的。“同种异型”是区分等位基因的抗原决定簇(或表位)。
每条链的可变区通过连接多肽序列与恒定区连接。连接序列由轻链基因中的“J”序列和重链基因中的“D”序列和“J”序列的组合编码。
抗体：可变区序列
抗体209
单克隆抗体209的可变区的重链氨基酸序列如下(SEQ ID NO：4)：LVDMDSRLNLVFLVLILKGVQCDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARWQTARATRGYAMDYWGQGTSVTVSS
单克隆抗体209的可变区的轻链氨基酸序列如下(SEQ ID NO：5)：VMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRFTGVPDLFTGSGSGTDFTFTINSVQAEDLAVYYCQQHYSSPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFHHPVSLG
可以通过本领域中已知的方法自这些可变区序列生成依照本文所描述的方法和组合物的抗VHZ抗体。例如，可以经由技术人员已知的重组遗传工程技术将重链和轻链序列重组入选定抗体的恒定序列中。
恒定区序列是本领域中已知的，并且可获自许多数据库，诸如IMGT/LIGM-DB数据库(记载于Giudicelli等，2006，Nucleic Acids Research 34(数据库刊号)：D781-D784及LeFranc等(1995)LIGM-DB/IMGT：An IntegratedDatabase of Ig and TcR，Part of the Immunogenetics Database.Annals of theNew York Academy of Sciences 764(1)，47-47doi：10.1111/j.1749-6632.1995.tb55805.x)和IMGT/GENE-DB数据库(记载于Giudicelli等，2005，Nucleic Acids Res.2005年1月1日；33(数据库刊号)：D256-61)。IMGT/LIGM-DB和IMGT/GENE-DB是位于www.ebi.ac.uk/imgt/的ImMunoGeneTics数据库的部分。
用于组合具有给定序列的可变区与恒定区以生成完整抗体的方法是本领域中已知的，并且记载于例如实施例16和Hanson等，(2006).RespiratoryResearch，7：126。可以通过本领域中已知的手段来生成完整抗体的片段诸如Fv、F(ab’)和F(ab’)2片段或单链抗体(scFv)。
例如使用所公开的序列和文献中所描述的方法，可以将抗体209的可变区的重链和轻链(其具有上文所显示的序列)与小鼠IgG恒定区序列转基因融合以生成小鼠单克隆抗VHZ抗体。
用途
可以在检测生物学样品中存在的VHZ多肽的方法中使用抗VHZ抗体，其通过包括如下各项的方法来进行：(a)提供抗VHZ抗体；(b)在容许形成抗体-抗原复合物的条件下将生物学样品与所述抗体一起温育；并(c)测定是否形成包含所述抗体的抗体-抗原复合物。
合适的样品包括提取物组织诸如脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰、睾丸、肝、肌肉和骨组织或者来自自此类组织衍生的赘生性生长。具体地，样品可以包含来自怀疑患有相关癌症的个体的组织，诸如结肠、肺、鳞状细胞(包括唇、喉、外阴、宫颈和阴茎)、胰腺、脑、食管、胃、膀胱、肾、皮肤、卵巢、前列腺和睾丸组织。
可以将抗体结合至固体支持物和/或在合适的容器中与合适的试剂、对照、指令等一起包装入试剂盒中。
抗体投递
可以依靠本领域已知的技术，例如通过使用脂质体、聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物、聚酰胺型胺类(polyamidoamine，PAMAM)树状聚物、HEMA、线性聚酰胺型胺类聚合物等)等将针对VHZ蛋白的抗体投递入细胞中。也可以将免疫球蛋白和/或抗体作为蛋白质融合物或与能够穿越质膜和/或核膜的蛋白质的偶联物投递入细胞中。例如，可以将免疫球蛋白和/或靶物与来自此类蛋白质的负责移位活性的域或序列融合或偶联。移位域和序列可以包括来自HIV-1反式活化蛋白(Tat)、果蝇(Drosophila)触角(Antennapedia)同源域蛋白和单纯疱疹-1病毒VP22蛋白的域和序列。
药物组合物和施用
虽然有可能单独施用抗VHZ剂，包括VHZ核酸、多肽、其片段、同系物、变体或衍生物，调控剂、激动剂或拮抗剂，结构相关化合物，或任一者的酸式盐，可以将活性成分配制为药物配制剂。
因此，我们还公开了包含抗VHZ剂的药物组合物。此类药物组合物可用于向个体投递抗VHZ剂诸如以如所描述的组合物的形式以治疗或减轻症状，如所描述的。
本文件的上下文中的药物组合物是至少包含抗VHZ剂(作为活性成分)的物质组合物。
药物配制剂包含有效量的抗VHZ剂以及一种或多种药学可接受载体。“有效量”指足以减轻如所描述的疾病的至少一种症状的量。
根据要治疗或减轻的特定疾病或综合征、以及其它因素，包括患者的年龄和重量、疾病等状态是何种程度的晚期、患者的一般健康、症状的严重程度、和抗VHZ剂是单独施用还是与其它疗法组合施用，有效量会有所变化。
合适的药学可接受载体是本领域公知的，并且随药物配制剂的想要的形式和施用模式而变化。例如，它们可以包括稀释剂或赋形剂诸如填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、滑润剂等。通常，载体是固体、液体或可蒸发的载体，或其组合。每种载体应当是“可接受的”，其意义为与配制剂中的其它成分是相容的而且对患者无害。载体应当是生物学可接受的，在给宿主施用时不会引发不利反应(例如免疫应答)。
涵盖的是，药物组合物的活性成分在例如减轻癌症、肿瘤、新生物和其它相关疾病中展现出治疗活性。可以调整剂量方案来提供最佳的治疗响应。例如，可以每天施用数个分剂或者可以根据治疗状况的紧急事件所指明的按比例降低剂量。
可以以方便的方式诸如通过口服、静脉内(在水溶性的情况中)、肌肉内、皮下、鼻内、皮内或栓剂路径或植入(例如使用缓慢释放分子)来施用活性化合物。根据施用路径，活性成分可能需要被包被在某种材料中以保护所述成分免于可灭活所述成分的酶、酸和其它天然条件的作用。
可以单独地或与其它治疗剂组合地施用抗VHZ剂。适合于本文中使用的其它治疗剂是对预期目的有效的任何相容性药物或与药剂配制剂互补的药物。可以与其它治疗同时或者序贯施用联合疗法中利用的配制剂，使得实现联合效果。
口服施用
在一些实施方案中，以口服组合物形式提供并相应施用VHZ活性、表达或量的抑制剂。VHZ活性、表达或量的抑制剂的剂量可以在约1mg/天至约10mg/天之间。
可以在片剂、胶囊或溶液形式的口服配制剂中施用药物组合物。每天给患者施用1至3次有效量的口服配制剂，直至疾病的症状得到减轻。
药剂的有效量取决于患者的年龄、重量和状况。一般而言，药剂的日口服剂量小于1200mg，且大于100mg。日口服剂量可以是约300-600mg。方便地以单位剂量形式呈现口服配制剂，并且可以通过药学领域已知的任何方法来制备。组合物可以与合适的药学可接受载体一起配制成任何想要的剂量形式。典型的单位剂量形式包括片剂、丸剂、粉剂、溶液、悬浮液、乳液、粒剂、胶囊、栓剂。一般而言，如下制备配制剂，即均一且密切地达到药剂组合物与液体载体或细碎的固体载体或两者的关联，并在必要时，使产物成形。可以以液体、粉剂、片剂或胶囊形式将活性成分掺入各种基本材料中以给出有效量的活性成分来治疗疾病。
可以适当地与例如惰性稀释剂或可同化的、可食用的载体一起口服施用组合物，或者它可以装入硬壳或软壳明胶胶囊中，或者它可以压制成片剂，或者它可以直接与饮食食物一起掺入。为了口服治疗性施用，可以将活性化合物与赋形剂一起掺入，并且以可摄食的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、速溶片(wafer)等形式使用。会获得此类合适剂量的此类治疗有用组合物中的活性化合物的量。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有下列成分：粘合剂诸如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂诸如磷酸二钙；崩解剂诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂诸如硬脂酸镁；并可以添加甜味剂诸如蔗糖、乳糖或糖精或调味剂诸如薄荷、冬青油、或樱桃调味剂。在剂量单位形式是胶囊时，在上述类型的材料外，它可以含有液体载体。
多种其它材料可以作为涂层存在或者以其它方式修饰剂量单位的物理形式。例如，可以用紫胶/虫胶、糖或两者包被片剂、丸剂、或胶囊。糖浆或酏剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂诸如樱桃或桔香料。当然，制备任何剂量单位形式中所使用的任何材料应当是药学上纯的，且所采用的量基本上无毒。另外，可以将活性化合物掺入持续释放制剂和配制剂中。
可注射或静脉内施用
在一些实施方案中，作为可注射或静脉内组合物提供并相应施用抗VHZ剂。抗VHZ剂抑制剂的剂量可以在约5mg/kg/2周至约10mg/kg/2周之间。可以以10-300mg/天之间，诸如至少30mg/天，小于200mg/天或30mg/天至200mg/天之间的剂量提供抗VHZ剂抑制剂。
适合于可注射使用的药学形式包括无菌水溶液(在水溶性的情况中)或分散体和供即时制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。在所有情况中，所述形式必须是无菌的，而且必须有存在容易的可注射性的程度的流动性。它在制造和贮存条件下必须是稳定的，而且必须针对微生物诸如细菌和真菌的污染作用进行保存/防腐。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和植物油。可以例如通过使用涂层诸如卵磷脂、在分散体的情况中通过维持所要求的粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
表面施用
本文所公开的药物组合物包括那些适合于表面和口服施用的，其中表面配制剂在受累组织主要是皮肤或表皮(例如，银屑病、湿疹和其它表皮疾病)的情况中是优选的。
表面配制剂包括如下那些药学形式，其中通过与要治疗的皮肤表面直接接触来外部应用所述组合物。供表面应用的常规药学形式包括浸泡液、软膏剂、乳剂、洗剂、糊剂、凝胶、贴片(stick)、喷雾剂、气雾剂、沐浴油、溶液等。通过各种媒介物投递表面疗法，媒介物的选择可以是重要的，并且一般涉及要治疗的是急性还是慢性疾病。作为一个例子，一般用水性干燥制剂治疗急性皮肤增殖疾病，而用水合制剂治疗慢性皮肤增殖疾病。浸泡液是干燥急性潮湿疹的最早方法。洗剂(水悬浮液中的粉末)和溶液(溶解于溶剂中的药物)对于多毛和擦烂区域是理想的。软膏剂或油包水乳剂是最有效的水合剂，适合于干燥的鳞屑疹，但是是多脂的，并且取决于损伤位置有时是不想要的。在适当时，它们可以与绷带联合应用，特别在想要提高药剂组合物透入损伤中时。乳剂或水包油乳剂和凝胶是可吸收的，并且在美容方面是患者最可接受的(Guzzo等，于Goodman & Gilman’s Pharmacological Basis ofTherapeutics，第9版，第1593页-第15950页(1996))。一般而言，乳剂配制剂包括如下成分，诸如石油、羊毛脂、聚乙二醇、矿物油、甘油、棕榈酸异丙酯、硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂醇(cetearyl alcohol)、醋酸生育酚(tocopheryl acetate)、肉豆蔻酸异丙酯(isopropyl myristate)、羊毛脂醇、西甲硅油(simethicone)、卡波姆(carbomen)、甲基氯异噻唑啉酮(methylchlorisothiazolinone)、甲基异噻唑啉酮(methylisothiazolinone)、环甲硅油(cyclomethicone)和羟丙基甲基纤维素，以及其混合物。
供表面应用的其它配制剂包括洗发剂、肥皂、摇荡剂等，特别是那些配制成在下面的皮肤诸如头皮上留下残留物的(Arndt等，于Dermatology InGeneral Medicine 2：2838(1993))。
一般而言，表面配制剂中的组合物浓度为约0.5至50％(按组合物的重量计)，诸如约1至30％，约2-20％，或约5-10％的量。最初，所使用的浓度可以在范围的上部部分中，随着治疗继续，可以降低浓度或者配制剂的应用频率可以更小。表面应用通常每天应用两次。然而，较大剂量的每天一次应用或较小剂量的较频繁应用可以是有效的。角质层可以起贮器作用，并容许药物在延长的一段时间里逐渐渗透入活的皮肤层中。
在表面应用中，足够量的活性成分必须渗透患者的皮肤，以便获得想要的药理学效果。一般了解的是，药物向皮肤中的吸收是药物性质、媒介物行为、和皮肤的函数。三个主要变量导致不同表面药物或不同媒介物中的相同药物的吸收或流出速率；媒介物中的药物浓度、角质层和媒介物之间的药物分配系数和角质层中的药物扩散系数不同。为了有效治疗，药物必须穿越负责皮肤屏障功能的角质层。一般而言，施加高的体外皮肤渗透的表面配制剂在体内是有效的。Ostrenga等(J.Pharm.Sci.，60：1175-1179(1971))证明了表面应用的类固醇的体内功效与体外类固醇进入取皮的(dermatomed)人皮肤中的渗透速率(rate)成比例。
可以将皮肤病学可接受的且与药剂相容的皮肤渗透增强剂掺入配制剂中以提高活性化合物自皮肤表面进入表皮角质形成细胞中的渗透。提高活性化合物进入皮肤的吸收的皮肤增强剂降低有效治疗所需要的药剂量，并提供持续更长的配制剂效果。皮肤渗透增强剂是本领域公知的。例如，已知二甲亚砜(美国专利No.3,711,602)；油酸、1，2-丁二醇表面活性剂(Cooper，J.Pharm.Sci.，73：1153-1156(1984))；乙醇和油酸或油醇的组合(EP 267,617)、2-乙基-1，3-己二醇(WO 87/03490)；癸基甲基亚砜和Azone.RTM.(Hadgraft，Eur.J.Drug.Metab.Pharmacokinet，21：165-173(1996))；醇、亚砜、脂肪酸、酯、Azone.RTM.、吡咯烷酮、尿素和多元醇(polyoles)(Kalbitz等，Pharmazie，51：619-637(1996))；萜诸如1，8-桉油素、薄荷酮、柠檬烯和橙花叔醇(Yamane，J.Pharmacy & Pharmocology，47：978-989(1995))；Azone.RTM.和Transcutol(Harrison等，Pharmaceutical Res.13：542-546(1996))；和油酸、聚乙二醇和丙二醇(Singh等，Pharmazie，51：741-744(1996))改善活性成分的皮肤渗透。
可以通过本领域技术人员已知的技术来确定药剂或组合物的渗透水平。例如，对活性化合物放射性标记，接着测量皮肤吸收的放射性标记的化合物的量使本领域技术人员能够使用测定测试化合物的皮肤渗透的数种方法之任一种来测定所吸收的组合物的水平。涉及皮肤渗透研究的出版物包括Reinfenrath，W G和G S Hawkins.The Weaning Yorkshire Pig as an AnimalModel for Measuring Percutaneous Penetration.于：Swine  in BiomedicalResearch(M.E.Tumbleson编)Plenum，New York，1986，和Hawkins，G.S.Methodology for the Execution of In Vitro Skin Penetration Determinations.于：Methods for Skin Absorption，B W Kemppainen和W G Reifenrath编，CRC Press，Boca Raton，1990，第67页-第80页；及W.G.Reifenrath，Cosmetics & Toiletries，110：3-9(1995)。
对于一些应用，可以使用本领域已知的配制剂诸如聚合物来施用长效形式的药剂或组合物。可以依照本领域已知的方法将药剂掺入皮肤贴片(Junginger，H.E.，于Acta Pharmaceutica Nordica 4：117(1992)；Thacharodi等，于Biomaterials 16：145-148(1995)；Niedner R.，于Hautarzt 39：761-766(1988))或绷带中，以提高向要治疗的区域投递药物的效率。
任选地，本文所描述的表面配制剂可以具有例如别的赋形剂；防腐剂诸如对羟基苯甲酸甲酯、苯甲醇、山梨酸或季铵化合物；稳定剂诸如EDTA，抗氧化剂诸如丁羟甲苯或丁羟茴醚，和缓冲剂诸如柠檬酸盐和磷酸盐。
胃肠外施用
也可以胃肠外或腹膜内施用活性化合物。也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中和在油中制备分散体。在一些实施方案中，可以在30％Capsitol(CyDex，Inc.，Lenexa，Kansas，USA)中制备分散体。Capsitol是一种聚阴离子β-环糊精衍生物，其中磺酸钠盐通过丁基醚间隔基团，或磺丁基醚(SBE)与亲脂性空穴分开。环糊精可以是SBE7-β-CD。
佐剂
组合物可以在佐剂中施用，与酶抑制剂共施用或者在脂质体中施用。佐剂以其最广义使用，并且包括任何免疫刺激化合物诸如干扰素。本文中所涵盖的佐剂包括雷锁辛(resorcinols)、非离子表面活性剂诸如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规的脂质体。
微生物生长的预防
在贮存和使用的通常条件下，这些制剂可以含有防腐剂以阻止微生物生长。
可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等来引起对微生物作用的预防。在许多情况中，有可能包括等张剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶来引起可注射组合物的吸收延长。
如下制备无菌可注射溶液，即在根据需要含有上文所列举的各种其它成分的合适溶剂中掺入需要量的活性化合物，接着进行过滤除菌。一般而言，分散体通过将经过灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中而制备，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举成分的所需其它成分。在供制备无菌可注射溶液用的无菌粉剂的情况中，制备方法可以包括真空干燥和冷冻干燥技术，其自先前经过无菌过滤的溶液产生含有活性成分加任何别的所需成分的粉末。
药学可接受载体
如本文中所使用的，“药学可接受载体和/或稀释剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域公知的。除非任何常规的介质或药剂与活性成分不相容，涵盖其在治疗性组合物中的应用。还可以将补充性的活性成分掺入组合物中。
剂量单位形式
为了容易施用和剂量的一致性，以剂量单位形式配制药物组合物是特别有利的。
如本文中所使用的，剂量单位形式指物理上离散的单元，适合作为要治疗的受试者的单一剂量；每个单元含有与所需要的药学载体联合的，预先确定数量的活性材料，其根据计算，产生想要的治疗效果。新的剂量单位形式的规格由下述各项规定，并直接取决于下述各项：(a)所述活性材料的独特特性和要达到的具体治疗效果，和(b)本领域配合此类活性材料以治疗身体健康受损的具有患病状况的活受试者中的疾病所固有的限制。
为了方便且有效的施用，主要的活性成分以有效量与合适的药学可接受载体在剂量单位形式中配合。在含有补充性的活性成分的组合物的情况中，通过参照施用所述成分的通常剂量和方式来确定剂量。
实施例
实施例1：VHZ-EGFP、VHZ(C95S)-EGFP、VHZ-GST、和VHZ(C95S)-GST表达构建体的生成
在VHZ片段的生成中使用人通用快速克隆II cDNA文库(BD，产品目录编号637260)作为模板。使用正向引物A：5’gcgaattcaccatgggcgtgcagccccccaacttctcc3’和反向引物B  ：5’gtggatcccgtttcgttcgctggtag3’来实施PCR(94，55，72℃，40个循环)。然后将VHZ PCR片段插入pEGFP-N1载体的EcoRI和BamHI位点中，产生C端加有EGFP标签的VHZ(VHZ-EGFP)。为了构建VHZ(C95S)，如先前所描述的那样(Zeng等2003)在类似的策略中使用上述正向引物A和反向引物B以及中部反向引物5’gccaaagcccagagcagagtgcactcccacagc3’和中部正向引物5’gcgaattcaccatgggcgtgcagccccccaacttctcc3’以制备没有催化活性的VHZ(C95S)。然后将VHZ(C95S)PCR片段插入pEGFP-N1载体的EcoRI和BamHI位点中以形成C端加有EGFP标签的突变型VHZ，即VHZ-(C95S)-EGFP。分别将VHZ和VHZ(C95S)PCR产物插入pGEX-KG中以形成VHZ-GST和VHZ(C95S)-GST。通过对编码区进行DNA测序来确认所有克隆。
实施例2：稳定表达VHZ-EGFP、VHZ-EGFP(C95S)和单独的EGFP载体的MCF-7和NRK细胞集合的生成
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)来将三种表达构建体分别转染入人乳腺癌细胞系MCF-7(ATCC HTB-22)或正常大鼠肾细胞NRK(ATCC CRL-6509)中。将细胞在补充有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)的RPMI 1640培养基中培养。在1mg/ml G418中选择细胞达20-30天以建立稳定细胞集合。然后通过FACS Vantage，SE模式(Becton Dickinson)对稳定集合(106个细胞/ml)进行EGFP分选以选择EGFP阳性细胞。
实施例3：对VHZ-EGFP亚细胞定位进行的共焦显微术和分析
将用VHZ-EGFP表达载体转染的NRK细胞在盖玻片上培养，并用PBSCM(含有1mM MgCl2和1mM CaCl2的PBS)清洗一次。然后在2.7％低聚甲醛中于室温(RT，24℃)固定细胞达20分钟。用PBSCM再清洗两次后，用PBSCM中的0.12％皂苷透化细胞达15分钟，并与来自Covance’Inc(Princeton，NJ)的家兔抗粒周蛋白抗体一起于RT温育1小时，然后于4℃过夜。用PBSCM温和地清洗细胞三次，并与偶联有德克萨斯红的抗小鼠IgG(Sigma)一起于RT温育4小时。通过荧光显微术来直接显现VHZ-EGFP(绿色)。实施共焦成像(Zeiss LSM510图像浏览器)。
实施例4：小鼠单克隆和家兔多克隆抗VHZ抗体的生成
先前描述了该方法(Li等，2005)。我们使用ClonaCellTM-HY杂交瘤克隆试剂盒(Stemcell Technologies Inc.)来生成VHZ杂交瘤。
融合自用VHZ-GST免疫的小鼠衍生的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞后，分离出506个存活的杂交瘤克隆，并培养。首先通过ELISA对所有克隆测试VHZ结合。80个克隆显示出与VHZ的良好反应，而选择具有最强反应性的两个特定VHZ克隆，因为这两个克隆能在数种应用中使用(图10)。
生成家兔多克隆抗VHZ血清(Genemed Synthesis，Inc.)。通过用与人VHZ的氨基酸残基(126-140)对应的合成肽CRRLRPGSIETYEQEK免疫家兔来生成抗体。通过蛋白A，然后通过肽亲和层析来纯化抗体。在对自数种细胞系衍生的细胞溶胞物的免疫印迹分析中通过此抗体检测出具有预期大小(16kDa)的特定条带，并且此条带的检测受到VHZ-GST融合蛋白特异性阻断(图10A)。
实施例5：对NRK、MCF-10A、和A431细胞中的内源性VHZ进行的共焦显微术和分析
将NRK细胞、人乳房上皮细胞MCF-10A(ATCC CRL-10317)、和人上皮癌瘤细胞A431(ATCC CRL-1555)在盖玻片上培养，并用PBSCM(含有1mMMgCl2和1mM CaCl2的PBS)清洗一次。然后在100％甲醇中于-20℃固定细胞达15分钟。用PBSCM再清洗两次后，用PBSCM中的0.12％皂苷透化细胞达15分钟，并与小鼠抗γ-微管蛋白(Sigma)和家兔抗VHZ抗体(1∶150稀释)一起于RT温育1小时，然后于4℃过夜。用PBSCM温和地清洗细胞三次，并与偶联有德克萨斯红的抗小鼠IgG(Sigma)和偶联有FITC的抗家兔IgG(Sigma)一起于RT温育4小时。实施共焦成像(Zeiss LSM 510图像浏览器)。
实施例6：酪氨酸磷酸酶测定法
使用EnzChek试剂盒(Invitrogen，R22065)。按照制造商的方案，在测定孔中用缓冲液重建荧光底物；将想要的潜在的PTP酶(每种蛋白质：VHZ-GST、VHZ-GST+磷酸酶抑制剂、VHZ(C95S)-GST、和对照GST为0.675皮摩尔)添加至各孔，并分别温育30分钟或90分钟。然后使用Gemini XPS微量板荧光分光光度计(Molecular Devices)量化荧光。以10分钟的时间间隔分别在358和452nm的激发和发射波长测量荧光。在测定法中使用磷酸酶抑制剂原钒酸钠(10μM)作为阴性对照。
实施例7：通过BrdU标记来测量新合成的DNA
通过使用APC BrdU流动试剂盒(BD Pharmingen)依照制造商的方案测量新合成的DNA来评估细胞增殖。使用WinMDI 2.8软件来分析FACS数据。测定APC标记的细胞(FL2)的百分比。
实施例8：Western印迹分析
详细的步骤如先前所描述的(Li等，2005)。以1∶500稀释度使用家兔抗VHZ抗体。磷酸-Rb(Ser780)、磷酸-Rb(Ser795)、磷酸-Rb(Ser807/811)、和b-肌动蛋白抗体来自Cell Signaling Technology(Beverly，MA)。GAPDH抗体来自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz)。
实施例9：免疫组织化学(IHC)
我们对人乳腺癌标本调查VHZ蛋白表达。用VECTASTAIN ABC试剂盒(Orton Southgate，Peterborough，England)，使用家兔抗VHZ抗体(1∶300稀释)来实施IHC实验。自Henan Medical Hospital病理科的档案收集原发性人乳腺癌样品的总共65份福尔马林固定的且石蜡包埋的手术标本。另外，人乳腺癌瘤组织阵列TMA(CC08-11-008)购自Cybrdi(Frederick)以再次确认结果。先前描述了IHC方法(Li等，2005)。购买E-钙粘着蛋白抗体(Cell SignalingTechnology)。
实施例10：MCF-7-VHZ-EGFP和MCF-7-VHZ(C95S)-EGFP细胞运动性
我们如先前所描述的那样进行评估(Sherri等，2006)。通过将细胞在盖玻片(12mm)上以汇合的单层铺片，然后将经细胞包被的盖玻片倒置，细胞一侧向下至新鲜的培养皿(35mm)。温和地将新鲜的培养基(2ml含10％FBS的RPMI)添加入该皿中。在0小时和48小时时拍摄图像。
实施例11：通过逆转录病毒生成和感染建立表达VHZ-EGFP和VHZ(C95S)-EGFP的MCF-10A稳定集合
分别将VHZ和VHZ(C95S)PCR片段克隆入逆转录病毒载体(pBABEpuro)的EcoRI和BamHI酶位点中。使用Lipofectamine依照制造商的指令(Invitrogen)分别用pBABEpuro-VHZ或pBABEpuro-VHZ(C95S)逆转录病毒载体转染双嗜性Phoenix包装细胞。48小时后，收集逆转录病毒上清液，过滤(0.45μm；Millipore)，并在存在5μg/ml Polybrene(Sigma-Aldrich)的情况中添加至靶MCF10A细胞上达6-8小时。完成两次感染。感染后，用嘌呤霉素(1μg/ml)选择细胞达1周，之后进行分析。
实施例12：伤口愈合测定法中的MCF-10A-VHZ-EGFP和MCF-10A-VHZ(C95S)-EGFP细胞运动性
通过用黄色移液头产生伤口来在细胞单层上实施测定法。用PBS清洗后，将细胞在新鲜的培养基中进行连续性温育。在测定法开始时(0小时，上部小图)和结束时(8小时，下部小图)为受伤区域拍照。
实施例13：内源性VHZ定位于中心体中并遍及胞质
测定蛋白质的胞内定位有时能提供关于蛋白质可能的生物学功能的线索。
为了评估VHZ的亚细胞定位，我们生成稳定表达VHZ-EGFP的NRK细胞。对这些细胞进行的共焦显微术显示，VHZ具有一系列亚细胞定位。在质膜和胞质处发现EGFP信号(图1A)。重要的是，加有EGFP标签的VHZ在中心体中的富集在细胞周期的所有阶段中都是明显的，因为它与中心体标志物--粒周蛋白共定位(图1B)。
内源性VHZ定位于中心体和胞质中。加有EGFP标签的VHZ蛋白提供关于其亚细胞定位的有用信息。为了理解VHZ的因果性质(causal nature)，有必要检查内源性VHZ蛋白的亚细胞分布。
使用用亲和纯化的家兔多克隆抗VHZ抗体连同小鼠单克隆(单抗)抗γ-微管蛋白(另一种中心体标志物)抗体进行的双重免疫荧光标记，在NRK细胞中(图2A，小图A-C)和在MCF-10A细胞中(图2A，小图D-F)在中心体中清楚地看到内源性VHZ与γ-微管蛋白共定位。另外，抗VHZ单抗与家兔多克隆抗粒周蛋白抗体一起再次显示，内源性VHZ在A431细胞中共定位至中心体(图2A，小图G-I)。
血清饥饿后，内源性VHZ从细胞质移位至细胞核，在中心体中富集。将NRK细胞进行血清饥饿过夜。用家兔抗VHZ抗体和抗γ-微管蛋白单抗进行双重免疫荧光标记，观察到内源性VHZ蛋白在中心体中是更集中的。此外，在NRK细胞中令人惊讶地观察到胞质分布的降低及伴随的细胞核中的升高(图2B)。
实施例14：VHZ是蛋白质酪氨酸磷酸酶
为了证实VHZ确实是活性酪氨酸磷酸酶，我们测定VHZ-GST或没有催化活性的VHZ(C95S)-GST融合蛋白的PTP活性，与作为对照蛋白质的单独的GST比较。通过将Cys95突变成Ser或者通过将磷酸酶抑制剂(原钒酸钠)添加入测定法中，VHZ-GST的PTP酶活性被消除，其表现为渐增的蓝色荧光(激发/发射最大值约358/452nm)(图3A，小图A)。
实施例15：VHZ通过促进G1/S转换来增强细胞增殖
VHZ与中心体的关联给我们提示，VHZ可在控制细胞周期调控中具有潜在功能。为了对此进行测试，我们生成稳定表达三种不同表达构建体：1.VHZ-EGFP；2.VHZ(C95S)-EGFP；和3.EGFP载体的MCF-7细胞。对3种稳定集合分析其细胞增殖。发现VHZ能够增强细胞增殖速率(数据未显示)。为了确认此观察结果，使用APC-BrdU进入新合成的DNA中的掺入来在这三种细胞系中测量DNA合成速率。实验显示表达VHZ-EGFP的细胞中的BrdU掺入显著高于表达VHZ(C95S)-EGFP或单独的EGFP载体的细胞(图3B)。通过对稳定表达相同的三种表达构建体的NRK细胞的FACS分析也获得类似的结果，并暗示VHZ能通过减少G1但增加S群体来加速G/S转换(图3C)。这提出如下的可能性，即野生型VHZ可在G1/S期行进中具有作用。
实施例16：VHZ能间接引起视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的超磷酸化
为了了解VHZ如何能促进G1/S期转换和为了解决可能的分子机制，我们对调控细胞周期自G1行进至S期中重要的数种主要分子实施免疫印迹研究。我们发现VHZ能下调肿瘤抑制蛋白p21Waf1/Cip1，及上调细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)4。Cdk4是决定G1向S期行进的主要参与物之一，并且能使视网膜母细胞瘤蛋白pRB磷酸化(Sherr和Roberts，1999)。与此一致，我们显示VHZ磷酸酶的过表达能间接导致Rb在残基Ser780、Ser795、和Ser807/811处的磷酸化积累，如通过磷酸特异性抗体所评估的(图4A，第3道)。
实施例17：在人乳腺癌上皮的中心体(约10％)或胞质(约17％)中找到过量生成的VHZ蛋白
VHZ与PRL-3磷酸酶共享28％的氨基酸序列相似性。基于PRL-3是与结肠直肠癌转移有关的磷酸酶的实情(Saha等，2001)，我们假设VHZ磷酸酶可能具有牵涉一些癌症的转移的类似功能。为了调查VHZ与多份人癌症标本之间的关系，使用亲和纯化的抗VHZ家兔抗体来进行免疫组织化学以评估VHZ蛋白表达。我们发现VHZ过表达优先与乳腺癌有关。65份乳腺癌样品(30份IDC/ILC I期，35份IDC II期)中，6份在中心体中表达高水平的VHZ蛋白，这得到用家兔抗VHZ和中心体标志物小鼠抗γ-微管蛋白对癌症样品的同一切片进行的双重免疫荧光(图5A)和用家兔抗VHZ抗体或小鼠抗γ-微管蛋白抗体对两张相邻切片进行的单一免疫组织化学(图5B，小图A-B)两者的证明。免疫荧光和免疫组织化学两者都确认，VHZ在诊断为侵入性导管癌(IDC)或侵入性小叶癌(ILC)I期的一些乳腺癌样品的中心体中是过表达的(图8A)。除了VHZ的中心体染色，我们在诊断为IDC II期的乳腺癌样品的不同子集中找到VHZ的替代(alternate)染色样式。65份乳腺癌样品中，11份显示遍及扩散上皮肿瘤细胞的胞质分布的高水平VHZ蛋白，所述扩散上皮肿瘤细胞展示成纤维细胞样形态学(图5C，小图A-B)(图8B)。
实施例18：VHZ的过表达与乳腺癌中丧失E-钙粘着蛋白表达相关联
因为我们在VHZ蛋白在乳腺癌样品的扩散成纤维细胞样细胞中特异性过表达的一些微环境内捕获到一种出乎意料的现象，我们调查这些细胞是否正在经历上皮-间充质转换(EMT)。EMT在胚胎发育和肿瘤发生过程中发生，其中上皮细胞获得成纤维细胞样特性，并丧失上皮细胞粘附和细胞骨架成分(Thiery和Sleeman，2006)。E-钙粘着蛋白的丧失导致细胞-细胞粘着连接的分解和体内肿瘤细胞侵入性升高，并且是EMT的标志(Kang等，2004)。我们观察到，大多数VHZ过表达细胞(红色箭标示)已经丧失E-钙粘着蛋白的表达(黑色箭标示)(图6A)，提示这些癌细胞可已经经历整个EMT过程。
实施例19：MCF-7细胞中的VHZ过表达增强细胞迁移
因为在乳腺癌进展过程中VHZ表现为与EMT有关，然后我们测试VHZ是否能在触发癌细胞迁移中起作用。为了研究由VHZ驱动的细胞迁移，对表达VHZ-EGFP或VHZ(C95S)-EGFP的MCF-7细胞检查细胞迁移特性。因为MCF-7细胞的迁移难以使用常规的伤口愈合或Transwell腔式测定法来测量，我们使用备选的先前所描述的“倒置盖玻片”测定法(Sherri等，2006)。如显示的，MCF-VHZ细胞迁移出盖玻片(图6B，小图A’的白色箭)，但是MCF-VHZ(C95S)细胞保留在盖玻片内(图6B，小图B’的白色箭)。结果提示，VHZ能够促进细胞迁移。使用永生化的人乳房上皮-MCF10A细胞来进一步调查VHZ在促进细胞迁移中的特性(图10)。
实施例20：材料和方法：特异性VHZ小鼠单克隆抗体的生成
使用来自Stemcell Technologies Inc(UBC Canada)的ClonaCellTM-Hy杂交瘤克隆试剂盒来生成杂交瘤。依照制造商的指令来遵循规程。简言之：1.用GST-VHZ融合蛋白免疫BALB/c小鼠。2.BALB/c亲本骨髓瘤细胞SP2/0的生长。3.准备BALB/c小鼠以自经免疫的小鼠制备脾细胞。4.融合脾细胞与SP2/0细胞。5.杂交瘤克隆的选择和表征。
实施例21：材料和方法：腹水的生成
将杂交瘤细胞(5x106个)在200μl无血清DMEM培养基中悬浮，并用26号针注射入腹膜腔中。
10天后，小鼠形成大量腹水，并且腹部极大地膨胀。处死小鼠，并做一小的浅的切口以打开腹腔。
用装备有18号针的10ml注射器抽吸腹水。以200g于4℃将流体离心10分钟。收集上清液流体，并于-70℃冷冻，直至进一步使用。
实施例22：材料和方法：免疫组织化学
我们对来自(http://cvbrdicom)的多种人癌症调查VHZ蛋白表达。
对于乳腺癌阵列：CC08-02-001和CC08-02-002；对于结肠癌阵列：CC05-01-001；对于肺癌阵列：CC04-01-006；对于多种癌症阵列：CC00-01-006；对于鳞癌阵列：CC00-01-009。
我们使用Dako EnVisionTM系统K 1395(Dako，Carpinteria，CA)来实施IHC实验。将经福尔马林固定的、经石蜡包埋的载玻片在新鲜的二甲苯中脱蜡5分钟。将步骤再重复一次。如下将载玻片进行再水化，即通过序贯的100％、95％、80％、和75％乙醇，然后是PBS(对于每次更换为2分钟)，接着在每个载玻片上在37℃水浴中用200μl(2.5mg/ml)胃蛋白酶(EK000-10K BioGenex，San Ramon，CA)进行抗原修复5分钟。
将载玻片转移至具有2％甘氨酸的PBS达2分钟，然后至黑暗中的具有1％H2O2的PBS达5分钟。将载玻片在PBS中清洗几次，并于RT在具有0.1％Tween20、0.1％TX-100、和0.1％皂苷(Merck)的PBS中处理20分钟。然后，将每个载玻片在具有10％山羊血清、1％BSA(Sigma#A-4161)和0.1％皂苷的300μlPBS中于RT封闭2小时。擦去过量的封闭溶液。
将单抗以1∶150在封闭缓冲液(具有10％山羊血清、1％牛血清清蛋白(Sigma)的PBS)中稀释。将合适的单抗(150μl)添加至每个载玻片，并于RT温育3小时，然后于4℃温育过夜。
次日，在温和摇动的情况中将载玻片在含有0.05％Tween 20、0.05％TX-100的PBS中清洗几次。然后，将载玻片与经标记的聚合物-HRP一起温育。重复清洗步骤。将200μl底物-色原溶液(对于聚合物-HRP为1ml缓冲液+20μlDAB)在黑暗中应用至每个载玻片达10-20分钟。重复清洗步骤。
实施例23：实施例20至22的结果
对经福尔马林固定的且经石蜡包埋的人多种癌症样品评估VHZ蛋白表达。
通过用VHZ特异性小鼠单克隆抗体染色用使用DAB色原(以褐色)的Dako EnVisionTM系统来揭示VHZ蛋白。VHZ阳性信号主要位于质膜和胞质中高尔基样亚细胞结构。
VHZ的过表达与肺、膀胱、食管、皮肤、唇、喉、外阴、宫颈、阴茎等中的鳞状细胞癌紧密相关。图12中显示了自组织阵列选定的VHZ阳性癌样品。放大率，x200或x400。X200。在多种人癌症中检测出VHZ蛋白，如下文表E1中所显示的。
  癌症类型   VHZ+/总的样品   VHZ+％
  乳房   27/200   13.5％
  结肠   25/143   17.5％
  肺   20/82   24.0％
  鳞癌*   22/63   35.0％
  胰   17/51   33.3％
  脑   7/40   17.5％
  贫管   4/12   33.3％
  胃   5/14   35.7％
  膀胱   2/6   33.3％
  肾   2/11   18.1％
  皮肤   2/6   33.3％
  卵巢   2/6   33.3％
  前列腺   3/8   37.5％
  睾丸   2/6   33.3％
表E1：VHZ在多种癌症中的表达。鳞癌指鳞状细胞癌，诸如唇、喉、外阴、宫颈、阴茎等。
实施例24：VHZ人/小鼠嵌合单抗(克隆#209)的生成
对于VHZ嵌合单抗生成，使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN，产品目录编号74104)自6x106个杂交瘤细胞(克隆#209)提取总RNA。然后，使用Superscript II RNA酶H(Invitrogen，产品目录编号18064-014)将RNA逆转录成cDNA。
使用所得的总cDNA作为模板来生成“通用可变区”，其对具有30个循环的PCR(95℃、54℃、72℃)使用Ig-Prime试剂盒(Novagen，产品目录编号69831-3)来进行。用TA克隆试剂盒(Invitrogen，部分编号45-0640)将PCR片段克隆入PCRII-TOPO载体中。用MfeI和XhoI切割PCR片段，然后插入人IgG1恒定区表达载体pCMV-人IgG1的各自位点中以连接小鼠重链可变区(克隆#209)与人IgG1恒定区。
对末端含有ApaLI和PstI限制性位点的小鼠轻链可变区(克隆#209)实施相似的PCR规程。用ApaLI和Pst I切割PCR片段，然后插入含有克隆#209重链可变区的人IgG1恒定区表达载体的各自位点中。
图13A显示了VHZ#209嵌合抗体构建体的概要步骤。
图13B显示了克隆209的可变重链的序列(SEQ ID NO：4)。序列是：LVDMDSRLNLVFLVLILKGVQCDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARWQTARATRGYAMDYWGQGTSVTVSS
图13C显示了克隆209的可变轻链的序列(SEQ ID NO：5)。序列是：VMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWYQQKPGQSPKLLI YSASYRFTGVPDLFTGSGSGTDFTFTINSVQAEDLAVYYCQQHYSSPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFHH PVSLG
实施例25：VHZ人/小鼠嵌合单抗(克隆#209)生成
将完整的构建体瞬时转染入在超低IgG FBS(Gibco，16250-078)中培养的293T细胞中。自培养上清液收获嵌合单抗，并用离心滤器装置(Millipore，产品目录编号UFC900596)浓缩多至40倍(times)。
实施例26：VHZ人/小鼠嵌合单抗(克隆#209)：间接免疫荧光和Western印迹
通过对数种细胞系和对多种小鼠组织进行的间接免疫荧光和Western印迹分析来在NRK(ATCC-CRL-6509)表达的EGFP-VHZ上对嵌合单抗测试其特异性。
HeLa(ATCC CCL2)是一种宫颈癌细胞系；CHO-K1(ATCC CCL61)是一种中国仓鼠卵巢细胞系；MCF-7(ATCC HTB-22)是一种人乳腺癌细胞系，HCT116(CCL-247)是一种人结肠直肠癌细胞系；MDCK(CCL-34TM)是犬肾细胞系；而DLD-1(CCL-221)是一种人结肠直肠腺癌细胞系。ATCC：美国典型培养物保藏中心。
图14A显示了关于间接免疫荧光的结果。
图14B显示了关于对细胞系进行的Western印迹分析的结果。
图14C显示了关于对小鼠组织进行的Western印迹分析的结果。
对多种小鼠组织进行的抗体测试的结果显示VHZ在脾和结肠中仅表达低水平，而且提示VHZ在组织中不是遍在表达的。
数据指明VHZ是一种较好的治疗靶物，因为VHZ抗体不会攻击正常的组织，而且不会引起太多的副作用。
实施例27：VHZ人/小鼠嵌合单抗(克隆#209)有效抑制表达VHZ的HCT116结肠癌细胞形成肿瘤
所有动物研究已经获得IMCB机构审查委员会批准。我们严格遵循新加坡科学技术研究局(Agency for Science，Technology and Research，A*STAR)动物房中心(Animal Facility Center)的规则和政策。使用9周龄裸鼠(Jackson Labs，USA)。
根据Western印迹，我们确认与MDCK细胞系相比，HCT116结肠癌细胞系是VHZ阳性。在第1天经由尾静脉将1x106个HCT116癌细胞注射入裸鼠的循环中。
图15A显示了此实验的结果。
将PBS(未处理的)或嵌合单抗(经处理的)施用入尾静脉中，在第3天开始第一次处理；接着每周进行两次施用。实验期：顶部两只动物开始于2009年2月11日-4月2日，底部两只动物开始于2009年2月11日-4月13日。
图15B显示了此实验的结果。如可以看到的，VHZ人/小鼠嵌合单抗(克隆#209)有效抑制表达VHZ的HCT116结肠癌细胞形成肿瘤。
实施例28：使用免疫组织化学(IHC)的组织病理学分析
我们对648份人癌症样品调查了VHZ蛋白表达。大多数组织购自Cybrdi，Inc.(Rockville，Maryland 20850USA：http://cvbrdi.com/index.php)。
这些包括主要实体瘤组织阵列(CC00-01-006)；鳞状细胞癌(CC00-01-009)；肺癌(CC04-01-006)；结肠腺癌(I级至III级)及正常组织对照组织阵列(CC05-01-001)；乳腺癌(CC08-02-001)；胰腺癌(导管腺癌/胰岛细胞癌/粘液癌)及正常对照组织阵列(CC14-01-001)；人低密度前列腺组织阵列(TS42081004)购自InnoGenex(San Ramon，CA)。
我们使用Dako EnVisionTM系统K 1395(Dako，Carpinteria，CA)来实施IHC分析。
实施例29：用于免疫组织化学(IHC)的详细步骤
将经福尔马林固定的、经石蜡包埋的载玻片在新鲜的二甲苯中脱蜡5分钟。将此步骤重复一次。
然后，如下将载玻片进行再水化，即通过序贯的100％、95％、80％、和75％乙醇，然后是PBS(对于每次交换为2分钟)，接着在每个载玻片上在37℃水浴中用200μl(2.5mg/ml)胃蛋白酶(EK000-10K BioGenex，San Ramon，CA)进行抗原修复5分钟。
将载玻片转移至具有2％甘氨酸的PBS达2分钟，然后至黑暗中保持的具有1％H2O2的PBS达5分钟。将载玻片在PBS中清洗几次，并于室温(RT)在含有0.1％Tween 20、0.1％TX-100、和0.1％皂苷(Merck)的PBS中处理20分钟。然后，将每个载玻片在具有10％山羊血清、1％BSA(Sigma#A-4161)和0.1％皂苷的300μl PBS中于RT封闭2小时。擦去过量的封闭溶液。用封闭缓冲液稀释VHZ单抗(1∶150)。
将稀释的VHZ单抗(150μl)添加至每个载玻片，并于RT温育3小时，然后于4℃温育过夜。次日，在温和摇动的情况中将载玻片在含有0.05％Tween 20、0.05％TX-100的PBS中清洗几次。然后，将载玻片与经标记的聚合物-HRP一起温育2小时。重复清洗步骤。
将200μl底物-色原溶液(对于聚合物-HRP为1ml缓冲液+20μl DAB)在黑暗中应用至每个载玻片达10-20分钟。重复清洗步骤。使用显微术来分析结果，并在图12A-F中显示了代表性图像。
在上文表E1中显示了结果。常常在多种人癌症中检测出VHZ蛋白。从总共648份人癌症样品汇总VHZ阳性癌症类型的百分比。
实施例30：讨论
我们已经显示，VHZ是一种新的中心体磷酸酶。中心体是在细胞周期行进和细胞分裂中起关键作用的细胞器。它贯穿细胞周期组织微管排列，并且在减数分裂和有丝分裂细胞中在调控细胞分裂中发挥枢要作用。中心体细胞器的失调与人类遗传疾病和癌症有联系。实际上，许多人肿瘤显示中心体失常(Doxsey，2001；Nigg，2002)。
我们的结果即VHZ在MCF-7细胞和NRK细胞中过表达支持如下结论，即VHZ磷酸酶可以在细胞周期行进过程中在促进G1/S转换方面起作用。在试图解决VHZ在促进MCF-7细胞生长中的机械学作用的尝试中，检查在G1/S细胞周期控制中起至关重要的作用的数种重要分子。我们发现，VHZ过表达能下调肿瘤抑制蛋白p21Waf1/Cip1，即细胞周期行进的一种抑制剂。p21Waf1/Cip1用来抑制激酶活性，并阻断通过G1/S的行进(Pestell等，1999)。VHZ对p21Waf1/Cip1的下调可以免除p21对细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)4的抑制(Sherr和Roberts，1999)。与此相一致，我们发现，VHZ能上调Cdk4表达。真核细胞周期行进部分依赖于受到紧密调控的CDK活性。Cdk4活化能将视网膜母细胞瘤蛋白Rb靶向磷酸化(Lukas等，1996)。因此，VHZ间接引起Rb磷酸化的增强。已知Rb的超磷酸化使Rb经由细胞周期的G1期内的限制点控制行进的功能失活(Lukas，等，1996，Sherr，1996)。如此，VHZ过表达能间接经由Rb失活来克服G1/S期限制点。虽然需要未来的研究，我们的结果使我们能够提出关于VHZ在细胞周期行进中的作用的工作模型(图4B)。
在一些乳腺癌样品中，我们发现VHZ蛋白在上皮肿瘤细胞的中心体(约10％)或胞质(约17％)中过表达。VHZ更通常在展示迁移成纤维细胞样形态学的癌细胞中过表达。我们观察到，VHZ中心体阳性细胞显示就ILC或IDCI期乳腺癌样品而言的典型的上皮形态学；而VHZ胞质溶胶阳性细胞更通常与IDC II期样品中分散的上皮有关。结果可指明，VHZ可以首先在中心体中，且随后遍及获得细胞运动性的肿瘤细胞的整个胞质溶胶过表达。值得注意的是，强烈染色的VHZ胞质溶胶阳性细胞是E-钙粘着蛋白阴性的。E-钙粘着蛋白的丧失在将上皮转变成迁移间充质细胞的EMT复杂过程中扮演初始步骤(Kang等，2004)。E-钙粘着蛋白的丧失导致细胞-细胞粘着连接的分解，并提高肿瘤细胞侵入性。VHZ的上调能充当启动EMT，或改变典型的上皮现象以促进细胞迁移的驱动力之一。癌细胞需要获得增强的运动性来克服赘生性上皮邻近物的屏障；导致恶性细胞进入新位置的侵入和长出(Thiery和Sleeman，2006)。肿瘤细胞以多种多样的样式(包括个体和集合细胞迁移策略两者)浸润周围组织基质(Friedl，2003；Vogelstein和Kinzler，2004)。在我们的研究中，我们显示个体(图5C，小图A)和集合细胞迁移(图5C，小图B)两者同时存在于VHZ胞质溶胶阳性细胞中。这些现象可以重演和代表由体内微环境内的VHZ驱动的局部侵入的相对早期发作。虽然不知道VHZ在肿瘤进展和癌细胞迁移中发挥的精确作用，我们的数据提示，VHZ的过表达或其升高的活性可以是局部侵入的至关重要的早期事件。与此假设相一致，我们能够显示，VHZ能增强MCF-7细胞迁移(图6B)。
这里我们的研究提供了如下的证据，即VHZ是牵涉细胞周期调控和乳腺癌进展的磷酸酶。我们的发现揭示对此小磷酸酶作为未来诊断和治疗策略中的重要靶物的新了解。我们提出，对VHZ的抑制可以是在早期阻断乳腺癌转移扩散的治疗办法的基础。
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在此通过提及而将本文件中所提及的每篇申请和专利，和每篇上述申请和专利中(包括在每篇申请和专利的审查过程中)引用或提及的每篇文件(“申请引用的文件”)，和每篇申请和专利中和任何申请引用的文件中引用或提及的任何产品的任何制造商指令或产品目录收入本文。此外，在此通过提及而将本文本中所引用的所有文件、和本文本中所引用的文件中所引用或提及的所有文件、和本文本中所引用或提及的任何产品的任何制造商指令或产品目录收入本文。
本发明的所述方法和系统的各种修饰和变化在不背离本发明的范围和精神的前提下对于本领域技术人员会是显而易见的。虽然本发明已经结合具体的优选实施方案进行了描述，应当理解的是，要求保护的发明不应过度地限于此类具体的实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修饰意图在权利要求书的范围内。

Claims (16)

1.抗VHZ抗体在制备用于治疗、预防或减轻侵入性癌症的药物组合物中的用途，所述侵入性癌症选自下组：结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌，睾丸癌和乳腺癌，其中所述癌症过表达VHZ；且其中所述抗体包含由SEQID NO:4和SEQ ID NO:5组成的序列或与之有至少95％序列同一性的序列，并且能够结合VHZ。
2.权利要求1的用途，其中所述抗体：
(a)包含能够结合如下表位的抗VHZ抗体，所述表位是包含VHZ的残基C95的序列；
(b)能够结合胞内VHZ多肽；
(c)能够穿过细胞的质膜；
(d)能够结合VHZ，并抑制VHZ的生物学活性；
(e)能够阻止癌症的转移；或
(f)包括单克隆抗体或人源化单克隆抗体；
(g)是Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv片段或单链抗体(scFv)。
3.权利要求1的用途，其中所述抗体是人源化抗-VHZ抗体。
4.权利要求2的用途，其中所述癌症是结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。
5.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述鳞状细胞癌包括唇癌、喉癌、外阴癌、宫颈癌和阴茎癌。
6.一种不用于诊断目的的方法，其选自下组：
(a)检测选自下组的侵入性癌细胞的方法：结肠癌细胞，肺癌细胞，鳞状细胞癌细胞，胰腺癌细胞，脑癌细胞，食管癌细胞，胃癌细胞，膀胱癌细胞，肾癌细胞，皮肤癌细胞，卵巢癌细胞，前列腺癌细胞和睾丸癌细胞，所述方法包括检测样品中VHZ的表达、量或活性的上调；其中所述方法包括使用抗VHZ抗体检测VHZ多肽；
(b)测定选自下组的侵入性癌细胞的增殖状态或者测定所述癌细胞会变为侵入性或攻击性的可能性的方法：结肠癌细胞，肺癌细胞，鳞状细胞癌细胞，胰腺癌细胞，脑癌细胞，食管癌细胞，胃癌细胞，膀胱癌细胞，肾癌细胞，皮肤癌细胞，卵巢癌细胞，前列腺癌细胞和睾丸癌细胞，该方法包括使用抗VHZ抗体检测自个体获得的样品中的VHZ的表达、量或活性的上调。
7.权利要求6的方法，其中所述鳞状细胞癌细胞包括唇癌、喉癌、外阴癌、宫颈癌和阴茎癌。
8.一种不用于诊断目的的在体外操作侵入性结肠癌细胞，肺癌细胞，鳞状细胞癌细胞，胰腺癌细胞，脑癌细胞，食管癌细胞，胃癌细胞，膀胱癌细胞，肾癌细胞，皮肤癌细胞，卵巢癌细胞，前列腺癌细胞和睾丸癌细胞的方法：
(a)所述方法包括下调所述细胞中的VHZ表达、量或活性；或
(b)所述方法包括下列步骤：(a)检测细胞中升高的VHZ表达、量或活性；并(b)降低所述细胞中的VHZ水平；
其中所述方法包括将所述细胞暴露于能够特异性结合VHZ的抗VHZ抗体，使得所述侵入性癌细胞由于所述操作而变为非侵入性的或非转移性的。
9.权利要求8的方法，其中所述鳞状细胞癌细胞包括唇癌、喉癌、外阴癌、宫颈癌和阴茎癌。
10.一种抗体，其包含由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的序列，或与其具有至少95％序列同一性的序列，并能够结合VHZ。
11.根据权利要求10的抗体，其中所述抗体：
(a)包含能够结合如下表位的抗VHZ抗体，所述表位是包含VHZ的残基C95的序列；
(b)能够结合胞内VHZ多肽；
(c)能够穿过细胞的质膜；
(d)能够结合VHZ，并抑制VHZ的生物学活性；
(e)能够阻止癌症的转移；或
(f)包括单克隆抗体或人源化单克隆抗体；
(g)是Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv片段或单链抗体(scFv)。
12.权利要求11的抗体，其中所述癌症是结肠癌，肺癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，脑癌，食管癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，皮肤癌，卵巢癌，前列腺癌和睾丸癌。
13.权利要求12的抗体，其中所述鳞状细胞癌包括唇癌、喉癌、外阴癌、宫颈癌和阴茎癌。
14.依照权利要求10或权利要求11的抗体，其中所述抗体是人源化的抗VHZ抗体。
15.一种包含能够编码依照权利要求10的抗体的序列的核酸。
16.一种细胞或此类细胞的后代，所述细胞包含依照权利要求15的核酸序列或经依照权利要求15的核酸序列转化。
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